CN117159748A

CN117159748A - Tmprss12基因在制备预防或治疗新型冠状病毒感染药物的应用

Info

Publication number: CN117159748A
Application number: CN202311170474.6A
Authority: CN
Inventors: 姜力; 丁宁; 张纯; 刘剑锋
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-09-12
Filing date: 2023-09-12
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2043-09-12
Also published as: CN117159748B

Abstract

本申请涉及生物医药领域。具体来说，本申请涉及TMPRSS12蛋白或其抑制剂在制备预防和/或治疗受试者的由SARS‑CoV‑2感染导致的疾病和/或症状的药物中的用途。本申请还涉及一种筛选用于预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染导致的疾病和/或症状的药物的方法。因此，本申请的TMPRSS12蛋白或其抑制剂在新型冠状病毒的预防、治疗以及靶向药物筛选中具有较大的潜能。

Description

TMPRSS12基因在制备预防或治疗新型冠状病毒感染药物的应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域。具体来说，本申请涉及TMPRSS12蛋白或其抑制剂在制备预防和/或治疗受试者的由SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物中的用途。本申请还涉及一种筛选用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物的方法。

背景技术

血管紧张素转化酶2(ACE2)已被确定为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)的功能宿主受体，主要在心脏、肾脏和睾丸中表达，有研究表明雄性睾丸中ACE2含量较高。

因此，针对SARS-CoV-2进入宿主细胞的方式，尤其是新冠病毒进入睾丸细胞的关键因子，开发一种预防和治疗新冠病毒感染的靶向药物具有重大应用价值。

发明内容

本申请的申请人发现TMPRSS12在猪精浆胞外囊泡中高度表达，且在睾丸间质细胞和支持细胞中具有较高的表达丰度。进一步的，本申请的申请人通过验证TMPRSS12与新冠病毒S蛋白以及ACE2的结合，以及检测TMPRSS12干扰后细胞的病毒感染量，确定了TMPRSS12与新冠病毒感染的关系。并且，本申请的申请人通过设计干扰小RNA序列抑制TMPRSS12的表达，从而抑制新冠病毒进入细胞，最终达到治疗和预防新冠病毒感染的目的。

因此，在第一方面，本申请提供了选自如下的(1)至(6)项中的任意一项在制备预防和/或治疗受试者的由SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物中的用途：

(1)TMPRSS12蛋白；

(2)TMPRSS12基因；

(3)核酸构建体，其含有用于完全敲除或者部分敲除TMPRSS12基因的多核苷酸；

(4)抑制或阻断TMPRSS12蛋白或其互作蛋白活性的试剂；

(5)抑制或降低TMPRSS12基因表达水平的试剂；

(6)抑制或降低另外的基因表达水平的试剂，所述另外的基因能够调控TMPRSS12基因的表达水平，或者所述另外的基因的表达水平受TMPRSS12基因调控。

在本申请中，术语“新型冠状病毒”或“SARS-CoV-2”不局限于某一种或某几种特定的毒株，其包括SARS-CoV-2野生型病毒株以及SARS-CoV-2突变型病毒株。

在某些实施方案中，所述SARS-CoV-2的病毒株包括但不限于，D614G毒株、B.1.1.7毒株、B.1.1.529毒株、P.1毒株、B.1.351毒株、B.1.429毒株、B.1.525毒株、B.1.526a毒株、B.1.526b毒株、B.1.617.1毒株、B.1.617.2毒株、C.37毒株和A.VOI.V2毒株。

在某些实施方案中，所述D614G毒株具有如GISAID:MN908947.3中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.1.7毒株具有如GISAID:EPI_ISL_601443中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.1.529毒株具有如GISAID:EPI_ISL_6704867中所示的序列。在某些实施方案中，所述P.1毒株具有如GISAID:EPI_ISL_792680中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.351毒株具有如GISAID:EPI_ISL_700428中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.429毒株具有如GISAID:EPI_ISL_873881中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.525毒株具有如GISAID:EPI_ISL_762449中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.526b毒株具有如GISAID:EPI_ISL_1009654中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.526a毒株具有如GISAID:EPI_ISL_995145中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.617.1毒株具有如GISAID:EPI_ISL_1595904中所示的序列。在某些实施方案中，所述B.1.617.2毒株具有如GISAID:EPI_ISL_1662451中所示的序列。在某些实施方案中，所述C.37毒株具有如GISAID:EPI_ISL_2921532中所示的序列。在某些实施方案中，所述A.VOI.V2毒株具有如GISAID:EPI_ISL_1347941中所示的序列。

在某些实施方案中，如上的(1)至(6)项中的任意一项用于预防SARS-CoV-2感染受试者的细胞、组织或器官(例如，生殖器官，心，肝，肺，胃，肾)。

在某些实施方案中，所述药物用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染受试者的细胞、组织或器官(例如，生殖器官，心，肝，肺，胃，肾)。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的TMPRSS12蛋白。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白选自天然的TMPRSS12蛋白，TMPRSS12蛋白的突变体，TMPRSS12蛋白的同源物，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白具有如SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述多核苷酸选自：反义寡核苷酸，siRNA，shRNA，miRNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的guide RNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的crRNA，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述siRNA具有如SEQ ID NO:1所示的正义链和如SEQ ID NO:2所示的反义链。

在某些实施方案中，所述siRNA具有如SEQ ID NO:3所示的正义链和如SEQ ID NO:4所示的反义链。

在某些实施方案中，所述guide RNA具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述试剂包括特异性结合TMPRSS12蛋白的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自ScFv，Fab，(Fab’)₂，Fv片段。

在某些实施方案中，所述试剂包括小分子化合物。

在某些实施方案中，所述互作蛋白为ACE2。

在某些实施方案中，所述ACE2蛋白为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的蛋白。

在某些实施方案中，所述另外的基因选自AR，JAK1，JAK2，MAPK14，CD147，TLR1，HYOU1，SFN，HSP90AA1，ITGB1，ART3，DNAH17，NELL2，LY6K，TEX101，CD74，DCN，RARRES2，ABCC2，PARP14，HERC5，HERC6，PLAC8，DDX58，MX1，DDX60，IFIT2，MX2，IFIT3，ISG15，LOC100155195，RSAD2，IFIT1，OASL，TMPRSS12，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述另外的基因为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的基因。

在某些实施方案中，所述抑制或降低另外的基因表达水平的试剂选自：反义寡核苷酸，siRNA，shRNA，miRNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的guide RNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的crRNA，或其任意组合。

在某些实施方案中，所述抑制或降低另外的基因表达水平的试剂具有如SEQ IDNO:24-59所示的序列。

在某些实施方案中，AR，JAK1，JAK2，MAPK14，CD147，TLR1，HYOU1，SFN，HSP90AA1，ITGB1，ART3，DNAH17，NELL2，LY6K，TEX101，CD74具有如下所示的Gene ID和/或Ensembl ID。

在某些实施方案中，DCN，RARRES2，ABCC2，PARP14，HERC5，HERC6，PLAC8，DDX58，MX1，DDX60，IFIT2，MX2，IFIT3，ISG15，LOC100155195，RSAD2，IFIT1，OASL，TMPRSS12具有如下所示的Gene ID和/或Ensembl ID。

在某些实施方案中，由SARS-CoV-2感染导致的疾病为新型冠状病毒感染。

在某些实施方案中，所述由SARS-CoV-2感染导致的症状选自发烧、咳嗽、肌肉痛、嗜睡、腹泻、呕吐、头痛、胃痛、气短、痰产生、咽喉痛、完全或部分嗅觉丧失和完全或部分味觉丧失。

在某些实施方案中，所述由SARS-CoV-2感染导致的症状选自男性生殖相关激素紊乱(例如，睾酮水平下降)，精子数量下降，精子质量下降。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，人。

在某些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在第二方面，本申请提供了一种筛选用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物的方法，所述方法包括给予细胞或动物以待测药物，以及检测TMPRSS12蛋白活性或者检测TMPRSS12基因表达水平的步骤。

在某些实施方案中，如果相对于给药之前或者不给药的对照，TMPRSS12蛋白活性降低或者TMPRSS12基因表达水平降低，初步判断待测药物为有效候选药物。

在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物的细胞，或者，所述动物为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白如第一方面所定义的。

在某些实施方案中，通过荧光定量PCR检测TMPRSS12基因的表达水平。

在第三方面，本申请提供了一种检测受试者接受的疗法是否有效的方法，所述疗法用于预防SARS-CoV-2感染，或者用于治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状；

其中，所述方法包括：

(1)检测受试者在接受所述疗法之后TMPRSS12蛋白活性或者TMPRSS12基因表达水平；

(2)将上述活性或水平与所述受试者在接受所述疗法之前的活性或水平进行比较；或者，将上述活性或水平与健康受试者的活性或水平进行比较。

在某些实施方案中，所述受试者在接受所述疗法之后TMPRSS12蛋白活性或者TMPRSS12基因表达水平低于所述受试者在接受所述疗法之前的活性或水平，或者，所述受试者在接受所述疗法之后TMPRSS12蛋白活性或者TMPRSS12基因表达水平低于健康受试者的所述目标化合物的活性或水平，则所述疗法有效。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白如第一方面所定义的。

在第四方面，本申请提供了选自如下的(1)至(6)项中的任意一项在制备筛选用于治疗和/或预防由SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物的动物模型或者细胞模型中的用途：

(1)TMPRSS12蛋白；

(2)TMPRSS12基因；

(4)抑制或阻断TMPRSS12蛋白或其互作蛋白活性的试剂；

(5)抑制或降低TMPRSS12基因表达水平的试剂；

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如，人。

在某些实施方案中，所述TMPRSS12蛋白如第一方面所定义的。

在某些实施方案中，所述多核苷酸如第一方面所定义的。

在某些实施方案中，所述试剂如第一方面所定义的。

在某些实施方案中，所述互作蛋白如第一方面所定义的。

在某些实施方案中，所述另外的基因如第一方面所定义的。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，又称为“新型冠状病毒”，属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。在某些实施方案中，ACE2的序列是本领域技术人员已知的，可参见公共数据库，例如GenBank。

如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒感染”是指，因新型冠状病毒感染而导致的疾病，例如肺炎。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人，啮齿类动物(小鼠，大鼠，豚鼠)，狗，马，牛，猫，猪，猴，黑猩猩等。在某些实施方案中，受试者是人。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”意指，制药领域公认的可用于动物，特别是可用于人的。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂(包括但不限于磷酸盐缓冲液)，表面活性剂(包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80)，佐剂，离子强度增强剂(包括但不限于氯化钠)，稀释剂，赋形剂，用于容纳或施用治疗剂的介质，以及其任何组合。

如本文中所使用的，药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物的或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。

如本文中所使用的，药学上可接受的赋形剂可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，药物组合物还可以包括润湿剂，或乳化剂例如透明质酸钠，或pH缓冲剂。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配方等形式。

如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本文中所使用的天然的TMPRSS12蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的TMPRSS12蛋白。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如GenBank数据库)获得TMPRSS12蛋白的氨基酸序列。例如，天然的TMPRSS12蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO：20或21所示。

如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“互作蛋白”是指彼此之间能够形成复合物的蛋白。研究蛋白质相互作用的方法有亲和纯化(AP)、化学交联偶联质谱CXMS)等方法。其中AP技术使用特别设计的纯化标签在非常接近于生理条件的情况下，能捕捉出特定的蛋白质及其分子伴侣。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

发明的有益效果

本申请通过获得了能够显著抑制SARS-CoV-2感染的靶向蛋白—TMPRSS12蛋白，通过降低或抑制TMPRSS12的表达水平，与TMPRSS2相比显著的抑制了SARS-CoV-2的感染量。不仅如此，通过降低或抑制TMPRSS12的表达水平还显著的抑制了SARS-CoV-2对生殖细胞的感染量。因此，本申请的TMPRSS12蛋白或其抑制剂在新型冠状病毒的预防、治疗以及靶向药物筛选中具有较大的潜能，且特别适用于预防和治疗新型冠状病毒对男性生殖功能的影响。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了猪源pTMPRSS12-pcDNA3.1(+)-HisA表达载体示意图。

图2显示了TMPRSS12蛋白和新冠病毒S蛋白及ACE2相互作用的检测结果。

图3显示了人源和猪源的TMPRSS12同源序列比对结果。

图4显示了本申请设计的TMPRSS12干扰片段Si-520和Si-751的干扰效率检测结果。

图5显示了在293T细胞(图5A)，hST细胞(图5B)，PK15细胞(图5C)和LC细胞(图5D)中干扰TMPRSS12和TMPRSS2之后其表达水平，以及干扰TMPRSS12和TMPRSS2之后新冠病毒的感染量。

图6显示了过表达TMPRSS12与对照组LC细胞Spike蛋白的表达及新冠病毒的感染量。

图7显示了过表达TMPRSS12与对照组hST细胞Spike蛋白的表达及新冠病毒的感染量。

图8显示了TMPRSS12敲除的两株LC细胞鉴定结果及其与对照组细胞的新冠病毒感染量。

图9中的A显示了LC细胞及其孵育病毒36h后TMPRSS12基因的表达变化；图9中的B显示了筛选出的20个差异表达基因在对照组、基因敲除组和过表达组的表达情况；图9中的C图显示了LC细胞分别干扰TMPRSS12和TMPRSS2基因后，TMPRSS12、TMPRSS2和ACE2的表达变化；图9中的D图显示了LC细胞干扰TMPRSS12基因后，16个相关通路基因的表达变化。

图10中的A至C显示了TMPRSS12调控胆固醇、睾酮和雌二醇合成的结果；图10中的D显示了敲除TMPRSS12后睾酮合成相关蛋白的表达结果；图10中的E显示了敲除TMPRSS12后细胞凋亡相关蛋白的表达结果；图10中的F显示了与TMPRSS12存在调控关系的蛋白表达。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.免疫共沉淀及免疫印迹法检测确认TMPRSS12和新冠病毒S蛋白及ACE2相互作用

(1)根据NCBI数据库中猪源TMPRSS12(Gene ID:110260566)基因序列构建猪源pTMPRSS12-pcDNA3.1(+)-HisA表达载体(简称pTMPRSS12+)，该载体的插入片段的序列如SEQ ID NO:22所示，pcDNA3.1(+)-HisA载体购自北京六合华大基因科技有限公司，His标签连接在载体TMPRSS12的3’端(图1)。从碧云天购买SARS-CoV-2-Spik蛋白的过表达载体pcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike-Myc(简称pcSpike+)。

(2)转染过表达载体：将构建好的猪源pTMPRSS12+过表达载体和pcSpike+利用lip3000转染试剂转染至LC细胞(猪睾丸间质细胞)中，质粒转染各2μg，6h后更换新的培养基，48h后弃培养基，使用预冷1×PBS，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(RIPA细胞总蛋白提取裂解液，1％蛋白酶抑制剂PMSF)后，置于冰上30min，4℃，12000rpm离心10min，吸取上清至干净1.5mL EP管中，为原始样品，称为input组，共分为5组进行后续处理，其中不做任何处理的input组(原始样品组)保留一份，其他4份进行如下处理：①不加抗体进行IP组，②添加鼠源IgG(m-IgG Fc BP-HRP，货号sc-525409，购于Santa cruz)进行IP组，③添加spike抗体(Anti-SARS spike glycoprotein抗体[1A9]，货号ab273433，购于Abcam)进行IP组，④添加His抗体(His-Tag抗体，货号sc-8036，购于Santa cruz)进行IP组，⑤添加ACE2抗体(ACE2抗体，货号sc-390851，购于Santa cruz)进行IP组，于4℃旋转孵育过夜进行免疫共沉淀，加入25μL Protein A+G Magnetic Beads，4℃旋转孵育3h，使用磁力架小心吸除上清，用500μL含1％PMSF的洗涤液洗涤5次。完成最后一次洗涤后，去除上清，加入100μLElution Buffer，孵育10min，取上清加入25μL SDS上样缓冲液，100℃处理10分钟，取25μL样品用于SDS-PAGE电泳，110V电泳10min，170V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。将凝胶蛋白转至PVDF膜，转膜条件130v，1h。5％脱脂奶粉封闭后，1×TBST洗三次，分别孵育anti-ACE2(货号sc-390851，购于Santa cruz)，anti-TMPRRSS12(货号PA5-70159，购于ThermoFisher Scientific)，anti-γ-actin(货号sc-65638，购于Santa cruz)和Anti-SARSspike glycoprotein抗体(货号ab273433，购于Abcam)，1×TBST洗三次，孵育二抗(1:2000)，二抗羊抗小鼠IgG-HRP(货号SE131)和羊抗兔IgG-HRP(货号SE134)购于Solarbio，化学发光显影。

结果表明Spike免疫沉淀产物，His免疫沉淀产物，ACE2免疫沉淀产物中都存在TMPRSS12(图2)，证明TMPRSS12分别与新冠病毒的Spike蛋白和ACE2存在直接的相互作用。基于上述实验结果分析，推测TMPRSS12可以结合病毒Spike蛋白，并对其进行切割，从而参与新型冠状病毒进入细胞的过程。

实施例2.干扰TMPRSS12显著降低人293T、人hST、猪PK15和猪LC细胞的病毒感染量

根据NCBI数据库人源TMPRSS12(Gene ID:283471)基因序列和猪源TMPRSS12(GeneID:110260566)基因序列，通过序列比对人源和猪源的TMPRSS12同源序列比对率达70.15％(图3)。针对同源序列片段设计干扰序列，将其命名为Si-751和Si-520，Si-751的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。Si-520的正义链的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。上述序列由上海吉码公司合成，具体序列信息见表1。

为了对比TMPRSS2对病毒感染细胞的影响，针对人的和猪的TMPRSS2基因序列设计干扰片段。根据NCBI数据库人源TMPRSS2(Gene ID:7113)基因序列和猪源TMPRSS2(GeneID:100739292)基因序列分别设计干扰片段，TMPRSS2-Homo-Si-817(正义链的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示)和TMPRSS2-pig-Si-390(正义链的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示)，进行后续试验。

细胞转染：将合成的Si序列利用lip3000转染试剂分别转染至HEK 293T细胞(人胚肾细胞)，hST细胞(人睾丸支持细胞)，PK15细胞(猪肾细胞)和LC细胞(猪睾丸间质细胞)中，6小时后更换新的培养基。

实时荧光定量PCR检测TMPRSS12在对照组和干扰组中的表达：每个实验组进行3个生物学重复，使用Trizol法提取细胞总RNA。具体为细胞培养六孔板的每孔细胞加入800μL的Trizol裂解液，涡旋混匀。室温(15-25℃)下静置5min。每管样本中加入200μL的氯仿，并盖紧盖，大力晃动15s，室温下静置2-3min，4℃，12000g离心15min。将上层清液转移到一个新的EP管中，注意避免不要混入下层液相，加入等体积异丙醇，混匀。4℃，8000g离心10min，弃上清。加1mL无水乙醇4℃，7500g离心10min，弃上清。加1mL 75％乙醇，4℃，7500g离心10min，弃上清。将EP管开盖室温静置3min。向EP管中加入50μL的RNAfree water，盖上盖子室温静置2min。Nanodrop核酸分析仪(Thermo Scientific，美国)检测总RNA的纯度和浓度；根据反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)(RR047，TAKARA，大连)说明书对样品总RNA进行反转录，得到cDNA，整个反应在冰上进行。反转录反应体系(总体积为20μL)如下：①模板总RNA为5μL，5×gDNA Eraser Buffer为2μL，gDNAEraser为1μL，RNase Free dH2O为2μL，反应条件42℃，2min，4℃保存；②将反应①的体系，与1μL PrimeScript RT Enzyme Mix，1μL RT Primer Mix，4μL5×PrimeScriptBuffer 2，4μL RNase Free dH2O混合，反应条件37℃，15min，85℃，5s，4℃保存。定量：根据TB Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)(RR820，Takara，大连)试剂盒说明书，采用引物对1进行实时荧光定量PCR，检测TMPRSS12表达量。PCR反应体系(总体积为20μL)如下：模板cDNA为5.0μL；引物对中F和R分别为0.8μL(具体序列如表1中的SEQ ID No:9-16所示)；TB GreenPremix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)为10.0μL；ddH2O为3.4μL。引物F和R在反应体系中的终浓度均为0.4μM。

表2.定量PCR运行程序

结果显示(图4)在LC细胞中，干扰片段Si-751和Si-520对TMPRSS12的表达均有较好的干扰。选择同源性较高的干扰片段Si-751进行后续试验。结果显示(图5A至图5D)在四种细胞系中，干扰组的TMPRSS12表达量显著低于对照组(NC)，表明干扰片段有效，可以显著降低TMPRSS12在人293T细胞、人hST细胞、猪PK15细胞和猪LC细胞中的表达量。

新冠病毒孵育和检测

实验前在显微镜下，对所用实验细胞进行观察，确定细胞饱满、分部均匀、无污染后进行后续实验。COVID-GFP假病毒购于金唯智公司，病毒带有荧光标记GFP的基因序列，进入细胞后可翻译为GFP蛋白，发荧光。采用的病毒滴度为1.60E+07TU/mL，感染后24小时更换新鲜培养基，48小时后观察荧光表达情况。

结果显示(图5A至图5D)，Si-751在293T，hST，PK15和LC细胞中显著降低TMPRSS12的表达，同时免疫荧光结果显示COVID-GFP假病毒进入细胞的量显著降低。因此，实验结果证明Si-751可以通过降低TMPRSS12的表达降低COVID-GFP假病毒进入细胞的感染量。

同时，可以观察到干扰TMPRSS2(Si-817)后的293T细胞，病毒感染量并未显著减少，表明TMPRSS2在介导新冠病毒进入293T细胞中并未发挥明显作用，而TMPRSS12在介导病毒进入细胞过程中则显示出了十分突出的作用。此外，在hST细胞和PK15细胞中，干扰TMPRSS2也表现出类似的结果。虽然干扰TMPRSS2后，COVID-GFP假病毒进入细胞的感染量降低，但干扰TMPRSS12基因的hST细胞和PK15细胞病毒感染量低于干扰TMPRSS2的hST细胞和PK15细胞，表明TMPRSS12在介导新冠病毒进入hST细胞和PK15细胞的过程中发挥更加重要的作用。在LC细胞中，干扰TMPRSS2和干扰TMPRSS12后细胞的病毒感染量都显著低于对照组。

实施例3.过表达TMPRSS12提高猪LC细胞和人hST细胞中新冠病毒的切割效率和感染量

1、猪LC细胞的切割效率和感染量检测

转染猪源TMPRSS12过表达载体到猪LC细胞：将构建好的猪源pTMPRSS12+利用lip3000转染试剂转染至LC细胞中，质粒分别转染4μg(图6中命名12+)和8μg(图6中命名12++)，12h后更换新的培养基，添加COVID-GFP假病毒，12h后弃培养基，使用预冷1×PBS，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(RIPA细胞总蛋白提取裂解液，1％蛋白酶抑制剂PMSF)后，置于冰上30min，4℃下12000rpm离心10min，吸取上清至干净1.5mL EP管中，加入5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，100℃或沸水浴处理10分钟，取25μL样品用于SDS-PAGE电泳，60V电泳30min，90V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。将凝胶蛋白转至PVDF膜，转膜条件130V，1h。5％脱脂奶粉封闭后，anti-TMPRRSS12(货号PA5-70159，购于Thermo Fisher Scientific)，antiγ-actin(货号sc-65638，购于Santa cruz)和Anti-SARS spike glycoprotein抗体(货号ab273433，购于Abcam)，1×TBST洗三次，孵育二抗(1:2000)，二抗羊抗小鼠IgG-HRP(货号SE131)和羊抗兔IgG-HRP(货号SE134)购于Solarbio，化学发光显影。同时，添加COVID-GFP假病毒24h后弃培养基，48小时后显微镜下观察荧光表达情况。

结果显示(图6)，两个过表达TMPRSS12组(12+和12++)，新冠病毒的Spike明显减少，表明TMPRSS12有助于切割Spike。并且与对照组(pcDNA3.1+)相比，过表达组(TMPRSS12-pcDNA3.1+)LC细胞内的新冠病毒GFP荧光显著增多(图6)。以上结果表明，TMPRSS12可以通过切割新冠病毒的Spike，促进病毒进入细胞。

2、人hST细胞的切割效率和感染量检测

转染人源TMPRSS12过表达载体(该载体的插入片段的序列如SEQ ID NO:23所示)到人hST细胞：TMPRSS12过表达载体构建参考前述过程。将构建好的人源TMPRSS12+利用lip3000转染试剂转染至LC细胞中，质粒分别转染4μg(图7中命名为12+)和8μg(图7中命名为12++)，12h后更换新的培养基，添加COVID-GFP假病毒，24h后弃培养基，使用预冷1×PBS，清洗3次，完全弃掉上清。48小时后显微镜下观察荧光表达情况。

结果显示，两个过表达TMPRSS12组(12+和12++)，新冠病毒的Spike明显减少，表明TMPRSS12有助于切割Spike。并且与对照组(pcDNA3.1+)相比，过表达组(TMPRSS12-pcDNA3.1+)hST细胞内的新冠病毒GFP荧光显著增多(图7)。以上结果表明，TMPRSS12可以通过切割新冠病毒的Spike，促进病毒进入人hST细胞。

实施例4.敲除TMPRSS12显著降低LC细胞新冠病毒的感染量

根据NCBI数据库中猪源TMPRSS12(Gene ID:110260566)基因序列，设计gDNA，设计引物针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序，确认细胞的基因型。针对猪源靶基因TMPRSS12设计并合成gRNA(序列如SEQ ID NO:17所示)，Cas9蛋白(货号Z03469)由金斯瑞公司提供，将gRNA和Cas9蛋白电转猪睾丸间质细胞(LC)，对细胞进行基因敲除；提取不同单克隆的基因组DNA，对CRISPR/Cas9编辑的部位进行PCR扩增并测序(扩增引物的序列如SEQID NO:18和19所示)，获得基因敲除纯合的单克隆细胞株。使用COVID-GFP假病毒孵育敲除细胞，病毒滴度为1.60E+07TU/mL，在感染后24h更换新鲜培养基，48小时后观察荧光表达情况。

最终共获得两种基因敲除LC细胞系。PCR产物测序结果表明，TMPRSS12基因序列碱基发生移码，导致翻译提前终止。其中一株敲除细胞系TMPRSS12蛋白不表达(1A9)，将此细胞系命名为KO-1A9；另一株敲除细胞系TMPRSS12蛋白表达量显著降低(1E2)，将此细胞系命名为KO-1E2。结果显示，孵育病毒后，KO-1A9细胞系中病毒荧光几乎全部消失，而KO-1E2细胞系中病毒荧光也明显减少(图8)。以上结果表明，TMPRSS12参与了COVID病毒进入睾丸间质细胞，并且TMPRSS12表达量的下降可以显著降低病毒的感染量。

实施例5.TMPRSS12介导的新冠病毒感染细胞的基因

1、转录组分析

将LC细胞接种至6孔细胞培养板，添加COVID-GFP假病毒，进行共培养，并在病毒孵育36h时收集病毒孵育细胞组(NC+COVID-GFP，简称NCS组)。使用实施例2的方法进行RNA提取和定量检测TMPRSS12的表达。结果显示(图9A)，在病毒孵育36h后，TMPRSS12在mRNA水平上显著降低。

基于上述结果，我们利用正常的LC细胞、敲除TMPRSS12基因的LC细胞(KO-1A9)和过表达TMPRSS12基因的LC细胞(TMPRSS12+)，分别进行病毒孵育处理36h，收集病毒孵育组，共3个组别，分别是：NCS(NC+COVID-GFP，简称NCS组)，KOS(KO-1A9+COVID-GFP，简称KS组)，TMPRSS12+S(TMPRSS12++COVID-GFP，简称TS组)。每组进行3个重复，将收集的3组细胞提取RNA进行转录组测序，探究影响病毒感染过程的相关基因及其表达情况。转录组结果分析显示，共有41个基因在KS vs NCS、KS vs TS和TS vs NCS组同时为差异表达基因。其中20个基因在KS vs NC和TS vs NC组中表达趋势相反(图9B)，表明这20个基因(表3)在病毒感染过程中发挥重要作用。

此外，将针对TMPRSS12的Si-751序列和针对TMPRSS2的Si-390序列利用lip3000转染试剂分别转染至LC细胞(猪睾丸间质细胞)中，6小时后更换新的培养基。转染后48h收样提取RNA进行反转录和定量，实验步骤与实施例2相同。

已有研究报道ACE2和TMPRSS2影响新冠病毒进入细胞。在本实施例中，干扰TMPRSS12的表达，可显著降低TMPRSS2和ACE2的表达(图9C)，表明TMPRSS12的表达可能会直接或间接降低TMPRSS2和ACE2的表达，从而减少病毒对细胞的进入。本实施例中，干扰TMPRSS2会升高TMPRSS12的表达(图9D)。根据实施例3的结果可知，过表达TMPRSS12会增加细胞的病毒感染量。上述结果表明，TMPRSS12和TMPRSS2、ACE2之间可能存在直接或间接的调控关系，对新冠病毒感染具有重要的作用。

基于相关数据分析，我们检测了潜在的影响新冠病毒感染的相关生物学通路中的16个基因。通过上述设计的TMPRSS12干扰序列转染到LC细胞，采用定量PCR检测基因的表达，结果如图10C所示。16个基因的表达发生显著的上调或下调，包括AR、JAK1、JAK2、MAPK14、CD147、TLR1、HYOU1、SFN、HSP90AA1、ITGB1、ART3、DNAH17、NELL2、LY6K、TEX101和CD74。这些基因在新冠病毒感染过程中可能具有重要作用。这些基因的猪源及人源序列的数据库编号具体如表4所示。此外，还针对这些基因设计了干扰引物对，具体引物对的序列如表1中的SEQ ID NO:24-59所示。

表3.基因序列的数据库编号

表4.基因序列的数据库编号

实施例6.TMPRSS12影响睾酮生成及细胞凋亡蛋白的表达

培养LC细胞和KO1A9细胞，铺板至6孔细胞培养板，约每孔2×10^5个细胞，培养12h后进行转染。将构建好的猪源pTMPRSS12+过表达载体利用lip3000转染试剂转染至LC细胞(猪睾丸间质细胞)中，质粒转染2μg，6h后更换新的培养基。48h后弃培养基，使用预冷1×PBS，清洗3次，完全弃掉上清。

利用Testosterone(睾酮)ELISA KIT(货号SEKSM-0003，购于Solarbio)，PorcineE2(Estradiol)(雌二醇)ELISA KIT(货号SEKP-0349，购于Solarbio)和总胆固醇(TC)含量检测试剂盒(货号BC1985，购于Solarbio)进行检测。

细胞内的胆固醇(TC)作为原料合成睾酮和雌二醇，且睾酮可以转化为雌二醇。图10A显示过表达TMPRSS12可以显著提高睾酮合成，KO组细胞则显著降低了睾酮的合成。图10B显示过表达TMPRSS12显著降低了雌二醇的含量，KO组则显著增加了雌二醇的合成。图10C显示，睾酮合成的原材料胆固醇含量在过表达TMPRSS12后也显著升高，KO组则显著降低。以上结果表明TMPRSS12可以调控胆固醇、睾酮和雌二醇的生成。

此外，我们检测了潜在影响睾酮生成和细胞凋亡的相关生物学通路基因的蛋白表达变化。针对LC细胞和构建的TMPRSS12敲除细胞系KO-1A9。培养至3×10^7个细胞后，弃培养基，使用预冷1×PBS，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(膜蛋白提取试剂盒，货号A10008，购于Abmart)后，按操作步骤分离蛋白样品，加入5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，取25μL样品用于SDS-PAGE电泳，120V电泳30min，180V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。将凝胶蛋白转至PVDF膜，转膜条件130V，30min-1h。5％脱脂奶粉封闭后，anti ATPase(货号T40109S，购于Abmart)，antiγ-actin(货号sc-65638，购于Santacruz)，anti HSD3B2(货号sc-515120，购于Santa cruz)，anti CYP19A1(货号sc-374176，购于Santa cruz)，anti CYP17A1(货号sc-374244，购于Santa cruz)，anti ATP5A(货号sc-136178，购于Santa cruz)，anti VDAC11(货号55259-1-AP，购于Proteintech)，anti BAX(货号60267-1-Ig，购于Proteintech)，anti-caspase3(货号sc-sc-56053，购于Santacruz)，anti-ACE2(货号sc-390851，购于Santa cruz)，1×TBST洗三次，孵育二抗(1:2000)，二抗羊抗小鼠IgG-HRP(货号SE131)和羊抗兔IgG-HRP(货号SE134)购于Solarbio，化学发光显影。

结果显示(图10D)，在KO-1A9组中，睾酮合成相关蛋白HSD3B2、CYP19A1和CYP17A1表达显著降低。以上结果表明，敲除TMPRSS12后，睾酮合成相关蛋白表达下降，影响睾酮合成。同时，敲除TMPRSS12，减少了细胞凋亡(图10E)。结果显示(图10F)，TMPRSS12和ACE2之间存在直接或间接的互作关系。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.选自如下的(1)至(6)项中的任意一项在制备预防和/或治疗受试者的由SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物中的用途：

(1)TMPRSS12蛋白；

(2)TMPRSS12基因；

(4)抑制或阻断TMPRSS12蛋白或其互作蛋白活性的试剂；

(5)抑制或降低TMPRSS12基因表达水平的试剂；

2.权利要求1所述的用途，其中，所述药物用于预防SARS-CoV-2感染受试者的细胞、组织或器官(例如，生殖器官，心，肝，肺，胃，肾)；

优选地，所述TMPRSS12蛋白为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的TMPRSS12蛋白；

优选地，所述TMPRSS12蛋白选自天然的TMPRSS12蛋白，TMPRSS12蛋白的突变体，TMPRSS12蛋白的同源物，或其任意组合；

优选地，所述TMPRSS12蛋白具有如SEQ ID NO:20或21所示的氨基酸序列。

3.权利要求1或2所述的用途，其中，所述多核苷酸选自：反义寡核苷酸，siRNA，shRNA，miRNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的guide RNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的crRNA，或其任意组合；

优选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:1所示的正义链和如SEQ ID NO:2所示的反义链；

优选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:3所示的正义链和如SEQ ID NO:4所示的反义链；

优选地，所述guide RNA具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。

4.权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述试剂包括特异性结合TMPRSS12蛋白的抗体或其抗原结合片段；

优选地，所述抗体为单克隆抗体；

优选地，所述抗原结合片段选自ScFv，Fab，(Fab’)₂，Fv片段。

5.权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述试剂包括小分子化合物。

6.权利要求1-5任一项所述的用途，其中，所述互作蛋白为ACE2；

优选地，所述ACE2蛋白为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的蛋白。

7.权利要求1-6任一项所述的用途，其中，所述另外的基因选自AR，JAK1，JAK2，MAPK14，CD147，TLR1，HYOU1，SFN，HSP90AA1，ITGB1，ART3，DNAH17，NELL2，LY6K，TEX101，CD74，DCN，RARRES2，ABCC2，PARP14，HERC5，HERC6，PLAC8，DDX58，MX1，DDX60，IFIT2，MX2，IFIT3，ISG15，LOC100155195，RSAD2，IFIT1，OASL，TMPRSS12，或其任意组合；

优选地，所述另外的基因为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)的基因；

优选地，所述抑制或降低另外的基因表达水平的试剂选自：反义寡核苷酸，siRNA，shRNA，miRNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的guide RNA，用于CRISPR/Cas蛋白酶系统的crRNA，或其任意组合；

优选地，所述抑制或降低另外的基因表达水平的试剂具有如SEQ ID NO:24-59所示的序列。

8.权利要求1-7任一项所述的用途，其中，由SARS-CoV-2感染导致的疾病为新型冠状病毒感染；

优选地，所述由SARS-CoV-2感染导致的症状选自发烧、咳嗽、肌肉痛、嗜睡、腹泻、呕吐、头痛、胃痛、气短、痰产生、咽喉痛、完全或部分嗅觉丧失和完全或部分味觉丧失；

优选地，所述由SARS-CoV-2感染导致的症状选自男性生殖相关激素紊乱(例如，睾酮水平下降)，精子数量下降，精子质量下降；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如，人；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

9.一种筛选用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物的方法，所述方法包括给予细胞或动物以待测药物，以及检测TMPRSS12蛋白活性或者检测TMPRSS12基因表达水平的步骤；

优选地，如果相对于给药之前或者不给药的对照，TMPRSS12蛋白活性降低或者TMPRSS12基因表达水平降低，初步判断待测药物为有效候选药物；

优选地，所述细胞为哺乳动物的细胞，或者，所述动物为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)；

优选地，所述TMPRSS12蛋白如权利要求2所定义的；

优选地，通过荧光定量PCR检测TMPRSS12基因的表达水平。

10.一种检测受试者接受的疗法是否有效的方法，所述疗法用于预防SARS-CoV-2感染，或者用于治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状；

其中，所述方法包括：

(2)将上述活性或水平与所述受试者在接受所述疗法之前的活性或水平进行比较；或者，将上述活性或水平与健康受试者的活性或水平进行比较；

优选地，所述受试者在接受所述疗法之后TMPRSS12蛋白活性或者TMPRSS12基因表达水平低于所述受试者在接受所述疗法之前的活性或水平，或者，所述受试者在接受所述疗法之后TMPRSS12蛋白活性或者TMPRSS12基因表达水平低于健康受试者的所述目标化合物的活性或水平，则所述疗法有效；

优选地，所述受试者为哺乳动物(例如，小鼠，猪，猴，人)；

优选地，所述TMPRSS12蛋白如权利要求2所定义的；

优选地，通过荧光定量PCR检测TMPRSS12基因的表达水平。

11.选自如下的(1)至(6)项中的任意一项在制备筛选用于治疗和/或预防由SARS-CoV-2感染导致的疾病和/或症状的药物的动物模型或者细胞模型中的用途：

(1)TMPRSS12蛋白；

(2)TMPRSS12基因；

(4)抑制或阻断TMPRSS12蛋白或其互作蛋白活性的试剂；

(5)抑制或降低TMPRSS12基因表达水平的试剂；

12.权利要求11所述的用途，其中，由SARS-CoV-2感染导致的疾病为新型冠状病毒感染；

优选地，所述受试者为哺乳动物，例如，人；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；

优选地，所述TMPRSS12蛋白如权利要求1-8任一项所定义的；

优选地，所述多核苷酸如权利要求1-8任一项所定义的；

优选地，所述试剂如权利要求1-8任一项所定义的；

优选地，所述互作蛋白如权利要求1-8任一项所定义的；

优选地，所述另外的基因如权利要求1-8任一项所定义的。