BR112021014812A2 - Variantes de subtilase e composições compreendendo as mesmas - Google Patents

Variantes de subtilase e composições compreendendo as mesmas Download PDF

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Abstract

variantes de subtilase e composições compreendendo as mesmas. são proporcionadas variantes de subtilase tendo estabilidade melhorada, composições detergentes compreendendo as variantes, uso das variantes e composições detergentes em um processo de limpeza tal como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras tal como lavagem de louça e métodos de produção das variantes.

Description

“VARIANTES DE SUBTILASE E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO AS MESMAS” Referência a uma Listagem de Sequências Este pedido contém uma listagem de sequências em formato legível por computador, que é incorporada aqui por referência.
ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção se relaciona com variantes de subtilase, composições compreendendo as variantes, polinucleotídeos codificando as variantes, métodos de produção das variantes e métodos de uso das variantes e composições.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO As subtilisinas são serina proteases da família S8, em particular da subfamília S8A, como definido pela base de dados MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml). Na subfamília S8A, os resíduos-chave do local ativo Asp, His e Ser são tipicamente encontrados em motivos que diferem daqueles da subfamília S8B. Na indústria dos detergentes, as enzimas têm sido implementadas há muitas décadas em formulações para lavagem. As enzimas usadas em tais formulações compreendem proteases, lipases, amilases, celulases, manosidases bem como outras enzimas ou suas misturas. Comercialmente, as enzimas mais importantes são as proteases. Um número crescente de proteases comercialmente usadas para, p.ex., detergentes para lavagem de roupa e lavagem de louça são variantes manipuladas por proteínas de proteases de tipo selvagem ocorrendo naturalmente. Adicionalmente outras variantes de subtilase foram descritas na técnica com alterações em relação a uma subtilase parental resultando em melhorias tais como melhor desempenho de lavagem, estabilidade térmica, estabilidade no armazenamento ou atividade catalítica. No entanto, vários fatores tornam vantajosa a melhoria adicional de proteases. Por exemplo, as condições de lavagem tais como temperatura e pH tendem a mudar ao longo do tempo e são também diferentes em diferentes países ou regiões do mundo, e muitas manchas são ainda difíceis de remover completamente sob condições de lavagem convencionais. Um outro desafio nas composições detergentes é a estabilidade das enzimas, uma vez que os componentes químicos destas composições,
bem como as condições de pH, temperatura e umidade tendem frequentemente a inativar as enzimas. Adicionalmente, as condições de lavagem podem também resultar na inativação das enzimas (devido a, p.ex., pH, temperatura ou instabilidade por quelação), resultando em perda de desempenho de lavagem durante o ciclo para lavagem. Assim, apesar da investigação intensiva no desenvolvimento de proteases, permanece uma necessidade de proteases novas e melhoradas que tenham estabilidade melhorada, por exemplo estabilidade no armazenamento melhorada, p.ex., em uma composição detergente, e que ao mesmo tempo tenham desempenho de lavagem similar ou melhorado em comparação com a subtilase parental. A presente invenção aborda estes desafios ao proporcionar novas variantes de subtilase tendo propriedades vantajosas em termos de estabilidade e desempenho de lavagem.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção se relaciona com novas variantes de subtilase adequadas para uso em, p.ex., composições detergentes, em que as variantes compreendem substituições pelo menos nas posições 9, 19 e 62 em relação a SEQ ID NO: 1, em particular as substituições S9R+R19L+N62D, por exemplo as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P. A presente invenção se relaciona também com composições compreendendo as variantes, em particular composições detergentes, polinucleotídeos codificando as variantes; construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção das variantes.
Visão global das sequências SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos da protease subtilisina 309, também conhecida como Savinase®. SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos da subtilisina BPN´.
Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um alinhamento das sequências de aminoácidos da subtilisina 309 (SEQ ID NO: 1) e subtilisina BPN´ (SEQ ID NO: 2).
DEFINIÇÕES Subtilase/protease: Os termos “subtilase” e “protease” podem ser usados indistintamente aqui e se referem a uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo em proteínas. Isto inclui qualquer enzima pertencendo ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses) e, em particular, endopeptidases (EC
3.4.21). O número EC se refere à Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. Atividade de protease: O termo “atividade de protease” significa uma atividade proteolítica (EC 3.4), em particular atividade de endopeptidase (EC 3.4.21). Existem vários tipos de atividade de protease, sendo os três principais tipos de atividade: tipo tripsina, onde existe clivagem de substratos de amida após Arg ou Lys em P1, tipo quimotripsina, onde a clivagem ocorre após um dos aminoácidos hidrofóbicos em P1, e tipo elastase com clivagem após uma Ala em P1. A atividade de protease pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito em WO 2016/087619. As variantes de subtilase da presente invenção têm preferencialmente pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações gênicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene. cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA carece de sequências de íntrons que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro. Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante.
As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA.
A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.
Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção.
Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) do ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si.
Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição.
Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional.
As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.
Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós- transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção.
Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam sua expressão.
Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de subtilase.
Um tal fragmento contém preferencialmente pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% do número de aminoácidos em SEQ ID NO: 1. Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.
O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
Propriedade melhorada: O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com a protease parental, a protease com SEQ ID NO: 1 ou uma protease de referência selecionada tal como uma variante de SEQ ID NO: 1. Tais propriedades melhoradas podem incluir, mas não estão limitadas a, eficiência catalítica, taxa catalítica, estabilidade química, estabilidade na oxidação, atividade de pH, estabilidade de pH, atividade específica, estabilidade sob condições de armazenamento, ligação ao substrato, clivagem do substrato, especificidade do substrato, estabilidade do substrato, propriedades de superfície, atividade térmica e termoestabilidade.
Em um aspecto da presente invenção, a propriedade melhorada é estabilidade melhorada, por exemplo termoestabilidade melhorada ou estabilidade no armazenamento melhorada em uma formulação detergente ou um tampão de estresse de pH definido.
Em um outro aspecto da invenção, a propriedade melhorada é desempenho de lavagem melhorado.
Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza.
Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que está pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
Polipeptídeo maduro: O termo “polipéptido maduro” significa um polipéptido na sua forma madura após processamento N-terminal (p.ex., remoção do peptídeo-sinal). Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro que tem atividade de subtilase.
Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.
Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que de outro modo não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle. Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante. Parente ou subtilase/protease parental: O termo “parente” ou “subtilase parental” ou “protease parental” significa qualquer polipeptídeo com atividade de subtilase ao qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O parente pode ser um polipeptídeo ocorrendo naturalmente (de tipo selvagem) ou sua uma variante de um polipeptídeo de tipo selvagem. Em uma modalidade particular, o parente é uma protease com pelo menos 75% de identidade, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO:
1. Alternativamente, o parente pode ter 100% de identidade com SEQ ID NO: 1. Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”. Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento) Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology
Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior.
Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento) Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de subtilase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais posições.
Uma substituição significa troca do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.
Subtilase de tipo selvagem: O termo subtilase de “tipo selvagem” significa uma subtilase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza.
Convenções para Designação de Variantes Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em uma variante de subtilase da invenção.
Isto é explicado em mais detalhe adicionalmente em baixo sob o cabeçalho “Numeração de posições/resíduos de aminoácidos”. A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em uma outra subtilase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372- 374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.
Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência.
É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC aceite.
Os termos “alteração” ou “mutação” podem ser usados indistintamente aqui para se referirem a substituições, inserções e deleções.
Substituições.
Para uma substituição de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído.
Por exemplo, a substituição de uma treonina na posição 220 por alanina é designada como “Thr220Ala” ou “T220A”. As substituições múltiplas podem ser separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Thr220Ala + Gly229Val” ou “T220A + G229V”, representando substituições nas posições 220 e 229 de treonina (T) por alanina (A) e glicina (G) por valina (V), respectivamente.
As substituições múltiplas podem alternativamente ser listadas com mutações individuais separadas por um espaço ou uma vírgula.
As substituições alternativas em uma posição particular podem ser indicadas com uma barra (“/”). Por exemplo, a substituição da treonina na posição 220 por alanina, valina ou leucina pode ser designada “T220A/V/L”. As substituições podem ser também indicadas com um “X” precedendo um número de posição, o que significa que qualquer aminoácido original em uma subtilase parental sem ser a subtilase de SEQ ID NO: 1 pode estar substituído na posição indicada correspondente na subtilase parental.
Por exemplo, “X19L” significa que qualquer resíduo de aminoácidos na posição 19 de uma subtilase parental sem ser L está substituído por L.
Deleções.
Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de treonina na posição 220 é designada como “Thr220*” ou “T220*”. As deleções múltiplas podem ser separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Thr220* + Gly229*” ou “T220* + G229*” ou, alternativamente, podem ser separadas por um espaço ou vírgula.
O uso de um “X” precedendo um número de posição é como descrito acima para substituições, p.ex., “X131*” significa que o resíduo de aminoácido na posição 131 está deletado.
Inserções.
Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido.
Conformemente, a inserção de lisina após treonina na posição 220 é designada “Thr220ThrLys” ou “T220TK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após treonina na posição 220 é indicada como “Thr220ThrLysAla” ou “T220TKA”. Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim: Parente: Variante: 220 220 220a 220b T T - K - A Alterações múltiplas. As variantes compreendendo alterações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), p.ex., “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente. As alterações múltiplas podem alternativamente ser listadas com mutações individuais separadas por um espaço ou uma vírgula. Alterações diferentes. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes podem ser separadas por uma vírgula, p.ex., “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala", “Tyr167Ala+Arg170Gly” e “Tyr167Ala+Arg170Ala”. As alterações diferentes em uma posição podem ser também indicadas com uma barra (“/”), por exemplo “T220A/V/L” como explicado acima. Alternativamente, as alterações diferentes podem ser indicadas usando parêntesis, p.ex., Arg170[Tyr, Gly] ou no código de uma letra R170 [Y,G]. Numeração de posições/resíduos de aminoácidos. Os números das posições de aminoácidos como usados aqui são baseados na numeração do polipeptídeo BPN´ de SEQ ID NO: 2. Assim, as posições de aminoácidos de um polipeptídeo protease parental tendo, p.ex., SEQ ID NO: 1 são aquelas das posições correspondentes de SEQ ID NO:
2. Este sistema de numeração é convencional na técnica, onde os números de posição usados para as subtilisina proteases na literatura de patentes são frequentemente baseados nos números de posição correspondentes de BPN´. Especificamente, a numeração é baseada no alinhamento na Tabela 1 de WO 89/06279, que mostra um alinhamento de cinco proteases, incluindo o polipeptídeo maduro da sequência de subtilase BPN´ (BASBPN) (sequência c na tabela) e o polipeptídeo maduro da subtilisina 309 de Bacillus lentus, também conhecido como Savinase® (BLSAVI) (sequência a na tabela).
A Figura 1 acompanhante é proporcionada para propósitos de referência e mostra um alinhamento entre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, com base na Tabela 1 de WO 89/06279, a partir da qual os números de posição correspondendo às posições de SEQ ID NO: 2 podem ser prontamente determinados. Para uma protease parental sem ser SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácidos de uma outra protease pode ser similarmente alinhada com SEQ ID NO: 2 para determinar os números de posição de aminoácidos correspondendo à numeração de SEQ ID NO: 2.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Variantes Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com variante de subtilase compreendendo as substituições X9R+X19L+X62D, em que (a) os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; (b) a variante tem atividade de protease; e (c) a variante tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; e com a condição de que a variante não compreende um resíduo de histidina na posição 14. Em um aspecto particular, a presente invenção se relaciona com variante de subtilase compreendendo as substituições X3T+X9R+X19L+X62D+X194P, em que (a) os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; (b) a variante tem atividade de protease; e (c) a variante tem pelo menos 80% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade deste aspecto, as substituições X3T+X9R+X19L+X62D+X194P são S3T+S9R+R19L+N62D+A194P. Assim, em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P.
Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P.
Em algumas modalidades, a variante de subtilase compreende adicionalmente pelo menos uma alteração selecionada do grupo consistindo em N43R, N76D, P131*, Q245R, S259D e R275Q, em que os números de posição correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Exemplos não limitantes de tais variantes são proporcionados em baixo.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P.
Como indicado acima, em um aspecto da invenção, as variantes de subtilase não compreendem um resíduo de histidina na posição 14.
Em uma modalidade do aspecto amplo da invenção descrito acima se relacionando com uma variante de subtilase compreendendo as substituições X9R+X19L+X62D, e onde a variante não compreende um resíduo de histidina na posição 14, as substituições X9R+X19L+X62D são S9R+R19L+N62D.
Em algumas modalidades deste aspecto, a variante de subtilase compreende adicionalmente pelo menos uma alteração selecionada do grupo consistindo em S3T, S3A, N43R, V68A, N76D, P131*, A194P, V205I, Q245R, S259D, N261D e R275Q, preferencialmente duas, três ou mais das referidas alterações, tais como quatro, cinco, seis ou mais das referidas alterações, em que os números de posição correspondem às posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Exemplos não limitantes de tais variantes são proporcionados em baixo.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*. Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% ou pelo menos 96% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+A15T+G61E+N62D+V68A+A194P+V205I+Q245R+N261D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+A15T+G61E+N62D+V68A+A194P+V205I+Q245R+N261D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% ou pelo menos 96% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+A15T+G61E+V68A+A194P+V205I+Q245R+S259D+N261D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+A15T+G61E+V68A+A194P+V205I+Q245R+S259D+N261D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N62D+P131*.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N62D+P131*. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%,
pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+Q245R+S259D+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P+Q245R+S259D.
Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e compreende as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P.
Em uma modalidade particular, a variante de subtilase compreende o ou consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P.
Em um aspecto, a variante de subtilase pode compreender 2-6, tal como 3, 4 ou 5, resíduos de histidina adicionados ao terminal N ou ao terminal C.
Um exemplo de uma tal variante é aquela que compreende SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+R275RHHHH, onde “R275RHHHH” indica quatro resíduos de histidina adicionais após o resíduo Arg C-terminal.
Adicionalmente às alterações de aminoácidos especificamente divulgadas aqui, uma variante de protease da invenção pode compreender alterações adicionais em uma ou mais outras posições.
Estas alterações adicionais podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação. Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Grupos de substituição conservativa comuns incluem, mas não estão limitados a: G=A=S; I=V=L=M; D=E; Y=F; e N=Q (onde, p.ex., “G=A=S” significa que estes três aminoácidos podem ser substituídos uns pelos outros). Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e similares. Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-
4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
Em um aspecto da invenção, a variante de protease tem pelo menos uma propriedade melhorada em comparação com uma protease de referência, onde a protease de referência pode, p.ex., ser a protease de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante.
Em uma modalidade, a variante de protease da invenção tem uma estabilidade melhorada, por exemplo termoestabilidade melhorada, estabilidade no armazenamento melhorada em uma formulação detergente ou estabilidade melhorada em um tampão de estresse de pH definido.
A estabilidade melhorada pode, p.ex., ser determinado como descrito nos exemplos aqui usando um dos ou ambos os seguintes ensaios: ● ensaio de estabilidade usando um tampão de estresse de pH baixo (pH 4,0) ● ensaio de estabilidade usando um tampão de estresse de pH elevado (pH 10,5) e LAS A estabilidade pode ser também medida como estabilidade em uma composição detergente, por exemplo em uma composição detergente em pó, p.ex., uma composição detergente para lavagem de roupa modelo em pó contendo os ingredientes estabelecidos na Tabela 3 aqui.
Por exemplo, uma variante de protease pode ser testada na composição detergente para lavagem de roupa modelo em pó da Tabela 3 em um ensaio de estabilidade no armazenamento acelerada, onde a composição detergente é armazenada durante, p.ex., 2 semanas ou 4 semanas a 37 °C e umidade relativa de 70%. Em este caso, a protease pode ser adicionada à composição detergente em pó na forma de um granulado, p.ex., compreendendo um revestimento tal como um revestimento de sal inorgânico; para mais informação ver em baixo sob o cabeçalho “Formulações detergentes granulares”. A atividade proteolítica é determinada antes do e após o armazenamento, e a atividade residual após o armazenamento é calculada com base na atividade inicial.
A atividade proteolítica pode ser determinada usando o ensaio de atividade de Suc-AAPF-pNA; ver em baixo na seção dos exemplos uma descrição deste ensaio.
Uma estabilidade melhorada pode, p.ex., ser expressa como um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF), que é calculado como a meia-vida de uma variante de protease em relação à meia-vida de uma protease de referência.
Em uma modalidade, a estabilidade de uma variante de protease da invenção é determinada como um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF) em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D.
Em esta modalidade, a variante de protease da invenção tem preferencialmente um fator de melhoria da meia-vida de pelo menos cerca de 1,2, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,5, tal como pelo menos cerca de 2,0, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9 ou pelo menos cerca de 10, em pelo menos um ensaio de estabilidade.
Em uma modalidade, a variante de protease da invenção tem um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF), em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D, de pelo menos cerca de 2, tal como pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9 ou pelo menos cerca de 10, no ensaio de estabilidade de pH baixo descrito no Exemplo 2 aqui.
Em uma modalidade, a variante de protease da invenção tem um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF), em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D, de pelo menos cerca de 1,2, preferencialmente pelo menos cerca de 1,3, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,4, tal como pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3 ou pelo menos cerca de 4, no ensaio de estabilidade de pH elevado + LAS descrito no Exemplo 2 aqui.
Em uma modalidade preferencial, a variante de protease da invenção tem uma estabilidade melhorada tanto no ensaio de estabilidade de pH baixo como no ensaio de estabilidade de pH elevado + LAS descrito no Exemplo 2 aqui.
Por exemplo, a variante de protease pode ter um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF), em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D, de pelo menos cerca de 2, tal como pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9 ou pelo menos cerca de 10, no ensaio de estabilidade de pH baixo descrito no Exemplo 2 aqui; e um fator de melhoria da meia-vida (T½ IF), em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D, de pelo menos cerca de 1,2, preferencialmente pelo menos cerca de 1,3, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,4, tal como pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3 ou pelo menos cerca de 4, no ensaio de estabilidade de pH elevado + LAS descrito no Exemplo 2 aqui.
Em uma outra modalidade, a variante de protease da invenção tem preferencialmente um fator de melhoria da meia-vida, em relação à meia-vida de uma variante de SEQ ID NO: 1 tendo as substituições S9R, P14H, R19L e N62D, de pelo menos cerca de 1,2, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,5, tal como pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou pelo menos cerca de 5, em um ensaio de estabilidade no armazenamento acelerada em uma composição detergente em pó.
O ensaio de estabilidade no armazenamento acelerada pode por exemplo compreender armazenamento durante, p.ex., 2 semanas ou 4 semanas a 37 °C e uma umidade relativa de 70%, onde a enzima é adicionada à composição detergente em pó na forma de um granulado, p.ex., compreendendo um revestimento tal como um revestimento de sal inorgânico; para mais informação ver em baixo sob o cabeçalho “Formulações detergentes granulares”. Em um outro aspecto da invenção, a variante de protease tem um desempenho de lavagem que é melhorado em comparação com aquele de uma protease de referência, onde a protease de referência pode, p.ex., ser a protease de SEQ ID NO: 1. Um desempenho de lavagem melhorado em este contexto pode ser definido como um desempenho de lavagem relativo melhorado na mancha EMPA117EH, por exemplo determinado com o ensaio de AMSA como descrito no Exemplo 3 aqui usando uma concentração de protease de 10 nM ou 20 nM e em comparação com uma protease de referência com SEQ ID NO: 1, de pelo menos cerca de 1,1, preferencialmente pelo menos cerca de 1,2, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,3, tal como pelo menos cerca de 1,4, pelo menos cerca de 1,5 ou pelo menos cerca de 1,6. Em uma modalidade, a variante de protease tem um desempenho de lavagem relativo melhorado na mancha PC-03, por exemplo determinado com o ensaio de AMSA como descrito no Exemplo 3 aqui usando uma concentração de protease de 10 nM ou 20 nM e em comparação com uma protease de referência com SEQ ID NO: 1, de pelo menos cerca de 1,0, tal como pelo menos cerca de 1,1, preferencialmente pelo menos cerca de 1,2, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,3, tal como pelo menos cerca de 1,4. Em uma outra modalidade, o desempenho de lavagem melhorado pode ser definido como um desempenho de lavagem relativo em qualquer uma das manchas PC- 03, PC-05, EMPA116 e/ou EMPA117EH, determinado com o ensaio de TOM como descrito no Exemplo 4 aqui em comparação com uma protease de referência com SEQ ID NO: 1, de pelo menos cerca de 1,2, preferencialmente pelo menos cerca de 1,3, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1,4, tal como pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 1,6, pelo menos cerca de 1,7, pelo menos cerca de 1,8, pelo menos cerca de 1,9 ou pelo menos cerca de 2.0. O desempenho de lavagem melhorado em TOM em relação a SEQ ID NO: 1 pode, por exemplo, ser um desempenho de lavagem relativo de pelo menos cerca de 1,5, pelo menos cerca de 1,8, pelo menos cerca de 2,0 ou pelo menos cerca de 2,2 na mancha EMPA117EH e/ou na mancha PC-03.
Subtilases parentais A subtilase parental de uma variante da invenção será tipicamente uma protease que tem pelo menos 75% de identidade com a subtilase de SEQ ID NO: 1. Em modalidades preferenciais, a subtilase parental pode ter pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 1, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO:
1. Alternativamente, a subtilase parental pode ter uma sequência que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1. O parente pode assim, por exemplo, ter a sequência da subtilase de SEQ ID NO: 1 ou, alternativamente, pode ser uma variante de SEQ ID NO: 1. O parente pode ser também uma subtilase relacionada, p.ex., da família S8A tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 como indicado acima. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos do parente pode por exemplo diferir em até 20 aminoácidos, tal como até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. A subtilase parente pode ser também um fragmento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 que tem atividade de protease ou uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. A subtilase parental pode ser obtida de um microrganismo de qualquer gênero adequado, em particular de um gênero de bactéria adequado. A subtilase parental é assim tipicamente uma subtilase bacteriana. Por exemplo, o parente pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como uma subtilase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces ou um polipeptídeo bacteriano Gram- negativo tal como uma subtilase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma.
Em uma modalidade, o parente é obtido de uma espécie de Bacillus. O parente pode assim, p.ex., ser uma subtilase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis Em uma modalidade, o parente é uma protease derivada de Bacillus lentus ou uma sua variante, p.ex., a protease de SEQ ID NO: 1. As estirpes destas espécies são prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). O parente pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubo, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, adubo, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um parente pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que um polinucleotídeo codificando um parente tenha sido detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., Molecular Cloning; 3ª Ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Preparação de Variantes A presente invenção se relaciona também com métodos para obtenção de uma variante de subtilase como descrito aqui. Uma modalidade se relaciona com um método para obtenção de uma variante de subtilase, o método compreendendo: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante de uma protease parental compreendendo as mutações X9R+X19L+X62D em comparação com SEQ ID NO: 1, em que os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80% mas menos do que 100%, e com a condição de que a variante não compreende um resíduo de histidina na posição 14; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas para expressão da variante; e (c) recuperar a variante. Em uma modalidade particular, o método para obtenção de uma variante de subtilase compreende: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante de uma protease parental compreendendo as mutações X3T+X9R+X19L+X62D+X194P em comparação com SEQ ID NO: 1, em que os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante tem atividade de protease e uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80% mas menos do que 100%; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas para expressão da variante; e (c) recuperar a variante. As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de gene sintético, construção de gene semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento de DNA, etc. Para informação sobre o uso destas técnicas de mutagênese ver, p.ex., WO 2017/207762. Será entendido que o método para obtenção de uma variante de subtilase se destina a englobar a expressão e recuperação de variantes tendo qualquer combinação de mutações divulgadas acima sob o cabeçalho “Variantes”.
Polinucleotídeos A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando uma variante da presente invenção.
Construtos de Ácido Nucleico A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar e otimizar a expressão de uma variante. Técnicas para a modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica. Estas incluem, p.ex., o uso de sequências de controle tais como promotores, terminadores da transcrição, regiões estabilizantes de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante, regiões codificantes do peptídeo-sinal, sequências codificantes do pré-peptídeo e sequências reguladoras. Para informação adicional ver, p.ex., WO 2017/207762.
Vetores de Expressão A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e controle podem ser unidas em conjunto para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição para permitir inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor adequado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado. Para informação sobre vetores de expressão ver, p.ex., WO 2017/207762.
Células Hospedeiras A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes compreendendo uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de forma a que o construto ou vetor seja mantido como integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando a variante e sua fonte. A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, p.ex., um procariota ou um eucariota. A célula hospedeira procariótica será tipicamente uma bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa, tal como uma bactéria Gram-positiva selecionada de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces ou uma bactéria Gram-negativa selecionada de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma. A célula hospedeira bacteriana pode, p.ex., ser uma célula de Bacillus selecionada de células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis Para informação sobre células hospedeiras adequadas ver, p.ex., WO 2017/207762.
Métodos de produção A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperar a variante. As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente a partir do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisados de células. A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos das variantes com atividade de protease e pode ser recuperada e purificada usando métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., WO 2017/207762 para informação adicional.
Composições A invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma variante de subtilase da invenção, p.ex., uma composição detergente ou de limpeza. A invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma variante de subtilase da invenção e compreendendo adicionalmente: um ou mais componentes detergentes; e/ou uma ou mais enzimas adicionais. Em uma modalidade preferencial, a composição é uma composição detergente compreendendo um ou mais componentes detergentes, em particular um ou mais componentes detergentes não ocorrendo naturalmente. A presente invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma variante de subtilase da presente invenção e compreendendo adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo em amilases, catalases, celulases (p.ex., endoglucanases), cutinases, haloperoxigenases, lipases, mananases, pectinases, pectina liases, peroxidases, proteases, xantanases, liquenases e xiloglucanases ou qualquer sua mistura. Uma composição detergente pode, p.ex., estar na forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Em uma modalidade preferencial, a composição detergente é uma composição em pó. A invenção se relaciona também com o uso de uma composição da presente em um processo de limpeza, tal como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras tal como lavagem de louça. A escolha de componentes adicionais para uma composição detergente está dentro da perícia do especialista e inclui ingredientes convencionais, incluindo os componentes não limitantes exemplificativos estabelecidos em baixo. A escolha de componentes pode incluir, para cuidado de tecidos, a consideração do tipo de tecido a ser limpo, o tipo e/ou grau de sujidade, a temperatura à qual a limpeza é para ter lugar e a formulação do produto detergente.
Em uma modalidade particular, uma composição detergente compreende uma variante de subtilase da invenção e um ou mais componentes detergentes não ocorrendo naturalmente, tais como tensoativos, hidrótropos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes quelantes, sistema lixiviante ou componentes lixiviantes, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes branqueadores fluorescentes, perfume, abrilhantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujidade, polímeros de liberação da sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, antioxidantes e solubilizantes.
Em uma modalidade, a variante de subtilase da invenção pode ser adicionada a uma composição detergente em uma quantidade correspondendo a 0,01-200 mg de proteína enzimática por litro de licor para lavagem, preferencialmente 0,05-50 mg de proteína enzimática por litro de licor para lavagem, em particular 0,1-10 mg de proteína enzimática por litro de licor para lavagem.
Uma composição para lavagem de louça automática (ADW) pode por exemplo incluir 0,001%-30%, tal como 0,01%-20%, tal como 0,1-15%, tal como 0,5-10%, de proteína enzimática em peso da composição.
Uma composição granulada para lavagem de roupa pode por exemplo incluir 0,001%-20%, tal como 0,01%-10%, tal como 0,05%-5%, de proteína enzimática em peso da composição.
Uma composição líquida para lavagem de roupa pode por exemplo incluir 0,0001%-10%, tal como 0,001-7%, tal como 0,1%-5%, de proteína enzimática em peso da composição.
As enzimas tais como a variante de subtilase da invenção podem ser estabilizadas usando agentes estabilizantes convencionais, p.ex., um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, p.ex., um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborônico tal como ácido 4-formilfenilborônico, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708 ou as variantes de acordo com a invenção podem ser estabilizadas usando cetonas ou aldeídos de peptídeo tal como descrito em WO 2005/105826 e WO 2009/118375. As variantes de subtilase da invenção podem ser formuladas em composições líquidas para lavagem de roupa tais como uma composição líquida para lavagem de roupa compreendendo: a) pelo menos 0,01 mg de variante de subtilase ativa por litro de detergente, b) 2% em peso a 60% em peso de pelo menos um tensoativo c) 5% em peso a 50% em peso de pelo menos um adjuvante A composição detergente pode ser formulada em um detergente granular para lavagem de roupa. Tal detergente pode compreender; a) pelo menos 0,01 mg de variante de protease ativa por grama de composição b) tensoativo aniônico, preferencialmente 5% em peso a 50% em peso c) tensoativo não iônico, preferencialmente 1% em peso a 8% em peso d) adjuvante, preferencialmente, 5% em peso a 40% em peso, tal como carbonatos, zeólitos, adjuvante de fosfato, adjuvantes sequestrantes de cálcio ou agentes complexantes. Embora os componentes mencionados em baixo estejam categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, isto não é para ser interpretado como uma limitação, pois um componente pode compreender funcionalidades adicionais como será apreciado pela pessoa perita na técnica.
Tensoativos A composição detergente pode compreender um ou mais tensoativos, que podem ser aniônicos e/ou catiônicos e/ou não iônicos e/ou semipolares e/ou zwitteriônicos ou uma sua mistura. Em uma modalidade particular, a composição detergente inclui uma mistura de um ou mais tensoativos não iônicos e um ou mais tensoativos aniônicos. O(s) tensoativo(s) está(ão) tipicamente presente(s) a um nível de cerca de 0,1% a 60% em peso, tal como cerca de 1% a cerca de 40%, ou cerca de 3% a cerca de 20% ou cerca de 3% a cerca de 10%. O(s) tensoativo(s) é(são) escolhido(s) com base na aplicação de limpeza desejada e inclui qualquer(quaisquer) tensoativo(s) convencional(ais) conhecido(s) na técnica. Pode ser utilizado qualquer tensoativo conhecido na técnica para uso em detergentes. Os tensoativos diminuem a tensão superficial no detergente, o que permite que a mancha sendo limpa seja levantada e dispersada e depois separada por lavagem. Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1% a cerca de 40% em peso, tal como de cerca de 5% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 5% a cerca de 15%, ou de cerca de 20% a cerca de 25% de um tensoativo aniônico.
Exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa- olefinassulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-di- ilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), étersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, ésteres de metila de ácido graxo alfa-sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico de dodecenila/tetradecenila (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão e suas combinações.
Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo catiônico.
Exemplos não limitantes de tensoativos catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de amônio quaternário alcoxilado (AQA) e suas combinações.
Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0,2% a cerca de 40% em peso de um tensoativo não iônico, por exemplo de cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular de cerca de 1% a cerca de 20%, de cerca de 3% a cerca de 10%, tal como de cerca de 3% a cerca de 5% ou de cerca de 8% a cerca de 12%. Exemplos não limitantes de tensoativos não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, álcoois graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilado, como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamida de ácido graxo propoxilada (PFAM), amidas poli- idroxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina de N-acila e N-alquila (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob os nomes comerciais SPAN e TWEEN, e suas combinações.
Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0%
a cerca de 10% em peso de um tensoativo semipolar. Exemplos não limitantes de tensoativos semipolares incluem óxidos de amina (AO) tais como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(coco alquila)-N,N-dimetilamina e óxido de amina N- (sebo-alquila)-N,N-bis(2-hidroxietila), alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas e suas combinações. Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo zwitteriônico. Exemplos não limitantes de tensoativos zwitteriônicos incluem betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína e suas combinações.
Adjuvantes e Coadjuvantes A composição detergente pode conter cerca de 0-65% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 45%, de um adjuvante ou coadjuvante de detergente ou uma sua mistura. Em um detergente para lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40-65%, particularmente 50-65%. Os adjuvantes e os quelantes amaciam, p.ex., a água de lavagem por remoção dos íons de metal do líquido. O adjuvante e/ou o coadjuvante podem ser particularmente um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser utilizado qualquer adjuvante e/ou coadjuvante conhecido na técnica para uso em detergentes para lavagem de roupa. Exemplos não limitantes de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tais como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos tais como carbonato de sódio, silicatos solúveis tais como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (p.ex., SKS-6 da Hoechst), etanolaminas tais como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, também conhecido como iminodietanol), trietanolamina (TEA, também conhecida como 2,2’,2”- nitrilotrietanol) e inulina de carboximetila (CMI) e suas combinações. A composição detergente pode conter também 0-20% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 10%, de um coadjuvante de detergente ou uma sua mistura. A composição detergente pode incluir um coadjuvante sozinho ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante de zeólito. Exemplos não limitantes de coadjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, tais como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Exemplos não limitantes adicionais incluem citrato, quelantes tais como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos e ácido alquil- ou alquenilsuccínico. Exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), ácido iminodissuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’-dissuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1- hidroxietano-1,1-difosfônico (HEDP), etilenodiaminatetra-(ácido metilenofosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminapentaquis(ácido metilenofosfônico) (DTPMPA ou DTMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico- ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspártico-ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N- monopropiônico (ASMP), ácido iminodissuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil)-aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)-aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil)-glutâmico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil)-glutâmico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido α-alanina-N,N-diacético (α-ALDA), ácido serina-N,N-diacético (SEDA), ácido isosserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido N,N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N,N-diacético (SLDA), ácido taurina-N,N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N-(2- hidroxietil)-etilidenodiamina-N,N’,N’-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), dietilenotriamina penta(ácido metilenofosfônico) (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP) e suas combinações e sais. Adjuvantes e/ou coadjuvantes exemplificativos adicionais são descritos em, p.ex., WO 2009/102854 e US 5,977,053. As variantes de subtilase da invenção podem ser também formuladas em uma composição para lavagem de louça, preferencialmente uma composição para lavagem de louça automática (ADW), compreendendo: a) pelo menos 0,01 mg de variante de protease ativa de acordo com a invenção e b) 10-50% em peso de adjuvante preferencialmente selecionado de ácido cítrico, ácido metilglicina-N,N-diacético (MGDA) e/ou ácido glutâmico-ácido N,N- diacético (GLDA) e suas misturas e c) pelo menos um componente lixiviante.
Sistemas Lixiviantes O detergente pode conter 0-50% em peso, tal como cerca de 0,1% a cerca de 25%, de um sistema lixiviante. Os sistemas lixiviantes removem a descoloração frequentemente por oxidação, e muitas lixívias têm também fortes propriedades bactericidas e são usadas para desinfeção e esterilização. Pode ser utilizado qualquer sistema lixiviante conhecido na técnica para uso em detergentes para lavagem de roupa. Componentes de sistema lixiviante adequados incluem catalisadores lixiviantes, fotolixiviantes, ativadores lixiviantes, fontes de peróxido de hidrogênio tais como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré-formados e suas misturas.
Perácidos pré-formados adequados incluem, mas não estão limitados a, ácidos e sais peroxicarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo, Oxone®, e suas misturas.
Exemplos não limitantes de sistemas lixiviantes incluem sistemas lixiviantes à base de peróxido, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico, incluindo sais de metal alcalino tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetra-hidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato, em combinação com um ativador lixiviante formador de perácido.
O termo ativador lixiviante se entende aqui como um composto que reage com lixívia de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido.
O perácido assim formado constitui a lixívia ativada.
Ativadores lixiviantes adequados a serem usados aqui incluem aqueles pertencendo à classe de amidas, imidas ou anidridos de éster.
Exemplos adequados são diamina de tetracetiletileno (TAED), 4-[(3,5,5-trimetil- hexanoil)óxi]benzenossulfonato de sódio (ISONOBS), ácido diperoxidodecanoico, 4- (dodecanoilóxi)benzenossulfonato (LOBS), 4-(decanoilóxi)benzenossulfonato, 4- (decanoilóxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoilóxi)-benzenossulfonato (NOBS) e/ou aqueles divulgados em WO 98/17767. Uma família particular de ativadores lixiviantes de interesse foi divulgada em EP 624154 e particularmente preferencial em essa família é citrato de acetiltrietila (ATC). ATC ou um triglicerídeo de cadeia curta como triacetina tem a vantagem de ser amigo do ambiente pois acaba por se degradar em ácido cítrico e álcool.
Além do mais, o citrato de acetiltrietila e a triacetina têm boa estabilidade hidrolítica no produto após armazenamento e são ativadores lixiviantes eficazes.
Finalmente, ATC proporciona uma boa capacidade adjuvante ao aditivo de lavagem de roupa.
Alternativamente, o sistema lixiviante pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.
O sistema lixiviante pode também compreender perácidos tais como ácido 6-(ftalimido)peróxi-hexanoico (PAP). O sistema lixiviante pode incluir também um catalisador lixiviante ou um impulsionador.
Alguns exemplos não limitantes de catalisadores lixiviantes que podem ser usados nas composições da presente invenção incluem oxalato de manganês, acetato de manganês, manganês-colágeno, catalisadores de cobalto-amina e catalisadores de triazaciclononano de manganês (MnTACN); são particularmente preferenciais complexos de manganês com 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano (Me3-TACN) ou 1,2,4,7-tetrametil-1,4,7-triazaciclononano (Me4-TACN), em particular Me3-TACN, tal como o complexo de manganês dinuclear [(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2, e
[2,2',2''-nitrilotris(etano-1,2-di-ilazanillideno-κN-metanililideno)trifenolato-κ3O]manganês (III). Os catalisadores lixiviantes podem ser também outros compostos de metal, tais como complexos de ferro ou cobalto. Em algumas modalidades, o componente lixiviante pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo em catalisadores orgânicos tendo as seguintes fórmulas: (iii) e suas misturas; em que cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 24 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, preferencialmente cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 18 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-propil-heptila, 2-butiloctila, 2-pentilnonila, 2-hexildecila, n-dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila, n-octadecila, iso-nonila, iso-decila, iso-tridecila e iso-pentadecila. Outros sistemas lixiviantes exemplificativos são descritos, p.ex., em WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 e WO 2007/087242. Fotolixiviantes adequados podem por exemplo ser ftalocianina de zinco sulfonatada.
Hidrótopos Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou, de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter tanto hidrofílico como hidrofóbico (assim chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensoativos); no entanto, as estruturas moleculares dos hidrótopos não favorecem geralmente a autoagregação espontânea, ver, p.ex., revisão por Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótopos não exibem uma concentração crítica acima da qual a autoagregação ocorre como encontrado para tensoativos e lipídeos formando mesofases micelares, lamelares ou outras bem definidas. Ao invés, muitos hidrótopos mostram um processo de agregação do tipo contínuo onde os tamanhos dos agregados crescem à medida que a concentração aumenta. No entanto, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, estabilidade e propriedades coloidais de sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensoativos e polímeros. Os hidrótopos são classicamente usados em várias indústrias desde a indústria farmacêutica, cuidados pessoais e alimentar a aplicações técnicas. O uso de hidrótopos em composições detergentes permite por exemplo formulações de tensoativos mais concentradas (como no processo de compactação de detergentes líquidos por remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fases ou elevada viscosidade. O detergente pode conter 0-5% em peso, tal como cerca de 0,5 a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 5%, de um hidrótopo. Pode ser utilizado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitantes de hidrótopos incluem benzenossulfonato de sódio, p-toluenossulfonatos de sódio (STS), xilenossulfonatos de sódio (SXS), cumenossulfonatos de sódio (SCS), cimenossulfonato de sódio, óxidos de amina, álcoois e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftalenossulfonato de sódio, etil-hexilsulfato de sódio e suas combinações.
Polímeros O detergente pode conter 0-10% em peso, tal como 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% ou 0,2-1%, de um polímero. Pode ser utilizado qualquer polímero conhecido na técnica para uso em detergentes. O polímero pode funcionar como um coadjuvante como mencionado acima ou pode proporcionar antirredeposição, proteção das fibras, liberação de sujidade, inibição de transferência de corantes, limpeza de gorduras e/ou propriedades antiespumantes. Alguns polímeros podem ter mais do que uma das propriedades acima mencionadas e/ou mais do que um dos motivos mencionados em baixo. Polímeros exemplificativos incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli(álcool vinílico) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada, inulina de carboximetila (CMI) e policarboxilatos tais como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico, CMC hidrofobicamente modificada (HM-CMC) e silicones, copolímeros de ácido tereftálico e glicóis oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) e poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridina- N-óxido) (PVPO ou PVPNO) e polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Polímeros exemplificativos adicionais incluem policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno e óxido de polipropileno (PEO-PPO) e etóxi sulfato diquaternário. Outros polímeros exemplificativos são divulgados em, p.ex., WO 2006/130575. Sais dos polímeros mencionados acima estão também contemplados.
Agentes de matização de tecidos As composições detergentes da presente invenção podem incluir também agentes de matização de tecidos tais como corantes ou pigmentos, que quando formulados em composições detergentes podem se depositar em um tecido quando o tecido é contatado com um licor de lavagem compreendendo as composições detergentes e alterando assim a tonalidade do tecido através de absorção/reflexão da luz visível. Os agentes branqueadores fluorescentes emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de matização de tecidos alteram o tom de uma superfície pois absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Agentes de matização de tecidos adequados incluem corantes e conjugados de corante-argila e podem também incluir pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo em corantes estando dentro das classificações de Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas, por exemplo, como descrito em WO 2005/003274, WO 2005/003275, WO 2005/003276 e EP 1876226 (deste modo incorporadas por referência). A composição detergente compreende preferencialmente de cerca de 0,00003% por peso a cerca de 0,2% por peso, de cerca de 0,00008% por peso a cerca de 0,05% por peso, ou mesmo de cerca de 0,0001% por peso a cerca de 0,04% por peso, de agente de matização de tecidos. A composição pode compreender de 0,0001% em peso a 0,2% em peso de agente de matização de tecidos, isto pode ser especialmente preferencial quando a composição estiver na forma de uma bolsa de dose unitária. Agentes de matização adequados são também divulgados em, p.ex., WO 2007/087257 e WO 2007/087243.
Enzimas Adicionais Um aditivo detergente ou composição detergente compreendendo a variante de subtilase da invenção pode compreender uma ou mais enzimas tais como uma amilase, arabinase, carboidrase, celulase (p.ex., endoglucanase), cutinase, galactanase, haloperoxigenase, lipase, mananase, oxidase, p.ex., lacase e/ou peroxidase, pectinase, pectina liase, protease, xilanase, xantanase e xiloglucanase. As propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (p.ex., pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.).
Celulases As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou manipulados por proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p.ex., as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas em US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259. Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas em EP 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas em WO 94/07998, EP 531315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299. Exemplos de celulases exibindo atividade de endo-beta-1,4-glucanase (EC
3.2.1.4) são descritas em WO 02/99091. Outros exemplos de celulases incluem as celulases da família 45 descritas em WO 96/29397 e, especialmente, suas variantes tendo substituição, inserção e/ou deleção em uma ou mais das posições correspondendo às seguintes posições em SEQ ID NO: 8 de WO 02/99091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, e/ou 20, preferencialmente selecionadas entre P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H ou Q146 R. As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™ e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ e Puradax HA™ (Genencor International Inc.) e KAC- 500(B)™ (Kao Corporation).
Proteases A composição pode compreender uma ou mais proteases adicionais incluindo aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, p.ex., origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou manipulados por proteínas. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode ser por exemplo da família S1, tal como tripsina, ou da família S8 tal como subtilisina. Uma metaloproteases protease pode por exemplo ser uma termolisina, por exemplo, da família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8. Exemplos de metaloproteases são as metaloprotease neutras como descrito em WO 2007/044993 (Genencor Int.) tais como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens. Enzimas protease comercialmente disponíveis adequadas incluem aquelas vendidas sob os nomes registrados Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase®, Esperase® e Progress® Excel (Novozymes A/S), aquelas vendidos sob o nome registrado Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Opticlean® e Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist- Brocades N.V.), BLAP (sequência mostrada na Figura 29 de US5352604) e suas variantes (Henkel AG) e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) da Kao.
Lipases e Cutinases As lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídas enzimas mutantes quimicamente modificadas ou manipuladas por proteínas. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, p.ex., de T. lanuginosus (previamente chamada Humicola lanuginosa) como descrito em EP 258068 e EP 305216, cutinase de Humicola, p.ex., H. insolens (WO 96/13580), lipase de estirpes de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas Burkholderia), p.ex., P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), estirpe de P. sp. SD705 (WO 95/06720 & WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), lipases do tipo GDSL de Streptomyces (WO 2010/065455), cutinase de Magnaporthe grisea (WO 2010/107560), cutinase de Pseudomonas mendocina (US 5,389,536), lipase de Thermobifida fusca (WO 2011/084412), lipase de Geobacillus stearothermophilus (WO 2011/084417), lipase de Bacillus subtilis (WO 2011/084599) e lipase de Streptomyces griseus (WO 2011/150157) e S. pristinaespiralis (WO 2012/137147). Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas em EP
407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 2007/87508 e WO 2009/109500. Produtos de lipase comerciais preferenciais incluem LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (originalmente da Gist-Brocades). Ainda outros exemplos são lipases por vezes referidas como aciltransferases ou per-hidrolases, p.ex., aciltransferases com homologia com lipase A de Candida antarctica (WO 2010/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), per-hidrolases da família CE 7 (WO 2009/067279) e variantes da per- hidrolase de M. smegmatis, em particular a variante S54V usada no produto comercial Gentle Power Bleach da Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 2010/100028).
Amilases As amilases adequadas que podem ser usadas em conjunto com as variantes de subtilase da invenção podem ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e podem ser de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou manipulados por proteínas. As amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, p.ex., uma estirpe especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1,296,839. As amilases adequadas incluem amilases tendo SEQ ID NO: 2 em WO 95/10603 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3. Variantes preferenciais são descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 e SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444. Diferentes amilases adequadas incluem amilases tendo SEQ ID NO: 6 em WO 02/10355 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO:
6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193. Outras amilases que são adequadas são alfa-amilases híbridas compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO 2006/066594 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com as mesmas. Variantes preferenciais desta alfa-amilase híbrida são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 de SEQ ID NO: 4 são aquelas tendo as substituições: M197T; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
Outras amilases adequadas são amilases tendo a sequência de SEQ ID NO: 6 em WO 99/19467 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas tendo deleção nas posições R181 e G182 ou posições H183 e G184. Amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas tendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 de WO 96/23873 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476, usando SEQ ID 2 de WO 96/23873 para numeração.
Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção em duas posições selecionadas de 181, 182, 183 e 184, tais como 181 e 182, 182 e 183 ou posições 183 e 184. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476. Outras amilases que podem ser usadas são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO 2008/153815, SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 de WO 2008/153815 ou 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 e 264. Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO
2009/061380 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma truncação do terminal C e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo as substituições: N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K; S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; ou S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, em que as variantes são C-terminalmente truncadas e opcionalmente compreendem adicionalmente uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181. Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 de WO 2013/184577 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 e G477. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K e G477K e/ou uma deleção na posição R178 e/ou S179 ou de T180 e/ou G181. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 compreendem as substituições: E187P+I203Y+G476K E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K e opcionalmente compreendem adicionalmente uma substituição na posição 241 e/ou uma deleção na posição 178 e/ou posição 179. Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 de WO 2010/104675 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: N21, D97, V128 K177, R179, S180, I181, G182, M200, L204, E242, G477 e G478. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K e G478K e/ou uma deleção na posição R179 e/ou S180 ou de I181 e/ou G182. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 compreendem as substituições N21D+D97N+V128I e, opcionalmente, compreendem adicionalmente uma substituição na posição 200 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181. Outras amilases adequadas são a alfa-amilase tendo SEQ ID NO: 12 em WO 01/66712 ou uma variante tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 12. Variantes de amilase preferenciais são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID NO: 12 em WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. As amilases particularmente preferenciais incluem variantes tendo uma deleção de D183 e G184 e tendo as substituições R118K, N195F, R320K e R458K e uma variante tendo adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, o mais preferencial uma variante que tem adicionalmente substituições em todas estas posições. Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas em WO 2011/098531, WO 2013/001078 e WO 2013/001087. Amilases comercialmente disponíveis são DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM, StainzimaTM, Stainzima PlusTM, NatalaseTM, Liquozyme X e BANTM (da Novozymes A/S) e RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase, Preferenz S1000, Preferenz S100 e Preferenz S110 (da Genencor International Inc./DuPont).
Peroxidases/Oxidases As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou manipulados por proteínas. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, p.ex., de C. cinereus, e suas variantes como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes
A/S).
Materiais adjuntos Podem ser utilizados quaisquer componentes detergentes conhecidos na técnica para uso em detergentes para lavagem de roupa. Outros componentes detergentes opcionais incluem agentes anticorrosão, agentes antiencolhimento, agentes antirredeposição de sujidades, agentes antipregueamento, bactericidas, aglutinantes, inibidores de corrosão, agentes desintegrantes/de desintegração, corantes, estabilizantes de enzimas (incluindo ácido bórico, boratos, CMC e/ou polióis tais como propilenoglicol), condicionadores de tecidos incluindo argilas, enchimentos/auxiliares de processamento, agentes branqueadores fluorescentes/abrilhantadores ópticos, impulsionadores de espuma, reguladores de espuma (solução saponífera), perfumes, agentes de suspensão de sujidade, amaciantes, supressores de solução saponífera, inibidores de escurecimento e agentes de migração, sozinhos ou em combinação. Pode ser utilizado qualquer ingrediente conhecido na técnica para uso em detergentes para lavagem de roupa. A escolha de tais ingredientes está bem dentro da perícia do especialista. Dispersantes: As composições detergentes da presente invenção podem também conter dispersantes. Em particular, os detergentes em pó podem compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo ou copoliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Dispersantes adequados são por exemplo descritos em Powdered Detergents, Surfactant Science Series volume 71, Marcel Dekker, Inc., 1997. Agentes de Inibição de Transferência de Corantes: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes adequados incluem, mas não estão limitados a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N- óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma composição em questão, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes a níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso da composição. Agente branqueador fluorescente: As composições detergentes da presente invenção irão preferencialmente conter também componentes adicionais que podem tingir os artigos sendo limpos, tais como agente branqueador fluorescente ou abrilhantadores ópticos.
Onde presente, o abrilhantador está preferencialmente a um nível de cerca de 0,01% a cerca de 05%. Pode ser usado qualquer agente branqueador fluorescente adequado para uso em uma composição detergente para lavagem de roupa na composição da presente invenção.
Os agentes branqueadores fluorescentes mais comummente usados são aqueles pertencendo às classes de derivados de ácido diaminoestilbenossulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil- diestirila.
Exemplos do tipo derivado de ácido diaminoestilbenossulfônico de agentes de branqueamento fluorescente incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4- anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6- ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidróxi-etilamino)- s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2- il)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1-metil-2-hidróxi-etilamino)-s-triazin-6- ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato e 2-(estilbil-4"-nafto-1,2':4,5)-1,2,3-trizol-2"- sulfonato.
Agentes branqueadores fluorescentes preferenciais são Tinopal DMS e Tinopal CBS disponíveis a partir da Ciba-Geigy AG, Basileia, Suíça.
Tinopal DMS é o sal dissódico de dissulfonato de 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6- ilamino)estilbeno.
Tinopal CBS é o sal dissódico de dissulfonato de 2,2'-bis-(fenil- estirila). Agentes branqueadores fluorescentes são também preferenciais é o Parawhite KX comercialmente disponível, fornecidos pela Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia.
Outros produtos fluorescentes adequados para uso na invenção incluem as pirazolinas de 1-3-diarila e as 7-alquilaminocoumarinas.
Os níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de cerca de 0,01, de 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2% em peso, a níveis superiores de 0,5 ou mesmo 0,75% em peso.
Polímeros de liberação de sujidade: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais polímeros de liberação de sujidade que auxiliam na remoção de sujidades de tecidos tais como tecidos à base de algodão e poliéster, em particular na remoção de sujidades hidrofóbicas de tecidos à base de poliéster.
Os polímeros de liberação de sujidade podem por exemplo ser polímeros à base de tereftalato não iônicos ou aniônicos, caprolactama e polivinila e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinila, poliamidas de poliéster, ver por exemplo Capítulo 7 em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.
Um outro tipo de polímeros de liberação de sujidade são polímeros de limpeza de gordura alcoxilados anfifílicos compreendendo uma estrutura nuclear e uma pluralidade de grupos alcoxilato anexados a essa estrutura nuclear. A estrutura nuclear pode compreender uma estrutura de polialquilenimina ou uma estrutura de polialcanolamina como descrito em detalhe em WO 2009/087523 (deste modo incorporada por referência). Além do mais, os copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujidade adequados. Os copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhe em WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (deste modo incorporadas por referência). Outros polímeros de liberação de sujidade são estruturas de polissacarídeos substituídos, especialmente estruturas celulósicas substituídas tais como derivados celulósicos tais como aqueles descritos em EP 1867808 ou WO 03/040279 (ambas são deste modo incorporadas por referência). Polímeros celulósicos adequados incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose anionicamente modificada, celulose não ionicamente modificada, celulose cationicamente modificada, celulose zwitterionicamente modificada e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose de metila, celulose de carboximetila, celulose de etila, celulose de hidroxietila, celulose de hidroxipropilmetila, celulose de carboximetila de éster e suas misturas. Agentes antirredeposição: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes antirredeposição tais como carboximetilcelulose (CMC), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maleico e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros à base de celulose descritos sob polímeros de liberação da sujidade acima podem também funcionar como agentes antirredeposição. Outros materiais adjuntos adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes antiencolhimento, agentes antipregueamento, bactericidas, aglutinantes, transportadores, corantes, estabilizantes de enzimas, amaciadores de tecidos, enchimentos, reguladores de espuma, hidrótopos, perfumes, pigmentos, supressores de solução saponífera, solventes e estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes elastificantes da estrutura.
Formulação de Produtos Detergentes A(s) enzima(s) detergente(s), i.e., uma variante de subtilase da invenção e opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais, pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas.
Um aditivo detergente compreendendo uma ou mais enzimas pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta semiaquosa, etc.
Formulações de aditivos detergentes preferenciais incluem granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas semiaquosas.
A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, p.ex., uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel ou um líquido regular, compacto ou concentrado.
Existe um número de formas de formulação detergente tais como camadas (mesmas ou diferentes fases), bolsas, bem como formas para unidade de dosagem da máquina.
As bolsas podem ser configuradas como compartimentos únicos ou múltiplos.
Podem estar em qualquer forma, formato e material que sejam adequados para conter a composição, p.ex., sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contato com a água.
A bolsa é feita de filme solúvel em água que encerra um volume interior.
O volume interno pode ser dividido em compartimentos da bolsa.
Filmes preferenciais são materiais poliméricos, preferencialmente polímeros que são formados em um filme ou folha.
Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferenciais são selecionados de poliacrilatos e copolímeros de acrilato solúveis em água, celulose de metila, celulose de carboximetila, dextrina de sódio, celulose de etila, celulose de hidroxietila, celulose de hidroxipropilmetila, maltodextrina, polimetacrilatos, o mais preferencialmente copolímeros de álcool polivinílico, e celulose de hidroxipropilmetila (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímero no filme, por exemplo PVA, é pelo menos cerca de 60%. O peso molecular médio preferencial será tipicamente cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes podem ser também de composições de combinação compreendendo combinações de polímeros hidroliticamente degradáveis e solúveis em água tais como polilactídeo e álcool polivinílico (conhecidas sob a Referência comercial M8630 como vendido pela Chris Craft In.
Prod. de Gary, Indiana, EUA) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, propilenoglicol, sorbitol e suas misturas.
As bolsas podem compreender uma composição detergente sólida para lavagem de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida para limpeza ou componentes parciais separados pelo filme solúvel em água.
O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que compartimentos contendo sólidos.
Ver, p.ex., US 2009/0011970.
Os ingredientes de detergentes podem estar separados fisicamente uns dos outros por compartimentos em bolsas dissolvíveis em água ou em diferentes camadas de comprimidos. Deste modo pode ser evitada interação de armazenamento negativa entre componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem também dar origem a dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem. Um detergente líquido ou em gel que não está em dose unitária pode ser aquoso, contendo tipicamente pelo menos 20% em peso e até 95% de água, tal como até cerca de 70% de água, até cerca de 65% de água, até cerca de 55% de água, até cerca de 45% de água, até cerca de 35% de água. Outros tipos de líquidos, incluindo, sem limitação, alcanóis, aminas, dióis, éteres e polióis, podem ser incluídos em um líquido ou gel aquoso. Um detergente líquido ou em gel aquoso pode conter de 0-30% de solvente orgânico. Um detergente líquido ou em gel pode ser não aquoso.
Barras de Sabão para Lavagem de Roupa As enzimas da invenção podem ser adicionadas a barras de sabão para lavagem da roupa e usadas para lavagem à mão de roupa, tecidos e/ou têxteis. O termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui barras para lavagem de roupa, barras de sabão, barras combinadas, barras syndet e barras de detergente. Os tipos de barra diferem usualmente no tipo de tensoativo que contêm, e o termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui aquelas contendo sabões de ácidos graxos e/ou sabões sintéticos. A barra de sabão para lavagem de roupa tem uma forma física que é sólida e assim não um líquido, gel ou pó à temperatura ambiente. A barra de sabão para lavagem de roupa pode conter uma ou mais enzimas adicionais, inibidores de protease tais como aldeídos de peptídeo (ou aduto de hidrossulfito ou aduto de hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax e/ou derivados do ácido fenilborônico tais como ácido 4-formilfenilborônico, um ou mais sabões ou tensoativos sintéticos, polióis tais como glicerina, compostos de controle do pH tais como ácidos graxos, ácido cítrico, ácido acético e/ou ácido fórmico, e/ou um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico em que o cátion monovalente pode ser, por exemplo, Na+, K+ ou NH4+ e o ânion orgânico pode ser, por exemplo, formato, acetato, citrato ou lactato tal que o sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico possam ser, por exemplo, formato de sódio. A barra de sabão para lavagem de roupa contém agentes complexantes tais como EDTA e HEDP, perfumes e/ou diferentes tipos de enchimentos, tensoativos, p.ex.,
tensoativos sintéticos aniônicos, adjuvantes, agentes de liberação de sujidade poliméricos, quelantes de detergente, agentes estabilizantes, enchimentos, tintas, corantes, inibidores de transferência de corantes, policarbonatos alcoxilados, supressores de solução saponífera, estruturantes, aglutinantes, agentes lixiviantes, ativadores lixiviantes, agentes de remoção de solo argiloso, agentes antirredeposição, agentes dispersantes poliméricos, abrilhantadores, amaciadores de tecidos, perfumes e/ou outros compostos conhecidos na técnica. A barra de sabão para lavagem de roupa pode ser processada em equipamento convencional de fabricação de barras de sabão para lavagem de roupa tal como mas não se limitando a: misturadores, plodders, p.ex., um plodder a vácuo de duas etapas, extrusoras, cortadores, estampagem de logo, túneis de resfriamento e empacotadores. Uma pré-mistura contendo um sabão, a enzima da invenção, opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais, um inibidor de protease e um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico pode ser preparada e a mistura é depois extrudada. A enzima e as enzimas adicionais opcionais podem ser adicionadas ao mesmo tempo que o inibidor de protease, por exemplo na forma líquida. Para além do passo de mistura e do passo de plodding, o processo pode compreender adicionalmente os passos de moagem, extrusão, corte, estampagem, resfriamento e/ou empacotamento.
Formulações detergentes granulares As enzimas na forma de grânulos, compreendendo um núcleo contendo enzima e opcionalmente um ou mais revestimentos, são comummente usadas em detergentes granulares (em pó). Vários métodos para preparar o núcleo são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a) secagem por pulverização de uma solução contendo enzima líquida, b) produção de produtos em camadas com uma enzima revestida como uma camada em torno de uma partícula nuclear inerte pré-formada, p.ex., usando um dispositivo de leito fluidizado, c) absorção de uma enzima sobre a e/ou na superfície de um núcleo pré-formado, d) extrusão de uma pasta contendo enzima, e) suspensão de um pó contendo enzima em cera fundida e atomização para resultar em produtos perolizados, f) granulação por misturador por adição de um líquido contendo enzima a uma composição em pó seca de componentes de granulação, g) redução do tamanho de núcleos contendo enzima por moagem ou esmagamento de partículas maiores, péletes, etc., e h) granulação em leito fluidizado. Os núcleos contendo enzima podem ser secos, p.ex., usando um secador de leito fluidizado ou outros métodos conhecidos para secar grânulos na indústria das rações ou enzimas, para resultar em um conteúdo de água de tipicamente 0,1 - 10% p/p de água.
Os núcleos contendo enzimas são opcionalmente proporcionados com um revestimento para melhorar a estabilidade no armazenamento e/ou para reduzir a formação de poeiras.
Um tipo de revestimento que é frequentemente usado para granulados de enzima para detergentes é um revestimento de sal, tipicamente um revestimento de sal inorgânico, que pode, p.ex., ser aplicado como uma solução do sal usando um leito fluidizado.
Outros materiais de revestimento que podem ser usados são, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), celulose de metil-hidroxipropila (MHPC) e álcool polivinílico (PVA). Os grânulos podem conter mais do que um revestimento, por exemplo, um revestimento de sal seguido por um revestimento adicional de um material tal como PEG, MHPC ou PVA.
A presente invenção se relaciona assim também com grânulos/partículas de enzima compreendendo a subtilase da invenção.
Em uma modalidade, o grânulo compreende um núcleo e, opcionalmente, um ou mais revestimentos (camadas externas) rodeando o núcleo.
O núcleo pode ter um diâmetro, medido como diâmetro esférico equivalente (tamanho médio de partículas com base no volume), de 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
Em uma modalidade, o núcleo compreende um ou mais polipeptídeos tendo atividade de protease da presente invenção.
O núcleo pode incluir materiais adicionais tais como enchimentos, materiais de fibra (celulose ou fibras sintéticas), agentes estabilizantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensão, agentes reguladores da viscosidade, esferas de luz, plastificantes, sais, lubrificantes e fragrâncias.
O núcleo pode incluir um aglutinante, tal como polímero sintético, cera, gordura ou carboidrato.
O núcleo pode incluir um sal de um cátion multivalente, um agente redutor, um antioxidante, um catalisador para decomposição de peróxido e/ou um componente de tampão ácido, tipicamente como uma combinação homogênea.
O núcleo pode incluir uma partícula inerte com a enzima absorvida na mesma ou aplicada na superfície, p.ex., por revestimento em leito fluidizado.
O núcleo pode ter um diâmetro de 20-2000 µm, particularmente 50-1500 µm, 100-1500 µm ou 250-1200 µm.
O núcleo pode ser rodeado por pelo menos um revestimento, p.ex., para melhorar a estabilidade no armazenamento, para reduzir formação de poeiras durante o manuseamento ou para colorir o grânulo.
O(s) revestimento(s) opcional(ais) pode(m) incluir um revestimento de sal ou outros materiais de revestimento adequados, tais como polietilenoglicol (PEG), celulose de metil-hidroxipropila (MHPC) e álcool polivinílico (PVA). O revestimento pode ser aplicado em uma quantidade de pelo menos 0,1% em peso do núcleo, p.ex., pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 15%. A quantidade pode ser no máximo 100%, 70%, 50%, 40% ou 30%. O revestimento tem preferencialmente pelo menos 0,1 µm de espessura, particularmente pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm ou pelo menos 5 µm.
Em algumas modalidades, a espessura do revestimento é abaixo de 100 µm, tal como abaixo de 60 µm ou abaixo de 40 µm.
O revestimento deve encapsular a unidade nuclear por formação de uma camada substancialmente contínua.
Uma camada substancialmente contínua é para ser entendida como um revestimento tendo poucos ou nenhuns orifícios, tal que a unidade nuclear que está encapsulando/encerrando tenha poucas ou nenhumas áreas não revestidas.
A camada ou revestimento deve ter, em particular, espessura homogênea.
O revestimento pode conter adicionalmente outros materiais como conhecidos na técnica, p.ex., enchimentos, agentes antiaderentes, pigmentos, corantes, plastificantes e/ou aglutinantes, tais como dióxido de titânio, caulim, carbonato de cálcio ou talco.
Um revestimento de sal pode compreender pelo menos 60% em peso de um sal, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em peso.
Para proporcionar proteção aceitável, o revestimento de sal tem preferencialmente pelo menos 0,1 µm de espessura, p.ex., pelo menos 0,5 µm, pelo menos 1 µm, pelo menos 2 µm, pelo menos 4 µm, pelo menos 5 µm ou pelo menos 8 µm.
Em uma modalidade particular, a espessura do revestimento de sal é abaixo de 100 µm, tal como abaixo de 60 µm ou abaixo de 40 µm.
O sal pode ser adicionado a partir de uma solução de sal onde o sal é completamente dissolvido ou a partir de uma suspensão de sal em que as partículas finas são menores do que 50 µm, tal como menores do que 10 µm ou menores do que 5 μm.
O revestimento de sal pode compreender um único sal ou uma mistura de dois ou mais sais.
O sal pode ser solúvel em água, em particular, tendo uma solubilidade pelo menos 0,1 g em 100 g de água a 20 °C, preferencialmente pelo menos 0,5 g por 100 g de água, p.ex., pelo menos 1 g por 100 g de água, p.ex., pelo menos 5 g por 100 g de água.
O sal pode ser um sal inorgânico, p.ex., sais de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples (menos do que 10 átomos de carbono, p.ex., 6 ou menos átomos de carbono) tais como citrato, malonato ou acetato.
Exemplos de cátions em estes sais são íons de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos, o íon de amônio ou íons de metais da primeira série de transição, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio, zinco ou alumínio.
Exemplos de ânions incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, sulfito, bissulfito, tiossulfato, fosfato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, hipofosfito, di-hidrogenopirofosfato, tetraborato, borato, carbonato, bicarbonato, metassilicato, citrato, malato, maleato, malonato, succinato, lactato, formato, acetato, butirato, propionato, benzoato, tartarato, ascorbato ou gluconato.
Em particular podem ser usados sais de metais alcalinos ou metais alcalinoterrosos de sulfato, sulfito, fosfato, fosfonato, nitrato, cloreto ou carbonato ou sais de ácidos orgânicos simples tais como citrato, malonato ou acetato.
O sal no revestimento pode ter uma umidade constante a 20 °C acima de 60%, particularmente acima de 70%, acima de 80% ou acima de 85%, ou pode ser uma outra forma hidratada de um tal sal (p.ex., anidrato). O revestimento de sal pode ser como descrito em WO 00/01793 ou WO 2006/034710. Exemplos específicos de sais adequados são NaCl (CH20°C=76%), Na2CO3 (CH20°C=92%), NaNO3 (CH20°C=73%), Na2HPO4 (CH20°C=95%), Na3PO4 (CH25°C=92%), NH4Cl (CH20°C = 79,5%), (NH4)2HPO4 (CH20°C = 93,0%), NH4H2PO4 (CH20°C = 93,1%), (NH4)2SO4 (CH20°C=81,1%), KCl (CH20°C=85%), K2HPO4 (CH20°C=92%), KH2PO4 (CH20°C=96,5%), KNO3 (CH20°C=93,5%), Na2SO4 (CH20°C=93%), K2SO4 (CH20°C=98%), KHSO4 (CH20°C=86%), MgSO4 (CH20°C=90%), ZnSO4 (CH20°C=90%) e citrato de sódio (CH25 °C = 86%). Outros exemplos incluem NaH2PO4, (NH4)H2PO4, CuSO4, Mg(NO3)2 e acetato de magnésio.
O sal pode estar em forma anidra ou pode ser um sal hidratado, i.e., um sal cristalino hidratado com água(s) de cristalização ligada(s), tal como descrito em WO 99/32595. Exemplos específicos incluem sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O), sulfato de zinco hepta-hidratado (ZnSO4.7H2O), fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado (Na2HPO4.7H2O), nitrato de magnésio hexa-hidratado (Mg(NO3)2(6H2O)), citrato de sódio di-hidratado e acetato de magnésio tetra-hidratado.
Preferencialmente, o sal é aplicado como uma solução do sal, p.ex., usando um leito fluidizado.
Os materiais de revestimento podem ser materiais de revestimento cerosos e materiais de revestimento de formação de filme.
Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono e di e triglicerídeos de ácidos graxos.
Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. O grânulo pode opcionalmente ter um ou mais revestimentos adicionais.
Exemplos de materiais de revestimento adequados são polietilenoglicol (PEG), celulose de metil-hidroxipropilcelula (MHPC) e álcool polivinílico (PVA). Exemplos de grânulos de enzimas com múltiplos revestimentos são descritos em WO 93/07263 e WO 97/23606. O núcleo pode ser preparado por granulação de uma combinação dos ingredientes, p.ex., por um método compreendendo técnicas de granulação tais como cristalização, precipitação, revestimento em recipiente, revestimento em leito fluidizado, aglomeração em leito fluidizado, atomização rotativa, extrusão, perolização, esferonização, métodos de redução do tamanho, granulação em tambor e/ou granulação de elevado cisalhamento.
Métodos para preparar o núcleo podem ser encontrados no Handbook of Powder Technology; Particle size enlargement por C.
E.
Capes; Volume 1; 1980; Elsevier.
Os métodos de preparação incluem tecnologias conhecidas de formulação de rações e grânulos, p.ex., (a) Produtos secos por pulverização, em que uma solução contendo enzima líquida é atomizada em uma torre de secagem por pulverização para formar gotículas pequenas que durante seu trajeto para baixo na torre de secagem secam para formar um material particulado contendo enzima.
Partículas muito pequenas podem ser produzidas deste modo (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; vol. 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). (b) Produtos em camadas, em que a enzima é revestida como uma camada em torno de uma partícula nuclear inerte pré-formada, em que uma solução contendo enzima é atomizada, tipicamente em um dispositivo de leito fluidizado em que as partículas nucleares pré-formadas são fluidizadas, e a solução contendo enzima adere às partículas nucleares e seca para deixar uma camada de enzima seca na superfície da partícula nuclear.
Partículas de um tamanho desejado podem ser obtidas deste modo se uma partícula nuclear útil do tamanho desejado puder ser encontrada.
Este tipo de produto é descrito em, p.ex., WO 97/23606. (c) Partículas nucleares absorvidas, em que, em vez do revestimento da enzima como uma camada em torno do núcleo, a enzima é absorvida sobre a e/ou na superfície do núcleo.
Um tal processo é descrito em WO 97/39116. (d) Produtos de extrusão ou peletizados, em que uma pasta contendo enzima é prensada em péletes ou sob pressão, é extrudada através de uma pequena abertura e cortada em partículas que são subsequentemente secas.
Tais partículas têm usualmente um tamanho considerável devido ao material no qual a abertura de extrusão é feita (usualmente uma placa com orifícios perfurados) define um limite na queda de pressão permissível através da abertura de extrusão.
Igualmente, pressões de extrusão muito elevadas quando se usa uma pequena abertura aumentam a geração de calor na pasta de enzima, que é prejudicial à enzima (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; vol. 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). (e) Produtos perolizados, em que um pó contendo enzima é suspenso em cera fundida e a suspensão é pulverizada, p.ex., através de um atomizador de disco rotativo, em uma câmara de resfriamento onde as gotículas solidificam rapidamente (Michael S.
Showell (editor); Powdered detergents; Surfactant Science Series; 1998; volume 71; páginas 140-142; Marcel Dekker). O produto obtido é aquele em que a enzima está uniformemente distribuída ao longo de um material inerte em vez de estar concentrada em sua superfície.
As Patentes dos E.U.A.
Nos. 4,016,040 e 4,713,245 descrevem esta técnica. (f) Produtos de granulação em misturador, em que um líquido contendo enzima é adicionado a uma composição em pó seca de componentes de granulação convencionais.
O líquido e o pó em uma proporção adequada são misturados e, à medida que a umidade do líquido é absorvida no pó seco, os componentes do pó seco começarão a aderir e aglomerar e partículas se acumularão, formando granulados compreendendo a enzima.
Um tal processo é descrito na Patente dos E.U.A.
No. 4,106,991 e documentos relacionados EP 170360, EP 304332, EP 304331, WO 90/09440 e WO 90/09428. Em um produto específico deste processo, vários misturadores de elevado cisalhamento podem ser usados como granuladores.
Os granulados consistindo em enzima, enchimentos e aglutinantes, etc. são misturados com fibras de celulose para reforçar as partículas para produzir o assim chamado granulado T.
As partículas reforçadas são mais robustas e liberam menos poeira enzimática. (g) Redução do tamanho, em que os núcleos são produzidos por moagem ou esmagamento de partículas maiores, péletes, comprimidos, briquetes, etc. contendo a enzima.
A fração de partículas nucleares desejadas é obtida por peneiração do produto moído ou esmagado.
As partículas sobre e subdimensionadas podem ser recicladas.
A redução do tamanho é descrita em Martin Rhodes (editor); Principles of Powder Technology; 1990; Capítulo 10; John Wiley & Sons. (h) Granulação de leito fluidizado.
A granulação de leito fluidizado envolve a suspensão de particulados em uma corrente de ar e pulverização de um líquido nas partículas fluidizadas através de bocais.
As partículas atingidas por gotículas de pulverização ficam úmidas e se tornam pegajosas.
As partículas pegajosas colidem com outras partículas e aderem às mesmas e formam um grânulo. (i) Os núcleos podem ser sujeitos a secagem, tal como em um secador de leito fluidizado.
Outros métodos conhecidos para a secagem de grânulos na indústria de rações ou enzimas podem ser usados pelo perito.
A secagem tem lugar preferencialmente a uma temperatura do produto de 25 a 90 °C.
Para algumas enzimas é importante que os núcleos compreendendo a enzima contenham uma baixa quantidade de água antes de serem revestidos com o sal.
Se as enzimas sensíveis à água forem revestidas com um sal antes da água excessiva ser removida, ela será aprisionada no núcleo e pode afetar a atividade da enzima negativamente.
Após secagem, os núcleos contêm preferencialmente 0,1-10% p/p de água.
Os granulados sem formação de poeiras podem ser produzidos, p.ex., como divulgado nas Patentes dos E.U.A.
Nos. 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica.
O granulado pode conter adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais.
Cada enzima estará então presente em mais grânulos assegurando uma distribuição mais uniforme das enzimas e também reduzindo a segregação física de diferentes enzimas devido a diferentes tamanhos de partículas.
Métodos para produção de cogranulados de múltiplas enzimas são divulgados na divulgação de ip.com IPCOM000200739D.
Um outro exemplo da formulação de enzimas pelo uso de cogranulados é divulgado em WO 2013/188331. A enzima pode ser também uma enzima protegida preparada de acordo com o método divulgado em EP 238,216.
Em uma modalidade, o grânulo compreende adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais, p.ex., hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase e transferase. A uma ou mais enzimas adicionais são preferencialmente selecionadas do grupo consistindo em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase, celobioidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectina esterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação. Para informação adicional sobre grânulos de enzima e sua produção ver WO 2013/007594 bem como, p.ex., WO 2009/092699, EP 1705241, EP 1382668, WO 2007/001262, US 6,472,364, WO 2004/074419 e WO 2009/102854.
Usos A presente invenção está também dirigida a métodos para uso das variantes de subtilase de acordo com a invenção ou suas composições na lavagem de têxteis e tecidos, tal como lavagem de roupa doméstica e lavagem de roupa industrial. A invenção está também dirigida a métodos para uso das variantes de acordo com a invenção ou suas composições na limpeza de superfícies duras tais como pisos, mesas, paredes, telhados, etc., bem como superfícies de objetos duros tais como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça). As variantes de subtilase da presente invenção podem ser adicionadas a e assim se tornarem um componente de uma composição detergente. Assim, um aspecto da invenção se relaciona com o uso de uma variante de subtilase em um processo de limpeza tal como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras. Uma composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina incluindo uma composição aditiva para lavagem de roupa adequada para pré- tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciadora de tecidos adicionada para enxaguamento ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras ou ser formulada para operações para lavagem de louça manual ou à máquina. O processo de limpeza ou o processo de cuidado de têxteis pode por exemplo ser um processo para lavagem de roupa, um processo para lavagem de louça ou limpeza de superfícies duras tais como azulejos de banheiro, pisos, tampos de mesas,
ralos, pias e lavatórios.
Os processos de lavagem de roupa podem ser por exemplo lavagem de roupa doméstica, mas podem também ser lavagem de roupa industrial.
Além do mais, a invenção se relaciona com um processo para lavagem de tecidos e/ou peças de vestuário, onde o processo compreende tratamento de tecidos com uma solução de lavagem contendo uma composição detergente e pelo menos uma variante de protease da invenção.
O processo de limpeza ou um processo de cuidado de têxteis pode ser por exemplo levado a cabo em uma lavagem ou manualmente.
A solução de lavagem pode ser por exemplo uma solução de lavagem aquosa contendo uma composição detergente.
Em um aspecto, as variantes de subtilase da invenção são usadas em um processo de limpeza, p.ex., um processo de lavagem, que compreende um ciclo de lavagem curto, tipicamente um ciclo de lavagem de não mais do que cerca de 30 minutos, tal como não mais do que cerca de 20 minutos, p.ex., não mais do que cerca de 15 minutos ou não mais do que cerca de 10 minutos.
Foi surpreendentemente descoberto que as variantes de subtilase da invenção são notavelmente eficazes em ciclos de lavagem curtos durando, por exemplo, somente cerca de 10-20 minutos.
Isto pode, p.ex., ser útil em máquinas de lavar de carregamento superior que têm frequentemente ciclos de lavagem curtos ou para lavagem à mão de roupa.
Em um outro aspecto, as variantes de subtilase da invenção são usadas num processo de limpeza, p.ex., um processo de lavagem de roupa, onde a água de lavagem é usada para mais do que uma porção da roupa.
Em este caso, a água de lavagem contendo um detergente com uma variante de subtilase da invenção pode ser usada em um primeiro ciclo de lavagem para uma primeira porção de roupa e, depois, reusada uma ou mais vezes para ciclos de lavagem adicionais com novas porções de roupa.
Foi descoberto que os detergentes contendo uma variante de subtilase da invenção são capazes de manter substancialmente o desempenho de limpeza em manchas sensíveis a proteases mesmo após três ciclos de lavagem ou mais.
Isto pode por exemplo ser útil para roupa lavada à mão e/ou em regiões com escassez de água.
Nos últimos anos tem existido um interesse crescente na substituição de componentes em detergentes que sejam derivados de petroquímicos por componentes biológicos renováveis tais como enzimas e polipeptídeos sem comprometer o desempenho de lavagem.
Quando os componentes de composições detergentes mudam podem ser necessárias novas atividades de enzimas ou novas enzimas tendo propriedades alternativas e/ou melhoradas em comparação com as enzimas de detergentes previamente usadas tais como proteases, lipases e amilases para alcançar um desempenho de lavagem similar ou melhorado em comparação com as composições detergentes tradicionais. A invenção diz adicionalmente respeito ao uso de variantes de subtilase da invenção em um processo de remoção de manchas proteináceas. As manchas proteináceas podem ser manchas tais como manchas de alimentos, p.ex., alimento para bebês, cacau, ovo ou leite, ou outras manchas tais como sebo, sangue tinta, grama ou uma sua combinação.
Método de Lavagem A presente invenção proporciona um método de limpeza de um tecido, peça de louça ou uma superfície dura com uma composição detergente compreendendo uma variante de protease da invenção. O método de limpeza compreende contato de um objeto com uma composição detergente compreendendo uma variante de protease da invenção sob condições adequadas para limpeza do objeto. Em uma modalidade preferencial, a composição detergente é usada em um processo para lavagem de roupa ou lavagem de louça. Uma outra modalidade se relaciona com um método para remoção de manchas de tecido ou peça de louça que compreende contato do tecido ou peça de louça com uma composição compreendendo uma protease da invenção sob condições adequadas para limpeza do objeto. No método de limpeza da invenção, o objeto sendo limpo pode ser qualquer objeto adequado tal como um têxtil ou uma superfície dura tal como peça de louça ou um piso, mesa, parede, etc. Estão também contempladas composições e métodos de tratamento de tecidos (p.ex., para desengomar um têxtil) usando uma ou mais das proteases da invenção. A protease pode ser usada em qualquer método de tratamento de tecidos que seja bem conhecido na técnica (ver, p.ex., US 6,077,316). Por exemplo, em um aspecto, a sensação e a aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contato do tecido com uma protease em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão. As composições detergentes da presente invenção são adequadas para uso em aplicações de lavagem de roupa e superfícies duras, incluindo lavagem de louça. Conformemente, a presente invenção inclui um método para lavagem de um tecido ou lavagem de uma peça de louça, compreendendo contato do tecido/peça de louça a ser limpo com uma solução compreendendo a composição detergente de acordo com a invenção. O tecido pode compreender qualquer tecido capaz de ser lavado em condições normais de uso pelo consumidor.
A peça de louça pode compreender qualquer peça de louça tal como faianças, talheres, cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos.
A solução tem preferencialmente um pH de cerca de 5,5 a cerca de 11,5. As composições podem ser empregues a concentrações de cerca de 100 ppm, preferencialmente 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução.
As temperaturas da água variam tipicamente de cerca de 5 °C a cerca de 95 °C, incluindo cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C, cerca de 40 °C, cerca de 45 °C, cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, cerca de 80 °C, cerca de 85 °C e cerca de 90 °C.
A razão entre água e tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1. A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizantes e inibidores de proteases convencionais, p.ex., um poliol tal como propilenoglicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, diferentes sais tais como NaCl; KCl; ácido láctico, ácido fórmico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, p.ex., um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborônico tal como ácido 4-formilfenilborônico, ou um aldeído de peptídeo tal como aldeídos de di-, tri- ou tetrapeptídeo ou análogos de aldeídos (da forma B1-B0-R em que, R é H, CH3, CX3, CHX2 ou CH2X (X = halogênio), B0 é um resíduo de aminoácido único (preferencialmente com uma cadeia lateral alifática ou aromática opcionalmente substituída); e B1 consiste em um ou mais resíduos de aminoácidos (preferencialmente um, dois ou três), compreendendo opcionalmente um grupo de proteção N-terminal ou como descrito em WO 2009/118375, WO 98/13459) ou um inibidor de protease do tipo de proteína tal como RASI, BASI, WASI (inibidores bifuncionais de alfa- amilase/subtilisina de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI.
A composição pode ser formulada como descrito em, p.ex., WO 92/19709, WO 92/19708 e US 6,472,364. Em algumas modalidades, as enzimas empregues aqui são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proporcionam tais íons às enzimas, bem como outros íons de metal (p.ex., bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), Estanho (II), cobalto (II), cobre (II), Níquel (II) e oxovanádio (IV)). As composições detergentes proporcionadas aqui são tipicamente formuladas tal que, durante o uso em operações de limpeza aquosas, a água de lavagem tenha um pH de cerca de 5,0 a cerca de 12,5, tal como de cerca de 5,0 a cerca de 11,5 ou de cerca de 6,0 a cerca de 10,5. Em algumas modalidades, os produtos de lavagem de roupa granulares ou líquidos são formulados para terem um pH de cerca de 6 a cerca de 8. Técnicas para controle de pH a níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, alcalinos, ácidos, etc., e são bem conhecidas daqueles peritos na técnica.
A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção.
EXEMPLOS Materiais e métodos Ensaio de atividade de Suc-AAPF-pNA A atividade proteolítica pode ser determinada por um método empregando Suc- AAPF-PNA como o substrato. Suc-AAPF-PNA é uma abreviatura de N-Succinil-Alanina- Alanina-Prolina-Fenilalanina-p-Nitroanilida e é um peptídeo bloqueado que pode ser clivado por endo-proteases. Após clivagem é liberada uma molécula de PNA livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medida por espectrofotometria visível ao comprimento de onda 405 nm. O substrato Suc-AAPF-PNA é fabricado pela Bachem (no. de cat. L1400, dissolvido em DMSO). A amostra de protease a ser analisada é diluída em tampão de atividade residual (Tris a 100 mM pH 8,6). O ensaio é realizado por transferência de 30 µL de amostras de enzimas diluídas para placa de microtitulação de 96 poços e adição de 70 µL de solução de trabalho de substrato (0,72 mg/mL em Tris a 100 mM pH 8,6). A solução é misturada à temperatura ambiente e a absorção é medida a cada 20 segundos ao longo de 5 minutos à OD 405 nm. O declive (absorvância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade da protease em questão sob o dado conjunto de condições. A amostra de protease é diluída até um nível onde o declive é linear.
Exemplo 1: Preparação e purificação de polipeptídeos A mutação e a introdução de cassetes de expressão em Bacillus subtilis foram realizadas por métodos padrão conhecidos na técnica. Todas as manipulações de DNA foram realizadas por PCR (p.ex., como descrito por Sambrook et al., 2001, supra) usando métodos padrão conhecidos do perito.
Construtos de B. subtilis recombinantes codificando polipeptídeos de subtilase foram inoculadas e cultivadas em um meio complexo (TBgly) sob seleção de antibiótico durante 24 h a 37 °C. Frascos de agitação contendo um meio rico (PS-1: Sacarose a 100 g/L (no. de cat. da Danisco 109-0429), soja de massa (farinha de soja) a 40 g/L, Na2HPO4.12H2O a 10 g/L (no. de cat. da Merck 106579), Dowfax63N10 a 0,1 mL/L (Dow) foram inoculados em uma razão de 1:100 com a cultura durante a noite. O cultivo em frascos de agitação foi realizado durante 4 dias a 30 °C agitando a 270 rpm. A purificação dos sobrenadantes da cultura foi realizada como se segue: O caldo de cultura é centrifugado a 26000 x g durante 20 minutos e o sobrenadante é cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante é filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 µm da Nalgene de modo a remover os restos das células hospedeiras. O pH no filtrado de 0,2 µm é ajustado até pH 8 com base Tris a 3 M e o filtrado com ajuste do pH é aplicado a uma coluna MEP Hypercel (Pall Corporation) equilibrada em Tris/HCl a 20 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 8,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a coluna é eluída passo a passo com CH3COOH/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 4,5. As frações a partir da coluna são analisadas quanto à atividade de protease usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9 e as frações do pico são agrupadas. O pH do agrupamento a partir da coluna MEP Hypercel é ajustado até pH 6 com CH3COOH a 20% (v/v) ou base Tris a 3 M e o agrupamento com ajuste do pH é diluída com água desionizada até à mesma condutividade que MES/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. O agrupamento diluído é aplicado a uma coluna SP-Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada em MES/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a variante de protease é eluída com um gradiente linear de NaCl (0  0,5 M) no mesmo tampão ao longo de cinco volumes da coluna. As frações a partir da coluna são analisadas quanto à atividade de protease usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9 e as frações ativas são analisadas por SDS-PAGE. As frações nas quais somente uma banda é observada no gel de SDS- PAGE colorido com Coomassie foram agrupadas como a preparação purificada e usadas para experiências adicionais.
Exemplo 2: Ensaios de estabilidade a diferentes valores de pH A estabilidade de variantes da invenção foi testada em um ensaio de estabilidade acelerada sob dois conjuntos diferentes de condições: 1) em um tampão de estresse de pH baixo (4,0) e 2) em um tampão de estresse de pH elevado (10,5) com LAS (sulfonato de alquilbenzeno linear).
Estabilidade a pH baixo Este ensaio a um pH baixo de 4,0 e na ausência de detergente é desenhado para simular as condições durante a produção de um granulado de enzima e no granulado antes da adição a uma composição detergente. Amostras de protease purificadas são diluídas com Triton X-100 a 0,01% até 0,04 e 0,02 mg/mL. Depois, 180 µL de tampão de estresse de pH baixo (ácido cítrico a 0,1 M, CaCl2 a 2 mM, MgSO4 a 2 mM, pH 4,0) são misturados com 20 µL de protease diluída no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Após incubação a 37 °C em um Eppendorf Thermomixer com agitação durante 0, 60 e 150 min, 20 µL são transferidos para uma nova placa de microtitulação e misturados com 180 µL de solução de substrato Suc-AAPF-pNA (Suc-AAPF-pNA a 0,4 mg/mL em Tris a 0,1 M pH 8,6). A atividade é encontrada por regressão linear do aumento inicial na absorbância a 405 nm medido a cada 20 segundos durante 3 minutos em um leitor de placas (SpectraMax® Plus). A meia-vida (T½) é calculada a partir da regressão linear de log(atividade) versus tempo de incubação. A meia-vida medida de uma protease de referência tendo SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R, P14H, R19L e N62D é definida como 1, e os fatores de melhoria da meia-vida (T½ IF) de outras proteases testadas são calculados como a meia-vida de uma variante em relação à meia-vida da protease de referência.
Estabilidade a pH elevado com LAS Este ensaio a um pH elevado de 10,5 e na presença de LAS é desenhado para simular condições em uma composição detergente, onde a enzima está em contato próximo com os componentes do detergente. Amostras de protease purificadas são diluídas com Triton X-100 a 0,01% até 0,04 e 0,02 mg/mL. Depois, 180 µL de tampão de estresse de pH elevado (Na-carbonato a 0,1 M, CaCl2 a 2 mM, MgSO4 a 2 mM, pH 10,5, LAS (Thonyl P85 NaLAS) a 0,5%) são misturados com 20 µL de protease diluída no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Após incubação a 37 °C em um Eppendorf Thermomixer com agitação durante 0, 60 e 150 min, 20 µL são transferidos para uma nova placa de microtitulação e misturados com 180 µL de solução de substrato Suc-AAPF-pNA (Suc-AAPF-pNA a 0,4 mg/mL em Tris a 0,1 M pH 8,6). A atividade é encontrada por regressão linear do aumento inicial na absorbância a 405 nm medido a cada 20 segundos durante 3 minutos em um leitor de placas (SpectraMax® Plus). A meia-vida (T½) é calculada a partir da regressão linear de log(atividade) versus tempo de incubação. A meia-vida medida de uma protease de referência tendo SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R, P14H, R19L e N62D é definida como 1, e os fatores de melhoria da meia-vida (T½ IF) de outras proteases testadas são calculados como a meia-vida de uma variante em relação à meia-vida da protease de referência. Os fatores de melhoria da meia-vida de variantes da invenção em ambos os tampões de estresse de pH baixo e pH elevado + LAS são dados na Tabela 1 em baixo, onde pode ser visto que as variantes da invenção têm excelente estabilidade em ambas as condições de pH baixo e pH elevado + LAS em comparação com a protease de referência.
Tabela 1: Fator de melhoria da meia-vida (T½ IF) de variantes da invenção T½ IF T½ IF pH elevado Variante pH baixo + LAS Referência (SEQ ID NO: 1 + S9R P14H R19L N62D) 1,0 1,0 S3T S9R R19L N62D A194P 8,8 3,2 S3T S9R R19L N62D A194P Q245R S259D 9,2 9,6 S3T S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 12,5 3,5 S3T S9R R19L N62D P131* A194P 16,8 5,6 S3T S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 20,1 18,7 S3T S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 19,8 12,8 S3T S9R R19L N43R N62D N76D A194P 15,3 7,4 S3T S9R R19L N43R N62D N76D P131* A194P 24,8 7,6 S3T S9R R19L N62D Q245R S259D 7,5 5,8 S3T S9R R19L N43R N62D R275Q 8,7 2,5 S3T S9R R19L N62D P131* 13,5 4,2 S3T S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 9,9 6,7 S3T S9R R19L N43R N62D P131* R275Q 16,0 5,7 S3T S9R R19L N43R N62D N76D 19,8 5,9 S3T S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 23,5 15,9 S3T S9R R19L N43R N62D N76D P131* 16,9 9,0 S9R A15T G61E N62D V68A A194P V205I Q245R N261D 7,9 1,3 S9R A15T G61E V68A A194P V205I Q245R S259D N261D 6,2 1,6 S9R R19L N43R N62D R275Q 4,9 1,6
S9R R19L N62D P131* 7,3 1,9 S3A S9R R19L N62D Q245R S259D 2,9 2,1 S3A S9R R19L N62D A194P 3,5 1,2 S9R R19L N43R N62D Q245R S259D R275Q 5,9 5,3 S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 9,2 7,5 S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 6,8 2,6 S9R R19L N62D P131* A194P 10,7 5,2 S9R R19L N43R N62D N76D 12,8 5,0 S3A S9R R19L N43R N62D Q245R S259D R275Q 4,0 3,0 S3A S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 6,2 6,8 S3A S9R R19L N62D A194P Q245R S259D 4,0 3,4 S3A S9R R19L N43R N62D P131* R275Q 6,6 2,2 S3A S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 4,6 1,8 S3A S9R R19L N62D P131* A194P 7,4 3,0 S3A S9R R19L N43R N62D N76D 8,7 3,5 S9R R19L N43R N62D P131* Q245R S259D R275Q 12,9 8,8 S9R R19L N43R N62D A194P Q245R S259D R275Q 7,1 7,3 S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 11,3 11,4 S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 14,4 14,3 S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 14,4 6,2 S9R R19L N43R N62D N76D P131* 24,7 9,9 S9R R19L N43R N62D N76D A194P 16,9 8,7 S3A S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 9,1 4,8 S3A S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 10,9 9,4 S3A S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 9,8 4,5 S3A S9R R19L N43R N62D N76D P131* 17,8 8,2 S3A S9R R19L N43R N62D N76D A194P 12,6 8,4 S9R R19L N43R N62D N76D P131* Q245R S259D 16,8 17,7 S9R R19L N43R N62D N76D A194P Q245R S259D 12,6 18,7 S9R R19L N43R N62D N76D P131* A194P 16,6 9,8
Exemplo 3: Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) O desempenho de lavagem das proteases selecionadas foi inicialmente testado usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA). O AMSA é um ensaio de lavagem em pequena escala usado para se assemelhar à lavagem em escala real, que permite que muitas proteases sejam testadas simultaneamente devido ao pequeno tamanho dos poços e volume da solução. No AMSA, a solução detergente incluindo protease é colocada em contato com o têxtil por agitação vigorosa da placa de teste de uma maneira oscilante, regular para aplicar estresse mecânico. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente a seção “Special method embodiments” nas páginas 23-24. As experiências de AMSA foram conduzidas usando as condições experimentais listadas na Tabela 2 em baixo usando o detergente para lavagem de roupa modelo para mercados emergentes (pó) como listado na Tabela 3. As amostras de tecido padrão Leite de chocolate com negro de carbono (PC-03) e Sangue, leite, tinta, extra-aquecidos (EMPA117EH) foram obtidas do Centre For Testmaterials BV (CFT, Stoomloggerweg 11, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos) e Swissatest Testmaterialien AG (Mövenstrasse 12, 9015 St. Gallen, Suíça), respectivamente.
Tabela 2: Condições experimentais de AMSA Detergente para lavagem de roupa modelo para mercado Detergente emergente (pó) Dosagem de 2,0 g/L detergente Dureza da água 9°dH Razão de dureza da 2:1:4,5 (Ca2+:Mg2+:CO32) água pH 10,2 Concentração de 0,26 e 0,52 mg de proteína enzimática/L (10 e 20 nM) protease Volume de solução de 160 µL teste Tempo de lavagem 20 minutos Temperatura de 25°C lavagem Leite de chocolate com negro de carbono (PC-03, CFT) Amostras de têxtil Sangue, leite, tinta, extra-aquecidos (EMPA117EH, Swissatest) Tabela 3: Lista de ingredientes para detergente para lavagem de roupa modelo para mercado emergente (pó) Ingrediente Conteúdo (p/p %)* LAS, sal de sódio 15,0% Tensoativo não iônico (etoxilato de álcool, AEO) 2,0% Carbonato de sódio 20,1%
Silicato de sódio hidratado 9,9% Zeólito 4A + 12,1% PCA, (copoli(ácido acrílico/ácido maleico), sal de sódio) 1,3% Sulfato de sódio 31,4% * As quantidades na Tabela 3 correspondem à quantidade de componente ativo nos ingredientes. O resto, aprox. 8%, consiste na parte inativa dos ingredientes, principalmente água.
Após a lavagem em AMSA, as amostras de têxtil foram enxaguadas em água, secas e digitalizadas usando um digitalizador de mesa (Epson Expression 10000XL). A limpeza das amostras de têxtil e assim o desempenho de lavagem de proteases individuais foi determinado por cálculo da intensidade da luz refletida a partir das imagens digitalizadas. É usada um aplicação de software desenhada especial (Novozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera valores de píxeis de 24 bits da imagem e os converte em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade é calculado por adição dos valores RGB em conjunto como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante usando esta fórmula: A Tabela 4 em baixo proporciona informação sobre o desempenho de lavagem de variantes da invenção em AMSA nas duas manchas EMPA117EH e PC-03 em duas concentrações de proteases diferentes, expressa como desempenho de lavagem relativo em comparação com aquele da protease de referência tendo SEQ ID NO: 1. Os valores relativos do desempenho de lavagem relativo na Tabela 4 foram calculados por 1) obtenção de uma melhoria do valor de intensidade em relação ao branco por deduzindo o valor de intensidade calculado de um branco, i.e., uma mancha lavada com o detergente modelo sem uma enzima, a partir do valor de intensidade calculado para uma variante ou a protease de referência e, depois, 2) divisão do desempenho de lavagem das variantes (melhoria do valor de intensidade em relação ao branco) pelo desempenho de lavagem da referência (melhoria do valor de intensidade em relação ao branco), por outras palavras: (Intensidadevariante - Intensidadebranco) / (Intensidadereferência - Intensidadebranco) Os resultados de lavagem de AMSA na Tabela 4 em baixo mostram que as variantes da invenção têm um desempenho de lavagem substancialmente melhorado em EMPA117EH em comparação com a protease de referência. Similarmente, para PC- 03, o desempenho de lavagem das variantes da invenção é na maioria dos casos melhor do que aquele da protease de referência.
Tabela 4: Desempenho de lavagem relativo em AMSA; melhoria em relação ao branco em relação a SEQ ID NO: 1 EMPA117EH PC-03 Variante 10 nM 20 nM 10 nM 20 nM Referência (Savinase®; SEQ ID NO: 1) 1,00 1,00 1,00 1,00 S3T S9R R19L N62D A194P 1,49 1,40 1,33 1,23 S3T S9R R19L N62D A194P Q245R S259D 1,54 1,52 1,58 1,50 S3T S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 1,46 1,38 1,46 1,33 S3T S9R R19L N62D P131* A194P 1,51 1,38 1,04 1,07 S3T S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 1,49 1,40 1,00 1,13 S3T S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 1,49 1,33 0,96 1,00 S3T S9R R19L N43R N62D N76D A194P 1,51 1,38 1,42 1,30 S3T S9R R19L N43R N62D N76D P131* A194P 1,54 1,48 1,04 1,13 S3T S9R R19L N62D Q245R S259D 1,60 1,52 1,46 1,30 S3T S9R R19L N43R N62D R275Q 1,43 1,36 1,33 1,27 S3T S9R R19L N62D P131* 1,57 1,52 1,17 1,20 S3T S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 1,74 1,64 1,75 1,63 S3T S9R R19L N43R N62D P131* R275Q 1,51 1,45 1,21 1,17 S3T S9R R19L N43R N62D N76D 1,49 1,43 1,46 1,37 S3T S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 1,60 1,50 1,46 1,40 S3T S9R R19L N43R N62D N76D P131* 1,51 1,43 1,04 1,17 S9R A15T G61E N62D V68A A194P V205I Q245R 1,83 1,69 1,58 1,40 N261D S9R A15T G61E V68A A194P V205I Q245R S259D 1,63 1,50 1,33 1,23 N261D S9R R19L N43R N62D R275Q 1,49 1,40 1,46 1,33 S9R R19L N62D P131* 1,60 1,50 1,17 1,13 S3A S9R R19L N62D Q245R S259D 1,60 1,52 1,50 1,43 S3A S9R R19L N62D A194P 1,46 1,36 1,33 1,30 S9R R19L N43R N62D Q245R S259D R275Q 1,54 1,45 1,42 1,27 S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 1,66 1,57 1,08 1,20 S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 1,43 1,36 1,29 1,23 S9R R19L N62D P131* A194P 1,49 1,45 1,17 1,23 S9R R19L N43R N62D N76D 1,49 1,40 1,46 1,37 S3A S9R R19L N43R N62D Q245R S259D R275Q 1,49 1,40 1,46 1,37 S3A S9R R19L N62D P131* Q245R S259D 1,51 1,43 1,08 1,13 S3A S9R R19L N62D A194P Q245R S259D 1,51 1,43 1,42 1,30 S3A S9R R19L N43R N62D P131* R275Q 1,40 1,36 1,00 1,07
S3A S9R R19L N43R N62D A194P R275Q 1,43 1,33 1,38 1,33 S3A S9R R19L N62D P131* A194P 1,54 1,45 1,17 1,20 S3A S9R R19L N43R N62D N76D 1,49 1,38 1,46 1,33 S9R R19L N43R N62D P131* Q245R S259D R275Q 1,43 1,38 0,96 1,03 S9R R19L N43R N62D A194P Q245R S259D R275Q 1,57 1,45 1,46 1,37 S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 1,49 1,43 1,13 1,17 S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 1,63 1,48 1,42 1,33 S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 1,49 1,40 1,08 1,13 S9R R19L N43R N62D N76D P131* 1,51 1,52 1,00 1,13 S9R R19L N43R N62D N76D A194P 1,49 1,40 1,42 1,33 S3A S9R R19L N62D P131* A194P Q245R S259D 1,51 1,48 1,13 1,20 S3A S9R R19L N43R N62D N76D Q245R S259D 1,63 1,55 1,50 1,43 S3A S9R R19L N43R N62D P131* A194P R275Q 1,49 1,40 1,08 1,10 S3A S9R R19L N43R N62D N76D P131* 1,46 1,43 0,92 1,03 S3A S9R R19L N43R N62D N76D A194P 1,49 1,40 1,46 1,33 S9R R19L N43R N62D N76D P131* Q245R S259D 1,57 1,48 1,08 1,13 S9R R19L N43R N62D N76D A194P Q245R S259D 1,54 1,40 1,38 1,30 S9R R19L N43R N62D N76D P131* A194P 1,51 1,43 1,04 1,10
Exemplo 4: Lavagem em Terg-O-toMeter (TOM) O desempenho de lavagem das proteases selecionadas foi adicionalmente testado no ensaio de lavagem em Terg-O-toMeter (TOM) de escala média, no qual mais tipos de amostras de têxtil podem ser testados.
Um TOM é basicamente um grande banho de água com temperatura controlada com até 16 provetas de metal abertas submersas nele.
Cada proveta constitui uma pequena máquina de lavagem estilo carregador de topo pequeno e, durante uma experiência, cada uma delas conterá uma solução de um sistema detergente/enzima específico em conjunto com tecidos sujos e não sujos cujo desempenho é testado.
Um braço de agitação rotativo dentro de cada proveta é usado para criar estresse mecânico, geralmente a 120 rpm.
O TOM proporciona uma ligação entre experiências de pequena escala, tais como AMSA, e experiências de lavagem em grande escala mais demorados e caros em máquinas de lavagem de tamanho normal.
As experiências de TOM foram conduzidas usando as condições experimentais listadas na Tabela 5 usando o detergente para lavagem de roupa modelo para mercados emergentes (pó) como listado na Tabela 3 acima.
As amostras de têxtil padrão foram obtidas do Center For Testmaterials B.V. (CFT, Stoomloggerweg 11, 3133 KT Vlaardingen. Países Baixos) ou de Swissatest Testmaterialien AG (Mövenstrasse 12, 9015 St. Gallen, Suíça).
Tabela 5: Condições experimentais de TOM Detergente para lavagem de roupa modelo para mercado Detergente emergente (pó) Dosagem de 2,0 g/L detergente Dureza da água 9°dH Razão de dureza da 2:1:4,5 (Ca2+:Mg2+:CO32) água pH 10,2 Concentração de 0,13 mg de proteína enzimática/L (5 mM) protease Volume de solução de 1L teste Taxa de agitação 120 rpm Tempo de lavagem 20 minutos Temperatura de 25°C lavagem Leite de chocolate com negro de carbono (PC-03, CFT) Sangue, leite, tinta (PC-05, CFT) Amostras de têxtil Sangue, leite, tinta (EMPA116, Swissatest) Sangue, leite, tinta, extra-aquecidos (EMPA117EH, Swissatest) Após a lavagem em TOM, as amostras de têxtil foram enxaguadas em água e secas. A limpeza das amostras de têxtil e assim o desempenho de lavagem de proteases individuais foram determinados por medição da remissão de luz a 460 nm usando um espectrofotômetro Macbeth Color-Eye 7000. Os valores de remissão medidos são usados para calcular um valor de remissão Delta (∆Rem), que é definido aqui como o resultado de uma medição de refletância ou remissão de uma amostra de amostra a um certo comprimento de onda, em este caso 460 nm, menos o valor de remissão de uma amostra de referência, que no presente exemplo é uma amostra lavada com o mesmo detergente sem uma enzima (branco). Os resultados do ensaio de TOM são mostrados na Tabela 6 em baixo. A Tabela 7 mostra os mesmos resultados, mas com os valores de desempenho de lavagem para SEQ ID NO: 1 definidos como 1, e com os valores de desempenho de lavagem relativo das variantes calculados em comparação com SEQ ID NO: 1.
Tabela 6: Desempenho de lavagem em ensaio de TOM Remissão delta em comparação com o branco Mancha: Variante: PC-03 PC-05 EMPA116 EMPA117EH Branco (sem enzima) 0 0 0 0 Referência 1 (SEQ ID NO: 1) 2,54 4,81 6,71 6,00 Referência 2 (SEQ ID NO: 1 + 6,64 8,96 9,67 15,15 S9R+P14H+R19L+N62D) S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 5,85 9,91 9,96 14,85 S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 6,98 8,67 8,88 15,32 + Q245R+S259D S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 6,77 9,87 9,07 15,27 + R275RHHHH Tabela 7: Desempenho de lavagem relativo em ensaio de TOM de variantes em comparação com a referência (SEQ ID NO: 1) com base na Tabela 6 Mancha: Variante: PC-03 PC-05 EMPA116 EMPA117EH Branco (sem enzima) 0 0 0 0 Referência 1 (SEQ ID NO: 1) 1,00 1,00 1,00 1,00 Referência 2 (SEQ ID NO: 1 + 2,61 1,86 1,44 2,53 S9R+P14H+R19L+N62D) S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 2,30 2,06 1,48 2,48 S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 2,75 1,80 1,32 2,55 + Q245R+S259D S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 2,67 2,05 1,35 2,55 + R275RHHHH Os dados do ensaio de TOM nas Tabelas 6 e 7 mostram que as variantes de protease da invenção têm um desempenho de lavagem que é substancialmente melhorado em relação àquele da protease de SEQ ID NO: 1 e ao mesmo nível da variante de elevado desempenho, mas instável de SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+P14H+R19L+N62D.
Exemplo 5: Desempenho de lavagem em ciclos de lavagem curtos, condições latino-americanas O desempenho de lavagem de uma variante da invenção em um conjunto de manchas composto por 8 manchas sensíveis à protease diferentes foi testado no ensaio de TOM descrito no Exemplo 4, sob condições latino-americanas usando uma base de detergente em pó latino-americana do Brasil sem enzimas. O teste foi realizado com uma temperatura de lavagem de 25 °C, sem embebição, e um ciclo de lavagem principal de 12, 15 ou 20 min. com agitação a 100 ciclos/min. A dureza da água era 5,6°dH (razão Ca2+/Mg2+/HCO3- 2:1:4,5), com uma dose de detergente de 2,5 g/L. A dose de protease foi 10 mM. O conjunto de manchas era composto por 8 manchas sensíveis à protease, disponível a partir do Center For Testmaterials B.V. (CFT, Stoomloggerweg 11, 3133 KT Vlaardingen. Países Baixos) ou a partir de Swissatest Testmaterialien AG (Mövenstrasse 12, 9015 St. Gallen, Suíça). Após lavagem, o desempenho de lavagem de protease nas amostras de teste foi determinado por medição da remissão de luz a 460 nm como descrito no Exemplo 4 e cálculo de um valor de remissão Delta como a medição de remissão de uma amostra de amostra menos o valor de remissão de uma amostra de referência lavada com o mesmo detergente mas sem uma enzima (branco). A Tabela 8 em baixo mostra a soma dos 8 valores Delta em comparação com o branco para a protease de referência (SEQ ID NO: 1) e uma protease da invenção (SEQ ID NO: 1 + S3T+S9R+R19L+N62D+A194P) determinados em ciclos de lavagem curtos de 12, 15 e 20 minutos, respectivamente.
Tabela 8: Soma dos valores delta em comparação com o branco para 8 manchas sensíveis à protease 12 min. 15 min. 20 min. Referência (SEQ ID NO: 1) 65 81 87 S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 83 98 97 Exemplo 6: Desempenho de lavagem em água suja, condições chinesas O desempenho de lavagem de uma variante da invenção em um conjunto de manchas composto por 7 manchas sensíveis à protease diferentes foi testado no ensaio de TOM descrito no Exemplo 4, sob condições chinesas usando um detergente para lavagem de roupa em pó chinês comercialmente disponível da Liby. O teste foi realizado com uma temperatura de lavagem de 25 °C, sem embebição, realizando três rondas de lavagens com tempo de lavagem de 20 min. cada uma na mesma solução de lavagem. Após cada um do primeiro e segundo ciclos de lavagem, as amostras de manchas lavadas foram removidas e descartadas, e novas amostras de manchas foram adicionadas para um ciclo de lavagem adicional na mesma água de lavagem (suja). Após o terceiro ciclo de lavagem, as amostras foram enxaguadas e secas como descrito no Exemplo 4, e a remissão foi medida. A dureza da água era 14°dH (razão Ca2+/Mg2+/HCO3- 3:2:0), com uma dose de detergente de 2 g/L. O teste foi realizado com duas doses de proteases diferentes, 9 nM e 12 nM. O conjunto de manchas era composto por 7 manchas sensíveis à protease, disponível a partir do Center For Testmaterials B.V. (CFT, Stoomloggerweg 11, 3133 KT Vlaardingen. Países Baixos) ou a partir de Swissatest Testmaterialien AG (Mövenstrasse 12, 9015 St. Gallen, Suíça). Após o terceiro ciclo de lavagem, o desempenho de lavagem de protease no terceiro conjunto de amostras de teste foi determinado por medição da remissão de luz a 460 nm como descrito no Exemplo 4 e cálculo de um valor de remissão Delta como a medição de remissão de uma amostra de amostra menos o valor de remissão de uma amostra de referência lavada com o mesmo detergente mas sem uma enzima (branco). A Tabela 9 em baixo mostra a soma dos 7 valores Delta em comparação com o branco para a protease de referência (SEQ ID NO: 1) e uma protease da invenção (SEQ ID NO: 1 + S3T+S9R+R19L+ N62D+A194P) determinados no terceiro conjunto de amostras de teste lavadas em água suja na qual já haviam sido realizados dois ciclos de lavagem.
Tabela 9: Soma dos valores delta em comparação com o branco para 7 manchas sensíveis à protease Protease a 9 nM Protease a 12 nM Referência (SEQ ID NO: 1) 18 21 S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 36 43 Exemplo 7: Desempenho de lavagem em água suja, condições do sudeste asiático O desempenho de lavagem de uma variante da invenção em um conjunto de manchas composto por 8 manchas sensíveis à protease diferentes foi testado no ensaio de TOM descrito no Exemplo 4 sob condições do sudeste asiático usando uma base de detergente em pó da Indonésia sem enzimas.
O teste foi realizado com uma temperatura de lavagem de 25 °C, sem embebição, realizando três rondas de lavagens consistindo cada uma em uma lavagem principal de 20 min. na mesma solução de lavagem usando 30 g de lastro. Após cada um do primeiro e segundo ciclos de lavagem, as amostras de manchas lavadas foram removidas e descartadas, e novas amostras de manchas foram adicionadas para um ciclo adicional de embebição e lavagem na mesma água de lavagem (suja). Após o terceiro ciclo de lavagem, as amostras foram enxaguadas e secas como descrito no Exemplo 4, e a remissão foi medida. A dureza da água era 5,6°dH (razão Ca2+/Mg2+/HCO3- 2:1:4,5), com uma dose de detergente de 2 g/L. O teste foi realizado com três doses de proteases diferentes, 3,4 nM, 4,4 nM e 5,7 nM. O conjunto de manchas era composto por 8 manchas sensíveis à protease, disponível a partir do Center For Testmaterials B.V. (CFT, Stoomloggerweg 11, 3133 KT Vlaardingen. Países Baixos) ou a partir de Swissatest Testmaterialien AG (Mövenstrasse 12, 9015 St. Gallen, Suíça). Após o terceiro ciclo de lavagem, o desempenho de lavagem de protease no terceiro conjunto de amostras de teste foi determinado por medição da remissão de luz a 460 nm como descrito no Exemplo 4 e cálculo de um valor de remissão Delta como a medição de remissão de uma amostra de amostra menos o valor de remissão de uma amostra de referência lavada com o mesmo detergente mas sem uma enzima (branco). A Tabela 10 em baixo mostra a soma dos 8 valores Delta em comparação com o branco para a protease de referência (SEQ ID NO: 1) e uma protease da invenção (SEQ ID NO: 1 + S3T+S9R+R19L+ N62D+A194P) determinados no terceiro conjunto de amostras de teste lavadas em água suja na qual já haviam sido realizados dois ciclos de lavagem.
Tabela 10: Soma dos valores delta em comparação com o branco para 8 manchas sensíveis à protease Protease a 3,4 Protease a 4,4 Protease a 5,7 nM nM nM Referência (SEQ ID NO: 1) 45 54 57 S3T+S9R+R19L+N62D+A194P 70 78 79

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Variante de subtilase caracterizada por compreender as substituições X9R+X19L+X62D, em que (a) os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; (b) a variante tem atividade de protease; e (c) a variante tem pelo menos 80%, mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; e com a condição de que a variante não compreende um resíduo de histidina na posição 14.
2. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender as substituições S9R+R19L+N62D e, adicionalmente, compreender pelo menos uma alteração selecionada do grupo consistindo em S3T, S3A, N43R, V68A, N76D, P131*, A194P, V205I, Q245R, S259D, N261D e R275Q, em que os números de posição correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
3. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a variante compreender um conjunto de alterações selecionadas do grupo consistindo em: ● S3T+S9R+R19L+N62D+A194P; ● S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q; ● S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P; ● S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+A194P+R275Q; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+A194P; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*+A194P. ● S3T+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q; ● S3T+S9R+R19L+N62D+P131*; ● S3T+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D; ● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+Q245R+S259D;
● S3T+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D+P131*; ● S9R+A15T+G61E+N62D+V68A+A194P+V205I+Q245R+ N261D; ● S9R+A15T+G61E+V68A+A194P+V205I+Q245R+S259D+ N261D; ● S9R+R19L+N43R+N62D+R275Q; ● S9R+R19L+N62D+P131*; ● S3A+S9R+R19L+N62D+Q245R+S259D; ● S3A+S9R+R19L+N62D+A194P; ● S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q; ● S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D; ● S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q; ● S9R+R19L+N62D+P131*+A194P: ● S9R+R19L+N43R+N62D+N76D; ● S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+Q245R+S259D+R275Q; ● S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+Q245R+S259D; ● S3A+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D; ● S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+R275Q; ● S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+R275Q; ● S3A+S9R+R19L+N62D+P131*+A194P; ● S3A+S9R+R19L+N43R+N62D+N76D; ● S9R+R19L+N43R+N62D+P131*+Q245R+S259D+R275Q; ● S9R+R19L+N43R+N62D+A194P+Q245R+S259D+R275Q; e ● S9R+R19L+N62D+P131*+A194P+Q245R+S259D.
4. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a variante compreender ou consistir em SEQ ID NO: 1 com um dos referidos conjuntos de alterações.
5. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a variante compreender as substituições X3T+X9R+X19L+X62D+X194P.
6. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P.
7. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizada por a variante compreender ou consistir em SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P.
8. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos uma alteração selecionada do grupo consistindo em N43R, N76D, P131*, Q245R, S259D e R275Q, em que os números de posição correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
9. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por compreender as substituições Q245R+S259D.
10. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a variante compreender ou consistir em SEQ ID NO: 1 com as substituições S3T+S9R+R19L+N62D+A194P+Q245R+S259D.
11. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a variante ter pelo menos 85%, p.ex., pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96% ou pelo menos 97%, mas menos do que 100% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
12. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a variante ter uma estabilidade melhorada em comparação com uma protease de referência tendo SEQ ID NO: 1 com as substituições S9R+P14H+R19L+N62D; p.ex., em que a variante tem uma estabilidade melhorada em comparação com a protease de referência quando testada no ensaio de pH baixo e/ou no ensaio de pH elevado + LAS descrito no Exemplo 2 aqui.
13. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a variante ter um desempenho de lavagem melhorado em EMPA117EH em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, p.ex., quando testado no ensaio de AMSA usando uma concentração de protease de 10 nM ou 20 nM como descrito no Exemplo 3 aqui.
14. Grânulo caracterizado por compreender: (a) um núcleo compreendendo a variante de subtilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e opcionalmente (b) um revestimento consistindo em uma ou mais camada(s) rodeando o núcleo.
15. Composição detergente caracterizada por compreender uma variante de subtilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou o grânulo, conforme definido na reivindicação 14, e pelo menos um componente detergente.
16. Uso de uma variante de subtilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, o grânulo, conforme definido na reivindicação 14, ou a composição detergente, conforme definida na reivindicação 15, caracterizado por ser em um processo de limpeza, tal como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras tal como lavagem de louça.
17. Método de limpeza, p.ex., para lavagem de roupa ou para limpeza de superfícies duras tal como lavagem de louça, caracterizado por compreender contato de um objeto com uma variante de subtilase, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, o grânulo, conforme definido na reivindicação 14, ou a composição detergente, conforme definida na reivindicação 15, sob condições adequadas para limpeza do objeto.
18. Método para obtenção de uma variante de subtilase caracterizado por compreender: (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante de uma protease parental compreendendo as mutações X9R+X19L+X62D em comparação com SEQ ID NO: 1, em que os números de posições correspondem a posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem atividade de protease e uma identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80% mas menos do que 100%, e com a condição de que a variante não compreende um resíduo de histidina na posição 14; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas para expressão da variante; e (c) recuperar a variante.
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