ES2967424T3

ES2967424T3 - Variantes de proteasa de rendimiento mejorado y almacenamiento estable

Info

Publication number: ES2967424T3
Application number: ES18209177T
Authority: ES
Inventors: Christian Degering; Layla Fernandez; Sabine Griemert; Nina Mussmann; Inken Prueser; Daria Strauss; Susanne Wieland
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: PL3660146T3; US11746341B2; DK3660146T3; EP3660146B1; US20200172890A1; EP3660146A1

Abstract

La invención se refiere a proteasas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO:1 en toda su longitud y, basándose en la numeración según SEQ ID NO:1 (i) , al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 o 199, y (ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267, tiene al menos un aminoácido sustitución, así como su producción y uso. Estas proteasas muestran muy buena estabilidad con un buen rendimiento de limpieza. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de proteasa de rendimiento mejorado y almacenamiento estable

La invención pertenece al campo de la tecnología enzimática. La invención se refiere a proteasas cuya secuencia de aminoácidos ha sido modificada, en particular con vistas a su uso en detergentes y composiciones de limpieza, en particular con vistas a detergentes líquidos y composiciones de limpieza, con el fin de darles una mejor estabilidad de almacenamiento y/o mejorar su rendimiento de limpieza, y a los ácidos nucleicos que las codifican, así como a su preparación. La invención también se refiere a los usos de estas proteasas y a los procesos en los que se utilizan, así como a las composiciones que las contienen, en particular composiciones de lavado y limpieza, en particular composiciones líquidas de lavado y limpieza.

Las proteasas se encuentran entre las enzimas más importantes desde el punto de vista técnico. En el caso de los detergentes y productos de limpieza, son las enzimas más antiguas y están presentes en prácticamente todos los detergentes y productos de limpieza modernos de alto rendimiento. Provocan la degradación de la suciedad que contiene proteínas en los productos que se van a limpiar. Entre ellas, son especialmente importantes las proteasas del tipo subtilisina (subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4.21.62), que son proteasas de serina debido a los aminoácidos catalíticamente activos. Actúan como endopeptidasas inespecíficas e hidrolizan cualquier enlace amida ácido situado en el interior de péptidos o proteínas. Su pH óptimo suele estar en el rango claramente alcalino. En el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", editado por R. Bott y C. Betzel, Nueva York, 1996. Las subtilasas son producidas naturalmente por microorganismos. Entre ellas, cabe mencionar las subtilisinas formadas y secretadas por especies de Bacillus como el grupo más importante dentro de las subtilasas.

Ejemplos de las proteasas de tipo subtilisina utilizadas preferentemente en detergentes y productos de limpieza son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa alcalina de Bacillus lentus, en particular de Bacillus lentus DSM 5483, la subtilisina DY y las enzimas termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7, que pueden asignarse a las subtilasas pero ya no a las subtilisinas en sentido estricto, así como las variantes de las proteasas mencionadas que tienen una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con la proteasa de partida. Las proteasas se modifican de forma selectiva o aleatoria mediante métodos conocidos en el estado de la técnica y, por lo tanto, optimizados para su uso en detergentes y agentes de limpieza, por ejemplo. Entre ellos se incluyen la mutagénesis puntual, por deleción o inserción, o la fusión con otras proteínas o partes de proteínas. Así pues, se conocen variantes optimizadas correspondientes para la mayoría de las proteasas conocidas en el estado de la técnica.

Las solicitudes internacionales de patente WO95/23221A1, WO92/21760A1, WO 2018/069158 y WO2013/060621A1, así como en la solicitud de patente alemana DE102004027091 divulgan variantes de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483 adecuadas para su uso en detergentes o agentes de limpieza. Además, en la solicitud de patente internacional WO2011/032988A1 y en la solicitud de patente europea EP3044302A1 se divulgan composiciones detergentes o limpiadoras que contienen variantes de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483. Las variantes de proteasa divulgadas en estos escritos pueden, además de otras posiciones en las posiciones 3, 4, 99 y/o 199, estar modificadas en el orden de recuento de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483 y tener, por ejemplo, aminoácidos 3T, 4I, 99E o 1991 en dichas posiciones. Las combinaciones de otras alteraciones, como se describe a continuación, no son, sin embargo, evidentes a partir de estos escritos.

En general, sólo las proteasas seleccionadas son adecuadas para su uso en preparados que contengan tensioactivos líquidos. Muchas proteasas no muestran un rendimiento catalítico suficiente en dichos preparados. Por lo tanto, para la aplicación de proteasas en detergentes y productos de limpieza, es especialmente deseable una elevada actividad catalítica en las condiciones que se dan durante un ciclo de lavado y una elevada estabilidad de almacenamiento.

En consecuencia, las formulaciones líquidas del estado de la técnica que contienen proteasas y tensioactivos presentan el inconveniente de que las proteasas que contienen no muestran una actividad proteolítica satisfactoria en condiciones de lavado estándar (por ejemplo, en un intervalo de temperaturas de 20 °C a 40 °C) o no son suficientemente estables durante el almacenamiento, por lo que las formulaciones no presentan un rendimiento de limpieza óptimo en suelos sensibles a las proteasas.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que una proteasa del tipo proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483 o una proteasa suficientemente similar a la misma (en términos de identidad de secuencia), que, en términos de numeración según SEQ ID NO: 1 en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199, las sustituciones de aminoácidos 3T, 4I, 99E y 1991, y (ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 921, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267, al menos una sustitución de aminoácido, en particular al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 1371, 139R, 141S, 1451, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C y 267S en términos de su estabilidad de almacenamiento y/o su rendimiento de lavado y/o su estabilidad con respecto a la forma de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) o una variante de partida tal como se describe en el documento WO2013060621A1 y, por lo tanto, es particularmente adecuada para su uso en detergentes o agentes de limpieza.

El objeto de la invención es, por lo tanto, una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 1 en toda su longitud y, basándose en la numeración según SEQ ID NO: 1, tiene al menos las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I,<r>99E y V199I en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199, y (ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 921, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 tiene al menos una sustitución de aminoácidos.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la preparación de una proteasa como se ha definido anteriormente que comprende introducir las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99E y V199I en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 según la numeración según la SEQ ID NO:1, y (ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42 según la numeración según la SEQ ID NO: 1 correspondiente a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267, en una molécula de partida que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO:1 en toda su longitud.

Por lo tanto, una proteasa en el sentido de la presente solicitud de patente comprende tanto la proteasa como tal como una proteasa producida por un proceso según la invención. Por lo tanto, todas las explicaciones relativas a la proteasa se refieren tanto a la proteasa como tal como a las proteasas producidas mediante los procesos correspondientes.

Otros aspectos de la invención se refieren a los ácidos nucleicos que codifican estas proteasas, a proteasas según la invención o a células huésped no humanas que contienen ácidos nucleicos, y a agentes que comprenden proteasas según la invención, en particular agentes de lavado y limpieza, métodos de lavado y limpieza, y a usos de las proteasas según la invención en agentes de lavado o limpieza para eliminar la suciedad que contiene proteínas. Estos y otros aspectos, características y ventajas de la invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de un estudio de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones. A este respecto, cualquier característica de cualquier aspecto de la invención puede utilizarse en cualquier otro aspecto de la invención. Además, se entiende que los ejemplos aquí expuestos pretenden describir e ilustrar la invención pero no pretenden limitar la invención y, en particular, la invención no se limita a estos ejemplos.

Los intervalos numéricos dados en el formato "de x a y" incluyen dichos valores. Cuando se dan múltiples rangos numéricos preferidos en este formato, se entiende que también se incluyen todos los rangos resultantes de la combinación de los diversos valores finales.

"Al menos uno", tal como se utiliza en la presente, significa uno o más, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más.

"Líquido", tal como se utiliza en la presente, incluye líquidos y geles, así como composiciones pastosas. Se prefiere que las composiciones líquidas sean fluidas y vertibles a temperatura ambiente, pero también es posible que tengan un punto de fluidez.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones descritas en el presente documento dan como resultado una estabilidad de almacenamiento mejorada y/o un rendimiento de limpieza mejorado de esta proteasa modificada en detergentes y composiciones de limpieza.

En formas de realización preferidas, la proteasa según la invención tiene en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 las sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 3T, 4I, 99E y 199I, y ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 tiene al menos una sustitución de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C o267S, en el que la combinación de las sustituciones de aminoácidos del grupo (i) y la al menos una sustitución de aminoácidos del grupo (ii) conduce a un rendimiento de limpieza mejorado de esta proteasa modificada en detergentes y agentes de limpieza en al menos una suciedad sensible a la proteasa.

En formas de realización preferidas, la proteasa según la invención tiene en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 las sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 3T, 4I, 99E y 199I, y ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 tiene al menos una sustitución de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C o267S, donde la combinación de las sustituciones de aminoácidos del grupo (i) y la sustitución de al menos un aminoácido del grupo (ii) conduce a una estabilidad de almacenamiento mejorada de esta proteasa modificada en detergentes y agentes de limpieza.

En formas de realización preferidas, la proteasa según la invención tiene en (i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 las sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 3T, 4I, 99E y 199I, y ii) al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 tiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C o267S, en la que la combinación de las sustituciones de aminoácidos del grupo (i) y la sustitución de al menos un aminoácido del grupo (ii) conduce tanto a un rendimiento de limpieza mejorado como a una estabilidad de almacenamiento mejorada de esta proteasa modificada en detergentes y agentes de limpieza.

Determinadas formas de realización de las proteasas según la invención han mejorado la estabilidad de almacenamiento. Tienen una mayor estabilidad en detergentes o agentes de limpieza en comparación con la enzima de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) y, en particular, también en comparación con la variante de partida de la proteasa (S<e>Q ID NO:2 del documento WO2013/060621A1), en particular cuando se almacenan durante 3 o más días, 4 o más días, 7 o más días, 10 o más días, 12 o más días, 14 o más días, 21 o más días o 28 o más días.

Determinadas formas de realización de las proteasas de la invención pueden tener una mayor actividad catalítica en detergentes o agentes de limpieza independientemente de o además de la mayor estabilidad de almacenamiento. En una variedad de formas de realización, las proteasas según la invención pueden tener una actividad proteolítica que es de al menos 101 %, 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 % o 110 % en relación con el tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) y/o una variante de partida de la proteasa ya mejorada en su rendimiento (SEQ ID NO:2 de WO2013/060621A1). Tales proteasas de rendimiento mejorado proporcionan mejores resultados de lavado en suelos proteolíticamente sensibles en diversos rangos de temperatura, en particular un rango de temperatura de 20 °C a 40 °C.

Además, las formas de realización preferidas de proteasas según la invención tienen una estabilidad particular en detergentes o agentes de limpieza, por ejemplo a tensioactivos y/o agentes blanqueadores y/o quelantes, y/o a influencias de temperatura, en particular a altas temperaturas, por ejemplo entre 50 °C y 65 °C, en particular 60°C, y/o a condiciones ácidas o alcalinas y/o a cambios de pH y/o a agentes desnaturalizantes u oxidantes y/o a degradación proteolítica y/o a un cambio en las relaciones redox. En consecuencia, con formas de realización particularmente preferidas de la invención, se proporcionan variantes de proteasa de rendimiento mejorado y/o más estables a la temperatura. Con otras formas de realización particularmente preferidas de la invención, se proporcionan variantes de proteasa de rendimiento mejorado y más estables a la temperatura. Tales formas de realización ventajosas de proteasas según la invención permiten por consiguiente resultados de lavado mejorados en suelos sensibles a proteasas en una amplia gama de temperaturas.

En el contexto de la invención, por rendimiento de limpieza se entiende el rendimiento de blanqueamiento en una o más suciedades, en particular en la colada o la vajilla. En el contexto de la invención, tanto la composición de lavado o limpieza que comprende la proteasa o el licor de lavado o limpieza formado por esta composición como la propia proteasa tienen un poder de limpieza respectivo. El poder limpiador de la enzima contribuye así al poder limpiador del agente o del licor de lavado o limpieza formado por el agente. El poder de limpieza se determina preferentemente como se indica a continuación.

Por licor de lavado se entiende la solución de trabajo que contiene el agente de lavado o de limpieza que actúa sobre los textiles o tejidos o superficies duras y entra así en contacto con la suciedad presente en los textiles o tejidos o superficies duras. Normalmente, el licor de lavado se forma cuando comienza el proceso de lavado o limpieza y el agente de lavado o limpieza se diluye con agua, por ejemplo en un lavavajillas, una lavadora u otro recipiente adecuado.

Las proteasas según la invención presentan actividad enzimática, es decir, son capaces de hidrolizar péptidos y proteínas, en particular en una composición de lavado o limpieza. Una proteasa según la invención es, por lo tanto, una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces amida/péptido en sustratos proteínicos/péptidos y, por lo tanto, es capaz de escindir proteínas o péptidos. Además, una proteasa según la invención es preferentemente una proteasa madura, es decir, la molécula catalíticamente activa sin señal y/o propéptido(s). A menos que se indique lo contrario, las secuencias dadas también se refieren a las respectivas enzimas maduras (procesadas).

En varias formas de realización de la invención, la proteasa es una enzima libre. Esto significa que la proteasa puede actuar directamente con todos los componentes de un agente y, si el agente es líquido, que la proteasa está en contacto directo con el disolvente del agente (por ejemplo, agua). En otras formas de realización, un agente puede contener proteasas que forman un complejo de interacción con otras moléculas o que contienen una "envoltura". En este caso, una o más moléculas de proteasa pueden estar separadas de los demás componentes del agente por una estructura envolvente. Dicha estructura separadora puede estar formada por vesículas, como una micela o un liposoma, entre otras. Sin embargo, la estructura circundante también puede ser una partícula vírica, una célula bacteriana o una célula eucariota. En diversas formas de realización, una composición puede comprender células de Bacillus pumilus o Bacillus subtilus que expresen las proteasas de la invención, o sobrenadantes de cultivos celulares de dichas células.

En realizaciones particularmente preferidas de la invención, la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %. %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93 %, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99% y 99,5% es idéntico, y basado en el la numeración según SEQ ID NO:1 (i) tiene las sustituciones de aminoácidos 3T, 4I, 99E y 199I, y (ii) al menos una sustitución de aminoácido en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 253, 255, 259 o 267, en donde la al menos una sustitución de aminoácido consiste preferiblemente en 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E. , 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C y 267S se selecciona el grupo existente.

En el contexto de la presente invención, la característica de que una proteasa tiene al menos una de las sustituciones de aminoácidos indicadas significa que contiene una (de las indicadas) sustitución(es) de aminoácidos en la posición respectiva, es decir, al menos las posiciones indicadas no están mutadas o suprimidas de otro modo, por ejemplo por fragmentación de la proteasa.

La determinación de la identidad de las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se realiza por comparación de secuencias. Esta comparación de secuencias se basa en el algoritmo BLAST, establecido y comúnmente utilizado en el estado de la técnica (cf. por ejemplo Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410, y Altschul et al. (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) y se realiza básicamente emparejando secuencias similares de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos. La asignación tabular de las posiciones en cuestión se denomina alineamiento. Otro algoritmo disponible en la técnica anterior es el algoritmo FASTA. Las comparaciones de secuencias (alineaciones), especialmente las comparaciones de secuencias múltiples, se crean con programas informáticos. Los más utilizados son, por ejemplo, la serie Clustal (véase, por ejemplo, Chenna et al. (2003) "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs", Nucleic Acids Res.

31 :3497-3500), T-Coffee (véase, por ejemplo, Notredame et al. (2000) "T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments", J. Mol. Biol. 302:205-217) o programas basados en estos programas o algoritmos. Además, son posibles las comparaciones de secuencias (alineaciones) con el programa informático Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, EE.UU.) con los parámetros estándar dados, cuyo módulo AlignX para las comparaciones de secuencias se basa en ClustalW. A menos que se indique lo contrario, la identidad de secuencia aquí especificada se determina utilizando el algoritmo BLAST.

Dicha comparación también permite hacer una declaración sobre la similitud de las secuencias comparadas entre sí. Suele expresarse como un porcentaje de identidad, es decir, la proporción de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones o posiciones correspondientes entre sí en un alineamiento. En el caso de las secuencias de aminoácidos, el concepto más amplio de homología incluye los intercambios de aminoácidos conservados en la consideración, es decir, aminoácidos con actividad química similar, ya que éstos suelen ejercer actividades químicas similares dentro de la proteína. Por lo tanto, la similitud de las secuencias comparadas también puede indicarse como porcentaje de homología o porcentaje de similitud. Las declaraciones de identidad y/o homología pueden hacerse sobre polipéptidos o genes completos o sólo sobre regiones individuales. Por lo tanto, las regiones homólogas o idénticas de diferentes secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se definen por coincidencias en las secuencias. Estas regiones suelen tener funciones idénticas. Pueden ser pequeñas y comprender sólo unos pocos nucleótidos o aminoácidos. A menudo, estas pequeñas regiones desempeñan funciones esenciales para la actividad global de la proteína. Por lo tanto, puede ser útil relacionar las coincidencias de secuencia sólo con regiones individuales, posiblemente pequeñas. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, las declaraciones de identidad u homología en la presente solicitud se refieren a la longitud total de la secuencia de ácido nucleico o aminoácido indicada en cada caso.

En el contexto de la presente invención, la indicación de que una posición de aminoácido corresponde a una posición designada numéricamente en SEQ ID NO: 1 significa, por lo tanto, que la posición correspondiente corresponde a la posición designada numéricamente en SEQ ID NO: 1 en un alineamiento como el definido anteriormente.

En otra forma de realización de la invención, la proteasa se caracteriza porque su rendimiento de purificación (después del almacenamiento, por ejemplo, durante 3 semanas) no se reduce significativamente en comparación con la enzima de tipo salvaje (SEQ ID nO:1) o una variante de partida descrita en WO201360621A1, es decir, tiene al menos el 80% del rendimiento de lavado de referencia, preferiblemente al menos el 100%, más preferiblemente al menos el 110% o más. El rendimiento de limpieza puede determinarse en un sistema de lavado que contenga un detergente a una dosis comprendida entre 4,5 y 7,0 gramos por litro de licor de lavado y la proteasa, en el que las proteasas que vayan a compararse se utilicen a la misma concentración (basada en proteína activa) y el rendimiento de limpieza contra la suciedad en algodón se determine midiendo el grado de limpieza de los textiles lavados. Por ejemplo, el proceso de lavado puede tener lugar durante 60 minutos a una temperatura de 40°C y el agua puede tener una dureza de entre 15,5 y 16,5° (dureza alemana). La concentración de proteasa en el detergente destinado a este sistema de lavado es del 0,001 al 0,1% en peso, preferentemente del 0,01 al 0,06% en peso, sobre la base de proteína activa purificada.

Por ejemplo, un detergente líquido de referencia para dicho sistema de lavado puede estar compuesto como sigue (todas las cifras en % en peso): 4,4% de ácido alquilbenceno sulfónico, 5,6% de otros tensioactivos aniónicos, 2,4% de NaSales de ácidos grasos C12-C18 (jabones), 4,4% de tensioactivos no iónicos, 0,2% de fosfonatos, 1,4% de ácido cítrico, 0,95% de NaOH, 0,01% de antiespumante, 2% de glicerol, 0,08% de conservantes, 1% de etanol y el resto de agua desmineralizada. Preferentemente, la dosificación del detergente líquido está comprendida entre 4,5 y 6,0 gramos por litro de lejía de lavado, por ejemplo 4,7, 4,9 o 5,9 gramos por litro de lejía de lavado. Preferentemente, el lavado se realiza en un intervalo de pH comprendido entre pH 7 y pH 10,5, preferentemente entre pH 7,5 y pH 8,5.

En el contexto de la invención, la determinación del rendimiento de limpieza se lleva a cabo, por ejemplo, a 20 °C o 40 °C utilizando un detergente líquido como el indicado anteriormente, preferentemente lavando durante 60 minutos a 600 rpm.

El grado de blancura, es decir, el aclaramiento de la suciedad, como medida del rendimiento de limpieza se determina utilizando métodos de medición óptica, preferentemente fotométricos. Un dispositivo adecuado para este fin es, por ejemplo, el espectrómetro Minolta CM508d. Normalmente, los aparatos utilizados para la medición se calibran previamente con un patrón blanco, preferentemente un patrón blanco suministrado con el aparato.

Un detergente líquido lavavajillas a mano de referencia para un sistema de lavado de este tipo puede, por ejemplo, estar compuesto como sigue (todas las cifras en % en peso): 8-20% de ácido alquilbenceno sulfónico, 30-80% de agua desmineralizada, 5,4% de NaOH (50%), 7,14% de éter sulfato de alcohol graso, 2,0% de NaCl (20%), 0,383% de ácido fosfórico (H3PO4; 34%/85%), 0,1% de conservante, 0,25% de perfume, 1,0% de colorante, 0,04% de amargante.

El uso de la proteasa respectiva con la misma actividad garantiza que, incluso si la relación entre la sustancia activa y la proteína total (los valores de la actividad específica) difieren, se comparen las propiedades enzimáticas respectivas, por ejemplo, el rendimiento de limpieza en determinadas suciedades. En general, una actividad específica baja puede compensarse añadiendo una mayor cantidad de proteína.

Por lo demás, los métodos para determinar la actividad de la proteasa son conocidos por los expertos en el campo de la tecnología enzimática y los utilizan habitualmente. Por ejemplo, tales métodos se divulgan en Surfactants, vol.

7 (1970), pp. 125-132. Alternativamente, la actividad de la proteasa puede determinarse por la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) del sustrato suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida (AAPF). La proteasa escinde el sustrato y libera pNA. La liberación de pNA provoca un aumento de la absorbancia a 410 nm, cuyo curso temporal es una medida de la actividad enzimática (cf. Del Mar et al., 1979). La medición se realiza a una temperatura de 25 °C, a pH 8,6 y a una longitud de onda de 410 nm. El tiempo de medición es de 5 min y el intervalo de medición es de 20s a 60s. La actividad de la proteasa suele expresarse en unidades de proteasa (PE). Las actividades de proteasa adecuadas son, por ejemplo, 2,25, 5 o 10 PE por ml de licor de lavado. Sin embargo, la actividad de la proteasa no es cero.

Una prueba alternativa para determinar la actividad proteolítica de las proteasas según la invención es un método de medición óptica, preferentemente un método fotométrico. La prueba adecuada para este fin implica la escisión dependiente de la proteasa de la proteína sustrato caseína. La proteasa la escinde en un gran número de productos parciales más pequeños. La totalidad de estos productos parciales muestra un aumento de la absorción a 290 nm en comparación con la caseína no escindida, por lo que este aumento de la absorción puede determinarse utilizando un fotómetro y, de este modo, puede extraerse una conclusión sobre la actividad enzimática de la proteasa.

La concentración de proteínas puede determinarse mediante métodos conocidos, por ejemplo el método BCA (ácido bicinconínico; ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-dicarboxílico) o el método Biuret (Gornall et al., J. Biol. Chem. 177 (1948): 751-766). A este respecto, la concentración de proteína activa puede determinarse mediante la valoración de los sitios activos utilizando un inhibidor irreversible adecuado y la determinación de la actividad residual (cf. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966): 5890-5913).

Además de los cambios de aminoácidos explicados anteriormente, las proteasas según la invención pueden presentar otros cambios de aminoácidos, en particular sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Tales proteasas se desarrollan, por ejemplo, mediante modificación genética dirigida, es decir, mediante procesos de mutagénesis, y se optimizan para fines específicos o con respecto a propiedades específicas (por ejemplo, con respecto a su actividad catalítica, estabilidad, etc.). Además, los ácidos nucleicos según la invención pueden introducirse en enfoques de recombinación y utilizarse así para generar proteasas u otros polipéptidos completamente nuevos.

El objetivo es introducir mutaciones selectivas como sustituciones, inserciones o deleciones en las moléculas conocidas para mejorar, por ejemplo, el rendimiento de purificación de las enzimas según la invención. Para ello, pueden modificarse en particular las cargas superficiales y/o el punto isoeléctrico de las moléculas y, por lo tanto, sus interacciones con el sustrato. Por ejemplo, puede modificarse la carga neta de las enzimas para influir a través de ella en la unión al sustrato, en particular para su uso en detergentes y agentes de limpieza. Alternativa o adicionalmente, la estabilidad o la actividad catalítica de la proteasa puede aumentarse mediante una o más mutaciones correspondientes, mejorando así su rendimiento de limpieza. Las propiedades ventajosas de las mutaciones individuales, por ejemplo las sustituciones individuales, pueden complementarse entre sí. Una proteasa ya optimizada con respecto a ciertas propiedades, por ejemplo con respecto a su estabilidad durante el almacenamiento, puede por lo tanto desarrollarse adicionalmente dentro del alcance de la invención.

Para la descripción de sustituciones que implican exactamente una posición de aminoácido (sustituciones de aminoácidos), se utiliza aquí la siguiente convención: primero, se designa el aminoácido presente de forma natural en forma del código de una letra utilizado internacionalmente, seguido de la posición de secuencia asociada y, por último, el aminoácido insertado. Varios intercambios dentro de la misma cadena polipeptídica se separan mediante barras. En el caso de las inserciones, los aminoácidos adicionales se nombran después de la posición de la secuencia. En el caso de las supresiones, el aminoácido que falta se sustituye por un símbolo, por ejemplo un asterisco o un guión, o se indica a delante de la posición correspondiente. Por ejemplo, A95G describe la sustitución de alanina en la posición 95 por glicina, A95AG la inserción de glicina tras el aminoácido alanina en la posición 95, y A95* o A59 la deleción de alanina en la posición 95. Esta nomenclatura es conocida por los expertos en el arte de la tecnología enzimática.

Otro objeto de la invención es, por lo tanto, una proteasa caracterizada porque se puede obtener a partir de una proteasa como la descrita anteriormente como molécula de partida mediante una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en la que la proteasa tiene al menos una de las sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente en el recuento según SEQ ID NO: 1. El término "sustitución conservadora de aminoácidos" significa el intercambio (sustitución) de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido, en el que dicho intercambio no da lugar a un cambio de polaridad o carga en la posición del aminoácido intercambiado, por ejemplo, el intercambio de un residuo de aminoácido no polar por otro residuo de aminoácido no polar. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos en el contexto de la invención incluyen, por ejemplo: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T

Alternativa o adicionalmente, la proteasa se caracteriza porque se puede obtener a partir de una proteasa según la invención como molécula de partida por fragmentación, deleción, inserción o mutagénesis de sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la molécula de partida en una longitud de al menos 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 o 269 aminoácidos contiguos, en el que la proteasa comprende (i) sustituciones de aminoácidos en las posiciones según la reivindicación 1 correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199, y (ii) al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267.

Por ejemplo, es posible suprimir aminoácidos individuales en los extremos o en los bucles de la enzima sin pérdida o reducción de la actividad proteolítica. Además, esta mutagénesis de fragmentación, deleción, inserción o sustitución puede, por ejemplo, reducir también la alergenicidad de las enzimas en cuestión y mejorar así su utilidad general. Ventajosamente, las enzimas conservan su actividad proteolítica incluso después de la mutagénesis, es decir, su actividad proteolítica corresponde al menos a la de la enzima parental, es decir, en una forma de realización preferida la actividad proteolítica es al menos del 80 %, preferentemente al menos del 90 % de la actividad de la enzima parental. Otras sustituciones también pueden tener efectos beneficiosos. Tanto los aminoácidos contiguos únicos como los múltiples pueden intercambiarse por otros aminoácidos.

Las posiciones de los aminoácidos se definen aquí mediante un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de una proteasa según la invención con la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus lentus tal como se indica en SEQ ID NO: 1. Además, la asignación de las posiciones se basa en la proteína madura (madura). En particular, esta asignación también debe aplicarse si la secuencia de aminoácidos de una proteasa según la invención comprende un número mayor o menor de residuos de aminoácidos que la proteasa de Bacillus lentus según SEQ ID NO: 1. Basándose en las posiciones mencionadas en la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus lentus, las posiciones de modificación en una proteasa según la invención son las que se asignan a estas mismas posiciones en un alineamiento.

Las posiciones ventajosas para cambios de secuencia, en particular sustituciones, de la proteasa de Bacillus lentus, que son preferentemente de importancia cuando se transfieren a posiciones homólogas de las proteasas según la invención y confieren propiedades funcionales ventajosas a la proteasa, son por lo tanto las posiciones que corresponden en un alineamiento a las posiciones descritas en el presente documento, es decir, en el recuento según SEQ ID NO: 1. Los siguientes residuos de aminoácidos están situados en las posiciones mencionadas en la molécula de tipo salvaje de la proteasa de Bacillus lentus (SEQ ID NO: 1): S3, V4, S9, L21, N42, R44, R99, I105, A112, G113, A131, V137, S139, T141, V145, I159, A168, Q176, N177, S182, V193, N198, V199, P204, G205, S206, S210, N212, Q230, S234, S250, S253, N255, S259.

Una confirmación adicional de la asignación correcta de los aminoácidos que deben modificarse, es decir, en particular su correspondencia funcional, puede proporcionarse mediante experimentos comparativos en los que las dos posiciones asignadas entre sí sobre la base de un alineamiento se modifican de la misma manera en ambas proteasas comparadas entre sí y se observa si la actividad enzimática se modifica de la misma manera en ambas. Por ejemplo, si un intercambio de aminoácidos en una posición determinada de la proteasa de Bacillus lentus según SEQ ID NO: 1 va acompañado de un cambio en un parámetro enzimático, por ejemplo un aumento en el valor KM, y si se observa un cambio correspondiente en el parámetro enzimático, por ejemplo también un aumento en el valor KM, en una variante de proteasa según la invención cuyo intercambio de aminoácidos se logró mediante el mismo aminoácido introducido, esto debe considerarse como confirmación de la asignación correcta.

Todo lo anterior también es aplicable a los métodos de la invención para producir una proteasa. En consecuencia, un proceso según la invención comprende además uno o más de los siguientes pasos del proceso:

(a) introducir una sustitución de aminoácidos conservadora única o múltiple en la proteasa, en la que la proteasa tiene:

i) sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99E y V199I en posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199, y

(ii) al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267;

(b) alteración de la secuencia de aminoácidos mediante mutagénesis por fragmentación, deleción, inserción o sustitución, de manera que la proteasa comprenda una secuencia de aminoácidos que coincida con la molécula parental en una longitud de al menos 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 o 269 aminoácidos contiguos, en la que la proteasa presenta:

(ii) al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267.

Todas las formas de realización se aplican también a los métodos según la invención.

En otras formas de realización de la invención, la proteasa o la proteasa producida por un procedimiento según la invención es todavía al menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 90,5 %, 91 %, 91,5 %, 92 %, 92,5 %, 93 %, 93,5 %, 94 %, 94,5 %, 95 %, 95,5 %, 96 %, 96,5 %, 97 %, 97,5 %, 98 %, 98,5 %, 98,8 %, 99 % o 99,5 % idéntico al establecido en SEQ ID NO: 1 en su longitud total. La proteasa o proteasa producida por un método según la invención tiene (i) las sustituciones de aminoácidos 3T, 4I, 99E y 199i en las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199, y (ii) al menos una de las sustituciones de aminoácidos 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C o 267S en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267, en cada caso en relación con la numeración según SEQ ID NO: 1. Los ejemplos incluyen las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos: (i) S3T V4I R99E V199I A267S<n>255Y; (ii) S3T V4I R99E V199I N198D S234A L21F; (iii) S3T V4I R99E V199I N212D; (iv) S3T V4I R99E V199I G205D; (v) S3T V4I R99E V199I S182C; (vi) S3T V4I R99E V199I R44S S234A; (vii) S3T V4I R99E V199I S253C; (viii) S3T V4I R99E V199I I105V; (ix) S3T V4I R99E V199I N177D; (x) S3T V4I R99E V199I V193M; (xi) S3T V4I R99E V199I S9C; (xii) S3T V4I R99E V199I N198D; (xiii) S3T V4I R99E V199I S259C; (xiv) S3T V4! R99E V199I I159L Q230E; (xv) S3T V4I R99E V199I P204L; (xvi) S3T V4I R99E V199I L21F; (xvii) S3T V4! R99E V199I N42H; (xviii) S3T V4I R99E V199I S139R S250N; (xix) S3T V4I R99E V199I N42S; (xx) S3T V4I R99E V199I V137I; (xxi) S3T V4I R99E V199I V145I; (xxii) S3T V4I R99E V199I S206A; (xxiii) S3T V4I R99E V199I G113A L21W; (xxiv) S3T V4I R99E V199I A112V; (xxv) S3T V4I R99E V199I A168V; (xxvi) S3T V4I R99E V199I Q176E A131D; (xxvii) S3T V4I R99E V199I T141S S210C, en cada caso respecto de la numeración según la SEQ ID NO: 1, así como las variantes descritas en los ejemplos.

Otro objeto de la invención es una proteasa descrita anteriormente que se estabiliza adicionalmente, en particular mediante una o más mutaciones, por ejemplo sustituciones, o mediante acoplamiento a un polímero. Al aumentar la estabilidad durante el almacenamiento y/o durante el uso, por ejemplo durante el proceso de lavado, se consigue que la actividad enzimática dure más tiempo y, por lo tanto, se mejora el rendimiento de la limpieza. En principio, pueden considerarse todas las posibilidades de estabilización descritas y/o útiles en el estado de la técnica. Se prefieren las estabilizaciones que se consiguen mediante mutaciones de la propia enzima, ya que tales estabilizaciones no requieren ningún otro paso de trabajo tras la recuperación de la enzima. Más arriba se han dado ejemplos de modificaciones de secuencia adecuadas. Se conocen otras modificaciones de secuencia adecuadas en la técnica anterior.

Otras posibilidades de estabilización son, por ejemplo:

- Modificación de la unión de iones metálicos, en particular de los sitios de unión de calcio, por ejemplo intercambiando uno o más de los aminoácidos implicados en la unión de calcio por uno o más aminoácidos cargados negativamente y/o introduciendo modificaciones de secuencia en al menos una de las secuencias de los dos aminoácidos arginina/glicina;

- protección contra la influencia de agentes desnaturalizantes como los tensioactivos mediante mutaciones que provoquen un cambio en la secuencia de aminoácidos en la superficie de la proteína o sobre ella;

- Intercambio de aminoácidos próximos al N-terminal por aquellos que presumiblemente contactan con el resto de la molécula a través de interacciones no covalentes y contribuyen así al mantenimiento de la estructura globular.

Las formas de realización preferidas son aquellas en las que la enzima se estabiliza de múltiples maneras, ya que múltiples mutaciones estabilizadoras actúan de forma aditiva o sinérgica.

Otro objeto de la invención es una proteasa como la descrita anteriormente, caracterizada porque tiene al menos una modificación química. Una proteasa que tiene tal modificación se denomina derivado, es decir, la proteasa está derivatizada..

Por consiguiente, en el sentido de la presente solicitud, se entiende que los derivados son proteínas cuya cadena de aminoácidos pura ha sido modificada químicamente. Dicha derivatización puede tener lugar, por ejemplo, in vivo por la célula huésped que expresa la proteína. A este respecto, destacan los acoplamientos de compuestos de bajo peso molecular, como lípidos u oligosacáridos. Sin embargo, la derivatización también puede llevarse a cabo in vitro, por ejemplo mediante la conversión química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante la unión covalente de otro compuesto a la proteína. Por ejemplo, es posible el acoplamiento de aminas a grupos carboxilo de una enzima para cambiar el punto isoeléctrico. Dicho otro compuesto también puede ser otra proteína, por ejemplo, unida a una proteína de la invención mediante compuestos químicos bifuncionales. Asimismo, por derivatización debe entenderse la unión covalente a un soporte macromolecular, o también la inclusión no covalente en estructuras jaula macromoleculares adecuadas. La derivatización puede, por ejemplo, influir en la especificidad del sustrato o en la fuerza de unión al sustrato o provocar un bloqueo temporal de la actividad enzimática si la sustancia acoplada es un inhibidor. Esto puede ser útil, por ejemplo, para el período de almacenamiento. Tales modificaciones pueden influir aún más en la estabilidad o la actividad enzimática. También pueden servir para reducir la alergenicidad y/o inmunogenicidad de la proteína y aumentar así su tolerancia cutánea, por ejemplo. Por ejemplo, los acoplamientos con compuestos macromoleculares, por ejemplo polietilenglicol, pueden mejorar la proteína en términos de estabilidad y/o tolerancia cutánea.

Los derivados de una proteína según la invención también pueden entenderse en el sentido más amplio como preparaciones de estas proteínas. Dependiendo de la extracción, el procesamiento o la preparación, una proteína puede combinarse con otras sustancias diversas, por ejemplo del cultivo de los microorganismos productores. Una proteína también puede haberse mezclado específicamente con otras sustancias, por ejemplo para aumentar su estabilidad de almacenamiento. Por lo tanto, todas las preparaciones de una proteína según la invención son también según la invención. Esto también es independiente de si realmente desarrolla o no esta actividad enzimática en una preparación particular. Esto se debe a que puede desearse que no tenga actividad, o que ésta sea escasa, durante el almacenamiento y que sólo desarrolle su función enzimática en el momento de su utilización. Esto puede controlarse, por ejemplo, mediante sustancias acompañantes adecuadas. En particular, es posible a este respecto la preparación conjunta de proteasas con inhibidores específicos.

Entre todas las proteasas o variantes y/o derivados de proteasas descritos anteriormente, se prefieren particularmente en el contexto de la presente invención aquellas cuya estabilidad de almacenamiento y/o cuyo rendimiento de purificación se mejora en comparación con la variante de partida, determinándose el rendimiento de purificación en un sistema de lavado como el descrito anteriormente.

Otro objeto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteasa según la invención, así como un vector que contiene dicho ácido nucleico, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.

Puede tratarse de moléculas de ADN o de ARN. Pueden estar presentes como una única cadena, como una única cadena complementaria a esta única cadena, o como una doble cadena. En el caso de las moléculas de ADN en particular, deben tenerse en cuenta las secuencias de ambas cadenas complementarias en cada uno de los tres marcos de lectura posibles. Además, hay que tener en cuenta que diferentes codones, es decir, tripletes de bases, pueden codificar los mismos aminoácidos, de modo que una secuencia de aminoácidos concreta puede estar codificada por varios ácidos nucleicos diferentes. Debido a esta degeneración del código genético, todas las secuencias de ácido nucleico capaces de codificar cualquiera de las proteasas descritas anteriormente están incluidas en esta invención. El experto en la materia es capaz de determinar estas secuencias de ácidos nucleicos sin lugar a dudas, ya que a pesar de la degeneración del código genético, se pueden asignar aminoácidos definidos a codones individuales. Por lo tanto, partiendo de una secuencia de aminoácidos, el experto puede determinar fácilmente los ácidos nucleicos que codifican esta secuencia de aminoácidos. Además, en los ácidos nucleicos según la invención, uno o más codones pueden sustituirse por codones sinónimos. Este aspecto se refiere en particular a la expresión heteróloga de las enzimas según la invención. Así, cada organismo, por ejemplo una célula huésped de una cepa de producción, tiene un uso particular de codones. Por uso de codones se entiende la traducción del código genético en aminoácidos por el organismo respectivo. Pueden producirse cuellos de botella en la biosíntesis de proteínas si los codones situados en el ácido nucleico del organismo se enfrentan a un número comparativamente pequeño de moléculas de ARNt cargadas. Aunque codifiquen para el mismo aminoácido, esto hace que un codón se traduzca de forma menos eficiente en el organismo que un codón sinónimo que codifique para el mismo aminoácido. Debido a la presencia de un mayor número de moléculas de ARNt para el codón sinónimo, este último puede traducirse de forma más eficiente en el organismo.

Es posible para un experto en la materia producir los ácidos nucleicos correspondientes hasta genes completos utilizando secuencias conocidas de ADN y/o aminoácidos mediante métodos generalmente conocidos en la actualidad, como la síntesis química o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con métodos estándar de biología molecular y/o química de proteínas. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3a ed., Cold Spring Laboratory Press. Edición Cold Spring Laboratory Press.

A los efectos de la presente invención, se entiende por vectores los elementos consistentes en ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico según la invención como región de ácido nucleico característica. Son capaces de establecer esto como un elemento genético estable en una especie o una línea celular a lo largo de varias generaciones o divisiones celulares. Los vectores son plásmidos especiales, es decir, elementos genéticos circulares, especialmente cuando se utilizan en bacterias. En el contexto de la presente invención, un ácido nucleico según la invención se clona en un vector. Los vectores incluyen, por ejemplo, aquellos cuyo origen son plásmidos bacterianos, virus o bacteriófagos, o bien vectores predominantemente sintéticos o plásmidos con elementos de origen de lo más diverso. Con los demás elementos genéticos presentes en cada caso, los vectores son capaces de establecerse como unidades estables en las células huésped en cuestión a lo largo de varias generaciones. Pueden existir extracromosómicamente como unidades separadas o integrarse en un cromosoma o ADN cromosómico.

Los vectores de expresión comprenden secuencias de ácido nucleico que les permiten replicarse en las células huésped que los contienen, preferentemente microorganismos, en particular preferentemente bacterias, y llevar allí a la expresión un ácido nucleico contenido. La expresión está influenciada en particular por el promotor o los promotores que regulan la transcripción. En principio, la expresión puede ser efectuada por el promotor natural originalmente situado aguas arriba del ácido nucleico a expresar, pero también por un promotor de la célula huésped proporcionado en el vector de expresión o también por un promotor modificado o un promotor completamente diferente de otro organismo u otra célula huésped. En el presente caso, se proporciona al menos un promotor para la expresión de un ácido nucleico de la invención y se utiliza para su expresión. Los vectores de expresión pueden ser además regulables, por ejemplo cambiando las condiciones de cultivo o cuando se alcanza una determinada densidad celular de las células huésped que los contienen, o añadiendo determinadas sustancias, en particular activadores de la expresión génica. Un ejemplo de este tipo de sustancias es el derivado de la galactosa isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), que se utiliza como activador del operón lactosa bacteriano (operón lac). A diferencia de los vectores de expresión, el ácido nucleico contenido en los vectores de clonación no se expresa.

Otro objeto de la invención es una célula huésped no humana que comprende un ácido nucleico o vector según la invención, o que comprende una proteasa según la invención, en particular una que secreta la proteasa en el medio que rodea a la célula huésped. Preferentemente, un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención se transforma en un microorganismo, que constituye entonces una célula huésped según la invención. Alternativamente, los componentes individuales, es decir, partes de ácido nucleico o fragmentos de un ácido nucleico según la invención pueden introducirse en una célula huésped de tal manera que la célula huésped resultante contenga un ácido nucleico o vector según la invención. Este procedimiento es particularmente adecuado si la célula huésped ya contiene uno o más componentes de un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención y los componentes adicionales se complementan entonces en consecuencia. Los métodos para transformar células están establecidos en la técnica anterior y son suficientemente conocidos por el experto. En principio, todas las células, es decir, procariotas o eucariotas, son adecuadas como células huésped. Las células huésped preferidas son aquellas que pueden manipularse de forma genéticamente ventajosa, por ejemplo con respecto a la transformación con el ácido nucleico o el vector y su establecimiento estable, por ejemplo hongos unicelulares o bacterias. Además, las células huésped preferidas se caracterizan por una buena manejabilidad microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere, por ejemplo, a la facilidad de cultivo, altas tasas de crecimiento, bajos requisitos de medios de fermentación y buenas tasas de producción y secreción de proteínas extrañas. Las células huésped preferidas según la invención secretan la proteína expresada (transgénicamente) en el medio que rodea a las células huésped. Además, las proteasas pueden ser modificadas por las células que las producen después de su producción, por ejemplo mediante la unión de moléculas de azúcar, formilaciones, aminaciones, etc. Tales modificaciones postraduccionales pueden afectar funcionalmente a la proteasa.

Otras formas de realización preferidas representan células huésped cuya actividad puede regularse sobre la base de elementos reguladores genéticos, que se proporcionan en el vector, por ejemplo, pero que también pueden estar presentes en estas células desde el principio. Por ejemplo, mediante la adición controlada de compuestos químicos que sirven como activadores, cambiando las condiciones de cultivo o cuando se alcanza una determinada densidad celular, éstas pueden ser estimuladas para expresarse. Esto permite una producción económica de las proteínas de la invención. Un ejemplo de tal compuesto es el IPTG descrito anteriormente.

Las células huésped preferidas son las procariotas o bacterianas. Las bacterias se caracterizan por unos tiempos de generación cortos y unas condiciones de cultivo poco exigentes. Como resultado, se pueden establecer procedimientos de cultivo o procesos de fabricación rentables. Además, el experto tiene una gran experiencia con bacterias en la tecnología de la fermentación. Para una producción específica, las bacterias gram-negativas o grampositivas pueden ser adecuadas por una amplia variedad de razones a determinar experimentalmente en casos individuales, como las fuentes de nutrientes, la tasa de formación del producto, los requisitos de tiempo, etc.

En bacterias gramnegativas como Escherichia coli, un gran número de proteínas se secretan en el espacio periplásmico, es decir, el compartimento entre las dos membranas que encierran las células. Esto puede resultar ventajoso para aplicaciones especiales. Además, las bacterias Gram negativas también pueden diseñarse para secretar las proteínas expresadas no sólo en el espacio periplásmico, sino también en el medio que rodea a la bacteria. Por el contrario, las bacterias Gram-positivas como los Bacilos o los Actinomicetos u otros representantes de los Actinomycetales no tienen membrana externa, de modo que las proteínas secretadas se liberan inmediatamente en el medio que rodea a la bacteria, normalmente el medio de cultivo, a partir del cual se pueden purificar las proteínas expresadas. Pueden aislarse directamente del medio o procesarse posteriormente. Además, las bacterias Gram-positivas están relacionadas o son idénticas a la mayoría de los organismos de origen de enzimas técnicamente importantes y normalmente producen ellas mismas enzimas comparables, por lo que tienen un uso de codones similar y su aparato de síntesis de proteínas está naturalmente alineado en consecuencia.

Las células huésped según la invención pueden modificarse con respecto a sus requisitos para las condiciones de cultivo, pueden tener marcadores de selección diferentes o adicionales o pueden expresar proteínas aún diferentes o adicionales. En particular, también pueden ser células huésped que expresen transgénicamente varias proteínas o enzimas.

La presente invención es en principio aplicable a todos los microorganismos, en particular a todos los microorganismos fermentables, en particular preferentemente a los del género Bacillus, y conduce al hecho de que las proteínas según la invención pueden producirse utilizando tales microorganismos. Tales microorganismos constituyen entonces células huésped en el sentido de la invención.

En otra forma de realización de la invención, la célula hospedadora se caracteriza porque es una bacteria, preferentemente una seleccionada del grupo de los géneros Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas y Pseudomonas, preferentemente una seleccionada del grupo de Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Stenotrophomonas maltophilia.

Sin embargo, la célula huésped también puede ser una célula eucariota caracterizada por tener un núcleo. Por lo tanto, otro objeto de la invención es una célula huésped caracterizada por tener un núcleo. A diferencia de las células procariotas, las células eucariotas son capaces de modificar postraduccionalmente la proteína formada. Ejemplos de ello son hongos como los actinomicetos o levaduras como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede ser especialmente ventajoso, por ejemplo, si las proteínas van a sufrir modificaciones específicas en relación con su síntesis que hacen posibles tales sistemas. Las modificaciones a las que se someten los sistemas eucariotas en relación con la síntesis de proteínas incluyen, por ejemplo, la unión de compuestos de bajo peso molecular, como anclajes de membrana u oligosacáridos. Estas modificaciones de oligosacáridos pueden ser deseables, por ejemplo, para reducir la alergenicidad de una proteína expresada. La coexpresión con enzimas producidas naturalmente por dichas células, como las celulasas, también puede ser beneficiosa. Además, los sistemas de expresión de hongos termófilos, por ejemplo, pueden ser particularmente adecuados para la expresión de proteínas o variantes resistentes a la temperatura.

Las células huésped de la invención se cultivan y fermentan de manera habitual, por ejemplo en sistemas discontinuos o continuos. En el primer caso, se inocula un medio nutritivo adecuado con las células huésped y el producto se recoge del medio tras un período de tiempo que se determinará experimentalmente. Las fermentaciones continuas se caracterizan por el logro de un equilibrio estacionario en el que, durante un periodo de tiempo comparativamente largo, las células mueren parcialmente pero también vuelven a crecer y, al mismo tiempo, la proteína formada puede eliminarse del medio.

Las células huésped según la invención se utilizan preferentemente para producir proteasas según la invención. Otro objeto de la invención es, por lo tanto, un procedimiento para la producción de una proteasa que comprende a) cultivar una célula huésped según la invención, y

b) aislar la proteasa del medio de cultivo o de la célula huésped.

Este objeto de la invención comprende preferentemente procesos de fermentación. Los procesos de fermentación son conocidos per se en el estado de la técnica y representan el paso de producción a gran escala real, normalmente seguido de un método de purificación adecuado del producto producido, por ejemplo las proteasas según la invención. Todos los procesos de fermentación basados en un proceso correspondiente para la producción de una proteasa según la invención representan formas de realización de este objeto de la invención.

Los procesos de fermentación que se caracterizan porque la fermentación se lleva a cabo a través de una estrategia de alimentación son particularmente elegibles. Aquí se alimentan los componentes del medio consumidos por el cultivo continuo. De este modo, pueden conseguirse aumentos considerables tanto en la densidad celular como en la masa celular o masa seca y/o, en particular, en la actividad de la proteasa de interés. Además, la fermentación también puede diseñarse de manera que los productos metabólicos indeseables se filtren o neutralicen mediante la adición de tampones o contraiones adecuados en cada caso.

La proteasa producida puede recogerse del medio de fermentación. Este proceso de fermentación es preferible al aislamiento de la proteasa de la célula huésped, es decir, a la preparación del producto a partir de la masa celular (masa seca), pero requiere el suministro de células huésped adecuadas o de uno o más marcadores o mecanismos de secreción y/o sistemas de transporte adecuados para que las células huésped secreten la proteasa en el medio de fermentación. En ausencia de secreción, la proteasa puede aislarse alternativamente de la célula huésped, es decir, purificarse a partir de la masa celular, por ejemplo mediante precipitación con sulfato de amonio o etanol, o mediante purificación cromatográfica.

Todo lo anterior puede combinarse para formar métodos de producción de proteasa según la invención.

Otro objeto de la invención es una composición caracterizada porque comprende una proteasa según la invención descrita anteriormente. Preferentemente, el agente es un detergente o agente de limpieza.

Este objeto de la invención incluye todos los tipos concebibles de agentes de lavado o limpieza, tanto concentrados como agentes para ser utilizados sin diluir, para su uso a escala comercial, en una lavadora o para el lavado o limpieza a mano. Esto incluye, por ejemplo, detergentes para textiles, alfombras o fibras naturales, para los que se utiliza el término detergente. También incluye, por ejemplo, detergentes para lavavajillas o detergentes de lavado manual o limpiadores para superficies duras como metal, vidrio, porcelana, cerámica, azulejos, piedra, superficies pintadas, plásticos, madera o cuero, para los que se utiliza la denominación detergente de limpieza, es decir, además de detergentes de lavado manual y automático, por ejemplo, detergentes abrasivos, limpiacristales, agentes de aclarado con fragancia WC, etc. Los agentes de lavado y limpieza dentro del ámbito de la invención también incluyen auxiliares de lavado que se añaden al agente de lavado real durante el lavado manual o a máquina de textiles con el fin de lograr un efecto adicional. Además, los agentes de lavado y limpieza dentro del ámbito de la invención también incluyen agentes de pretratamiento y postratamiento textil, es decir, aquellos agentes con los que la prenda se pone en contacto antes del lavado propiamente dicho, por ejemplo para disolver la suciedad persistente, y también aquellos agentes que, en un paso posterior al lavado textil propiamente dicho, confieren otras propiedades deseables a la prenda, como un tacto agradable, resistencia a las arrugas o baja carga estática. Los suavizantes, entre otros, se incluyen en esta última categoría.

Las composiciones de lavado o limpieza según la invención, que pueden presentarse como sólidos en polvo, en forma de partículas postcompactadas, como geles, soluciones homogéneas o suspensiones, pueden contener, además de una proteasa según la invención, todos los ingredientes conocidos habituales en tales composiciones, preferentemente con al menos un ingrediente adicional presente en la composición. Los agentes según la invención pueden contener, en particular, tensioactivos, potenciadores, compuestos de peroxígeno o activadores de blanqueo. Además, pueden contener disolventes orgánicos miscibles en agua, otras enzimas, agentes secuestrantes, electrolitos, reguladores del pH y/o otros auxiliares como blanqueadores ópticos, inhibidores del agrisamiento, reguladores de la espuma, así como colorantes y fragancias y combinaciones de los mismos.

En particular, una combinación de una proteasa según la invención con uno o más ingrediente(s) adicional(es) de la composición es ventajosa, ya que tal composición en formas de realización preferidas según la invención tiene un rendimiento de limpieza mejorado debido a los sinergismos resultantes. En particular, tal sinergismo puede lograrse combinando una proteasa según la invención con un tensioactivo y/o un constructor (andamio) y/o un compuesto de peroxígeno y/o un activador de blanqueo. Sin embargo, en formas de realización preferidas, el agente según la invención puede no contener ácido bórico.

Los ingredientes ventajosos de las composiciones según la invención se divulgan en la solicitud de patente internacional WO2009/121725A1, que comienza en la página 5, penúltimo párrafo, y termina en la página 13 después del segundo párrafo.

Una composición según la invención contiene ventajosamente la proteasa en una cantidad de 2 mg a 20 mg, preferentemente de 5 mg a 17,5 mg, más preferentemente de 20 mg a 15 mg y más preferentemente de 50 mg a 10 mg por g de la composición. En diversas formas de realización, la concentración de la proteasa (enzima activa) descrita en el presente documento en la composición es >0 a 1 % en peso, preferentemente 0,001 a 0,1 % en peso basado en el peso total de la composición o la composición. Además, la proteasa contenida en la composición y/u otros ingredientes de la composición pueden estar recubiertos con una sustancia que es impermeable a la enzima a temperatura ambiente o en ausencia de agua y que se hace permeable a la enzima en condiciones de uso de la composición. Tal realización de la invención se caracteriza así porque la proteasa está recubierta con una sustancia impermeable a la proteasa a temperatura ambiente o en ausencia de agua. Además, la propia composición de lavado o limpieza también puede envasarse en un recipiente, preferentemente un recipiente permeable al aire, del que se libera poco antes de su uso o durante el proceso de lavado.

En otras formas de realización de la invención, la composición se caracteriza porque

(a) se presenta en forma sólida, en particular como polvo fluido con una densidad aparente de 300 g/l a 1200 g/l, en particular de 500 g/l a 900 g/l, o bien

(b) en forma pastosa o líquida, y/o

(c) en forma de gel o bolsita, y/o

(d) se presenta en forma de sistema monocomponente, o

(e) está dividido en varios componentes.

Estas formas de realización de la presente invención abarcan todas las formas de dosificación sólidas, en polvo, líquidas, en gel o en pasta de los agentes según la invención, que opcionalmente también pueden constar de varias fases y pueden estar en forma comprimida o no comprimida. El agente puede presentarse como un polvo que fluye libremente, en particular con una densidad aparente de 300 g/l a 1200 g/l, en particular de 500 g/l a 900 g/l o de 600 g/l a 850 g/l. Las formas de dosificación sólidas del agente incluyen además extruidos, gránulos, comprimidos o bolsas. Alternativamente, el agente puede estar en forma líquida, gel o pasta, por ejemplo en forma de detergente líquido no acuoso o pasta o en forma de detergente líquido acuoso o pasta. En general, se prefieren los agentes líquidos. Además, la composición puede presentarse en forma de sistema monocomponente. Tales agentes constan de una sola fase. Alternativamente, un agente también puede constar de varias fases. De este modo, dicho agente se divide en varios componentes.

Los agentes de lavado o limpieza según la invención pueden contener sólo una proteasa. Alternativamente, también pueden contener otras enzimas hidrolíticas u otras enzimas en una concentración apropiada para la eficacia de la composición. Así pues, otra forma de realización de la invención son agentes que comprenden además una o más enzimas adicionales. Como enzimas adicionales se aplican preferentemente todas las enzimas que pueden desarrollar una actividad catalítica en el agente según la invención, en particular una lipasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, -glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa u otra proteasa -distinguible de las proteasas según la invención- así como mezclas de las mismas. Ventajosamente, las enzimas adicionales están presentes en la composición en una cantidad de 1310-8 a 5% en peso, basada en la proteína activa, en cada caso. Cada vez más preferentemente, cada enzima adicional está presente en la composición según la invención en una cantidad de 1310-7 a 3 % en peso, de 0,00001 a 1 % en peso, de 0,00005 a 0,5 % en peso, de 0,0001 a 0,1 % en peso y particularmente preferentemente de 0,0001 a 0,05 % en peso, en cada caso basado en proteína activa. Es particularmente preferible que las enzimas presenten un rendimiento de limpieza sinérgico con respecto a determinadas suciedades o manchas, es decir, que las enzimas contenidas en la composición de agentes se apoyen mutuamente en su rendimiento de limpieza. Muy preferentemente, tal sinergismo está presente entre la proteasa contenida según la invención y otra enzima de un agente según la invención, incluyendo en particular entre dicha proteasa y una amilasa y/o una lipasa y/o una mananasa y/o una celulasa y/o una pectinasa. Pueden producirse efectos sinérgicos no sólo entre diferentes enzimas, sino también entre una o más enzimas y otros ingredientes de la composición según la invención.

En las composiciones de limpieza aquí descritas, las enzimas que se van a utilizar pueden formularse además junto con sustancias acompañantes, por ejemplo procedentes de la fermentación. En las formulaciones líquidas, las enzimas se utilizan preferentemente como formulación(es) líquida(s) enzimática(s).

Por lo general, las enzimas no se suministran en forma de proteína pura, sino en forma de preparados estabilizados que pueden almacenarse y transportarse. Estas preparaciones preformuladas incluyen, por ejemplo, las preparaciones sólidas obtenidas por granulación, extrusión o liofilización o, en particular en el caso de las preparaciones líquidas o en forma de gel, soluciones de las enzimas, ventajosamente lo más concentradas posible, con la menor cantidad de agua posible y/o con estabilizantes u otros auxiliares añadidos.

Como alternativa, las enzimas pueden encapsularse tanto para las formas farmacéuticas sólidas como para las líquidas, por ejemplo, mediante secado por pulverización o extrusión de la solución enzimática junto con un polímero preferentemente natural o en forma de cápsulas, por ejemplo, aquellas en las que las enzimas están encerradas como en un gel solidificado o en las de tipo núcleo-cápsula en las que un núcleo que contiene enzimas está recubierto con una capa protectora impermeable al agua, al aire y/o a los productos químicos. Los ingredientes activos adicionales, por ejemplo estabilizadores, emulsionantes, pigmentos, agentes blanqueadores o colorantes, pueden aplicarse en capas superpuestas. Tales cápsulas se aplican por métodos conocidos per se, por ejemplo mediante granulación por agitación o rodamiento o en procesos de lecho fluido. Ventajosamente, tales gránulos, por ejemplo mediante la aplicación de formadores de película poliméricos, son bajos en polvo y estables en almacenamiento debido al recubrimiento.

Además, es posible confeccionar dos o más enzimas juntas, de modo que un solo gránulo tenga múltiples actividades enzimáticas.

Las enzimas también pueden incorporarse a películas hidrosolubles, como las utilizadas en el envasado de detergentes y productos de limpieza en forma de dosis unitarias. Una película de este tipo permite que las enzimas se liberen al entrar en contacto con el agua. Tal como se utiliza en el presente documento, "soluble en agua" se refiere a una estructura de película que es preferentemente completamente soluble en agua. Preferentemente, dicha película comprende alcohol polivinílico (PVA) total o parcialmente hidrolizado.

Otro objeto de la invención es un proceso para limpiar textiles o superficies duras, caracterizado porque en al menos un paso del proceso se usa un agente según la invención, o porque en al menos un paso del proceso una proteasa según la invención se vuelve catalíticamente activa, en particular de tal manera que la proteasa se usa en una cantidad de 40|jg a 4g, preferentemente de 50|jg a 3g, más preferentemente de 100|jg a 2g y más preferentemente de 200jg a 1g o en las concentraciones descritas en el presente documento.

En diversas formas de realización, el proceso descrito anteriormente se caracteriza porque la proteasa se utiliza a una temperatura de 0 a 100 °C, preferentemente de 0 a 60 °C, más preferentemente de 20 a 40 °C, y más preferentemente a 25 °C.

Esto incluye tanto procesos manuales como a máquina, siendo preferibles los procesos a máquina. Los procedimientos para la limpieza de textiles se caracterizan generalmente por el hecho de que diversas sustancias limpiadoras activas se aplican al artículo a limpiar en varios pasos del proceso y se lavan después del tiempo de exposición, o que el artículo a limpiar se trata de otro modo con un detergente o una solución o dilución de este agente. Lo mismo se aplica a los procesos de limpieza de todos los materiales distintos de los textiles, en particular las superficies duras. Todos los procesos imaginables de lavado o limpieza pueden enriquecerse en al menos uno de los pasos del proceso mediante el uso de un agente de lavado o limpieza o proteasa según la invención y constituyen entonces formas de realización de la presente invención. Todos los hechos, objetos y formas de realización descritos para la proteasa según la invención y las composiciones que la contienen son también aplicables a este objeto de la invención. Por lo tanto, aquí se hace referencia explícita a la divulgación en el lugar apropiado con la indicación de que esta divulgación también se aplica a los métodos anteriores según la invención. Dado que las proteasas según la invención ya tienen naturalmente una actividad hidrolítica y también desarrollan esta actividad en medios que de otro modo no tienen poder de limpieza, como por ejemplo en un simple tampón, un único paso de dicho proceso puede consistir en poner en contacto una proteasa según la invención con la suciedad como único componente activo de limpieza, preferentemente en una solución tampón o en agua. Esto representa una forma de realización más de este objeto de la invención.

Las formas de realización alternativas de este tema de la invención también representan procesos para tratar materias primas textiles o para el cuidado textil, en los que una proteasa según la invención se vuelve activa en al menos un paso del proceso. Entre estos se prefieren los procesos para materias primas textiles, fibras o textiles con constituyentes naturales, y particularmente para aquellos con lana o seda.

Por último, la invención también abarca el uso de las proteasas descritas en el presente documento en detergentes o composiciones de limpieza, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, para la eliminación (mejorada) de suciedades que contienen proteínas, por ejemplo de textiles o superficies duras. En las formas de realización preferidas de este uso, la proteasa en la composición de lavado o limpieza se almacena durante 3 o más días, 4 o más días, 7 o más días, l0 o más días, 12 o más días, 14 o más días, 21 o más días o 28 o más días antes de una operación de lavado o limpieza.

Todos los hechos, objetos y formas de realización descritos para la proteasa según la invención y las composiciones que la contienen son también aplicables a este objeto de la invención. Por lo tanto, aquí se hace referencia explícita a la divulgación en el lugar apropiado con la indicación de que esta divulgación también se aplica al uso anterior según la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Visión general de las mutaciones

La invención se refiere a una proteasa alcalina de tipo subtilisina de Bacillus lentus. A partir de una variante de partida (proteasa según SEQ ID NO:2 del documento WO2013/060621A1), se produjeron variantes mediante mutagénesis aleatoria, que luego se examinaron para, entre otras cosas, mejorar el rendimiento de lavado y/o la estabilidad de la enzima. De este modo, se generaron mutantes con estabilidad de almacenamiento mejorada y/o rendimiento de purificación mejorado a partir de la proteasa 27 antes mencionada.

Matriz del detergente utilizado

Matriz de lavavajillas usada

Nombre químico____________________________| % en peso de sustancia activa en la formulación

Ejemplo 2: Determinación de la estabilidad de almacenamiento

Almacenamiento

Las variantes de proteasa según la invención se expresaron en Bacillus subtilis. Las proteasas se diluyeron al mismo nivel de actividad a partir de los sobrenadantes del cultivo de Bacillus subtilis. Para determinar la estabilidad de almacenamiento en detergente o detergente lavavajillas, se mezcló un 50% de matriz de detergente sin ácido bórico o un 50% de matriz de detergente lavavajillas con un 50% del cultivo de Bacillus subtilis diluido correspondientemente y se mezcló bien. Los recipientes sellados se almacenaron a 40°C durante tres y 3,5 semanas respectivamente. La cantidad de muestra recogida se disolvió en Tris/HCl 0,1M (pH 8,6) durante 20 min a temperatura ambiente agitando. A continuación, se realizó el ensayo AAPF como se describe a continuación.

Ensayo de actividad de la proteasa

La actividad de la proteasa se determina por la liberación del cromóforo para-nitroanilina a partir del sustrato succinil alanina-prolina-fenilalanina-para-nitroanilida (AAPFpNA; Bachem L-1400). La liberación de pNA provoca un aumento de la absorbancia a 410 nm, cuyo curso temporal es una medida de la actividad enzimática.

La medición se realizó a una temperatura de 25°C, pH 8,6 y una longitud de onda de 410nm. El tiempo de medición fue de 5 min con un intervalo de medición de 20 a 60 segundos.

Solución de medición:

10 |jL de solución de AAPF (70 mg/mL).

1000 j L Tris/HCl (0,1 M; pH 8,6 con 0,1 % Brij 35)

10 j L de solución de proteasa diluida

Cinética obtenida durante 5 min a 25°C (410nm)

A continuación se muestra la estabilidad mejorada en % en comparación con la estabilidad de la variante inicial tras 3 semanas de almacenamiento a 40°C en la matriz de detergente o detergente lavavajillas mencionada:

Todas las variantes muestran una estabilidad mejorada en detergente y/o detergente lavavajillas en comparación con la variante inicial.

Ejemplo 3: Determinación del rendimiento de limpieza

Prueba de minilavado

Prueba de lavado con sobrenadantes de cultivo deBacillus subtilis que contienen los mutantes de proteasa seleccionados mediante expresión heteróloga. Los sobrenadantes se utilizan con la misma actividad que la referencia = variante inicial con una concentración comercialmente disponible para proteasas en detergentes. A diferencia de la determinación de la estabilidad de almacenamiento, las muestras no se almacenan, sino que se determina directamente el rendimiento de limpieza. Los mutantes están todos relacionados con el rendimiento de lavado de la variante inicial, que se fija igual al 100% (suma de los 7 suelos, corregida por el rendimiento del detergente solo).

Condiciones: 40°C, 16° dH agua, 1h.

Suciedades:

1. CFT CS038

2. CFT PC-10

3. WfK 10N

4. CFT C-03

5. EMPA 112

6. CFT C-05

7. H-MR-B

Se colocaron tejidos perforados (diámetro = 10 mm) en placas de microtitulación, se pretempló el licor de lavado a 40°C, concentración final 3,17 g/L, se añadieron licor y enzima al frotis, se incubó durante 1h a 40°C y 600 rpm, después se aclaró el frotis varias veces con agua clara, se dejó secar y se determinó el brillo con un colorímetro. Cuanto más brillante es el tejido, mejor es el resultado de la limpieza. Aquí se mide el valor L = brillo, cuanto más alto, más brillante. La suma de los 7 niveles de suciedad en % se da en relación con la variante inicial corregida por el rendimiento del detergente sin proteasa.

Las variantes 10 y 13 muestran un mayor rendimiento de lavado en comparación con la variante de partida.

Por consiguiente, las proteasas según la invención, en particular las variantes 10 y 13, muestran no sólo una estabilidad de almacenamiento mejorada, sino también un rendimiento de purificación mejorado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 sobre la longitud total de la misma y que, basándose en la numeración según la SEQ ID NO: 1, presenta en

i) las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99E y V199I, y

2. Proteasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

la sustitución de al menos un aminoácido en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 se selecciona del grupo formado por 9C, 21F, 21W, 42S, 42H, 44S, 105V, 112V, 113A, 131D, 137I, 139R, 141S, 145I, 159L, 168V, 176E, 177D, 182C, 193M, 198D, 204L, 205D, 206A, 210C, 212D, 230E, 234A, 250N, 253C, 255Y, 259C y 267S.

3. Proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la proteasa presenta, basándose respectivamente en la numeración según la SEQ ID NO: 1:

(i) las sustituciones de aminoácidos S3T V4I R99E V199I; y

(ii) una de las siguientes combinaciones de sustitución de aminoácidos: (i) A267S N255Y; (ii) N198D S234A L21F; (iii) N212D; (iv) G205D; (v) S182C; (vi) R44S S234A; (vii) S253C; (viii) I105V;(ix) N177D; (x) V193M; (xi) S9C; (xii) N198D; (xiii) S259C; (xiv) I159L Q230E; (xv) P204L; (xvi) L21F; (xvii) N42H; (xviii) S139R S250N; (xix) N42S; (xx) V137I; (xxi) V145I; (xxii) S206A; (xxiii) G113A L21W; (xxiv) A112V; (xxv) A168V; (xxvi) Q176E A131D; (xxvii) T141S S210C.

4. Proteasa caracterizada porque

(a) se puede obtener a partir de una proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como molécula de partida mediante una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde dicha proteasa presenta:

(ii) al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267; o

(b) se puede obtener a partir de una proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como molécula de partida mediante fragmentación, deleción, inserción o mutagénesis de sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que coincide con la molécula de partida en una longitud de al menos 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 o 269 aminoácidos contiguos, en donde la proteasa presenta

5. Procedimiento para la preparación de una proteasa que comprende introducir

i) las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99E y V199I en las posiciones correspondientes a las posiciones 3, 4, 99 y 199 con respecto a la numeración según la SEQ ID NO: 1, y

ii) al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 9, 21, 42, 44, 105, 112, 113, 131, 137, 139, 141, 145, 159, 168, 176, 177, 182, 193, 198, 204, 205, 206, 210, 212, 230, 234, 250, 253, 255, 259 o 267 en relación con la numeración según SEQ ID NO:1,

en una molécula de partida que presente una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:1 en toda su longitud.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además uno o más de los siguientes pasos del procedimiento:

(a) introducción de una única o múltiples sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde la proteasa presenta:

7. Ácido nucleico que codifica una proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o que codifica una proteasa obtenida según un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 6.

8. Vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.

9. Célula huésped no humana que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8, o que comprende una proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o que comprende una proteasa obtenida por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en particular una que secreta la proteasa en el medio que rodea a la célula huésped.

10. Procedimiento para la preparación de una proteasa que comprende

a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9; y

b) aislar la proteasa del medio de cultivo o de la célula huésped.

11. Agente, en particular un agente de lavado o de limpieza, en particular un agente de lavado líquido o un agente lavavajillas a mano, caracterizado porque contiene al menos una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteasa obtenida de acuerdo con un procedimiento de las reivindicaciones 5 a 6.

12. Procedimiento para la limpieza de textiles o superficies duras, caracterizado porque un agente de acuerdo con la reivindicación 11 se utiliza en al menos una etapa del proceso.

13. Uso de una proteasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteasa obtenida según un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 6 en una composición de lavado o limpieza para eliminar las suciedades que contienen péptidos o proteínas.