ES2579437T3 - Procedimientos de cribado de proteasas y proteasas identificadas por los mismos - Google Patents

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ES2579437T3 ES11173352.3T ES11173352T ES2579437T3 ES 2579437 T3 ES2579437 T3 ES 2579437T3 ES 11173352 T ES11173352 T ES 11173352T ES 2579437 T3 ES2579437 T3 ES 2579437T3
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Abstract

Un polipéptido de la serina proteasa 1 tipo membrana (MT-SP1) modificado o una porción catalíticamente activa del mismo, que comprende un reemplazo de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 60(g), basado en la numeración de quimotripsina, por el que la especificidad por sustrato por una proteína del complemento es elevada en comparación con el polipéptido de MT-SP1 que no contiene el reemplazo de aminoácido.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
C. Polipéptidos de captura de proteasas
1. Serpinas: Estructura, función y expresión
2. Catálisis de proteasas, mecanismo inhibidor de serpinas y formación del producto intermedio de acil5 enzima
a. Serpinas a modo de ejemplo
i. PAI-1
ii. Antitrombina (AT3)
3. Otros polipéptidos de captura de proteasas
a.
p35 15 b. Alfa-macroglobulinas (aM)
4.
Competidores de polipéptidos de captura de proteasas
5.
Polipéptidos de captura de proteasas variantes
D. Proteasas
1. Proteasas candidatas
a.
Clases de proteasas 25
i. Serina proteasas (a) MT-SP1
E. Proteasas modificadas y conjuntos para el cribado
1. Generación de proteasas variantes
a.
Mutagénesis al azar
b.
Mutagénesis dirigida
35 2. Formas quiméricas de proteasas variantes
3. Bibliotecas combinatorias y otras bibliotecas
a.
Bibliotecas de exposición sobre fago
b.
Bibliotecas de exposición sobre la superficie celular
c.
Otras bibliotecas de exposición
F. Procedimientos para poner en contacto, aislar e identificar proteasas seleccionadas
1. Cribado iterativo
45 2. Proteasas seleccionadas a modo de ejemplo
G. Procedimientos de evaluación de la actividad y especificidad de la proteasa
H. Procedimientos de producción de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de captura de proteasas (es decir, serpinas) o variantes de los mismos o proteasas/proteasas modificadas
1.
Vectores y células
2.
Expresión
a.
Células procariotas 55 b. Células de levadura
c.
Células de insecto
d.
Células de mamífero
e.
Plantas
3.
Técnicas de purificación
4.
Proteínas de fusión
5.
Secuencias de nucleótidos
I.
Preparación, formulación y administración de polipéptidos de proteasas seleccionados 65
1. Composiciones y administración
7
imagen6
imagen7
Como se usa en este documento, un conjunto de proteasas se refiere a un conjunto que contiene al menos 10 proteasas diferentes y/o porciones proteolíticamente activas de las mismas, y que generalmente contiene al menos 50, 100, 500, 1000, 104, 105 o más miembros. Los conjuntos normalmente contienen proteasas (o porciones proteolíticamente activas de las mismas) que van a cribarse para especificidad por sustrato. En los conjuntos se
5 incluyen proteasas que se producen naturalmente (o porciones proteolíticamente activas de las mismas) y/o proteasas modificadas (o porciones proteolíticamente activas de las mismas). Las modificaciones incluyen mutaciones al azar a lo largo de la longitud de las proteasas y/o modificaciones en regiones elegidas como diana o seleccionadas (es decir, mutaciones dirigidas). Las modificaciones pueden ser combinatorias y pueden incluir todas las permutaciones, por sustitución de todos los aminoácidos en un locus particular o en todos los loci o subconjuntos de las mismas. Los conjuntos pueden incluir proteasas de longitud completa o más cortas que sólo incluyen el dominio de proteasa. Las proteasas pueden incluir cualquier proteasa tal como serina proteasas y cisteína proteasas. El usuario determina el tamaño del conjunto y el conjunto particular. En otras realizaciones, el conjunto puede contener tan sólo 2 proteasas.
15 Como se usa en este documento, “conjuntos combinatorios” o “bibliotecas combinatorias” se refiere a un conjunto de polipéptidos de proteasas que tienen mutaciones de aminoácidos distintas y diversas en su secuencia con respecto a la secuencia de una secuencia de polipéptidos de la proteasa molde de partida. Las mutaciones representadas en el conjunto pueden ser a través de la secuencia del polipéptido o pueden ser en una región especificada o regiones de la secuencia de polipéptidos. Las mutaciones pueden hacerse al azar o pueden ser mutaciones elegidas como diana diseñadas empíricamente o racionalmente basándose en información estructural o funcional.
Como se usa en este documento, una “proteasa molde” se refiere a una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos que se usa para la mutagénesis de la misma. Una proteasa molde puede ser la secuencia de una proteasa natural, o una porción catalíticamente activa de la misma, o puede ser la secuencia de una proteasa
25 variante, o porción catalíticamente activa de la misma, para la que se hacen mutaciones adicionales. Por ejemplo, una proteasa mutante identificada en los procedimientos de selección en este documento puede usarse como molde de partida para la mutagénesis adicional que va a usarse en rondas posteriores de selección.
Como se usa en este documento, mutación al azar se refiere a la introducción de uno o más cambios de aminoácidos a través de la secuencia de un polipéptido sin consideración o predisposición a la mutación. La mutagénesis al azar puede facilitarse por una variedad de técnicas conocidas para un experto en la materia que incluyen, por ejemplo, irradiación UV, procedimientos químicos y procedimientos de PCR (por ejemplo, PCR propensa a error).
35 Como se usa en este documento, una mutación dirigida se refiere a uno o más cambios de aminoácidos en una región especificada (o regiones) o una posición especificada (o posiciones) de un polipéptido. Por ejemplo, puede hacerse mutación elegida como diana de los aminoácidos en el sitio de unión a especificidad de una proteasa. La mutagénesis dirigida puede realizarse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis dirigida a mutisitio usando técnicas recombinantes convencionales conocidas en la técnica.
Como se usa en este documento, un complejo estable entre una captura de proteasas y una proteasa o una porción proteolíticamente activa de la misma se refiere a un complejo que es suficientemente estable para separarse de proteasas que no forman complejos con la captura de proteasas (es decir, proteasas sin complejar). Tales complejos pueden formarse mediante cualquier interacción estable que incluye interacciones covalentes, iónicas e hidrófobas,
45 pero son suficientemente estables bajo las condiciones de reacción para permanecer complejadas durante un tiempo suficiente para separar complejos para el aislamiento. Normalmente, tales interacciones, tales como entre serpinas y proteasas escindidas, son enlaces covalentes.
Como se usa en este documento, un “punto caliente” se refiere a una posición que está mutada en múltiples variantes que resultan de la selección de proteasas que presentan actividad y/o selectividad mejorada para la nueva secuencia de sustrato deseada. Pueden identificarse uno o más “puntos calientes” durante la selección de proteasas. Por tanto, tales posiciones son determinantes de la especificidad y/o selectividad por la proteasa y, por tanto, contribuyen a la especificidad por sustrato y también pueden producirse como determinantes de la especificidad y/o selectividad anchos a través del locus correspondiente en más de un miembro de una familia de
55 proteasas tal como una familia de serina proteasas o una familia de proteasas particular tal como basándose en la numeración de la quimotripsina.
Como se usa en este documento, especificidad deseada con referencia a la especificidad por sustrato se refiere a especificidad de escisión por un sustrato predeterminado o preseleccionado o elegido como diana de otro modo.
Como se usa en este documento, “seleccionar” o variaciones gramaticales del mismo se refieren a coger o elegir una proteasa que está en el complejo con un polipéptido de captura de proteasas. Por tanto, para los fines en este documento, seleccionar se refiere a sacar la proteasa basándose en su asociación en complejos estables con un polipéptido de captura de proteasas. Generalmente, la selección puede facilitarse por captura de los complejos 65 covalentes y, si se desea, la proteasa puede aislarse. Por ejemplo, la selección puede facilitarse marcando el polipéptido de captura de proteasas, por ejemplo, con un marcador, marca u otro resto detectable predeterminado
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para así identificar la proteasa basándose en su asociación en el complejo estable.
Como se usa en este documento, “identificar” y variaciones gramaticales del mismo se refiere al reconocimiento de o conocimiento de una proteasa en un complejo estable. Normalmente, en los procedimientos en este documento, la
5 proteasa se identifica por su asociación en un complejo estable con un polipéptido de captura de proteasas que puede llevarse a cabo, por ejemplo, por amplificación (es decir, crecimiento en una célula huésped apropiada) de las proteasas unidas en el complejo seguido de secuenciación de ADN.
Como se usa en este documento, marcada para la detección o separación significa que la molécula, tal como un polipéptido de captura de proteasas, está asociada a una marca detectable, tal como un fluoróforo, o está asociada a una marca u otro resto tal como para la purificación o aislamiento o separación. Detectablemente marcada se refiere a una molécula, tal como un polipéptido de captura de proteasas, que está marcada para la detección o separación.
15 Como se usa en este documento, referencia a amplificación de una proteasa o porción proteolíticamente activa de una proteasa significa que la cantidad de la proteasa o porción proteolíticamente activa es elevada, tal como mediante aislamiento y clonación y expresión o, si la proteasa o porción proteolíticamente activa está expuesta sobre un microorganismo, el microorganismo se introduce en un huésped apropiado y crece o se cultiva de manera que se produzca más proteasa expuesta o porción proteolíticamente activa.
Como se usa en este documento, homogénea con referencia a una mezcla de reacción significa que los reactivos están en la fase líquida como una mezcla, que incluye como una disolución o suspensión.
Como se usa en este documento, la recitación que un conjunto de proteasas o porciones proteolíticamente activas
25 de proteasas se “basa en” una proteasa particular significa que el conjunto se deriva de la proteasa particular, tal como por mutagénesis al azar o dirigida o diseño racional u otro esquema o protocolo de modificación, para producir un conjunto.
Como se usa en este documento, una enfermedad o afección que es tratada por la administración de t-PA se refiere a una enfermedad o afección para la que un experto en la materia administraría t-PA. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a, afecciones fibrinolíticas tales como trombosis arterial, trombosis venosa y tromboembolia, accidente cerebrovascular isquémico, trastornos adquiridos de la coagulación, coagulación intravascular diseminada y precursores de la misma tales como infecciones bacterianas o víricas, periodontitis, y afecciones neurológicas.
35 Como se usa en este documento, una enfermedad o afección que está mediada por VEGFR-2 participa en la patología o etiología. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a, afecciones inflamatorias y angiogénicas tales como cánceres, retinopatías diabéticas y trastornos oftálmicos que incluyen degeneración macular.
Como se usa en este documento, “proteasas”, “proteinasas” y “peptidasas” se usan indistintamente para referirse a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes. Estas designaciones incluyen formas de zimógenos y formas mono, bi y multicatenarias de las mismas. Por claridad, la referencia a proteasa se refiere a todas las formas. Las proteasas incluyen, por ejemplo, serina proteasas, cisteína proteasas, proteasas aspárticas, treonina y metalo-proteasas dependiendo de la actividad catalítica de su sitio activo y mecanismo de escisión de enlaces peptídicos de un sustrato diana.
45 Como se usa en este documento, un zimógeno se refiere a una proteasa que se activa por escisión proteolítica que incluye escisión por maduración tal como escisión por activación y/o formación de complejos con otra(s) proteína(s) y/o cofactor(es). Un zimógeno es un precursor inactivo de una enzima proteolítica. Tales precursores son generalmente más grandes, aunque no necesariamente más grandes que la forma activa. Con referencia a las serina proteasas, los zimógenos se convierten en enzimas activas por escisión específica que incluye escisión catalítica y autocatalítica, o por unión de un co-factor activante que genera una enzima activa. Por tanto, un zimógeno es una proteína enzimáticamente inactiva que se convierte en una enzima proteolítica por la acción de un activador. La escisión puede efectuarse autocatalíticamente. Los zimógenos, generalmente, son inactivos y pueden convertirse en polipéptidos activos maduros por escisión catalítica o autocatalítica de la prorregión del zimógeno.
55 Como se usa en este documento, una “prorregión”, “propéptido” o “prosecuencia” se refiere a una región o un segmento que se escinde para producir una proteína madura. Esto puede incluir segmentos que funcionan para suprimir la actividad enzimática enmascarando la maquinaria catalítica y, por tanto, previniendo la formación del producto intermedio catalítico (es decir, ocluyendo estéricamente el sitio de unión a sustrato). Una prorregión es una secuencia de aminoácidos posicionada en el extremo amino de un polipéptido biológicamente activo maduro y puede tener tan sólo algunos aminoácidos o puede ser una estructura multidominio.
Como se usa en este documento, una secuencia de activación se refiere a una secuencia de aminoácidos en un zimógeno que son el sitio requerido para la escisión por activación o escisión por maduración para formar una
65 proteasa activa. La escisión de una secuencia de activación puede catalizarse autocatalíticamente o por componentes de activación.
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sustratos más. Por ejemplo, la especificidad por sustrato de una proteasa por sustratos competentes o de proteasas competentes por un sustrato puede compararse comparando kcat/Km. Por ejemplo, una proteasa que tiene una constante de especificidad de 2 x 106 M-1 s-1 para un sustrato diana y 2 x 104 M-1s-1 para un sustrato no diana es más específica por el sustrato diana. Usando las constantes de especificidad de antes, la proteasa tiene una relación de
5 especificidades por sustrato de 100 por la proteasa diana.
Como se usa en este documento, la preferencia por un sustrato diana puede expresarse como una relación de especificidades por sustrato. El valor particular de la relación que refleja una preferencia es una función de los sustratos y proteasas en cuestión. Una relación de especificidades por sustrato que es mayor a 1 significa una preferencia por un sustrato diana y una especificidad por sustrato inferior a 1 significa una preferencia por un sustrato no diana. Generalmente, una relación de al menos o aproximadamente 1 refleja una diferencia suficiente para que una proteasa se considere un agente terapéutico candidato.
Como se usa en este documento, especificidad alterada se refiere a un cambio en la especificidad por sustrato de
15 una proteasa modificada o seleccionada en comparación con una proteasa natural o molde de partida. Generalmente, el cambio en la especificidad es un reflejo del cambio en la preferencia de una proteasa modificada por un sustrato diana en comparación con un sustrato natural de la proteasa molde (denominado en lo sucesivo en este documento un sustrato no diana). Normalmente, las proteasas modificadas o proteasas seleccionadas proporcionadas en este documento presentan un aumento de la especificidad por sustrato por uno cualquiera o más secuencias de escisión predeterminadas o deseadas de una proteína diana en comparación con la especificidad por sustrato de una proteasa molde. Por ejemplo, una proteasa modificada o proteasa seleccionada que tiene un relación de especificidades por sustrato de 100 para un sustrato diana frente a un sustrato no diana presenta un aumento de 10 veces en la especificidad en comparación con una proteasa estructural con un relación de especificidades por sustrato de 10. En otro ejemplo, una proteasa modificada que tiene un relación de
25 especificidades por sustrato de 1 en comparación con una relación de 0,1 presenta un aumento 10 de veces en la especificidad por sustrato. Para presentar el aumento de especificidad en comparación con una proteasa molde, una proteasa modificada tiene 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces o una especificidad por sustrato mayor por uno cualquiera de más de los sustratos diana predeterminados.
Como se usa en este documento, “selectividad” puede usarse indistintamente con especificidad cuando se refiere a la capacidad de una proteasa para elegir y escindir un sustrato diana de entre una mezcla de sustratos competentes. El aumento de selectividad de una proteasa por un sustrato diana en comparación con cualquier uno o más sustratos diana puede determinarse, por ejemplo, comparando las constantes de especificidad de escisión del
35 sustratos diana por una proteasa. Por ejemplo, si una proteasa tiene una constante de especificidad de escisión de 2 x 106 M-1s-1 para un sustrato diana y 2 x 104 M-1s-1 para cualquier otro de más sustratos, la proteasa es más selectiva por el primer sustrato diana.
Como se usa en este documento, actividad se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o porción del mismo asociado a una proteína de longitud completa (completa). Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad para unirse a o competir con un polipéptido para unirse a un anticuerpo anti-polipéptido), inmunogenicidad, capacidad para formar multímeros, y la capacidad para unirse específicamente a un receptor o ligando para el polipéptido.
45 Como se usa en este documento, actividad catalítica o actividad de escisión se refiere a la actividad de una proteasa como se evalúa en ensayos proteolíticos in vitro que detectan la proteolisis de un sustrato seleccionado. La actividad de escisión puede medirse evaluando la eficiencia catalítica de una proteasa.
Como se usa en este documento, actividad hacia un sustrato diana se refiere a la actividad de escisión y/o actividad funcional, u otra medición que refleja la actividad de una proteasa en o hacia un sustrato diana. La actividad de escisión puede medirse evaluando la eficiencia catalítica de una proteasa. Para los fines en este documento, una actividad es elevada si una proteasa presenta mayor proteolisis o escisión de un sustrato diana y/o modula (es decir, activa o inhibe) una actividad funcional de una proteína de sustrato diana con respecto a la ausencia de la proteasa.
55 Como se usa en este documento, serina proteasa o serina endopeptidasas se refiere a una clase de peptidasas que se caracteriza por la presencia de un residuo de serina en el centro activo de la enzima. Las serina proteasas participan en una amplia gama de funciones en el cuerpo, que incluyen coagulación de la sangre, inflamación, además de enzimas digestivas en procariotas y eucariotas. El mecanismo de escisión por “serina proteasas” se basa en el ataque nucleófilo de un enlace peptídico elegido como diana por una serina. Las moléculas de cisteína, treonina o agua asociadas a aspartato o metales también pueden desempeñar esta función. Las cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato forman una tríada catalítica común a la mayoría de las serina proteasas. El sitio activo de las serina proteasas tiene forma de una hendidura a la que se une el sustrato de polipéptido. Serina proteasas a modo de ejemplo incluyen activador del plasminógeno urinario (u-PA) expuesto en SEC ID Nº: 433 y MT-SP1 expuesta en SEC ID Nº: 253, y porciones catalíticamente activas de los mismos, por ejemplo, el dominio de
65 proteasa MT-SP1 (también llamado la cadena B) expuesto en SEC ID Nº: 505.
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aminoácidos. No más del 10% (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de prueba se diferencian de los del polipéptido de referencia. Pueden hacerse comparaciones similares entre polinucleótidos de prueba y de referencia. Tales diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales al azar distribuidas sobre la longitud completa de un polipéptido, o pueden agruparse en una o más localizaciones de longitud variable hasta la máxima
5 permisible, por ejemplo, 10/100 diferencias de aminoácidos (aproximadamente el 90% de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o de aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades superiores a aproximadamente el 85-90%, el resultado debería ser independiente del programa y el conjunto de parámetros del hueco; tales altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente frecuentemente por alineamiento manual sin basarse en software.
Como se usa en este documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud e/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Normalmente, dos o más secuencias que están relacionadas el 50% o más de identidad están alineadas. Un conjunto alineado de secuencias se refiere a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y puede incluir
15 alinear secuencias derivadas de ARN tales como EST y otros ADNc, alineados con la secuencia de ADN genómico.
Como se usa en este documento, “cebador” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar de punto de iniciación de la síntesis de ADN dirigida con molde bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro nucleósido trifosfatos diferentes y un agente de polimerización tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que ciertas moléculas de ácidos nucleicos pueden servir de “sonda” y de “cebador”. Sin embargo, un cebador tiene un grupo hidroxilo en 3' para la extensión. Un cebador puede usarse en una variedad de procedimientos que incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (RT)-PCR, PCR de ARN, LCR, PCR múltiplex, PCR de mango de sartén, PCR de captura, PCR de expresión, RACE en 3' y 5', PCR in situ, PCR mediada por ligación y
25 otros protocolos de amplificación.
Como se usa en este documento, “par de cebadores” se refiere a un conjunto de cebadores que incluyen un cebador en 5' (en la dirección 5') que se hibrida con el extremo 5' de una secuencia que va a amplificarse (por ejemplo, por PCR) y un cebador en 3' (en la dirección 3') que se hibrida con el complemento del extremo 3' de la secuencia que va a amplificarse.
Como se usa en este documento, “se hibrida específicamente” se refiere a hibridar, por emparejamiento de bases complementarias, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) con una molécula de ácido nucleico diana. Aquellos expertos en la materia son familiares con los parámetros in vitro e in vivo que afectan la
35 hibridación específica tales como longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes para la hibridación in vitro incluyen adicionalmente temperatura de hibridación y de lavado, composición del tampón y concentración de sales. Las condiciones de lavado a modo de ejemplo para eliminar moléculas de ácidos nucleicos no específicamente unidas a alta rigurosidad son 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS, 65ºC, y a rigurosidad media son 0,2 x SSPE, 0,1% de SDS, 50ºC. En la técnica se conocen condiciones de rigurosidad equivalentes. El experto puede ajustar fácilmente estos parámetros para lograr la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para una aplicación particular.
Como se usa en este documento, sustancialmente idéntico a un producto significa suficientemente similar de manera que la propiedad de interés sea suficientemente invariable de manera que el producto sustancialmente
45 idéntico pueda usarse en lugar del producto.
Como se usa en este documento, también se entiende que los términos “sustancialmente idéntico” o “similar” varían con el contexto como es entendido por aquellos expertos en la materia relevante.
Como se usa en este documento, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce naturalmente mediante mutación, y puede producir polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado), o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos alterada. El término “variante alélica” también se usa en este documento para denotar 55 una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Normalmente, la forma de referencia del gen codifica una forma natural y/o forma predominante de un polipéptido de una población o miembro de referencia único de una especie. Normalmente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre dos especies y entre especies, normalmente tienen al menos el 80%, 90% de identidad o mayor de aminoácidos con una forma natural y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es entre especies o intraespecie. Generalmente, las variantes alélicas intraespecie tienen al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%
o el 95% de identidad o mayor con una forma natural y/o predominante que incluye el 96%, 97%, 98%, 99% de identidad o mayor con una forma natural y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en este documento se refiere generalmente a variaciones de proteínas entre miembros de la misma especie.
65 Como se usa en este documento, “alelo”, que se usa indistintamente en este documento con “variante alélica”, se refiere a formas alternativas de un gen o porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en
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se produce entre los aminoácidos R (PI) y M (P1'). La modificación de cualquiera o más de los aminoácidos de la secuencia VSARM puede hacerse para modificar la secuencia de escisión de PAI-I para seleccionar proteasas con especificidad alterada. El Ejemplo 1 ejemplifica la modificación de PAI-I en el que la secuencia VSARM en el bucle del sitio reactivo se modifica para ser RRARM (SEC ID Nº: 379). En otro ejemplo, el bucle del sitio reactivo de la
5 secuencia VSARM puede modificarse a la PFGRS del sustrato de péptido eficiente conocido (SEC ID Nº: 389). Tal PAI-1 mutante a modo de ejemplo se expone en SEC ID Nº: 610 y 611.
En otro ejemplo, las modificaciones pueden hacerse en el RSL de antitrombina III (AT3). Por ejemplo, P4-P1' de AT3 es IAGRSL (SEC ID Nº: 478), en la que la escisión se produce entre los aminoácidos R (PI) y S (P1'). La 10 modificación de uno cualquiera o más de los aminoácidos de la secuencia IAGRSL puede hacerse para modificar la secuencia de escisión de AT3 para seleccionar proteasas con especificidad alterada. Los Ejemplos 6 y 7 ejemplifican la modificación de AT3 en la que la secuencia IAGRSL en el bucle del sitio reactivo se modifica para ser RRVRKE (SEC ID Nº: 498). En otro ejemplo, la secuencia de aminoácidos IAGRSL en el bucle del sitio reactivo puede modificarse a SLGRKI (SEC ID Nº: 479). Se hicieron otros polipéptidos de AT3 modificados que contienen el
15 reemplazo de la secuencia de aminoácidos IAGRSL con la secuencia de aminoácidos SKGRSL (SEC ID Nº: 501) o la secuencia de aminoácidos PRFKII (SEC ID Nº: 503). Tales moléculas de AT3 mutantes a modo de ejemplo se exponen en cualquiera de SEC ID Nº: 497, 499, 500 y 502.
Alternativamente, y si fuera necesario, la modificación en una cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos
20 P4-P2' puede hacerse de una en una, de dos en dos, de tres en tres, etc., y la serpina modificada resultante puede probarse por separado en rondas sucesivas de selección de manera que se optimice para proteasas que presentan especificidad y/o selectividad por sustrato en cada una de las posiciones modificadas.
En la mayoría de los casos, los residuos de aminoácidos que sustituyen residuos de aminoácidos en el bucle del
25 sitio reactivo de una serpina natural, o secuencia análoga en otra captura de proteasas, se eligen basándose en secuencias de escisión en un sustrato diana deseado. Una proteína de sustrato diana es una que normalmente participa en una patología en la que la escisión de la proteína diana en una secuencia de sustrato dada sirve de tratamiento para la patología (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. nº US 2004/0146938, US2006/0024289, US2006/0002916, y la solicitud provisional nº de serie 60/729.817). Por ejemplo, la proteína diana
30 puede ser una que participa en artritis reumatoide (es decir, TNFR), septicemia (es decir, proteína C), tumorigenicidad (es decir, un receptor del factor de crecimiento tal como VEGFR) o inflamación (es decir, una proteína del complemento). Un sustrato diana también puede ser una proteína vírica de forma que, tras la escisión de la proteína vírica, los virus no podrían infectar células. La siguiente Tabla 5 expone a modo de ejemplo sustratos diana.
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TABLA 5: Sustratos diana a modo de ejemplo
Diana
Indicación Clase de molécula
IL-5/IL-5R
Asma Citocina
IL-1/IL-1R
Asma, inflamación, trastornos reumáticos Citocina
IL-13/IL-13R
Asma Citocina
IL-12/IL-12R
Trastornos inmunológicos Citocina
IL-4/IL-4R
Asma Citocina
TNF/TNFR
Asma, enfermedad de Crohn, infección por el VIH, inflamación, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino Citocina
CCR5/CXCR4
Infección por el VIH GPCR
gp120/gp41
Infección por el VIH Proteína de fusión
CD4
Infección por el VIH Inmunorreceptor
Hemaglutinina
Infección por gripe Proteína de fusión
Proteína de fusión de RSV
Infección por RSV Proteína de fusión
B7/CD28
Trastorno de injerto frente a huésped, artritis reumatoide, rechazo de trasplante, diabetes mellitus Inmunorreceptor
IgE/IgER
Trastorno de injerto frente a huésped, rechazo de trasplante Receptor de anticuerpo
CD2, CD3, CD4, CD40
Trastorno de injerto frente a huésped, rechazo de trasplante, psoriasis Inmunorreceptor
IL-2/ IL-2R
Trastornos autoinmunitarios, trastornos de injerto frente a huésped, artritis reumatoide Citocina
VEGF, FGF, EGF, TGF
Cáncer Factor de crecimiento
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TABLA 5: Sustratos diana a modo de ejemplo
Diana
Indicación Clase de molécula
HER2/Neu
Cáncer (es decir, cáncer de mama) Receptor de factores de crecimiento
CCR1
Esclerosis múltiple GPCR
CXCR3
Esclerosis múltiple, artritis reumatoide GPCR
CCR2
Aterosclerosis, artritis reumatoide GPCR
Src
Cáncer, osteoporosis Cinasa
Akt
Cáncer Cinasa
Bcl-2
Cáncer Proteína-proteína
BCR-Abl
Cáncer Cinasa
GSK-3
Diabetes Cinasa
Cdk-2/cdk-4
Cáncer Cinasa
EGFR
Cáncer de pulmón, mama, vejiga, próstata, colorrectal, riñón, cabeza y cuello
VEGFR-1, VEGFR2
Cáncer de cuello Receptor de factores de crecimiento
Complemento
Enfermedades inflamatorias Inmunomoléculas
Los sitios de escisión dentro de proteínas diana son conocidos o pueden identificarse fácilmente. Los sitios de escisión dentro de las proteínas diana se identifican por los siguientes criterios: 1) se localizan en la superficie expuesta de la proteína; 2) se localizan en regiones que carecen de estructura secundaria (es decir, no en hojas P 5 de hélices), como se ha determinado por estructura atómica de algoritmos de predicción de estructura (estas regiones tienden a ser bucles sobre la superficie de proteínas o tallo sobre receptores de la superficie celular); 3) se localizan en sitios que es probable que inactiven (o activen) la proteína, basándose en su función conocida. Las secuencias de escisión tienen, por ejemplo, cuatro residuos de longitud (es decir, posiciones P1-P4) para coincidir con la especificidad por sustrato extendida de proteasas, pero pueden ser más largas o más cortas. Por ejemplo, los 10 residuos de aminoácidos P4-P1 para una secuencia de escisión en el factor de complemento C2 son SLGR (SEC ID Nº: 431), pero también pueden representarse como la secuencia P4-P2' de SLGRKI (SEC ID Nº: 479), en la que la escisión se produce entre la posición P1 y P1' (es decir, entre R/K). Por tanto, uno cualquiera o más residuos dentro de una secuencia de escisión, que incluyen uno cualquiera o más de los residuos P4-P2', que incluyen P4-P1, pueden introducirse en un polipéptido de captura de proteasas tal como en el RSL de una serpina para generar un
15 polipéptido de captura de proteasas mutantes.
Las secuencias de escisión pueden identificarse en un sustrato diana mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. publicada nº US 2004/0146938). En un ejemplo, la escisión de un sustrato diana se determina incubando el sustrato diana con cualquier proteasa conocida por escindir el sustrato. 20 Tras la incubación con la proteasa, la proteína diana puede separarse por SDS-PAGE y pueden identificarse productos degradativos por tinción con un colorante de proteínas tal como azul brillante de Coomassie. Los fragmentos proteolíticos pueden secuenciarse para determinar la identidad de las secuencias de escisión, por ejemplo, la secuencia de escisión de P4-P2' de 6 aminoácidos y, en particular, los residuos de la secuencia de escisión de P4-P1 de cuatro aminoácidos. La Tabla 6 identifica secuencias de escisión correspondientes a las
25 posiciones P4-P1 para sustratos diana a modo de ejemplo.
TABLA 6: Secuencia de escisión para sustratos diana a modo de ejemplo (residuos P4-P1)
Diana
Secuencia de escisión
TNF-
AEAK(406)
TNF-R1
ENVK (407); GTED (408)
TNF-R2
SPTR (409); VSTR (410); STSF (411)
HER-2
KFPD (412); AEQR (413)
EGFR
KYAD (414); NGPK (415)
VEGFR-1
SSAY (416); GTSD (417)
VEGFR-2
AQEK (418); RIDY (419); VLKD (480); LVED (481); WFKD (482); RIYD (483); KVGR (484); RVRK (485); RKTK (486); KTKK (487); TKKR (488); RRVR (489)
C3
REFK (420); GLAR (421); RLGR (422); AEGK (423); QHAR (424); LPSR (425); SLLR (426); LGLA (427); LSVV (428)
C4
HRGR (429)
C2
GATR (430); SLGR (431); VFAK (432)
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EJEMPLO 11
Producción, selección, evaluación e identificación de mutantes de MT-SP1
5 A. Ensayo fluorogénico de mutantes de MT-SP1 de cadena B de la biblioteca de fagémido
Este ejemplo describe un ensayo fluorogénico que se llevó a cabo para analizar la actividad y especificidad de los fagos que llevan el dominio de la proteasa MT-SP1 producidos usando la biblioteca producida como se describe en el Ejemplo 8. La biblioteca de MT-SP1 se preparó como se describe en el Ejemplo 8 anterior, usando la cadena B
10 nativa de MT-SP1 que tiene una serina en lugar de la cisteína en la posición 122 basándose en la numeración de la quimotripsina (SEC ID Nº: 507) como molde. La biblioteca se preparó como se ha descrito antes, usando el vector pMal-C2 y condiciones de PRC propensa a error recomendadas por el proveedor para lograr una velocidad de mutagénesis aproximada del 0,5%. El rendimiento de esta reacción de mutagénesis fue 4 x 109 recombinantes.
15 La selección de fagos basándose en la tasa de interacción con y escisión de la AT3 variante que contiene la secuencia de sustrato diana (en lugar del RCL nativo; como se describe en el Ejemplo 7) se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 9A usando una forma de 96 pocillos de polipropileno. Para esta selección, 1 x 1012 fagos recombinantes se mezclaron con AT3 variante 3,3 nM que llevaba una secuencia de RCL SLGRKI RCL durante 30 minutos. Después de lavar, el fago se eluyó como se describe en el Ejemplo 9A anterior, y se usó para infectar
20 células XL-1 Blue como se describe en el Ejemplo 9B.
Se realizaron rondas sucesivas de selección para enriquecer para la rápida interacción con y escisión de la secuencia de sustrato diana usando procedimientos proporcionados y descritos en este documento. Por ejemplo, los clones seleccionados en la primera ronda se sometieron a una segunda ronda de selecciones como se describe en
25 este documento usando AT3 3,3, 1,1, y 0,33 nM durante una hora como se describe en el Ejemplo 9A(3).
Tras la primera ronda de selección, el sobrenadante de fagos se preparó como en el Ejemplo 9C usando precipitación con PEG de clones seleccionados. Los clones de fago se cribaron usando el procedimiento del Ejemplo 10(B) anterior usando como sustratos fluorogénicos tanto Ac-SLGR-ACC (que contiene secuencia del sitio de 30 escisión diana C2) y Ac-RQAR-ACC (que contiene la secuencia de escisión nativa para el MT-SP1 nativo). Para cada clon, la tasa de fluorescencia (ROF) determinada a partir del ensayo de Ac-SLGR-ACC se comparó con la ROF determinada a partir del ensayo de Ac-RQAR-ACC como medio para comparar la actividad de cada dominio de la proteasa MT-SP1 mutada en la secuencia de sustrato nativa para su actividad en las secuencias de sustrato diana. Las ROF en los ensayos de MT-SP1 mutante también se compararon con la ROF en el ensayo de MT-SP1 (C122S)
35 molde. Los resultados obtenidos con clones individuales se muestran en la siguiente Tabla 21 que enumera números de clones y enumera la tasa de fluorescencia como UFR/s (unidades de fluorescencia relativa por segundo).
Tabla 21: Cribado de fago que lleva el dominio de la proteasa MT-SP1 mutante seleccionado para la tasa de 40 escisión de AT3-SLGRKI
Número de clon de MT-SP1 mutante
Tasa de Ac-SLGR-ACC (UFR/s) Tasa de Ac-RQAR-ACC (UFR/s)
Molde
1,85 15,6
CPC-0019595
7,1 33
CPC-0023085
0,8 2
CPC-0023230
1,3 4
CPC-0023401
3,9 12
CPC-0023949
0,7 2
CPC-0024129
3,8 15
CPC-0024153
2,5 6
CPC-0024527
4,3 12
CPC-0024715
3,2 12
CPC-0025366
1,3 1
CPC-0025387
6,8 14
CPC-0025533
6,9 23
CPC-0025582
1,7 3
CPC-0025720
2,5 5
CPC-0025866
1,2 4
CPC-0025876
4,0 8
112
Número de clon de MT-SP1 mutante
Tasa de Ac-SLGR-ACC (UFR/s) Tasa de Ac-RQAR-ACC (UFR/s)
CPC-0025890
10,6 33
CPC-0025941
1,0 4
CPC-0025974
9,3 41
CPC-0026100
14,8 25
CPC-0026122
6,5 31
CPC-0026125
17,4 84
CPC-0026200
7,0 21
CPC-0026219
8,0 23
CPC-0026232
7,1 15
CPC-0026597
11,0 34
CPC-0026727
0,8 2
CPC-0026761
7,8 25
CPC-0027290
3,9 12
CPC-0027306
11,0 50
CPC-0027309
8,3 50
CPC-0027326
9,1 54
CPC-0027335
12,3 57
CPC-0027369
2,3 11
CPC-0027399
13,4 99
CPC-0027484
2,5 12
CPC-0027516
3,4 17
CPC-0027617
1,4 7
CPC-0027706
0,4 1
CPC-0027718
2,1 7
CPC-0027797
5,5 15
CPC-0027841
2,7 9
CPC-0028017
5,1 16
CPC-0028333
5,6 17
CPC-0028341
5,5 26
B. Identificación de fagos de mutantes de MT-SP1 seleccionados por secuenciación de ADN
Este ejemplo describe un procedimiento usado para la identificación de clones de fagos positivos que se prepararon 5 como se describe en los ejemplos previos y se seleccionaron basándose en los resultados de un ensayo fluorogénico tal como el descrito en el Ejemplo 10B anterior. Para este procedimiento, clones individuales se mezclaron con células XL-1 Blue de E. coli para la infección y los cultivos se cultivaron durante la noche con agitación a 37ºC. El ADN de plásmido se purificó del cultivo durante la noche usando un kit de preparación de plásmidos (Qiagen), y el ADN se envió para secuenciación para la identificación de los mutantes. 10 En un ejemplo de este procedimiento, las secuencias de aminoácidos de mutantes de MT-SP1 de cadena beta seleccionados del Ejemplo 11A anterior se identificaron usando las etapas explicadas resumidamente anteriormente. El cebador de secuenciación que se usó para la identificación de estos clones se expone en SEC ID Nº: 618: 5'GGTGTTTTCACGAGCACTTC3' . Los resultados obtenidos analizando los datos de secuenciación se exponen en 15 la siguiente Tabla 22. Esta tabla sólo enumera los mutantes con residuos que se ha encontrado que están mutados en más de una cepa aislada. La Tabla 22 enumera las mutaciones/posiciones de aminoácidos para cada clon en comparación con la secuencia de la cadena B de MT-SP1 natural (SEC ID Nº: 505), que se determinó por análisis de datos de secuenciación. La numeración de aminoácidos es según la numeración de la quimotripsina. SEC ID Nº también se enumeran para tanto la secuencia de residuos de aminoácidos que codifica el dominio de la proteasa 20 MT-SP1 (cadenas B) que contiene las mutaciones de aminoácidos indicadas como también para la secuencia de residuos de aminoácidos que codifica la proteína MT-SP1 de longitud completa que tiene las mismas mutaciones.
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