JP2023539632A - 操作されたプロテアーゼバリアント - Google Patents
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- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
Abstract
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、ならびに酸性(pH<7)および塩基性(pH>7)条件を含むある範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および/または栄養目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年8月28日に出願された米国仮出願第63/071,625号に基づく利益を主張する。
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年8月28日に出願された米国仮出願第63/071,625号に基づく利益を主張する。
発明の分野
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含む所定範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含む所定範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式の写しは、EFS-Web経由でASCIIフォーマットのテキストファイルとして、本明細書と同時に提出され、ファイル名は「CX7-210WO2_ST25.txt」であり、作成日は2021年8月27日であり、サイズは約9.07メガバイトである。EFS-Web経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の公式の写しは、EFS-Web経由でASCIIフォーマットのテキストファイルとして、本明細書と同時に提出され、ファイル名は「CX7-210WO2_ST25.txt」であり、作成日は2021年8月27日であり、サイズは約9.07メガバイトである。EFS-Web経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
膵酵素補充療法(PERT)は、膵酵素機能不全(PEI)の処置において用途がある。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵がんを含む様々な障害が、十二指腸への膵酵素の分泌減少の結果としてPEIを生じ得る。その結果、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不適切な吸収がもたらされ、これにより、栄養障害が生じ得る。経口投与されたPERT処置を現在利用できるが、この状態は、胃腸管におけるPERTの不十分な活性および/または現在の処置プロトコールに伴う著しい丸剤服用負担による治療法の不十分な患者服薬遵守が原因で、一部の人々において軽減されない場合がある。一部の場合では、脂肪吸収係数(CFA)および/または窒素吸収係数(CNA)は、健康な患者のものよりも劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。よって、当技術分野には、改善されたPERT処置の必要が依然としてある。
膵酵素補充療法(PERT)は、膵酵素機能不全(PEI)の処置において用途がある。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵がんを含む様々な障害が、十二指腸への膵酵素の分泌減少の結果としてPEIを生じ得る。その結果、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不適切な吸収がもたらされ、これにより、栄養障害が生じ得る。経口投与されたPERT処置を現在利用できるが、この状態は、胃腸管におけるPERTの不十分な活性および/または現在の処置プロトコールに伴う著しい丸剤服用負担による治療法の不十分な患者服薬遵守が原因で、一部の人々において軽減されない場合がある。一部の場合では、脂肪吸収係数(CFA)および/または窒素吸収係数(CNA)は、健康な患者のものよりも劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。よって、当技術分野には、改善されたPERT処置の必要が依然としてある。
発明の概要
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含むある範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および/または栄養目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含むある範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および/または栄養目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたリパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびリパーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも約70%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9、17、29、30、32、34、35、36、37、43、47、50、63、75、77、81、85、92、93、107、127、132、133、135、143、145、147、162、168、187、188、189、200、205、207、208、209、210、212、220、221、222、223、225、228、236、237、238、239、241、244、245、247、257、258、260、261、262、263、265、266、283、294、300、301、307、308、318、319、334、336、339、342、344、345、346、347、355、359、361、362、363、366、368、370、373、398、404、405、406、408、412、424、427、429、431、439、441、442、446、448、449、450、454、468、470、480、481、482、485、489、490、495、497、501、504、505、506、508、511、512、514、516、523、526、527、529、533、535、536E、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、552、553、554、555、556、558、559、560、565、566、567、568、570、571、573、575、577、580、581、582、583、586、589、591、592、594、596、599、601、604、609、610、615、616、620、631、632、634、639、643、644、645、646、647、648A、649、650、652、653、654、659、661、662、663、664、665および666から選択される位置に1個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236、258、261、339、439、446および454から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236V、258K、261L、339M、339W、439M、446A、446G、446L、446M、446Tおよび454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M236V、Q258K、E261L、N339M、N339W、S439M、P446A、P446G、P446L、P446M、P446TおよびA454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、107/536、162/408、168/547、208/366/504/591、208/485/526、210/223/258/552、210/241/258/599、223/241/258/599、223/429/481/533、223/481/533/552、225、225/260/263/265/544、225/262、225/362/366/591、225/366、225/482/591、244、258、258/318/429、258/449/481、258/481、261、261/504、318/481、318/533、318/599、339、342、345、362/366/485/591、363、366、366/485、366/497、366/526/591、366/591、408、427、446、448、449、450、481/533/552、482、482/485、482/591、485、485/591、533、533/552、536、544、547、549、565、615および652から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、107T/536D、162I/408R、168N/547V、208T/366G/504P/591L、208T/485D/526L、210D/223R/258K/552N、210D/241P/258K/599L、223R/241P/258K/599L、223R/429L/481S/533K、223R/481S/533K/552N、225A/260D/263H/265R/544R、225A/262L、225A/362T/366G/591L、225A/366G、225A/482V/591L、225K、244K、258K、258K/318D/429L、258K/449V/481S、258K/481S、258R、261G、261G/504V、261L、261R、261S、261V、318D/481S、318D/533K、318D/599L、339F、339W、342R、345W、362T/366G/485D/591L、363E、363W、366A、366G、366G/485D、366G/497R、366G/526L/591L、366G/591L、366L、366Q、408R、427H、427R、446R、446V、448K、448R、448W、449K、450W、481S/533K/552N、482V、482V/485D、482V/591L、485D、485D/591L、533A、533D、533E、533K、533K/552N、533N、536E、536G、536V、544R、547A、547E、549T、565C、565D、615A、615D、615G、615P、615T、615Wおよび652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M107T/Q536D、T162I/A408R、S168N/Q547V、A208T/N366G/Q504P/K591L、A208T/N485D/R526L、N210D/N223R/Q258K/K552N、N210D/E241P/Q258K/D599L、N223R/E241P/Q258K/D599L、N223R/K429L/A481S/M533K、N223R/A481S/M533K/K552N、T225A/N260D/R263H/G265R/T544R、T225A/P262L、T225A/N362T/N366G/K591L、T225A/N366G、T225A/R482V/K591L、T225K、R244K、Q258K、Q258K/Q318D/K429L、Q258K/A449V/A481S、Q258K/A481S、Q258R、E261G、E261G/Q504V、E261L、E261R、E261S、E261V、Q318D/A481S、Q318D/M533K、Q318D/D599L、N339F、N339W、L342R、Q345W、N362T/N366G/N485D/K591L、Q363E、Q363W、N366A、N366G、N366G/N485D、N366G/Q497R、N366G/R526L/K591L、N366G/K591L、N366L、N366Q、A408R、P427H、P427R、P446R、P446V、N448K、N448R、N448W、A449K、N450W、A481S/M533K/K552N、R482V、R482V/N485D、R482V/K591L、N485D、N485D/K591L、M533A、M533D、M533E、M533K、M533K/K552N、M533N、Q536E、Q536G、Q536V、T544R、Q547A、Q547E、V549T、N565C、N565D、K615A、K615D、K615G、K615P、K615T、K615WおよびK652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、258、258/261/342/345、258/261/342/504/533、258/261/345/504/549、258/261/482/504/549、258/342、258/342/504/533/536/549、258/345/427、258/408/427/504/549、258/427、258/427/482/504/533/536、258/427/482/536、261/342/345/536、261/342/482/504/533/536、261/342/482/504/549、261/342/482/536、261/342/533、261/482、318/339/362/544/547、318/339/448/544、318/339/547、318/448/544/615、339/362/363/544/547/615、339/362/544、339/448、339/448/547、339/544/547、342、342/408、342/408/536、342/482/536、362/363/544/547、362/448、363/544/547、427/482/504/533/536、427/533/536/549、448、448/544および448/544/547/615から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、258K、258K/261L/342R/345W、258K/261L/342R/504P/533D、258K/261L/345W/504P/549T、258K/261R/482V/504P/549T、258K/342R、258K/342R/504P/533K/536E/549T、258K/345W/427R、258K/408R/427R/504P/549T、258K/427R、258K/427R/482V/504P/533K/536E、258K/427R/482V/536E、261L/342R/345W/536E、261L/342R/482V/504P/533K/536E、261L/342R/533D、261R/342R/482V/504P/549T、261R/342R/482V/536E、261R/482V、318D/339W/362T/544R/547E、318D/339W/448R/544R、318D/339W/547E、318D/448R/544R/615A、339W/362T/363E/544R/547E/615A、339W/362T/544R、339W/448K、339W/448R、339W/448R/547E、339W/544R/547E、342R、342R/408R、342R/408R/536E、342R/482V/536E、362T/363E/544R/547E、362T/448R、363E/544R/547E、427R/482V/504P/533D/536E、427R/533K/536E/549T、448R、448R/544Rおよび448R/544R/547E/615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、Q258K、Q258K/E261L/L342R/Q345W、Q258K/E261L/L342R/Q504P/M533D、Q258K/E261L/Q345W/Q504P/V549T、Q258K/E261R/R482V/Q504P/V549T、Q258K/L342R、Q258K/L342R/Q504P/M533K/Q536E/V549T、Q258K/Q345W/P427R、Q258K/A408R/P427R/Q504P/V549T、Q258K/P427R、Q258K/P427R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、Q258K/P427R/R482V/Q536E、E261L/L342R/Q345W/Q536E、E261L/L342R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、E261L/L342R/M533D、E261R/L342R/R482V/Q504P/V549T、E261R/L342R/R482V/Q536E、E261R/R482V、Q318D/N339W/N362T/T544R/Q547E、Q318D/N339W/N448R/T544R、Q318D/N339W/Q547E、Q318D/N448R/T544R/K615A、N339W/N362T/Q363E/T544R/Q547E/K615A、N339W/N362T/T544R、N339W/N448K、N339W/N448R、N339W/N448R/Q547E、N339W/T544R/Q547E、L342R、L342R/A408R、L342R/A408R/Q536E、L342R/R482V/Q536E、N362T/Q363E/T544R/Q547E、N362T/N448R、Q363E/T544R/Q547E、P427R/R482V/Q504P/M533D/Q536E、P427R/M533K/Q536E/V549T、N448R、N448R/T544RおよびN448R/T544R/Q547E/K615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、505、541、556および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205Q、205T、505A、541R、556V、646Lおよび646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205Q、S205T、Q505A、S541R、T556V、A646LおよびA646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、220、239、261、261/339、261/339/547、261/536、261/536/547、339/427/536、339/427/536/547、339/427/547、405、442、505、539、541、542、545、556、558、594、631、663および665から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205R、220A、239K、261L、261L/339S/547E、261L/339W、261L/536W、261L/536W/547E、339W/427R/536W、339W/427R/536W/547E、339W/427R/547E、405R、442L、442S、505G、539*、541G、541I、542*、545*、545I、545R、556*、558E、594A、631W、663*、663Mおよび665Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205R、S220A、D239K、E261L、E261L/N339S/Q547E、E261L/N339W、E261L/Q536W、E261L/Q536W/Q547E、N339W/P427R/Q536W、N339W/P427R/Q536W/Q547E、N339W/P427R/Q547E、V405R、V442L、V442S、Q505G、P539*、S541G、S541I、I542*、A545*、A545I、A545R、T556*、T558E、V594A、G631W、E663*、E663MおよびP665Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205/442/505/536/545/620/646、205/505/536/541/545/547/558/646/665、258、263、355/536/545/547、359、366、446、449、505/536/545/558/646、506、555、556、620および650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205R/442L/505A/536W/545I/620V/646V、205R/505A/536W/541I/545R/547E/558E/646V/665E、258G、263M、263S、355R/536W/545I/547E、359Y、366S、446P、449L、505A/536W/545I/558E/646V、506R、555D、555G、555L、556G、620L、620Q、620Sおよび650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205R/V442L/Q505A/Q536W/A545I/E620V/A646V、S205R/Q505A/Q536W/S541I/A545R/Q547E/T558E/A646V/P665E、K258G、R263M、R263S、L355R/Q536W/A545I/Q547E、F359Y、N366S、R446P、A449L、Q505A/Q536W/A545I/T558E/A646V、G506R、E555D、E555G、E555L、T556G、E620L、E620Q、E620SおよびI650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、283/319/359/449/450/506、283/345/359/449/450/553/555、283/449/450/508/541/553/555、449/450、450/508/553/555/558、508および508/541/553から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、283H/345C/359Y/449L/450R/553T/555G、283L/319K/359Y/449L/450R/506R、283L/449L/450R/508G/541I/553T/555G、449L/450R、450R/508G/553R/555G/558E、508Gおよび508G/541I/553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N283H/Q345C/F359Y/A449L/N450R/D553T/E555G、N283L/N319K/F359Y/A449L/N450R/G506R、N283L/A449L/N450R/N508G/S541I/D553T/E555G、A449L/N450R、N450R/N508G/D553R/E555G/T558E、N508GおよびN508G/S541I/D553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、205/442/449/450、205/450/536/545、205/450/536/545/646、258/442/446、258/442/449/646、258/450/536/545、308、361、439、442/446/536/545/620/646、442/450/536/545、514、535、577、591、592、610、639、643および644から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205S、205S/442V/449A/450N、205S/450N/536Q/545A、205S/450N/536Q/545A/646A、258Q/442V/446P、258Q/442V/449A/646A、258Q/450N/536Q/545A、308E、361V、439M、442V/446P/536Q/545A/620E/646A、442V/450N/536Q/545A、514H、535R、535V、577V、591R、591V、592P、610L、610P、610S、639E、639K、643E、643Rおよび644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R205S、R205S/L442V/L449A/R450N、R205S/R450N/W536Q/I545A、R205S/R450N/W536Q/I545A/V646A、K258Q/L442V/R446P、K258Q/L442V/L449A/V646A、K258Q/R450N/W536Q/I545A、A308E、I361V、S439M、L442V/R446P/W536Q/I545A/V620E/V646A、L442V/R450N/W536Q/I545A、R514H、E535R、E535V、D577V、K591R、K591V、A592P、A610L、A610P、A610S、A639E、A639K、A643E、A643RおよびD644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、32/490/639、236、236/238/404/480/555/568/592、236/359/404/406/555/639、236/359/490/581/639、236/359/555、236/359/609、236/370/406/568/581、236/370/568/592、236/370/581、236/404/406/480/490、236/404/555/581/609/639、236/568、236/592、236/639、238/359/370/404/490/568/639、245/363/408/512/514/596/666、245/363/512/514/537/560、308/514/535/639/644、359/404、359/404/406/490/546/581、363/408/512/514/537、363/408/601/650、363/639/644、408/512、408/514/537、408/514/560/650、490/568/592/639、512/537/560/601、514/535/546/575/644、514/639/644、514/644、535/575/639/644、535/639/643/644、535/643/644および601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、32T/490E/639T、236V、236V/238I/404G/480L/555Q/568P/592P、236V/359Y/404G/406R/555Q/639T、236V/359Y/490E/581T/639T、236V/359Y/555Q、236V/359Y/609G、236V/370C/406R/568P/581T、236V/370C/568P/592P、236V/370C/581T、236V/404G/406R/480L/490E、236V/404G/555Q/581T/609G/639T、236V/568P、236V/592P、236V/639T、238I/359Y/370C/404G/490E/568P/639T、245S/363K/408V/512N/514H/596T/666D、245S/363K/512N/514H/537P/560S、308E/514H/535R/639K/644A、359Y/404G、359Y/404G/406R/490E/546E/581T、363H/639K/644A、363K/408V/512N/514H/537P、363K/408V/601I/650T、408V/512N、408V/514H/537P、408V/514H/560S/650T、490E/568P/592P/639T、512N/537P/560S/601I、514H/535R/546E/575G/644A、514H/639K/644A、514H/644A、535R/575G/639K/644A、535R/639K/643R/644A、535V/643R/644Aおよび601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、I32T/Q490E/A639T、M236V、M236V/L238I/S404G/I480L/E555Q/L568P/A592P、M236V/F359Y/S404G/K406R/E555Q/A639T、M236V/F359Y/Q490E/S581T/A639T、M236V/F359Y/E555Q、M236V/F359Y/A609G、M236V/S370C/K406R/L568P/S581T、M236V/S370C/L568P/A592P、M236V/S370C/S581T、M236V/S404G/K406R/I480L/Q490E、M236V/S404G/E555Q/S581T/A609G/A639T、M236V/L568P、M236V/A592P、M236V/A639T、L238I/F359Y/S370C/S404G/Q490E/L568P/A639T、T245S/Q363K/A408V/S512N/R514H/M596T/S666D、T245S/Q363K/S512N/R514H/E537P/T560S、A308E/R514H/E535R/A639K/D644A、F359Y/S404G、F359Y/S404G/K406R/Q490E/V546E/S581T、Q363H/A639K/D644A、Q363K/A408V/S512N/R514H/E537P、Q363K/A408V/M601I/I650T、A408V/S512N、A408V/R514H/E537P、A408V/R514H/T560S/I650T、Q490E/L568P/A592P/A639T、S512N/E537P/T560S/M601I、R514H/E535R/V546E/S575G/D644A、R514H/A639K/D644A、R514H/D644A、E535R/S575G/A639K/D644A、E535R/A639K/A643R/D644A、E535V/A643R/D644AおよびM601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236、236/308/370/548、236/308/490/581/643、236/308/555/560/596、236/370、236/370/490/639、236/555、236/560/581、245/359/363/406/535/650、245/363/406/575/601/666、300、301、308、308/490/560/581/639/643、336、359/363/406/535/601/650、359/404/406/535、359/406/575/650/666、359/535/575/601、363/404/406/535/568、404/406/535、406、406/480/535/568/601、406/535/575、468および480/575/601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236V、236V/308E/370C/548E、236V/308E/490E/581T/643R、236V/308E/555Q/560S/596T、236V/370C、236V/370C/490E/639T、236V/555Q、236V/560S/581T、245S/359Y/363K/406R/535R/650T、245S/363K/406R/575G/601I/666D、300F、301V、308E、308E/490E/560S/581T/639T/643R、336W、359Y/363K/406R/535R/601I/650T、359Y/404G/406R/535R、359Y/406R/575G/650T/666D、359Y/535R/575G/601I、363K/404G/406R/535R/568P、404G/406R/535R、406R、406R/480L/535R/568P/601I、406R/535R/575G、468Sおよび480L/575G/601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M236V、M236V/A308E/S370C/D548E、M236V/A308E/Q490E/S581T/A643R、M236V/A308E/E555Q/T560S/M596T、M236V/S370C、M236V/S370C/Q490E/A639T、M236V/E555Q、M236V/T560S/S581T、T245S/F359Y/Q363K/K406R/E535R/I650T、T245S/Q363K/K406R/S575G/M601I/S666D、L300F、A301V、A308E、A308E/Q490E/T560S/S581T/A639T/A643R、Y336W、F359Y/Q363K/K406R/E535R/M601I/I650T、F359Y/S404G/K406R/E535R、F359Y/K406R/S575G/I650T/S666D、F359Y/E535R/S575G/M601I、Q363K/S404G/K406R/E535R/L568P、S404G/K406R/E535R、K406R、K406R/I480L/E535R/L568P/M601I、K406R/E535R/S575G、A468SおよびI480L/S575G/M601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、133/301/346/347/468、205/236/347、205/236/370/490/537/620、205/342/439/442/514/620/639、205/370/537、205/442/505/620、236/258/370/505/545/639、236/339/514、236/370/450/620、236/545、258/339/342/505/537、258/342/370/408/442/537、300/301/308/346/347/468、300/301/347/468、301/308/336/346/406/468/601、301/308/346/406/468、301/308/468/601、301/347/406、308/336/347/468、308/347/468、342、342/408/490/505/514/545/639/646、342/620、370/442、370/537/639、489、539/649、542、543、543/673、558、559、566、634および661から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、133M/301V/346K/347F/468S、205S/236M/347F、205S/236M/370S/490Q/537E/620E、205S/342L/439S/442V/514R/620E/639A、205S/370S/537E、205S/442V/505Q/620E、236M/258Q/370S/505Q/545A/639A、236M/339N/514R、236M/370S/450N/620E、236M/545A、258Q/339N/342L/505Q/537E、258Q/342L/370S/408A/442V/537E、300F/301V/308E/346K/347F/468S、300F/301V/347F/468S、301V/308E/336W/346K/406R/468S/601I、301V/308E/346K/406R/468S、301V/308E/468S/601I、301V/347F/406R、308E/336W/347F/468S、308E/347F/468S、342L、342L/408A/490Q/505Q/514R/545A/639A/646A、342L/620E、370S/442V、370S/537E/639A、489Y、539M/649H、542M、543A、543V/673Y、558R、559H、559S、566G、634Cおよび661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、L133M/A301V/V346K/V347F/A468S、R205S/V236M/V347F、R205S/V236M/C370S/E490Q/P537E/V620E、R205S/R342L/M439S/L442V/H514R/V620E/T639A、R205S/C370S/P537E、R205S/L442V/A505Q/V620E、V236M/K258Q/C370S/A505Q/I545A/T639A、V236M/W339N/H514R、V236M/C370S/R450N/V620E、V236M/I545A、K258Q/W339N/R342L/A505Q/P537E、K258Q/R342L/C370S/V408A/L442V/P537E、L300F/A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、L300F/A301V/V347F/A468S、A301V/A308E/Y336W/V346K/K406R/A468S/M601I、A301V/A308E/V346K/K406R/A468S、A301V/A308E/A468S/M601I、A301V/V347F/K406R、A308E/Y336W/V347F/A468S、A308E/V347F/A468S、R342L、R342L/V408A/E490Q/A505Q/H514R/I545A/T639A/V646A、R342L/V620E、C370S/L442V、C370S/P537E/T639A、D489Y、P539M/D649H、I542M、F543A、F543V/H673Y、T558R、L559H、L559S、T566G、P634CおよびG661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205/236/342/439/505/514/537/545、236/342/505/514/537/545、300/301/308/336/347/468/601、300/301/347/406、301/308/346/347/468、301/336/346/347/406/601および308/336/347/406/468/601から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205S/236M/342L/439S/505Q/514R/537E/545A、236M/342L/505Q/514R/537E/545A、300F/301V/308E/336W/347F/468S/601I、300F/301V/347F/406R、301V/308E/346K/347F/468S、301V/336W/346K/347F/406R/601Iおよび308E/336W/347F/406R/468S/601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R205S/V236M/R342L/M439S/A505Q/H514R/P537E/I545A、V236M/R342L/A505Q/H514R/P537E/I545A、L300F/A301V/A308E/Y336W/V347F/A468S/M601I、L300F/A301V/V347F/K406R、A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、A301V/Y336W/V346K/V347F/K406R/M601IおよびA308E/Y336W/V347F/K406R/A468S/M601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346/511/537、346/511/537/541/543、346/511/542/582、346/511/581/582、346/511/583、346/529/571/581/582/583/589、511/537、516/539/568、537/582、539、568/662/663および581/582から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E、346V/511S/537E/541I/543G、346V/511S/542S/582R、346V/511S/581L/582R、346V/511S/583R、346V/529G/571I/581C/582V/583V/589A、511S/537E、516M/539E/568R、537E/582R、539E、568R/662W/663Wおよび581L/582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E、K346V/A511S/P537E/S541I/F543G、K346V/A511S/I542S/Y582R、K346V/A511S/S581L/Y582R、K346V/A511S/I583R、K346V/V529G/S571I/S581C/Y582V/I583V/T589A、A511S/P537E、P516M/P539E/L568R、P537E/Y582R、P539E、L568R/F662W/E663WおよびS581L/Y582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346/511/537/582、346/511/543/582、346/511/544、346/537/542/544、346/543/544、346/583、511/537/542/582/583、516、516/539/555、537/543/582、539/568、540、542/544/581、548、549、559、559/568、582、647、650および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E/582V、346V/511S/543G/582R、346V/511S/544L、346V/537E/542S/544L、346V/543G/544L、346V/583R、511S/537E/542S/582R/583R、516M、516M/539E/555G、537E/543G/582R、539E/568R、540G、542S/544L/581R、548R、549G、559S、559S/568R、582V、647L、647W、650Gおよび664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E/Y582V、K346V/A511S/F543G/Y582R、K346V/A511S/T544L、K346V/P537E/I542S/T544L、K346V/F543G/T544L、K346V/I583R、A511S/P537E/I542S/Y582R/I583R、P516M、P516M/P539E/E555G、P537E/F543G/Y582R、P539E/L568R、V540G、I542S/T544L/S581R、D548R、V549G、L559S、L559S/L568R、Y582V、Q647L、Q647W、I650GおよびQ664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680もしくは1650に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、261/355/543、261/355/567/568、261/489、261/489/511/568、261/489/539、261/489/567、261/539/543、261/539/543/567、261/542/543/568、511、511/539/543、511/567、543および583から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680もしくは1650に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、261D/355C/543A、261D/355C/567R/568R、261D/489E、261D/489E/511D/568R、261D/489E/539L、261D/489E/567R、261D/539L/543A、261D/539L/543D/567R、261D/542L/543A/568R、511D、511D/539L/543A、511D/567R、543Aおよび583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680もしくは1650に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、L261D/L355C/F543A、L261D/L355C/D567R/L568R、L261D/D489E、L261D/D489E/A511D/L568R、L261D/D489E/P539L、L261D/D489E/D567R、L261D/P539L/F543A、L261D/P539L/F543D/D567R、L261D/I542L/F543A/L568R、A511D、A511D/P539L/F543A、A511D/D567R、F543AおよびI583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9、9/17/34/35/93/554、9/17/50、9/17/93、9/29/35/43/77/542/554、9/32/77/93、9/43/77、9/50/63/93、9/93、17/29/34/35/36/77/93、17/32/34/35、17/77、32/34/93、43、50/77/93、50/93、77/93、93、205/263/470、205/344/470/565、205/345/470/538/664、205/470/545/568/645/647/664、205/470/567/568/645、263/344/664、263/470/645、263/489、263/539/541/568/645、344/355/470/489/645、344/355/470/568/645/647、344/470/489/539/542/645/647/664、344/470/489/567/568、344/470/568、344/470/647、470、470/489、470/541/542/543/565/645/647、470/567/568、470/664および542/543から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9K、9K/17A/34M/35G/93E/554M、9K/17A/50S、9K/17A/93E、9K/29S/35G/43P/77D/542V/554M、9K/32A/77D/93E、9K/43P/77D、9K/50S/63E/93E、9K/93E、9Q/17A/93E、17A/29S/34M/35G/36D/77D/93E、17A/32A/34M/35G、17A/77D、32A/34M/93E、43P、50S/77D/93E、50S/93E、77D/93E、93E、205L/263V/470Q、205L/344V/470Q/565A、205L/345P/470Q/538T/664R、205L/470Q/545L/568R/645S/647W/664R、205L/470Q/567R/568R/645S、263I/344V/664R、263I/470Q/645S、263I/489D、263I/539L/541R/568R/645S、344V/355C/470Q/489D/645S、344V/355C/470Q/568R/645S/647W、344V/470Q/489D/539L/542L/645S/647W/664R、344V/470Q/489D/567R/568R、344V/470Q/568R、344V/470Q/647W、470Q、470Q/489D、470Q/541R/542L/543A/565A/645S/647W、470Q/567R/568R、470Q/664Rおよび542L/543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R9K、R9K/T17A/T34M/E35G/A93E/L554M、R9K/T17A/N50S、R9K/T17A/A93E、R9K/N29S/E35G/S43P/N77D/I542V/L554M、R9K/I32A/N77D/A93E、R9K/S43P/N77D、R9K/N50S/A63E/A93E、R9K/A93E、R9Q/T17A/A93E、T17A/N29S/T34M/E35G/T36D/N77D/A93E、T17A/I32A/T34M/E35G、T17A/N77D、I32A/T34M/A93E、S43P、N50S/N77D/A93E、N50S/A93E、N77D/A93E、A93E、R205L/R263V/P470Q、R205L/N344V/P470Q/N565A、R205L/Q345P/P470Q/S538T/Q664R、R205L/P470Q/I545L/L568R/K645S/Q647W/Q664R、R205L/P470Q/D567R/L568R/K645S、R263I/N344V/Q664R、R263I/P470Q/K645S、R263I/E489D、R263I/P539L/S541R/L568R/K645S、N344V/L355C/P470Q/E489D/K645S、N344V/L355C/P470Q/L568R/K645S/Q647W、N344V/P470Q/E489D/P539L/I542L/K645S/Q647W/Q664R、N344V/P470Q/E489D/D567R/L568R、N344V/P470Q/L568R、N344V/P470Q/Q647W、P470Q、P470Q/E489D、P470Q/S541R/I542L/F543A/N565A/K645S/Q647W、P470Q/D567R/L568R、P470Q/Q664RおよびI542L/F543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9/17/32/34/36/50/77/107/127、9/17/63/77、9/43/93/127、9/63/93/107、17/29/32/34/36/63、29/34/35/77、32/43/93、35/93/145および205/263/489/647から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9K/17A/32A/34M/36D/50S/77D/107K/127S、9K/17A/63E/77D、9K/43P/93E/127S、9K/63E/93E/107K、17A/29S/32A/34M/36D/63E、29S/34M/35G/77D、32A/43P/93E、35G/93E/145Eおよび205L/263V/489D/647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R9K/T17A/I32A/T34M/T36D/N50S/N77D/M107K/G127S、R9K/T17A/A63E/N77D、R9K/S43P/A93E/G127S、R9K/A63E/A93E/M107K、T17A/N29S/I32A/T34M/T36D/A63E、N29S/T34M/E35G/N77D、I32A/S43P/A93E、E35G/A93E/G145EおよびR205L/R263V/E489D/Q647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、188、189、265、266、334、442、454、646および649から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、188W、189A、189P、265R、266E、266G、334I、442V、454L、454M、454S、646I、646M、646R、649Tおよび649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N188W、K189A、K189P、G265R、N266E、N266G、V334I、L442V、A454L、A454M、A454S、V646I、V646M、V646R、D649TおよびD649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、189、266、266/283、546、594および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、189I、266A、266L、266L/283K、266M、266S、266V、266W、266Y、546L、594Aおよび646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K189I、N266A、N266L、N266L/N283K、N266M、N266S、N266V、N266W、N266Y、V546L、V594AおよびV646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、263/470/568、266、470/542/543/664および558/577/594から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、263I/470P/568R、266R、470P/542L/543A/664Qおよび558E/577V/594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R263I/Q470P/L568R、N266R、Q470P/I542L/F543A/R664QおよびT558E/D577V/V594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/35、29/35/342/581/582/664、29/50/511/539/581、35、35/50/205/406/511/581、35/205/511、35/342/346/511/539/581、35/346、35/346/406/511/581/582/664、35/511、35/539、50/342、132、133、143、147、187、188、257、258、263、294、294/441/527、308/342/511/581/582、342、346、398、406/664、429/652、441、441/446/526、446/652、482、505、511、526、527、536、545、581、582、615、620、639、645、646、648、652、654および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29F、29G、29S/35G、29S/35G/342L/581S/582Y/664Q、29S/50S/511S/539L/581S、35D/511S、35G、35G/50S/205S/406R/511S/581S、35G/205S/511S、35G/342L/346V/511S/539L/581S、35G/346V、35G/346V/406R/511S/581S/582Y/664Q、35G/511S、35G/539L、50S/342L、132T、133V、143H、147T、187G、188T、257L、258H、258N、263S、294A、294A/441A/527A、308A/342L/511S/581S/582Y、342F、346V、398G、406R/664Q、429L/652T、441A、441A/446P/526L、441V、446P/652T、482V、505F、505M、511S、526V、527D、527R、536H、536R、545V、581A、581S、582G、582S、582Y、615Q、620E、639E、639I、645E、645G、645W、646G、646R、648Q、648V、652L、652Q、652T、652Y、654C、664G、664Vおよび664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29F、N29G、N29S/E35G、N29S/E35G/R342L/L581S/R582Y/R664Q、N29S/N50S/A511S/P539L/L581S、E35D/A511S、E35G、E35G/N50S/R205S/K406R/A511S/L581S、E35G/R205S/A511S、E35G/R342L/K346V/A511S/P539L/L581S、E35G/K346V、E35G/K346V/K406R/A511S/L581S/R582Y/R664Q、E35G/A511S、E35G/P539L、N50S/R342L、I132T、L133V、E143H、A147T、I187G、N188T、R257L、K258H、K258N、R263S、R294A、R294A/R441A/K527A、E308A/R342L/A511S/L581S/R582Y、R342F、K346V、A398G、K406R/R664Q、K429L/K652T、R441A、R441A/R446P/R526L、R441V、R446P/K652T、R482V、A505F、A505M、A511S、R526V、K527D、K527R、W536H、W536R、I545V、L581A、L581S、R582G、R582S、R582Y、K615Q、V620E、T639E、T639I、K645E、K645G、K645W、V646G、V646R、R648Q、R648V、K652L、K652Q、K652T、K652Y、R654C、R664G、R664VおよびR664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/143/263/266/441/639、29/263/266、29/263/266/441/620、29/266/441、29/441/639、30、37、47/570、75、81、85、92、135、143、143/263/266/639、143/266/441/620/639、168、189/424、237/527、244、258/342/582/648、263、263/266/441、263/266/639、266/441、266/441/620/639、266/620/639、266/639、267、342/526/664、342/545、342/582、429、441、482、495、501、523、526、527、568、570、573、581、582、616、632、648、653および654から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29G/143H/263S/266A/441V/639I、29G/263S/266A、29G/263S/266L/441A/620E、29G/266A/441A、29G/441V/639V、29S、30G、37L、47G/570E、75N、75S、81N、85L、92L、135E、143H/263S/266A/639V、143H/266A/441V/620E/639V、143Q、168E、189Q/424G、237E/527V、244S、258H/342F/582S/648Q、263S/266A/441A、263S/266A/441V、263S/266A/639V、263T、266A/441V/620E/639V、266A/620E/639I、266A/639I、266L/441A、267G、342F/526V/664G、342F/545V、342F/582G、429P、441E、482V、495L、501Q、523V、526E、527E、527L、527M、527R、527T、568P、570E、573T、581T、582F、616T、632Q、648A、653Iおよび654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29G/E143H/R263S/N266A/R441V/T639I、N29G/R263S/N266A、N29G/R263S/N266L/R441A/V620E、N29G/N266A/R441A、N29G/R441V/T639V、N29S、R30G、R37L、E47G/K570E、R75N、R75S、R81N、R85L、P92L、R135E、E143H/R263S/N266A/T639V、E143H/N266A/R441V/V620E/T639V、E143Q、S168E、K189Q/D424G、D237E/K527V、R244S、K258H/L342F/R582S/R648Q、R263S/N266A/R441A、R263S/N266A/R441V、R263S/N266A/T639V、R263T、N266A/R441V/V620E/T639V、N266A/V620E/T639I、N266A/T639I、N266L/R441A、R267G、L342F/R526V/R664G、L342F/I545V、L342F/R582G、K429P、R441E、R482V、I495L、R501Q、M523V、R526E、K527E、K527L、K527M、K527R、K527T、L568P、K570E、K573T、S581T、R582F、K616T、K632Q、R648A、M653IおよびR654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/30、29/30/143/263/482/646、29/30/263、29/30/616/648、29/75/263/568/570/648、29/168/648、29/263/527/568、75、75/143/168/527、75/168、75/616、143、168/247/482/648、168/263/616、168/482/616、168/495/616、263、263/616、429/545、495および527から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29S、29S/30G、29S/30G/143Q/263T/482V/646E、29S/30G/263T、29S/30G/616T/648A、29S/75S/263T/568P/570E/648A、29S/168E/648A、29S/263T/527L/568P、75S、75S/143Q/168E/527L、75S/168E、75S/616T、143Q、168E/247S/482V/648A、168E/263T/616T、168E/482V/616T、168E/495L/616T、263T、263T/616T、429P/545V、495Lおよび527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29S、N29S/R30G、N29S/R30G/E143Q/S263T/R482V/V646E、N29S/R30G/S263T、N29S/R30G/K616T/R648A、N29S/R75S/S263T/L568P/K570E/R648A、N29S/S168E/R648A、N29S/S263T/K527L/L568P、R75S、R75S/E143Q/S168E/K527L、R75S/S168E、R75S/K616T、E143Q、S168E/G247S/R482V/R648A、S168E/S263T/K616T、S168E/R482V/K616T、S168E/I495L/K616T、S263T、S263T/K616T、K429P/I545V、I495LおよびK527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、207、222、266、307、454、535、546、548、580、604および610から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、207R、222T、266K、307L、454L、535V、546R、548S、580C、604Pおよび610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、Q207R、S222T、A266K、Q307L、A454L、E535V、V546R、D548S、H580C、H604PおよびA610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75/168/207/454/568/586/610/648/659、75/168/266/454/546/570/580、75/207/454/570/659、75/207/546/580/648、75/263/454/548/568/604/648、75/266/454、75/454、75/454/546/548/568/604、75/546/548/610/648、168/207/263/454/568/570/604、168/263/266/546/604、168/454/604、207/604/610、209、212、221、223、228、266/454/568、319、373、412/546/554、431、454、454/546/568/570/580、454/546/570、454/570/580/610、454/580、454/659および506から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75S/168E/207R/454L/568P/586V/610R/648A/659T、75S/168E/266K/454L/546R/570E/580C、75S/207R/454L/570E/659T、75S/207R/546R/580C/648A、75S/263T/454L/548S/568P/604P/648A、75S/266K/454L、75S/454L、75S/454L/546R/548S/568P/604P、75S/546R/548S/610R/648A、168E/207R/263T/454L/568P/570E/604P、168E/263T/266K/546R/604P、168E/454L/604P、207R/604P/610R、209V、212S、221I、223Q、228I、228V、266K/454L/568P、319Q、373F、412Y/546L/554M、431T、454I、454L/546R/568P/570E/580C、454L/546R/570E、454L/570E/580C/610R、454L/580C、454L/659Tおよび506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R75S/S168E/Q207R/A454L/L568P/L586V/A610R/R648A/E659T、R75S/S168E/A266K/A454L/V546R/K570E/H580C、R75S/Q207R/A454L/K570E/E659T、R75S/Q207R/V546R/H580C/R648A、R75S/S263T/A454L/D548S/L568P/H604P/R648A、R75S/A266K/A454L、R75S/A454L、R75S/A454L/V546R/D548S/L568P/H604P、R75S/V546R/D548S/A610R/R648A、S168E/Q207R/S263T/A454L/L568P/K570E/H604P、S168E/S263T/A266K/V546R/H604P、S168E/A454L/H604P、Q207R/H604P/A610R、I209V、D212S、L221I、N223Q、T228I、T228V、A266K/A454L/L568P、N319Q、L373F、F412Y/V546L/L554M、P431T、A454I、A454L/V546R/L568P/K570E/H580C、A454L/V546R/K570E、A454L/K570E/H580C/A610R、A454L/H580C、A454L/E659TおよびG506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも85%、80%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75/189/373/582、75/200/212/431/482、75/212/373/431/482、75/212/431/482/568/615/664、75/368/582、75/373/431/526/582、75/431/482/570/604/664、75/632、189/212/431/568/570、200/205/373/431、200/431/482/615/664、200/482/664、212/228/431、212/228/568/570/582/664、212/373/446/482/582、368/373/431、373/431/570/604/664、373/568/632、431、431/604/664、482/582、582および615/652/664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75S/189A/373F/582G、75S/200W/212S/431T/482S、75S/212S/373F/431T/482S、75S/212S/431T/482S/568P/615M/664G、75S/368M/582G、75S/373F/431T/526E/582G、75S/431T/482S/570K/604P/664G、75S/632Q、189A/212S/431T/568P/570K、200W/205S/373F/431T、200W/431T/482S/615M/664G、200W/482S/664W、212S/228V/431T、212S/228V/568P/570K/582G/664W、212S/373F/446F/482S/582G、368M/373F/431T、373F/431T/570K/604P/664W、373F/568P/632Q、431T、431T/604P/664G、482S/582G、582Gおよび615M/652V/664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R75S/K189A/L373F/R582G、R75S/K200W/D212S/P431T/R482S、R75S/D212S/L373F/P431T/R482S、R75S/D212S/P431T/R482S/L568P/K615M/R664G、R75S/K368M/R582G、R75S/L373F/P431T/R526E/R582G、R75S/P431T/R482S/E570K/H604P/R664G、R75S/K632Q、K189A/D212S/P431T/L568P/E570K、K200W/R205S/L373F/P431T、K200W/P431T/R482S/K615M/R664G、K200W/R482S/R664W、D212S/T228V/P431T、D212S/T228V/L568P/E570K/R582G/R664W、D212S/L373F/R446F/R482S/R582G、K368M/L373F/P431T、L373F/P431T/E570K/H604P/R664W、L373F/L568P/K632Q、P431T、P431T/H604P/R664G、R482S/R582G、R582GおよびK615M/K652V/R664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、408/439、439/514、470、470/667、514、514/537および537から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、408A/439S、439S/514R、470G、470G/667D、470P、514R、514R/537Eおよび537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、V408A/M439S、M439S/H514R、Q470G、Q470G/G667D、Q470P、H514R、H514R/P537EおよびP537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27に提供される少なくとも1個の位置における少なくとも1個の突然変異を含み、位置は、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも約80%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396~1362のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含み、配列は、ヒスチジンタグおよびヒスチジンタグに先行する4アミノ酸リンカーを欠く。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、高温および/または低温への曝露後に、参照配列と比較して、より高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、野生型プロテアーゼであり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列は、別の組換えプロテアーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、40~50℃で安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、25℃、37℃、42℃および/または48℃で安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、40~50℃で参照配列よりも安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、25℃、37℃、42℃および/または48℃で参照配列よりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低pH環境において安定し、一方、他の実施形態では、組換えプロテアーゼは、高pH環境において安定し、またさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、中性pH環境において安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低および高pH環境において安定し、一部の追加の実施形態では、プロテアーゼは、低、中性および高pH環境において安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低、高および/または中性pH環境への曝露後に、酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、高、中性および/または低pH環境(複数可)で、参照配列と比較して、より安定している。一部の実施形態では、参照配列は、野生型プロテアーゼであり、一方、他の実施形態では、参照配列は、別の操作されたプロテアーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低、中性および高pH環境において、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、低、中性および高pH環境において、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、7よりも大きいpHで、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、7よりも大きいpHで、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.8で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.8で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、7未満のpHで(すなわち、酸性pH条件またはレベル下で)、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7未満のpHで(すなわち、酸性pH条件またはレベル下で)、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、5未満のpHで、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH4で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.8で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.8で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.26で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.26で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.75で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.75で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7よりもpH6で活性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7よりもpH6で、配列番号2のプロテアーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7よりもpH6で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも活性が高い。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、ペプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、トリプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、キモトリプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも、キモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、キモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、ペプシン、トリプシンおよび/またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。
一部の実施形態では、本発明の組換えプロテアーゼは、自己分解(すなわち、組換えプロテアーゼそれ自体による組換えプロテアーゼのタンパク質分解)に対して抵抗性である。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも自己分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも自己分解に対する抵抗性が高い。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で活性がある。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号2のプロテアーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも活性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、胆汁酸塩への曝露後に、酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、胆汁酸塩への曝露後に、参照配列と比較して、より高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼである。一部の追加の実施形態では、胆汁酸塩は、タウロコール酸塩である。
また一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、野生型プロテアーゼまたは別の組換えプロテアーゼと比較して、2種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2と比較して、2種以上の改善された特性を示し、一方、一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278と比較して、2種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、改善された特性は、酸安定性、アルカリ安定性、酸性pHにおける安定性、アルカリpHにおける安定性、中性pHにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、自己分解抵抗性、酸性pHにおける増加した活性、および少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。一部の実施形態では、改善された特性は、酸安定性、酸性pHにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、自己分解抵抗性、酸性pHにおける増加した活性、および少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。また一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、酸性pHで安定性が高いおよび/もしくは活性が高い、熱安定性が高い、タンパク質分解に対する抵抗性が高い、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で活性が高い。改善された特性のいずれかの組合せが、本発明において用途があることが企図される。本発明が、改善された特性のいずれか具体的な組合せに限定されることは意図されない。さらに、一部の実施形態では、2種の改善された特性が存在し、一方、一部の他の実施形態では、3種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、4種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、5種またはそれを超える改善された特性が存在する。本発明の組換えプロテアーゼが、追加の改善をさらに含むことも企図される。一部の実施形態では、このような追加の改善は、野生型プロテアーゼを上回る利点を提供し、一方、一部の他の実施形態では、追加の改善は、他の組換えプロテアーゼを上回る利点を提供するであろう。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/または活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、少なくとも1種の胆汁酸塩に対する改善された安定性および/またはその存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/または活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、少なくとも1種の胆汁酸塩に対する改善された安定性および/またはその存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、自己分解に対する改善された安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/または活性、改善された熱安定性、自己分解に対する改善された安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性、ならびに少なくとも1種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された安定性ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性、ならびに少なくとも1種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した安定性、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも2種またはそれを超える参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、精製されている。
さらに一部のさらなる実施形態では、プロテアーゼは、食物および/または飲料において安定している。一部の追加の実施形態では、プロテアーゼは、栄養および他の補助食品において安定している。一部の実施形態では、補助食品は、液体であり、一方、他の実施形態では、エマルション、懸濁液または固体である。本発明が、いずれか特定の食物、飲料および/または補助食品形式または形態に限定されることは意図されない。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を提供する。一部の追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列から選択される配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、本明細書に提供される組換えポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、配列番号4~1362および1366~2332に提供される偶数番号の配列に提供される組換えポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えプロテアーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えプロテアーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えプロテアーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332に提供される偶数番号の配列を含むポリペプチド配列を含む。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼをコードする少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。一部の追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される。一部の実施形態では、制御配列は、プロモーターである。一部のさらなる実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼをコードする少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1種の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼをコードする少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される組換えプロテアーゼをコードする少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、一方、一部の代替実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Escherichia coliである。一部の代替実施形態では、宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiaeである。
本発明はまた、少なくとも1種の組換えプロテアーゼを産生する方法であって、組換えポリヌクレオチドによってコードされる組換えプロテアーゼが産生される条件下で、本明細書に提供される少なくとも1種の宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、プロテアーゼを回収するステップをさらに含む。また一部の追加の実施形態では、方法は、プロテアーゼを精製するステップをさらに含む。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物は、医薬組成物を含む。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、膵機能不全の処置に適する。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの非経口注射または注入に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの経口投与に適する。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1種のリパーゼをさらに含む。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物であって、他の使用に適する組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、in vivoまたはin vitroでタンパク質を加水分解するための方法であって、タンパク質および本発明の少なくとも1種の操作されたプロテアーゼを用意するステップと、タンパク質が加水分解される条件下で、タンパク質を少なくとも1種の操作されたプロテアーゼに曝露するステップとを含む方法を提供する。
本発明はまた、対象における膵機能不全の症状を処置および/または予防するための方法であって、膵機能不全を有する対象を確保するステップと、本明細書に提供される医薬組成物を対象に与えるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、膵機能不全の症状は、対象への少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物の投与後に、対象において軽快する。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1種のリパーゼをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1種のアミラーゼをさらに含む。また一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1種のリパーゼおよび少なくとも1種のアミラーゼをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、対象は、膵機能不全の症状を示す対象に要求される食事よりも、そのタンパク質含有量の制限が少ない食事を取ることができる。一部の追加の実施形態では、対象は、ヒト患者である。一部の実施形態では、ヒト患者は、乳児であり、一方、一部の他の実施形態では、ヒト患者は、小児である。また一部のさらなる実施形態では、ヒト患者は、成人であり、一方、一部の代替実施形態では、ヒト患者は、若年成人である。一部の実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。本発明はさらに、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む医薬を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物の使用を提供する。
本発明はまた、タンパク質加水分解のための方法であって、タンパク質および本明細書に提供される少なくとも1種の操作されたプロテアーゼを用意するステップと;操作されたプロテアーゼによってタンパク質が加水分解されるような条件下で、タンパク質を少なくとも1種のそのような操作されたプロテアーゼに曝露するステップとを含む方法を提供する。一部の追加の実施形態では、本発明はまた、タンパク質加水分解のための方法であって、タンパク質および本明細書に提供される少なくとも1種の操作されたプロテアーゼを含む組成物を用意するステップと;組成物の操作されたプロテアーゼによってタンパク質が加水分解されるような条件下で、タンパク質を組成物に曝露するステップとを含む方法を提供する。
発明の説明
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含むある範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼバリアントは、PEI状態のPERT処置における用途がある。一部の追加の実施形態では、プロテアーゼは、腸溶コーティングおよび/またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)を要求しない形式で投与される。本発明はまた、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
略語および定義:
本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、改善された活性、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、自己分解安定性、および酸性(pH<7)条件を含むある範囲のpH条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療目的のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼバリアントは、PEI状態のPERT処置における用途がある。一部の追加の実施形態では、プロテアーゼは、腸溶コーティングおよび/またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)を要求しない形式で投与される。本発明はまた、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびプロテアーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。
略語および定義:
他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。そのような技法は、周知されており、当業者にとって周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されているものと同様または等価の任意の適切な方法および材料が、本発明の実施において用途があるが、一部の方法および材料が、本明細書に記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用される文脈に応じて変動し得るため、本発明が、そのようなものに限定されないことを理解されたい。したがって、直ぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に記載される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。
数的な範囲は、当該範囲を定義する数を包括する。よって、本明細書に開示されている全ての数的範囲は、斯かるより広い数的範囲内に収まる全てのより狭い数的範囲を、あたかも斯かるより狭い数的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかのように、包含することが意図される。本明細書に開示されている全ての最大(または最小)の数的限界が、全てのより低い(またはより高い)数的限界を、あたかも斯かるより低い(またはより高い)数的限界が本明細書に明確に書かれているかのように、含むことも意図される。
用語「約」は、特定の値に許容される誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値範囲の0.05%、0.5%、1.0%または2.0%以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の1、2、3または4標準偏差以内を意味する。
さらに、本明細書に提供される見出しは、本出願を全体として参照することによって得られる本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、直ぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に定義される。そうであるにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下に定義する。
他に指示がなければ、核酸は、左から右へ、5’から3’への方向性で;アミノ酸配列は、左から右へ、アミノからカルボキシへの方向性で、それぞれ書かれる。
本明細書で使用される場合、用語「を含む(comprising)」およびその同語源語は、それらの包括的な意味で(すなわち、用語「を含む(including)」およびその対応する同語源語と等価に)使用される。
本明細書で使用される場合、「EC」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法(Enzyme Nomenclature of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC-IUBMB)を指す。IUBMB生化学分類は、触媒する化学反応に基づく酵素の数的分類系である。
本明細書で使用される場合、「ATCC」は、そのバイオレポジトリ収集物が遺伝子および系統を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)を指す。
本明細書で使用される場合、「NCBI」は、国立生物工学情報センター(National Center for Biological Information)およびその中で提供される配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、用語「プロテアーゼ」(および「プロテイナーゼ」および「ペプチダーゼ」)は、タンパク質を加水分解する多数の酵素を指す。タンパク質の、より小型のポリペプチド単位または単一のアミノ酸への分解に関与する多数のプロテアーゼが存在する。プロテアーゼは、経口摂取したタンパク質の消化、タンパク質異化反応、および細胞シグナル伝達を含む多数の生物学的機能に重要である。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質分解」は、タンパク質および/またはポリペプチドの、より小型のペプチドおよび/またはアミノ酸への分解(例えば、加水分解による)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「自己分解」は、細胞および/または酵素の自己破壊または自己消化を指す。自己分解が関与する例示的な状況は、それ自身の作用による、その構造における、プロテアーゼの分解を含む(すなわち、プロテアーゼは、自身を分解または破壊する)。
本明細書で使用される場合、用語「リパーゼ」は、トリグリセリドのエステル結合を加水分解することにより脂肪の加水分解を触媒する、「リパーゼ」と一般的に称される任意
の酵素を指す。膵リパーゼは、脂肪の、脂肪酸、グリセロールおよび他のアルコールへの分解において重要である。リパーゼは、大部分の生物で、食事由来の脂質の消化、輸送およびプロセシングにおいて必須である。
の酵素を指す。膵リパーゼは、脂肪の、脂肪酸、グリセロールおよび他のアルコールへの分解において重要である。リパーゼは、大部分の生物で、食事由来の脂質の消化、輸送およびプロセシングにおいて必須である。
本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、脂肪酸およびそのエステル、ステロール、プレノール(prenol)、ある特定の難溶性ビタミン、ならびに他の関連化合物を含む、非水溶性巨大分子のクラスを指す。「脂肪」は、脂肪酸エステル(例えば、グリセロールおよび3個の脂肪酸でできたトリグリセリド)で構成された脂質のサブセットである。本発明が、いずれかの具体的な脂質および/または脂肪に限定されることは意図されない。文脈を考慮に入れると、用語「脂肪」および「脂質」は、本明細書で互換的に使用されている。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さにも翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にも関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも2個のアミノ酸のポリマーを表示するように本明細書で互換的に使用されている。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)によって推奨される、その一般的に公知の3文字記号または1文字記号のいずれかで、本明細書で参照される。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に許容される単一文字コードで参照することができる。
本明細書で使用される場合、「操作された」、「組換え」、「天然に存在しない」および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを参照して使用される場合、修飾されなければ自然界に存在し得ない様式で修飾された、または自然界のものと同一であるが、合成材料からおよび/または組換え技法を使用したマニピュレーションによって産生もしくは派生された、材料または当該材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミド等のベクターにクローニングし、E.coli、S.cerevisiae等の所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者にとって周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法が存在する。さらに、多くの商業的分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットを入手することもできる。規定されたアミノ酸における特異的置換(部位指定)、遺伝子の限局された領域における特異的もしくはランダム突然変異(位置指定)、または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発(例えば、飽和突然変異誘発)を行うための方法を利用できる。PCRを使用した一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAの部位指定突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャッフリングおよび化学的飽和突然変異誘発、または当技術分野で公知の他の任意の適切な方法が含まれるがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が、当業者にとって公知である。DNAおよびタンパク質操作のために使用される方法の非限定的な例は、次の特許に提供される:米国特許第6,117,679号;米国特許第6,420,175号;米国特許第6,376,246号;米国特許第6,586,182号;米国特許第7,747,391号;米国特許第7,747,393号;米国特許第7,783,428号;および米国特許第8,383,346号。バリアントが産生された後に、バリアントをいずれか所望の特性(例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減した活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および/または酸性pH安定性等)についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えプロテアーゼポリペプチド」(「操作されたプロテアーゼポリペプチド」、「バリアントプロテアーゼ酵素」および「プロテアーゼバリアント」とも本明細書で称される)は用途がある。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離され得る、人間によるマニピュレーションによって意図的に修飾されたことがない、生物に存在する配列である。
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸の一部(例えば、遺伝子)を指す。
本明細書で使用される場合、「パーセント(%)配列同一性」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較を指すように本明細書で使用されており、比較ウィンドウにわたり2種の最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2種の配列の最適な整列のために、参照配列と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列で発生するかまたは核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いて整列される位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。当業者は、2種の配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。比較のための配列の最適な整列は、例えば、当技術分野で公知の通り、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981])、NeedlemanおよびWunschの相同性整列アルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970])、PearsonおよびLipmanの類似性検索方法(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988])、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理されたインプリメンテーション(例えば、GCG Wisconsin Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、または目視検査によって実行することができる。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの例は、Altschulら(それぞれAltschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990];およびAltschul et al., Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977]を参照)によって記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが含まれるがこれらに限定されない。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)ウェブサイトにより公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列における同じ長さのワードと整列されたときにある正の値の閾値スコアTにマッチするかこれを満たす、クエリー配列における長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対(HSP)を同定することを伴う。Tは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al.、上記を参照)。このような初期近隣ワードヒットは、これを含有するより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットは、累積的整列スコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列のため、パラメーターM(マッチする残基の対のための報酬スコア;常に>0)およびN(ミスマッチする残基のためのペナルティースコア;常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列のために、累積的スコアを計算するためのスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、次の場合に停止される:累積的整列スコアが、その最大達成値から含量Xだけ落ちる;1つもしくは複数の負のスコアリング残基整列の蓄積により、累積的スコアがゼロまたはそれを下回る値になる;またはどちらかの配列の終わりに達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、整列の感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列のための)は、デフォルトとして、11のワード長さ(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長さ(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]を参照)。配列整列および%配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、GCG Wisconsin Softwareパッケージ(Accelrys、Madison WI)におけるBESTFITまたはGAPプログラムを用いることができる。
本明細書で使用される場合、用語「参照配列」は、配列比較のための基盤として使用される、規定された配列を指す。参照配列は、より大型の配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも20個のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも25個の残基の長さ、少なくとも50個の残基の長さ、少なくとも100個の残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、(1)2種の配列の間で同様である配列(すなわち、完全配列の部分)を含むことができ、かつ(2)2種の配列の間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、2種の(またはそれを超える)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は典型的に、「比較ウィンドウ」にわたり2種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列に1個または複数の変化を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、少なくとも約20個の近接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも20個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウにおける配列の部分は、2種の配列の最適な整列のために、参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して、20パーセントまたはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。比較ウィンドウは、20個の近接残基よりも長いことがあり、必要に応じて、30、40、50、100個またはそれよりも長いウィンドウを含む。
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、「に対応して」、「を参照して」または「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合、その指定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的位置によるのではなく、参照配列に対して指名される。例えば、操作されたプロテアーゼのアミノ酸配列等の所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して2種の配列の間の残基マッチを最適化することにより、参照配列と整列することができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それが整列された参照配列に対して為される。
本明細書で使用される場合、用語「突然変異」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の任意の変化を指す。これは、配列に存在するいずれかの数(すなわち、1個または複数)の置換、挿入、欠失および/または再編成(すなわち、出発または参照配列と比較して)を包含することが意図される。よって、配列における突然変異は、本明細書に提供されるバリアントポリペプチド(例えば、バリアントまたは組換えプロテアーゼ)の産生をもたらす。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差」または「残基差」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の差を指す。アミノ酸差の位置は一般に、「Xn」と本明細書で称され、nは、残基差が基づく参照配列における対応する位置を指す。例えば、「配列番号2と比較した位置X92における残基差」は、配列番号2の位置92に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差を指す。よって、配列番号2の参照ポリペプチドが、位置92にスレオニンを有する場合、「配列番号2と比較した位置X92における残基差」は、配列番号2の位置92に対応するポリペプチドの位置にスレオニン以外のアミノ酸残基が存在する(例えば、T92A)ことを意味する。本明細書における大部分の例では、ある位置における具体的なアミノ酸残基差は、「XnY」として指し示され、「Xn」は、上に記載されている通りの対応する位置を指定し、「Y」は、操作されたポリペプチドに見出されるアミノ酸(すなわち、参照ポリペプチドのものとは異なる残基)の単一文字識別子である。一部の例では(例えば、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27において)、本開示はまた、従来の表示法「AnB」によって表示される具体的なアミノ酸差を提供し、Aは、参照配列における残基の単一文字識別子であり、「n」は、参照配列における残基位置の番号であり、Bは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の単一文字識別子である。一部の例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて1個または複数のアミノ酸残基差を含むことができ、これは、参照配列と比べて残基差が存在する指定の位置のリストによって指し示される。一部の実施形態では、2個以上のアミノ酸が、ポリペプチドの具体的な残基位置において使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「/」によって分離される(例えば、X446A/X446G/X446MまたはX446A/G/MまたはP446A/G/M)。一部の実施形態では、酵素バリアントは、2個以上の置換を含む。これらの置換は、読み易くするためにスラッシュによって分離される(例えば、V408A/M439S)。本出願は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか一方/または両方を含む1個または複数のアミノ酸差を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、残基の、同様の側鎖を有する異なる残基による置換を指し、よって、典型的に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは同様の規定されたクラス内のアミノ酸による置換が関与する。限定ではなく例として、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸により置換され得る(例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン);ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸により置換される(例えば、セリンおよびスレオニン);芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される(例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン);塩基性側鎖を有するアミノ酸は、基準(basis)側鎖を有する別のアミノ酸により置換される(例えば、リシンおよびアルギニン);酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸);および/または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸により置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、規定された群内ではなく規定された群間のアミノ酸を使用することができ、(a)置換の区域におけるペプチド骨格の構造(例えば、グリシンに代えたプロリン)、(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の容積に影響を与える。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸により置換された酸性アミノ酸;小型のアミノ酸により置換された芳香族アミノ酸;および疎水性アミノ酸により置換された親水性アミノ酸であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「欠失」は、参照ポリペプチドからの1個または複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドに対する修飾を指す。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持しながらおよび/または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する1個もしくはそれを超えるアミノ酸、2個もしくはそれを超えるアミノ酸、5個もしくはそれを超えるアミノ酸、10個もしくはそれを超えるアミノ酸、15個もしくはそれを超えるアミノ酸または20個もしくはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸の総数の最大10%、またはアミノ酸の総数の最大20%の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および/または末端部分を指向することができる。様々な実施形態では、欠失は、連続的セグメントを含み得る、または不連続であり得る。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の文脈で使用されるアステリスク(*)は、ポリヌクレオチド配列内の停止コドンの存在を指し示す。一部の実施形態では、バリアントプロテアーゼは、停止コドンの存在により、出発または参照配列と比較してトランケートされる。
本明細書で使用される場合、用語「挿入」は、参照ポリペプチドからの1個または複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドに対する修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分に、またはカルボキシもしくはアミノ末端に為すことができる。挿入は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知の通りの融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の近接セグメントであり得る、または天然に存在するポリペプチドにおけるアミノ酸のうち1個または複数によって分離され得る。
「機能的断片」および「生物活性がある断片」は、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端欠失(複数可)ならびに/または内部欠失を有するが(例えば、配列はトランケートされている)、残っているアミノ酸配列が、比較されている配列(例えば、全長の本発明の操作されたプロテアーゼ)における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指すように本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それに天然で付随する他の夾雑物(例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド)から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはin vitro合成)から除去または精製されたポリペプチドを包含する。組換えプロテアーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得る、細胞培地中に存在し得る、またはライセートもしくは単離された調製物等の様々な形態で調製され得る。したがって、一部の実施形態では、組換えプロテアーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然で付随する少なくとも1種の他の構成成分から除去された分子(例えば、単離された核酸、ポリペプチド等)または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求するものではなく、むしろ、相対的な定義として意図される。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である(すなわち、モル濃度または重量基盤で、組成物における他のいずれの個々の巨大分子種よりも豊富である)組成物を指し、一般に、対象種が、モルまたは%重量で存在する巨大分子種の少なくとも約50パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なプロテアーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは%重量で全巨大分子種の約60%またはそれよりも多く、約70%またはそれよりも多く、約80%またはそれよりも多く、約90%またはそれよりも多く、約95%またはそれよりも多く、および約98%またはそれよりも多くを構成する。一部の実施形態では、対象種は、出発調製物から、組成物が単一の巨大分子種から本質的になる本質的均一性(すなわち、従来の検出方法によって組成物において夾雑物種を検出することができない)となるまで精製される。溶媒種、小分子(<500ダルトン)および元素イオン種は、巨大分子種と考慮されない。一部の実施形態では、単離された組換えプロテアーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。一部の実施形態では、実質的に純粋な組換えプロテアーゼポリペプチド調製物は、本発明における使用に適切な製剤に添加される(例えば、多糖、界面活性物質等)。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」および「改善された特性」は、参照プロテアーゼポリペプチドと比較した、および/または野生型プロテアーゼポリペプチドもしくは別の操作されたプロテアーゼポリペプチドとしての、いずれかの酵素特性における改善を含む、操作されたプロテアーゼポリペプチドの特性を指す。改善された特性は、増加したタンパク質発現、増加した熱活性(thermoactivity)、増加した熱安定性、増加したpH活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終産物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性または塩基性pHに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性(すなわち、タンパク質分解に対する低減した感受性)、低減した凝集、増加した溶解性、低減した免疫原性、改善された翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)および変更された温度プロファイル等の特性が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」または「増強された触媒活性」は、参照プロテアーゼ酵素と比較した、比活性(例えば、産生された産物/時間/重量タンパク質)の増加または基質から産物へのパーセント変換の増加(例えば、指定の量のプロテアーゼを使用した指定の期間における出発量の基質から産物へのパーセント変換)によって表すことができる、操作されたプロテアーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供される。Km、Vmaxまたはkcatの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれかの特性が影響され得、その変化は、増加した酵素活性を生じ得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約1.1倍から、プロテアーゼポリペプチドが派生された天然に存在するプロテアーゼまたは別の操作されたプロテアーゼの2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍またはそれを超える酵素活性もの大きさであり得る。
プロテアーゼ活性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法(例えば、反応物または産物の分光光度的特性の変化のモニタリング等の標準アッセイ)によって測定することができる。一部の実施形態では、産生された産物の量は、ENZCHEK(商標)プロテアーゼアッセイキット(ThermoFisher)等の蛍光に基づくアッセイを使用して測定することができ、一方、一部の他の実施形態では、産物は、当技術分野で公知の代替方法を使用して測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書で詳細にさらに記載される通り、酵素の規定される調製物、設定条件下での規定されるアッセイ、および1個または複数の規定される基質を使用して為される。
本明細書で使用される場合、用語「プロテアーゼに安定」および「タンパク質分解に対する安定性」は、機能し、任意のタンパク質分解酵素または他のタンパク質分解化合物もしくは因子によって媒介されるタンパク質分解に耐え、プロテアーゼによる処置後にその機能を保持するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。この用語が、タンパク質の安定性を評価するためのいずれか特定のプロテアーゼの使用に限定されることは意図されない。実際に、本発明の操作されたプロテアーゼは、様々なプロテアーゼの存在下で安定しており、酵素活性を保持する。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシンおよび/またはペプシンの存在下で安定している。しかし、本発明が、いずれかの具体的なプロテアーゼや、タンパク質分解安定性を評価するいずれか特定の方法に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、用語「pH安定性」は、特定のpHでのインキュベーション後に機能するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。一部の実施形態では、本発明は、pH2~pH7の範囲を含むがこれに限定されない、ある範囲のpHで安定している組換えプロテアーゼを提供する。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、本明細書に提供される実施例において指し示される通り、様々なpH範囲で安定している。本発明が、いずれかのpH安定性レベルやpH範囲に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、用語「酸性pHに対する改善された耐性」は、本発明にかかる組換えプロテアーゼが、参照プロテアーゼまたは別の酵素と比較して、増加した安定性(指定の期間[例えば、1時間、最大24時間等]にわたる酸性pHへの曝露後に、約pH7、6、5、4、3、2またはさらにより低いpHで、より高い保持活性)を有することになることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「生理的pH」は、対象の(例えば、ヒトの)血液において一般に見出されるpH範囲(例えば、pH7.2~7.4)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「塩基性pH」(例えば、塩基性pH条件に対する改善された安定性または塩基性pHに対する増加した耐性を参照して使用される)は、約7~11のpH範囲、または一部の実施形態では、pH11を超えるpH範囲を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「酸性pH」(例えば、酸性pH条件に対する改善された安定性または酸性pHに対する増加した耐性を参照して使用される)は、7未満のいずれかのpH値を包含するpH範囲を意味する。一部の実施形態では、酸性pHは、7未満であり、一方、一部の他の実施形態では、このpHは、約6、5、4、3、2またはそれよりも低い値未満である。一部の代替実施形態では、本発明の組換えプロテアーゼは、2~4のpHレベルで安定している。しかし、本発明が、いずれかの具体的なpH値や値の範囲に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、語句「胃的チャレンジ」は、組換えリパーゼが、胃(例えば、ヒトの胃)の中で遭遇し得る条件に曝露されるような、低pH環境および少なくとも1種の酵素(例えば、ペプシン)の存在への本発明の組換えプロテアーゼの曝露を指す。
本明細書で使用される場合、語句「腸的チャレンジ」は、組換えプロテアーゼが、腸管(例えば、ヒトの腸)の中で遭遇し得る条件に曝露されるような、中性pH環境ならびに少なくとも1種のプロテアーゼ(例えば、トリプシンおよび/またはキモトリプシン等の腸プロテアーゼ)および/または少なくとも1種の胆汁酸塩(例えば、タウロコール酸ナトリウム)の存在への本発明の組換えプロテアーゼの曝露を指す。
本明細書で使用される場合、語句「順次の複数チャレンジ」は、一連のチャレンジ条件への本発明の組換えプロテアーゼの曝露を指す。例えば、一部の実施形態では、1時間の熱チャレンジに続いて、1時間の胃的チャレンジが為され、それに続いて、1時間の腸的チャレンジが為された。本発明が、いずれかの具体的なチャレンジおよび/またはチャレンジ条件や、チャレンジの具体的な順番に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、用語「熱的安定性」および「熱安定性」は、特定の温度で機能するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。一部の実施形態では、この用語は、特定の温度でのインキュベーション後に機能するタンパク質の能力を指す。一部の実施形態では、本発明の組換えプロテアーゼは、「熱耐性」である(すなわち、この酵素は、上昇した温度でその触媒活性を維持する)。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、上昇した温度での不活性化に抵抗し、一部の実施形態では、延長した曝露時間にわたる上昇した温度で触媒活性を維持する。これらの用語は、本明細書で互換的に使用される。本発明が、いずれかの具体的な温度および/または曝露時間に限定されることは意図されない。そのような安定性は、当技術分野で公知のいずれかの方法(例えば、本明細書に記載されている方法)によって測定することができる。本発明が、いずれかの具体的な温度安定性レベルや温度範囲に限定されることは意図されない。一部の実施形態では、熱的安定性は、特定の温度でのタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)のインキュベーション後に測定される。
本明細書で使用される場合、用語「熱的安定性」は、特定の温度で機能するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。熱的安定性は、当技術分野で公知のいずれかの方法(例えば、本明細書に記載されている方法)によって測定することができる。本発明が、いずれかの具体的な温度安定性レベルや温度範囲に限定されることは意図されない。一部の実施形態では、熱的安定性は、特定の温度でのタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)のインキュベーション後に測定される。よって、一部の実施形態では、この用語は、特定の温度でインキュベートされた後に、特定の温度で機能するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。
本明細書で使用される場合、用語「化学的安定性」は、別のタンパク質の機能に有害に影響する化学物質の存在下で機能するタンパク質(例えば、本発明の組換えプロテアーゼ)の能力を指す。本発明が、いずれかの具体的な化学的安定性レベルや化学的安定性の範囲に限定されることは意図されない。
本明細書で使用される場合、用語「変換」は、基質(複数可)から対応する産物(複数可)への酵素変換(または生体内分解)を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下で、ある期間内に産物へと変換される基質のパーセントを指す。よって、プロテアーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特異的な期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、変動するものの、より高いストリンジェンシーの洗浄が為される。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的DNAが、標的DNAに対して約60%同一性、好ましくは約75%同一性、約85%同一性を有する、標的ポリヌクレオチドに対して約90%を超える同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、42℃での50%ホルムアミド、5×デンハルト(Denhart)液、5×SSPE、0.2%SDSにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く42℃での0.2×SSPE、0.2%SDSにおける洗浄と等価の条件である。
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般に、規定されたポリヌクレオチド配列に関して溶液条件下で決定される熱的融解温度Tmよりも約10℃低い条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、65℃で0.018M NaClにおいて安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが、65℃で0.018M NaClにおいて安定していない場合、本明細書で考慮される高ストリンジェンシー条件下で安定していないことになる)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、42℃での50%ホルムアミド、5×デンハルト液、5×SSPE、0.2%SDSと等価の条件におけるハイブリダイゼーションと、それに続く65℃での0.1×SSPEおよび0.1%SDSにおける洗浄によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、65℃での0.1%(w:v)SDSを含有する5×SSCにおけるハイブリダイズと等価の条件におけるハイブリダイズと、65℃での0.1%SDSを含有する0.1×SSCにおける洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と共に中等度にストリンジェントな条件は、上に引用されている参考文献に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞にDNA配列を導入するためのDNA構築物を指す。一部の実施形態では、ベクターは、DNA配列にコードされたポリペプチドの適切な宿主における発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、プラスミドは、ベクターとしての用途がある。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するための、DNA配列(例えば、導入遺伝子)に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が、目的の生物においてより効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において、遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物によるコドン使用は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏ることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質、対、低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集したタンパク質コード領域に関して、より高いことがある。一部の実施形態では、プロテアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本出願のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現に必要なまたは有利なあらゆる構成成分を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるがこれらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入する目的のリンカーと共に提供することができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドと相対的な位置に適切に置かれた(すなわち、機能的な関係性で)配置として本明細書で定義される。
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列等の目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞にとって相同または異種のいずれかである、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
本明細書で使用される場合、語句「適切な反応条件」は、本出願のプロテアーゼポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することができる、酵素変換反応溶液における条件(例えば、酵素ローディング、基質ローディング、温度、pH、緩衝液、共溶媒の範囲、等)を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本出願に提供され、実施例によって説明される。
本明細書で使用される場合、「化合物ローディング」または「酵素ローディング」の中等の用語「ローディング」は、反応開始時の反応混合物における構成成分の濃度または量を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈で使用される用語「基質」は、プロテアーゼポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における用語「産物」は、基質におけるプロテアーゼポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾が含まれるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および/または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾が含まれるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等)は、それが作動可能に連結された別の配列にとって「異種」である(この2種の配列が、自然界で付随していない場合)。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主系統」は、本明細書に提供されるDNA(例えば、プロテアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド)を含む発現ベクターに適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えDNA技法を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。
本明細書で使用される場合、用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと70%超の配列同一性かつ100%未満の配列同一性(例えば、75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%超の配列同一性)を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンが含まれるがこれらに限定されない1個または複数の天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、アナログは、1個または複数のD-アミノ酸残基、および2個またはそれを超えるアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、任意の適切な条件(例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用した)下での細胞の集団の生育を指す。一部の実施形態では、細胞は、微生物細胞(例えば、細菌)であり、一方、一部の他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または別の動物から得られる細胞である。本発明が、いずれか特定の細胞もしくは細胞型の培養またはいずれかの具体的な培養方法に限定されることは意図されない。実際に、本発明が、任意の適切な条件下で培養された任意の適切な細胞型を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「治療薬」は、病理の兆候または症状を示す対象に投与されたときに、医学的な効果を含む有益なまたは望ましい効果をもたらす化合物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本発明によって包含される薬学的有効量の操作されたプロテアーゼポリペプチドおよび許容される担体を含む、対象(例えば、ヒト)における医薬品使用に適切な組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の結果の産生に十分な量を意味する。当業者は、ルーチンの実験法を使用することにより有効量を決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマルおよび実験動物(例えば、齧歯類およびウサギ類(lagamorph))等の哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない、動物を包含する。この用語は、雌と共に雄を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患について評価されている、これについて処置されている、またはこれを経験している、いずれかの対象を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「乳児」は、生後1ヶ月からおよそ1歳までの期間の小児を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生児」は、出生から生後28日目の期間の小児を指す。用語「未熟児」は、一般に、出生時にほぼ500~ほぼ2499グラムの体重の、妊娠期間満20週より後だが正常満期出産の前に生まれた乳児を指す。「極低出生体重児」は、出生時に1500g未満の体重の乳児である。
本明細書で使用される場合、用語「小児」は、処置または研究手順の同意に関する法定年齢に達していない人物を指す。一部の実施形態では、この用語は、出生時と青年期の間の人物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「成人」は、関連する管轄権に関する法定年齢に達した人物を指す(例えば、米国では18歳)。一部の実施形態では、この用語は、任意の十分に成長した成熟した生物を指す。一部の実施形態では、用語「若年成人」は、18歳未満だが、性的成熟に達した人物を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の適切な使用(例えば、医薬組成物、食事用および/または栄養補助食品、餌等)に意図される、本発明の少なくとも1種の操作されたプロテアーゼを含む産物を包含する。
本明細書で使用される場合、組成物の「投与」およびこれを「投与すること」という用語は、本発明の組成物を対象(例えば、膵機能不全の影響を被る人物)に与えることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「担体」は、医薬組成物に関して使用される場合、安定剤、保存料およびアジュバント等、標準医薬品担体、緩衝液および賦形剤のいずれかを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、またはそれが含有される構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく対象に投与することができ、所望の生物活性を保持する、材料を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、活性医薬品成分(API;例えば、本発明の操作されたプロテアーゼポリペプチド)以外の、任意の薬学的に許容される添加剤、担体、希釈剤、アジュバントまたは他の成分を指す。賦形剤は典型的に、製剤化および/または投与目的で含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患/状態の症状に関して使用される場合、疾患/状態の1種もしくは複数の症状を軽快、減弱もしくは排除する、または症状(複数可)の発病を予防もしくは遅延する、化合物(例えば、操作されたプロテアーゼポリペプチド)の量および/または濃度を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患/状態に関して使用される場合、疾患/状態を軽快、減弱または排除する、組成物(例えば、操作されたプロテアーゼポリペプチド)の量および/または濃度を指す。一部の実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医師または他の臨床医によって探究される、組織、系または動物対象による生物学的(例えば、医学的)応答を誘発する、組成物の量に関して使用される。
本明細書で使用される場合、用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、本明細書に提供されるもの等の医薬組成物の投与を含む、対象(例えば、ヒト患者)に施される医療を指す。用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、予防性(例えば、予防的)と共に対症的な処置またはケアを包含することが意図される。一部の実施形態では、処置は、疾患の症状を予防または軽快するために提供される。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、膵酵素機能不全疾患または状態の処置または予防において用途がある。
操作されたプロテアーゼポリペプチド
操作されたプロテアーゼポリペプチド
本発明は、膵酵素機能不全の処置を含む様々な使用に適切な操作されたプロテアーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼは、野生型プロテアーゼ(例えば、配列番号2のポリペプチド)と比較して、少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼは、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278と少なくとも約75%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%アミノ酸配列同一性、ならびに1個または複数のアミノ酸位置(配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/もしくは2278、または配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/もしくは2278と少なくとも70%、75%、80%、85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくはそれよりも大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個またはそれを超えるアミノ酸位置等)における配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278と比較したアミノ酸残基差を有する。一部の実施形態では、1個または複数の位置における配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250および/または1308と比較した残基差は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27に収載されているポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、表3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27に収載されているポリペプチドを含み、操作されたプロテアーゼは、カルボキシ末端におけるヒスチジンタグおよび先行するアミノ酸リンカーを欠く(すなわち、欠如する)。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を含む。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、配列番号34、190、292、342、382、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を含む。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも約70%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、配列番号2の配列と比べて1個または複数の置換を含む。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9、17、29、30、32、34、35、36、37、43、47、50、63、75、77、81、85、92、93、107、127、132、133、135、143、145、147、162、168、187、188、189、200、205、207、208、209、210、212、220、221、222、223、225、228、236、237、238、239、241、244、245、247、257、258、260、261、262、263、265、266、283、294、300、301、307、308、318、319、334、336、339、342、344、345、346、347、355、359、361、362、363、366、368、370、373、398、404、405、406、408、412、424、427、429、431、439、441、442、446、448、449、450、454、468、470、480、481、482、485、489、490、495、497、501、504、505、506、508、511、512、514、516、523、526、527、529、533、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、552、553、554、555、556、558、559、560、565、566、567、568、570、571、573、575、577、580、581、582、583、586、589、591、592、594、596、599、601、604、609、610、615、616、620、631、632、634、639、643、644、645、646、647、648A、649、650、652、653、654、659、661、662、663、664、665、666から選択される位置に1個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、1個または複数の置換は、35、75、143、205、212、236、258、261、263、266、300、301、308、339、342、346、347、370、408、431、439、441、442、446、449、450、454、468、468、470、482、489、490、505、511、514、536、537、539、545、546、568、570、581、582、615、620、620、639、639、646および664から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、35、75、143、205、212、236、258、261、263、266、300、301、308、339、347、370、408、431、439、441、442、446、449、450、454、468、470、482、489、490、505、511、514、536、537、539、545、546、568、570、582、615、620、639、646および664から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、35、143、205、236、258、261、263、266、300、301、308、339、347、370、408、439、441、442、446、449、450、454、468、470、489、490、505、511、514、536、537、539、545、546、570、582、620、639、646および664から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、35、205、236、258、261、300、301、308、339、347、370、408、439、442、446、449L、450、468、470、489、490、505、511、514、536、537、539、545、582、620、639、646および664から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、205、236、258、261、300、301、308、339、342、346、347、370、408、439、442、446、449、450、468、490、505、514、536、537、545、620、639および646から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、205、258、261、339、342、439、442、446、449、450、505、536、545、620および646から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、205、258、261、339、342、442、446、505、536、545、620および646から選択される位置にある。一部の実施形態では、1個または複数の置換は、258、261、339、342および446から選択される位置にある。
一部の実施形態では、1個または複数の置換は、9KまたはQ;17A;29F、GまたはS;30G;32AまたはT;34M;35DまたはG;36D;37L;43P;47G;50S;63E;75NまたはS;77D;81N;85L;92L;93E;107KまたはT;127S;132T;133MまたはV;135E;143HまたはQ;145E;147T;162I;168N;187G;188TまたはW;189A、I、PまたはQ;200W;205R、T、L、QまたはR;207R;208T;209V;210D;212S;220A;221I;222T;223QまたはR;225AまたはK;228IまたはV;236V;237E;238I;239K;241P;244KまたはS;245S;247S;257L;258G、H、N、KまたはR;260D;261G、L、R、S、VまたはD;262L;263T、H、I、M、S、TまたはV;265R;266E、K、A、G、L、M、R、S、V、W、YまたはG;283H、KまたはL;294A;300F;301V;307L;308E;318D;319KまたはQ;334I;336W;339N、F、M、SまたはW;342F、RまたはL;344V;345W、CまたはP;346K;347F;355CまたはR;359Y;361V;362T;363E、H、K、W、またはY;366A、G、L、QまたはS;368M;370C;373F;398G;404G;405R;406R;408RまたはV;412Y;424G;427R、HまたはL;429LまたはP;431T;439M;441E、AまたはV;442LまたはS;446A、G、L、M、R、T、VまたはF;448K、M、RまたはW;449K、L、A;450RまたはW;454I、L、MまたはS;468S;470GまたはQ;480L;481S;482SまたはV;485D;489EまたはY;490E;495L;497R;501Q;504PまたはV;505A、F、GまたはM;506NまたはR;508G;511DまたはS;512N;514H;516M;523V;526E、LまたはV;527E、A、D、L、M、R、TまたはV;529G;533E、A、D、KまたはN;535RまたはV;536E、D、G、H、R、VまたはW;537P;538T;539E、LまたはM;540G;541G、IまたはR;542L、M、SまたはV;543A、D、GまたはV;544LまたはR;545I、RまたはV;546E、LまたはR;547E、AまたはV;548E、RまたはS;549GまたはT;552N;553RまたはT;554M;555D、G、LまたはQ;556GまたはV;558EまたはR;559HまたはS;560S;565A、CまたはD;566G;567R;568PまたはR;570E;571I;573T;575G;577V;580C;581C、L、R、TまたはA;582F、G、R、SまたはV;583E、RまたはV;586V;589A;591L、RまたはV;592P;594A;596T;599L;601I;604P;609G;610L、P、RまたはS;615A、D、G、M、P、Q、TまたはW;616T 620L、Q、SまたはV;631W;632Q;634C;639E、I、K、TまたはV;643EまたはR;644A;645E、G、SまたはW;646E、G、I、L、M、RまたはV;647LまたはW;648A、QまたはV;649H、TまたはY;650GまたはT;652I、L、Q、T、VまたはY;653I;654CまたはV;659T;661D;662W;663MまたはW;664G、R、VまたはW;665E;および666Dから選択され、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9KまたはQ;17A;29F、GまたはS;30G;32AまたはT;34M;35DまたはG;36D;37L;43P;47G;50S;63E;75NまたはS;77D;81N;85L;92L;93E;107KまたはT;127S;132T;133MまたはV;135E;143HまたはQ;145E;147T;162I;168N;187G;188TまたはW;189A、I、PまたはQ;200W;205R、T、L、QまたはR;207R;208T;209V;210D;212S;220A;221I;222T;223QまたはR;225AまたはK;228IまたはV;236V;237E;238I;239K;241P;244KまたはS;245S;247S;257L;258G、H、N、KまたはR;260D;261G、L、R、S、VまたはD;262L;263T、H、I、M、S、TまたはV;265R;266E、K、A、G、L、M、R、S、V、W、YまたはG;283H、KまたはL;294A;300F;301V;307L;308E;318D;319KまたはQ;334I;336W;339N、F、M、SまたはW;342F、RまたはL;344V;345W、CまたはP;346K;347F;355CまたはR;359Y;361V;362T;363E、H、K、W、またはY;366A、G、L、QまたはS;368M;370C;373F;398G;404G;405R;406R;408RまたはV;412Y;424G;427R、HまたはL;429LまたはP;431T;439M;441E、AまたはV;442LまたはS;446A、G、L、M、R、T、VまたはF;448K、M、RまたはW;449K、L、A;450RまたはW;454I、L、MまたはS;468S;470GまたはQ;480L;481S;482SまたはV;485D;489EまたはY;490E;495L;497R;501Q;504PまたはV;505A、F、GまたはM;506NまたはR;508G;511DまたはS;512N;514H;516M;523V;526E、LまたはV;527E、A、D、L、M、R、TまたはV;529G;533E、A、D、KまたはN;535RまたはV;536E、D、G、H、R、VまたはW;537P;538T;539E、LまたはM;540G;541G、IまたはR;542L、M、SまたはV;543A、D、GまたはV;544LまたはR;545I、RまたはV;546E、LまたはR;547E、AまたはV;548E、RまたはS;549GまたはT;552N;553RまたはT;554M;555D、G、LまたはQ;556GまたはV;558EまたはR;559HまたはS;560S;565A、CまたはD;566G;567R;568PまたはR;570E;571I;573T;575G;577V;580C;581C、L、R、TまたはA;582F、G、R、SまたはV;583E、RまたはV;586V;589A;591L、RまたはV;592P;594A;596T;599L;601I;604P;609G;610L、P、RまたはS;615A、D、G、M、P、Q、TまたはW;616T 620L、Q、SまたはV;631W;632Q;634C;639E、I、K、TまたはV;643EまたはR;644A;645E、G、SまたはW;646E、G、I、L、M、RまたはV;647LまたはW;648A、QまたはV;649H、TまたはY;650GまたはT;652I、L、Q、T、VまたはY;653I;654CまたはV;659T;661D;662W;663MまたはW;664G、R、VまたはW;665E;および666Dから選択される1個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含むが、ただし、組換えプロテアーゼが、配列番号2のポリペプチド配列を有しないことを条件とする。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、1個または複数の置換をさらに含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼおよび/または生物活性がある組換えプロテアーゼ断片は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、9、17、29、30、32、34、35、36、37、43、47、50、63、75、77、81、85、92、93、107、127、132、133、135、143、145、147、162、168、187、188、189、200、205、207、208、209、210、212、220、221、222、223、225、228、236、237、238、239、241、244、245、247、257、258、260、261、262、263、265、266、283、294、300、301、307、308、318、319、334、336、339、342、344、345、346、347、355、359、361、362、363、366、368、370、373、398、404、405、406、408、412、424、427、429、431、439、441、442、446、448、449、450、454、468、470、480、481、482、485、489、490、495、497、501、504、505、506、508、511、512、514、516、523、526、527、529、533、535、536E、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、552、553、554、555、556、558、559、560、565、566、567、568、570、571、573、575、577、580、581、582、583、586、589、591、592、594、596、599、601、604、609、610、615、616、620、631、632、634、639、643、644、645、646、647、648A、649、650、652、653、654、659、661、662、663、664、665または666から選択される位置に1個または複数の置換をさらに含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、位置に関して上に記載されているアミノ酸置換を使用することができる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236、258、261、339、439、446および454から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236V、258K、261L、339M、339W、439M、446A、446G、446L、446M、446Tおよび454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M236V、Q258K、E261L、N339M、N339W、S439M、P446A、P446G、P446L、P446M、P446TおよびA454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、107/536、162/408、168/547、208/366/504/591、208/485/526、210/223/258/552、210/241/258/599、223/241/258/599、223/429/481/533、223/481/533/552、225、225/260/263/265/544、225/262、225/362/366/591、225/366、225/482/591、244、258、258/318/429、258/449/481、258/481、261、261/504、318/481、318/533、318/599、339、342、345、362/366/485/591、363、366、366/485、366/497、366/526/591、366/591、408、427、446、448、449、450、481/533/552、482、482/485、482/591、485、485/591、533、533/552、536、544、547、549、565、615および652から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、107T/536D、162I/408R、168N/547V、208T/366G/504P/591L、208T/485D/526L、210D/223R/258K/552N、210D/241P/258K/599L、223R/241P/258K/599L、223R/429L/481S/533K、223R/481S/533K/552N、225A/260D/263H/265R/544R、225A/262L、225A/362T/366G/591L、225A/366G、225A/482V/591L、225K、244K、258K、258K/318D/429L、258K/449V/481S、258K/481S、258R、261G、261G/504V、261L、261R、261S、261V、318D/481S、318D/533K、318D/599L、339F、339W、342R、345W、362T/366G/485D/591L、363E、363W、366A、366G、366G/485D、366G/497R、366G/526L/591L、366G/591L、366L、366Q、408R、427H、427R、446R、446V、448K、448R、448W、449K、450W、481S/533K/552N、482V、482V/485D、482V/591L、485D、485D/591L、533A、533D、533E、533K、533K/552N、533N、536E、536G、536V、544R、547A、547E、549T、565C、565D、615A、615D、615G、615P、615T、615Wおよび652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M107T/Q536D、T162I/A408R、S168N/Q547V、A208T/N366G/Q504P/K591L、A208T/N485D/R526L、N210D/N223R/Q258K/K552N、N210D/E241P/Q258K/D599L、N223R/E241P/Q258K/D599L、N223R/K429L/A481S/M533K、N223R/A481S/M533K/K552N、T225A/N260D/R263H/G265R/T544R、T225A/P262L、T225A/N362T/N366G/K591L、T225A/N366G、T225A/R482V/K591L、T225K、R244K、Q258K、Q258K/Q318D/K429L、Q258K/A449V/A481S、Q258K/A481S、Q258R、E261G、E261G/Q504V、E261L、E261R、E261S、E261V、Q318D/A481S、Q318D/M533K、Q318D/D599L、N339F、N339W、L342R、Q345W、N362T/N366G/N485D/K591L、Q363E、Q363W、N366A、N366G、N366G/N485D、N366G/Q497R、N366G/R526L/K591L、N366G/K591L、N366L、N366Q、A408R、P427H、P427R、P446R、P446V、N448K、N448R、N448W、A449K、N450W、A481S/M533K/K552N、R482V、R482V/N485D、R482V/K591L、N485D、N485D/K591L、M533A、M533D、M533E、M533K、M533K/K552N、M533N、Q536E、Q536G、Q536V、T544R、Q547A、Q547E、V549T、N565C、N565D、K615A、K615D、K615G、K615P、K615T、K615WおよびK652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、258、258/261/342/345、258/261/342/504/533、258/261/345/504/549、258/261/482/504/549、258/342、258/342/504/533/536/549、258/345/427、258/408/427/504/549、258/427、258/427/482/504/533/536、258/427/482/536、261/342/345/536、261/342/482/504/533/536、261/342/482/504/549、261/342/482/536、261/342/533、261/482、318/339/362/544/547、318/339/448/544、318/339/547、318/448/544/615、339/362/363/544/547/615、339/362/544、339/448、339/448/547、339/544/547、342、342/408、342/408/536、342/482/536、362/363/544/547、362/448、363/544/547、427/482/504/533/536、427/533/536/549、448、448/544および448/544/547/615から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、258K、258K/261L/342R/345W、258K/261L/342R/504P/533D、258K/261L/345W/504P/549T、258K/261R/482V/504P/549T、258K/342R、258K/342R/504P/533K/536E/549T、258K/345W/427R、258K/408R/427R/504P/549T、258K/427R、258K/427R/482V/504P/533K/536E、258K/427R/482V/536E、261L/342R/345W/536E、261L/342R/482V/504P/533K/536E、261L/342R/533D、261R/342R/482V/504P/549T、261R/342R/482V/536E、261R/482V、318D/339W/362T/544R/547E、318D/339W/448R/544R、318D/339W/547E、318D/448R/544R/615A、339W/362T/363E/544R/547E/615A、339W/362T/544R、339W/448K、339W/448R、339W/448R/547E、339W/544R/547E、342R、342R/408R、342R/408R/536E、342R/482V/536E、362T/363E/544R/547E、362T/448R、363E/544R/547E、427R/482V/504P/533D/536E、427R/533K/536E/549T、448R、448R/544Rおよび448R/544R/547E/615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、Q258K、Q258K/E261L/L342R/Q345W、Q258K/E261L/L342R/Q504P/M533D、Q258K/E261L/Q345W/Q504P/V549T、Q258K/E261R/R482V/Q504P/V549T、Q258K/L342R、Q258K/L342R/Q504P/M533K/Q536E/V549T、Q258K/Q345W/P427R、Q258K/A408R/P427R/Q504P/V549T、Q258K/P427R、Q258K/P427R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、Q258K/P427R/R482V/Q536E、E261L/L342R/Q345W/Q536E、E261L/L342R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、E261L/L342R/M533D、E261R/L342R/R482V/Q504P/V549T、E261R/L342R/R482V/Q536E、E261R/R482V、Q318D/N339W/N362T/T544R/Q547E、Q318D/N339W/N448R/T544R、Q318D/N339W/Q547E、Q318D/N448R/T544R/K615A、N339W/N362T/Q363E/T544R/Q547E/K615A、N339W/N362T/T544R、N339W/N448K、N339W/N448R、N339W/N448R/Q547E、N339W/T544R/Q547E、L342R、L342R/A408R、L342R/A408R/Q536E、L342R/R482V/Q536E、N362T/Q363E/T544R/Q547E、N362T/N448R、Q363E/T544R/Q547E、P427R/R482V/Q504P/M533D/Q536E、P427R/M533K/Q536E/V549T、N448R、N448R/T544RおよびN448R/T544R/Q547E/K615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、505、541、556および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205Q、205T、505A、541R、556V、646Lおよび646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205Q、S205T、Q505A、S541R、T556V、A646LおよびA646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、220、239、261、261/339、261/339/547、261/536、261/536/547、339/427/536、339/427/536/547、339/427/547、405、442、505、539、541、542、545、556、558、594、631、663および665から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205R、220A、239K、261L、261L/339S/547E、261L/339W、261L/536W、261L/536W/547E、339W/427R/536W、339W/427R/536W/547E、339W/427R/547E、405R、442L、442S、505G、539*、541G、541I、542*、545*、545I、545R、556*、558E、594A、631W、663*、663Mおよび665Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205R、S220A、D239K、E261L、E261L/N339S/Q547E、E261L/N339W、E261L/Q536W、E261L/Q536W/Q547E、N339W/P427R/Q536W、N339W/P427R/Q536W/Q547E、N339W/P427R/Q547E、V405R、V442L、V442S、Q505G、P539*、S541G、S541I、I542*、A545*、A545I、A545R、T556*、T558E、V594A、G631W、E663*、E663MおよびP665Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205/442/505/536/545/620/646、205/505/536/541/545/547/558/646/665、258、263、355/536/545/547、359、366、446、449、505/536/545/558/646、506、555、556、620および650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205R/442L/505A/536W/545I/620V/646V、205R/505A/536W/541I/545R/547E/558E/646V/665E、258G、263M、263S、355R/536W/545I/547E、359Y、366S、446P、449L、505A/536W/545I/558E/646V、506R、555D、555G、555L、556G、620L、620Q、620Sおよび650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、S205R/V442L/Q505A/Q536W/A545I/E620V/A646V、S205R/Q505A/Q536W/S541I/A545R/Q547E/T558E/A646V/P665E、K258G、R263M、R263S、L355R/Q536W/A545I/Q547E、F359Y、N366S、R446P、A449L、Q505A/Q536W/A545I/T558E/A646V、G506R、E555D、E555G、E555L、T556G、E620L、E620Q、E620SおよびI650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、283/319/359/449/450/506、283/345/359/449/450/553/555、283/449/450/508/541/553/555、449/450、450/508/553/555/558、508および508/541/553から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、283H/345C/359Y/449L/450R/553T/555G、283L/319K/359Y/449L/450R/506R、283L/449L/450R/508G/541I/553T/555G、449L/450R、450R/508G/553R/555G/558E、508Gおよび508G/541I/553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N283H/Q345C/F359Y/A449L/N450R/D553T/E555G、N283L/N319K/F359Y/A449L/N450R/G506R、N283L/A449L/N450R/N508G/S541I/D553T/E555G、A449L/N450R、N450R/N508G/D553R/E555G/T558E、N508GおよびN508G/S541I/D553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205、205/442/449/450、205/450/536/545、205/450/536/545/646、258/442/446、258/442/449/646、258/450/536/545、308、361、439、442/446/536/545/620/646、442/450/536/545、514、535、577、591、592、610、639、643および644から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205S、205S/442V/449A/450N、205S/450N/536Q/545A、205S/450N/536Q/545A/646A、258Q/442V/446P、258Q/442V/449A/646A、258Q/450N/536Q/545A、308E、361V、439M、442V/446P/536Q/545A/620E/646A、442V/450N/536Q/545A、514H、535R、535V、577V、591R、591V、592P、610L、610P、610S、639E、639K、643E、643Rおよび644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R205S、R205S/L442V/L449A/R450N、R205S/R450N/W536Q/I545A、R205S/R450N/W536Q/I545A/V646A、K258Q/L442V/R446P、K258Q/L442V/L449A/V646A、K258Q/R450N/W536Q/I545A、A308E、I361V、S439M、L442V/R446P/W536Q/I545A/V620E/V646A、L442V/R450N/W536Q/I545A、R514H、E535R、E535V、D577V、K591R、K591V、A592P、A610L、A610P、A610S、A639E、A639K、A643E、A643RおよびD644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、32/490/639、236、236/238/404/480/555/568/592、236/359/404/406/555/639、236/359/490/581/639、236/359/555、236/359/609、236/370/406/568/581、236/370/568/592、236/370/581、236/404/406/480/490、236/404/555/581/609/639、236/568、236/592、236/639、238/359/370/404/490/568/639、245/363/408/512/514/596/666、245/363/512/514/537/560、308/514/535/639/644、359/404、359/404/406/490/546/581、363/408/512/514/537、363/408/601/650、363/639/644、408/512、408/514/537、408/514/560/650、490/568/592/639、512/537/560/601、514/535/546/575/644、514/639/644、514/644、535/575/639/644、535/639/643/644、535/643/644および601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、32T/490E/639T、236V、236V/238I/404G/480L/555Q/568P/592P、236V/359Y/404G/406R/555Q/639T、236V/359Y/490E/581T/639T、236V/359Y/555Q、236V/359Y/609G、236V/370C/406R/568P/581T、236V/370C/568P/592P、236V/370C/581T、236V/404G/406R/480L/490E、236V/404G/555Q/581T/609G/639T、236V/568P、236V/592P、236V/639T、238I/359Y/370C/404G/490E/568P/639T、245S/363K/408V/512N/514H/596T/666D、245S/363K/512N/514H/537P/560S、308E/514H/535R/639K/644A、359Y/404G、359Y/404G/406R/490E/546E/581T、363H/639K/644A、363K/408V/512N/514H/537P、363K/408V/601I/650T、408V/512N、408V/514H/537P、408V/514H/560S/650T、490E/568P/592P/639T、512N/537P/560S/601I、514H/535R/546E/575G/644A、514H/639K/644A、514H/644A、535R/575G/639K/644A、535R/639K/643R/644A、535V/643R/644Aおよび601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、I32T/Q490E/A639T、M236V、M236V/L238I/S404G/I480L/E555Q/L568P/A592P、M236V/F359Y/S404G/K406R/E555Q/A639T、M236V/F359Y/Q490E/S581T/A639T、M236V/F359Y/E555Q、M236V/F359Y/A609G、M236V/S370C/K406R/L568P/S581T、M236V/S370C/L568P/A592P、M236V/S370C/S581T、M236V/S404G/K406R/I480L/Q490E、M236V/S404G/E555Q/S581T/A609G/A639T、M236V/L568P、M236V/A592P、M236V/A639T、L238I/F359Y/S370C/S404G/Q490E/L568P/A639T、T245S/Q363K/A408V/S512N/R514H/M596T/S666D、T245S/Q363K/S512N/R514H/E537P/T560S、A308E/R514H/E535R/A639K/D644A、F359Y/S404G、F359Y/S404G/K406R/Q490E/V546E/S581T、Q363H/A639K/D644A、Q363K/A408V/S512N/R514H/E537P、Q363K/A408V/M601I/I650T、A408V/S512N、A408V/R514H/E537P、A408V/R514H/T560S/I650T、Q490E/L568P/A592P/A639T、S512N/E537P/T560S/M601I、R514H/E535R/V546E/S575G/D644A、R514H/A639K/D644A、R514H/D644A、E535R/S575G/A639K/D644A、E535R/A639K/A643R/D644A、E535V/A643R/D644AおよびM601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236、236/308/370/548、236/308/490/581/643、236/308/555/560/596、236/370、236/370/490/639、236/555、236/560/581、245/359/363/406/535/650、245/363/406/575/601/666、300、301、308、308/490/560/581/639/643、336、359/363/406/535/601/650、359/404/406/535、359/406/575/650/666、359/535/575/601、363/404/406/535/568、404/406/535、406、406/480/535/568/601、406/535/575、468および480/575/601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、236V、236V/308E/370C/548E、236V/308E/490E/581T/643R、236V/308E/555Q/560S/596T、236V/370C、236V/370C/490E/639T、236V/555Q、236V/560S/581T、245S/359Y/363K/406R/535R/650T、245S/363K/406R/575G/601I/666D、300F、301V、308E、308E/490E/560S/581T/639T/643R、336W、359Y/363K/406R/535R/601I/650T、359Y/404G/406R/535R、359Y/406R/575G/650T/666D、359Y/535R/575G/601I、363K/404G/406R/535R/568P、404G/406R/535R、406R、406R/480L/535R/568P/601I、406R/535R/575G、468Sおよび480L/575G/601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、M236V、M236V/A308E/S370C/D548E、M236V/A308E/Q490E/S581T/A643R、M236V/A308E/E555Q/T560S/M596T、M236V/S370C、M236V/S370C/Q490E/A639T、M236V/E555Q、M236V/T560S/S581T、T245S/F359Y/Q363K/K406R/E535R/I650T、T245S/Q363K/K406R/S575G/M601I/S666D、L300F、A301V、A308E、A308E/Q490E/T560S/S581T/A639T/A643R、Y336W、F359Y/Q363K/K406R/E535R/M601I/I650T、F359Y/S404G/K406R/E535R、F359Y/K406R/S575G/I650T/S666D、F359Y/E535R/S575G/M601I、Q363K/S404G/K406R/E535R/L568P、S404G/K406R/E535R、K406R、K406R/I480L/E535R/L568P/M601I、K406R/E535R/S575G、A468SおよびI480L/S575G/M601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、133/301/346/347/468、205/236/347、205/236/370/490/537/620、205/342/439/442/514/620/639、205/370/537、205/442/505/620、236/258/370/505/545/639、236/339/514、236/370/450/620、236/545、258/339/342/505/537、258/342/370/408/442/537、300/301/308/346/347/468、300/301/347/468、301/308/336/346/406/468/601、301/308/346/406/468、301/308/468/601、301/347/406、308/336/347/468、308/347/468、342、342/408/490/505/514/545/639/646、342/620、370/442、370/537/639、489、539/649、542、543、543/673、558、559、566、634および661から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、133M/301V/346K/347F/468S、205S/236M/347F、205S/236M/370S/490Q/537E/620E、205S/342L/439S/442V/514R/620E/639A、205S/370S/537E、205S/442V/505Q/620E、236M/258Q/370S/505Q/545A/639A、236M/339N/514R、236M/370S/450N/620E、236M/545A、258Q/339N/342L/505Q/537E、258Q/342L/370S/408A/442V/537E、300F/301V/308E/346K/347F/468S、300F/301V/347F/468S、301V/308E/336W/346K/406R/468S/601I、301V/308E/346K/406R/468S、301V/308E/468S/601I、301V/347F/406R、308E/336W/347F/468S、308E/347F/468S、342L、342L/408A/490Q/505Q/514R/545A/639A/646A、342L/620E、370S/442V、370S/537E/639A、489Y、539M/649H、542M、543A、543V/673Y、558R、559H、559S、566G、634Cおよび661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、L133M/A301V/V346K/V347F/A468S、R205S/V236M/V347F、R205S/V236M/C370S/E490Q/P537E/V620E、R205S/R342L/M439S/L442V/H514R/V620E/T639A、R205S/C370S/P537E、R205S/L442V/A505Q/V620E、V236M/K258Q/C370S/A505Q/I545A/T639A、V236M/W339N/H514R、V236M/C370S/R450N/V620E、V236M/I545A、K258Q/W339N/R342L/A505Q/P537E、K258Q/R342L/C370S/V408A/L442V/P537E、L300F/A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、L300F/A301V/V347F/A468S、A301V/A308E/Y336W/V346K/K406R/A468S/M601I、A301V/A308E/V346K/K406R/A468S、A301V/A308E/A468S/M601I、A301V/V347F/K406R、A308E/Y336W/V347F/A468S、A308E/V347F/A468S、R342L、R342L/V408A/E490Q/A505Q/H514R/I545A/T639A/V646A、R342L/V620E、C370S/L442V、C370S/P537E/T639A、D489Y、P539M/D649H、I542M、F543A、F543V/H673Y、T558R、L559H、L559S、T566G、P634CおよびG661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205/236/342/439/505/514/537/545、236/342/505/514/537/545、300/301/308/336/347/468/601、300/301/347/406、301/308/346/347/468、301/336/346/347/406/601および308/336/347/406/468/601から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、205S/236M/342L/439S/505Q/514R/537E/545A、236M/342L/505Q/514R/537E/545A、300F/301V/308E/336W/347F/468S/601I、300F/301V/347F/406R、301V/308E/346K/347F/468S、301V/336W/346K/347F/406R/601Iおよび308E/336W/347F/406R/468S/601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R205S/V236M/R342L/M439S/A505Q/H514R/P537E/I545A、V236M/R342L/A505Q/H514R/P537E/I545A、L300F/A301V/A308E/Y336W/V347F/A468S/M601I、L300F/A301V/V347F/K406R、A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、A301V/Y336W/V346K/V347F/K406R/M601IおよびA308E/Y336W/V347F/K406R/A468S/M601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346/511/537、346/511/537/541/543、346/511/542/582、346/511/581/582、346/511/583、346/529/571/581/582/583/589、511/537、516/539/568、537/582、539、568/662/663および581/582から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E、346V/511S/537E/541I/543G、346V/511S/542S/582R、346V/511S/581L/582R、346V/511S/583R、346V/529G/571I/581C/582V/583V/589A、511S/537E、516M/539E/568R、537E/582R、539E、568R/662W/663Wおよび581L/582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E、K346V/A511S/P537E/S541I/F543G、K346V/A511S/I542S/Y582R、K346V/A511S/S581L/Y582R、K346V/A511S/I583R、K346V/V529G/S571I/S581C/Y582V/I583V/T589A、A511S/P537E、P516M/P539E/L568R、P537E/Y582R、P539E、L568R/F662W/E663WおよびS581L/Y582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346/511/537/582、346/511/543/582、346/511/544、346/537/542/544、346/543/544、346/583、511/537/542/582/583、516、516/539/555、537/543/582、539/568、540、542/544/581、548、549、559、559/568、582、647、650および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E/582V、346V/511S/543G/582R、346V/511S/544L、346V/537E/542S/544L、346V/543G/544L、346V/583R、511S/537E/542S/582R/583R、516M、516M/539E/555G、537E/543G/582R、539E/568R、540G、542S/544L/581R、548R、549G、559S、559S/568R、582V、647L、647W、650Gおよび664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E/Y582V、K346V/A511S/F543G/Y582R、K346V/A511S/T544L、K346V/P537E/I542S/T544L、K346V/F543G/T544L、K346V/I583R、A511S/P537E/I542S/Y582R/I583R、P516M、P516M/P539E/E555G、P537E/F543G/Y582R、P539E/L568R、V540G、I542S/T544L/S581R、D548R、V549G、L559S、L559S/L568R、Y582V、Q647L、Q647W、I650GおよびQ664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、261/355/543、261/355/567/568、261/489、261/489/511/568、261/489/539、261/489/567、261/539/543、261/539/543/567、261/542/543/568、511、511/539/543、511/567、543および583から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、261D/355C/543A、261D/355C/567R/568R、261D/489E、261D/489E/511D/568R、261D/489E/539L、261D/489E/567R、261D/539L/543A、261D/539L/543D/567R、261D/542L/543A/568R、511D、511D/539L/543A、511D/567R、543Aおよび583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1608を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号680もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、L261D/L355C/F543A、L261D/L355C/D567R/L568R、L261D/D489E、L261D/D489E/A511D/L568R、L261D/D489E/P539L、L261D/D489E/D567R、L261D/P539L/F543A、L261D/P539L/F543D/D567R、L261D/I542L/F543A/L568R、A511D、A511D/P539L/F543A、A511D/D567R、F543AおよびI583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1608を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9、9/17/34/35/93/554、9/17/50、9/17/93、9/29/35/43/77/542/554、9/32/77/93、9/43/77、9/50/63/93、9/93、17/29/34/35/36/77/93、17/32/34/35、17/77、32/34/93、43、50/77/93、50/93、77/93、93、205/263/470、205/344/470/565、205/345/470/538/664、205/470/545/568/645/647/664、205/470/567/568/645、263/344/664、263/470/645、263/489、263/539/541/568/645、344/355/470/489/645、344/355/470/568/645/647、344/470/489/539/542/645/647/664、344/470/489/567/568、344/470/568、344/470/647、470、470/489、470/541/542/543/565/645/647、470/567/568、470/664および542/543から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9K、9K/17A/34M/35G/93E/554M、9K/17A/50S、9K/17A/93E、9K/29S/35G/43P/77D/542V/554M、9K/32A/77D/93E、9K/43P/77D、9K/50S/63E/93E、9K/93E、9Q/17A/93E、17A/29S/34M/35G/36D/77D/93E、17A/32A/34M/35G、17A/77D、32A/34M/93E、43P、50S/77D/93E、50S/93E、77D/93E、93E、205L/263V/470Q、205L/344V/470Q/565A、205L/345P/470Q/538T/664R、205L/470Q/545L/568R/645S/647W/664R、205L/470Q/567R/568R/645S、263I/344V/664R、263I/470Q/645S、263I/489D、263I/539L/541R/568R/645S、344V/355C/470Q/489D/645S、344V/355C/470Q/568R/645S/647W、344V/470Q/489D/539L/542L/645S/647W/664R、344V/470Q/489D/567R/568R、344V/470Q/568R、344V/470Q/647W、470Q、470Q/489D、470Q/541R/542L/543A/565A/645S/647W、470Q/567R/568R、470Q/664Rおよび542L/543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R9K、R9K/T17A/T34M/E35G/A93E/L554M、R9K/T17A/N50S、R9K/T17A/A93E、R9K/N29S/E35G/S43P/N77D/I542V/L554M、R9K/I32A/N77D/A93E、R9K/S43P/N77D、R9K/N50S/A63E/A93E、R9K/A93E、R9Q/T17A/A93E、T17A/N29S/T34M/E35G/T36D/N77D/A93E、T17A/I32A/T34M/E35G、T17A/N77D、I32A/T34M/A93E、S43P、N50S/N77D/A93E、N50S/A93E、N77D/A93E、A93E、R205L/R263V/P470Q、R205L/N344V/P470Q/N565A、R205L/Q345P/P470Q/S538T/Q664R、R205L/P470Q/I545L/L568R/K645S/Q647W/Q664R、R205L/P470Q/D567R/L568R/K645S、R263I/N344V/Q664R、R263I/P470Q/K645S、R263I/E489D、R263I/P539L/S541R/L568R/K645S、N344V/L355C/P470Q/E489D/K645S、N344V/L355C/P470Q/L568R/K645S/Q647W、N344V/P470Q/E489D/P539L/I542L/K645S/Q647W/Q664R、N344V/P470Q/E489D/D567R/L568R、N344V/P470Q/L568R、N344V/P470Q/Q647W、P470Q、P470Q/E489D、P470Q/S541R/I542L/F543A/N565A/K645S/Q647W、P470Q/D567R/L568R、P470Q/Q664RおよびI542L/F543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9/17/32/34/36/50/77/107/127、9/17/63/77、9/43/93/127、9/63/93/107、17/29/32/34/36/63、29/34/35/77、32/43/93、35/93/145および205/263/489/647から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、9K/17A/32A/34M/36D/50S/77D/107K/127S、9K/17A/63E/77D、9K/43P/93E/127S、9K/63E/93E/107K、17A/29S/32A/34M/36D/63E、29S/34M/35G/77D、32A/43P/93E、35G/93E/145Eおよび205L/263V/489D/647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R9K/T17A/I32A/T34M/T36D/N50S/N77D/M107K/G127S、R9K/T17A/A63E/N77D、R9K/S43P/A93E/G127S、R9K/A63E/A93E/M107K、T17A/N29S/I32A/T34M/T36D/A63E、N29S/T34M/E35G/N77D、I32A/S43P/A93E、E35G/A93E/G145EおよびR205L/R263V/E489D/Q647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、188、189、265、266、334、442、454、646および649から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、188W、189A、189P、265R、266E、266G、334I、442V、454L、454M、454S、646I、646M、646R、649Tおよび649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N188W、K189A、K189P、G265R、N266E、N266G、V334I、L442V、A454L、A454M、A454S、V646I、V646M、V646R、D649TおよびD649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、189、266、266/283、546、594および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、189I、266A、266L、266L/283K、266M、266S、266V、266W、266Y、546L、594Aおよび646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、K189I、N266A、N266L、N266L/N283K、N266M、N266S、N266V、N266W、N266Y、V546L、V594AおよびV646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、263/470/568、266、470/542/543/664および558/577/594から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、263I/470P/568R、266R、470P/542L/543A/664Qおよび558E/577V/594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R263I/Q470P/L568R、N266R、Q470P/I542L/F543A/R664QおよびT558E/D577V/V594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/35、29/35/342/581/582/664、29/50/511/539/581、35、35/50/205/406/511/581、35/205/511、35/342/346/511/539/581、35/346、35/346/406/511/581/582/664、35/511、35/539、50/342、132、133、143、147、187、188、257、258、263、294、294/441/527、308/342/511/581/582、342、346、398、406/664、429/652、441、441/446/526、446/652、482、505、511、526、527、536、545、581、582、615、620、639、645、646、648、652、654および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29F、29G、29S/35G、29S/35G/342L/581S/582Y/664Q、29S/50S/511S/539L/581S、35D/511S、35G、35G/50S/205S/406R/511S/581S、35G/205S/511S、35G/342L/346V/511S/539L/581S、35G/346V、35G/346V/406R/511S/581S/582Y/664Q、35G/511S、35G/539L、50S/342L、132T、133V、143H、147T、187G、188T、257L、258H、258N、263S、294A、294A/441A/527A、308A/342L/511S/581S/582Y、342F、346V、398G、406R/664Q、429L/652T、441A、441A/446P/526L、441V、446P/652T、482V、505F、505M、511S、526V、527D、527R、536H、536R、545V、581A、581S、582G、582S、582Y、615Q、620E、639E、639I、645E、645G、645W、646G、646R、648Q、648V、652L、652Q、652T、652Y、654C、664G、664Vおよび664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29F、N29G、N29S/E35G、N29S/E35G/R342L/L581S/R582Y/R664Q、N29S/N50S/A511S/P539L/L581S、E35D/A511S、E35G、E35G/N50S/R205S/K406R/A511S/L581S、E35G/R205S/A511S、E35G/R342L/K346V/A511S/P539L/L581S、E35G/K346V、E35G/K346V/K406R/A511S/L581S/R582Y/R664Q、E35G/A511S、E35G/P539L、N50S/R342L、I132T、L133V、E143H、A147T、I187G、N188T、R257L、K258H、K258N、R263S、R294A、R294A/R441A/K527A、E308A/R342L/A511S/L581S/R582Y、R342F、K346V、A398G、K406R/R664Q、K429L/K652T、R441A、R441A/R446P/R526L、R441V、R446P/K652T、R482V、A505F、A505M、A511S、R526V、K527D、K527R、W536H、W536R、I545V、L581A、L581S、R582G、R582S、R582Y、K615Q、V620E、T639E、T639I、K645E、K645G、K645W、V646G、V646R、R648Q、R648V、K652L、K652Q、K652T、K652Y、R654C、R664G、R664VおよびR664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/143/263/266/441/639、29/263/266、29/263/266/441/620、29/266/441、29/441/639、30、37、47/570、75、81、85、92、135、143、143/263/266/639、143/266/441/620/639、168、189/424、237/527、244、258/342/582/648、263、263/266/441、263/266/639、266/441、266/441/620/639、266/620/639、266/639、267、342/526/664、342/545、342/582、429、441、482、495、501、523、526、527、568、570、573、581、582、616、632、648、653および654から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29G/143H/263S/266A/441V/639I、29G/263S/266A、29G/263S/266L/441A/620E、29G/266A/441A、29G/441V/639V、29S、30G、37L、47G/570E、75N、75S、81N、85L、92L、135E、143H/263S/266A/639V、143H/266A/441V/620E/639V、143Q、168E、189Q/424G、237E/527V、244S、258H/342F/582S/648Q、263S/266A/441A、263S/266A/441V、263S/266A/639V、263T、266A/441V/620E/639V、266A/620E/639I、266A/639I、266L/441A、267G、342F/526V/664G、342F/545V、342F/582G、429P、441E、482V、495L、501Q、523V、526E、527E、527L、527M、527R、527T、568P、570E、573T、581T、582F、616T、632Q、648A、653Iおよび654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29G/E143H/R263S/N266A/R441V/T639I、N29G/R263S/N266A、N29G/R263S/N266L/R441A/V620E、N29G/N266A/R441A、N29G/R441V/T639V、N29S、R30G、R37L、E47G/K570E、R75N、R75S、R81N、R85L、P92L、R135E、E143H/R263S/N266A/T639V、E143H/N266A/R441V/V620E/T639V、E143Q、S168E、K189Q/D424G、D237E/K527V、R244S、K258H/L342F/R582S/R648Q、R263S/N266A/R441A、R263S/N266A/R441V、R263S/N266A/T639V、R263T、N266A/R441V/V620E/T639V、N266A/V620E/T639I、N266A/T639I、N266L/R441A、R267G、L342F/R526V/R664G、L342F/I545V、L342F/R582G、K429P、R441E、R482V、I495L、R501Q、M523V、R526E、K527E、K527L、K527M、K527R、K527T、L568P、K570E、K573T、S581T、R582F、K616T、K632Q、R648A、M653IおよびR654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29、29/30、29/30/143/263/482/646、29/30/263、29/30/616/648、29/75/263/568/570/648、29/168/648、29/263/527/568、75、75/143/168/527、75/168、75/616、143、168/247/482/648、168/263/616、168/482/616、168/495/616、263、263/616、429/545、495および527から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、29S、29S/30G、29S/30G/143Q/263T/482V/646E、29S/30G/263T、29S/30G/616T/648A、29S/75S/263T/568P/570E/648A、29S/168E/648A、29S/263T/527L/568P、75S、75S/143Q/168E/527L、75S/168E、75S/616T、143Q、168E/247S/482V/648A、168E/263T/616T、168E/482V/616T、168E/495L/616T、263T、263T/616T、429P/545V、495Lおよび527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、N29S、N29S/R30G、N29S/R30G/E143Q/S263T/R482V/V646E、N29S/R30G/S263T、N29S/R30G/K616T/R648A、N29S/R75S/S263T/L568P/K570E/R648A、N29S/S168E/R648A、N29S/S263T/K527L/L568P、R75S、R75S/E143Q/S168E/K527L、R75S/S168E、R75S/K616T、E143Q、S168E/G247S/R482V/R648A、S168E/S263T/K616T、S168E/R482V/K616T、S168E/I495L/K616T、S263T、S263T/K616T、K429P/I545V、I495LおよびK527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、207、222、266、307、454、535、546、548、580、604および610から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、207R、222T、266K、307L、454L、535V、546R、548S、580C、604Pおよび610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、Q207R、S222T、A266K、Q307L、A454L、E535V、V546R、D548S、H580C、H604PおよびA610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75/168/207/454/568/586/610/648/659、75/168/266/454/546/570/580、75/207/454/570/659、75/207/546/580/648、75/263/454/548/568/604/648、75/266/454、75/454、75/454/546/548/568/604、75/546/548/610/648、168/207/263/454/568/570/604、168/263/266/546/604、168/454/604、207/604/610、209、212、221、223、228、266/454/568、319、373、412/546/554、431、454、454/546/568/570/580、454/546/570、454/570/580/610、454/580、454/659および506から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75S/168E/207R/454L/568P/586V/610R/648A/659T、75S/168E/266K/454L/546R/570E/580C、75S/207R/454L/570E/659T、75S/207R/546R/580C/648A、75S/263T/454L/548S/568P/604P/648A、75S/266K/454L、75S/454L、75S/454L/546R/548S/568P/604P、75S/546R/548S/610R/648A、168E/207R/263T/454L/568P/570E/604P、168E/263T/266K/546R/604P、168E/454L/604P、207R/604P/610R、209V、212S、221I、223Q、228I、228V、266K/454L/568P、319Q、373F、412Y/546L/554M、431T、454I、454L/546R/568P/570E/580C、454L/546R/570E、454L/570E/580C/610R、454L/580C、454L/659Tおよび506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R75S/S168E/Q207R/A454L/L568P/L586V/A610R/R648A/E659T、R75S/S168E/A266K/A454L/V546R/K570E/H580C、R75S/Q207R/A454L/K570E/E659T、R75S/Q207R/V546R/H580C/R648A、R75S/S263T/A454L/D548S/L568P/H604P/R648A、R75S/A266K/A454L、R75S/A454L、R75S/A454L/V546R/D548S/L568P/H604P、R75S/V546R/D548S/A610R/R648A、S168E/Q207R/S263T/A454L/L568P/K570E/H604P、S168E/S263T/A266K/V546R/H604P、S168E/A454L/H604P、Q207R/H604P/A610R、I209V、D212S、L221I、N223Q、T228I、T228V、A266K/A454L/L568P、N319Q、L373F、F412Y/V546L/L554M、P431T、A454I、A454L/V546R/L568P/K570E/H580C、A454L/V546R/K570E、A454L/K570E/H580C/A610R、A454L/H580C、A454L/E659TおよびG506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75/189/373/582、75/200/212/431/482、75/212/373/431/482、75/212/431/482/568/615/664、75/368/582、75/373/431/526/582、75/431/482/570/604/664、75/632、189/212/431/568/570、200/205/373/431、200/431/482/615/664、200/482/664、212/228/431、212/228/568/570/582/664、212/373/446/482/582、368/373/431、373/431/570/604/664、373/568/632、431、431/604/664、482/582、582および615/652/664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、75S/189A/373F/582G、75S/200W/212S/431T/482S、75S/212S/373F/431T/482S、75S/212S/431T/482S/568P/615M/664G、75S/368M/582G、75S/373F/431T/526E/582G、75S/431T/482S/570K/604P/664G、75S/632Q、189A/212S/431T/568P/570K、200W/205S/373F/431T、200W/431T/482S/615M/664G、200W/482S/664W、212S/228V/431T、212S/228V/568P/570K/582G/664W、212S/373F/446F/482S/582G、368M/373F/431T、373F/431T/570K/604P/664W、373F/568P/632Q、431T、431T/604P/664G、482S/582G、582Gおよび615M/652V/664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、R75S/K189A/L373F/R582G、R75S/K200W/D212S/P431T/R482S、R75S/D212S/L373F/P431T/R482S、R75S/D212S/P431T/R482S/L568P/K615M/R664G、R75S/K368M/R582G、R75S/L373F/P431T/R526E/R582G、R75S/P431T/R482S/E570K/H604P/R664G、R75S/K632Q、K189A/D212S/P431T/L568P/E570K、K200W/R205S/L373F/P431T、K200W/P431T/R482S/K615M/R664G、K200W/R482S/R664W、D212S/T228V/P431T、D212S/T228V/L568P/E570K/R582G/R664W、D212S/L373F/R446F/R482S/R582G、K368M/L373F/P431T、L373F/P431T/E570K/H604P/R664W、L373F/L568P/K632Q、P431T、P431T/H604P/R664G、R482S/R582G、R582GおよびK615M/K652V/R664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、408/439、439/514、470、470/667、514、514/537および537から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、408A/439S、439S/514R、470G、470G/667D、470P、514R、514R/537Eおよび537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えプロテアーゼは、V408A/M439S、M439S/H514R、Q470G、Q470G/G667D、Q470P、H514R、H514R/P537EおよびP537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27に提供される少なくとも1個の位置における少なくとも1個の突然変異を含み、位置は、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、2278および2332のポリペプチド配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~1362のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1366~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号4~20のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号22~188のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号190~268のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号270~282のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号284~340のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号342~380のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号382~394のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号396~450および1366~1420のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号452~522および1422~1492のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号524~574および1494~1544のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号576~646および1546~1616のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号648~660および1618~1630のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号662~684および1632~1654のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号686~728および1656~1698のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号730~756および1700~1726のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号758~836および1728~1806のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号838~854および1808~1824のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号856~886および1826~1856のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号888~910および1858~1880のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号912~916および1882~1886のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号918~1058および1888~2028のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1060~1172および2030~2142のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1174~1216および2144~2186のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1218~1238および2188~2208のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1240~1300および2210~2270のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1302~1346および2272~2316のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号1348~1362および2318~2332のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも1種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、2278および2332から選択されるポリペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、本発明によって包含される操作されたプロテアーゼポリペプチドの機能的断片を含む。機能的断片は、それが派生された操作されたプロテアーゼポリペプチド(すなわち、本明細書に記載されている、親である操作されたプロテアーゼまたは参照プロテアーゼ)の活性の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%を有する。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたプロテアーゼの親配列の少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%およびさらには99%を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、5個未満、10個未満、15個未満、10個未満、25個未満、30個未満、35個未満、40個未満、45個未満および50個未満のアミノ酸だけトランケートされる。
本発明の操作されたプロテアーゼは、参照配列と比較して、少なくとも1種の改善された特性を含む。一部の実施形態では、参照配列は、野生型プロテアーゼであり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列は、別の操作されたプロテアーゼである。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、40~50℃で安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、25℃、37℃、42℃および/または48℃で安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、40~50℃で参照配列よりも安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、25℃、37℃、42℃および/または48℃で参照配列よりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも熱安定性が高い。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低pH環境において安定しており、一方、他の実施形態では、組換えプロテアーゼは、高pH環境において安定している。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、低および高pH環境の両方において安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、参照配列と比較して、高pH環境または低pH環境のどちらか(または両方の環境)で、より安定している。一部の実施形態では、参照配列は、野生型プロテアーゼであり、一方、他の実施形態では、参照配列は、別の操作されたプロテアーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、7よりも大きいpHで、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、7よりも大きいpHで、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.8で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.8で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、7未満のpHで、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH7未満のpHで、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH6で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、5未満のpHで、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH4で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.8で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.8で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.26で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.26で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH3で、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.75で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.75で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.5で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2.5で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2で、配列番号2のプロテアーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、pH2で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、ペプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。
一部の実施形態では、本発明の組換えプロテアーゼは、自己分解に対して抵抗性である。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼよりも自己分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも自己分解に対する抵抗性が高い。
一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で活性がある。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号2のプロテアーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、胆汁酸塩は、タウロコール酸塩である。
また一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、野生型プロテアーゼまたは別の組換えプロテアーゼと比較して、2種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2と比較して、2種以上の改善された特性を示し、一方、一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278と比較して、2種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、改善された特性は、酸安定性、アルカリ安定性、酸性pHにおける安定性、アルカリpHにおける安定性、中性pHにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、自己分解抵抗性、および少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。一部の実施形態では、改善された特性は、酸性pHにおける活性、酸性pHにおける安定性、中性pHにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、自己分解抵抗性、および少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。また一部の追加の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも、酸性pHで安定性が高いおよび/もしくは活性が高い、熱安定性が高い、タンパク質分解に対する抵抗性が高い、自己分解に対する抵抗性が高い、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で活性が高い。改善された特性のいずれかの組合せが、本発明において用途があることが企図される。本発明が、改善された特性のいずれか具体的な組合せに限定されることは意図されない。さらに、一部の実施形態では、2種の改善された特性が存在し、一方、一部の他の実施形態では、3種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、4種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、5種またはそれを超える改善された特性が存在する。本発明の組換えプロテアーゼが、追加の改善をさらに含むことも企図される。一部の実施形態では、このような追加の改善は、野生型プロテアーゼを上回る利点を提供し、一方、一部の他の実施形態では、追加の改善は、他の組換えプロテアーゼを上回る利点を提供するであろう。
一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも2種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも3種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/または活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号2のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性、ならびに少なくとも1種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼと比較して、酸性pHにおける改善された安定性および/もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、自己分解に対する改善された抵抗性、ならびに/または少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも1種の改善された特性、ならびに少なくとも1種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも1種の参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、少なくとも2種またはそれを超える参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH3.5に対する増加した耐性;iv)pH3に対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278から選択される。一部のさらなる実施形態では、組換えプロテアーゼは、精製されている。
さらに一部のさらなる実施形態では、プロテアーゼは、食物および/または飲料において安定している。一部の追加の実施形態では、プロテアーゼは、栄養および他の補助食品において安定している。一部の実施形態では、補助食品は、液体であり、一方、他の実施形態では、エマルション、懸濁液または固体である。本発明が、いずれか特定の食物、飲料および/または補助食品形式または形態に限定されることは意図されない。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞:
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞:
本発明は、本明細書に記載される操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを創出するために、遺伝子発現を制御する1個または複数の異種調節配列に動作可能に連結される。操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応するプロテアーゼポリペプチドを発現するために、適切な宿主細胞中に導入され得る。
当業者にとって明らかなように、タンパク質配列の入手可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドの記載を提供する。同じアミノ酸が代替的なまたは同義のコドンによってコードされる、遺伝コードの縮重は、非常に多数の核酸が作製されることを可能にし、その全てが、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有していれば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で、1個または複数のコドンの配列を単純に改変することによって、いくつもの異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製され得る、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各々のおよび全ての可能な変形形態を具体的に企図し、全てのかかる変形形態は、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に提供されるバリアント、または表3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に提供されるバリアントであって、ヒスチジンタグおよび先行するアミノ酸リンカーを欠如するバリアントを含む、本明細書に記載される任意のポリペプチドについて具体的に開示されたとみなされる。
種々の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用される一方、真菌において使用される好ましいコドンは、真菌における発現のために使用される。結果として、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約40%、50%、60%、70%、80%、または90%よりも多くにおいて、好ましいコドンを含有する。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/または2277に対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/または2277に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号3~1361および1365~2331のうち奇数番号の配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/または2277のポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される場合、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性と共にプロテアーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、参照配列(例えば、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278)に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に開示される任意のバリアント、または表3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に開示される任意のバリアントであって、ヒスチジンタグおよび先行するアミノ酸リンカーを欠如するバリアントのアミノ酸配列と、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/もしくは2278の参照ポリペプチド、または表に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較した1個もしくは複数の残基差異(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基位置)とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性と共にプロテアーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278の参照配列に対する少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性と、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278のポリペプチドと最適にアラインされた場合に、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/または3.27に提供されるものから選択される残基位置に、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278と比較した1個または複数の残基差異とを有する、アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、この組換えプロテアーゼは、236、258、261、339、439、446、および454から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、236V、258K、261L、339M、339W、439M、446A、446G、446L、446M、446T、および454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、組換えプロテアーゼは、M236V、Q258K、E261L、N339M、N339W、S439M、P446A、P446G、P446L、P446M、P446T、およびA454Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、107/536、162/408、168/547、208/366/504/591、208/485/526、210/223/258/552、210/241/258/599、223/241/258/599、223/429/481/533、223/481/533/552、225、225/260/263/265/544、225/262、225/362/366/591、225/366、225/482/591、244、258、258/318/429、258/449/481、258/481、261、261/504、318/481、318/533、318/599、339、342、345、362/366/485/591、363、366、366/485、366/497、366/526/591、366/591、408、427、446、448、449、450、481/533/552、482、482/485、482/591、485、485/591、533、533/552、536、544、547、549、565、615および652から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、107T/536D、162I/408R、168N/547V、208T/366G/504P/591L、208T/485D/526L、210D/223R/258K/552N、210D/241P/258K/599L、223R/241P/258K/599L、223R/429L/481S/533K、223R/481S/533K/552N、225A/260D/263H/265R/544R、225A/262L、225A/362T/366G/591L、225A/366G、225A/482V/591L、225K、244K、258K、258K/318D/429L、258K/449V/481S、258K/481S、258R、261G、261G/504V、261L、261R、261S、261V、318D/481S、318D/533K、318D/599L、339F、339W、342R、345W、362T/366G/485D/591L、363E、363W、366A、366G、366G/485D、366G/497R、366G/526L/591L、366G/591L、366L、366Q、408R、427H、427R、446R、446V、448K、448R、448W、449K、450W、481S/533K/552N、482V、482V/485D、482V/591L、485D、485D/591L、533A、533D、533E、533K、533K/552N、533N、536E、536G、536V、544R、547A、547E、549T、565C、565D、615A、615D、615G、615P、615T、615Wおよび652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、M107T/Q536D、T162I/A408R、S168N/Q547V、A208T/N366G/Q504P/K591L、A208T/N485D/R526L、N210D/N223R/Q258K/K552N、N210D/E241P/Q258K/D599L、N223R/E241P/Q258K/D599L、N223R/K429L/A481S/M533K、N223R/A481S/M533K/K552N、T225A/N260D/R263H/G265R/T544R、T225A/P262L、T225A/N362T/N366G/K591L、T225A/N366G、T225A/R482V/K591L、T225K、R244K、Q258K、Q258K/Q318D/K429L、Q258K/A449V/A481S、Q258K/A481S、Q258R、E261G、E261G/Q504V、E261L、E261R、E261S、E261V、Q318D/A481S、Q318D/M533K、Q318D/D599L、N339F、N339W、L342R、Q345W、N362T/N366G/N485D/K591L、Q363E、Q363W、N366A、N366G、N366G/N485D、N366G/Q497R、N366G/R526L/K591L、N366G/K591L、N366L、N366Q、A408R、P427H、P427R、P446R、P446V、N448K、N448R、N448W、A449K、N450W、A481S/M533K/K552N、R482V、R482V/N485D、R482V/K591L、N485D、N485D/K591L、M533A、M533D、M533E、M533K、M533K/K552N、M533N、Q536E、Q536G、Q536V、T544R、Q547A、Q547E、V549T、N565C、N565D、K615A、K615D、K615G、K615P、K615T、K615WおよびK652Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号2を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号34に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、258、258/261/342/345、258/261/342/504/533、258/261/345/504/549、258/261/482/504/549、258/342、258/342/504/533/536/549、258/345/427、258/408/427/504/549、258/427、258/427/482/504/533/536、258/427/482/536、261/342/345/536、261/342/482/504/533/536、261/342/482/504/549、261/342/482/536、261/342/533、261/482、318/339/362/544/547、318/339/448/544、318/339/547、318/448/544/615、339/362/363/544/547/615、339/362/544、339/448、339/448/547、339/544/547、342、342/408、342/408/536、342/482/536、362/363/544/547、362/448、363/544/547、427/482/504/533/536、427/533/536/549、448、448/544および448/544/547/615から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、258K、258K/261L/342R/345W、258K/261L/342R/504P/533D、258K/261L/345W/504P/549T、258K/261R/482V/504P/549T、258K/342R、258K/342R/504P/533K/536E/549T、258K/345W/427R、258K/408R/427R/504P/549T、258K/427R、258K/427R/482V/504P/533K/536E、258K/427R/482V/536E、261L/342R/345W/536E、261L/342R/482V/504P/533K/536E、261L/342R/533D、261R/342R/482V/504P/549T、261R/342R/482V/536E、261R/482V、318D/339W/362T/544R/547E、318D/339W/448R/544R、318D/339W/547E、318D/448R/544R/615A、339W/362T/363E/544R/547E/615A、339W/362T/544R、339W/448K、339W/448R、339W/448R/547E、339W/544R/547E、342R、342R/408R、342R/408R/536E、342R/482V/536E、362T/363E/544R/547E、362T/448R、363E/544R/547E、427R/482V/504P/533D/536E、427R/533K/536E/549T、448R、448R/544Rおよび448R/544R/547E/615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、Q258K、Q258K/E261L/L342R/Q345W、Q258K/E261L/L342R/Q504P/M533D、Q258K/E261L/Q345W/Q504P/V549T、Q258K/E261R/R482V/Q504P/V549T、Q258K/L342R、Q258K/L342R/Q504P/M533K/Q536E/V549T、Q258K/Q345W/P427R、Q258K/A408R/P427R/Q504P/V549T、Q258K/P427R、Q258K/P427R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、Q258K/P427R/R482V/Q536E、E261L/L342R/Q345W/Q536E、E261L/L342R/R482V/Q504P/M533K/Q536E、E261L/L342R/M533D、E261R/L342R/R482V/Q504P/V549T、E261R/L342R/R482V/Q536E、E261R/R482V、Q318D/N339W/N362T/T544R/Q547E、Q318D/N339W/N448R/T544R、Q318D/N339W/Q547E、Q318D/N448R/T544R/K615A、N339W/N362T/Q363E/T544R/Q547E/K615A、N339W/N362T/T544R、N339W/N448K、N339W/N448R、N339W/N448R/Q547E、N339W/T544R/Q547E、L342R、L342R/A408R、L342R/A408R/Q536E、L342R/R482V/Q536E、N362T/Q363E/T544R/Q547E、N362T/N448R、Q363E/T544R/Q547E、P427R/R482V/Q504P/M533D/Q536E、P427R/M533K/Q536E/V549T、N448R、N448R/T544RおよびN448R/T544R/Q547E/K615Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号34を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号190に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、205、505、541、556、および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、205Q、205T、505A、541R、556V、646L、および646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、S205Q、S205T、Q505A、S541R、T556V、A646L、およびA646Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号190を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号292に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、205/442/505/536/545/620/646、205/505/536/541/545/547/558/646/665、258、263、355/536/545/547、359、366、446、449、505/536/545/558/646、506、555、556、620および650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、205R/442L/505A/536W/545I/620V/646V、205R/505A/536W/541I/545R/547E/558E/646V/665E、258G、263M、263S、355R/536W/545I/547E、359Y、366S、446P、449L、505A/536W/545I/558E/646V、506R、555D、555G、555L、556G、620L、620Q、620Sおよび650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、S205R/V442L/Q505A/Q536W/A545I/E620V/A646V、S205R/Q505A/Q536W/S541I/A545R/Q547E/T558E/A646V/P665E、K258G、R263M、R263S、L355R/Q536W/A545I/Q547E、F359Y、N366S、R446P、A449L、Q505A/Q536W/A545I/T558E/A646V、G506R、E555D、E555G、E555L、T556G、E620L、E620Q、E620SおよびI650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号292を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号342に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、283/319/359/449/450/506、283/345/359/449/450/553/555、283/449/450/508/541/553/555、449/450、450/508/553/555/558、508および508/541/553から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、283H/345C/359Y/449L/450R/553T/555G、283L/319K/359Y/449L/450R/506R、283L/449L/450R/508G/541I/553T/555G、449L/450R、450R/508G/553R/555G/558E、508Gおよび508G/541I/553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、N283H/Q345C/F359Y/A449L/N450R/D553T/E555G、N283L/N319K/F359Y/A449L/N450R/G506R、N283L/A449L/N450R/N508G/S541I/D553T/E555G、A449L/N450R、N450R/N508G/D553R/E555G/T558E、N508GおよびN508G/S541I/D553Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号342を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号396もしくは1366に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、205、205/442/449/450、205/450/536/545、205/450/536/545/646、258/442/446、258/442/449/646、258/450/536/545、308、361、439、442/446/536/545/620/646、442/450/536/545、514、535、577、591、592、610、639、643および644から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、205S、205S/442V/449A/450N、205S/450N/536Q/545A、205S/450N/536Q/545A/646A、258Q/442V/446P、258Q/442V/449A/646A、258Q/450N/536Q/545A、308E、361V、439M、442V/446P/536Q/545A/620E/646A、442V/450N/536Q/545A、514H、535R、535V、577V、591R、591V、592P、610L、610P、610S、639E、639K、643E、643Rおよび644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R205S、R205S/L442V/L449A/R450N、R205S/R450N/W536Q/I545A、R205S/R450N/W536Q/I545A/V646A、K258Q/L442V/R446P、K258Q/L442V/L449A/V646A、K258Q/R450N/W536Q/I545A、A308E、I361V、S439M、L442V/R446P/W536Q/I545A/V620E/V646A、L442V/R450N/W536Q/I545A、R514H、E535R、E535V、D577V、K591R、K591V、A592P、A610L、A610P、A610S、A639E、A639K、A643E、A643RおよびD644Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号396または1366を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号400もしくは1370に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、32/490/639、236、236/238/404/480/555/568/592、236/359/404/406/555/639、236/359/490/581/639、236/359/555、236/359/609、236/370/406/568/581、236/370/568/592、236/370/581、236/404/406/480/490、236/404/555/581/609/639、236/568、236/592、236/639、238/359/370/404/490/568/639、245/363/408/512/514/596/666、245/363/512/514/537/560、308/514/535/639/644、359/404、359/404/406/490/546/581、363/408/512/514/537、363/408/601/650、363/639/644、408/512、408/514/537、408/514/560/650、490/568/592/639、512/537/560/601、514/535/546/575/644、514/639/644、514/644、535/575/639/644、535/639/643/644、535/643/644および601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、32T/490E/639T、236V、236V/238I/404G/480L/555Q/568P/592P、236V/359Y/404G/406R/555Q/639T、236V/359Y/490E/581T/639T、236V/359Y/555Q、236V/359Y/609G、236V/370C/406R/568P/581T、236V/370C/568P/592P、236V/370C/581T、236V/404G/406R/480L/490E、236V/404G/555Q/581T/609G/639T、236V/568P、236V/592P、236V/639T、238I/359Y/370C/404G/490E/568P/639T、245S/363K/408V/512N/514H/596T/666D、245S/363K/512N/514H/537P/560S、308E/514H/535R/639K/644A、359Y/404G、359Y/404G/406R/490E/546E/581T、363H/639K/644A、363K/408V/512N/514H/537P、363K/408V/601I/650T、408V/512N、408V/514H/537P、408V/514H/560S/650T、490E/568P/592P/639T、512N/537P/560S/601I、514H/535R/546E/575G/644A、514H/639K/644A、514H/644A、535R/575G/639K/644A、535R/639K/643R/644A、535V/643R/644Aおよび601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、I32T/Q490E/A639T、M236V、M236V/L238I/S404G/I480L/E555Q/L568P/A592P、M236V/F359Y/S404G/K406R/E555Q/A639T、M236V/F359Y/Q490E/S581T/A639T、M236V/F359Y/E555Q、M236V/F359Y/A609G、M236V/S370C/K406R/L568P/S581T、M236V/S370C/L568P/A592P、M236V/S370C/S581T、M236V/S404G/K406R/I480L/Q490E、M236V/S404G/E555Q/S581T/A609G/A639T、M236V/L568P、M236V/A592P、M236V/A639T、L238I/F359Y/S370C/S404G/Q490E/L568P/A639T、T245S/Q363K/A408V/S512N/R514H/M596T/S666D、T245S/Q363K/S512N/R514H/E537P/T560S、A308E/R514H/E535R/A639K/D644A、F359Y/S404G、F359Y/S404G/K406R/Q490E/V546E/S581T、Q363H/A639K/D644A、Q363K/A408V/S512N/R514H/E537P、Q363K/A408V/M601I/I650T、A408V/S512N、A408V/R514H/E537P、A408V/R514H/T560S/I650T、Q490E/L568P/A592P/A639T、S512N/E537P/T560S/M601I、R514H/E535R/V546E/S575G/D644A、R514H/A639K/D644A、R514H/D644A、E535R/S575G/A639K/D644A、E535R/A639K/A643R/D644A、E535V/A643R/D644AおよびM601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号400または1370を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号454もしくは1424に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、236、236/308/370/548、236/308/490/581/643、236/308/555/560/596、236/370、236/370/490/639、236/555、236/560/581、245/359/363/406/535/650、245/363/406/575/601/666、300、301、308、308/490/560/581/639/643、336、359/363/406/535/601/650、359/404/406/535、359/406/575/650/666、359/535/575/601、363/404/406/535/568、404/406/535、406、406/480/535/568/601、406/535/575、468および480/575/601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、236V、236V/308E/370C/548E、236V/308E/490E/581T/643R、236V/308E/555Q/560S/596T、236V/370C、236V/370C/490E/639T、236V/555Q、236V/560S/581T、245S/359Y/363K/406R/535R/650T、245S/363K/406R/575G/601I/666D、300F、301V、308E、308E/490E/560S/581T/639T/643R、336W、359Y/363K/406R/535R/601I/650T、359Y/404G/406R/535R、359Y/406R/575G/650T/666D、359Y/535R/575G/601I、363K/404G/406R/535R/568P、404G/406R/535R、406R、406R/480L/535R/568P/601I、406R/535R/575G、468Sおよび480L/575G/601I/650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、M236V、M236V/A308E/S370C/D548E、M236V/A308E/Q490E/S581T/A643R、M236V/A308E/E555Q/T560S/M596T、M236V/S370C、M236V/S370C/Q490E/A639T、M236V/E555Q、M236V/T560S/S581T、T245S/F359Y/Q363K/K406R/E535R/I650T、T245S/Q363K/K406R/S575G/M601I/S666D、L300F、A301V、A308E、A308E/Q490E/T560S/S581T/A639T/A643R、Y336W、F359Y/Q363K/K406R/E535R/M601I/I650T、F359Y/S404G/K406R/E535R、F359Y/K406R/S575G/I650T/S666D、F359Y/E535R/S575G/M601I、Q363K/S404G/K406R/E535R/L568P、S404G/K406R/E535R、K406R、K406R/I480L/E535R/L568P/M601I、K406R/E535R/S575G、A468SおよびI480L/S575G/M601I/I650Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号454または1424を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、133/301/346/347/468、205/236/347、205/236/370/490/537/620、205/342/439/442/514/620/639、205/370/537、205/442/505/620、236/258/370/505/545/639、236/339/514、236/370/450/620、236/545、258/339/342/505/537、258/342/370/408/442/537、300/301/308/346/347/468、300/301/347/468、301/308/336/346/406/468/601、301/308/346/406/468、301/308/468/601、301/347/406、308/336/347/468、308/347/468、342、342/408/490/505/514/545/639/646、342/620、370/442、370/537/639、489、539/649、542、543、543/673、558、559、566、634および661から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、133M/301V/346K/347F/468S、205S/236M/347F、205S/236M/370S/490Q/537E/620E、205S/342L/439S/442V/514R/620E/639A、205S/370S/537E、205S/442V/505Q/620E、236M/258Q/370S/505Q/545A/639A、236M/339N/514R、236M/370S/450N/620E、236M/545A、258Q/339N/342L/505Q/537E、258Q/342L/370S/408A/442V/537E、300F/301V/308E/346K/347F/468S、300F/301V/347F/468S、301V/308E/336W/346K/406R/468S/601I、301V/308E/346K/406R/468S、301V/308E/468S/601I、301V/347F/406R、308E/336W/347F/468S、308E/347F/468S、342L、342L/408A/490Q/505Q/514R/545A/639A/646A、342L/620E、370S/442V、370S/537E/639A、489Y、539M/649H、542M、543A、543V/673Y、558R、559H、559S、566G、634Cおよび661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、L133M/A301V/V346K/V347F/A468S、R205S/V236M/V347F、R205S/V236M/C370S/E490Q/P537E/V620E、R205S/R342L/M439S/L442V/H514R/V620E/T639A、R205S/C370S/P537E、R205S/L442V/A505Q/V620E、V236M/K258Q/C370S/A505Q/I545A/T639A、V236M/W339N/H514R、V236M/C370S/R450N/V620E、V236M/I545A、K258Q/W339N/R342L/A505Q/P537E、K258Q/R342L/C370S/V408A/L442V/P537E、L300F/A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、L300F/A301V/V347F/A468S、A301V/A308E/Y336W/V346K/K406R/A468S/M601I、A301V/A308E/V346K/K406R/A468S、A301V/A308E/A468S/M601I、A301V/V347F/K406R、A308E/Y336W/V347F/A468S、A308E/V347F/A468S、R342L、R342L/V408A/E490Q/A505Q/H514R/I545A/T639A/V646A、R342L/V620E、C370S/L442V、C370S/P537E/T639A、D489Y、P539M/D649H、I542M、F543A、F543V/H673Y、T558R、L559H、L559S、T566G、P634CおよびG661Dから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号562もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、205/236/342/439/505/514/537/545、236/342/505/514/537/545、300/301/308/336/347/468/601、300/301/347/406、301/308/346/347/468、301/336/346/347/406/601および308/336/347/406/468/601から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、205S/236M/342L/439S/505Q/514R/537E/545A、236M/342L/505Q/514R/537E/545A、300F/301V/308E/336W/347F/468S/601I、300F/301V/347F/406R、301V/308E/346K/347F/468S、301V/336W/346K/347F/406R/601Iおよび308E/336W/347F/406R/468S/601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R205S/V236M/R342L/M439S/A505Q/H514R/P537E/I545A、V236M/R342L/A505Q/H514R/P537E/I545A、L300F/A301V/A308E/Y336W/V347F/A468S/M601I、L300F/A301V/V347F/K406R、A301V/A308E/V346K/V347F/A468S、A301V/Y336W/V346K/V347F/K406R/M601IおよびA308E/Y336W/V347F/K406R/A468S/M601Iから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号562または1532を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号638もしくは1532に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、346/511/537、346/511/537/541/543、346/511/542/582、346/511/581/582、346/511/583、346/529/571/581/582/583/589、511/537、516/539/568、537/582、539、568/662/663および581/582から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E、346V/511S/537E/541I/543G、346V/511S/542S/582R、346V/511S/581L/582R、346V/511S/583R、346V/529G/571I/581C/582V/583V/589A、511S/537E、516M/539E/568R、537E/582R、539E、568R/662W/663Wおよび581L/582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1532を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E、K346V/A511S/P537E/S541I/F543G、K346V/A511S/I542S/Y582R、K346V/A511S/S581L/Y582R、K346V/A511S/I583R、K346V/V529G/S571I/S581C/Y582V/I583V/T589A、A511S/P537E、P516M/P539E/L568R、P537E/Y582R、P539E、L568R/F662W/E663WおよびS581L/Y582Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1532を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号638もしくは1608に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、346/511/537/582、346/511/543/582、346/511/544、346/537/542/544、346/543/544、346/583、511/537/542/582/583、516、516/539/555、537/543/582、539/568、540、542/544/581、548、549、559、559/568、582、647、650および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、346V/511S/537E/582V、346V/511S/543G/582R、346V/511S/544L、346V/537E/542S/544L、346V/543G/544L、346V/583R、511S/537E/542S/582R/583R、516M、516M/539E/555G、537E/543G/582R、539E/568R、540G、542S/544L/581R、548R、549G、559S、559S/568R、582V、647L、647W、650Gおよび664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、K346V/A511S/P537E/Y582V、K346V/A511S/F543G/Y582R、K346V/A511S/T544L、K346V/P537E/I542S/T544L、K346V/F543G/T544L、K346V/I583R、A511S/P537E/I542S/Y582R/I583R、P516M、P516M/P539E/E555G、P537E/F543G/Y582R、P539E/L568R、V540G、I542S/T544L/S581R、D548R、V549G、L559S、L559S/L568R、Y582V、Q647L、Q647W、I650GおよびQ664Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号638または1608を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号680もしくは1650に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、261/355/543、261/355/567/568、261/489、261/489/511/568、261/489/539、261/489/567、261/539/543、261/539/543/567、261/542/543/568、511、511/539/543、511/567、543および583から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、261D/355C/543A、261D/355C/567R/568R、261D/489E、261D/489E/511D/568R、261D/489E/539L、261D/489E/567R、261D/539L/543A、261D/539L/543D/567R、261D/542L/543A/568R、511D、511D/539L/543A、511D/567R、543Aおよび583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、L261D/L355C/F543A、L261D/L355C/D567R/L568R、L261D/D489E、L261D/D489E/A511D/L568R、L261D/D489E/P539L、L261D/D489E/D567R、L261D/P539L/F543A、L261D/P539L/F543D/D567R、L261D/I542L/F543A/L568R、A511D、A511D/P539L/F543A、A511D/D567R、F543AおよびI583Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号680または1650を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、9、9/17/34/35/93/554、9/17/50、9/17/93、9/29/35/43/77/542/554、9/32/77/93、9/43/77、9/50/63/93、9/93、17/29/34/35/36/77/93、17/32/34/35、17/77、32/34/93、43、50/77/93、50/93、77/93、93、205/263/470、205/344/470/565、205/345/470/538/664、205/470/545/568/645/647/664、205/470/567/568/645、263/344/664、263/470/645、263/489、263/539/541/568/645、344/355/470/489/645、344/355/470/568/645/647、344/470/489/539/542/645/647/664、344/470/489/567/568、344/470/568、344/470/647、470、470/489、470/541/542/543/565/645/647、470/567/568、470/664および542/543から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、9K、9K/17A/34M/35G/93E/554M、9K/17A/50S、9K/17A/93E、9K/29S/35G/43P/77D/542V/554M、9K/32A/77D/93E、9K/43P/77D、9K/50S/63E/93E、9K/93E、9Q/17A/93E、17A/29S/34M/35G/36D/77D/93E、17A/32A/34M/35G、17A/77D、32A/34M/93E、43P、50S/77D/93E、50S/93E、77D/93E、93E、205L/263V/470Q、205L/344V/470Q/565A、205L/345P/470Q/538T/664R、205L/470Q/545L/568R/645S/647W/664R、205L/470Q/567R/568R/645S、263I/344V/664R、263I/470Q/645S、263I/489D、263I/539L/541R/568R/645S、344V/355C/470Q/489D/645S、344V/355C/470Q/568R/645S/647W、344V/470Q/489D/539L/542L/645S/647W/664R、344V/470Q/489D/567R/568R、344V/470Q/568R、344V/470Q/647W、470Q、470Q/489D、470Q/541R/542L/543A/565A/645S/647W、470Q/567R/568R、470Q/664Rおよび542L/543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R9K、R9K/T17A/T34M/E35G/A93E/L554M、R9K/T17A/N50S、R9K/T17A/A93E、R9K/N29S/E35G/S43P/N77D/I542V/L554M、R9K/I32A/N77D/A93E、R9K/S43P/N77D、R9K/N50S/A63E/A93E、R9K/A93E、R9Q/T17A/A93E、T17A/N29S/T34M/E35G/T36D/N77D/A93E、T17A/I32A/T34M/E35G、T17A/N77D、I32A/T34M/A93E、S43P、N50S/N77D/A93E、N50S/A93E、N77D/A93E、A93E、R205L/R263V/P470Q、R205L/N344V/P470Q/N565A、R205L/Q345P/P470Q/S538T/Q664R、R205L/P470Q/I545L/L568R/K645S/Q647W/Q664R、R205L/P470Q/D567R/L568R/K645S、R263I/N344V/Q664R、R263I/P470Q/K645S、R263I/E489D、R263I/P539L/S541R/L568R/K645S、N344V/L355C/P470Q/E489D/K645S、N344V/L355C/P470Q/L568R/K645S/Q647W、N344V/P470Q/E489D/P539L/I542L/K645S/Q647W/Q664R、N344V/P470Q/E489D/D567R/L568R、N344V/P470Q/L568R、N344V/P470Q/Q647W、P470Q、P470Q/E489D、P470Q/S541R/I542L/F543A/N565A/K645S/Q647W、P470Q/D567R/L568R、P470Q/Q664RおよびI542L/F543Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号756もしくは1726に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、9/17/32/34/36/50/77/107/127、9/17/63/77、9/43/93/127、9/63/93/107、17/29/32/34/36/63、29/34/35/77、32/43/93、35/93/145および205/263/489/647から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、9K/17A/32A/34M/36D/50S/77D/107K/127S、9K/17A/63E/77D、9K/43P/93E/127S、9K/63E/93E/107K、17A/29S/32A/34M/36D/63E、29S/34M/35G/77D、32A/43P/93E、35G/93E/145Eおよび205L/263V/489D/647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R9K/T17A/I32A/T34M/T36D/N50S/N77D/M107K/G127S、R9K/T17A/A63E/N77D、R9K/S43P/A93E/G127S、R9K/A63E/A93E/M107K、T17A/N29S/I32A/T34M/T36D/A63E、N29S/T34M/E35G/N77D、I32A/S43P/A93E、E35G/A93E/G145EおよびR205L/R263V/E489D/Q647Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号756または1726を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、188、189、265、266、334、442、454、646、および649から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、188W、189A、189P、265R、266E、266G、334I、442V、454L、454M、454S、646I、646M、646R、649T、および649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、N188W、K189A、K189P、G265R、N266E、N266G、V334I、L442V、A454L、A454M、A454S、V646I、V646M、V646R、D649T、およびD649Yから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、189、266、266/283、546、594、および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、189I、266A、266L、266L/283K、266M、266S、266V、266W、266Y、546L、594A、および646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、K189I、N266A、N266L、N266L/N283K、N266M、N266S、N266V、N266W、N266Y、V546L、V594A、およびV646Lから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、263/470/568、266、470/542/543/664、および558/577/594から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、263I/470P/568R、266R、470P/542L/543A/664Q、および558E/577V/594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R263I/Q470P/L568R、N266R、Q470P/I542L/F543A/R664Q、およびT558E/D577V/V594Aから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号812もしくは1782に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、29、29/35、29/35/342/581/582/664、29/50/511/539/581、35、35/50/205/406/511/581、35/205/511、35/342/346/511/539/581、35/346、35/346/406/511/581/582/664、35/511、35/539、50/342、132、133、143、147、187、188、257、258、263、294、294/441/527、308/342/511/581/582、342、346、398、406/664、429/652、441、441/446/526、446/652、482、505、511、526、527、536、545、581、582、615、620、639、645、646、648、652、654および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、29F、29G、29S/35G、29S/35G/342L/581S/582Y/664Q、29S/50S/511S/539L/581S、35D/511S、35G、35G/50S/205S/406R/511S/581S、35G/205S/511S、35G/342L/346V/511S/539L/581S、35G/346V、35G/346V/406R/511S/581S/582Y/664Q、35G/511S、35G/539L、50S/342L、132T、133V、143H、147T、187G、188T、257L、258H、258N、263S、294A、294A/441A/527A、308A/342L/511S/581S/582Y、342F、346V、398G、406R/664Q、429L/652T、441A、441A/446P/526L、441V、446P/652T、482V、505F、505M、511S、526V、527D、527R、536H、536R、545V、581A、581S、582G、582S、582Y、615Q、620E、639E、639I、645E、645G、645W、646G、646R、648Q、648V、652L、652Q、652T、652Y、654C、664G、664Vおよび664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、N29F、N29G、N29S/E35G、N29S/E35G/R342L/L581S/R582Y/R664Q、N29S/N50S/A511S/P539L/L581S、E35D/A511S、E35G、E35G/N50S/R205S/K406R/A511S/L581S、E35G/R205S/A511S、E35G/R342L/K346V/A511S/P539L/L581S、E35G/K346V、E35G/K346V/K406R/A511S/L581S/R582Y/R664Q、E35G/A511S、E35G/P539L、N50S/R342L、I132T、L133V、E143H、A147T、I187G、N188T、R257L、K258H、K258N、R263S、R294A、R294A/R441A/K527A、E308A/R342L/A511S/L581S/R582Y、R342F、K346V、A398G、K406R/R664Q、K429L/K652T、R441A、R441A/R446P/R526L、R441V、R446P/K652T、R482V、A505F、A505M、A511S、R526V、K527D、K527R、W536H、W536R、I545V、L581A、L581S、R582G、R582S、R582Y、K615Q、V620E、T639E、T639I、K645E、K645G、K645W、V646G、V646R、R648Q、R648V、K652L、K652Q、K652T、K652Y、R654C、R664G、R664VおよびR664Wから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号812または1782を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1030もしくは2000に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、29、29/143/263/266/441/639、29/263/266、29/263/266/441/620、29/266/441、29/441/639、30、37、47/570、75、81、85、92、135、143、143/263/266/639、143/266/441/620/639、168、189/424、237/527、244、258/342/582/648、263、263/266/441、263/266/639、266/441、266/441/620/639、266/620/639、266/639、267、342/526/664、342/545、342/582、429、441、482、495、501、523、526、527、568、570、573、581、582、616、632、648、653および654から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、29G/143H/263S/266A/441V/639I、29G/263S/266A、29G/263S/266L/441A/620E、29G/266A/441A、29G/441V/639V、29S、30G、37L、47G/570E、75N、75S、81N、85L、92L、135E、143H/263S/266A/639V、143H/266A/441V/620E/639V、143Q、168E、189Q/424G、237E/527V、244S、258H/342F/582S/648Q、263S/266A/441A、263S/266A/441V、263S/266A/639V、263T、266A/441V/620E/639V、266A/620E/639I、266A/639I、266L/441A、267G、342F/526V/664G、342F/545V、342F/582G、429P、441E、482V、495L、501Q、523V、526E、527E、527L、527M、527R、527T、568P、570E、573T、581T、582F、616T、632Q、648A、653Iおよび654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、N29G/E143H/R263S/N266A/R441V/T639I、N29G/R263S/N266A、N29G/R263S/N266L/R441A/V620E、N29G/N266A/R441A、N29G/R441V/T639V、N29S、R30G、R37L、E47G/K570E、R75N、R75S、R81N、R85L、P92L、R135E、E143H/R263S/N266A/T639V、E143H/N266A/R441V/V620E/T639V、E143Q、S168E、K189Q/D424G、D237E/K527V、R244S、K258H/L342F/R582S/R648Q、R263S/N266A/R441A、R263S/N266A/R441V、R263S/N266A/T639V、R263T、N266A/R441V/V620E/T639V、N266A/V620E/T639I、N266A/T639I、N266L/R441A、R267G、L342F/R526V/R664G、L342F/I545V、L342F/R582G、K429P、R441E、R482V、I495L、R501Q、M523V、R526E、K527E、K527L、K527M、K527R、K527T、L568P、K570E、K573T、S581T、R582F、K616T、K632Q、R648A、M653IおよびR654Vから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、29、29/30、29/30/143/263/482/646、29/30/263、29/30/616/648、29/75/263/568/570/648、29/168/648、29/263/527/568、75、75/143/168/527、75/168、75/616、143、168/247/482/648、168/263/616、168/482/616、168/495/616、263、263/616、429/545、495および527から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、29S、29S/30G、29S/30G/143Q/263T/482V/646E、29S/30G/263T、29S/30G/616T/648A、29S/75S/263T/568P/570E/648A、29S/168E/648A、29S/263T/527L/568P、75S、75S/143Q/168E/527L、75S/168E、75S/616T、143Q、168E/247S/482V/648A、168E/263T/616T、168E/482V/616T、168E/495L/616T、263T、263T/616T、429P/545V、495Lおよび527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、N29S、N29S/R30G、N29S/R30G/E143Q/S263T/R482V/V646E、N29S/R30G/S263T、N29S/R30G/K616T/R648A、N29S/R75S/S263T/L568P/K570E/R648A、N29S/S168E/R648A、N29S/S263T/K527L/L568P、R75S、R75S/E143Q/S168E/K527L、R75S/S168E、R75S/K616T、E143Q、S168E/G247S/R482V/R648A、S168E/S263T/K616T、S168E/R482V/K616T、S168E/I495L/K616T、S263T、S263T/K616T、K429P/I545V、I495LおよびK527Tから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1136もしくは2106に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、207、222、266、307、454、535、546、548、580、604、および610から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、207R、222T、266K、307L、454L、535V、546R、548S、580C、604P、および610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、Q207R、S222T、A266K、Q307L、A454L、E535V、V546R、D548S、H580C、H604P、およびA610Rから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1180もしくは2150に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、75/168/207/454/568/586/610/648/659、75/168/266/454/546/570/580、75/207/454/570/659、75/207/546/580/648、75/263/454/548/568/604/648、75/266/454、75/454、75/454/546/548/568/604、75/546/548/610/648、168/207/263/454/568/570/604、168/263/266/546/604、168/454/604、207/604/610、209、212、221、223、228、266/454/568、319、373、412/546/554、431、454、454/546/568/570/580、454/546/570、454/570/580/610、454/580、454/659および506から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、75S/168E/207R/454L/568P/586V/610R/648A/659T、75S/168E/266K/454L/546R/570E/580C、75S/207R/454L/570E/659T、75S/207R/546R/580C/648A、75S/263T/454L/548S/568P/604P/648A、75S/266K/454L、75S/454L、75S/454L/546R/548S/568P/604P、75S/546R/548S/610R/648A、168E/207R/263T/454L/568P/570E/604P、168E/263T/266K/546R/604P、168E/454L/604P、207R/604P/610R、209V、212S、221I、223Q、228I、228V、266K/454L/568P、319Q、373F、412Y/546L/554M、431T、454I、454L/546R/568P/570E/580C、454L/546R/570E、454L/570E/580C/610R、454L/580C、454L/659Tおよび506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R75S/S168E/Q207R/A454L/L568P/L586V/A610R/R648A/E659T、R75S/S168E/A266K/A454L/V546R/K570E/H580C、R75S/Q207R/A454L/K570E/E659T、R75S/Q207R/V546R/H580C/R648A、R75S/S263T/A454L/D548S/L568P/H604P/R648A、R75S/A266K/A454L、R75S/A454L、R75S/A454L/V546R/D548S/L568P/H604P、R75S/V546R/D548S/A610R/R648A、S168E/Q207R/S263T/A454L/L568P/K570E/H604P、S168E/S263T/A266K/V546R/H604P、S168E/A454L/H604P、Q207R/H604P/A610R、I209V、D212S、L221I、N223Q、T228I、T228V、A266K/A454L/L568P、N319Q、L373F、F412Y/V546L/L554M、P431T、A454I、A454L/V546R/L568P/K570E/H580C、A454L/V546R/K570E、A454L/K570E/H580C/A610R、A454L/H580C、A454L/E659TおよびG506Nから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1250もしくは2220に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、75/189/373/582、75/200/212/431/482、75/212/373/431/482、75/212/431/482/568/615/664、75/368/582、75/373/431/526/582、75/431/482/570/604/664、75/632、189/212/431/568/570、200/205/373/431、200/431/482/615/664、200/482/664、212/228/431、212/228/568/570/582/664、212/373/446/482/582、368/373/431、373/431/570/604/664、373/568/632、431、431/604/664、482/582、582および615/652/664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、75S/189A/373F/582G、75S/200W/212S/431T/482S、75S/212S/373F/431T/482S、75S/212S/431T/482S/568P/615M/664G、75S/368M/582G、75S/373F/431T/526E/582G、75S/431T/482S/570K/604P/664G、75S/632Q、189A/212S/431T/568P/570K、200W/205S/373F/431T、200W/431T/482S/615M/664G、200W/482S/664W、212S/228V/431T、212S/228V/568P/570K/582G/664W、212S/373F/446F/482S/582G、368M/373F/431T、373F/431T/570K/604P/664W、373F/568P/632Q、431T、431T/604P/664G、482S/582G、582Gおよび615M/652V/664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、R75S/K189A/L373F/R582G、R75S/K200W/D212S/P431T/R482S、R75S/D212S/L373F/P431T/R482S、R75S/D212S/P431T/R482S/L568P/K615M/R664G、R75S/K368M/R582G、R75S/L373F/P431T/R526E/R582G、R75S/P431T/R482S/E570K/H604P/R664G、R75S/K632Q、K189A/D212S/P431T/L568P/E570K、K200W/R205S/L373F/P431T、K200W/P431T/R482S/K615M/R664G、K200W/R482S/R664W、D212S/T228V/P431T、D212S/T228V/L568P/E570K/R582G/R664W、D212S/L373F/R446F/R482S/R582G、K368M/L373F/P431T、L373F/P431T/E570K/H604P/R664W、L373F/L568P/K632Q、P431T、P431T/H604P/R664G、R482S/R582G、R582GおよびK615M/K652V/R664Gから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1308もしくは2278に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼ、またはその機能的断片をコードし、コードされた組換えプロテアーゼは、408/439、439/514、470、470/667、514、514/537、および537から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、408A/439S、439S/514R、470G、470G/667D、470P、514R、514R/537E、および537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされた組換えプロテアーゼは、V408A/M439S、M439S/H514R、Q470G、Q470G/G667D、Q470P、H514R、H514R/P537E、およびP537Eから選択される少なくとも1個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、2278、または2332に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、2278、または2332のポリペプチド配列を含む組換えプロテアーゼをコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号1、33、189、2、291、341、381、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、および/もしくは1307、またはそれらの相補体、あるいは本明細書で提供されるバリアントプロテアーゼポリペプチドのうちいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/または3.27に示される任意の位置から選択される残基位置に、配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/または2277と比較して1個または複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含むプロテアーゼポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に提供される操作されたポリヌクレオチド、または表3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に提供される操作されたポリヌクレオチドであって、ヒスチジンタグおよび先行するアミノ酸リンカーをコードする配列が存在しない操作されたヌクレオチド、から選択され;あるいは配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/または2277から選択される参照配列に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27、ならびに/または配列番号1、33、189、2、291、341、381、395、399、453、561、637、679、755、811、1029、1135、1179、1249、1307、1365、1369、1423、1531、1607、1649、1725、1781、1999、2105、2149、2219、および/もしくは2277に提供される少なくとも1個のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号3~1361および1365~2331から選択される少なくとも1個のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号1365~2331から選択される少なくとも1個のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号3~1361および1365~2331から選択される配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号1365~2331から選択される配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、または1~50個の塩基変化を含む。一部のなお他の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31、32、33、34、35、40、45、または50個の塩基変化を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、または25個の塩基変化を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたプロテアーゼポリペプチドのうちいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の発現およびポリペプチドの産生を提供するために、種々の方法で操作される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターとして提供され、その中には、1個または複数の制御配列が、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を調節するために存在する。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作が、発現ベクターに依存して、望ましいまたは必要な場合がある。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野で周知である。
一部の実施形態では、制御配列には、他の配列のうちで、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当技術分野で公知のように、適切な制御配列は、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。本発明は、任意の具体的な制御配列に限定されない意図である。
細菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Escherichia coliラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン、T7バクテリオファージ由来のT7プロモーター、およびSaccharopolyspora erythraeaエリスロマイシン抵抗性遺伝子の遺伝子から得られたプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus niger耐酸性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ(例えば、WO96/00787を参照されたい)の遺伝子から得られたプロモーター、ならびにNA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼおよびAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド)、ならびにそれらの突然変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)、およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野で公知である(例えば、Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]を参照されたい)。哺乳動物細胞における使用のための例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、サル空胞ウイルス(Simian vacuolating virus)40(SV40)由来のもの、Homo sapiensホスホグリセリン酸キナーゼ、ベータアクチン、伸長因子-1aもしくはグリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ由来のもの、またはGallusのβ-アクチン由来のものが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列であり、これは、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターが、本発明において使用される。例えば、細菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、T7ターミネーターについてはT7細菌ファージから得られ得る、またはEscherichia coliリボソームRNAから得られ得る(例えば、rrnBターミネーター)。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeチトクロムC(CYC1)、およびSaccharomyces cerevisiaeグリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である(例えば、Romanos et al.、上記を参照されたい)。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、サル空胞ウイルス40(SV40)由来のもの、またはHomo sapiens成長ホルモン由来のものが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列であり、これは、宿主細胞による翻訳のために重要なmRNAの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼおよびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーには、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子、およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られるものが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列であってもよく、これは、核酸配列の3’末端に作動可能に連結された配列であり、転写されると、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして、宿主細胞によって認識される。選択された宿主細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ、およびAspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼの遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列もまた、当技術分野で公知である(例えば、Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]を参照されたい)。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に仕向ける、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントとイン翻訳リーディングフレームで天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の5’末端は、コード配列にとって外来のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。
発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に仕向ける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたプロテアーゼポリペプチドの発現のために使用される。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域には、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼ、およびHumicola lanuginosaプロテアーゼの遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域が含まれるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、Saccharomyces cerevisiaeアルファ-因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、免疫グロブリンガンマ(IgG)の遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、一部の場合には、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素原」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。
別の態様では、本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それらが導入される宿主の型に依存した、1個または複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点等とを含む、組換え発現ベクターもまた提供する。一部の実施形態では、上記種々の核酸および制御配列は、そのような部位におけるバリアントプロテアーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするための1個または複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生するために互いに接続される。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列(複数可)は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現される。発現ベクターを創出する際に、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列をベクター中に位置させる。
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に簡便に供することができ、バリアントプロテアーゼポリヌクレオチド配列の発現を生じ得る、任意のベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状または閉鎖環状プラスミドであり得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター(すなわち、その複製が染色体複製から独立した染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体)である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替的実施形態では、ベクターは、宿主細胞中に導入されると、ゲノム中に組み込まれ、それが中に組み込まれた染色体(複数可)と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、合わせると、宿主細胞のゲノム中に導入される総DNAを含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは2個もしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用され得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする1種または複数の選択可能なマーカーを含有する。
「選択可能なマーカー」は、その産物が殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求性に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。細菌宿主細胞のための適切なマーカーには、カルベニシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシンおよびゼオシン(zeocin)が含まれるがこれらに限定されない。
酵母宿主細胞のための適切なマーカーには、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、およびURA3が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択可能なマーカーには、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニリルトランスフェラーゼ)、およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびにそれらの等価物が含まれるがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、本出願の少なくとも1種の操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたプロテアーゼ酵素(複数可)の発現のための1個または複数の制御配列に動作可能に連結されている。
本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現する際の使用のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、これには、細菌細胞(例えば、E.coli);真菌細胞、例えば、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris[例えば、ATCC受託番号201178]);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞)、植物細胞、動物細胞(例えば、CHO、COS、およびBHK)、およびヒト細胞(例えば、HEK293T、ヒト線維芽細胞、THP-1、JurkatおよびBowes黒色腫細胞系)が含まれるがこれらに限定されない。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能な宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、これらの方法は、本明細書に記載されるプロテアーゼポリペプチドを単離および/または精製するステップをさらに含む。
上記宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。プロテアーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の種々の方法によって、細胞中に導入され得る。技法には、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
本明細書で開示される特性を有する操作されたプロテアーゼは、天然に存在するまたは操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の、および本明細書に記載される、突然変異誘発法および/または指向性進化法に供することによって得られ得る。例示的な指向性進化技法は、突然変異誘発および/またはDNAシャッフリングである(例えば、Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, 91:10747-10751;WO95/22625;WO97/0078;WO97/35966;WO98/27230;WO00/42651;WO01/75767および米国特許第6,537,746号を参照されたい)。使用され得る他の指向性進化手順には、とりわけ、互い違い伸長プロセス(staggered extension process)(StEP)、in vitro組換え(例えば、Zhao et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16:258-261を参照されたい)、変異原性PCR(例えば、Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140, 1994を参照されたい)、およびカセット突然変異誘発(例えば、Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93:3525-3529を参照されたい)が含まれる。
組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生され得る。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、ベクター、例えば、プラスミドにクローニングし、所望の宿主、例えば、E.coli等において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の種々の方法によって生成することができる。実際、当業者にとって周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法が存在する。さらに、多くの分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットを入手することもできる。規定されたアミノ酸における特異的置換(部位指定)、遺伝子の限局された領域における特異的もしくはランダム突然変異(位置特異的)、または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発(例えば、飽和突然変異誘発)を行う方法が利用できる。PCRを使用した一本鎖DNAまたは二本鎖DNAの部位指定突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャッフリング、および化学的飽和突然変異誘発、または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法が含まれるがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が、当業者にとって公知である。突然変異誘発法および指向性進化法は、発現、スクリーニングおよびアッセイされ得るバリアントライブラリーを生成するために、酵素をコードするポリヌクレオチドに容易に適用され得る。任意の適切な突然変異誘発法および指向性進化法が、本発明において使用され、当技術分野で周知である(例えば、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号、同第5,837,458号、同第5,928,905号、同第6,096,548号、同第6,117,679号、同第6,132,970号、同第6,165,793号、同第6,180,406号、同第6,251,674号、同第6,265,201号、同第6,277,638号、同第6,287,861号、同第6,287,862号、同第6,291,242号、同第6,297,053号、同第6,303,344号、同第6,309,883号、同第6,319,713号、同第6,319,714号、同第6,323,030号、同第6,326,204号、同第6,335,160号、同第6,335,198号、同第6,344,356号、同第6,352,859号、同第6,355,484号、同第6,358,740号、同第6,358,742号、同第6,365,377号、同第6,365,408号、同第6,368,861号、同第6,372,497号、同第6,337,186号、同第6,376,246号、同第6,379,964号、同第6,387,702号、同第6,391,552号、同第6,391,640号、同第6,395,547号、同第6,406,855号、同第6,406,910号、同第6,413,745号、同第6,413,774号、同第6,420,175号、同第6,423,542号、同第6,426,224号、同第6,436,675号、同第6,444,468号、同第6,455,253号、同第6,479,652号、同第6,482,647号、同第6,483,011号、同第6,484,105号、同第6,489,146号、同第6,500,617号、同第6,500,639号、同第6,506,602号、同第6,506,603号、同第6,518,065号、同第6,519,065号、同第6,521,453号、同第6,528,311号、同第6,537,746号、同第6,573,098号、同第6,576,467号、同第6,579,678号、同第6,586,182号、同第6,602,986号、同第6,605,430号、同第6,613,514号、同第6,653,072号、同第6,686,515号、同第6,703,240号、同第6,716,631号、同第6,825,001号、同第6,902,922号、同第6,917,882号、同第6,946,296号、同第6,961,664号、同第6,995,017号、同第7,024,312号、同第7,058,515号、同第7,105,297号、同第7,148,054号、同第7,220,566号、同第7,288,375号、同第7,384,387号、同第7,421,347号、同第7,430,477号、同第7,462,469号、同第7,534,564号、同第7,620,500号、同第7,620,502号、同第7,629,170号、同第7,702,464号、同第7,747,391号、同第7,747,393号、同第7,751,986号、同第7,776,598号、同第7,783,428号、同第7,795,030号、同第7,853,410号、同第7,868,138号、同第7,783,428号、同第7,873,477号、同第7,873,499号、同第7,904,249号、同第7,957,912号、同第7,981,614号、同第8,014,961号、同第8,029,988号、同第8,048,674号、同第8,058,001号、同第8,076,138号、同第8,108,150号、同第8,170,806号、同第8,224,580号、同第8,377,681号、同第8,383,346号、同第8,457,903号、同第8,504,498号、同第8,589,085号、同第8,762,066号、同第8,768,871号、同第8,849,575号、同第9,593,326号、同第9,665,694号、同第9,684,771号、同第9,864,833号、同第9,996,661号、ならびに全ての関連の米国、ならびにPCTおよび非米国対応物;Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997];Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996];Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985];Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985];Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986];Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984];Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985];Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999];Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999];Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998];Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997];Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997];Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996];Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994];Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994];WO95/22625;WO97/0078;WO97/35966;WO98/27230;WO00/42651;WO01/75767;およびWO2009/152336を参照されたい。これらは全て、これにより参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、突然変異誘発処理後に得られた酵素バリアントは、酵素バリアントを規定された温度(または他のアッセイ条件)に供し、熱処理または他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、プロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するDNAが、宿主細胞から単離され、ヌクレオチド配列変化(存在する場合)を同定するために配列決定され、異なるまたは同じ宿主細胞において酵素を発現するために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法(例えば、標準的な生化学の技法、例えば、HPLC解析)を使用して実施され得る。
既知の配列の操作されたポリペプチドについて、酵素をコードするポリヌクレオチドは、標準的な固相法によって、公知の合成方法に従って調製され得る。一部の実施形態では、最大約100塩基の断片が、個々に合成され得、次いで、任意の所望の連続配列を形成するために、(例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介性の方法によって)接続され得る。例えば、本明細書で開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、古典的ホスホラミダイト法を使用する化学的合成によって調製され得る(例えば、Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859-69 [1981];およびMatthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984]を参照されたい)が、それは、これが自動化合成方法で典型的には実施されるからである。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドが合成され(例えば、自動DNA合成器において)、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。しかし、本発明は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの産生のための任意の具体的な方法に限定されない意図であるが、それは、任意の適切な方法が本発明において使用されるからである。
したがって、一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドを調製するための方法は、(a)表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、3.27に提供される任意のバリアント(例えば、配列番号4~1362のうち偶数番号の配列)、または表3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/もしくは3.27に提供される任意のバリアントであって、ヒスチジンタグおよび先行するアミノ酸リンカーを欠如するバリアント(例えば、配列番号1366~2332のうち偶数番号の配列)のアミノ酸配列:ならびに配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および2278から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップ;ならびに(b)ポリヌクレオチドによってコードされるプロテアーゼポリペプチドを発現させるステップ、を含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、1個またはいくつかの(例えば、最大3、4、5個の、または最大10個の)アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、または1~50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31、32、33、34、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、または25個のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を含む。一部の実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
発現された操作されたプロテアーゼポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイおよび条件が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイを使用して、任意の所望の改善された特性(例えば、活性、選択性、安定性、耐酸性、プロテアーゼ感受性等)について評価され得る。
一部の実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたプロテアーゼポリペプチドのいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、熱処理、超遠心分離、およびクロマトグラフィーが含まれる、タンパク質精製のための周知の技法のうちいずれか1種または複数を使用して、細胞および/または培養培地から回収される。
プロテアーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法には、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は、因子、例えば、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等に一部依存し、当業者にとって明らかである。一部の実施形態では、親和性技法が、改善されたバリアントプロテアーゼ酵素を単離するために使用され得る。親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、バリアントプロテアーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用される。
親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、プロテアーゼに共有結合されたグリカンに結合するタンパク質が使用される。親和性クロマトグラフィー精製を利用するなお他の実施形態では、プロテアーゼ活性部位に結合する任意の小分子が使用される。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラット等が含まれるがこれらに限定されない種々の宿主動物が、ポリペプチド(例えば、プロテアーゼバリアント)、またはその断片を用いた注射によって免疫される。一部の実施形態では、プロテアーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによって、適切な担体、例えば、BSAに結合される。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、操作されたプロテアーゼポリペプチドの産生に資する条件下で、本明細書に記載される操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞(例えば、E.coli、S.cerevisiae、Daucus carota、Nicotiana tabacum、H.sapiens(例えば、HEK293T)、またはCricetulus griseus(例えば、CHO))を培養するステップ、ならびに操作されたプロテアーゼポリペプチドを、細胞および/または培養培地から回収するステップを含む方法によって、宿主細胞において産生される。
一部の実施形態では、本発明は、参照配列(例えば、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278)に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%配列同一性を有する操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を培養するステップを含む、操作されたプロテアーゼポリペプチドを産生する方法を包含する。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたプロテアーゼポリペプチドを産生する方法であって、参照配列(例えば、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278)に対する少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%配列同一性と、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278のアミノ酸配列と最適にアラインされた場合に、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26、および/または3.27に提供されるもの(例えば、配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列)、および/またはそれらの組合せから選択される、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、および/または2278と比較した1個または複数のアミノ酸残基差異とを有する、操作されたプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を、操作されたプロテアーゼポリペプチドの産生を可能にする適切な培養条件下で培養するステップ、ならびに操作されたプロテアーゼポリペプチドを、培養物および/または培養された細菌細胞から必要に応じて回収するステップを含む方法を包含する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドが組換え宿主細胞または細胞培養培地から回収されると、これらは、当技術分野で公知の任意の適切な方法(複数可)によってさらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製されたプロテアーゼポリペプチドは、異なる適用および使用のための、操作されたプロテアーゼポリペプチドを適切な場合に含む組成物および製剤(例えば、医薬組成物)を提供するために、他の成分および化合物と組み合わされる。一部の追加の実施形態では、精製されたポリペプチド、または製剤化されたプロテアーゼポリペプチドは、凍結乾燥される。
組成物および使用
組成物および使用
本発明は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない種々の組成物および形式を提供する。一部の実施形態では、本発明は、医薬組成物および他の組成物、例えば、健康補助食品および/または栄養補助食品における使用に適切な操作されたプロテアーゼポリペプチドを提供する。
投与の様式に依存して、本発明に従う操作されたプロテアーゼの治療有効量を含むこれらの組成物は、固体、半固体、または液体の形態である。一部の実施形態では、組成物は、他の薬学的に許容される構成成分、例えば、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、防腐剤、安定剤、フィラー、および他の成分を含む。製剤化および投与のための技法に関する詳細は、当技術分野で周知であり、文献中に記載されている。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、医薬組成物での使用のために製剤化される。丸剤、錠剤、ゲルタブ、カプセル、ロゼンジ、糖衣錠、粉末、軟ゲル、ゾル-ゲル、ゲル、エマルション、インプラント、パッチ、スプレー、軟膏、リニメント、クリーム、ペースト、ゼリー、ペイント、エアロゾル、チューインガム、粘滑剤、スティック、溶液、懸濁物(油ベースの懸濁物、水中油エマルション等を含むがこれらに限定されない)、スラリー、シロップ、徐放性製剤、坐剤等を含むがこれらに限定されない、操作されたプロテアーゼポリペプチドを送達する際の使用のための任意の適切な形式が、本発明において使用される。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、注射または注入に適切な形式で(すなわち、注射可能な製剤で)提供される。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、生体適合性マトリックス、例えば、シリカベースの(例えば、オキシラン(oxysilane))ゾル-ゲルが含まれるゾル-ゲルで提供される。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、封入されるおよび/または腸溶性コーティングされる。一部の代替的実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、ナノ構造(例えば、ナノチューブ、ナノ細管、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、ミクロスフィア、リポソーム等)中に封入される。実際、本発明は、任意の特定の送達製剤および/または送達手段に限定されない意図である。操作されたプロテアーゼポリペプチドは、非経口、経口、外用、経皮、鼻腔内、眼内、くも膜下腔内、インプラントを介する等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって投与される意図である。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、グリコシル化、化学的架橋試薬、ペグ化(すなわち、ポリエチレングリコール[PEG]または活性化されたPEG等による改変)または他の化合物によって化学的に改変される(例えば、Ikeda, Amino Acids, 2005, 29:283-287;米国特許第7,531,341号、同第7,534,595号、同第7,560,263号、および同第7,553,653号;米国特許出願公開第2013/0039898号、同第2012/0177722号等を参照されたい)。実際、本発明は、任意の特定の送達方法および/または機構に限定されない意図である。
一部の追加の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、マトリックスで安定化された酵素結晶を含む製剤で提供される。一部の実施形態では、製剤は、架橋された結晶性の操作されたプロテアーゼ酵素と、酵素結晶に接着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明は、ポリマー中の操作されたプロテアーゼポリペプチドもまた提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、糖(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、および/またはソルビトール)、デンプン(例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物デンプン)、セルロース(例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム)、ゴム(例えば、アラビア、トラガカント、グアー等)、および/またはタンパク質(例えば、ゼラチン、コラーゲン等)を含むがこれらに限定されない、1種または複数の一般に使用される担体化合物を含む。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、食物タンパク質消化を改善するための使用に適切である。一部のさらなる実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、食品または飼料の消費の前に、食品および飼料中のタンパク質を分解する際に使用される。投与される操作されたプロテアーゼポリペプチド(複数可)の投薬量は、対象の状態または疾患、全身状態、および当業者にとって公知の他の因子に依存する。一部の実施形態では、組成物は、単一または複数回の投与のために意図される。一部の実施形態では、膵機能不全疾患を有する対象に投与される組成物(複数可)中の操作されたプロテアーゼポリペプチド(複数可)の濃度は、疾患(例えば、膵機能不全疾患)を有効に処置および/または軽快させるのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、対象は、本明細書で患者とも呼ばれるヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、イヌ、およびネコである。一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、膵酵素機能不全等の疾患の処置のために、他の酵素、例えば、アミラーゼおよび/またはリパーゼと組み合わせて使用される。
一部の実施形態では、操作されたプロテアーゼポリペプチドは、健康補助食品、栄養補給食品等を含むがこれらに限定されない他の医薬組成物および/または食事組成物と組み合わせて投与される。本発明は、投与の任意の具体的な方法にも形態にも限定されない意図であるが、それは、任意の適切な方法および/または形態が使用されるからである。
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示のみを目的として提供されているのであって、本発明を限定すると解釈すべきではない。
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される:ppm(百万分率);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度)、uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec.(秒);min(複数可)(分(複数可));h(複数可)およびhr(複数可)(時間(複数可));kDa(キロダルトン);U(単位);MW(分子量);rpm(1分当たりの回転数);℃(セルシウス度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center[CGSC]、New Haven、CTから入手可能な、一般に使用される実験室E.coli株);EPI(膵外分泌機能不全);btLIP(B.thermoamylovoransリパーゼ);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);ms(質量分析またはマススペクトロスコピー);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動);PES(ポリエーテルスルホン);ACN(アセトニトリル);IPA(イソプロピルアルコール);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);PBS(リン酸緩衝食塩水);PMBS(ポリミキシンB硫酸塩);NADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸);LB(Luriaブロス);MeOH(メタノール);FIOPCおよびFIOP(陽性対照を超える改善倍数);HTP(ハイスループット);CAV(セル加速器電圧(cell accelerator voltage);衝突セル加速器電圧(collision cell accelerator voltage));CE(衝突エネルギー);RF(無線周波数);Greiner(Greiner Bio-One North America,Inc.、Monroe、NC);Biorad(Bio-Rad Laboratories,Inc.、Hercules、CA);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Pall Corp.(Pall,Corp.、Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.、Billerica MA);Difco(Difco Laboratories、BD Diagnostic Systems、Detroit、MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC、Sunnyvale、CA);Kuhner(Adolf Kuhner,AG、Basel、Switzerland);Applied Biosystems(Life Technologies,Corp.、Grand Island、NYに属するApplied Biosystems)、Agilent(Agilent Technologies,Inc.、Santa Clara、CA);RAPIDFIRE(登録商標)MS(RAPIDFIRE(登録商標)質量分析器、Agilent);Thermo Scientific(ThermoFisher Scientific、Waltham、MAに属する);Gibco(ThermoFisher Scientific);Pierce(Pierce Biotechnology(現在はThermo Fisher Scientificに属する)、Rockford、IL);ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.、Palo Alto、CA);AbbVie(AbbVie,Inc.、North Chicago、IL);Jackson(The Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA);およびGraphPad(GraphPad Software、San Diego、CA)。
(実施例1)
プロテアーゼ遺伝子の獲得および発現ベクターの構築
(実施例1)
プロテアーゼ遺伝子の獲得および発現ベクターの構築
ペプチダーゼS8ファミリーからの、Microcoleus spの野生型プロテアーゼ(WP_015180421.1)(「WT Pro_16」)(配列番号2)をコードするDNA配列を、E.coliにおける発現のためにコドン最適化し、E.coli発現ベクターpCK110900ベクターシステム(例えば、全てこれにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,629,157号および同第9,714,437号、ならびに米国特許出願公開第2006/0195947号を参照されたい)またはpJV110900ベクターシステム(例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2017/213758号を参照されたい)にクローニングした。しかし、本発明は、任意の具体的なベクターに限定されない意図である。さらに、一部の実施形態では、抗菌薬抵抗性マーカーを欠如する発現ベクターが使用される。構築物の一部では、C末端6×Hisタグを、プロテアーゼバリアントに付加した。プラスミド構築物を、W3110に由来するE.coli株に形質転換した。当業者にとって一般に公知の指向性進化技法を使用して、このプラスミド構築物ならびにその誘導体からの遺伝子バリアントのライブラリー(例えば、米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103を参照されたい)を生成した。
(実施例2)
プロテアーゼバリアントのハイスループット(HTP)成長およびスクリーニング条件
(実施例2)
プロテアーゼバリアントのハイスループット(HTP)成長およびスクリーニング条件
本発明のプロテアーゼを産生する細胞を成長させるために使用される方法、ならびにプロテアーゼを特徴付けるためのスクリーニング方法が、この実施例で提供される。
Microcoleus sp.プロテアーゼ(「WT Pro_16」)およびバリアントのハイスループット(HTP)成長
Microcoleus sp.プロテアーゼ(「WT Pro_16」)およびバリアントのハイスループット(HTP)成長
形質転換されたE.coli細胞を、選択薬と共に1%グルコースを含有するLB寒天プレート上にプレートすることによって選択した。37℃で一晩のインキュベーションの後、コロニーを、1%グルコースおよび選択薬(例えば、クロラムフェニコール)を補充した180μl/ウェルのLBを満たした96ウェル浅型平底プレート(NUNC(商標)、Thermo-Scientific)のウェル中に置いた。培養物を、シェーカーインキュベーター(200rpm、30℃、および85%相対湿度;Kuhner)中で18~20時間にわたって一晩成長させた。
一晩成長試料(20μL)を、選択マーカーを補充した380μLのTerrific Brothを満たしたCOSTAR(登録商標)96ウェル深型プレート中に移した。プレートを、シェーカー(250rpm、30℃、および85%相対湿度;Kuhner)中で135分間インキュベートした。次いで、リパーゼバリアントの発現を、滅菌水中10mMのIPTG 40μLを用いて誘導し、培養物を、シェーカー(250rpm、30℃、および85%相対湿度;Kuhner)中で20~24時間にわたって一晩インキュベートした。細胞を、遠心分離(4000rpm×20分)によってペレット化し、上清を廃棄し、細胞を、解析前に-80℃で凍結した。
HTPペレットの溶解
HTPペレットの溶解
最初に、200μLの溶解緩衝液(1×PBS、1mg/mlリゾチーム、および0.5mg/mlポリミキシンB硫酸塩)を、細胞ペレットに添加した。細胞ペレットおよび緩衝液を、室温で1.5~2時間穏やかに振盪し、本明細書に記載される種々のHTPアッセイにおける清澄化された溶解物の使用の前に遠心分離した(4000rpm×15分)。SDS-PAGEによるこれらの溶解物の解析により、それぞれ成熟活性プロテアーゼおよび切断されたプロドメインの予想されたMWと一致する、約52kDaおよび約22kDaの見かけのMWにおける、過剰発現されたタンパク質バンドの存在が明らかになった。一部の実験では、清澄化された溶解物の追加の希釈を、チャレンジおよび解析の前にPBS緩衝液を用いて実施した。
解析のためのプロテアーゼバリアントの精製
解析のためのプロテアーゼバリアントの精製
Hisタグ化バリアントを精製するために、清澄化された細胞溶解物を、製造業者のプロトコールに従ってHisPur Ni-NTAスピンプレート(Thermo Fisher Scientific)およびZeba脱塩プレート(Thermo Fisher Scientific)を用いて精製した。精製されたタンパク質を、PBS緩衝液中で溶出および脱塩した。
プロテアーゼ活性についての清澄化された溶解物または精製されたタンパク質の解析
プロテアーゼ活性についての清澄化された溶解物または精製されたタンパク質の解析
本発明の開発の間に産生されたバリアントプロテアーゼの活性を、EnzChek(登録商標)プロテアーゼアッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を使用してカゼインの分解を測定することによって決定した。このアッセイのために、水性緩衝液(100mM NaPO4、pH6~7;または10mM Tris-HCl、pH7.8)中5μg/mLまたは10μg/mLのBODIPY(登録商標)FL-カゼイン基質90μLを、96ウェルの不透明黒色マイクロタイタープレート(COSTAR(登録商標)プレート)に添加した。アッセイを開始するために、10μLの試料(細胞溶解物または精製されたプロテアーゼ)を、反応ミックスに添加し、混合した。プレートを、速度論的蛍光(励起:485、発光:530、3分間)について、SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)上で即座に読み取った。傾きを、線形範囲、一般的には3分間にわたって計算して、プロテアーゼ活性を評価した。試料がアッセイを飽和させなかったことを確実にするために、試料を、必要に応じて、所定の希釈倍率(最大256×)に基づいて、解析前にアッセイ緩衝液中に希釈した。用語「チャレンジなしの活性」は、以下のアッセイ方法の説明に記載されたいずれの外部チャレンジもない場合のプロテアーゼ活性として定義される。このアッセイは、特記しない限り、本明細書の実施例に記載されるデフォルトプロテアーゼ活性アッセイである。
プロテアーゼ活性についての清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析のための代替法
プロテアーゼ活性についての清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析のための代替法
一部の実験では、代替的活性アッセイを使用した。このアッセイのために、100mM NaPO4緩衝液、pH7.5中0.086g/LのNα-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)187μLを、透明平底プレート(Greiner UV-STAR(登録商標)マイクロプレート)に添加した。次に、8μLの1mM塩酸をプレートに添加した。反応を開始するために、5μLの試料を反応ミックスに添加した。プレートを、速度論的吸光度(A253、200s)について、SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)上で即座に読み取った。傾きを、プロファイルの線形範囲にわたって計算した。
熱チャレンジを用いて事前インキュベートした清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析
熱チャレンジを用いて事前インキュベートした清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析
バリアントプロテアーゼバリアントの熱安定性を、この実施例に記載した通りに評価した。清澄化された溶解物をPCRプレート(Biorad)に移し、サーモサイクラー中で40~50℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を遠心分離して、熱沈殿したタンパク質をペレット化し、上清を、本明細書に記載されるように、プロテアーゼ残留活性について解析した。
低pHで事前インキュベートしたおよび/またはペプシンに曝露させた清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析
低pHで事前インキュベートしたおよび/またはペプシンに曝露させた清澄化された溶解物または精製されたタンパク質のHTP解析
バリアントプロテアーゼバリアントの活性を、胃の環境をシミュレートするための低pHまたはペプシンの存在下での低pHのいずれかにおける事前インキュベーションの後に決定した。最初に、清澄化された溶解物を、2.0~4.0の最終チャレンジpHおよび最大1.5mg/mLの最終ペプシン濃度になるように、PCRプレート(Biorad)において、McIlvaine緩衝液、pH2.0~4.0と共に1:1で混合し、ブタ胃粘膜由来のペプシン(Sigma)0~3.0mg/mLを添加した。試料を混合し、次いで、サーモサイクラー中で37℃で1~2時間インキュベートした。反応をクエンチするために、試料を、400mM NaPO4、pH6.0~7.0と1:1で混合し、それにより、pHを中和し、ペプシンを不活性化した。次いで、中和されたチャレンジ試料を、本明細書に記載されるように、プロテアーゼ残留プロテアーゼ活性について解析した。
精製されたタンパク質の自己分解安定性のHTP評価
精製されたタンパク質の自己分解安定性のHTP評価
プロテアーゼバリアントの自己分解の程度を評価するために、精製されたプロテアーゼバリアントを、本明細書に記載されるように、プロテアーゼ活性の決定の前に1または3日間にわたって、室温(25℃)または37℃のいずれかでインキュベートした。
順を追った複数のチャレンジのHTP評価
順を追った複数のチャレンジのHTP評価
2個の安定性特徴を同時に調査していた間、2種のチャレンジスクリーニングを、順番に組み合わせた。例えば、1時間の熱安定性チャレンジの後に、1時間のpHおよびペプシンチャレンジを行った。これは、逐次チャレンジまたは逐次事前インキュベーションと示される。逐次チャレンジの後、試料を、本明細書に記載されるように、残留プロテアーゼ活性について解析した。
タウロコール酸ナトリウムとの事前インキュベーション後のプロテアーゼ活性のHTP評価
タウロコール酸ナトリウムとの事前インキュベーション後のプロテアーゼ活性のHTP評価
プロテアーゼバリアントの活性を、腸の環境をシミュレートするためのタウロコール酸ナトリウムの存在下での中性pHにおける事前インキュベーションの後に決定した。清澄化された溶解物を、6.5の最終pHおよび5mMタウロコール酸ナトリウムの最終濃度になるように、PCRプレート(BioRad)において、10mMタウロコール酸ナトリウムを含有する100mM NaPO4、pH6.5と1:1で混合した。混合物を、サーモサイクラー中、37℃で1時間インキュベートした。試料を、100mM NaPO4、pH6.5中でさらに8×希釈し、その後、本明細書に記載されるように、残留プロテアーゼ活性について解析した。
プロテアーゼバリアントの振盪フラスコ発現および精製
プロテアーゼバリアントの振盪フラスコ発現および精製
目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するE.coliの単一コロニーを、1%グルコースおよび選択薬を含むLuria Bertani培地5mL中に接種した。細胞を、250rpmで振盪しながら、30℃のインキュベーター中で一晩(少なくとも16時間)成長させた。培養物を、1リットルのフラスコ中で、選択薬を含むTerrific Broth(12g/Lバクト-トリプトン、24g/L酵母抽出物、4mL/Lグリセロール、65mMリン酸カリウム、pH7、1mM MgSO4)250mL中に希釈し、30℃で成長させた。アミラーゼ遺伝子の発現を、培養物のOD600が0.6~0.8になった時点で、1mMの最終濃度になるようにIPTGを添加することによって誘導した。次いで、インキュベーションを一晩(少なくとも16時間)継続した。細胞を、遠心分離(5000rpm、15分、4℃)によって収集し、上清を廃棄した。細胞を、150mM NaClを含むPBS 40~50mL中に再懸濁し、標準的なE.coli溶解設定でMICROFLUDIZER(登録商標)高圧ホモジナイザー(Microfluidics)を通過させ、4℃で維持した。
きれいにした溶解物上清を収集し、イミダゾールを、25mMの最終濃度になるように溶解物に添加した。この溶解物を、150mL NaClおよび25mMイミダゾールを含むPBSを洗浄緩衝液として使用し、150mL NaClおよび250mMイミダゾールを含むPBSを溶出緩衝液として使用して、AC Step 1ml/5ml HiTrap - Affinity Chromatography Quick Startプロトコールを用いてAKTA Startシステム上でHIS-親和性精製した。精製されたプロテアーゼを、BioradのEconoPac-10DG Desalting Prepacked Gravity Flow Columnを用いて、PBS中に緩衝液交換した。
(実施例3)
プロテアーゼバリアントについてのスクリーニング結果
(実施例3)
プロテアーゼバリアントについてのスクリーニング結果
ホモログ多様性および飽和突然変異誘発から生成されたバリアントを、実施例2に記載されるように、pH4で1時間の事前インキュベーションの後に、pH7.8におけるプロテアーゼ活性について一連でスクリーニングした。結果(配列番号2で得られた結果との比較)は、表3.1に提供される。ホモログ多様性および飽和突然変異誘発ライブラリーから生成された一部のバリアントを、実施例2に記載されるように、pH4で1時間の事前インキュベーションの後に、pH7.8におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号2で得られた結果との比較)は、表3.2に提供される。
表3.2に示される結果に基づいて、配列番号34を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.2に示される結果から同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。バリアントを、実施例2に記載されるように、pH3で1時間の事前インキュベーションの後に、pH7.8におけるプロテアーゼ活性について三連でスクリーニングした。結果(配列番号34について得られた結果との比較)は、表3.3に提供される。
表3.3に示される結果に基づいて、配列番号190を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.3に示される結果から同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号190に基づいて構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、pH3.5で1時間の事前インキュベーションの後に、pH7.8におけるプロテアーゼ活性について一連でアッセイした。結果(配列番号190について得られた結果との比較)は、表3.4に提供される。さらに、ライブラリーからのバリアントの一部を、実施例2に記載されるように、pH3.5で1時間の事前インキュベーションの後に、pH7.8におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号190について得られた結果との比較)は、表3.5に提供される。
表3.5に示される結果に基づいて、配列番号292を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.5に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号292に基づいて構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、5mMタウロコール酸塩との1時間の事前インキュベーションの後、およびpH4における0.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーションの後に、pH6.5におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号292について得られた結果との比較)は、表3.6に提供される。
表3.6に示される結果に基づいて、配列番号342を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.6に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。バリアントを、実施例2に記載されるように、5mMタウロコール酸塩との1時間の事前インキュベーションの後、およびpH4における0.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーションの後に、pH6.5におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号342について得られた結果との比較)は、表3.7に提供される。
表3.7に示される結果に基づいて、配列番号382を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。この配列を、C末端ヒスチジンタグと共に(配列番号396)pJV110900ベクターにサブクローニングした。表3.7に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、配列番号396を使用して組み換えた。さらに、バリアントを、異なる位置におけるホモログ多様性および突然変異誘発を介して、配列番号396を使用して構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、42℃における1時間の事前インキュベーション後、およびpH3.8における1.5mg/mLペプシンとの2時間の事前インキュベーション後に、pH6.5におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号396について得られた結果との比較)は、表3.8に提供される。
表3.8に示される結果に基づいて、配列番号400を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.8に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置におけるホモログ多様性を介して、バリアントもまた、配列番号400を使用して構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、48℃における1時間の事前インキュベーションと、その後のpH3.8における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーションとを含む逐次スクリーニングにおいて、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号400について得られた結果との比較)は、表3.9に提供される。
表3.9に示される結果に基づいて、配列番号454を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.9に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号454を使用して構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、48℃における1時間の事前インキュベーションと、その後のpH3.26における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーションとを含む逐次スクリーニングにおいて、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号454についての結果との比較)は、表3.10に提供される。
表3.10に示される結果に基づいて、配列番号562を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.10に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における飽和突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号562を使用して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH4における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性についても三連でアッセイした。結果(配列番号562について得られた結果との比較)は、表3.11に提供される。さらに、実施例2に記載されるように、バリアントの一部を精製し、pH3.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性についても三連でアッセイした。結果(配列番号562について得られた結果との比較)は、表3.12に提供される。
表3.11に示される結果に基づいて、配列番号638を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.11に示される結果から同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における飽和突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号638を使用して構築した。バリアントを、実施例2に記載されるように、pH7.5における代替的BAEEアッセイを用いて、pH3.26における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号638について得られた結果との比較)は、表3.13に提供される。追加の実験では、実施例2に記載されるように、プロテアーゼバリアントの一部を精製し、pH3.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性についても三連でアッセイした。配列番号638と比較したデータの解析は、表3.14に列挙される。
表3.13からの結果に基づいて、配列番号680を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.13および表3.14から同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH3.25における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号680について得られた結果との比較)は、表3.15に提供される。
表3.15に示される結果に基づいて、配列番号756を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表13.15に示される結果から同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、ホモログ多様性を用いて、バリアントもまた、配列番号756を使用して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH3.25における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号756について得られた結果との比較)は、表3.16に提供される。一部の追加の実験では、実施例2に記載されるように、プロテアーゼバリアントの一部を精製し、pH3.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号756について得られた結果との比較)は、表3.17に提供される。
表3.16に示される結果に基づいて、配列番号812を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.16の結果から同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における飽和突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号812を使用して構築した。生成されたバリアントを、実施例2に記載されるように、pH2.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について一連でスクリーニングした。結果(配列番号812について得られた結果との比較)は、表3.18に提供される。一部の追加の実験では、実施例2に記載されるように、プロテアーゼバリアントの一部を精製し、pH3における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号812について得られた結果との比較)は、表3.18に提供される。一部の追加の実験では、実施例2に記載されるように、バリアントの一部を精製し、pH3.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号812について得られた結果との比較)は、表3.19および表3.20に提供される。
試験した異なる条件について観察され、上記表に示された有益な突然変異を、配列番号812中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発、ホモログ多様性を用いて、ならびにまたアルギニンおよびリシン残基の除去のために、バリアントもまた、配列番号812を使用して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH3における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、室温における1日間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号812について得られた結果との比較)は、表3.21に提供される。
表3.21に示される結果に基づいて、配列番号1030を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.21に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号1030に対して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH3における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、37℃における24時間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性を測定することによって、自己分解安定性についても三連でアッセイした。結果(配列番号1030について得られた結果との比較)は、表3.22に提供される。
表3.22に示される結果に基づいて、配列番号1136を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.22に示される結果から同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。バリアントを、実施例2に記載されるように、pH2.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイした。結果(配列番号1136について得られた結果との比較)は、表3.23に提供される。さらに、異なる位置に突然変異を有するバリアントもまた、配列番号1136を使用して構築した。これらのバリアントを、実施例2に記載されるように、pH2.5における1.5mg/mLペプシンとの2時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について一連でアッセイした。結果(配列番号1136について得られた結果との比較)は、表3.24に提供される。
表3.23に示される結果に基づいて、配列番号1180を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.23および表3.24に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。さらに、異なる位置における突然変異誘発を用いて、バリアントもまた、配列番号1180を使用して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH2.5における1.5mg/mLペプシンとの1時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、37℃における24時間のインキュベーション後の自己分解安定性についても三連でアッセイした。結果(配列番号1180について得られた結果との比較)は、表3.25に提供される。
表3.25からの結果に基づいて、配列番号1250を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。表3.25に示される結果に基づいて同定された有益な突然変異を、この骨格中に組み換えた。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH2.75における1.5mg/mLペプシンとの2時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、37℃における24時間のインキュベーション後にプロテアーゼ活性についてアッセイすることによって、自己分解安定性についても三連でアッセイした。結果(配列番号1250について得られた結果との比較)は、表3.26に提供される。
表3.26に示される結果に基づいて、配列番号1308を、タンパク質最適化の次の繰り返しのための次の親配列として選択した。配列番号1308多様性に基づくコンビナトリアルライブラリーを、この骨格中に組み換えた。470位における飽和突然変異誘発ライブラリーもまた、この骨格を使用して構築した。実施例2に記載されるように、バリアントを精製し、pH2.75における1.5mg/mLペプシンとの2時間の事前インキュベーション後に、pH6におけるプロテアーゼ活性について三連でアッセイし、37℃における24時間のインキュベーション後の自己分解安定性について三連でアッセイした。結果(配列番号1308について得られた結果との比較)は、表3.27に提供される。
(実施例4)
Hisタグありおよびなしのバリアントの比較
Hisタグありおよびなしのバリアントの比較
配列番号1362からリンカーおよびC末端Hisタグを除去して、配列番号2332を生成した。配列番号1362は、実施例2における振盪フラスコ精製法を使用して産生し、配列番号2332は、以下の実施例7に記載されるように産生した。等しいタンパク質濃度(タンパク質含有量および純度によって測定される)の配列番号1362および配列番号2332を、実施例2に記載されるように、以下のin vitroアッセイにおいて特徴付けた:チャレンジなしの活性、pH3.5における1時間の事前インキュベーション後の活性、pH4における1時間の事前インキュベーション後の活性、pH3.5における1.5g/Lペプシンとの1時間の事前インキュベーション後の活性、pH4における1.5g/Lペプシンとの1時間の事前インキュベーション後の活性、5mMタウロコール酸塩との1時間の事前インキュベーション後の活性、および37℃における1日間のインキュベーション後の自己分解安定性。これらの実験を、三連または六連のいずれかで試験した。試験した種々の条件下で、配列番号1362および配列番号2332は、表4に示されるように、類似の特性を有することが見出された。
(実施例5)
ミニチュアブタにおける膵外分泌機能不全の手術モデルの生成および検証
ミニチュアブタにおける膵外分泌機能不全の手術モデルの生成および検証
膵外分泌機能不全(EPI)の手術モデルを、膵管結紮によってSinclair(商標)ミニチュアブタにおいて生成した。手術の7日前に開始し、実験を通じて継続して、7~8月齢および19.9~26.2kgの間の雌性ミニチュアブタに、高脂肪食(HFD;BERTOLLI(登録商標)オリーブ油、および事前分配された3.9オンスカップの無加糖MOTT’S(登録商標)アップルソースと10:1、w/wで混合したSinclair標準食S-9[19%タンパク質、5.8%脂肪])を1日1回給餌した。24時間にわたる総糞便排出量を、手術直前の連続する3日間に、ならびに手術後15、16、および17日目に、収集した。各動物からの一日総糞便収集を、およそ1.5×糞便正味重量の体積の蒸留水を添加し、ホモジナイズし、3×50mLアリコートに分割し、解析まで-20℃で凍結することによって、引き続く解析のために調製した。モデルを、糞便試料中の脂肪含有量(改変Van de Kamer法による;Van de Kamer, Seligson (ed), Standard Methods of Clinical Chemistry, volume 2, Academic Press, New York, NY (1958), pp. 34-39を参照されたい)、および窒素含有量(燃焼法によるVario Max CN機械によるKjeldahl総窒素;Watson et al., Peters et al. (eds.) Recommended Methods of Manure Analysis, Univ. of Wisconsin Cooperative Extension Publishing, Publication No. A3769. Madison, WI. [2003], p. 18-24を参照されたい)を測定し、手術の前および後のパーセント変化を評価することによって、検証した。手術前には、健康なミニチュアブタから収集された糞便物質は、低レベルの脂肪(0.86g±0.1g SD/100g糞便物質)および窒素(0.43g±0.28g SD/100g糞便物質)を含有した。手術後に、糞便含有量は、3.75g脂肪±0.05g SD/100g糞便物質(336%の増加)および0.72g窒素±0.04g SD/100g糞便物質(67%の増加)まで増加し、こうして、EPI研究のためにこの手術モデルを検証した。
(実施例6)
膵外分泌機能不全のミニチュアブタモデルにおけるプロテアーゼバリアントのin vivo特徴付け
(実施例6)
膵外分泌機能不全のミニチュアブタモデルにおけるプロテアーゼバリアントのin vivo特徴付け
EPIの検証されたSinclair(商標)ミニチュアブタ手術モデル(n=6頭の雌性、8~9月齢)を、in vivo研究に進めて、維持のための操作されたリパーゼ(配列番号1364)と共に共投薬した操作されたプロテアーゼバリアント(配列番号756)を評価した。投薬の28日前(手術の18日後)に開始して、EPIミニチュアブタを、1日1回のHFDから、有効性研究のための調製物中の、1日1回の高タンパク質食(HPD;事前分配された3.9オンスカップの無加糖MOTT’S(登録商標)アップルソースと混合したSinclair高タンパク質食S-11[23.79%タンパク質、5.65%脂肪])に切り替えた。投薬日の間、食事を、各動物のために逐次準備して、摂取前の食物脂肪およびタンパク質との最小限のex vivo酵素相互作用を確実にした。簡潔に述べると、S-11ミニチュアブタ飼料を、きれいな飼料ボウル中に最初に分配した。次に、酵素(それぞれ、44,000Uのリパーゼおよび465,000Uのプロテアーゼに対応する、0.045gの凍結乾燥されたリパーゼ粉末および3.0gの凍結乾燥されたプロテアーゼ粉末)を、3.9オンスカップの無加糖アップルソース中に混合した(リパーゼ酵素およびプロテアーゼ酵素の単位は、United States Pharmacopeia(USP)アッセイによって決定した)。次いで、酵素-アップルソース混合物を、S-11ミニチュアブタ飼料に移し、迅速に混合した。最後に、飼料ボウルをミニチュアブタに即座に提供し、その後次の調製に取り掛かった。2時間後、飼料ボウルを除去した;動物は、30分またはそれ未満以内に、全ての食餌を消費していた。投薬期は、14日間の持続時間にわたって持続した。24時間にわたる総糞便排出量を、投薬開始直前の連続する3日間に、ならびに投薬期の間の6、7、8日目、および12、13、14日目に収集した。糞便試料を、およそ1.5×糞便正味重量の体積の蒸留水を各一日総糞便収集に添加し、ホモジナイズし、3×50mLに分割し、解析まで-20℃で凍結することによって調製し、残りは廃棄した。糞便材料中の窒素含有量についての解析を、モデル検証について上記したように完了した。投薬の前には、窒素含有量は、0.82g±0.11g SD/100g糞便物質であり、これは、投薬の1週間後または2週間後において、有意には異ならなかった(それぞれ、0.75g±0.08g SD/100g糞便物質および0.78g±0.07g SD/100g糞便物質)。プロテアーゼ有効性の代替的評価として、投薬前および投薬後の血清試料中のアミノ酸を定量化した。Gottingenミニチュアブタにおける以前の研究は、種々の給餌したタンパク質供給源に応答した、血漿中の食後アミノ酸における差次的増加を示しており(Hagemeister et al., J. Nutrition, 1990, 120: 1305-1311)、したがって、この尺度は、タンパク質含有食事を投薬した場合の改善されたプロテアーゼ活性を評価するために有用であり得る。試料を、食前2時間の時点(投薬前-6日目および投薬中12日目)、ならびに食後0.75、1.25、1.75、2.25、4.25、8.25、および24*時間の時点(投薬前-3日目および投薬中14日目;*24時間の時点は、実際には次の日に給餌の前に得た)で得た。指定された時点(±10%公称時間)において、3mLの全血を、頸静脈または他の適切な血管の直接的静脈穿刺を介して収集した。血液を、室温で約30分間凝血させ、その後、約3000RPMで約4℃で約15分間遠心分離した。血清試料を、事前にラベル付けした一次および予備のクライオバイアル(cryovial)へとアリコート化し、解析まで約70℃で貯蔵した。血清試料を、アミノ酸定量化のために以下のように調製した:200uLの血清を、1.5mL Eppendorf遠心バイアル中に量り取り、6%スルホサリチル酸を1:1(V:V)の比で添加し、混合物を完全にホモジナイズした。4℃で10分間静置した後、混合物を、16.0rcfで15分間冷蔵(4℃)下でスピンダウンした。次いで、25uLの上清を、個々のアミノ酸を分離するためのカチオン交換カラムと定量化のためのカラム後ニンヒドリン比色分析とを使用する完全自動化Biochrom 30+アミノ酸解析器(UK)上にロードした。生物流体のためのアミノ酸標準は、Sigmaから購入した。ノルロイシンを、QCのための内部標準として追加した。データ解析は、GraphPad Prism 7(GraphPad)において実施した。投薬前および投薬後の食前値は、有意には異ならなかった。9種の必須アミノ酸のうち8種(EAA;メチオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リシン、およびスレオニン)は、投薬前と比較して、投薬後に食後血清試料において有意に上昇した;9番目(トリプトファン)もまた、投薬後に増加を示したが、統計的有意性は達成されなかった。図1は、必須アミノ酸の総計が、配列番号756による14日間の投薬後に、食後に有意に増加したことを示している。さらに、5種の条件付き必須アミノ酸(チロシン、グリシン、プロリン、セリン、およびオルニチン)は、14日間のプロテアーゼ投薬後に、食後に有意に上昇し、6番目(アルギニン)は、いくらかの増加を示したが、統計的有意性は達成されなかった。
(実施例7)
膵外分泌機能不全(EPI)のミニブタモデルにおけるプロテアーゼバリアントのin vivo特徴付け
(実施例7)
膵外分泌機能不全(EPI)のミニブタモデルにおけるプロテアーゼバリアントのin vivo特徴付け
操作されたリパーゼバリアント配列番号1364および操作されたプロテアーゼバリアント配列番号2332のための発現構築物を、E.coliに形質転換し、得られた株を、流加15L形式で発酵させた。発酵期の最後に、細胞を、遠心分離によって収集した。
収集した細胞を、再懸濁し、迅速な圧力変化によって溶解させた。全細胞溶解物を、フロキュレーションとその後の遠心分離とによって清澄化した。次いで、可溶性標的プロテアーゼを、コスモトロピック塩の添加によって溶液から可逆的に沈殿させ、遠心分離によって収集した。収集したプロテアーゼ沈殿物を再可溶化した。接線流濾過を実施して、再可溶化したプロテアーゼを濃縮し、製剤化緩衝液へと緩衝液交換した。得られた残余分をフリーズドライして、酵素粉末を得た。
EPIの検証されたSinclairミニブタ手術モデル(n=4頭の雌性、47kg BW平均、2.5~3歳、およびn=8頭の雌性、31.6kg BW平均、1.3歳)を、in vivo研究に進めて、維持のための操作されたリパーゼと共に共投薬した操作されたプロテアーゼバリアントを評価した。投薬の21日前に開始して、Viokase(登録商標)処置を中止して疾患状態を誘導し、有効性研究のための調製物中の、高タンパク質食[HPD;事前分配された3.9オンスカップの無加糖MOTT’S(登録商標)アップルソースと混合したSinclair高タンパク質食S-11(23.79%タンパク質、5.65%脂肪)]を、1日1回給餌した。投薬日の間、食事を、各ブタのために逐次準備して、摂取前の食物脂肪およびタンパク質との最小限のex vivo薬物相互作用を確実にした。簡潔に述べると、ブタの体重(600gまたは450gのいずれか)に適切なS-11ミニブタ飼料を、きれいな飼料ボウル中に最初に分配した。次に、酵素(液体の製剤化された配列番号1364、および凍結乾燥された配列番号2332)を、酸性pHが早期の酵素活性化に対する保護を与えられるように、3.9オンスカップの無加糖アップルソース中に混合した。リパーゼについての投薬(1333U/g脂肪)は、USPリパーゼ単位に基づき、USPアッセイ(United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 42-NF 37). Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention; 2016)によって決定し、計算した総脂肪を、食事中に提供した。プロテアーゼについての投薬(8.95mg酵素/gタンパク質)は、凍結乾燥粉末中の酵素含有量に基づいて計算し、SDS-PAGEによって決定し、計算した総タンパク質を、食事中に提供した。投薬した総単位は、33892Uまたは45189Uのリパーゼおよび137Uまたは183Uのプロテアーゼであり、これらは、提供されたS-11食の量に対応するミニブタ体重に起因して変動した。次いで、酵素-アップルソース混合物を、S-11ミニブタ飼料に移し、迅速に混合した。調製したら、飼料ボウルをミニブタに即座に提供し、その後次の調製に取り掛かった。2時間後、飼料ボウルを除去した;ブタは、30分またはそれ未満以内に、全ての食餌を消費していた。研究は、クロスオーバー設計を利用した;投薬期は、1日1回のHPDによる14日間の洗い流しによって隔てられた、14日間の持続時間にわたって持続した。24時間にわたる総糞便排出量を、投薬開始直前の順化の間の連続する3日間に、ならびに12、13、14日目(投薬期1)、27、28、29日目(洗い流し)、および41、42、43日目(投薬期2)に収集した。糞便試料を、およそ1.5×糞便正味重量の体積の蒸留水を各一日総糞便収集に添加し、ホモジナイズし、3×50mLに分割し、解析まで-20℃で凍結することによって調製し、残りは廃棄した。糞便物質中の脂肪(改変Van de Kamer法による;Van de Kamer, Seligson (ed), Standard Methods of Clinical Chemistry, volume 2, Academic Press, New York, NY [1958], pp. 34-39を参照されたい)および窒素(燃焼法によるVario Max CN機械によるKjeldahl総窒素;Watson et al., Peters et al. (eds.) Recommended Methods of Manure Analysis, Univ. of Wisconsin Cooperative Extension Publishing, Publication No. A3769. Madison, WI. [2003], p. 18-24を参照されたい)含有量を定量化した。投薬期の前には、窒素含有量は、0.634g±0.09g SD/100g糞便物質(順化)および0.834±0.14g SD/100g糞便物質(洗い流し)であり、これは、期1または期2の投薬後において、有意には異ならなかった(それぞれ、0.78g±0.14g SD/100g糞便物質および0.872g±0.17g SD/100g糞便物質)。プロテアーゼ有効性の代替的評価として、投薬前および投薬後の血清試料中のアミノ酸を定量化した。Gottingenミニブタにおける以前の研究は、種々の給餌したタンパク質供給源に応答した、血漿中の食後アミノ酸における差次的増加を示している(Hagemeister, et al., The Journal of Nutrition, 1990, 120(11):1305-1311)。-1、14、27、および42日目の試料を、食前2時間の時点で、ならびに食後1、1.5、2、2.5、4.5、6.5、および8.5時間の時点で得た。指定された時点(±10%公称時間)において、3mLの全血を、頸静脈または他の適切な血管の直接的静脈穿刺を介して収集した。血液を、室温で約30分間凝血させ、その後、約3000RPMで約4℃で約15分間遠心分離した。血清試料を、事前にラベル付けした一次および予備のクライオバイアルへとアリコート化し、解析まで約70℃で貯蔵した。血清試料を、0.1%ギ酸を含有するアセトニトリルでの希釈、4,000RPMで10分間の遠心分離、およびLC-MS/MS(HILIC)による解析のための上清の移行によって、アミノ酸定量化のために調製した。データ解析は、GraphPad Prism 7(GraphPad Software、San Diego、CA)において実施した。投薬前および投薬後の食前値は、有意には異ならなかった。9種の必須アミノ酸のうち5種(EAA;ロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、およびリシン)についてのAUCは、投薬前と比較して、投薬後に食後血清試料において有意に上昇した。さらに、チロシンおよびアルギニンについてのAUCは、14日間のプロテアーゼ投薬後に、食後に有意に上昇した。
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれると個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
種々の具体的な実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の変化がなされ得ることが理解される。
Claims (79)
- 配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えプロテアーゼ。
- 配列番号34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、236、258、261、339、439、446および454から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換を含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号2を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 位置236、258、261、339、439、446および454における置換が、236V、258K、261L、339M、339W、439M、446A、446G、446L、446M、446Tおよび454Lから選択される、請求項5に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、107/536、162/408、168/547、208/366/504/591、208/485/526、210/223/258/552、210/241/258/599、223/241/258/599、223/429/481/533、223/481/533/552、225、225/260/263/265/544、225/262、225/362/366/591、225/366、225/482/591、244、258、258/318/429、258/449/481、258/481、261、261/504、318/481、318/533、318/599、339、342、345、362/366/485/591、363、366、366/485、366/497、366/526/591、366/591、408、427、446、448、449、450、481/533/552、482、482/485、482/591、485、485/591、533、533/552、536、544、547、549、565、615、および652から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号2を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号34に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、258、258/261/342/345、258/261/342/504/533、258/261/345/504/549、258/261/482/504/549、258/342、258/342/504/533/536/549、258/345/427、258/408/427/504/549、258/427、258/427/482/504/533/536、258/427/482/536、261/342/345/536、261/342/482/504/533/536、261/342/482/504/549、261/342/482/536、261/342/533、261/482、318/339/362/544/547、318/339/448/544、318/339/547、318/448/544/615、339/362/363/544/547/615、339/362/544、339/448、339/448/547、339/544/547、342、342/408、342/408/536、342/482/536、362/363/544/547、362/448、363/544/547、427/482/504/533/536、427/533/536/549、448、448/544、および448/544/547/615から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号34を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号190に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、205、505、541、556および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号190を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号190に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、205、220、239、261、261/339、261/339/547、261/536、261/536/547、339/427/536、339/427/536/547、339/427/547、405、442、505、539、541、542、545、556、558、594、631、663および665から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号190を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号292に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、205/442/505/536/545/620/646、205/505/536/541/545/547/558/646/665、258、263、355/536/545/547、359、366、446、449、505/536/545/558/646、506、555、556、620および650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号292を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号342に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、283/319/359/449/450/506、283/345/359/449/450/553/555、283/449/450/508/541/553/555、449/450、450/508/553/555/558、508および508/541/553から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号342を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号396または1366に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、205、205/442/449/450、205/450/536/545、205/450/536/545/646、258/442/446、258/442/449/646、258/450/536/545、308、361、439、442/446/536/545/620/646、442/450/536/545、514、535、577、591、592、610、639、643および644から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号396または1366を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号400または1370に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、32/490/639、236、236/238/404/480/555/568/592、236/359/404/406/555/639、236/359/490/581/639、236/359/555、236/359/609、236/370/406/568/581、236/370/568/592、236/370/581、236/404/406/480/490、236/404/555/581/609/639、236/568、236/592、236/639、238/359/370/404/490/568/639、245/363/408/512/514/596/666、245/363/512/514/537/560、308/514/535/639/644、359/404、359/404/406/490/546/581、363/408/512/514/537、363/408/601/650、363/639/644、408/512、408/514/537、408/514/560/650、490/568/592/639、512/537/560/601、514/535/546/575/644、514/639/644、514/644、535/575/639/644、535/639/643/644、535/643/644、および601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号400または1370を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号454または1424に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、236、236/308/370/548、236/308/490/581/643、236/308/555/560/596、236/370、236/370/490/639、236/555、236/560/581、245/359/363/406/535/650、245/363/406/575/601/666、300、301、308、308/490/560/581/639/643、336、359/363/406/535/601/650、359/404/406/535、359/406/575/650/666、359/535/575/601、363/404/406/535/568、404/406/535、406、406/480/535/568/601、406/535/575、468、および480/575/601/650から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号454または1424を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号562または1532に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、133/301/346/347/468、205/236/347、205/236/370/490/537/620、205/342/439/442/514/620/639、205/370/537、205/442/505/620、236/258/370/505/545/639、236/339/514、236/370/450/620、236/545、258/339/342/505/537、258/342/370/408/442/537、300/301/308/346/347/468、300/301/347/468、301/308/336/346/406/468/601、301/308/346/406/468、301/308/468/601、301/347/406、308/336/347/468、308/347/468、342、342/408/490/505/514/545/639/646、342/620、370/442、370/537/639、489、539/649、542、543、543/673、558、559、566、634、および661から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号562または1532を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号562または1532に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、205/236/342/439/505/514/537/545、236/342/505/514/537/545、300/301/308/336/347/468/601、300/301/347/406、301/308/346/347/468、301/336/346/347/406/601および308/336/347/406/468/601から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号562または1532を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号638または1608に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、346/511/537、346/511/537/541/543、346/511/542/582、346/511/581/582、346/511/583、346/529/571/581/582/583/589、511/537、516/539/568、537/582、539、568/662/663および581/582から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号638または1608を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号638または1608に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、346/511/537/582、346/511/543/582、346/511/544、346/537/542/544、346/543/544、346/583、511/537/542/582/583、516、516/539/555、537/543/582、539/568、540、542/544/581、548、549、559、559/568、582、647、650および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号638または1608を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号680または1650に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、261/355/543、261/355/567/568、261/489、261/489/511/568、261/489/539、261/489/567、261/539/543、261/539/543/567、261/542/543/568、511、511/539/543、511/567、543および583から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号680または1650を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号756または1726に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、9、9/17/34/35/93/554、9/17/50、9/17/93、9/29/35/43/77/542/554、9/32/77/93、9/43/77、9/50/63/93、9/93、17/29/34/35/36/77/93、17/32/34/35、17/77、32/34/93、43、50/77/93、50/93、77/93、93、205/263/470、205/344/470/565、205/345/470/538/664、205/470/545/568/645/647/664、205/470/567/568/645、263/344/664、263/470/645、263/489、263/539/541/568/645、344/355/470/489/645、344/355/470/568/645/647、344/470/489/539/542/645/647/664、344/470/489/567/568、344/470/568、344/470/647、470、470/489、470/541/542/543/565/645/647、470/567/568、470/664、および542/543から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号756または1726を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号756または1726に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、9/17/32/34/36/50/77/107/127、9/17/63/77、9/43/93/127、9/63/93/107、17/29/32/34/36/63、29/34/35/77、32/43/93、35/93/145および205/263/489/647から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号756または1726を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号812または1782に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、188、189、265、266、334、442、454、646および649から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号812または1782を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号812または1782に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、189、266、266/283、546、594および646から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号812または1782を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号812または1782に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、263/470/568、266、470/542/543/664および558/577/594から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号812または1782を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号812または1782に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、29、29/35、29/35/342/581/582/664、29/50/511/539/581、35、35/50/205/406/511/581、35/205/511、35/342/346/511/539/581、35/346、35/346/406/511/581/582/664、35/511、35/539、50/342、132、133、143、147、187、188、257、258、263、294、294/441/527、308/342/511/581/582、342、346、398、406/664、429/652、441、441/446/526、446/652、482、505、511、526、527、536、545、581、582、615、620、639、645、646、648、652、654、および664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号812または1782を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1030または2000に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、29、29/143/263/266/441/639、29/263/266、29/263/266/441/620、29/266/441、29/441/639、30、37、47/570、75、81、85、92、135、143、143/263/266/639、143/266/441/620/639、168、189/424、237/527、244、258/342/582/648、263、263/266/441、263/266/639、266/441、266/441/620/639、266/620/639、266/639、267、342/526/664、342/545、342/582、429、441、482、495、501、523、526、527、568、570、573、581、582、616、632、648、653、および654から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1030または2000を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1136または2106に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、29、29/30、29/30/143/263/482/646、29/30/263、29/30/616/648、29/75/263/568/570/648、29/168/648、29/263/527/568、75、75/143/168/527、75/168、75/616、143、168/247/482/648、168/263/616、168/482/616、168/495/616、263、263/616、429/545、495および527から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1136または2106に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、207、222、266、307、454、535、546、548、580、604および610から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1136または2106を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1180または2150に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、75/168/207/454/568/586/610/648/659、75/168/266/454/546/570/580、75/207/454/570/659、75/207/546/580/648、75/263/454/548/568/604/648、75/266/454、75/454、75/454/546/548/568/604、75/546/548/610/648、168/207/263/454/568/570/604、168/263/266/546/604、168/454/604、207/604/610、209、212、221、223、228、266/454/568、319、373、412/546/554、431、454、454/546/568/570/580、454/546/570、454/570/580/610、454/580、454/659、および506から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1180または2150を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1250または2220に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、75/189/373/582、75/200/212/431/482、75/212/373/431/482、75/212/431/482/568/615/664、75/368/582、75/373/431/526/582、75/431/482/570/604/664、75/632、189/212/431/568/570、200/205/373/431、200/431/482/615/664、200/482/664、212/228/431、212/228/568/570/582/664、212/373/446/482/582、368/373/431、373/431/570/604/664、373/568/632、431、431/604/664、482/582、582、および615/652/664から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1250または2220を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、配列番号1308または2278に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えプロテアーゼが、408/439、439/514、470、470/667、514、514/537および537から選択される1個または複数の位置に少なくとも1個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号1308または2278を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記組換えプロテアーゼが、表3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、3.10、3.11、3.12、3.13、3.14、3.15、3.16、3.17、3.18、3.19、3.20、3.21、3.22、3.23、3.24、3.25、3.26および/または3.27に提供される少なくとも1個の位置における少なくとも1個の突然変異を含み、前記位置が、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278を参照して番号付けされる、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号4~1362および1366~2332のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号4~1362のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項32に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号1366~2332のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項32に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号1348~1362および2318~2332のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220、2278および2332から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも熱安定性が高い、請求項1~36のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 酸性pH条件下で、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している、請求項1~37のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- pH7またはそれよりも高いpHで、配列番号2、34、190、292、342、382、396、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している、請求項1~38のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 酸性pH条件下およびpH7またはそれよりも高いpHの条件下で、配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも安定している、請求項1~39のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い、請求項1~40のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも自己分解に対して安定している、請求項1~41のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- pH7またはそれよりも低いpHで、配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも活性が高い、請求項1~42のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 少なくとも1種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号2、34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1366、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および/または2278のプロテアーゼよりも活性が高い、請求項1~43のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 精製されている、請求項1~44のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 参照配列と比較して、i)増強された触媒活性;ii)酸性pHに対する増加した耐性;iii)pH4もしくはそれよりも低いpHに対する増加した耐性;iv)pH5もしくはそれよりも高いpHに対する増加した耐性;v)少なくとも1種のプロテアーゼに対する増加した耐性;vi)少なくとも1種の胆汁酸塩に対する増加した耐性;vii)増加した熱耐性;viii)自己分解に対する増加した耐性;またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、vii)およびviii)のいずれかの組合せから選択される少なくとも1種の改善された特性を示す、請求項1~44のいずれかに記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記参照配列が、配列番号2である、請求項46に記載の組換えプロテアーゼ。
- 前記参照配列が、配列番号34、190、292、342、382、400、454、562、638、680、756、812、1030、1136、1180、1250、1308、1364、1370、1424、1532、1608、1650、1726、1782、2000、2106、2150、2220および2278から選択される、請求項46に記載の組換えプロテアーゼ。
- 請求項1~48のいずれかに記載の少なくとも1種の組換えプロテアーゼを含む組成物。
- 請求項1~48のいずれかに表示される少なくとも1種の組換えプロテアーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列。
- コドン最適化されている、請求項50に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
- 請求項50または51に記載の少なくとも1種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 前記組換えポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項52に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列が、プロモーターである、請求項52または53に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項54に記載の発現ベクター。
- 請求項52~55のいずれかに記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 真核細胞または原核細胞である、請求項56に記載の宿主細胞。
- 組換えプロテアーゼを産生する方法であって、前記組換えポリヌクレオチドによってコードされる前記組換えプロテアーゼが産生される条件下で、請求項56または57に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
- 前記プロテアーゼを回収するステップをさらに含む、請求項58に記載の方法。
- 前記プロテアーゼを精製するステップをさらに含む、請求項59に記載の方法。
- 請求項49に記載の組成物を含む、膵機能不全の処置のための医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含む、請求項61に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1種のリパーゼをさらに含む、請求項61または62に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1種のアミラーゼをさらに含む、請求項61~63のいずれかに記載の医薬組成物。
- 少なくとも1種のプロテアーゼ、少なくとも1種のリパーゼおよび少なくとも1種のアミラーゼを含む膵臓抽出物をさらに含む、請求項61~64のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトへの非経口注射もしくは注入、皮下注射、吸入、または皮膚適用に適する、請求項61~65のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトへの経口投与に適する、請求項61~65のいずれかに記載の医薬組成物。
- 腸溶コーティングをさらに含む、請求項67に記載の医薬組成物。
- 対象における膵機能不全の症状を処置および/または予防するための方法であって、膵機能不全を有する対象に、請求項71~68のいずれかに記載の医薬組成物を与えるステップを含む方法。
- 膵機能不全の前記症状が軽快する、請求項69に記載の方法。
- 前記対象が、膵機能不全の前記症状を示す対象に要求される食事よりも、そのタンパク質含有量の制限が少ない食事を取ることができる、請求項69または70に記載の方法。
- 前記対象が、ヒト患者である、請求項69~71のいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト患者が、乳児または小児である、請求項72に記載の方法。
- 前記ヒト患者が、成人または若年成人である、請求項73に記載の方法。
- 前記対象が、非ヒト哺乳動物である、請求項69~71のいずれかに記載の方法。
- 医薬としての使用のための、請求項1~47のいずれかに記載の組換えプロテアーゼまたは請求項49および61~68のいずれかに記載の組成物。
- 栄養補助食品としての使用のための、請求項1~47のいずれかに記載の組換えプロテアーゼまたは請求項49および61~68のいずれかに記載の組成物。
- 膵機能不全の症状の処置または予防における使用のための、請求項1~47のいずれかに記載の組換えプロテアーゼまたは請求項49および61~68のいずれかに記載の組成物。
- 請求項49および61~68のいずれかに提供される組成物の使用。
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