JP4382994B2 - 新規アルカリセルラーゼ - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗剤酵素として有用なアルカリセルラーゼ及びその製造法並びに当該アルカリセルラーゼを生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
衣料、紙、建築材料等に利用されているセルロースは、分解によって燃料物質やより高付加価値の代謝物質へと変換が可能である。従って、当該セルロースを分解する酵素セルラーゼについては、世界中の研究機関において多岐にわたり研究され、これまでに中酸性に最適反応ｐＨを有する中酸性セルラーゼを中心として、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来のセルラーゼが数多く見出されている。
【０００３】
一方、１９８２年に掘越（特公昭５０−２８５１５号公報、Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、それまで困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が示唆されて以来、アルカリセルラーゼは衣料用洗剤等へ配合され、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼと並ぶ洗剤用酵素としての地位を確立してきた（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−３０５７８号公報、ＵＳＰ４９４５０５３等）。
【０００４】
一般に、洗剤用酵素として優れた効果を発揮するプロテアーゼ、リパーゼ又はアミラーゼ等の共通した特徴として、いずれも高い等電点を有していることが経験的に認められ、等電点の高い酵素は洗浄力も高いと考えられている。従って、洗剤用酵素としてのセルラーゼについても等電点の高いものが求められるが、これまでに高等電点を有するアルカリセルラーゼは一部のカビ（Fusarium oxysporum）由来のものが見出されているのみであり（ＷＯ９５／２４４７１号公報）、その等電点も９であって、洗浄力も必ずしも十分とはいえない。
【０００５】
本発明の目的は、高い等電点を有し、優れた洗浄力を有する新規なアルカリセルラーゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自然界から高等電点を有するアルカリセルラーゼを得るべく種々のセルラーゼ産生菌をスクリーニングしたところ、等電点約９．３を有し、洗剤用酵素として有用な新規アルカリセルラーゼを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、等電点電気泳動法により測定された等電点が約９．３であるアルカリセルラーゼ及びその製造法並びに該アルカリセルラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【０００８】
また本発明は、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３として寄託された微生物を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリセルラーゼは、その等電点が約９．３であることを特徴とするものであるが、酸化剤に耐性を有すること、酵素タンパク質の中で容易にジスルフィド結合が生じて活性等に影響を与えないこと等の点から、当該酵素タンパクの構成アミノ酸としてシステインを含まないものが好ましく、更にグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合に、最適反応温度が約５５℃であるものが好ましい。
【００１０】
また本発明のアルカリセルラーゼは、更に以下の酵素学的性質を有するものが好ましい。
１．作用：
カルボキシメチルセルロースを液化型で良好に分解する。
２．基質特異性：
カルボキシメチルセルース、リケナン、結晶性セルロース及びセロトリオース以上のセロオリゴ糖を分解し、還元糖を生成する。
３．最適反応ｐＨ：
少なくともｐＨ５〜１０で作用し、最適ｐＨは約８．５である。
４．最適反応温度：
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合、最適反応温度は約５５℃である。
５．安定ｐＨ範囲：
３０℃、６０分間で処理した場合、ｐＨ５〜１１の範囲で安定である。
６．耐熱性：
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１５分間の処理において、５５℃まで安定である。
７．分子量：
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、約４３ｋＤａである。
【００１１】
本発明のアルカリセルラーゼはその生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造される。斯かるアルカリセルラーゼ生産菌としては、バチルス属に属する細菌、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株が挙げられる。
【００１２】
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×３．２〜６．８μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．８〜１．０×１．０〜１．６μｍ、準端位、膨潤有り。
（ｅ）グラム染色：不定、但しクリスタルバイオレット（ＣＶＴ）寒天培地には生育しない。
（ｆ）抗酸性：陰性
【００１３】
Ｂ．生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地１）：陽性
（ｂ）脱窒反応（培地１）：陰性
（ｃ）ＭＲテスト（培地２）：陽性（ｐＨ５−５．５）
（ｄ）ＶＰテスト（培地２）：陰性
（ｅ）インドールの生成（培地３）：陰性
（ｆ）硫化水素の生成（培地４）：陰性
（ｇ）デンプンの加水分解（培地５）：陽性
（ｈ）カゼインの加水分解（培地６）：陰性
（ｉ）ゼラチンの液化（培地７）：陰性
（ｊ）クエン酸の利用（培地８）：陰性
（ｋ）カタラーゼ：陽性
（ｌ）オキシダーゼ（培地９）：陽性
（ｍ）ウレアーゼ（培地１０）：陰性
（ｎ）生育の温度範囲（培地１１）：１３−１４℃
（ｏ）生育のｐＨ範囲（培地１２）：ｐＨ６−１０
（ｐ）生育における酸素の影響（培地１３）：嫌気条件下で生育する。
（ｑ）塩化ナトリウム耐性（培地１４）：１０％塩化ナトリウム存在下で生育する。
（ｒ）グルコースからのガス産生（培地１５）：陰性
（ｓ）糖からの酸産生（培地１６）：グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトール、ガラクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース、フラクトース、メリビオース、リボース、サリシン、グリセロール、ラムノース等から酸産生が認められ、ソルビトール、イノシトールから酸産生は認められない。
【００１４】
ここで、培地１〜１６は、それぞれ以下の組成を示す。
培地１：ニュートリエントブロス（ディフコ）０．８重量％、硝酸カリウム０．１重量％
培地２：バクトペプトン（ディフコ）０．７重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース（別滅菌）０．５重量％
培地３：ＳＩＭ培地、インドール産生試験用濾紙（日水製薬）
培地４：ＴＳＩ寒天培地（栄研化学）
培地５:バクトペプトン（ディフコ）１．５重量％、酵母エキス０．５重量％、可溶性デンプン２．０重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、寒天１．５重量％
培地６：酵母エキス０．５重量％、グルコース２．０重量％、カゼイン０．５重量％、リン酸１水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、寒天１．５重量％
培地７：ニュートリエントブロス（ディフコ）０．８重量％、ゼラチン１．２重量％、酵母エキス０．５重量％
培地８：Ｓｉｍｍｏｎｓ培地（栄研化学）
培地９：チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬）
培地１０：尿素培地（栄研化学）
培地１１：ニュートリエントブロス
培地１２：ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、塩酸を別滅菌後に添加し、ｐＨを調整。
培地１３：アナエロビックアガー（ディフコ）
培地１４：ニュートリエントアガー（ディフコ）に塩化ナトリウムを添加。
培地１５：バクトペプトン１．０重量％、塩化ナトリウム０．５重量％、グルコース１．０重量％、フェノールレッド０．００２重量％、ｐＨ７．２〜７．４に調整。
培地１６：リン酸１水素アンモニウム０．１重量％、塩化カリウム０．０２重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０２重量％、酵母エキス０．０２重量％、寒天１．５重量％、ブロモクレゾールパープル０．０００６重量％、糖類（濾過滅菌）１．０重量％
【００１５】
以上、ＫＳＭ−Ｎ２５７株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス サーキュランスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス サーキュランスとは一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３）として寄託した。
【００１６】
ＫＳＭ−Ｎ２５７株等のアルカリセルラーゼ生産菌を用いて本発明のアルカリセルラーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すればよい。使用する炭素源、窒素源には特に制限はなく、資化し得る炭素源、例えばセロオリゴ糖、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ラクトース、ガラクトース、アラビノース、シュークロース、マルトース等が挙げられる。また、窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられる。その他リン酸塩、金属塩、有機無機微量栄養源を適宜添加することができる。培地のｐＨは、本発明の酵素生産に適したｐＨに炭酸ナトリウム等を用いて調整すればよい。
【００１７】
得られた培養液中からのアルカリセルラーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段、例えば塩析法、溶剤沈殿法、限外濃縮等により目的酵素を濃縮することができる。塩析法の例として硫酸アンモニウム（３０−９０％飽和画分）、溶剤沈殿の例として冷アセトン（５０％以上）等の条件下において酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理を行い凍結乾燥粉末や噴霧乾燥粉末を得ることができる。脱塩方法としては透析、セファデックスＧ−１０等を用いるゲル濾過、限外濾過等が用いられる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが、更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１８】
かくして得られる本発明のアルカリセルラーゼは、下記（１）〜（１１）に示す性質を有する。尚、酵素活性の測定は次のように行った。
【００１９】
＜酵素活性測定法＞
試験管に０．１mLの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、０．４mLの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＡＯ１ＭＣ；日本製紙）、０．４mLの脱イオン水、０．１mLの適当に希釈した酵素液（希釈は１０mMトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５で行った）を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmoLのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００２０】
＜酵素学的性質＞
（１）分子量（ＳＤＳ電気泳動）
ＳＤＳ処理（１００℃、３分間）した酵素液について１２．５％アクリルアミドゲルを用いＳＤＳ電気泳動を行った。標準タンパク質としてホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）、血清アルブミン（６７ｋＤａ）、卵白アルブミン（４５ｋＤａ）、カルボニックアンヒドロラーゼ（３１ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を用い、それぞれの移動度と分子量から検量線を作成し、本酵素の分子量を求めたところ約４３ｋＤａと推定された。
【００２１】
（２）等電点
２％（ｖ／ｖ）アンフォライン（ファルマライトｐＨ８−１０．５；ファルマシア）を添加した５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルを用いて本酵素の等電点電気泳動を行った（１１１型；バインラッド）。泳動したゲルをクマーシブリリアントブルーＧ−２５０により染色した後、標準タンパク質の等電点と移動点から得た検量線より本酵素の等電点を求めたところ、約９．３であると決定された。
【００２２】
（３）最適反応ｐＨ
酢酸緩衝液（ｐＨ４−６）、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５−７．５）、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６−８）、リン酸緩衝液（ｐＨ６−８）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９−１１）、炭酸緩衝液（ｐＨ９−１１）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１−１２．５）の各緩衝液（５０mM）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、本酵素はｐＨ８．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ７から９の間で最大活性の７０％以上の活性を示すとともにｐＨ５から１０の広範囲でも最大活性の１０％以上の活性を有していた（図１）。
【００２３】
（４）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中、３０℃−７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は５５℃付近に最適反応温度を示した（図２）。
【００２４】
（５）安定ｐＨ範囲
酢酸緩衝液（ｐＨ４−６）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４−７）、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６−８）、リン酸緩衝液（ｐＨ６−８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−１１）、炭酸緩衝液（ｐＨ９−１１）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１−１２．５）の各緩衝液（２０mM）中に酵素を加え、３０℃、６０分間恒温した後、残存活性を測定した。その結果、本酵素は処理前活性を１００％とした場合、ｐＨ５−１１の範囲で極めて安定であった（図３）。
【００２５】
（６）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に酵素を添加し、３０℃−７０℃の各温度で１５分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において５５℃まで安定であった（図４）。また、１mM塩化カルシウムを添加した場合においても同様の結果であった。
【００２６】
（７）基質特異性
標準活性測定条件下でカルボキシメチルセルロースに対する分解速度を１００％とした場合、リケナンに対して２８７％と高い分解速度を示したが、キシラン、カードラン、ラミナリンについては全く分解しなかった。また、不溶性セルロースであるシグマセル１０１（シグマ）に対し０．１２％、アビセルＳＦ（フナコシ）に対し０．０１３％の反応速度で分解した。
しかし、パラニトロフェニル基（ｐＮＰ）誘導体であるグリコシド（ｐＮＰＧ１）からセロテトラオシド（ｐＮＰＧ４）についてはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で全く分解しなかった。
【００２７】
（８）基質の分解様式
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、１．０％カルボキシメチルセルロース（Ａ１ＯＭＣ；日本製紙）からなる反応液をオストワルド粘度計に入れ、３０℃で１０分間恒温した後、酵素を添加し全量を１０mLとした。５分〜３０分後に粘度を測定し、また各時間での反応液中の還元糖の生成量をジニトロサリチル酸法により調べ、切断量を算出した。その結果、図５に示すように本酵素はカルボキシメチルセルロースをエンド形式で分解することが明らかとなった。
次にセロオリゴ糖（Ｇ１−Ｇ６）を基質として５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で３０℃、２時間分解を行った。その後、一定量を薄層クロマトプレート（シリカゲル６０、ｎｏ．５５６７；メルク社）にスポットし、ブタノール／エタノール／脱イオン水＝５／３／１（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。糖スポットの検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用いた。その結果、本酵素はセロペンタオシド（Ｇ５）をＧ２とＧ３に分解した。またセロヘキサオキシド（Ｇ６）をＧ３にあるいはＧ２とＧ４に分解した。しかし、セロテトラオシド（Ｇ４）以下のオリゴ糖には作用しなかった。
【００２８】
（９）界面活性剤を０．０５％又は０．０１％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素の活性を測定した。その結果、それぞれの界面活性剤の存在下において本酵素は、対照に比べ７０％以上の活性を発現し得ることが判った（表１）。
【００２９】
【表１】

【００３０】
（１０）キレート剤の影響
本酵素を５mM ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、オルトフェナントリンを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０℃、３０分間恒温した後、１０倍に希釈し標準活性測定法により残存活性を調べた。その結果、本酵素はいずれのキレート剤に対しても極めて安定であった。
【００３１】
（１１）金属塩の影響
標準活性条件に０．５mMの各金属塩を加えて酵素反応を行った。その結果、本酵素は塩化コバルトにより１７％程度活性化されることが判った。その他のマンガン、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、カドミウム、アルミニウム、銅、鉄、ストロンチウム、バリウム、鉛、バリウム、ベリリウム、バラジウム等の金属イオンは殆ど影響を示さなかった。
【００３２】
また、本発明のアルカリセルラーゼを塩酸加水分解し、アミノ酸分析計(日立製作所 L−8500)によってアミノ酸組成を調べた結果、その構成アミノ酸にはシステインが含まれなかった。
【００３３】
このように本発明のセルラーゼは、等電点が約９．３、最適反応温度が５５℃であり、界面活性剤及びキレート剤に対して耐性の新規酵素であり、衣料用等の洗浄剤用、バイオマス用、繊維処理用酵素として有用である。
【００３４】
本発明の洗浄剤組成物への上記アルカリセルラーゼの配合量はアルカリセルラーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり１０〜１００万Ｕが配合できるが、経済性等を考慮し、１０万Ｕ以下が好ましく、さらに好ましくは１万Ｕ以下である。
【００３５】
このようにして得られる本発明のアルカリセルラーゼを含有する洗浄剤組成物は後記実施例４に示すように優れた洗浄力を有している。
【００３６】
なお、本発明のアルカリセルラーゼを粉末洗剤組成物に用いる場合は、熱による失活あるいは分解を防ぐため特開昭６２−２５７９９０号公報に記載の方法に基づき製造した顆粒を洗剤粒子製造後に混合することが好ましい。
【００３７】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリセルラーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、プロテアーゼ、本発明以外のセルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボザイム社）、プロペラーゼ、プラフェクト（ジェネンコア社）、またKAP（花王）、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム（以上、ノボザイム社）、またKAC（花王）、特開平10-313859号公報記載のバチルス・エスピーKSM-S237株が生産するアルカリセルラーゼ（花王）等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル（以上、ノボザイム社）、プラスター（ジェネンコア社）、またKAM（花王）、等が挙げられる。これらの酵素は０．００１〜１０％、好ましくは０．０３〜５％配合される。
【００３８】
また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
【００３９】
（１）界面活性剤
界面活性剤は洗剤組成物中０．５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉末状洗剤組成物については10〜45%、液体洗剤組成物については２０〜５０％配合することが好ましい。また本発明の洗剤組成物が漂白洗剤又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００４０】
本発明の洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくはアニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤である。
【００４１】
アニオン界面活性剤としては、炭素数10〜18のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜20のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が10〜14の、より好ましくは12〜14の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００４２】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜20）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜20）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜22）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜22）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン界面活性剤としては、炭素数10〜18のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜20モル付加した〔HLB値（グリフィン法で算出）が10.5〜15.0、好ましくは11.0〜14.5であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００４３】
（２）二価金属イオン補足剤
二価金属イオン補足剤は０．０１〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン補足剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等が挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００４４】
（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１〜８０％、好ましくは１〜４０％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号等の非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、またトリポリリン酸塩等のリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる
【００４５】
（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸等のホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸等のアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００４６】
（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩等の漂白剤は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載等の漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０％配合することができる。
【００４７】
（６）蛍光剤
本発明の洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ等）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料等）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２％配合するのが好ましい。
【００４８】
（７）その他の成分
本発明の洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩等）、抑泡剤（シリコーン等）、香料、その他の添加剤を含有させることができる。
【００４９】
本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られたセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒等にすることができる。
かくして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤等として使用することができる。
【００５０】
本発明の洗浄剤組成物が粉末洗剤である場合、以下のような洗浄剤組成物であることが特に好ましい。
界面活性剤を１０〜５０重量％（好ましくは１５〜４５重量％）、水溶性無機物を１０〜５０重量％（好ましくは２０〜４０重量％）、及び水不溶性無機物５〜５０重量％（好ましくは１０〜４０重量％）を含有する粒子であって、水溶性無機物と水不溶性無機物の合計が４０〜７０重量％（好ましくは４５〜６５重量％）であるような粒子を含む洗浄剤組成物。またこの粒子が水に溶解する過程において粒子径の１／１０以上の径の気泡を粒子内部から放出し得る粒子であるような洗浄剤組成物。
【００５１】
斯かる粒子に用いられる界面活性剤としては（１）に記述したような様々な界面活性剤を用いることができる。
水溶性無機物としては、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、亜硫酸塩、硫酸水素塩、塩酸塩、又はリン酸塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、又はアミン塩等の水溶性無機塩類や、クエン酸塩やフマル酸塩等の低分子量の水溶性有機酸塩が挙げられる。
水不溶性無機物としては、１次粒子の平均粒径が0.1〜20μｍのものが好ましく、例えば、結晶性もしくは非晶質のアミノ珪酸塩や、二酸化珪素、水和珪酸化合物、パーライト、ベントナイト等の粘土化合物等があるが、結晶性もしくは非晶質のアルミノ珪酸塩や、二酸化珪素、水和珪酸化合物が好適であり、中でも金属イオン封鎖能及び界面活性剤の担持能の点で結晶性アルミノ珪酸塩が好ましい。
【００５２】
この粒子は洗浄性能の点で、更に水溶性ポリマーを０．５〜２０重量％含有することが好ましく、１〜１５重量％がより好ましく、３〜１０重量％が更に好ましい。
水溶性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、カルボン酸系ポリマー、カルボキシメチルセルロース、可溶性澱粉、糖類等が挙げられるが、中でも金属イオン封鎖能、固体汚れ・粒子汚れの分散能及び再汚染防止能の点で分子量が数千〜１０万のカルボン酸系ポリマー及びポリエチレングリコールが好ましい。特に、アクリル酸−マレイン酸コポリマーの塩、ポリアクリル酸塩及びポリエチレングリコールが好ましい。ここで、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩が挙げられる。
【００５３】
この粒子は流動性及び非ケーキング性の点で、表面被覆剤により表面改質を行うことが好ましい。表面被覆剤は本粒子中１〜３０重量％が好ましく、２〜２５重量％がより好ましく、５〜２５重量％が更に好ましい。表面被覆剤としては、例えば、アルミノケイ酸塩、ケイ酸カルシウム、二酸化ケイ素、ベントナイト、タルク、クレイ、非晶質シリカ誘導体、結晶性シリケート化合物等のシリケート化合物、金属石鹸、粉末の界面活性剤等の微粉体、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ソーダ、アクリル酸とマレイン酸のコポリマー又はその塩等のポリカルボン酸塩等の水溶性ポリマー、脂肪酸が挙げられる。中でも水不溶性無機物が好ましく、特に結晶性アルミノケイ酸塩、非晶質アルミノケイ酸塩、結晶性シリケート化合物が好ましい。
【００５４】
この粒子は溶解性の点で、水に溶解する過程において好ましくは粒子径の１／１０以上、より好ましくは１／５以上、更に好ましくは１／４以上、特に好ましくは１／３以上の径の気泡を放出する。気泡の放出は、水に静置した状態にて溶解させた場合、１２０秒以内に所定の大きさの気泡が発生することが好ましく、６０秒以内がより好ましく、４５秒以内が更に好ましい。また、気泡の放出には、所定の大きさの気泡を放出可能な気孔（単数個でも複数個でもよい）を有していればよく、特に粒子の形態、構造には限定されない。
【００５５】
この粒子の製法は特に限定されないが、溶解性の点で、水溶性無機物、水不溶性無機物及び要すれば水溶性ポリマーを含有するスラリーを噴霧乾燥することによって得られたベース顆粒１００重量部に、界面活性剤５〜８０重量部を担持させ、次いで表面被覆剤により表面改質する製法が好ましい。
【００５６】
この粒子は、利便性や廃棄物低減の点で、ＪＩＳ Ｋ ３３６２により規定された方法で測定する嵩密度は６００ｇ／Ｌ以上が好ましく、７００ｇ／Ｌ以上がより好ましく、８００ｇ／Ｌ以上が更に好ましい。また、溶解性の点で、嵩密度は１６００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１３００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１０００ｇ／Ｌ以下が更に好ましい。
【００５７】
この粒子は溶解性の点で、ＪＩＳ Ｚ ８８０１の標準篩を用いて５分間振動させた後、篩目のサイズによる重量分率から求める平均粒径は１５０〜７００μｍが好ましく、より好ましくは１５０〜６００μｍ、更に好ましくは１８０〜４００μｍである。また、溶解性の点で１７７〜３５０μｍの粒子が粒子中４０重量％以上が好ましく、より好ましくは５０重量％以上である。
【００５８】
この粒子は洗浄性能の点で洗浄剤組成物中５０〜９９．５重量％が好ましく、５０〜９８重量％がより好ましく、６０〜９６重量％が更に好ましく、７０〜９４重量％が特に好ましい。
【００５９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００６０】
実施例１ アルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した〔２．０％カルボキシメチルセルロース（Ａ１０ＭＣ）、１．０％肉エキス（オキソイド社）、１．０％バクトペプトン（ディフコ社）、塩化ナトリウム１．０％、リン酸２水素カリウム０．１％、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌）〕。３０℃の培養器で３日間静置培養し、菌の生育後、０．１％（ｗ／ｖ）コンゴーレッド溶液を注ぎ染色した。その後、１Ｍの塩化ナトリウム溶液で脱色し、生育した菌の周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これらの菌株をポリペプトンＳ（日本製薬）２．０％、魚肉エキス（和光純薬）１．０％、リン酸１水素カリウム０．１５％、酵母エキス（ディフコ社）０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０７％、カルボキシメチルセルロース０．１％、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌）からなる液体培地を用いて３０℃、３日間振盪培養を行った。培養上清液に硫安を９０％飽和になるように加え、沈殿物を少量の２mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対し一昼夜透析を行った。透析内液の一部を採り、Ｐｈａｓｔ−ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア；ＩＥＦゲル、ｐＨ３．０−９．０）を用いて等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸した後、カルボキシメチルセルロースを含む寒天プレート〔１．０％カルボキシメチルセルロース、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、１．５％寒天〕上に置いた。３０℃、３時間放置後、ゲルを取り去り、０．１％コンゴーレッド溶液を注いだ。約１０分後に１Ｍの塩化ナトリウム溶液で脱色し、等電点の高い部分にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株を取得した。
【００６１】
実施例２ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株によるアルカリセルラーゼ生産
上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、３日間好気的に行った。培地組成は、ポリプペトンＳ（日本製薬）２．０％、魚肉エキス（和光純薬）１．０％、リン酸１水素カリウム０．１５％、酵母エキス（ディフコ社）０．１％、硫酸マグネシウム水塩０．０７％、カルボキシメチルセルロース０．１％、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌）とした。その結果、約３３０Ｕ／Ｌの生産性を得た。
【００６２】
実施例３ アルカリセルラーゼの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株の培養液を遠心分離し（８０００×ｇ、１５分間、４℃）、上清液（４．５L）を得た。これに硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように添加し、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）により沈殿物を集めた。少量の１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した後、同緩衝液に対し一昼夜透析を行った。透析内液を予め１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×２０cm；東ソー）に添着した。約３００mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させたところ、セルラーゼは非吸着画分に存在し、この画分を集め（６３０mL）、硫酸アンモニウムにより濃縮を行った。遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）により沈殿物を集め、少量の１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、同緩衝液に対し一昼夜透析を行った。次いで１０mMリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化しておいたＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×２０cm；東ソー）へ添着し、約３００mLの同緩衝液にて洗浄溶出を行った。更に０から０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（３００mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、約０．０３Ｍの塩化ナトリウム濃度付近でアルカリセルラーゼ活性が溶出された。この画分を集め限外濾過（ＹＭ３メンブレン；アミコン）により濃縮を行った（３３mL）。これを再び前述と同様に平衡化したＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（２．５×２０cm）へ添着し、０から０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（２００mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により、吸着タンパク質の溶出を行った。約０．０３Ｍの塩化ナトリウム濃度付近でアルカリセルラーゼ活性が溶出され、この画分を集め限外濾過（ＹＭ３メンブレン）により濃縮を行った。得られた酵素液を予め１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｓカラム（１．５×１３cm）に添着し、約８０mLの平衡化緩衝液にて洗浄溶出を行った。セルラーゼ画分は非吸着部に溶出され、この画分を集めて限外濾過（ＹＭ１０メンブレン）により濃縮を行った（１．１mL、１６５Ｕ、９．３ｍｇタンパク質）。以上の精製操作により本酵素は約１００倍に精製され、活性収率は１８％であった。
ここで得られた精製アルカリセルラーゼ標品は、前述の酵素学的性質を示した。
【００６３】
実施例４ 洗浄力試験
（１）洗剤の調製
ＷＯ９９／２９８３０号公報の実施例３に記載の洗剤を用いて洗浄力試験を行った。即ち撹拌翼を有した１ｍ³の混合槽に水４６５ｋｇを加え、水温が５５℃に達した後に、５０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液４８ｋｇ、４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸ナトリウム水溶液１３５ｋｇを添加した。１５分間撹拌した後に、炭酸ナトリウム１２０ｋｇ、硫酸ナトリウム６０ｋｇ、亜硫酸ナトリウム９ｋｇ、蛍光染料３ｋｇを添加した。更に１５分間撹拌した後に、ゼオライト３００ｋｇを添加し、３０分間撹拌して均質なスラリーを得た（スラリー中の水分は５０重量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の塔頂付近に設置した圧力噴霧ノズルから噴霧することでベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で排出）。
次に非イオン界面活性剤１５重量部と５０重量％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液１５重量部とポリエチレングリコール１重量部を７０℃になるように加熱混合し、混合液を作製した。レディゲミキサー（松坂技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００重量部を投入し、主軸（１５０ｒｐｍ）とチョッパー（４０００ｒｐｍ）の撹拌を開始した。なお、ジャケットに７５℃の温水を１０Ｌ／分で流し、そこに上記混合液を３分間で投入し、その後５分間撹拌を行った。更にこの洗剤粒子群の粒子表面を結晶性アルミノ珪酸塩１０重量部で表面被膜を行い、最終粒状洗剤を得た。
【００６４】
＜使用した原料＞
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液：ネオペレックスＦ６５（花王（株）製）
非イオン界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報に実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００，花王（株）製）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
【００６５】
（２）洗浄力の測定法
（ａ）油脂人工汚染布
特開昭５７―１０８１９９号記載の油脂人工汚染布を用いた。
【００６６】
（ｂ）アルカリセルラーゼ造粒物の調製
実施例３で得られた精製酵素から特開昭６２―２５７９９０号公報記載の方法に基づき調製した（６００Ｕ／g）。
【００６７】
（ｃ）洗浄条件及び方法
３０℃に恒温した４°ＤＨ硬水に洗剤を溶解し、０．０６６７％洗剤水溶液１Lを調製する。人工油脂汚染布５枚（６×６ｃｍ）を洗剤水溶液に添加し、３０℃、１時間放置後、洗剤溶液と人工汚染布をそのまま、ターゴトメーター用ステンレスビーカーに移し、ターゴトメーターにて１００ｒｐｍ、３０℃、１０分間撹拌洗浄する。人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし反射率測定に供した。洗浄率の算出は下式に従った。
原布及び洗浄前後の汚染布の５５０ｎｍにおける反射率を自記色彩系（島津製作所製）にて測定し、次式によって洗浄率を算出した。
洗浄率＝（洗浄後の反射率−洗浄前の反射率）／（原布の反射率−洗浄前の反射率）×１００
【００６８】
（１）で示した粒状洗剤に種々の配合量で上記酵素を添加して洗浄力試験を行った。結果を表２に示す。本発明洗浄剤組成物が優れた洗浄力を有していることが判る。
【００６９】
【表２】

【００７０】
【発明の効果】
本発明のアルカリセルラーゼは、等電点が約９．３、最適反応温度が約５５℃であり、界面活性剤及びキレート剤に対して耐性の新規酵素であり、衣料用等の洗浄剤用酵素として有用である。また、その製造法によれば当該アルカリセルラーゼを大量に且つ安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のアルカリセルラーゼ活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図２】 本発明のアルカリセルラーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図３】 本発明のアルカリセルラーゼ安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図４】 本発明のアルカリセルラーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図５】 本発明のアルカリセルラーゼによるカルボキシメチルセルロース分解における粘度低下と還元末端の生成量の関係を示す図である。

Claims (7)

1. 以下の酵素学的性質を有する等電点電気泳動法により測定された等電点が９．３であるアルカリセルラーゼ。
   １．作用：カルボキシメチルセルロースを液化型で良好に分解する。
   ２．基質特異性：カルボキシメチルセルース、リケナン、結晶性セルロース及びセロトリオース以上のセロオリゴ糖を分解し、還元糖を生成する。
   ３．最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ５〜１０で作用し、最適ｐＨは８．５である。
   ４．最適反応温度：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合、最適反応温度は５５℃である。
   ５．安定ｐＨ範囲：３０℃、６０分間で処理した場合、ｐＨ５〜１１の範囲で安定である。
   ６．耐熱性：トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１５分間の処理において、５５℃まで安定である。
   ７．分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、４３ｋＤａである。
2. 構成アミノ酸としてシステインを含まない請求項１記載のアルカリセルラーゼ。
3. 請求項１又は２記載のアルカリセルラーゼを産生する菌を培養し、その培養物から当該アルカリセルラーゼを採取するアルカリセルラーゼの製造法。
4. アルカリセルラーゼ産生菌が、バチルス属細菌である請求項３記載のアルカリセルラーゼの製造法。
5. バチルス属細菌がバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３）である請求項４記載のアルカリセルラーゼの製造法。
6. バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３として寄託された微生物。
7. 請求項１又は２記載のアルカリセルラーゼを含有する洗浄剤組成物。

Images