ES2728758T3 - Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/2488—Mannanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C11D2111/12—
Abstract
Una composición de detergente que comprende al menos una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 74 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, en el que la al menos una enzima tiene actividad degradativa de manano.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas
Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevas composiciones de detergente que comprenden enzimas mananasas bacterianas. Las composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas son útiles en aplicaciones de lavandería y limpieza en las que se desea la degradación o modificación de manano. La invención también se refiere al uso de dichas composiciones de detergente en aplicaciones de lavandería y limpieza, así como a un método para degradar el manano.
Antecedentes
Los mananos son polisacáridos que contienen manosa y se encuentran en varias plantas. Los mananos son poco solubles en un ambiente acuoso y sus propiedades fisicoquímicas dan lugar a dispersiones viscosas. Además, los mananos tienen una alta capacidad de unión con el agua. Todas estas características causan problemas en varias industrias, entre las que se incluyen, las de la elaboración de cerveza, panificación, nutrición animal, y aplicaciones de lavandería y limpieza.
En las dietas basadas en plantas, están presentes diferentes p-mananos y, dependiendo de sus cantidades y propiedades, pueden comprometer la digestión de nutrientes, la colonización microbiana y rendimiento del crecimiento. La degradación enzimática de los mananos reduce la viscosidad digestiva de los mananos con alta solubilidad en agua y conduce a la producción de manano-oligosacáridos que pueden formar mananos lineales insolubles en agua presentes en las plantas leguminosas. La mananasa aumenta la ganancia diaria promedio, la eficiencia de la alimentación, la uniformidad de peso y la habitabilidad en todos los animales monogástricos.
Para aplicaciones de alimentación animal, tales como piensos para animales monogástricos con dietas de cereales, el manano es un factor que contribuye a la viscosidad del contenido intestinal y, por lo tanto, afecta negativamente a la digestibilidad del alimento y a la tasa de crecimiento animal. Para los rumiantes, el manano representa un componente sustancial de la ingesta de fibra y una digestión más completa del manano facilitaría mayores eficiencias de conversión de los alimentos.
Para aplicaciones de lavandería y limpieza, las composiciones de detergente que comprenden mananasa pueden utilizarse para degradar el manano. Sin embargo, es difícil proporcionar mananasas que sean estables en diferentes condiciones de almacenamiento y uso y que aún muestren una buena actividad degradativa de manano.
El documento WO 99/64619 A2 desvela y caracteriza varias mananasas y su posible uso supuesto en varias aplicaciones industriales.
Es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones de detergente que comprenden nuevas enzimas que presentan actividad mananasa cuando se aplican en estas composiciones de detergente. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar composiciones de detergente que tengan un rendimiento mejorado de eliminación de manchas en manchas que contienen manano.
Sumario
Según el primer aspecto de la invención, se proporciona una composición de detergente que comprende al menos una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 74 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (Man7), en la que al menos una enzima tiene actividad degradativa de manano.
En una realización de la invención, al menos una enzima tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:16.
Las mananasas comprendidas en la composición de detergente de la invención son adecuadas para degradar y modificar materiales que contengan manano en diversos entornos químicos, preferentemente en composiciones de detergente.
En una realización de la presente invención, la composición de detergente comprende además una o más enzimas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa,
pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacasa y/o peroxidasa, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, amilasas, celulasas y lipasas.
En una realización adicional de la presente invención, la composición de detergente está en forma de una pastilla, un comprimido homogéneo, un comprimido que tiene dos o más capas, una bolsa que tiene uno o más compartimentos, un polvo regular o compacto, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado. En una realización, la composición de detergente puede ser una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida.
La presente invención se refiere además al uso de la composición de detergente como se describe en el presente documento para la degradación de manano.
En una realización adicional, la presente invención se refiere al uso de la composición de detergente como se describe en el presente documento en un proceso de lavandería.
La presente invención se refiere además a un método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente como se describe en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un método para degradar manano que comprende aplicar al manano una composición de detergente como se describe en el presente documento, en el que, preferentemente, el manano está en la superficie de un textil.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra una representación esquemática del vector pEV1 para la replicación en Bacillus
La figura 2 muestra esquemáticamente los casetes de expresión utilizados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para la sobreproducción de la proteína mananasa Man7 recombinante según la presente invención, así como otras proteínas mananasas (Man6 y Man14) recombinantes. Los genes de mananasa estaban bajo el control del promotor cel7A/cbh1 de T. reesei (pcbhl) y la terminación de la transcripción se garantizó utilizando la secuencia de terminación cel7A/cbh1 de T. reesei tcbh1). El gen de amdS se incluyó como un marcador de transformación.
La figura 3 muestra el perfil de temperatura de las mananasas Man6, Man7 y Man14 recombinantes (producidas por Bacillus) analizado en tampón de Britton-Robinson 40 mM, pH 7, utilizando un tiempo de reacción de 10 minutos, como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina. Todas las mediciones se realizaron al menos por duplicado. Los puntos de datos son promedios de mediciones individuales.
La figura 4 describe el efecto del pH sobre la actividad de las proteínas mananasas Man6, Man7 y Man14 recombinantes (producidas por Bacillus) en tampón de Britton-Robinson 40 mM, a un pH de 4 a 11. La temperatura de reacción fue de 50 °C y el tiempo de reacción fue de 10 min. Como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina. Todas las mediciones se realizaron al menos por duplicado. Los puntos de datos son promedios de mediciones individuales.
La figura 5 muestra un análisis SDS PAGE de mananasas bacterianas.
La figura 6 describe el rendimiento de la eliminación de manchas de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus y Trichoderma) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en presencia de 4,4 g/l de detergente A líquido comercial para uso industrial a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 8,3 y enzimas dosificadas como unidades de actividad. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 7 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en presencia de 4,4 g/l de detergente A líquido comercial para uso industrial a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 8,3 y enzimas dosificadas como proteína enzimática activa (PEA). Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 8 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en presencia de 3,8 g/l de detergente en polvo comercial para ropa de color a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 10. y enzimas dosificadas como unidades de actividad. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 9 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 4 manchas) en presencia de 3,8 g/l de detergente en polvo comercial para ropa de color a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 10 y enzimas dosificadas como proteína enzimática activa. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 10 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 3 manchas) en presencia de 4,2 g/l de detergente blanqueador en polvo para uso comercial a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 9,5 y enzimas dosificadas como proteína enzimática activa. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®. La figura 11 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man14 (producida en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 2 manchas) en presencia de 5 g/l de detergente B líquido comercial para uso industrial a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 8,3 y enzimas dosificadas como unidades de actividad. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 12 describe el rendimiento de eliminación de manchas de Man14 (producida en Bacillus) como un aumento de la luminosidad (suma de AL* de 2 manchas) en presencia de 5 g/l de detergente B líquido comercial para uso industrial a 40 °C, 16 °dH, 60 min, pH de aprox. 8,3 y enzimas dosificadas como proteína enzimática activa. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway®.
La figura 13 describe la estabilidad de Man 6 y Man7 (producidas en Bacillus) en detergente líquido (OMO para ropa de color) a 37 °C. Para establecer comparaciones se utilizaron 4,0 l de la preparación comercial Mannaway® La figura 14 describe la estabilidad de Man 6 (producida en Bacillus) detergente A líquido comercial para uso industrial. Para establecer comparaciones se utilizó la preparación comercial Mannaway® 4,0 l.
LISTADOS DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man6_1
SEQ ID NO: 2 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man6_2
SEQ ID NO: 3 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man7_1
SEQ ID NO: 4 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man7_2
SEQ ID NO: 5 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man14_1
SEC ID NO: 6 Secuencia del cebador oligonucleotídico Man14_2
SEC ID NO: 7 Secuencia del cebador oligonucleotídico Vec_1
SEC ID NO: 8 Secuencia del cebador oligonucleotídico Vec_2
SEQ ID NO: 9 La secuencia de nucleótidos de la man6 de Bacillus clausii
SEQ ID NO: 10 La secuencia de nucleótidos de la man6 de Bacillus clausii sin secuencia codificante de péptido señal y con optimización de codones para Trichoderma reesei
SEQ ID NO: 11 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man6 de Bacillus clausii
SEQ ID NO: 12 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man6 de Bacillus clausii sin péptido señal SEQ ID NO: 13 La secuencia de nucleótidos de la man7 de Bacillus hemicellulosilyticus
SEQ ID NO: 14 La secuencia de nucleótidos de la man7 de Bacillus hemicellulosilyticus sin secuencia codificante de péptido señal y con optimización de codones para Trichoderma reesei
SEQ ID NO: 15 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man7 de Bacillus hemicellulosilyticus
SEQ ID NO: 16 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man7 de Bacillus hemicellulosilyticus sin péptido señal
SEQ ID NO: 17 La secuencia de nucleótidos de la man14 de Virgibacillus soli
SEQ ID NO: 18 La secuencia de nucleótidos de la man14 de Virgibacillus soli sin secuencia codificante de péptidos señal y con optimización de codones para Trichoderma reesei
SEQ ID NO: 19 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man14 de Virgibacillus soli
SEQ ID NO: 20 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man14 de Virgibacillus soli sin péptido señal
SEQ ID NO: 21 Secuencia del cebador oligonucleotídico BMAN1
SEQ ID NO: 22 Secuencia del cebador oligonucleotídico BMAN2
SEQ ID NO: 23 Secuencia del cebador oligonucleotídico BMAN3
SEQ ID NO: 24 Secuencia del cebador oligonucleotídico BMAN4
SEQ ID NO: 25 La secuencia de nucleótidos de man31 de Bacillus pumilus
SEQ ID NO: 26 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man31 de Bacillus pumilus
SEQ ID NO: 27 La secuencia de nucleótidos de la man32 de Bacillus amyloliquefaciens
SEQ ID NO: 28 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man32 de Bacillus amyloliquefaciens
SEQ ID NO: 29 La secuencia de nucleótidos de la man33 de Amphibacillus xylanus
SEQ ID NO: 30 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man33 de Amphibacillus xylans
SEQ ID NO: 31 La secuencia de nucleótidos de la man34 de Paenibacillus polymyxa
SEQ ID NO: 32 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man34 de Paenibacillus polymyxa
SEQ ID NO: 33 La secuencia de nucleótidos de la man35 de Bacillus hemicellulosilyticus
SEQ ID NO: 34 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man35 de Bacillus hemicellulosilyticus
SEQ ID NO: 35 La secuencia de nucleótidos de la man36 de Bacillus alcalophilus
SEQ ID NO: 36 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man36 de Bacillus alcalophilus
SEQ ID NO: 37 La secuencia de nucleótidos de la man37 de Bacillus sp.
SEQ ID NO: 38 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man37 de Bacillus sp.
SEQ ID NO: 39 La secuencia de nucleótidos de la man38 de Bacillus circulans
SEQ ID NO: 40 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man38 de Bacillus circulans
SEQ ID NO: 41 La secuencia de nucleótidos de la man39 de Paenibacillus sp.
SEQ ID NO: 42 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man39 de Paenibacillus sp.
SEQ ID NO: 43 La secuencia de nucleótidos de la man40 de Bacillus circulans
SEQ ID NO: 44 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man40 de Bacillus circulans
SEQ ID NO: 45 La secuencia de nucleótidos de la man41 de Bacillus nealsonii
SEQ ID NO: 46 La secuencia de aminoácidos deducida de la Man41 de Bacillus nealsonii
SEQ ID NO: 47 La secuencia de nucleótidos de la man42 de Bacillus circulans
SEQ ID NO: 48 La secuencia de nucleótidos de la Man42 de Bacillus circulans
Descripción detallada
Como se usa en el presente documento, "aislada" significa una sustancia en una forma o entorno que no se produce en la naturaleza. Como ejemplos no limitativos de sustancias aisladas se incluyen (1) cualquier sustancia de origen no natural, (2) cualquier sustancia incluyendo cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se extrae, al menos parcialmente, de uno o más o de todos los constituyentes de origen natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre relacionada con esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada al aumentar o disminuir la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que está asociada de forma natural (por ejemplo, producción recombinante
en una célula hospedadora); una o múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; y uso de un promotor alternativo al promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia). En una realización un polipéptido, una enzima, un polinucleótido, una célula hospedadora o la composición de la invención está aislado(a).
Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" incluye los significados más amplios de "que incluye", "que contiene" y "que comprende", así como las expresiones más limitadas "que consiste en" y "que consiste solo en".
Como se usa en el presente documento, "fragmento" significa una proteína o un polinucleótido que tiene delecionado uno o más aminoácidos o nucleótidos. En el contexto de ADN, un fragmento incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario de cualquier longitud. Un fragmento puede ser un fragmento activo que tiene la función biológica, tal como actividad enzimática o actividad reguladora, de la proteína o del polinucleótido. Un fragmento también puede ser un fragmento inactivo, es decir, no tiene uno o más efectos biológicos de la proteína o polinucleótido natural.
Como se usa en el presente documento, "variante" significa un fragmento de secuencia (nucleótido o aminoácido) insertado o delecionado por uno o más nucleótidos/aminoácidos o que se modifica químicamente.
Como se usa en el presente documento, un "péptido" y un "polipéptido" son secuencias de aminoácidos que incluyen una pluralidad de restos de aminoácidos polimerizados consecutivos. Para los fines de la presente invención, los péptidos son moléculas que incluyen hasta 20 restos de aminoácidos, y los polipéptidos incluyen más de 20 restos de aminoácidos. El péptido o polipéptido puede incluir restos de aminoácidos modificados, restos de aminoácidos de origen natural no codificados por un codón, y restos de aminoácidos de origen no natural. Como se usa en el presente documento, una "proteína" puede referirse a un péptido o a un polipéptido de cualquier tamaño. Una proteína puede ser una enzima, una proteína, un anticuerpo, una proteína de membrana, una hormona peptídica, un regulador, o cualquier otra proteína.
El término "polinucleótido" significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas.
Como se usa en el presente documento, "modificación", "modificado", y términos similares en el contexto de los polinucleótidos, se refieren a modificaciones en una región codificante o no codificante del polinucleótido, tal como una secuencia reguladora, una región 5' no traducida, una región 3' no traducida, un elemento genético de regulación positiva, un elemento genético de regulación negativa, un potenciador, un supresor, un promotor, una región exónica o intrónica. En algunas realizaciones la modificación puede ser solo estructural, sin efecto sobre el efecto, la acción o la función biológica del polinucleótido. En otras realizaciones, la modificación es una modificación estructural que proporciona un cambio en el efecto, la acción o la función biológica del polinucleótido. Dicha modificación puede potenciar, suprimir o cambiar la función biológica del polinucleótido.
Como se usa en el presente documento, "identidad" significa el porcentaje de coincidencias exactas de restos de aminoácidos entre dos secuencias alineadas sobre el número de posiciones donde hay restos presentes en ambas secuencias. Cuando una secuencia tiene un resto que no tiene resto correspondiente en la otra secuencia, el programa de alineación permite un espacio en la alineación, y esa posición no se cuenta en el denominador del cálculo de identidad. La identidad es un valor determinado con la herramienta de alineación de secuencias EMBOSS Needle en el sitio web de EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/).
Como se usa en el presente documento, "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción, emparejamiento, cruce o similar con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier descendencia que no sea idéntica debido a las mutaciones que se producen durante la replicación. Son ejemplos no limitativos de una célula hospedadora las células fúngicas, las células fúngicas filamentosas de la División Ascomycota Subdivisión Pezizomycotina; preferentemente del grupo que consiste en miembros de la Clase Sordariomycetes, Subclase Hypocreomycetidae, Órdenes Hipocreales y Microascales y Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora y Humicola; más preferentemente del grupo que consiste en las Familias Hypocreacea, Nectriaceae, Clavicipitaceae, Microascaceae, y los géneros Tricoderma (anamorfo de Hypocrea), Fusarium, Gibberella, Nectria, Stachybotrys, Claviceps, Metarhizium, Villosiclava, Ophiocordyceps, Cephalosporium y Scedosporium; más preferentemente del grupo que consiste en Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina), T. citrinoviridae, T. longibrachiatum, T. virens, T. harzianum, T. asperellum, T. atroviridae, T. parareesei, Fusarium oxysporum, F. gramineanum, F. pseudograminearum, F. venenatum, Gibberella fujikuroi, G. moniliformis, G. zeaea, Nectria (Haematonectria) haematococca, Stachybotrys chartarum, S. chlorohalonata, Claviceps purpurea, Metarhizium acridum, M. anisopliae, Villosiclava virens, Ophiocordyceps sinensis, Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum, y Scedosporium apiospermum y Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Humicola insolens, y Humicola grisea, más preferentemente Trichoderma reesei. Son ejemplos no limitativos de una célula hospedadora, las células bacterianas, preferentemente bacilos grampositivos (por ejemplo, B . subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus), actinomycetales (por ejemplo, Streptomyces sp.) y levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica)
En una realización de ejemplo de la célula hospedadora esta es una célula fúngica, preferentemente una célula fúngica filamentosa, tal como Trichoderma o Trichoderma reesei. En una realización de ejemplo de la célula hospedadora esta es una célula bacteriana, preferentemente una célula de Bacillus grampositivo, tal como B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. amyloliquefaciens, B. pumilus.
Una "célula recombinante" o "célula hospedadora recombinante" se refiere a una célula o célula hospedadora que se ha modificado o alterado genéticamente para comprender una secuencia de ácido nucleico que no es natural para dicha célula o célula hospedadora. En una realización, la modificación genética comprende integrar el polinucleótido en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización, el polinucleótido es exógeno en comparación con la célula hospedadora.
Como se usa en el presente documento, "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido en una célula hospedadora, incluyendo, pero sin limitación, transcripción, traducción, modificación postraduccional y secreción. La expresión puede ir seguida de la recolección, es decir, de la recuperación de las células hospedadoras o del producto expresado.
La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés unido operativamente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección, un potenciador, una señal de poliadenilación, un transportador y similares. Los vectores de expresión generalmente derivan de plásmidos o de ADN vírico, o pueden contener elementos de ambos. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión que esté convenientemente sujeto a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la que se introducirá el vector. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en que se ha integrado.
La expresión "expresado recombinante" o "expresado de manera recombinante" utilizada en el presente documento en relación con la expresión de un polipéptido o proteína se define según la definición estándar en la técnica.
La expresión "obtenido de" y "obtenible" como se usa en el presente documento en relación con una fuente microbiana específica, significa que el polinucleótido y/o polipéptido se produce por la fuente específica (expresión homóloga), o por una célula en la que se ha insertado un gen de la fuente (expresión heteróloga).
La expresión "composición enzimática" significa un producto de fermentación enzimática convencional, posiblemente aislado y purificado, de una sola especie de un microorganismo, comprendiendo dicha preparación habitualmente diversas actividades enzimáticas diferentes; o una mezcla de enzimas monocomponentes, preferentemente enzimas derivadas de especies bacterianas o fúngicas utilizando técnicas recombinantes convencionales, cuyas enzimas se han fermentado y posiblemente aislado y purificado por separado y que pueden provenir de diferentes especies, preferentemente especies fúngicas o bacterianas o el producto de fermentación de un microorganismo que actúa como una célula hospedadora para la expresión de una mananasa recombinante, pero cuyo microorganismo produce simultáneamente otras enzimas.
La expresión "unidos operativamente", cuando se refiere a segmentos de ADN, significa que los segmentos están ordenados de modo que funcionen al unísono para sus propósitos previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador
El término "promotor" significa una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran, comúnmente, pero no siempre, en las regiones 5' no codificantes de los genes.
El término "secuencia señal secretora" significa una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una ruta secretora de una célula hospedadora en la que se sintetiza. La secuencia señal secretora puede ser natural o puede reemplazarse con una secuencia de señal secretora o secuencia transportadora de otra fuente. Dependiendo de la célula hospedadora, el péptido más grande puede escindirse para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.
La expresión "región central" significa un dominio de una enzima que puede o no haberse modificado o alterado, pero que ha conservado su actividad original; el dominio catalítico tal como se conoce en la técnica ha permanecido funcional.
Por el término "enlazador" o "espaciador" se entiende un polipéptido que comprende al menos dos aminoácidos que pueden estar presentes entre los dominios de una proteína multidominio, por ejemplo, una enzima que comprende un
núcleo enzimático y un dominio de unión tal como un módulo de unión a carbohidratos (CBM, del inglés carbohydrate binding module) o cualquier otro híbrido de enzima, o entre dos proteínas o polipéptidos expresados como un polipéptido de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende dos enzimas núcleo. Por ejemplo, la proteína de fusión de un núcleo enzimático con un CBM se proporciona mediante la fusión de una secuencia de ADN que codifica el núcleo enzimático, una secuencia de ADN que codifica el enlazador y una secuencia de ADN que codifica el CBM secuencialmente en un marco de lectura abierto y que expresa esta construcción.
La expresión "composición de detergente ", incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado granulares o en polvo, multiuso o de uso industrial, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado líquidos, en gel o pasta, multiuso, especialmente los tipos de líquidos denominados de uso industrial (HDL, heavy-duty liquid); detergentes líquidos para tejidos delicados; agentes de lavado manual de vajilla o de lavado ligero de vajilla, especialmente los del tipo muy espumoso; agentes de lavavajillas, incluidos los diversos tipos de comprimidos, granulados, líquidos y ayudantes de aclarado de uso doméstico e institucional; agentes limpiadores líquidos y desinfectantes, champús para automóviles o alfombras, limpiadores de aseos; limpiadores de metales; así como auxiliares de limpieza, tales como los aditivos blanqueadores y los tipos de "barritas para manchas" o de tratamiento previo. Las expresiones "composición de detergente " y "formulación detergente" se utilizan en referencia a mezclas que están destinadas para su uso en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En algunas realizaciones, las expresiones se utilizan en referencia a tejidos y/o prendas de lavado (por ejemplo, "detergentes de lavandería"). En realizaciones alternativas, las expresiones se refieren a otros detergentes, como los que se utilizan para lavar platos, cubertería, etc. (por ejemplo, "detergentes para lavavajillas"). No se pretende limitar la presente invención a ninguna formulación o composición de detergente particular. Se pretende que, además de las variantes según la invención, el término abarca detergentes que pueden contener, por ejemplo, tensioactivos, adyuvantes de detergencia, quelantes o agentes quelantes, sistemas o componentes blanqueadores, polímeros, acondicionadores de tejido, reforzadores de formación de espuma, supresores de espuma de jabón, tintes, perfumes, inhibidores de ennegrecimiento, abrillantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de la suciedad, agentes anticorrosivos, inhibidores o estabilizadores enzimáticos, activadores enzimáticos, transferasa(s), enzimas hidrolíticas, oxidorreductasas, agentes azulantes y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizantes.
El término "textil" significa cualquier material textil, incluyendo hilos, productos intermedios de hilos, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos, y cualquier otro material textil, telas fabricadas de estos materiales y productos fabricados de telas (por ejemplo, prendas de vestir y otros artículos). El textil o la tela puede estar en forma de puntos, tejidos, telas vaqueras, tejidos no tejidos, fieltros, hilos y telas de toalla. El textil puede estar basado en celulosa, tal como celulosas naturales, incluyendo algodón, lino/tela de sábana, yute, ramio, sisal o celulosa de fibra de coco o artificial (por ejemplo, procedente de pulpa de madera), incluida la viscosa/el rayón, ramio, fibras de acetato de celulosa (tricel), lyocell o sus mezclas. El textil o la tela también puede tener una base no celulósica, como las poliamidas naturales, incluyendo lana, camello, cachemir, mohair, conejo y seda o polímeros sintéticos como el nailon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno y spandex/elastano, o mezclas de los mismos, así como una mezcla de fibras basadas y no basadas en celulosa. Son ejemplos de mezclas las mezclas de algodón y/o rayón/viscosa con uno o más materiales complementarios, como lana, fibras sintéticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de poli(cloruro de polivinilo), fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (por ejemplo, rayón/viscosa, ramio, lino/tela de sábana, yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell). La tela puede ser ropa convencional lavable, por ejemplo ropa de hogar sucia. Cuando se utiliza el término tela o prenda de vestir, se pretende incluir también los textiles en sentido más amplio.
El término "estabilidad" incluye estabilidad de almacenamiento y estabilidad durante el uso, por ejemplo, durante un proceso de lavado (en estabilidad de lavado) y refleja la estabilidad de la variante de proteasa según la invención en función del tiempo, por ejemplo, cuánta actividad se conserva cuando la proteasa se mantiene en solución, en particular en una solución de detergente. La estabilidad está influenciada por muchos factores, por ejemplo, el pH, la temperatura, la composición de detergente, por ejemplo, cantidad de adyuvante de detergencia, tensioactivos, etc. La estabilidad de la proteasa puede medirse utilizando el 'ensayo de estabilidad' descrito en el apartado de Materiales y Métodos del presente documento. La expresión "estabilidad mejorada" o "estabilidad aumentada", como se define en el presente documento, se refiere a una proteasa variante que muestra estabilidad aumentada en soluciones, en relación con la estabilidad de la proteasa precursora. Las expresiones "estabilidad mejorada" y "estabilidad aumentada" incluyen "estabilidad química mejorada", "estabilidad del detergente" o "estabilidad mejorada del detergente".
Composición de detergente
La presente invención se refiere a nuevas composiciones de detergente que comprenden enzimas mananasas bacterianas. Las composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas son útiles en aplicaciones de lavandería y limpieza en las que se desea la degradación o modificación de manano. La invención también se refiere al uso de dichas composiciones de detergente en aplicaciones de lavandería y limpieza, así como a un método para degradar el manano.
Como se usa en el presente documento, el término "manano" se refiere a polisacáridos que consisten en una cadena principal de manosa ligadas entre sí por enlaces p-1,4 con cadenas laterales de galactosa fijadas a la cadena principal por enlaces a-1,6. Los mananos comprenden material vegetal, tal como goma guar y goma de algarrobo. Los glucomananos son polisacáridos que tienen una cadena principal de manosa y glucosa ligadas de manera alterna más o menos regularmente por enlaces p-1,4, los galactomananos y galactoglucomananos son mananos y glucomananos con ramificaciones laterales de galactosa unidas por enlaces alfa-1,6.
Como se usa en el presente documento, el término "mananasa" o "galactomananasa" significa una enzima mananasa definida según la técnica como manan endo-1,4-beta-manosidasa y que tiene los nombres alternativos beta-mananasa y endo-1,4-mananasa y cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-manosídicos en mananos, galactomananos, glucomananos y galactoglucomananos. Según la nomenclatura enzimática, las mananasas se clasifican como EC 3.2.1.78.
La "actividad mananasa", como se usa en el presente documento, se refiere a la actividad degradativa de manano de un polipéptido. Degradar o modificar, como se usa en este documento, significa que la mananasa hidroliza las unidades de manosa del polisacárido de manano. La actividad degradativa de manano de los polipéptidos según la presente invención, puede someterse a ensayo según procedimientos de ensayo estándar conocidos en la técnica. El ejemplo 7 proporciona un ejemplo de un método estándar para determinar la actividad mananasa.
Según el primer aspecto, la composición de detergente de la presente invención comprende al menos una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 74 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 (Man7), en la que la al menos una enzima tiene actividad degradativa de mamano.
En una realización de la invención, al menos una enzima tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
Las mananasas comprendidas en la composición de detergente de la invención son adecuadas para degradar y modificar materiales que contengan manano en diversos entornos químicos, preferentemente en composiciones de detergente.
En una realización de la presente invención, la composición de detergente comprende además una o más enzimas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacasa y/o peroxidasa, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, amilasas, celulasas y lipasas.
En general, las propiedades de la(s) enzima(s) seleccionada(s) deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debe(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.
Celulasas
Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente u obtenidos mediante ingeniería de proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los siguientes géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum divulgadas en los documentos US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Son ejemplos de dichas celulasas las celulasas descritas en los documentos EP 0495257, EP 0531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, y WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa como las descritas en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299._Son ejemplos de celulasas que exhiben actividad endo-beta-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) las que se describen en el documento WO02/099091._Otros ejemplos de celulasas incluyen la familia de celulasas 45 descrita en el documento WO96/29397, y especialmente variantes de las mismas que tienen sustituciones, inserciones y/o deleciones en una o más de las posiciones correspondientes a las siguientes posiciones en la SEC ID N°: 8 del documento WO 02/099091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200 y/o 20, preferentemente seleccionadas entre P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H o Q146 R. Las celulasas disponibles en el comercio incluyen Celluclean™ Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase ™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC-500 (B)™ (Kao Corporation).
Proteasas
Las proteasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano, fúngico, vegetal, vírico o animal, por ejemplo, de origen vegetal o microbiano. Se prefieren las de origen microbiano. Se incluyen los mutantes modificados químicamente u obtenidos mediante ingeniería de proteínas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serina proteasa o una metaloproteasa. Una serina proteasa puede ser, por ejemplo, de la familia S1, tal como tripsina, o de la familia S8, tal como subtilisina. Una proteasa de las metaloproteasas puede ser, por ejemplo, una termolisina, por ejemplo, la familia M4 u otra metaloproteasa, tal como la de las familias M5, M7 o M8.
El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de serina proteasas según Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serina proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizado por tener una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas pueden dividirse en 6 subdivisiones, es decir, la familia Subtilisina, la familia Termitasa, la familia Proteinasa K, la familia de peptidasas Lantibióticas, la familia Kexina y la familia Pirolisina. Son ejemplos de subtilasas las derivadas de Bacillus tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii descritas en los documentos; US7262042 y WO09/021867, y subtilisina lentus, subtilisina novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN’, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 descritas en el documento WO89/06279 y proteasa PD138 descrita en el documento (WO93/18140). Otras proteasas útiles pueden ser las descritas en los documentos WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 y WO02/016547. Los ejemplos de proteasas del tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en los documentos WO89/06270, WO94/25583 y WO05/040372, y las proteasas de quimotripsina derivadas de Cellumonas descritas en los documentos WO05/052161 y WO05/052146. Una proteasa adicional preferida es la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, que se describe, por ejemplo, en el documento WO95/23221, y variantes de la misma, que se describen en los documentos WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 y EP1921148. Los ejemplos de metaloproteasas son la metaloproteasa neutra que se describe en el documento WO07/044993 (Genencor lnt.) tal como las derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.
Los ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en los documentos: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración BPN'. Las variantes de subtilasas más preferidas pueden comprender las mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (utilizando la numeración BPN'). Las enzimas proteasas adecuadas, disponibles en el comercio, incluyen las comercializadas con las marcas registradas Alcalase®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® y Esperase® (Novozymes A/S), las comercializadas con la marca registrada Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz™, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Buen ase®, Effectenz™, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (GistBrocases N.V.), BLAP (secuencia mostrada en la Figura 29 del documento US5352604) y variantes de las mismas (Henkel AG) y KAP ('subtilisina de Bacillus alkalophilus) de Kao.
Lipasas y Cutinasas
Las lipasas y cutinasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes modificadas químicamente o modificadas por proteínas. Los ejemplos incluyen lipasa de Thermomyces, por ejemplo, de T. lanuginosus (previamente denominada Humicola lanuginosa) como se describe en los documentos EP258068 y EP305216, cutinasa de Humicola, por ejemplo, H. insolens (WO96/13580), lipasa de cepas de Pseudomonas (algunas de estas ahora han cambiado su nombre a Burkholderia), por ejemplo, P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP218272) P. cepacia (EP331376), cepa SD705 de P. sp (WO95/06720 y WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipasas de Streptomyces de tipo GDSL (WO10/065455), cutinasa de Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinasa de Pseudomonas mendocina (US 5.389.536), lipasa de Termobifida fusca (WO11/084412), lipasa de Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), lipasa de Bacillus subtilis (WO11/084599) y lipasa de Streptomyces griseus (WO11/150157) y S. pristinaespiralis (WO12/137147).
Otros ejemplos son variantes de lipasa, tales como las descritas en los documentos EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 y WO09/109500.
Los productos de lipasa comerciales preferidos incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente de Gist-Brocades).
Otros ejemplos más son lipasas a veces denominadas aciltransferasas o perhidrolasas, por ejemplo, aciltransferasas con homología a lipasa A de Cándida antártica (WO10/111143), aciltransferasa de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolasas de la familia CE 7 (WO09/67279), y variantes de la perhidrolasa de M. smegmatis, en
particular la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).
Amilasas
Las amilasas adecuadas que pueden utilizarse junto con variantes de subtilasa de la invención pueden ser una alfaamilasa o una glucoamilasa y pueden ser de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente u obtenidos mediante ingeniería de proteínas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita con más detalle en el documento GB 1.296.839.
Las amilasas adecuadas incluyen amilasas que tienen la SEQ ID NO: 3 en el documento WO 95/10603 o variantes que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 3 de la misma. Las variantes preferidas se describen en los documentos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 y la SEQ ID NO: 4 del documento WO 99/019467, como variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444. Diferentes amilasas adecuadas incluyen amilasas que tienen la SEC ID N°: 6 en el documento WO 02/010355 o variantes de la misma que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la misma. Las variantes preferidas son las que tienen una deleción en las posiciones 181 y 182 y una sustitución en la posición 193.
Otras amilasas que son adecuadas, son las alfa-amilasas híbridas que comprenden los restos 1-33 de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrados en la SEC ID N°: 6 del documento WO 2006/066594 y los restos 36-483 de la alfa-amilasa de B. liqueniforme mostrados en la SEC ID N°: 4 del documento WO 2006/066594 o variantes que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la misma. Las variantes preferidas de esta alfa-amilasa híbrida son las que tienen una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, 1201, A209 y Q264. Las variantes más preferidas de la alfa-amilasa híbrida que comprenden los restos 1-33 de la alfa-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrados en la SEC ID N°: 6 del documento WO 2006/066594 y los restos 36-483 de la SEC ID N°: 4 del documento WO2006 / 066594 son las que tienen las sustituciones:
M197T;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; o G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
Otras amilasas que son adecuadas son las amilasas que tienen la SEQ ID NO: 6 en el documento WO 99/019467 o variantes de las mismas que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 6. Las variantes preferidas de SEQ ID NO: 6 son las que tienen una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: R181, G182, h 183, G184, N195, I206, E212, E216 y K269. Son amilasas particularmente preferidas las que tienen una deleción en las posiciones R181 y G182, o en las posiciones H183 y G184. Otras amilasas que pueden utilizarse son las que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7 del documento WO 96/023873 o variantes de las mismas que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7. Variantes preferidas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7 son las que tienen una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 y 476. Las variantes más preferidas son las que tienen una deleción en las posiciones 181 y 182 o en las posiciones 183 y 184. Las variantes de amilasa más preferidas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7 son las que tienen una deleción en las posiciones 183 y 184 y una sustitución en una o más de las posiciones 140, 195, 206, 243, 260, 304 y 476.
Otras amilasas que pueden utilizarse son amilasas que tienen la SEC ID N°: 2 del documento WO 08/153815, la SEQ ID NO: 10 en el documento WO 01/66712 o variantes de las mismas que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 2 del documento WO 08/153815 o una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 10 en el documento WO 01/66712. Las variantes preferidas de la SEQ ID NO: 10 en el documento WO 01/66712 son las que tienen una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: 176, 177, 178, 179, 190, 201,207, 211 y 264. Otras amilasas adecuadas son las amilasas que tienen la SEQ ID NO: 2 del documento WO 09/061380 o variantes que tienen una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 2 de la misma. Las variantes preferidas de la s Eq ID NO: 2 son las que tienen un truncamiento del extremo C y/o una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 y G475. Las variantes más preferidas de la SEQ ID NO: 2 son las que tienen la sustitución en una o más de las siguientes posiciones: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E y G475K y/o la deleción en la posición R180 y/o S181 o de T182 y/o G183. Las variantes de amilasa más preferidas de la SEQ ID NO: 2 son las que tienen las sustituciones:
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; o S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K en las que las variantes están truncadas en el extremo C y opcionalmente comprenden además una sustitución en la posición 243 y/o una deleción en la posición 180 y/o posición 181.
Otras amilasas adecuadas son las alfa-amilasas que tienen la SEQ ID NO: 12 en el documento WO01/66712 o una variante que tiene al menos una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 12. Las variantes de amilasa preferidas son las que tienen una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones de la SEC ID N°: 12 en el documento WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Las amilasas preferidas particulares incluyen variantes que tienen una deleción de D183 y G184 y que tienen las sustituciones R118K, N195F, R320K y R458K, y una variante que adicionalmente tiene sustituciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo: m 9, G149, Gl82, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 y A339, lo más preferido es una variante que adicionalmente tiene sustituciones en todas estas posiciones.
Otros ejemplos son variantes de amilasa como las descritas en los documentos WO2011/098531, WO2013/001078 y WO2013/001087.
Las amilasas disponibles en el comercio son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X y BAN™ (de Novozymes A / S), y Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase y Preferenz S100 (de Genencor International Inc./DuPont).
Peroxidasas/Oxidasas
Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente u obtenidos mediante ingeniería de proteínas. Como ejemplos de peroxidasas útiles se incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus y variantes de las mismas como las descritas en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.
Las peroxidasas disponibles en el comercio incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).
La enzima (o enzimas) de detergente puede incluirse en una composición de detergente añadiendo aditivos individuales que contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo individual o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, un líquido, una pasta semilíquida, etc. Las formulaciones de aditivos de detergentes preferidas son granulados, en particular, granulados no en polvo, líquidos, en particular, líquidos o pastas semilíquidas estabilizados.
Pueden producirse granulados no en polvo, por ejemplo, como se describe en los documentos US 4.106.991 y 4.661.452 y pueden recubrirse opcionalmente mediante métodos conocidos en la técnica. Son ejemplos de materiales de recubrimiento cerosos los productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1 000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono y di y triglicéridos de ácidos grasos. En el documento GB 1483591 se ofrecen ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para su aplicación mediante técnicas de lecho fluido. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Pueden prepararse enzimas protegidas según el método desvelado en el documento EP 238.216.
Una composición para su uso en detergentes sólidos de lavandería, por ejemplo, puede incluir de 0,000001 % a 5 %, tal como de 0,000005 % a 2 %, tal como de 0,00001 % a 1 %, tal como de 0,00001 % a 0,1 % de proteína enzimática en peso de la composición.
Una composición para su uso en detergentes líquidos de lavandería, por ejemplo, puede incluir de 0,000001 % a 3 %, tal como de 0,000005 % a 1%, tal como de 0,00001% a 0,01% de proteína enzimática en peso de la composición.
Una composición para su uso en lavavajillas automático, por ejemplo, puede incluir de 0,000001 % a 5 %, tal como de 0,000005 % a 2 %, tal como de 0,00001 % a 1 %, tal como de 0,00001 % a 0,1 % de proteína enzimática en peso de la composición.
La enzima (o enzimas) de la composición de detergente de la invención puede estabilizarse utilizando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol, tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilborónico, tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede formularse como se describe, por ejemplo, en los documentos WO92/19709 y WO92/19708.
En una realización, la invención está dirigida a composiciones de detergente que comprenden una enzima de la presente invención en combinación con uno o más componentes adicionales de la composición de limpieza. La elección de componentes adicionales se incluye en las competencias del experto en la técnica e incluye ingredientes convencionales, incluyendo los componentes no limitativos ejemplares expuestos a continuación.
La elección de componentes puede incluir, para el cuidado textil, tener en cuenta el tipo de textil que se va a limpiar, el tipo y/o grado de suciedad, la temperatura a la que se realizará la limpieza y la formulación del producto de detergente. Aunque los componentes mencionados a continuación se clasifican mediante un encabezamiento general
según una funcionalidad particular, esto no debe interpretarse como una limitación, ya que los componentes pueden comprender funcionalidades adicionales como apreciarán los expertos en la técnica.
1. Tensioactivos
La composición de detergente puede comprender uno o más tensioactivos, que pueden ser aniónicos y/o catiónicos y/o no iónicos y/o semipolares y/o zwitteriónicos, o una mezcla de los mismos. En una realización particular, la composición de detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y de uno o más tensioactivos aniónicos. Normalmente, el tensioactivo (o tensioactivos) está presente a un nivel de aproximadamente 0,1 % a 60 % en peso, tal como de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 %, o de aproximadamente 3 % a aproximadamente 20 %, o de aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 %. El tensioactivo (o tensioactivos) se selecciona en función de la aplicación de limpieza deseada, e incluye cualquier tensioactivo (o tensioactivos) convencional conocido en la técnica. Para uso en detergentes, puede utilizarse cualquier tensioactivo conocido en la técnica.
Cuando se incluye en esta composición, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % en peso, tal como de aproximadamente 5 % a aproximadamente 30 %, incluyendo de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, o de aproximadamente 20 % a aproximadamente 25 % de un tensioactivo aniónico. Como ejemplos no limitativos de tensioactivos aniónicos se incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS), isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanosulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis (sulfatos), hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, alquilsulfatos (AS) tales como dodecil sulfato de sodio (SDS), sulfatos de alcoholes grasos (FAS), sulfatos de alcoholes primarios (PAS), etersulfatos de alcohol (AES o AEOS o FES, también conocidos como etoxisulfatos de alcohol o éter sulfatos de alcoholes grasos), alcanosulfonatos secundarios (SAS), parafina sulfonatos (PS), éster sulfonatos, ésteres de glicerol de ácido graso sulfonado, esteres metílicos de alfa-sulfo ácidos grasos (alfa-SFMe o SES), incluyendo éster sulfonato de metilo (MES), ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil succínico (DTSA), derivados de ácidos grasos de aminoácidos, diésteres y monoésteres de ácido sulfo-succínico o jabón, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluye en esta composición, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente 0 % a aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo catiónico. Como ejemplos no limitativos de tensioactivos catiónicos se incluyen alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de dimetildistearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio, compuestos de alquil amonio cuaternario, compuestos de amonio cuaternario alcoxilado (AQA) y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluye en esta composición, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 40 % en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 30 %, en particular de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 %, tal como de aproximadamente 3 % a aproximadamente 5 %, o de aproximadamente 8 % a aproximadamente 12 %. Como ejemplos no limitativos de tensioactivos no iónicos se incluyen etoxilatos de alcohol (Ae o AEO), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos propoxilados (PFA), ésteres alquílicos de ácidos grasos alcoxilados, tales como ésteres alquílicos de ácidos grasos etoxilados y/o propoxilados, etoxilatos de alquilfenol (APE), etoxilatos de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicósidos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácidos grasos (FAM), dietanolamidas de ácidos grasos (FADA), monoetanolamidas de ácidos grasos etoxilados (EFAM), monoetanolamidas de ácidos grasos propoxilados (PFAM), amidas de ácidos grasos de polihidroxialquilo o derivados de N-acil N-alquil glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácidos grasos, FAGA), así como los productos disponibles con las marcas registradas SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluye en esta composición, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente 0 % a aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo semipolar. Como ejemplos no limitativos de tensioactivos semipolares se incluyen óxidos de amina (AO) tales como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(coco alquil)-N, N-dimetilamina y óxido de N-(sebo-alquil)-N,N-bis(2-hidroxietil) amina, alcanolamidas de ácidos grasos y alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, y combinaciones de los mismos.
Cuando se incluye en esta composición, el detergente generalmente contendrá de aproximadamente 0 % a aproximadamente 10 % en peso de un tensioactivo zwitteriónico. Como ejemplos no limitativos de tensioactivos zwitteriónicos se incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína, y combinaciones de las mismas.
2. Hidrótropos
Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrófobos en soluciones acuosas (o, por el contrario, sustancias polares en un entorno no polar). Normalmente, los hidrótropos tienen un carácter tanto hidrófilo como hidrófobo (las denominadas propiedades anfifílicas conocidas de los tensioactivos); sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea. Los hidrótropos no muestran una concentración crítica por encima de la cual se produce una autoagregación como la que se encuentra en los tensioactivos y los lípidos que forman mesofases micelares, lamelares u otras bien definidas. En su lugar, muchos
hidrótropos muestran un proceso de agregación de tipo continuo en el que los tamaños de los agregados crecen a medida que aumenta la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de las fases, la estabilidad y las propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótropos se utilizan clásicamente en todas las industrias, desde aplicaciones farmacéuticas, cuidado personal, alimentos, hasta aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones de detergente permite, por ejemplo, formulaciones más concentradas de tensioactivos (como en el proceso de compactación de detergentes líquidos mediante la eliminación de agua) sin inducir fenómenos no deseados, como la separación de fases o la alta viscosidad.
El detergente puede contener 0-5 % en peso, tal como de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 %, o de aproximadamente 3 % a aproximadamente 5 %, de un hidrótropo. Se puede utilizar cualquier hidrótropo conocido en la técnica para su uso en detergentes. Como ejemplos no limitativos de hidrótropos se incluyen benceno sulfonato sódico, p-tolueno sulfonato sódico (STS), xileno sulfonato sódico (SXS), cumeno sulfonato sódico (SCS), cimeno sulfonato sódico, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoléteres, hidroxinaftoato sódico, hidroxinaftaleno sulfonato sódico, etilhexil sulfato sódico y combinaciones de los mismos.
3. Adyuvantes y coadyuvantes (de detergencia)
La composición de detergente puede contener aproximadamente 0-65 % en peso, tal como aproximadamente de 5 % a aproximadamente 45 % de un adyuvante y coadyuvante de detergencia, o una mezcla de los mismos. En un detergente para lavavajillas, normalmente el nivel del adyuvantes es de 40-65 %, particularmente de 50-65%. El adyuvante y coadyuvante puede ser particularmente un agente quelante que forme complejos solubles en agua con Ca y Mg. Para su uso en detergentes para la ropa, puede utilizarse cualquier adyuvante y coadyuvante conocido en la técnica. Como ejemplos no limitativos de adyuvantes se incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos, tal como trifosfato sódico (STP o STPP), carbonatos, tal como carbonato sódico, silicatos solubles tal como metasilicato sódico, silicatos en capas (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst), etanolaminas, tal como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, también conocida como iminodietanol), trietanolamina (TEA, también conocida como 2,2',2"-nitrilotrietanol), y carboximetil inulina (CMI), y combinaciones de los mismos.
La composición de detergente también puede contener 0-20 % en peso, tal como aproximadamente de 5 % a aproximadamente 10 %, de un adyuvante de detergente, o una mezcla de los mismos. La composición de detergente puede incluir un coadyuvante solo, o en combinación con un adyuvante, por ejemplo un adyuvante de zeolita. Como ejemplos no limitativos de coadyuvantes se incluyen homopolímeros de poliacrilatos o copolímeros de los mismos, tales como ácido(poliacrílico) (PAA) o ácido (copoliacrílico/maleico) (PAA/PMA). Otros ejemplos no limitativos incluyen citrato, quelantes, tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil o alquenilsuccínico. Como ejemplos específicos adicionales se incluyen ácido 2,2',2"-nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilendiamino-W,W-disuccínico (EDDS), ácido metilglicinodiacético (MGDA), ácido glutámico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico (HEDP), ácido etilendiaminotetra-(metilenfosfónico) (EDTMPA), ácido dietilentriaminopentakis(metilenfosfónico) (DTPMPA o DTMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico-ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspártico-ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiónico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil)-aspártico(SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)-aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil)-glutámico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil)-glutámico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido a-alanin-N,N-diacético (a-ALDA), ácido serin-N,N-diacético (SEDA), ácido isoserin-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanin-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido N,N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N,N-diacético (SLDA), ácido taurin-N,N-diacético (TUDA) y ácido sulfometil-N,N-diacético (Sm DA), ácido N-(2-hidroxietil)-etilendiamino-N,N'N'-triacético (HEDTA), dietanolglicina (DEG), ácido dietilentriamina penta (metilenfosfónico)(DTPMP), ácido aminotris(metilenfosfónico) (ATMP), y combinaciones y sales de los mismos. Por ejemplo, en los documentos WO 09/102854 y US 5977053 se describen otros ejemplos de adyuvantes y/o coadyuvantes
4. Sistemas de blanqueamiento
El detergente puede contener 0-50 % en peso, tal como aproximadamente de 0,1 % a aproximadamente 25 %, de un sistema de blanqueamiento. Para su uso en detergentes de lavandería, puede utilizarse cualquier sistema de blanqueamiento conocida en la técnica. Los componentes adecuados del sistema de blanqueamiento incluyen catalizadores de blanqueamiento, fotoblanqueadores, activadores de blanqueamiento, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato de sodio y perboratos de sodio, perácidos preformados y mezclas de los mismos. Los perácidos preformados adecuados incluyen, pero sin limitación, ácidos peroxicarboxílicos y sales, ácidos percarbónicos y sales, ácidos perimídicos y sales, ácidos peroximonosulfúricos y sales, por ejemplo, oxona (R) y mezclas de los mismos. Como ejemplos no limitativos de sistemas de blanqueamiento se incluyen sistemas de blanqueamiento basados en peróxido, que puede comprender, por ejemplo, una sal inorgánicas, incluidas las sales de metales alcalinos, tales como sales de perborato de sodio (generalmente mono- o tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato, en combinación con un activador blanqueante de formación de perácido. En el presente documento, por activador blanqueante se entiende un compuesto que reacciona con el blanqueador de peroxígeno tipo peróxido de hidrógeno para formar un perácido. El perácido formado de este modo constituye el
blanqueador activado. Los activadores blanqueantes adecuados para su uso en el presente documento incluyen los que pertenecen a la clase de ésteres de amidas, imidas o anhídridos. Son ejemplos adecuados la tetracetiletilendiamina (TAED), sodio 4-[(3,5,5-trimetilhexanoil)oxi]benzenosulfonato (ISONOBS), ácido diperoxi dodecanoico, 4-(dodecanoiloxi)bencenosulfonato (LOBS), 4-(decanoiloxi)bencenosulfonato, 4-(decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoiloxi)bencenosulfonato (NOBS) y/o los descritos en el documento WO98/17767. Una familia particular de activadores blanqueantes de interés se desvelo en el documento EP624154 y se prefiere particularmente en esa familia el acetil trietil citrato (ATC). El ATC, o un triglicérido de cadena corta como la triacetina, tiene la ventaja de que es ecológico ya que con el tiempo se degrada en ácido cítrico y alcohol. Además, el acetil trietil citrato y la triacetina tienen una buena estabilidad hidrolítica en el producto durante el almacenamiento y es un activador blanqueante eficaz. Por último, el ATC proporciona una buena capacidad adyuvante al aditivo de lavandería. Como alternativa, el sistema de blanqueamiento puede comprender peroxiácidos, por ejemplo, del tipo amida, imida o sulfona. El sistema de blanqueamiento también puede comprender perácidos tales como ácido 6-(ftalimino)peroxihexanoico (PAP). El sistema de blanqueamiento también puede incluir un catalizador blanqueante. En algunas realizaciones, el componente blanqueante puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas:
(i)
(ii)
(iii) y mezclas de los mismos; en las que cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos, preferentemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos, más preferentemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, noctadecilo, iso-nonilo, iso-decilo, iso-tridecilo e iso-pentadecilo. Se describen otros sistemas de blanqueamiento ejemplares, por ejemplo, en los documentos WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 y WO2007/087242. Por ejemplo, la ftalocianina de zinc sulfonada puede ser un fotoblanqueador adecuado
5. Polímeros
El detergente puede contener 0-10 % en peso, tal como 0,5-5 %, 2-5 %, 0,5-2 % o 0,2-1 % de un polímero. Para su uso en detergentes puede utilizarse cualquier polímero conocido en la técnica. Como se ha mencionado anteriormente, el polímero puede funcionar como un coadyuvante o puede proporcionar propiedades contra la redeposición, protección de fibra, eliminación de suciedad, inhibición de la transferencia de tintes, limpieza de grasa y/o propiedades antiespumantes. Algunos polímeros pueden tener más de una de las propiedades mencionadas anteriormente y/o más de uno de los motivos mencionados a continuación. Los polímeros ejemplares incluyen (carboximetil)celulosa (CMC), alcohol(polivinílico) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenimina) etoxilada, carboximetil inulina (CMI) y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, CMC modificada hidrofóbicamente (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) y poli(tereftalato de oxietileno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridin-N-óxido) (PVPO o PVPNO) y polivi nilpirrolidonavinilimidazol (PVPVI). Otros polímeros ejemplares incluyen policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y etoxi sulfato dicuaternario. Otros polímeros ejemplares se describen, por ejemplo, en el documento WO 2006/130575. También se contemplan las sales de los polímeros mencionados anteriormente.
6. Agentes de coloración de tela
Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden incluir agentes de coloración de tela tales como tintes o pigmentos, que cuando se formulan en composiciones de detergente pueden depositarse sobre una tela cuando dicha tela se pone en contacto con un líquido de lavado que comprende dichas composiciones de detergente y, por lo tanto, altera el tinte de dicha tela a través de la absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes de blanqueamiento fluorescentes emiten al menos algo de luz visible. Por el contrario, los agentes de coloración de tela
alteran el tinte de una superficie al absorber al menos una parte del espectro de luz visible. Los agentes de coloración de tela adecuados incluyen tintes y conjugados de tinte y arcilla, y también pueden incluir pigmentos. Los tintes adecuados incluyen tintes de molécula pequeña y tintes poliméricos. Los tintes de molécula pequeña adecuados incluyen tintes de molécula pequeña seleccionados del grupo que consiste en tintes que se encuentran en las clasificaciones del Índice de Color (IC) de Direct Blue, rojo directo, violeta directo, azul ácido, rojo ácido, violeta ácido, azul básico, violeta básico y rojo básico, o mezclas de los mismos, por ejemplo, como se describe en los documentos WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 y EP1876226 (incorporados por referencia en el presente documento). Preferentemente, la composición de detergente comprende de aproximadamente 0,00003 % en peso a aproximadamente 0,2 % en peso, de aproximadamente 0,00008 % en peso a aproximadamente 0,05 % en peso, o incluso de aproximadamente 0,0001 % en peso a aproximadamente 0,04 % en peso de agente de coloración de tela. La composición puede comprender de 0,0001 % en peso a 0,2 % en peso de agente de coloración de tela, esto puede ser especialmente preferido cuando la composición está en forma de una bolsa de una sola dosis. Agentes de coloración adecuados también se desvelan, por ejemplo, en los documentos WO 2007/087257 y WO2007/087243.
7. Materiales complementarios
Para su uso en detergentes de lavandería también puede utilizarse cualquier componente de detergente conocido en la técnica. Otros componentes de detergente opcionales incluyen agentes contra la corrosión, agentes contra el encogimiento, agentes contra la redeposición de manchas, agentes contra las arrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, agentes desintegrantes/disgregantes, tintes, estabilizadores enzimáticos (incluido el ácido bórico, boratos, CMC, y/o polioles tal como propilenglicol), acondicionadores de telas incluyendo arcillas, rellenos/ayudantes de procesamiento, agentes de blanqueamiento fluorescentes/abrillantadores ópticos, reforzadores de formación de espuma, reguladores de espuma (espuma de jabón), perfumes, agentes de suspensión de la suciedad, suavizantes, supresores de espuma de jabón, inhibidores de ennegrecimiento y agentes percolantes, en solitario o en combinación. Para uso en detergentes de lavandería puede utilizarse cualquier ingrediente conocido en la técnica. La elección de dichos ingredientes se incluye en las competencias del experto en la técnica.
Dispersantes: Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen ácidos homo o copoliméricos o sus sales, en los que el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant science series volumen 71, Marcel Dekker, Inc., se describen dispersantes adecuados.
Agentes inhibidores de transferencia de tinte: Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes inhibidores de transferencia de tinte. Como agentes inhibidores de transferencia de tinte poliméricos adecuados se incluyen, pero sin limitación, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos. Cuando están presentes en una composición objeto de estudio, los agentes inhibidores de transferencia de tinte pueden estar presentes a niveles de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 5 % o incluso de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 3 % en peso de la composición.
Agente blanqueador fluorescente: Las composiciones de detergente de la presente invención también contendrán, preferentemente, componentes adicionales que pueden teñir los artículos que se va a limpiar, tales como agentes de blanqueamiento fluorescentes o abrillantadores ópticos. Cuando está presente, el abrillantador está preferentemente a un nivel de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,5 %. En la composición de la presente invención puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para uso en una composición de detergente de lavandería. Los agentes de blanqueamiento fluorescentes que se utilizan más frecuentemente son los que pertenecen a las clases de derivados de ácido diaminoestilbensulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenildistirilo. Ejemplos de agentes de blanqueamiento fluorescentes del tipo de los derivados de ácido diaminoestilbenosulfónico, incluyen las sales de sodio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triacin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triacin-6- ilamino) estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxi-etilamino)-s-triacin-6-ilamino) estilben-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilben-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1-metil-2-hidroxi-etilamino)-s-triacin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-disulfonato y 2-(estilbil-4"-nafto-1.,2':4,5)-1,2,3-trizol-2"-sulfonato. Los agentes de blanqueamiento fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, disponibles en Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica de 4,4'-bis-(2-morfolino-4 anilino-s-triacin-6-ilamino) estilbeno disulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica de 2,2'-bis-(fenil-estiril) disulfonato. También preferidos son los agentes de blanqueamiento fluorescentes como Parawhite KX disponible en el comercio, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Bombay, India. Otros fluorescentes adecuados para su uso en la invención incluyen las 1-3-diaril pirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas. Los niveles de abrillantador fluorescente adecuados incluyen niveles inferiores de aproximadamente 0,01 % en peso, de 0,05, de aproximadamente 0,1 o incluso de aproximadamente 0,2 % en peso a niveles superiores de 0,5 o incluso de 0,75 % en peso.
Polímeros de eliminación de suciedad: Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden incluir uno o más polímeros de eliminación de suciedad que ayudan a eliminar la suciedad de telas tales como telas a base de algodón y poliéster, en particular, la eliminación de suciedad hidrófoba de telas a base de poliéster. Los
polímeros de eliminación de suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros no iónicos o aniónicos, basados en tereftalto, polivinil caprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros de injerto de vinilo, poliamidas de poliéster, véase, por ejemplo, el Capítulo 7 en Powdered Detergents, Surfactant science series volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros de eliminación de suciedad son polímeros anfifílicos, alcoxilados que limpian la grasa, que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato fijados a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina como se describe en detalle en el documento WO 2009/087523 (incorporado por referencia en el presente documento). Además, los copolímeros de injerto aleatorio son polímeros de eliminación de suciedad adecuados. En el documento WO 2007/138054 se describen con más detalle copolímeros de injerto adecuados WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (incorporados por referencia en el presente documento). Otros polímeros de eliminación de suciedad son estructuras polisacarídicas sustituidas, especialmente estructuras de celulosa sustituidas, tales como derivados de celulosa modificados, tales como los descritos en los documentos EP 1867808 o WO 2003/040279 (ambos incorporados por referencia en el presente documento). Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de las mismas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa aniónicamente modificada, celulosa no aniónicamente modificada, celulosa catiónicamente modificada, celulosa zwitteriónicamente modificada, y mezclas de las mismas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, éster de carboximetilcelulosa, y mezclas de las mismas.
Agentes contra la redeposición: Las composiciones de detergente de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes contra la redeposición tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros basados en celulosa descritos anteriormente como polímeros de eliminación de suciedad, también pueden funcionar como agentes contra la redeposición.
Otros materiales complementarios adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, transportadores, tintes, estabilizadores enzimáticos, suavizantes de tela, cargas, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de espuma de jabón, disolventes y estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastizantes de estructura.
En una realización adicional de la presente invención, la composición de detergente está en forma de una pastilla, un comprimido homogéneo, un comprimido que tiene dos o más capas, una bolsa que tiene uno o más compartimentos, un polvo regular o compacto, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado. En una realización, la composición de detergente puede ser una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida. Existen diversas formas de formulación de detergentes, tales como capas (fases iguales o diferentes), bolsitas, así como formas para unidades de dosificación de lavadora.
Las bolsitas pueden configurarse como compartimentos individuales o múltiples. Pueden tener cualquier forma, configuración y material que sea adecuado para contener la composición, por ejemplo, que no permita liberar la composición de la bolsa antes de que entre en contacto con el agua. La bolsa está fabricada de una película soluble en agua que encierra un volumen interior. Dicho volumen interior puede dividirse en compartimentos de la bolsa. Las películas preferidas son materiales poliméricos, preferentemente polímeros que se forman en una película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados preferidos de los mismos son poliacrilatos seleccionados, y copolímeros de acrilato solubles en agua, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, malto dextrina, polimetacrilatos, lo más preferentemente copolímeros de alcohol polivinílico e, hidroxipropil metil celulosa (HPMC). Preferentemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo PVA, es de al menos aproximadamente 60 %. Normalmente, el peso molecular promedio preferido será de aproximadamente 20000 a aproximadamente 150000. Las películas también pueden ser de composiciones de mezcla que comprenden mezclas de polímeros hidrolíticamente degradables y solubles en agua, tales como polilactida y alcohol polivinílico (conocido con la referencia comercial M8630, comercializado por Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., EE. UU.) más plastificantes como glicerol, etilenglicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos. Las bolsitas pueden comprender una composición de detergente de lavandería sólida o componentes de partes y/o una composición de limpieza líquida o componentes de partes separados por la película soluble en agua. El compartimento para componentes líquidos puede tener una composición diferente a la de los compartimentos que contienen sólidos. Ref: (US2009/0011970 A1).
Los ingredientes de detergente pueden separarse físicamente entre sí mediante compartimentos en bolsitas disolubles en agua o en diferentes capas de comprimidos. De este modo, se puede evitar la interacción de almacenamiento negativa entre los componentes. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimentos también pueden dar lugar a una disolución retardada de los componentes seleccionados en la solución de lavado.
Un detergente líquido o en gel que no es una unidad dosificada, puede ser acuoso, que normalmente contiene al menos 20 % en peso y hasta 95 % de agua, tal como hasta aproximadamente 70 % de agua, hasta aproximadamente 65 % de agua, hasta aproximadamente 55 % de agua, hasta aproximadamente 45 % de agua, hasta aproximadamente el 35% de agua. Otros tipos de líquidos, incluyendo, sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles, pueden
incluirse en un líquido o gel acuoso. Un detergente líquido acuoso o en gel puede contener de 0 a 30 % de disolvente orgánico. Un detergente líquido o en gel puede ser no acuoso.
Las composiciones de detergente de la presente invención pueden proporcionarse en forma de pastillas de jabón de lavandería y utilizarse para lavar a mano la ropa, telas y/o textiles. El término pastilla de jabón de lavandería incluye pastillas de lavandería, pastillas de jabón, pastillas combinadas, pastillas syndet (tensioactivos sintéticos) y pastillas de detergente. Los tipos de pastillas generalmente difieren en el tipo de tensioactivo que contienen, y la expresión pastilla de jabón de lavandería incluye pastillas que contienen jabones de ácidos grasos y/o jabones sintéticos. La pastilla de jabón de lavandería tiene una forma física que es sólida y no líquida, en gel o en polvo a temperatura ambiente. El término sólido se define como una forma física que no cambia significativamente con el tiempo, es decir, si un objeto sólido (por ejemplo, una pastilla de jabón de lavandería) se coloca dentro de un recipiente, el objeto sólido no cambia al llenar el recipiente en el que se coloca. La pastilla es un sólido normalmente en forma de pastilla, pero puede tener otras formas sólidas, tales como redondeadas u ovaladas.
La pastilla de jabón de lavandería puede contener una o más enzimas adicionales, inhibidores de proteasa, tales como aldehídos peptídicos (o aducto de hidrosulfito o aducto de hemiacetal), ácido bórico, borato, derivados de bórax y/o ácido fenilborónico, tal como el ácido 4-formilfenilborónico, uno o más jabones o tensioactivos sintéticos, polioles, tales como glicerina, compuestos que controlan el pH, tales como ácidos grasos, ácido cítrico, ácido acético y/o ácido fórmico, y/o una sal de un catión monovalente y un anión orgánico en la que el catión monovalente puede ser, por ejemplo, Na+, K+ o NH4+ y el anión orgánico puede ser, por ejemplo, formato, acetato, citrato o lactato de manera que la sal de un catión monovalente y un anión orgánico pueda ser, por ejemplo, formiato sódico.
La pastilla de jabón de lavandería también puede contener agentes complejantes como EDTA y HEDP, perfumes y/o diferentes tipos de cargas, tensioactivos, por ejemplo, tensioactivos sintéticos aniónicos, adyuvantes, agentes poliméricos de eliminación de suciedad, quelantes detergentes, agentes estabilizantes, cargas, tintes, colorantes, inhibidores de transferencia de tinte, policarbonatos alcoxilados, supresores de espumas, estructurantes, aglutinantes, agentes de lixiviación, activadores de blanqueamiento, agentes de eliminación de suciedad arcillosa, agentes contra la redeposición, agentes dispersantes poliméricos, abrillantadores, suavizantes de tela, perfumes y/u otros compuestos conocidos en la técnica.
La pastilla de jabón de lavandería puede procesarse en aparatos convencionales de fabricación de pastillas de jabón de lavandería, tales como, sin limitación: mezcladoras, empastilladoras, por ejemplo, una empastilladora de vacío bifásica, extrusoras, cortadoras, logo estampadoras, túneles de enfriamiento y empacadoras. La invención no se limita a preparar las pastillas de jabón de lavandería mediante un solo método. La premezcla de la invención puede añadirse al jabón en diferentes fases del proceso. Por ejemplo, la premezcla que contiene un jabón, una enzima, opcionalmente una o más enzimas adicionales, un inhibidor de proteasa y una sal de un catión monovalente y un anión orgánico, puede prepararse y, después, la mezcla se empastilla. La enzima y enzimas adicionales opcionales pueden añadirse al mismo tiempo que el inhibidor de proteasa, por ejemplo, en forma líquida. Además de la etapa de mezclar y de empastillar, el proceso puede comprender además las siguientes etapas de molienda, extrusión, corte, estampado, enfriamiento y/o empacado.
La presente invención se refiere además a diferentes usos de la composición de detergente como se describe en este documento, tal como para degradar mananos y para su uso en un proceso de lavandería.
La presente invención se refiere además a un método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente como se describe en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un método para degradar manano que comprende aplicar al manano una composición de detergente como se describe en el presente documento, en el que, preferentemente, el manano está en la superficie de un textil. Al degradar el manano fijado al textil o tejido, la mancha o suciedad unida al manano se elimina y no puede volver a unirse al manano o a las manchas de manano.
En una realización de la presente invención, la mananasa comprendida en la composición de detergente de la presente invención, tiene una actividad relativa de al menos 30 % en el intervalo de temperatura de 45 °C a 65 °C. Proporcionar mananasas que conserven su actividad a temperaturas superiores a la temperatura ambiente y en pH ácido, es ventajoso para aplicaciones en las que se requiere la degradación de manano en dichas condiciones.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención, hidroliza al azar los enlaces endo-beta-1,4-manosídicos.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención, puede obtenerse o derivar de una fuente bacteriana.
En una realización, la mananasa comprendida en las composiciones de detergente de la presente invención, se fusiona con al menos un polipéptido adicional, formando así un polipéptido de fusión. El polipéptido de fusión o el polipéptido adicional pueden tener otras actividades catalíticas o de unión además de las de la mananasa. En una realización, el
polipéptido adicional comprende o consiste en un módulo de unión a carbohidratos, que es opcionalmente un fragmento de otra proteína o enzima derivada del mismo o diferente organismo que la mananasa. La mananasa puede conectarse al polipéptido adicional con un enlazador.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar varios aspectos de la presente invención. Con estos ejemplos no se pretende limitar la invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Aunque los siguientes ejemplos están relacionados con tres proteínas mananasas diferentes, se considera que la proteína mananasa Man7 es la nueva mananasa según la presente invención.
Ejemplo 1: Exploración
Para la identificación de nuevas beta-1,4-mananasas se exploraron bases de datos públicas (NCBI, EBI) y se seleccionaron genomas de propiedad exclusiva y públicos. Todos los genomas de propiedad exclusiva y públicos utilizados en este trabajo se muestran en la Tab. 1. Todos los aciertos se agruparon y finalmente se seleccionaron 15 genes de origen bacteriano para la clonación en Bacillus en función de la distancia filogenética entre ellos (Tabla 2) Tabla 1:^ Li n m r i x l iv li iliz r l x l r i n -14-m nanasas
T l 2: Li ^ n l i n r l l n i n n B ill
Ejemplo 2: Clonación de mananasas bacterianas en Bacillus
A menos que se indique otra cosa, los métodos de biología molecular, incluyendo manipulaciones y transformaciones de ADN, se realizaron como se describe en Sambrook y Russell (2001) y Harwood y Cutting (1990). Los genes man6, man7 y man14, se amplificaron por PCR utilizando polimerasa Pfx Accu Prime (Invitrogen). Las PCR se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la construcción de los plásmidos de expresión se utilizaron las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial durante 120 segundos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 15 segundos a 94 °C, 30 segundos de emparejamiento en uno de los siguientes 50/55 °C, 110/290 segundos de extensión a 68 °C y la extensión final a 68 °C durante 10 min. Para la amplificación de ADN genómico de man7 de Bacillus hemicellulosilyticus se utilizó JCM 9152. man6 and man14 se ordenaron como genes sintéticos sin optimización de codones (Eurofins MWG, Alemania). En la Tabla 3 se muestran las secuencias de los cebadores utilizados para la clonación. Los nucleótidos protuberantes para la hibridación se indican subrayados.
T l : Li r iliz r l m lifi i n m n m n7 m n14
Man7_1 37 CAACCGCCT CT GCAGCTTCT GATGGT CAT AGC 3 ilyticus CAAAC
Man7_2 36 CGGTATATCTCTGT CTTATT GGATTGTT
ilyticus ACATGATC 4
14 Man14_1 40 CAACCGCCT CT GCAGCT GCAAGCGGG 5TTTTATGTAAACGG
14 Man14_2 39 CGGTATATCTCTGTCTTATTT AAT GGTA 6ACGTTATCAAC
pUB110 Vec 1 17 AGCTGCAGAGGCGGTTG 7
Los genes se clonaron en un vector estándar pEV1 pEV1 (Fig. 1), un derivado de pUB110 que incluye el promotor PaprE de Bacillus licheniformis y el péptido señal de xilanasa de Bacillus amyloliquefaciens, utilizando la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder®Hifi (NEB, Frankfurt). Para la clonación se aplicó una relación de vector: inserto de 1: 3. La cantidad total de fragmentos fue de 0,2 pmol en un volumen total de 20 pl. Las muestras se incubaron durante 40 min a 50 °C. Para los fines de la construcción, los plásmidos de expresión se transformaron por competencia inducida en Bacillus subtilis SCK6, como se describe en Zhang y Zhang 2011. Las células transformadas se colocaron en placas con LB (Luria-Bertani) complementadas con 10 mg/l de kanamicina. Las placas se incubaron durante 20 h a 37 °C. Las colonias que surgieron se seleccionaron y el plásmido se aisló utilizando el kit QiaPrep MiniPrep (Qiagen, Hilden). El procedimiento de aislamiento se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones de los fabricantes para preparaciones de plásmidos de grampositivos. Los insertos se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger (GATC, Alemania) y revelaron las secuencias de ADN correspondientes a las partes maduras de las mananasas Man6, Man7 y Man14. Las comparaciones de las secuencias se realizaron utilizando el alineamiento de secuencias de ClustalW (Thompson et al 1994). Por último, los plásmidos de expresión se transformaron mediante electroporación en una cepa de producción de Bacillus adecuada. La cepa de producción de Bacillus se cultivó en medio de electroporación que contenía Triptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g, NaCl 10 g y sacarosa 2 M y se recogieron 10 ml a una DO(600 nm) de 0,4. Las células se lavaron con tampón de electroporación que contenía sacarosa 0,272 M, MgCh 1 mM y KH2PO4 7 mM y finalmente se resuspendieron en 250 pl de tampón de electroporación. La electroporación se realizó utilizando las siguientes condiciones: 1,2 kV, 150 u>, 50 pF. Después de esto, se añadió 1 ml de medio de electroporación y las células se incubaron durante 3 horas a 37 °C. Las células se colocaron en placas LB complementadas con kanamicina 20 mg/l y se incubaron durante 18 horas a 37 ° C. Los clones se verificaron como se describió anteriormente y se utilizaron para la generación de material para pruebas analíticas. Por lo tanto, las cepas se inocularon en una expresión estándar en condiciones de inducción de proteínas y se incubaron durante 30 horas a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se utilizaron para pruebas analíticas y de aplicación. En las Tablas 4 y 5 se muestran los genes y las características de las enzimas.
Tabla 4. Resumen de los genes que codifican las mananasas de la familia GH5 de Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus h mi ll l il i M 1 2 Vir i ill li PL2 .
Tabla 5. Resumen de las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de genes que codifican las mananasas de la familia GH5 de Bacillus clausii KSM-K16, Bacillus hemicellulosilyticus JCM 9152 y Virgibacillus soli PL205.
Ejemplo 3: Clonación por PCR de mananasas bacterianas man6 y man7 en Trichoderma reesei
En el aislamiento y tratamientos enzimáticos de ADN (por ejemplo, aislamiento del ADN plasmídico, digestión de ADN para producir fragmentos de ADN), en transformaciones de E. coli, secuenciación, etc., se utilizaron métodos estándar de biología molecular. Los métodos básicos utilizados fueron los descritos por el fabricante de la enzima, el reactivo o el kit o los descritos en el manual estándar de biología molecular, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001). El aislamiento de ADN genómico se realizó como describen con detalle Raeder y Broda (1985).
Man6 and man7 de Bacillus clausii y Bacillus hemicellulosilyticus, respectivamente, también se clonaron para su expresión en Trichoderma reesei Los genes se clonaron por PCR utilizando genes sintéticos con optimización de codones para Trichoderma reesei. Las secuencias de ADN que codifican los péptidos señal de man6 y man7, se eliminaron utilizando PCR y se crearon nuevos sitios de clonación. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 6 (SEQ ID NO: 21-24).
Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados como cebadores de PCR para amplificar genes mananasa de Bacillus hemicellulosil ticus Bacillus clausii.
Los genes se amplificaron por PCR con los cebadores descritos en la Tabla 6 y utilizando como moldes ADN sintéticos en las reacciones. Cada una de las mezclas de PCR de man6 de Bacillus clausii y de man7 de Bacillus hemicellulosilyticus contenía tampón HF 1x para la polimerasa Phusion HF (NEB/BioNordika, Finlandia), mezcla de dNTP 0,2 mM (Thermo Fisher Scientific, Finlandia), 1 pM de cada cebador, Dm SO al 3 % (Thermo Fisher Scientific), 1 unidad de polimerasa Phusion High-Fidelity (NEB/BioNordika, Finlandia) y 50 ng del ADN plasmídico correspondiente. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial durante 30 segundos a 98 °C, seguido de 28 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos de emparejamiento en uno de los siguientes 45/50/55/60 °C, extensión de 45 segundos a 72 °C y la extensión final a 72 °C durante 7 min.
La combinación de cebadores descrita en la Tabla 6 produjo productos de ADN específicos que tenían los tamaños esperados. Los productos de la PCR se aislaron del gel de agarosa con el kit de extracción de gel GenJet (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante, se digirieron con las enzimas de restricción Nrul y BamHI (Thermo Fisher Scientific) y se clonaron en un vector de expresión escindido con Nrul y BamHI. Las mezclas de ligamiento se transformaron en Escherichia coli XL1-Blue (AH Diagnostics) y se sembraron en placas con LB (Luria-Bertani) que contenía ampicilina 50-100 pg/ml. Se recogieron varias colonias de E. coli de las placas y el ADN se aisló con el kit GenJet Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific). Los clones positivos se exploraron utilizando digestiones con enzimas de restricción. Los genes que codificaban las mananasas de la familia GH5, man6 de Bacillus clausii y man7 de Bacillus hemicellulosilyticus, se secuenciaron sin sus propias secuencias codificantes del péptido señal y los plásmidos se denominaron pALK4274 y pALK4273, respectivamente (para detalles véase el Ejemplo 6).
Ejemplo 4: Clonación de mananasa bacteriana sintética man14
En el aislamiento y tratamientos enzimáticos de ADN (por ejemplo, aislamiento del ADN plasmídico, digestión de ADN para producir fragmentos de ADN), en transformaciones de E. coli, secuenciación, etc., se utilizaron métodos estándar de biología molecular. Los métodos básicos utilizados fueron los descritos por el fabricante de la enzima, el reactivo o el kit o los descritos en el manual estándar de biología molecular, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001). El aislamiento de ADN genómico se realizó como describen con detalle Raeder y Broda (1985).
El gen de mananasa man14 de Virgibacillus soli también se clonó para la expresión en Tricoderma. El gen que codifica la mananasa Man14 de la familia GH5 de Virgibacillus soli se ordenó de GenScript como una construcción sintética con optimización de codones para Trichoderma reesei.
El ADN plasmídico obtenido de GenScript, que incluía el gen man14 se resuspendió en agua estéril, se digirió con las enzimas de restricción Nrul y BamHI (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante y se clonaron en un vector de expresión escindido con Nrul y BamHI. La mezcla de ligamiento se transformó en Escherichia coli XL1-Blue (AH Diagnostics) y se sembró en placas con LB (Luria-Bertani) que contenía ampicilina 50-100 pg/ml. Se recogieron varias colonias de E. coli de las placas y el ADN se aisló con el kit GenJet Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific). Los clones positivos se exploraron utilizando digestiones con enzimas de restricción y se mostró que contenían insertos de tamaños esperados. Los sitios de fusión de man14 de Virgibacillus soli para el plásmido de expresión, se secuenciaron y el plásmido se denominó pALK4414 (para detalles, véase el Ejemplo 6).
Ejemplo 5: Producción de proteínas de mananasa GH5 bacteriana recombinantes en Bacillus
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de proteínas de mananasa GH5 (Man6, Man7 y Man14) recombinantes de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus y Virgibacillus soli. Los plásmidos de expresión construidos se enumeran en la Tabla 7. Los genes de GH5 (man6, man7 and man 14) recombinantes, sin sus propias secuencias de señal, se fusionaron al promotor PaprE de Bacillus licheniformis y el péptido señal de la xilanasa de B. amyloliquefaciens. La terminación de la transcripción se garantizó mediante un terminador fuerte y se utilizó un marcador de resistencia a kanamicina para la selección de los transformantes. Las transformaciones se realizaron como se describe en el Ejemplo 2.
Tabla 7. Plásmidos de expresión construidos para producir las proteínas Man6, Man7 y Man14 recombinantes de B ill l ii B ill h mi ll l il i Vir i ill li n n x r i n B ill r i .
La producción de GH5 de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz de agitación. Los transformantes se inocularon de las placas LB a matraces de agitación que contenían glucosa al 2 %, polvo de macerado de maíz al 6 %, (NH4)2HPO4 al 1,3 %, MgSO4 al 0,05 % x 7H2O y CaCl2 al 0,5 %. El pH se ajustó a pH 7,5. La producción de proteína GH5 de los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo después de cultivarlos durante 30 horas a 37 °C, 180 rpm. La producción heteróloga de proteínas recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE con posterior tinción con Coomassie. Los mejores transformantes de producción se seleccionaron para cultivarse en biorreactores a escala de laboratorio. Los transformantes se cultivaron en biorreactores a 37 °C en condiciones de inducción de proteínas y suministro adicional hasta que se alcanzó un rendimiento adecuado. Los sobrenadantes se recuperaron para pruebas de aplicación por centrifugación o filtración.
Ejemplo 6: Producción de proteínas de mananasa GH5 bacterianas recombinantes en Trichoderma reesei
Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de proteínas de mananasa GH5 (Man6, Man7 y Man14) recombinantes de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus y Virgibacillus soli (véanse los ejemplos 3 y 4) en Trichoderma reesei. Los plásmidos de expresión construidos se enumeran en la Tabla 8. Los genes de GH5 (man6, man7 y man14) recombinantes, sin sus propias secuencias señal, se fusionaron al promotor cel7A/cbh1 de T. reesei con el transportador y enlazador CMB cel6A/cbh2 de T. reesei seguido del sitio de reconocimiento de la proteasa Kex2. La terminación de la transcripción se garantizó mediante el terminador cel7A/cbh1 de T. reesei y para la selección de los transformantes se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans como se describe en Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión lineal (Fig. 2) se aislaron de las cadenas principales del vector después de digestiones con NotI y se transformaron en protoplastos de T. Reesei. Las cepas hospedadoras utilizadas no producen ninguna de las cuatro celulasas principales de T. reesei(CBHI, CBHII, EGI, EGII). Las transformaciones se realizaron como en Penttila. et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen. et al. (1993), seleccionando acetamidasa como única fuente de nitrógeno (gen marcador amdS). Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de esporularlos en PD.
Tabla 8. Se construyeron casetes de expresión para producir proteínas recombinantes Man6, Man7 y Man14 de Bacillus clausii, Bacillus hemicellulosilyticus y Virgibacillus soli en Trichoderma reesei. La estructura general de los casetes de expresión fue como se describe en la Fig. 2.
La producción de mananasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz de agitación. Los transformantes se inocularon de las inclinaciones de PD a matraces de agitación que contenían 50 ml de medio inductor de celulasa basado en lactosa compleja (JJoutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4. al 5 %. La producción de proteína GH5 de los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo después de cultivarlos durante 7 días a 30 °C, 250 rpm. La producción heteróloga de proteínas recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE con posterior tinción con Coomassie. Los mejores transformantes de producción se seleccionaron para cultivarse en biorreactores a escala de laboratorio. Los transformantes se cultivaron en biorreactores en forma discontinua o mediante un tipo de proceso de suministro adicional en condiciones de inducción de proteínas a una temperatura típica de cultivo de hongos mesófilos y en condiciones ligeramente ácidas. El cultivo continuó hasta el agotamiento de los azúcares en el medio o hasta que se alcanzó el rendimiento adecuado. Los sobrenadantes se recuperaron para pruebas de aplicación por centrifugación o por filtración.
Ejemplo 7: Ensayo de actividad galactomananasa mediante el método con DNS
La actividad mananasa (MNU) se midió como la liberación de azúcares reductores del galactomanano (0,3 % p/p) a 50 °C y pH 7,0 en 5 min. La cantidad de carbohidratos reductores liberados se determinó espectrofotométricamente utilizando ácido dinitrosalicílico. El sustrato (0,3 % p/p) utilizado en el ensayo se preparó de la siguiente manera: 0,6 g de goma de algarrobo (Sigma G-0753) estaban en tampón de citrato de sodio 50 mM, pH 7 (o tampón de fosfato de citrato, pH 7) a aproximadamente 80 °C utilizando un termoagitador magnético y se calentaron hasta el punto de ebullición. La solución se enfrió y se dejó disolver durante la noche en sala refrigerada (2-8 °C) con agitación continua y los residuos insolubles se eliminaron por centrifugación. Después, esa solución se llenó hasta 200 ml con tampón. El sustrato se conservó congelado y se fundió por calentamiento en un baño de agua hirviendo a aproximadamente 80 °C, se enfrió a temperatura ambiente y se mezcló cuidadosamente antes de usarlo. El reactivo DNS utilizado en el ensayo se preparó disolviendo 50 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico (Sigma D-550) en aproximadamente 4 litros de agua. Con agitación magnética continua, se añadieron gradualmente 80,0 g de NaOH y se dejaron disolver. Una cantidad de 1500 g de sal de Rochelle (tartrato de K-Na, Merck 8087) se añadió en pequeñas porciones con agitación continua. La solución que podría haberse calentado con precaución a una temperatura máxima de 45 °C, se enfrió a temperatura ambiente y se llenó hasta 5000 ml. Después de eso, se filtró a través de un filtro de papel Whatman No.1 y se conservó en un frasco oscuro a temperatura ambiente. La reacción se inició primero añadiendo 1,8 ml de solución de sustrato a cada uno de los dos tubos de ensayo y se dejó equilibrar a 50 °C durante 5 minutos después de lo cual 200 pl de solución de enzima diluida adecuadamente se añadieron a uno de los tubos, se mezcló bien con un mezclador vorticial y se incubó exactamente durante 5 minutos a 50 °C. Los blancos enzimáticos no necesitaban equilibrarse o incubarse. La reacción se detuvo añadiendo 3,0 ml de reactivo DNS en ambos tubos y se mezcló. Se añadieron 200 pl de solución de muestra a los tubos blancos enzimáticos. Ambos tubos se colocaron en un baño de agua hirviendo. Después de hervir durante exactamente 5 minutos, los tubos se colocaron en un baño de agua fría y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. La absorbancia de la muestra se midió contra el blanco enzimático a 540 nm y se leyó la actividad de la curva de calibración y se multiplicó por el factor de dilución. Una muestra diluida adecuada produjo una diferencia de absorbancia de 0,15 a 0,4. Se preparó una curva estándar 20 mM a partir de la solución madre de manosa disolviendo 360 mg de manosa (SigmaM-6020, conservada en un evaporador) en tampón de ensayo y diluida en soluciones que contenían 3, 6, 10 y 14 pmol/ml de manosa. Los estándares se manejaron como las muestras, solo que se incubaron a 50 °C. Las absorbancias se midieron contra el blanco de reactivo (que contenía tampón en lugar de la dilución estándar de manosa) a 540 nm. Para cada serie de ensayos se construyó una curva de calibración. Una unidad de mananasa (MNU) se definió como la cantidad de enzima que produce carbohidratos reductores que tienen un poder reductor correspondiente a un nmol de manosa de galactomanano en un segundo en las condiciones de ensayo (1 MNU = 1nkat).
Ejemplo 8: Purificación de mananasa Man6
Las células y los sólidos se eliminaron del medio de cultivo de fermentación mediante centrifugación durante 10 minutos, 4000 g a 4 °C. Para la purificación de la proteína se utilizaron 10 ml de sobrenadante. La muestra se filtró a través de una membrana de PVDf de 0,44 pm (Millex-HV, Merck Millipore Ltd, Carrigtwohill, IRL). El filtrado se cargó en una columna desalinizadora HiPrep 26/10 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) equilibrada en HEPES 20 mM pH 7. La muestra desalada se cargó después en una columna HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) pre equilibrada con HEPES 20 mM pH 7. Después de cargar la muestra, la columna se lavó con el mismo tampón para 20 ml. Las proteínas se eluyeron con gradiente de sal lineal HEPES 20 mM, NaCl 500 mM pH 7 en 15 CV. Se recogieron fracciones de 5 ml y se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían la proteína diana se combinaron y se concentraron a 2 ml utilizando los dispositivos de ultrafiltración Vivaspin 20, 10 kDa MWCO (GE Healthcare). La muestra concentrada se fraccionó adicionalmente utilizando una columna de filtración en gel Superdex
75 26/60 equilibrada con MES 20 mM, NaCI 200 mM, pH 6,5. Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían mananasa pura se combinaron. Otras mananasas se purificaron utilizando el mismo protocolo, pero cambiando la composición del tampón en las etapas de desalinización e intercambio iónico. Las composiciones de tampón se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9. Tam ones utilizados en la cromato rafía de intercambio iónico
El contenido enzimático de la muestra purificada se determinó utilizando medidas de absorbancia UV de 280 nm. Los coeficientes de excitación para cada mananasa se calcularon sobre las bases de la secuencia de aminoácidos de la enzima utilizando ExPASy Server http://web.expasy.org/protparam/. (Gasteiger E et al 2005). La actividad de la enzima (MNU) de las muestras purificadas se midió como la liberación de azúcares reductores como se describe en el Ejemplo 7. La actividad específica (MNU/mg) de las mananasas se calculó dividiendo la actividad MNU de la muestra purificada entre la cantidad de enzima purificada. Los valores obtenidos se utilizaron para calcular las dosis de enzimas utilizadas en los Ejemplos 10 y 11.
Perfiles de pH de las mananasas
Los perfiles de pH de las mananasas purificadas se determinaron utilizando el ensayo de comprimidos de betamanazima con galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina (T-MNZ 11/14) de Megazyme con pequeñas modificaciones en el protocolo sugerido. La linealidad del ensayo se verificó con cada una de las enzimas purificadas. El ensayo se realizó en tampón de Britton-Robinson 40 mM ajustado a valores de pH entre 4 y 11. La solución enzimática se diluyó en el tampón de ensayo y 500 pl de solución enzimática se equilibraron en un baño de agua a 50 °C durante 5 minutos antes de añadir un comprimido de sustrato. Después de 10 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 10 ml de Tris al 2 % a pH 12. Los tubos de reacción se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos, se agitaron y el líquido se filtró a través de un filtro de papel Whatman No.1. La eliminación de tinte azul del sustrato se cuantificó midiendo la absorbancia a 595 nm. La actividad enzimática a cada pH se refirió como actividad relativa en la que la actividad al pH óptimo se estableció en 100 %. Los perfiles de pH se muestran en la Figura 3.
La actividad relativa (%) de la mananasa se calculó dividiendo la actividad mananasa de una muestra entre la actividad mananasa de una muestra de referencia. En el caso del perfil de pH, la muestra de referencia es una muestra con el pH óptimo. En el caso del perfil de temperatura, la muestra de referencia es una muestra a la temperatura óptima.
Perfiles de temperatura de las mananasas
La temperatura óptima de las mananasas purificadas se determinó utilizando el ensayo de comprimidos de betamanazima con galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina (T-MNZ 11/14) de Megazyme con pequeñas modificaciones en el protocolo sugerido. El ensayo se realizó a temperaturas que variaban entre 30-90 ° C durante 10 minutos en un tampón de Britton-Robinson 40 mM, pH 7. La actividad enzimática se informó como actividad relativa donde la actividad a temperatura óptima se estableció en 100%. Los perfiles de temperatura se muestran en la Figura 4.
Temperatura y pH característicos de las mananasas
La Man6 tiene una masa molecular entre 30-35 kDa. La temperatura óptima de la enzima a pH 7 es de 50 °C a 70 °C. Dicha enzima tiene un pH óptimo en el intervalo de pH de al menos pH 6 a pH 9 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 minutos y como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina.
La Man7 tiene una masa molecular entre 50-55 kDa. La temperatura óptima de la enzima a pH 7 es de 50 °C a 70 °C. Dicha enzima tiene un pH óptimo en el intervalo de pH de al menos pH 7 a pH 10 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 minutos y como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina.
La Man14 tiene una masa molecular entre 30-40 kDa. La temperatura óptima de la enzima a pH 7 es de 50 °C a 70 °C. Dicha enzima tiene un pH óptimo en el intervalo de pH de al menos pH 7 a pH 8 a 50 °C. La temperatura óptima y el pH óptimo se determinaron utilizando un tiempo de reacción de 10 minutos y como sustrato se utilizó galactomanano de algarrobo entrecruzado con azurina.
Ejemplo 9: Rendimiento de eliminación de manchas de las mananasas Man6 y Man7 con detergentes comerciales sin agentes de blanqueamiento
Las mananasas Man6 y Man7 producidas en Bacillus (como se describe en el Ejemplo 5) y en Tricoderma (como se describe en el Ejemplo 6), se sometieron a ensayo con respecto a su capacidad para eliminar manchas estándar sensibles a mananasa a 40 ° C y con una dureza del agua de 16 °dH con detergentes comerciales sin agentes de blanqueamiento y se comparó con la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 l (Novozymes ). Se utilizaron los siguientes paños de ensayo del Center for testmaterial B.V. (Países Bajos) manchados artificialmente: Pudin de chocolate mananasa sensible sobre algodón (E-165), Goma de algarrobo, con pigmento sobre algodón (CS-73) y sobre poliéster/algodón (PC-S-73) y goma guar con negro de carbón sobre algodón (CS-43). La tela se cortó en muestras de 6 cm x 6 cm y en el ensayo se utilizaron 2 piezas de cada una de ellas.
Se utilizó detergente A líquido comercial para uso industrial que contenía todas las otras enzimas, salvo mananasa, a una concentración de 4,4 g por litro de líquido de lavado y se utilizó detergente en polvo comercial para ropa de color sin enzimas a 3,8 g/l. Se preparó detergente que contenía líquido de lavado en agua de grifo sintética con una dureza de 16 °dH. Se añadieron proteasa Savinase® 16 l (0,5 %p/p) y amilasa Stainzyme® 12 l (0,4 %p/p) al agua dura utilizada con detergente en polvo comercial para ropa de color, el detergente líquido ya contenía amilasa y proteasa. El pH del líquido de lavado del detergente en polvo para ropa de color era de aproximadamente 10 y con el detergente líquido de aproximadamente 8,3.
Las dosificaciones de mananasa estaban en el intervalo de 0-0,2/0,25 % del peso del detergente, pero para la evaluación, las dosificaciones se calcularon como unidades de actividad enzimática (MNU) por ml de líquido de lavado o como mg de proteína enzimática activa (PEA) por l de líquido de lavado. La actividad se midió como se describe en el Ejemplo 7. El contenido de PEA de cada preparación se calculó dividiendo la actividad enzimática entre la actividad específica, definida en el Ejemplo 8. La muestra de control contenía la solución de detergente pero no mananasa.
Para agua de grifo sintética con una dureza de 16 °dH, se prepararon las siguientes soluciones madre en agua desionizada (Milli-Q o equivalente):
Solución madre con una dureza de 1000 °dH al calcio: CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA, Alemania) 26,22 g/l
Solución madre con una dureza de 200 °dH al magnesio: MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA, Alemania) 8,79 g/l H2O
Solución madre de NaHCO3: NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Alemania) 29,6 g/l
Se añadieron 13,3 ml de solución de CaCl2, 13,3 ml de solución de MgSO4 y 10,0 ml de solución de NaHCO3 recién preparada en un matraz volumétrico en el orden indicado, hasta 1 litro con agua desionizada y se mezclaron. La dureza del agua se determinó por valoración complejométrica y se encontró que era correcta.
Los tratamientos de eliminación de manchas se realizaron en un Launder-Ometer Atlas LP-2 de la siguiente manera. En primer lugar, el Launder-Ometer se precalentó a 40 °C. Después, en recipientes de 1,2 litros, se añadió detergente, 250 ml de agua de grifo sintética con una dureza de 16 °dH y enzima diluida (<1,0 ml). Se añadieron manchas y el Launder-Ometer se activó a 40 °C durante 60 minutos con una velocidad de rotación de 42 rpm. Después de eso, las muestras se enjuagaron cuidadosamente con agua corriente y se secaron durante la noche en aire interior, en una rejilla protegida contra la luz solar. El efecto de eliminación de manchas se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia con el espectrofotómetro Fúngicas Minolta CM-3610A utilizando las coordenadas de espacio de color L*a*b* (iluminación d 65/10°, corte de 420 nm). La desaparición de las manchas, que indica el rendimiento de las mananasas (eficiencia de eliminación de manchas), se calculó como AL* (delta L*), lo que significa valor de luminosidad L* de la tela tratada con enzima menos valor de luminosidad L* de la tela tratada con líquido de lavado sin mananasa (control). Los resultados finales (efecto de eliminación total de la mancha) se mostraron como la suma de AL* de cada mancha. Los valores de color de cada mancha fueron un promedio de 2 muestras. Los resultados obtenidos con detergente líquido comercial se muestran en las Figs. 6-7. Las mananasas según la invención, tienen un rendimiento de eliminación de manchas similar (Man6) o considerablemente mejor (Man7) con detergente líquido cuando se dosifican como unidades de actividad o como proteína enzimática activa en comparación con la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 l. Se obtuvo un rendimiento similar con Man6 y Man7 independientemente del hospedador de expresión, Bacillus o Trichoderma (Fig 6). Los resultados obtenidos con el detergente en polvo comercial para ropa de color (Figs. 8-9) muestran que las mananasas según la invención tienen un mejor rendimiento de eliminación de manchas con el polvo detergente de color cuando se dosifican como unidades de actividad o como proteína enzimática activa en comparación con la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 l.
Ejemplo 10: Rendimiento de eliminación de manchas de las mananasas Man6 y Man7 con detergente que contiene blanqueador
La capacidad de las mananasas Man6 y Man7 producidas en Bacillus (como se describe en el Ejemplo 5) para eliminar manchas estándar sensibles a mananasa, se sometió a ensayo a una temperatura de 40 °C y una dureza del agua de 16 °dH con detergente en polvo comercial con blanqueador y se comparó con la preparación comercial de mananasa
Mannaway® 4,0 l (Novozymes). El sistema de ensayo fue similar al descrito en el Ejemplo 9, solo que se utilizaron 3 paños de ensayo diferentes del Center for testmaterial B.V. (Países Bajos) manchados artificialmente: Pudin de chocolate mananasa sensible sobre algodón (E-165), Goma de algarrobo, con pigmento sobre algodón (C-S-73) y goma guar con negro de carbón sobre algodón (CS-43). El detergente en polvo comercial para ropa de color se utilizó a una concentración de 4,2 g por litro de líquido de lavado y el pH del líquido de lavado fue de aprox. 9,5. Al agua dura utilizada en el ensayo, se añadió proteasa Savinase® 16 l (0,5 % p/p) y amilasa Stainzyme® 12 l (0,4 % p/p), ya que el detergente no contenía enzimas. El color de las muestras después del tratamiento se midió y los resultados se calcularon como la suma de AL* de cada una de las 3 manchas como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados (Fig. 10) obtenidos con detergente comercial que contiene blanqueador, indican que la mananasa según la invención (Man7) tiene un rendimiento de eliminación de manchas considerablemente mejor en comparación con la mananasa comercial Mannaway® 4,0 l cuando se dosifica como proteína enzimática activa. Con Man6 se obtiene al menos un rendimiento similar en comparación con una mananasa bacteriana comercial.
Ejemplo 11: Rendimiento de eliminación de manchas de la mananasa Man14 con detergente líquido comercial
La capacidad de la mananasa Man14 producida en Bacillus (como se describe en el Ejemplo 5) para eliminar manchas estándar sensibles a mananasa, se sometió a ensayo a una temperatura de 40 °C y una dureza del agua de 16 °dH con detergente B líquido comercial de uso industrial y se comparó con la preparación comercial de mananasa Mannaway® 4,0 l (Novozymes). El sistema de ensayo fue similar al descrito en el Ejemplo 9, solo que se utilizaron dos paños de ensayo diferentes del Center for testmaterial B.V. (Países Bajos) manchados artificialmente: Pudin de chocolate mananasa sensible sobre algodón (E-165) y goma de algarrobo, con pigmento sobre algodón (CS-73). El detergente B líquido comercial para uso industrial se utilizó a una concentración de 5 g por litro de líquido de lavado y el pH del líquido de lavado fue de aprox. 8,3. Al agua dura utilizada en el ensayo, se añadió proteasa Savinase® 16 l (0,5 % p/p) y amilasa Stainzyme® 12 l (0,4 % p/p), ya que el detergente no contenía enzimas. El color de las muestras después del tratamiento se midió y los resultados se calcularon como la suma de AL* de cada una de las 2 manchas como se describe en el Ejemplo 9. Los resultados (Figs. 11-12) obtenidos con detergente que contiene líquido comercial indican que Man14 tuvo un buen rendimiento en un detergente líquido, comparable al producto comercial, cuando se dosifica como unidades de actividad o como proteína enzimática activa.
Ejemplo 12: Estabilidad de las mananasas Man6 y Man7 en detergentes líquidos comerciales
La estabilidad de las preparaciones de mananasa Man6 y Man7 producidas en Bacillus se sometieron a ensayo en detergente líquido OMO para ropa de color adquirido en el supermercado local y se comparó con la de la preparación de mananasa comercial Mannaway® 4,0 l. Se añadieron preparaciones de mananasa al 0,5 % p/p en detergentes y las muestras se incubaron a 37 °C, durante 5 semanas, en tubos de plástico con tapa. La actividad se midió a determinados intervalos con el ensayo de actividad descrito en el Ejemplo 7, solo que se utilizó un tiempo de incubación de 30 minutos. Los resultados se calcularon como actividad residual (%), que se obtuvo dividendo la actividad de una muestra tomada en cierto punto de tiempo entre la actividad inicial de la muestra. La estabilidad de Man7 producida tanto en Bacillus como en Tricoderma y la de Man6 producida en Tricoderma se sometió a ensayo contra Mannaway® 4,0 l también en un detergente líquido A de uso industrial que contenía proteasa pero no mananasa. En este ensayo, se utilizaron mananasas al 1 % (p/p) y se incubaron muestras a 37 °C durante 12 semanas. Los resultados en el detergente Omo para ropa de color (Fig. 13) muestran que, en comparación con la preparación Mannaway® 4,0 l, Man6 tuvo una estabilidad considerablemente mejor y Man7 una estabilidad similar. Tanto Man7 como especialmente Man6, fueron más estables que la preparación Mannaway® 4,0 l con otro detergente A líquido comercial, tal como se muestra en la figura 14. Los resultados obtenidos en otro ensayo en las mismas condiciones mostraron que Man6 tenía una estabilidad similar independientemente del hospedador de expresión, Bacillus o Trichoderma (datos no mostrados). Los resultados de los experimentos de estabilidad muestran que la mananasa según la invención es estable en detergentes durante varias semanas, incluso cuando se conserva a alta temperatura como 37 °C. La estabilidad de las mananasas (Man6 y Man7) según la invención se mejora en comparación con la de una mananasa bacteriana comercial en detergente líquido.
Ejemplo 13: Rendimiento de lavado de composiciones de detergente líquido según la invención
El rendimiento de lavado de composiciones de detergente líquido según la presente invención se determinó utilizando manchas estandarizadas que pueden obtenerse en el CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen, Países Bajos ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing
agency, Testmaterials], San Gallen, Suiza ("EMPA") y Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, Condado de Durham ("Equest").
Como formulación base se utilizó un agente de lavado líquido con la siguiente composición (todos los valores se dan en porcentaje en peso):
En función de esta formulación base, la composición 2 de detergente líquido se preparó añadiendo la enzima respectiva como se indica a continuación:
Composición 2: Enzima según la SEC ID N°: 16 (Man7)
El lavado se realizó de la siguiente manera según el Método AISE: 3,5 kg de paño de lastre limpio, 4 Paños SBL, lavadora Miele, programa corto a 20 °C y 40 °C.
Todas las mananasas se añadieron en las mismas cantidades en función del contenido total de proteínas.
La relación de dosificación del agente de lavado líquido fue de 4,0 gramos por litro de líquido de lavado. El procedimiento de lavado se realizó durante 60 minutos a una temperatura de 20 °C y 40 °C, teniendo el agua una dureza de entre 15,5 y 16,5 ° (grados alemanes de dureza).
Los resultados obtenidos son los valores de diferencia entre las unidades de remisión obtenidas con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contiene la mananasa de referencia disponible en el comercio (Mannaway 4,0 l, obtenida de Novozymes). Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado de las composiciones de detergente que comprenden las mananasas de la presente invención en comparación con la misma composición de detergente que comprende la mananasa de referencia. En el ensayo de lavado se ensayó una gran variedad de manchas.
La blancura, es decir, el brillo de las manchas, se determinó fotométricamente como una indicación del rendimiento de lavado. Se utilizó un dispositivo espectrométrico Minolta CM508d, que se calibró de antemano utilizando un patrón blanco proporcionado con la unidad.
Los resultados obtenidos son los valores de diferencia entre las unidades de remisión obtenidas con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contiene las combinaciones de enzimas. Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado debido a las combinaciones de enzimas presentes en el detergente. Las mananasas de la invención en composiciones de detergente muestran un rendimiento mejorado en una variedad de manchas ue com renden manano.
continuación
Ejemplo 14: Rendimiento de lavado de las composiciones de detergente en polvo según la invención
El rendimiento de lavado de las composiciones de detergente en polvo según la presente invención se determinó utilizando manchas estandarizadas que pueden obtenerse en el CFT (Center for Testmaterials) B.V., Vlaardingen,
Países Bajos ("CFT"), Eidgenossische Material- und Prüfanstalt Testmaterialien AG [Federal materials and testing agency, Testmaterials], San Gallen, Suiza ("EMPA") Warwick Equest Ltd Unit 55, Consett Business Park, Consett, Condado de Durham ("Equest").
Como formulación base se utilizó un agente de lavado sólido con la siguiente composición (todos los valores se dan en porcentaje en peso):
En función de esta formulación base, la composición de detergente sólida 4 se preparó añadiendo las enzimas respectivas como se indica a continuación:
Composición 4: Enzima según la SEC ID N°: 16 (Man7)
El lavado se realizó de la siguiente manera según el Método AISE: 3,5 kg de paño de lastre limpio, 4 Paños SBL, lavadora Miele, programa corto a 20 °C y 40 °C. Todas las mananasas se añadieron en las mismas cantidades en función del contenido total de proteínas.
La relación de dosificación del agente de lavado en polvo fue de 3,8 gramos por litro de líquido de lavado. El procedimiento de lavado se realizó durante 60 minutos a una temperatura de 20 °C y 40 °C, teniendo el agua una dureza de entre 15,5 y 16,5 ° (grados alemanes de dureza).
La blancura, es decir, el brillo de las manchas, se determinó fotométricamente como una indicación del rendimiento de lavado. Se utilizó un dispositivo espectrométrico Minolta CM508d, que se calibró de antemano utilizando un patrón blanco proporcionado con la unidad.
Los resultados obtenidos son los valores de diferencia entre las unidades de remisión obtenidas con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contiene la mananasa de referencia (Mannaway 4,0 l, obtenida de Novozymes). Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado de las variantes en el detergente. Las mananasas de la invención muestran un rendimiento mejorado sobre diversas manchas. Por lo tanto, es evidente que las mananasas según la invención muestran un rendimiento de lavado mejorado en comparación con Mannaway.
Claims (9)
1. Una composición de detergente que comprende al menos una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 74 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, en el que la al menos una enzima tiene actividad degradativa de manano.
2. La composición de detergente de la reivindicación 1, en la que la al menos una enzima tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
3. La composición de detergente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, comprendiendo la composición además una o más enzimas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, pectato liasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanasa, lacasa y/o peroxidasa.
4. La composición de detergente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición está en forma de una pastilla, un comprimido homogéneo, un comprimido que tiene dos o más capas, una bolsa que tiene uno o más compartimentos, un polvo regular o compacto, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado.
5. La composición detergente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición de detergente es una composición de detergente de lavandería, preferentemente una composición de detergente de lavandería líquida o sólida.
6. Uso de una composición de detergente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para degradar manano.
7. Uso de una composición de detergente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un proceso de lavandería.
8. Un método para eliminar una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición de detergente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Un método para degradar manano que comprende aplicar al manano una composición de detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que, preferentemente, el manano está en la superficie de un textil.
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