JP3042715B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents

新規プロテアーゼ

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JP3042715B2
JP3042715B2 JP4507968A JP50796892A JP3042715B2 JP 3042715 B2 JP3042715 B2 JP 3042715B2 JP 4507968 A JP4507968 A JP 4507968A JP 50796892 A JP50796892 A JP 50796892A JP 3042715 B2 JP3042715 B2 JP 3042715B2
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bacillus
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リンデガールト，ポウル
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Novo Nordisk AS
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Novo Nordisk AS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、好バシラスSP.株由来の洗剤プロテアーゼ
の分野に存する。更に詳しくは、本発明は、バシラスS
P.TY145株由来の新規アルカリプロテアーゼに関する。
更に詳しくは、本発明はプロテアーゼの製造方法、洗剤
用酵素としてのプロテアーゼの使用、および本発明のプ
ロテアーゼを含んでなる洗剤組成物に関する。
背景技術 洗剤用酵素は、20年以上も市場で取引されてきており
そして今や世界中で粉末および液体の洗剤中の正規な洗
剤成分として十分確立されている。
低温での洗たくに対する傾向と共に、洗剤用酵素の消
費は近年において増加してきている。洗浄用製剤に於て
用いられる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ、セルラーゼ並びに他の酵素、又はそれらの混合物を
含んでなる。商業的に最も重要なものはプロテアーゼで
ある。
洗剤用プロテアーゼは、天然に見出されるプロテアー
ゼを単離し、引き続き洗剤用製剤中で試験することによ
り開発されてきた。大抵の洗剤用プロテアーゼは、バシ
ラス属の構成員から得られる。近年、新しいタイプのプ
ロテアーゼが市場に表われ、種々の特定条件の下でより
良い原価／性能割合を与える可能性を提供している。
商業上のプロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（AL
CALASE）（登録商標）、エスペラーゼ（ESPERASE）（登
録商標）およびサビナーゼ（SAVINASE）（登録商標）で
あり、全てノボノルディスク社、デンマークより提供さ
れている。これらの及び他当の商業的起源からの類似の
酵素製品は、洗剤溶液中、８〜11のpH値でかつ金属イオ
ン封鎖剤、界面活性剤およびホウ酸ナトリウムの如き漂
白剤の存在下で活性である。アルカラーゼ（ALCALASE）
（登録商標）は、種バシラスリケニホルミスの株によっ
て生産される。エスペラーゼ（ESPERASE）（登録商標）
およびサビナーゼ（SAVINASE）（登録商標）は、好アル
カリ性バシリ（Bacilli）を培養することによって得ら
れる。
発明の要約 本発明によれば、新規洗剤用プロテアーゼが提供され
る。
第一の面に於て、本発明は38KDの見掛分子量、約8.8
のpI,pH9〜11の範囲内に最適pH（25℃で）、45〜55℃の
範囲内に最適温度（pH9.5）でおよびバシラスSP.TY145,
NCIMB No.40339由来のプロテアーゼの免疫化学的性質と
同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテア
ーゼを提供する。より特異的な面において、プロテアー
ゼは、バシラスSP.TY145の株から得ることができる。更
に、より特異的面に於て、プロテアーゼはバシラスSP.T
Y145,NCIMB No.40339、又はこれらの突然変異体もしく
は変異体から得ることができる。
他の面に於て、本発明はバシラスSP.TY145の株の単離
された生物学的に純粋な培養物を提供する。より特異的
な面に於て、バシラスSP.TY145,NCIMB No.40339又はこ
れらの突然変異体もしくは変異体の株が提供される。
第三の面に於て、本発明はプロテアーゼの製造方法を
提供するものであり、この方法は炭素および窒素源並び
に無機塩を含有する適当な栄養培値中でバシラスSP.TY1
45のプロテアーゼ生産株を培養し、引き続き目的の酵素
を回収することを含んでなる。より特異的な面に於て、
バシラスSP.TY145,NCIMB No.40339、又はそれらの突然
変異体もしくは変異体を培養する。
第四の面に於て、洗剤用酵素としての酵素の使用が権
利要求される。より特異的な面に於て、本発明は洗剤組
成物およびプロテアーゼを含んでなる洗剤用添加剤が提
供される。
図面の簡単な説明 本発明は、添付の図面を参照することにより更に説明
される：図中、第１図は本発明に係る酵素の蛋白質分解
活性と温度との関係を示す（実施例１に従って得られる
酵素調製品、基質としてカゼインに関しそしてpH9.5
で）；そして第２図は、本発明に係る酵素の蛋白質分解
活性とpHの関係を示す（実施例１に従って得られる酵素
調製品、基順としてカゼインに関しそして25℃で）。
発明の詳細な開示 微生物 本発明の酵素を生産し得る、本発明の新規微生物は、
南極地方の土境サンプルから単離された。パシラスSP.T
Y145はブダペスト条約に従ってNo.40339をもってNCIMB
に寄託された。
本発明の微生物は、バシラス属に属する好気性の胞子
形成細菌である。形態学的には、該微生物は直径0.7〜
0.9ミクロンおよび２〜３ミクロンの長さを有する自動
性棒状体として記載できる。胞子は球形ないし楕円体で
あり、胞子のうを膨潤せず、サブターミナル（subtermi
nal）に中心がある。増殖のための最適温度は30〜37℃
内であり、そして増殖のための最適pHは７〜９内にあ
り、pH9.7では増殖せず、そして50℃で増殖しない。微
生物は栄養源寒天斜面上で乾燥した、毛のように生長し
た白色のコロニーを形成し、そして色素の寒天内への拡
散は観察されない。
微生物の培養 本発明の微生物は、他の必須の栄養源と共に同化性の
炭素および窒素を含有する栄養源培地中、好気的条件の
もとで培養することができ、培地は公知技術の原則に従
って構成される。
適当な炭素源は、スクロース、グルコースおよびデン
プンの如き炭水化物、又は穀物、麦芽、米およびモロコ
シの如き物質を含有する炭水化物である。培地中に導入
される炭水化物の濃度は、広く変化することができ、例
えば25％までそして１〜５％までであるが、通常８〜10
％が適当であり、パーセントはグルコースの当量として
計算される。
栄養源培地中の窒素源は、無機性および／又は有機性
のものであってよい。適当な無機源はニトラートおよび
アンモニウム塩である。有機窒素源の内で、全く多くの
ものが、細菌の培養を含む発酵プロセスに於て正規に用
いられる。それらの例は、大豆ミル、綿実ミル、ピーナ
ッツミル、カゼイン、とうもろこし、コーンスチープリ
カー、酵母抽出物、尿素およびアルブミンである。加え
て、栄養源培地は又通常の微量物質を含有すべきであ
る。
本発明の新規バシラス種は、わずかに好アルカリ性で
ある。従って、培養はわずかにアルカリpH値で好ましく
行われ、これは増殖培地の殺菌後、炭酸水素ナトリウ
ム、pH9.0、の如き適当な緩衝剤の添加によって得るこ
とができる。タンク発酵器内での培養に対し、人口の通
気を用いることが必要である。通気の速度は、通常のタ
ンク発酵内で用いられる速度に類似している。
発酵後、液体の酵素濃縮物がプロセスから粗い物質を
除去することにより生産され、又は所望ならば低温度で
蒸発により又は逆浸透によりブロスの濃縮によって生産
される。
固体酵素調製品は、精製されおよび／又はNa2SO4の如
き塩、又はエタノールもしくはアセトンの如き水混和性
溶剤を用いて沈殿せしめた濃縮ブロスから製造でき、噴
霧乾燥の如き適当な乾燥方法によってブロス中の水の除
去も用いることができる。
蛋白質分解活性の分析 蛋白質分解活性は、基質としてカゼインについて測定
される。１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準
条件下、すなわち25℃でかつpH9.5で30分間インキュベ
ーションして毎分1mMの第一級アミノ基（セリン標準と
比較することによって測定）を放出する酵素の量として
比較される。分析法を記載する、折りたたんだ印刷物AF
228/1は、要求によりノボノルディスク社、デンマーク
国から入手可能であり、この印刷物は参考のため本明細
書に導入される。
酵素 本発明の酵素は、新規洗剤用プロテアーゼである。こ
の酵素は、アルカリ性プロテアーゼであり、本発明の微
生物、好ましくはバシラスSP.TY145,NCIMB No.40339、
又はその突然変異体もくは変異体を、炭素および窒素源
および無機塩を含有する適当な栄養源培地中で培養する
ことによって得ることができる。酵素は又組換え体DNA
技術によっても得ることができる。
本発明のプロテアーゼは次の特徴を有する。
物理化学的性質 SDS−PAGEにより測定して分子量38KD.LKBアムホリン
（Ampholine）（登録商標）PAGプレートに関する等電点
電気泳動により測定した8.8のpI.。
プロテアーゼ活性は、PMSF,α−１−アンチトリプシ
ンおよびターキー−卵白プロテアーゼ阻害剤によって阻
害される。EDTAおよび大豆−蛋白質阻害剤は、プロテア
ーゼ活性に影響しない。
温度活性の関係が基質としてカゼインを用いて測定さ
れた。前に記載した蛋白質分解活性に対する分析が用い
られたが、次の変更がなされた。すなち、インキュベー
ション温度は15℃から70℃の間隔内で変化した。結果を
第１図に示す。酵素は、15℃未満の温度から70℃超まで
で蛋白質分解活性および45〜55℃の範囲内、50℃付近に
最適温度を有する。
活性のpHに関する依存性を、pH6〜11内の予じめ定め
られたpH値に調節された緩衝剤を用い、同じ手順によっ
て測定された。結果を第２図に示す。酵素は６未満から
11超のpH値で蛋白質分解活性を有し、最適pHをpH8〜pH1
1の範囲内、pH10付近に有する。
本発明のプロテアーゼは、ヨーロッパおよびアトリカ
のタイプの洗剤中、洗たく条件下、40℃で60分間安定で
ある。
免疫化学的性質 免疫化学的性質を交差反応同一性試験によって免疫学
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニ−
二重免疫拡散法又はアレクセン、N.H.（Handbook of Im
munoprecipitation−in−Gel Techniques;ブラックウェ
ル サイエンティフィック パブリケーション（198
3）、５章および14章）に従った双頭交差免疫電気泳動
によって行うことができる。語句「抗原の同一性」およ
び「部分的抗原の同一性」は同書中、５章、19章および
20章に記載されている。
単一特異性抗血清を、本発明の精製プロテアーゼで兎
を免疫することにより前記方法に従って発生させた。免
疫源をフロイントアジュバントと混合し、次いで２週間
毎に兎に皮下注入した。８週の全免疫期間後に抗血清を
得、そして免疫グリブリンを前記のN.H.アレクセンによ
って記載される如くそれから調製した。
オクテルロニ−二重免疫拡散試験は、本発明のプロテ
アーゼと公知のアルカリセリンプロテアーゼ、アルカラ
ーゼ（ALCALASE）（登録商標）、サビナーゼ（SAVINAS
E）（登録商標）、エスペラーゼ（ESPERASE）（登録商
標）、ズブチリシンBPN′およびカズサーゼ（KAZUSAS
E）（登録商標）の間には交差反応を示さなかった。
洗剤組成物 本発明の洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面活性
剤を含むことができ、この界面活性剤は、アニオン、非
イオン、カチオン、両性又は双性イオンタイプ又はこれ
らの混合物である。アニオン界面活性剤の典型的例は、
直鎖アルキルベンゼンスルホナート（LAS）、アルキル
スルフェート（AS）、αオレフィンスルホナート（AO
S）、アルコールエトキシスルフェート（AES）および天
然脂肪酸のアルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤
の例は、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノ
ニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、スク
ロースおよびグルコースの脂肪酸エステルおよびポリエ
トキシル化アルキルグルコシドである。
本発明の洗剤組成物は、又業界公知の他の洗剤用成
分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、耐蝕剤、
金属イオン封鎖剤、抗土境−再付着剤、香料、酵素用安
定剤および漂白剤、配合助剤、蛍光増白剤、起泡増進
剤、キレート化剤、充てん剤、布帛柔軟剤等を含有する
ことができる。本発明の洗剤組成物は、J.フオルベによ
って記載される如く実質的に製剤化できる〔フオルベ、
J.;Surfactants in Consumer Products.Theory,Tecnolo
gy and Application;スプリンゲルフェルラーク1987,特
に「液体／粉末重質洗剤用フレーム製剤化」の標題が付
けられた節を参照のこと〕。
現在、以下のように考察されている。すなわち、本発
明の洗剤組成物は、洗液１当たり蛋白質分解酵素の0.
0005〜0.5CPUに相当する量の酵素調製品を含有できる。
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合の形態、例えば
粉体、液体等に製剤化できる。
本発明の洗剤組成物は、好都合には１種又はそれ以上
の他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラー
ゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを洗
剤組成物中に好都合に含ませて含有できる。
本発明のプロテアーゼは、洗剤用プロテアーゼを含む
別個の添加剤を添加することにより、又は異なる洗剤用
酵素を含んでなる混合添加剤を添加することにより洗剤
組成物中に含有せしめることができる。
本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等
として配合できる。好ましい洗剤用添加剤製剤は、無粉
塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又は保
護された酵素である。無塵の粒質物は、例えば英国特許
1,362,365又は米国特許4,106,991に従って製造でき、そ
して所望により業界公知方法により被覆できる。洗剤用
酵素は造粒前又は造粒後混合できる。
液体酵素調製品は、例えば、確立された方法に従い例
えばプロピレングリコールの如きポリオール、糖もしく
は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより
安定化できる。他の酵素安定化剤は当業者に十分周知で
ある。保護された酵素はヨーロッパ特許公開公報第238,
216号に開示された方法に従って調製できる。
有用な態様に於て、本発明のプロテアーゼは例えばヨ
ーロッパ特許公開公報第342,177号、同368,575、同378,
261および同378,262に従って洗剤配合物に導入できる。
本発明を更に次の実施例において説明するが、これは
いかなる場合もクレームされた如き本発明の範囲を制限
するものではない。
実施例１ 培養例 バシラスSP.TY145を、以下の組成（当たり）の培地
100mlを含有する500mlのバフル化エルレンマイヤーフラ
スコ中、回転振動テーブル（300r.p.m.）上で25℃で培
養した： ポテトデンプン 100g 粉砕大麦 50g 大豆粉末 50g Na2HPO4×12H2O 10g ナトリウムカゼイナート 10g プルロニック（Pluronic）（登録商標） 0.1g 培地中のデンプンは、α−アミラーゼにより液化され
そして培地は120℃で45分間加熱することにより殺菌さ
れる。
殺菌後、培地のpHを１モル溶液の炭酸水素ナトリウム
10mlを添加することにより11.5に調節する。
インキュベーションの５日後、培養物の蛋白質分解活
性を前記方法を用いて測定した。
培養後、ブロスの酵素活性は10CPU/であった。
固形物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグ
ラフィー法により精製した。
１の培養ブロスからの収率は50CPU/を有する50ml
であった。純度はSDS−PAGEにより判断される如く90％
以上であった。
この実施例に従って調製される製剤の特徴は、本明細
書中の初め部分で言及されており、ここで参照される。
実施例２ 洗たく性能 洗たく性能試験を、20℃のモデル洗たくシステム中、
等温的に10分間、綿布上の草の汚れについて実行した。
商業上の米国タイプの液体洗剤2.0g/を試験におい
て用いた。洗剤は、本発明の添加前、如何なる酵素も含
まなかった。洗剤は、約６゜dH（ドイツ硬度）水に溶解
され、そしてpHは約８に測定された。繊維／洗液比は、
洗剤溶液１当たり約6gの繊維であった。実施例１に係
る酵素調製品を0.01;0.04;0.08;0.16および0.5CPU/の
酵素濃度で用いた。
洗たくに続いて、布帛を流れる水道水で25分間すすぎ
次いで風乾した。プロテアーゼの性能を、データーカラ
ーエレフォメーター2000を用い、460nmで測定した規約
反射率（％Ｒ）の変化（ΔＲ）によって測定した。ΔＲ
はプロテアーゼを添加して洗たくした規約反射率からプ
ロテアーゼを添加しないで洗たくした規約反射率を差し
引いたものである。
試験結果を表１に示す。
表１ 酵素濃度 デルタＲ 0.01CPU/ 4 0.04CPU/ 6.7 0.08CPU/ 8.7 0.16CPU/ 9.7 0.50CPU/ 11.2 示差規約反射率値は、本発明のプロテアーゼが良好な
洗たく適性を有することを示す。
実施例３ 洗剤中での安定性 本発明の酵素（実施例１に従って得られた酵素調製
品）の安定性を、洗剤の存在下で試験した。この試験で
用いた洗剤は、アメリカのタイプの粉末洗剤とアメリカ
のタイプの液体洗剤であった。
残留活性を40℃で60分後に測定した。酵素用量は0.3C
PU/であった。
残留活性 粉末洗剤:0.9g/ 100％ 液体洗剤:2.0g/ 95％ この実験は、プロテアーゼが洗たく条件下、洗剤中で
安定であることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リンデガールト，ポウル デンマーク国，デーコー−2100 コペン ハーゲン エー．，オエステル ソエガ ゼ 52 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C11D 3/386 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の特性を有することを特徴とするプロテ
    アーゼ： （ａ）38KDの見掛分子量； （ｂ）8.8のpI; （ｃ）pH8〜11の範囲内に最適pH（25℃で）； （ｄ）45〜55℃の範囲内に最適温度（pH9.5で）； （ｅ）バシラス種（sp）TY145,NCIMB No.40339由来のプ
    ロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免
    疫化学的性質。
  2. 【請求項２】プロテアーゼがバシラス種（sp）TY145の
    株から得られる、請求の範囲第１項記載のプロテアー
    ゼ。
  3. 【請求項３】バシラス種（sp）TY145,NCIMB No.40339、
    又はその突然変異体もしくは変異体から得られる、請求
    の範囲第２項記載のプロテアーゼ。
  4. 【請求項４】バシラス種（sp）TY145の株から単離され
    た生物学的に純粋な培養物。
  5. 【請求項５】株がバシラス種（sp）TY145,NCIMB No.403
    39、又はその突然変異体もしくは変異体である、請求の
    範囲第４項記載の培養物。
  6. 【請求項６】請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の
    プロテアーゼを製造する方法であって、バシラス種（s
    p）TY145のプロテアーゼ生産株を、炭素および窒素源並
    びに無機塩を含有する適当な栄養源培地中で培養し、引
    き続き所望の酵素を回収することを含んでなる、前記製
    造方法。
  7. 【請求項７】バシラス種（sp）TY145,NCIMB No.40339、
    又はその突然変異体もしくは変異体を培養する、請求の
    範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】洗剤用酵素としての請求の範囲第１〜３項
    のいずれかに記載のプロテアーゼを使用する方法。
  9. 【請求項９】請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の
    プロテアーゼを含んでなる洗剤組成物。
  10. 【請求項１０】更に１種又はそれ以上の他の酵素（アミ
    ラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、および
    ／又はペルオキシダーゼ）を含んでなる、請求の範囲第
    ９項記載の洗剤組成物。
  11. 【請求項１１】非発塵性の粒状物、液体、スラリー、又
    は保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第１
    〜３項のいずれかに記載のプロテアーゼを含んでなる洗
    剤組成物。
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