BR112017000102B1 - Variantes de subtilase de uma subtilase progenitora, composição detergente, uso da mesma e método para a produção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease - Google Patents
Variantes de subtilase de uma subtilase progenitora, composição detergente, uso da mesma e método para a produção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease Download PDFInfo
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Abstract
variantes de subtilases e polinucleotídeos que codificam as mesmas. a presente invenção refere-se a variantes de subtilases inovadoras que exibem estabilidade aumentada e, de preferência, desempenho de lavagem equivalente ou melhorado. as variantes da invenção são adequadas para uso, por exemplo, em composições de limpeza ou detergentes, como composições detergentes de lavandaria e composições de lavagem de louça, incluindo composições de lavagem automática de louça. a presente invenção também se refere a sequências de dna isoladas que codificam as variantes, vetores de expressão e células hospedeiras, e métodos de produção e uso das variantes da invenção.
Description
[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em suporte informático legível, que é incorporada aqui por referência.
[0002] A presente invenção refere-se a variantes de subtilases inovadoras que exibem estabilidade aumentada e, de preferência, desempenho de lavagem equivalente ou melhorado. As variantes da invenção são adequadas para uso, por exemplo, em composições de limpeza ou detergentes, como composições de detergentes de lavandaria e composições de lavagem de louça, incluindo composições de lavagem automática de louça. A presente invenção também se refere a sequências de DNA isoladas que codificam as variantes, vetores de expressão, células hospedeiras, e métodos de produção e uso das variantes da invenção.
[0003] Na indústria de detergentes, enzimas têm sido utilizadas, há muitas décadas, em formulações de lavagem. Enzimas usadas em tais formulações compreendem proteases, lipases, amilases, celulases, manosidases bem como outras enzimas ou suas misturas. Do ponto de vista comercial, as enzimas mais importantes são proteases.
[0004] Um número crescente de proteases usadas comercialmente são variantes proteicas manipuladas de proteases do tipo selvagem de ocorrência natural Everlase®, Relase®, Ovozyme®, Polarzyme®, Liquanase®, Liquanase Ultra® e Kannase® (Novozymes a/s), Purafast®, Purafect OXP®, FN3®, FN4® e Eraser®, Excellase® (Genencor International, Inc.). Além disso, diversas variantes são descritas na técnica, como no documento WO2004/041979 (Novozymes A/S) que descreve variantes de subtilases que exibem alterações em relação à subtilase progenitora, por exemplo, no desempenho de lavagem, estabilidade térmica, estabilidade no armazenamento ou atividade catalítica. As variantes são adequadas para uso, por exemplo, em composições de limpeza ou detergentes.
[0005] Foram descritas diversas variantes de subtilases úteis, muitas das quais proporcionaram atividade, estabilidade e solubilidade melhoradas em diferentes detergentes.
[0006] No entanto, vários fatores tornam vantajosa uma melhoria adicional das proteases. As condições de lavagem, como a temperatura e o pH, se alteram ao longo do tempo e muitas manchas ainda são difíceis de remover completamente em condições convencionais de lavagem. Além disso, condições de lavagem podem resultar na inativação das enzimas (devido, por exemplo, ao pH, temperatura ou instabilidade por quelação) originando perda de desempenho de lavagem durante o ciclo de lavagem. Assim, apesar da pesquisa intensiva no desenvolvimento de proteases, continuam a ser necessárias proteases novas e melhoradas que tenham estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em lavagem melhorada, e, preferencialmente, desempenho de lavagem similar ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora.
[0007] A presente invenção refere-se a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com sua subtilase progenitora.
[0008] Em um aspecto, a invenção refere-se a variantes de subtilase que têm atividade de protease e que compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0009] Um outro aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, que compreendem duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em: X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0010] A presente invenção também se refere às variantes de subtilases que têm estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em lavagem melhorada, e, de preferência, desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a protease progenitora ou em comparação com uma protease de referência. A presente invenção refere-se adicionalmente a polinucleotídeos que codificam as variantes de subtilases; composições, preferencialmente, composições detergentes, compreendendo a variante de subtilase; uso das composições em um processo de limpeza e métodos para obter uma variante de subtilase e para remover uma mancha de uma superfície.
[0011] O termo "variante alélica" significa qualquer uma dentre duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
[0012] O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura e submetida a splicing obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo splicing, antes de aparecer como mRNA maduro submetido a splicing.
[0013] O termo “sequência codificadora” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. Os limites da sequência codificadora são geralmente determinados por uma fase de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificadora pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma combinação dos mesmos.
[0014] O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (ou seja, do mesmo gene) ou estranha (ou seja, de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo que codifica a variante nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, uma sequência de poliadenilação, uma sequência de pró- peptídeo, um promotor, uma sequência de peptídeo sinal e um terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificadora do polinucleotídeo que codifica uma variante.
[0015] O termo "componente detergente" é definido no presente documento como os tipos de produtos químicos que podem ser usados em composições detergentes. Exemplos de componentes detergentes são tensoativos, hidrotropos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes de branqueamento fluorescentes, perfumes, branqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, polímeros de libertação de sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizadores da enzima, ativadores de enzimas, antioxidantes e solubilizantes. A composição detergente pode compreender um ou mais de qualquer tipo de componente detergente.
[0016] O termo "composição detergente" inclui, a menos que indicado em contrário, todas as formas de composições detergentes, como composições em gel, granuladas, líquidas, em pasta, em pó, pulverização ou placas, incluindo líquidos para trabalhos pesados (HDL), detergentes líquidos para tecidos sensíveis, detergente líquido e/ou sólidos para lavagem de roupa e detergentes para tecidos sensíveis; formulações para limpeza de superfícies duras, por exemplo, para balcões e janelas de vidro, madeira, cerâmica e metal; produtos de limpeza para carpetes; produtos de limpeza para fornos; perfumadores de tecidos; amaciadores de tecidos; produtos de pré-tratamento de têxteis e lavagem de roupa, bem como detergentes para lavagem de louça, como agentes para lavagem manual de louça, agentes de lavagem de louça para trabalhos leves, agentes para lavagem de louça à máquina; agentes de lavagem polivalentes ou para trabalhos pesados, agentes de lavagem polivalentes líquidos, em forma de gel ou pasta, agentes líquidos de limpeza e desinfetantes, incluindo os tipos antibacterianos de lavagem manual, barras de limpeza, elixires bucais, produtos de limpeza de dentaduras, xampus para carros ou carpetes, produtos de limpeza sanitária; xampus para o cabelo e para lavagem dos cabelos; géis de banho, espumas para banho; produtos de limpeza de metais; bem como auxiliares de limpeza, como aditivos alvejantes e os tipos "tira-manchas" ou pré-tratamento.
[0017] Para além de conter uma variante de subtilase da invenção, a formulação detergente pode conter uma ou mais enzimas adicionais (tais como proteases, amilases, lipases, cutinases, celulases, endoglucanases, xiloglucanases, pectinases, pectina liases, xantanases, peroxidases, haloperoxigenases, catalases e mananases, ou qualquer mistura destas), e/ou componentes, tais como surfactantes, adjuvantes, queladores ou agentes quelantes, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, amaciadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, corantes, perfumes, inibidores de acastanhamento, abrilhantadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, agentes anticorrosão, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, transferase (ou transferases), enzimas hidrolíticas, óxido redutases, agentes de anilação e corantes fluorescentes, antioxidantes, e solubilizadores.
[0018] O termo "lavagem de louça" se refere a todas as formas de lavagem de louça, por exemplo, lavagem de louça à mão ou automática. Lavagem de louça inclui, mas sem limitação, a limpeza de todas as formas de louça de barro tais como pratos, taças, copos, tigelas, todas as formas de talheres tais como colheres, facas, garfos e utensílios de cozinha bem como cerâmicas, plásticos, metais, porcelana, vidro e acrílicos.
[0019] O termo "composição de lavagem de louça" se refere a todas as formas de composições para lavagem de superfícies duras. A presente invenção não está restringida a qualquer tipo particular de composição de lavagem de louça ou qualquer detergente particular.
[0020] O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, mas sem limitação, a transcrição, a modificação pós-transcricional, a tradução, a modificação pós-translacional e a secreção.
[0021] O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.
[0022] O termo "limpeza de superfícies duras" é definido aqui como limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir pisos, mesas, paredes, tetos, etc., bem como superfícies de objetos duros, como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça). Lavagem de louça inclui, mas sem limitação, limpeza de pratos, taças, copos, tigelas, e talheres tal como colheres, facas, garfos, utensílios para servir, cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos.
[0023] O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução ou similar, sendo que um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não seja idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0024] O termo “propriedade melhorada” significa uma característica associada a uma variante de subtilase que é melhorada em comparação com a subtilase progenitora ou em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, ou em comparação com uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos idêntica à variante, mas excluindo as alterações na variante. Tais propriedades melhoradas incluem, mas sem limitação, desempenho por lavagem, atividade de protease, perfil de atividade térmica, termoestabilidade, perfil de atividade por pH, estabilidade a pH, especificidade substrato/cofator, propriedades de superfície melhoradas, especificidade para substrato, especificidade para produto, estabilidade aumentada, estabilidade melhorada em condições de armazenamento e estabilidade química.
[0025] O termo “estabilidade” inclui estabilidade de armazenamento e estabilidade durante o uso, por exemplo, durante um processo de lavagem, e reflete a estabilidade da variante de subtilase de acordo com a invenção em função do tempo, por exemplo, quanta atividade é retida quando a variante de subtilase é mantida em solução, em particular, em uma solução detergente. A estabilidade é influenciada por muitos fatores, por exemplo, pH, temperatura, composição detergente, por exemplo, quantidade de adjuvante, tensoativos, etc. A estabilidade da variante de subtilase pode ser medida com o uso do ensaio descrito no Exemplo 3. O termo "estabilidade melhorada" ou "estabilidade aumentada" é definido no presente documento como uma subtilase variante que exibe uma estabilidade aumentada em soluções, em relação à estabilidade da subtilase progenitora, em relação a uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos idêntica à variante, mas excluindo as alterações na variante ou relativas a SEQ ID NO: 1. Os termos “estabilidade melhorada” e “estabilidade aumentada” incluem “estabilidade química melhorada”, “estabilidade em detergente” ou “estabilidade melhorada em detergente”.
[0026] O termo “estabilidade química melhorada” é definido no presente documento como uma subtilase variante que exibe retenção de atividade enzimática após um período de incubação na presença de um produto químico ou produtos químicos, de ocorrência natural ou origem sintética, que reduz a atividade enzimática da enzima progenitora. A estabilidade química melhorada também pode fazer com que variantes sejam mais capazes de catalisar uma reação na presença de tais agentes químicos. Em um aspecto particular da invenção, a estabilidade química melhorada é uma estabilidade melhorada em um detergente, em particular, em um detergente líquido. O termo “estabilidade em detergente” ou “estabilidade melhorada em detergente” é, em particular, uma estabilidade melhorada da atividade de protease quando uma variante de subtilase da presente invenção é misturada em uma formulação detergente líquida, especialmente em uma formulação detergente líquida de acordo com a Tabela 1, e então armazenada a temperaturas entre 15 e 50 °C, por exemplo, 20 °C, 30 °C ou 40 °C.
[0027] O termo “atividade térmica melhorada” significa uma variante que exibe um perfil de atividade dependente da temperatura alterado a uma temperatura específica em relação ao perfil de atividade dependente da temperatura do progenitor, em relação a uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos idêntica à variante, mas que exclui as alterações na variante ou em relação a uma protease com SEQ ID NO: 1. O valor da atividade térmica fornece uma medida da eficiência da variante na intensificação da catálise de uma reação de hidrólise ao longo de uma faixa de temperaturas. Uma variante termicamente mais ativa conduzirá a um aumento da intensificação da taxa de hidrólise de um substrato por uma composição enzimática, desse modo, decrescendo o tempo requerido e/ou decrescendo a concentração da enzima requerida para atividade. Alternativamente, uma variante com uma atividade térmica reduzida irá intensificar uma reação enzimática a uma temperatura menor do que a temperatura ideal da enzima progenitora definida pelo perfil de atividade dependente da temperatura da enzima progenitora.
[0028] O termo “desempenho de lavagem melhorado” é definido no presente documento como uma variante de subtilase de acordo com a invenção que exibe um desempenho de lavagem melhorado em relação ao desempenho de lavagem da protease progenitora, em relação a um polipeptídeo com SEQ ID NO: 1, ou em relação a uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos idêntica da variante, mas excluindo as alterações na variante, por exemplo, por meio da remoção de manchas aumentada. O termo "desempenho de lavagem" inclui o desempenho na lavagem de roupa, mas também, por exemplo, na lavagem de louça. O desempenho de lavagem pode ser quantificado conforme descrito sob a definição de “desempenho de lavagem” no presente documento.
[0029] O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.
[0030] O termo “lavagem de roupa” se refere tanto à lavagem de roupa doméstica como à lavagem de roupa industrial e significa o processo de tratamento de têxteis e/ou tecidos com uma solução contendo uma composição detergente da presente invenção. O processo de lavagem de roupa pode, por exemplo, ser realizado usando, por exemplo, uma máquina de lavar doméstica ou industrial ou pode ser realizado manualmente.
[0031] O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós- translacionais, como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, ativação autocatalítica, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é um dos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 1 e 1 a 275 de SEQ ID NO: 2. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.
[0032] O termo "sequência codificadora do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro que tem atividade de protease.
[0033] O termo "mutante" significa um polinucleotídeo que codifica uma variante.
[0034] O termo "construto de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que, de outra maneira, não existiria na natureza ou que é sintética, a qual compreende uma ou mais sequências de controle.
[0035] O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificadora.
[0036] O termo “progenitor” significa uma protease na qual é efetuada uma alteração para produzir as variantes de subtilase da presente invenção. Assim, a progenitora é uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos idêntica à variante, mas que não tem as alterações em uma ou mais, por exemplo, duas ou mais das posições especificadas. Será entendido que, no presente contexto, a expressão “que tem sequência de aminoácidos idêntica” se refere a 100% de identidade de sequência. Em uma modalidade particular, a progenitora é uma protease com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com qualquer um dos polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12. Os exemplos de proteases progenitoras e subtilases progenitoras são descritos em "proteases progenitoras".
[0037] O termo "protease" é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas. O termo inclui qualquer enzima pertencente ao grupo enzimático EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses). O número EC refere-se à Nomenclatura Enzimática 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1 a 5 publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1 a 6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1 a 6; e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610 a 650; respectivamente. As proteases mais amplamente usadas na indústria de detergente, como lavagem de roupas e de louça, são as serina proteases ou serina peptidases, que são um subgrupo de proteases distinguidas por terem uma serina no sítio ativo, que forma um aduto covalente com o substrato. Adicionalmente, as subtilases (e as serina proteases) são caracterizadas por terem dois resíduos de aminoácidos de local ativo separados da serina, nomeadamente um resíduo de histidina e ácido aspártico. A "subtilase" se refere a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 a 737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501 a 523. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, isto é, a família das subtilisinas, a família das termitases, a família da proteinase K, a família das peptidases lantibióticas, a família das quexinas e a família das pirolisinas. O termo “atividade de protease” significa atividade proteolítica (EC 3.4). As proteases utilizáveis em detergentes são principalmente endopeptidases (EC 3.4.21). Existem vários tipos de atividade de protease: Os três principais tipos de atividade são: tipo tripsina onde existe clivagem de substratos de amida após Arg ou Lys em P1, tipo quimotripsina onde a clivagem ocorre após um dos aminoácidos hidrofóbicos em P1, e tipo elastase com clivagem após uma Ala em P1. Para propósitos da presente invenção, a atividade de proteína, como a atividade de protease, é determinada de acordo com o procedimento descrito na seção de Exemplos abaixo. Em um aspecto, as variantes de subtilase da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade enzimática do polipeptídeo maduro da enzima progenitora. Em um aspecto particular, as variantes de subtilase da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100 % da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0038] O termo “atividade de protease” significa uma atividade proteolítica (EC 3.4). As proteases da invenção são endopeptidases (EC 3.4.21). Existem vários tipos de atividade de protease: Os três principais tipos de atividade são: tipo tripsina, na qual existe clivagem de substratos de amida após Arg ou Lys em P1, tipo quimotripsina, na qual a clivagem ocorre após um dos aminoácidos hidrofóbicos em P1, e tipo elastase com clivagem após uma Ala em P1. Para propósitos da presente invenção, a atividade de protease é determinada de acordo com o ensaio de atividade Suc-AAPF-pNA descrito em “Materiais e Métodos” no presente documento. As variantes de subtilase da presente invenção têm, de preferência, pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0039] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência". Para os propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48: 443 a 453) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento).
[0040] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)
[0041] O termo "variante substancialmente pura" significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual está nativa ou recombinantemente associado. De preferência, a variante é pelo menos 92% pura, por exemplo, pelo menos 94% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 96% pura, pelo menos 97% pura, pelo menos 98% pura, pelo menos 99% pura, pelo menos 99,5% pura e 100% pura em peso do material polipeptídico total presente na preparação. As variantes da presente invenção estão o, de preferência, sob uma forma substancialmente pura. Isso pode ser alcançado, por exemplo, preparando- se a variante por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.
[0042] O termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeos isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual está nativa ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas que ocorrem naturalmente, tais como promotores e terminadores. É preferencial que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, por exemplo, pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro e pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura.
[0043] O termo "têxtil" significa qualquer material têxtil incluindo fios, intermediários de fios, fibras, materiais não urdidos, materiais naturais, materiais sintéticos, bem como tecidos feitos destes materiais, como peças de vestuário, roupas e outros artigos. Quando o termo tecido ou peças de vestuário é usado, o mesmo se destina a incluir também o termo têxteis, o qual é mais amplo.
[0044] O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de protease que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições em comparação com a protease progenitora. Uma substituição significa substituição do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos adjacentes e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição. O termo variante de subtilase se refere a uma variante de um progenitor de subtilase, isto é, uma variante de subtilase e é uma subtilase que compreende alterações isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições em comparação com a subtilase progenitora.
[0045] O termo “desempenho de lavagem” é usado como a capacidade de uma enzima de remover manchas presentes no objeto a ser limpo durante, por exemplo, lavagem, como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras. A melhoria do desempenho de lavagem pode ser quantificada calculando o denominado valor de intensidade (Int) definido no ensaio AMSA, como descrito na seção Materiais e Métodos.
[0046] O termo “subtilase de tipo selvagem” significa uma protease expressa por um organismo de ocorrência natural, como uma bactéria, archaea, levedura, fungo, planta ou animal, presente na natureza. Um exemplo de uma subtilase do tipo selvagem é savinase, isto é, aminoácido 1 a 269 de SEQ ID NO: 1 ou BPN', isto é, aminoácido 1 a 275 de SEQ ID NO: 2.
[0047] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo (BPN') divulgado na SEQ ID NO: 2 é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra protease. A sequência de aminoácidos de outra protease é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2, e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo divulgado em SEQ ID N°: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).
[0048] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra protease pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências polipeptídicas com o uso de vários programas de computador que inclui, porém sem limitação, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por -expectativa log; versão 3.5 ou superior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792 a 1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059 a 3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511 a 518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372 a 374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39 a 64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899 a 1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673 a 4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.
[0049] Quando a outra enzima divergir do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de modo que a comparação tradicional à base de sequências não consiga detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J Mol. Biol. 295: 613 a 615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequências pareadas. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797 a 815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874 a 881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê o dobramento estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903 a 919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.
[0050] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser transferidos por download. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88 a 96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739 a 747), e pode ser adicionalmente utilizada implantação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566 a 567).
[0051] Ao descrever as variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceita da IUPAC.
[0052] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Consequentemente, a substituição de histidina na posição 226 por alanina é designada como "His226Ala" ou "H226A". Múltiplas mutações podem ser separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Ile205Arg + Leu217Phe" ou "I205R + L217F", que representam substituições nas posições 205 e 217 de isoleucina (I) por arginina (R) e leucina (L) por fenilalanina (F), respectivamente. No contexto do presente pedido, as substituições são normalmente indicadas com o aminoácido presente em savinase (SEQ ID NO: 1) em uma posição que corresponde à posição de BPN' (SEQ ID NO: 2). Conforme descrito em "protease progenitora", diversas proteases progenitoras são adequadas para a fabricação das variantes divulgadas. Será evidente para o versado na técnica que o aminoácido substituído, isto é, o aminoácido precedente pode ser diferente daqueles de savinase (SEQ ID NO: 1) se os variantes forem feitos a partir de um outro progenitor. Isso poderia ser demonstrado por um X que representa qualquer aminoácido indicando que qualquer aminoácido original na posição pode ser substituído. Por exemplo, X9E significa que qualquer resíduo de aminoácidos na posição 9 além de E é substituído por E.
[0053] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Em conformidade, a deleção de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". Múltiplas deleções são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Gly195* + Ser9*" ou "G195* + S9*".
[0054] Inserções: A inserção de um resíduo de aminoácido adicional, tal como, por exemplo, uma lisina após G195, pode ser indicada por: Gly195GlyLys ou G195GK. Alternativamente, a inserção de um resíduo de aminoácido adicional como lisina após G195 pode ser indicada por: *195aK. Quando é inserido mais do que um resíduo de aminoácido, tal como, por exemplo, um Lys, e Ala após G195, isto pode ser indicado como: Gly195GlyLysAla ou G195GKA. Em tais casos, o resíduo (ou resíduoss) de aminoácido inserido também pode ser numerado pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o resíduo (ou resíduos) de aminoácido inserido, neste exemplo: *195aK *195bA. No exemplo acima, as sequências 194 até 196 serão assim: 194 195 196 Savinase A - G - L 194 195 195a 195b 196 Variante A - G - K - A - L
[0055] Nos casos em que ocorre uma substituição e uma inserção na mesma posição, isto pode ser indicado como S99SD+S99A ou abreviado como S99AD. A mesma modificação também pode ser indicada como S99A + *99aD.
[0056] Nos casos em que é inserido um resíduo de aminoácido idêntico ao resíduo de aminoácido existente, é claro que surge degenerescência na nomenclatura. Se, por exemplo, uma glicina for inserida após a glicina no exemplo acima, tal será indicado por G195GG ou *195GaG. A mesma alteração real pode igualmente ser indicada como A194AG ou *194aG para a alteração de: 194 195 196 Savinase A - G - L Em: 194 195 195a 196 Variante A - G - G - L 194 194a 195 196
[0057] Tais Casos Serão Evidentes Para O Versado Na Técnica E, Assim, Pretende-se Que A Indicação G195gg E Indicações Correspondentes Para Esse Tipo De Inserções Compreendam Tais Indicações Degeneradas Equivalentes.
[0058] Múltiplas alterações: Variantes compreendendo múltiplas alterações são separadas por sinais de adição ("+"), por exemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" ou "R170Y+G195E" representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente. Alternativamente, múltiplas alterações podem ser separadas por um espaço ou uma vírgula, por exemplo, R170Y G195E ou R170Y, G195E respectivamente.
[0059] Alterações diferentes: Quando alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" e "Tyr167Ala+Arg170Ala".
[0060] Alternativamente, diferentes alterações ou substituições opcionais podem ser indicadas entre parênteses, por exemplo, Arg170[Tyr, Glu] ou Arg170{Tyr, Glu} ou abreviado R170 [Y,G] ou R170 {Y,G}.
[0061] Exceto quando indicado em contrário, a numeração de aminoácido usada no presente documento corresponde à sequência de aminoácidos de subtilase BPN' (BASBPN). A sequência de aminoácidos de subtilisina BPN' é a sequência de aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 2 (Siezen et al., 1991, Protein Eng. 4: 719 a 737).
[0062] A Tabela 1 do documento sob o n° WO 89/06279 mostra o alinhamento do polipeptídeo maduro da sequência de subtilase BPN’ (BASBPN) (sequência c na Tabela 1) e do polipeptídeo maduro de subtilisina 309 de B. Lentus, também conhecida como Savinase®, (BLSAVI) (sequência a na Tabela 1).
[0063] A presente invenção refere-se a variantes de subtilase com estabilidade melhorada em comparação com sua subtilase progenitora. Um aspecto preferencial particular da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com sua subtilase progenitora. De preferência, as variantes de subtilase, de acordo com a invenção, têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1. Um aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de um progenitor de subtilase, isto é, "variantes de subtilase", que tem atividade de protease e tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, em que a variante de subtilase compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0064] Cada uma das mutações únicas acima aumenta a estabilidade em comparação com a subtilase progenitora. Dessa forma, a introdução de qualquer uma das substituições acima em um progenitor de subtilase fornece estabilidade aumentada.
[0065] Conforme mencionado, cada uma das mutações únicas aumenta a estabilidade em comparação com a subtilase progenitora, e a adição de duas, três, quatro, etc. dessas mutações aumenta a estabilidade ainda mais, conforme pode ser visto no Exemplo 4. Dessa forma, um aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de um progenitor de subtilase, em que a variante de subtilase tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, em que a variante de subtilase compreende duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0066] A protease progenitora é, de preferência, selecionada a partir de proteases com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com qualquer um dos polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
[0067] A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11. A variante de subtilase é, de preferência, selecionada a partir de variantes de subtilase com pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos que 100% de identidade com o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.
[0068] Um aspecto da invenção se refere a variantes de um progenitor de subtilase, em que a variante de subtilase tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, em que a variante de subtilase compreende duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 60% de identidade, como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos que 100% de identidade com um polipeptídeo com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
[0069] Um aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 50% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0070] Um outro aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 75% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0071] Um outro aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 100% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0072] Um outro aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25%, como pelo menos 30%, como pelo menos 35% como pelo menos 40%, como pelo menos 45%, como pelo menos 50%, como pelo menos 55%, como pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, como pelo menos 75%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95%, como pelo menos 100%, como pelo menos 105%, como pelo menos 110%, como pelo menos 115% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0073] A estabilidade melhorada é, nesse contexto, medida pelo fator de melhoria conforme descrito no Exemplo 4 no presente documento. Presume-se que o decréscimo em atividade durante a incubação com detergente seja exponencial. As meia-vidas (T7) foram encontradas a partir da regressão linear de Log(Atividade) versus tempo de incubação (0, 1 a 4 e 20 a 25 horas), e os fatores de melhoria de meia-vida (T7 IF) foram calculados como meia-vida de variante de subtilase em relação à meia-vida da enzima de referência. A enzima de referência no Exemplo 3 é Savinase (SEQ ID NO: 1) com mutação N76D (SEQ ID NO: 3). A enzima de referência nos Exemplos 5 e 6 é SEQ ID NO: 8. A enzima de referência é, de preferência, uma subtilase progenitora, dessa forma, a contribuição de cada mutação pode ser medida. O termo estabilidade melhorada é, nesse contexto, o fator de melhoria conforme calculado acima, indicado como uma porcentagem de melhoria. Dessa forma, 25% de melhoria corresponde a um fator de melhoria de 1,25 e assim por diante.
[0074] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 1 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0075] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 2, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 2 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 2.
[0076] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 3, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 3 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 3.
[0077] Um aspecto preferencial se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, em que a subtilase compreende a substituição N76D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q2R, W6I, I8C, I8H, S9C, S9D, S9E, S9Q, N18S, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, S49T, G53A, G53L, G61D, I72A, I72V, S78D, S78N, V104F, V104P, V104T, V104Y, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, V149Q, A158E, G160D, G160P, S161C, S161Y, S161E, I162L, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N184D, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, A194D, A194E, N204D, N204V, V205I, V205L, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, Y209L, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222N, M222R, P225A, P225S, V244H, N248H, T255C, T255E, T255Q, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260A, T260E, T260P, N261D, N261C, N261E, N261L, N261M, N261R, N261V, N261W, N261Y, N261F, L262Y, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0078] Um outro aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, que compreendem a substituição N76D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q2R, W6I, I8C, I8H, S9C, S9D, S9E, S9Q, N18S, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, S49T, G53A, G53L, G61D, I72A, I72V, S78D, S78N, V104F, V104P, V104T, V104Y, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, V149Q, A158E, G160D, G160P, S161C, S161Y, S161E, I162L, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N184D, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, A194D, A194E, N204D, N204V, V205I, V205L, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, Y209L, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222N, M222R, P225A, P225S, V244H, N248H, T255C, T255E, T255Q, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260A, T260E, T260P, N261D, N261C, N261E, N261L, N261M, N261R, N261V, N261W, N261Y, N261F, L262Y, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0079] Um outro aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, que compreendem a substituição N76D e duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q2R, W6I, I8C, I8H, S9C, S9D, S9E, S9Q, N18S, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, S49T, G53A, G53L, G61D, I72A, I72V, S78D, S78N, V104F, V104P, V104T, V104Y, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, V149Q, A158E, G160D, G160P, S161C, S161Y, S161E, I162L, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N184D, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, A194D, A194E, N204D, N204V, V205I, V205L, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, Y209L, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222N, M222R, P225A, P225S, V244H, N248H, T255C, T255E, T255Q, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260A, T260E, T260P, N261D, N261C, N261E, N261L, N261M, N261R, N261V, N261W, N261Y, N261F, L262Y, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0080] Um aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, que compreendem a substituição N76D e uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q2R, W6I, I8C, I8H, N18S, S49T, G53A, G53L, G61D, S78N, V104P, V104T, V104Y, V149Q, S161Y, I162L, A194D, A194E, V205L, Y209L, M222A, P225S, V244H, N248H, T255Q, T260A, N261R e L262Y, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0081] Um outro aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, que compreendem a substituição N76D e uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262Ee L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0082] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 4, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 4 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 4.
[0083] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 5, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 5 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 5.
[0084] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 6, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 6 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 6.
[0085] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 7, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 7 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 7.
[0086] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 8, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 8 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 8.
[0087] Um aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 8 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3V, S3Y, S9M, P40E, N43E, N43D, R45E, H120I, H120D, A133E, Q182E, S188T, V205I, Q206E, S212D, N218D, A228S, Q236E, Q245R,S259D, L262Y e A270G, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0088] Um outro aspecto preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 8 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3V, S3Y, S9M, S9C, S9D, S9E, S9Q, P40E, N43E, N43D, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, R45E, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120D, H120I, H120T, H120V, P129D, A133E, V147W, V149C, 149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182E,Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188T, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, N218D, M222C, M222R, P225A, A228S, Q236E, Q245R, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262Y, L262C, L262E, L262Q e A270G, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0089] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 9, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 9 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 9.
[0090] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 10, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 10 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 10.
[0091] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 11, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 11 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 11.
[0092] Um aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 12, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3, conforme descrito no presente documento, e em que a variante de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 12 compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem pelo menos 80% de identidade com SEQ ID NO: 12.
[0093] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora ou com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo da subtilase progenitora, com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0094] Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante de subtilase compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é a) um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da subtilase progenitora; ou b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora.
[0095] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 65%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 70%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 75%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 85%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 90%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 93%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 95%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 96%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 97%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 98%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da subtilase progenitora.
[0096] Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 65%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 75%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 80%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 85%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 90%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 93%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 95%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 96%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 97%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase é codificada por um polinucleotídeo que tem pelo menos 98%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora.
[0097] Em um aspecto, o número total de alterações na variante de subtilase em comparação com a subtilase progenitora é entre 3 e 30, de preferência, entre 3 e 20, com mais preferência, entre 3 e 15, com mais preferência ainda, entre 3 e 10, com a máxima preferência, entre 3 e 8 alterações. Em um outro aspecto, o número total de alterações na subtilase progenitora é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 alterações.
[0098] A subtilase progenitora pode ser qualquer subtilase. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 1. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 270 de SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 270 de SEQ ID NO: 6. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 8. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 9. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 10. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 11. Em um aspecto, a subtilase progenitora é um dos aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 12.
[0099] Uma modalidade da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0100] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 65%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 70%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 75%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 85%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 90%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 93%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 95%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 96%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 97%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 98%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0101] Em um aspecto, o número total de alterações no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é entre 3 e 30, preferencialmente, entre 3 e 20, mais preferencialmente, entre 3 e 15, ainda mais preferencialmente, entre 3 e 10, com máxima preferência, entre 3 e 8 alterações. Em um outro aspecto, o número total de alterações no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 alterações.
[0102] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em lavagem melhorada e/ou desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0103] Em uma modalidade, a invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, 9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, 120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, 185E, 188C, 188D, 188E, 191N, 204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12;
[0104] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 65%, como pelo menos 70%, como pelo menos 75%, como pelo menos 80%, como pelo menos 81%, como pelo menos 82%, como pelo menos 83%, como pelo menos 84%, como pelo menos 85%, como pelo menos 86%, como pelo menos 87%, como pelo menos 88%, como pelo menos 89%, como pelo menos 90%, como pelo menos 91%, como pelo menos 92%, como pelo menos 93%, como pelo menos 94%, como pelo menos 95%, como pelo menos 96%, como pelo menos 97%, como pelo menos 98%, como pelo menos 99%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com qualquer um dos polipeptídeos que compreendem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0105] Em um aspecto, o número total de alterações em qualquer um dos polipeptídeos progenitores selecionados a partir de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 é entre 3 e 30, de preferência, entre 3 e 20, com mais preferência, entre 3 e 15, com mais preferência ainda, entre 3 e 10, com a máxima preferência, entre 3 e 8 alterações. Em um outro aspecto, o número total de alterações em qualquer um dos polipeptídeos progenitores selecionados a partir de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 alterações.
[0106] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com qualquer um dos polipeptídeos com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em lavagem melhorada e/ou desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com qualquer um dos polipeptídeos com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0107] Em uma modalidade particular, a subtilase progenitora é qualquer uma das subtilases SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 e mutações estabilizantes de quaisquer preferências particulares selecionadas a partir das seguintes substituições S9C, S9D, S9E, S9Q, N43C, N43R, I72A, G115W, H120V, P129D, A158E, G160D, G160P, Q182E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206I, Q206V, Q206W, Q206L, Y209W, S212D, S212G, S212N, S216V, L217C, L217M, N218T, P225A, S256C, S256D, S259D, T260E, N261C, N261E, N261L, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q. Cada uma dessas mutações fornece estabilidade significativamente melhorada. Conforme mencionado, os inventores constataram que a adição de duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou até mais mutações estabilizantes aumenta ainda mais o efeito estabilizante. Dessa forma, uma modalidade preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante de subtilase compreende duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43C, N43R, I72A, G115W, H120V, P129D, A158E, G160D, G160P, Q182E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206I, Q206V, Q206W, Q206L, Y209W, S212D, S212G, S212N, S216V, L217C, L217M, N218T, P225A, S256C, S256D, S259D, T260E, N261C, N261E, N261L, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com a subtilase progenitora, em que a protease progenitora é selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12.
[0108] As mutações estabilizantes preferenciais ainda mais particulares são selecionadas a partir das seguintes substituições S9E, N43R, H120V, Q182E, Q191N, N204D, V205I, Q206L, Y209W, S212G, S216V, S256D, S259D, N261E, N261W e L262E. Dessa forma, uma outra modalidade preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9E, N43R, H120V, Q182E, Q191N, N204D, V205I, Q206L, Y209W, S212G, S216V, S256D, S259D, N261E, N261W e L262E, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a protease progenitora e em que a protease progenitora é selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12.
[0109] Em um aspecto da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste em uma ou mais, de preferência, duas ou mais das substituições na Tabela 1, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste em uma ou mais, de preferência, duas ou mais das substituições na Tabela 1, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em um aspecto da invenção, a variante de subtilase compreende uma sequência de aminoácidos que compreende uma ou mais, de preferência, duas ou mais substituições em comparação com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, em que a substituição (ou substituições) é selecionada a partir das substituições da Tabela 1 e em que as posições correspondem à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou com qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12. Tabela 1: Variantes de subtilase SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 + uma ou mais mutações listadas abaixo
[0110] Em uma modalidade, a subtilase progenitora é a subtilase que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Dessa forma, em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0111] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0112] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0113] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9Q no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0114] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0115] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0116] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43L no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0117] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43R no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0118] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0119] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0120] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0121] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S78D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0122] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V104F no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0123] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115T no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0124] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0125] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120I no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0126] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120T no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0127] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0128] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição P129D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0129] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V147W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0130] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0131] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149N no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0132] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição A158E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0133] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0134] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160P no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0135] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0136] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0137] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0138] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0139] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0140] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0141] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0142] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0143] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0144] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0145] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0146] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q191N no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0147] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0148] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0149] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V205I no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0150] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0151] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0152] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206I no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0153] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206K no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0154] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206T no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0155] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0156] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0157] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206L no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0158] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Y209W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0159] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0160] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0161] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212G no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0162] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212N no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0163] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216I no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0164] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216T no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0165] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0166] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L217C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0167] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L217M no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0168] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N218T no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0169] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0170] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222R no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0171] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição P225A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0172] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0173] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0174] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0175] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0176] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0177] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0178] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256Y no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0179] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S259D no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0180] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0181] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260P no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0182] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0183] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0184] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261L no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0185] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261M no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0186] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261V no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0187] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0188] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261Y no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0189] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261F no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que cada posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2.
[0190] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0191] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0192] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262Q no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0193] Em uma modalidade preferencial da invenção, a variante é um polipeptídeo que tem as substituições de acordo com a invenção e tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica a SEQ ID NO: 1. Dessa forma, em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0194] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0195] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0196] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9Q, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0197] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0198] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0199] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0200] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43R, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0201] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0202] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0203] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0204] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S78D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0205] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V104F, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0206] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição A114V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0207] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0208] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0209] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0210] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0211] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0212] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição P129D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0213] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V147W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0214] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0215] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0216] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição A158E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0217] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0218] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160P, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0219] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0220] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0221] A variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos. Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0222] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0223] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0224] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0225] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0226] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0227] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0228] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0229] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S188E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0230] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q191N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0231] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0232] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0233] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V205I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0234] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0235] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0236] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0237] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206K, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0238] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0239] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0240] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0241] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0242] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Y209W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0243] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0244] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0245] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212G, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0246] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0247] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0248] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0249] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0250] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L217C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0251] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L217M, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0252] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N218T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0253] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0254] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222R, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0255] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição P225A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0256] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0257] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0258] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0259] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0260] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0261] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0262] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256Y, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0263] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S259D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0264] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0265] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260P, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0266] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0267] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0268] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0269] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261M, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0270] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0271] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0272] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261Y, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0273] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261F, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0274] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0275] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0276] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262Q, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1.
[0277] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X9C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0278] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X9D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0279] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X9E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0280] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X9Q em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0281] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X43A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0282] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X43C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0283] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X43L em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0284] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X43R em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0285] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X43W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0286] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X72A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0287] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X72V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0288] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X78D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0289] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X104F em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0290] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X114V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0291] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X115T em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0292] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X115W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0293] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X120I em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0294] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X120T em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0295] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X120V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0296] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X129D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0297] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X147W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0298] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X149C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0299] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X149N em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0300] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X158E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0301] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X160D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0302] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X160P em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0303] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X161C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0304] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X161E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0305] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X163A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0306] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X163D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0307] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X182C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0308] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X182E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0309] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X185C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0310] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X185E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0311] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X188C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0312] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X188D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0313] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X188E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0314] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X191N em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0315] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X204D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0316] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X204V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0317] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X205I em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0318] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0319] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0320] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206I em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0321] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206K em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0322] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206T em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0323] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0324] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0325] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X206L em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0326] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X209W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0327] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X212A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0328] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X212D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0329] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X212G em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0330] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X212N em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0331] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X216I em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0332] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X216T em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0333] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X216V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0334] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X217C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0335] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X217M em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0336] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X218T em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0337] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X222C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0338] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X222R em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0339] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X225A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0340] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X255C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0341] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X255E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0342] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X256A em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0343] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X256C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0344] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X256D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0345] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X256V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0346] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X256Y em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0347] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X259D em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0348] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X260E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0349] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X260P em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0350] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0351] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0352] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261L em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0353] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261M em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0354] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261V em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0355] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261W em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0356] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261Y em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0357] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X261F em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0358] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X262C em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0359] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X262E em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0360] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição X262Q em qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0361] Em uma outra modalidade preferencial da invenção, a variante é um polipeptídeo que tem as substituições de acordo com a invenção e tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0362] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição S9C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0363] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X9D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0364] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X9E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0365] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X9Q, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0366] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X43A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0367] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X43C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0368] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X43L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0369] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X43R, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0370] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X43W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0371] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X72A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0372] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X72V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0373] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X78D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0374] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X104F, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0375] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X114V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0376] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X115T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0377] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X115W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0378] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X120I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0379] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X120T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0380] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X120V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0381] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X129D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0382] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X147W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0383] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X149C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0384] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X149N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0385] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X158E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0386] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X160D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0387] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X160P, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0388] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X161C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0389] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X161E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0390] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X163A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0391] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X163D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0392] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X182C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0393] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X182E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0394] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X185C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0395] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X185E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0396] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X188C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0397] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X188D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0398] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X188E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0399] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X191N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0400] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X204D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0401] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X204V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0402] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X205I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0403] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0404] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0405] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0406] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206K, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0407] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0408] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0409] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0410] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X206L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0411] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X209W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0412] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X212A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0413] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X212D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0414] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X212G, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0415] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X212N, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0416] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X216I, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0417] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X216T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0418] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X216V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0419] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X217C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0420] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X217M, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0421] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X218T, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0422] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X222C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0423] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X222R, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0424] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X225A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0425] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X255C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0426] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X255E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0427] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X256A, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0428] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X256C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0429] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X256D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0430] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase, em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, compreende ou consiste na substituição X256V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0431] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X256Y, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0432] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X259D, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0433] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X260E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0434] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X260P, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0435] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0436] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0437] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261L, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0438] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261M, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0439] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261V, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0440] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261W, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0441] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261Y, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0442] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X261F, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0443] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X262C, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0444] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X262E, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0445] Em uma modalidade, a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80%, como pelo menos 90%, como pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a variante de subtilase em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreende ou consiste na substituição X262Q, em que a posição corresponde à posição correspondente de SEQ ID NO: 2.
[0446] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 206 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 206 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E, I, K, T, V, L ou W, de preferência, por L, C ou W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição Q206L, Q206W ou Q206C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0447] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 262 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 262 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E ou Q, de preferência, por E ou C. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição L262E ou L262C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0448] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 225 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 225 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por A. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição P225A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0449] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 9 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 9 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, D, E ou Q, de preferência, por E. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição S9E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0450] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 209 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 209 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por L ou W, de preferência, por W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição Y209W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0451] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 212 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 212 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por A, D, G ou N, de preferência, por D, G ou N. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição S212D, S212G ou S212N no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0452] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 261 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 261 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E, L, M V, W, Y ou F, de preferência, por W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição N261W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 (numeração BPN').
[0453] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 206 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 206 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E, I, K, T, V, L ou W, de preferência, por L, C ou W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição Q206L, Q206W ou Q206C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0454] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 262 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 262 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E ou Q, de preferência, por E ou C. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição Y262E ou Y262C no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0455] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 225 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 225 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por A. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição P225A no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0456] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 9 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 9 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, D, E ou Q, de preferência, por E. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição S9E no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0457] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 209 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 209 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição L209W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0458] Em um aspecto preferencial da invenção, as variantes de subtilase da invenção compreendem ou consistem em uma substituição em uma posição que corresponde à posição 261 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferencial, o aminoácido em uma posição que corresponde à posição 261 do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 é substituído por C, E, L, M, V, W ou Y, de preferência, por W. Em um outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição F261W no polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (numeração BPN').
[0459] Os inventores mostraram que cada uma das mutações selecionadas a partir da lista que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q fornece um efeito estabilizante para uma subtilase protease. Esse efeito estabilizante é aumentado quando são adicionadas mais mutações estabilizantes.
[0460] Dessa forma, um outro aspecto da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease, em que a variante compreende duas das substituições selecionadas a partir da lista que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0461] Uma outra modalidade preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante compreende duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43C, N43R, I72A, G115W, H120V, P129D, A158E, G160D, G160P, Q182E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206I, Q206V, Q206W, Q206L, Y209W, S212D, S212G, S212N, S216V, L217C, L217M, N218T, P225A, S256C, S256D, S259D, T260E, N261C, N261E, N261L, N261V, N261Y, N261W, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
[0462] Uma outra modalidade preferencial da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que a variante compreende duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9E, N43R, H120V, Q182E, Q191N, N204D, V205I, Q206L, Y209W, S212G, S216V, S256D, S259D, N261E, N261W e L262E, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
[0463] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0464] Em um aspecto da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste em um ou mais conjuntos de substituições na Tabela 2, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em um aspecto da invenção, a variante de subtilase compreende uma sequência de aminoácidos que compreende uma ou mais substituições em comparação com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, em que a substituição (ou substituições) é selecionada a partir de um ou mais conjuntos de substituições da Tabela 2 e em que as posições correspondem à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Tabela 2: Variantes de subtilase SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 + uma ou mais mutações listadas abaixo
[0465] Em um outro aspecto da invenção, a variante de subtilase da invenção compreende três substituições selecionadas a partir da lista que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com a subtilase progenitora. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a protease progenitora.
[0466] As variantes preferenciais incluem variantes que em comparação com qualquer uma dentre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 compreendem as seguintes mutações: N76D+S9E+L262E N76D+P225A+S259D N76D+S212D+P225A N76D+N43R+L262E N76D+S212D+S259D N76D+Q206C+Y209W N76D+V205I+Q206L N76D+P131*+S212D N76D+P131*+S259D N76D+V205I+Q206I N76D+G160P+S161E N76D+N204D+Q206L N76D+V205I+Q206V N76D+A194P+Q206E N76D+P131*+P225A N76D+N204D+Q206I N76D+N204D+V205I N76D+N204D+Q206V N76D+N204D+Q206W N76D+N261W+L262E N76D+N261L+L262E N76D+G160P+S161Y N76D+N261E+L262E N76D+N261V+L262E N76D+Q206L+Y209W N76D+N261Y+L262E N76D+V205I+Q206W N76D+G160D+S161E N76D+V205I+Q206E N76D+Q206L+S256D N76D+G115T+H120T N76D+G160D+S161Y N76D+N18S+V205I N76D+A194P+M222S N76D+Y209W+S256D N76D+N18S+Q206E N76D+Y209W+S256C N76D+G115T+H120V N76D+T255E+S256D N76D+G115T+H120I N76D+T255Q+S256D, N76D +*99aE +S212D +N261D N76D +T255E +S256Y +T260E N76D +T255E +S256Y +T260P N76D +T255Q +S256Y +T260E N76D +T255Q +S256Y +T260P N76D +T255E +S256A +T260P N76D +T255Q +S256A +T260E N76D +T255Q +S256A +T260P N76D +A158E +G160D +S161E N76D +A158E +G160D +S161H N76D +A158E +G160D +S161Y N76D +A158E +G160P +S161E N76D +A158E +G160P +S161H N76D +A158E +G160P +S161Y N76D +N204D +V205I +Q206I N76D +N204D +V205I +Q206L N76D +N204D +V205I +Q206V N76D +N204D +V205I +Q206W N76D +N204D +V205L +Q206I N76D +N204D +V205L +Q206L N76D +N204D +V205L +Q206V N76D +N204D +V205L +Q206W N76D +T255E +S256D +T260E N76D +T255E +S256D +T260P N76D +T255Q +S256D +T260E N76D +T255Q +S256D +T260P N76D +P129D +A158E +Q191N N76D +P129D +G160D +S161E N76D +P129D +G160D +S161H N76D +P129D +G160D +S161Y N76D +P129D +G160P +S161H N76D +G160P +S161Y +Q191N S9E +N43R +N76D +L262E S9E +N76D +S212D +S259D N43R +N76D +S212D +S259D S9E +N76D +S212D +N261D S9E +N76D +S212D +N261D N76D +S212D +S259D +N261D S9E +G61E +N76D +L262E G61E +N76D +Q206L +L262E N76D +*99aE +G195E +K235L N76D +*99aE +H120D +G195E S9E +N76D +*99aE +L262E N76D +*99aE +H120D +K235L N76D +*99aE +A194P +Q206E N43R +N76D +*99aE +L262E N18S +N76D +V205I +Q206E N76D +Q206C +Y209W +S256D N76D +Q206L +Y209W +S256D N76D +Q206L +Y209W +S256C G61E +N76D +A194P +V205I +Q206E S9E +N43R +N76D +A194P +L262E S9E +N43R +N76D +S212D +S259D S9E +N43R +G61E +N76D +L262E S9E +N76D +Q206L +Y209W +S256D G61E +N76D +Q206L +Y209W +S256D S9E +G61E +N76D +Q206L +Y209W N76D +*99aE +S212D +S259D N76D +*99aE +P131* +S259D S9E +N76D +*99aE +S212D +S259D N43R +N76D +*99aE +S212D +S259D S9E +N76D +*99aE +S212D +N261D S212D +N76D +*99aE +P131* *35aD +N76D +H120D +G195E +*275aF N43R +N76D +Q206L +Y209W +S256D N76D +*99aE +H120D +G195E +K235L N76D +*99aE +Q206L +Y209W +S256D N76D +*99aE +Q206L +Y209W +S256D S9E +N43R +N76D +*99aE +L262E N76D +A158E +G160D +S161E +Q191N N76D +P129D +A158E +G160D +S161E N76D +P129D +A158E +G160D +S161E N76D +P129D +A158E +G160D +S161E N76D +P129D +A158E +G160D +S161E N76D +A158E +G160D +S161H +Q191N N76D +P129D +A158E +G160D +S161H N76D +A158E +G160D +S161Y +Q191N N76D +P129D +A158E +G160D +S161Y N76D +A158E +G160P +S161E +Q191N N76D +P129D +A158E +G160P +S161E N76D +P129D +A158E +G160P +S161Y N76D +N204D +V205I +Q206I +S216V N76D +N204D +V205I +Q206L +S216V N76D +Q182E +N204D +V205I +Q206L N76D +S99D +H120N +P131* +Q206E +S212D N76D +S99D +H120N +P131* +A194P +Q206E N76D +S99D +H120N +P131T +A194P +Q206E A15T +N76D +H120N +P131* +V205I +Q206E A15T +N76D +H120I +P131T +V205I +Q206E S9E +N43R +N76D +Q206H +S212D +S259D *35aD +N76D +H120D +G195E +K235L +*275aR S9E +G61E +N76D +Q206L +Y209W +S256D S9E +N43R +I72A +N76D +A194P +L262E S9E +N43R +N76D +Q206L +Y209W +S256D S9E +N43R +N76D +*99aE +A194P +L262E S9E +N43R +N76D +*99aE +S212D +S259D N76D +P129D +A158E +G160D +S161E +Q191N N76D +P129D +A158E +G160D +S161H +Q191N N76D +P129D +A158E +G160D +S161Y +Q191N N76D +P129D +A158E +G160P +S161E +Q191N N76D +P129D +A158E +G160P +S161H +Q191N N76D +Q182E +N204D +V205I +Q206I +S216V N76D +Q182E +N204D +V205I +Q206L +S216V 35aD +N76D +H120D +G195E +K235L +*275aH S9R +A15T +N76D +A194P +Q206E +Q245R +N261D S9R +A15T +G61E +N76D +A194P +Q245R +N261D S9E +N43R +N76D +A158E +G160P +A194P +L262E S9E +N43R +N76D +*99aE +Q206H +S212D +S259D S9E +N43R +N76D +P131* +Q206L +Y209W +S256D S9E +N43R +I72A +N76D +A158E +G160P +A194P +L262E 35aD +N76D +H120D +G195E +K235L +*275aH +*275bH A15T +G61D +N76D +S99D +H120N +P131* +Q206E +S212D S9R +A15T +N76D +S99D +A194P +V205I +Q206E +Q245R +N261D *35aD +N76D +H120D +G195E +K235L +*275aH +*275bH +*275cH A15T +N76D +S99D +H120D +A194P +V205I +S212D +Q245R +N261D T58Y +N76D +S99D +H120N +P131* +A194P +Q206E +S212D +S259D A15T +N76D +S99D +H120N +A194P +Q206E +Q245R +N261D +L262Y S9E +N43R +I72A +N76D +A158E +G160P +A194P +L262E +*275aH +*275bH A15T +G61D +N76D +H120I +P131* +A194P +Q206L +S212D +Q245R +S259D A15T +G61D +N76D +H120I +P131* +A194P +Q206V +S212D +Q245R +S259D S9E +N43R +I72A +N76D +Q137H +S141H +R145H +A158E +G160P +A194P +L262E, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0467] Em um outro aspecto da invenção, a variante de subtilase da invenção compreende quatro, cinco, seis, sete ou oito das substituições selecionadas a partir da lista que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
[0468] Uma modalidade particular da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende qualquer uma das mutações adicionais selecionadas a partir da lista que consiste em Q2R, W6L,W6I, I8C,I8H, S9R A15T, N18S, S24H, *35aD, A48H, S49T, G53A, G53L, T58Y, G61E, G61D, N76D, S99D, *99aE,V104P, V104T, V104Y, N117H, H120N, H120D, P131*, Q137H, S141H, R145H V149Q, S161Y, I162L, N184D, A194P, A194D, A194E, V205L, M222N, P225S, K235L, N238H, V244H, N248H, T255Q, T260A, N261D, N261R, *275aR, *275aF, *275aH, *275bH e *275cH.
[0469] As variantes de subtilase podem compreender, adicionalmente, uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G,S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E,Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0470] Dessa forma, em modalidades adicionais da invenção, a variante de subtilase descrita na Tabela 1 e 2 compreende ou consiste, adicionalmente, em uma ou mais substituições S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que cada posição corresponde à posição correspondente do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com a subtilase progenitora ou em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0471] Uma modalidade particular da invenção se refere a variantes de subtilase que têm atividade de protease e têm pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, em que as variantes de subtilase compreendem uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante compreende qualquer uma das mutações adicionais selecionadas a partir da lista que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0472] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste em uma das substituições S9C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0473] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0474] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0475] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S9Q e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0476] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0477] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0478] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43L e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0479] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43R e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0480] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N43W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0481] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0482] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição I72V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0483] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S78D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0484] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição A114V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0485] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115T e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0486] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G115W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0487] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120I e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 4).
[0488] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120T e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0489] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição H120V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0490] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V147W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0491] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0492] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V149N e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0493] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição A158E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0494] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0495] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição G160P e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0496] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0497] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S161E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0498] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0499] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S163D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0500] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0501] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q182E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0502] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0503] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N185E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0504] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q188C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0505] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q188D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0506] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q188E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0507] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q191N e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0508] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0509] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N204V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0510] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição V205I e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0511] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0512] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0513] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206I e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0514] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206K e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0515] Em Uma Modalidade Da Invenção, A Variante De Subtilase Compreende Ou Consiste Na Substituição Q206t E Uma Ou Mais Substituições Selecionadas A Partir Do Grupo Que Consiste Em S3t, V4i, A15t, S24g, S24r, V68a, S99d, S99e, S101r, S101k, S101n, S101m, S101e, S101d, S101l, S101i, S103a, V104i, S128a, S128l, S128s, P129n, P129q S130a, V199m, L217y, L217d, L217e, L217q, N218d, N218e, Q245k E Q245r (Numeração De Acordo Com Seq Id No: 2).
[0516] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0517] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0518] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Q206L e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0519] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição Y209W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0520] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0521] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0522] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212G e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0523] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S212N e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0524] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216I e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0525] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216T e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0526] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S216V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q, S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0527] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q, S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0528] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição M222R e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0529] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição P225A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0530] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0531] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T255E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0532] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256A e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0533] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0534] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0535] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0536] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S256Y e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0537] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição S259D e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0538] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0539] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição T260P e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0540] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0541] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0542] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261L e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0543] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261M e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0544] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261V e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0545] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261W e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0546] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261Y e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0547] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição N261F e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0548] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262C e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0549] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262E e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0550] Em uma modalidade da invenção, a variante de subtilase compreende ou consiste na substituição L262Q e uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0551] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
[0552] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em In, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
[0553] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ideal e similares.
[0554] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1.081 a 1.085). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consultar, também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4.699 a 4.708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica podem ser também determinados por análise física da estrutura, tal como determinados por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Consultar, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59 a 64. Para BPN' (SEQ ID NO: 2) a tríade catalítica que compreende os aminoácidos S221, H64 e D32 é essencial para a atividade de protease da enzima.
[0555] As variantes de subtilases podem consistir em 150 a 350, por exemplo, 175 a 330, 200 a 310, 220 a 300, 240 a 290, 260 a 280 ou 269, 270, 271, 272, 273, 274 ou 275 aminoácidos.
[0556] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com a enzima progenitora, em que a estabilidade em armazenamento é medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" conforme descrito no Exemplo 3 de Materiais e Métodos no presente documento. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que a estabilidade é medida com o uso do ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" conforme descrito na seção de Materiais e Métodos no presente documento.
[0557] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em lavagem melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a enzima progenitora, em que a estabilidade em lavagem é medida com o uso do "ensaio de estabilidade em lavagem" e o desempenho de lavagem é medido com o uso do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, conforme descrito na seção de Materiais e Métodos no presente documento. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que a estabilidade em armazenamento é medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" e o desempenho de lavagem é medido com o uso do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, conforme descrito na seção "Materiais e Métodos" no presente documento.
[0558] A protease precursora ou progenitora pode ser qualquer subtilase ou qualquer subtilisina preferencial conforme definido abaixo. As sequências de aminoácidos das subtilases podem ser alinhadas para identificar aminoácidos correspondentes em uma determinada sequência. Conforme mencionado acima, SEQ ID NO: 2 (BPN') é usado para a numeração. Entretanto, a protease precursora ou progenitora pode ser qualquer subtilase, dessa forma, conforme descrito na "convenção para designação de variantes", o aminoácido em uma determinada posição pode ser diferente entre diversas subtilases. Será evidente para o elemento versado na técnica que, por exemplo, a seguinte mutação V205I no contexto da presente invenção não exige que o mesmo seja o aminoácido valina que é substituído por isoleucina ou leucina. Dessa forma, as mutações de acordo com a invenção podem ser escritas conforme exposto a seguir: X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que X é qualquer aminoácido que pode estar presente na subtilase progenitora ou na subtilase precursora ou inicial. Será evidente que se a protease progenitora, precursora ou inicial já compreender, por exemplo, I na posição que corresponde às posições 205 de SEQ ID NO: 2 isso não será substituído.
[0559] Enzimas que clivam as ligações amida em substratos proteicos são classificadas como proteases ou (de forma intercambiável) peptidases (consultar Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3).
[0560] Uma serina protease é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas, e em que há um resíduo serina essencial no sítio ativo (White, Handler e Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Quinta Edição, McGraw-Hill Book Company, NY, páginas 271 a 272).
[0561] As serina proteases bacterianas têm pesos moleculares situados na faixa de 20.000 a 45.000 Dalton. As mesmas são inibidas por fluorofosfato de di-isopropila. As mesmas hidrolisam ésteres terminais simples e têm atividade similar à quimotripsina eucariótica, também, uma serina protease. Um termo mais limitado, protease alcalina, que abrange um subgrupo, reflete o elevado pH ideal de algumas das serina proteases, a partir de pH 9,0 a 11,0 (para análise, consultar Priest (1977) Bacteriological Rev. 41:711 a 753).
[0562] Um subgrupo das serina proteases tentativamente designadas subtilases foi proposto por Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719 a 737 e Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501 a 523. As mesmas são definidas por análise de homologia de mais de 170 sequências de aminoácidos de serina proteases previamente denominadas como proteases do tipo subtilisina. Muitas vezes, uma subtilisina foi previamente definida como uma serina protease produzida por bactérias Gram-positivas ou fungos, e de acordo com Siezen et al. agora é um subgrupo das subtilases. Fo identificada uma grande variedade de subtilases, e foi determinada a sequência de aminoácidos de algumas subtilases. Quanto a uma descrição mais detalhada de tais subtilases e suas sequências de aminoácidos é feita referência a Siezen et al. (1997).
[0563] Um subgrupo das subtilases é as subtilisinas que são serina proteases da família S8, em particular, da subfamília S8A, como definido pelo banco de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/cgi- bin/famsum?family=S8).
[0564] BPN' e Savinase têm os números MEROPS S08.034 e S08.003, respectivamente.
[0565] O termo “subtilase progenitora” descreve uma subtilase definida de acordo com Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501 a 523. Para detalhes adicionais consultar a descrição de “Subtilases” acima. Uma subtilase progenitora também pode ser uma subtilase isolada de uma fonte natural, na qual foram efetuadas modificações subsequentes (como troca (ou trocas) da cadeia (ou cadeias) lateral de aminoácidos, substituição (ou substituições), deleção (ou deleções) e/ou inserção (ou inserções)) retendo a característica de uma subtilase. Além disso, uma subtilase progenitora pode ser uma subtilase que foi preparada pela técnica de rearranjo de DNA, como descrito por J.E. Ness et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:893 a 896.
[0566] Alternativamente, o termo "subtilase progenitora" pode ser chamado de "subtilase precursora" e o termo é usado para descrever a protease inicial na qual são feitas mutações para se obter a variante da invenção. A subtilase progenitora é, de preferência, dos subgrupos subtilisina.
[0567] Um subgrupo das subtilases, I-S1 ou subtilisinas “verdadeiras”, compreende as subtilisinas "clássicas", como subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, Novozymes A/S) e subtilisina DY (BSSDY). BPN’ é a subtilisina BPN’ de B. amyloliquefaciens, a BPN’ tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. Outro subgrupo das subtilases, I-S2 ou subtilisinas altamente alcalinas, é reconhecido por Siezen et al. (supra). As proteases de subgrupo I-S2 são descritas como subtilisinas altamente alcalinas e compreendem enzimas como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, Novozymes A/S), elastase alcalina YaB (BSEYAB) e subtilisina 309 (SAVINASE®, Novozymes A/S) que tem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
[0568] De preferência, a subtilase progenitora é selecionada a partir de qualquer uma das proteases que têm as sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0569] Como referência, a tabela 3 embaixo apresenta uma lista de alguns acrônimos para várias subtilases mencionadas no presente documento. Quanto a acrônimos adicionais, consultar Siezen et al. (1991 e 1997).Tabela 3: Acrônimos de várias subtilases
[0570] A homologia entre duas sequências de aminoácidos, neste contexto, é descrita pelo parâmetro “identidade” para propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch conforme descrito acima em "convenção para designação de variantes". O resultado da rotina, para além do alinhamento de aminoácidos, é o cálculo da "Percentagem de Identidade" entre as duas sequências.
[0571] Com base nesta descrição, é rotineiro para o elemento versado na técnica identificar subtilases homólogas adequadas, que podem ser modificadas de acordo com a invenção.
[0572] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.
[0573] De preferência, a subtilase progenitora é selecionada a partir de qualquer uma das proteases que têm pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0574] Em um aspecto, a progenitora tem uma identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da progenitora difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12.
[0575] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0576] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[0577] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0578] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
[0579] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[0580] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0581] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[0582] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[0583] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[0584] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
[0585] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[0586] Em outro aspecto, o progenitor compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
[0587] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao N-terminal ou C-terminal de uma região de outro polipeptídeo.
[0588] A subtilase progenitora pode ser obtida a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de", para uso na presente invenção, em conexão com uma determinada fonte deve significar que o progenitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o progenitor é secretado extracelularmente.
[0589] A enzima progenitora pode ser uma protease bacteriana. Por exemplo, a enzima progenitora pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram- positivo, como uma protease de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces ou um polipeptídeo bacteriano Gram- negativo, como uma protease de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella ou Ureaplasma.
[0590] Em um aspecto, a enzima progenitora é uma protease de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis.
[0591] Em um aspecto, a enzima progenitora é uma protease de Bacillus amyloliquefaciens , por exemplo, a protease de SEQ ID NO: 2.
[0592] Em um outro aspecto, a enzima progenitora é uma protease de Bacillus lentus ou uma protease de bacillus clausii, por exemplo, a protease de SEQ ID NO: 1.
[0593] Cepas dessas espécies estão prontamente acessíveis ao público em várias coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0594] O progenitor pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo micro-organismos isolados da natureza (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) com o uso das sondas acima mencionadas. Técnicas para o isolamento de micro-organismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo que codifica um progenitor pode ser depois obtido por triagem similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro micro-organismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo que codifica um progenitor com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por meio da utilização de técnicas que são conhecidas por aqueles elementos versados na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
[0595] A presente invenção também se refere a métodos para obter uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase progenitora uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0596] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0597] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 2 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, N261F, Y262C, Y262E e Y262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0598] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 3 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em Q2R, W6I, I8C, I8H, S9C, S9D, S9E, S9Q, N18S, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, S49T, G53A, G53L, G61D, I72A, I72V, S78D, S78N, V104F, V104P, V104T, V104Y, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, V149Q, A158E, G160D, G160P, S161C, S161Y, S161E, I162L, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N184D, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, A194D, A194E, N204D, N204V, V205I, V205L, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, Y209L, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222N, M222R, P225A, P225S, V244H, N248H, T255C, T255E, T255Q, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260A, T260E, T260P, N261D, N261C, N261E, N261L, N261M, N261R, N261V, N261W, N261Y, N261F, L262Y, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0599] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 4 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0600] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 5 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0601] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 6 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0602] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 7 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0603] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 8 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S3V, S3Y, S9M, S9C, S9D, S9E, S9Q, P40E, N43E, N43D, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, R45E, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120D, H120I, H120T, H120V, P129D, A133E, V147W, V149C, 149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182E, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188T, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, N218D, M222C, M222R, P225A, A228S, Q236E, Q245R, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262Y, L262C, L262E, L262Q e A270G, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0604] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 9 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0605] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 10 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0606] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 11 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0607] Um outro aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: (a) introduzir em uma subtilase que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 12 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, K43A, K43C, K43L, K43R, K43W, V72A, S78D, Y104F, A114V, I115T, I115W, D120I, D120T, D120V, P129D, V147W, V149C, V149N, T158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, S182C, S182E, Q185C, Q185E, S188C, S188D, S188E, S191N, S204D, S204V, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L, L209W, N212A, N212D, N212G, A216I, A216T, A216V, Y217C, Y217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, K256A, K256C, K256D, K256V, K256Y, S260E, S260P, F261C, F261E, F261L, F261M, F261V, F261Y, F261W, Y262C, Y262E e Y262Q, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e (b) recuperar a variante.
[0608] A subtilase de protease progenitora é, de preferência, selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.
[0609] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para obter uma variante de subtilase tendo atividade de protease, compreendendo: a) introduzir em uma subtilase progenitora que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo com SEQ ID NO: 1; b) recuperar a variante.
[0610] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para obter uma variante de subtilase tendo atividade de protease, compreendendo: a) introduzir em uma subtilase progenitora que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1 duas ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo com SEQ ID NO: 1; b) recuperar a variante.
[0611] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para obter uma variante de subtilase tendo atividade de protease, compreendendo: a) introduzir em uma subtilase progenitora que tem a sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 1 três ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo com SEQ ID NO: 1; b) recuperar a variante.
[0612] As variantes de subtilase podem compreender, adicionalmente, uma ou mais substituições (por exemplo, várias) selecionadas a partir do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2).
[0613] Em uma modalidade, a invenção se refere a um método para obter uma variante de subtilase que tem atividade de protease, que compreende: a) introduzir em uma subtilase progenitora com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, 9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, 120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, 185E, 188C, 188D, 188E, 191N, 204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2), em que a variante de subtilase é um polipeptídeo que tem pelo menos 60%, SEQ ID NO: 1; b) introduzir uma ou mais mutações adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em X3T, X4I, X15T, X24G, X24R, X68A, X99D, X99E, X101R, X101K, X101N, X101M, X101E, X101D, X101L, X101I, X103A, X104I, X128A, X128L, X128S, X129N, X129Q, X130A, X199M, X217Y, X217D, X217E, X217Q, X218D, X218E, X245K e X245R (numeração de acordo com SEQ ID NO: 2) c) recuperar a variante.
[0614] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção gênica sintética, construção gênica semissintética, mutagênese aleatória, rearranjo, etc.
[0615] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (por exemplo, várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo que codifica o progenitor.
[0616] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores oligonucleotídicos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um sítio no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo que codifica o progenitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Normalmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e do inserto se liguem umas às outras. Consultar, por exemplo, Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4.949 a 4.955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7.349 a 4.966.
[0617] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente No U.S. 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773 a 776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285 a 290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15 a 16.
[0618] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio- dirigida na presente invenção. Há muitos kits comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.
[0619] A construção gênica sintética implica a síntese in vitro de uma molécula polinucleotídica desenhada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando várias técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip de multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1.050 a 1.054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.
[0620] Podem ser feitas e testadas substituições, deleções, e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou rearranjo, seguidos de um procedimento de rastreamento relevante, tal como os divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; Patente N° U.S. 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênese região-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0621] Podem ser combinados métodos de mutagênese/rearranjo com métodos de rastreamento automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
[0622] A construção gênica semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção gênica sintética e/ou mutagênese sítio-dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou rearranjo. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos polinucleotídicos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas à amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências polinucleotídicas podem ser depois rearranjadas.
[0623] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam uma variante da presente invenção.
[0624] A presente invenção também se refere a construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
[0625] O polinucleotídeo pode ser manipulado de várias formas de modo a proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.
[0626] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle da transcrição que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
[0627] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansacarase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301 a 315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor e gene da betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci USA 75: 3.727 a 3.731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 a 25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74 a 94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados no documento no WO 99/43835.
[0628] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.
[0629] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.
[0630] A sequência de controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm a jusante de um promotor e a montante da sequência codificadora de um gene que aumenta a expressão do gene.
[0631] Exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3.465 a 3.471).
[0632] A sequência de controle pode ser também uma região de codificação de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao N- terminal de uma variante e dirige a variante para a via secretória da célula. A extremidade 5' da sequência codificadora do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificadora de peptídeo sinal naturalmente ligada em fase de leitura translacional com o segmento da sequência codificadora que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificadora pode conter uma sequência codificadora de peptídeo sinal que é estranha para a sequência codificadora. Uma sequência codificadora de peptídeo sinal estranha pode ser requerida quando a sequência codificadora não contém naturalmente uma sequência codificadora de peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificadora do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificadora do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto, pode ser usada qualquer sequência codificadora de peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretória de uma célula hospedeira.
[0633] Sequências codificadoras de peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificadoras de peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109 a 137.
[0634] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificadora de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no N-terminal de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificadora de pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0635] Quando estiverem presentes ambas as sequências de peptídeo sinal e pró-peptídeo, a sequência do pró-peptídeo é posicionada próxima ao N-terminal da variante e a sequência do peptídeo sinal é posicionada próxima ao N-terminal da sequência do pró-peptídeo.
[0636] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp.
[0637] A presente invenção se refere também a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As várias sequências nucleotídicas e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica a variante em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de modo que a sequência codificadora esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.
[0638] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
[0639] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual o mesmo foi integrado. Adicionalmente, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.
[0640] O vetor contém, de preferência, um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador de seleção é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.
[0641] Exemplos de marcadores de seleção bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou de Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tais como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina.
[0642] O vetor contém, de preferência, um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.
[0643] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo que codifica a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização (ou localizações) precisa no cromossomo (ou cromossomo). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificadores ou codificadores. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
[0644] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador plasmidial que medeie a replicação autônoma e que funcione em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador plasmidial" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
[0645] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitem replicação em E. coli e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl que permitem replicação em Bacillus.
[0646] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador de seleção amplificável com o polinucleotídeo, em que células contendo cópias amplificadas do gene marcador de seleção, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente de seleção apropriado.
[0647] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um elemento versado na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Células Hospedeiras
[0648] A presente invenção se refere também a células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um construtos ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica a variante e sua fonte.
[0649] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.
[0650] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas sem limitação, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas sem limitação, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella e Ureaplasma.
[0651] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas sem limitação, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.
[0652] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas sem limitação, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
[0653] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas sem limitação, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.
[0654] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111 a 115), transformação de células competentes (consultar, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol 81: 823 a 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209221), eletroporação (consultar, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 a 751), ou conjugação (consultar, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5.271 a 5.278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557 a 580) ou eletroporação (consultar, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6.127 a 6.145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (consultar, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399 a 405), conjugação (consultar, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3.583 a 3.585), ou transdução (consultar, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6.289 a 6.294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (consultar, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391 a 397), ou conjugação (consultar, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51 a 57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (consultar, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1.295 a 1297), transformação de protoplastos (consultar, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189 a 207), eletroporação (consultar, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3.800 a 3.804), ou conjugação (consultar, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409 a 436). No entanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.
[0655] A presente invenção se refere também a métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperar a variante.
[0656] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada, pode ser recuperada de lisados celulares.
[0657] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes com atividade de protease. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, uso de anticorpos específicos, formação de um produto enzimático, ou desaparecimento de um substrato enzimático. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade da variante.
[0658] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.
[0659] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (consultar, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.
[0660] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante.
[0661] Em um determinado aspecto, as variantes de subtilase de acordo com a invenção têm desempenho de lavagem melhorado em comparação com a enzima progenitora ou em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que o desempenho de lavagem é medido com o uso do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, conforme descrito na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0662] Em um outro determinado aspecto, as variantes de acordo com a invenção têm estabilidade melhorada, de preferência, estabilidade em armazenamento melhorada, em comparação com a enzima progenitora ou em comparação com uma protease com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em que a estabilidade em armazenamento é medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" conforme descrito na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0663] Assim, em uma modalidade preferencial, a composição é uma composição detergente, e um aspecto da invenção refere-se ao uso da composição detergente compreendendo uma variante de acordo com a invenção em um processo de limpeza como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras.
[0664] A escolha de componentes adicionais está no âmbito da habilidade do elemento versado na técnica e inclui ingredientes convencionais, incluindo os componentes não limitantes exemplificadores apresentados em baixo. A escolha de componentes pode incluir, para cuidado dos tecidos, a consideração do tipo de tecido a ser limpo, do tipo e/ou grau de sujidade, da temperatura à qual a limpeza é para ter lugar, e da formulação do produto detergente. Embora os componentes mencionados abaixo estejam categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, isto não deve ser interpretado como uma limitação, à medida que um componente pode compreender funcionalidades adicionais conforme será observado pelo elemento versado na técnica.
[0665] Em uma modalidade da presente invenção, a variante de subtilase da presente invenção pode ser adicionada a uma composição detergente em uma quantidade correspondente a 0,01 a 200 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem, de preferência, 0,05 a 50 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem, em particular 0,1 a 10 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavagem.
[0666] Uma composição para uso em lavagem de louça automática (ADW), por exemplo, pode incluir 0,0001% a 50%, como 0,001% a 30%, como 0,01% a 20%, como 0,5 a 15% de proteína enzimática em peso da composição.
[0667] Uma composição para uso em granulação de lavagem de roupa, por exemplo, pode incluir 0,0001% a 50%, como 0,001% a 20%, como 0,01% a 10%, como 0,05% a 5% de proteína enzimática em peso da composição.
[0668] Uma composição para uso em líquido de lavagem de roupa, por exemplo, pode incluir 0,0001% a 10%, tal como 0,001 a 7%, tal como 0,1% a 5% de proteína enzimática em peso da composição.
[0669] As enzimas, como a variante de subtilase da invenção, podem ser estabilizadas com o uso de agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol, como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, como ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito, por exemplo, nos documentos sob os nos WO 92/19709 e WO 92/19708 ou as variantes de acordo com a invenção podem ser estabilizadas com o uso de cetonas ou aldeídos peptídicos como descrito nos documentos sob os nos WO 2005/105826 e WO 2009/118375.
[0670] Uma variante da presente invenção também pode ser incorporada nas formulações detergentes divulgadas no documento sob o n° WO 97/07202, que está incorporado ao presente documento a título de referência.
[0671] A composição detergente pode compreender um ou mais tensoativos, que podem ser aniônicos e/ou catiônicos e/ou não iônicos e/ou semipolares e/ou zwitteriônicos, ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade particular, a composição detergente inclui uma mistura de um ou mais tensoativos não iônicos e um ou mais tensoativos aniônicos. O tensoativo (ou tensoativos) está tipicamente presente a um nível de cerca de 0,1% a 60% em peso, tal como cerca de 1% a cerca de 40%, ou cerca de 3% a cerca de 20%, ou cerca de 3% a cerca de 10%. O tensoativo (ou tensoativos) é escolhido com base na aplicação de limpeza desejada, e inclui qualquer tensoativo (ou tensoativos) convencional conhecido na técnica. Pode ser utilizado qualquer tensoativo conhecido na técnica para uso em detergentes.
[0672] Quando incluído no mesmo, o detergente irá normalmente conter a partir de cerca de 1% a cerca de 40% em peso, como a partir de cerca de 5% a cerca de 30%, incluindo a partir de cerca de 5% a cerca de 15%, ou a partir de cerca de 20% a cerca de 25% de um tensoativo aniônico. Exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa-olefinossulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), etersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, ésteres de metila de ácido graxo alfa- sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico de dodecenila/tetradecenila (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão, e suas combinações.
[0673] Quando incluído no mesmo, o detergente irá normalmente conter a partir de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo catiônico. Exemplos não limitantes de tensoativos catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de amônio quaternário alcoxilado (AQA), e combinações dos mesmos.
[0674] Quando incluído no mesmo, o detergente irá normalmente conter a partir de cerca de 0,2% a cerca de 40% em peso de um tensoativo não iônico, por exemplo, a partir de cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular a partir de cerca de 1% a cerca de 20%, a partir de cerca de 3% a cerca de 10%, como a partir de cerca de 3% a cerca de 5% ou a partir de cerca de 8% a cerca de 12%. Exemplos não limitantes de tensoativos não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, álcoois graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilado, como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamida de ácido graxo propoxilada (PFAM), amidas poliidroxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina de N-acila e N-alquila (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob os nomes comerciais SPAN e TWEEN, e suas combinações.
[0675] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo semipolar. Exemplos não limitantes de tensoativos semipolares incluem óxidos de amina (AO) tais como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(coco alquila)-N,N-dimetilamina e óxido de amina N-(sebo-alquila)-N,N-bis(2- hidroxietila), alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas, e suas combinações.
[0676] Quando incluído aí, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensoativo zwitteriônico. Exemplos não limitantes de tensoativos zwitteriônicos incluem betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína, e suas combinações.
[0677] Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter hidrofílico e hidrofóbico (assim chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensoativos); no entanto, a estrutura molecular dos hidrótopos não favorece geralmente a autoagregação espontânea, consultar por exemplo, revisão por Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121 a 128. Os hidrótopos não exibem uma concentração crítica acima da qual a autoagregação ocorre como encontrado em tensoativos e lipídeos formando mesofases micelares, lamelares e outras bem conhecidas. Em vez disso, muitos hidrótopos mostram um processo de agregação do tipo contínuo em que os tamanhos dos agregados crescem à medida que a concentração aumenta. No entanto, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, estabilidade, e propriedades coloidais de sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensoativos e polímeros. Os hidrótopos são classicamente usados em várias indústrias desde indústrias farmacêutica, de higiene pessoal, alimentar, a aplicações técnicas. O uso de hidrótopos em composições detergentes permite, por exemplo, formulações de tensoativos mais concentradas (como no processo de compactação de detergentes líquidos por remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fases ou elevada viscosidade.
[0678] O detergente pode conter 0 a 5% em peso, como cerca de 0,5 a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 5% de um hidrótopo. Pode ser usado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitantes de hidrótopos incluem benzeno sulfonato de sódio, p-tolueno sulfonatos de sódio (STS), xileno sulfonatos de sódio (SXS), cumeno sulfonatos de sódio (SCS), cimeno sulfonato de sódio, óxidos de amina, álcoois e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftaleno sulfonato de sódio, etilhexil sulfato de sódio e suas combinações.
[0679] A composição detergente pode conter cerca de 0 a 65% em peso, como cerca de 5% a cerca de 45% de um adjuvante ou coadjuvante de detergente, ou uma mistura dos mesmos. Em um detergente de lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40 a 65%, particularmente 50 a 65%. O adjuvante e/ou coadjuvante pode ser particularmente um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser utilizado qualquer adjuvante e/ou coadjuvante conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Exemplos não limitantes de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos, como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos, como carbonato de sódio, silicatos solúveis, como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst), etanolaminas, como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, também conhecido como iminodietanol), trietanolamina (TEA, também conhecida como 2,2’,2”-nitrilotrietanol) e inulina de carboximetila (CMI), e combinações dos mesmos.
[0680] A composição detergente pode conter também 0 a 20% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 10% de um coadjuvante de detergente, ou uma mistura dos mesmos. A composição detergente pode incluir um coadjuvante sozinho, ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante de zeólito. Exemplos não limitantes de coadjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, tais como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Outros exemplos não limitantes incluem citrato, quelantes tais como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos, e ácido alquilou alquenilsuccínico. Os exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’-disuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietano- 1,1-difosfônico (HEDP), etilenodiaminetetra-(ácido metilenofosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminapentaquis(ácido metilenofosfônico) (DTPMPA ou DTMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico- ácido N-monoacético (ASMA), ácido aspártico- ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiônico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil)-aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)- aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil)-glutâmico (SMGL), ácido N-(2- sulfoetil)-glutâmico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido α- alanina-N, N-diacético (α-ALDA), ácido serina-N, N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N, N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N, N-diacético (PHDA), ácido antranílico-ácidoN, N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N, N- diacético (SLDA), ácido taurina-N, N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil-N, N-diacético (SMDA), N-(2-hidroxietil)-etilidenodiamina-N, N’, N’-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), dietilenotriamina penta(ácido metilenofosfônico) (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP), e suas combinações e sais. Adjuvantes e/ou coadjuvantes exemplificadores adicionais são descritos em, por exemplo, WO 09/102854, US 5977053.
[0681] O detergente pode conter 0 a 50% em peso, tal como cerca de 0,1% a cerca de 25%, de um sistema de lixiviação. Pode ser utilizado qualquer sistema de lixiviação conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Componentes de sistema de lixiviação adequados incluem catalisadores de lixiviação, ativadores de lixiviação, fontes de peróxido de hidrogênio tais como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré-formados e suas misturas. Perácidos pré-formados adequados incluem, mas sem limitação, ácidos e sais peroxicarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo, Oxone<Superscript>®</Superscript>, e suas misturas. Exemplos não limitantes de sistemas de lixiviação incluem sistemas de lixiviação à base de peróxido, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico, incluindo sais de metal alcalino tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetraidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato, em combinação com um ativador de lixiviação formando perácido. O termo ativador de lixiviação se entende aqui como um composto que reage com lixívia de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido. O perácido assim formado constitui a lixívia ativada. Ativadores de lixívia adequados a serem usados aqu incluem aqueles pertencendo à classe de amidas, imidas ou anidridos de éster. Exemplos adequados são diamina de tetracetiletileno (TAED), 4- [(3,5,5-trimetilhexanoíl)oxi]benzenossulfonato de sódio (ISONOBS), ácido dodecanoico de diperoxi, 4-(dodecanoíloxi)benzenossulfonato (LOBS), 4- (decanoíloxi)benzenossulfonato, 4-(decanoíloxi)benzoato (DOBS), 4- (nonanoíloxi)-benzenossulfonato (NOBS), e/ou aqueles divulgados no documento no WO98/17767. Uma família particular de ação de interesse fo divulgada no documento no EP624154 e particularmente preferencial nessa família é o citrato de acetila e tributila (ATC). ATC ou um triglicerídeo de cadeia curta como triacetina tem a vantagem de ser amigo do ambiente pois acaba por se degradar em ácido cítrico e álcool. Além disso, o citrato de acetila e tributila e a triacetina têm uma boa estabilidade hidrolítica no produto após armazenamento e são ação eficazes. Finalmente, ATC proporciona uma boa capacidade adjuvante ao aditivo de lavagem de roupa.
[0682] O sistema de lixiviação pode incluir também um catalisador de ou reforçador de lixiviação.
[0683] Alguns exemplos não limitadores de catalisadores de lixiviação que podem ser usados nas composições da presente invenção incluem oxalato de manganês, acetato de manganês, manganês-colágeno, catalisadores à base de cobalto-amina e catalisadores de triazaciclononano de manganês (MnTACN); são particularmente preferenciais os complexos de manganês com 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano (Me3-TACN) ou 1,2,4,7-tetrametil-1,4,7-triazaciclononano (Me4-TACN), em particular Me3- TACN, como o complexo de manganês dinuclear [(Me3- TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2, e [2,2',2''-nitrilotris(etano-1,2- diilazanillideno-KN-metanililideno)trifenolato-K3O]manganês(III). catalisadores de lixiviação podem ser também outros compostos de metal, como complexos de cobalto ou ferro.
[0684] Alternativamente, o sistema de lixiviação pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona. O sistema de lixiviação pode compreender também perácidos tais como ácido 6- (ftalimido)peroxihexanoico (PAP). O sistema de lixiviação pode incluir também um catalisador de lixiviação. Em algumas modalidades, o componente de lixiviação pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo em catalisadores orgânicos tendo as seguintes fórmulas:
[0685] (iii) e suas misturas; em TI que cada R1 é independentemente umgrupo alquila ramificado contendo de 9 a 24 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, preferencialmente cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 18 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-propilheptila, 2-butiloctila, 2-pentilnonila, 2-hexildecila, n- dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila, n-octadecila, iso-nonila, iso-decila, isotridecila e iso-pentadecila. Outros sistemas de lixiviação exemplificadores são descritos, por exemplo, nos documentos sob os nos WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 e WO2007/087242. Fotolixiviadores adequados podem, por exemplo, ser ftalocianina de zinco sulfonatada.
[0686] O detergente pode conter 0 a 10% em peso, tal como 0,5 a 5%, 2 a 5%, 0,5 a 2% ou 0,2 a 1% de um polímero. Pode ser utilizado qualquer polímero conhecido na técnica para uso em detergentes. O polímero pode funcionar como um coadjuvante como mencionado acima, ou pode proporcionar propriedades antirredeposição, proteção das fibras, liberação de sujidade, inibição de transferência de corantes, limpeza de gorduras e/ou antiespumantes. Alguns polímeros podem ter mais do que uma das propriedades acima mencionadas e/ou mais do que um dos motivos mencionados em baixo. Polímeros exemplificadores incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli(álcool de vinila) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada, inulina de carboximetila (CMI), e policarboxilatos tais como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico, CMC hidrofobicamente modificadas (HM-CMC) e silicones, copolímeros de ácido tereftálico e glicóis oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) e poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridina-N-óxido) (PVPO ou PVPNO) e polivinilpirrolidona- vinilimidazol (PVPVI). Polímeros exemplificadores adicionais incluem policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno e óxido de polipropileno (PEO-PPO) e sulfato de etóxi diquaternário. Outros polímeros exemplificadores são divulgados em, por exemplo, WO 2006/130575. Sais dos polímeros acima mencionados estão também contemplados.
[0687] As composições detergentes da presente invenção podem incluir também agentes de matização de tecido, como corantes ou pigmentos, que quando formulados em composições detergentes podem se depositar em um tecido quando o tecido é colocado em contato com um licor de lavagem que compreende as composições detergentes e alterando, deste modo, a tonalidade do tecido através de absorção/reflexão da luz visível. Agentes de branqueamento fluorescentes emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de coloração de tecido alteram a tonalidade de uma superfície pois absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Agentes de coloração de tecido adequados incluem corantes e conjugados de corante-argila, e podem incluir também pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo em corantes se enquadrando nas classificações do Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas, por exemplo, como descrito nos documentos nos WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 e EP1876226 (deste modo incorporados a título de referência). A composição detergente compreende preferencialmente de cerca de 0,00003% em peso a cerca de 0,2% em peso, de cerca de 0,00008% em peso a cerca de 0,05% em peso, ou até mesmo de cerca de 0,0001% em peso a cerca de 0,04% em peso de agente de coloração de tecido. A composição pode compreender de 0,0001% em peso a 0,2% em peso de agente de coloração de tecido, isto pode ser especialmente preferencial quando a composição estiver na forma de uma bolsa de dose unitária. Agentes de coloração adequados são também divulgados em, por exemplo, WO 2007/087257 e WO2007/087243.
[0688] O aditivo de detergente bem como a composição detergente podem compreender uma ou mais enzimas (adicionais) tais como uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou peroxidase.
[0689] Em geral, as propriedades da enzima (ou enzimas) selecionada devem ser compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a enzima (ou enzimas) deve estar presente em quantidades eficazes.
[0690] As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação proteica. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por exemplo, as celulases fúngicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas em US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259.
[0691] Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas nos documentos nos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulases tais como aquelas descritas nos documentos nos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.
[0692] Exemplos de celulases exibindo atividade de endo-beta-1,4- glucanase (EC 3.2.1.4) são aqueles tendo sido descritos no documento no WO02/099091.
[0693] Outros exemplos de celulases incluem as celulases da família 45 descritas no documento no WO96/29397, e especialmente suas variantes tendo substituição, inserção e/ou deleção em uma ou mais das posições correspondendo às seguintes posições em SEQ ID NO: 8 do documento sob o n° WO 02/099091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, e/ou 20, de preferência, selecionadas entre P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H ou Q146 R.
[0694] Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation). Proteases
[0695] A composição detergente pode incluir proteases adicionais. As proteases adicionais adequadas incluem aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, por exemplo, origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação proteica. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode ser, por exemplo, da família S1, tal como a tripsina, ou da família S8 tal como a subtilisina. Uma protease das metaloproteases pode ser, por exemplo, uma termolisina da, por exemplo, família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8.
[0696] O termo "subtilases" se refere a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 a 737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501 a 523. As serina proteases são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no sítio ativo, que forma um aduto covalente com o substrato. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, isto é, a família das Subtilisinas, a família das Termitases, a família da Proteinase K, a família das Peptidases lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas.
[0697] Os exemplos de subtilases são aquelas derivadas a partir de Bacillus como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii descritas nos documentos sob os nos US7262042 e WO09/021867 e subtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, , subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 descritas no documento sob o n° WO89/06279 e protease PD138 descrita no documento sob o n° (WO93/18140). Outras proteases úteis podem ser aquelas descritas nos documentos sob os nos WO01/016285, WO02/026024 e WO02/016547. Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita nos documentos nos WO89/06270, WO94/25583 e WO05/040372, e as proteases quimotripsina derivadas de Cellulomonas descritas nos documentos nos WO05/052161 e WO05/052146.
[0698] Uma protease preferencial adicional é a protease alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como descrito por exemplo no documento no WO95/23221, e suas variantes que são descritas nos documentos nos WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 e EP1921148.
[0699] Exemplos de metaloproteases são a metaloprotease neutra como descrita no documento no WO07/044993 (Genencor Int.) tais como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.
[0700] Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas nos documentos sob os n°s: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 com o uso da numeração BPN'. Mais preferencial, as variantes de subtilase podem compreender as mutações: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (com o uso de numeração BPN').
[0701] As enzimas proteases comercialmente disponíveis adequadas incluem aquelas vendidas sob os nomes registrados Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® (Novozymes A/S), aquelas vendidas sob os nomes registrados Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3® , FN4®, Excellase®, Eraser® , Ultimase®, Opticlean® e Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (sequência mostrada na Figura 29 do documento sob o n° US5352604) e variantes dos mesmos (Henkel AG) e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) disponível junto a Kao.
[0702] Lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, por exemplo, de T. lanuginosus (previamente nomeada Humicola lanuginosa) como descrito nos documentos nos EP258068 e EP305216, cutinase de Humicola, por exemplo, H. insolens (WO96/13580), lipase de cepas de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas Burkholderia), por exemplo, P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), cepa de P. sp. SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipases do tipo GDSL de Streptomyces (WO10/065455), cutinase de Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinase de Pseudomonas mendocina (US5,389,536), lipase de Thermobifida fusca (WO11/084412), lipase de Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), lipase de Bacillus subtilis (WO11/084599) e lipase de Streptomyces griseus (WO11/150157) e S pristinaespiralis (WO12/137147).
[0703] Outros exemplos são variantes de lipase como aquelas descritas nos documentos sob os n°s EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 e WO09/109500.
[0704] Produtos de lipase comerciais preferenciais incluem LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (originalmente da Gist-Brocades).
[0705] Outros exemplos ainda são lipases por vezes denominadas como aciltransferases ou perhidrolases,, por exemplo, aciltransferases com homologia com lipase A de Candida antarctica (WO10/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolases da família CE 7 (WO09/67279), e variantes da perhidrolase de M smegmatis, em particular a variante S54V usada no produto comercial Gentle Power Bleach da Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).
[0706] As amilases adequadas que podem ser usadas em conjunto com as variantes de subtilase da invenção podem ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e podem ser de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação proteica. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1.296.839.
[0707] Amilases adequadas incluem amilases que têm a SEQ ID NO: 2 no documento no WO 95/10603 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. Variantes preferenciais são descritas nos documentos nos WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 e SEQ ID NO: 4 do documento no WO 99/019467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444.
[0708] Diferentes amilases adicionais incluem amilases que têm SEQ ID NO: 6 no documento no WO 02/010355 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas que têm uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193.
[0709] Outras amilases que são adequadas são alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1 a 33 da alfa-amilase derivada de B amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID NO: 6 do documento no WO 2006/066594 e resíduos 36 a 483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 no documento no WO 2006/066594 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com a mesma. Variantes preferenciais desta alfa-amilase híbrida são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1 a 33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID NO: 6 do documento no WO 2006/066594 e resíduos 36 a 483 de SEQ ID NO: 4 são aquelas que têm as substituições: M197T; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.
[0710] Amilases adicionais que são adequadas são amilases que têm SEQ ID NO: 6 no documento no WO 99/019467 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas que têm deleção nas posições R181 e G182, ou posições H183 e G184.
[0711] Amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas que têm SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 do documento no WO 96/023873 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID N°: 7. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476, usando SEQ ID 2 do documento no WO 96/023873 para numeração. Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção em duas posições selecionadas de 181, 182, 183 e 184, tal como 181 e 182, 182 e 183, ou posições 183 e 184. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas que têm uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476.
[0712] Outras amilases que podem ser usadas são amilases que têm SEQ ID NO: 2 do documento no WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 no documento no WO 01/66712 ou suas variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 do documento no WO 08/153815 ou 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10 no documento no WO 01/66712. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 10 na WO 01/66712 são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 e 264.
[0713] Amilases adequadas adicionais são amilases que têm SEQ ID NO: 2 do documento no WO 09/061380 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas que têm um truncamento do C-terminal e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E, R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. As variantes de amilase de SEQ ID NO: 2 com máxima prefeência são aquelas que têm as substituições: N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K; S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; or S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K em que as variantes são truncadas em C-terminal e opcionalmente compreendem, ainda, uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.
[0714] Amilases adequadas adicionais são amilases que têm SEQ ID NO: 1 do documento no WO13184577 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 e G477. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K e G477K e/ou deleção na posição R178 e/ou S179 ou de T180 e/ou G181. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm as substituições: E187P+I203Y+G476K E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K, em que as variantes também compreendem opcionalmente uma substituição na posição 241 e/ou uma deleção na posição 178 e/ou posição 179.
[0715] Amilases adequadas adicionais são amilases que têm SEQ ID NO: 1 do documento no WO10104675 ou variantes que têm 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: N21, D97, V128 K177, R179, S180, I181, G182, M200, L204, E242, G477 e G478. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K e G478K e/ou deleção na posição R179 e/ou S180 ou de I181 e/ou G182. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas que têm as substituições: N21D+D97N+V128I, em que as variantes também compreendem opcionalmente uma substituição na posição 200 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.
[0716] Outras amilases adequadas são a alfa-amilase que têm SEQ ID NO: 12 no documento no WO01/66712 ou uma variante que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12. Variantes de amilases preferenciais são aquelas que têm uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID NO: 12 no documento no WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Amilases preferenciais particulares incluem variantes que têm uma deleção de D183 e G184 e que têm as substituições R118K, N195F, R320K e R458K, e uma variante que tem adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, com máxima preferência uma variante que tem adicionalmente substituições em todas estas posições.
[0717] Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas nos documentos nos WO2011/098531, WO2013/001078 e WO2013/001087. Amilases comercialmente disponíveis são DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM, Stainzima TM, Stainzima PlusTM, NatalaseTM, Liquozyme X e BANTM (disponíveis junto à Novozymes A/S), e RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase, Preferenz S1000, Preferenz S100 e Preferenz S110 (disponíveis junto à Genencor International Inc./DuPont).
[0718] Peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação proteica. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e suas variantes como aquelas descritas nos documentos nos WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.
[0719] Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes A/S).
[0720] A enzima (ou enzimas) de detergente pode ser incluída em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta, etc.. Formulações de aditivo de detergente preferenciais são granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas.
[0721] Podem ser produzidos granulados sem formação de poeiras, por exemplo, como divulgado em US 4.106.991 e 4.661.452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1.000 a 20.000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Podem ser preparadas enzimas protegidas de acordo com o método divulgado no documento no EP 238,216.
[0722] Podem ser usados quaisquer componentes de detergentes conhecidos na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Outros componentes de detergente opcionais incluem agentes anticorrosão, agentes antiencolhimento, agentes antirredeposição de sujidades, agentes antipregueamento, bactericidas, ligantes, inibidores de corrosão, agentes desintegrantes/de desintegração, corantes, estabilizadores de enzimas (incluindo ácido bórico, boratos, CMC, e/ou polióis tais como propileno glicol), condicionadores de tecido incluindo argilas, agentes de enchimento/auxiliares de processamento, agentes de branqueamento fluorescentes/branqueadores óticos, impulsionadores de espuma, reguladores de espuma (solução saponífera), perfumes, agentes de suspensão de sujidade, amaciadores, supressores de solução saponífera, inibidores de embaciamento, e agentes de migração, ou sozinhos ou em combinação. Pode ser usado qualquer ingrediente conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. A escolha de tais ingredientes está bem no âmbito da habilidade do elemento versado na técnica.
[0723] Dispersantes: As composições detergentes da presente invenção podem também conter dispersantes. Em particular, os detergentes em pó podem compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo- ou copoliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Dispersantes adequados são por exemplo descritos em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.
[0724] Agentes de Inibição de Transferência de Corantes: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes poliméricos adequados incluem, mas sem limitação, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma composição sujeito, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes a níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso da composição.
[0725] Agente de branqueamento fluorescente: As composições detergentes da presente invenção irão preferencialmente conter componentes adicionais que poderão tingir os artigos sendo limpos, tais como agente de branqueamento fluorescente ou branqueadores óticos. Quando presente, o branqueador está preferencialmente a um nível de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%. Qualquer agente de branqueamento fluorescente adequado para uso em uma composição detergente de lavagem de roupa pode ser usado na composição da presente invenção. Os agentes de branqueamento fluorescente mais comumente usados são aqueles pertencendo às classes de derivados de ácido diaminoestilbenossulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil-diestirila. Exemplos do tipo derivado de ácido diaminoestilbenossulfônico de agentes de branqueamento fluorescente incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6- ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6- ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxi- etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil- 2,1,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1-metil-2- hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato e 2-(estilbil- 4"-nafto-1,2':4,5)-1,2,3-trizol-2"-sulfonato. Agentes de branqueamento fluorescentes preferenciais são Tinopal DMS e Tinopal CBS disponíveis junto à Ciba-Geigy AG, Basileia, Suíça. Tinopal DMS é o sal dissódico de dissulfonato de 4,4'-bis-(2-morfolino-4 anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno. Tinopal CBS é o sal dissódico de dissulfonato de 2,2'-bis-(fenil-estiril). Agentes de branqueamento fluorescentes também preferencias são os Parawhite KX comercialmente disponíveis, fornecidos pela Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia. Outros produtos fluorescentes adequados para uso na invenção incluem as 1-3-diarilpirazolinas e as 7- alquilaminocoumarinas. Níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de cerca de 0,01 a 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2% em peso a níveis superiores de 0,5 ou mesmo 0,75% em peso.
[0726] Polímeros de liberação de sujidade: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais polímeros de liberação de sujidade que auxiliam na remoção de sujidades dos tecidos tais como tecidos à base de algodão e poliéster, em particular na remoção de sujidades hidrofóbicas de tecidos à base de poliéster. Os polímeros de liberação de sujidade podem, por exemplo, ser polímeros à base de tereftalto não iônicos ou aniônicos, caprolactama de polivinila e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinila, poliamidas de poliéster, consultar, por exemplo, Capítulo 7 em
[0727] Powdered Detergents, Surfactant science series, volume 71, Marcel Dekker, Inc. Outro tipo de polímeros de liberação de sujidade são polímeros de limpeza de gordura alcoxilados anfifílicos compreendendo uma estrutura nuclear e uma pluralidade de grupos alcoxilato anexados a essa estrutura nuclear. A estrutura nuclear pode compreender uma estrutura de polialquilenimina ou uma estrutura de polialcanolamina como descrita em detalhe no documento no WO 2009/087523 (aqui incorporado a título de referência). Além disso, copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujidade adequados. Copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhe nos documentos nos WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (aqui incorporados a título de referência). Outros polímeros de liberação de sujidade são estruturas de polissacarídeos substituídos especialmente estruturas celulósicas substituídas tais como derivados celulósicos tais como aqueles descritos no documento no EP 1867808 ou WO 2003/040279 (ambas são aqui incorporadas por referência). Polímeros celulósicos adequados incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose anionicamente modificada, celulose não ionicamente modificada, celulose cationicamente modificada, celulose zwitterionicamente modificada, e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, éster de carboximetilcelulose e suas misturas.
[0728] Agentes antirredeposição: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes antirredeposição, como carboximetilcelulose (CMC), álcool de polivinila (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maleico e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros à base de celulose descritos sob polímeros de liberação de sujidade acima podem também funcionar como agentes antirredeposição.
[0729] Outros materiais adjuntos adequados incluem, mas sem limitação, agentes anti-encolhimento, agentes anti-pregueamento, bactericidas, ligantes, transportadores, corantes, estabilizantes de enzima, amaciadores de tecido, enchimentos, reguladores de espuma, hidrótopos, perfumes, pigmentos, supressores de solução saponífera, solventes, e estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes de elastização da estrutura.
[0730] A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete homogêneo, um tablete tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Existe um número de formas de formulação de detergentes tal como camadas (mesmas ou diferentes fases), bolsas, bem como formas para unidade de dosagem da máquina.
[0731] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos únicos ou múltiplos. Podem estar em qualquer forma, formato e material que sejam adequados para conter a composição, por exemplo, sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contato com a água. A bolsa é feita de filme solúvel em água que encerra um volume interior. O volume interno pode ser dividido em compartimentos da bolsa. Filmes preferenciais são materiais poliméricos, preferencialmente polímeros que são formados em um filme ou folha. Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferenciais são poliacrilatos selecionados, e copolímeros de acrilato solúveis em água, metil celulose, carbóxi metil celulose, dextrina de sódio, etil celulose, hidroxietil celulose, hidroxipropil metil celulose, malto dextrina, poli metacrilatos, com máxima preferência, copolímeros de álcool polivinílico e, hidroxipropil metil celulose (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímeros no filme, por exemplo, PVA, é pelo menos cerca de 60%. O peso molecular médio preferencial será tipicamente cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes podem ser também de composições de combinação compreendendo combinações de polímeros hidroliticamente degradáveis e solúveis em água, tais como poliactida e álcool de polivinila (conhecido sob a Referência comercial M8630 como vendido por Chris Craft In. Prod. Of Gary, Ind., EUA) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, Propileno glicol, sorbitol e suas misturas. As bolsas podem compreender uma composição detergente sólida de lavagem de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida de limpeza ou componentes parciais separados pelo filme solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que os compartimentos contendo sólidos. Ref: (US2009/0011970 A1).
[0732] Os ingredientes de detergentes podem estar separados fisicamente uns dos outros por compartimentos em bolsas dissolvíveis em água ou em diferentes camadas de tabletes. Desta forma pode ser evitada interação de armazenamento negativa entre componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem dar origem a dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem.
[0733] Um detergente líquido ou em gel, que não seja doseado à unidade, pode ser aquoso, contendo tipicamente pelo menos 20% em peso e até 95% de água, tal como até cerca de 70% de água, até cerca de 65% de água, até cerca de 55% de água, até cerca de 45% de água, até cerca de 35% de água. Outros tipos de líquidos, incluindo, sem limitação, alcanóis, aminas, dióis, éteres e polióis podem ser incluídos em um líquido ou gel aquoso. Um detergente líquido ou em gel aquoso pode conter de 0 a 30% de solvente orgânico. Um detergente líquido ou em gel pode ser não aquoso.
[0734] As enzimas da invenção podem ser adicionadas a barras de sabão para lavagem da roupa e usadas para lavagem à mão de roupa, tecidos e/ou têxteis. O termo barra de sabão para lavagem de roupa inclu barras para lavagem de roupa, barras de sabão, barras combinadas, barras syndet e barras de detergente. Os tipos de barra diferem usualmente no tipo de tensoativo que contêm, e o termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui aquelas contendo sabões de ácidos graxos e/ou sabões sintéticos. A barra de sabão para lavagem de roupa tem uma forma física que é sólida e não um líquido, gel ou um pó à temperatura ambiente. O termo sólido é definido como uma forma física que não muda significativamente ao longo do tempo, isto é., se um objeto sólido (por exemplo, barra de sabão para lavagem de roupa) é colocado dentro de um recipiente, o objeto sólido não muda para encher o recipiente em que está colocado. A barra é um sólido tipicamente na forma de barra mas pode estar em outras formas sólidas tais como redonda ou oval.
[0735] A barra de sabão para lavagem de roupa pode conter uma ou mais enzimas adicionais, inibidores de protease tais como aldeídos de peptídeo (ou aduto de hidrossulfito ou aduto de hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax e/ou derivados do ácido fenilborônico tais como ácido 4- formilfenilborônico, um ou mais sabões ou tensoativos sintéticos, polióis tais como glicerina, compostos de controle do pH tais como ácidos graxos, ácido cítrico, ácido acético e/ou ácido fórmico, e/ou um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico em que o cátion monovalente pode ser, por exemplo, Na+, K+ ou NH4+ e o ânion orgânico pode ser, por exemplo, formato, acetato, citrato ou lactato tal que o sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico possam ser, por exemplo, formato de sódio.
[0736] A barra de sabão para lavagem de roupa contém agentes complexantes como EDTA e HEDP, perfumes e/ou diferentes tipos de enchimentos, tensoativos, por exemplo, tensoativos sintéticos aniônicos, adjuvantes, agentes de liberação de sujidade poliméricos, quelantes de detergente, agentes estabilizantes, enchimentos, tintas, corantes, inibidores da transferência de corante, policarbonatos alcoxilados, supressores de solução saponífera, estruturantes, ligantes, agentes lixiviantes, ação, agentes de remoção de solo argiloso, agentes antirredeposição, agentes dispersantes poliméricos, branqueadores, amaciadores de tecido, perfumes e/ou outros compostos conhecidos na técnica.
[0737] A barra de sabão para lavagem de roupa pode ser processada em equipamento de fabricação de barras de sabão para lavagem de roupa convencionais, tal como, mas sem limitação: misturadores, "plodders", por exemplo, um "plodder" a vácuo de duas etapas, extrusoras, cortadores, estampagem de logo, túneis de esfriamento e empacotadores. A invenção não está limitada à preparação das barras de sabão para lavagem de roupa por qualquer método único. A pré-mistura da invenção pode ser adicionada ao sabão em diferentes etapas do processo. Por exemplo, a pré-mistura contendo um sabão, uma enzima, opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais, um inibidor de protease, e um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico pode ser preparada e a mistura é depois extrudada. A enzima e as enzimas adicionais opcionais podem ser adicionadas ao mesmo tempo do inibidor de protease, por exemplo, na forma líquida. Para além da etapa de mistura e da etapa de extrusão, o processo pode compreender adicionalmente as etapas de moagem, extrusão, corte, estampagem, resfriamento e/ou empacotamento.
[0738] Um detergente granular pode ser formulado conforme descrito nos documentos sob os n°s WO09/092699, EP1705241, EP1382668, WO07/001262, US6472364, WO04/074419 or WO09/102854. Other useful detergent formulations are described in WO09/124162, WO09/124163, WO09/117340, WO09/117341, WO09/117342, WO09/072069, WO09/063355, WO09/132870, WO09/121757, WO09/112296, WO09/112298, WO09/103822, WO09/087033, WO09/050026, WO09/047125, WO09/047126, WO09/047127, WO09/047128, WO09/021784, WO09/010375, WO09/000605, WO09/122125, WO09/095645, WO09/040544, WO09/040545, WO09/024780, WO09/004295, WO09/004294, WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, WO09/074398, WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, WO09/021813, WO09/030632, e WO09/015951. WO2010025161, WO2010014395, WO2010044905, WO2010145887, WO2010142503, WO2010122051, WO2010102861, WO2010099997, WO2010084039, WO2010076292, WO2010069742, WO2010069718, WO2010069957, WO2010057784, WO2010054986, WO2010018043, WO2010003783, WO2010003792, WO2011023716, WO2010142539, WO2010118959, WO2010115813, WO2010105942, WO2010105961, WO2010105962, WO2010094356, WO2010084203, WO2010078979, WO2010072456, WO2010069905, WO2010076165, WO2010072603, WO2010066486, WO2010066631, WO2010066632, WO2010063689, WO2010060821, WO2010049187, WO2010031607, WO2010000636.
[0739] A presente invenção também é dirigida a métodos de uso das variantes de subtilase de acordo com a invenção ou composições das mesmas em lavagem de têxteis e tecidos, como lavagem de roupa doméstica e lavagem de roupa industrial.
[0740] A invenção também é dirigida a métodos de uso das variantes de acordo com a invenção ou respectivas composições em limpeza de superfícies duras, como pisos, mesas, paredes, telhados, etc., bem como superfícies de objetos duros, como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça).
[0741] As variantes de subtilase da presente invenção podem ser adicionadas a e, dessa forma, se tornar um componente de uma composição detergente. Dessa forma, um aspecto da invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 em um processo de limpeza como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras.
[0742] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em um processo de limpeza como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras.
[0743] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e em que a variante de subtilase tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, mas menos que 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, em um processo de limpeza como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras.
[0744] Em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que tem atividade de protease e que tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase progenitora quando medida conforme descrito no ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado no Exemplo 3 no presente documento, que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em um processo de limpeza como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras.
[0745] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em um processo de limpeza, como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras e em que a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 quando medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado", conforme descrito no Exemplo 3 na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0746] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 em um processo de limpeza como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras e em que a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular, estabilidade em armazenamento melhorada, em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 quando medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado", conforme descrito no Exemplo 3 na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0747] As variantes de subtilase da presente invenção podem ser adicionadas a e, dessa forma, se tornar um componente de uma composição detergente. Dessa forma, um aspecto da invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 em um processo de limpeza, como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras e em que a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em relação ao progenitor ou em relação a uma protease progenitora que tem a sequência de aminoácidos idêntica à variante, mas que exclui as substituições em uma ou mais das posições quando medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" e do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, respectivamente, conforme descrito na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0748] Em outro aspecto, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em um processo de limpeza, como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras e em que a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em relação a SEQ ID NO: 1 medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" e do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, respectivamente, conforme descrito na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0749] Em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de uma variante de subtilase que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que a posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que a variante tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 76% pelo menos 77% pelo menos 78% pelo menos 79% pelo menos 80%, pelo menos 81% pelo menos 82% pelo menos 83% pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86% pelo menos 87% pelo menos 88% pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, mas menos que 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12 em um processo de limpeza, como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras e em que a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade em armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em relação ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, quando medida com o uso do "ensaio de estabilidade em armazenamento acelerado" e do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para lavagem de roupa, respectivamente, conforme descrito na seção Materiais e Métodos no presente documento.
[0750] Uma composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina, incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciadora de tecidos adicionada para enxaguamento, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina. Em um aspecto específico, a presente invenção proporciona um aditivo de detergente compreendendo um polipeptídeo da presente invenção como descrito aqui.
[0751] O processo de limpeza ou o processo de cuidado de têxteis pode, por exemplo, ser um processo de lavagem de roupa, um processo de lavagem de louça ou limpeza de superfícies duras tais como azulejos de banheiro, pisos, tampos de mesas, ralos, pias e lavatórios. Os processos de lavagem de roupa podem ser, por exemplo, lavagem de roupa doméstica, mas podem também ser lavagem de roupa industrial. Além disso, a invenção se refere a um processo para lavagem de tecidos e/ou peças de vestuário em que o processo compreende tratamento de tecidos com uma solução de lavagem contendo uma composição detergente, e pelo menos uma variante de protease da invenção. O processo de limpeza ou um processo de cuidado de têxteis pode ser, por exemplo, realizado em um processo de lavagem à máquina ou em um processo de lavagem manual. A solução de lavagem pode ser, por exemplo, uma solução de lavagem aquosa contendo uma composição detergente.
[0752] Nos últimos anos tem existido um interesse crescente na substituição de componentes em detergentes, que sejam derivados de petroquímicos com componentes biológicos renováveis tais como enzimas e polipeptídeos sem comprometer o desempenho de lavagem. Quando os componentes de composições detergentes mudam, são necessárias novas atividades enzimáticas ou novas enzimas que têm propriedades alternativas e/ou melhoradas em comparação com as enzimas de detergente comumente usadas tais como proteases, lipases e amilases para alcançar um desempenho de lavagem similar ou melhor em comparação com as composições detergentes tradicionais.
[0753] A invenção diz adicionalmente respeito ao uso de variantes de subtilases da invenção em um processo de remoção de manchas proteináceas. As manchas proteináceas podem ser manchas tais como manchas de alimentos, por exemplo, alimentos para bebês, sebo, cacau, ovo, sangue, leite, tinta, grama, ou uma sua combinação.
[0754] Composições detergentes típicas incluem vários componentes adicionalmente às enzimas, estes componentes têm efeitos diferentes, alguns componentes como os tensoativos diminuem a tensão superficial no detergente, que permite que a mancha sendo limpa seja levantada e dispersa e depois lavada, outros componentes como sistemas de lixiviação removem descoloração frequentemente por oxidação e muitos lixiviadores têm também fortes propriedades bactericidas, e são usados para desinfecção e esterilização. Ainda outros componentes como adjuvante e quelante amolecem, por exemplo, a água de lavagem por remoção dos íons de metal do líquido.
[0755] Em uma modalidade particular, a invenção diz respeito ao uso de uma composição compreendendo uma variante de subtilase da invenção e um ou mais componentes detergentes, como surfactantes, hidrótopos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes de branqueamento fluorescentes, perfume, branqueadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujidade, polímeros de liberação de sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizadores de enzimas, ativadores de enzimas, antioxidantes, e solubilizadores.
[0756] Em uma modalidade particular, a invenção diz respeito ao uso de uma composição que compreende uma variante de subtilase da invenção e uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases, amilases, lipases, cutinases, celulases, endoglucanases, xiloglucanases, pectinases, pectina liases, xantanases, peroxidases, haloperoxigenases, catalases e mananases, ou qualquer mistura das mesmas.
[0757] Em uma modalidade particular, a invenção diz respeito ao uso de uma composição que compreende uma variante de subtilase da invenção, uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em proteases, amilases, lipases, cutinases, celulases, endoglucanases, xiloglucanases, pectinases, pectina liases, xantanases, peroxidases, haloperoxigenases, catalases e mananases, ou qualquer mistura das mesmas e um ou mais componentes detergentes, como tensoativos, hidrótopos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes de branqueamento fluorescentes, perfume, branqueadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão de sujidade, polímeros de liberação de sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizadores de enzimas, ativadores de enzimas, antioxidantes e solubilizadores.
[0758] A presente invenção refere-se a um método de limpeza de um tecido, uma louça ou superfície dura com uma composição detergente compreendendo uma variante de protease da invenção.
[0759] Uma modalidade preferencial diz respeito a um método de limpeza, em que o método compreende as etapas de: colocar um objeto em contato com uma composição detergente que compreende uma variante de protease da invenção sob condições adequadas para a limpeza do objeto. Em uma modalidade preferencial, a composição detergente é usada em uma lavagem de roupa ou em um processo de lavagem de louça.
[0760] Ainda outra modalidade se refere a um método de remoção de manchas de tecido ou louça que compreende colocar o tecido ou louça em contato com uma composição que compreende uma protease da invenção sob condições adequadas para a limpeza do objeto.
[0761] Também contemplados são composições e métodos de tratamento de tecidos (por exemplo, para desengomar um têxtil) usando uma ou mais das proteases da invenção. A protease pode ser usada em qualquer método de tratamento de tecidos que seja bem conhecido na técnica (consultar, por exemplo, US6,077,316). Por exemplo, em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contato do tecido com uma protease em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão.
[0762] As composições detergentes da presente invenção são adequadas para uso em lavagem de roupa e aplicações de superfícies duras, incluindo lavagem de louça. Em conformidade, a presente invenção inclui um método para lavagem de um tecido ou lavagem de louça. O método compreende as etapas de contatar o tecido/louça a ser limpo com uma solução compreendendo a composição detergente de acordo com a invenção. O tecido pode compreender qualquer tecido capaz de ser lavado em condições normais de uso do consumidor. A louça pode compreender qualquer louça, como faianças, talheres, cerâmicas, plásticos, como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos. A solução tem preferencialmente um pH de cerca de 5,5 a cerca de 11,5. As composições podem ser empregues a concentrações desde cerca de 100 ppm, preferencialmente 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água variam tipicamente desde cerca de 5 °C a cerca de 95 °C, incluindo cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C, cerca de 40 °C, cerca de 45 °C, cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, cerca de 80 °C, cerca de 85 °C e cerca de 90 °C. A razão de água em relação a tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.
[0763] A enzima (ou enzimas) da composição detergente da invenção pode ser estabilizada com o uso de agentes estabilizadores e inibidores de proteases convencionais, por exemplo, um poliol, como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, diferentes sais, como NaCl; KCl; ácido lático, ácido fórmico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, como ácido 4-formilfenil borônico, ou um aldeído peptídico, como aldeídos di-, tri- ou tetrapeptídicos ou análogos de aldeídos (da forma B1- B0-R em que, R é H, CH3, CX3, CHX2, ou CH2X (X=halogênio), B0 é um resíduo de aminoácido único (preferencialmente com uma cadeia lateral alifática ou aromática opcionalmente substituída); e B1 consiste em uma ou mais resíduos de aminoácidos (preferencialmente um, dois ou três), opcionalmente que compreende um grupo de proteção N-terminal, ou como descrito nos documentos sob os n°s WO09118375, WO98/13459) ou um inibidor de protease do tipo proteico, como RASI, BASI, WASI (inibidores bifuncionais de alfa-amilase/subtilisina de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI. A composição pode ser formulada conforme descrito, por exemplo, nos documentos sob os nos WO 92/19709, WO 92/19708 e US 6.472.364. Em algumas modalidades, as enzimas empregues aqui são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proporcionam tais íons às enzimas, bem como outros íons de metal (por exemplo, bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), Estanho (II), cobalto (II), cobre (II), Níquel (II), e oxovanádio (IV)).
[0764] Em algumas modalidades preferenciais, as composições detergentes proporcionadas no presente documento são tipicamente formuladas de modo que, durante o uso em operações de limpeza aquosas, a água de lavagem tenha um pH desde cerca de 5,0 até cerca de 11,5 ou, em modalidades alternativas, mesmo desde cerca de 6,0 até cerca de 10,5. Em algumas modalidades preferenciais, produtos de lavagem de roupa granulares ou líquidos são formulados de modo a terem um pH desde cerca de 6 até cerca de 8. Técnicas para controle de pH a níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, alcalinos, ácidos, etc., e são bem conhecidas daqueles elementos versados na técnica.
[0765] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.
[0766] Com a finalidade de avaliar o desempenho de lavagem em roupa são realizados experimentos de lavagem com o uso do ensaio de estresse mecânico automático (AMSA, do inglês "Automatic Mechanical Stress Assay"). Com o AMSA, pode ser examinado o desempenho de lavagem de muitas soluções enzima-detergente de pequeno volume. A placa AMSA tem várias ranhuras para as soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente o têxtil a ser lavado contra as aberturas da ranhura. Durante a lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar estresse mecânico de uma maneira regular, periodicamente oscilante. Para descrição adicional consultar WO 02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments" nas páginas 23 e 24.
[0767] As experiências de lavagem de roupa são conduzidas sob as condições experimentais especificadas em baixo:Tabela 3
Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) para Lavagem Automática de Louça
[0768] Foram realizados experimentos de lavagem para avaliar o desempenho de lavagem de variantes de protease selecionadas em composições detergentes de lavagem de louça. As proteases do presente pedido foram testadas com o uso do Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA). Com o AMSA, pode ser examinado o desempenho de lavagem de muitas soluções enzima-detergente de pequeno volume. A placa AMSA tem várias ranhuras para soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente o ladrilho de melamina a ser lavado contra as aberturas de ranhura. Durante a lavagem, a placa, soluções de teste, ladrilho de melamina e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o ladrilho de melamina sujo e aplicar estresse mecânico de uma maneira regular, periodicamente oscilante. Para descrição adicional, consultar WO 02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments" nas páginas 23 e 24.
[0769] O experimento foi conduzido sob as condições experimentais conforme especificado nas tabelas 4 e 5 abaixo.Tabela 4: Condições Experimentais de AMSA usando detergente modelo de ADW com MGDA
Tabela 5: Condições Experimentais de AMSA usando detergente modelo de ADW com STPP
[0770] A dureza da água foi ajustada para 21°dH por adição de CaCl2, MgCl2, e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:CO32- = 4:1:10) ao sistema de teste. Após a lavagem, os ladrilhos de melamina de gema de ovo foram enxaguados em água da torneira e secos.
[0771] O desempenho da variante de enzima é medido como o brilho da cor do ladrilho de melamina (e têxtil para lavagem de roupa) lavado com essa variante de subtilase específica. O brilho pode ser também expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem de uma protease. As medições de cor foram feitas com um digitalizador de mesa profissional (EPSON EXPRESSION 10000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 Ballerup, Dinamarca), que é usado para capturar uma imagem dos ladrilhos de melamina lavados.
[0772] Para extrair um valor para a intensidade da luz a partir das imagens digitalizadas, é usado um aplicativo de software projetado especial (Novozymes Colour Vector Analyzer). O programa obtém da imagem os valores dos pixels de 24 bits e converte-os em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) é calculado adicionando-se os valores RGB como vetores e, depois, considerando-se o comprimento do vetor resultante:Tabela 6: Composição de detergentes modelo e materiais de teste O detergente modelo e os materiais de teste foram os seguintes:
[0773] Os materiais de teste são obtidos junto à EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Suíça, do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos, e WFK Testgewebe GmbH, Christenfeld 10, D-41379 Brüggen, Alemanha.
[0774] A dureza da água foi ajustada para 15°dH por meio da adição de CaCl2, MgCl2 e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+ = 4:1:7,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram passados por água da torneira e secos.
[0775] A atividade proteolítica pode ser determinada por um método empregando o substrato Suc-AAPF-PNA. Suc-AAPF-PNA é uma abreviatura de N-Succinil-Alanina-Alanina-Prolina-Fenilalanina-p- Nitroanilida, e é um peptídeo bloqueado que pode ser clivado por endoproteases. Após a clivagem, é liberada uma molécula de PNA livre e tem uma cor amarela e, assim, pode ser medida por espectrofotometria visível ao comprimento de onda de 405 nm. O substrato Suc-AAPF-PNA é fabricado pela Bachem (n° cat. L1400, dissolvido em DMSO).
[0776] A amostra de protease a ser analisada foi diluída em tampão de atividade residual (100 mM de Tris pH 8,6). O ensaio foi realizado por meio da transferência de 30 μl de amostras de enzimas diluídas para uma placa de microtitulação de 96 poços e da adição de 70 μl de solução de trabalho de substrato (0,72 mg/ml em 100 mM de Tris pH 8,6). A solução foi misturada à temperatura ambiente e a absorção é medida de 20 em 20 segundos ao longo de 5 minutos a OD 405 nm.
[0777] A inclinação (absorvância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade da protease em questão sob o conjunto determinado de condições. A amostra de protease deve ser diluída para um nível em que a inclinação é linear.
[0778] A menos que mencionado de outro modo, as manipulações e transformações de DNA foram realizadas usando métodos comuns de biologia molecular (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood e Cutting (1990).
[0779] O seguinte resume a mutação e introdução de um cassete de expressão em Bacillus subtilis. Todas as manipulações de DNA foram efetuadas por PCR (por exemplo, Sambrook et al.; Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press) e podem ser repetidas por qualquer elemento versado na técnica.
[0780] Os construtos de B. subtilis recombinante que codificam variantes de subtilase foram usados para inocular frascos agitados contendo um meio rico (por exemplo, 100 g/l de sacarose (n° cat. da Danisco 109-0429), 40 g/l de casca de soja (farinha de soja), 10 g/l de Na2HPO4.12H2O (n° cat. da Merck 6579), 0,1 ml/l de replace- Dowfax63N10 (Dow). O cultivo demora tipicamente 4 dias a 30 °C com agitação a 220 rpm.
[0781] O caldo de cultura foi centrifugado (26.000 x g, 20 min.) e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante foi filtrado em uma unidade de filtração Nalgene de 0,2 μm para remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. O pH no filtrado de 0.2μm foi ajustado para um pH 8 com 3M de base Tris e o filtrado com pH ajustado foi aplicado a uma coluna Hypercel MEP (disponível junto à Pall corporation) equilibrada em 20mM de Tris/HCl, 1mM de CaCl2, pH 8,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilibração, a coluna foi eluída de modo descontínuo com CH3COOH/NaOH 20 mM, CaCl2 1 mM, pH 4,5. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease (usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9) e as frações do pico foram agrupadas. O pH da reunião da coluna MEP Hypercel foi ajustado para pH 6 com CH3COOH a 20% (v/v) ou 3M de base Tris e a reunião de pH ajustado foi diluída com água desionizada para a mesma condutividade de 20 mM de MES/NaOH, 2 mM de CaCl2, pH 6,0. A reunião diluída foi aplicada em uma coluna SP-sefarose FF (da GE Healthcare) equilibrada em MES/NaOH 20 mM, CaC2 2 mM, pH 6,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a protease foi eluída com um gradiente linear de NaCl (0 --> 0,5 M) no mesmo tampão ao longo de cinco volumes da coluna. Frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease (usando o ensaio de Suc-AAPF- pNA a pH 9) e as frações ativas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações onde somente uma banda foi observada no gel de SDS-PAGE manchado com coomassie foram reunidas formando a preparação purificada que foi usada para experimentos adicionais.
[0782] A estabilidade em armazenamento de variantes de protease em detergente líquido foi avaliada com o uso de um ensaio acelerado com incubação em temperaturas elevadas durante até 24 horas.
[0783] Todas as amostras de protease purificadas foram diluídas a concentrações de 0,2 e 0,1 mg/ml com base na absorvância a 280 nm e coeficiente de extinção teórica com o uso de Triton X-100 a 0,01%. Para cada variante 2 poços com alta concentração de protease e 2 poços com baixa concentração foram incluídos. Como referência, SEQ ID NO: 3 foi incluído em cada placa de microtitulação. 30 μl de amostra de protease foram misturados com 270 μl de detergente (Modelo O ou CNS EDTA pH 9) no poço de uma placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml) com o uso de uma barra magnética (em estação de pipetagem Zephyr (Caliper LifeSciences) durante 30 min.). 20 μl dessa mistura foram, então, transferidos para uma outra placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml com barras magnéticas adicionadas) e misturados com 150 μl de 100 mM de Tris pH 8,6 (pelo menos 5 min. em Zephyr). 30 μl dessa diluição foram transferidos para uma Nunc F 96-MTP, e após a adição de 70 μl de solução de substrato, a atividade inicial da amostra sem estresse foi determinada mediante a medição da absorvância a 405 nm a cada 20 s durante 5 min. (em um SpectraMax Plus). Após a vedação, a placa de detergente fo incubada em temperatura adequada (50 a 62 °C para o Modelo O, 35 °C para CNS EDTA pH 9) em um Eppendorf Thermomixer (sem agitação). Após 1 a 4 e 20 a 25 horas de incubação, 20 μl de amostras foram retirados e a atividade residual da amostra sob estresse foi medida conforme com a atividade inicial sem estresse.
[0784] Presume-se que o decréscimo em atividade durante a incubação com detergente seja exponencial. As meia-vidas (T1^) foram encontradas a partir da regressão linear de Log(Atividade) versus tempo de incubação (0, 1 a 4 e 20 a 25 horas), e os fatores de melhoria de meia-vida (T1^ IF) foram calculados como meia-vida de variante de protease em relação à meia-vida da SEQ ID NO: 3. A Tabela 8 mostra a melhoria de meia-vida de variantes de mutações únicas de SEQ ID NO: 3.Tabela 7Tabela 8: Estabilidade em armazenamento acelerado de variantes T½ IF: O fator de melhoria de meia-vida foi medido para variantes de mutação única de SEQ ID NO: 3 em relação a SEQ ID NO: 3
[0785] A Tabela 8 mostra que todas as mutações acima melhoram a estabilidade em comparação com a protease progenitora (nesse exemplo, SEQ ID NO: 3) com pelo menos 25%. Tabela 9: Estabilidade em armazenamento acelerado de variantes T1^ IF: O fator de melhoria de meia-vida foi medido em relação a SEQ ID NO: 3
[0786] A estabilidade em armazenamento de variantes de protease em detergente líquido foi avaliada com o uso de um ensaio acelerado com incubação em temperaturas elevadas durante até 24 horas.
[0787] Os sobrenadantes de cultura contendo as variantes de protease foram diluídos 8 vezes com o uso de Triton X-100 a 0,01%. Cada sobrenadante de cultura foi testado em duplicatas. Como referência, Savinase purificada (SEQ ID NO: 1) diluída a concentrações de 0,2 e 0,1 mg/ml com Triton X-100 a 0,01% foi incluída em cada placa de microtitulação. 30 μl de amostra de protease foram misturados com 270 μl de detergente Modelo O no poço de uma placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml) com o uso de uma barra magnética (em estação de pipetagem Zephyr (Caliper LifeSciences) durante 15 min.). 20 μl dessa mistura foram, então, transferidos para uma outra placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml com barras magnéticas adicionadas) e misturados com 150 μl de 100 mM de Tris pH 8,6 (pelo menos 5 min. em Zephyr). 30 μl dessa diluição foram transferidos para uma Nunc F 96-MTP, e após a adição de 70 μl de solução de substrato, a atividade inicial da amostra sem estresse fo determinada mediante a medição da absorvância a 405 nm a cada 20 s durante 5 min. (em um SpectraMax Plus). Após a vedação, a placa de detergente foi incubada a 50 °C em um Eppendorf Thermomixer (sem agitação). Após 1, 4 e 24 horas de incubação, 20 μl de amostras foram retirados e a atividade residual da amostra sob estresse foi medida conforme com a atividade inicial sem estresse.
[0788] Presume-se que o decréscimo em atividade durante a incubação com detergente seja exponencial. As meia-vidas (T1^) foram encontradas a partir da regressão linear de Log(Atividade) versus tempo de incubação (0, 1, 4 e 24 horas), e os fatores de melhoria de meia-vida (T^ IF) foram calculados como meia-vida de variante de protease em relação à meia-vida da referência de Savinase (SEQ ID NO: 1).Tabela 10: Estabilidade em armazenamento acelerado de variantes em Modelo O a 50 °C. T^ IF: Fator de melhoria de meia-vida em relação à referência de Savinase (SEQ ID NO: 1).
[0789] A Tabela 10 mostra que todas as mutações acima melhoram a estabilidade em comparação com a protease progenitora (nesse exemplo, SEQ ID NO: 1).
[0790] A estabilidade em lavagem foi medida de acordo com o "Ensaio de estabilidade em lavagem", conforme descrito abaixo, com o uso dos detergentes modelos MGDA e STPP, conforme definido na Tabela 6. Os resultados estão apresentados na tabela 11.
[0791] Ambos os detergentes são dissolvidos em 50 mM de tampão CHES (ácido N-ciclo-hexil-2-aminoetanossulfônico, Sigma C2885) para assegurar que o pH seja mantido durante o experimento a 10,0 também após a adição da amostra de protease.
[0792] Sobrenadantes de cultura de protease são previamente diluídos 2 a 4 vezes e amostras de protease purificadas são diluídas para aproximadamente 0,1 e 0,05 mg/ml usando água desionizada. 10 μL de amostra de protease diluída são então misturados com 190 μL de solução de detergente modelo em um poço de uma placa de PCR de 96 poços de 0,2 ml. Após mistura, 20 μL são transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços (Nunc F) e a atividade inicial de protease é medida por adição de 100 μL de solução de substrato Suc-AAPF-pNA (Suc- Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 0,72 mg/ml (Bachem L-1400) em Tris 0,1 M, pH 8,6) a cada poço, mistura e medição da absorvância a 405 nm a cada 20 s por 5 min. em um SpectraMax Plus (Molecular Devices). A inclinação da regressão linear de medições iniciais da absorvância é usada para cálculos da atividade.
[0793] As proteases na placa de PCR são então estressadas por 30 min. de incubação a 58 °C para o detergente modelo STPP e 60 ou 62 °C para o detergente modelo MGDA em um Ciclador Térmico BioRad T100. Após esfriamento rápido para a temperatura ambiente, 20 μL são transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e a atividade residual é medida como descrito para a atividade inicial de protease. As temperaturas na etapa de estresse são escolhidas para gerar atividades residuais adequadas da protease de referência (SEQ ID NO: 8) e os polipeptídeos (de preferência, no intervalo de 10 a 80% da atividade inicial).
[0794] Presume-se que o decréscimo da atividade durante a etapa de estresse é exponencial. Assim, a meia-vida durante a etapa de estresse é calculada usando a fórmula: T1/2 = T * ln(2) / ln(A(Inicial) / A(Residual))
[0795] em que T1^ é a meia-vida, T é o tempo de incubação (30 min.), A(Inicial) é a atividade inicial de protease, e A(Residual) é a atividade de protease após a etapa de estresse. Todas as amostras de protease são testadas duas vezes (usando 2 vezes a mesma diluição da amostra para sobrenadantes de cultura e 0,1 e 0,05 mg/ml para amostras de protease purificadas). O fator de melhoria relativa da estabilidade em lavagem é então calculado por: Fator de Melhoria Relativa da Estabilidade em Lavagem = Média(T^(Amostra)) / Média(T^(Referência)
[0796] em que Média(T^(Amostras)) é a média das meia-vidas para a determinada amostra de protease e Média(T^(Referência)) é a média das meia-vidas para a protease de referência (SEQ ID NO: 8).Tabela 11: Dados de Estabilidade em Lavagem usando os detergentes modelo MGDA e STPP
[0797] Foram realizados experimentos de lavagem para avaliar o desempenho de lavagem de polipeptídeos de protease selecionados em composições detergentes de lavagem de louça. As proteases do presente pedido são testadas com o uso do ensaio de estresse mecânico automático (AMSA) para lavagem de louça, conforme descrito acima.
[0798] Os resultados são mostrados na Tabela 12 abaixo. As variantes de subtilase têm desempenho de lavagem melhorado em lavagem de louça em comparação com a protease com SEQ ID NO: 1.Tabela 12
[0799] A estabilidade em armazenamento de variantes de subtilase em detergente líquido foi avaliada com o uso de um ensaio acelerado com incubação em temperaturas elevadas durante até 24 horas.
[0800] Todas as amostras de protease purificadas foram diluídas a concentrações de 0,2 e 0,1 mg/ml com base na absorvância a 280 nm e coeficiente de extinção teórica com o uso de Triton X-100 a 0,01%. Para cada variante 2 poços com alta concentração de protease e 2 poços com baixa concentração foram incluídos. Como referência, SEQ ID NO: 3 foi incluído em cada placa de microtitulação. 30 μl de amostra de protease foram misturados com 270 μl de detergente (Modelo O ou CNS EDTA pH 9) no poço de uma placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml) com o uso de uma barra magnética (em estação de pipetagem Zephyr (Caliper LifeSciences) durante 30 min.). 20 μl dessa mistura foram, então, transferidos para uma outra placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 ml com barras magnéticas adicionadas) e misturados com 150 μl de 100 mM de Tris pH 8,6 (pelo menos 5 min. em Zephyr). 30 μl dessa diluição foram transferidos para uma Nunc F 96-MTP, e após a adição de 70 μl de solução de substrato, a atividade inicial da amostra sem estresse foi determinada mediante a medição da absorvância a 405 nm a cada 20 s durante 5 min. (em um SpectraMax Plus). Após a vedação, a placa de detergente foi incubada em temperatura adequada (50 a 62 °C para o Modelo O, 35 °C para CNS EDTA pH 9) em um Eppendorf Thermomixer (sem agitação). Após 1 a 4 e 20 a 25 horas de incubação, 20 μl de amostras foram retirados e a atividade residual da amostra sob estresse foi medida conforme com a atividade inicial sem estresse.
[0801] Presume-se que o decréscimo em atividade durante a incubação com detergente seja exponencial. As meia-vidas (T1^) foram encontradas a partir da regressão linear de Log(Atividade) versus tempo de incubação (0, 1 a 4 e 20 a 25 horas), e os fatores de melhoria de meia-vida (T1^ IF) foram calculados como meia-vida de variante de protease em relação à meia-vida da SEQ ID NO: 3.Tabela 13Tabela 14: Estabilidade em armazenamento acelerado de variants T^ IF: O fator de melhoria de meia-vida foi medido em relação a SEQ ID NO: 3
A Tabela 14 mostra que todas as variantes acima têm melhorado a estabilidade em comparação com SEQ ID NO: 3.
Claims (10)
1. Variante de subtilase de uma subtilase progenitora caracterizada por a variante ter atividade de protease e ter ao menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase de SEQ ID NO: 1, em que a subtilase variante consiste no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 com quatro ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em X9C, X9D, X9E, X9Q, X43A, X43C, X43L, X43R, X43W, X72A, X72V, X78D, X104F, X114V, X115T, X115W, X120I, X120T, X120V, X129D, X147W, X149C, X149N, X158E, X160D, X160P, X161C, X161E, X163A, X163D, X182C, X182E, X185C, X185E, X188C, X188D, X188E, X191N, X204D, X204V, X205I, X206C, X206E, X206I, X206K, X206L, X206T, X206V, X206W, X209W, X212A, X212D, X212G, X212N, X216I, X216T, X216V, X217C, X217M, X218T, X222C, X222R, X225A, X255C, X255E, X256A, X256C, X256D, X256V, X256Y, X259D, X260E, X260P, X261C, X261E, X261L, X261M, X261V, X261W, X261Y, X261F, X262C, X262E e X262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
2. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a variante compreender quatro ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43C, N43R, I72A, G115W, H120V, P129D, A158E, G160D, G160P, Q182E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206I, Q206V, Q206W, Q206L, Y209W, S212D, S212G, S212N, S216V, L217C, L217M, N218T, P225A, S256C, S256D, S259D, T260E, N261C, N261E, N261L, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.
3. Variante de subtilase, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a variante compreender três ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em S9E, N43R, H120V, Q182E, Q191N, N204D, V205I, Q206L, Y209W, S212G, S216V, S256D, S259D, N261E, N261W e L262E, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.
4. Variante de subtilase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender, adicionalmente, uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.
5. Composição detergente caracterizada por compreender uma variante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um ou mais componentes detergentes.
6. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender, adicionalmente, uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo que consiste em proteases, amilases, lipases, cutinases, celulases, endoglucanases, xiloglucanases, pectinases, pectina liases, xantanases, peroxidases, haloperoxigenases, catalases e mananases, ou qualquer mistura das mesmas.
7. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada por estar sob a forma de uma barra, um tablet homogêneo, um tablet tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado.
8. Uso de uma composição detergente em um processo de limpeza, como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras, como lavagem de louça, caracterizado por a composição detergente ser uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores 5 a 7.
9. Método para a produção de uma variante de subtilase que tem atividade de protease caracterizado por o método compreender: a. introduzir na subtilase de SEQ ID NO: 1 quatro ou mais alterações selecionadas do grupo que consiste em S9C, S9D, S9E, S9Q, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, I72A, I72V, S78D, V104F, A114V, G115T, G115W, H120I, H120T, H120V, P129D, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, S163A, S163D, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, N204D, N204V, V205I, Q206C, Q206E, Q206I, Q206K, Q206T, Q206V, Q206W, Q206L Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217M, N218T, M222C, M222R, P225A, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261L, N261M, N261V, N261Y, N261W, N261F, L262C, L262E e L262Q, em que cada posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2 e b. recuperar a variante; em que a variante tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com a subtilase de SEQ ID NO: 1.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por introduzir, adicionalmente, em uma subtilase progenitora uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, V68A, S99D, S99E, S101R, S101K, S101N, S101M, S101E, S101D, S101L, S101I, S103A, V104I, S128A, S128L, S128S, P129N, P129Q S130A, V199M, L217Y, L217D, L217E, L217Q, N218D, N218E, Q245K e Q245R, em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2.
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