FI110434B - Uudet proteaasit - Google Patents

Description

110434

Uudet proteaasit - Nya proteaser Tämä keksintö liittyy pesuaineproteaaseihin, jotka on johdettu 5 alkalofiilisista Bacillus sp. kannoista. Tarkemmin sanoen keksintö kohdistuu uuteen alkaliseen proteaasiin, joka on johdettu Bacillus sp. J 20 kannasta. Keksintö kohdistuu lisäksi prote-aasin valmistusmenetelmään, proteaasin käyttöön pesuaine-entsyyminä samoin kuin pesuainekoostumuksiin ja pesuainelisäainei-10 siin, jotka sisältävät keksinnön mukaista proteaasia.

Pesuaine-entsyymejä on markkinoitu yli 20 vuoden ajan ja niistä on tullut pesuaineiden vakioaineosia sekä jauhemaisissa että nestemäisissä pesuaineissa kaikkialla maailmassa. Koska suun-15 tauksena ovat yhä matalammat pesulämpötilat pesuaine-entsyymien kulutus on viime vuosina jatkuvasti lisääntynyt. Pesukoostu-muksissa käytettäviä entsyymejä ovat muun muassa proteaasit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit samoin kuin muutkin entsyymit sekä näiden seokset. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

20

Pesuaineproteaaseja on kehitetty eristämällä luonnossa esiintyviä proteaaseja ja kokeilemalla niitä pesuainekoostumuksissa.

. : Useimmat pesuaineproteaasit saadaan Bacillus-suvun jäsenistä.

·'·*: Markkinoille tulee nykyisin uusia proteaasityyppejä, joilla . ;’;25 voidaan päästä parempiin kustannus/teho suhteisiin erilaisissa spesifisissä olosuhteissa.

Esimerkkeinä kaupallisista proteaasituotteista voidaan mainita Alcalase™, Esperase™ ja Savinase™ (kaikkien valmistaja Novo 30 Nordisk A/S, Tanska). Nämä ja samantapaiset muista kaupalli-: .* sista lähteistä saatavat entsyymituotteet ovat aktiivisia pesu- v · aineliuoksissa eli pH-arvojen ollessa alueella 8-11 ja kun läs- nä on sekvestrointiaineita, pinta-aktiivisia aineita ja valkai-,···, suaineita kuten natriumboraattia. Alcalase™-proteaasi tuote-’·' 35 taan Bacillus licheniformis lajin kannoista. Esperase™- ja 110434

Savinase™-proteaasit saadaan viljelemällä alkalofii1 isiä Bacil- 1us-kantoja.

2 Tämän keksinnön mukaisilla uusilla pesuaineproteaasei11a on 5 erinomainen pesunkestävyys.

Ensimmäisenä keksinnön kohteena on proteaasi, jonka näennäinen molekyylipaino on 29 kD, pl noin 8,8, optimi-pH alueella pH 10-12 (25eC:ssa) ja optimi lämpötila alueella 45-65°C (pH 9,5).

10

Toisena keksinnön kohteena on proteaasi, jonka näennäinen mole-kyylipaino on 29 kD, pl noin 8,8, optimi-pH alueella pH 10-12 (25°C:ssa) ja optimilämpötila alueella 45-65"c (pH:n ollessa 9,5) ja jonka immunkokemialliset ominaisuudet ovat samanlaisia 15 tai osittain samanlaisia kuin proteaasi 11a, joka on johdettu bakteerista Bacillus sp. J 20, NCIMB No. 40262. Tarkemmin sanoen proteaasi saadaan Bacillus sp. J 20 kannasta. Vielä spe-si f i semmin proteaasi saadaan bakteerista Baci llus sp. J 20, NCIMB No. 40262, tai sen mutantista tai. variantista.

20

Kolmantena keksinnön kohteena on eristetty biologisesti puhdas viljelmä kannasta Bacillus sp. J 20. Tarkemmin sanoen kyseessä ***. on Bacillus sp. J 20 kanta, NCIMB No. 40262, tai sen mutantti tai variantti.

’ 25

Neljäntenä keksinnön kohteena on proteaasi n valmistusmenetelmä, ’ t jossa viljellään proteaasia tuottavaa Bacillus sp. J. 20 kantaa « ·* sopivassa elatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typpi lähteitä *.· * sekä epäorgaanisia suoloja ja haluttu entsyymi kootaan sitten 30 talteen. Tarkemmin sanoen viljellään basillusta Bacillus sp. J 20, NCIMB No. 40262, tai sen mutanttia tai muunnelmaa.

Viidentenä patenttivaatimusten kohteena on entsyymin käyttö ;;; pesuaine-entsyyminä. Tarkemmin sanoen keksintö koskee proteaa-'•35 siä sisältävää pesuainekoostumusta. Toinen tarkemmin sanottu ;Y: kohde ovat proteaasia sisältävät pesuaine!isäaineet.

3 110434

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patentti vaatimuksisa.

Keksintöä kuvataan tarkemmin oheen liitettyjen kuvioiden avul-5 la, joissa: kuvio 1 osoittaa lämpötilan ja keksinnön mukaisen entsyymin (kaseiini substraattina pH-arvossa 9,5) proteolyyttisen aktiivisuuden suhdetta (prosentuaalinen suhteellinen aktiivisuus) 10 kun läsnä on tai ole STPP:tä ( J20; □ J20 + 0,1 % STPP) ja kuvio 2 osoittaa pH-arvon ja keksinnön mukaisen entsyymin (kaseiini substraattina, lämpötila 25 °C) proteolyyttisen aktiivisuuden suhdetta (prosentuaalinen suhteellinen aktiivisuus).

15 Uudet keksinnön mukaiset mikro-organismit, jotka pystyvät tuottamaan keksinnön mukaista entsyymiä, eristettiin olennaisesti alkalofiilisten Bacillus-bakteerien valikointimenetelmällä, jota kuvaa GB-1243784. Eräs tällainen viljelmä, Bacillus sp. J 20, on talletettu 27.2.1990 (Budapest Treaty, NCIMB Ltd., 23 20 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK) tulonumerolla ’•j NCIMB 40262.

/ Tämän keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu Bacillus-sukuun. Morfologi-/25 sesti niitä voidaan kuvata liikuntakykyisiksi sauvoiksi, joiden läpimitta on 0,6 - 0,8 mikrometriä ja pituus 2-3 mikrometriä.

* Itiöt ovat pyöreistä ellipsoidisiin, itiöpesäkkeitä turvotta-mattomia, sentraalisista subterminaalisiin. Optimaalinen kas-vulämpötila on 35-40 °C ja optimaalinen kasvu-pH on 8,5 - 10, •‘"BO ei kasvua alle pH 8:ssa. Mikro-organismi muodostaa keltaisia / . pesäkkeitä ravintoagarvinoviljelmissä, pigmentin diffusoitu-' I mistä agariin ei ole havaittavissa.

: Taulukkoon 1 kootut koetulokset kuvaavat keksinnön mukaista ;··£5 mikro-organismia edelleen.

110434 4 TAULUKKO 1 KOE DSM485 DSM4972 J20

Elatusagar (Difco) pH 91 + + +

Elatusagar (Difco) pH 71 W - w

Elatusagar (Difco) pH 111 + B.Subtilin minimal -elatusaine (Spizizen) pH 71 w - w

Kasvu 50°C:ssa1 - +

Kasvu NaClrssa 2% + + 5% + + 7% - + + 10% - + ( + )3

Hydrolyysi: Tärkkelys + + +

Kaseiini + + +

Gelatiini + + + cmc < » « « , Happolähde:

; Glukoosi + W

• *

Mannitoli - +

Sorbitoli ’’’ * Ksyloosi : . ’ Pelkistys: : Nitraatti - +

Anaerobinen kasvu - -

Voges Proskauer -reaktio - - 5 110434 DSM 485: B. alkalophilus DSM 497: B. alkalophilus subsp. halodurans J 20 : B. sp. J 20, NCIMB No. 40262 W - heikko 5 1 : Saatu 2 päivän inkuboinnin jälkeen. Kaikki muut inkuboinnit 7 päivää.

2 : Tiedot saatu kirjallisuudesta.

3 : Positiivinen 14 päivän inkuboinnnin jälkeen, negatiivinen 7 päivän kuluttua.

10

Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidaan viljellä aerobisissa olosuhteissa elatusväliaineessa, joka sisältää assimiloituvaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden olennaisten ravinteiden kanssa; elatusaine on muodostettu alalla tavalliseen tapaan.

15

Sopivia hiililähteitä ovat hiilihydraatit kuten sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, sekä hiilihydraatteja sisältävät aineet kuten viljanjyvät, mallas, riisi ja durra. Elatusaineeseen lisättävän hiilihydraatin pitoisuus voi vaihdella suuresti, se 20 voi olla esimerkiksi enimmillään 25 % ja pienimmillään 1-5 %, mutta tavallisesti sopiva määrä on 8-10 %, prosentit laskettuna glukoosiekvivalentteina.

t · 9 » • i * ··,*. Elatusväliaineen typpilähde voi olla luonteeltaan epäorgaaninen ’.25 ja/tai orgaaninen. Sopivia epäorgaanisia typpilähteitä ovat • * · nitraatit ja ammoniumsuolat. Orgaanisista typpilähteistä usei- % % ♦ » ta käytetään tavallisesti käymisprosesseissa, bakteerien vilje- s t * ; ·' ly mukaanlukien. Kuvaavia esimerkkejä ovat soijajauhot, puu-• · V · villansiemenjauhot, maapähkinäjauhot, kaseiini, maissi, maissin 30 liotusneste, hiivauutteet, urea ja albumiini. Elatusaineen f > * ; ’ : tulisi lisäksi sisältää tavanomaisia hivenaineita.

t « * ·

Koska tämän keksinnön mukaiset uudet Bacillus-lajit ovat aika- I I i ;;; lofiilisiä eivätkä pysy kasvamaan pH:n ollessa alle 8 viljely * **3*5 on edullisinta suorittaa aikalisissä pH-arvoissa, joihin voi- Y: daan päästä lisäämällä sopivia puskuriaineita kuten natriumkar- t » 6 110434 bonaattia tai natriumkarbonaatin ja natriumbikarbonaatin seoksia elatusaineen steriloinnin jälkeen. Säiliöfermentoreissa viljeltäessä tarvitaan keinotekoista ilmastusta. Ilmastusmäärä on vastaava kuin perinteisessä säiliöfermentoinnissa.

5

Fermentoinnin jälkeen nestemäiset entsyymikonsentraatit voidaan saada aikaan poistamalla karkea aines liemestä tai haluttaessa konsentroida liemi haihduttamalla matalassa lämpötilassa tai käänteisosmoosin avulla. Konsentraattiin voidaan lopuksi lisä-10 tä säilytysaineita.

Kiinteitä entsyymivalmisteita voidaan valmistaa puhdistetusta ja/tai konsentroidusta liemestä saostamalla suoloilla, esimerkiksi Na2S04:lla tai veteen sekoittuvilla liuottimilla kuten 15 etanolilla tai asetonilla. On myös mahdollista poistaa liemen vesi sopivin kuivatusmenetelmin, esimerkiksi sumutuskuivausta käyttäen.

Saadun proteaasivalmisteen proteolyyttinen aktiivisuus on ta-20 vallisesti alueella 1-50 CPU/g.

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään kaseiini substraattina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö (CPU) on määritetty määräksi ent-... syymiä, joka vapautta 1 mM primaarisia aminoryhmiä (määritetty-,)^5 nä suhteessa seriinistandardiin) per minuutti standardiolosuh- < i · • teissä (inkubointi 30 minuuttia 25°C:ssa, pH 9,5). Tätä ana-lyyttistä menetelmää kuvaava kansio AF 228 on haluttaessa saa-tavilla Novo Nordisk A/S yhtiöltä Tanskasta ja se on oheenlii- tetty.

; ‘ib

Keksinnön mukainen entsyymi on uusi pesuaineproteaasi. Se on alkalinen proteaasi, joka saadaan viljelemällä keksinnön mu-; kaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus Sp. J 20, NCIMB

• No. 40262, tai sen mutanttia tai muunnelmaa sopivassa elatusvä-•3-5 liaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä sekä epäor- 7 110434 gaanisia suoloja. Entsyymi voidaan saada myös yhdistelmä-DNA-tekniikoin.

Keksinnön mukaista proteaasia voidaan kuvailla seuraavasti.

5

Fysikaaliskemialliset ominaisuudet:

Molekyylipaino 29 kD, määritettynä SDS-PAGE:n avulla, pl-arvo 8,8 määritettynä isoelektrisen fokusoinnin avulla LKB Ampholine R PAG -levyjä käyttäen. Proteaasiaktiviteetti inhiboituu 10 PMSF:llä, a-l-antitrypsiinillä ja kalkkunanvalkuaisproteinaasi-inhibiittorilla. EDTA ja soijaproteiini-inhibiittori eivät vaikuta proteinaasiaktiivisuuteen. Proteaasi pilkkoo ihmisen insuliinia hydrofobisten aminohappojen C-terminaalipuolella. Tarkemmin sanoen ihmisen insuliini pilkkoutuu seuraavien 15 aminohappojen väliltä: A-ketjussa Leu13-Tyr14/ B-ketjussa Leu-n-Val12, Leu15-Tyr16 ja Cys19-Gly20 (Cys on disulfidi).

Lämpötilan ja aktiivisuuden suhde määritettiin kaseiini substraattina. Aiemmin kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden koet-20 ta käytettiin muunneltuna siten että inkubointilämpötilaa muunneltiin alueella 15-60°C. Entsyymireaktio toteutettiin kun läsnä oli tai ei ollut 0,1 % natriumtripolyfosfaattia (STPP). Tulokset on koottu taulukkoon 1. Entsyymi osoittaa proteolyyt-... tistä aktiivisuutta lämpötilan ollessa alle 15°C:sta yli 70°C:-.:25 een, lämpötilaoptimina (STPP:n poissaollessa) alue 45-65°C, • 1’ tarkemmin sanoen 55-65°C; noin 60°C.

*"· Aktiivisuuden riippuvutta pH:sta tutkittiin samalla menetelmäl-: 1.· lä käyttämällä puskuriaineita, jotka säädettiin etukäteen mää-:30 ritettyihin pH-arvoihin alueella 7-11. Tulokset näkyvät taulukosta 2. Entsyymi on proteolyyttisesti aktiivista pH-arvojen ollessa alle 6:sta yli ll:een, optimi-pH alueella pH 10 - pH 12; noin pH 11.

•3Ö Keksinnön mukainen proteaasi on stabiili 60 minuuttia 40°C:ssa ja pesuolosuhteissa kun läsnä on tai ei ole valkaisuaineita i » · 8 110434 kuten perboraattia ja NOBS:ia sekä eurooppalais- että amerikkalaistyyppisissä pesuaineissa.

Immunokemialliset ominaisuudet: 5 Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologises-ti ristireaktiotunnuskokein. Tunnuskokeet voidaan suorittaa tunnetulla Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiomenetelmällä tai tandemristeävällä immunoelektroforeesilla N. H. Axelsenin mukaan (Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, Black-10 well Scientific Publications, 1983, luvut 5 ja 14). Termejä "antigeeni-identtisyys" ja "osittainen antigeeni-identtisyys" selvitetään saman teoksen luvuissa 5, 19 ja 20.

Luotiin monospesifinen antiseerumi yllä mainitulla menetelmällä 15 immunisoimalla kaniineja puhdistetulla keksinnön mukaisella proteaasilla. Immunogeeni sekoitettiin Freundin adjuvantin kanssa ja injektoitiin subkutaanisesti kaniineihin joka toinen viikko. Antiseerumia saatiin 8 viikon kokonaisimmunisointijakson jälkeen, ja siitä valmistettiin immunoglobuliinia tavalla, 20 jota kuvaa N. H. Axelsen, supra.

Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiokokeet eivät osoittaneet ristireaktiota keksinnön mukaisen proteaasin ja tunnetun alka-...t listen seriiniproteaasien Alcalase™, Savinase™, Esperase™, Sub-.^45 tilisin BPN' ja protease API-21 välillä.

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää yhtä tai ' ' useampaa pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla tyypiltään • anioninen, ioniton, kationinen, amfoteerinen tai zwitterioninen * < · :30 tai jokin näiden seos. Tavallisia anionisia pinta-aktiivisia aineta ovat esimerkiksi lineaariset alkyylibentseenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS) ,alfaolef iinisulfonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) sekä luonnon rasvahappojen alka- • limetallisuolat. Esimerkkeinä ionittomista pinta-aktiivisista >2>% aineista voidaan mainita alkyylipolyetyleeniglykolieetterit, nonyylifenolipolyetyleenigykolieetterit, sakkaroosin ja glukoo- 1 » » 9 110434 sin rasvahappoesterit sekä polyetoksyloidun alkyyliglukosidin esterit.

Keksinnön mukaiset pesuainekoostumukset voivat sisältää muita-5 kin alalla hyvin tunnettuja pesuaineen aineosia kuten tehoaineita, valkaisuaineita, valkaisuaktivaattoreita, korroosiones-toaineita, sekvestrointiaineita, lian uudelleenasettumista estäviä aineita, hajusteita, entsyymien ja ja valkaisuaineiden stabilisaattoreita, koostumusta parantavia aineita, optisia 10 kirkasteita, vaahdontehostajia, kelatoivia aineita, täyteaineita ja kankaiden pehmennysaineita. Keksinnön mukainen pesu-ainekoostumus voidaan muodostaa olennaisesti tavalla, jota kuvaa J. Falbe (Falbe, J., Surfactants in Consumer Products, Theory, Technology and Application, Springer Verlag, 1987, ks. 15 erityisesti osa "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents).

Katsotaan, että keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää entsyymivalmistetta määrän, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU pro-20 teolyyttistä entsyymiä per litraa pesunestettä.

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan muodostaa millaiseksi tahansa sopivaksi muodoksi kuten jauheiksi tai nesteiksi.

» » · ',’Ζδ Lisäksi keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi edullisesti * * ;* sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, esimerkiksi li- t » '·’ paaseja, amylaaseja, sellulaaseja ja/tai peroksidaaseja, joita tavallisestikin käytetään pesuainekoostumuksissa, samoin kuin ; V muuta alkuperää olevia proteaaseja.

:'ia Tämän keksinnön mukainen proteaasi voidaan liittää pesuaine-koostumukseen lisäämällä erikseen lisäaineita, jotka sisältävät :·. pesuaineproteaasin tai lisäämällä yhdistelmälisäainetta, joka i i sisältää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

* * t l % · • i « 10 110434

Keksinnön mukainen lisäaine, siis erillinen lisäaine tai yhdis-telmälisäaine, voidaan muodostaa esimerkiksi granulaateiksi, nesteiksi tai lietteiksi. Suositeltavia pesuainelisäainekoos-tumuksia ovat pölyämättömät granulaatit, nesteet, erityisesti 5 stabiloidut nesteet, lietteet sekä suojatutu entsyymit. Pölyämättömät granulaatit voidaan valmistaa esimerkiksi tavalla, jota kuvaa GB-1362365 tai US-4106991, ja ne voidaan myös päällystää alalla tunnetuin tavoin, pesuaine-entsyymit voidaan sekoittaa ennen granulointia tai sen jälkeen. Nestemäiset ent-10 syymivalmisteet voidaan stabiloida esimerkiksi lisäämällä jotain polyolia kuten propyleeniglykolia, sokeria tai sokeralko-holia, maitohappoa tai boorihappoa, tunnettujen menetelmien mukaisesti. Alalla tunnetaan muitakin entsyymistabilisaatto-reita. Suojatut entsyymit voidaan valmistaa tavalla, jota ku-15 vaa EP-238216.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

, Esimerkki 1 20 Bacillus sp. J 20 viljeltiin 25°C:ssa pyörivällä tärypöydällä (300 kierrosta minuutissa) 500 ml:n suuntaa muuttavissa erlen-meyerpulloissa, jotka sisälsivät 100 ml elatusainetta, jonka koostumus oli (per litraa) : i * * ,;*25 Perunatärkkelys 100 g t 1 ♦

Jauhettu ohra 50 g 'J*' Soijajauho 20 g

Na2HP04 X 12 H20 9 g r· * ( ; V Pluronic* 1 g - i · .30 Natriumkaseinaatti 10 g ·.*. Elatusaineen tärkkelys nesteytettiin a-amylaasilla ja elatusai- . » , ; , ne steriloitiin kuumentamina 120°C:een 45 minuutiksi.

I f · » . » » .35 Steriloinnin jälkeen elatusaineen pH säädettiin arvoon 9,7 > I * lisäämällä 10 ml natriumseksvikarbonaatin 1 M liuos.

i » * i i * » » » » 11 110434

Viiden päivän inkuboinnin jälkeen viljelmän proteolyttinen aktiivisuus määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.

Viljelyn jälkeen liemen entsyymiaktiivisuus oli 120 CPU/1.

5

Esimerkki 2

Valmistettiin puhdas entsyymivalmiste seuraavaan tapaan:

Fermentoitu viljelmäliemi, joka valmistettiin esimerkin 1 talo paan sentrifugoitiin kiinteän aineen poistamiseksi. Sentrifu-gaattiin lisättiin ¼ tilavuutta asetonia, presipitaatti poistettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois. Sentrifugaattiin lisättiin vielä asetonia kokonaismäärään 2 tilavuutta. Presipitaatti poistettiin sentrifugoimalla ja liuottamalla seuraava 15 kaltaiseen puskuriaineeseen: 0,1 M boorihappoa, 0,01 M dimetyy-| liglutaarihappoa, 0,002 M kalsiumkloridia, pH säädetty arvoon 7,0.

Tästä liuoksesta entsyymi eristettiin affiniteettikromatografi-20 an avulla. Proteolyyttisen aktiivisuuden fraktiot koottiin, konsentroitiin, pestiin puskurilla UF-kammiossa ja lyofilisoi-tiin.

Saanto yhdestä litrasta viljelmälientä oli 1,2 g ja 25,6 CPU/g.

’ ; 25 SDS-PAGEn avulla arvioitu puhtaus oli yli 90 %.

Tämän esimerkin mukaisesti valmistettujen entsyymivalmisteiden : V omainaisuuksia on jo käsitelty aiemmin tässä patenttihakemuk-V ‘ sessa.

30 :’·’: Esimerkki 3 » »

Pesukyky: ·, Kokeissa käytettiin entsyymipitoisuuksia 0,001, 0,01 ja 0,1 CPU/1, ja entsyymivalmiste oli esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti ’>··1 35 saatu.

t i 12 110434

Pesukykykokeet suoritettiin sekalialla (oliiviöljy, gelatiini, tussi, kaoliini) puuvillassa 40°C:ssa tasainen lämpö 15 minuutin ajan.

5 Käytettiin 1,5 g/1 kaupallista amerikkalaistyyppistä nestemäistä pesuainetta. Pesuaine liuotettiin kovuudeltaan noin 6°dH (saksalainen kovuus) olevaan veteen ja mitattu pH oli 7,83. Tekstiilien/veden nestesuhde oli 10 g tekstiilejä per litraa pesunestettä. Pesun jälkeen pH oli muuttunut arvoon 7,7.

10

Pesun jälkeen kankaat huuhdeltiin juoksevassa hanavedessä ja ilmakuivattiin. Määritettiin remissio (R%) 460 nm:ssa.

Pesukyvyn mittana käytettiin differentiaaliremissiota AR, joka 15 oli remissio pesun jälkeen kun käytettiin entsyymiä miinus remissio pesun jälkeen kun entsyymiä ei lisätty.

Kokeiden tulokset näkyvät taulukosta 3.

20 TAULUKKO 3 ···, Keksinnön mukaisen entsyymin J20 pesukyky. Differentiaalire-missio, AR, mitattiin sen jälkeen kun oli suoritettu pesu kau-' ; 25 pallisella amerikkalaistyyppisellä nestemäisellä pesuaineella.

' Entsyymipitoisuus AR

30 0,001 3,1 0,01 10,3 0,10 16,1 1 - Differentiaaliremissioarvot osoittavat, että keksinnön mukai-35 sella proteaasilla on erinomainen pesukyky.

110434 13

International Application No: PCT/ /

MICROORGANISMS

O 27-28

Ofttonal Shot m cmmcHni «M» tho mlcroorpowlom to Of* Nff« J , »no .. of tho dwcrtpUfi * a. iDiimncATfON op oirosir *

Purthor dopoolts wo Idsntiflod on on oddKfonol ehoet Q·

Nsmo of dopooftvy Inumutton * NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL & MARINE BACTERIA LTD.

AtOf··· of depMltonr InatttullMi (Inctutflfw pe«ttl cedeant coqntvy) * . _ ,, .

23 St. Macnar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland

Oat· of MfMlt · Accmlw NunW( · 27 February 1990 40262

B. ADDITIONAL INDICATIONS 1 (loovo Monk If not sppUcabJo). This Infomotton I· continued on a ooporbts athcM shoot Q

In respect of those designations in which a European patent is sought, a sample of the deposited microorganism will be made available only by the issue of such a sample to an expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC) until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the appli-—oatien·· hao-boor>-r-efucod or· lo—deoraed to bo withdrawn-.- C. OKNINNATCD STATIN PON WHICH INDICATIONS AM MAD· · (H th· indtestions oro not ter Ml deolpnotod SWh) D. SIP AN ATI PUNMISHINS OP INDICATIONS » Omw bUnh It not o»p»tbMo)

Ths indicotteno Ustod below wUI bs submitted lb Ihs tMetnottbnel Swfoou lotor * (SpwHy Ihs goners! not»*· bt th# Indications s.ft.a ** Accession Number of Oeposlt **) t 8. Q This shoot woo received with tho Intemetionsl applrcstlon who* Aled (lb bo checked by tho rocoMnf OMco) . ___________ ( J t (Authorized Officer) J / % Q Tho dots of rocolot (from th# applicant) by tho Intamattonsi 8wroeu >· ' ; · »«« -----------—------ -------------------- • (Awlhorizad Officer) form PCT/ftO/fM (January tWI)

Claims (7)

110434

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet : 5 a) näennäinen molekyylipaino 29 kD, b) pl noin 8, 8 c) optimi-pH alueella pH 10-12 (25 °C:ssa) d) optimilämpötila alueella 45-65 °C (pH 9,5) ja 10 e) immunokemialliset ominaisuudet, jotka ovat samanlaiset tai osittain samanlaiset kuin proteaasilla, joka on saatavissa Bacillus sp. J 20:stä, NCIMB No. 40262, ja että voidaan saada viljelemällä Bacillus sp. J 20:ta, NCIMB no 40262. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että proteaasi saadaan Bacillus sp. J 20-kannasta, NCIMB No. 40262.

3. Eristetty biologisesti puhdas viljelmä, tunnettu siitä, .••fettä viljelmä on Bacillus sp. J 20, NCIMB No. 40262. i · · • · • · ;';4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen proteaasin * · · ....walmistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä viljellään proteaa- 2f?.*jsia tuottavaa Bacillus sp. J 20-kantaa NCIMB No. 40262, sopi-• · ’..’.yassa elatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä • · · sekä epäorgaanisia suoloja, ja haluttu entsyymi kootaan talteen. • · · 30.. .5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen proteaasin käyttö ”· .pesuaine-entsyyminä. .· 6. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patent-'· 'tivaatimuksen 1 tai 2 mukaista proteaasia. 35.. .:

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi yhtä tai useampaa muuta entsyy 110434 miä, erityisesti lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja tai perok-sidaasej a.

8. Pesuainelisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää patent-5 tivaatimuksen 1 tai 2 mukaista proteaasia granulaattien, edullisesti pölyämättömien granulaattien muodossa, nesteenä, erityisesti stabiloituna nesteenä, lietteenä tai suojattuna entsyyminä.

10 Patentkrav