DE3787009T2

DE3787009T2 - Von bazillen abgeleitete alkalinprotease und deren benutzung.

Info

Publication number: DE3787009T2
Application number: DE87905616T
Authority: DE
Inventors: Sven Branner; Claus Dambmann; Helle Outtrup
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1986-08-14
Filing date: 1987-08-14
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2007-08-15
Also published as: JP2559439B2; DK386586D0; DK197388D0; JPH01500642A; EP0277216B1; DE3787009D1; EP0277216A1; ATE92957T1; DK158233C; DK197388A; WO1988001293A1; DK158233B

Description

Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf eine neuartige Alkalinproteasezubereitung mit erhöhter Oxidationsstabilität auf ein Verfahren zur Herstellung derselben und auf ihre Benutzung als ein Zusatzstoff für Reinigungsmittel. Typische Reinigungsmittel sind Waschmittelzusammensetzungen für das Waschen von Textilien.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Proteolytische Enzyme, die durch Kultivierung von Angehörigen der Gattung Bacillus in geeigneten Nährstoffmedien hergestellt werden, werden in breitem Umfang in Waschmittelzusammensetzungen verwendet. Beispiele solche kommerziellen Proteaseprodukte sind ALCALASE, ESPERASE und SAVINASE (diese sind eingetragene Warenzeichen), alle geliefert von NOVO Industri A/S (jetzt Novo Nordisk A/S) Dänemark. Diese zeigen angemessene Lagerstabilität in der Gegenwart der üblichen Bestandteile von Waschmittelzusammensetzungen , wie etwa Maskierungsmittel, oberflächenaktive Mittel und sogar Bleichmittel vom Peroxy- Typ, vorausgesetzt daß sie in geeigneter Weise vor ihrer physischen Umgebung in der Waschmittelzusammensetzung geschützt sind, z. B. durch ihren Einbau in in geeigneter Weise beschichtete Teilchen.
Im Textilwaschverfahren jedoch, in dem das löslichgemachte Enzym denselben Mitteln in Lösung ausgesetzt ist, kann Stabilität in dem Sinne kritisch werden, daß das Enzym anfällig ist für Zerstörung vor Vollendung seiner beabsichtigten fleckentfernenden Wirkung, insbesondere bei erhöhten Temperaturen in der Gegenwart von Bleichmitteln des Peroxy-Typs, wie etwa Percarbonat-, Perborat- und Persulfat-Salzen. Da alle von Bacillus abgeleiteten Proteasen, die in der Technik bekannt sind, eine merkliche Instabilität bei Textilwaschtemperaturen, die 50ºC übersteigen- in der Gegenwart einer Peroxy-Verbindung zeigen, wird oft empfohlen, das Waschprogramm zu verlängern, indem eine Haltezeit bei niedriger Temperatur einbezogen wird, wenn Waschmittelproteasezusammensetzungen verwendet werden.
Versuche, die Stabilität von Bacillus abgeleiteten Serin-Proteasen gegenüber oxidierenden Mitteln durch Anwendung der Technik der ortsspezifischen Mutation der entsprechenden Gene zu erhöhen, sind in der Technik bekannt, z. B. aus der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 130 756, die stabilisierte Subtilisine offenbart, indem der zum Aktivstellen-Serinrest nächste Methioninrest durch Aminosäurereste ersetzt wird, die weniger anfällig für Oxidation sind. Die mit der Anpassung rekombinanter DNA-Strategien an Herstellungsverfahren im Großmaßstab in Zusammenhang stehenden Hindernisse sind jedoch gut bekannt, wobei die häufigsten Instabilität des gentechnisch veränderten Mikroorganismus durch Verlust von genetischem Material und niedrigere Ausbeuten, verglichen mit denjenigen, die von dem Wildstamm oder seinen herkömmlichen Mutanten erhalten werden, sind.
Soweit den jetzigen Erfindern bewußt ist, schweigt sich der Stand der Technik aus über von nicht gentechnisch verändertem Bacillus abgeleitete Serin-Proteasen, die eine erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation zeigen, verglichen mit kommerziellen Bacillus-Proteasen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die obengenannten Instabilitätsprobleme zu überwinden, die bei den von Bacillus abgeleiteten Alkalinproteasezubereitungen, die bisher bekannt sind, angetroffen werden. Gemäß der Erfindung ist diese Aufgabe dadurch gelöst, daß überraschenderweise festgestellt worden ist, daß eine Anzahl von Bacillus-Stämmen, die zu dem gehören, was gegenwärtig als dieselbe neue Spezies definiert wird, Alkalinprotease produzieren, die eine merkbar erhöhte Stabilität gegenüber Bleichmitteln vom Peroxy-Typ, die herkömmlicherweise zum Waschen von Textilien verwendet werden, zeigt.
Normalerweise wird die Alkalinprotease, die von der neuartigen Bacillus-Spezies dieser Erfindung produziert wird, drei hauptsächliche konstituierende, voneinander unterscheidbare Alkalinproteasen (hier bezeichnet als A, B und C), oft in Anteilen, gemessen in Proteaseaktivitätseinheiten, von grob jeweils einem Drittel. Variantenstämmen kann jedoch die Fähigkeit fehlen, wenigstens eine dieser konstituierenden Proteasen zu produzieren. Zufälligerweise zeigen alle drei konstituierenden Proteasen ähnliche Waschkraft und Stabilitäteigenschaften.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit eine Proteasezubereitung zur Verfügung, die von einer neuartigen alkalophilen Bacillus-Spezies, definiert durch den Stamm NCIB 12288 und NCIB 12289, ableitbare Alkalinprotease umfaßt, wobei die Alkalinprotease eine Restaktivität, gemessen in Casein Protease Units (CPU) nach 30 Minuten bei pH 9,5 in einer Lösung von 1,75 g/l Natriumtripolyphosphat (STPP), 1,0 g/l Natriumperborat und 0,1 g/l Tetraacetylethylendiamin (TA- ED), von wenigstens 80 bzw. 60% bei Temperaturen von 40ºC bzw. 50ºC der Restaktivität bei 25ºC in der Abwesenheit von Natriumperborat und TAED beibehält, wobei die Protease ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 41,5 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 9,3, ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 28,5 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 8,8 oder ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 30,0 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 5,2 besitzt, wobei die Protease immunchemische Nicht-Identität zu bekannten alkalischen Bacillus-Proteasen zeigt, nämlich "ALCALASE" (abgeleitet von Bacillus licheniformis, mit Subtilisin Carlsberg als dem aktiven Bestandteil), "SAVINASE" und "ESPERASE" (hergestellt aus alkalophilem Bacillus sp., gemäß U.S.-Patent Nr. 3723250) und "API-21" (U.S.-Patent Nr. 4480037)
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Proteasezubereitung zur Verfügung, die wenigstens 10% nach Aktivität in CPU einer konstituierenden Protease A umfaßt, die immunochemisch identisch zu der Protease ist, die durch die Position von Peak A in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen identifiziert ist, und die folgenden zusätzlichen Merkmale besitzt: ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 41,5 kD, einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 9,3, eine spezifische Aktivität von wenigstens 150 Anson Units und 250 Hemoglobin Protease Units (AU bzw. HPU) pro g Protein und eine Restaktivität, gemessen in CPU nach 30 Minuten bei pH 9,5 in einer Lösung von Natriumtripolyphosphat (STPP, 1,75 g/l), Natriumperborat (1,0 g/l) und Tetraacetylethylendiamin (TAED, 0,1 g/l), von wenigstens 80 bzw. 60% bei Temperaturen von 40ºC bzw. 50ºC der Restaktivität bei 25ºC in der Abwesenheit von Natriurrtperborat und TAED und immunchemische Nicht-Identität mit bekannten alkalischen Bacillus-Proteasen zeigt, nämlich "ALCALASE", (abgeleitet von Bacillus licheniformis, mit Subsilisin Carlsberg als dem aktiven Bestandteil), "SAVINASE", und "ESPERASE" (hergestellt aus alkalophilem Bacillus sp. gemäß U.S.-Patent Nr. 3723250) und "API-21" (U.S.-Patent Nr. 4480037)
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Proteasezubereitung im wesentlichen frei von den Proteasen B und C, identifiziert durch Peak B in Fig. 1 bzw. durch Peak C von Fig. 1 und 2.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Ausgleich der Proteaseaktivität zusammen von besagten Proteasen B und C oder einzeln durch eine von diesen bereitgestellt. Immunchemisch sind die Proteasen B und C identisch zueinander und verschieden von Protease A. Protease B und C haben Molekulargewichte von etwa 28,5 bzw. 31 kD und isoelektrische Punkte von etwa 8,8 bzw. 5,2.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Proteasezubereitung zur Verfügung, die im wesentlichen besagte Protease B umfaßt.
Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auf eine Proteasezubereitung gerichtet, die im wesentlichen besagte Protease C umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Proteasezubereitung zur Verfügung gestellt, welches gekennzeichnet ist durch Kultivieren eines Stammes der neuartigen Bacillus-Spezies, definiert durch die Stämme NCIB 12288 und NCIB 12289, unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthält, vorzugsweise gefolgt von Gewinnung der Proteasezubereitung aus der Fermentationsbrühe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Herstellung der Proteasezubereitung wird die Fermentation mit einem Stamm der oben definierten Bacillus-Spezies durchgeführt, welcher so mutiert ist, daß seine Fähigkeit, eine oder zwei der konstituierenden Proteasen zu synthetisieren, im wesentlichen blockiert ist, während seine Fähigkeit, die übrigbleibende(n) konstituierende(n) Protease oder Proteasen zu produzieren, beibehalten ist.
In einer anderen bevorzugten Art und Weise der Herstellung der Proteasezubereitung wird die Fermentation mit einem Bacillus- Stamm durchgeführt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus NCIB 12288 , NCIB 12289, NCIB 12512 und NCIB 12513 besteht.
Gemäß einem noch anderen Aspekt wird ein Reinigungsmittel zur Verfügung gestellt, das eine wirksame Menge, vorzugsweise wenigstens 0,1 AU, bevorzugter von 0,5 bis 10 AU, der Proteasezubereitung dieser Erfindung pro 100 g Reinigungsmittel enthält. Das Reinigungsmittel kann ein Pulver oder eine Flüssigkeit sein, wobei die Proteasezubereitung geschützt ist, z. B. durch Einbau in Granulatkörner oder als eine Suspension in einem hydrophoben Medium.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das Elutionschromatogramm der von NCIB 12289 abgeleiteten Proteasezubereitung auf einer CM Sepharose® CL 6B- Säule, im Anschluß an Gelfiltration auf Sephadex® G 25.
Fig. 2 zeigt Affinitätschromatographie von Protease C auf einer Bacitracin-Säule.
Figs. 3 und 4 sind beispielhaft für die pH-Aktivitäts- bzw. Temperaturaktivitätskurven der Proteasezubereitung dieser Erfindung, wobei alle Proteasebestandteile ähnliche Temperatur- und pH-Aktivitätseigenschaften zeigen.
Figs. 5 und 6 veranschaulichen die Ergebnisse von Vergleichswaschexperimenten, die mit der Proteasezubereitung dieser Erfindung und ALCALASE unter Verwendung zweier unterschiedlicher Waschmittel durchgeführt wurden. Experimentelle Bedingungen sind in Beispiel 5 weiter unten angegeben.
Fig. 7 veranschaulicht die Ergebnisse von Waschexperimenten, die mit jeder der konstituierenden Proteasen durchgeführt wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Mikroorganismus, Taxonomie. Morphologie, biochemische Reaktionen

Der Mikroorganismus:

Die die Alkalinprotease der vorliegenden Erfindung produzierenden Mikroorganismen wurden im wesentlichen mit dem Verfahren zur Selektion von alkalophilen Bacilli isoliert, das im britischen Patent Nr. 1,243,784 beschrieben ist. Sie werden nicht auf für Bacillus-Stämmen üblichen Medien wachsen, sofern diese nicht durch entweder 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,0-9,7 oder eine 7-10% (w/v) Lösung von NaCl ergänzt sind, wobei der 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,0 der bevorzugte Ergänzungsstoff ist. Zwei Kulturen sind bei The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, United Kingdom, für die Zwecke von Patentverfahren am unten angegebenen Datum hinterlegt worden. NCIB, die eine internationale Hinterlegungsstelle ist, die nach dem Budapester Vertrag von 1977 autorisiert ist, gewährleistet Dauerhaftigkeit der Hinterlegung und Zugänglichkeit zu dieser durch die Öffentlichkeit gemäß den Regeln 9 bzw. 11 des obigen Vertrages. Hinterlegungsdatum Bezugszeichen des Herstellers NCIB-Bezeichnung 8. Juli 1986 5. August 1987

Taxonomie:

Medium TY wurde für taxonomische Untersuchungen verwendet, die gemäß den Verfahren von Ruth Gordon et al. durchgeführt wurden (The Genus Bacillus, Agriculture Handbook No. 427, U.S.D.A. 1973)
Zusammensetzung von Medium TY:
Trypticase 20 g
Hefeextrakt 5 g
FeCl&sub3;·6H&sub2;O 7 mg
MnCl&sub2;·4H&sub2;O 1 mg
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 15 g
destilliertes H&sub2;O auf 1000 ml
pH eingestellt auf 7,3 mit KOH vor Autoklavierung für 15 Minuten bei 121ºC.
Flüssige Medien für die Bestimmung der Produktion von Säure aus Kohlehydraten wurden mit 10% Nacl vor dem Autoklavieren ergänzt.
Feste Medien wurden mit 2% Agar vor dem Autoklavieren ergänzt und steriler Carbonatpuffer pH 9,0 wurde aseptisch auf eine Endkonzentration von 0,1 M unmittelbar vor dem Gießen der Schrägplatten zugesetzt.
Die Mikroorganismen dieser Erfindung sind aerobe, sporenbildende Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören.
Morphologie: Vegetative Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,6-0,8 Nikron, Länge 1,2-3 Mikron.
Sporen: Zentral bis subterminal, oval, die Sporangia nicht aufquellend. Biochemische Reaktionen: NCIB 12288 NCIB 12289 Produktion von Katalase Acetoin (VP-Test) Indol Anerobes Wachstum bei 50ºC in 7% NaCl Wachstum bei pH 5,7 Hydrolyse von Stärke Hippurat Casein Tyrosin Phenylalanin Nitrat zu Nitrit Säure aus Glucose Saccharose Xylose Mannit
Keiner der Stämme NCIB 12288 und NCIB 12289 produzierte Säure aus Arabinose, Mannose, Melibiose, Raffinose oder Sorbit.
Optimale Wachstumsbedingungen sind 30-37ºC, pH 9,0.
Die obigen taxonomischen Ergebnisse zeigen, daß die zwei Stämme nicht zu irgendeiner zuvor beschriebenen Spezies gehören, sondern so angesehen werden sollten, daß sie eine neuartige Bacillus-Spezies definieren. Taxonomische Daten für Stämme NCIB 12512 und NCIB 12513 sind sehr ähnlich zu den obigen, was darauf hinweist, daß alle vier Stämme zur selben Spezies gehören.

Test auf proteolytische Aktivität

OPA-Casein-Methode

Proteolytische Aktivität wird mit Casein als dem Substrat bestimmt. Eine Casein Protease Unit (CPU) ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 mmol primäre Aminogruppen (bestimmt durch Vergleich mit einem Serin-Standard) pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. Inkubation für 30 Minuten bei 25ºC und pH 9,5, freisetzt.
Eine 2% (w/v) Lösung von Casein (Hammarsten, geliefert von Merck AG, West-Deutschland) wird mit dem auf pH 9,5 eingestellten Universal-Puffer, der von Britton und Robinson (Journ.Chem.Soc. 1931, S. 1451) beschrieben ist, hergestellt.
Zwei ml Substratlösung werden in einem Wasserbad für 10 Minuten bei 25ºC vorinkubiert. 1 ml Enzymlösung&sub1; die b g/ml Enzymzubereitung enthält, was etwa 0,2-0,3 CPU/ml Britton-Robinson- Puffer (pH 9,5) entspricht, wird zugesetzt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 25ºC wird die Reaktion durch Zugabe eines Stopmittels (5 ml einer Lösung, die Trichloressigsäure (17,9 g), Natriumacetat (29,9 g) und Essigsäure (19,8 g) enthält, aufgefüllt mit entionisiertem Wasser auf 500 ml) abgebrochen. Eine Blindprobe wird in derselben Art und Weise wie die Testlösung hergestellt, ausgenommen daß das Stopmittel vor der Enzymlösung zugegeben wird.
Die Reaktionsmischungen werden für 20 Minuten in dem Wasserbad gehalten, woraufhin sie durch Papierfilter Whatman® 42 filtriert werden.
Primäre Aminogruppen werden durch ihre Farbentwicklung mit o- Phthaldialdehyd (OPA) bestimmt.
Dinatriumtetraborat-Decahydrat (7,62 g) und Natriumdodecylsulfat (2,0 g) wird in 150 ml Wasser gelöst. OPA (160 mg), gelöst in 4 ml Ethanol, wird dann zusammen mit 400 ul Beta-Mercaptoethanol zugegeben, woraufhin die Lösung mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt wird.
Zum OPA-Reagenz (3 ml) werden 400 ul der oben genannten Filtrate unter Vermischen zugegeben. Die optische Dichte (OD) bei 340 nm wird nach etwa 5 Minuten gemessen.
Der OPA-Test wird auch mit einem Serin-Standard durchgeführt, der 10 mg Serin in 100 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 9,5) enthält. Der Puffer wird als eine Blindptobe verwendet.
Die Proteaseaktivität wird aus den Messungen der optischen Dichte mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
CPU/g Enzymzubereitung =
CPU/g Enzymzubereitung = CPU/ml: b
in der ODt, ODb, ODser und ODB die optische Dichte der Testlösung, der Blindprobe, des Serin-Standards bzw. des Puffers, Cser die Konzentration von Serin in mg/ml im Standard, MWser das Molekulargewicht von Serin ist. Q ist der Verdünnungsfaktor (in diesem Falle gleich 8) für die Enzymlösung und ti ist die Inkubationszeit in Minuten.

OPA-Hämoglobin-Methode

Proteolytische Aktivität wird bestimmt mit mit Harnstoff denaturiertem Hämoglobin als dem Substrat. Eine Hemoglobin Protease Unit (HPU) ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 mmol primäre Aminogruppen (bestimmt durch Vergleich mit einem Serin-Standard) pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. Inkubation für 30 Minuten bei 25ºC und pH 9,5, freisetzt.
Eine 2% (w/v) Lösung von mit Harnstoff denaturiertem Hämoglobin wird mit 0,2 M Boratpuffer hergestellt, eingestellt auf pH 9,5.
2 ml Substratlösung werden in einem Wasserbad für 10 Minuten bei 25ºC vorinkubiert. 1 ml Enzymlösung, die b g/ml Enzymzubereitung enthält, was etwa 0,2-0,3 HPU/ml Boratpuffer entspricht, wird zugegeben. Inkubation, Abbruch der Reaktion und Bestimmung der primären Aminogruppen mit Hilfe des OPA-Reagenz sind dieselben, wie oben für die OPA-Casein-Methode beschrieben.
Der OPA-Test wird auch mit einem Serin-Standard durchgeführt, der 10 mg Serin in 100 ml des Boratpuffers enthält, wobei der Puffer selbst als eine Blindprobe dient.
Die Proteaseaktivität in HPU wird aus einer Formel berechnet, die identisch zu derjenigen ist, die in der OPA-Casein-Methode verwendet wird.

Modifizierte Anson-Hämoglobin-Methode

In der Anson-Hämoglobin-Methode für die Bestimmung von proteolytischer Aktivität wird denaturiertes Hämoglobin unter Standardbedingungen verdaut. Das nicht-verdaute Hämoglobin wird mit Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt und die Menge an in TCA löslichem Produkt wird mit Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz bestimmt.
Eine Anson Unit (AU) ist die Menge an Enzym, die unter Standardreaktionsbedingungen Hämoglobin mit einer solchen Anfangsgeschwindigkeit verdaut, das pro Minute eine Menge an in TCA löslichem Produkt freigesetzt wird, die dieselbe Farbe mit Phenolreagenz ergibt, wie ein Miliäquivalent Tyrosin.
Die Standardreaktionsbedingungen sind die folgenden: Temperatur 25ºC; Reaktionszeit 10 Minuten; pH 7,5.
Für weitere Bezugnahme, siehe M.L. Anson, Journal of General Physiology Bd. 22 (1939), S. 79-80; O. Folin and V. Ciocalteu, The Journal of Biological Chemistry Bd. 73 (1972), S. 627-636.
Verschiedene Werte für proteolytische Aktivität werden stets in Abhängigkeit von der Wahl der analytischen Methode erhalten werden. Während der OPA-Casein-Test zur Überwachung proteolytischer Aktivität für Laboratoriums- und Produktionszwecke geeignet ist, könnte man sagen, daß proteolytische Aktivität gegenüber einem Porphyrin enthaltenden Substrat, wie etwa Hämoglobin, wegen der im allgemeinen angetroffenen
Schwierigkeiten bei der Entfernung von Flecken aus Blut und Chlorophyll relevanter für die Bestimmung der Nützlichkeit einer Waschmittelprotease ist. Eine hoch spezifische Aktivität einer Waschmittelprotease gegenüber Porphyrin enthaltenden Substraten ist wünschenswert.

Die Proteasezubereitung

Die die Protease dieser Erfindung produzierenden Bacillus- Stämme werden unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium kultiviert, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit anderen essentiellen Nährstoffen enthält, wobei das Medium gemäß den Prinzipien des bekannten Standes der Technik zusammengesetzt ist.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie etwa Saccharose, Glucose und Stärke, oder Kohlehydrate enthaltende Materialien, wie etwa Getreidekörner, Malz, Reis und Sorghum. Polysaccharide werden üblicherweise durch geeignete hydrolysierende Enzyme vor dem Fermentationsprozeß wenigstens teilweise in fermentierbare Zucker umgewandelt. Die Kohlehydratkonzentration, die in das Medium einbezogen ist, kann in breitem Umfang variieren, z. B. hoch bis zu 25% und herunter bis zu 1-5%, aber üblicherweise werden 5-15% geeignet sein, wobei die Prozentangaben als Glucose-Äquivalente berechnet sind.
Die Stickstoffquelle im Nährstoffmedium kann von anorganischer und/oder organischer Natur sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen wird eine ganze Anzahl regelmäßig in Fermentationsprozessen verwendet, die die Kultivierung von Bakterien mit sich bringen. Veranschaulichende Beispiele sind Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Casein, Cornsteep-Liquor, Hefeextrakt, Harnstoff und Albumin. Zusätzlich sollte das Nährstoffmedium auch die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die optimale Temperatur für die Vermehrung der Bacillus-Stämme und für ihre Produktion von Protease wird routinemäßig von dem Fachmann festgestellt. Die Kultivierung kann im Temperaturbereich von 25ºC bis 35ºC durchgeführt werden, vorzugsweise bei alkalischen pH-Werten. Die letzteren können erhalten werden durch Zugabe geeigneter Puffer, wie etwa Natriumcarbonat oder Mischungen von Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat, nach Sterilisierung des Nährstoffmediums. Zur Kultivierung in Tankfermentern ist es notwendig, künstliche Belüftung zu verwenden. Die Belüftungsrate ist ähnlich derjenigen, die bei herkömmlicher Tankfermentation verwendet wird.
Nach der Fermentation können flüssige Enzymkonzentrate durch Entnahme von Grobmaterial aus der Brühe und, falls gewünscht, Konzentration durch Eindampfen bei niedriger Temperatur oder durch Umkehrosmose hergestellt werden. Schließlich können Konservierungsstoffe zum Konzentrat zugesetzt werden.
Feste Enzymzubereitungen können aus der gereinigten und/oder konzentrierten Brühe durch Ausfällung mit Salzen, wie etwa Na&sub2;SO&sub4;, oder mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie etwa Ethanol oder Aceton, hergestellt werden; Entfernung des Wassers in der Brühe durch geeignete Trocknungsmethoden, wie etwa Sprühtrocknung, kann ebenfalls eingesetzt werden.
Die proteolytische Aktivität der so erhaltenen Proteasezubereitung ist üblicherweise im Bereich von 0,1 bis 10 CPU/g.
Die pH-Aktivitäts- und Temperaturaktivitätskurven von Protease gemäß dieser Erfindung sind in Fig. 1 und 2 dargestellt. Die verwendete Probe war die in Beispiel 1 unten hergestellte, und Aktivität wurde mit der oben beschriebenen CPU-Methode bestimmt, ausgenommen daß pH oder Temperatur verändert wurde. Die Kurven zeigen, daß optimaler pH mit Casein als Substrat etwa 6 bis 11 ist und daß optimale Temperatur für 30 Minuten- Reaktion etwa 50-60ºC ist.

Reinigung von konstituierenden Proteasen

Die erste, zweite und dritte Protease (hier im weiteren als Protease A, Protease B bzw. Protease C bezeichnet) können durch dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannte Trenntechniken getrennt und gereinigt werden.
Eine anfängliche Reinigung der rohen Protease kann durch Auflösung z. B. in einem geeigneten Puffer, gefolgt von Proteinausfällung, z. B. mit einem Salz, wie etwa (Na&sub4;)&sub2;SO&sub4;&sub1; oder einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton, bewirkt werden.
Weitere Reinigung des gewonnenen Niederschlags wird üblicherweise erreicht durch chromatographische Methoden, z. B. einschließlich Gelfiltration in einem Puffersystem als der Anfangsschritt. Protease enthaltende Fraktionen des Eluats können durch Überwachen der UV-Extinktion und/oder durch Bestimmen der Proteaseaktivität lokalisiert werden.
Im Anschluß an die Gelfiltration wird weitere Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf einem Sephade®-Anionen- oder -Kationenaustauscher, erreicht, wodurch wenigstens teilweise Auflösung der konstituierenden Proteasen durch Verwendung geeigneter Puffer-Salz-Gradientensysteme bewirkt werden kann. Die erneute Chromatographie von Peakmaterial daraus mit Hilfe desselben oder eines verschiedenen Ionenaustauschers liefert üblicherweise die Protease-Spezies in einem genügend reinem Zustand. Falls erforderlich, kann weitere Reinigung der einzelnen Proteasen dadurch erreicht werden, daß man sie Affinitätschromatographie, z. B. auf einer Bacitracin-Säule, unterwirft.
Reinigung der konstituierenden Proteasen wird geeigneterweise durch Gelelektrophorese überwacht, z. B. in einem Polyacrylamidgel (PAGE) mit oder ohne Natriumdodecylbenzolsulfonat (SDS). Selbstverdauung der Proteasen kann durch Aktivstellenblockierung vor der Elektrophorese verhindert werden, z. B. mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF).
SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF) in Gegenwart von Markerproteinen sind geeignete Mittel zur Bestimmung von Molekulargewicht (MW) bzw. isoelektrichem Punkt (pI). Gemäß diesen Methoden haben die Proteasen A, B und C Molekulargewichte von etwa 41,5, 28,5 bzw. 31,0 kD und die isoelektrischen Punkte von etwa 9,3, 8,8 bzw. 5,2. Protease A ist weiter gekennzeichnet durch spezifische Aktivitäten pro Gramm Protein von etwa 180 AU/g und 270 HPU/g.

Immunchemische Charakterisierung

Monospezifische Antiseren gegen jede der gereinigten Proteasen können z. B. durch Immunisieren von Kaninchen gemäß der Vorschrift gezüchtet werden, die von N. Axelsen et al. in: A manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, beschrieben ist. Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren erhalten, z. B. durch Salzausfällung ((NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex.
Immunchemische Charakterisierung von Proteinen wird üblicherweise entweder durch Ouchterlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655-706) oder durch Kreuzimmunelektrophorese (N. Axelsen et al., aaO, Kapitel 3 und 4) durchgeführt.
Die Proteasen B und C der Erfindung zeigen untereinander immunchemische Identität und beide zeigen Nicht-Identität zu Protease A. Die Proteasen A, B und C der Erfindung zeigen alle immunchemische Nicht-Identität zu den folgenden bekannten alkalischen Bacillus-Proteasen:
- Alcalase (Produkt von Novo Industri A/S, Dänemark), abgeleitet von Bacillus licheniformis, mit Subtilisin Carlsberg als dem aktiven Bestandteil.
- Savinase und Esperase (Produkte von Novo Industri A/S), hergestellt aus alkalophilem Bacillus sD. gemäß US 3,723,250.
- API-21 (U.S.-Patent 4,480,037).
- Die Protease der dänischen Patentanmeldung Nr. DK 87/0544.

Reinigungsmittel

Reinigungsmittel gemäß der Erfindung ist typischerweise ein Textilwaschmittel in flüssiger oder Pulverform. Im Fall eines flüssigen Waschmittels kann die Stabilität der Protease während der Lagerung unbefriedigend sein und es ist daher bevorzugt, Enzymstabilisatoren in der Formulierung einzuschließen. Die flüssige Formulierung kann somit Polyole, wie etwa 1,2- Propandiol (Propylenglykol), typischerweise 1-20%, einschließen. Fakultativ kann die Formulierung Borsäure (oder alternativ Boroxid, Borax oder ein Borak), typischerweise bis zu 10%, einschließen. Ebenfalls fakultativ kann Formiat oder ein Salz einer anderen niederen Fettsäure eingeschlossen sein, z. B. in einer Menge von bis zu 10%. Der Calciumgehalt im flüssigen Waschmittel kann von 0,001 bis 0,1% liegen (alle % gewichtsbezogen).

Beispiel 1

Proteasezubereitung, abgeleitet von Stamm NCIB 12289

Zellen von Bacillus-Stamm NCIB 12289 wurden geerntet nach zweitägiger Inkubation bei 30ºC von Schrägplatten aus TY-Agar, aseptisch ergänzt mit 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,0 und 1% Magermilch. Die Zellen wurden in unterteilte 500 ml-Rüttelkolben überführt, die 100 ml BP-X-Medium + 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,0 enthielten.
Medium BP-X:
Kartoffelstärke 100 g
Gerstenmehl 50 g
Sojabohnenmehl 20 g
Na-Caseinat 10 g
Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O 9g
TERMAMYL® 60L (NOVO) 0,1 g
PLURONIC® 0,1 g
Leitungswasser auf 1000 ml
Die Mischung wurde langsam über 30 Minuten unter Bewegung von 60ºC auf 85ºC erwärmt, um die Stärke zu verflüssigen. Die Mischung wurde dann schnell erhitzt und oberhalb 95ºC für 10 Minuten gehalten, bevor sie abgekühlt, in die Rüttelkolben verteilt und für 40 Minuten bei 121ºC autoklaviert wurde.
Die beimpften Rüttelkolben wurden für 4 Tage bei 25ºC auf einem Drehrüttler bei 240 UPM inkubiert. Die Fermentationsbrühe (2,5 l, 54 CPU/l, wie getestet durch die OPA-Casein-Methode) wurde für 30 Minuten bei 4000 UPM zentrifugiert. Die zentrifugierte Flüssigkeit (2,0 l) wurde durch Ultrafiltration auf einem Mini-Lab-Modul von DDS, RO-Division, Dänemark, auf 1,0 l konzentriert. Nach der Konzentration wurde sie mit 5,0 l 0,01 molarem Natriumborat, pH 9,0, gewaschen und schließlich weiter auf 400 ml konzentriert. Sie wurde dann lyophilisiert, was 25,5 g Rohzubereitung mit einer Aktivität von 3,0 CPU/g ergab. Ausbeute: 57%.

Beispiel 2

Trennung der konstituierenden Proteasen A, B und C

Fermentation mit NCIB 12289 wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 ausgeführt. Die Kulturbrühe (75 AU/kg) wurde durch die folgenden Schritte gereinigt:
- Ausflockung
- Zentrifugation
- Eindampfen
- Blankfiltration
- Salzausfällung mit Na&sub2;SO&sub4;
- Erneute Auflösung
- Blankfiltration
- Sterilfiltration
- Konzentration durch Ultrafiltration und Waschen
- Lyophilisation
Die lyophilisierte rohe Zubereitung (Aktivität 15,3 CPU/g oder 24,5 AU/g) wurde gereinigt und durch die folgende Sequenz von Schritten in die konstituierenden Proteasen aufgetrennt.

1. Erneute Auflösung

2,5 g Protease wurden gelöst in 50 ml des folgenden Puffers:
Dimethylglutarsäure 0,01 M
Borsäure 0,1 M
Calciumchlorid 0,002 M
Natriumhydroxid auf pH 7,0

2. Zentrifugation

Die erneut gelöste Protease wurde bei 18.000 UPM bei 25-30ºC für 20 Minuten zentrifugiert.

3. Filtration

Der Überstand wurde auf Whatman-Glasfilter Typ GF/F filtriert, 42 ml geklärte Proteaselösung wurden gesammelt.

4. Gelfiltration auf Sephadex G 25 Medium

40 ml geklärte Proteaselösung wurden auf eine G 25-Säule (5 cm ·22,6 cm) aufgebracht, die mit dem in Schritt 1 verwendeten Puffer äquilibriert worden war. 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt, mit einem Durchfluß von 3,3 ml/min, und auf Aktivität getestet. Fraktionen 19-25, die 54% der aufgebrachten Aktivität umfaßten, wurden gepoolt, auf 100 ml verdünnt und auf Millipor 0,45 u-Filter Typ HA filtriert.

5. Ionenaustauschchromatographie auf CM Sepharose CL 6B

Das filtrierte Eluat wurde auf eine CM Sepharose CL 6B-Säule (5 cm ·7,8 cm) aufgebracht, die mit dem in Schritt 1 verwendeten Puffer äquilibriert worden war. Protease C und gefärbte Substanzen wurden mit demselben Puffer aus der Säule ausgewaschen. Die anderen Bestandteile wurden mit einem 0-0,05 M NaCl-Gradienten in 2 l desselben Puffers eluiert. 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt, mit einem Durchfluß von 3,3 ml/min, und durch UV-Extinktion überwacht. Der Gradient wurde nach Fraktion 37 begonnen. Die UV-absorbierenden Fraktionen 5-40 und 71-150 wurden auf Proteaseaktivität getestet. Die Proteaseaktivität wurde in 3 charakteristischen Peaks gefunden, wie in Fig. 1 zu sehen.
Fraktionen 9-25, die 23,1% der aufgebrachten Aktivität umfaßten, wurden gepoolt (Protease C).
Fraktionen 76-98, die 25,3% der aufgebrachten Aktivität umfaßten, wurden gepoolt und als Protease A bezeichnet.
Fraktionen 122-140, die 23,7% der aufgebrachten Aktivität umfaßten, wurden gepoolt und als Protease B bezeichnet.

6. Affinitätschromatographie auf einer Bacitracin-Säule

Die Säule (1,6 cm ·12 cm) wurde mit dem Puffer von Schritt 1 äquilibriert. Der Pool aus Fraktionen 9-25 wurde auf die Säule aufgebracht. Die Protease wurde mit demselben Puffer mit zugesetztem NaCl (1 M) und Isopropanol (25%) eluiert. Der Durchfluß betrug 5 ml/min und die Fraktionsgröße 10 ml. Das Elutionsdiagramm ist in Fig. 2 dargestellt (OD bei 280 nm gegen Zeit). Fraktionen 24-27, die 73% der aufgebrachten Proteaseaktivität umfaßten, wurden gepoolt und als Protease C bezeichnet.

Beispiel 3

Proteasezubereitung abgeleitet von Stamm NCIB 12288

Dieselbe Vorgehensweise wie in Beispiel 1 oben wurde für die Kultivierung von Stamm NCIB 12288 befolgt. Die Fermentationsbrühe (0,3 1, 35 CPU/l) ergab 11,7 g rohe Zubereitung mit einer Aktivität von 0,39 CPU/g. Ausbeute 43%.

Beispiel 4

Proteasezubereitung, abgeleitet von Stamm NCIB 12512

Dieselbe Vorgehensweise wie in Beispiel 1 oben wurde für die Kultivierung von Stamm NCIB 12512 befolgt. Die Fermentationsbrühe (1,8 1, 30 CPU/l) ergab 19,1 g rohe Zubereitung mit einer Aktivität von 1,0 CPU/g. Ausbeute: 35%.

Beispiel 5

Proteasezubereitung, abgeleitet von Stamm NCIB 12513

Dieselbe Vorgehensweise wie in Beispiel 1 oben wurde für die Kultivierung von Stamm NCIB 12513 befolgt. Die resultierende Zubereitung wurde wie in Beispiel 2 oben getrennt und erwies sich als frei von Protease B.

Beispiel 6

Stabilität von Bacillus-Proteasen in Lösungen von STPP, Natrium erborat und TAED

Lösungen, jede mit einer Aktivität von 0,2 CPU pro Liter der Protease und 1,75 g/l Natriumtripolyphosphat (STPP), 1,0 g/l Natriumperborat und 0,1 g/l Tetraacetylethylendiamin (TAED) enthaltend, wurden für 30 Minuten bei 40ºC und 50ºC inkubiert. Die Restaktivität wurde dann gemäß der OPA-Casein-Methode gemessen, wobei die Aktivität nach Inkubation bei 25ºC in der Abwesenheit von Natriumborat und TAED als 100% gerechnet wurde. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle vorgelegt: Protease Prozent Restaktivität nach 30 Minuten bei 40ºC ALCALASE ESPERASE SAVINASE von Beispiel 1

Beispiel 7

Waschversuche mit roher Proteasezubereitung

Waschtests wurden in einem Terg-O-Tometer (wie beschrieben bei Jay C. Harris: "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd. (1954), S. 60-61) bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 100 UPM für 10 Minuten bei 60ºC mit EMPA 116 Testgewebestoffproben, 5 cm·10 cm (Baumwolle, verschmutzt mit Blut, Milch und Ruß), geliefert von der Eidgenössischen Materialprüfungs- und Versuchsanstalt, Sankt Gallen, Schweiz, durchgeführt. Die folgenden Waschmittelzusammensetzungen A und B wurden in Wasser mit 90 Deutsche Härte verwendet: Waschmittel A (g/l) LAS Seife STPP Natriumsilikat Natriumsulfat Natriumperborat keines TAED pH
wobei
LAS lineares Alkylsulfonat ist (NANSA 80S, hergestellt von Albright & Wilson)
STPP Natriumtripolyphosphat ist
TAED Tetraacetylethylendiamin ist.
Das Verhältnis von Stoff zu Flüssigkeit betrug 9 Stoffproben pro 900 ml Waschmittellösung. Die verwendeten Waschmittelenzyme waren die Enzymzubereitung von Beispiel 1 und ALCALASE-Protease, beide bei Dosierungsniveaus von 0,05, 0,1 und 0,5 CPU/l.
Die Ergebnisse von Doppelwaschtests mit Waschmitteln A und B sind in Fig. 5 bzw. 6 dargestellt, wobei die Waschwirksamkeit ausgedrückt ist als Mittelwerte von % Remission, wie bestimmt durch Remissionsphotometrie unter Verwendung eines ZEISS ELRE- PHO Photometers bei 460 nm. Die Figur zeigt, daß die Waschwirkung der Protease dieser Erfindung bei Dosierungsniveaus von etwa 0,05 CPU/l und darüber diejenige der ALCALASE-Protease sowohl in Abwesenheit (Waschmittel A) als auch in Gegenwart(Waschmittel B) von Perborat + TAED übersteigt.

Beispiel 8

Waschversuche mit den konstituierenden Proteasen A, B und C

Waschtests wurden in einem Terg-O-Tometer bei 100 UPM für 10 min bei 50ºC durchgeführt. Die folgende Waschmittelzusammensetzung wurde in Wasser mit 9º Deutsche Härte verwendet:
LAS 0,4 g/l
AE 0,15 g/l
Seife 0,15 g/l
STPP 1,75 g/l
Natriumsilikat 0,4 g/l
CMC 0,05 g/l
EDTA 0,01 g/l
Natriumsulfat 2,1 g/l
Natriumperborat 1,0 g/l
TAED 0,1 g/l
pH 9,5
wobei
LAS, STPP und TAED wie in Beispiel 7 sind.
AE ist Alkoholethoxylat (Berol 065, hergestellt von Berol Kemi AB, Schweden).
Saubere Stoffproben bestanden aus weißen Baumwollgewebe, das mit Amylase (BAN Novo) entschlichtet, getrocknet und in Stücke (10·20 cm) geschnitten wurde.
Saubere Stoffproben wurden in Spinatsaft eingetaucht, zwischen zwei Walzen ausgedrückt und in einer Drehtrommel bei 60ºC getrocknet. Dies wurde zweimal wiederholt, um verschmutzte Stoffproben zu erhalten.
Das Verhältnis von Stoff zu Flüssigkeit betrug 8 Stoffproben (4 saubere und 4 verschmutzte) in 800 ml Waschmittellösung. Protease A, B und C aus Beispiel 2 wurden bei Dosierungen von 0,1, 0,5 und 1,0 CPU/l getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 als % Remission bei 460 nm gegen Proteasedosierung dargestellt.
Die Figur zeigt, daß alle drei konstituierenden Proteasen eine gute Waschwirkung in Waschmittel mit Perborat bei 50ºC besitzen.

Beispiel 9

Lagerstabilität in flüssigen Waschmitteln

Flüssige Waschmittel wurden wie folgt formuliert (Mengen in g): Fraktion I: Wasser TEA CaCl&sub2;, 2H&sub2;O DTPA DG Trinatriumzitrat H&sub3;BO&sub3; MPG Ethanol, Ölsäure AE AES LAS 10 N NaOH auf pH: Wasser zugegeben auf (g):
TEA steht für Triethanolamin, DTPA für Pentanatriumsalz von Diethylentriaminpentaacetat, DG für Natriumdiglykolat, MPG für Monopropylenglykol, AES für Alkoholethoxysulfat (Dobanol 25- 3S/60, Produkt von Shell), LAS für lineares Alkylbenzolsulfonat (Nansa 1169P), und AE steht für Alkoholethoxylat (Berol 160, Produkt von Berol Kemi AB, Schweden). In jedem Fall wurden die Bestandteile in Fraktion I und II vermischt und dann wurde Fraktion II langsam unter Rühren zu Fraktion I zugegeben.
Der Wassergehalt (einschließlich Wasser, das in anderen Bestandteilen enthalten ist) betrug etwa 41 Gew.-% in allen Waschmitteln.
Die folgenden Proteasezubereitungen wurden getestet:
- Die lyophilisierte rohe Zubereitung von Beispiel 2, gelöst in einer Mischung von Wasser und MPG (1 : 1 nach Gewicht) und verdünnt auf eine Aktivität von 2,5 AU/g.
- Alcalase 2,5L (Produkt von Novo Industri A/S, Dänemark), eine kommerzielle flüssige Zubereitung von Alkalinprotease aus Bacillus licheniformis.
- Esperase 8,0L (Produkt von Novo Industri A/S, Dänemark), eine kommerzielle flüssige Zubereitung von Bacillus-Alkalinprotease, hergestellt gemäß US 3,723,250.
Der Calciumgehalt jeder Proteasezubereitung wurde auf 1,0 Gew.-% (als Ca&spplus;&spplus;) durch Zugabe von CaCl&sub2;, 2H&sub2;O eingestellt. In jedem Experiment wurden 1 Gew.-% einer Proteasezubereitung (nach Ca&spplus;&spplus;-Einstellung) zu einem der obigen Waschmittel zugegeben, die Mischung wurde bei 50ºC inkubiert und Proben wurden nach 0, 23, 47 und 134 Stunden Inkubation genommen. Die Proteaseaktivität jeder Gruppe wurde bestimmt und die Ergebnisse sind unten dargestellt, ausgedrückt als Restaktivität in % der Anfangsaktivität (d. h. Aktivität nach 0 Tagen). pH wurde gemessen nach 0 und 134 Stunden. pH: Waschmittel Bsp. 2 ESPERASE ALCALASE % Restaktivität Waschmittel Bsp. 2 ESPERASE ALCALASE
pH war nahezu konstant in allen Experimenten. Man sieht, daß Protease der Erfindung in allen getesteten Waschmittelformulierungen stabiler als ESPERASE und ALCALASE ist. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß Borat und MPG sehr wirkungsvoll als Stabilisatoren für Protease der Erfindung in flüssigen Waschmitteln sind.

Claims

1. Proteasezubereitung, die von einer neuartigen alkalophilen Bacillus-Spezies, definiert durch den Stamm NCIB 12288 und NCIB 12289, ableitbare Alkalinprotease umfaßt, wobei die Alkalinprotease eine Restaktivität, gemessen in Casein Protease Units (CPU) nach 30 Minuten bei pH 9,5 in einer Lösung von 1,75 g/l Natriumtripolyphosphat (STPP), 1,0 g/l Natriumperborat und 0,1 g/l Tetraacetylethylendiamin (TAED), von wenigstens 80% bzw. 60% bei Temperaturen von 40ºC bzw. 50ºC der Restaktivität bei 25ºC in der Abwesenheit von Natriumperborat und TAED beibehält, wobei die Protease ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 41,5 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 9,3, ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 28,5 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 8,8 oder ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 30,0 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 5,2 besitzt, wobei die Protease immunchemische Nicht-Identität zu den folgenden alkalischen Bacillus-Proteasen zeigt, nämlich "ALCALASE", "SAVINASE", "ESPERASE" und "API-21",.

2. Proteasezubereitung, die wenigstens 10% nach Aktivität in CPU einer konstituierenden Protease A umfaßt, die immunchemisch identisch zu der durch die Position von Peak A in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen identifizierten Protease ist und die folgenden zusätzlichen Merkmale besitzt: ein Molekulargewicht (SPS-PAGE) von etwa 41,5 kD, einen isoelektrischen Punkt (IEF) von etwa 9,3, eine spezifische Aktivität von wenigstens 150 Anson Units und 250 Hemoglobin Protease Units (AU bzw. HPU) pro g Protein und eine Restaktivität, gemessen in CPU, nach 30 Minuten bei pH 9,5 in einer Lösung von Natriumtripolyphosphat (STPP, 1,75 g/l), Natriumperborat (1,0 g/l) und Tetraacetylethylendiamin (TAED, 0,1 g/l) von wenigstens 80% bzw. 60% bei Temperaturen von 40ºC bzw. 50ºC der Restaktivität bei 25ºC in der Abwesenheit von Natriumperborat und TAED und immunchemische Nicht- Identität zu den folgenden alkalischen Bacillus-Proteasen zeigt, nämlich "ALCALASE", "SAVINASE", "ESPERASE" und "API- 21".

3. Proteasezubereitung nach Anspruch 2, die im wesentlichen frei von anderen Proteasen als besagter erster Protease A ist.

4. Proteasezubereitung nach Anspruch 2, wobei der Rest der Proteaseaktivität durch die Proteasen B und C zusammen oder einzeln durch eine von diesen bereitgestellt wird, wobei besagte Proteasen durch Peak B von Fig. 1 bzw. durch Peak C von Fig. 1 und 2, durch Molekulargewichte (SPS-PAGE) von etwa 28,5 bzw. 31,0 kD, durch isoelektrische Punkte (IEF) von etwa 8,8 bzw. 5,2 identifiziert sind, wobei besagte Proteasen B und C immunchemisch identisch zueinander sind, aber nichtidentisch zu besagter Protease A.

5. Proteasezubereitung, bei der die Protease-Aktivität im wesentlichen durch besagte Protease B, wie definiert in Anspruch 4, bereitgestellt wird.

6. Proteasezubereitung, bei der die Protease-Aktivität im wesentlichen durch besagte Protease C, wie definiert in Anspruch 4, bereitgestellt wird.

7. Verfahren zur Herstellung einer Proteasezubereitung, welches gekennzeichnet ist durch Kultivierung eines Stammes der neuartigen Bacillus-Spezies, die durch die Stämme NCIB 12288 und NCIB 12289 definiert ist, unter aeroben Bedingungen in einem Nährstoffmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorquellen enthält, vorzugsweise gefolgt von Gewinnung der Proteasezubereitung aus der Fermentationsbrühe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Fermentation mit einem Stamm der oben definierten Bacillus-Spezies durchgeführt wird, welcher so mutiert ist, daß seine Fähigkeit zur Synthese von ein oder zwei der konstituierenden Proteasen im wesentlichen blockiert ist, während seine Fähigkeit, die übrigbleibende(n) konstituierende(n) Protease oder Proteasen zu produzieren, beibehalten ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Fermentation mit einem Bacillus-Stamm durchgeführt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus NCIB 12288, NCIB 12289, NCIB 12512 und NCIB 12513 besteht.

10. Reinigungsmittel, das eine wirksame Menge, vorzugsweise wenigstens 0,1 AU, bevorzugter von 0,5 bis 10 AU, der Proteasezubereitung einer der Ansprüche 1 bis 6 und/oder der Proteasezubereitung, die nach dem Verfahren einer der Ansprüche 7 bis 9 hergestellt ist, enthält.