FI114921B - Pesuainekoostumus - Google Patents

Description

114921

Pesuainekoostumus Tämä keksintö kuuluu pesuaine-entsyymien alaan. Tarkemmin sanoen tämä keksintö koskee proteaasien käyttöä, jotka ovat peräisin Verticillum-suvun sienistä, 5 pesuainetarkoituksiin.

Sienet, jotka kuuluvat Verticillium-sukuun, ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja ja niiden tiedetään aiheuttavan tauteja hyönteisille ja kasveille. Näiden sienten tiedetään myös tuottavan proteolyyttisiä entyymejä, joita on tutkittu sienten tautien ai-heuttavuuden suhteen.

10 Nyt on yllättäen havaittu, että Verticillium-sienisuvun jäsenistä peräisin olevilla pro-teaaseilla on erinomainen pesusuorituskyky.

Näin ollen tämä keksintö kohdistuu pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät prote-aaseja, jotka ovat saatavissa, tai proteaaseja, joilla on immunokemiallisia ominaisuuksia, jotka ovat identtisiä tai osittain identtisiä sellaisen proteeasin ominaisuuk-15 sien kanssa, joka on peräisin mistä tahansa kannoista CBS nro 145.70; CBS nro 146.70; CBS nro 247.68; ja CBS nro 464.88.

Toisessa kohdassaan tämä keksintö kohdistuu pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät proteaaseja, jotka ovat saatavissa Verticillium-suvun jäsenestä tai sen mutantista tai muunnoksesta.

·_ 20 Vielä muussa kohdassaan tämä keksintö kohdistuu pesuaineen lisäaineisiin, jotka sisältävät proteaaseja, jotka ovat saatavissa, tai proteaaseja, joilla on immunoke-miallisia ominaisuuksia, jotka ovat identtisiä tai osittain identtisiä sellaisen proteaa-,,’,Γ sin ominaisuuksien kanssa, joka on peräisin mistä tahansa kannoista CBS nro :T: 145.70; CBS nro 146.70; CBS nro 247.68; ja CBS nro 464.88.

. 25 Lisäkohdassaan tämä keksintö kohdistuu pesuaineen lisäaineisiin, jotka sisältävät proteaaseja, jotka ovat saatavissa Verticillium-suvun jäsenestä tai sen mutantista ’·;* tai muunnoksesta.

!.. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

• » Tätä keksintöä kuvataan tarkemmin viitaten oheisiin piirroksiin, joissa: · « 2 114921

Kuvio 1 esittää lämpötilan (°C) ja tämän keksinnön entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden (%, suhteellinen) välistä suhdetta (pH-arvolla 9,5; pH -arvolla 9,5 ja 0,1 %:n STPP-lisäyksellä); ja

Kuvio 2 esittää pH-arvon ja tämän keksinnön entsyymin proteolyyttisen aktiivisuu-5 den (%, suhteellinen) välistä suhdetta.

Tämä keksintö kohdistuu pesuainekoostumuksiin, jotka sisältävät proteaaseja, jotka ovat saatavissa Verticillium-suvun sienilajeista. Verticillium-sukuun kuuluvat sienet ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja ja kuvattuja. Verticillium-suvun kantoja on talletettu ja tehty saataviksi eri kansainvälisistä talletuslaitoksista, esim. kantoja 10 CBS nro 247.68; CBS nro 145.70; CBS nro 146.70; tai CBS nro 464.88.

Proteaasit ovat saatavissa menetelmillä, jotka ovat tunnettuja ja joita on kuvattu kirjallisuudessa, esim. viljelemällä Verticillium-suvun proteaasia tuottavaa kantaa sopivassa ravintoväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteenotto, tai niitä voidaan valmistaa esi-15 merkiksi käyttämällä rekombinantti-DNA-teknologiaa.

Protetaasit Tämän keksinnön yhteydessä sopivia proteaaseja ovat Verticillium-suvun lajeista saatavat proteaasit tai niiden mutantit tai muunnokset tai proteaasit, joilla on immunokemialliset ominaisuudet, jotka ovat identtiset tai osittain identtiset sellai-• 20 sen proteaasin ominaisuuksien kanssa, joka on saatavissa Verticillium-suvun lajis- ta, esim. lajista V. bulbillosum.

: Entsyymimuunnoksella tai mutatoidulla entsyymillä tarkoitetaan entsyymiä, joka . on saatavissa isäntägeenin tai sen johdannaisten DNA-nukleotidisarjan muutok- ; sella. Entsyymimuunnos tai mutatoitu entsyymi voidaan ilmaista ja valmistaa, kun ’ 25 entsyymiä koodaava DNA-nukleotidisarja on sijoitettu sopivassa isäntäorganismis- sa olevaan sopivaan vektoriin. Isäntäorganismi ei ole välttämättä identtinen sen ., ; ‘ organismin kanssa, josta isäntägeeni on peräisin.

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologisesti ristikkäis- > * t 'f ' reaktioihin perustuvilla tunnistuskokeilla. Tunnistuskokeet voidaan suorittaa hyvin 30 tunnetulla Ouchterlonyn kaksoisimmunodiffuusiomenettelyllä tai peräkkäin risteä-;**: väliä immunoelektroforeesilla N.H. Axelsenin mukaan, Handbook of Immuno- precipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications (1983), luvut 5 ja 3 114921 14. Termejä "antigeeninen identtisyys" ja "osittainen antigeeninen identtisyys" kuvataan samassa kirjassa luvuissa 5, 19 ja 20.

Pesuainekoostumukset Tämän keksinnön koostumus voi sisältää yhtä tai useampia pinta-aktiivisia aineita, 5 jotka voivat olla anionista, ionitonta, kationista, amfoteerista tai kahtaisionityyppiä tai näiden seosta. Tyypillisiä esimerkkejä anionisista pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyylibentseenisulfonaatit (LAS); alkyylisulfaatit (AS); alfa-olefiinisulfo-naatit (AOS); alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnon rasvahappojen alkalimetalli-suolat. Esimerkkejä ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkyylipolyetyleeni-10 glykolieetterit; nonyylifenolipolyetyleeniglykolieetterit; sakkaroosin ja glukoosin ras-vahappoesterit; ja polyetoksiloidun alkyyliglukosidin esterit.

Tämän keksinnön pesuainekoostumus voi sisältää myös muita tekniikassa tunnettuja pesuaineen aineosia, kuten apuaineita, valkaisuaineita, valkaisuaktivaattorei-ta, korroosionestoaineita, sekvestrausaineita, lian uudelleen saostumista estäviä 15 aineita hajusteita, entsyymien ja valkaisuaineiden stabilisaattoreita, kokoonpano-apuaineita, optisia kirkasteita, vaahtotehoaineita, kelatointiaineita, täyteaineita, kankaanpehmennysaineita jne. Tämän keksinnön pesuainekoostumus voidaan kokoonpanna oleellisesti siten kuin J. Falbe on kuvannut [Falbe, J., Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1987, 20 vide, erityisesti luku otsikolla "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty j’·,. detergents"].

Esillä olevassa tapauksessa on ajateltu, että tämän keksinnön pesuainekoostu-[ mus voi sisältää entsyymivalmistetta määrän, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU-yksik- ; ’ köä proteolyyttistä entsyymiä litraa kohti pesunestettä.

25 Tämän keksinnön koostumukset voidaan seostaa mihin tahansa sopivaan muotoon, kuten pulvereiksi, nesteiksi jne.

..!i‘ Tämän keksinnön pesuainekoostumus voi sisältää edullisesti yhtä tai useampia muita entsyymejä, esim. lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja, ja/tai .·*·. peroksidaaseja, joita tavanomaisesti sisältyy pesuainekoostumuksiin, samoin kuin , · · ·, 30 muuta alkuperää olevia proteaaseja.

Tämän keksinnön proteaasi voidaan sisällyttää pesuainekoostumukseen lisäämäl-. \ : lä erillisiä lisäaineita, jotka sisältävät pesuaineproteaasia, tai lisäämällä yhdistettyä lisäainetta, joka sisältää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

4 114921 Tämän keksinnön lisäaine, ts. erillinen lisäaine tai yhdistetty lisäaine voidaan seostaa esim. rakeiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Edullisia pesuaineen lisäaine-kokoonpanoja ovat pölyämättömät rakeet, nesteet, erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut entsyymit. Pölyämättömiä rakeita voidaan valmistaa esim. GB-5 patentin 1 362 365 tai US-patentin 4 106 991 mukaisesti ja ne voidaan valinnaisesti pinnoittaa tekniikassa tunnetuin menetelmin. Pesuaine-entsyymit voidaan sekoittaa mukaan ennen rakeistusta tai sen jälkeen. Nestemäiset entsyymivalmis-teet voidaan stabiloida esimerkiksi lisäämällä polyolia, kuten esim. propyleeni-glykolia; sokeria tai sokerialkoholia; maitohappoa tai boorihappoa vakiintuneiden 10 menetelmien mukaisesti. Muita entsyymistabilisaattoreita tunnetaan hyvin tekniikassa. Suojattuja entsyymejä voidaan valmistaa EP-patenttihakemuksessa 238 216 paljastetun menetelmän mukaisesti.

Tätä keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä, joiden tarkoituksena ei ole millään lailla rajoittaa patenttivaatimuksissa esitetyn keksinnön suoja-15 piiriä.

Esimerkki 1

Valmistusesimerkki

Verticillium bulbillosum kantaa CBS 247.68 viljeltiin 25 °C:ssa pyörivällä ravistin-pöydällä (240 rpm) 500 ml:n väliseinillä varustetuissa Erlenmeyer-pulloissa, jotka 20 sisälsivät 100 ml väliainetta, jolla oli seuraava koostumus (litraa kohti): • > · •

Sakkaroosi 100 g • : Soijapapujauho 40 g j Na2HP04x12H20 10 g

PluronicR 0,1 g ' - * 25 Väliainetta steriloitiin kuumentamalla 120 °C:ssa 45 minuutin ajan.

12 vuorokauden idätyksen jälkeen viljelmän proteolyyttiseksi aktiivisuudeksi , ·, määritettiin 21 CPU/I käyttäen seuraavassa kuvattua menetelmää.

:T: Kiinteän materiaalin erotuksen jälkeen proteaasi puhdistettiin tavanomaisella kro- :' “; matografisella menetelmällä.

:: 30 Saanto 1 l:n viljelyliemestä oli 30 ml, jonka aktiivisuus oli 270 CPU/I. Puhtaus oli yli 90 % arvioituna SDS-PAGE-menetelmällä.

• · 5 114921

Kannnoista V. bulbillosum, CBS 145.70, V. bulbillosum, CBS 146.70 ja V. suchlasporium var. suchlasporium, CBS 464.88 saatiin valmisteet samalla tavoin.

Esimerkki 2

Entsyymin karakterisointi 5 Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu valmiste saatettiin seuraavaan karakterisointiin.

Moolimassaksi määritettiin 30 kD SDS-PAGE-menetelmällä. pl-arvon määritettiin olevan yli 9,3 isoelektrisellä fokusoinnilla LKB AmpholineR PAG-levyillä. Proteaasi-aktiivisuutta inhibitoivat PMSF, α-1-antitrypsiini ja kalkkunan munanvalkuaisprotei-10 naasi-inhibiittori. EDTA ja soijapapuproteiini-inhibiittori eivät vaikuta proteaasin aktiivisuuteen.

Lämpötila-aktiivisuus riippuvuus määritettiin käyttäen kaseiinia alusta-aineena. Edellä kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden määritystä käytettiin sillä muutoksella, että idätyslämpötilaa vaihdettiin ko. väliajalla välillä 15-70 °C. Tulos esite-15 tään kuviossa 1. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta alle 15°C:n lämpötiloista yli 70 °C:n lämpötiloihin ja lämpötilaoptimi on välillä 45-65 °C, noin 55 °C:ssa.

Aktiivisuuden riippuvuus pH-arvosta määritettiin samalla menettelyllä käyttäen en- i ,, naita määrättyihin pH-arvoihin 6-11 säädettyjä puskureita. Tulokset esitetään 20 kuviosa 2. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta pH-arvoilla alle 6 - yli 11 opti- .. ,: mi-pH-alueen ollessa välillä pH 8 - pH 11.

» : Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys >»

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään käyttäen kaseiinia alusta-aineena. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö (CPU) määritellään entsyymimääräksi, joka vapauttaa 1 25 mM primäärisiä aminoryhmiä (määritetty vertaamalla seriinistandardiin) minuutissa standardiolosuhteissa, ts. idättäen 30 minuuttia 25 °C:ssa ja pH-arvolla 9,5. Esite t » ’;·1 AF 228, jossa kuvataan analyyttistä menetelmää, on saatavissa pyydettäessä yhtiöltä Novo Nordisk A/S, Tanska, joka esite liitetään viitteenä tähän esitykseen.

* 1 > 1 » · » • · 6 114921

Esimerkki 3 Pesusuorituskyky

Suoritettiin kaksi sarjaa pesusuorituskykykokeita ruohonesteen likaamalla puuvillalla 20 °C:ssa isotermisesti 10 minuutin ajan.

5 Ensimmäisessä sarjassa käytettiin 2,0 g/l kaupallista, amerikkalaistyyppistä pulve-ripesuainetta. Pesuaine liuotettiin kovuudeltaan suunnilleen 6° dH (German Hardness) olevaan veteen. pH oli 9,5. Näiden kokeiden tulosket esitetään taulukossa 1.

Toisessa sarjassa käytettiin 2,0 g/l kaupallista, amerikkalaistyyppistä pulveripesu-10 ainetta, jossa oli valkaisuainetta ja aktivaationa. Pesuaine liuotettiin kovuudeltaan suunnilleen 6° dH (German Hardness) olevaan veteen. pH oli 9,5. Näiden kokeiden tulokset esitetään taulukossa 2.

Kummassakin sarjassa tekstiili/pesunestesuhde oli 6 g tekstiiliä litraa kohti pesunestettä.

15 Pesun jälkeen kankaat huuhdeltiin juoksevan vesijohtoveden alla ja kuivattiin ilmassa. Remissio (% R) määritettiin aallonpituudella 460 nm.

Pesusuorituskyvyn mittana käytettiin remissioeroa, delta R, joka on yhtä kuin remissio pesun jälkeen entsyymilisäyksellä miinus remissio pesun jälkeen ilman ; ‘ entsyymilisäystä.

20 Taulukko 1

Eemissioero, delta R mitattuna kaupallisella, amerikkalaistyyppisellä pulveripesu-; aineella suoritetun pesun jälkeen

Laji nro Entsyymiannos (CPU/I) f (CBS) 0,01 0,05 0,1 0,5 25 145.70 11 17,8 18,9 19,3 247.68 7,6 16 19 19,7 ;···; 464.88 8,1 15,2 19,3 19,9 » « > » > 1 · lii • I ·

I I

7 114921

Taulukko 2

Remissioero, delta R mitattuna pesun jälkeen, joka suoritettiin kaupallisella, amerikkalaistyyppisellä pulveripesuaineella, jossa oli valkaisuainetta ja aktivaationa

Laji nro Entsyymiannos (CPU/I) 5 (CBS) 0,01 0,05 0,1 0,5 145.70 8,4 13,5 13,6 13,8 247.68 8,4 12,8 14,1 14,1 464.88 7,3 13,0 14,4 14,7

Kuten remissioeroarvot osoittavat keksinnön proteaasit soveltuvat hyvin käytettä-10 väksi pesuaine-entsyymeinä.

♦ » j > 1 1 1 I » *

* I

t 1 i i 1 i > • » I t · · » ·

Claims (10)

114921

1. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää yhtä tai useampia prote-aaseja, jonka proteaasin pH-optimi on alueella 8-11 ja lämpötilaoptimi alueella 45-65 °C, ja että proteaasit saadaan Verticillium-suvun jäsenestä tai sen mutantista 5 tai muunnoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että proteaasit saadaan mistä tahansa Verticillium-suvun kannasta CBS nro 145.70, CBS nro 146.70, CBS nro 247.68 ja CBS nro 464.88, tai niiden mutantista tai muunnoksesta.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi yhtä tai useampia muita entsyymejä, erityisesti amylaaseja, lipaaseja, sellulaseja, oksidaaseja ja/tai peroksidaaseja.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 -3 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että proteaasin lämpötilaoptimi noin 55 °C.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen pesuainekoostumus, tun nettu siitä, että proteaasin molekyylipaino on 30 kDa.

6. Pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää yhtä tai useampia prote-aaseja, jonka proteaasin pH-optimi on alueella 8-11 ja lämpötilaoptimi alueella 45- :·. 65 °C, ja että proteaasit saadaan Verticillium-suvun jäsenestä tai sen mutantista 20 tai muunnoksesta. t IMI

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, että proteaasit saadaan mistä tahansa Verticillium-suvun kannasta CBS nro 145.70, *! CBS nro 146.70, CBS nro 247.68 ja CBS nro 464.88, tai niiden mutantista tai muunnoksesta.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen pesuaineen lisäaine, tunnettu siitä, • - -: että proteaasin lämpötilaoptimi noin 55 °C. » ·

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 6-8 mukainen pesuaineen lisäaine, tun- ‘‘ nettu siitä, että proteaasin molekyylipaino on 30 kDa.

» · ,. · ·, 10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 6-9 mukainen pesuaineen lisäaine, tun- * · 30 nettu siitä, että se on aikaansaatu rakeen, erityisesti pölyämättömän rakeen, nes-teen, erityisesti stabiloidun nesteen, lietteen tai suojatun entsyymin muotoon. 114921