JPH03287698A

JPH03287698A - 洗浄剤組成物

Info

Publication number: JPH03287698A
Application number: JP9117990A
Authority: JP
Inventors: Taeko Sone; 曽禰　妙子; Masaki Tosaka; 登坂　正樹; Katsuhisa Saeki; 勝久佐伯; Katsutoshi Ara; 勝俊荒; Katsuhiko Deguchi; 勝彦出口
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1990-04-05
Filing date: 1990-04-05
Publication date: 1991-12-18
Anticipated expiration: 2010-02-01
Also published as: JPH078993B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はアルカリプルラナーゼを含有する洗浄剤組成物
に関する。

〔従来の技術〕

洗浄剤に酵素を配合することは古くから実施されている
。洗浄剤中の酵素は洗浄補助剤として働き、例えば衣料
用洗浄剤においては、衣料に付着した各種の汚垢及びシ
ミを、また食器用洗浄剤においては、食器表面に残留す
る油脂類、蛋白質、澱粉等を分解ないしは変質させて除
去しやすくする機能を果す。

特に澱粉質の汚れを除去するために従来はα−アミラー
ゼが用いられており、α−アミラーゼ含有洗浄液に被洗
物を長時間浸漬しておくことにより澱粉質汚れに対する
洗浄力を向上させることができる。

また、本発明者らは、特定のプルラナーゼが、食器、繊
維などに強固に付着した澱粉質汚れに効果的に作用し、
洗浄力を顕著に向上せしめ得ることを見出した（特願昭
６３−２８５４２４号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、自然界において従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性ないし酸性領域において最
大かつ安定な酵素活性を示す、いわゆる中性もしくは酸
性プルラナーゼに分類されるものであるた約、食器用洗
浄剤又は衣料用洗浄剤組成物に適する、すなわちアルカ
リ領域において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐
性を有するプルラナーゼ、いわゆるアルカリプルラナー
ゼ及びアルカリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

・尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適ｐＨをア
ルカリ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プルラナ
ーゼとは、至適ｐｌ（は中性から酸性領域に有するが、
アルカリ領域に於いても至適ｐＨに於ける活性に比較し
て充分な活性を有し、且つ安定性を保持するものを言う
。また、中性とはｐＨ６〜８の範囲を言い、アルカリ性
とはそれ以上のｐＨ範囲を言う。

従来、アルカリプルラナーゼとしては特公昭５３−２７
７８６号公報に記載されているもののみが知られている
。しかし、これは、アルカリ領域に至適ｐＨを有する酵
素であり、従来知られているプルラナーゼより基質特異
性が広い等の特徴を有してはいるが、至適ｐＨが８〜９
と弱アルカリ領域にあるため、洗浄剤成分として使用す
るには適さないという問題があった。また、酵素が不安
定であると同時に酵素の生産性が悪いという欠点も有し
ており、工業的発酵生産に適うものではなかった。

〔課題を解決するための手段〕

このような実情において、本発肋者らは洗浄剤成分とし
て好適な、より高ｐＨ側に至適ｐＨを有し、しかも安定
で生産性も良好なアルカリプルラナーゼについて鋭意研
究を行った結果、下記のアルカリプルラナーゼがかかる
要件を満たすものであることを見出し、本発明を完成し
た。

すなわち本発明は、次の酵素学的性質を有するアルカリ
プルラナーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物
を提供するものである。

１）　作用プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合を加水分解する。

２）基質特異性 α−１，６グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有
する糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分か
れ構造を加水分解する。

３）　作用ｐｉ（及び至適ｐＨ作用ｐＨはｐＨ５〜１１の範囲であり、至適ｐ＋は９．
５〜１１の範囲である。

４）　　ｐ）ｌ安定性ｐ）１８〜１０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ７〜１
０．５の範囲に於いても、５０％以上の相対活性を有す
る（４５℃、１０分間処理による）。

５）　作用温度範囲及び最適温度１０〜６０℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約５
０℃である。

６）温度安定性４０℃までは極めて安定である（ｐＨ９，５の１０ｍＭ
グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間
処理による）。

７）分子量ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は１２０
．０００±５．０００である。

８）金属イオンの影響ｌａｇ”、　Ｃｄ”、　Ｍｎ２＋及びＰｂ２＋で阻害さ
れる。

９）界面活性剤の影響直鎮アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
よって殆ど活性阻害を受けない。

１０）キレート剤の影響ＢＤＴ＾、ＢＧＴＡ、クエン酸及びゼオライトで殆ど活
性阻害を受けない。

１１）プロテアーゼ耐性アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。

本発明に用いられる上記アルカリプルラナーゼは、例え
ば好アルカリ性微生物の一種であるバチルスエスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＫＳＭ−ＡＰ１３７８（Ｆ
［！ＲＭＰ−１０８８６）が産生ずるものである。

この微生物は、次のような菌学的性質を有する。

尚、以下において菌株の分類に用いた培地は次の培地１
〜２１の２１種類であり、これらは何れも別滅菌した炭
酸ナトリウム（Ｎａ２ｃＯｓ）を０．５重量％（以下、
単に％という）含有する。

使用した培地の組成（表示は％）：培地１．　二ニートリエンドブロス、０．８；　　寒天
束（和光純薬製）、１．５培地２．　ニュートリエンドブロス、０．８培地３．　
二ニートリエンドブロス、０．８．　　ゼラチン、２０
．０；寒天束（和光純薬製）、１．５培地４．　バタト
リトマスミルク、１０．５培地５．　ニュートリエンド
ブロス、　０．８　；　ＫＮＯ３，０，１培地６．バタ
トペブトン、０．７；　　ＮａＣ１，０，５；　　ブド
ウ糖、０．５培地７．　３１Ｍ寒天培地（栄研化学ｍｌり　、指示量
培地８．　　ＴＳＩ寒天培地（栄研化学製）、指示量培
地９．酵母エキス、０．５；　　バクトペプトン、１．
５；に２ＨＰＯ４，０，１；　　Ｍｇ５ＩＬ・７Ｈ２０
，０，０２；可溶性澱粉、２．０．寒天束（和光純薬製
）、１．５培地１０．コーサー培地（栄研化学製）、指
示量培地１１．クリステンセン培地（栄研化学製）、指
示量培地１２．■酵母エキス、　０．０５　　：　　Ｎａｚ
Ｓ０４．０．１　　：ＫＨ，ＰＯ，、０，１；　　ブド
ウ糖、１．０■酵母エキス、　０．０５　　：　　Ｎａ
２５Ｏ−、０，１：ＫＨ，ＰＯ４，０，１；　　ブドウ
糖、１．０；　　ＣａＣｌ１２・２Ｈ２０，０，０５；
　　Ｍｎ５Ｏ１’４〜６ＨａＯ＋０．０１；Ｆｅ５０，
４ＬＤ、０．００１；ＭｇＳ［］−４Ｈ−０，０，０２
窒素源としては、硝酸す）　ＩＪウム、亜硝酸ナトリウ
ム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞ
れ０．２５％、０、２０２５％、０．１５８％、０．１
９５％となるように上記■及び■の培地に加えて用いた
。

培地１３．キングＡ培地“栄研″（栄研化学製）。

指示量培地１４．キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）。

指示量培地１５．尿素培地“栄研”　（栄研化学製）、指示量培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
本製薬製）培地１７．３％過酸化水素水培地１８．バタトペプトン、０，５；　　酵母エキス、
０．５；に２ＨＰＯ，、０，１；　　ブドウ糖、１．　
Ｏ；　　Ｍｇ５Ｏ＜・’１Ｈ２０，０，０２培地１９．バクトベプトン、２．７；　　ＮａＣｌ！、
５．５；に、１（Ｐ（１，，０，３；　　ブドウ糖、０
．５；ブロモチモールブルー、０．０６　；　　寒天末
（和光紬薬製）、１．５培地２０．（ＮＨ，）２）ＩＰＯ，，０，１；　　Ｋ（
Ｊ！、０，０２　；　　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０，０，０
２；　　酵母エキス、０．０５；糖、１．０培地２１．
カゼイン、０．５；　　酵母エキス、０．５．　　ブド
ウ糖、１．０；　　Ｋ２）ＩＰＯ４，０，１；　　Ｍｇ
５０４−１Ｈ２Ｑ、　０．０２　；　　寒天末（和光紬
薬製）、　１．５〔菌学的性質〕（ａ）　　顕微鏡的観察結果菌体の大きさは、１．０〜２．２．ｕｍ　ｘ２．２〜４
．４μｍの桿菌であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子
（０，８〜１．口μｍＸ　１．０〜１．８　μｍ）を作
る。周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は不定。抗
酸性はない。

（社）各種培地に於ける生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（培地１）生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑又は波状である。

又集落の色調は乳白色半透明で光沢がある。

■　肉汁寒天斜面培養（培地１）生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色半透
明である。

■　肉汁液体培養（培地２）生育する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３）生育状態は良い。ゼラチンの液化が請められる。

■　リドマスミルク培地（培地４）ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。

リドマスの変色は培地がアルカリ性のため判定できない
。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）硝酸塩の還元
は陽性。脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地６）培地がアルカリ性のため判定できない。

■　ＶＰテスト（培地６）陰性。

■　インドールの生成（培地７）陰性。

■　硫化水素の生成（培ｊｔ！！８）陰性。

■　澱粉の加水分解（培地９）陽性。

■　クエン酸の利用コーサー培地（培地１０）で陰性。グリステンセン培地
（培地１１）では陽性か陰性か判定できない。

■　無機窒素源の利用（培地１２）硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

■　色素の生成（培地１３．１４）陰性。

■　ウレアーゼ（培地１５）陰性。

■　オキシダーゼ（培地１６）陰性、陰性のどちらとも判断できない。

■　カタラーゼ（培地１７）陽性。

■　生育の範囲（培地１８）生育の温度範囲は２０〜４Ｄｔ、生育最適温度範囲は３
０〜３５℃であった。

生育のｐｉ（範囲はｐＨ７〜１Ｏ０５、生前最適ｐＨは
ｐＨ１０であった。

■　酸素に対する態度好気的。

■　Ｏ−Ｆテスト（培地１９）アルカリ性のため変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

■　糖の利用性（培地２０）Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、シヨＩＮ、乳！、）レバロース、Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、サリシ
ン、Ｄ−リボース及びデキストリンを利用する。

■　食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）食塩濃
度が５％では生育するが、７％で生育できない。

■　カゼインの分解（培地２１）陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブのバタテリオロ
ジ−（Ｂｅｒｇｅｙ　ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ）第８
版及びザ・ジーナス・バチルス（”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ。

ｆ！、　　Ｇｏｒｄｏｎ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ　　Ｎ１１４２７゜＾ｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　　Ｌｌ
、　　Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、　Ｃ，。

（１９７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は
有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一
種であると認められる。しかし、本菌株は中性領域では
生育できず、専ら高ｐ＋領域で良好な生育を示すことか
ら、最近、Ｎｏｒ　１ｋｏｓｈ　ｉとＡｋｉｂａ（”Ａ
ｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍ　　　、　　ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｔｏｋｙｏ）、　　１９８
２年刊）の主張している、所謂好アルカリ性（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物に属し、暫定的に
、従来ノ中性で生育するバチルス属細菌とは区別される
。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス　エスピー　ＫＳＭ−ＡＰ１８７６と命名
し、微工研菌寄第１０８８７号（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０８
８７）として通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託した。

上記の微生物を用いて本発明に使用される前記アルカリ
プルラナーゼを得るには、培地に微生物を接種し、常法
に従って培養すればよい。また、培地中には、資化し得
る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好
ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、
例えば、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、
バイブロ、アジパワー、ソイビーンミーノベ綿実油粕、
カルチベーター、アジブロン、ゼストなどの有機窒素源
及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸ア
ンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源と
しては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じ
た分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグリ
コース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボ
ース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビ
ット、クリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸など
が挙げられる。

またその他、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩
、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カ
リウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量
栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リプルラナーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分
離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去すれば、粗酵素液を得ることができる。この
粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要に
応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段によ
り粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化するこ
とにより精製酵素として使用することも可能である。

以下、本発明に使用されるアルカリブルラナーゼの精製
法の一例を挙げ、更に詳しく説明する。

アルカリ性バチルス属細菌にＳトへＦ１８７６株を、１
％プルラン、０．２％トリプトン、０．１％酵母エキス
、０．０３％ＫＨ２ＰＯ，，０，０２％ＣａＣ１２’　
２１（，０，０，１％（ＮＨ４）２Ｓ口１、０．００１
％Ｆｅ５Ｏａ”？Ｈ２０、０，０００１％ＭｎＣｊ！ｚ
・４Ｈ２０，０，０２％Ｍｇ５Ｏｉ・７Ｈ３０及び０．
５％炭酸ナトリウムを含む培地で、３０℃にて３日間好
気的に振盪培養し、得られる培養液から菌体を除き、上
澄液を得る。次いで、該上澄液にＤＲＡＢ−セルロース
粉末を加え、上澄液中のプルラナーゼを完全にＤＢＡＢ
−セルロースに吸着させる。次いで、１０ｍＭ）　’）
スー塩酸緩衝液（ｐＨ８＞で樹脂を洗浄した後、０．６
Ｍの食塩を含む同緩衝液で酵素を溶出する。更に、１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対して透析濃縮後
、同緩衝液で平衡化したＤ［！ＡＢ−セルロースＤＢＳ
２に吸着させ、同緩衝液を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度
勾配により溶出し、その活性画分を集め、平均分画分子
量１０．０００の限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．
１Ｍ食塩を含む同緩衝液を用いて一夜透析する。これを
濃縮し、次いで透析後、０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で
平衡化したセファクリルＳ−２００カラムに吸着後、Ｏ
，１Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画分を集
め、更にＤＢＡＥ！トヨバール６５０３カラムに吸着さ
せる。吸着した酵素を、１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（
ｐｔ１８）中、０．１〜ＩＭの食塩の濃度勾配により溶
８し、その活性画分を集める。集められた活性画分を、
限外濾過膜を用いて濃縮した後、２Ｍ硫酸アンモニウム
を含む同緩衝液で平衡化したブチル　トヨパール６５０
８カラムに吸着させ、１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（Ｊ
）Ｈ８）を用いて２〜ＯＭの硫酸アンモニウムの濃度勾
配により溶出し、その活性画分を集める。

集められた活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後
、同緩衝液を用いて一夜透析する。斯くして得られる精
製酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１
５％）及びソジウムドデシル硫酸（ＳＯ３）電気泳動で
単一のバンドを与え、活性収率は約４％であった。

斯くして得られる、アルカリプルラナーゼの酵素化学的
諸性質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々１０ｍＭ宛）を
用い、以下の方法に従って行った。

ｐＨ４〜６　　酢酸緩衝液ｐｔ１６〜８　　リン酸緩衝液ｐＨ１１〜１２　　　グリシン−食塩−水酸化す）　Ｉ
Ｊウム緩衝液ｐＨ１１〜１２　　　塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液酵素活性測定法：各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は０
．２５％）を溶解させた基質溶液０．９ｄに、酵素液０
゜１ｄを加え、４０℃で、３０分間反応させた。反応後
、３．５−ジニトロサリチル酸（３゜５−ｄｉｎｉｔｒ
ｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ））法にて
、還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０−にＤＮ
Ｓ試薬１．０−を加え、５分間、１００℃で加熱発色さ
せ、冷却後、４．０ｍｌの脱イオン水を加えて希釈し、
波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素の力価は、１分間
に１μｍｏ１のグルコースに相当する還元糖を生成する
酵素量を１単位（ＩＵ）とした。

（酵素学的諸性質） ■　作用プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合も加水分解する。

■　基質特異性 α−１，６グルコシド結合で分岐した枝分がれ糖のうち
、マルトース以上の重合度を有する枝分かれ構造を加水
分解する（表１）。

以下余白表１ ■　作用ｐＨ及び至適ｐＨ作用ｐｌをｐＨ５〜１１の範囲に有し、至適ｐＨをｐＨ
９，５〜１１の範囲に有する。

尚、各ｐＨにおけるプルラナーゼ活性を、０．２５％プ
ルラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、リン酸緩
衝液（ｐＨ６〜８．５）、グリシン−食塩−水酸化す）
　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ８，５〜１１）及び塩化カリウ
ム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉｌｌ〜１２）の反
応系を用い、４０℃で３０分間反応させて測定した結果
を第１図に示す。

■　ｐＨ安定性ＰＨ８〜１０で極めて安定であり、ｐＨ７〜１０．５に
於いても、約５０％以上の活性を維持する。

尚、各ｐＨにおけるプルラナーゼ活性を、０．２５％プ
ルラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）、リン酸緩
衝液（ｐｔ１６〜８．５）、グリシン−食塩−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，５〜１１）及び塩化カリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉｌｌ〜１２）の反応
系を用い、４５℃で１０分間反応させて測定した結果を
第２図に示す。

■　作用温度範囲及び最適温度１０℃〜６０℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は
約５０℃に認められる（第３図）。

■　温度安定性本酵素についてｐ）１９．５の条件で温度を変化させ、
各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べ
ると、４０℃までは極めて安定であり、また、５０℃に
於いても約５０％以上の残存活性を有する（第４図）。

■　分子量ＳＯ３電気泳動法（ゲル濃度７．５％）による分子量は
約１２０．０００±５．０００である。

■　金属イオンの影響１ｒｎＭの）Ｉｇ”、　Ｃｄ”、及びＭｎ２＋で強く阻
害され、Ｐｂ２＋で若干疎外された。

■　界面活性剤の影響直鎮アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ＳＯ３，
石鹸、ソフタノール（登録商標）等の各種界面活性剤の
０．０５％溶液で４０℃にて１５分間処理しても殆ど活
性阻害を受けない。

■　キレート剤の影響キレート剤であるＢＤＴＡ　（１０ｍＭ）　、ＢＧＴＡ
　（１０Ｍｍ）　、クエン酸（０，０５％）及びゼオラ
イト　（０，０５％）は殆ど活性を阻害しない。

■　プロテアーゼ耐性ＡＰＩ−２１（昭和電工社製）、マクサターゼ（ＩＢＩ
Ｓ社製）、サビナーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ（
ノボ社製）等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共
存（０，２Ａｌｌ／ｊ７）させても、何れのプロテアー
ゼに対しても強い耐性を有する。

上記アルカリプルラナーゼは、本発明洗浄剤組成物中に
、通常０．１〜１０重量％配合される。

なお、アルカリ又はアルカリ耐性プルラナーゼは、精製
酵素を用いてもよいし、培養液をそのまま粗製酵素とし
て用いてもよい。

本発明の洗浄組成物に配合される、その他の洗剤常用成
分は、特に限定は付されず、用途、目的に合わせて任意
に配合されてよい。以下、それらの配合成分について述
べる。

（１）界面活性剤の配合量は特に限定されないが好まし
くは０．５〜６０重量％配合される。本発明の洗浄剤組
成物に用いることができる界面活性剤としては、陰イオ
ン性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルフォン
酸塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩、アルキ
ル又はアルケニル硫酸塩１．ｔレフインスルフォン酸塩
、アルカンスルフォン酸塩、飽和又は不飽和脂肪酸塩、
アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−ス
ルホ脂肪酸塩又はエステル、アミノ酸型界面活性剤、Ｎ
−アシルアミノ酸型界面活性剤、アルキル又はアルケニ
ル酸性燐酸エステル、アルキル又はアルケニル燐酸エス
テル又はその塩などが、両性界面活性剤としては、カル
ボキシ又はスルホベタイン型界面活性剤などが、非イオ
ン界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル
又はアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又は
そのアルキレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステ
ル、脂肪酸クリセリンモノエステル、アルキルアミンオ
キサイド、アルキルグリコシドなどが、カチオン性界面
活性剤としては、第四級アンモニウム塩などが例示され
る。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合は界面活性剤としては、低泡性乃至無泡性の非
イオン性界面活性剤が好ましい。

この種の界面活性剤の例としてはアルコキシ化非イオン
性界面活性剤（このアルコキシ部はエチレンオキサイド
、プロピレンオキシド及びその混合物からなる群から選
ばれたものである）が挙げられる。このような界面活性
剤の具体例としては、ＢＡＳＦジャパン社の”ｐｌｕｒ
ａｆａｃ　（登録商標）　ＬＦ４０３”、“Ｐｌｕｒａ
ｆａｃ　ＬＦ１３００″及び日本触媒化学工業■の“ソ
フタノールＥＰ７０４５”　（登録商標）等が挙げられ
る。本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤とし
て用いる場合、界面活性剤は組成物中に０．５〜３０重
量％配合されることが好ましい。

（２）炭酸塩、重炭酸塩、珪酸塩、ホウ酸塩、アルカノ
ールアミンなどのアルカリ剤あるいは硫酸塩などの無機
電解質は、普通０〜９０重量％配合される。

（３）トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルトリン酸
塩等のリン酸塩、エタン−１，１−ジホスホン酸塩等の
ホスホン酸の塩、２−ホスホノブタン−１，２−ジカル
ボン酸等のホスホノカルボン酸の塩、アスパラギン酸、
グルタミン酸等のアミノ酸の塩、ニトリロ三酢酸塩、エ
チレンジアミン四酢酸塩等のアミノポリ酢酸塩、ポリア
クリル酸、ポリアコニット酸等の高分子キレート剤、シ
ュウ酸、クエン酸等の有機酸の塩、アルミノ・珪酸塩な
どの二価金属イオン捕捉剤は、組成物中に普通０〜５０
重量％配合される。

（４）過炭酸ソーダ、過炭酸ソーダ、次亜塩素酸ソータ
、ジクロルイソシアル酸などの漂白剤は０〜８５重量％
配合される。

（５）その他の少量成分として、ポリエチレングリコー
ル、カルボキシメチルセルロース等の再汚染防止剤、プ
ロテアーゼ、リパーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ等
の酵素、亜硫酸塩等の酵素失活防止剤、螢光染料、青味
付剤、色素、ケーキング防止剤、可溶化剤、酵素あるい
は漂白剤の活性化剤、金属腐食防止剤などを必要に応じ
て配合することができる。

本発明に使用し得るプロテアーゼの例としては、バチル
ス・ズブチリスやバチルス・リケニフォルミス等、特定
の菌株から得られるズブチリシンが挙げられる。これら
の例としてはギスト社から販売されている“マクサター
ゼ”　（登録商標）、ノボ・インダストリー社の“アル
カラーゼ″　（登録商標）、“エスペラーゼ”　（登録
商標）及び“サビナーゼ”　（登録商標）などが挙げら
れる。

また、本発明に使用し得るα−アミラーゼの例としては
、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ズブチリス
等から得られたものが挙げられ、市販品の例としてノボ
・インダストリー社の“ターマミル”　（登録商標）、
ギスト社の“マキサミル”　（登録商標）等が挙げられ
る。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合、前記各成分以外のバランス成分としては、粉
末組成物の場合、無機アルカリ剤を用いるのが好ましい
。無機アルカリ剤としては、例えばピロリン酸ナトリウ
ム、オルトリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウ
ム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、セスキ炭酸ナ
トリウム、ホウ砂、珪酸ナトリウムなとが挙げられる。

特に、珪酸酸ナトリウムは金属腐食防止作用を有するの
で、これを他のアルカリ剤と併用するのが望ましい。こ
の場合、他のアルカリ剤３５〜８５重量％及び珪酸ナト
リウム（ＳｉＯ２／　Ｎａ２Ｏ比が１／１〜４／１、好
ましくは２／１〜２．５／１）２〜１５重量％を併用す
るのが最も好ましい。無機アルカリ剤は、０．０５〜１
重量％濃度の洗剤溶液がｐＨ！］、０〜１１．０になる
ように配合量を調整する。液体の場合は、バランス成分
は水である。

また、自動食器洗浄機用洗剤には、銅腐食防止剤として
炭化水素鎖長が８〜１８程度である脂肪酸や、ベンゾト
リアゾール等を添加することも効果的である。

また、多くの洗浄剤について無リン洗剤が主流である現
在、環境問題の点からリン酸塩含有洗剤は社会的な問題
になりかねない。そこで、自動食器洗浄機の普及に伴い
、各種汚れに対する洗浄力を低下することなく無リン化
することも重要である。

無リン化する際には、二価金属イオン捕捉剤として、次
の一般式（Ｉ）で表わされるヒドロキシ多価カルボン酸
又はその水溶性塩を使用するのが好ましい。

（式中、ＸＩ；！−）１、−Ｃ）１３、−ＣＨ，ＣＤ叶
又は−ＣＨ（ＤＨ）　ＣＤＤＨを、Ｙは一■又は−計を
表す）この中でも、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸又はそ
れらの水溶性塩が好ましい。かかる塩としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、モノエタノールアミン塩、ジェタ
ノールアミン塩、トリエタノールアミン塩等が例示され
る。

このような成分は、本発明洗浄剤組成物中に０．５〜３
０重量％配合するのが好ましい。

また、更に二価金属イオン捕捉剤として高分子キレート
剤１〜１０重量％を併用するのが好ましい。高分子キレ
ート剤としては、特開昭５７−１４５１９９号公報に記
載されているような二価金属イオン捕捉高分子電解質が
例示できるが、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、
アクリル酸メタクリル酸共重合体、それらの水溶性塩等
が挙げられ、平均分子量は１．５００〜１００．０００
、特に３．０００〜２０．０００のものが好ましい。

本発明の洗浄剤組成物は、上記成分を常法に従って混合
し、粉末状、顆粒状又は液状の衣料用、食器用、住居用
等の洗浄剤として使用することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

製造例１（１）神奈川県横浜市の土壌を薬匙−杯（約０．５ｇ）
、滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理し
た。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天
培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて
３日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にプルラ
ンの溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、プル
ラナーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液
体培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後
、遠心分離した上清液について、プルラナーゼ活件をｐ
Ｈ１０にて測定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスク
リーニングした。

上述の方法により、アルカリプルラナーゼ生産菌バチル
ス　エスピー　ＫＳＭ−八Ｐ１８７６（ＦＢＲＭ　Ｐ１
０８Ｂ？）を取得することが出来た。

培地Ａ、プルラン　　　　　　　　　０．８％着色プル
ラン　　　　　　　０．２％ポリペプトン　　　　　　　０．２％酵母エキスＫＨ，ＰＯ。

（ＮＨ４）　、ＳＯ。

Ｍｇ５Ｏｓ・７Ｈ２０ＣａＣｊ！　２”２Ｈ２０ＦｅＳＯ，”７ＬＯＭｎＣｊ！　２”４Ｈ２０寒天ｐＨ１０，０培地Ｂ、プルラントリプトン酵母エキスＫＨ２ＰＯ。

（ＮＨ，）　２ＳＯ。

Ｍｇ５ＩＬ・７１１．０ＣａＣｊ！　ｚ・２Ｈ２０ＦｅＳ０．４Ｈ，ＯＭｎＣｊ！　２”４Ｈ２００，１％０．０３％０．１％０．０２％０．０２％０．００１％０．０００１％１．５％１　％０．２％０．１％０．０３％０．１％０．０２％０．０２％０．００１％０、０００１％ｐＨ１０，０（２）アルカリプルラナーゼ生産菌であるバチルスエス
ピー　ＫＳＭ−ＡＰＬ８７６株を参考例１の液体培地已
に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体
を遠心分離して除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更
に、通常の方法に従って、エタノール乾燥粉末とし、以
下の表２に示す粗酵素標品を得た。なお、表２の酵素活
性はｐＨ９に於ける測定値である）。

（３）（２）で得られた粗酵素液について、■ＤＢＡＥ
セルロース吸着、■ＤＲＡＢセルロース（ワットマン社
製）クロマトクラフィー、■セファクリル（ファルマシ
ア社製）クロマトグラフィー、■ＤＢＡＥ　）ヨバール
（東洋曹達社製）クロマトグラフィー、■ブチル　トヨ
バール（東洋曹達社製）クロマトグラフィーをすること
によって精製を行い、アルカリプルラナーゼを得た。

得られたアルカリプルラナーゼについてデービス（Ｄａ
ｖｉｓ　Ｄ、Ｊ、、＾ｎｎ、　Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、　１２１゜４０４　（１９６４））の方法に従
って電気泳動を行った後、コマシー・ブリリアント・ブ
ルーで染色して単一のバンドを与えることを確言忍した
（第５図）。

（４）　　（３）で得られたアルカリプルラナーゼにつ
いて常法に従い、ＳＯ３電気泳動を行った（第６図）。

この結果から、本酵素の分子量は１２０．０００±５．
０００・であった。

実施例１　（自動食器洗浄機用洗浄剤）本実施例で採用
した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果は次の通りであ
る。

（１）洗浄条件使用洗浄機；松下電器■製全自動食器洗い機（機種ＮＰ
−６００）洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの。

洗浄温度；５℃から５５℃まで徐々に昇温する。

洗浄用水；硬度３．５°叶の水洗浄濃度；０．２％洗浄時間；洗浄２０分、すすぎ２０分洗浄時の循環水量；２．５β （２）洗浄力の評価澱粉汚れの汚染皿及び評価方法（汚染皿）白玉と米飯を９＝１で混合し、これに等量の水道水を加
えミキサーで混合する。この汚れ４ｇを直径２２ｃｍの
磁性の皿に均一に塗布し、−昼夜風乾する。

以上の汚染皿３枚を洗浄試験に供した。

（澱粉汚れ洗浄力評価方法）澱粉の残存を、ヨウ素の呈色反応によって生じる青色部
分面積（Ｐｌ）を写真判定によって測り、以下初期の汚
染面積（Ｓｏ）から洗浄率を下の式によって求めた。

洗浄率＝　Ｃ（Ｓｏ−Ｐ、）／Ｓ、１ｘ１００（３）洗
浄組成表３クエン酸ナトリウム　　　　　　　　２０１号珪酸ナト
リウム　　　　　　　　５酵素　　　　　　　表３炭酸ナトリウム　　　　　　　　バランス（注）数字は
重量％を示す。

ただし酵素は洗剤中の活性で示す。

（４）洗浄力試験結果試験結果を表３に示す。

以下余白表３中の酵素活性は、以下の方法で測定した。

プルラナーゼ２種については、１０ｍＭグリシン−食塩
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９、０）中にプルラン
（反応系における最終濃度は０．２５％）を溶解させた
基質溶液０．９ｍＩ！に、酵素液０．１−を加え４０℃
で３００分間反応せる。

また、ターマミル６０Ｔについては、１０ｍＭグリシン
−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中に可溶性
澱粉（反応系における最終濃度は０．２５％）を溶解さ
せた基質溶液０．９ｍｆに、酵素液０．１−を加え５０
℃で、１５分間反応させる。

反応後、３．５−ジニトロサリチル酸（３，５−ｄｉｎ
ｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ））
法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液ｉ、　Ｏ
ｍｊ！に［］ＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１００
℃で加熱発色させ、冷却後、４．０−の脱イオン水を加
えて希釈し、波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素の力
価は、１分間に１μｍｏｊ７のグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を１単位（ＩＵ）とした。

実施例２（衣料用洗浄剤）本実施例で採用した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果
は次の通りである。

（１）人工汚染布白玉と米飯を９：１で混合し、水道水で２倍に希釈しミ
キサーにかける。この液を木綿布１０ｃｍＸ１０ｃｍの
試験片に布の重量の２．５〜５％になるように塗布する
。２０℃、２４時間乾燥し、実験に供した。

（２）洗浄条件及び方法４°叶硬水に洗剤を溶解し、０．６６５％洗剤水溶液１
１を調製する。木綿人工汚染布５枚を洗剤水溶液に添加
し、４０℃で１時間静置後、洗剤溶液と人工汚染布をそ
のままターボトメ−ター用ステンレスビーカーに移し、
ターボトメ−ターにて１１００ｒｐ　、　２０℃、１０
分間撹拌洗浄する。流水下ですすいだ後、２０℃、２４
時間乾燥し、重量測定に供した。

（３）洗浄力の評価洗浄前の原布及び洗浄前後の汚染布の重量を測定し、次
式によって洗浄率（％）を算出した。

洗浄率（％）＝表４中の各洗浄率の値は５枚の平均値を示した。

（４）洗剤組成アルキルエトキシ硫酸ソーダ　　　　　５（Ｃ，ｓ〜Ｃ
，ｓ、　ＢＯ＝３ｍｏｆ　）４Ａ型ゼオライト　　　　
　　　　　　　１５ケイ酸ソーダ　　　　　　　　　　
　１５炭酸ソーダ　　　　　　　　　　　　　１５ポリ
アクリル酸ソーダ（ＭＷ＝８０００）　　　　１５ポリ
エチレングリコール（ＭＷ＝６０００＞　　　１．５酵
素　　　　　　　表４螢光染料　　　　　　　　　　　　　　０．５芒　硝　
　　　　　　　　　　　　　　残量水　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５（注）数字は重量％
を示す。

ただし酵素は洗剤中の活性を示す。

（５）洗浄力試験結果試験結果を表４に示す。

以下余白表４なお表４中の酵素活性の測定は、表３に準じて行った。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明の洗浄剤組成物は、通常の洗浄時
間内において、澱粉質汚れに対する優れた洗浄力を有す
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応ＰＨと相対活性との関係を示す図面である。第２図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理ｐＨと残存活性との関係を示す図面である。第３図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応温度（ｐＨ９，５＞と相対活性との関係を示す図面
である。第４図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理温度（ｐＨ９，５）と残存活性との関係を示す図面
である。第５図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
電気泳動の結果を示す図面である。第６図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
ＳＯ３電気泳動の結果を示す図面である。以上第１図４　５　６７　８　９　１０１１１２反応ｐ）（反応間反応ｐＨ第３図第５図０２゜３０　４０　５０　６０゜反応温度（０Ｃ）０第図第図処理温度（０Ｃ）手続補正書（自船６、補正の対象平成２年７月２日明細書の「発明の詳細な説明」の欄７、補正の内容１、事件の表示平成２年特許願第９１１７９号（１）明細書第９ページ第５〜６行、ｒＫＳＭ−ＡＰ１３７８（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０８８６月
とあるを、２、発明の名称ｒＫＳＭ−ＡＰ１８７６（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０８８７月
と訂正する。洗浄剤組成物住所

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の酵素学的性質を有するアルカリプルラナーゼ
を含有することを特徴とする洗浄剤組成物。１）作用プルランのα−１，６グルコシド結合を分解してマルト
トリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、
グリコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−１，６グ
ルコシド結合を加水分解する。２）基質特異性 α−１，６グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有
する糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分か
れ構造を加水分解する。３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ作用ｐＨはｐＨ５〜１１の範囲であり、至適ｐＨは９．
５〜１１の範囲である。４）ｐＨ安定性ｐＨ８〜１０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ７〜１０
．５の範囲に於いても、５０％以上の相対活性を有する
（４５℃、１０分間処理による）。５）作用温度範囲及び最適温度１０〜６０℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約５
０℃である。６）温度安定性４０℃までは極めて安定である（ｐＨ９．５の１０ｍＭ
グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間
処理による）。７）分子量ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は１２０
，０００±５，０００である。８）金属イオンの影響Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋及びＰｂ＾
２＾＋で阻害される。９）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
よって殆ど活性阻害を受けない。１０）キレート剤の影響ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸及びゼオライトで殆ど活
性阻害を受けない。１１）プロテアーゼ耐性アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。
（２）アルカリプルラナーゼが、バチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）属に属する微生物の培養物よ
り分離取得されたものである請求項１記載の洗浄剤組成
物。
（３）微生物が、バチルスエスピー（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ￥ｓｐ．）ＫＳＭ−ＡＰ１８７６と命名され、微工研
菌寄第１０８８７号として寄託されたものである請求項
２記載の洗浄剤組成物。