ES2829288T3 - Proteasas con estabilidad enzimática mejorada en detergentes - Google Patents
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Abstract
Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos, que sobre la totalidad de su longitud exhibe identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2 y que exhibe una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 o Q271, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2, en la que la por lo menos una sustitución de aminoácidos es elegida de entre el grupo consistente en P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteasas con estabilidad enzimática mejorada en detergentes
La invención está en el ámbito de la tecnología de enzimas. La invención se refiere a proteasas de Bacillus pumilus cuya secuencia de aminoácidos fue modificada, en particular respecto al uso en agentes de lavado y detergentes, para impartirles una mejor estabilidad al almacenamiento, y los ácidos nucleicos se codifican para ellas, así como su fabricación. La invención se refiere además a las aplicaciones de estas proteasas y procedimientos en los cuales son usadas, así como los agentes que contienen proteasas, en particular agentes de lavado y detergentes.
Las proteasas pertenecen principalmente a las enzimas más importantes técnicamente. Para detergentes y agentes de limpieza son las enzimas establecidas por más largo tiempo y presentes en prácticamente todos los detergentes y agentes de limpieza modernos y efectivos. Causan la degradación de suciedades que tienen proteína en el elemento para limpieza. Entre ellas a su vez son particularmente importantes las proteasas del tipo de la subtilisina (subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4.21.62), que debido a los aminoácidos con eficacia catalítica son serinaproteasas. Actúan como endopeptidasas no específicas e hidrolizan cualquier enlace de amida grasa que está en el interior de péptidos o proteínas. Su pH óptimo está usualmente en el intervalo claramente alcalino. Por ejemplo el artículo "Subtilases: Subtilisin-like proteases" de R. Siezen, páginas 75-95 en "Subtilisin enzymes", editado por R. Bott y C. Betzel, Nueva York, 1996 ofrece un vistazo sobre esta familia. Las subtilasas se forman de manera natural de microorganismos. Entre ellos se mencionan en particular las formadas de especies de Bacillus y subtilisinas secretadas, como el grupo más importante dentro de las subtilasas.
Ejemplos de las proteasas del tipo de la subtilisina usadas preferiblemente en detergentes y agentes de limpieza son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa de Bacillus lentus, en particular de Bacillus lentus DSM 5483, subtilisina DY y las enzimas termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7 que van a ser asignadas en sentido estricto a las subtilasas, aunque ya no a las subtilisinas, así como variantes de las proteasas mencionadas, que exhiben una secuencia de aminoácidos modificada respecto a la proteasa de partida. Las proteasas son modificadas de manera focalizada o fortuita mediante procedimientos conocidos a partir del estado de la técnica y así optimizadas por ejemplo para el uso en detergentes y agentes de limpieza. A ellos pertenecen la mutagénesis puntual, mutagénesis de eliminación o de inserción, o de fusión con otras
Descripción (copia limpia)
proteínas o partes de proteínas. De este modo, para la mayoría de las proteasas conocidas a partir del estado de la técnica, se conocen de modo correspondiente variantes optimizadas. Por ejemplo, a partir de los documentos WO9530010, US5741664A, WO2011014278, WO2011036263, WO2011036264,WO2014207228, WO2011072177,US2003191038A1 se conoce una serie de variantes de BPN' y savinasa. otras subtilisinas son conocidas a partir por ejemplo, de los documentos WO9628566, WO2015089441 y WO9628557. Los documentos WO2010060822 y DE102006022224 divulgan una proteasa alcalina de Bacillus pumilus.
En el documento europeo de patente EP 2 016 175 A1 se divulga por ejemplo una proteasa de Bacillus pumilus prevista para agentes de lavado y detergentes. En general, para el uso en preparaciones líquidas que tienen tensioactivo sólo son adecuadas de cualquier manera proteasas elegidas. Muchas proteasas no muestran en tales preparaciones un desempeño catalítico o estabilidad suficientes. En particular para el uso en detergentes, que son obtenidos normalmente por el usuario en una cantidad, de modo que hasta el último consumo del detergente pueden transcurrir varias semanas o meses (es decir el detergente tiene que ser almacenado por el usuario por semanas o meses), muchas proteasas muestran una inestabilidad que, a su vez, conduce a una insuficiente actividad catalítica durante el proceso de lavado. En preparaciones líquidas de tensioactivo que contienen fosfonato este problema es aún más sensible, por ejemplo debido a las propiedades de formación de complejo de los fosfonatos o a interacciones no ventajosas entre el fosfonato y la proteasa.
En consecuencia, las formulaciones líquidas del estado de la técnica, que contienen proteasa y tensioactivo, tienen como desventaja que frecuentemente después del almacenamiento, la formulación no exhibe una actividad proteolítica satisfactoria y por ello no muestra un poder de limpieza óptimo sobre suciedades sensibles a la proteasa.
De modo sorprendente se ha establecido que una proteasa de Bacillus pumilus o una proteasa suficientemente similar a ella (en referencia a la identidad de secuencia), que exhibe una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 o Q271, referidas en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2, está mejorada respecto a la estabilidad (al almacenamiento), comparada con la forma de tipo silvestre, y por ello es particularmente adecuada para el uso en agentes de lavado o detergentes.
Por ello, en un primer aspecto, es objetivo de la invención una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos, que sobre la totalidad de su longitud exhibe una identidad de secuencia de por lo menos 90% frente a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, y exhibe una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 o Q271, referida en cada caso a la
numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2, en la que la por lo menos una sustitución de aminoácidos es elegida de entre el grupo consistente en P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2.
Otro objetivo de la invención es un procedimiento para la preparación de una proteasa, que comprende la sustitución de un aminoácido en por lo menos una posición, que corresponde a la posición 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 o 271 en SEQ ID NO:2, en una proteasa de partida, que sobre la totalidad de su longitud exhibe una identidad de secuencia de por lo menos 90% frente a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, de modo que la proteasa exhibe por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E.
En el sentido de la presente memoria, una proteasa comprende por ello tanto la proteasa como tal, como también una proteasa preparada con un procedimiento de acuerdo con la invención. Por ello, todas las realizaciones para la proteasa se refieren tanto a la proteasa como tal, como también a las proteasas preparadas por medio del procedimiento correspondiente.
Otro aspecto de la invención se refiere a los ácidos nucleicos que codifican para estas proteasas, células anfitrión no humanas que contienen proteasas o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, así como agentes que comprenden proteasas de acuerdo con la invención, en particular agentes de lavado y detergentes, procedimientos de limpieza y lavado, y aplicaciones de las proteasas en agentes de lavado o detergentes de acuerdo con la invención, para la eliminación de suciedades que tienen grasa.
"Por lo menos un", como se usa en esta memoria, significa uno o varios, es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más.
La presente invención se basa en la conclusión sorprendente según la cual una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 o 271 de la proteasa de Bacillus pumilus de acuerdo con SEQ ID NO:2, que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en por lo menos 90 % a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, de modo que en por lo menos de las posiciones correspondientes están presentes los aminoácidos 9T/S/H, 62E, 101E, 130D, 166S, 187H, 216C, 238K o 271E, causa una estabilidad (al almacenamiento) mejorada de estas proteasas modificadas en agentes de lavado y detergentes. Esto es sorprendente en particular en la medida que ninguna de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente fue asociada con una estabilidad elevada de la proteasa.
Las proteasas de acuerdo con la invención disponen de una elevada estabilidad en agentes de lavado o detergentes, en particular para un almacenamiento de 3 o más días, 4 o más días, 7 o más días, 10 o más días, 12 o más días o 14 o más días. Tales proteasas con poder mejorado hacen posible resultados mejorados de lavado en suciedades sensibles a la proteólisis en un amplio intervalo de temperatura.
Las proteasas de acuerdo con la invención exhiben actividad enzimática, es decir, son capaces de hidrolizar péptidos y proteínas, en particular en un agente de lavado o detergente. Una proteasa de acuerdo con la invención es por ello una enzima, que cataliza la hidrólisis de enlaces amido/péptido en sustratos de proteína/péptido y por ello están en capacidad de escindir proteínas o péptidos. Además, una proteasa de acuerdo con la invención es preferiblemente una proteasa madura (mature), es decir es una molécula catalíticamente activa sin péptido(s) de señal y/o propéptido(s). En tanto no se indique de otro modo, la secuencia indicada se refiere también a enzimas maduras (procesadas) en cada caso.
En diferentes formas de realización, la proteasa de acuerdo con la invención contiene por lo menos una sustitución de aminoácidos que es elegida de entre el grupo consistente en P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K y Q271E, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2. En formas más preferidas de realización, la proteasa de acuerdo con la invención contiene una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos: (i) P9T; (ii) Q271E; (iii) P9S y N238K; (iv) P9H; (v) N187H; (vi) S216C; (vii) Q62E y N130D; (viii) Q62E, D101E, N130D, G166S y Q271E; o (ix) P9T, N187H, S216C y Q271E, en las que la numeración está referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2.
En otra forma de realización de la invención, la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que sobre la totalidad de su longitud es idéntica en por lo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% y 98,8%, a la secuencia indicada en SEQ ID NO:2, y que en por lo menos una de las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 o 271 en la numeración de acuerdo con SeQ ID NO:2, exhibe una o varias sustituciones de aminoácidos 9T/S/H, 62E, 101E, 130D, 166S, 187H, 216C, 238K o 271E. En relación con la presente invención, el rasgo según el cual una proteasa exhibe las sustituciones indicadas, significa que contiene por lo menos uno de los aminoácidos correspondientes en las posiciones correspondientes, es decir no todas las 9 posiciones mutan de otra forma o, por ejemplo, son eliminadas por fragmentación de la proteasa. Las secuencias de aminoácidos de tales proteasas, que son preferidas de acuerdo con la invención, están indicadas en SEQ ID Nos: 3-11.
La determinación de la identidad de las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos ocurre mediante una comparación de secuencias. Esta comparación de secuencias se basa en el algoritmo BLAST establecido y comúnmente usado en el estado de la técnica (véase por ejemplo Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, y Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp .3389 3402) y ocurre principalmente mediante asignación mutua de sucesiones similares de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos. Una asignación tabular de las posiciones en cuestión es denominada una alineación. Otro algoritmo disponible en el estado de la técnica es el algoritmo FASTA. Las comparaciones de secuencia (alineaciones), en particular comparaciones de secuencia múltiple, son preparadas con programas de ordenador. Frecuentemente se usan por ejemplo la serie Clustal (véase por ejemplo Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (véase por ejemplo Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) o programas que se basan en estos programas o algoritmos. Además, son posibles comparaciones de secuencia (alineaciones) con el programa de ordenador Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, EEUU) con los parámetros estándar preestablecidos, cuyo módulo AlignX para la comparación de secuencias se basa en ClustalW. en tanto no se indique de otro modo, la identidad de secuencia indicada en esta memoria, es determinada con el algoritmo BLAST.
Tal comparación permite también una declaración sobre la similitud de las secuencias comparadas mutuamente. Ella es indicada usualmente en porcentaje de identidad, es decir la fracción de los nucleótidos o radicales aminoácido idénticos en las mismas posiciones o posiciones correspondientes mutuamente en una alineación. El concepto más incluyente de la homología comprende en la consideración, para secuencias de aminoácidos, intercambios de aminoácidos conservados, por consiguiente aminoácidos con actividad química similar, puesto que dentro de la proteína usualmente estos ejercen actividades químicas similares. Por ello, la similitud de las secuencias comparadas puede ser indicada también como Homología Porcentual o Similitud Porcentual. Los datos de identidad y/u homología pueden cubrir la totalidad del polipéptido o gen o sólo intervalos individuales. Por ello los intervalos homólogos o idénticos de diferentes secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos son definidos mediante coincidencias en las secuencias. Tales intervalos exhiben frecuentemente funciones idénticas. Pueden ser pequeños y comprender sólo pocos nucleótidos o aminoácidos. Frecuentemente tales intervalos pequeños ejercen funciones esenciales para la totalidad de la actividad de la proteína. Por ello, puede ser sensato obtener coincidencias de secuencias sólo sobre intervalos individuales, dado el caso pequeños. En tanto no se indique de otro modo, en el presente documento los datos de identidad u homología se refieren sin embargo a la totalidad de la longitud de la secuencia de ácido nucleico o aminoácido indicada en cada caso.
En relación con la presente invención, la información significa que una posición de aminoácido corresponde por ello a una posición denominada numéricamente en SEQ ID NO:2, que la posición correspondiente a la posición denominada numéricamente en SEQ ID NO:2 es asignada en una alineación como se definió anteriormente.
En otra forma de realización de la invención, la proteasa se caracteriza porque no disminuye significativamente su poder de limpieza frente al de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos, la cual corresponde a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, es decir posee por lo menos 80 % del poder de lavado de referencia, preferiblemente por lo menos 100 %, aún más preferiblemente por lo menos 110%. El poder de limpieza puede ser determinado en un sistema de lavado que contiene un detergente en una dosificación entre 4,5 y 7,0 gramos por litro de licor de lavado así como la proteasa, en el que las proteasas que van a ser comparadas son usadas en la misma concentración (referido a la proteína activa) y el poder de limpieza es determinado frente a una suciedad sobre algodón, mediante medición del grado de limpieza de los textiles lavados. Por ejemplo el procedimiento de lavado puede ocurrir por 70 minutos a una temperatura de 40°C y el agua puede exhibir una dureza entre 15,5 y 16,5° (dureza alemana). La concentración de la proteasa en el detergente determinado para este sistema de lavado, es 0,001-0,1 % en peso, preferiblemente 0,01 a 0,06 % en peso, referido a la proteína purificada activa.
Un detergente líquido de referencia para un sistema de lavado así puede estar compuesto como sigue (todos los datos en porcentaje en peso): 4,4% de ácido alquilbenceno sulfónico, 5,6% de otros tensioactivos, 2,4% de sales de ácidos grasos C12-C18 (jabones), 4,4% de tensioactivos no iónicos, 0,2% de fosfonatos, 1,4% de ácido cítrico, 0,95% de NaOH, 0,01% de antiespumante, 2% de glicerina, 0,08% de agente conservante, 1% de etanol, el resto es agua desmineralizada. Preferiblemente, la dosificación del detergente líquido está entre 4,5 y 6,0 gramos por litro de licor de lavado, por ejemplo 4,7, 4,9 o 5,9 gramos por litro de licor de lavado. Preferiblemente se lava en un intervalo de valor de pH entre pH 8 y pH 10,5, preferiblemente entre pH 8 y pH 9.
En el marco de la invención, la determinación del poder de limpieza ocurre por ejemplo a 40°C usando un detergente líquido como se indicó anteriormente, en lo cual el procedimiento de lavado ocurre preferiblemente por 60 minutos a 600 rpm.
El grado de blancura es decir el aclaramiento de las suciedades, como medida del desempeño de limpieza es determinado con procedimientos ópticos de medición, preferiblemente de modo fotométrico. Un aparato adecuado
para ello es por ejemplo el espectrómetro Minolta CM508d. Usualmente los aparatos usados para la medición son calibrados previamente con un estándar blanco, preferiblemente un estándar blanco incluido.
Mediante el uso de la misma actividad de la respectiva proteasa se asegura que, también para una eventual divergencia de la relación de sustancia activa a proteína total (los valores de actividad específica), se comparan las respectivas propiedades enzimáticas, por consiguiente por ejemplo el poder de limpieza sobre determinadas suciedades. En general, es válido que puede compensarse una baja actividad específica, mediante adición de una mayor cantidad de proteína.
Aparte de ello, los procedimientos para la determinación de la actividad de proteasa son familiares para el experto en el campo de la tecnología de las enzimas, y él los aplica de manera rutinaria. Por ejemplo tales procedimientos son divulgados en Tenside, volumen 7 (1970), pp. 125-132. De modo alternativo puede determinarse la actividad de proteasa mediante la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) a partir del sustrato suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida (AAPF). La proteasa escinde el sustrato y libera pNA. La liberación del pNA causa un aumento de la extinción a 410 nm, cuyo curso a lo largo del tiempo es una medida de la actividad enzimática (véase del Mar et al., 1979). La medición ocurre a una temperatura de 25°C, a pH 8,6, y una longitud de onda de 410 nm. El tiempo de medición es de 5 min y el intervalo de medición es de 20s a 60s. La actividad de proteasa es indicada usualmente en unidades de proteasa (PE). Las actividades adecuadas de proteasa son por ejemplo 2,25, 5 o 10 PE por ml de licor de lavado. Sin embargo, la actividad de proteasa no es igual a cero.
Una prueba alternativa para el establecimiento de la actividad proteolítica de las proteasas de acuerdo con la invención, es un procedimiento óptico de medición, preferiblemente un procedimiento fotométrico. La prueba adecuada para ello comprende la escisión dependiente de la proteasa de la proteína sustrato caseína. Esta es escindida por la proteasa en una multiplicidad de productos parciales más pequeños. La totalidad de estos productos parciales exhibe una absorción elevada a 290 nm frente a la caseína no escindida, en lo cual esta absorción elevada es determinada mediante uso de un fotómetro, y con ello puede trazarse una inferencia a la actividad enzimática de la proteasa.
La concentración de proteína puede ser determinada con ayuda de procedimientos conocidos, por ejemplo el procedimiento BCA (ácido bicincónico; ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-dicarboxílico) o el procedimiento de biuret (A. G. Gornall, C. S. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). La determinación de la concentración de proteína activa puede ocurrir a este respecto mediante una titulación de los centros activos, usando un inhibidor irreversible adecuado y determinación de la actividad residual (véase M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913).
Adicionalmente a las modificaciones de aminoácidos ilustradas previamente, las proteasas de acuerdo con la invención pueden exhibir otras modificaciones de aminoácidos, en particular sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos. Tales proteasas son optimizadas por ejemplo mediante modificación genética focalizada, es decir mediante procedimientos de mutagénesis y optimizadas para determinados propósitos de uso o respecto a propiedades especiales (por ejemplo respecto a su actividad catalítica, estabilidad, etc.). Además, pueden incorporarse ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en suplementos de recombinación y con ello pueden usarse para la generación de proteasas u otros polipéptidos de tipo completamente novedoso.
El objetivo es introducir en las moléculas conocidas, mutaciones focalizadas como sustituciones, inserciones o eliminaciones, para mejorar por ejemplo el poder de limpieza de enzimas de acuerdo con la invención. Para ello pueden modificarse en particular las cargas superficiales y/o el punto isoeléctrico de la molécula y mediante ello sus interacciones con el sustrato. De este modo puede modificarse por ejemplo la carga neta de la enzima, para influir mediante ello en la unión al sustrato, en particular para el uso en detergentes y agentes de limpieza. De modo alternativo o como complemento, puede elevarse adicionalmente la estabilidad de la proteasa mediante una o varias mutaciones correspondientes y mediante ello mejorar su poder de limpieza. Las propiedades ventajosas de mutaciones individuales, por ejemplo sustituciones individuales, pueden ser complementadas. Una proteasa ya optimizada respecto a determinadas propiedades, por ejemplo respecto a su estabilidad al almacenamiento, puede ser por ello mejorada adicionalmente en el marco de la invención.
Para la descripción de sustituciones, que conciernen exactamente a una posición de aminoácido (intercambio de aminoácidos), se aplica la siguiente convención: primero se denomina el aminoácido presente de forma natural en forma del código internacional convencional de una letra, entonces sigue la posición de secuencia relacionada y finalmente el aminoácido introducido. Cuando una posición puede ser reemplazada por varios aminoácidos alternativos, las alternativas son separadas una de otra mediante barras oblicuas. De este modo, por ejemplo P9T/S/H significa que prolina puede ser reemplazada en la posición 9 por treonina, serina o histidina. Para las inserciones, después de la posición de secuencia se nombran los aminoácidos adicionales. Para eliminaciones, el aminoácido faltante es reemplazado mediante un símbolo, por ejemplo una estrella o una raya o antes de la posición correspondiente se indica un A. Por ejemplo P9T describe la sustitución de prolina en la posición 9 por treonina, P9KT describe la inserción treonina después del aminoácido lisina en la posición 9 y P9* o AP9 describen la eliminación de prolina en la posición 9. Esta nomenclatura es conocida por los expertos en el campo de la tecnología de enzimas.
Por ello, otro objetivo de la invención es una proteasa, que se caracteriza porque es obtenible a partir de una proteasa como molécula de partida, como se describió anteriormente, mediante una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que la proteasa en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO. 2 aun exhibe por lo menos una de las sustituciones de acuerdo con la invención de aminoácidos en las posiciones, que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 en SEQ ID NO:2, como se describió anteriormente. El concepto "sustitución conservadora de aminoácido" significa el intercambio (sustitución) de un radical aminoácido por otro radical aminoácido, en el que este intercambio no conduce a una modificación de la polaridad o carga en la posición del aminoácido intercambiado, por ejemplo intercambio de un radical aminoácido apolar por otro radical aminoácido apolar. En el marco de la invención, las sustituciones conservadoras de aminoácido comprenden por ejemplo: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
De modo alternativo o como complemento, la proteasa se caracteriza porque es obtenible a partir de una proteasa de acuerdo con la invención como molécula de partida, mediante fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que sobre una longitud de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 o 274 aminoácidos contiguos, coincide con la molécula de partida, en la cual aún está(n) presente(s) la(s) sustitución(es) de aminoácidos presente(s) en la molécula de partida en una o varias de las posiciones, que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 en SEQ ID NO:2.
De esta manera, es posible por ejemplo eliminar aminoácidos individuales en los extremos o en los bucles de la enzima, sin que por ello se pierda o se reduzca la actividad proteolítica. Además, mediante tales fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución puede reducirse por ejemplo también el carácter alergénico de la enzima en cuestión y con ello mejorarse en total su utilidad. De manera ventajosa, también después de la mutagénesis las enzimas retienen su actividad proteolítica, es decir su actividad proteolítica corresponde por lo menos a la de la enzima de partida, es decir, en una forma preferida de realización la actividad proteolítica es por lo menos 80, preferiblemente por lo menos 90 % de la actividad de la enzima de partida. Otras sustituciones pueden mostrar también efectos ventajosos. Tanto aminoácidos individuales, como también varios aminoácidos contiguos pueden ser intercambiados por otros aminoácidos.
De modo alternativo o como complemento, la proteasa se caracteriza porque es obtenible a partir de una proteasa de acuerdo con la invención como molécula de partida, mediante sustitución individual o múltiple conservadora de aminoácidos, en la que la proteasa exhibe por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, n 187H, S216C, n238K o Q271E en las posiciones, que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2.
En otras formas de realización, la proteasa se caracteriza porque es obtenida a partir de una proteasa de acuerdo con la invención como molécula de partida, mediante fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos, que a lo largo de una longitud de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 o 274 aminoácidos contiguos coincide con la molécula de partida, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E en las posiciones, que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2.
Las otras posiciones de aminoácidos son definidas para ello mediante una alineación de la secuencia de aminoácidos de una proteasa de acuerdo con la invención, con la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus pumilus, como se indica en SEQ ID NO:2. Además, la asignación se orienta a las posiciones de acuerdo con la proteína madura (mature). Esta asignación aplica en particular también cuando la secuencia de aminoácidos de una proteasa de acuerdo con la invención comprende un número más elevado de radicales aminoácido, que la proteasa Bacillus pumilus de acuerdo con SEQ ID NO:2. Partiendo de las posiciones mencionadas en la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus pumilus, las posiciones de modificación en una proteasa de acuerdo con la invención son las que están asignadas en el plano de estas posiciones en una alineación.
Las posiciones ventajosas para modificaciones de secuencia, en particular sustituciones, de la proteasa Bacillus pumilus, que aplican a posiciones homólogas de las proteasas de acuerdo con la invención, preferiblemente son de importancia e imparten a la proteasa propiedades funcionales ventajosas, son de acuerdo con ello las posiciones que en una alineación corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 en SEQ iD NO:2, es decir en la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2. En las posiciones mencionadas en la molécula tipo silvestre de la proteasa de Bacillus pumilus están los siguientes radicales de aminoácido: P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 y Q271.
Los ensayos de comparación pueden entregar otra confirmación de la correcta asignación de los aminoácidos que van a ser modificados, es decir en particular su correspondencia funcional, por lo que se modifican del mismo modo las dos posiciones asignadas mutuamente, sobre la base de una alineación en ambas proteasas mutuamente comparadas, y se observa si en ambas cambia de la misma manera la actividad enzimática. Si por ejemplo un
intercambio de aminoácidos en una posición determinada de la proteasa de Bacillus pumilus de acuerdo con SEQ ID NO:2, está acompañado con una modificación de un parámetro enzimático, por ejemplo con la elevación del valor KM, y se observa una modificación correspondiente del parámetro enzimático, por ejemplo por consiguiente así mismo una elevación del valor KM, en una variante de proteasa de acuerdo con la invención, cuyo intercambio de aminoácidos fue alcanzado mediante el mismo aminoácido introducido, entonces aquí se ve una confirmación de la correcta asignación.
Todas las circunstancias mencionadas son también aplicables al procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de una proteasa. De acuerdo con ello, un procedimiento de acuerdo con la invención comprende además una o varias de las siguientes etapas de procedimiento:
a) introducción de una sustitución conservadora simple o múltiple de aminoácido, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácido P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2;
b) modificación de la secuencia de aminoácidos mediante fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución, de modo que la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que coincide sobre una longitud de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 o 274 aminoácidos contiguos, con la molécula de partida, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácido P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216c , N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2.
Todas las realizaciones son válidas también para los procedimientos de acuerdo con la invención.
En otros acondicionamientos de la invención, la proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento de acuerdo con la invención es aún idéntica en por lo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, o 98,8% a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, sobre la totalidad de su longitud. De manera alternativa, la proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento de acuerdo con la invención es aún idéntica en por lo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, o 98 a una de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID Nos:3-11, sobre la totalidad de su longitud. La proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento de acuerdo con la invención exhibe una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 o Q271, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2. En formas de realización más preferidas, la sustitución de aminoácidos es por lo menos una elegida de entre el grupo consistente en P9T/S/H, Q62E, D101 E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K y Q271E, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2. En formas de realización más preferidas, la proteasa comprende una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos: (i) P9T; (ii) Q271E; (iii) P9S y N238K; (iv) P9H; (v) N187H; (vi) S216C; (vii) Q62E y N130D; (viii) Q62E, D101E, N130D, G166S y Q271E; o (ix) P9T, N187H, S216C y Q271E.
Otro objetivo de la invención es una proteasa descrita anteriormente que adicionalmente es estabilizada, en particular mediante una o varias mutaciones, por ejemplo sustituciones, o mediante acoplamiento a un polímero. Una elevación de la estabilidad en el almacenamiento y/o durante el uso, por ejemplo en el procedimiento de lavado, conduce a que la actividad enzimática se detenga por más tiempo y con ello mejore el desempeño de limpieza. Básicamente entran en consideración todas las posibilidades de estabilización descritas y/o convenientes en el estado de la técnica. Se prefieren aquellas estabilizaciones que son alcanzadas mediante mutaciones de la enzima misma, puesto que aquellas estabilizaciones no requieren otra etapa de trabajo a continuación de la obtención de la enzima. Previamente se han mencionado ejemplos de modificaciones de secuencia adecuados para ello. Otras modificaciones de secuencia adecuados son conocidos a partir del estado de la técnica.
Otras posibilidades de estabilización son por ejemplo:
- Modificación de la unión de iones metálicos, en particular de las posiciones de unión con calcio, por ejemplo mediante intercambio de uno o varios de los aminoácido(s) involucrados en la unión con calcio, por uno o varios aminoácidos con carga negativa y/o mediante la introducción de modificaciones de secuencia en por lo menos uno de los resultados de los dos aminoácidos arginina/glicina;
- protección contra la influencia de agentes que desnaturalizan, como tensioactivos, mediante mutaciones que causan una modificación de la secuencia de aminoácidos sobre o en la superficie de la proteína;
- intercambio de aminoácidos, que están cerca al extremo N, por aquellos que presumiblemente entran en contacto mediante interacciones no covalentes con el resto de la molécula y con ello logran una contribución a la preservación de la estructura globular.
Son formas preferidas de realización aquellas en las cuales la enzima es estabilizada por varias formas, puesto que varias mutaciones estabilizantes actúan de modo aditivo o sinérgico.
Otro objetivo de la invención es una proteasa como se describió anteriormente, que se caracteriza porque exhibe por lo menos una modificación química. Una proteasa con una modificación así es denominada como derivado, es decir la proteasa es transformada en derivado.
En el sentido del presente documento, se entiende por derivados de acuerdo con ello, a aquellas proteínas cuya cadena de aminoácidos puros ha sido modificada por vía química. Tales formaciones de derivado pueden ocurrir por ejemplo in vivo mediante la célula anfitrión, que expresa la proteína. Respecto a esto, se enfatizan particularmente acoplamientos de compuestos de bajo peso molecular, como de lípidos u oligosacáridos. Sin embargo, las formaciones de derivados pueden ser ejecutadas también in vitro, por ejemplo mediante la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante enlace covalente de otro compuesto a la proteína. Por ejemplo es posible el acoplamiento de aminas a grupos carboxilo de una enzima, mediante la modificación del punto isoeléctrico. Un otro compuesto así puede ser también otra proteína, que está unida por ejemplo mediante compuestos químicos bifuncionales a una proteína de acuerdo con la invención. Así mismo, se entiende por formación de derivado la unión covalente a un vehículo macromolecular, o también una inclusión no covalente en estructuras de jaula macromoleculares adecuadas. Las formaciones de derivado pueden influir por ejemplo en la especificidad de sustrato o la fortaleza de la unión al sustrato o precipitar un bloqueo transitorio de la actividad enzimática, cuando la sustancia acoplada es un inhibidor. Esto puede ser sensato por ejemplo para el espacio de tiempo del almacenamiento. Tales modificaciones pueden influir además en la estabilidad o la actividad enzimática. Además también pueden servir para disminuir el carácter alergénico y/o carácter inmunogénico de la proteína y con ello elevar por ejemplo su compatibilidad con la piel. Por ejemplo los acoplamientos con compuestos macromoleculares, por ejemplo polietilenglicol, pueden mejorar la proteína respecto a la estabilidad y/o compatibilidad con la piel. En el sentido más amplio, por derivados de una proteína de acuerdo con la invención pueden entenderse también preparaciones de esta proteína. Dependiendo de la obtención, procesamiento o preparación, una proteína puede estar combinada con diversas otras sustancias, por ejemplo del cultivo de los microorganismos productores. A una proteína pueden añadirse de manera focalizada también, por ejemplo para elevar su estabilidad al almacenamiento, otras sustancias. Por eso, también todas las preparaciones de una proteína de acuerdo con la invención, son de acuerdo con la invención. Ello es independiente de si en una preparación determinada, esta actividad enzimática es realmente desplegada o no. Entonces puede ser deseable que en el almacenamiento no posea o sólo posea una baja actividad, y justo en el momento del uso despliegue su función enzimática. Esto puede ser controlado por ejemplo mediante correspondientes sustancias concomitantes. En particular, a este respecto es posible la preparación conjunta de proteasas con inhibidores.
Entre todas las proteasas o variantes de proteasa y/o derivados descritas anteriormente, en el marco de la presente invención son preferidas de modo particular, aquellas cuya estabilidad y/o actividad corresponde por lo menos a la de la proteasa de acuerdo con SEQ ID Nos: 3-11, y/o cuyo desempeño de limpieza corresponde por lo menos al de la proteasa de acuerdo con SEQ ID Nos: 3-11, en las que se determina el desempeño de limpieza en un sistema de lavado, como se describió anteriormente.
Otro objetivo de la invención es un ácido nucleico que codifica para una proteasa de acuerdo con la invención, así como un vector que contiene un ácido nucleico tal, en particular un vector de clonación o un vector de expresión. Un ácido nucleico tal puede exhibir como secuencia que codifica la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1, que ha mutado en las posiciones correspondientes, para dar como resultado la sustitución deseada de aminoácidos.
Para ello puede tratarse de moléculas de ADN o de ARN. Ellas pueden estar presentes como cuerda individual, como una cuerda individual complementaria a ésta cuerda individual o como cuerda doble. En particular para moléculas de ADN, en cada caso se consideran las secuencias de ambas cuerdas complementarias en todos los tres marcos de lectura posibles. Además, se considera que diferentes codones, por consiguiente tripletes de bases, pueden codificar para los mismos aminoácidos, de modo que una determinada secuencia de aminoácidos puede ser codificada por varios ácidos nucleicos diferentes. Debido a esta degeneración del código genético, todas las secuencias de ácidos nucleicos están incluidas en este objetivo de la invención, que pueden codificar una de las proteasas descritas anteriormente. El experto está en capacidad de determinar de manera inequívoca estas secuencias de ácidos nucleicos, puesto que a pesar de la degeneración del código genético, se asignan codones individuales de aminoácidos definidos. Por ello, partiendo de una secuencia de aminoácidos, el experto puede determinar sin problema ácidos nucleicos que codifican para esta secuencia de aminoácidos. Además, para ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, puede reemplazarse uno o varios codones por codones sinónimos. Este aspecto se refiere en particular a las expresiones heterólogas de las enzimas de acuerdo con la invención. De este modo cada organismo, por ejemplo una célula anfitrión de una cepa de producción, posee una determinada aplicación de codón. Se entiende por aplicación de codón, la traducción del código genético en aminoácidos, mediante el respectivo organismo. Pueden ocurrir cuellos de botella en la biosíntesis de proteína, cuando los codones que están sobre el ácido nucleico en el organismo confrontan un número comparativamente bajo de moléculas cargadas de tARN. Aunque codifican para el mismo aminoácido, ello conduce a que en el organismo un codón sea traducido de modo menos eficiente, comparado con un codón sinónimo que codifica para el mismo aminoácido. Debido a la presencia de un mayor número de moléculas de tARN para el codón sinónimo, éste puede ser traducido de modo más eficiente en el organismo.
Para un experto es posible, mediante métodos en general conocidos por estos días, como por ejemplo la síntesis química o la reacción de cadena de polimerasa (PCR) en conjunto con métodos estándar de biología molecular y/o de química de proteínas, mediante secuencias conocidas de ADN y/o de aminoácidos preparar los correspondientes ácidos nucleicos hasta los genes completos. Tales métodos son conocidos por ejemplo a partir de Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3a edición Cold Spring Laboratory Press.
En el sentido de la presente invención se entiende por vectores, elementos que consisten en ácidos nucleicos, que como intervalo característico de ácido nucleico contienen un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Ellos pueden establecer éste en una especie o una línea de células por varias generaciones o divisiones celulares, como elemento genéticamente estable. Los vectores son en particular para el uso en bacterias, plásmidos especiales, por consiguiente elementos genéticos circulares. En el marco de la presente invención, se clona un ácido nucleico de acuerdo con la invención en un vector. Entre los vectores se cuentan por ejemplo aquellos cuyo origen son plásmidos bacterianos, virus o bacteriófagos, o vectores o plásmidos predominantemente sintéticos con elementos de diferente origen. Con los otros elementos genéticos presentes en cada caso, los vectores son capaces de establecerse en las células anfitrión en cuestión por varias generaciones, como unidades estables. Pueden estar presentes de modo extracromosomal como unidades propias o integrar en un cromosoma o ADN cromosomal.
Los vectores de expresión comprenden secuencias de ácido nucleico que son capaces de replicarlos en las células anfitrión que los contienen, preferiblemente microorganismos, preferido de modo particular bacterias, y allí llevar a expresión un ácido nucleico presente. La expresión recibe influencia en particular del o de los promotores que regulan la transcripción. En principio la expresión puede ocurrir mediante el promotor localizado de modo natural, originalmente antes del ácido nucleico que va a ser expresado, pero también mediante un promotor de la célula anfitrión preparado en el vector de expresión o también mediante un promotor, modificado o completamente diferente, de otro organismo u otra célula anfitrión. En el presente caso se pone a disposición al menos un promotor para la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y se usa para su expresión. Los vectores de expresión pueden además ser regulables, por ejemplo mediante modificación de las condiciones de cultivo o alcanzando una determinada densidad celular de las células anfitrión que los contienen o mediante adición de determinadas sustancias, en particular activadores de expresión de gen. Un ejemplo de una sustancia tal es el derivado de galactosa isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), que es usado como activador del operón bacteriano de lactosa (lac-Operon). En contraste con los vectores de expresión, el ácido nucleico presente en vectores de clonación, no se expresa.
Otro objetivo de la invención es una célula anfitrión no humana, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención, o que comprende una proteasa de acuerdo con la invención, en particular una que secreta la proteasa al medio que rodea la célula anfitrión. Preferiblemente se transforma un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención en un microorganismo, el cual representa entonces una célula anfitrión de acuerdo con la invención. De modo alternativo pueden incorporarse en una célula anfitrión también componentes individuales, es decir partes o fragmentos de ácido nucleico de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, de modo que entonces la célula anfitrión resultante contiene un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención. Este procedimiento es adecuado en particular entonces cuando la célula anfitrión ya contiene uno o varios componentes de un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención y entonces de modo correspondiente se complementan los otros componentes. Los procedimientos para la transformación de las células están establecidos en la técnica y son suficientemente conocidos por los expertos. Como células anfitrión son adecuadas en principio todas las células, es decir células procariotas o eucariotas. Se prefieren aquellas células anfitrión, por ejemplo mohos o bacterias unicelulares, que se dejan manipular genéticamente de manera ventajosa, lo cual concierne por ejemplo a la transformación con el ácido nucleico o el vector y su establecimiento estable. Además, las células anfitrión preferidas se distinguen por una buena facilidad de manipulación microbiológica y biotecnológica. Ello se refiere por ejemplo a facilidad para ser cultivadas, elevadas tasas de crecimiento, bajos requerimientos de medios de fermentación y buenas tasas de producción y secreción para proteínas externas. Las células anfitrión preferidas de acuerdo con la invención secretan la proteína expresada (transgénica) al medio que rodea las células anfitrión. Además, las proteasas de las células que las producen pueden ser modificadas después de su preparación, por ejemplo mediante unión a moléculas de azúcar, formilaciones, aminaciones, etc. Tales modificaciones postranslacionales pueden influir funcionalmente en la proteasa.
Otras formas de realización preferidas representan aquellas células anfitrión que debido a elementos de regulación genética, que son suministrados por ejemplo en el vector, pero que también pueden estar presentes desde el principio en estas células, son regulables en su actividad. Por ejemplo mediante la adición controlada de compuestos químicos, que sirven como activadores, mediante modificación de las condiciones de cultivo o al alcanzar una determinada densidad celular, pueden promoverse estos a la expresión. Esto hace posible una producción económica de las proteínas de acuerdo con la invención. Un ejemplo de tal compuesto es IPTG, como se describió anteriormente.
Las células anfitrión preferidas son procariotas o células bacterianas. Las bacterias se distinguen por cortos tiempos de generación y bajos requerimientos sobre las condiciones de cultivo. Mediante ello pueden establecerse procedimientos de cultivo o procedimientos de preparación convenientes en costes. Además, con bacterias en la
técnica de fermentación, el experto dispone un tesoro de experiencia sustancial. Para una producción especial, por las más diversas razones que van a ser determinadas experimentalmente en el caso individual, como fuentes de nutrientes, tasa de formación de producto, tiempo requerido, etc. pueden ser adecuadas bacterias gramnegativas o grampositivas.
Para bacterias gramnegativas, como por ejemplo Escherichia coli, se secreta una multiplicidad de proteínas en el espacio periplasmático, por consiguiente en el compartimiento entre las dos membranas que incluyen las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. Además, pueden acondicionarse también bacterias gramnegativas, de modo que descarguen las proteínas expresadas, no sólo en el espacio periplasmático, sino en el medio que rodea la bacteria. En contraste, las bacterias grampositivas, como por ejemplo bacillos o actinomicetos u otros representantes de los actinomicetales no poseen membrana exterior, de modo que las proteínas secretadas son emitidas inmediatamente al medio que rodea las bacterias, por regla general el medio nutritivo, desde el cual se purifican las proteínas expresadas. Ellas pueden ser aisladas directamente del medio o procesadas adicionalmente. Además, las bacterias grampositivas están emparentadas, o son idénticas, por enzimas técnicamente importantes con la mayoría de organismos de origen, y forman usualmente en sí mismas enzimas comparables, de modo que disponen de un uso similar de codón y su aparato de síntesis de proteínas está orientado correspondientemente de modo natural.
Las células anfitrión de acuerdo con la invención pueden ser modificadas respecto a sus requerimientos de condiciones de cultivo, pueden exhibir otros o adicionales marcadores de selección o expresar aun otras o adicionales proteínas. En particular pueden ser también células anfitrión que expresan de modo transgénico varias proteínas o enzimas.
La presente invención es aplicable en principio a todos los microorganismos, en particular a todos los microorganismos que pueden fermentar, preferido de modo particular a aquellos del género Bacillus, y conduce a que mediante el uso de tales microorganismos se preparen proteínas de acuerdo con la invención. Tales microorganismos representan entonces células anfitrión en el sentido de la invención.
En otra forma de realización de la invención, la célula anfitrión se caracteriza porque es una bacteria, preferiblemente una, que es elegida de entre el grupo de los géneros de Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas y Pseudomonas, más preferiblemente una que es elegida de entre el grupo de Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Stenotrophomonas maltophilia.
Sin embargo, la célula anfitrión puede ser también una célula eucariota, que se caracteriza porque posee un núcleo celular. Por ello, otro objetivo de la invención representa una célula anfitrión, que se caracteriza porque posee un núcleo celular. En contraste con las células procariotas, las células eucariotas están en capacidad de modificar de modo postranslacional la proteína formada. Son ejemplos de ello mohos como actinomicetos o levaduras como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede ser particularmente ventajoso por ejemplo entonces cuando la proteína debiera experimentar modificaciones específicas en relación con su síntesis, que hacen posible tales sistemas. A las modificaciones que ejecutan los sistemas eucariotes en particular en relación con la síntesis de proteína, pertenecen por ejemplo la unión de compuestos de bajo peso molecular como anclas de membrana u oligosacáridos. Tales modificaciones de oligosacáridos pueden ser deseadas por ejemplo para reducir el carácter alergénico de una proteína expresada. También puede ser ventajosa una coexpresión con las enzimas formadas de modo natural de tales células, como por ejemplo celulasas. Además pueden ser adecuados por ejemplo sistemas de expresión de hongos termófilos, en particular para la expresión de proteínas o variantes resistentes a la temperatura.
Las células anfitrión de acuerdo con la invención son cultivadas y fermentadas de manera corriente, por ejemplo en sistemas discontinuos o continuos. En el primer caso, se inocula con las células anfitrión un medio nutritivo adecuado y se cosecha del medio el producto después de un periodo de tiempo que va a ser determinado experimentalmente. Las fermentaciones continuas se distinguen porque alcanzan un equilibrio dinámico, en el cual durante un periodo de tiempo comparativamente largo, las células sufren necrosis parcial, pero también crecen de nuevo y simultáneamente puede retirarse del medio la proteína formada.
Las células anfitrión de acuerdo con la invención son usadas preferiblemente para preparar proteasas de acuerdo con la invención. Por ello, otro objetivo de la invención es un procedimiento para la preparación de una proteasa, que comprende
a) cultivo de una célula anfitrión de acuerdo con la invención, y
b) aislamiento de la proteasa del medio de cultivo o de la célula anfitrión.
Este objetivo de la invención comprende preferiblemente procedimientos de fermentación. Los procedimientos de fermentación son conocidos a partir del estado de la técnica y representan la verdadera etapa de producción a escala industrial, seguida por regla general por un procedimiento adecuado de purificación del producto preparado,
por ejemplo la proteasa de acuerdo con la invención. Todos los procedimientos de fermentación, que descansan en un procedimiento correspondiente para la preparación de una proteasa de acuerdo con la invención, representan formas de realización de este objetivo de la invención.
Entran en consideración en particular los procedimientos de fermentación, que se caracterizan porque la fermentación es ejecutada mediante una estrategia de adición. Para ello, se suministran en forma de suplemento los componentes del medio, que son consumidos por el cultivo en progreso. Mediante ello pueden alcanzarse elevaciones considerables tanto en la densidad celular, como también en la masa celular o la masa seca y/o en particular en la actividad de la proteasa de interés. Además, también puede acondicionarse la fermentación, de modo que se separan por filtración productos metabólicos indeseados o se neutraliza mediante adición de amortiguadores o iones contrarios pertinentes en cada caso.
La proteasa preparada puede ser cosechada del medio de fermentación. Un procedimiento de fermentación así es preferido frente a un aislamiento de la proteasa de la célula anfitrión, es decir un procesamiento de producto de la masa celular (masa seca), sin embargo requiere de suministro de células anfitrión adecuadas o de uno o varios marcadores o mecanismos adecuados de secreción y/o sistemas de transporte, con ello las células anfitrión secretan la proteasa al medio de fermentación. De modo alternativo, sin secreción, puede ocurrir el aislamiento de la proteasa de la célula anfitrión, es decir una purificación de la misma de la masa celular, por ejemplo por precipitación con sulfato de amonio o etanol o mediante purificación cromatográfica.
Todos los asuntos previamente citados pueden ser combinados en el procedimiento, para preparar proteasas de acuerdo con la invención.
Otro objetivo de la invención es un agente que se caracteriza porque contiene una proteasa de acuerdo con la invención, como se describió previamente. Preferiblemente el agente es un detergente o agente limpiador.
En este objetivo de la invención se cuentan todos los tipos imaginables de detergentes o agentes limpiadores, que van a ser usados tanto concentrados como también no diluidos, para el uso a escala comercial, en las máquinas lavadoras o el lavado o la limpieza manual. A ellos pertenecen por ejemplo detergentes para textiles, alfombras o fibras naturales, para los cuales se usa la denominación de detergente. A ellos pertenecen por ejemplo también detergentes para vajillas para lavadoras para vajillas o detergentes para el lavado manual de vajillas o limpiadores para superficies duras, como metal, vidrio, porcelana, cerámica, azulejos, piedra, superficies lacadas, plásticos, madera o cuero, para los cuales se usa la denominación de agente limpiador, por consiguiente aparte de detergentes para lavado manual y automático de vajillas, por ejemplo también limpiadores abrasivos, detergentes para vidrio, detergentes con olor para sanitarios, etc. Entre los detergentes y agentes de limpieza en el marco de la invención se encuentran además agentes auxiliares de lavado, que son añadidos al verdadero detergente en el lavado manual o automático de textiles, para alcanzar un efecto adicional. Además entre los detergentes y agentes de limpieza en el marco de la invención se cuentan también agentes de tratamiento anterior y posterior de textiles, por consiguiente aquellos agentes con los cuales, antes del verdadero lavado, se pone en contacto la pieza que se va a lavar, por ejemplo para disolver suciedades persistentes, y también aquellos agentes que en una etapa subsiguiente al verdadero lavado de textiles, imparten al material que se va a lavar otras propiedades deseables, como sensación agradable al tacto, ausencia de arrugas o baja carga estática. Al último agente mencionado se orientan entre otros los suavizantes de telas.
Los detergentes o agentes limpiadores de acuerdo con la invención, que pueden estar presentes como sustancia sólida en polvo en forma de partículas compactadas adicionalmente, como soluciones homogéneas o suspensiones pueden, aparte de una proteasa de acuerdo con la invención, contener todos los ingredientes conocidos y usuales en tales agentes, en los que preferiblemente en el agente está presente por lo menos otro ingrediente. Los agentes de acuerdo con la invención pueden contener en particular tensioactivos, agentes auxiliares de lavado (sustancias estructurales), compuesto de peroxígeno o activadores de blanqueo. Además, pueden contener solventes orgánicos miscibles con agua, otras enzimas, agentes de secuestración, electrolitos, reguladores de pH y/u otras sustancias auxiliares como aclaradores ópticos, inhibidores de engrisamiento, reguladores de espuma así como colorantes y perfumes, así como combinaciones de ellos.
En particular es ventajosa una combinación de una proteasa de acuerdo con la invención con uno o varios otros ingrediente(s) del agente, puesto que en acondicionamientos preferidos de acuerdo con la invención, un agente así exhibe un desempeño mejorado de limpieza, mediante sinergismos que surgen. En particular, mediante la combinación de una proteasa de acuerdo con la invención con un tensioactivo y/o un agente auxiliar de lavado (sustancia estructural) y/o un compuesto de peroxígeno y/o un activador de blanqueo, puede alcanzarse un sinergismo tal. Puesto que la proteasa descrita en esta memoria exhibe, ya sin estabilizante de enzima, como por ejemplo ácido bórico, una elevada estabilidad de la enzima, en diferentes formas de realización puede renunciarse a la adición de tales estabilizantes al agente que contiene enzimas, o reducirse la cantidad de estos estabilizantes.
Los ingredientes ventajosos de agentes de acuerdo con la invención son divulgados en el documento internacional WO2009/121725, comenzando allí en la página 5, penúltimo párrafo, y terminando en la página 13 después del
segundo párrafo. Se hace expresa referencia a esta divulgación y el contenido allí divulgado es incluido en el presente documento.
Un agente de acuerdo con la invención contiene la proteasa de manera ventajosa en una cantidad de 2|jg a 20mg, preferiblemente de 5 jg a 17,5mg, preferido de modo particular de 20jg a 15mg y de modo muy particularmente preferido de 50jg a 10mg por g del agente. Además, la proteasa presente en el agente, y/u otros ingredientes del agente, están envueltos con una sustancia impermeable a la enzima a temperatura ambiente o en ausencia de agua, la cual bajo las condiciones de aplicación del agente es permeable a la enzima. Con ello, una forma tal de realización de la invención está caracterizada porque la proteasa está envuelta con una sustancia impermeable a la proteasa a temperatura ambiente o en ausencia de agua. Además, también el detergente o agente limpiador en sí mismo puede estar empacado en un recipiente, preferiblemente un recipiente permeable al aire, a partir del cual es liberado justo antes del uso o durante el procedimiento de lavado.
En otras formas de realización de la invención, el agente está caracterizado porque
(a) está presente en forma sólida, en particular como polvo que fluye con un peso a granel de 300 g/l a 1200 g/l, en particular 500 g/l a 900 g/l, o
(b) está presente en forma pastosa o líquida, y/o
(c) está presente en forma de gel o bolsas para dosificación (Pouches), y/o
(d) está presente como sistema de un componente, o
(e) está dividido en varios componentes.
Estas formas de realización de la presente invención comprenden todas las formas de administración del agente de acuerdo con la invención sólidas, en polvo, líquidas, en forma de gel o pastosas, que dado el caso pueden consistir también en varias fases así como pueden estar presentes en forma comprimida o no comprimida. El agente puede estar presente como polvo que fluye, en particular con una densidad a granel de 300 g/l a 1200 g/l, en particular 500 g/l a 900 g/l o 600 g/l a 850 g/l. Entre las formas sólidas de administración del agente se cuentan además extrudidos, granulados, comprimidos o bolsas. De modo alternativo, el agente puede ser también líquido, en forma de gel o pastoso, por ejemplo en forma de un detergente líquido no acuoso o una pasta no acuosa o en forma de un detergente líquido acuoso o una pasta que tiene agua. Además, el agente puede estar presente como sistema de un componente. Tales agentes consisten en una fase. De modo alternativo, un agente puede consistir también en varias fases. De acuerdo con ello, un agente así está dividido en varios componentes.
Los detergentes o agentes limpiadores de acuerdo con la invención pueden contener exclusivamente una proteasa. De modo alternativo pueden contener también otras enzimas hidrolíticas u otras enzimas, en una concentración conveniente para la eficacia del agente. Con ello, otra forma de realización de la invención representa agentes, que además comprenden una o varias otras enzimas. Como otras enzimas preferiblemente utilizables están todas las enzimas que pueden desplegar una actividad catalítica en el agente de acuerdo con la invención, en particular una lipasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, p-glucosidasa, pectinasa, carraginasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidoreductasa u otra proteasa diferenciable de la proteasa de acuerdo con la invención, así como sus mezclas. Otras enzimas están presentes en el agente, de manera ventajosa en cada caso en una cantidad de 1 x 10-8 a 5 por ciento en peso, referido a la proteína activa. Con creciente preferencia, cada otra enzima está presente en el agente de acuerdo con la invención en una cantidad de 1 x 10-7-3 % en peso, de 0,00001-1 % en peso, de 0,00005-0,5 % en peso, de 0,0001 a 0,1 % en peso y preferido de modo particular de 0,0001 a 0,05 % en peso, referida a la proteína activa. Preferido de modo particular, las enzimas muestran poderes sinérgicos de limpieza frente a determinadas suciedades o manchas, es decir las enzimas presentes en la composición de agentes se ayudan una a otra en su poder de limpieza. De modo muy particularmente preferido un sinergismo tal está presente entre la proteasa presente de acuerdo con la invención y otra enzima de un agente de acuerdo con la invención, entre ellas en particular entre la mencionada proteasa y una amilasa y/o una lipasa y/o una mananasa y/o una celulasa y/o una pectinasa. Los efectos sinérgicos pueden ocurrir no sólo entre diferentes enzimas, sino también entre una o varias enzimas y otros ingredientes del agente de acuerdo con la invención.
Otro objetivo de la invención es un procedimiento para la limpieza de textiles o superficies duras, caracterizado porque en por lo menos una etapa del procedimiento se aplica un agente de acuerdo con la invención, o porque en por lo menos una etapa del procedimiento se torna catalíticamente activa una proteasa de acuerdo con la invención, en particular de modo que la proteasa es usada en una cantidad de 40jg a 4g, preferiblemente de 50jg a 3g, preferido de modo particular de 100jg a 2g y de modo muy particularmente preferido de 200jg a 1g.
En diferentes formas de realización, el procedimiento descrito anteriormente se distingue porque la proteasa es usada a una temperatura de 0-100°C, preferiblemente 0-60°C, más preferiblemente 20-40°C y con máxima preferencia a 35°C.
Bajo ellos caen tanto procedimientos manuales como también automáticos, en los que se prefieren los procedimientos automáticos. Los procedimientos para la limpieza de textiles se distinguen en general porque en varias etapas del procedimiento, sobre el material que va a ser lavado se aplican diferentes sustancias con actividad
de limpieza y después del tiempo de acción son enjuagados, o porque el material que va a ser limpiado es tratado de otra manera con un detergente o una solución o dilución de este agente. Lo correspondiente es válido para procedimientos para la limpieza de todos los otros materiales diferentes a los textiles, en particular de superficies duras. Todos los procedimientos de lavado o limpieza imaginables pueden ser mejorados en al menos una de las etapas del procedimiento, alrededor de la aplicación de un detergente o agente limpiador de acuerdo con la invención o una proteasa de acuerdo con la invención y representan entonces formas de realización de la presente invención. Todos los asuntos, objetivos y formas de realización que se describen para las proteasas de acuerdo con la invención y agentes que las contienen, son aplicables también en este objetivo de la invención. Por ello, en este pasaje se remite expresamente a la divulgación en los correspondientes pasajes, indicando que esta divulgación es válida también para los procedimientos precedentes de acuerdo con la invención.
Puesto que las proteasas de acuerdo con la invención de modo natural ya poseen una actividad hidrolítica y despliegan ésta también en medios que de otro modo no poseen fuerza limpiadora, como por ejemplo en simples amortiguadores, una etapa individual y/o la única etapa de un procedimiento así puede consistir en que como único componente con actividad de limpieza, se pone en contacto una proteasa de acuerdo con la invención con la suciedad, preferiblemente en una solución amortiguadora o en agua. Esto representa otra forma de realización de este objetivo de la invención.
También procedimientos para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado textil, representan formas de realización alternativas de este objetivo de la invención, en las cuales en al menos una etapa del procedimiento se torna activa una proteasa de acuerdo con la invención. Entre ellos se prefieren procedimientos para materias primas textiles, fibras o textiles con componentes naturales, y de modo muy particular para aquellas con lana o seda. Finalmente, la invención también abarca la aplicación de las proteasas descritas en esta memoria en agentes de lavado o detergentes, por ejemplo como se describió anteriormente, para la eliminación (mejorada) de suciedades que contienen proteína, por ejemplo de textiles o superficies duras.
Todos los asuntos, objetivos y formas de realización, que son descritos para las proteasas de acuerdo con la invención y agentes que las contienen, son aplicables también en este objetivo de la invención. Por ello, de manera expresa en este pasaje se remite a la divulgación en los respectivos pasajes, anotando que esta divulgación también es válida para el uso precedente de acuerdo con la invención.
Ejemplos
Todas las etapas de trabajo de biología molecular siguen procedimientos estándar, como se indican por ejemplo en el Manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, 1989, o trabajos pertinentes comparables. Se usaron enzimas y conjuntos constituyentes (kits) de acuerdo con las indicaciones del respectivo fabricante en cada caso.
Vista eneral sobre las mutaciones:
Ejemplo 1: Estabilidad al almacenamiento de la enzima en el detergente
Se incorporan agitando las proteasas al mismo nivel de actividad en una matriz de detergente y se almacenan 30°C. Mediante un ensayo corriente de actividad para proteasas (hidrólisis de suc-AAPFpNA), se mide la actividad inicial y la actividad residual de la proteasa después de almacenamiento durante 42 h y 9 días a 30°C.
Para generar condiciones severas, se almacenan las proteasas una vez en la matriz de detergente sin estabilizante (ácido bórico) y para la comparación una vez con ácido bórico.
Esta es la matriz de detergente que se usó en este caso (LSPA+):
Ejemplo 2: Enzimas
Las proteasas están presentes en sobrenadantes de Bacillus subtilis generados en matraces para agitación. Son diluidas hasta un nivel de actividad igual. A 50% de matriz de detergente /- ácido bórico se añade 50% del correspondiente sobrenadante de proteasa diluida de Bacillus subtilis y se mezcla bien. Se incuban a 30°C los recipientes cerrados. En el momento de la toma de muestra, se retira una cierta cantidad de matriz/mezcla de proteasa y se disuelve mediante agitación por 20 min a temperatura ambiente en el amortiguador de muestras (0,1 M Tris/HCI, pH 8,6). Luego se ejecuta el ensayo AAPF como se describe abajo.
Se han expuesto como ventajosos 9 mutantes (SEQ ID Nos. 3-11), la actividad es representada en % del valor inicial. Este fue medido directamente después de la mezcla de las proteasas con la matriz y es definido como 100%:
Para mutantes de acuerdo con SEQ ID Nos. 9-11 se trata de recombinantes, que fueron medidos en otro ensayo:
Claims (12)
1. Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos, que sobre la totalidad de su longitud exhibe identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2 y que exhibe una sustitución de aminoácidos en por lo menos una de las posiciones P9, Q62, D101, N130, G166, N187, S216, N238 o Q271, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2, en la que la por lo menos una sustitución de aminoácidos es elegida de entre el grupo consistente en P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E, referida en cada caso a la numeración de acuerdo con SEQ ID NO:2.
2. Proteasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteasa exhibe una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos:
(i) P9T;
(ii) Q271E;
(iii) P9S y N238K;
(iv) P9H;
(v) N187H;
(vi) S216C;
(vii) Q62E y N130D;
(viii) Q62E, D101 E, N130D, G166S y Q271E; o
(ix) P9T, N187H, S216C y Q271E.
3. Proteasa, caracterizada porque
(a) es obtenible a partir de una proteasa de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 como molécula de partida, mediante sustitución conservadora individual o múltiple de aminoácidos, en la que la proteasa exhibe por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2; y/o
(b) es obtenible a partir de una proteasa de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 como molécula de partida, por fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que sobre una longitud de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 o 274 aminoácidos contiguos, coincide con la molécula de partida, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2.
4. Procedimiento para la preparación de una proteasa que comprende la sustitución de un aminoácido en por lo menos una de las posiciones, que corresponde a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 en SEQ ID NO:2 en una proteasa de partida, que sobre la totalidad de su longitud exhibe una identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, de modo que la proteasa comprende en por lo menos una posición la sustitución de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216C, N238K o Q271E.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además una o ambas de las siguientes etapas de procedimiento:
(a) incorporación de una sustitución simple o múltiple conservadora de aminoácidos, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216c , N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2;
b) modificación de la secuencia de aminoácidos mediante fragmentación, mutagénesis de eliminación, de inserción o de sustitución, de modo que la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos, que sobre una longitud de por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 270, 271, 272, 273 o 274 aminoácidos contiguos, coincide con la molécula de partida, en la que la proteasa comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos P9T/S/H, Q62E, D101E, N130D, G166S, N187H, S216c , N238K o Q271E en las posiciones que corresponden a las posiciones 9, 62, 101, 130, 166, 187, 216, 238 y 271 de acuerdo con SEQ ID NO:2.
6. Ácido nucleico que codifica para una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o que codifica para una proteasa obtenible de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 o 5.
7. Vector que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.
8. Célula anfitrión no humana, que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7, o que contiene una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, o que contienen una proteasa obtenible de acuerdo con un procedimiento de las reivindicaciones 4 o 5.
9. Procedimiento para la preparación de una proteasa que comprende
a) cultivo de una célula anfitrión de acuerdo con la reivindicación 8; y
b) aislamiento de la proteasa del medio de cultivo o de la célula anfitrión.
10. Agente, en particular un agente de lavado o detergente, caracterizado porque contiene por lo menos una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o una proteasa obtenible de acuerdo con un procedimiento de las reivindicaciones 4 o 5.
11. Procedimiento para la limpieza de textiles o superficies duras, caracterizado porque en por lo menos una etapa del procedimiento se usa un agente de acuerdo con la reivindicación 10, o porque en por lo menos una etapa del procedimiento se usa una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o una proteasa obtenible de acuerdo con un procedimiento de las reivindicaciones 4 o 5.
12. Uso de una proteasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o una proteasa obtenible de acuerdo con un procedimiento de las reivindicaciones 4 o 5, en un agente de lavado o detergente, para la eliminación de suciedades que tienen proteína.
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