KR100284246B1 - 알칼리 프로테아제 및 그 제조방법 - Google Patents

알칼리 프로테아제 및 그 제조방법 Download PDF

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담브만 클라우스
아니타 아슬링 도르리트
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노보 노르디스크 에이/에스
안네 제헤르
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Abstract

본 발명은 Bacillus sp.의 균주로부터 유도된 프로테아제에 관한 것이다.
보다 상세히 말하면 본 발명은 Bacillus sp. PD498의 균주로부터 유도된 신규의 알칼리 프로테아제는 물론 Bacillus sp. PD498의 분리된 생물학적 순배양물에 관한 것이다.
더욱 본 발명은 본 프로테아제의 제조방법, 본 발명의 프로테아제로 이루어지는 세제 첨가제 및 세제 조성물, 그리고 세척방법에서의 본 프로테아제의 사용에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
알칼리 프로테아제 및 그 제조방법
[도면의 간단한 설명]
본 발명을 첨부도면을 참조하여 더 예시한다. 도면에서
제1도는 온도와 본 발명에 따른 효소의 단백질분해 활성의 관계를 나타낸다(실시예 1에 따라 얻어진 효소 조제품, 2% 카세인을 기질로 함, pH 9.5에서 측정됨; ■ 완충제, □완충제+0.1% STPP).
제2도는 pH와 본 발명에 따른 효소의 단백질분해 활성의 관계를 나타낸다(실시예 1에 따라 얻어진 효소 조제품, 1% 카세인을 기질로 함, 25℃에서 측정됨).
제3도는 시중의 세제효소와 비교한 본 발명 효소의 세척 성능을 나타낸다(□ 실시예 1에 따라 얻어진 효소 조제품; ○ SavinaseTM, 덴마크, 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브).
[발명의 상세한 설명]
[기술 분야]
본 발명은 Bacillus sp.의 균주로부터 유도된 프로테아제(단백질분해 효소)에 관한 것이다. 보다 상세히 말하면 본 발명은 Bacillus sp. PD498의 균주로부터 유도된 신규의 알칼리 프로테아제는 물론 Bacillus sp. PD498의 분리된 생물학적 순배양물에 관한 것이다.
더욱 본 발명은 본 프로테아제의 제조방법, 본 발명의 프로테아제로 이루어지는 세제 첨가제 및 세제 조성물, 그리고 세척방법에서의 본 프로테아제의 사용에 관한 것이다.
[배경기술]
세제 효소는 20년 이상동안 시장에서 거래되어 왔으며 현재 전 세계에 걸쳐 분말 세제와 액체 세제 양자에 있어서의 통상의 세제 성분으로서 잘 기정되어 있다. 세척 온도의 하향 추세에 따라 최근 세제 효소 소비가 증대하고 있다. 세척용 제제에 사용도는 효소는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 세룰라제는 물론 다른 효소 또는 이들의 혼합물로 이루어져 있다. 통상적으로 가장 중요한 것은 프로테아제이다.
세제 프로테아제는 자연에서 발견된 프로테아제의 분리에 의해 개발된 뒤 세제 제제에 시험되어 왔다. 대부분의 세제 프로테아제는 Bacillus속(屬)의 구성원으로부터 얻어진다. 현재 여러 지정된 조건에서 보다 나은 비용/성능비의 부여 가능성을 제공하는 새로운 종류의 프로테아제가 시장에 들어와 있다.
시중 프로테아제 제품의 예는 모두 덴마크, 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브가 공급하는 ALCALASETM, ESPERASETM및 SAVINASETM이다. 이들과 다른 시중 공급원으로부터의 유사 효소제품은 세제 용액내에서, 즉 8 내지 11범위내의 pH 값에서와 금속이온 봉쇄재, 계면활성제 및 붕산나트륨과 같은 표백제의 존재하에서 활성이다.
ALCALASETM프로테아제는 Bacillus licheniformis종의 균주에 의해 생성된다. ESPERASETM및 SAVINASETM프로테아제는 친알칼리성 Bacilli의 균주의 배양에 의해 얻어진다.
[발명의 개시]
본 발명에 따르면 신규의 세제 프로테아제가 제공된다.
그 제1양태에 있어, 본 발명은 SDS-PAGE에 의해 측정할 때 34kD의 겉보기 분자량, 대략 9.3의 pI, 25℃에서 (카세인을 기질로 하여) 측정된 pH 9-11 범위내의 pH 최적치, pH 9.5에서 (카세인을 기질로 하여) 측정된 40-55℃ 범위내의 온도 최적치, 및 Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484로부터 유도된 프로테아제의 것과 동일하거나 부분적으로 동일한 면역화학적 성질을 가지는 프로테아제를 제공한다.
제2양태에 있어, 본 발명은 SDS-PAGE에 의해 측정할 때 34kD의 겉보기 분자량, 대략 9.3의 pI, 25℃에서 (카세인을 기질로 하여) 측정된 pH 9-11 범위내의 pH 최적치, pH 9.5에서 (카세인을 기질로 하여) 측정된 40-55℃ 범위내의 온도 최적치를 가지며, Bacillus sp. PD498의 균주로부터, 또는 Bacillus sp. PD498로부터 유도된 프로테아제의 것과 동일하거나 부분적으로 동일한 면역화학적 성질을 가지는 프로테아제를 코드화하는 유전자를 지니는 또 다른 숙주 유기체로부터 얻을 수 있다.
제3양태에 있어, 본 발명은 Bacillus sp. PD498의 균주의 분리된 생물학적 순배양물을 제공한다. 보다 구체적인 양태에 있어서는, Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484의 균주, 또는 그 돌연변이체 또는 변이체가 제공된다.
제4양태에 있어, 본 발명은 본 프로테아제의 제조방법을 제공하는데 이 방법은 Bacillus sp. PD498의 프로테아제 생성성 균주를 탄소 및 질소원과 무기염을 함유하는 적당한 영양 배지에서 배양하고, 이어서 원하는 효소를 회수하는 것으로 이루어진다.
보다 구체적인 양태에 있어서는, Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484, 또는 그 돌연변이체 또는 변이체, 또는 Bacillus sp. PD498로부터 유도된 프로테아제의 것과 동일하거나 부분적으로 동일한 면역화학적 성질을 가지는 프로테아제를 코드화하는 유전자를 지니는 또다른 숙주 유기체를 배양한다.
제5양태에 있어서는, 본 효소를 세제 효소로서 사용하는 것이 특허청구된다.
보다 구체적인 양태에 있어서는, 본 발명은 본 발명의 프로테아제로 이루어지는 세제 첨가제 및 세제 조성물을 제공한다. 궁극적으로 본 발명은 세척방법에서의 본 발명 효소의 사용에 관한 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[미생물]
본 발명의 효소를 생성할 수 있는 본 발명의 신규의 미생물을 토양 시료로부터 분리되었다. Bacillus sp. PD498은 부다페스트 조약에 따라 NCIMB에 No.40484로 기탁되었다.
본 발명의 미생물은 Bacillus속에 속하는 세균을 생성하는 호기성 포자이다.
형태학적으로 그것은 직경 0.7-0.9미크론, 길이 2-3미크론인 운동성 간상체로서 묘사될 수있다. 포자는 둥글든지 타원면이고, 포자낭은 끝 가까운데서 끝으로 약간 부풀어 있다. 성장에 최적 온도는 25-37℃내이고, 성장에 최적 pH는 7-9이며, pH 9.7에서는 전형 성장하지 않고, 50℃에서도 전혀 성장하지 않는다.
이 미생물은 영양 한천구배상에 둥글고 매끄러운 황생 콜로니를 형성하며, 한천으로의 색소확산은 전혀 관찰되지 않는다.
[PD498의 세포 특성]
본 발명의 균주 Bacillus sp. PD498의 세포 특성을 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, Germany에 기탁된 공지의 Bacillus sp.형 균주의 것과 비교하였다.
본 발명 PD498의 DNA내의 G+C 백분율이 높다는 것은 연구한 모든 다른 친알칼리성 Bacillus 균주와의 중요한 차이점이다.
[미생물의 배양]
본 발명의 미생물은 동화 탄소 및 질소와 함께 다른 필수 영양소를 함유하는 영양배지에서 호기성 조건하에 배양될 수 있는데, 배지는 공지기술의 원리에 따라 구성된다.
적당한 탄소원은 수크로스, 글루코스 및 전분과 같은 탄수화물, 또는 곡물의 낟알, 맥아, 쌀 및 수수와 같은 물질을 함유하는 탄수화물이다. 배지에 혼입되는 탄수화물 농도는 예컨대 25% 까지와 1-5%에 이르기까지 크게 변화할 수 있으나, 보통은 8-10%가 적당하고, 이 백분율은 글루코스의 당량으로서 산출된다.
영양 배지내 질소원은 무기 및/또는 유기성인 것일 수 있다. 적당한 무기질소원은 질산염 및 암모늄염이다. 유기질소원 가운데 꽤 다수가 세균의 배양을 수반하는 발효방법에 정규적으로 사용된다. 실례는 콩가루, 면실박, 땅콩가루, 카세인, 옥수수, 옥수수 담금액, 이스트 추출물, 요소 및 알부민이다. 그 위에 영양 배지는 또한 통상의 미량 물질도 함유하여야 한다.
본 발명의 신규의 Bacillus종은 약간 친알칼리성이다. 따라서 배양은 약알칼리 pH 값에서 행해지는 것이 바람직한테, 이것은 성장 배지의 살균후 pH 9.0인 중탄산나트륨과 같은 적당한 완충제를 가하여 얻어질 수 있다. 탱크 발효기에서의 배양에 대해서는 인공 폭기를 사용하는 것이 필요한다. 폭기 속도는 종래식 탱크 발효에 사용되는 것과 유사하다.
발효후, 액체효소 농축물은 발효액으로부터 굵은 물질을 제거함으로써 그리고 원한다면 저온에서의 증발이나 한외여과에 의해 발효액을 농축시킴으로써 생성될 수 있다. 최종적으로 농축물에 보존제를 가할 수도 있다.
고체 효소 조제품은 정제 및/또는 농축 발효액으로부터 Na2SO4와 같은 염이나 에탄올 또는 아세톤과 같은 수혼화성 용매에 의한 침전에 의해 제조될 수 있다.
분무건조와 같은 적당한 건조방법에 의해 발효액내의 물이 제거될 수도 있다.
[단백질분해 활성에 대한 평가분석]
단백질분해 활성은 카세인을 기질로 하여 측정한다. 1카세인 프로테아제 단위(CPU)는 표준조건, 즉 30분간 25℃ 및 pH 9.5에서의 배양하에서 분당 1mM의 일차 아미노기(세린표준과 비교하여 측정됨)를 유리시키는 효소의 양으로서 정의된다.
분석방법을 기재한 접책(摺冊) AF228은 덴마크, 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브에 요청하면 압수할 수 있는데 이 접책은 여기에 참고로 포함된다.
[효소]
본 발명의 효소는 신규의 세제 프로테아제이다. 그것은 본 발명의 미생물, 바람직하게는 Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484, 또는 그 돌연변이체 또는 변이체를 탄소 및 질소원과 무기염을 함유하는 적당한 영양 배지에서 배양하여 얻을 수 있는 알칼리프로테아제이다. 이 효소는 또한 재조합 DNA 기술에 의해 얻을 수도 있다.
본 발명의 프로테아제는 다음 특성에 의해 설명될 수 있다.
[물리화학적 성질]
본 발명의 프로테아제는 SDS-PAGE에 의해 측정할 때 34kD의 겉보기 분자량을 가진다.
대략 9.3의 pI가 LKB AmpholinePAG 플레이트상에 등전집속하여 측정되었다.
본 프로테아제 활성은 PMSF, 세린 프로테이나제 억제제에 의해 억제된다. EDTA 및 콩단백질 억제제는 본 프로테아제 활성에 영향을 미치지 않는다.
온도활성관계를 제1도에 나타낸다. 이 활성은 2% 카세인을 기질로 하여 pH 9.5에서 0.1% 트리폴리인산나트륨(STPP, 많은 시중 세제에서의 공통 성분)의 존재(흰색 정사각형) 및 부존재(검정색 정사각형)하에 측정하였다. 배양온도를 15 내지 70℃ 사이에서 변경한 수정을 포함한 앞서 기술된 단백질분해 활성에 대한 평가분석이 사용된다. 도면으로부터 효소가 15℃부터 70℃까지의 단백질분해 활성을 지니며, 50℃ 부근 40-55℃ 범위내의 온도 최적치를 가지는 것이 명백하다.
pH에 대한 활성의 의존성을, 6 내지 11의 pH 범위내의 소정 pH 값으로 조정된 완충제를 사용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 결과를 제2도에 나타낸다.
이 도면으로부터 효소가 pH 10 부근 pH 9-11 범위내의 겉보기 pH 최적치와 함께, pH6 이하부터 pH 11 이상까지의 매우 넓은 pH 범위내에서 단백질분해활성을 지니는 것이 명백하다.
더욱 본 발명의 프로테아제는 유럽형 및 미국형 세제에서 측정할 때 세척조건하 25℃에서 60분간 안정함을 알았다.
[면역화학적 성질]
본 발명의 프로테아제는 균주 Bacillus sp, PD498, NCIMB No.40484로부터 유도된 프로테아제의 것과 동일하거나 부분적으로 동일한(즉 적어도 부부적으로 동일한) 면역화학적 성질을 가지고 있다.
면역화학적 성질은 교차반응 동일성 시험에 의해 면역학적으로 측정할 수 있다.
이 동일성 시험은 잘 알려진 아우치터로니(Ouchterlony) 이중면역확산법에 의해 또는 N.H.Axelsen; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific Publications (1983), chapters 5 and 14에 따라 탠덤 교차 면역전기영동법에 의해 행할 수 있다. “항원 동일성”및 “부분 항원 동일성”이란 말이 같은 책, 5, 19 및 20장에 기재되어 있다.
상술한 방법에 따라 토끼를 본 발명의 정제 프로테아제에 의해 면역이 되게 함으로써 단일특이적 항혈청을 발생시켰다. 면역원을 프로인트 보제와 혼합하고 토끼에게 2주마다 피하주사하였다. 8주의 전 면역 기간후 항혈청을 얻었고, 그것으로부터 상기 문헌에 N.H.Axelsen에 의해 기재된 바와 같이 면역글로불린을 제조하였다.
아우치터로니 이중 면역확산시험으로 본 발명의 프로테아제와 Bacillus종, 예컨대 ALCALASETM, SAVINASETM및 ESPERASETM서브틸리신 Novo(덴마크, 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브로부터 입수가능함) 및 KAZUSASETM(일본, 쇼와 덴코로부터 입수가능함)으로부터의 공지된 알칼리 세린 프로테아제 사이의 교차반응은 전혀 없음을 알 수 있었다.
[세제 조성물]
본 발명의 세제 조성물은 1종 이상의 계면활성제로 이루어질 수 있는데, 이것은 음이온, 비이온, 양이온, 양쪽성 또는 쯔비터이온형이나 이들의 혼합물로 되어 있을 수 있다. 음이온 계면활성제의 전형적 예는 선상 알킬 벤젠 술포네이트(LAS), 알킬술페이트(AS), 알파 올레핀 술포네이트(AOS), 알코올 에톡시 술페이트(AES) 및 천연 지방산의 알칼리금속염이다. 비이온 계면활성제의 예는 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 스크로스 및 글루코스의 지방산 에스테르 그리고 폴리에톡실화 알킬 글루코시드의 에스테르이다.
본 발명의 세제 조성물은 또한 빌더, 표백제, 표백활성제, 방식제, 금속이온봉쇄제, 오염물재침착방지제, 향료, 효소 및 표백제용 안정제, 제제 보조제, 광학 증백제, 거품 부스터, 킬레이트화제, 충전제, 섬유연화제 등과 같은 본 기술분야에 알려진 다른 세제 성분들을 함유할 수도 있다. 본 발명의 세제 조성물은 실질적으로 Falbe, J.에 기재된 바와 같이 제제될 수 있다.[Falbe, J.; Surfactants in Consumer Products, Theory, Technology and Application; Springer Verlag 1987, 특히 “Frame formulations for liquid/powder heavyduty detergents”라는 제목의 절을 참조].
현재 본 발명의 세제 조성물은 효소 조제품을 세척액 리터당 단백질분해효소 0.0005-0.5 CPU에 상당하는 양으로 함유할 수 있다고 예상된다.
본 발명의 세제 조성물은 분말, 액체 등과 같은 어떤 편리한 형태로든지 제제될 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 세제 조성물에 통상적으로 포함되는 1종 이상의 다른 효소, 즉 리파제, 아밀라제, 셀룰라제, 옥시다제 및/또는 퍼옥시다제를 유리하게 포함할 수 있다.
본 발명의 프로테아제는 세제 프로테아제를 함유하는 별개의 첨가제를 가하거나 또는 상이한 세제 효소들로 이루어지는 배합첨가제를 가함으로써 세제 조성물내에 포함될 수 있다.
본 발명의 첨가제는 예컨대 과립, 액체, 슬러리 등으로서 제제될 수 있다.
바람직한 세제 첨가제 제제는 비-분진 과립, 액체, 특히 안정화 액체, 슬러리 또는 보호효소이다. 분진이 없는 과립은 예컨대 영국특허공개 제1,362,365호 또는 미국특허 제4,106,991호에 따라 제조될 수 있으며, 임의로 본 기술분야에 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 세제 효소는 과립화 전 또는 후에 혼합될 수 있다.
액체 효소 조제품은 예컨대 기정의 방법에 따라 예컨대 프로필렌 글리콜, 당 또는 당알코올과 같은 폴리올, 락트산 또는 붕산을 가함으로써 안정화될 수 있다.
다른 효소 안정제는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 보호 효소는 유럽특허공개 제238,216호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명을 다음 실시예에서 더 예시하는데, 이것은 특허청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 한정하는 식으로 되도록 의도되지는 않는다.
[실시예 1]
Bacillus sp. PD498을 25℃에서 회전 진동 테이블(300 r.p.m)상에서 다음 조성(리터당)의 배지 100mℓ를 수용하는 500mℓ 배플 에를렌마이어 플라스크내에서 배양하였다.
감자 전분 100g
지면 보리 50g
콩가루 20g
Na2HPO4×12H2O 9g
Pluronic0.1g
카세인산 나트륨 10g
배지내 전분을 α-아밀라제로 액화하고, 배지를 120℃에서 45분간 가열하여 살균한다. 살균후 배지의 pH를 1M 중탄산나트륨 용액 10mℓ를 가하여 9.0으로 조정한다.
4일 배양후 배양물의 단백질분해활성을 상술한 방법을 이용하여 측정하였다.
배양후 발효액의 효소활성은 5 CPU/ℓ였다.
고체물질의 분리후 프로테아제를 종래식 크로마토그래피법에 의해 정제하였다.
배양 발효액 3.5ℓ로부터의 수량은 120 CPU/ℓ를 갖는 31mℓ였다. 순도는 SDS-PAGE와 등전집속 둘다에 의해 판단할 때 90% 이상이었다.
본 실시예에 따라 제조된 조제품의 특성은 본 명세서에 이미 언급되어 있으며, 여기에 참고가 된다.
[실시예 2]
[세척 성능]
세척성능시험은 풀(grass)로 더럽혀진 면직물에 대하여 20℃에서 10분간 등온적으로 달성하였다.
이 시험은 리터당 효소 단백질 0.02와 0.5mg 사이의 효소농도에서 행하였다.
시중의 미국제 분말세제 2.0g/ℓ를 사용하였다. 이 세제를 대략 6°dH(독일식 경도)물에 용해하고, pH를 9.5로 조정하였다. 직물/세척액 비는 세척액 리터당 직물 6g이었다.
세척에 이어 직물을 흐르는 생수내에서 평평하게 하고 공기건조시켰다.
460nm에서의 면제도(remission; %R)를 측정하였다.
세척 성능의 단위로서는 효소를 가한채 세척한 후의 면제도에서 효소를 전혀 가하지 않은채 세척한 후의 면제도를 뺀 차이면제도, ΔR을 사용하였다.
이들 시험의 결과를 제3도에 나타낸다. 이 도면으로부터 본 발명의 프로테아제가 우수한 세척력을 지님이 명백하다.

Claims (11)

  1. 다음 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 균주 Bacillus sp. PD498, NCIMB NO.40484로부터 얻을 수 있는 프로테아제. (a) 34kD의 겉보기 분자량(SDS-PAGE에 의해 측정됨), (b) 대략 9.3의 pI, (c) pH 9-11 범위내의 pH 최적치(25℃에서 카세인을 기질로 하여), (d) 40-55℃ 범위내의 온도 최적치(pH 9.5에서 카세인을 기질로 하여), 및 (e) 균주 Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484로부터 유도된 프로테아제의 것과 동일한 면역화학적 성질.
  2. 생물학적으로 순수하게 분리된 Bacillus sp. PD498의 균주.
  3. 제2항에 있어서, 균주가 제1항의 프로테아제를 생성하는 Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. Bacillus sp. PD498의 프로테아제 생성 균주를 탄소 및 질소원과 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 배양하고, 이어서 원하는 효소를 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 특허청구의 범위 제1항에 따른 프로테아제의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 균주 Bacillus sp. PD498, NCIMB No.40484를 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 비-분진 과립, 액체, 특히 안정화 액체, 슬러리 또는 보호 효소의 형태로 제공되는, 제1항에 따른 프로테아제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세제 첨가제.
  7. 제1항에 따른 프로테아제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 1종 이상의 다른 효소, 특히 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 옥시다제 및/또는 퍼옥시다제로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 세제 조성물.
  9. 제1항에 따른 프로테아제를 가하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세척방법.
  10. 제9항에 있어서, 특허청구의 범위 제6항에 따른 세제 첨가제를 가하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세척방법.
  11. 제9항에 있어서, 특허청구의 범위 제7항 또는 제8항에 따른 세제 조성물을 가하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세척방법.
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