DE2926808A1 - Proteaseprodukt mit verringerter allergener wirkung, herstellungsverfahren und waschmittel - Google Patents

Proteaseprodukt mit verringerter allergener wirkung, herstellungsverfahren und waschmittel

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DE2926808A1
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Hans Erik Schiff
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Description

Novo Industrie A/S
Novo Allee
2880 Bagsvaerd, Dänemark
Proteaseprodukt mit verringerter allergener Wirkung, Herstellungsverfahren und Waschmittel
B_e_s_c_h_r_e_i_b_u_n_g
Die Erfindung betrifft ein von Bacillus licheniformis abgeleitetes Proteasepräparat mit wesentlich verringerten allergenen Eigenschaften, das als ein Protease-Handelsprodukt geeignet ist, beispielsweise zum Beimischen in Detergens-Zusammensetzungen, wie Waschpulver-Zusammensetzungen für die Anwendung im Haushalt.
Handelsübliche Detergens-Proteasepräparate werden gewöhnlich durch Kultivieren ausgewählter Stämme von Bacillus licheniformis erhalten. Die Protease wird extrazellulär durch den Mikroorganismus erzeugt, und anschließend wird ein Proteasekonzentrat aus der Kulturbrühe gewonnen, z. B. durch Ausfällen mit Salzen und/oder Lösungsmitteln. Die Aufarbeitungsverfahren können in derartiger Weise durchgeführt werden, daß praktisch keine Proteaseaktivität in der Kulturbrühe zurückbleibt. Jedoch ist das Gewinnungsverfahren nicht besonders spezifisch im Hinblick auf die Protease und daher enthält das Proteasekonzentrat normalerweise auch Brühenbestandteile, die sich von dem Enzym unterscheiden. Zur Herstellung eines gewerblich verwertbaren Detergens-Proteaseprodukts, wie Alcalase, ein Handelsprodukt der
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Novo Industrie A/S, Dänemark (bei Alcalase handelt es sich um ein Warenzeichen), wird das Proteasekonzentrat anschließend mit einem inerten Füllstoffmaterial und den Hilfsmitteln vermischt, die dazu dienen, ein wenig staubendes Proteaseprodukt mit einer vorherbestimmten . proteolytischen Wirksamkeit zu bilden.
Die weitaus vorherrschendste proteolytische Komponente handelsüblicher Proteaseprodukte, die von Bacillus licheniformis herrühren, wie Alcalase, wurde als Subtilopeptidase A (EC 3.4.21.14), im folgenden als Subtilisin bezeichnet, identifiziert. Dieses Enzym, das aus dem Handelsprodukt in gereinigter und kristallisierter Form gewonnen werden kann, wurde sehr genau charakterisiert, und es wurde gefunden, daß es der gleichen Gruppe der sog. Serinproteasen, wie Trypsin und Chymotrypsin, angehört.Die Enzymnomenklatur spielt darauf an, daß ursprünglich die Mikroorganismenquelle für Alcalase als B. subtilis klassifiziert wurde. Allgemein wird heute jedoch davon ausgegangen, daß der Alcalase produzierende Mikroorganismus B. licheniformis ist.
Praktisch sämtliche Proteine, einschließlich industrieller En- -zyme, weisen allergene Eigenschaften bzw. Allergien erzeugende Eigenschaften unterschiedlicher Stärke, je nach dem einzelnen Protein auf.Ein beträchtlicher allergener Effekt von Proteasepräparaten, die von Bacillus licheniformis stammen, wurde bald nach deren- gewerblicher Einführung festgestellt, und seit dieser Zeit wurde eine derartige allergene Wirkung vom Fachmann als Nachteil angesehen, der mit der Verwendung der Proteaseprodukte verbunden war.
Bisher richteten sich Versuche, das Auftreten von hypersensitiven Reaktionen bei Arbeitern und Anwendern auf ein Minimum herabzusetzen, lediglich darauf, wenig staubende, teilchenförmige, z. B. granuläre oder eingekapselte Proteaseprodukte bereitzustellen, um die Gefahr der Berührung von sowohl Arbeitern in Detergensenzym- und Waschpulver-Herstellungsanlagen, sowie von Anwendern von Haushalts-Waschpulvern zu verringern. Der Erfolg dieser Bemühungen ist teilweise daraus ersichtlich, daß Waschpulver, die
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Detergensenzyme enthalten, fortgesetzt und verbreitet im Haushalt verwendet werden.
Es ist jedoch bekannt, daß die Entwicklung allergischer Reaktionen schlecht vorhersehbar und dem Zufall unterworfen sein kann. So verbleibt ein weiteres Bedürfnis nach einem im Handel verwertbaren Proteasepräparat mit allergenen Eigenschaften, die im Vergleich mit denen bisher bekannter Präparate wesentlich verringert sind.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Proteaseprodukts von B. licheniformis, das eine verringerte allergene Wirkung aufweist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung des industriell durchführbaren Verfahrens zu Herstellung eines Produkts mit einer verringerten allergenen Wirkung.
Die Erreichung dieser Ziele basiert auf bestimmten Beobachtungen, die sich auf die Bestandteile handelsüblicher Proteasepräparate und deren Eigenschaften beziehen.
Kürzlich veröffentlichte Untersuchungen, die mittels qualitativer (jedoch hochempfindlicher) Immunoelektrophoresen durchgeführt wurden (z. B. nach Grabar-Williams, vgl. R. Verbruggen et al., Biochim, Biophys, Acta, Band 365, 1974, Seiten 108 - 114) zeigten, daß handelsübliche Proteaseprodukte, insbesondere Alcalase, antigenisch heterogen sind.
In anschließenden Untersuchungen, die von Verbruggen veröffentlicht wurden (Biochem. Journal, Band 151, 1975, Seiten 149 - 155) unter Anwendung der Technik der quanitativen gekreuzten Agarosegel-Immunoelektrophorese, wurde gefunden, daß die Hauptproteasekomponente der Alcalase, die aus einer Familie von Subtilisinisoenzymen besteht, von einer geringen Proteinkomponente begleitet wird, die sich antigenisch von der Hauptproteasekomponente unterscheidet.
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Eine Möglichkeit, die Zusammensetzung handelsüblicher Proteasepräparate weiter aufzuklären, die auch auf einen präparativen Laboratoriumsmaßstab zur Fraktionierung derartiger Präparate anwendbar ist, liegt darin, das aus der Kulturbrühe gewonnene Proteasekonzentrat einer Ionenaustauscher-Chromatographie zu unterziehen. So wurde beispielsweise ein B. licheniformis-Proteasekonzentrat (30 g) an einer Säule ( 5 χ 35 cm) von Carboxymethylzellulose (CMC,500 g), die bei 4°C gehalten wurde, und mit einem Puffer vom pH-Wert 6,5, bestehend aus 0,005 m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan(TRIS)maleat und 0,002 m-Calciumacetat ins Gleichgewicht'gebracht. Eluiert wurde mit dem gleichen Puffer,unter Anwendung eines linearen Natriumchloridgradienten im Anschluß an das Auftreten des Frontpeaks. Die optimale Dichte der Fraktionen (20 ml), die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 210 ml/Std. gewonnen wurden, wurde bei 280 nm überwacht. Das Chromatogramm ist in der Figur 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
Die Hauptproteasekomponente, die aus vereinten Fraktionen gewonnen wurde, die dem Peak B des Chromatogramms entsprachen (beim Peak A handelt es sich um den Frontpeak), wurde als Subtilisin identifiziert. Es wird angenommen, daß die geringere Proteasekomponente, die durch den Peak C dargestellt wird, identisch ist mit der geringeren Proteinkomponente, die bei der gkreuzten Immunoelektrophorese (vgl. vorstehend) festgestellt wurde und als antigenisch unterschiedlich von der Hauptkomponente beschrieben, jedoch nicht weiter charakterisiert wurde. Im folgenden wird die geringere Proteasekomponente, die vorstehend identifiziert wurde, als "Komponente C" bezeichnet. Es wurde gefunden, daß die Komponente C etwa 5 bis etwa 15 % des Gesamt-Proteasegehalts der Alcalase bildet.
Zur weiteren Charakterisierung wurden die Subtilisinkomponente und die Komponente C, wie sie aus den vereinten Fraktionen,die den Peaks B bzw Centsprachen, erhalten wurden,einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Die Elektrophorese wurde in 0,075 m-Natriumbarbitalpuffer vom pH-Wert 8,0 bei 100C während 60 Minuten durchgeführt,
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unter Anwendung eines Spannungsgradienten von 15 V/cm. Die Proben wurden als 1 % Gew./VoI.-Lösungen aufgebracht. Die Elektropherogramme, die in der Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, zeigen, daß unter den Untersuchungsbedingungen Subtilisin (Position I) und die Komponente C (Position II) deutlich unterschiedliche kathodische Wandungsgeschwindigkeiten aufweisen.
Darüber hinaus zeigen die Elektropherogramme, daß, da beide Proteasen in Form von Bandmustern wandern, von denen jedes aus einem Hauptband besteht, das von langsamer wandernden Nebenbändern begleitet ist, sowohl der Subtilisinbestandteil als auch die Komponente C multiple Isoenzymsysteme sind (Verbruggen, vgl. vorstehend).
Inhibierungsuntersuchungen, die in der vorliegenden Beschreibung später erläutert werden, haben gezeigt, daß die Komponente C im Gegensatz zu Subtilisin eine nicht-Serin-Protease ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die -allergene Stärke der Subtilisinkomponente wesentlich geringer ist, als die allergene Stärke der Komponente C.
Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird ein Proteasepräparat bereitgestellt, das zum Einmischen in Waschzusammensetzungen, geeignet ist, in das ein von B. licheniformis stammendes Proteasekonzentrat eingearbeitet ist, das dadurch charakterisiert ist, daß das Proteasekonzentrat, das durch einen Gehalt von aus der Kulturbrühe stammenden nicht-proteolytischen Peptiden stabilisiert ist, im wesentlichen frei ist von nicht-Serin-Protease, und wesentlich verringerte allergene Eigenschaften im Vergleich mit einem nicht-Serin-Protease enthaltenden Proteasekonzentrat aufweist.
Das Proteasekonzentrat leitet im allgemeinen mindestens 99 % seiner proteolytischen Wirksamkeit von dem Subtilisinisoenzym-System ab und enthält mindestens etwa 2 % nicht-proteolytisch
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aktive Peptide.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteasekonzentrats bereitgestellt, das zur Einarbeitung in die Proteasepräparate geeignet ist, die in Waschzusammensetzungen eingemischt werden können, wobei dieses Proteasekonzentrat im wesentlichen frei von nicht-Serin-Protease ist und wesentlich verringerte allergene Eigenschaften im Vergleich mit einem nicht-Serin-Protease enthaltenden Proteasekonzentrat hat; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von B. licheniformis, der dahin mutiert wurde, daß im wesentlichen seine Eigenschaft zur Synthese anderer Proteasen als Subtilisin blockiert ist, in einem Nährmedium kultiviert wird, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor enthält, worauf das Proteasekonzentrat gewonnen wird, das Subtilisin und Peptide, die von der Kulturbrühe stammen, enthält.
Derartige Gewinnungsmethoden sind üblich, bzw. dem Fachmann bekannt. Gewöhnlich wird die Kulturbrühe filtriert, zentrifugiert oder in anderer Weise geklärt, worauf eine Ausfällung des Proteasekonzentrats erfolgt, beispielsweise durch Zusatz eines wasserlöslichen anorganischen Salzes, wie Natrium- oder Ammoniumsulfat oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels., wie Äthanol oder Aceton. Die Ausfällung kann in üblicher Weise gewonnen werden, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren.
Die feuchte Proteaseausfällung kann durch übliche Methoden getrocknet werden, beispielsweise im Vakuum. Ein besonders vorteilhaftes Trocknungsverfahren im großen Maßstab, bei dem eine Sprühtrocknung mit einer anschließenden Trocknungsstufe unter Fluidbett- bzw. Wirbelschichtbett-Bedingungen kombiniert wird, wird in der GB-PS 1 360 969 beschrieben..
Die Umwandlung des getrockneten Enzymkonzentrats in ein gewerblich verwertbares, teilchenförmiges nicht staubendes Protease-
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präparat mit einer vorherbestimmten Aktivität kann nach verschiedenen bekannten bzw. üblichen Methoden erfolgen. Eine Methode wird in der GB-PS 1 338 249 beschrieben, in der im wesentlichen sphärische Kügelchen bzw. Perlen hergestellt werden aus einem Gemisch des Proteasekonzentrats und eines wasserdxspergxerbaren festen, wachsartigen Bindemittelmaterials, wie ein nicht-ionisches Detergens. Es wird auch auf die GB-PS 1 362 365 Bezug genommen, die ein Verfahren beschreibt, bei dem ein befeuchtetes Vorgemisch des Enzymkonzentrats und eines festen Verdünnungsmittels, wie Natriumchlorid, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Bindemittels, z. B. Dextrin und/oder Polyäthylenglykol, stranggepreßt wird und anschließend zu Kügelchen verarbeitet wird, beispielsweise mittels einer Vorrichtung, die unter dem Handelsnamen Marumerizer erhältlich ist, worauf schließlich unter Fluidbett- bzw. Wirbelschichtbett-Bedingungen getrocknet wird.
Alternativ kann ein granuläres Enzymprodukt hergestellt werden, nach dem in der US-PS 4 106 991 beschriebenen Verfahren. Ein anschließendes überzugsverfahren kann gegebenenfalls angewendet werden, um die Stäube-Eigenschaften des Endprodukts weiter zu verringern. Ein überziehen des teilchenförmigen Produkts führt man gewöhnlich mittels eines geschmolzenen Wachses, vorzugsweise Polyäthylenglykol, gegebenenfalls mit einem anschließenden Stäuben bzw. Pudern des resultierenden überzogenen Produkts mit einem fein zerkleinerten Färbemittel, beispielsweise TiO2, vermischt mit Hilfs-Stäube- bzw. Pudermitteln durch.
Durch die Erfindung werden auch durch Mutation entstandene Stämme von B.licheniformis bereitgestellt, die hinsichtlich der Synthese des Bestandteils C blockiert sind, wobei ihre Fähigkeit zur Synthese von Subtilisin erhalten blieb.
Außerdem wird durch die Erfindung eine Waschmittelzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge des von B. licheniformis erhaltenen Protease-Produkts enthält, das im wesentlichen frei von der Proteasekomponente C ist.
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Außer dem Enzym enthält die gewerblich verwertbare Waschpulverzusammenstzung der Erfindung im allgemeinen:
a) mindestens ein oberflächenaktives Mittel, bei dem es sich um eine anionische, nicht-ionische oder amphotere oder eine wasserlösliche Seife handeln kann. Typischerweise wird ein anionisches, oberflächenaktives Mittel (z. B. ein lineares Alkylarylsulfonat) im Gemisch mit einem nicht-ionischen (z.B. einem Alkylphenyl-polyglykoläther) in Mengen von 5-30 bzw. von 1-5 Gew.-% der Waschmittelzusammensetzung verwendet.
b) Ein oder mehrere Waschhilfsmittel, die vorzugsweise gleichzeitig eine sequestierende Fuktion haben. Natriumtripolyphosphat, Natriumeitrat, Natriumsilikat und Zeolite sind Beispiele für derartige Verbindungen, die gewöhnlich 10-70 Gew.-% der Detergens-Zusammensetzung bilden.
c) Ein Bleichmittel, vorzugsweise eine Peroxiverbindung, wie Natriumperborat, das typischerweise in einer Menge bis zu 30 Gew.-% der Zusammensetzung eingearbeitet ist.
"d) Ergänzende Mittel, wie Carboxymethylcellulose, optische Aufheller und Duftstoffe. Gegebenenfalls wird ein den pH-Wert einstellendes Mittel zugesetzt, um einen pH-Wert in dem Waschmedium im Bereich von 8,0 bis 10,5 zu ergeben.
Das erfindungsgemäße teilchenförmige Proteasepräparat wird in einer Menge zugesetzt, die so berechnet ist, daß sie eine Proteaseaktivität von mindestens 0,1 Anson-Einheiten (AU, vgl. später) vorzugsweise von 0,5 - 2,5 AU pro 100 g der Waschzusammensetzung ergibt. Falls erforderlich, kann ein Ausgleich auf 100 % mittels eines anorganischen Füllstoffs, vorzugsweise Natriumsulfat, erfolgen.
Flüssige Detergens-Zusammensetzungen können hergestellt werden aus Enzymaufschlämmungen, vorzugsweise in nicht-wässrigen Medien. Typischerweise können derartige Aufschlämmungen aus einer Suspen-
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sion von fein vermahlenem Proteasekonzentrat in einem flüssigen, nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, beispielsweise Tergitol 15 S 9 oder einem Gemisch derartiger oberflächenaktiver Mittel bestehen. Gewöhnlich enthält die Aufschlämmung auch einen oder mehrere anorganische Füllstoffe, wie fein vermahlenes Natriumchlorid, gegebenenfalls im Gemisch mit einem Suspensionsstabilisator, beispielsweise abgerauchtes Siliciumdioxid (Aerosil 200), wobei es sich bei Tergitol und Aerosil um Warenzeichen handelt.
Die erfindungsgemäße Proteaseaufschlämmung wird in einer Menge, die so berechnet ist, daß sie eine Proteaseaktivität von mindestens 0,1 AU, vorzugsweise 0,5 - 2,5 AU pro 100 g der flüssigen Detergenszusammensetzung ergibt, zugesetzt.
Die Waschzusammensetzungen bzw. Waschmittelzusammensetzungen können in üblicher Weise hergestellt werden durch Vermischen der Bestandteile. Alternativ wird eine Vormischung bzw. ein Prämix hergestellt, die bzw. das anschließend mit den restlichen Bestandteilen vermischt wird.
Ein gereinigtes Subtilisin, beispielsweise eines, das aus vereinten Fraktionen gewonnen werden kann, die dem Peak B des CMC-Ionenaustauscher-Chromatogramms der Figur 1 entsprechen,mit einer proteolytischen Wirksamkeit in der Größenordnung vom 3-bis 5fachen der des Proteasekonzentrats ist für die Durchführung der Erfindung nicht von Bedeutung. Die Handhabung eines derart starken Proteasekonzentrats würde die Gefahr des Auftretens lokaler Reizungen, insbesondere des Respirationstrakts und anderer muköser Membranen auf ein Ausmaß erhöhen, das für die Arbeiter einer Enzymherstellungsanlage unzumutbar wäre.
Außerdem ist die enzymatische Instabilität einer derartigen gereinigten Subtilisinkomponente zu groß, um ein derartiges Proteasekonzentrat als Detergensenzym brauchbar zu machen. Der wesentliche Unterschied in der Stabilität, der zwischen dem gereinigten Enzym und handelsüblichen Proteasepräparaten festgestellt wurde,
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beruht wahrscheinlich auf der Anwesenheit von enzymatisch nichtaktiven Bestandteilen der Kulturbrühe in letzteren, die die Protease stabilisieren. Derartige stabilisierende Bestandteile können zumindest teilweise als kleinere Peptide und Aminosäuren identifiziert werden, die hauptsächlich von der Autodigestion der Protease während ihrer fermentativen Herstellung stammen. Jedoch können auch zusätzliche stabilisierende Bestandteile der Kulturbrühe mit unspezifischem Charakter vorhanden sein. Aus Zweckmäßigkeitsgründen wird im folgenden der Ausdruck "Peptid-Fraktion" für diese nicht-proteolytischen Kulturbrühenbestandteile verwendet.
Die Peptidfraktion wird zusammen mit dem Frontpeak A eluiert, wenn das Proteasekonzentrat an einer CMC-Ionenaustauschersäule fraktioniert wird, wie in Verbindung mit der Figur 1 beschrieben wurde.
Der Peptidfraktiongehalt wird aus der folgenden Gleichung berechnet:
I-Gesamt N - %-Protein N
% Peptidfraktion =
0,14
ProteinN der Stickstoffgehalt einer Trichloressigsäure-Ausfällung, hergestellt unter standardisierten Bedingungen, ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die proteolytische Aktivität des Proteasekonzentrats im Bereich von 2 - 20, vorzugsweise von 5-15 Anson-Einheiten (AU) pro g, wobei der Gehalt der Peptidfraktion darin, die sich von der Kulturbrühe ableitet, im Bereich von 2 - 15 Gew.-% liegt.
Im Prinzip kann das Ziel der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Proteaseprodukts, das im wesentlichen frei von der Komponente C ist, dadurch erzielt werden, daß nur die Kompo-
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nente C aus dem Proteasekonzentrat entfernt wird, z. B. durch fraktionelle Ausfällung und/oder selektive Extraktionsverfahren. Jedoch würde, abgesehen davon, daß bisher keine derartige Methode gefunden wurde, jede derartige Methode fast unvermeidbar zu gleichzeitigen Ausbeuteverlusten an Subtilisin führen.
Darüber hinaus würden die Kosten zur Durchführung der Entfernung der Komponente C wesentlich zu den Produktionskosten des endgültigen Proteaseproduktes beitragen. Die Abtrennungsmethode ist daher aus praktischen Gründen nicht vertretbar.
In gleicher Weise spricht die unvermeidliche Anhebung der Produktionskosten gegen jede Methode, die die Entfernung der Komponente C einbezieht, z. B. durch Chromatographie an einer CMC-Ionenaustauschersäule, wie in der Figur 1 dargestellt, nach der die Komponente C einfach entfernt werden könnte, durch Anhalten der Elution, kurz vor dem Auftreten des Peaks C in dem Chromatogramm.
Die vorstehenden Hindernisse zur Herstellung eines weniger allergenen Proteasekonzentrats wurden nunmehr dadurch ausgeräumt, daß ein Verfahren bereitgestellt wurde, bei dem die Komponente C im wesentlichen auf mikrobiologischer Ebene eliminiert wurde, durch Verwendung eines Stammes von B. licheniformis, der mutiert wurde, um im wesentlichen die Syntehese der Komponente C zu blockieren, während die Fähigkeit zur Synthese der Subtilisinkomponente voll erhalten blieb. Kulturen von drei derartigen Mutanten-Stämmen von B. licheniformis wurden beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und mit folgenden HinterIegungsnummern versehen:
NRRL B-11301,
NRRL B-11302 und
NRRL B-11303.
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Die Mutation von B.licheniformis zur Blockierung seiner Synthese der Komponente C unter Beibehaltung seiner Fähigkeit zur Synthese von Subtilisin wurde in folgender Weise durchgeführt. Logarithmisch wachsende Zellen auf einem Medium, das Trypticase (2%), Hefeextrakt (0,5 %), FeCl3.6H2O (0,0007 %), MnCl3.4H2O (ο,οοοΐ %) und MgSO4.7H2O (0,0015 %) beim pH-Wert 7,3 und auf einer Temperatur von 300C gehalten enthielt, wurden nach 5 Stunden geerntet und in Tris-Maleat-Puffer vom pH-Wert 5,7 suspendiert.
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin wurde zur Bildung einer Konzentration von 100 /Uxj/ml zugesetzt, und die Suspension wurde 30 Minuten in einem Wasserbad von 30 C inkubiert. Anschließend an diese Behandlung betrug das Überlebensausmaß 0,1 %.
Die Zellen wurden mehrfach mit dem Puffer gewaschen und anschließend auf Agarplatten ausgebreitet, die mit dem vorstehenden Kulturmedium hergestellt waren.
Selektion der Mutanten
Nach zweitätiger Inkubation bei 37°C wurden ausgeschnittene Agarscheiben, von denen jede eine Mutantenkolonie trug, auf eine Glasplatte in hexagonalen Mustern angeordnet, wonach ein 1 %-Agarosegel auf die Platte gegossen wurde. In einer Öffnung, die zentral in jedes Hexagon geschnitten wurde, wurde eine Probe des spezifischen Antiserums für die Komoponente C gefügt. Die Platte wurde nach eintägiger Inkubation bei 300C untersucht. Mutantenkolonien, die keine Ausfällungslinien zeigten, wurden ausgewählt,durch Subkultivieren gereinigt und anschließend in Schüttelkolben propagiert.
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Weitere_Charakterisierung_der_Komgonente_C
Aminosäure-Analysen
Die etwaige Aminosäurezusammensetzung der Komponente C ist im nachstehenden aufgeführt. Die Bestimmungen unterliegen dem üblichen Fehler von - 10 % der angegebenen Werte. Zu Vergleichszwecken sind die entsprechenden Literaturdaten für Subtilisin selbst in Klammern angegeben-
Lys: 10 (9), His: 8 (5), Arg: 11 (4), Asp: 22 (28), GIu: (12), Thr: 33 (19), Ser: 33 (32), Pro: 13 (9), GIy: 37 (35), AIa: 17 (41), VaI: 16 (31), Leu: 7 (16), Heu: 15 (10), Phe: 6 (4), Tyr: 21 (13), Cys (1/2): 2 (0), Met: 3 (5) , Trp: nicht bestimmt (1), NH3: 27 (25). Gesamtanzahl der Aminosäuren 269 (273), mit Ausnahme von Trp.
Die Aminosäurezusammensetzung der Komponente C zeigt sich als beträchtlich von der des Subtilisins abweichend, wobei der deutlichste Unterschied im Vorhandensein der zwei Cysteinreste (Cys 1/2) in der erstgenannten im Vergleich mit keinem indem letztgenannten liegt. Es gibt bestimmte Anzeichen, daß die Cysteinreste der Komponente C durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die Anwesenheit einer S-S-Brücke in der Komponente C , bei der es sich um einen Glied der Gruppe von Proteasen handelt, die von Bacillus stammen, wäre äußerst ungewöhnlich..
Molekulargewicht
Aus den Zahlen der Aminosäurezusammensetzungen ist ersichtlich, daß die Molekulargewichte der Komponente C und von Subtilisin im gleichen Bereich liegen (die Literaturangabe für letztere liegt bei etwa 27 300).
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InhibierungsUntersuchungen
Im Gegensatz zum Subtilisin wird die Komponente C nicht durch phosphorylierende Mittel, wie Diisopropyl-phosphofluoridat (DFP) oder Phenylmethansulfonyl-fluorid (PMSF) inhibiert. Aus diesen Beobachtungen geht hervor, daß die Komponente C keine Serinprotease ist.
Darüber hinaus zeigt die Tatsache, daß die Komponente C nicht durch chelierende Mittel, wie Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) inhibiert wird, daß es sich nicht um eine Metalloprotease handelt.
Wirkung des pH-Werts auf die Stabilität
Die Komponente C weist im pH-Wertbereich von 9 - 10, dem vorherrschenden pH-Wertbereich von Waschlösungen, eine geringere Stabilität auf, als Subtilisin. Dies bedingt zumindest teilweise die Tatsache, daß die Detergensenzym-Eigenschaften der Komponente C wesentlich schlechter sind, als die des Subtilisins.
Bildung von IgE-Antikörpern in Kaninchen
Lösungen (0,5 ml) von jeder der zu untersuchenden Substanzen Subtilisin (15,1 % Protein N) und Komponente C (13,7 % Protein N) wurden zusammen mit Alhydrogel (Superfos. Copenhagen, 0,5 ml einer 1,3 %igen Emulsion, berechnet als Al3O-) als Adjuvans subkutan an Kaninchen injiziert (24 Tiere in jeder Gruppe). Die Dosierungen der zwei zu vergleichenden Immunogene, ausgedrückt in M.g Protein N, waren gleich. Vergleiche wurden bei 3 Dosierungen durchgeführt, die 0,015, 0,15 bzw 1,5 jucq Protein N ent-
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sprachen.
Den Tieren wurde am 13. Tag nach der ersten Immunisierung Blut entnommen und anschließend wurde am folgenden Tag erneut immunisiert. Dieses Schema wurde an jedem 14. Tage während der gesamten üntersuchungsdauer von 139 Tagen wiederholt.
Passiver kutaner Anaphylaxie(PCA)-Test
Diese Untersuchung wurde nach der von N. J . Zvaifler et al. in Journal of Experimental Medicine, Band 130 (1969), Seite 907 beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt. In den frisch geschorenen Rücken von Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2500 g wurden intradermale Injektionen von 0,2 ml Gesamtserum oder Serumverdünnungen gemacht. Die Untersuchungen wurden dreifach durchgeführt. Nach einer Sensibilisierungsperiode von 72 Stunden wurden die Tiere intravenös mit Antigen + 50 mg Ewans Blue (Merck) gelöst in 5 ml Salzlösung gereizt. Die Reizdosis entsprach 750 u.q Protein N pro Tier.
Die Tiere wurden nach 30 - 60 Minuten mit einer Überdosis von Nembutal getötet und die resultierenden Läsionen wurden gemessen und aufgezeichnet.
Bei einer Dosierung von 0,15 *tg traten die positiven Titer für die Komponente C wesentlich früher und bei einem wesentlich größeren Anteil der Tiere auf, als für Subtilisin.
Beim gleichen Dosierungsniveau lag die Summe der Titergehalte, die durch die Komponente C induziert waren, über 10 Blutnahmen beträchtlich höher, als die des Subtilisins (P </ 0,02). In gleicher Weise erzielte die Komponente C wesentlich höhere Maximaltiter (P 4 0,02).
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Modifizierte Anson-Hämoglobinmethode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität
Bei der Anson-Hämoglobinmethode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität, wird denaturiertes Hämoglobin unter Standard-Bedingungen digeriert. Das nicht-digerierte Hämoglobin wird mit Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt, und die Menge von in TCA löslichem Produkt wird mit dem Folin-Ciocalteu-Phenolreagens bestimmt.
Eine Ansoneinheit (AU) ist die Enzymmenge, die unter Standard-Reaktionsbedingungen Hämoglobin mit einer derartigen Anfangsgeschwindigkeit digeriert, daß pro Minute eine Menge an in TCA löslichem Produkt freigesetzt wird, die die gleiche Färbung mit dem Phenolreagens ergibt, wie 1 Milliäquivalent Tyrosin.
Die Standard-Reaktionsbedingungen sind im folgenden aufgeführt:
Temperatur: 25°C
Reaktionszeit: 10 Minuten
pH-Wert: 7,5
Es sei hierzu hingewiesen auf M. L. Anson, Journal of General Physiology, Band 22 (1939), Seiten 79 - 89 und O. Folin und V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry, Band 73 (1927), Seiten 627 - 636.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung,
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Beispiel 1
Jeder der B.licheniformis-Stänraie NRRL B-11301, B-11302 und B-11303 wurde unter folgenden Bedingungen kultiviert:
Mit Prallwänden versehene 500 ml Erlenmeyer-Kolben wurden mit jeweils 100 ml Substrat versehen. Es wurden folgende Substratzusammensetzungen verwendet:
Substrat 1 Substrat 2 Substrat 3 % (Gew./VoI) % (Gew/Vol) % (Gew/Vol)
Kartoffelstärke Soj abohnenmehl Na3HPO4.12 H2O Pluronic L-61 Tween 80 Barley-Stärke Natriumkaseinat BAN 120 L
Pluronic L-61 ist ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, bei dem es sich um ein Handelsprodukt der Wyandotte Corporation, Michigan, USA, handelt.
Tween 80 ist Polyoxyäthylen-sorbitan-monooleat, ein Handelsprodukt der Atlas Chemical Industries, Delaware, USA.
BAN 120 L ist ein handelsübliches ©6-Amylaseprodukt, erhalten durch Fermentation von B. subtilis, der Novo Industrie A/S, Dänemark.
Die Medien wurden während 50 Minuten von 50 auf 900C und während
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10 ,0 1 12 ,5 10 ,0 1
5 7 ,5 2
1 0 ,5 1
0 0 ,01 0
,0 1 1 ,0 1
5
1
0 0 ,01 0
weiterer 80 Minuten auf 121°C erwärmt, worauf gekühlt wurde.
Die Kolben wurden mit dem B. licheniformis-Stamm inoculiert und anschließend auf einem Rotationsschutteltxsch während 5 Tagen bei 300C mit 240 UpM geschüttelt. Anschließend wurde die Proteaseaktivitat nach der Anson-Methode bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten (AU/kg):
Stamm Substrat 1 Substrat 2 Substrat 3
NRRL B-11301 160 219 153
NRRL B-11302 158 200 155
NRRL B-11303 161 192 150
Proben der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen Kulturbrühen unter Verwendung des Substrats 2 wurden 30 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt, und aliquote Teile von 50 ml wurden auf 37°C erwärmt. 15 g wasserfreies Na3SO4 wurden zu jedem Teil gefügt, und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Die Ausfällung wurde anschließend abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Die resultierenden Proteasekonzentrate wiesen folgende Charakteristika auf:
Stamm proteolytische Protein- Peptidfraktion Aktivität AU/g gehalt % %
B-11301 11 34 8
B-11302 10 35 10
B-11303 10 31 8
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Eine Probe von 5 g des von B. licheniformis NRRL B-11301 erhaltenen Produkts wurde an einer Säule (25 χ 23,5 cm) von 130 g CMC unter analogen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, chromatographiert. Das Chromatogramm wurde durch OD2fl_-Überwachung von 20 ml Fraktionen erhalten, die mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 45 ml/Std. erhalten wurden.
Außerdem wurde eine Lösung (3 % Gew./Gew.) des gleichen Konzentrats einer Agarosegel-Elektrophorese nach der vorstehend beschriebenen Methode unterzogen. Lösungen (1 % Gew./Vol.) von Subtilisin und der Komponente C wurden als Bezugssubstanzen verwendet. Das Chromatogramm und die Elektropherogramme, die in den Figuren 3 bzw. 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, zeigen, daß die einzige in dem Proteasekonzentrat feststellbare Protease (Figur 4, Position III) Subtilisin ist (Position II), wohingegen die Komponente C (Position I) nicht vorhanden ist.
Beispiel 2
Der B. licheniformis-Stamm NRRL B-11301 wurde auf einem Nähragar während 1-2 Tagen bei 37°C in einem Fernbach-Kolben kultiviert. Die Kultur wurde anschließend in einem Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl propagiert , der das nachstehend beschriebene Fermentationssubstrat enthielt. Nach 24 Stunden bei 34°C unter Belüftung und Rühren erhielt man eine dichte Kultur. Diese Kultur wurde anschließend zur Animpfung des Enzym-Produktionsbehälters verwendet.
Die Animpfungskultur (35 1) wurde in einen Fermentations-Behälter aus rostfreiem Stahl eingebracht, der das nachstehend beschriebene Fermentationssubstrat enthielt. Die Fermentations-Bedingungen für sowohl den Animpfungsbehälter, als auch den Hauptbehälter sind im folgenden aufgeführt:
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gesamtes Behältervolumen: Substratvolumen: Belüftungsgeschwindxgkeit: Rühren:
550 1 350 1 300 l/Min.
400 UpM mit einem Turbinenrührer mit 6 Blättern von 28 cm Durchmesser
Temperatur: 34°C 100 g/i
Substrat-Zusammensetzung: Kartoffelstärke 50 g/i
Soj abohnenmehl 10 g/i
Na3HPO4.12H2O 0,1 ml/l
BAN 120 L 1 g/i
P!uronic L-61
Herstellung des Substrats:
Das Substrat wurde während 50 Minuten von 50 auf 95 C erwärmt und anschließend 60 Minuten bei 1210C sterilisiert.
Nach einer Fermentationszeit von 50 Stunden betrug die Protease-Aktivität 160 AU/kg, bestimmt nach der modifizierten Anson-Methode. Die Fermentationsbrühe wurde anschließend auf etwa 5°C gekühlt.
a) Eine Probe der Kulturbrühe aus der vorstehend beschriebenen Fermentation wurde 30 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und anschließend auf 37°C erwärmt. Wasserfreies Na3SO4 (320 g/l) wurde zugesetzt ,und das Gemsich wurde anschließend 30 Minuten gerührt, wobei es noch bei 37 C gehalten wurde. Die Ausfällung wurde anschließend abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Das resultierende Proteasekonzentrat wies folgende Charakteristika auf:
proteolytische Aktivität 8 Aü/g Proteingehalt 20 %
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Peptidfraktion 4 %
Die Chromatographie an CMC und die Agarosegel-Elektrophorese, durchgeführt in gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, zeigten, daß das Proteaseprodukt frei von der Komponente C war und die einzig feststellbare Protease Subtilisin war.
b) Ein zweiter aliquoter Teil der vorstehenden Kulturbrühe wurde 30 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert. Anschließend wurde die überstehende Flüssigkeit abgetrennt. Aceton (3 Volumina) wurde langsam unter kräftigem Rühren zu der überstehenden Flüssigkeit gefügt. Die resultierende Ausfällung wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Das resultierende Proteasekonzentrat wies folgende Charakteristika auf:
proteolytische Aktivität 6 AU/g Proteingehalt 15 %
Peptidfraktion 3 %
Die Chromatographie an CMC und die Agarosegel-Elektrophorese, durchgeführt in gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, zeigten, daß das Proteaseprodukt frei von der Komponente C war und die einzige, feststellbare Protease Subtilisin war.
Beispiel 3
Ein im Handel verwertbares teilchenförmiges Proteaseprodukt wurde folgerndermaßen hergestellt:
Ein Prämix, bestehend aus Enzymkonzentrat (8 AU/g, 25 Gew.-%),
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hergestellt, wie im Beispiel 2 a beschrieben, Polyvinylpyrrolidon (2 %), Polyäthylenglykol 6000 (6 %) und Natriumchlorid (67 %) wurden mit Wasser (8 %) befeuchtet, durch ein Sieb mit Öffnungen mit 0,9 mm stranggepreßt und anschließend wie in der GB-PS 1 362 365 zu Sphären verarbeitet. Das teilchenförmige Produkt wurde in einem Wirbelschichtbett auf einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 0,5 % getrocknet, worauf mit Polyäthylenglykol (4 Gew.-%) überzogen wurde und schließlich mit einem Gemisch (11 %) von Titandioxid und Magnesiumsilikat bestäubt wurde. Das endgültige Enzympräparat wies eine Aktivität von 1,7 AU/g auf.
Beispiel 4
Ein granuläres Proteaseprodukt wurde im wesentlichen, wie in der US-PS 4 106 991 beschrieben, hergestellt.
Fein vermahlenes-Proteasekonzentrat (9 AU/g, 25 Gew.-%), hergestellt wie im Beispiel 2 a, Titandioxid (2 %), Zellulosepulver (1 %) , CEPO S 20 (The Swedish Cellulose Powder and Wood Flour Mills, Ltd.) und fein vermahlenes Natriumchlorid (62 %) wurden in einem Lödige-Mischer, wie im Beispiel 1 der vorstehenden US-PS beschrieben, vermischt.
Das trockene Gemisch wurde mit einer 4,5 %igen wässrigen Lösung von Polyvinylpyrrolidon K 30 (1 Gew.-% des Gesamtgemische) besprüht, das als ein Bindemittel fungierte. In dem Lödige-Mischer wurde das Produkt granuliert, worauf das granulierte Produkt auf einen Feuchtigkeitsgehalt unter 3 % getrocknet wurde. Schließlich wurden die Granulate gesiebt und anschließend mit Polyäthylenglykol überzogen und nach der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise bestäubt. Das so erhaltene Proteasepräparat wies eine Aktivität von 2 AU/g auf.
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Beispiel 5
Die nach den Beispielen 3 und 4 hergestellten teilchenförmigen Proteaseprodukte wurden zur Herstellung von Waschpulverzusammensetzungen mit den folgenden Formulierungen verwendet:
Bestandteil Menge (Gew.-%)
NANSA S 40 S Berol WASC Seife Natriumtripolyphosphat Natriumperborat Natriumsilicat Natrium CMC Optische Aufheller, Duftstoffe pH-Wert einstellende Mittel Proteaseprodukt (1,5 - 2,0 Aü/g) Natriumsulfat, Rest auf 10
30 25
0,5 je nach Bedarf
0,8 100
Bestandteil Menge (Gew.-%)
NANSA S 40 S Berol WASC Seife Natriumtripolyphosphat SASIL Natriumperborat Natriums iIi cat Natrium CMC Optische Aufheller, Duftstoffe pH-Wert einstellende Mittel Proteaseprodukt (1,5 - 2,0 AU/g) Natriumsulfat, Rest auf 10
15 15 25
0,5 je nach Bedarf
0,8 100
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NANSA S 40 S ist ein Natriumalkylbenzol-sulfonat, basierend auf einem "weichen" ("soft") voll-biozersetzlichen Alkylat in Pulverform (Marchon Ltd.).
Berol WASC ist ein nicht-ionischer Alkylphenyl-polyglykoläther (Berol A/B).
SASIL ist ein Natriumaluminium-silicatzeolit des Typs A mit der Formel Na12 (AlO2) 12 (SiO3) 1 2-27H2O (Degussa).
Zusammenfassend betrifft die Erfindung ein neues Proteaseprodukt, das zum Einmischen in Waschzusammensetzungen bzw. Waschmittelzusammensetzungen geeignet ist und wesentlich verringerte allergene Eigenschaften aufweist. Es wird hergestellt durch Kultivieren von Stämmen von Bacillus licheniformis, die mutiert wurden, um ihre Synthese von Proteasen, die sich von Subtilopeptidase A (Subtilisin) unterscheiden, zu blockieren. Die handelsüblichen von Bacillus licheniformis stammenden Proteaseprodukte sind Gemische von Subtilisin und einer nicht-Serin-Protease mit geringerer Stabilität und größerer allergener Wirkung als Subtilisin.
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ORIGINAL INSPECTED

Claims (9)

PATENTANWÄLTE Dr. rer. nat DIETER LOUlS Dipl-Phys. CLAUS PÖHLA'J DlpUng-FRANZ LOrSRENTZ NORNBERQ ICBSLERPLATZ 1 Novo Industrie A/S Novo Allee Bagsvaerd, Dänemark Patentansprüche
1. Protease-Präparat, geeignet zum Einmischen in Waschzusammensetzungen bzw. Waschmittelzusammensetzungen, in das ein von B. licheniformis stammendes Proteasekonzentrat eingearbeitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Proteasekonzentrat, das durch darin enthaltene nicht-proteolytische Peptide aus der Kulturbrühe stabilisiert ist, im wesentlichen frei von nicht-Serin-Protease ist und wesentlich verringerte allergene Eigenschaften im Vergleich mit einem nicht-Serinprotease enthaltenden Proteasekonzentrat aufweist.
2. Proteasepräparat nach Anspruch 1 , in dem 99 % der proteolytischen Aktivität des darin enthaltenen Proteasekonzentrats von dem Subtilisin-Isoenzym-System stammen.
3. Proteasepräparat nach Anspruch 1, in dem das darin enthaltene Proteasekonzentrat mindestens 0,5, vorzugsweise 2-15 Gew.-% an nicht-proteolytischen Peptiden aus der Kulturbrühe ententhält.
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4. Proteasepräparat nach Anspruch 1, in dem die proteolytische Aktivität des darin enthaltenen Proteasekonzentrats im Bereich von 2-20, vorzugsweise von 5-15 Anson-Einheiten pro Gramm liegt.
Verfahren zur Herstellung eines Proteasekonzentrats, das geeignet ist zur Einarbeitung in Proteasepräparate, die zum
Einmischen in Waschzusammensetzungen bzw. Waschmittelzusammensetzungen geeignet sind, wobei das Proteasekonzentrat im wesentlichen frei von nicht-Serin-Protease ist und wesentlich verringerte allergene Eigenschaften im Vergleich mit
einem nicht-Serin-Protease enthaltenden Proteasekonzentrat aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von B. licheniformis, der so mutiert wurde, daß seine Fähigkeit zur Synthese anderer Proteasen als Subtilisin blockiert wurde, in einem Nährmedium kultiviert wird, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor enthält, worauf das
Proteasekonzentrat, das Subtilisin und aus der Kulturbrühe stammende Peptide enthält, gewonnen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den mutierten Stamm von B. licheniformis auswählt aus Stämmen mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-11301, B-11302 und
B-11303.
7. B. licheniformis-Stamm, der mutiert ist, so daß seine Fähigkeit zur Synthese von nicht-Serin-Protease im wesentlichen blockiert ist, wohingegen seine Fähigkeit zur Synthese von Subtilisin erhalten ist.
8. B. licheniformis-Stamm nach Anspruch 7, ausgewählt aus den Stämmen mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-11301, B-11302 und B-11303.
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9. Waschzusammensetzung bzw. Waschmittelzusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge des Proteasepräparats nach Anspruch 1 .
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