DK158233B

DK158233B - Proteasepraeparat, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf

Info

Publication number: DK158233B
Application number: DK197388A
Authority: DK
Inventors: Helle Outtrup; Claus Dambmann; Sven Branner
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1986-08-14
Filing date: 1988-04-12
Publication date: 1990-04-16
Also published as: ATE92957T1; DK197388D0; DK386586D0; DE3787009T2; JP2559439B2; EP0277216B1; DK158233C; EP0277216A1; DE3787009D1; WO1988001293A1; JPH01500642A; DK197388A

Description

i

DK 158233 B

Nærværende opfindelse angår et hidtil ukendt alkalisk proteasepræparat med forbedret oxidationsstabilitet, en fremgangsmåde til dets fremstilling og et rensemiddel indeholdende proteasepræparatet. Typiske rensemidler er vaske-5 midler til vask af tøj.

Proteolytiske enzymer, fremstillet ved dyrkning af mikroorganismer af Bacillus-slægten i egnede dyrkningsmedier, anvendes i udstrakt grad i vaskemiddelkompositioner. Eksempler på sådanne kommercielt tilgængelige proteasepro-10 dukter er: - Alcalase® (produkt fra Novo Industri A/S, Denmark), afledt fra Bacillus licheniformis med subtilisin Carlsberg som den aktive bestanddel.

- Savinase® og Esperase® (produkter fra Novo Industri A/S), 15 fremstillet fra alkalophile Bacillus sp. i henhold til dansk fremlæggelsesskrift nr. 136.162.

Disse kendte enzymer udviser tilstrækkelig lagerstabilitet i tilstedeværelse af de sædvanlige bestanddele i vaskemiddel-kompositioner, såsom sekvestreringsmidler, over-20 fladeaktive stoffer og endog blegemidler af peroxytypen, forudsat at de på passende måde beskyttes imod deres fysiske omgivelser i vaskemidlet, f.eks ved at lade dem indgå i partikler, der er overtrukket med egnede beskyttelsesmidler.

Under vaskeprocessen, hvor de opløste enzymer bli-25 ver påvirket af de samme midler i opløsning, kan stabili-tetssituationen dog blive kritisk, forstået således at enzymet er tilbøjeligt til at blive ødelagt inden dets tilsigtede smudsfjernelse er afsluttet, især ved forhøjede temperaturer i tilstedeværelse af blegemidler af peroxytypen såsom percar-30 bonat, perborat og persulfatsalte. Da alle kendte proteaser, der er afledt af Bacillus, udviser en væsentlig ustabilitet ved vasketemperaturer på over 50°C i tilstedeværelsen af

DK 158233 B

2 peroxyforbindelser, anbefales det ofte at forlænge vaskeprogrammet ved at indsætte en pause ved lav temperatur ved brug af proteaseholdige vaskemidler.

Forsøg på at forbedre stabiliteten af serin-pro-5 teaser, der er afledt af Bacillus, overfor iltningsmidler ved at anvende positions-specifik mutation af tilsvarende gener, er kendt teknik, f.eks. fra europæisk patentpublikation nr.

0 130 756, som beskriver stabiliserede subtilisiner hvor methionin-molekylet nærmest serin-molekylet i proteinasens 10 aktive center erstattes med aminosyrer, som er mindre tilbøjelig til at blive iltet. Dog er hindringerne, der er forbundet med tilpasningen af rekorabinant DNA strategier til fremstillingsprocesser i stor skala, velkendte, hvoraf den hyppigste er ustabilitet af den konstruerede mikroorganisme 15 på grund af tab af genetisk materiale og lavere udbytte sammenlignet med det udbytte, der opnås fra den vilde stamme eller dets konventionelle mutanter.

Der findes intet i den kendte teknik om ikke-kon-struerede Bacillus-afledte serin-proteaser, der udviser en 20 forbedret stabilitet overfor oxidation ved sammenligning med kommercielle Bacillus-proteaser.

Det er kendt fra bl.a. US 3,163,606 og DK-A 2908/80, at TAED (tetra-acetyl-ethylen-diamin) kan forøge blegevirkningen af perborat i vaskemidler.

25 Formålet med den foreliggende opfindelse er at overvinde de ovennævnte stabilitetsproblemer ved de hidtil kendte alkaliske Bacillus-proteasepræparater. Ifølge opfindelsen er dette formål opfyldt derved, at det overraskende har vist sig, at et antal Bacillus-stammer, der anses for at til-30 høre samme hidtil ukendte art, producerer alkalisk protease, som udmærker sig ved en forbedret stabilitet overfor de blegemidler af peroxytypen, der sædvanligvis anvendes ved vask af tøj sammen med TAED.

Normalt indeholder den alkaliske protease, der er 35 fremstillet ved hjælp af hidtil ukendte Bacillus-arter ifølge opfindelsen, tre hovedbestanddele, som alle er forskellige

DK 158233 B

3 alkaliske proteaser (heri betegnet A, B og C) og ofte i forholdet (målt i proteaseaktivitetsenheder) på ca. en tredjedel hver. Dog kan stammevarianter mangle evnen til at danne mindst én af disse proteasebestanddele. Tilfældigvis udviser 5 alle tre proteasebestanddele lignende vaskevirkning og stabilitetsegenskab .

Proteasepræparatet ifølge opfindelsen indeholder alkalisk protease, og er ejendommelig ved, at den alkaliske protease udgøres af én eller flere af de proteaser, som dan-10 nes ved dyrkning af stammer af Bacillus identificeret ved stammerne NCIB 12288, NCIB 12289 eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber, hvilken alkalisk protease bevarer en restaktivitet målt i casein proteaseenheder (CPU) efter 30 minutter ved pH 9,5 i en opløsning af 1,75 g/1 natriumtri- 15 polyfosfat (STPP), 1,0 g/1 natriumperborat og 0,1 g/1 tetra-acetylethylendiamin (TAED) på mindst 80% og 60% ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 50°C i forhold til restaktiviteten ved 25°C i fraværelse af natriumperborat og TAED.

En foretrukken udførelsesform af den foreliggende 20 opfindelse angår et proteasepræparat som ovenfor angivet, og som er ejendommelig ved, at proteasen indeholder mindst 10 aktivitets-% i CPU af en proteasebestanddel A, som er immuno-kemisk identisk med proteasen, der er identificeret ved positionen af top A i fig. 1, og som har følgende yderligere ken-25 detegn: en molekylvægt på ca. 41,5 kD, et isoelektrisk punkt på ca. 9,3, en specifik aktivitet på mindst 150 Ansonenheder og 250 hæmoglobin-proteaseenheder (AU og HPU, henholdsvis) pr. g protein, og bevarer en restaktivitet målt i CPU efter 30 minutter ved pH 9,5 i en opløsning af natriumtripolyfosfat 30 (STPP, 1,75 g/1), natriumperborat (1,0 g/1), og tetraacetyl-ethylendiamin (TAED, 0,1 g/1) af mindst 80% og 60% ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 50°C i forhold til restaktiviteten ved 25°C i fraværelse af natriumperborat og TAED.

I en særlig foretrukken udførelsesform for prote-35 asepræparatet ifølge opfindelsen er proteasepræparatet hovedsagelig fri for andre proteaser end ovennævnte protease A.

DK 158233 B

4 I endnu en foretrukken udførelsesform ifølge opfindelsen tilvejebringes balancen af proteaseaktiviteten af begge nævnte proteaser B og C, som er identificeret ved top B i fig. 1 og ved top C i henholdsvis fig. 1 og 2, eller blot 5 én af disse. Proteaserne B og C er immunokemisk identiske med hinanden og forskellige fra protease A. Protease B og C har molekylvægt på ca. 28,5 og 31 kD og isoelektriske punkter på henholdsvis ca. 8,8 og 5,2.

Nærværende opfindelse angår tillige et proteasepræ-10 parat hovedsageligt omfattende nævnte protease B.

Endvidere angår den foreliggende opfindelse et pro-teasepræparat, som hovedsageligt omfatter nævnte protease C.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af ovennævnte proteasepræparat, hvilken frem-15 gangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af Bacillus identificeret ved stammerne NCIB 12288, NCIB 12289 eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber under aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende assimi-lerbare kilder af karbon, nitrogen og fosfor, fortrinsvis 20 efterfulgt af udvinding af proteasepræparatet fra gæringsvæsken.

I en foretrukken udførelsesform for fremstilling af proteasepræparatet foretages gæringen med en stamme af ovenfor angivne Bacillus-arter, hvilken stamme er muteret for i 25 det væsentlige at blokere dets evne til syntetisering af en eller to af de deraf bestående proteaser, medens evnen til at fremstille resten af den eller de deraf bestående protease(r) bevares.

Endnu en foretrukken udførelsesform for fremgangs-30 måden til fremstillingen af ovennævnte proteasepræparat er ejendommelig ved, at den muterede stamme er NCIB 12512 eller NCIB 12513.

DK 158233 B

5

Opfindelsen angår endvidere et rensemiddel indeholdende en effektiv mængde på mindst 0,1 AU, fortrinsvis fra 0,5 til 10 AU af ovennævnte proteasepræparat og/eller prote-asepræparat fremstillet ved den ovenfor beskrevne fremgangs-5 måde.

Fig. i viser elueringskromatogrammet af protease-præparatet, der er afledt af NCIB 12289 på en CM Sepharose® CL 6B søjle, efterfulgt af gelfiltrering på Sephadex® G 25.

Fig. 2 viser affinitetskromatografi af protease C 10 på en bacitracinsøjle.

Fig. 3 og 4 er eksempler på kurverne for henholdsvis pH-aktiviteten og temperatur-aktiviteten af proteasepræ-paratet ifølge opfindelsen, hvor alle proteasebestanddelene udviser lignende egenskaber for temperatur- og pH-aktivitet.

15 Fig. 5 og 6 illustrerer resultatet af sammenlign ende vaskeforsøg, der blev udført med proteasepræparatet ifølge opfindelsen og ALCALASE®, hvorved to forskellige detergenter blev brugt. Forsøgsbetingelserne er angivet i nedenstående eksempel 5.

20 Fig. 7 illustrerer resultaterne af vaskeforsøg, der blev udført med hver af proteasebestanddelene A, B og C.

De mikroorganismer, der frembringer den alkaliske protease ifølge nærværende opfindelse blev isoleret i det væsentlige efter den metode, der er beskrevet i britisk 25 patentskrift nr. 1,243,784 for udvælgelsen af alkalophile baciller. De kan ikke gro i et almindeligt medium for Bacil-lusstammer, med mindre der tilsættes enten en 0,1 M carbonat-puffer, pH 9,0 - 9,7 eller en NaCl-opløsning på 7 - 10% (w/v), hvoraf 0,1 M carbonatpuffer, pH 9,0 er det mest fore-30 trukne. Fire mikroorganismer er deponeret hos The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, England på den nedenfor angivne dato. NCIB, som i henhold til Budapesttraktaten af 1977 er et autorise-

DK 158233 B

6 ret, internationalt deponeringsinstitut, yder opretholdelse af og offentlig adgang til depotet i overensstemmelse med henholdsvis reglerne 9 og 11 i ovennævnte traktat.

Deponeringsdato Deponentens ref. NCIB nr.

5 8. juli 1986 C608 12288 8. juli 1986 C609 12289 5. august 1987 C610 12512 5. august 1987 C611 12513

Taxonomi; 10 TY-mediet blev anvendt til taxonomiske undersøg elser, der blev udført i henhold til de af Ruth Gordon et al.

(The Genus Bacillus, Agriculture Handbook no. 427, U.S.D.A. 1973) beskrevne fremgangsmåder.

Sammensætningen af TY-mediet: 15 Trypticase 20 g Gærekstrakt 5 -

FeC 1^.6^0 7 mg

MnCl2.4H20 1 -

MgS04.7H20 15 g 20 destilleret H20 til 1000 ml pH indstil-let til 7,3 med KOH før autoklavering i 15 minutter ved 121°C.

Flydende medier til bestemmelsen af syreproduktionen fra kulhydrater blev tilført 10% NaCl før autoklavering.

25 Faste medier blev tilført 2% agar før autoklaver ing, og man tilførte en steril carbonatpuffer pH 9,0 under sterile forhold til en færdig koncentration af 0,1 M lige før man hældte substratet i skrårør eller petriskåle.

DK 158233 B

7

Mikroorganismerne ifølge nærværende opfindelse er aerobe, sporedannende bakterier tilhørende slægten Bacillus.

Morfologi: vegetative stave med en diameter på 0,6 - 0,8 mikrometer, længde 1,2 - 3 mikrometer.

5 Sporer: Centralt til subterminalt forekommende, ovale, sporangier ikke opsvulmede.

Biokemiske reaktioner: NCIB 12288 NCIB 12289

Dannelse af katalase + +

Dannelse af acetoin (VP-test)

10 Dannelse af indol Anaerob vækst Vækst ved 50°C

Vækst i 7% NaCl + + Vækst ved pH 5,7 15 Hydrolyse af stivelse + +

Hydrolyse af hippurat

Hydrolyse af casein + +

Hydrolyse af tyrosin + +

Deaminering af phenylalanin 20 Reduktion af nitrat til nitrit

Syre fra glucose + +

Syre fra saccharose + +

Syre fra xylose +

Syre fra mannitol (+) (+) 25 Ingen af stammerne NCIB 12288 NCIB 12289 producerer syre fra arabinose, mannose, melibiose, raffinose eller sorbitol.

Optimale vækstbetingelser er 30 - 37°C, pH 9,0. Ovennævnte taxonomiske resultater viser, at de to 30 stammer ikke tilhører nogen tidligere beskrevet art, men bør betragtes som hørende til en hidtil ukendt Bacillus art.

DK 158233 B

8

Taxonomiske data for stammerne NCIB 12512 og NCIB 12513 er meget lig ovennævnte, hvilket indikerer, at alle fire stammer tilhører samme art.

OPA-casein-metode 5 Den proteolytiske aktivitet bestemmes med casein som substrat. En casein proteaseenhed (CPU) defineres som den mængde enzym, der frigør 1 millimol primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) pr. minut under standardiserede betingelser, dvs. inkubering i 30 minutter 10 ved 25°C og pH 9,5.

En 2% (vægt/vol.) opløsning af casein (Hammarsten, fra Merck A.G., Vesttyskland) blev fremstillet med den af Britton og Robinson (Journ.Chem.Soc 1931, p. 1451) beskrevne universalpuffer og indstillet på pH 9,5.

15 To ml af substratopløsningen forinkuberes i et vandbad i 10 minutter ved 25°C. En ml af enzymopløsningen, indeholdende b g/ml af enzympræparatet svarende til 0,2 - 0,3 CPU/ml i Britton-Robinson puffer (pH 9,5), tilsættes. Efter inkubering i 30 minutter ved 25°C standses reaktionen ved 20 tilsætning af et stopreagens (5 ml af en opløsning indeholdende trikloreddikesyre (17,9 g), natriumacetat (29,9 g) og eddikesyre (19,8 g), fyldt op til 500 ml med af ioniseret vand). En blindprøve fremstilles på samme måde som prøveopløsningen, med undtagelse af at stopreagenset tilsættes før 25 enzymopløsningen.

Reaktionsblandingerne henstår 20 minutter i et vandbad, hvorefter de filtreres på Whatman® 42 filterpapir.

Primære aminogrupper bestemmes ved hjælp af deres farveudvikling med o-phthaldialdehyd (OPA).

30 Dinatriumtetraborat decahydrat (7,62 g) og natrium- dodecylsulfat (2,0) opløses i 150 ml vand. OPA (160 mg) opløst i 4 ml methanol tilsættes derefter sammen med 400 μΐ beta-mercaptoethanol, hvorefter opløsningen fyldes op til 200 ml med vand.

DK 158233 B

9 3 ml af OPA-reagenset blandes med 400 μΐ af de ovenfor nævnte filtrater. Den optiske tæthed OD ved 340 nm måles efter ca. 5 minutter.

OPA-testen udføres også med en serinstandard inde-5 holdende 10 mg serin i 100 ml Britton-Robinson puffer (pH 9,5). Pufferen anvendes som reference.

Proteaseaktiviteten beregnes ud fra OD målingerne ved hjælp af følgende formel: 10 <0Dt - 0Db)x Cser x 0 CPU/ml af enzymopløsningen = - (OD - OD„) x MW x t. ser B ser i CPU/g af enzympræparatet = CPU/ml: b hvor OD, , OD, , OD og OD„ er den optiske tæthed målt for t b ser ^ B r henholdsvis prøveopløsning, reference, serinstandard og puf-15 fer, C er koncentrationen af serin i mg/ml i standarden og

S63T

MV?ser er molekylvægten af serin; Q er fortyndingsfaktoren for enzymopløsningen og t^ er inkuberingstiden i minutter.

OPA-hæmoglobin-metode

Proteolytisk aktivitet bestemmes med urea-denatu-20 reret hæmoglobin som substratet. En hæmoglobin proteaseenhed (HPU) defineres som mængden af enzym, der frigør 1 millimol af primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) pr. minut under standardiserede betingelser, dvs. inkubering i 30 minutter ved 25°C og pH 9,5.

25 En 2% (w/v) opløsning af urea-denatureret hæmoglo bin fremstilles med 0,2M boratpuffer, indstillet til pH 9,5.

To ml substratopløsning for-inkuberes i et vandbad i 10 minutter ved 25°C. 1 ml enzymopløsning indeholdende b g/ml enzympræparat, svarende til ca. 0,2 - 0,3 HPU/ml borat-

DK 158233 B

10 .puffer tilsættes. Inkubation, afslutning af reaktionen og bestemmelsen af primære aminogrupper ved hjælp af OPA-reagen-sen udføres som overfor beskrevet for OPA-casein-metoden.

OPA-testen udføres også med en serinstandard inde-5 holdende 10 mg af serin i 100 ml af boratpufferen, hvor pufferen i sig selv tjente som blindprøve.

Proteaseaktiviteten i HPU beregnes fra en formel, der er identisk med den, der anvendtes ved OPA-casein-metoden.

10 Modificeret Anson-hæmoglobin-metode I Anson-hæmoglobin-metoden til bestemmelsen af pro-teolytisk aktivitet nedbrydes denatureret hæmoglobin under standardiserede betingelser. Det ikke-nedbrudte hæmoglobin udfældes med trichloreddikesyre (TCA) og mængden af nedbryde-15 ligt TCA-produkt bestemmes med Folin-Ciocalteu-phenolreagens.

En Ansonenhed (AU) er mængden af enzym, der under standardiserede reaktionsbetingelser nedbryder hæmoglobin med en sådan initial hastighed, at der pr. minut frigøres den mængde TCA-opløseligt produkt, der giver den samme farve med 20 phenolreagens som en milliækvivalent tyrosin.

De standardiserede reaktionsbetingelser er følgende: Temperatur 25°C; reaktionstid 10 minutter; pH 7,5.

Endvidere henvises til M.L. Anson, Journal of General Physiology, bind 22 (1939), s. 79-89; 0. Folin og V.

25 Ciocalteur The Journal of Biological Chemistry, bind 73 (1972), s. 627-636.

Forskellige værdier for proteolytisk aktivitet opnås uvægerligt afhængigt af valget af analytisk metode. Medens OPA-casein-testen egner sig til at vise proteolytisk 30 aktivitet til laboratorie- og produktionsformål, kan man sige, at proteolytisk aktivitet overfor et porphyrin-holdigt protein, såsom hæmoglobin, er mere relevant for at kunne vurdere anvendeligheden af en detergentprotease på grund af de problemer, der sædvanligvis opstår ved fjernelsen af blod- og chlorophylpletter. En høj specifik aktivitet af en deter- gentprotease overfor porphyrin-holdige proteiner er ønskvær digt.

DK 158233 B

11

Bacillusstammerne som danner protease ifølge denne 5 opfindelse dyrkes under aerobe betingelser i et næririgsmedium indeholdende assimilerbare kulstof- og nitrogenforbindelser tillige med andre essentielle næringsstoffer, idet mediet er sammensat efter de i teknikken kendte retningslinier.

Egnede kulstofkilder er kulhydrater, som f.eks.

10 saccharose, glucose og stivelse eller kulhydratholdige materialer, såsom kornprodukter, malt, ris og sorghum. Poly-saccharider omdannes sædvanligvis i det mindste delvist til forgærbart sukker ved passende hydrolyserende enzymer før gæringsprocessen. Koncentrationen af kulhydrat der inkorpo-15 reres i mediet kan variere inden for vide grænser, f.eks. op til 25% og ned til 1% - 5%, men sædvanligvis vil 5 til 15% være passende, idet procentindholdet beregnes som glucose-ækvivalenter.

Næringsmediets nitrogenkilde kan være uorganisk 20 og/eller organisk materiale. Egnede uorganiske nitrogenkilder er nitrater og ammoniumsalte. Af organiske nitrogenkilder anvendes et større antal almindeligvis i gæringsprocesser, der indebærer dyrkning af bakterier. Illustrative eksempler er sojamel, bomuldsfrømel, jordnøddemel, casein, majsstøbe-25 vand, gærekstrakt, urinstof og albumin. Derudover bør næringsmediet også indeholde de sædvanlige sporstoffer.

Den optimale temperatur for formering af Bacillus-stammen og for dens produktion af protease fastlægges rutinemæssigt af erfarne fagfolk. Dyrkningen kan udføres ved tempe-30 raturer i området fra 25°C til 35°C, fortrinsvis ved alkaliske pH-værdier. Sidstnævnte kan opnås ved tilsætning af passende puffere, såsom natriumcarbonat og natriumhydrogen-carbonat efter sterilisation af vækstmediet. Ved dyrkning i gæringstanke er det nødvendigt at anvende kunstig beluftning.

35 Beluftningshastigheden er af lignende størrelsesorden som den, der anvendes i konventionel tankgæring.

DK 158233B

12

Efter gæring kan der fremstilles et flydende enzymkoncentrat ved fjernelse af groft materiale fra kulturvæsken eller, om ønsket, ved koncentrering af gæringsvæsken ved ind-dampning ved lav temperatur eller ved omvendt osmose. Til 5 slut kan koncentratet tilsættes konserveringsmidler.

Enzympræparater i fast form kan fremstilles ud fra den oprensede og/eller koncentrerede kulturvæske ved fældning med salte, såsom natriumsulfat, eller med vandblandbare opløsningsmidler, såsom ethanol eller acetone. Kulturvæsken kan 10 også afvandes ved anvendelsen af egnede tørringsmetoder, som f.eks. spray-tørring.

Den proteolytiske aktivitet af det således fremstillede proteasepræparat ligger sædvanligvis i området fra 0,1 til 10 CPU/g.

15 pH-aktivitets- og temperaturaktivitetskurverne for proteasepræparatet ifølge opfindelsen fremgår af fig. 3 og 4.

Den anvendte prøve blev fremstillet som angivet i nedenstående eksempel 1, og aktiviteten blev bestemt med den ovenfor angivne CPU-metode, med undtagelse af at pH eller temperatur 20 var ændret. Kurverne viser, at pH-optimum med casein som substrat ligger omkring 6 til 11, og at temperaturoptimum ved reaktion i 30 minutter er ca. 50-60°C.

Den første, anden og tredje protease (i det følgende kaldet henholdsvis protease A, protease B og protease C) 25 kan separeres og oprenses ved en separationteknik, der sædvanligvis kendes af en fagmand på området.

En initial oprensning af den rå protease kan udføres ved opløsning, f.eks. i en egnet puffer, efterfulgt af proteinudfældning, f.eks. med et salt, såsom (NH^^SO^, eller 30 et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. acetone.

Yderligere oprensning af det udvundne udfældede materiale opnås sædvanligvis ved kromatografimetoder, f.eks. gelfiltrering i et puffersystem som det indledende trin. Pro-teaseholdige fraktioner af det eluerede materiale kan lokali-35 seres ved at undersøge U.V. absorptionen og/eller ved bestemmelse af proteaseaktiviteten.

DK 158233 B

13

Efter gelfiltrering opnås sædvanligvis yderligere oprensning ved ionbytterkromatografi, f.eks. på en SEPHADEX® anion- eller kationbytter, hvorved i det mindste en delvis adskillelse af proteasebestanddelene kan udføres ved anvend-5 else af egnede puffer-salt-gradient-systemer. Rekromatografi af stof fra en top derfra ved hjælp af den samme eller en anden ionbytter frembringer sædvanligvis proteasen i en tilstrækkelig ren tilstand. Om ønsket kan yderligere oprensning af de enkelte proteaser opnås ved at udsætte dem for affini-10 tetskromatografi, f.eks. på en bacitracinsøjle.

Oprensning af proteasekomponenten vises nemt ved gelelektroforese, f.eks. i en polyacrylamidgel (PAGE) med eller uden natriumdodecylbenzensulfonat (SDS) . Selvnedbrydning af proteaserne kan undgås ved blokering af det aktive 15 center forud for elektroforese, f.eks. med phenylmethylsulfo-nylfluorid (PMSF).

SDS-PAGE og isoelektrisk fokusering (IEF) i tilstedeværelsen af markør-proteiner er egnede midler til bestemmelse af henholdsvis molekylvægt (MW) og isoelektrisk 20 punkt (pi). I henhold til disse fremgangsmåder har proteaserne A, B og C molekylvægte på ca. 41,5, 28,5 og 31,0 kD, og isoelektriske punkter på henholdsvis ca. 9,3, 9,2 og 5,2. Protease A er yderligere kendetegnet ved specifikke aktiviteter pr. gram protein på ca. 180 AU/g og 270 HPU/g.

25 Immunokemisk karakerisering

Monospecifik antiserum mod hver af de oprensede proteaser kan rejses f.eks. ved at immunisere kaniner i henhold til forskrifterne beskrevet af N. Axelsen et al. i: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell 30 Scientific Publications, 1973, kapitel 23. Oprensede immuno-globuliner kan opnås fra antiserum, f.eks. ved udfældning af salt ((NH^^SO^), efterfulgt af dialyse og ionbytterkromato-grafi, f.eks. på DEAE-Sephadex.

DK 158233 B

14

Immunokemisk karakterisering' af proteiner udføres sædvanligvis enten ved Ouchterlony dobbelt diffusionsanalyse (0. Ouchterlony i: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, ED.), Blackwell Scientific Publications, 1967, s. 655-5 706) eller ved krydset immunoelektroforese (N. Axelsen et al., se ovenfor, kap. 3 og 4).

Protease B og C ifølge opfindelsen viser immunokemisk identitet med hinanden, og begge viser ikke-identitet med protease A. Protease A, B og C ifølge opfindelsen viser 10 alle immunokemisk ikke-identitet med følgende kendte alkaliske Bacillus-proteaser; - Alcalase® , Savinase® og Esperase® - API-21 (US patentskrift nr. 4,480,037).

Rensemidler ifølge opfindelsen er typisk et deter-15 gent til vask af tøj i flydende form eller som pulver. I tilfælde af et flydende detergent kan stabiliteten af protease-præparatet under lagring være utilfredsstillende, og det foretrækkes derfor at inkludere enzymstabilisatorer i formuleringen. Den flydende formulering kan således omfatte poly-20 oler såsom 1.2-propandiol (propylenglycol), typisk 1 - 20%.

Om ønsket kan formuleringen omfatte borsyre (eller som alternativ, boroxid, borax eller et borat), typisk op til 10%. Endvidere kan man, om ønsket, inkludere formiat eller et salt af anden lavere fedtsyre, f.eks. i en mængde af op til 10%.

25 Indholdet af kalcium i det flydende detergent kan være fra 0,001 til 0,1% (alle %'er i vægt-%).

DK 158233B

EKSEMPEL 1 15

Proteasepræparat fra stamme nr. NCIB 12289

Celler fra Bacillus-stammen NCIB 12289 blev høstet efter inkubering ved 30°C i 2 dage fra skrårør med TY-agar, 5 hvortil der under sterile forhold var sat 0,1 M karbonatpuffer pH 9,0 og 1% skummetmælk. Cellerne blev overført til 500 ml kolber forsynet med baffel-anordning og indeholdende 100 ml BP-X medium + 0,1 M karbonatpuffer pH 9,0.

Medium BP-X: 10 Kartoffelstivelse 100 g bygmel 50 g

Sojamel 20 g

Natriumcaseinat 10 g

Na2HP04.12H20 9 g 15 TERMAMYL® 60L (NOVO) 0,1 g ΦΜ $ PLURONIC 0,1 g

Postevand til 1000 ml

Blandingen blev langsomt opvarmet fra 60°C til 85°C i 30 minutter med omrøring for at forflyde stivelsen. Blan-20 dingen blev derefter hurtigt opvarmet og temperaturen holdt over 95°C i 10 minutter før afkøling, fordeling i kolber og autoklavering i 40 minutter ved 121°C.

De podede kolber blev inkuberet i 4 dage ved 25°C på et rystebord ved 240 omdr/min. Gæringsvæsken (2,5 1, 54 25 CPU/1 målt med OPA metoden) blev centrifugeret i 30 minutter ved 400 omdr/min. Den centrifugerede væske (2,0 1) blev koncentreret til 1,0 1 ved ultrafiltrering på et Mini-lab modul fra DDS, RO-divisionen, Danmark. Efter koncentreringen blev den vasket med 5,0 1 0,01 molær natriumborat, pH 9,0, og til 30 sidst koncentreret yderligere til 400 ml. Derefter blev den frysetørret, og gav 25,5 g råt præparat med en aktivitet på 3,0 CPU/g. Udbytte: 57%.

DK 158233 B

EKSEMPEL 2 16

Separation af proteasebestanddelene A, B og C

Gæring med NCIB 12289 blev i det væsentlige udført som i eksempel 1. Kulturvæsken (75 AU/kg) blev oprenset ved 5 nedenstående trin: - flokkulering - centrifugering - inddampning - blank-filtrering 10 - salt-udfældning med Na2S0^ - genopløsning - blank-filtrering - steril filtrering - koncentrering ved ultrafiltrering og vask 15 - frysetørring

Det frysetørrede rå præparat (aktivitet 15,3 CPU/g eller 24,5 AU/g) blev oprenset og delt i proteasebestanddele ved nedenstående trinrækkefølge: 1. Genopløsning 20 2,5 g protease blev opløst i 50 ml af følgende puf fer: dimethy-lglut ar syre 0,0 lM borsyre 0,1M calciumchlorid 0.002M 25 natriumhydroxid til pH 7,0 2. Centrifugering

Den genopløste protease blev centrifugeret ved 18000 rpm ved 25 - 30°C i 20 minutter.

DK 158233 B

17 3. Filtrering

Supernatanten blev filtreret på Whatman® glasfilter type GF/F, 42 ml klar proteaseopløsning blev opsamlet.

4. Gelfiltrering på Sephadex G 25 søjle

5 40 ml klaret proteaseopløsning blev anbragt på en G

25 søjle (5 cmø x 22,6 cm) equilibreret med den puffer, der blev anvendt i trin 1. 10 ml fraktioner blev opsamlet med en flowhastighed på 3,3 ml/min og testet for aktivitet. Fraktionerne 19 - 25, omfattende 54% af den anvendte aktivitet, 10 blev samlet, fortyndet til 100 ml og filtreret på Millipore 0,45 μ filter type HA.

5. Ionbytterkromatografi på CM Sepharose CL 6B

Det filtrerede eluerede stof blev anbragt på en CM Sepharose CL 6B søjle (5 cmø x 7,8 cm), equilibreret med den 15 puffer, der blev anvendt i trin 1. Protease C og farveholdigt stof blev vasket ud af søjlen med samme puffer. De andre bestanddele blev elueret med en 0 - 0,05M NaCl gradient i 2 1 af den samme puffer. 10 ml fraktioner blev opsamlet med en flowhastighed på 3,3 ml/min og blev undersøgt ved UV-absor-20 bans. Gradienten blev påbegyndt efter fraktion 37. UV-absor-berende fraktioner 5 - 40 og 71 - 150 blev testet for prote-aseaktivitet. Proteaseaktiviteten blev fundet som 3 markante toppe, som det fremgår af fig. 1.

Fraktionerne 9 - 25 omfattende 23,1% af den an- 25 vendte aktivitet blev samlet (Protease C).

Fraktionerne 76 - 98 omfattende 25,3% af den an vendte aktivitet blev samlet og benævnt Protease A.

Fraktionerne' 122 - 140 omfattende 23,7% af den anvendte aktivitet blev samlet og benævnt Protease B.

30 6. Affinitetskromtografi på en bacitracinsøjle Søjlen (1,6 cmø x 12 cm) blev equilibreret med pufferen fra trin 1. Den samlede mængde af fraktionerne 9-25 blev anbragt på søjlen. Proteasen blev fortyndet med den sam-

DK 158233 B

18 me puffer tilsat NaCl (1 M) og isopropanol (25%). Flowhastig-heden var 5 ml/min, fraktionsstørrelsen 10 ml. Elueringsdia-grammet fremgår af fig. 2 (OD på 280 nm overfor tid). Fraktionerne 24 - 27 omfattende 73% af den anvendte protease- 5 aktivitet blev samlet og benævnt Protease C.

EKSEMPEL 3

Proteasepræparat afledt fra stamme NCIB 12288

Den samme fremgangsmåde som i ovenstående eksempel 1 blev fulgt til dyrkningen af stamme NCIB 12288. Gærings-10 væsken (0,3 1, 35 CPU/1) gav 11,7 g groft præparat med en aktivitet på 0,39 CPU/g. Udbytte: 43%.

EKSEMPEL 4

Proteasepræparat afledt fra stamme NCIB 12512

Den samme fremgangsmåde som i ovenstående eksempel 15 1 blev fulgt til dyrkningen af stamme NCIB 12512. Gæringsvæsken (1,8 1, 30 CPU/1) gav 19,1 g groft præparat med en aktivitet på 1,0 CPU/g. Udbytte: 35%.

EKSEMPEL 5

Proteasepræparat afledt fra stamme NCIB 12513 20 Den samme fremgangsmåde som i ovenstående eksempel 1 blev fulgt til dyrkningen af stamme NCIB 12513. Det fremkomne præparat blev separeret som i ovenstående eksempel 2, og det viste sig, at det var frit for Protease B.

EKSEMPEL 6

DK 158233 B

19

Bacillusproteasers stabilitet i opløsninger med STPP, natriumperborat og TAED

Opløsninger, hver med en aktivitet på 0,2 CPU pr.

5 liter protease, og indeholdende 1,75 g/1 natriumtripolyfosfat (STPP), 1,0 g/1 natriumperborat og 0,1 g/1 tetraacetylethy- lendiamin (TAED), blev inkuberet i 30 minutter ved 40°C og 50°C. Restaktiviteten måltes derefter ifølge OPA-caseinmeto-den, idet aktiviteten efter inkubering ved 25°C uden natrium-10 perborat og TAED blev sat til 100%. Resultaterne er vist i den følgende tabel: I Procent restaktivitet | I efter 30 minutter ved |

Protease_j_40°C_J_50°C_|

15 III

Protease fra eksempel 1 | 90 - 100 | 60-75 | 20 Protease fra eksempel 3 | 95 - 100 | 70 |

Protease A fra eksempel 2 |_91_| 65 - 70_| EKSEMPEL 7

Vaskeforsøg

Vaskeforsøg udførtes i et Terg-O-tometer (som be-25 skrevet i Jay C. Harris: "Detergency Evaluation and Testing", Interscience Publishers Ltd. (1954), s. 60-61) ved en omrøringshastighed på 100 omdr/min. i 10 minutter ved 60°C med EMPA 116 prøvelapper, 5 cm x 10 cm (bomuld tilsmudset med

DK 158233 B

20 blod, mælk og trækul) fra Eidgenossische Materialprufungs-und Versuchsanstalt, Sankt Gallen, Schweiz. Nedenfor anførte detergentkompositioner A og B anvendtes i vand med 9° tysk hårdhed.

5 Vaskemiddel A (g/1) Vaskemiddel B (g/1^ LAS 1,0 1,0 Sæbe 0,1 0,1 STPP 1,25 1,25

Natriumsilikat 0,25 0,25 10 Natriumsulfat 2,4 2,4

Natriumperborat intet 1,0 TAED intet 0,1 pH 9,5 9,5 hvor 15 LAS = Lineært alkylsulfat (NANSA 80S, produceret af Albright & Wilson) STPP - Natriumtripolyfosfat TAED = Tetraacetylethylendiamin.

Forholdet mellem tøj og væske var 9 lapper pr. 900 20 ml vaskeflotte. De anvendte vaskemiddelenzymer var enzympræparaterne ifølge eksempel 1 og ALCALASE®-protease, begge ved doseringer på 0,05, 0,1 and 0,5 CPU/1.

Resultaterne af gentagne vaskeforsøg med vaskemidlerne A og B er vist i henholdsvis fig. 5 og 6, hvor vas-25 kevirkningen er udtrykt som middelværdier af % remission, bestemt ved remissionfotometri med et ZEISS ELREPHO fotometer ved 460 nm. Tegningen viser, at vaskeeffekten for protease-præparatet ifølge denne opfindelse ved doseringer på ca. 0,05 CPU/1 og derover overstiger virkningen af ALCALASE® protease 30 både med (vaskemiddel B) og uden (vaskemiddel A) perborat + TAED.

EKSEMPEL 8

DK 158233 B

21

Vaskeforsøg med proteasebestandelene A, B og C

Vaskeforsøg blev udført i et Terg-O-Tometer med 100 rpm i 10 minutter ved 50°C. Nedenstående sammensætning an-5 vendtes i vand med 9° tysk hårdhed: LAS 0,4 g/1 AE 0,15 - Sæbe 0,15 - STPP 1,75 - 10 Natriumsilikat 0,4 CMC 0,05 - EDTA 0,01 -

Natriumsulfat 2,1

Natriumperborat 1,0 15 TAED 0,1 - pH 9,5 hvor LAS, STPP og TAED er som i eksempel 7.

AE er alkoholethoxylat (Berol 065, fremstillet af Berol Kemi 20 AB, Sverige).

Rene lapper bestod af hvid bomuld, som blev afslettet med amylase (BAN Novo) tørret og klippet i stykker (10 x 20 cm ) .

Rene lapper blev dyppet i spinatjuice, presset mel-25 lem to ruller og tørret i en tumbler ved 60°C. Dette blev gentaget 2 gange for at opnå besmudsede lapper.

Forholdet mellem stof og væske var 8 lapper (4 rene og 4 besmudsede) i 800 ml detergentopløsning. Protease A, B og C fra eksempel 2 blev testet ved doseringer på 0,1, 0,5 og 30 1,0 CPU/1. Resultaterne fremgår af fig. 7 som %. Remission ved 460 nm overfor proteasedosering.

i DK 158233 B j 22

Figuren viser, at alle tre proteasebestanddele har god vaskevirkning i detergent med perborat ved 50°C.

EKSEMPEL 9

Lagerstabilitet i flydende detergenter 5 Flydende detergenter blev formuleret på følgende måde (mængder i g):

Al/2 Bl/2 Cl/2 Dl/2

Fraktion I;

Vand 30,0/42,0 30,0/42,0 5,0/17,0 28,0/40,0 10 TEA 10,0 10,0 10,0 10,0

CaCl2, 2H20 0,10 0,10 0,10 0,10 DTPA 0,10 0,10 0,10 0,10 DG - - -

Tri-natriumcitrat 5,0 5,0 5,0 5,0 15 H3B03 0/5,0 0/5,0 0/5,0 0/5,0

Fraktion II: MPG 0/12,5 0/12,5 0/12,5 0/12,5

Ethanol, 96% 7,0 7,0 7,0 7,0

Oliesyre 5,0 5,0 5,0 5,0 20 AE 15,0 15,0 15,0 15,0 AES 25,0 25,0 - 25,0 LAS - - 50,0 10 N NaOH til pH: 9,0 10,0 9,0 9,0

Vand tilsat til (g): 100/129,7 100/129,7 100/129,7 100/129,7 25 TEA står for triethanolamin, DTPA for penta-natri- umsalt af diethylen-triamin-pentaacetat, DG for natriumdigly-colat, MPG for mono-propylenglycol, AES for alkohol-ethoxy-sulfat (Dobanol 25-3S/60, produkt fra Shell), LAS for lineær

DK 158233 B

23 alkyl-benzensulfonat (Nansa 1169P), og AE står for alkohol-ethoxylat (Berol 160, product fra Berol Kemi AB, Sverige). I hvert tilfælde blev ingredienserne i fraktion I og II blandet, hvorefter fraktion II langsomt blev tilsat til fraktion 5 I under omrøring.

Vandindholdet (inklusive vand indeholdt i andre ingredienser) var ca. 41% w/w i alle detergenter.

Nedenstående proteasepræparat blev testet: - Det frysetørrede rå præparat fra eksempel 2, opløst i en 10 blanding af vand og MPG (1:1 i vægt) og fortyndet til en aktivitet på 2,5 AU/g.

- Alcalase® 2,5L (produkt fra Novo Industri A/S, Danmark), et kommercielt flydende præparat af alkalisk protease fra Bacillus licheniformis.

15 - Esperase® 8,OL (produkt fra Novo Industri A/S, Danmark) et kommercielt flydende præparat af alkalisk Bacillus- protease, fremstilet i henhold til US patentskrift nr. 3,723,250.

Kalciumindholdet i hvert proteasepræparat blev ind- 20 stillet til 1,0% w/w (som Ca++) ved tilsætning af CaCl 2H~0. I hvert forsøg blev 1% w/w af et proteasepræparat ^ ++ (efter Ca indstilling) til en af ovenstående detergenter, blandingen blev inkuberet ved 50°C og prøver blev taget efter 0, 23, 47 og 134 timers inkubering. Proteaseaktiviteten for 25 hver prøve blev bestemt, og resultaterne fremgår af nedenstående, udtrykt som restaktivitet i % af initial aktivitet (dvs. aktivitet efter 0 dage). pH blev målt efter 0 og 134 timer.

DK 158233 B

24 pH: O t 134 t O t 134 t

Detergent Al A2

Eks. 2 9,0 9,0 9,0 9,0 5 ESPERASE® 9,0 9,1 9,0 9,0 ALCALASE® 9,0 9,1 8,9 9,0

Detergent Bl B2

Eks. 2 10,0 9,9 9,9 9,9 ESPERASE® 10,1 9,8 9,9 9,8 10 ALCALASE® 10,1 9,8 9,9 9,8

Detergent Cl C2

Eks. 2 9,2 9,2 9,0 9,0 ESPERASE® 9,2 9,2 9,0 9,0 ALCALASE® 9,2 9,2 9,0 9,1 15 Detergent Dl D2

Eks. 2 9,1 9,2 9,1 9,0 ESPERASE® 9,2 9,1 9,1 9,0 ALCALASE® 9,2 9,1 9,1 9.0 % restaktivitet: 20 23 t 47 t 134 t 23 t 47 t 134 t

Detergent Al A2

Eks. 2 46 37 16 102 90 86 ESPERASE® 321 72 77 53 ALCALASE® 111 111 25 Detergent Bl B2

Eks. 2 43 33 12 91 80 55 ESPERASE® 2 2 1 67 70 39 ALCALASE® 111 111

DK 158233 B

25 23 t 47 t 134 t 23 t 47 t 134 t

Detergent Cl C2

Eks. 2 38 31 16 89 80 66 ESPERASE® 2 2 21 73 72 41 5 ALCALASE® 111 15 13 3

Detergent Dl D2

Eks. 2 46 37 19 92 87 75 ESPERASE® 951 90 88 66 ALCALASE® 111 441 10 pH var næsten konstant i alle forsøg. Det fremgår, at proteasepræparatet ifølge opfindelsen er mere stabil end Esperase® og Alcalase® i alle de testede detergentformuleringer. Resultaterne viser endvidere, at borat og MPG er meget effektive som stabilisatorer for proteasepræparatet 15 ifølge opfindelsen i flydende detergenter.

Claims

1. Proteasepræparat indeholdende alkalisk protease, kendetegnet ved, at den alkaliske protease udgøres af én eller flere af de proteaser, som dannes ved dyrkning af 5 stammer af Bacillus identificeret ved stammerne NCIB 12288, NCIB 12289 eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber, hvilken alkalisk protease bevarer en restaktivitet målt i casein proteaseenheder (CPU) efter 30 minutter ved pH 9.5 i en opløsning af 1,75 g/1 natriumtripolyfosfat (STPP), 10 1,0 g/1 natriumperborat og 0,1 g/1 tetraacetylethylendiamin (TAED) på mindst 80% og 60% ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 50°C i forhold til restaktiviteten ved 25°C i fraværelse af natriumperborat og TAED.

2. Proteasepræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 proteasen indeholder mindst 10 aktivitets-% i CPU af en pro- teasebestanddel A, som er immunokemisk identisk med proteasen, der er identificeret ved positionen af top A i fig. 1, og som har følgende yderligere kendetegn: en molekylvægt på ca. 41,5 kD, et isoelektrisk punkt på ca. 9,3, en specifik 20 aktivitet på mindst 150 Ansonenheder og 250 hæmoglobin-pro-teaseenheder (AU og HPU, henholdsvis) pr. g protein, og bevarer en restaktivitet målt i CPU efter 30 minutter ved pH 9.5 i en opløsning af natriumtripolyfosfat (STPP, 1,75 g/1), natriumperborat (1,0 g/1), og tetraacetylethylendiamin (TAED, 25 0,1 g/1) af mindst 80% og 60% ved temperaturer på henholdsvis 40°C og 50°C i forhold til restaktiviteten ved 25°C i fraværelse af natriumperborat og TAED. DK 158233 B 27

3. Proteasepræparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det i det væsentlige er fri for andre proteaser end nævnte første protease A.

4. Proteasepræparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 5 balancen af proteaseaktiviteten tilvejebringes af de to proteaser B og C eller blot én af disse, hvor nævnte proteaser er identificeret ved top B i fig. 1 og ved top C i fig. 1 og 2 ved molekylvægte på henholdsvis ca. 28,5 og 31,0 kD ved isoelektriske punkter på henholdsvis ca. 8,8 og 5,2, hvor 10 nævnte proteaser B og C er immunokemisk identiske med hinanden men forskellige fra nævnte protease A.

5. Proteasepræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteasen indeholder i det væsentlige nævnte protease B.

6. Proteasepræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 proteasen indeholder i det væsentlige nævnte protease C.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et proteasepræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker en stamme af Bacillus identificeret ved stammerne NCIB 12288, NCIB 12289 eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber 20 under aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder af karbon, nitrogen og fosfor, fortrinsvis efterfulgt af udvinding af proteasepræparatet fra gæringsvæsken.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at 25 gæ-ringen udføres med en stamme af ovenfor definerede Bacillus-art, hvilken stamme er muteret således, at dens evne til at syntetisere én eller to af proteasebestanddelene i det væsentlige blokeres, mens den bevarer sin evne til at fremstille den/de resterende proteasebestanddel(e). DK 158233B 28

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den muterede stamme er NCIB 12512 eller NCIB 12513.

10. Rensemiddel indeholdende en effektiv mængde, på mindst 0,1 AU, fortrinsvis fra 0,5 til 10 AU af protease-5 præparatet ifølge ethvert af kravene 1 til 6 og/eller pro-teasepræparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 7 til 9.