JP2001008687A - 新規金属プロテアーゼ及び該金属プロテアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】創薬標的分子としての可能性が非常に高い、新
規金属プロテアーゼファミリー蛋白質をコードする遺伝
子を単離・同定し、それらの活性を修飾する物質を探索
するために必要となる組換え蛋白の提供。 【解決手段】ADAMファミリーに分類される新規金属プロ
テアーゼをコードする遺伝子を単離し、全長ORF配列を
決定して、該金属プロテアーゼを発現させた。該遺伝子
を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該宿主細
胞を用いた同金属プロテアーゼの製造法、及び、該金属
プロテアーゼ及び該金属プロテアーゼ活性を修飾する化
合物、ペプチド及び抗体のスクリーニング法を確立し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、新規金属プロテア
ーゼ、該金属プロテアーゼをコードする遺伝子、該金属
プロテアーゼの製造方法、該金属プロテアーゼを用いた
スクリーニング法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】これまでに数百種類のプロテアーゼが報
告されている。これらのプロテアーゼの中には、単に蛋
白やペプチドの消化を行う分子の他に、ペプチド鎖の切
断を介して蛋白質の成熟や生理活性の発現、代謝の調
節、情報の発現や伝達など生命現象に直結した重要な役
割に関与している分子が多数あることが知られている。
そのため、古くより、プロテアーゼ阻害剤の医薬品応用
が進められてきた。プロテアーゼの分類において、金属
プロテアーゼ、特に亜鉛を含むものは、アンギオテンシ
ンI交換酵素（ACE）の阻害剤が実際に高血圧等の循環器
疾患治療薬として医療の場で使用されている他、マトリ
ックスメタロプロテアーゼ群、エンドセリン変換酵素、
TNF(Tumor Necrosis Factor) 変換酵素（TACE）、プロ
コラーゲンＣプロテイナーゼ等多くの分子が創薬標的分
子となり、その阻害剤の臨床開発が行われている（監
修：早石修、プロテアーゼとそのインヒビター、メジカ
ルビュー社、1993）。ここで、金属プロテアーゼの中で
も注目すべきものとして、ADAM（A Disintegrin And Me
talloprotease）ファミリーが挙げられる。ADAMはその
名前の通り、Cys残基を多く含むディスインテグリン様
ドメインと金属プロテアーゼ様ドメインを含む分子であ
り、その多くがプロペプチドと金属プロテアーゼ様ドメ
インとの間にfurinプロテアーゼの認識配列を有し、そ
れらによりプロペプチドが切断除去され、成熟蛋白とな
ると考えられている（Black, R. A. et al.,Curr. Opi
n. Cell Biol., 10, 654-659, 1998; Huovila A. P. J.
et al., Curr. Opin. Cell Biol., 8, :692-699, 199
6; Wolfsberg T. G. et al., J. CellBiol., 131, 275-
278, 1995）。ADAMはその金属プロテアーゼ様ドメイン
の相同性より、マトリックスメタロプロテアーゼ群とは
独立した金属プロテアーゼサブファミリーを構成してい
る。最近になり、膜貫通型に加えてトロンボスポンジン
I型繰り返し配列（以下、TSP-1繰り返し配列という）と
それらの中間に位置する配列でマトリックスに付着する
型があることが報告された（Kuno, K. et al., J. Bio
l. Chem., 272, 556-562, 1997; Kuno, K. et al., J.
Biol. Chem., 273,13912-13917,1998; Tang, B. L. et
al., FEBS Lett., 445, 223-225, 1999）。

【０００３】現在までに20種以上知られているADAMファ
ミリーの分子の中で、TACE（ADAM17; Moss, M. L. et a
l., Nature, 385, 733-736, 1997; Black, R. A. et a
l., Nature, 385, 729-733, 1997）、ADAM9（MDC9; Wes
kamp, G. et al., J. Cell Biol., 132, 717-26, 199
6）、ADAM10（MADM; Howard, L. et al., Biochem. J.,
317, 45-50, 1996）、ADAM12(Meltrin alpha; Yagami-H
iromasa, T. et al., Nature, 377, 652-656, 1995)、A
DAM15（Metargidin; Kratzschmar, J. et al., J. Bio
l. Chem., 271; 4593-4596, 1996）、ADAM20（Hooft va
n Huijsduijnen, R., Gene, 206, 273-282, 1998）、マ
ウスADAMTS-1(Kuno, K. et al., J. Biol.Chem., 272,
556-562, 1997)が金属プロテアーゼ様ドメイン内にHExx
H(HisGluXaaXaaHis)からなる亜鉛結合コンセンサス配列
を有している。この中で、TACEはTNFの他、ノックアウ
トマウスの解析からアミロイドプレカーサー蛋白APP（B
uxbaum, J. D. et al., J. Biol. Chem., 273, 27765-2
7767,1998）、TNF受容体、L-セレクチン、TGF(Transfor
ming Growth Factor)-α.（Peschon, J. J. et al., Sc
ience, 282, 1281-1284, 1998）を切断することが示さ
れている。そのため、TACEはTNF変換酵素（可溶性TNFの
生成）、APPのαセクレターゼとしての活性を含め、多
くの膜蛋白のsheddingに関与し、多彩な生理機能を担っ
ているとされている。実際に、TNF変換酵素としての機
能に注目し、その阻害剤の炎症領域への応用が探られて
いる(Conquering Airway Inflammation inthe 21st Cen
tury (Part A), September 14-16, 1998)。また、ADAM1
0はそのショウジョウバエのホモログであるKuzbanianの
解析から、Notch（Blobel, C. P.,Cell, 90, 589-592,
1997; Pan, D. et al., Cell, 90, 271-280, 1997）、N
otch ligand delta（Qi, H. et al., Science, 283, 91
-94, 1999）を切断することが示唆されている。加え
て、in vitroの実験で、APP（Lammich, S. et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA., 96 3922-3927, 1999）、プ
ロTNF（Lunn, C. A. et al., FEBS Lett., 400, 333-33
5, 1997）、IV型コラーゲン(Millichip, M. I.et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 245, 594-598, 199
8）を切断することが示されている。そのため、ADAM10
はNotchシグナルの制御に関与し、神経形成に重要な役
割を果たしている他、膜蛋白のsheddingの一翼、さらに
は細胞外マトリックス成分の分解への関与も示唆されて
いる。さらに、最近になり、関節炎や変形性関節症にお
ける軟骨細胞外基質アグリカンの分解の本体の酵素であ
ると考えられていたアグリカナーゼの1種であるaggreca
nase-1が精製、クローニングされ、ADAMファミリーの分
子であること報告された（Tortorella, M. D. et al.,
Science, 284, 1664-1666, 1999）。このように、ADAM
の細胞接着活性に加えて、プロテアーゼ活性と生理的意
義との関連が注目されきている（Black, R.A. et al.,
Curr. Opin. Cell Biol., 10, 654-659, 1998）。

【０００４】このような観点から、ADAMのプロテアーゼ
活性の検討が行われ、ADAM9とADAM12に生理的基質は不
明なものの蛋白分解能があることが示されてきた。すな
わち、ADAM9は多くのプロテアーゼの基質になるインス
リンB鎖を切断し（Roghani, M. et al., J. Biol. Che
m., 274, :3531-3540, 1999）、 ADAM12は広範囲なプロ
テアーゼと反応するアルファ2マクログロブリン（以下
α2M）との反応産物を生成することが報告された(Loech
el, F. et al., J. Biol. Chem., 273, 16993-16997, 1
998.)。これらの分子に関しては、今後、生理的基質の
探索が行われ、プロテアーゼ活性と生理的意義の関連性
が探られていくと考えられる。その結果、疾患との関連
性があれば、その阻害剤もしくはプロテアーゼ蛋白自体
の医薬品応用がなされていくと期待される。一方、その
他の3種の亜鉛結合コンセンサスを有するADAMに関して
はプロテアーぜ活性の報告はなかった。すなわち、プロ
テアーゼ様ドメインに亜鉛結合コンセンサス配列があっ
たとしてもプロテアーゼ活性の有無を判別することがで
きない状況にあった。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、創薬標的分
子としての可能性が非常に高い新規金属プロテアーゼフ
ァミリー蛋白質をコードする遺伝子を単離・同定し、そ
れらの発現生産系を構築し、それらの活性を修飾する物
質を探索するために必要となる組換え蛋白を提供するこ
とを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討した結果、上記ADAMファミリーに分類
される新規金属プロテアーゼをコードする遺伝子を単離
し、全長ORF配列を決定して、組み換え蛋白の生産を可
能にすることに成功した。さらには、プロテアーゼ活性
を有するアミノ酸配列の単位を特定し、そのアミノ酸配
列を有する組み換え蛋白を用いて、その部位にプロテア
ーゼ活性があることを示し、本発明を見いだした。さら
にまた、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む宿
主細胞、該宿主細胞を用いた同金属プロテアーゼの製造
法を確立した。これにより、該金属プロテアーゼ及び該
金属プロテアーゼ活性を修飾する化合物、ペプチド及び
抗体のスクリーニングを可能にし、本発明を完成した。

【０００６】即ち本発明は、 （１）配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番から
第473番のアミノ酸配列、配列番号10で表されるアミノ
酸配列の第234番から第478番のアミノ酸配列、若しく
は、配列番号20で表されるアミノ酸配列の第214番から
第451番のアミノ酸配列を含み、かつ、蛋白分解能を有
する金属プロテアーゼ、又は、該金属プロテアーゼの同
効物である金属プロテアーゼ。 （２）配列番号１、10若しくは20で表されるアミノ酸配
列を有する蛋白質、又は、配列番号1で表されるアミノ
酸配列の第1番から第473番のアミノ酸配列、配列番号10
で表されるアミノ酸配列の第1番から第478番のアミノ酸
配列、若しくは、配列番号20で表されるアミノ酸配列の
第1番から第451番のアミノ酸配列を有する蛋白質、又
は、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番から第
473番のアミノ酸配列、配列番号10で表されるアミノ酸
配列の第234番から第478番のアミノ酸配列、若しくは、
配列番号20で表されるアミノ酸配列の第214番から第451
番のアミノ酸配列を有する蛋白質。 （３）（１）記載の金属プロテアーゼ、若しくは（２）
記載の蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子。 （４）（３）記載の遺伝子を含むベクター。 （５）（４）記載のベクターを含む宿主細胞。 （６）（５）記載の宿主細胞を用いる（１）乃至（２）
記載の金属プロテアーゼの製造方法。 （７）（１）記載の金属プロテアーゼに対する抗体。 （８）（１）又は（２）記載の金属プロテアーゼと被験
化合物とを接触させ、当該金属プロテアーゼの活性を修
飾する物質をスクリーニングする方法、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明で使用される用語に
つき説明する。本明細書中で使用される「金属プロテア
ーゼ」は、亜鉛コンセンサス配列(HExxH)を有し、プロ
テアーゼ活性を有する「金属プロテアーゼ」を意味す
る。また、「プロテアーゼ」は断りがない限り、「蛋
白」を表す。本発明の新規金属プロテアーゼは、配列番
号1で表されるアミノ酸配列の第233番から第473番のア
ミノ酸配列、配列番号10で表されるアミノ酸配列の第23
4番から第478番のアミノ酸配列、若しくは、配列番号20
で表されるアミノ酸配列の第214番から第451番のアミノ
酸配列を含み、かつ、蛋白分解能を有する金属プロテア
ーゼ、又は、該金属プロテアーゼの同効物である金属プ
ロテアーゼならいずれでもよい。ここで、「金属プロテ
アーゼの同効物」とは、配列番号1で表されるアミノ酸
配列の第233番から第473番のアミノ酸配列、配列番号10
で表されるアミノ酸配列の第234番から第478番のアミノ
酸配列、若しくは、配列番号20で表されるアミノ酸配列
の第214番から第451番のアミノ酸配列の中のいずれかの
１乃至複数個の部位において、１乃至複数個のアミノ酸
残基が置換、失欠、または挿入されていてもよく、か
つ、蛋白分解能を有する金属プロテアーゼである。「金
属プロテアーゼの同効物」として好ましくは、SNPなど
のアミノ酸置換で生じた該金属プロテアーゼを示す。本
発明の新規金属プロテアーゼとして好ましくは、配列番
号１、10若しくは20で表されるアミノ酸配列を含むポり
ペプチド、又は、配列番号1で表されるアミノ酸配列の
第1番から第473番のアミノ酸配列、配列番号10で表され
るアミノ酸配列の第1番から第478番のアミノ酸配列、若
しくは、配列番号20で表されるアミノ酸配列の第1番か
ら第451番のアミノ酸配列を含むポりペプチド、又は、
配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番から第473
番のアミノ酸配列、配列番号10で表されるアミノ酸配列
の第234番から第478番のアミノ酸配列、若しくは、配列
番号20で表されるアミノ酸配列の第214番から第451番の
アミノ酸配列を含むポりペプチドであり、特に好ましく
は、配列番号1、10、若しくは、20記載のアミノ酸配列
を有するポりペプチドである。

【０００８】また、本発明の新規金属プロテアーゼをコ
ードする遺伝子は、上記の金属プロテアーゼをコードす
る塩基配列を含む遺伝子、即ち、配列番号1で表される
アミノ酸配列の第233番から第473番のアミノ酸配列、配
列番号10で表されるアミノ酸配列の第234番から第478番
のアミノ酸配列、若しくは、配列番号20で表されるアミ
ノ酸配列の第214番から第451番のアミノ酸配列で示され
る金属プロテアーゼ、又はそれらの同効物をコードする
塩基配列を含み、かつ、蛋白分解能を有する金属プロテ
アーゼ遺伝子ならいずれでもよい。本発明の新規金属プ
ロテアーゼをコードする遺伝子として好ましくは、配列
番号１、10若しくは20で表されるアミノ酸配列をコード
する遺伝子、又は、配列番号1で表されるアミノ酸配列
の第1番から第473番のアミノ酸配列、配列番号10で表さ
れるアミノ酸配列の第1番から第478番のアミノ酸配列、
若しくは、配列番号20で表されるアミノ酸配列の第1番
から第451番のアミノ酸配列をコードする遺伝子、又
は、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番から第
473番のアミノ酸配列、配列番号10で表されるアミノ酸
配列の第234番から第478番のアミノ酸配列、若しくは、
配列番号20で表されるアミノ酸配列の第214番から第451
番のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。さらに好
ましくは、配列番号2記載の塩基配列の1番目から5058番
目、配列番号11記載の塩基配列の1番から3309番、配列
番号21記載の塩基配列の1番から2667番を有する遺伝子
である。

【０００９】ここで、本発明の金属プロテアーゼをコー
ドする遺伝子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、
本発明の金属プロテアーゼ、本発明の金属プロテアーゼ
の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体のスクリー
ニング方法、金属プロテアーゼに反応する抗体の製造方
法を以下の１）〜４）に記載する。 １）新規金属プロテアーゼ遺伝子の製造方法 a）第１製造法−PCRを用いた方法 本発明の金属プロテアーゼを産生する能力を有するヒト
細胞あるいは組織からmRNAを抽出する。次いでこのmRNA
を鋳型として該金属プロテアーゼmRNAまたは一部のmRNA
領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。denatu
re温度、変性剤添加条件などを改良し、本発明の配列番
号1、10又は20で表されるアミノ酸配列の一部を含む蛋
白質のそれぞれに適した逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖
反応（以下RT-PCRという）を行うことにより、該金属プ
ロテアーゼの全長cDNAまたはその一部を得ることができ
る。もしくは、本発明の金属プロテアーゼを産生する能
力を有するヒト細胞あるいは組織から調製したmRNAから
逆転写酵素により作製したcDNAあるいは市販の該ヒト細
胞あるいは組織由来のcDNAを鋳型とした、ポリメラーゼ
連鎖反応（以下、PCRという）を行うことにより、該金
属プロテアーゼの全長cDNAまたはその一部を得ることが
できる。さらに、得られた金属プロテアーゼの全長cDNA
またはその一部を適当な発現ベクターに組み込むことに
より、宿主細胞で発現させ、該金属プロテアーゼを製造
することができる。まず、本発明の金属プロテアーゼの
産生能力を有する細胞あるいは組織から該プロテアーゼ
をコードするものを包含するmRNAを既知の方法により抽
出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート
・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート
−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグ
アニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられ
る。該プロテアーゼの産生能力を有する細胞あるいは組
織は、該プロテアーゼをコードする塩基配列を有する遺
伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング
法、該プロテアーゼに特異的な抗体を用いたウエスタン
ブロッティング法などにより特定することができる。mR
NAの精製は常法に従えばよく、例えばmRNAをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製すること
ができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりmRNA
をさらに分画することもできる。また、mRNAを抽出せず
とも、市販されている抽出精製済みのmRNAを用いても良
い。次に、精製されたmRNAをランダムプライマー、オリ
ゴｄＴプライマーまたはカスタム合成したプライマーの
存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖cDNAを合成す
る。この合成は常法によって行うことができる。得られ
た第１鎖cDNAを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさん
だ２種類のプライマーを用いてPCRに供し、目的とする
新規金属プロテアーゼDNAを増幅する。また、cDNAを合
成せずとも、市販のcDNAを用いてもよい。得られたDNA
をアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望によ
り、上記DNAを制限酸素等で切断し、接続することによ
って目的とするDNA断片を得ることもできる。

【００１０】b）第２製造法 本発明の遺伝子は上述の製造法の他、常法の遺伝子工学
的手法を用いて製造することもできる。まず、前述の方
法で得たmRNAを鋳型として逆転写酵素を用いて１本鎖cD
NAを合成した後、この１本鎖cDNAから２本鎖cDNAを合成
する。その方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法（Efstrati
adis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976)、Land法(L
and, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266,
1981)、O. Joon Yoo法(Yoo, O. J. et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983)、Okayama-B
erg法(Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell. Biol.,
2,161-170, 1982)などが挙げられる。次に、上述の方法
で得られる組換えプラスミドを大腸菌、例えばDH5α
株、HB101株、JM109株等に導入して形質転換させて、テ
トラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等に対す
る薬剤耐性を指標として組換体を選択することができ
る。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌
の場合にはHanahanの方法(Hanahan, D. J., Mol. Bio
l., 166, 557-580, 1983)、すなわちCaCl₂やMgCl₂また
はRbClを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換
えDNA体を加える方法により実施することができる。も
ちろん、市販のコンピテント細胞を使用しても構わな
い。なお、ベクターとしてはプラスミド以外にもラムダ
系などのファージベクターも用いることができる。上記
により得られる形質転換株から、目的の新規金属プロテ
アーゼ蛋白質のDNAを有する株を選択する方法として
は、例えば以下に示す各種方法を採用できる。

【００１１】 合成オリゴヌクレオチドプローブを用
いるスクリーニング法 本発明の金属プロテアーゼの全部または一部に対応する
オリゴヌクレオチドを合成し（この場合コドン使用頻度
を用いて導いたヌクレオチド配列または考えられるヌク
レオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のど
ちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてそ
の種類を減らすこともできる）、これをプローブ（³²P
又は³³Pで標識する）として、形質転換株のDNAを変性固
定したニトロセルロースフィルターやナイロンフィルタ
ーとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、
これを選択する。 ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用
いるスクリーニング法 本発明の金属プロテアーゼの一部に対応するセンスプラ
イマーとアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチド
を合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応(Sai
ki, R. K. et al., Science 239, 487-491, 1988)を行
い、目的の金属プロテアーゼの全部又は一部をコードす
るDNA断片を増幅する。ここで用いる鋳型DNAとしては、
該金属プロテアーゼを産生する細胞のmRNAより逆転写反
応にて合成したcDNA、またはゲノムDNAを用いることが
できる。このようにして調製したDNAを断片を³²P又は³³
Pで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイ
ブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより目的のクローンを選択する。 他の動物細胞で新規金属プロテアーゼを産生させて
スクリーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能で転写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動
物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのい
ずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白を細胞外に
産生させる。本発明の金属プロテアーゼに対する抗体を
用いて該金属プロテアーゼを検出することにより、元の
形質転換株より目的の金属プロテアーゼをコードするcD
NAを有する株を選択する。 本発明の金属プロテアーゼに対する抗体を用いて選
択する方法 あらかじめ、cDNAを発現ベクターに組込み、形質転換株
の培養上清、細胞内もしくは細胞表面に蛋白を産生さ
せ、本発明の金属プロテアーゼに対する抗体および該抗
体に対する２次抗体を用いて、所望の金属プロテアーゼ
産生株を検出し、目的の株を選択する。 セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランス
レーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるcDNAを、ニトロセルロースフィ
ルター等にブロットし本発明の金属プロテアーゼ産生細
胞からのmRNAをハイブリダイズさせた後、cDNAに結合し
たmRNAを解離させ、回収する。回収されたmRNAを蛋白翻
訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入
や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞
系で蛋白に翻訳させる。本発明の金属プロテアーゼに対
する抗体を用いて検出して、目的の株を選択する。得ら
れた目的の形質転換株より本発明の金属プロテアーゼを
コードするDNAを採取する方法は、公知の方法(Sambroo
k, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manu
al", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) 等の
遺伝子操作実験マニュアルに従い実施できる。例えば細
胞よりプラスミドDNAに相当する画分を分離し、該プラ
スミドDNAよりcDNA領域を切り出すことにより行ない得
る。

【００１２】ｃ）第３製造法 本発明の金属プロテアーゼ遺伝子は、化学合成法によっ
て製造したDNA断片を結合することによっても製造でき
る。各DNAは、DNA合成機［例えば、Oligo 1000M DNA Sy
nthesizer (Beckman社製)、あるいは、394 DNA/RNA Syn
thesizer (Applied Biosystems社製)など］を用いて合
成することができる。

【００１３】ｄ）第４製造法 本発明の金属プロテアーゼ遺伝子は、金属プロテアーゼ
の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル
法(Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 19
84)等の常法に従い、核酸の化学合成により製造するこ
ともできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ
自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定でき
る(Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43
-r74, 1981)。さらに、これら塩基配列のコドンの一部
改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイトス
ペシフィック・ミュータジェネシス(site specific mut
agenesis) (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 81, 5662-5666, 1984)等に従うことができ
る。

【００１４】以上、ａ）乃至ｄ）により得られるDNAの
配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法
(Maxam, A. M. and Gilbert, W., "Methods in Enzymol
ogy", 65, 499-559, 1980)やジデオキシヌクレオチド鎖
終結法(Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269-2
76, 1982)等により行うことができる。また、本発明の
ベクター、本発明の宿主細胞、本発明の金属プロテアー
ゼは、下記の方法によって得ることができる。 ２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の金
属プロテアーゼの組み換え蛋白質の製造方法 単離された本発明の金属プロテアーゼをコードする遺伝
子を含む断片は、適当なベクターDNAに再び組込むこと
により、真核生物および原核生物の宿主細胞を形質転換
させることができる。さらに、これらのベクターに適当
なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入す
ることにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発
現させることが可能である。例えば、真核生物の宿主細
胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎
動物細胞としては、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,
Y. Cell, 23, 175-182, 1981)やチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞(CHO)のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
（Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980)、ヒト胎児腎臓由来HE
K293細胞および同細胞にEpstein BarrVirusのEBNA-1遺
伝子を導入した293-EBNA細胞（Invitrogen社）等がよく
用いられるが、これらに限定されるわけではない。脊椎
動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとす
る遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等
を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製
起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーターを有するpSV2dhfr (Subraman
i, S., et al. Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 198
1)、ヒトのelongation factorプロモーターを有するpEF
-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids
Res., 18, 5322, 1990)、cytomegalovirusプロモーター
を有するpCEP4(Invitrogen社製）等を例示できるが、こ
れに限定されない。宿主細胞として、COS細胞を用いる
場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製
起点を有し、COS細胞において自律増殖が可能であり、
さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびRNA
スプライス部位を備えたものを用いることができ、例え
ば、 pME18S、 (Maruyama, K. and Takebe,Y., Med. Im
munol., 20, 27-32, 1990)、pEF-BOS (Mizushima, S. a
nd Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 199
0)、 pCDM8(Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987)等
が挙げられる。該発現ベクターはDEAE−デキストラン法
(Luthman, H. and Magnusson, G.,, Nucleic Acids Re
s., 11, 1295-1308, 1983)、リン酸カルシウム−DNA共
沈殿法(Graham, F. L. and van der Ed, A. J.,, Virol
ogy, 52, 456-457, 1973)、 FuGENE^TM6 Transfection R
eagent(Boeringer Mannheim社製）を用いた方法、およ
び電気パスル穿孔法(Neumann, E. et al.,, EMBO J.,
1, 841-845,1982)等によりCOS細胞に取り込ませること
ができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができ
る。

【００１５】また、宿主細胞としてCHO細胞を用いる場
合には、発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして
機能するneo遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSVn
eo(Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Labor
atory Manual", Cold SpringHarbor Laboratory, NY, 1
989)やpSV2-neo(Southern, P. J. and Berg,P., J.,Mo
l. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982)等をコ・トランス
フェクトし、G418耐性のコロニーを選択することにより
新規金属プロテアーゼを安定に産生する形質転換細胞を
得ることができる。また、宿主細胞として293-EBNA細胞
を用いる場合には、Epstein Barr Virusの複製起点を有
し、293-EBNA細胞で自己増殖が可能なpCEP4(Invitrogen
社製）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞
を得ることができる。上記で得られる所望の形質転換細
胞は、常法に従い培養することができ、該培養により細
胞外に本発明の金属プロテアーゼが生産される。該培養
に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて
慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記COS
細胞であればRPMI-1640培地やダルベッコ修飾イーグル
最小必須培地(DMEM)等の培地に必要に応じ牛胎児血清(F
BS)等の血清成分を添加したものを使用できる。また、
上記293-EBNA細胞であれば牛胎児血清(FBS)等の血清成
分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地(DME
M)等の培地にG418を加えたものを使用できる。上記によ
り、形質転換細胞の細胞外に生産される本発明の金属プ
ロテアーゼは、該金属プロテアーゼの物理的性質や生化
学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、
分離・精製することができる。該方法としては、具体的
には例えば該金属プロテアーゼを含む培養液を通常の蛋
白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグ
ラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種
液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を
例示できる。本発明の金属プロテアーゼはマーカー配列
とインフレームで融合して発現させることで、該金属プ
ロテアーゼの発現の確認、精製等が可能になる。マーカ
ー配列としては、例えば、FLAG epitope、Hexa-Histidi
ne tag、Hemagglutinin tag、myc epitopeなどがある。
また、マーカー配列と該金属プロテアーゼの間にエンテ
ロキナーゼ、ファクターXa、トロンビンなどのプロテア
ーゼが認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することに
より、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより
切断除去する事が可能である。

【００１６】３）本発明の金属プロテアーゼの活性を修
飾する化合物、ペプチド及び抗体のスクリーニング方法 本発明のスクリーニング方法は、少なくとも前記により
調製された金属プロテアーゼを用いて、該金属プロテア
ーゼの生化学的な特性に応じた金属プロテアーゼ活性の
修飾の指標を測定する系に被験物質を添加し、該指標を
測定する手段を含む。ここで、該測定系としては、公知
の各種プロテアーゼ測定系（鶴 大典・船津 勝編 生
物化学実験法30 「蛋白質分解酵素I」 学会出版センタ
ー、1993、同31 「蛋白質分解酵素I」 学会出版センタ
ー、1993）を挙げることができ、該文献に記載された処
理方法に従い、あるいは準じて、あるいは応用して実施
することにより被験物質のスクリーニングを行うことが
できる。また、後記実施例5-2に記載したプロテアーゼ
活性測定法を使用してスクリーニングを行うこともでき
る。被験物質としては従来金属プロテアーゼ阻害活性を
有することは知られているが該新規金属プロテアーゼの
活性に対して修飾するか不明な化合物またはペプチド、
あるいはケミカルファイルに登録されている種々の公知
化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技
術（Terrett, N. K. et al., Tetrahedron,51, 8135-81
37, 1995）によって得られた化合物群やファージ・ディ
スプレイ法（Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222,
301-310, 1991）などを応用して作成されたランダム・
ペプチド群を用いることができる。また、微生物の抽出
物や培養上清、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組
織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは
本発明のスクリーニング法により選択された化合物また
はペプチドを化学的または生物学的に修飾した化合物ま
たはペプチドを用いうる。本発明の金属プロテアーゼの
活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体のスクリーニ
ングには、本発明のプロテアーゼまたはその部分ペプチ
ドの基質となるものであればいずれのものでも使用可能
である。例えば、カゼイン、コラーゲン、フイブロネク
チン、ゼラチン等の蛋白、インスリン等の生理活性ペプ
チドや合成ペプチド、蛍光もしくは放射線標識したゼラ
チン、コラーゲンや合成ペプチド、蛍光団、発色団を有
する合成基質等が用いられる。ここでいう合成ペプチド
とは非天然型アミノ酸を含むものも含有する。Knightの
基質など、市販の基質も用いられる。該金属プロテアー
ゼの生化学的な特性に応じた金属プロテアーゼ活性の修
飾の指標を測定する系として、上記の基質と本発明の金
属プロテアーゼ蛋白を適当な緩衝液中で混合し、反応さ
せた後、それぞれの基質にあった方法でプロテアーゼ活
性を検出する。たとえば、非標識の基質を用いる場合
は、SDS-PAGE、HPLC、Zymography等で分解物を検出する
ことが可能であるし、放射線標識した基質や蛍光団、発
光団を有する基質を用いる場合は、液体シンチレーショ
ンカウンター、蛍光検出器、発光検出器等、適当な検出
器を用いることにより、プロテアーゼ活性を検出するこ
とができる。

【００１７】４）本発明の金属プロテアーゼに反応する
抗体の作成方法 本発明の金属プロテアーゼに反応する抗体、例えばポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体は、各種動物に該
新規金属プロテアーゼや該金属プロテアーゼの断片を直
接投与することで得ることができる。また、本発明金属
プロテアーゼをコードする遺伝子を導入したプラスミド
を用いてDNAワクチン法（Raz, E. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; Donnelly, J.
J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996）
によっても得ることができる。ポリクローナル抗体は該
金属プロテアーゼまたはその断片をフロイント完全アジ
ュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮
下また静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、
ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製
造される。このように製造されたポリクローナル抗体は
常法の蛋白質単離精製法により、分離精製することがで
き、常法の蛋白質単離精製法としては例えば、遠心分
離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE-セルロ
ース、ハイドロキシアパタイト、プロテインAアガロー
ス等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。モノク
ローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法
（Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-49
7, 1975）により当業者が容易に製造することが可能で
ある。すなわち、本発明金属プロテアーゼまたはその断
片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバ
ントに乳濁した乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮
下または静脈に数回繰り返し接種することにより免疫す
る。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞
と融合してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマ
を得るためのミエローマ細胞としては、ヒポキサンチン
ーグアニンーホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損や
チミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを持つミエロー
マ細胞、例えば、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.U
1、を利用する。また、融合剤としてはポリエチレング
リーコールを利用する。さらにはハイブリドーマ作製に
おける培地として、イーグル最小必須培地、ダルベッコ
修飾最小必須培地、RPMI-1640などの通常よく用いられ
ているものに適宜10〜30%の牛胎児血清を加えて用い
る。融合株はHAT選択法により選択する。ハイブリドー
マのスクリーニングは培養上清を用い、ELISA法、免疫
組織染色法などの周知の方法または前記のスクリーニン
グ法により行い、目的の抗体を分泌しているハイブリド
ーマのクローンを選択する。また、限界希釈法によっ
て、サブクローニングを繰り返すことによりハイブリド
ーマの単クローン性を保証する。このようにして得られ
るハイブリドーマは培地中で数日間、あるいはプリスタ
ンで前処理したBALB/c系マウスの腹腔内で10〜20日培養
することで精製可能な量の抗体が産生される。このよう
に製造されたモノクローナル抗体は培養上清あるいは腹
水から常法の蛋白質単離精製法により分離精製すること
ができる。

【００１８】以上のように分離精製された抗体につき、
常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素に
よって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法に
より分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含
む抗体断片、例えば、F(ab') ₂、Fab、Fab'、Fvを得るこ
とができる。さらには、本発明金属プロテアーゼに反応
する抗体を、クラクソンらやゼベデらの方法（Clackso
n, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Zebedee,
S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3
179, 1992）によりsingle chain FvやFabとして得るこ
とも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体
遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Lonber
g, N. et al., Nature,368, 856-859, 1994）に免疫す
ることでヒト抗体を得ることも可能である。

【００１９】本発明には、金属プロテアーゼまたは前記
スクリーニング法により選択された金属プロテアーゼの
活性を有意に修飾する化合物、ペプチド及び抗体を有効
成分とする医薬が包含される。本発明の金属プロテアー
ゼ活性修飾化合物、ペプチド、抗体または抗体断片を有
効成分とする製剤は、該有効成分のタイプに応じて、そ
れらの製剤化に通常用いられる担体や賦形剤、その他の
添加剤を用いて調製されうる。投与は錠剤、丸剤、カプ
セル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液剤などによる
経口投与、あるいは静注、筋注などの注射剤、坐剤、経
皮投与剤、経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げら
れる。特に胃で消化されるペプチドにあっては静注等の
非経口投与が望まれる。本発明による経口投与のための
固体組成物は、一つ又はそれ以上の活性物質が少なくと
も一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、
ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセル
ロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸
アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は常
法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば滑沢
剤、崩壊剤、安定化剤、溶解乃至溶解補助剤などを含有
していてもよい。錠剤や丸剤は必要により糖衣又は胃溶
性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆していても
よい。

【００２０】経口のための液体組成物は、乳濁剤、溶液
剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤を含み、一般的
に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノー
ルを含む。該組成物は不活性な希釈剤以外の添加剤、例
えば湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、防腐剤を含有し
ていてもよい。非経口のための注射剤としては、無菌の
水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を含む。水
溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として例えば注射用
蒸留水、生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液
剤、懸濁剤の希釈剤としてはプロピレングリコール、ポ
リエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エ
タノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等
を含む。該組成物はさらに湿潤剤、乳化剤、分散剤、安
定化剤、溶解乃至溶解補助剤、防腐剤などを含んでいて
もよい。組成物は例えばバクテリア保留フィルターを通
す濾過、殺菌剤の配合、または照射によって無菌化され
る。また、無菌の固体組成物を製造し、使用に際し無菌
水その他の無菌用注射用媒体に溶解し使用することもで
きる。投与量は前記スクリーニング法により選択された
有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、性別等
を考慮して適宜決定される。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を更に具体的に説明する。特に
断りのない限り、公知の方法(Sambrook, J. et al., "M
olecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, NY, 1989) 等の遺伝子操作実験マ
ニュアルに従ったが、本発明は実施例に限定されるもの
ではない。

【００２２】（実施例１）新規ヒトADAM型金属プロテア
ーゼ（MDTS1）の全長ORF配列の決定 新規ヒトADAM型金属プロテアーゼMDTS1全長蛋白翻訳領
域(以下ORFとする)配列は、ヒト心臓由来のcDNAクロー
ン、さらにそれらにより取得した配列を用いたrapid am
plification of cDNA ends（以下、RACEとする）により
取得した配列をつなぎ合わせることにより決定した。ヒ
ト心臓由来cDNAライブラリーのスクリーニングには、配
列番号2の399番から831番に対応するDNA断片をプローブ
にした。プローブDNA断片の³²P標識および精製は、それ
ぞれ、BcaBEST^TM Labeling Kit (宝酒造社製)、NICK^TM
カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を
用いて行い、比活性5×10⁸ cpm/μg以上の³²P標識プロ
ーブを調製した。

【００２３】ヒト心臓cDNAライブラリー（human heart
5-strech plus; Clontch社製、カタログ番号：HL3026、
ロット番号：3Y001）約120万クローンを対象にスクリー
ニングを実施した。具体的には、まず、Hybond N⁺（ア
マシャム ファルマシア バイオテク社製）添付の指示書
に従い、Hybond N⁺のナイロン膜へプラークを転写、ア
ルカリ処理によりDNAを固定した後、65℃で18時間³²P標
識プローブとのハイブリダイゼーションを行い、2×SSP
E, 0.1×SDS, 室温15分2回、1×SSPE, 0.1×SDS, 65℃1
5分2回、0.1×SSPE, 0.1×SDS, 65℃15分2回の条件で洗
浄した。続いて、ナイロン膜をX線フィルムに１日から
２日間露出した後、X線フィルムを現像し、陽性シグナ
ルを検出した。陽性シグナルの位置から回収したファー
ジを対象に、上記と同じ条件で2次スクリーニングを行
った。その結果、陽性クローン45-21を取得した。クロ
ーン45-21にはMDTS1遺伝子の一部（配列番号2の745番か
ら2727番）が含有されていた。5'側の残りのORFのDNA配
列は、MDTS1の部分配列を含むcDNAクローン：IMAGEクロ
ーン番号：272098 (ATCC Cat. No. 529211)を購入し、
塩基配列を決定することにより取得した。同クローンに
はMDTS1遺伝子の一部（配列番号2の1番から1277番）が
含まれていた。

【００２４】さらに3'側のDNA配列は、RACEにより生成
したDNA断片を直接塩基配列解析することにより決定し
た。RACEはClontech社のヒト胎盤のMarathon-Ready^TM c
DNAを鋳型として、2回のPCRを1セットとして実施した。
第1セット1回目のPCRは、ヒト胎盤のMarathon-Ready^TM
cDNAを鋳型、配列番号3で示されるオリゴDNA、配列番号
4で示されるオリゴDNA(以下、AP-1とする)各10pmolをプ
ライマーとして、LA-Taq^TM（宝酒造社製、コード番号：
RR002A）を用いて、94℃2分の後、98℃20秒、72℃2分の
サイクル5回、98℃20秒、70℃2分のサイクル5回、98℃2
0秒、68℃2分のサイクル30回という条件で行った。この
1回目の反応液をTE緩衝液で50倍希釈した溶液5μlを鋳
型に、配列番号5で示されるオリゴDNA、配列番号6で示
されるオリゴDNA(以下、AP-2とする）各10pmolをプライ
マーとして、1回目と同じ条件のサイクルで2回目のPCR
反応を行った。第2セットの1回目のPCRは配列番号7で示
されるオリゴDNAとAP-1をプライマーとし、2回目のPCR
は配列番号8で示されるオリゴDNAとAP-2をプライマーと
して、上記第1セットと同じ条件で行った。第3セットの
1回目のPCRは配列番号8で示されるオリゴDNAとAP-1、2
回目のPCRは配列番号9で示されるオリゴDNAとAP-2を用
いた。これにより生成したDNA断片の塩基配列を決定す
ることにより、ようやくインフレームの終止コドンに到
達した。以上より取得した配列をつなぎ合わせること
で、MDTS1全長ORFは5061bpからなり(配列番号2)、1686
アミノ酸からなる蛋白をコードすることが判明した(配
列番号1)。

【００２５】（実施例2）新規ヒトADAM型金属プロテア
ーゼ（MDTS2）の全長ORF配列の決定 MDTS2の全長ORF配列は、ヒト心臓由来cDNAライブラリー
スクリーニングとPCR、RACE法を併用して取得した。ま
ず、実施例1で作製したナイロン膜を用いて、同様の方
法で、ヒト心臓由来cDNAライブラリースクリーニングを
行った。プローブとしては、配列番号11の1189番から14
35番に対応するDNA断片を用いた。プローブ断片の³²P標
識は実施例1に示す通りに行った。その結果、陽性クロ
ーンとしてH1/A1を取得した。H1/A1にはMDTS2の遺伝子
の一部（配列番号11の88番から2994番）が含有されてい
た。ところで、 MDTS2遺伝子の一部約0.7kb（配列番号1
1の845番から1467番）を含むクローンをATCCからIMAGE
クローン#1101403 (ATCC#1368844)として購入したが、
該クローンには配列番号11に示す塩基配列の1468番から
1470番にTGAからなる終止コドンが出現した。この部分
のDNA配列を確認するため、pfu DNAポリメラーゼを用い
たPCRを行い、新たに該当部を含むDNA断片を増幅し、PC
R-Bluntにサブクローニングした後、それぞれ10クロー
ンの塩基配列を決定した。鋳型としては、ヒト子宮また
は乳腺のcDNA（Clontech社製）を用い、forward primer
としては配列番号12で示されるオリゴDNA、reverse pri
merとしては配列番号13で示されるオリゴDNAを用いた。
この結果、検討したヒト子宮または乳腺においては、少
なくとも終止コドンが出現するものと終止コドンが出現
せずORFが続行するものの両者が存在することが判明し
た。この部分を含め、MDTS2では少なくとも数カ所でのa
lternative splicingが確認でき、短長型も数種存在し
たが、cDNAクローンやRACE断片の配列を比較することに
より、配列番号11に示す全長ORF配列を決定した。

【００２６】MDTS2の5'側配列はヒト胎盤cDNAライブラ
リー（宝酒造社製 Human Placentaプラスミド型）を鋳
型、ヒト胎盤cDNAライブラリー作製に用いられた配列番
号14で示されるオリゴDNAと配列番号15、16及び17で示
されるオリゴDNAをプライマーとしたPCRにより取得し
た。PCRにはadvantage cDNA polymerase mix(Clontech
社製)を用いた。PCRは94℃2分、続いて94℃5秒、72℃1
分のサイクルを5回、94℃5秒、70℃1分のサイクルを5
回、94℃5秒、68℃1分のサイクルを5回、94℃30秒、63
℃30秒、72℃1分のサイクルを30回という条件で行っ
た。最初の反応では配列番号14で示されるオリゴDNAと
配列番号15で示されるオリゴDNAを用い、2回目の反応で
は1回目の反応溶液を50倍希釈したもの1μlを鋳型とし
て、配列番号14で示されるオリゴDNAと配列番号16で示
されるオリゴDNAを用い、3回目の反応では同様に2回目
の反応溶液を50倍希釈したもの1μlを鋳型として、配列
番号14で示されるオリゴDNAと配列番号17で示されるオ
リゴDNAを用いてPCR反応を行った。これにより生成した
DNA断片の塩基配列を解析することで、MDTS2の配列番号
11の1番から87番までの塩基配列が明らかとなった。配
列番号11の3'側の残りのORFの塩基配列は、実施例１と
同じ条件のRACEで生成したDNA断片の塩基配列を解析す
ることにより決定した。但し、1回目のPCRは鋳型として
前記ヒト胎盤のMarathon-Ready^TM cDNA、プライマーと
して配列番号18で示されるオリゴDNAとAP-1、２回目のP
CRはプライマーとして配列番号19で示されるオリゴDNA
とAP-2を用いた。以上よりMDTS2全長ORFは3312bpからな
り(配列番号11)、1103アミノ酸からなる蛋白をコードす
ることが判明した(配列番号10)

【００２７】（実施例３）新規ヒトADAM型金属プロテア
ーゼ（MDTS3）の全長ORF配列の決定 MDTS3の全長配列は、ヒト脊髄cDNAライブラリーのスク
リーニングとRACE法を併用して取得した。まず、ヒト脊
髄由来cDNAライブラリー（human spinal cord 5-strech
plus; Clontch社製、カタログ番号：HL5001aロット番
号：46027）約120万クローンを実施例１に示す方法でス
クリーニングした。プローブとしては、配列番号21の84
8番から1144番の塩基に対応するDNA断片を用いた。プロ
ーブの³²P標識および精製は実施例１で示す条件で行
い、比活性5×10⁸ cpm/μg以上の³²P標識プローブを準
備した。その結果、陽性クローンとして69-4を取得し
た。69-4クローンにはMDTS3遺伝子の一部（配列番号21
の532番から2451）が含有されていた。残りの5'側と3'
側部分についてはRACEで生成したDNA断片の塩基配列を
解析することにより決定した。3'側については、まず、
ヒト脳のMarathon-Ready^TM cDNA（Clontech社製）を鋳
型、配列番号22で示されるオリゴDNAとAP-1をプライマ
ーとして、TaKaRa Ex Taq（宝酒造社製）を用いて、1回
目のPCRを行った。反応は、94℃1分の後、94℃5秒、72
℃2分のサイクル5回、94℃5秒、70℃2分のサイクル5
回、94℃5秒、68℃2分のサイクル30回という条件で行っ
た。この反応液をアガロースゲル電気泳動して分離し、
約１.0Kbpと約1.3Kbpの主要なDNA断片を抽出、精製し
た。これらのDNA断片溶液の30分の1量を鋳型、配列番号
23で示されるオリゴDNAとAP-2をプライマーとして、94
℃1分の後、94℃5秒、72℃2分のサイクル5回、94℃5
秒、70℃2分のサイクル5回、94℃5秒、68℃2分のサイク
ル15回という条件で、2回目のPCRを行った。増幅された
約１.0Kbpと約1.3Kbpの主要なDNA断片をアガロースゲル
で分離後、抽出、精製し、直接塩基配列を決定した結
果、配列番号23で示されるオリゴDNAの直下流から終止
コドンまで同一の配列であった。

【００２８】5'側の配列は、実施例1に示した条件で2セ
ットのRACEを行い、生成したDNA断片の塩基配列を決定
することにより、取得した。第1セットの1回目のPCR
は、前記ヒト胎盤のMarathon-Ready^TM cDNA鋳型、配列
番号24で示されるオリゴDNAとAP-1をプライマーとし
て、2回目のPCRは配列番号25で示されるオリゴDNAとAP-
2をプライマーとして用いた。しかしながら、翻訳開始M
etに到達しなかったため、第2セットのRACEを行った。
第2セット1回目のPCRはClontech社製のヒト胎盤のMarat
hon-Ready^TM cDNA、同ヒト脳のMarathon-Ready^TM cDN
A、同ヒト心臓Marathon-Ready^TM cDNA、同ヒト肺Marath
on-Ready^TM cDNA、同ヒト骨格筋Marathon-Ready ^TM cDN
A、同ヒトメラノーマMarathon-Ready^TM cDNAを鋳型、配
列番号26で示されるオリゴDNAとAP-1をプライマーとし
て用いた。2回目のPCRは、1回目のPCR反応液をTE緩衝液
にて50倍希釈した溶液5μlを鋳型、配列番号27で示され
るオリゴDNAとAP-2をプライマーとして実施した。しか
しながら、これらの反応で生成した約350bpのDNA断片は
いずれも配列番号20に示したMDTS3アミノ酸配列の翻訳
開始Metから8番目のPro残基に相当する部分を欠くもの
であった。本発明者らは、第2セット1回目のPCR反応産
物をアガロースゲル電気泳動し、200bp毎に分画、抽出
したものを2回目のRACEの鋳型にすることにより、この
問題を解決した。具体的には、前記ヒト胎盤のMarathon
-Ready^TM cDNAを鋳型として1回目の反応を行い、その反
応液をアガロースゲル電気泳動した。バンドは全く検出
されなかったが、200bpラダーの分子量マーカー（宝酒
造社製）を基準に、200bp毎にゲル抽出し、その10分の1
量を2回目のPCRの鋳型とした。この結果、600-800bp領
域を鋳型とした場合のみ約500bpのバンドが主要産物の
一つとして検出できた。この約500bpのDNA断片の塩基配
列を解析した。以上よりMDTS3全長ORFは2670bpからなり
(配列番号21)、889アミノ酸からなる蛋白をコードする
ことが判明した(配列番号20)。

【００２９】以上の操作により取得した新規ADAM型蛋白
質MDTS1、MDTS2、MDTS3はお互いに相同性を示し、報告
されているADAMファミリーの中ではマウスADAMTS-1と最
も高いアミノ酸配列レベルでの相同性を示し、そのドメ
イン構造も、N末から分泌シグナル配列、プロペプチ
ド、金属プロテアーゼ様ドメイン、ディスインテグリン
様ドメイン、TSP-1繰り返し配列と同じであった。

【００３０】（実施例4）新規ヒトADAM型金属プロテア
ーゼの動物細胞での発現 新規ヒトADAM型金属プロテアーゼは、分泌シグナル配
列、プロペプチド、金属プロテアーゼ様ドメイン、ディ
スインテグリン様ドメイン、TSP-1繰り返し配列、とい
うドメイン構造をとっている。金属プロテアーゼ活性の
発揮には、少なくとも分泌シグナルから金属プロテアー
ゼ様ドメインまでの蛋白発現が必要と考えられる。そこ
で、MDTS1、MDTS2及びMDTS3について、N末からディスイ
ンテグリン様ドメインの1番目のCys残基の手前のGln残
基までの蛋白の発現、生産をHEK293EBNA細胞を宿主に行
った。以下、詳細を述べる。

【００３１】（実施例4-1）発現ベクターの改良 pCEP4（Invitrogen社製）を制限酵素ClaI、NsiIで切断
し、平滑末端化後、自己連結反応を行い、EBNA1発現ユ
ニットを除去した発現ベクターpCEP4dを作製した。この
ベクターを制限酵素NheI、BamHIで切断し、アガロース
ゲル抽出した約7.7Kbaの断片に、配列番号28で示される
核酸と配列番号29で示される核酸をアニールさせた重鎖
オリゴヌクレオチドを挿入して、目的の配列を有するク
ローンを選択し、pCEP4d-FLAGと命名した。このベクタ
ーを鋳型、配列番号30で示されるオリゴDNA、配列番号3
1で示されるオリゴDNAをプライマーとして、PyroBest D
NAポリメラーゼを用いてPCR反応を行った。生じた約0.4
kbpのDNA断片を制限酵素SpeIで切断し、XbaIで切断した
pCEP4d-FLAG（約7.7Kbp）に挿入し、目的通りプロモー
ターよりクローニングサイトのXbaI、NheI、NotI、BamH
I認識配列そしてFLAGタグという順になっているクロー
ンを選択して、pCEP4dE2-FLAGを完成した。

【００３２】以下の実施例4-2乃至実施例4-4において、
インフレームにFLAGタグがC末端に付加するようにデザ
インしたDNA断片を、これらの発現プラスミドの制限酵
素部位に挿入した。 （実施例4-2）MDTS1プロテアーゼ発現プラスミドの構築 MDTS1のプロテアーゼ活性を検討するべく、MDTS1の分泌
シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ様ドメイン
を含むMDTS1の配列番号1の1番から473番のアミノ酸に相
当する蛋白を発現することにした。そのために必要とな
る配列番号2の1番から1419番までの塩基配列を含むDNA
断片をPyroBest^TM DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用
いてPCRにより取得した。前記ヒト胎盤のMarathon-Read
y^TM cDNAを鋳型、配列番号32で示されるオリゴDNAと配
列番号33で示されるオリゴDNAをプライマーとして、94
℃1分の後、98℃10秒、60℃30秒、72℃2分のサイクルを
40回、72℃7分の条件でPCRを行った。こうして生成した
5'側にXbaI、SpeI認識配列およびKozak配列を、3'側にB
amHI認識配列が付加された目的断片をPCR-Bluntにサブ
クローンして配列を確認した後、制限酵素XbaI、BamHI
で切断し、pCEP4dE2-FLAGのXbaI、BamHI部位に挿入し
て、発現プラスミドpCEP-MDTS1PR-FLAGを完成した。

【００３３】（実施例4-3）MDTS2プロテアーゼ発現プラ
スミドの構築 MDTS2のプロテアーゼ活性を検討するべく、MDTS2の分泌
シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ様ドメイン
を含むMDTS2の配列番号10の1番から478番のアミノ酸に
相当する蛋白質を発現することにした。そのために必要
となる配列番号12の1番から1434番までの塩基配列を含
むDNA断片を（実施例4-2）に示した方法で取得した。但
し、プライマーとしては配列番号34で示されるオリゴDN
Aと配列番号35で示されるオリゴDNAを用いた。こうして
生成した5'側にSpeI認識配列およびKozak配列を、3'側
にBamHI認識配列が付加された目的断片をPCR-Bluntにサ
ブクローンして配列を確認した後、制限酵素SpeI、BamH
Iで切断し、pCEP4dE2-FLAGのXbaI、BamHI部位に挿入し
て、発現プラスミドpCEP-MDTS2PR-FLAGを完成した。

【００３４】（実施例4-4）MDTS3プロテアーゼ発現プラ
スミドの構築 MDTS3のプロテアーゼ活性を検討するべく、MDTS3の分泌
シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ様ドメイン
を含むMDTS3の配列番号20の1番から451番のアミノ酸に
相当する蛋白質を発現することにした。そのために必要
となる配列番号21の1番から1353番の塩基配列を含むDNA
断片を取得するべく、配列番号36で示されるオリゴDNA
と配列番号37で示されるオリゴDNAを用い、実施例3に示
した各種ヒトMarathon-Ready^TM cDNAを鋳型として（実
施例4-2）に示した条件でPCRを行ったが、目的とするDN
A断片の増幅はみられなかった。そこで、本発明者ら
は、まず、鋳型として実施例3の第2回目のRACEで得たPC
R断片1μlを用い、配列番号36で示されるオリゴDNA、配
列番号27で示されるオリゴDNAをプライマーとして、前
記LA-Taq^TMをDNAポリメラーゼとして、94℃1分の後、98
℃20秒、60℃20秒、72℃1分のサイクル40回、72℃7分の
サイクル1回という条件で、PCRを行った。また、前記ヒ
ト脳Marathon-Ready^TM cDNAを鋳型、配列番号38で示さ
れるオリゴDNAと配列番号24で示されるオリゴDNAをプラ
イマーとして、同じ条件でPCRを行った。それぞれのPCR
で増幅した約350bpと約600bpのDNA断片の混合液を鋳
型、配列番号36で示されるオリゴDNAと配列番号24で示
されるオリゴDNAをプライマーとし、前記LA-Taq^TMを用
いて、94℃1分の後、98℃20秒、68℃1分のサイクル15
回、68℃7分のPCR反応を行い、生成した約830bpのDNA断
片をpCR-Bluntにサブクローンし、正しい配列を有する
クローン5N5を得た。ファージクローン69-4の保存液を
蒸留水にて10倍希釈し、99℃5分処理した溶液5μlを鋳
型、配列番号39で示されるオリゴDNAと配列番号47で示
されるオリゴDNAをプライマーとして、前記LA-Taq^TMを
用いて、94℃1分の後、98℃20秒、60℃20秒、72℃1分の
サイクル40回、72℃7分のサイクル1回という条件で、PC
Rを行った。生成した約720bpのDNA断片をpCR-Bluntにサ
ブクローンして、正しい配列を有するクローンPR2を得
た。5N5を制限酵素XbaI、EcoRIで切断して生じた約790b
pのDNA断片と、PR2を制限酵素EcoR1、BamHIで切断して
生じた約570bpのDNA断片をアガロースゲル抽出、精製し
た。これらの2断片を連結し、pCEP4dE2-FLAGのXbaI、Ba
mHI部位に挿入して、発現プラスミドpCEP-MDTS3PR-FLAG
を完成した。

【００３５】（実施例4-5）MDTS1〜MDTS3プロテアーゼ
の動物細胞株での発現 MDTS1〜MDTS3いずれに関しても、（実施例4-2〜4-4）に
おいてpCEP4dE2-FLAGを骨格として作製した発現プラス
ミドをFuGENE^TM6 Transfection Reagent（Boeringer Ma
nnheim社製）を用いて添付指示書に従いHEK293-EBNA細
胞に導入した。プラスミド導入後、2-3日培養を継続し
て得た培養上清中、もしくは200μg/mlのHygromycin B
を添加した培地で選択された細胞の培養上清に目的蛋白
が存在することを、C末端に付加したFLAGタグに対する
抗体（マウス抗FLAGモノクローナル抗体（M2；Sigma社
製））を用いたウエスタンブロッティングで確認した。
すなわち、上記培養上清をSDS/10%〜20% アクリルアミ
ドゲル（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動後、ブロ
ッティング装置を用いてPVDF膜に転写した。転写後のPV
DF膜に、ブロックエース（大日本製薬社製）を添加して
ブロッキングした後、マウス抗FLAGモノクローナル抗体
（M2；Sigma社製）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識
ウサギ抗マウスIgGポリクローナル抗体（Zymed社製もし
くはTAGO社製）を順次反応させた。または、ブロッキン
グ後、ビオチン化M2抗体（Sigma社製）、西洋わさびパ
ーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Amasham社
製）を順次反応させた。反応後、ECLウエスタンブロッ
ティング検出システム（アマシャムファルマシア社製）
を用いて該プロテアーゼの発現を確認した。

【００３６】（実施例5）動物細胞を宿主に発現したMDT
S1〜MDTS3プロテアーゼの酵素活性の検出 （実施例5-1）MDTS1〜MDTS5プロテアーゼの精製 （実施例4-5）でHEK293-EBNA細胞を宿主に発現、生産し
た目的蛋白を含む培養液上清からの目的蛋白の精製は、
C末端にFLAGタグが付加していることを利用して、アフ
ィニィティ精製した。すなわち、培養上清をカラムに詰
めたM2-agarose（Sigma社製）にアプライし、20 mM Tri
s-HCl(pH7.4)/150 mM NaCl（以下、TBSという）で洗浄
した後、100μg/ml FLAG peptide（Sigma社製）含有のT
BSで、溶出し、分画した。精製したHEK293-EBNA細胞発
現MDTS1、MDTS2、MDTS3プロテアーゼ蛋白をSDS/10%〜20
% アクリルアミドゲルを用いて電気泳動後、銀染色およ
び抗FLAG抗体（M2）を用いたウエスタンブロッティング
での確認実験の結果、furinプロテアーゼでプロセスさ
れて生じたと考えられる分子とプロセスされていない分
子が検出された。SDS/10%〜20% アクリルアミドゲルお
ける見かけの分子量は、それぞれ、MDTS1が約35KDaと約
55KDa、MDTS2が約33KDaと約57KDa、MDTS3が約35KDaと約
57KDaであった。furinプロテアーゼでプロセスされたMD
TS1は配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番から
第473番のアミノ酸配列と推定され、furinプロテアーゼ
でプロセスされたMDTS2は配列番号10で表されるアミノ
酸配列の第234番から第478番のアミノ酸配列と推定さ
れ、furinプロテアーゼでプロセスされたMDTS3は配列番
号20で表されるアミノ酸配列の第214番から第451番のア
ミノ酸配列と推定される。これらの分子量は当該アミノ
酸配列から計算される値と矛盾しないものであった。

【００３７】（実施例5-2） MDTS1〜MDTS3プロテアーゼ
の酵素活性の検出 配列番号40で示される合成ペプチドAを基質として、酵
素活性を検討した。すなわち、上記で精製したプロテア
ーゼ蛋白と該合成ペプチドを、TBS中室温で反応させた
後、YMC packed R&D RODS-5(4.6I.D.X25cm)カラムを使
用したHPLCで解析した。検出波長は220nmを用い、溶離
液A：0%アセトニトリル／0.085%トリフルオロ酢酸B：14
%アセトニトリル／0.085%トリフルオロ酢酸で、流速1ml
/mlでA→Bのリニアグラジエント（20分）で分離した。
その結果、MDTS1〜MDTS3プロテアーゼいずれにおいて
も、ペプチドAのピークが縮小し、分解産物のピークが
検出された（図１）。この現象は終濃度10mMのEDTAを反
応液に添加することで完全に阻害された。これらのこと
から、 MDTS1〜MDTS3プロテアーゼが実際に金属プロテ
アーゼ活性を有することが示された。

【００３８】

【発明の効果】本発明で得られた新規金属プロテアーゼ
及び蛋白質は、金属プロテアーゼの活性を選択的に制御
することを特徴としており、その蛋白質の医薬用途とし
ては該金属プロテアーゼ活性の亢進、低下、変性等の異
常に起因するあるいは該異常を発現・併発する疾患、例
えば、癌、関節炎、変形性関節症などが挙げられる。

【００３９】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、control、MDTS1、MDTS2、MDTS3プロテ
アーゼのペプチド切断実験の結果を示す。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. <120> 新規金属プロテアーゼ及び該金属プロテアーゼ遺伝子 <130> 0000002891 <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Gly Gly Pro Ser Pro Arg Ser Pro Ala Pro Leu Leu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala 20 25 30 Pro Gly Arg Ala Thr Glu Gly Arg Ala Ala Leu Asp Ile Val His Pro 35 40 45 Val Arg Val Asp Ala Gly Gly Ser Phe Leu Ser Tyr Glu Leu Trp Pro 50 55 60 Arg Ala Leu Arg Lys Arg Asp Val Ser Val Arg Arg Asp Ala Pro Ala 65 70 75 80 Phe Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Arg Phe Asn Leu Thr 85 90 95 Ala Asn Gln His Leu Leu Ala Pro Gly Phe Val Ser Glu Thr Arg Arg 100 105 110 Arg Gly Gly Leu Gly Arg Ala His Ile Arg Ala His Thr Pro Ala Cys 115 120 125 His Leu Leu Gly Glu Val Gln Asp Pro Glu Leu Glu Gly Gly Leu Ala 130 135 140 Ala Ile Ser Ala Cys Asp Gly Leu Lys Gly Val Phe Gln Leu Ser Asn 145 150 155 160 Glu Asp Tyr Phe Ile Glu Pro Leu Asp Ser Ala Pro Ala Arg Pro Gly 165 170 175 His Ala Gln Pro His Val Val Tyr Lys Arg Gln Ala Pro Glu Arg Leu 180 185 190 Ala Gln Arg Gly Asp Ser Ser Ala Pro Ser Thr Cys Gly Val Gln Val 195 200 205 Tyr Pro Glu Leu Glu Ser Arg Arg Glu Arg Trp Glu Gln Arg Gln Gln 210 215 220 Trp Arg Arg Pro Arg Leu Arg Arg Leu His Gln Arg Ser Val Ser Lys 225 230 235 240 Glu Lys Trp Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Ala Lys Met Val Glu 245 250 255 Tyr His Gly Gln Pro Gln Val Glu Ser Tyr Val Leu Thr Ile Met Asn 260 265 270 Met Val Ala Gly Leu Phe His Asp Pro Ser Ile Gly Asn Pro Ile His 275 280 285 Ile Thr Ile Val Arg Leu Val Leu Leu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Leu 290 295 300 Lys Ile Thr His His Ala Asp Asn Thr Leu Lys Ser Phe Cys Lys Trp 305 310 315 320 Gln Lys Ser Ile Asn Met Lys Gly Asp Ala His Pro Leu His His Asp 325 330 335 Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg Lys Asp Leu Cys Ala Ala Met Asn Arg 340 345 350 Pro Cys Glu Thr Leu Gly Leu Ser His Val Ala Gly Met Cys Gln Pro 355 360 365 His Arg Ser Cys Ser Ile Asn Glu Asp Thr Gly Leu Pro Leu Ala Phe 370 375 380 Thr Val Ala His Glu Leu Gly His Ser Phe Gly Ile Gln His Asp Gly 385 390 395 400 Ser Gly Asn Asp Cys Glu Pro Val Gly Lys Arg Pro Phe Ile Met Ser 405 410 415 Pro Gln Leu Leu Tyr Asp Ala Ala Pro Leu Thr Trp Ser Arg Cys Ser 420 425 430 Arg Gln Tyr Ile Thr Arg Phe Leu Asp Arg Gly Trp Gly Leu Cys Leu 435 440 445 Asp Asp Pro Pro Ala Lys Asp Ile Ile Asp Phe Pro Ser Val Pro Pro 450 455 460 Gly Val Leu Tyr Asp Val Ser His Gln Cys Arg Leu Gln Tyr Gly Ala 465 470 475 480 Tyr Ser Ala Phe Cys Glu Asp Met Asp Asn Val Cys His Thr Leu Trp 485 490 495 Cys Ser Val Gly Thr Thr Cys His Ser Lys Leu Asp Ala Ala Val Asp 500 505 510 Gly Thr Arg Cys Gly Glu Asn Lys Trp Cys Leu Ser Gly Glu Cys Val 515 520 525 Pro Val Gly Phe Arg Pro Glu Ala Val Asp Gly Gly Trp Ser Gly Trp 530 535 540 Ser Ala Trp Ser Ile Cys Ser Arg Ser Cys Gly Met Gly Val Gln Ser 545 550 555 560 Ala Glu Arg Gln Cys Thr Gln Pro Thr Pro Lys Tyr Lys Gly Arg Tyr 565 570 575 Cys Val Gly Glu Arg Lys Arg Phe Arg Leu Cys Asn Leu Gln Ala Cys 580 585 590 Pro Ala Gly His Pro Ser Phe Arg His Val Gln Cys Ser His Phe Asp 595 600 605 Ala Met Leu Tyr Lys Gly Gln Leu His Thr Trp Val Pro Val Val Asn 610 615 620 Asp Val Asn Pro Cys Glu Leu His Cys Arg Pro Ala Asn Glu Tyr Phe 625 630 635 640 Ala Glu Lys Leu Arg Asp Ala Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Tyr Gln 645 650 655 Val Arg Ala Ser Arg Asp Leu Cys Ile Asn Gly Ile Cys Lys Asn Val 660 665 670 Gly Cys Asp Phe Glu Ile Asp Ser Gly Ala Met Glu Asp Arg Cys Gly 675 680 685 Val Cys His Gly Asn Gly Ser Thr Cys His Thr Val Ser Gly Thr Phe 690 695 700 Glu Glu Ala Glu Gly Leu Gly Tyr Val Asp Val Gly Leu Ile Pro Ala 705 710 715 720 Gly Ala Arg Glu Ile Arg Ile Gln Glu Val Ala Glu Ala Ala Asn Phe 725 730 735 Leu Ala Leu Arg Ser Glu Asp Pro Glu Lys Tyr Phe Leu Asn Gly Gly 740 745 750 Trp Thr Ile Gln Trp Asn Gly Asp Tyr Gln Val Ala Gly Thr Thr Phe 755 760 765 Thr Tyr Ala Arg Arg Gly Asn Trp Glu Asn Leu Thr Ser Pro Gly Pro 770 775 780 Thr Lys Glu Pro Val Trp Ile Gln Leu Leu Phe Gln Glu Ser Asn Pro 785 790 795 800 Gly Val His Tyr Glu Tyr Thr Ile His Arg Glu Ala Gly Gly His Asp 805 810 815 Glu Val Pro Pro Pro Val Phe Ser Trp His Tyr Gly Pro Trp Thr Lys 820 825 830 Cys Thr Val Thr Cys Gly Arg Gly Val Gln Arg Gln Asn Val Tyr Cys 835 840 845 Leu Glu Arg Gln Ala Gly Pro Val Asp Glu Glu His Cys Asp Pro Leu 850 855 860 Gly Arg Pro Asp Asp Gln Gln Arg Lys Cys Ser Glu Gln Pro Cys Pro 865 870 875 880 Ala Arg Trp Trp Ala Gly Glu Trp Gln Leu Cys Ser Ser Ser Cys Gly 885 890 895 Pro Gly Gly Leu Ser Arg Arg Ala Val Leu Cys Ile Arg Ser Val Gly 900 905 910 Leu Asp Glu Gln Ser Ala Leu Glu Pro Pro Ala Cys Glu His Leu Pro 915 920 925 Arg Pro Pro Thr Glu Thr Pro Cys Asn Arg His Val Pro Cys Pro Ala 930 935 940 Thr Trp Ala Val Gly Asn Trp Ser Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Glu 945 950 955 960 Gly Thr Gln Arg Arg Asn Val Leu Cys Thr Asn Asp Thr Gly Val Pro 965 970 975 Cys Asp Glu Ala Gln Gln Pro Ala Ser Glu Val Thr Cys Ser Leu Pro 980 985 990 Leu Cys Arg Trp Pro Leu Gly Thr Leu Gly Pro Glu Gly Ser Gly Ser 995 1000 1005 Gly Ser Ser Ser His Glu Leu Phe Asn Glu Ala Asp Phe Ile Pro His 1010 1015 1020 His Leu Ala Pro Arg Pro Ser Pro Ala Ser Ser Pro Lys Pro Gly Thr 1025 1030 1035 1040 Met Gly Asn Ala Ile Glu Glu Glu Ala Pro Glu Leu Asp Leu Pro Gly 1045 1050 1055 Pro Val Phe Val Asp Asp Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asn Phe Ile Asn Phe 1060 1065 1070 His Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Pro Ser Glu Glu Pro Asp Leu Asp Leu 1075 1080 1085 Ala Gly Thr Gly Asp Arg Thr Pro Pro Pro His Ser His Pro Ala Ala 1090 1095 1100 Pro Ser Thr Gly Ser Pro Val Pro Ala Thr Glu Pro Pro Ala Ala Lys 1105 1110 1115 1120 Glu Glu Gly Val Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ser Pro Trp Pro Ser Gln 1125 1130 1135 Ala Gly Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ser Glu Gln Thr Pro Gly Asn Pro 1140 1145 1150 Leu Ile Asn Phe Leu Pro Glu Glu Asp Thr Pro Ile Gly Ala Pro Asp 1155 1160 1165 Leu Gly Leu Pro Ser Leu Ser Trp Pro Arg Val Ser Thr Asp Gly Leu 1170 1175 1180 Gln Thr Pro Ala Thr Pro Glu Ser Gln Asn Asp Phe Pro Val Gly Lys 1185 1190 1195 1200 Asp Ser Gln Ser Gln Leu Pro Pro Pro Trp Arg Asp Arg Thr Asn Glu 1205 1210 1215 Val Phe Lys Asp Asp Glu Glu Pro Lys Gly Arg Gly Ala Pro His Leu 1220 1225 1230 Pro Pro Arg Pro Ser Ser Thr Leu Pro Pro Leu Ser Pro Val Gly Ser 1235 1240 1245 Thr His Ser Ser Pro Ser Pro Asp Val Ala Glu Leu Trp Thr Gly Gly 1250 1255 1260 Thr Val Ala Trp Glu Pro Ala Leu Glu Gly Gly Leu Gly Pro Val Asp 1265 1270 1275 1280 Ser Glu Leu Trp Pro Thr Val Gly Val Ala Ser Leu Leu Pro Pro Pro 1285 1290 1295 Ile Ala Pro Leu Pro Glu Met Lys Val Arg Asp Ser Ser Leu Glu Pro 1300 1305 1310 Gly Thr Pro Ser Phe Pro Thr Pro Gly Pro Gly Ser Trp Asp Leu Gln 1315 1320 1325 Thr Val Ala Val Trp Gly Thr Phe Leu Pro Thr Thr Leu Thr Gly Leu 1330 1335 1340 Gly His Met Pro Glu Pro Ala Leu Asn Pro Gly Pro Lys Gly Gln Pro 1345 1350 1355 1360 Glu Ser Leu Ser Pro Glu Val Pro Leu Ser Ser Arg Leu Leu Ser Thr 1365 1370 1375 Pro Ala Trp Asp Ser Pro Ala Asn Ser His Arg Val Pro Glu Thr Gln 1380 1385 1390 Pro Leu Ala Pro Ser Leu Ala Glu Ala Gly Pro Pro Ala Asp Pro Leu 1395 1400 1405 Val Val Arg Asn Ala Ser Trp Gln Ala Gly Asn Trp Ser Glu Cys Ser 1410 1415 1420 Thr Thr Cys Gly Leu Gly Ala Val Trp Arg Pro Val Arg Cys Ser Ser 1425 1430 1435 1440 Gly Arg Asp Glu Asp Cys Ala Pro Ala Gly Arg Pro Gln Pro Ala Arg 1445 1450 1455 Arg Cys His Leu Arg Pro Cys Ala Thr Trp His Ser Gly Asn Trp Ser 1460 1465 1470 Lys Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Val Arg Asp Val Gln 1475 1480 1485 Cys Val Asp Thr Arg Asp Leu Arg Pro Leu Arg Pro Phe His Cys Gln 1490 1495 1500 Pro Gly Pro Ala Lys Pro Pro Ala His Arg Pro Cys Gly Ala Gln Pro 1505 1510 1515 1520 Cys Leu Ser Trp Tyr Thr Ser Ser Trp Arg Glu Cys Ser Glu Ala Cys 1525 1530 1535 Gly Gly Gly Glu Gln Gln Arg Leu Val Thr Cys Pro Glu Pro Gly Leu 1540 1545 1550 Cys Glu Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Arg Pro Cys Asn Thr His 1555 1560 1565 Pro Cys Thr Gln Trp Val Val Gly Pro Trp Gly Gln Cys Ser Ala Pro 1570 1575 1580 Cys Gly Gly Gly Val Gln Arg Arg Leu Val Lys Cys Val Asn Thr Gln 1585 1590 1595 1600 Thr Gly Leu Pro Glu Glu Asp Ser Asp Gln Cys Gly His Glu Ala Trp 1605 1610 1615 Pro Glu Ser Ser Arg Pro Cys Gly Thr Glu Asp Cys Glu Pro Val Glu 1620 1625 1630 Pro Pro Arg Cys Glu Arg Asp Arg Leu Ser Phe Gly Phe Cys Glu Thr 1635 1640 1645 Leu Arg Leu Leu Gly Arg Cys Gln Leu Pro Thr Ile Arg Thr Gln Cys 1650 1655 1660 Cys Arg Ser Cys Ser Pro Pro Ser His Gly Ala Pro Ser Arg Gly His 1665 1670 1675 1680 Gln Arg Val Ala Arg Arg 1685 <210> 2 <211> 5061 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcccggcg gccccagtcc ccgcagcccc gcgcctttgc tgcgccccct cctcctgctc 60 ctctgcgctc tggctcccgg cgcccccgga cccgcaccag gacgtgcaac cgagggccgg 120 gcggcactgg acatcgtgca cccggttcga gtcgacgcgg ggggctcctt cctgtcctac 180 gagctgtggc cccgcgcact gcgcaagcgg gatgtatctg tgcgccgaga cgcgcccgcc 240 ttctacgagc tacaataccg cgggcgcgag ctgcgcttca acctgaccgc caatcagcac 300 ctgctggcgc ccggctttgt gagcgagacg cggcggcgcg gcggcctggg ccgcgcgcac 360 atccgggccc acaccccggc ctgccacctg cttggcgagg tgcaggaccc tgagctcgag 420 ggtggcctgg cggccatcag cgcctgcgac 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agtatatcac caggttcctt 1320 gaccgtgggt ggggcctgtg cctggacgac cctcctgcca aggacattat cgacttcccc 1380 tcggtgccac ctggcgtcct ctatgatgta agccaccagt gccgcctcca gtacggggcc 1440 tactctgcct tctgcgagga catggataat gtctgccaca cactctggtg ctctgtgggg 1500 accacctgtc actccaagct ggatgcagcc gtggacggca cccggtgtgg ggagaataag 1560 tggtgtctca gtggggagtg cgtacccgtg ggcttccggc ccgaggccgt ggatggtggc 1620 tggtctggct ggagcgcctg gtccatctgc tcacggagct gtggcatggg cgtacagagc 1680 gccgagcggc agtgcacgca gcctacgccc aaatacaaag gcagatactg tgtgggtgag 1740 cgcaagcgct tccgcctctg caacctgcag gcctgccctg ctggccaccc ctccttccgc 1800 cacgtccagt gcagccactt tgacgctatg ctctacaagg gccagctgca cacatgggtg 1860 cccgtggtca atgacgtgaa cccctgcgag ctgcactgcc ggcccgcgaa tgagtacttt 1920 gccgagaagc tgcgggacgc cgtggtcgat ggcaccccct gctaccaggt ccgagccagc 1980 cgggacctct gcatcaacgg catctgtaag aacgtgggct gtgacttcga gattgactcc 2040 ggtgctatgg aggaccgctg tggtgtgtgc cacggcaacg gctccacctg ccacaccgtg 2100 agcgggacct tcgaggaggc cgagggcctg gggtatgtgg atgtggggct gatcccagcc 2160 ggcgcacgcg agatccgcat ccaagaggtt gccgaggctg ccaacttcct ggcactgcgg 2220 agtgaggacc cggagaagta cttcctcaat ggtggctgga ccatccagtg gaacggggac 2280 taccaggtgg cagggaccac cttcacatac gcacgcaggg gcaactggga gaacctcacg 2340 tccccgggtc ccaccaagga gcctgtctgg atccagctgc tgttccagga gagcaaccct 2400 ggggtgcact acgagtacac catccacagg gaggcaggtg gccacgacga ggtcccgccg 2460 cccgtgttct cctggcatta tgggccctgg accaagtgca cagtcacctg cggcagaggt 2520 gtgcagaggc agaatgtgta ctgcttggag cggcaggcag ggcccgtgga cgaggagcac 2580 tgtgaccccc tgggccggcc tgatgaccaa cagaggaagt gcagcgagca gccctgccct 2640 gccaggtggt gggcaggtga gtggcagctg tgctccagct cctgcgggcc tgggggcctc 2700 tcccgccggg ccgtgctctg catccgcagc gtggggctgg atgagcagag cgccctggag 2760 ccacccgcct gtgaacacct tccccggccc cctactgaaa ccccttgcaa ccgccatgta 2820 ccctgtccgg ccacctgggc tgtggggaac tggtctcagt gctcagtgac atgtggggag 2880 ggcactcagc gccgaaatgt cctctgcacc aatgacaccg gtgtcccctg tgacgaggcc 2940 cagcagccag ccagcgaagt cacctgctct ctgccactct 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gacggcagtg cctgcgagac catcgagggc gtcttcagcc cagcctcacc tggggccggg 2160 tacgaggatg tcgtctggat tcccaaaggc tccgtccaca tcttcatcca ggatctgaac 2220 ctctctctca gtcacttggc cctgaaggga gaccaggagt ccctgctgct ggaggggctg 2280 cccgggaccc cccagcccca ccgtctgcct ctagctggga ccacctttca actgcgacag 2340 gggccagacc aggtccagag cctcgaagcc ctgggaccga ttaatgcatc tctcatcgtc 2400 atggtgctgg cccggaccga gctgcctgcc ctccgctacc gcttcaatgc ccccatcgcc 2460 cgtgactcgc tgccccccta ctcctggcac tatgcgccct ggaccaagtg ctcggcccag 2520 tgtgcaggcg gtagccaggt gcaggcggtg gagtgccgca accagctgga cagctccgcg 2580 gtcgcccccc actactgcag tgcccacagc aagctgccca aaaggcagcg cgcctgcaac 2640 acggagcctt gccctccaga ctgggttgta gggaactggt cgctctgcag ccgcagctgc 2700 gatgcaggcg tgcgcagccg ctcggtcgtg tgccagcgcc gcgtctctgc cgcggaggag 2760 aaggcgctgg acgacagcgc atgcccgcag ccgcgcccac ctgtactgga ggcctgccac 2820 ggccccactt gccctccgga gtgggcggcc ctcgactggt ctgagtgcac ccccagctgc 2880 gggccgggcc tccgccaccg cgtggtcctt tgcaagagcg cagaccaccg cgccacgctg 2940 cccccggcgc actgctcacc cgccgccaag ccaccggcca ccatgcgctg caacttgcgc 3000 cgctgccccc cggcccgctg ggtggctggc gagtggggtg agtgctctgc acagtgcggc 3060 gtcgggcagc ggcagcgctc ggtgcgctgc accagccaca cgggccaggc gtcgcacgag 3120 tgcacggagg ccctgcggcc gcccaccacg cagcagtgtg aggccaagtg cgacagccca 3180 acccccgggg acggccctga agagtgcaag gatgtgaaca aggtcgccta ctgccccctg 3240 gtgctcaaat ttcagttctg cagccgagcc tacttccgcc agatgtgctg caaaacctgc 3300 cagggccact ag 3312 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gaggacattg gcctggccac agcgttcacc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cggcggccgg gatgctgttg gtgatgcacc 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 taatacgact cactataggg aattc 25 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tctctcactc cacaggctgt gtccaggtgg 30 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gccgtgtgca gggcttggag t 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ccgacaatgg ggggcttaca ctgc 24 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aagggagacc aggagtccct gctgctggag 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tccagactgg gttgtaggga actggtcgct 30 <210> 20 <211> 889 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Leu Pro Ala Pro Ala Ala Pro Arg Trp Pro Pro Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Arg Gly Ala Pro Ala Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Ala Ser Glu Leu Val Val Pro Thr Arg Leu Pro Gly 35 40 45 Ser Ala Gly Glu Leu Ala Leu His Leu Ser Ala Phe Gly Lys Gly Phe 50 55 60 Val Leu Arg Leu Ala Pro Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro Glu Phe Lys 65 70 75 80 Ile Glu Arg Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ala Thr Gly Gly Glu Arg Gly 85 90 95 Leu Arg Gly Cys Phe Phe Ser Gly Thr Val Asn Gly Glu Pro Glu Ser 100 105 110 Leu Ala Ala Val Ser Leu Cys Arg Gly Leu Ser Gly Ser Phe Leu Leu 115 120 125 Asp Gly Glu Glu Phe Thr Ile Gln Pro Gln Gly Ala Gly Gly Ser Leu 130 135 140 Ala Gln Pro His Arg Leu Gln Arg Trp Gly Pro Ala Gly Ala Arg Pro 145 150 155 160 Leu Pro Arg Gly Pro Glu Trp Glu Val Glu Thr Gly Glu Gly Gln Arg 165 170 175 Gln Glu Arg Gly Asp His Gln Glu Asp Ser Glu Glu Glu Ser Gln Glu 180 185 190 Glu Glu Ala Glu Gly Ala Ser Glu Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Thr 195 200 205 Ser Arg Thr Lys Arg Phe Val Ser Glu Ala Arg Phe Val Lys Thr Leu 210 215 220 Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Ala Phe Tyr Gly Ala Asp Leu Gln 225 230 235 240 Asn His Ile Leu Thr Leu Met Ser Val Ala Ala Arg Ile Tyr Lys His 245 250 255 Pro Ser Ile Lys Asn Ser Ile Asn Leu Met Val Val Lys Val Leu Ile 260 265 270 Val Glu Asp Glu Lys Trp Gly Pro Glu Val Ser Asp Asn Gly Gly Leu 275 280 285 Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln Arg Arg Phe Asn Gln Pro Ser 290 295 300 Asp Arg His Pro Glu His Tyr Asp Thr Ala Ile Leu Leu Thr Arg Gln 305 310 315 320 Asn Phe Cys Gly Gln Glu Gly Leu Cys Asp Thr Leu Gly Val Ala Asp 325 330 335 Ile Gly Thr Ile Cys Asp Pro Asn Lys Ser Cys Ser Val Ile Glu Asp 340 345 350 Glu Gly Leu Gln Ala Ala His Thr Leu Ala His Glu Leu Gly His Val 355 360 365 Leu Ser Met Pro His Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Arg Leu Phe Gly 370 375 380 Pro Met Gly Lys His His Val Met Ala Pro Leu Phe Val His Leu Asn 385 390 395 400 Gln Thr Leu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Met Tyr Leu Thr Glu Leu 405 410 415 Leu Asp Gly Gly His Gly Asp Cys Leu Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala 420 425 430 Leu Pro Leu Pro Thr Gly Leu Pro Gly Arg Met Ala Leu Tyr Gln Leu 435 440 445 Asp Gln Gln Cys Arg Gln Ile Phe Gly Pro Asp Phe Arg His Cys Pro 450 455 460 Asn Thr Ser Ala Gln Asp Val Cys Ala Gln Leu Trp Cys His Thr Asp 465 470 475 480 Gly Ala Glu Pro Leu Cys His Thr Lys Asn Gly Ser Leu Pro Trp Ala 485 490 495 Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser Cys 500 505 510 Leu Pro Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Val Val Asp Gly Gly 515 520 525 Trp Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly 530 535 540 Gly Val Gln Phe Ser His Arg Glu Cys Lys Asp Pro Glu Pro Gln Asn 545 550 555 560 Gly Gly Arg Tyr Cys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Tyr Gln Ser Cys His 565 570 575 Thr Glu Glu Cys Pro Pro Asp Gly Lys Ser Phe Arg Glu Gln Gln Cys 580 585 590 Glu Lys Tyr Asn Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Met Asp Gly Asn Leu Leu 595 600 605 Gln Trp Val Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Arg Asp Arg Cys Lys 610 615 620 Leu Phe Cys Arg Ala Arg Gly Arg Ser Glu Phe Lys Val Phe Glu Ala 625 630 635 640 Lys Val Ile Asp Gly Thr Leu Cys Gly Pro Glu Thr Leu Ala Ile Cys 645 650 655 Val Arg Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp His Val Val Asp Ser 660 665 670 Pro Arg Lys Leu Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Lys Gly Asn Ser 675 680 685 Cys Arg Lys Val Ser Gly Ser Leu Thr Pro Thr Asn Tyr Gly Tyr Asn 690 695 700 Asp Ile Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr Asn Ile Asp Val Lys Gln 705 710 715 720 Arg Ser His Pro Gly Val Gln Asn Asp Gly Asn Tyr Leu Ala Leu Lys 725 730 735 Thr Ala Asp Gly Gln Tyr Leu Leu Asn Gly Asn Leu Ala Ile Ser Ala 740 745 750 Ile Glu Gln Asp Ile Leu Val Lys Gly Thr Ile Leu Lys Tyr Ser Gly 755 760 765 Ser Ile Ala Thr Leu Glu Arg Leu Gln Ser Phe Arg Pro Leu Pro Glu 770 775 780 Pro Leu Thr Val Gln Leu Leu Thr Val Pro Gly Glu Val Phe Pro Pro 785 790 795 800 Lys Val Lys Tyr Thr Phe Phe Val Pro Asn Asp Val Asp Phe Ser Met 805 810 815 Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Thr Thr Asn Ile Ile Gln Pro Leu Leu 820 825 830 His Ala Gln Trp Val Leu Gly Asp Trp Ser Glu Cys Ser Ser Thr Cys 835 840 845 Gly Ala Gly Trp Gln Arg Arg Thr Val Glu Cys Arg Asp Pro Ser Ser 850 855 860 Gln Ala Ser Ala Thr Cys Asn Lys Ala Leu Lys Pro Glu Asp Ala Lys 865 870 875 880 Pro Cys Glu Ser Gln Leu Cys Pro Leu 885 <210> 21 <211> 2670 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 atgctccccg cccccgccgc cccccggtgg cctccgctcc tgctgctgct gctgctgctg 60 ctgccgctgg cccgcggcgc cccggcccgg cccgcagccg gggggcaggc ctcggagctg 120 gtggtgccca cgcggttgcc cggcagcgcg ggcgagctcg cgctccacct gtccgccttc 180 ggcaagggct tcgtgctgcg cctggcgccc gacgacagct tcctggcgcc cgagttcaag 240 atcgagcgcc tcgggggctc cggccgggcg accgggggcg agcgggggct gcgcggctgc 300 ttcttctccg gcaccgtgaa tggggagccc gagtcgctgg cggcggtcag cctgtgccgc 360 gggctgagcg gctccttcct gctggacggc gaggagttca ccatccagcc gcagggcgcg 420 gggggctccc tggctcagcc gcaccgcctg cagcgctggg gtcccgccgg agcccgcccc 480 ctcccgcgag gacccgagtg ggaggtggag acgggagagg gtcagaggca ggagagagga 540 gaccaccagg aggacagcga ggaggagagc caagaagagg aggcagaagg cgctagcgag 600 ccgccaccgc ccctgggggc cacgagtagg accaagcggt ttgtgtctga ggcgcgcttc 660 gtgaagacgc tgctggtggc cgatgcgtcc atggctgcct tctacggggc cgacctgcag 720 aaccacatcc tgacgttaat gtctgtggca gcccgaatct acaagcaccc cagcatcaag 780 aattccatca acctgatggt ggtaaaagtg ctgatcgtag aagatgaaaa atggggccca 840 gaggtgtccg acaatggggg gcttacactg cgtaacttct gcaactggca gcggcgtttc 900 aaccagccca gcgaccgcca cccagagcac tacgacacgg ccatcctgct caccagacag 960 aacttctgtg ggcaggaggg gctgtgtgac accctgggtg tggcagacat cgggaccatt 1020 tgtgacccca acaaaagctg ctccgtgatc gaggatgagg ggctccaggc ggcccacacc 1080 ctggcccatg aactagggca cgtcctcagc atgccccacg acgactccaa gccctgcaca 1140 cggctcttcg ggcccatggg caagcaccac gtgatggcac cgctgttcgt ccacctgaac 1200 cagacgctgc cctggtcccc ctgcagcgcc atgtatctca cagagcttct ggacggcggg 1260 cacggagact gtctcctgga tgcccctgct gcggccctgc ccctccccac aggcctcccg 1320 ggccgcatgg ccctgtacca gctggaccag cagtgcaggc agatctttgg gccggatttc 1380 cgccactgcc ccaacacctc tgctcaggac gtctgcgccc agctttggtg ccacactgat 1440 ggggctgagc ccctgtgcca cacgaagaat ggcagcctgc cctgggctga cggcacgccg 1500 tgcgggcctg ggcacctctg ctcagaaggc agctgtctac ctgaggagga agtggagagg 1560 cccaagcccg tggtagatgg aggctgggca ccgtggggac cctggggaga atgttctcgg 1620 acctgtggag gaggagtaca gttttcacac cgtgagtgca aggaccccga gcctcagaat 1680 ggaggaagat actgcctggg tcggagagcc aagtaccagt catgccacac ggaggaatgc 1740 ccccctgacg ggaaaagctt cagggagcag cagtgtgaga agtataatgc ctacaattac 1800 actgacatgg acgggaatct cctgcagtgg gtccccaagt atgctggggt gtccccccgg 1860 gaccgctgca agttgttctg ccgagcccgg gggaggagcg agttcaaagt gttcgaggcc 1920 aaggtgattg atggcaccct gtgtgggcca gaaacactgg ccatctgtgt ccgtggccag 1980 tgtgtcaagg ccggctgtga ccatgtggtg gactcgcctc ggaagctgga caaatgcggg 2040 gtgtgtgggg gcaaaggcaa ctcctgcagg aaggtctccg ggtccctcac ccccaccaat 2100 tatggctaca atgacattgt caccatccca gctggtgcca ctaatattga cgtgaagcag 2160 cggagccacc cgggtgtgca gaacgatggg aactacctgg cgctgaagac ggctgatggg 2220 cagtacctgc tcaacggcaa cctggccatc tctgccatag agcaggacat cttggtgaag 2280 gggaccatcc tgaagtacag cggctccatc gccaccctgg agcgcctgca gagcttccgg 2340 cccttgccag agcctctgac agtgcagctc ctgacagtcc ctggcgaggt cttcccccca 2400 aaagtcaaat acaccttctt tgttcctaat gacgtggact ttagcatgca gagcagcaaa 2460 gagagagcaa ccaccaacat catccagccg ctgctccacg cacagtgggt gctgggggac 2520 tggtctgagt gctctagcac ctgcggggcc ggctggcaga ggcgaactgt agagtgcagg 2580 gacccctcca gccaggcctc tgccacctgc aacaaggctc tgaaacccga ggatgccaag 2640 ccctgcgaaa gccagctgtg ccccctgtga 2670 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cccaccaatt atggctacaa tgacattgtc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 aacgatggga actacctggc gctgaagacg 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tcttctacga tcagcacttt taccaccatc 30 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaaggcagcc atggacgcat cggccacc 28 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gctgagccag ggagcccccc gcgccctgcg 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagcgactcg ggctccccat tcacggtgcc 30 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ctagcgcggc cgcaggatcc gactacaagg acgacgatga caaatgataa 50 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gatcttatca tttgtcatcg tcgtccttgt agtcggatcc tgcggccgcg 50 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 ggactagtct agaagctggg taccagctgc tagc 34 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ggactagtgt cgaccggtca tggctgcgc 29 <210> 32 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 acatctagaa ctagtgccat gcccggcggc cccagtcccc gcagcccc 48 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 ggatccctgg tggcttacat catagaggac 30 <210> 34 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ggactagtac catggctccc gcctgccaga tcctccgc 38 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ggatccttgc tcatctgcat cgtaggcttg 30 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gctctagacc atgctccccg cccccgccgc ccccc 35 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 cgggatccct gctggtccag ctggtacagg gccat 35 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 ggcgcccgag ttcaagatcg agcg 24 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gccatatgtt tgtgtctgag gcgcgcttcg tgaag 35 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val 1 5 10

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 9/64 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 笹又 美穂 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 BA14 CA04 DA02 GA27 4B050 CC03 DD11 LL01 LL10 4B063 QA01 QA05 QQ79 QR16 QR24 QS17 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA33 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA75 DA89 EA28 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233
   番から第473番のアミノ酸配列、配列番号10で表される
   アミノ酸配列の第234番から第478番のアミノ酸配列、若
   しくは、配列番号20で表されるアミノ酸配列の第214番
   から第451番のアミノ酸配列を含み、かつ、プロテアー
   ゼ活性を有する金属プロテアーゼ、又は、該金属プロテ
   アーゼの同効物である金属プロテアーゼ。
2. 【請求項２】配列番号１、10若しくは20で表されるアミ
   ノ酸配列を有する蛋白質、又は、配列番号1で表される
   アミノ酸配列の第1番から第473番のアミノ酸配列、配列
   番号10で表されるアミノ酸配列の第1番から第478番のア
   ミノ酸配列、若しくは、配列番号20で表されるアミノ酸
   配列の第1番から第451番のアミノ酸配列を有する蛋白
   質、又は、配列番号1で表されるアミノ酸配列の第233番
   から第473番のアミノ酸配列、配列番号10で表されるア
   ミノ酸配列の第234番から第478番のアミノ酸配列、若し
   くは、配列番号20で表されるアミノ酸配列の第214番か
   ら第451番のアミノ酸配列を有する蛋白質。
3. 【請求項３】請求項1記載の金属プロテアーゼ、若しく
   は請求項２記載の蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺
   伝子。
4. 【請求項４】請求項3記載の遺伝子を含むベクター。
5. 【請求項５】請求項4記載のベクターを含む宿主細胞。
6. 【請求項６】請求項5記載の宿主細胞を用いる請求項１
   乃至２記載の金属プロテアーゼの製造方法。
7. 【請求項７】請求項1記載の金属プロテアーゼに対する
   抗体。
8. 【請求項８】請求項１又は２記載の金属プロテアーゼと
   被験化合物とを接触させ、当該金属プロテアーゼの活性
   を修飾する物質をスクリーニングする方法。