JP3126732B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents

新規プロテアーゼ

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JP3126732B2
JP3126732B2 JP03516379A JP51637991A JP3126732B2 JP 3126732 B2 JP3126732 B2 JP 3126732B2 JP 03516379 A JP03516379 A JP 03516379A JP 51637991 A JP51637991 A JP 51637991A JP 3126732 B2 JP3126732 B2 JP 3126732B2
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
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  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は好アルカリ性バチルス（Bacillus）種の株に
由来する洗浄プロテアーゼの分野に属する。より詳しく
は、本発明はバチルス種J20の株に由来する新規のアル
カリ性プロテアーゼに関する。更に、本発明はこのプロ
テアーゼの調製のための方法、洗浄酵素としてのこのプ
ロテアーゼの利用、並びに本発明のプロテアーゼを含ん
で成る洗浄組成物及び洗浄添加剤に関する。
背景技術 洗浄酵素は20年以上も前から市販され、そして現在世
界中で粉末及び液状洗剤の両方における正常洗浄成分と
してよく確立されている。低温度洗濯の流行に伴い、洗
浄酵素の消費はこの数年間で上昇している。洗剤におい
て用いられている酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、ア
ミラーゼ、セルラーゼ及びその他の酵素、又はそれらの
混合物を含んで成る。商業的に最も重要なのはプロテア
ーゼである。
洗浄プロテアーゼは天然において発見されたプロテア
ーゼの単離、それに続く洗剤における試験により開発さ
れている。ほとんどの洗浄プロテアーゼバチルス属の構
成員から得られる。現在、種々の特定された条件で優れ
た価格／性能の比を提供する可能性を授ける新しいタイ
プのプロテアーゼが市場に参入している。
商業的プロテアーゼ製品の例はALCALASE（商標）、ES
PERASE（商標）及びSAVINASE（商標）であり、これら全
てノボ ノルディスクA/Sデンマーク国より供給されて
いる。これら、及びその他の商業起源に由来する類似の
酵素製品は洗浄溶液中で、即ち、封鎖鎖、界面活性剤及
び漂白剤、例えばホウ酸ナトリウムの存在下において８
〜11の範囲におけるpH値にて活性である。ALCALASEプロ
テアーゼはバチルス リシェニホルミス（Bacillus Iic
heniformis）種の株により生産される。ESPERASE及びSA
VINASEプロテアーゼはアルカリ性バチルス属の株の培養
により得られる。
発明の概要 本発明により、優れた洗浄能力を有する新規な洗浄プ
ロテアーゼが提供される。
第１の観点において、本発明は見かけ上の分子量29K
D;pI約8.8;pH10〜12（25℃で）の範囲におけるpH最適
性;45〜65℃（pH9.5）の範囲における温度最適性を有す
るプロテアーゼを提供する。
他の観点において、本発明は見かけ上の分子量29KD;p
I約8.8;pH10〜12（25℃）の範囲におけるpH最適性;45〜
65℃（pH9.5）の範囲における温度最適性；及びバチル
ス種J20,NCIMB No.40262に由来するプロテアーゼと同一
又は部分的に同一の免疫化学的性質を有するプロテアー
ゼを提供する。より特別な観点において、このプロテア
ーゼはバチルス種J20の株より得られうる。更により特
別な観点において、そのプロテアーゼはバチルス種J20,
NCIMB No.40262、又はその突然変異体もしくは変異体よ
り得られうる。
第３の観点において、本発明はバチルス種J20の株の
生物学的に純粋な単離培養物を提供する。より特別な観
点において、バチルス種J20の株、NCIMB No.40262、又
はその突然変異体もしくは変異体を提供する。
第４の観点において、本発明はプロテアーゼの調製の
ための方法を提供し、ここでこの方法は、炭素及び窒素
源並びに無機塩類を含む適切な栄養培地の中でのバチル
ス種J20のプロテアーゼ生産株の培養、それに続く所望
の酵素の回収を含んで成る。より特別な観点において、
バチルス種J20、NCIMB No.40262又はその突然変異体も
しくは変異体を培養する。
第５の観点において、洗浄酵素としての酵素の利用を
請求する。より特別な観点において、本発明はこのプロ
テアーゼを含んで成る洗浄組成物を提供する。他の特別
の観点において、本発明はこのプロテアーゼを含んで成
る洗浄添加剤を提供する。
図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら更に説明するが、こ
こで： 図１はSTPPの存在下及び非存在下（J20;J20＋0.1％の
STPP）における本発明に関する酵素の温度とタンパク質
分析活性（基質としてカゼインを伴い、pH9.5にて）と
の関係（％比活性）を示し；そして 図２は本発明に関する酵素のpHとタンパク質分解活性
（基質としてカゼインを伴い、25℃にて）との関係（％
比活性）を示す。
発明の詳細な開示 微生物 本発明の酵素を生産できる本発明の新規な微生物は、
英国特許第1,243,784号に詳細の好アルカリ性バチルス
の選別に関する方法によって本質的に単離した。かかる
培養物の一つ、バチルス種J20をブタペスト条約に従い1
990年２月27日にNCIMB L＋ｄ（23 St.マーチャー ドラ
イブ，アバーディーンAB21RY,スコットランド，英国）
に受託番号NCIMB 40262で寄託してある。
本発明の微生物は好気的であり、バチルス属に属する
胞子形成細菌である。形態学的にはこれらは0.6〜0.8ミ
クロンの径及び２〜３ミクロンの長さを有する運動性桿
菌として説明することができる。その胞子は円形から楕
円形に到り、胞子嚢は中心から末端付近まで膨らんでい
ない。増殖のための最適温度は35〜40℃内であり、そし
て増殖のための最適pHは8.5〜10内であり、pH8以下では
増殖しない。この微生物は栄養アガープレート上で黄色
いコロニーを形成し、そしてアガーへの色素の拡散は観
察されない。
本発明の微生物は表１に記載する試験結果により更に
特徴付けできる。
微生物の培養 本発明の微生物は、同化性炭素及び窒素をその他の必
須栄養素と共に含む栄養培地の中で好気的条件のもとで
培養されることができ、この培地は既知の技術の原理に
従って構成されている。
適切な炭素源は炭水化物、例えばスクロース、グルコ
ース及びデンプンであるか、又は穀物種子；麦芽；米及
びモロコシ類を含む炭水化物である。この培地に含ませ
る炭水化物の濃度は、例えば高くて25％までそして低く
て１〜５％にわたって大きく変えてよく、しかしながら
８〜10％が適切であろう。％はグルコース当量として計
算した。
栄養培地中の窒素源は無機及び／又は有機物質であり
うる。適切な無機窒素源は硝酸塩及びアンモニウム塩で
ある。有機窒素源の中でかなりの数ものが細菌の培養を
包括する培養工程において一般的に利用されている。そ
の例はダイズ粉；綿実粉；ピーナッツ粉；カゼイン；コ
ーン；コーン浸け液；酵母抽出物；尿素及びアルブミン
である。更に、この栄養培地は通常の微量元素も含むべ
きである。
本発明の新規なるバチルスの種は好アルカリ性であ
り、そしてpH8以下では増殖できないため、その培養は
好ましくはアルカリ性のpH値で実施し、このpHの増殖培
地の滅菌後の炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムと炭酸
水素ナトリウムとの混合物のような適切な緩衝液の添加
によって得ることができる。タンク型発酵槽の中での培
養のためには人工通気を利用する必要がある。通気の割
合は常用のタンク発酵に用いるのと類似である。
発酵後、液状酵素濃縮物は、この培養液からの粗粒材
料の除去により、又は所望するならば、低温度でのエバ
ポレーションによりもしくは逆浸透によるこの培養液の
濃縮によって提供されうる。最後に、この濃縮物に防腐
剤を加えることがある。
固形酵素調製物はNa2SO4のような塩又はエタノールも
しくはアセトンのような水混和性溶媒による沈殿により
精製及び／又は濃縮培養液から調製できる。培養液中の
水の除去は適当な乾燥方法によることができ、例えばス
プレー乾燥も利用できる。
このようにて得られる該プロテアーゼ調製物のタンパ
ク質分解活性は通常１〜50CPU/gの範囲にある。
タンパク質分解活性についてのアッセイ タンパク質分解活性は基質としてのカゼインにより決
定する。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準
条件、即ち、25℃及びpH9.5での30分間のインキュベー
ションのもとで１分間当り1mMの第一アミノ基を遊離さ
せる酵素の量（セリン標準品との比較により設定）とし
て定義される。この分析方法を詳細しているホルダーAF
228は、ノボ ノルディスクA/S、デンマーク国への請求
により入手でき、このホルダーは本明細書に参考として
組入れている。
酵素 本発明の酵素は新規なる洗浄プロテアーゼである。こ
れはアルカリ性プロテアーゼであり、炭素及び窒素源並
びに無機塩を含む適切な栄養培地の中での本発明の微生
物、好ましくはバチルス種JP20,NCIMB No.40262又はそ
の突然変異体もしくは変異体の培養によって得られる。
この酵素は組換えDNA工学によって得られうる。
本発明のプロテアーゼは以下の特性によって詳細でき
る。
物理−化学的性質 SDS−PAGEにより、分子量29KDと決定された。LKB Amp
holine（商標）PAGプレートでの等電点電気泳動によりp
Iは8.8と決定された。プロテアーゼ活性はPMSF、α−１
−抗トリプシン及び七面鳥卵白プロテアーゼインヒビタ
ーにより阻害される。EDTA及びダイズタンパク質インヒ
ビターはプロテアーゼ活性に影響を及ぼさない。このプ
ロテアーゼはインスリンを、その疎水性アミノ酸のＣ−
末端側で切断する。特に、ヒトインスリンは以下のアミ
ノ酸の間、即ち、Ａ−鎖のLeu13−Tyr14において；並び
にＢ−鎖のLeu11−Val12,Leu15−Tyr16及びCys19−Gly
20（Cysはジスルフィドとして）において切断される。
温度−活性の関係は基質としてのカゼインにより決定
される。前記したタンパク質分解活性についてのアッセ
イを、15〜60℃の間隔を開けてインキュベーション温度
を変える変更を伴って利用した。酵素反応は0.1％のト
リポリリン酸ナトリウム（STPP）の存在下及び非存在下
において実施した。その結果を表１に示す。この酵素は
低くて15℃から高くて70℃までの温度にてタンパク質分
解活性を保有し、そして最適温度（STPPの非存在下）は
45〜65℃の範囲；より好ましくは55〜65℃；約60℃であ
る。
活性のpH依存性を同一の手順により、７〜11のpH範囲
における予め決めたpH値に緩衝液を調整して決定した。
その結果を図２に示す。この酵素は低くて６から高くて
11までのpH値にてタンパク質分解活性を保持し、最適pH
はpH10〜pH12の範囲；約pH11にある。
本発明のプロテアーゼは40℃で60分間、並びにヨーロ
ッパ及び米国タイプの洗浄剤における過硼酸塩及びNOBS
のような漂白剤を伴う又は伴わない両方の洗浄条件のも
とで安定である。
免疫化学的性質 免疫化学的性質は交差反応同定試験によって免疫学的
に決定できる。この同定試験はよく知られたアウターロ
ーニー二重免疫拡散手順により、又はN,H,Axelsen;Hand
book of lmmunoprecipitation−in−Gel Techniques;B
lackwell Scientific Publications（1983）第５及び1
4章に従うタンデム交差免疫電気泳動によって実施でき
る。「抗原性同一」及び「部分的抗原性同一」なる語が
この本の第5,19及び20章に説明されている。
モノ特異性抗血清は、ウサギを本発明の精製プロテア
ーゼにより免疫することで上記の方法に従って作った。
免疫原をフロインドのアジュバンドと混ぜ、そして２週
ごとにウサギに皮下注射した。全体で８週間にわたる免
疫期間の後に抗血清が得られ、そしてイムノグロブリン
をこれよりN.H.Axelsen（前述）に記載の通りに調製し
た。
アウターローニー二重免疫拡散試験は、本発明のプロ
テアーゼと、既知のアルカリ性セリンプロテアーゼ、AL
CALASE（商標）、SAVINASE（商標）、ESPERASE（商
標）、ズブチリシンBPN′及びプロテアーゼAPI−21との
交差反応を示さなかった。
洗浄組成物 本発明の洗浄組成物は陰イオン性、非イオン性、陽イ
オン性、両性もしくは両電解性型、又はその混合であり
うる１又は複数の界面活性剤を含んで成りうる。陰イオ
ン界面活性剤の典型例は線状アルキルベンゼンスルホネ
ート（LAS）；アルキルスルフェート（AS）；アルファ
ーオレフィンスルホネート（AOS）；アルコールエトキ
シスルフェート（AES）及び天然脂肪酸のアルカリ金属
塩である。非イオン界面活性剤の例はアルキルポリエチ
レングリコールエーテル；ノニルフェノールポリエチレ
ングリコールエーテル；スクロース及びグルコースの脂
肪酸エステル；並びにポリエトキシル過アルキルグルコ
シドのエステルである。
本発明の洗浄組成物は当境界において既知のその他の
洗浄成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性剤、耐蝕
剤、封鎖剤、土壌再付着防止剤、香料、酵素及び漂白剤
のための安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進
剤、キレート剤、充填剤、布帛ソフトナー等を含むこと
もある。本発明の洗浄剤は実質的にJ.Falbe〔Falbe,J.;
Surfactants in Consumer Products.Theory,Technology
and Application;Springer Verlag 1987,特に表題「Fr
ame formulations for liquid/powder heavy−duty det
ergents」の章〕に詳細されている通りに製剤化されう
る。
本発明の洗浄組成物は洗浄液１リッター当り0.0005−
0.5CPUのタンパク質分解酵素に相当する量における本酵
素調製物を含みうることが現状考えられる。
本発明の洗浄組成物は任意の常用の形態、例えば粉
末、液状等において製剤化されうる。
本発明の洗浄組成物は好都合に、１又は複数のその他
の酵素、例えば洗浄組成物に通常含まれているリパー
ゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；及び／又はペルオキシダ
ーゼ、並びに他の起源のプロテアーゼを含みうる。
本発明のプロテアーゼは、該洗浄プロテアーゼを含む
別々の添加剤を加えることにより、又は異なる洗浄酵素
を含んで成る組合せ添加剤を加えることにより、洗浄組
成物の中に含ませることができる。
本発明の添加剤、即ち、独立添加剤又は組合せ添加剤
は、例えば顆粒、液状、スラリー等として製剤化されう
る。好ましい洗浄添加製剤は無粉塵性顆粒、液状、特に
安定液体、スラリー又は保護化酵素である。無粉塵顆粒
は例えば英国特許第1,362,365号又は米国特許第4,106,9
91号に従って製造でき、そして当業界に周知の方法によ
って任意的に被覆されうる。この洗浄酵素は粒状化の前
後で混合されうる。液状酵素調製物は例えばポリエチレ
ングリコールのようなポリオール；糖又は糖アルコー
ル；乳酸又は硼酸を確立されている方法に従って加える
ことにより安定化されうる。その他の酵素安定剤は当業
界によく知られている。保護化酵素はヨーロッパ特許出
願第238,216号に開示された方法に従って調製できる。
以下の実施例は本発明を更に説明する。
実施例１ バチルス種J20を、以下の組成の培地（リットル当
り）100mlを含む500mlのバッフル付きエーレンマイヤー
フラスコの中で、ロータリーシェーキングテーブル上で
（300r.p.m.）25℃で培養した。
ポテトデンプン 100g 粉砕した大麦 50g ダイズ小麦粉 20g Na2HPO4×12H4O 9g Pluronic（商標） 0.1g カゼイン酸ナトリウム 10g 培地の中のデンプンをα−アミラーゼにより液化し、
そしてこの培地を120℃で45分間加熱することによって
滅菌した。
滅菌後、この培地のpHを0.1Mのセスキ炭酸ナトリウム
の溶液10mlの添加により9.7に調整した。
５日間のインキュベーションの後、この培養物のタン
パク質分解活性を前記した方法を用いて決定した。
培養後のこの培養液の酵素活性は120CPU/であっ
た。
実施例２ 純粋な酵素調製物を以下の通りに調製した：実施例１
の通りに調製した発酵培養培地を遠心して固形物質を除
去した。この遠心物に1/2容量のアセトンを加え、次い
でこの沈渣を遠心して除去し、そして廃棄した。この遠
心物に更に全体で２容量のアセトンを加えた。この沈渣
を遠心により除去し、そして以下の緩衝液に溶かした:
0.1Mの硼酸:0.01Mのジメチルグルタル酸:0.002Mの塩化
カルシウム;pH7.0に調整。
この溶液から該酵素をアフィニティークロマトグラフ
ィーにより単離した。タンパク質分解活性を有する画分
をプールし、濃縮し、そしてUF−セルの中で緩衝液で洗
い、そして凍結乾燥した。
１の培養培地からの収量は1.2gであり、25.6CPU/g
を有していた。SDS−PAGEによる判定に従い、純度は90
％以上であった。
本実施例に従って調製した酵素調製物の特徴は本明細
書のはじめに言及していたので、それを参照していただ
きたい。
実施例３ 洗浄性能 試験は0.001;0.01及び0.10CPU/の酵素濃度の、実施
例１−２に従って得た該酵素調製物で実施した。
洗浄性能試験は、綿の上に混合汚れ（オリーブ油；ゼ
ラチン；インドインク；カオリン）を40℃の等温で15分
間つけることによって行った。
1.5g/の商業用米国タイプ液状洗剤を利用した。こ
の洗剤を約６゜dH（ドイツ硬度〔German Hardness〕）
の水に溶かし、測定されたpHは7.83であった。繊維／洗
浄液の比は、10gの繊維／洗浄液１リットルとした。洗
濯が終えたとき、pHは7.7に変化していた。
洗濯の後に、この布を流水道水ですすぎ、そして風乾
した。460nmでの規約反射率（％Ｒ）を測定した。
洗浄性能の測定値として、規約反射率差ΔＲを利用し
た。これは酵素を加えて洗濯した後の規約反射率から、
酵素を加えないで洗濯した後の規約反射率を差し引いた
ものに相当する。
この結果を表３に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アースリュンク，ドリト アニタ デンマーク国，デーコー−4000 ロスキ ルゼ，スボゲルスレウ，フュレン ８ (56)参考文献 特開 平１−101884（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の特性： （ａ）29KDの見かけ上の分子量； （ｂ）約8.8のpI; （ｃ）25℃においてpH10〜12の範囲における至適pH; （ｄ）pH9.5において45〜65℃の範囲における至適温
    度；及び （ｅ）バチルス種J20、NCIMB No.40262に由来するプロ
    テアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的に同一な免
    疫化学的性質、を有することを特徴とするプロテアー
    ゼ。
  2. 【請求項２】前記プロテアーゼがバチルス種J20の株よ
    り得ることができる、請求項１に記載のプロテアーゼ。
  3. 【請求項３】バチルス種J20,NCIMB No.40262又はその突
    然変異体もしくは変異体より得ることができる、請求項
    ２に記載のプロテアーゼ。
  4. 【請求項４】バチルス種J20の株の培養物。
  5. 【請求項５】前記の株が、バチルス種J20,NCIMB No.402
    62又はその突然変異体もしくは変異体である、請求項４
    に記載の培養物。
  6. 【請求項６】請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロ
    テアーゼの調製方法であって、炭素及び窒素源並びに無
    機塩を含む適切な栄養培地の中でのバチルス種J20のプ
    ロテアーゼ生産株の培養、それに続く所望の酵素の回収
    を含んで成る方法。
  7. 【請求項７】バチルス種J20,NCIMB No.40262又はその突
    然変異体もしくは変異体を培養する、請求項６に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロ
    テアーゼを含んで成る洗浄組成物。
  9. 【請求項９】１又は複数のその他の酵素を更に含んで成
    る、請求項８に記載の洗浄組成物。
  10. 【請求項１０】前記その他の酵素がリパーゼ、アミラー
    ゼ、セルラーゼ又はペルオキシダーゼである、請求項９
    に記載の洗浄組成物。
  11. 【請求項１１】顆粒、液体、スラリー、又は保護化酵素
    の形態の施された、請求項１〜３のいずれか１項に記載
    のプロテアーゼを含んで成る洗浄添加剤。
  12. 【請求項１２】前記顆粒が無粉塵性顆粒である、請求項
    11記載の洗浄添加剤。
  13. 【請求項１３】前記液体が安定化液体である、請求項11
    記載の洗浄添加剤。
JP03516379A 1990-10-12 1991-10-11 新規プロテアーゼ Expired - Lifetime JP3126732B2 (ja)

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DK2462/90 1990-10-12
DK246290A DK246290D0 (da) 1990-10-12 1990-10-12 Nyt enzym
PCT/DK1991/000309 WO1992007067A1 (en) 1990-10-12 1991-10-11 Novel proteases

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JPH06503717A JPH06503717A (ja) 1994-04-28
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ID=8112543

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JP03516379A Expired - Lifetime JP3126732B2 (ja) 1990-10-12 1991-10-11 新規プロテアーゼ

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