FI117759B - Alkaliiniproteaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

% .

117759

Alkaliiniproteaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi - Alkalin-proteas samt ett förfarande för dess framställning 5 Tämä keksintö liittyy proteaaseihin, jotka on johdettu Bacillus sp. -kannoista. Tarkemmin sanoen keksintö kohdistuu uuteen alkaliiniproteaasiin, joka on johdettu kannasta Bacillus sp.

PD498, sekä eristettyihin biologisesti puhtaisiin Bacillus sp.

PD498 -viljelmiin.

10

Lisäksi keksintö kohdistuu menetelmään valmistaa proteaasia, pesuainelisäaineisiin sekä pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät keksinnön mukaista proteaasia samoin kuin tämän prote- ^ aasin käyttöön pesuprosesseissa.

15

Pesuaine-entsyymejä on markkinoitu jo yli 20 vuoden ajan, ja niillä on vakiintunut asema normaaleina pesuaineen aineosina sekä jauhemaisissa että nestemäisissä pesuaineissa kaikkialla maailmassa. Suuntauksen ollessa kohti yhä matalampia pesuläm-20 pötiloja pesuaine-entsyymien kulutus on lisääntynyt viime vuosina. Pesuainekoostumuksissa käytetään entsyymeinä esimerkiksi proteaaseja, lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja ja muitakin • · entsyymejä samoin kuin niiden seoksia. Kaupallisesti merkittä- • I'*; vimpiä ovat proteaasit.

·** *25 • * • · · :·· : Pesuaineproteaasit on kehitetty eristämällä luonnossa esiinty- • * * via proteaaseja ja testaamalla niitä pesuainekoostumuksissa.

• · · Useimmat pesuaineproteaasit on saatu Bacillus-suvun jäsenistä.

Äskettäin on tullut markkinoille uudentyyppisiä proteaaseja, ^*••30 jotka tarjoavat mahdollisuuden parempaan hinnan ja suoritusky-vyn suhteeseen erilaisissa erikoisolosuhteissa.

• · ψ · · | Esimerkkejä kaupallisista tuotteista ovat ALCALASE™, ESPERASE™, i * ja SAVINASE™, joita kaikkia tuottaa Novo Nordisk A/S, Tanska.

: :*35 Nämä ja muista kaupallisista lähteistä saatavat samantapaiset • · · * .*·,· entsyymituotteet ovat aktiivisia peusaineliuoksissa, ts. pH-• * . 117759 2 arvoalueella 8-11 ja kun läsnä on sekvestrointiaineita, pinta-aktiivisia aineita ja valkaisuaineita kuten natriumboraattia. ALKALSE™-proteaasia tuottavat Bacillus licheniformis -lajin kannat. ESPERASE™ ja SAVINASE™ -proteaasit saadaan viljelemäl-5 lä alkalofiilisiä Bacillus-suvun kantoja.

Tämä keksintö koskee uusia pesuaineproteaaseja.

Ensimmäisenä kohteena on proteaasi, jonka näennäismolekyylipai-10 no on 34 kD SDS-PAGElla määritettynä, pl noin 9,3, optimi-pH alueella 9-11 määritettynä 25°C:ssa (kaseiini substraattina), optimilämpötila alueella 40-55'c määritettynä pH 9,5:ssä (kaseiini substraattina), ja joka on immunokemiallisilta ominaisuuksiltaan täysin samanlainen tai osittain samanlainen kuin prote-15 aasi, joka on johdettu kannasta Bacillus sp. PD498,NCIMB No. 40484.

Keksinnön toisena kohteena on proteaasi, jonka näennäismolekyy-lipaino on 34 kD SDS-PAGElla määritettynä, pl noin 9,3, optimi-20 pH alueella 9-11 määritettynä 25"C:ssa (kaseiini substraattina), optimilämpötila alueella 40-55’C määritettynä pH 9,5:ssä (kaseiini substraattina), ja joka saadaan kannasta Bacillus sp.

• 1 PD498 tai muusta isäntäorganismista, jossa on geeni, joka Y“.' koodaa proteaasia, joka on immunokemiallisilta ominaisuuksil-* 1 1 *“.125 taan täysin samanlainen tai osittain samanlainen kuin prote- **··^ aasi, jota on johdettu kannasta Bacillus sp. PD498.

• · · • · · · ♦ · · · Keksinnön kolmantena kohteena on eristetty biologisesti puhdas Bacillus sp. PD498 -kannan viljelmä. Tarkemmin sanoen kyseessä *••30 on kanta Bacillus sp. PD498,NCIMB No. 40484 tai sen mutantti t1M ST f :1·1: tai variantti.

t »M1· . Keksinnön neljäntenä kohteena on menetelmä proteaasin valmistamiseksi. Menetelmässä viljellään kantaa Bacillus sp. PD498 ::135 tuottavaa proteaasia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja sisältävässä sopivassa ravintoväliaineessa, ja otetaan 3 117759 haluttu entsyymi sitten talteen. Tarkemmin sanoen viljellään Bacillus sp. PD498,NCIMB No. 40484:ää tai sen mutanttia tai varianttia tai muuta isäntäorganismia, jolla on geeni, joka koodaa proteaasia, joka on immunokemiallisilta ominaisuuksil-5 taan täysin samanlainen tai osittain samanlainen verrattuna proteaasiin, joka on johdettu Bacillus sp. PD498:sta.

Keksinnön viidentenä patenttivaatimusten kohteena on käyttää tätä entsyymiä pesuaine-entsyyminä. Tarkemmin eriteltyinä 10 kohteina keksintö tuo esiin pesuainelisäaineita ja pesuaine-koostumuksia, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaista proteaasia. Viimeiseksi mainittuna keksintö liittyy keksinnön mukaisen entsyymin käyttöön pesuprosesseissa.

15 Esillä olevaa keksintöä kuvataan oheistettuihin kuvioihin viitaten. Kuvioissa: kuvio 1 esittää lämpötilan ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välisen suhteen (entsyymivalmiste 20 valmistettuna esimerkin 1 mukaan, 2 % kaseiini substraattina ja määritettynä pH 9,5:ssä; Puskuri, □ Puskuri + 0,1 % STPP), • · • * * • i .·, kuvio 2 esittää pH-arvon ja keksinnön mukaisen entsyymin prote-olyyttisen aktiivisuuden välisen suhteen (entsyymivalmiste *.*’.‘25 valmistettuna esimerkin 1 mukaan, 2 % kaseiini substraattina, * * * ···· määritettynä 25°C:ssa), ja ··« ♦ · · * • *· V * kuvio 3 esittää keksinnön mukaisen entsyymin pesukykyä verrattuna kaupalliseen entsyymiin (□ Entsyymi valmistettu esimerkin *:30 1 mukaan; O Savinase™, Novo Nordisk A/S, Tanska).

·♦·♦ 9 f · t ··· • · · • · ♦ ’ . Mikro-organismi . Tämän keksinnön mukainen keksinnön mukaista entsyymiä tuottamaan pystyvä uusi mikro-organismi eristettiin maaperänäyttees-j:*S5 tä. Bacillus sp. PD498 on talletettu Budapestin sopimuksen ·*·.· mukaisesti NCIMBrhen numerolla 40484.

• · ; 4 117759 Tämän keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen, itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu Bacillus-sukuun. Morfologi-sesti sitä voidaan kuvata liikkuvaksi sauvaksi, jonka läpimitta on 0,7-0,9 mikrometriä ja pituus 2-3 mikrometriä. Itiöiden 5 muoto vaihtelee pyöreistä elliptisiin, on heikosti itiöpesäk-keitä paksuntava, subterminaalisista terminaalisiin. Optimaalinen kasvatuslämpötila on 25-37'C, optimi-pH kasvatuksen kannalta 7-9; kasvua ei tapahdu pH 9,7:ssä eikä 50°C:ssa. Tämä mikro-organismi muodostaa keltaisia pesäkkeitä, pyöreitä ja 10 sileitä, ravinneagarvinoviljelmissä, pigmentin sekoittumista agariin ei ole havaittavissa.

PD498:n sellulaariset ominaispiirteet

Keksinnön mukaisen kannan Bacillus sp. PD498 sellulaarisia 15 ominaispiirteitä verrattiin tunnettuihin Bacillus sp. -tyypin kantoihin, jotka on talletettu: Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg IB, D-3300 Braunschweig, Saksa.

20 PD498 B.alcalophilus B.alcalophilus % huomatt. Vedder subsp. Halodermus • · * rasvahappoja DSM2526 DSM497 I**·! 25 ‘ • * * •*Y c 15-1 iso 30 34 45 • « · :»y C 15 anteiso 33 32 26 ·..! C 17-1 iso 2 5 8 ·♦· V : C 17 anteiso 12 12 10 30 ··· Tyydytt. yht. 6 9 0 • ·· ·

Haarautumatt.

* * . yhteensä 4 4 4 • ♦ * | 55 DNA-koostumus: : rnol% G+C 48,8 36,2 44,1 • · * · • * • f · • * · • * ...117759 5

Suuri DNA:n G+C-prosentti keksinnön mukaisessa PD198:ssa on huomattavin ero kaikkiin muihin tutkittuihin alkalofiilisiin Bacillus-kantoihin.

5 Mirko-organismien viljely

Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidan viljellä aerobisissa olosuhteissa ravintoväliaineessa, joka sisältää assimiloituvaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden olennaisten ravinteiden kanssa. Väliaine muodostetaan alalla tunnettujen periaatteiden 10 mukaisesti.

Sopivia hiililähteitä ovat sellaiset hiilihydraatit kuin sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraatteja sisältävät materiaalit kuten viljanjyvät, mallas, riisi ja durra. Väliai-15 neeseen sisältyvän hiilihydraatin pitoisuus voi vaihdella suuresti, esimerkiksi olla enimmillään noin 25 % ja vähimmillään noin 1-5 %, mutta tavallisesti 8-10 % on sopiva, prosentit laskettuna glukoosiekvivalentteina.

20 Väliaineen typpilähde voi olla luonteeltan epäorgaaninen ja/tai orgaaninen. Nitraatit ja ammoniurnsuolat ovat sopivia epäorgaa-nisiä typpilähteitä. Orgaanisista typpilähteistä hyvin suurta • * | osaa käytetään yleisesti käymisprosesseissa, joissa viljellään "" bakteereita. Kuvaavina esimerkkeinä mainittakoon soijajauho, • · » |*··25 puuvillansiemen jauho, maapähkinä jauho, kaseiini, maissi, mais-• · * : sinliotusneste, hiivauute, urea ja albumiini. Tämän lisäksi * väliaineen tulisi sisältää myös tavallisia hivenaineita.

• · * • » · • * · Tämän keksinnön mukainen uusi Bacillus-laji on lievästi alkalo- • ••30 fiilinen. Tämän vuoksi viljely suoritetaan mieluiten lievän • * » » .*:*. aikalisissä pH-arvoissa, jotka voidaan saada aikaan lisäämällä 4 sopivia puskureita kuten natriumbikarbonaattia, pH 9,0, kasva-tusväliaineen steriloinnin jälkeen. Käymissäiliöviljelyssä täytyy käyttää keinoilmastusta. Ilmastusvoimakkuus on saman- f * | j*ji5 lainen kuin perinteisessä säiliöfermentoinnissa.

IM I

* ♦ * · · • «* • · 6 117759

Fermentoinnin jälkeen voidaan nestemäisiä entsyymikonsentraat-teja tuottaa poistamalla karkea aines liemestä ja, haluttaessa, konsentroimalla liemi haihdutuksella matalissa lämpötiloissa tai ultrasuodatuksella. Lopuksi konsentraattiin voidaan lisätä 5 säilymistä parantavia aineita.

Kiinteitä entsyymivalmisteita voidaan valmistaa puhdistetusta ja/tai konsentroidusta liemestä saostamalla suoloilla, esim. NaaS04, tai veteen sekoittuvilla liuottimilla kuten etanolilla 10 tai asetonilla. Voidaan myös käyttää veden poistamista liemestä sopivin kuivausmenetelmin, esimerkiksi sumutuskuivauksen avulla.

Proteolyyttisen aktiivisuuden analysointi 15 Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään kaseiini substraattina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö, CPU (Casein Protease Unit) määritetään entsyymimääräksi, joka vapauttaa 1 mM primaarisia aminoryhmiä (määritettynä vertailulla seriiniin) minuutissa standardiolosuhteissa, esim, inkuboimalla 30 minuuttia 25°C:ssa 20 pH:n ollessa 9,5. Analyyttistä menetelmää kuvaava kansio AF 228, on saatavilla pyynnöstä Novo Nordisk A/S -yhtiöltä Tans-kasta. Kansio on oheenliitetty.

• · • * • · · I*·; Entsyymi * · · • * f ***.*25 Keksinnön mukainen entsyymi on uudenlainen pesuaineproteaasi.

* ♦ * :*:* Se on alkaliiniproteaasi, ja se saadaan viljelemällä keksinnön « · * mukaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus sp. PD498, • · * V : ncimb No. 40484:ää, tai sen mutanttia tai varianttia sopivassa ravinneväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä sekä *••30 epäorgaanisia suoloja. Entsyymi voidaan valmistaa myös yhdis-·»·* .*:*. telmä-DNA-tekniikoin.

* *

Keksinnön mukaista proteaasia voidaan kuvata seuraavin piir-tein.

* · _ _ • * *3 5 ·*» · φ · • · · « ·« 7 117759

Fysikaaliskemialliset ominaisuudet

Keksinnön mukaisen proteaasin näennäinen molekyylipaino on 34 kD SDS-PAGElla määritettynä. Isoelektrisellä fokusoinnilla LKB Ampholine® PAG-levyillä saatiin pl-arvoksi noin 9,3. PMSF, 5 seriiniproteaasi-inhibiittori estää proteaasiaktiivisuutta. EDTA- ja soijaproteiini-inhibiittorit eivät vaikuta proteaasi-aktiivisuuteen.

Kuviossa 1 on esitetty lämpötilan ja aktiivisuuden suhde.

10 Aktiivisuus määritettiin 2 % kaseiini substraattina pH-arvossa 9,5 kun läsnä oli (valkoiset neliöt) tai läsnä ei ollut (mustat neliöt) 0,1 % natriumtripolyfosfaattia (STPP, tavallinen aineosa useissa kaupallisissa pesuaineissa). Aiemmin kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden analysointia koskevaa koetta 15 käytettiin niin, että inkubointilämpötilaa vaihdeltiin välillä 15-70°C. Kuviosta ilmenee, että entsyymi on proteolyyttisesti aktiivista alueella 15-70°C, ja sen optimilämpötila on alueella 40-55“C, noin 50“C.

20 Aktiivisuuden riippuvuus pH:sta määritettiin samalla menettelytavalla käyttämällä puskuriaineita, joiden pH-arvot olivat .·.·. ennalta määrättyjä alueella 6-11. Tulos nähdään kuviossa 2.

• *

Kuviosta ilmenee, että entsyymin proteolyyttinen aktiivisuus sijoittuu laajalle pH-alueella alle pH 6:sta yli pH ll:een • * · ‘**.*25 näennäisen pH-optimin ollessa alueella 9-11, noin pH 10.

* * » * * * • · · » * • · · ···· Lisäksi ilmeni, että keksinnön mukainen proteaasi on stabiili

• M

V : 60 minuuttia 25°C:ssa pesuolosuhteissa määritettynä eurooppa lais- ja amerikkalaistyyppisissä pesuaineissa.

*:*30 • · · · ·*·'· Immunokemialliset ominaisuudet * . Keksinnön mukainen proteaasi on immunokemiallisiltä ominaisuuk-, siltaan identtinen tai osittain identtinen (ts. ainakin osittain identtinen) proteaasin kanssa, joka on johdettu kannasta : :*35 Bacillus sp. PD498, NCIMB No. 40484.

•»· · * r • · • · · »a ' ' 8 117759

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologises-ti ristiinreagointi-identtisyyskokein. Identtisyyskokeet voidaan suorittaa tunnetulla Ouchterlonyn kaksoisimmunodif-fuusioraenetelmällä tai tandemristikkäisimmunoelektroforeesilla 5 tavalla, jonka on kehittänyt N. H. Axelsen; Handbook of Im-munoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications, 1983, luvut 5 ja 14. Termejä "antigeeni-identtisyys" ja "osittainen antigeeni-identtisyys" kuvataan samassa kirjassa luvuissa 5, 19 ja 20. iO

Luotiin monospesifinen antiseerumi edellä mainitulla menetelmällä immunisoimalla kaniineja puhdistetulla keksinnön mukaisella proteaasilla. Immunogeeni sekoitettiin Freundin adjuvan-tin kanssa ja injektoitiin subkutaanisesti kaniineihin joka 15 toinen viikko. Antiseerumi saatiin 8 viikon kokonaisimmunisaa-tiojakson jälkeen, ja siitä valmistettiin immunoglobuliini tavalla, jota on kuvannut N. H. Axelsen, supra.

Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiokokeissa keksinnön mukaisel- 20 la proteaasilla ja tunnetuilla Bacillus-lajien alkaliini- seriiniproteaaseilla, esim. ALCALASE™, SAVINASE’’", ESPERASE™, ,·,·, Novo-subtilisiini (valmistaja Novo Nordisk A/S, Tanska) tai • · KAZUSASE™ (valmistaja SHOWA DENKO, Japani) ei ilmennyt ristiin- "** reagointia.

• · · • · · ... «25 • · • * ϊ·: · Pesuainekoostumukset

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää yhtä tai ··· : useampaa pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla tyypiltään anioninen, ei-ioninen, kationinen, amfoteerinen tai zwitter- •••30 ioninen taikka näiden seos. Tyypillisiä esimerkkejä anionisis-• ··· ta pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyylibent-·, seenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS), alfaolefiinisul- • a a · · [ fonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnon rasva- * happojen alkalimetallisuolat. Esimerkkejä ei-ionisista pinta- • ;*?5 aktiivista aineista ovat alkyylipolyetyleeniglykolieetterit, ·♦· · ,*.J nonyylifenolipolyetyleeniglykolieetterit, sakkaroosin ja glu-• · 9 117759 koosin rasvahappoesterit sekä polyetoksyloidun alkyyliglu-kosidin esterit.

Keksinnön mukainen pesuaine voi sisältää myös muita alalla 5 tunnettuja pesuaineaineosia, joista voidaan mainita tehoaineet, valkaisuaineet, valkaisuaktivaattorit, korroosionestoaineet, sekvestrointiaineet, lian uudellen tarttumista estävät aineet, hajusteet, entsyymejä ja valkaisuaineita stabiloivat aineet, formuloinnin apuaineet, optiset kirkasteet, vaahdontehostimet, 10 kelatoivat aineet, täyteaineet, pehmennysaineet jne. Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan formuloida olennaisesti tavalla, jota on kuvannut J. Palbe (Falbe J., Surfactants in Consumer Products, Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1987, katso erityisesti luku "Frame formulations for 15 liquid/powder heavy-duty detergents").

Tällä hetkellä katsotaan, että keksinnön mukainen pesuainekoos- tumus voi sisältää entsyymivalmistetta määrän, joka vastaa 0,0005 - 0,5 CPU proteolyyttistä aktiivisuutta pesunestelitraa 20 kohti.

Keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voidaan formuloida • · ^ mihin tahansa sopivaan muotoon kuten jauheiksi, nesteiksi jne.

* • ·« · • · tv |**t*25 Edullisesti keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voivat • * * •‘•I : lisäksi sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, esimerkiksi * ...t lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja/tai perok-·»· V : sidaaseja tavalliseen tapaan pesuainekoostumuksiin sisällytet tyinä.

♦••30 »··*

Keksinnön mukainen proteaasi voidaan sisällyttää pesuainekoos- • , tumukseen lisäämällä pesuaineproteaasia sisältäviä erillisiä [ lisäaineita taikka lisäämällä yhdistelmänä lisäineita, jotka • * sisältävät erilaisia pesuaine-entsyymejä.

: :*35 *♦♦ · • · · • · 10 117759

Keksinnön mukainen lisäaine voidaan formuloida esim. rakeisiksi jauheiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Suositeltavia pesuaine-lisäaineformulointeja ovat pölyämättömät rakeiset jauheet, nesteet, erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut 5 entsyymit. Pölyttömiä pesuaineita voidaan valmistaa esimerkiksi tavoin, joita kuvaa GB-1362365 tai US-4106991, ja valinnaisesti ne voidaan päällystää tunnetuin tekniikoin. Pesuaine-entsyymit voidaan sekoittaa ennen rakeistamista tai rakeistami-sen jälkeen. Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan esimerkik- 10 si stabiloida lisäämällä polyolia kuten propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa tunnetuin tekniikoin. Alalla tunnetaan muitakin entsyymistabilaat-toreita. Suojattuja entsyymejä voidaan valmistaa tavalla, jonka tuo esiin EP-238216.

15

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavin esimerkein, joita ei ole tarkoitettu millään tavoin patenttivaatimuksissa esille tuotavaa keksinnön suojapiiriä rajoittaviksi.

20 Esimerkki 1

Viljeltiin Bacillus sp. PD498:aa 2510:333 pyörivällä täryalus-talla (300 rpm) 500 ml väliseinällisissä Erlenmeyer-pulloissa, * 1 * m\t jotka sisälsivät 100 ml seuraavanlaista väliainetta litraa ;1·; kohti: k « · • « · */’/25 .

* « k k · 1 • 1♦ · ♦ ···: Perunatärkkelys 100 g V 5 Jauhettu ohra 50 g soijajauho 20 g ♦•130 Na2HP0txl2H20 9 g

Pluronic® 0,1 g « * , Natriumkaseinaatti 10 g »M·1 * t ’ 1 Väliaineen tärkkelys nesteytettiin a-amylaasilla ja väliaine , • ;1S5 steriloitiin kuumennuksella 120°C:een 45 minuutiksi.

* · ·1·

A

11 117759

Steriloinnin jälkeen väliaineen pH säädettiin arvon 9,0 lisäämällä 10 ml 1 M natriumbikarbonaattiliuosta.

Neljän inkubointipäivän jälkeen viljelmän proteolyyttinen 5 aktiivisuus määritettiin käyttämällä edellä kuvattua menetelmää.

Viljelyn jälkeen liemen entsyymiaktiivisuus oli 5 CPU/1.

10 Kun kiinteä aines oli poistettu proteaasi puhdistettiin perinteisellä kromatografiamenetelmällä.

Saanto 3,5 l:sta viljelylientä oli 31 ml aktiivisuusarvolla 120 CPU/1. Puhtaus oli yli 90-prosenttinen sekä SDS-PAGElla 15 että isoelektrisellä fokusoinnilla arvioituna.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun valmisteen ominaispiirteisiin on viitattu aiemmin tässä selityksessä ja siihen viitataan tässä.

20

Esimerkki 2 Pesukyky * « • I Pesukykykokeet suoritettiin rasvatahratulla puuvillalla, 20°c ♦ ·· /*** isotermisesti 10 minuuttia.

• t · • · **r **•25 • * s,: ί Kokeet suoritettiin entsyymipitoisuuksien ollessa 0,02 - 0,5 mg entsyymiproteiinilitraa kohti.

y t * f · · i · λ

A

Käytettiin 2,0 g/1 kaupallista amerikkalaista pesuainejauhetta. *»30 Pesuaine liuotettiin veteen, jonka kovuus oli noin 6“dH (saksa- • ·. · 4 lainen kovuus), ja pH säädettiin arvoon 9,5. Tekstiilien suhde , pesunesteeseen oli 6 g tekstiilejä pesunestelitraa kohti.

• ·

Pesun jälkeen kankaat huuhdeltiin juoksevassa hanavedessä ja ϊ .*35 ilmakuivattiin. Määritettiin väheneminen (%R) 460 nm:ssa.

« » « · i » * * · * · · • « 12 117759

Pesukyvyn mittana käytettiin differentiaalivähenemistä, cR, väheneminen entsyymipesun jälkeen miinus väheneminen pesun jälkeen ilman entsyymiä.

5 Kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 3. Kuviosta ilmenee, että keksinnön mukaisen proteaasin pesukyky on hyvä.

4 A 9 » f * » · m « ··« • 9 4*· 9 * 9 · * ' ' • · · "»t · * i » · • « · «*· · ·«♦ * • 9 % * 9 m *

% 9 H

• 9 9 Λ • Λ9 * • * · * · ♦ 9 9 * 4 9 m n 9 ·· 4 «···· 9 9 9 • · « t · «at».

« · * * · • #· • * 13 1 1 7759

International Application No: PCT/ /

MICROORGANISMS

o ] I

OrVtntl itint In cenfweaon »Iin tn* mk/w>ii*nl·'" t* »n »*9*—— "*----·* i,,u1pe®" 1 a. loiMTincATtoN or diposit ·

Fvith* d*po*itt in M*mPUd on «n »edition*! »A**d Q ·

Nanv· »I jl*o«*JQrYli>dtilvti*n 4 NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL & MARINE BACTERIA LTD.

,my??deen AB2 1RY, Scotland DM «I <»»0*11 * A««MO« Nymbof · 9 March 1992 NCIMB 40W___

A ADDITIONAL INDICATIONS 1 OM.» »Uftt H n*I i»pl>c*bl·)· TM» Inloniuuon I· cenenu*d *n · »·**ιιι· attKMd ·*>·** Q

In respect of those designations in which a European patent is sought, a sample of the deposited microorganism will be made available only by the issue of such a sample to an expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC) until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application has been refused or is deemed to be withdrawn.

¢. DllieNATID ST ATI· FOA WHICH INDICATION* AM NADI · <H ih· IndlcMIOft· »f» Mt It it dHlfHlM SKIM) • · • * D. SIFAftATI PUAMISHIMt OF INDICATIONS * (luv· UAAktf »»»Uu»*} • _ • · · _ _ ___ — ···· Th* ·λ*Κ*Ι»#Λ· 11·«·* below ·*Η N «ubfhMt·* I· th* lnt*rMti*ft*J iwf**v l«t* 1 (SMC»*jr th* 9*0*91 Mtu™ ·* **· 11»*!««»·*· ·*·** . « *Ά«β·«#ι·Λ Number of 0·ρο**Π • · · • · * • · · · • · • ♦ ♦ • ·* ♦ ·*** » · · • * * • * · (, Q Thti ihe·! *«» mAh th* trtt*rn«lt*n*l a»pfcc*ttOA *h*« Mo* (t* b* chock·* by W** ΙΜ·*?ΙΛ( 0·«·) :. — /7; /' • * · (Avthonto* OSkofl » .

• · · * # Q Tha Ola »I tacaifi (from th# i|#liciAl) by (h* InlffMOflal i* • · # ··*·♦ «II ____ _ ^ _ ----—»— — * (AvihoNiM OtildN) • * _ __ .___ ;β· \ F»nn ACTrftO/1M (J*ftu#ry IKI) • · • · · « *

Claims (10)

117759

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että se on saatavissa viljelemällä kantaa Bacillus sp. PD498, NCIMB No. 40484 ja että sillä 5 on seuraavat ominaisuudet: a) näennäismolekyylipaino 34 kD (SDS-PAGElla määritettynä), b) pl noin 9,3 c) optimi-pH alueella 9-11 (25°C:ssa kaseiini substraattina), 10 d) lämpötilaoptimi alueella 40-55°C (pH 9,5:ssä ja kaseiini substraattina) ja e) sen immunokemialliset ominaisuudet ovat identtiset verrattuna proteaasiin, joka on johdettu kannasta Bacillus sp. PD498,NCIMB No. 40484. 15

2. Eristetty biologisesti puhdas kannan Bacillus sp. PD498 viljelmä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen viljelmä, tunnettu siitä, 20 että kanta on Bacillus sp. PD498,NCIMB No. 40484. ·· · • · * t •j.

4. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 mukainen ···· : .·. proteaasi, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään pro- • · · : teaasia tuottavaa kantaa Bacillus sp. PD498, NCIMB No. 40484, * » t ***.’ 25 sopivassa ravinnevällaineessa, joka sisältää hiili- ja typpi- # lähteitä sekä epäorgaanisia suoloja, ja otetaan sitten haluttu · · *·" * entsyymi talteen.

5. Pesuainelisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää patent- t · · *...* 30 tivaatimuksen 1 mukaista proteaasia pölyämättömien rakeisten * .···, jauheiden, nesteen, erityisesti stabiloidun nesteen, lietteen, * · tai suojatun entsyymin muodossa.

* * ·· · • ’.· 6. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patent- • « ϊ/.ί 35 tivaatimuksen 1 mukaista proteaasia. SI1 Ί II I '..... ΙΊ 117759 Ti

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, erityisesti amylaaseja, lipaaseja, sellulaaseja, oksidaa-seja ja/tai peroksidaaseja.

8. Pesuprosessi, tunnettu siitä, että siinä lisätään patenttivaatimuksen 1 mukaista proteaasia.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pesuprosessi, tunnettu 10 siitä, että siinä lisätään patenttivaatimuksen 5 mukaista pesu-ainelisäainetta,

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pesuprosessi, tunnettu siitä, että siinä lisätään patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaista 15 pesuainekoostumusta.