MXPA01008944A

MXPA01008944A - Identificacion de un canal de calcio capacitivo en celulas que presentan antigenos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA01008944A
Application number: MXPA01008944A
Authority: MX
Inventors: Grentzmann Guido
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 2000-09-05
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2005-04-19
Also published as: BR0103879A; US20020106671A1; JP2002345488A; EP1186661A1; CA2356553A1

Abstract

La presente invencion se refiere a la identificacion de un homologo de canal de calcio capacitivo para la activacion del sistema inmune, y su uso para reportar o para modular la actividad de las celulas del sistema inmune in vitro, ex vivo o in vivo. Esta invencion describe en forma mas especifica que un producto de gen mlsnl representa un canal de calcio capacitivo en las celulas del sistema inmune tales como macrofagos, monocitos, celulas T, celulas B y mastocitos. Esta invencion es una identificacion probada de un gen que expresa un canal de calcio capacitivo en las celulas del sistema inmune, y puede ser utilizado en diversas composiciones y metodos para monitorear o para modular una respuesta inmune en un individuo. La presente invencion se puede utilizar para desarrollar marcadores biologicos para la activacion del sistema inmune o las respuestas inflamatorias o para seleccionar respecto a farmacos especificos que alteren la actividad del sistema inmune.

Description

IDENTIFICACION DE UN CANAL DE CALCIO CAPACITIVO EN CELULAS QUE PRESENTAN ANTIGENOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la caracterización de un homólogo de canal de calcio capacitivo para la activación del sistema inmune, y su uso para reportar o para modular la actividad de las células del sistema inmune in vitro, ex vivo o in vivo. Esta invención describe en forma más específica que un producto de gen mlsnl representa un canal de calcio capacitivo en las células del sistema inmune tales como macrófagos, monocitos, células T, células B y mastocitos. Esta invención es una identificación probada de un gen que expresa un canal de calcio capacitivo en las células del sistema inmune, y puede ser utilizado en diversas composiciones y métodos para monitorear o para modular una respuesta inmune en un individuo. La presente invención se puede utilizar para desarrollar marcadores biológicos para la activación del sistema inmune o las respuestas inflamatorias o para seleccionar respecto a fármacos específicos que alteren la actividad del sistema inmune. REF: 132651 ANTECEDENTES DE LA INVENCION La entrada regulada de calcio a través de la membrana plasmática es un mecanismo de señalización esencial, involucrado en fenómenos tales como la exocitosis, contracción, expresión de genes y diferenciación celular (1) . Los canales operados por reservas (SOC por sus siglas en inglés) , definidos como canales que se abren en respuesta al agotamiento de las reservas de calcio intracelular, representan uno de los mecanismos más ubicuos para activar la entrada de calcio en células no excitables. Un número grande de receptores de superficie de célula se acoplan mediante las proteínas G o las tirosina cinasas para activar la fosfolipasa C (PLC por sus siglas en inglés) y por consiguiente para generar 1 , 4 , 5-trifosfato de inositol (IP3 por sus siglas en inglés) (2). IP3 en niveles incrementados, actuando sobre su receptor (3) da como resultado un incremento en el calcio intracelular ([Ca2+]i) a través del agotamiento de las reservas de calcio intracelular. Aún sigue siendo un asunto controversial el cómo el agotamiento de las reservas de calcio intracelular activa la entrada de Ca2-f a través de la membrana celular. El mecanismo más simple podría implicar una acción directa de IP3, o del receptor de IP3, sobre los canales de Ca'~ en la membrana plasmática. Por otro lado el agotamiento de las reservas podría enviar una señal de activación de algún tipo hacia los canales en la membrana plasmática (4). La activación del canal de Ca2+ de la membrana plasmática da como resultado una corriente interna pequeña en paralelo con una elevación sostenida en [Ca2+] i . Se ha demostrado que tal corriente es inducida por diálisis intracelular con IP3 en mastocitos de rata (5) o mediante la activación de las células T de Jurkat con Tapsigargin (6) : La Tapsigargin (TG por sus siglas en inglés) , una lactona sesquiterpénica obtenida de plantas, agota las reservas sensibles a IP3 a través de su capacidad para inhibir las Ca÷-ATPasas (7) . Varios grupos han demostrado que el agotamiento por TG de las reservas de calcio intracelular en las células T activa una entrada de Ca2+ que es similar y que no se suma con aquel evocado por la estimulación del receptor de célula T (TCR por sus siglas en inglés) (8-10) . Los SOC tienen una alta diversidad. La característica de definición esencial de estos canales es que estos se activan mediante una variedad de estímulos que agotan las reservas intracelulares tales como los agonistas de los receptores enlazados a fosfoinosítido, IP3 intraceluiar , ionóforos de Ca21", inhibidores de Ca"÷-ATPasas de tipo SERCA y diálisis intraceluiar con soluciones reguladoras que contienen concentraciones bajas de Ca2' ( [Ca2+] <50 n ) (1) La activación de SOCs mediada por IP3 implica que el canal no está acoplado directamente al receptor y que la activación del agotamiento de reservas artificial indica que la activación de SOC responde al agotamiento de Ca2+ de la reserva después de la unión IP3 -receptor en vez de IP3 mismo. Los SOC se describen en forma general como compuertas dependientes de la ausencia de voltaj e . Se ha demostrado que la entrada de calcio a través de Icrac acelera la velocidad de exocitosis en los mastocitos. Esta inhibe la adenilil ciclasa tipo VI, pero activa la adenilil ciclase tipo I. La actividad de la Icrac podría ser regulada ya sea en forma directa o indirecta mediante la concentración de Ca^÷ (13) . Un incremento en la concentración del ión de calcio intraceluiar controla una gama diversa de funciones celulares, incluyendo adhesión, movilidad, expresión de genes y la proliferación se puede presentar como eventos transitorios individuales, oscilaciones repetitivas o una meseta sostenida (14). Dos reportes recientes han sugerido que la amplitud, duración y frecuencia de una señal de Ca2÷ en las células del sistema inmune controlan la activación diferencial de los reguladores de transcripción proinflamatorios NF-??, JNK y NF-AT (15; 16) . De este modo, la señalización de calcio podría desempeñar un papel importante en la activación de células del sistema inmune. La identificación de un canal de calcio específico en el sistema inmune podría por lo tanto representar un paso importante hacia la determinación de la patología de Icrac en estados patológicos. Mlsnl y sus productos génicos podrían por lo tanto ser utilizados como una base en la selección para identificar nuevos compuestos terapéuticos tales como supresores del sistema inmune, incluyendo compuestos anti-alérgicos o anti-inflamatorios, o activadores del sistema inmune para el tratamiento de trastornos inmunodegenerativos . Mlsnl podría de igual manera representar un marcador biológico poderoso para el inicio y avance de enfermedades autoinmunes o inflamatorias (por ejemplo, COPD, Artritis, rechazo de órganos) BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención describe la caracterización de un canal de Ca2+ capacitivo en células del sistema inmune, en forma más específica en macrófagos. La expresión de ARNm se incrementa en forma diferencial en los monocitos hasta la diferenciación a macrófagos así como en la activación de los macrófagos. En forma más particular, los inventores han identificado la presencia de una secuencia para poro de calcio novedosa dentro de los productos del gen mlsnl, y este poro de calcio es parte del canal de calcio capacitivo principal en las células del sistema inmune, en forma más específica en los macrófagos. La presente invención muestra que un producto del gen mlsnl se expresa en las células U937 (similares a monocitos) en forma específica después de 48 horas de diferenciación hacia una célula de tipo macrófago y que el mlsnl regula la entrada de calcio capacitiva en estas células. La expresión se incrementa también mediante la activación de los macrófagos. Los experimentos de sustracción de PCR demuestran que la expresión del gen mlsnl es regulada en forma positiva varias veces, lo cual está en corcondancia con los incrementos diferenciales del fenocipo de señalización de calcio, previamente establecidos, durante este paso de diferenciación (18) . Esta invención también demuestra que los ácidos nucleicos antisentido específicos para mlsnl particulares regulan en forma negativa la entrada de calcio en las células U937 diferenciadas hasta un fenotipo de macrófago. Esto es de importancia particular debido a que es la primera vez que una herramienta específica de secuencia ha tenido éxito para inhibir la señalización de calcio en las células del sistema inmune, asociando con esto un gen determinado con la expresión del gen para el poro de Ca2÷ . Esta invención representa la caracterización de un canal SOC en células inmuno-moduladoras , en forma más específica en macrófagos . Esta invención provee medios (1) para utilizarlo como un modulador de la activación del sistema inmune; (2) para utilizarlo como un marcador biológico para la activación del sistema inmune y la inflamación; (3) para identificar nuevos blancos para la selección de inmuno-moduladores. La invención descrita muestra también, la secuencia de ácido nucleico de los elementos promotores de la transcripción de Mlsnl en el extremo 5 ' hacia el codón de inicio de Mlsnl putativo. Uno de los objetivos de la presente invención reside en el uso de un gen mlsnl, el producto o productos del gen y los promotores de transcripción para seleccionar compuestos que modulen la actividad de una célula del sistema inmune que exprese Icrac, en forma más específica de una célula que presente el antígeno, de manera aún más específica de un compuesto que module la actividad de los macrófagos . Los objetivos adicionales de la presente invención incluyen péptidos de Mlsnl, ácidos nucleicos, vectores y células recombinantes , los cuales se pueden utilizar para métodos terapéuticos (como blancos) o de diagnóstico (como marcadores biológicos) .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de Mlsnl con estructura secundaria pronos icada. En la cual ; <<N-TERMINUS>> representa el dominio del extremo N-terminal _TMD1 a 6 representa los dominios de transmembrana --EXL1 a 3-- representa el bucle extracelular --INLI y 2-- representa los bucles intracelulares <<C-TERMINUS>> representa el dominio del extremo C- erminal La figura 2 representa el análisis sobre agarosa de los productos de PCR obtenidos con pares de iniciadores específicos para Mlsnl proveniente de células tipo macrófago U937 diferenciadas o no diferenciadas. La figura 3 ilustra el análisis de expresión de Mlsnl (TrpC8) mediante substracción de ADNc. 1: Células U937 diferenciadas con dbcAMP sustraídas por células U937 no diferenciadas. 2: Control U937 diferenciadas con dbcAMP sin sustraer . 3: Células U937 no diferenciadas sustraídas por células U937 diferenciadas con dbcAMP. 4: Control de células U937 no diferenciadas y sin sustraer. 5: Escalera de 1 kb. Se ha realizado la PCR en la sustracción de fragmentos de ADN utilizando los iniciadores específicos para Mlsnl "Not la" y "Not 2b". La figura 4 muestra la regulación negativa de la entrada de calcio durante la diferenciación con dbcAMP de las células U937 utilizando análisis de antisentido de Mlsnl-flujo de calcio empleando Indo-1 y citometría de flujo . a: células U937 sin diferenciar b: células U937 diferenciadas con dbcAMP c: células U937 diferenciadas con dbcAMP tratada con 10 µ? de oligonucleótido revuelto. d: células U937 diferenciadas con dbcAMP tratadas con ?µ? de antisentido de Mlsnl e: células U937 diferenciadas con dbcAMP tratadas con 10 µ? de antisentido de Mlsnl.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención reside en la caracterización de componentes de Mlsnl funcionales. Se ha determinado la estructura del polipéptido de Mlsnl. Se han identificado las secuencias de ácido nucleico y los péptidos que codifican para las regiones N- y C-terminal . Además, se han identificado las secuencias de ácido nucleico y los péptidos que codifican para los dominios de transmembrana y las regiones de bucle intracelular y extracelular . En forma importante, se han identificado el ácido nucleico y la secuencia de péptido que codifican para la región de poro de calcio de Mlsnl. Las secuencias de ácido nucleico y de péptido anteriores ofrecen moléculas blanco vitales para el desarrollo de moléculas terapéuticas para combatir trastornos asociados con la función aberrante de Icrac. Además, los inventores han identificado los elementos de promotor de transcripción putativo del extremo 5' para el ácido nucleico que codifica para el codón de inicio Metionina-1 de Mlsnl. Otro objetivo de esta invención reside, en forma general, en el uso de un gen mlsnl, un producto del gen, fragmentos del mismo, o elementos del promotor de transcripción para seleccionar un compuesto o compuestos que modulen la actividad de una célula del sistema inmune, en forma más específica para seleccionar un compuesto que module la actividad de monocitos, macrófagos, células T, células B y mastocitos in vitro, ex vivo o in vivo, de manera aún más específica para seleccionar compuestos que modulen la actividad de los macrófagos in vitro, ex vivo o in vivo. Esta invención se refiere también a polipéptidos y ácidos nucleicos para Mlsnl particulares, métodos de selección de inmuno-moduladores . Otros aspectos de la presente invención se refieren a: Métodos para seleccionar compuestos inmuno-moduladores, que comprenden poner en contacto un compuesto de prueba con un gen para Mlsnl o un producto del gen para Mlsnl, o un elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl, y para determinar la capacidad de dicho compuesto de prueba para interactuar con el gen para Mlsnl o un producto del gen para Mlsnl o un elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl. Métodos de selección para identificar blancos inmuno-moduladores (conocidos o desconocidos) después de modular el gen para Mlsnl, la actividad del producto del gen para Mlsnl, o la actividad del promotor de transcripción. Los aspectos adicionales de la presente invención se refieren a: El uso del gen mlsnl, los productos del gen o los ácidos nucleicos para reportar y/o para modular la actividad de Mlsnl en células del sistema inmune in vi tro, ex vivo o in vi vo . Dentro del contexto de la presente invención, el termino gen mlsnl designa una secuencia de nucleótido que codifica para la proteína Mlsnl, cualquier secuencia de nucleótidos que codifique para un fragmento de la proteína Mlsnl o cualquiera de las variantes u homólogos de la misma. Las variantes u homólogos designan en forma más particular a cualquiera de los genes humanos que existen en forma natural los cuales podrían presentar variaciones en la secuencia que resultan de polimorfismos, mutaciones, u otras alteraciones en comparación con la secuencia anterior, sin anular la propiedad de la proteína codificada para que funcione como un canal Icrac. Los homólogos o variantes incluyen también a cualquier molécula de ADN recombinante , tal como una molécula de ADNc, que codifica para una proteína Mlsnl. Las variantes adicionales también incluyen a cualquiera de las secuencias que se puedan hibridar con las secuencias de ácido nucleico anteriores bajo condiciones astringentes y que puedan codificar para un canal de Icrac f ncionalmente activo. También quedan incluidas las secuencias de nucleótidos que codifican para fragmentos de la proteína Mlsnl, las cuales representan una región biológica relevante de esta proteína tal como los dominios de los extremos N-terminal y C- erminal, los dominios de transmembrana, los bucles intracelulares y extracelulares y el poro de calcio pronosticado así como los polipéptidos que representan esta región biológicamente relevante. Como una modalidad de ejemplo, las condiciones de hibridación pueden definirse como sigue: El paso de hibridación se conduce a 65°C en presencia de 6 x de solución reguladora SSC, 5 x de solución de Denhardt, 0.5% de SDS y 100 ng/ml de ADN de esperma de salmón. El paso de hibridación es seguido por cuatro pasos de lavado: • Dos lavados durante 5 minutos, de preferencia a 65°C en 2 x de solución reguladora SSC y 0.1% de solución reguladora SDS. • Un lavado durante 30 minutos, de preferencia a 65°C en 2 x de solución reguladora SSC y 0.1% de solución reguladora SDS . • Un lavado durante 10 minutos, de preferencia a 35°C en una 0.1 x de solución reguladora SSC y 0.1% de solución reguladora SDS, entendiéndose que las condiciones de hibridación definidas anteriormente son apropiadas para ácidos nucleicos de aproximadamente veinte nucleótidos de longitud y que estas condiciones podrían también adaptarse para ácidos nucleicos más cortos o más largos, de conformidad con las técnicas bien conocidas en el campo, por ejemplo aquellas descritas por Sambrook et al. (1989). Un producto del gen para Mlsnl designa, de conformidad con la presente invención, polipéptidos (o proteínas) codificadas por un gen mlsnl tal como el descrito anteriormente. El producto del gen para Mlsnl podría comprender varios polipéptidos, que resultan de empalmes alternativos de un gen mlsnl durante la transcripción. En forma más específica los productos del gen para Mlsnl de esta invención son codificados por un gen mlsnl tal como el descrito anteriormente y/o comprenden la secuencia de aminoácidos de Mlsnl, tal como aquella de SEQ ID No. 1. También dentro del contexto de la presente invención, el término promotor o promotores de transcripción de Mlsnl designa secuencias de nucleótidos que codifican para el elemento o elementos del promotor de transcripción de Mlsnl, la secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de la misma, o cualquiera de las variantes u homólogos de la misma. Variantes u homólogos designa en forma más particular a cualquiera de los elementos promotores de transcripción de humano que podrían presentar variaciones en la secuencia resultantes de polimorfismos, mutaciones u otras alteraciones en comparación con la secuencia anterior, sin anular la propiedad de las secuencias de ácido nucleico para que funcionen como un promotor de transcripción de Icrac. Las variantes adicionales también incluyen a cualquiera de las secuencias que se podrían hibridar con las secuencias de ácido nucleico anteriores bajo condiciones astringentes y codificar para un promotor de transcripción funcionalmente activo. Un elemento promotor de transcripción de Mlsnl designa, de conformidad con la presente invención, codificado por una secuencia de ácido nucleico para Mlsnl como la descrita anteriormente. Los elementos de promotor de transcripción se caracterizan adicionalmente por estar localizados en el extremo 5 'del codón de inicio de Mlsnl. En forma más específica, los elementos de promotor de transcripción de Mlsnl de esta invención son codificados por las secuencias de ácidos nucleicos para Mlsnl de SEQ ID No. 41, 42 ó 43.

Secuencias de nucleótido y de aminoácidos que codifican para Mlsnl El ADNc del gen mlsnl de humano ha sido descrito en la patente E.U.A. No. 5,674,739 como FOHY030. Se describe que este gen es expresado específicamente en ciertas células de tumor y no en te idos sanos y por lo tanto se caracterizó como implicado en el avance de tumores. La secuencia de ADNc del gen mlsnl de humano también está disponible a partir de Genbank (número de acceso AF071787) . Se predice que la secuencia de ácido nucleico publicada que codifica para el marco de lectura abierta de Mlsnl de humano es de 4602 ácidos nucleicos de longitud (incluyendo un codón de detención) . Esta secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID No. 23. Este gen mlsnl publicado codifica para un polipéptido lineal de 1533 aminoácidos. La secuencia de aminoácido de esta Mlsnl pronosticada se muestra en SEQ ID No. 1 y en la figura 1. La presente invención se basa en la identificación de que la expresión de un producto del gen para Mlsnl es esencial para un canal de calcio capacitivo funcional en células del sistema inmune, tales como monocitos, macrófagos, células T, células B y mastocitos, en forma específica en células que presentan el antígeno, en forma más específica en macrófagos. Considerando la implicación de la entrada de calcio en la regulación de diversas actividades celulares, esta invención provee medios adicionales para el diseño de compuestos inmuno-moduladores así como de compuestos moduladores y para reportar la activación inmune y la inflamación. De manera más particular, esta invención en la actualidad provee un blanco novedoso para seleccionar compuestos inmuno-moduladores y para descifrar las rutas de gen para activación del sistema inmune . Por lo tanto, un primer objetivo de la invención es el uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifique para una Mlsnl de humano o una secuencia complementaria al mismo, en el cual, el ácido nucleico codificador codifica para un polipéptido que tiene las siguientes características: (1) La región N-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 300 nucleótidos, más preferido por lo menos 750 nucleótidos, más preferido aún 1500 nucleótidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los nucleótidos 1 a 2268 de SEQ ID No. 23, (2) Una región de transmembrana que codifica para seis dominios de extensión de membrana, codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleótidos, de preferencia por lo menos 300 nucleótidos, más preferido por lo menos 750 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región C-terminal de Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los nucleótidos 2271 a 3045 de SEQ ID No. 23, y (3) Una región C-terminal codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 150 nucleótidos, más preferido por lo menos 600 nucleótidos localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y la región de transmembrana de Mlsnl. De manera más particular se selecciona dentro de los nucleótidos 3048 a 4599 de SEQ ID No. 23, para seleccionar moduladores de Mlsnl, en forma más específica moduladores de Icrac. Unos ácidos nucleicos preferidos que codifican para Mlsnl son los de SEQ ID No. 23. Un objetivo adicional de la invención consiste del uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que tenga por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID No. 23 o una secuencia complementaria a la misma, para seleccionar' moduladores de Mlsnl, en forma más específica moduladores de Icrac. También queda abarcado por la presente invención el uso del ácido nucleico que se híbrida, bajo condiciones astringentes, con SEQ ID No. 23, su cadena complementaria, o con una porción de la misma, y que codifica para un polipéptido con actividad de canal de calcio. Un segundo objetivo de la invención es el uso de cualquier péptido purificado o aislado que codifica para una Mlsnl de humano o un fragmento de la misma, en la cual, el péptido tiene las siguientes características: (1) La región N-terminal comprende la secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, más preferido por lo menos 250 aminoácidos, más preferido aún 500 aminoácidos, localizada en el extremo N-terminal con respecto a las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los aminoácidos 1 a 756 de SEQ ID No. 1, (2) Una región de transmembrana que forma seis dominios de extensión de membrana, que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, más preferido por lo menos 250 aminoácidos, en el extremo C-terminal con respecto a la región N-terminal, y en el extremo N- erminal con respecto a la región C-terminal de Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los aminoácidos 757 a 1015 de SEQ ID No. 1 y (3) Una región C-terminal que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos, más preferido por lo menos 200 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal con respecto a las regiones del extremo N-terminal y de transmembrana de Mlsnl. De manera más particular las secuencias se seleccionan dentro de los aminoácidos 1016 a 1533 de SEQ ID No. 1, para seleccionar moduladores de Icrac, de manera más específica moduladores de Mlsnl. Los aminoácidos preferidos que codifican para Mlsnl son los de SEQ ID No. 1. Un objetivo adicional de la invención consiste del uso de cualquier péptido purificado o aislado que tenga por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con la secuencia de SEQ ID No. l o fragmentos de la misma, para seleccionar moduladores de Mlsnl, más específicamente moduladores de Icrac.

Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en el cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID No. 1. Además, el descubrimiento de que la función de Icrac está modulada por Mlsnl provee medios para correlacionar la gravedad de un trastorno asociado con Icrac con los niveles de expresión en células del sistema inmune. Un tercer objetivo de la invención es el uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifica para una Mlsnl de humano o para una secuencia complementaria a la misma, en el cual el ácido nucleico codificador codifica para un polipéptido que tiene las siguientes características : (1) La región K-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 300 nucleótidos, más preferido por lo menos 750 nucleótidos, más preferido aún 1500 nucleótidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los nucleótidos 1 a 2268 de SEQ ID No. 23, (2) Una región de transmembrana que codifica para seis dominios de extensión de membrana, codificados por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleótidos, de preferencia por lo menos 300 nucleótidos, más preferido por lo menos 750 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región C-terminal de Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los nucleótidos 2271 a 3045 de SEQ ID No. 23, y (3) Una región C-terminal codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 150 nucleótidos, más preferido por lo menos 600 nucleótidos localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y la región de transmembrana de Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona dentro de los nucleótidos 3048 a 4599 de SEQ ID No. 23, para el diagnóstico de trastornos asociados con la función aberrante de Icrac en células del sistema inmune. Un ácido nucleico preferido que codifica para lsnl es el de SEQ ID No. 23. Un objetivo adicional de la invención consiste del uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que tenga por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID No. 23 o una secuencia complementaria a la misma, para el diagnóstico de trastornos asociados con la función aberrante de Icrac en las células del sistema inmune. Un cuarto objetivo de la invención es el uso de cualquier péptido purificado o aislado que codifique para Mlsnl de humano o fragmentos de la misma, en el cual el péptido tiene las siguientes características .- (1) La región N- erminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, más preferido por lo menos 250 aminoácidos, más preferido aún 500 aminoácidos, localizada en la región N- erminal con respecto a las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl. En forma más particular la secuencia se selecciona dentro de dos aminoácidos 1 a 756 de SEQ ID No. 1. (2) Una región de transmembrana que forma seis dominios de extensión de membrana que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, más preferido por lo menos 250 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal con respecto a la región N-terminal y en el extremo N-terminal con respecto a la región C-terminal de Mlsnl. De manera más particular, la secuencia se selecciona dentro de los ácidos nucleicos 757 a 1015 de SEQ ID No. 1, y (3) una región C-terminal que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos, más preferido por lo menos 200 aminoácidos, localizada en la región C-terminal, con respecto a las regiones N-terminal y de transmembrana de Mlsnl. De manera más particular la secuencia se selecciona a partir de los aminoácidos 1016 a 1533 de SEQ ID No. 1, para el diagnóstico de trastornos asociados con la función de Icrac aberrante en células del sistema inmune. Un ácido nucleico preferido que codifica para Mlsnl es el de SEQ ID No. 1. Un objetivo adicional de la invención consiste del uso de cualquier péptido aislado o purificado que tenga por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID No. 1 o fragmento de una misma, para la selección de moduladores de Icrac y para el diagnóstico de trastornos asociados con la función de Icrac aberrante en células del sistema inmune.

Estructura de Mlsnl Los inventores han identificado componentes biológicos relevantes del gen mlsnl y los productos de expresión. Los inventores realizaron experimentos de alineación de gen con diversos subtipos de canales de Ca2' controlados por voltaje, utilizando el método Clustal (Paquete de software MegAlign-DNAstar/Lasergene) . En particular, se compararon las secuencias de aminoácido de las siguientes proteínas Trp se compararon, en una ventana de 41 residuos entre los segmentos 5 y 6 de transmembrana pronosticados (se indican los números de acceso de Genbank correspondientes): Trp, J04844; TRPL proteína de unión a calmodulina, M88185; TRPC7 canal 7 de potencial de receptor transitorio, NM 003307; Melastatina 1, AF071787 y la secuencia genómica del nemátodo Caenorhabditis elegans, Z77132. Estos experimentos permitieron identificar una secuencia para poro de calcio novedosa en el gen para Mlsnl. Los inventores creen que la forma activa de Mlsnl es un polipéptido de extensión de membrana. Se pronostica que este polipéptido posee 6 dominios de transmembrana (TRD 1-6 por sus siglas en inglés) , y los dominios N-terminal y C-terminal citoplasmáticos . El dominio N, el dominio C y los TMD están todos conectados mediante 5 bucles peptídicos, 2 bucles intracelulares y 3 bucles extracelulares . El bucle 3 extracelular que forma parte del poro para calcio de Icrac. Los TMD incorporan los siguientes péptidos: TRD1, aminoácidos 757-781 (tal como se muestra en la figura 1 de la secuencia polipeptídica con anotaciones) ; TMD2, aminoácidos 790-810 (tal como se muestra en la figura 1) ; TMD3 , aminoácidos 828-849 (tal como se muestra en la figura 1) ,· TMD4 aminoácidos 859-878 (tal como se muestra en la figura 1) ; TMD5 aminoácidos 892-912 (tal como se muestra en la figura 1) ; y TMD6 aminoácidos 985-1015 (tal como se muestra en la figura 1) . La región N-terminal incluye los aminoácidos 1 a 756 como se muestra en SEQ ID No. 2 y 3, y en la figura 1. La región C-terminal incluye los aminoácidos 1016-1533 como se muestra en SEQ ID No. 4 y 5, y en la figura 1. La región de bucle intracelular 1 está codificada por los aminoácidos 811-827 tal como se muestra en SEQ ID No. 6 y 7, y en la figura 1. El bucle intracelular 2 es codificado por los aminoácidos 879-891 tal como se muestra en SEQ ID No. 8 y 9 y en la figura 1. El bucle extracelular 1 es codificado por los aminoácidos 782-789 como se muestra en SEQ ID No. 10 y 11 y en la figura 1. El bucle extracelular 2 es codificado por los aminoácidos 850-858 como se muestra en SEQ ID No. 12 y 13 y en la figura 1. El bucle extracelular 3 es codificado por los aminoácidos 913-984 como se muestra en SEQ ID No. 14 a 17 y en la figura 1. Los inventores creen que el bucle extracelular 3 juega un papel en la formación del poro del canal de calcio. Además, los inventores creen que la secuencia peptídica de 23 aminoácidos (aminoácidos 922-944) de SEQ ID No. 16 la cual se pronostica que es parte del poro para calcio es esencial para la función de Icrac. Los inventores creen que las superficies expuestas intracelulares y extracelulares de Mlsnl así como del canal de calcio proveen moléculas blanco vitales para el desarrollo de compuestos terapéuticos para modular Icrac. Estas superficies incluyen aminoácidos que codifican para las regiones N-terminal y C-terminal así como los aminoácidos que codifican para los bucles que conectan los dominios de transmembrana. En forma bastante importante, el asignar la función de Icrac a Mlsnl ha permitido que los inventores identifiquen un poro de calcio dentro de la región de transmembrana, y un bucle peptídico externo. Se cree que este bucle modula en forma directa el flujo de calcio en Icrac. Tanto el poro para calcio como el bucle asociado conservan una significado especial en el desarrollo de compuestos terapéuticos para el tratamiento de la función de Icrac aberrante. Además, los péptidos de Mlsnl permiten el desarrollo de herramientas de diagnóstico para evaluar la función de Icrac y los niveles en células del sistema inmune . De igual modo los ácidos nucleicos que codifican para dichos péptidos ofrecen oportunidades para identificar moduladores de Icrac, y el desarrollo de herramientas de diagnóstico .

Péptidos de Mlsnl Los inventores creen que la región citoplasmática de Mlsnl podría participar en la translocación del polipéptido para Mlsnl desde el citoplasma hacia la membrana celular . Por lo tanto, un objetivo de la invención es una región N-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, de la cual la región N-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, más preferido por lo menos 250 aminoácido y más preferido aún por lo menos 500 aminoácidos, localizada en la región N-terminal de la primer región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No. 2 ó 3. Son más preferidas las secuencias de SEQ ID No. 2 ó 3. Un objetivo adicional de la invención descansa en una región N-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, en el cual la región N-terminal tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98%, y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los páptidos de las secuencias de aminoácido de SEQ ID No. 2 ó 3, o fragmentos de las mismas. Los inventores creen también que la región C-terminal de Mlsnl participa en la modulación de la actividad de Mlsnl. Por lo tanto, un segundo objetivo de la invención consiste de una región C-terminal de Mlsnl de humano aislada o purificada, en la cual la región C-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos, más preferido por lo menos 100 aminoácidos y más preferido aún por lo menos 200 aminoácidos, localizada en la región C-terminal de la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva cornada a partir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 o 5. Son más preferidas las secuencias de SEQ ID No. 4 o 5. Un objetivo adicional de la invención descansa en una región C- erminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región C-terminal tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98%, y más preferido aún 99% de identidad de aminoácidos con cualquiera de los péptidos de la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 4 o 5, o fragmentos de la misma. Los inventores creen que el péptido que codifica para el bucle 1 intracelular de Mlsnl participa en forma importante en la regulación de Mlsnl y su capacidad para traducir las señales intracelulares . Por lo tanto, un tercer objetivo de la invención es una región de bucle 1 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 1 intracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 7 aminoácidos, de preferencia por lo menos 10 aminoácidos, más preferido por lo menos 15 aminoácidos localizada en la región C-terminal de la segunda región de transmembrana y en la región N-terminal hacia la tercer región de transmembrana de la proteína Mlsnl . Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6 ó 7. Son más preferidas las secuencias de SEQ ID No. 6 ó 7. Un objetivo adicional de la invención reside en una región de bucle 1 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 1 intracelular tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 6 ó 7, o fragmentos de las mismas. Los inventores creen que el péptido que codifica para el bucle 2 intracelular de Mlsnl también realiza un papel importante en la regulación de Mlsnl y su capacidad para traducir las señales intracelulares . Por lo tanto, un cuarto objetivo de la invención es una región de bucle 2 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 2 intracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 7 aminoácidos, de preferencia por lo menos 10 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la cuarta región de transmembrana y en la región N-terminal de la quinta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de las secuencias de aminoácido de SEQ ID No. 8 ó 9. Es más preferida la secuencia de SEQ ID No. S ó 9. Un objetivo adicional de la invención es una región de bucle 2 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 2 intracelular tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 8 o 9 o fragmentos de las mismas. Los inventores creen que los péptidos que codifican para el bucle 1 extracelular de Mlsnl podrían participar en un papel crucial en la modulación de calcio a través del canal Icrac. Por lo tanto, un quinto objetivo de la invención es una región de bucle 1 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 1 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 5 aminoácidos localizada en el extremo C-terminal de la primer región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la segunda región de transmembrana de proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No. 10 ó 11. Es más preferida la secuencia de SEQ ID No. 10 Ó 11.

Un objetivo adicional de la invención es una región de bucle 1 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 1 extracelular tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98 % y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 10 o 11, o fragmentos de las mismas. Los inventores creen que los péptidos que codifican para la región de bucle 2 extracelular de Mlsnl podrían también participar en un papel crucial en la modulación de calcio a través del canal Icrac. Por lo tanto, un sexto objetivo de la invención es una región de bucle 2 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 2 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 5 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la tercer región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la cuarta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 12 o 13 . Se prefiere más la secuencia de SEQ ID No. 12 o 13. Un objetivo adicional es la región de bucle 2 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle extracelular tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98%, y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 12 o 13 o fragmentos de las mismas. Los inventores creen que los péptidos que codifican para la región de bucle 3 extracelular, tienen una función en la modulación del flujo de calcio en Icrac. Por lo tanto, un séptimo objetivo de la invención es una región de bucle 3 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 3 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 7 aminoácidos, de preferencia por lo menos 10 aminoácidos, más preferido por lo menos 20 aminoácidos, más preferido aún por lo menos 50 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la quinta región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 14, 15, 16 ó 17. Son más preferidas las secuencias de SEQ ID No. 14, 15, 16 ó 17. Un objetivo adicional de la invención es la región de bucle 3 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región de bucle 3 extracelular tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 9S%, y más preferido aún 99% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 14, 15, 16 ó 17, o fragmentos de las mismas. Los inventores creen que los péptidos que contienen las regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares y las regiones de transmembrana pero que carecen de las regiones N- y C- terminales asociadas podrían jugar un papel en el entendimiento de Icrac y en el desarrollo de moduladores de Icrac y de herramientas de diagnóstico. Por lo tanto un octavo objetivo de la invención es un péptido de Mlsnl de humano purificado o aislado que contiene las regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares, en la cual dicha región de bucle intracelular y extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos, de preferencia por lo menos 100 aminoácidos, y más preferido por lo menos 250 aminoácidos, localizada en la región C- erminal a la región N-terminal y en la región N-terminal hacia la región C-terminal de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.18 ó 19. Es más preferida la secuencia de SEQ ID No.18 ó 19. Un objetivo adicional de la invención es un péptido de Mlsnl de humano purificado o aislado, que contiene las regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares en la cual la región de bucle intracelular y extracelular tienen por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% de identidad de aminoácidos con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 18 ó 19, o fragmentos de las mismas. Se puede determinar la identidad de aminoácido utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. En particular, se puede valorar la identidad de aminoácido (u homología de secuencia) mediante los programas de computadora disponibles comercialmente, tales como CLUSTAL o BLAST (NCBI) . También se podrían utilizar diversos parámetros de investigación o alineamiento. En una modalidad preferida se determina el % de identidad de aminoácido (o de ácido nucleico) utilizando el programa CLUSTAL-W (Compugen) .

Acidos Nucleicos que codifican para péptidos de Mlsnl Esta invención se refiere también en forma general al uso de secuencias de ácido nucleico que codifican para dichos péptidos de Mlsnl para el desarrollo de tecnologías de selección y de diagnóstico. Un objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región N-terminal de Mlsnl de humano, en la cual la región N-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 300 nucleótidos, más preferido por lo menos 750 nucleótidos y más preferido aún por lo menos 1500 nucleótidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la primer región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID No. 24 ó 25. Se prefiere más la secuencia de SEQ ID No. 24 ó 25. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada, que codifica para la región N-terminal de Mlsnl de humano en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95%, y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótido de SEQ ID No. 24 ó 25, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en la cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 90%, de preferencia 95, más preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 2 ó 3. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región C- terminal de Mlsnl de humano, en la cual la región C-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos, de preferencia por lo menos 150 nucleótidos, más preferido por lo menos 300 nucleótidos y más preferido aún por lo menos 600 nucleótidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 26° ó 27. Es más preferida la secuencia de SEQ ID NO. 26 ó 27. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región C- terminal de Mlsnl, en la cual la secuencia de ácidos nucleicos tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleotidos o SEQ ID No. 26 ó 27, o de una secuencia complementaria a la misma. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en la cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tenga por lo menos un 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% en cualquiera de los polipéptido de SEQ ID No . 4 ó 5. Un objetivo adicional de la invención reside en una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-1 intracelular de Mlsnl, en la cual la región de bucle 1 intracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleotidos, de preferencia por lo menos 30 nucleotidos, más preferido por lo menos 45 nucleotidos, localizados en el extremo 3' con respecto a los nucleotidos que codifican para la segunda región de transmembrana y hacia al extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican la tercer región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 28 ó 29. Se prefiere más la secuencia de SEQ ID No. 28 ó 29. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-1 de Mlsnl de humano, en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID No. 28 ó 29, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificado o aislado que codifica para un polipéptido, en el cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tenga por lo menos 90%, de preferencia 95%, mas preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 6 ó 7. Otro objetivo de la invención en una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-2 intracelular de Mlsnl de humano, en la cual la región de bucle-2 intracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleotidos, de preferencia por lo menos 30 nucleotidos, localizados en el extremo 3 ' con respecto a los nucleotidos que codifican para la cuarta región transmembrana, y hacia el extremo 5' con respecto los nucleotidos que codifican para la quinta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 30 ó 31. Se prefiere mas la secuencia de SEQ ID No. 30 ó 31. Otro objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-2 intracelular de Mlsnl de humano, en la cual la secuencia de ácido nucleico cieñe por lo menos 80%, de preferencia 90%, mas preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico en cualquiera de las secuencias SEQ ID No. 30 ó 31, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención en una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en la cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 90%, de preferencia 95%, mas preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 8 ó 9.

Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-1 extracelular de Mlsnl de humano, en la cual la región de bucle-1 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 15 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la primer región de transmembrana y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la segunda región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 32 ó 33. Es más preferida la secuencia de SEQ ID No. 32 o 33. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-1 extracelular de Mlsnl de humano en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID No. 32 ó 33, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico aislada o purificada que codifica para un polipéptido, en la cual dicho ácido nucleico codifica paraun polipéptido que tenga por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 10 ó 11. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-2 extracelular de Mlsnl de humano, en la cual la región de bucle-2 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 15 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la tercer región de transmembrana y hacia el extremo 5 ' con respecto a los nucleótidos que codifican para la cuarta región de transmembrana de la protelna Mlsn. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 34 ó 35. Se prefiere más la secuencia de SEQ ID No. 34 ó 35. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácidos nucleicos purificada o aislada que codifica para la región de bucle-2 extracelular de Mlsnl de humano, en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótido de SEQ ID No. 34 ó 35, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico aislada o purificada que codifica para un polipéptido, en la cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tenga por lo menos 90%, de preferencia 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de os polipéptidos de SEQ ID No. 12 ó 13. Un objetivo adicional de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-3 extracelular de Mlsnl de humano, en la cual la región de bucle -3 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleótidos, de preferencia por lo menos 30 nucleótidos, más preferido por lo menos 60 nucleótidos y más preferido aún por lo menos 150 nucleótidos en el extremo 3 ' con respecto a los nucleótidos que codifican para la quinta región de transmembrana y hacia el extremo 51 con respecto a los nucleótidos que codifican para la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID No. 36, 37 ó 38. Más preferida es la secuencia de SEQ ID No.36, 37 ó 38. Un objetivo adicional es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para la región de bucle-3 extracelular de Mlsnl, en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleotido de SEQ ID No. 36, 37 ó 38, o una secuencia complementaria a las mismas. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en el cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 90%, de preferencia, 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 14, 15, 16 ó 17. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un péptido de Mlsnl de humano que contiene regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares , en la cual dicha región de bucle intracelular y extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleótidos, de preferencia de por lo menos 300 nucleótidos y más preferido por lo menos 750 nucleótidos en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región C-terminal de la proteína Mlsnl. Se prefiere una secuencia consecutiva tomada a partir de una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 39 ó 40. Es más preferida la secuencia de SEQ ID No. 39 ó 40. Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para el péptido de Mlsnl que contiene regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares , en la cual el ácido nucleico tiene por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de ácido nucleico en cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO. 39 ó 40 o una secuencia complementaria a las mismas . Otro objetivo de la invención es una secuencia de ácido nucleico purificada o aislada que codifica para un polipéptido, en el cual dicho ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 90%, de preferencia, 95%, más preferido 98% y más preferido aún 99% con cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID No. 18 ó 19. Se puede determinar la identidad de secuencia de ácido nucleico utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. En particular, se puede evaluar la identidad de secuencia de ácido nucleico (u homología de secuencias) mediante programas de computadora disponibles comercialmente, tales como CLUSTAL o BLAST (NCBI) . También se podrían utilizar diversos parámetros de investigación o alineamiento. En una modalidad preferida, la identidad de % de aminoácido (o de ácido nucleico) se determina utilizando el programa CLUSTAL-W (Compugen) .

Promotores de transcripción de Mlsnl Los inventores han identificado tres secuencias de ácido nucleico genómico en el extremo 5' hacia el codón publicado que codifica para metionina 1 del gen para Mlsnl que codifica para las secuencias de promotor de transcripción. Los inventores creen que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los elementos promotores de transcripción de Mlsnl son blancos para el desarrollo de agentes terapéuticos que modulen la actividad de Icrac. Una primer secuencia de ácido nucleico preferida es una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID NO. 41 o una secuencia complementaria a la misma. Un objetivo adicional de la invención consiste de secuencias de ácido nucleico que tienen por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferente 95% y más preferente aún 98% de identidad de nucleotido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 41 o una secuencia complementaria a la misma. Una segunda secuencia de ácido nucleico preferida es una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID NO. 42 o una secuencia complementaria a la misma. Un objetivo adicional de la invención consiste de secuencias de ácido nucleico que tienen por lo menos 80%, de preferencia 30%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 42 o una secuencia complementaria a la misma. Una tercer secuencia de ácido nucleico preferida es una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID NO. 43 o una secuencia complementaria a la misma. Un objetivo adicional de la invención consiste de secuencias de ácido nucleico que tienen por lo menos 80%, de preferencia 90%, más preferido 95% y más preferido aún 98% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO.43 o una secuencia complementaria a la misma.

Expresión de Mlsnl Los inventores descubrieron que el gen para Mlsnl se expresa en células U937 diferenciadas hacia el fenotipo de macrófago y que el producto de este gen funciona como un canal de calcio, en forma más específica como un canal de Icrac. Se diseñaron iniciadores específicos para Mlsnl y se utilizaron para seleccionar respecto a la expresión del gen para Mlsnl en diversas células. La composición de estos iniciadores se indica en SEQ ID NO.44 a 47. Con dichos pares de iniciadores, los productos de PCR específicos de Mlsnl se obtuvieron a partir de células U937. Además los experimentos de sustracción de ADNc se realizaron utilizando preparaciones de ADN provenientes de células U937 diferenciadas y no diferenciadas. Los resultados obtenidos demuestran que la expresión del producto del gen para Mlsnl en células U937 se incrementan en forma diferencial en células U937 diferenciadas con dbcAMP (de tipo macrófago) en comparación con células U937 no diferenciadas (de tipo monocito) . La regulación positiva del gen mlsnl se correlaciona con la expresión del fenotipo de Icrac en células U937 (18) y de esta manera establece que la regulación positiva de la expresión de Mlsnl en estas células coinciden con el fenotipo incrementado para Icrac.

Se obtuvo la evidencia específica de secuencia para la implicación de Mlsnl en el fenotipo de Icrac demostrando que el tratamiento de células U937 con antisentido específicas de Mlsnl durante la diferenciación inducida por dbcAMP podría reducir en forma significativa la señal de calcio en estas células. Por consiguiente, esta invención en forma inesperada demuestra que Mlsnl se expresa en células inmunes tales como macrófagos y que la regulación negativa de la expresión del gen mlsnl durante la diferenciación de células U937 hasta células tipo macrófagos reduce la entrada de calcio en estas células. Esta invención demuestra también que el producto génico de Mlsnl está regulado positivamente durante la diferenciación de la célula U937 hasta células de tipo macrófago, lo cual se correlaciona con la etapa de maduración de estas células y con su capacidad para presentar el fenotipo Icrac.

Producción de polipéptidos o de ácidos nucleicos para Mlsnl Vectores de expresión recombinantes La presente invención abarca también una familia de vectores recombinantes que comprende a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención. Por lo tanto, la invención también trata con un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de: (a) Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para Mlsnl, de preferencia Mlsnl de humano o los elementos promotores de transcripción de Mlsnl, y en forma más preferida un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con un polipéptido que se selecciona de grupo que consiste de: ácidos nucleicos que codifican parta Mlsnl, tales como SEQ ID N0.1, ácidos nucleicos que codifican para la región N-terminal de Mlsnl tal como SEQ ID NO.2 y 3, ácidos nucleicos que codifican para la región C-terminal de Mlsnl, tales como SEQ ID NO.4 y 5, ácidos nucleicos que codifican para los bucles intracelulares de Mlsnl, tales como SEQ ID NO.6 a 9, ácidos nucleicos que codifican para los bucles extracelulares 1 y 2 de Mlsnl, tales como SEQ ID NO.10 a 13, ácidos nucleicos que codifican para el bucle extracelular 3 de Mlsnl, tales como SEQ ID No. 14 a 17, ácidos nucleicos que codifican para los bucles tanto intracelulares como extracelulares de Mlsnl, tales como SEQ ID NO.18 y 19 y ácidos nucleicos que codifican para los elementos promotores de transcripción de SEQ ID NO. 1 a 43, o una secuencia complementaria a los mismos. (b) Un ácido nucleico purificado o aislado que tiene por lo menos 80% de identidad de nucleótido con un polinucleótido que se selecciona de grupo que consiste de las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO.23 a 43, o una secuencia complementaria a las mismas. (c) Un polinucleó ido purificado o aislado que comprende por lo menos 10 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico descrito en (a) o en (b) , o una secuencia complementaria a la misma. En una primera modalidad preferida se utiliza un vector recombinante de la invención para amplificar el polinucleótido insertado obtenido a partir del ácido nucleico que codifica para una Mlsnl de la invención o el promotor de transcripción de Mlsnl en una célula hospedera apropiada, siendo amplificado este polinucleótido cada vez que el vector recombinante se replica. Una segunda modalidad preferida de los vectores recombinantes de conformidad con la invención consiste de vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico que codifica para una Mlsnl de la invención, de preferencia un ácido nucleico que codifica para una Mlsnl de humano, y más preferido un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que se selecciona de grupo que consiste de las secuencias de aminoácido de SEQ ID NO.l a 22. Los vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para los fragmentos péptidos de una Mlsnl que se especifican en la siguiente especificación también son parte de la invención . Dentro de ciertas modalidades, se pueden utilizar los vectores expresión para expresar la Mlsnl de la invención o un fragmento peptídico de la misma el cual puede ser purificado después y por ejemplo, se puede utilizar como un immunógeno con el fin de crear anticuerpos específicos contra dicha proteína Mlsnl o un fragmento de péptido de la misma. En otra modalidad, los vectores de expresión se utilizan para construir animales transgénicos y también para terapia con genes, en forma remarcable para terapia con antisentido . La expresión requiere que se provean señales apropiadas en los vectores, incluyendo dichas señales diversos elementos reguladores tales como me oradores/promotores de fuentes tanto vírales como mamíferas que activen la expresión de los genes de interés en las células hospederas. Las secuencias reguladoras de los vectores de expresión de la invención están enlazados en forma operable al ácido nucleico que codifica para la proteína Mlsnl de interés o un fragmento de péptido de la misma . Tal como se utiliza en la presente invención, el término "enlazado en forma operable" se refiere a un enlazamiento de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor o un mejorador está enlazado en forma operable a una secuencia codificadora si éste afecta la transcripción de la secuencia codificadora. De manera más precisa, se dice que dos moléculas de ADN (tales como un polinucleotido que contiene una región de promotor y un polinucleotido que codifica para un polipéptido o polinucleotido deseado) están "enlazadas en forma operable" si la naturaleza del enlace entre los dos polinucleótidos : (1) no da como resultado la introducción de una mutación por desplazamiento de marco o (2) no interfiere con la capacidad del polinucleotido que contiene al promotor para dirigir la transcripción del polinucleotido codificador . Por lo general, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de replicación, marcadores que puedan ser seleccionados, q e permiten la transformación de la célula hospedera, y un promotor obtenido a partir de un gen expresado en forma bastante elevada para dirigir la transcripción de una secuencia estructural hacia el extremo 3'. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en un marco apropiado con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y de preferencia una secuencia líder que pueda dirigir las secuencias de la proteína traducida hacia el espacio periplasmático o hacia el medio extracelula . En una modalidad específica en la cual el vector está adaptado para transfectar y expresar las secuencias deseadas en células hospederas de mamífero, los vectores preferidos comprenderán un origen de replicación proveniente de la célula deseada, un promotor apropiado y un mejorador, y también cualquiera de los sitios de unión a ribosoma, sitio de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción necesarias, y en forma opcional secuencias no transcritas con flanqueo en el extremo 5'. Se podrían utilizar secuencias de ADN derivadas a partir de del genoma viral de SV 40, por ejemplo origen, promotor temprano, mejorador y sitios de poliadenilación de SV 40 para proveer los elementos genéticos no transcritos requeridos . En forma adicional, un vector de expresión recombinante de la invención también comprende, en forma ventajosa, un polinucleótido no transcrito localizado en el extremo 3' de la secuencia codificadora (ORF) , siendo útil este polinucleótido para 3'-UTR para estabilizar al ARNm correspondiente o para incrementar la velocidad de expresión del inserto de vector si este 3 ' -UTR aloja elementos de señal de regulación tales como las secuencias me oradoras. Las regiones de promotor apropiadas utilizadas en los vectores de expresión de conformidad con la invención se eligen tomando en consideración la célula hospedera en la cual se tienen que expresar los ácidos nucleicos. Un promotor apropiado podría ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el cual éste controla la expresión, o en forma alternativa podría ser endógeno respecto al polinucleótido original que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar. En forma adicional, el promotor por lo general es heterólogo con respecto a las secuencias de vector recombinante dentro de las cuales se ha insertado la construcción promotor/secuencia codificadora. Los promotores de origen bacteriano preferidos son los promotores LacI, LacZ o los promotores de ARN polimerasa de bacteriófago T3 o T7, los promotores lambda PR, Pl y crp (véase el documento EP-0 036 776) , el promotor de polihedrina, o el promotor de la proteína plO proveniente de baculovirus (estuche Novagen; Smith et al., (1983); O'Reilly et al . (1992) ) . Los genes marcadores que puede ser seleccionados preferidos, contenidos en los vectores recombinantes de expresión de la invención para seleccionar las células hospederas transformadas son de preferencia el gen para dehidrofolato reductasa o el gen de resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S. cerevisiae o el de resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o Levamsacarasa para Mycobacteria, siendo este último marcador un marcador de selección negativo . Los vectores de origen bacteriano preferidos de la invención se listan posteriormente como ejemplos ilustrativos pero no limitantes: PQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen) , pDlO, phagescript, psiX174, p.Bluescript SK, pNHSA, pNHISA, pNH18A, pNH45A (Stratagene) ; pK 223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl , pSG (Stratagene); pSVK , pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) ; pQE-30 (QIA express) . Los vectores recombinantes de bacteriófago de ia invención preferidos son los vectores de bacteriófago Pl tales como los descritos por Sternberg N.L. (1992 ; 1994) . Un vector apropiado para la expresión del polipéptido para Mlsnl de la invención o un fragmento del mismo, es un vector de baculovirus que puede ser propagado en células de insecto y en líneas celulares de insecto. Un sistema de vector de hospedero apropiado, específico es el vector de transferencia pVL 1392/1393 de baculovirus (Pharmingen) que se utiliza para transfectar la línea celular SF9 (ATCC No. CRL 1711) la cual se obtiene a partir de Spodoptera frugiperda. También se pueden derivar los vectores de expresión recombinantes de la invención a partir de un adenovirus tal como aquellos descritos por Feldman y Steig (1996) o por Ohno et al. (1994). Otro adenovirus recombinante preferido de conformidad con esta modalidad específica de la presente invención es el adenovirus humano tipo dos o tipo cinco (Ad2 o Ad5) o un adenovirus de origen animal (Solicitud de Patente Francesa No. FR 93 05 954) . Los retrovirus particularmente preferidos respecto a la preparación o construcción de vehículos retrovirales para suministrar genes in vi tro o in vivo de la presente invención incluyen retrovirus que se seleccionan del grupo que consiste de Virus Inductor de Foco de célula de Mink, virus de sarcoma de murino y virus de sarcoma de Ross. Otros vectores retrovirales preferidos son aquellos descritos en Roth et al., (1996), en la Solicitud WO 93/25 234 del PCT, en la Solicitud WO 94/06920 del PCT, y además en Roux et al., (1989), Julan et al., (1992) y Nada et al., (1991) . Aún, otro sistema de vector viral contemplado por la invención consiste de los virus adeno-asociados (AAV por sus siglas en inglés) tales como aquellos descritos por Flotte et al., (1992), Samulski et al., (1989), y McLaughlin et al . , (1996) . Por lo tanto, un objetivo adicional de la invención consiste de un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para una Mlsnl o un fragmento peptídico de la misma o para una variante de la misma, en el cual dicho ácido nucleico está enlazado en forma operable a una secuencia de promotor. En una modalidad preferida, este ácido nucleico codifica para una Mlsnl de humano, un fragmento de Mlsnl de humano, o para un promotor de transcripción de Mlsnl, y de preferencia aquel de SEQ ID No. 23 y una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de péptido de SEQ ID No. 1, o una variante o un fragmento peptídico de la misma. Los fragmentos preferidos incluyen aquellos de SEQ ID No. 2-22 y 24 hasta 40. Los promotores de transcripción de Mlsnl incluyen aquellos de SEQ ID No. 41 a 43. En una modalidad específica de esta invención, se podría utilizar cualquiera de los elementos promotores de Mlsnl identificados de SEQ ID No. 41 a 43 para modular la expresión de una molécula reportera, como parte de una construcción de expresión. Además, estos elementos promotores de transcripción de Mlsnl se podrían utilizar para regular el gen de Mlsnl o la expresión de un fragmento del gen como parte de una construcción.

Células hospederas que expresan a Mlsnl Las células hospederas que expresan a Mlsnl en forma endógena o que han sido transformadas o transíectadas con uno de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención, o con uno de los vectores recombinantes, en particular un vector de expresión recombinante, descritos en la presente invención también son parte de la presente invención . También quedan incluidas las células hospederas que están transformadas (células procarióticas) o que están transfectadas (células eucarióticas) con un vector recombinante tal como aquellos descritos anteriormente. Las células hospederas preferidas utilizadas como receptores para los vectores de expresión de la invención son las siguientes : (a) células hospederas procarióticas: Escherichia coli, cepas (es decir cepa DH5-a) , Eacillus subtilis, Salmonella typhi urium y cepas provenientes de especies tales como Pseudo onas, Streptomyces y Staphylococcus; (b) células hospederas eucarióticas: líneas de célula T (ECACC U937, 85011440; ECACC J.CaM1.6, 96060401; ECACC Jurkat E6.1, 88042803 y ECACC J45.01, 93031145), células HeLa (ATCC No. CCL2 : No. CCL2.1 ; No. CCL2.2), células Cv 1 (ATCC No. CCL70) , células COS (ATCC No. CRL 1650; No. CRL 1651), células Sf-9 (ATCC No. CRL 1711), células C127 (ATCC No. CRL-1804), células 3T3 (ATCC No. CRL-6361), células CHO (ATCC No. CCL-61), células 293 de riñon humano (ATCC No. 45504; No. CRL-1573), BHK (ECACC No. 84100 501; No. 84111301), PC12 (ATCC No. CRL-1721), NT2 , SHSY5Y (ATCC No. CRL-2266) , NG108 (ECACC No. 88112302) Y FU, SK-N-SH (ATCC No. CRL-HTB-11) , SK-N-BE(2) (ATCC No. CRL-2271), IMR-32 (ATCC No . CCL-127) . Un sistema preferido en el que se puede expresar el gen de la invención son las líneas celulares tales como las líneas de célula T, las líneas de célula B, las líneas de mastocitos, las líneas de células jurkat, las líneas de células U937, las líneas de células KU-812, las células COS, las células 3T3, las células HeLa, las células 292 y las células CHO. Un sistema más preferido para la expresión eficiente de Mlsnl implica el uso de líneas de células T. El gen se puede expresar a través de un promotor endógeno de células T originales, o a través de un promotor exógeno. Los promotores exógenos apropiados incluyen a aquellos tales como SV40 y CMV, o quizá un promotor eucariótico tal como el promotor de tetraciclina . El promotor que se prefiere cuando la Mlsnl se expresa en forma endógena es un promotor endógeno. CMV podría ser un promotor preferido en una línea celular recombinante. En una modalidad específica de las células hospederas antes descritas, estas células hospederas también han sido transíectadas o transformadas con un polinucleótido o un vector recombinante que permita la expresión de un ligando natural de Mlsnl o de un modulador de Mlsnl. La presente invención también se refiere a un método para producir a uno de los polipéptidos o pép idos para Mlsnl descritos en la presente invención y de manera especial un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No. l a 22, en el cual dicho método comprende los pasos de: (a) insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de Mlsnl o para un fragmento peptídico del mismo en un vector apropiado; (b) cultivar, en un medio de cultivo apropiado, una célula hospedera transformada o transfectada previamente con el vector recombinante del paso (a) ; (c) cosechar el medio de cultivo acondicionado de esta manera o lisar la célula hospedera, por ejemplo mediante aplicación de energía sónica o mediante choque osmótico; (d) separar o purificar, a partir de dicho medio de cultivo, o a partir de dicha pella del material lisado de la célula hospedera resultante, el polipéptido para Mlsnl de interés producido de esta manera. En una primera modalidad preferida del método anterior, el ácido nucleico que se va a insertar en el vector apropiado ha sido sometido previamente a una reacción de amplificación, utilizando un par de iniciadores.

Los iniciadores preferidos utilizados para dicha reacción de amplificación son pares de iniciadores que amplifican los ácidos nucleicos que codifican para el marco de lectura abierto de Mlsnl y para fragmentos del mismo. En una segunda modalidad preferida del método anterior, el polipéptido producido de esta manera se caracteriza además, por ejemplo uniéndolo en una columna de cromatografía de inmuno-afinidad sobre la cual se han inmovilizado previamente anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el polipéptido para Mlsnl o los fragmentos peptídicos del mismo. Se puede realizar la purificación de las proteínas de Mlsnl recombinantes de conformidad con la presente invención o de un fragmento peptídico de la misma pasándolas en una columna de cromatografía de afinidad de níquel o cobre . En otra modalidad, los polipéptidos para Mlsnl o los fragmentos peptídicos de los mismos se podrían purificar por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento, (CLAR) , tal como CLAR de fase inversa y/o de intercambio catiónico, como se describe por Rougeot et al. (1994) . La razón por la que se prefiere este tipo de purificación de péptido o proteína es la ausencia de subproductos formados en las muestras de elusión, lo cual hace que la proteína o péptido purificado resultante sea más apropiado para el uso terapéutico.

Producción de Mlsnl o de un fragmento de la misma La proteína Mlsnl o fragmentos de la misma se pueden preparar utilizando tecnología recombinante, líneas celulares o síntesis química. La tecnología recombinante y la síntesis química de la Mlsnl o de os fragmentos de la misma pueden permitir la modificación del gen que codifica para la Mlsnl para que incluya características tales marcas de reconocimiento, sitios de corte y modificaciones del polipéptido de Mlsnl o fragmentos del mismo. Para producir en forma eficiente el polipéptido, el sistema de expresión endógeno o el sistema de expresión recombinante deberán permitir que el polipéptido de Mlsnl sea expresado en, y transportado hacia, la superficie de la célula en una forma funcional o deberán permitir la producción de fragmentos de Mlsnl que puedan ser purificados. Las líneas celulares preferidas son aquellas que permiten niveles elevados de expresión de Mlsnl o de fragmentos de la misma. Tales líneas celulares incluyen líneas celulares que expresan en forma natural a Mlsnl o las líneas celulares comunes de mamífero que expresen a Mlsnl tales como las células CHO y las células COS, etc., o las líneas celulares del sistema inmune más específicas tales como las líneas de las células T. Sin embargo, también se pueden considerar otros tipos de células que se utilizan comúnmente en la producción de proteínas recombinantes tales como las células de insectos, células de anfibios tales como los ovocitos, líneas de células de levaduras y procarióticas tales como E. coli. La Mlsnl o fragmentos de la misma se pueden utilizar en una selección de ligandos ya sea como una proteína purificada, como una proteína quimérica tales como aquellas descritas en el despliegue de fagos, como una preparación (lípida o detergente) de membranas celulares, o en células intactas. Por lo tanto, el polipéptido de Mlsnl o los fragmentos del mismo, se pueden utilizar en un formato de selección funcional o en un formato de selección por unión a ligando. A continuación se proveen ejemplos de ambos formatos de selección.

Selección de ligandos para Mlsnl La presente invención también se refiere a métodos para seleccionar sustancias o moléculas útiles como ligandos que sean capaces de modular la actividad biológica del gen para Mlsnl o del producto del gen de la invención. Por ejemplo en enfermedades en las cuales existe una regulación negativa del sistema inmune y condiciones asociadas con la infección por virus y microorganismos, podría ser benéfico el mejoramiento de la actividad de Mlsnl. En condiciones tales como asma, inflamación y enfermedad del sistema inmune sería benéfico identificar ligandos que puedan regular en forma negativa la actividad del gen para Mlsnl. En este sentido, la invención describe ahora el uso de un producto del gen para Mlsnl para seleccionar un compuesto o compuestos que modulen la actividad de las células del sistema inmune, en particular células que presenten el antígeno, de manera más específica para seleccionar un compuesto o compuestos que modulen la actividad de los macrofagos, in vitro, ex vivo o in vitro. Esta invención describe también el uso de elementos promotores de Mlsnl para seleccionar compuestos que modulen la actividad de las células del sistema inmune, en particular de células que presenten el antígeno, de manera más específica para seleccionar un compuesto o compuestos que modulen la actividad de los macrofagos, in vi tro, ex vivo o in vi tro. Dentro de la presente invención se pueden utilizar varias pruebas de selección, tales como las pruebas de unión o las pruebas funcionales. En una modalidad particular, esta invención se refiere en forma más específica a métodos para seleccionar compuestos inmuno-moduladores , que comprenden: a) poner en contacto un compuesto de prueba con el gen para Mlsnl, con un producto del gen para Mlsnl o con un elemento promotor de Mlsnl y, b) medir la capacidad de dicho compuesto para interactuar con el gen para Mlsnl, con un producto del gen para Mlsnl o con un elemento promotor de la transcripción (es decir, pruebas de unión) . En otra modalidad, el método de selección comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que exprese a Mlsnl, de manera más particular una célula que presente el antígeno (o un macrófago) y, b) determinar la capacidad de dicho compuesto de prueba para afectar la actividad del gen para Mlsnl o de un producto del gen para Mlsnl dentro de las células. En una modalidad preferida, el método de selección comprende poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que exprese un gen reportero bajo control de los elementos promotores de transcripción de Mlsnl, de manera más particular una célula que presente el antígeno (o un macrófago) , expresar dicha construcción promotor/reportero y determinar la capacidad de dicho compuesto de prueba para modular la expresión del reportero. Las selecciones por unión de ligando al gen, polipéptido para Mlsnl, un fragmento del mismo o al elemento promotor de la transcripción de Mlsnl pueden permitir la identificación rápida de ligandos que puedan interactuar con el gen o sus productos. Se podría requerir de pruebas adicionales para determinar la actividad terapéutica de estos ligandos. El desarrollo de una selección funcional, con la cual se mide la actividad de Mlsnl (o se mide la actividad del reportero) después de unirse al ligando permite que se identifiquen en forma rápida los ligandos que modulan la actividad de Mlsnl. Esta invención también se refiere al uso del producto el gen para Mlsnl para seleccionar a cualquiera de las moléculas implicadas en la ruta del gen para Mlsnl, es decir para cualquier proteína o péptido que interactúe con Mlsnl. Se puede seleccionar a tales blancos (o compañeros de Mlsnl o moléculas de señalización) mediante técnicas de análisis de interacción proteína-proteína (por ejemplo el sistema de híbrido doble) , o cualquier otro método conocido por el experto en la técnica.

Método de selección por unión al ligando (despliegue de fago, flashplate) La selección por unión al ligando comprende, de preferencia, poner en contacto un compuesto de prueba con un producto del gen para lsnl o con el elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl y determinar la capacidad de dicho compuesto de prueba para interactuar con el producto del gen de Mlsnl o con el elemento o elementos promotores de la transcripción. En una modalidad típica, la selección por unión al ligando comprende poner en contacto a uno o varios compuestos de prueba (en paralelo) con un polipéptido de Mlsnl (por ejemplo, una proteína o fragmento del mismo) o con un elemento o elementos promotores de la transcripción, en presencia (o en ausencia, como referencia) de un ligando de Mlsnl o con un ligando del promotor de transcripción, y evaluar la capacidad del compuesto o compuestos de prueba para unirse al polipéptido o al elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl mediante evaluación de la unión al ligando.

El polipéptido de Mlsnl puede ser parte de una célula intacta, de una preparación de membrana o de un polipéptido purificado, unido en forma opcional a un soporte, tal como esferas, placa de columna, etc. De preferencia el polipéptido se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir de SEQ ID No. 1 a 22. El elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl pueden de preferencia, pero en forma no exclusiva, ser un ácido nucleico purificado, unido en forma opcional a un soporte, tal como esferas, placa de columna, etc. De preferencia el ácido nucleico que codifica para los elementos se caracteriza porque comprende secuencias de ácido nucleico que se seleccionan a partir de SEQ ID No. 41, 42 Ó 43. El compuesto de prueba puede ser un péptido o una proteína o un anticuerpo o entidad química, ya sea solo o en combinación o combinaciones, o en una mezcla con cualquier otra sustancia. El compuesto de prueba podría incluso representar un conjunto de compuestos. De manera opcional, el exceso de ligando no unido a Mlsnl se puede eliminar mediante separación. La separación puede tomar la forma de lavado/filtración o centrifugación (para convertir en pella a la proteína de Mlsnl) . En este último caso, el sobrenadante se puede eliminar después y la Mlsnl se puede volver a suspender en solución reguladora. La prueba de unión se realiza de preferencia en presencia de un ligando de Mlsnl o de un ligando del elemento promotor de transcripción, para permitir una evaluación de la actividad de unión de cada compuesto de prueba. En particular, en una modalidad preferida, se utiliza ligando de Mlsnl o un ligando del elemento promotor marcado y se determina la actividad de unión del compuesto de prueba evaluando cualquier modulación de la unión al ligando. El ligando se puede poner en contacto con el polipéptido o con el elemento promotor de transcripción de Mlsnl ya sea antes, simultáneamente o después del compuesto de prueba . Se debe poder detectar y/o cuantificar al ligando. Para lograr esto, se puede marcar al ligando en una variedad de maneras, tales como por ejemplo, con un cromóforo, un marcador radiactivo, fluorescente, fosforescente, enzimático o con un anticuerpo. Si el ligando no se , uede detectar en forma directa, éste debe ser susceptible de ser detectado y cuantificado mediante detección secundaria, la cual podría emplear las tecnologías anteriores. De preferencia (en el caso de ciertos métodos de detección) , el ligando no unido se elimina de la mezcla antes de realizar la detección de unión de ligando, como se describió anteriormente. De manera alternativa, el polipéptido de Mlsnl o fragmento del mismo o el elemento o elementos promotores de transcripción de Mlsnl pueden ser detectados o cuantificados . Esto se puede lograr en una manera similar a la antes descrita. Los ejemplos preferidos de dichos ligandos para Mlsnl que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen cualquier producto que sea conocido por interactuar con Mlsnl tal como un anticuerpo, un ligando o receptor fisiológico, o ligandos sintéticos o inhibidores de Mlsnl. Los ejemplos específicos de tales ligandos incluyen compuestos de tipo pirazol como los descritos en el documento WO 99/19303, el cual presenta el efecto inhibidor del canal de calcio dependiente de la liberación de calcio. Estos compuestos se pueden marcar de conformidad con diversas técnicas, incluyendo radioactividad o fluorescencia. Los compuestos más específicos son los compuestos SEW04225, M02940, KM03000 y GK02421 como se lista en el Catálogo de Fármacos de Prueba de Maybridge Co.

(RU, Cornwall, publicado en Agosto de 1995). Los ejemplos preferidos de ligandos para el elemento promotor de transcripción de Mlsnl que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen cualquier producto que sea conocido por interactuar con los elementos de promotor de Mlsnl, tales como polimerasas, anticuerpos otros ligandos que se presentan en forma natural o ligandos sintéticos. La unión de los compuestos de prueba moifica la interacción del lligando con el sitio de unión y cambia la afinidad de unión del ligando para/hacia su sitio de acción. La diferencia entre la cantidad observada de ligando ligado con relación a la cantidad teórica máxima de ligando ligado (o a la de ligando unido en ausencia de un compuesto de prueba bajo las mismas condiciones) es un reflejo de la capacidad de unión (y en forma opcional de la cantidad y/o afinidad) de un compuesto de prueba para unirse a Mlsnl o a sus elementos de promotor de transcripción. De manera alternativa, se puede determinar la cantidad de compuesto de prueba ligado a la proteína Mlsnl o un fragmento de la misma, o al elemento o elementos promotores de transcripción mediante una combinación de cromatografía y espectrometría de masas. También se puede determinar la cantidad de compuesto de prueba ligado a la proteína Mlsnl o un fragmento de la misma, o al elemento o elementos promotores de transcripción mediante medición directa del cambio de masa después de la unión del compuesto o ligando a Mlsnl o al elemento o elementos promotores de transcripción. Esto se puede lograr con tecnologías tales como Biacore (Amersham Pharmacia) . En forma alternativa, la proteína Mlsnl o un fragmento de la misma, el elemento o elementos de promotor, el compuesto o el ligando pueden estar marcados en forma fluorescente y se puede seguir la asociación de la proteína o el elemento o elementos de promotor de Mlsnl con el compuesto mediante los cambios en la Transferencia de Energía de Fluorescencia (FRET por sus siglas en inglés) .

Método de selección funcional Además de, o como reemplazo de la selección por unión, se podrían utilizar selecciones funcionales para identificar o caracterizar agentes inmuno-moduladores o moduladores de Mlsnl. Una selección funcional como tal se puede transferir en forma ventajosa hacia un rendimiento elevado, para permitir la selección de números grandes de compuestos de prueba. La selección funcional comprende esencialmente en poner en contacto una célula que exprese a Mlsnl con un compuesto de prueba, y evaluar la capacidad de dicho compuesto de prueba para afectar la ruta del gen para Mlsnl o la actividad del producto del gen para Mlsnl dentro de las células. Esto se puede realizar midiendo los flujos de calcio, el potencial (o perfil) de activación o la trayectoria de transducción de la señal (por ejemplo, nivel de expresión del gen celular seleccionado) dentro de dichas células . En una modalidad particular, la presente invención reside por lo tanto en un método para seleccionar (o para identificar o seleccionar o caracterizar) agentes inmuno-moduladores, que comprende (i) exponer una célula que exprese a Mlsnl a uno o a varios compuestos de prueba y (ii) detectar al compuesto que induzca una modulación del flujo de calcio o del potencial de activación en dichas células. En forma más preferida, las células son células recombinantes que expresan al polipéptido de Mlsnl, o células del sistema inmune, en particular células que presentan al antígeno, más preferido son macrófagos. En una primer variante preferida de esta modalidad, el método de selección funcional comprende los siguientes pasos: (1) obtener una célula recombinante que exprese al gen o al producto del gen para Mlsnl, (2) exponer dicha célula recombinante a una sustancia o molécula que va a ser probada; y (3) medir el cambio en el flujo de calcio o en el potencial de activación dentro de la célula recombinante expuesta . En una modalidad preferida, la célula expresa un polipéptido de Mlsnl funcional que comprende a toda o a una parte de SEQ ID No. 1, en particular un polipéptido que comprende una secuencia que se selecciona a partir de SEQ ID No. 1 a 22.

Flujo de calcio El flujo de calcio se puede medir de conformidad con diversas técnicas, tales como por ejemplo la utilización de colorantes sensibles al sodio tales como Fura II. En una modalidad particular, se seleccionan los compuestos respecto a su capacidad para ocasionar un incremento en la concentración de calcio dentro de la célula. En otra modalidad, se seleccionan los compuestos respecto a su capacidad para ocasionar un descenso en la concentración de calcio dentro de la célula. En forma alternativa, se seleccionan los compuestos respecto a su capacidad para alterar la velocidad de recuperación del canal de calcio.

Electro isiología En otra modalidad del método de selección funcional, se seleccionan las sustancias o moléculas de interés respecto a su capacidad para inducir cambios en el potencial de activación, en el tiempo de desactivación, o en la velocidad de recuperación del canal de sodio. Las moléculas o sustancias preferidas son aquellas que inducen una reducción en el potencial de desactivación, y/o una reducción en la velocidad de desactivación, y/o que reduce la velocidad de recuperación de la desactivación, en comparación con las mismas medidas realizadas en ausencia de la sustancia o molécula que se va a probar. En otra variante preferida, la selección funcional se basa en la medición de la expresión o actividad del gen seleccionado dentro de las células. En este sentido, la presente invención propone, por primera vez, seleccionar moduladores de Icrac tomando como base su capacidad para modificar el patrón de expresión de genes par iculares. De manera más preferida, los genes seleccionados se seleccionan a partir de genes para citocina (en particular para interleucina-2 , interleucina-8 , etc) y de genes para quimiocina (en particular para MlPa) . Por consiguiente, un método de selección preferido de esta invención comprende poner en contacto células que expresan a Mlsnl con uno o varios compuestos de prueba e identificar a los compuestos que ocasionan una modificación en la expresión o actividad de un gen seleccionado a partir de un gen para citosina o para quimiocina, dentro de dichas células expuestas. Se puede determinar la modificación en la expresión o actividad del gen evaluando la presencia o nivel (relativo) del producto del gen en la célula, en particular del ARNm o del polipéptido. Los polipéptidos podrían ser detectados o dosificados utilizando reactivos de afinidad, tales como anticuerpos (o fragmentos o derivados de los mismos) , ya sea dentro de las células o en la superficie celular, o en el medio de cultivo celular (o sobrenadante) . Se podrían evaluar los niveles de ARNm utilizando técnicas convencionales (iniciadores, sondas, etc.). En una modalidad específica, las células expuestas (o cualquier preparación derivada de las mismas tales como membranas, pellas, molécula de ARN, etc) se ponen en contacto con un soporte al cual están unidos los reactivos de afinidad particulares (anticuerpos o ácidos nucleicos) .

Promotor de transcripción-reportero En una modalidad adicional se puede utilizar una prueba para promotor-reportero para seleccionar compuestos que modulen la expresión de Mlsnl. Se coloca un gen reportero que codifica para una molécula reportera (es decir una molécula o moléculas que puedan ser detectadas en forma directa o indirecta) hacia el .extremo 3' con respecto a los ácidos nucleicos que codifican para el o los elementos de transcripción de Mlsnl. La posición y orientación de los cuales es tal que la expresión del gen reportero se inicia a partir del promotor de transcripción de Mlsnl. Los elementos de promotor de transcripción preferibles se eligen a partir de los ácido nucleicos codificados por SEQ ID No. 41, 42 ó 43. Los genes reporteros preferidos podrían ser aquellos que codifican para ß-galactosidasa, Proteína fluorescente Verde o Luciferaza funcionales. Sin embargo, se podrían utilizar muchas otras moléculas reporteras, cuyas identidades y características son conocidas por los expertos en la técnica. Se podría lograr la optimización adicional de la expresión del reportero incluyendo elementos adicionales de ácido nucleico, como se describió previamente.

Se puede medir la acción de los compuestos de prueba exponiendo estos compuestos a líneas celulares que expresen la construcción promotor-reportero. Los compuestos que regulan en forma negativa la acción de los elementos de promotor de Mlsnl se manifestarán por una reducción en la cantidad o actividad del reportero en la célula con relación a las células no tratadas con el compuesto. Los compuestos que regulan en forma positiva la acción de los elementos de promotor de Mlsnl se manifestarán por un incremento en la cantidad o actividad del reportero con relación a las células no tratadas con el compuesto . Los compuestos que modulan la cantidad del reportero o la actividad por otros medios podrían distinguirse de aquellos que no lo hacen mediante selección secundaria con líneas celulares similares que expresan al reportero sin elementos de promotor de transcripción de Mlsnl. Se podría considerar que los compuestos que modulan al reportero en la primera selección pero no en la segunda selección son mediadores de su acción ya sea en forma directa o indirecta a través de los elementos de promotor de transcripción de Mlsnl. Una prueba podría comprender los siguientes pasos: a) obtener una célula recombinante que exprese a una molécula reportera bajo el control de un promotor de transcripción de Mlsnl o de un gen para Mlsnl, b) exponer dicha célula recombinante a una sustancia o molécula que se va a probar; y medir el cambio en la expresión o actividad del reportero en dicha célula recombinante . De conformidad con una modalidad adicional, los compuestos activos se evalúan mediante su actividad in vi tro. Esta actividad se determina por ejemplo midiendo la CI50. La elección de los compuestos (llamados de aquí en adelante "impactos") a partir de la cual se desarrollan series de compuestos debe tomar en consideración parámetros tales como medición de la CI50, características estructurales de los "impactos", la posibilidad de alterar los sustituyentes, las propiedades fisico-químicas tales como solubilidad así como las características fisiológicas tales como la vida media y la biodisponibilidad... Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención es el uso de un compuesto activo ("impacto") como el identificado, seleccionado o caracterizado mediante el método de selección descrito previamente para preparar compuestos o composiciones farmacéuticas que se unan a, y/o que modulen la actividad biológica de Mlsnl.

Pruebas y estuches de diagnóstico Los inventores creen que la capacidad para detectar y medir la cantidad de Mlsnl en células del sistema inmune sería una herramienta valiosa para la prognosis de condiciones aberrantes de Mlsnl y de Icrac en humanos. Los inventores creen que se podría lograr la detección de Mlsnl en células del sistema inmune midiendo la cantidad de ácido nucleico para Mlsnl expresado en las células del sistema inmune. Esto se podría lograr utilizando un procedimiento de pasos múltiples: (a) obtener una muestra (pequeña) de sangre a partir de un paciente (de volumen conocido) , (b) en forma opcional separar las células del sistema inmune de los otros componentes de la sangre. Esto se consigue mediante centrifugación y/o cromatografía de afinidad . (c) transcribir a la inversa el ARN celular hasta ADNc utilizando protocolos similares a los descritos en los ejemplos, (d) amplificar el ácido nucleico para Mlsnl obtenido en el paso (c) mediante PCR con una pluralidad de oligonucleótidos específicos para Mlsnl que se puedan hibridar, bajo condiciones astringentes a los ácidos nucleicos para Mlsnl. En los ejemplos se han señalado tales oligonucleótidos y condiciones de amplificación. (e) caracterizar el producto de PCR. Una manera de identificar la presencia de un producto de PCR específico para Mlsnl sería el someter una alícuota de ácido nucleico amplificado a electroforesis en gel de agarosa. Dicha tecnología ha sido señalada en los ejemplos. Esta prueba se podría utilizar para determinar si Mlsnl está siendo expresada en las células del sistema inmune, brindando de esta forma una indicación valiosa en la prognosis de trastornos asociados con la función aberrante de Icrac. Además, sería de gran ayuda poder cuantificar en forma precisa el nivel de expresión de Mlsnl en las células del sistema inmune en la prognosis de la gravedad de un trastorno asociado con Icrac. Se podría lograr la cuantificación incluyendo pasos adicionales. Estos pasos adicionales podrían requerir evaluar una cantidad conocida de ácido nucleico que codifique para Mlsnl. La electroforesis conjunta de muestras que no han sido sometidas a productos sanguíneos pero que han sido "picadas" (spiked) con concentraciones conocidas de ácidos nucleicos que codifiquen para Mlsnl de humano tales como SEQ ID No. 23 o fragmentos de la misma, o con secuencias complementarias a la misma con la muestra de prueba, podría permitir la identificación y cuantificación de los niveles de Mlsnl en la muestra de sangre. En la siguiente sección experimental, la cual debe considerarse como ilustrativa y no como limitación del campo de protección, se describirán otros aspectos y ventajas de la presente invención.

EJEMPLOS 1. Un producto del gen para Mlsnl se expresa en células U937 de humano Se prepararon genotecas de ADNc a partir de células U937 (refiriéndose a estas células como células no diferenciadas) y de células U937 diferenciadas con dbcAMP (48 horas) utilizando el sistema SMART de Clontech (K1052-1) . En breve, se cultivaron células U937 en suspensión en medios de cultivo (RPMI 1640 más 10% de FBS inactivado con calor) a 37°C en 5% de C02, en presencia y en ausencia del agente para diferenciación (dbcAMP, concentración ?µ?) (48 horas) . Las células diferenciadas y no diferenciadas se cosecharon mediante centrifugación a l,200g durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante de la pella y se extrajo el ARN celular utilizando el estuche FastTrack 2.0 (Invitrogen) . Se preparó una genoteca SMART a partir de las células diferenciadas y no diferenciadas de conformidad con los protocolos de Clontech. Estas genotecas se utilzaron para determinar la abundancia relativa de ADNc para Mlsnl en las genotecas. Se diseñaron dos pares de iniciadores anidados para seleccionar el ADNc para Mlsnl en las genotecas anteriores. La secuencia de estos iniciadores es como sigue: Iniciador la (SEQ ID No. 44) : TGAAGTAAAATCAATATCCAACCAGG Iniciador Ib (SEQ ID No. 45) : GCACTGCTCCTCGAACTCATGCAGCC Iniciador 2a (SEQ ID No. 46) : TCCAACCAGGTGTGGAAGTTCCAGCG Iniciador 2b (SEQ ID No. 47) : GGAAGTGCTCCTGCACGCACTGCTCC Bajo las siguientes condiciones de PCR: Todas las reacciones de PCR se realizaron utilizando el estuche para PCR de ADNc Advantage (#K1905-1) en las condiciones de solución reguladora del proveedor. La concentración de iniciador para PCR fue de 20 fmol/iniciador/100 µ? de reacción. La concentración de la plantilla de ADNc fue 0.2µg. Las reacciones de PCR se realizaron como ciclos de dos pasos (desnaturalización 95°C durante 30 segundos, para templado/alargamiento 68 °C durante 6 minutos) . Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio (0.5µg ml) . La PCR anidada utilizando el par de iniciadores de SEQ ID No. 44 y 47 y el par anidado de SEQ ID No. 45 y 46 indicó la expresión de Mlsnl en células U937. Los experimentos similares indicaron la expresión de Mlsnl en células Jurkat y U-812. La presencia de la expresión de Mlsnl en estas genotecas se confirmo también utilizando iniciadores para PCR anidados, SEQ ID No. 44 y 46 junto con el iniciador CDS III/3 de las genotecas de ADNc SMART (Estuche de PCR para ADNc Advantage (#K1905-1)) . Se obtuvo un producto de PCR de 2 kb (figura 2) . Este correspondió con el tamaño pronosticado de un producto de PCR para Mlsnl e indicó que el gen que codifica para Mlsnl se estaba expresando en las líneas de células U937 diferenciadas y no diferenciadas. Sin embargo, la intensidad de la banda correspondiente al producto de PCR para Mlsnl fue mayor en la genoteca de célula diferenciada que la de la genoteca de célula no diferenciada. Estos resultados indican que el ADNc para Mlsnl estaba presente en las líneas de células U937 y que esta expresión de Mlsnl fue más pronunciada en las líneas de células U937 diferenciadas hasta un fenotipo de macrófago. 2. Expresión de MLSNl(TrpC8) se incrementa en forma diferencial en células U937 (de tipo macrófago) tratadas con dbcAMP Se determinó la abundancia relativa de ácido nucleico que codifica para Mlsnl en líneas de células U937 no diferenciadas y diferenciadas con dbcAMP. En breve, se cultivaron células U937 no diferenciadas y diferenciadas con dbcAMP y se cosecharon como se describió anteriormente, y las genotecas de ADNc sustraídas se prepararon utilizando el estuche PCR Select de Clontech ( 1804-1) y los protocolos del mismo. Esta tecnología permite el enriquecimiento selectivo de los genes expresados en forma diferencial entre las líneas de células diferenciadas y no diferenciadas. Después de la sustracción con PCR, se utilizó un par de iniciadores específicos para Mlsnl (SEQ ID No. 44 y 47) para amplificar los fragmentos de ADNc a partir de Mlsnl proveniente de mezclas y controles sustraídos utilizando el estuche de PCR para ADNc Advantage, bajo las condiciones del proveedor como ciclos de dos pasos (95°C durante 30 segundos, 68°C durante 1 minuto para templado/alargamiento) (figura 3 ) . La sustracción de avance de ácido nucleico de células diferenciadas con ácido nucleico de células no diferenciadas dio como resultado un producto de PCR específico para Mlsnl fuerte. La sustracción por retroceso de las células no diferenciadas con las células diferenciadas dio como resultados cantidades no detectables de producto de PCR. Este resultado indica que existe una expresión mayor del gen para Mlsnl en las células U937 diferenciadas que en las células U937 no diferenciadas. Este resultado se correlaciona con la observación que el fenotipo Icrac se incrementa durante el tratamiento con dbcAMP de la línea de células U937 hacia un fenotipo más del tipo de macrófago. Los inventores concluyen que la aparición de un fenotipo Icrac en las células U937 diferenciadas con dbcAMP corresponde con un incremento en la expresión de Mlsnl. 3. Regulación negativa de la entrada de calcio en células U937 (de tipo macrófago) tratadas con dbcAMP utilizando anti-sentido de Mlsnl Se cultivaron células U937 a 37°C en 5% de C02 en RPMI 1640, 10% de FBS inactivado con calor. Las células se incubaron en ausencia o en presencia de 0 , 1 ó 10 µ? de ácido nucleico antisentido de Mlsnl (SEQ ID No. 26) , 4 horas antes de y 48 horas durante el tratamiento de diferenciación con dbcAMP. Todos los oligonucleótidos utilizados en este experimento contenían modificaciones de tipo fosforotiorato en sus primeros dos y en sus últimos dos enlaces (enlace terminal en los extremos 5' y 3')- Se utilizó un oligonucleótido revuelto (5 'CTGGTGGAAGAAGAGGACGTCCAT3 , SEQ ID No. 48) a una concentración 10 µ? en las mismas condiciones que el control negativo. Se utilizó otro oligonucleótido contra FcvRII (CD 32) (5 'TCTGGGACATACATTCTGAGACAT3 ' , SEQ ID No. 49) a una concentración de 10 µ en las mismas condiciones que las del control positivo para la absorción de anti-sentido. La diferenciación inducida con dbcAMP se controló mediante inmunofluorescencia utilizando cuantificación FACS de CD 32 y de CD 64, así como de la señalización de Ca2+ después de la estimulación con Tapsigargin, antes y después del tratamiento con dbcAMP utilizando fura 2 y fluorimetría . Se midió el Ca2* intracelular después de la estimulación con ionomicina durante el análisis FACS. Las células se cargaron con 2 µg/ l de indo-1 durante 30 minutos a 37°C, 5% e C02 en RPMI, 2 mg/ml de BSA. Las células se activavron después con 2 µ /??1 de ionomicina. Se midieron las variaciones de la concentración de calcio intracelular inducidas por ionomicina utilizando citometría de flujo (figura 4) . Se cuantificó la expresión de CD 32 mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-CD32 marcado con FITC utilizando citometría de flujo. La comparación de las figuras 4a) y 4b) muestra la aparición de una corriente de calcio perdurable cuando las células U937 se diferencian con dbcAMP. La comparación de las figuras 4b) y 4c) muestra una inhibición no específica de la corriente de calcio perdurable debido a las condiciones de tratamiento con antisentido. La comparación de las figuras 4c) y 4d) muestra una inhibición específica de la corriente de calcio perdurable debido a 1 µ? de antisentido de Mlsnl. La comparación de las figuras 4c) y 4e) muestra una inhibición específica de la corriente de calcio perdurable debido a 10 µ? de antisentido de Mlsnl. La diferencias inducidas por la diferenciación con dibutirato-AMPc en las respuestas del flujo de calcio sobre las células U937 después de la estimulación con 2 ng/ml de ionomicina (R2 fue de 3% en el tipo silvestre contra 29% después de la diferenciación con DBC. En particular, Aún cuando la condición antisentido (ausencia de antisentido mismo) afectó el nivel de diferenciación (R2 fue 29% contra 23%) , parece ser que el tratamiento con antisentido de Mlsnl reduce la expresión de la población R2 en una forma relacionada con la dosis, R2 se desplazó desde el 23% hasta el 17% y 14 % de conformidad con el control antisentido, 1 µ? y 10 µ? de tratamiento de antisentido de Mlsnl respectivamente. Estos datos muestran la existencia de un flujo perdurable de calcio después de diferenciar las células U937 con DBC con un 39% de inhibición de esta inducción típica del flujo de calcio después del tratamiento con 10 µ? de antisentido de Mlsnl. Se demostró que el tratamiento con dbcAMP incrementa el Ca2+ intracelular después de la estimulación de conformidad con Floto et al. Los resultados demuestran que los cultivos tratados con oligonucleótido de an isentido tienen una reducción en su señal de calcio de aproximadamente 40%. Este experimento con antisentido demuestra que la regulación negativa de los oligonucleotidos antisentido para la expresión de Mlsnl da como resultado un fenotipo Icrac disminuido en las líneas de células U937. Este resultado demuestra también que el ácido nucleico antisentido específico para Mlsnl puede regular en forma negativa al fenotipo Icrac.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Warner-Lambert <120> IDENTIFICACION DE UN CANAL DE CALCIO CAPACITIVO EN CELULAS QUE PRESENTAN EL ANTIGENO Y OSOS DEL MISMO <130> Mlsnl (310800) <140> <141> <160> 49 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1533 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr lie Arg Val Ser Tyr Asp Thr Lys Pro Asp Ser Leu Leu His 1 5 10 15 Leu Met. Val Lys Asp Trp Gln Leu Glu Leu Pro Lys Leu Leu lie Ser 20 " 25 30 Val His Gly Gly Leu Gln Asn Phe Glu Met Gln Pro Lys Leu Lys Gln 35 40 45 Val Phe Gly Lys Gly Leu lie Lys Ala Ala Met Thr Thr Gly Ala Trp 50 55 60 lie Phe Thr Gly Gly Val Ser Thr Gly Val lie Ser His Val Gly Asp 65 70 75 B0 Ala Leu Lys Asp His Ser Ser Lys Ser Arg Gly Arg Val Cys Ala lie 85 90 95 Gly lie Ala Pro Trp Gly lie Val Glu Asn Lys Glu Asp Leu Val Gly 100 105 110 Lys Asp Val Thr Arg Val Tyr Gln Thr Met Ser Asn Pro Leu Sur Lys 115 120 125 Leu Ser Val Leu Asn Asn Ser His Thr His Phe lie Leu Ala Asp Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Gly Lys Tyr Gly Ala Glu Val Lys Leu Arg Arg Leu Leu 145 !50 155 160 Glu Lys His lie Ser Leu Gln Lys lie Asn Thr Arg Leu Gly Gln Gly 165 170 175 Val Pro Leu Val Gly Leu Val Val Glu Gly Gly Pro Asn Val Val Ser 180 185 190 lie Val Leu Glu Tyr Leu Gln Glu Glu Pro Pro lie Pro Val Val lie 195 200 205 Cys Asp Giy Ser Gly Arg Ala Ser Asp He Leu Ser Phe Ala His Lys 210 215 220 Tyr Cys Glu Glu Gly Gly He He Asn Glu Ser Leu Arg Glu Gln Leu 225 230 235 240 Leu Val Thr He Gln Lys Thr Phe Asn Tyr Asn Lys Ala Gln Ser His 245 250 255 Glr. Leu Phe Ala He He Met Glu Cys Met Lys Lys Lys Glu Leu Val 260 265 270 Thr Val Phe Arg Met Gly Ser Glu Gly Gln Gln Asp He Glu Met Ala 275 280 285 He Leu Thr Ala Leu Leu Lys Gly Thr Asn Val Ser Ala Pro Asp Gln 290 295 300 Leu Ser Leu Ala Leu Ala Trp Asn Arg Val Asp He Ala Arg Ser Gln 305 310 315 320 He Phe Val Phe Gly Pro His Trp Thr Pro Leu Gly Ser Leu Ala Pr 325 330 335 Pro Thr Asp Ser Lys Ala Thr Glu Lys Glu Lys Lys Pro Pro Met Al 340 345 350 Thr Thr Lys Gly Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Lys 355 360 365 Val Lys Glu Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp Pro Arg Lys He Glu Leu 370 375 380 Leu Asn Trp al Asn Ala Leu Glu Gln Ala Met Leu Asp Ala Leu Val 3S5 390 395 400 Leu Asp Arg Val Asp Phe Val Lys Leu Leu He Glu Asn Gly Val Asn 405 410 415 Met Gln His Phe Leu Thr He Pro Arg Leu Glu Glu Leu Tyr Asn Thr 420 425 430 Arg Leu Gly Pro Pro Asn Thr Leu His Leu Leu Val Arg Asp Val Lys 435 440 445 Lys Ser Asn Leu Pro Pro Asp Tyr His He Ser Leu He Asp He Gly 450 455 460 Leu Val Leu Glu Tyr Leu Met Gly Gly Ala Tyr Arg Cys Asn Tyr Thr 465 470 475 480 Arg Lys As. Phe Arg Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Phe Gly Pro Lys Arg 485 490 495 Pro Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly Met Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala 500 505 510 Lys Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu He Asp lie 515 520 525 Asp Val Asp Asp Pro Ala Val Ser Arg Phe Gln Tyr Pro Phe His Glu 53C 535 540 Leu Mee Val Trp Ala Val Leu Met Lys Arg Gln Lys Met Ala Val Phe 545 550 555 560 Leu Trp Gln Arg Gly Glu Glu Ser Met Ala Lys Ala Leu Val Ala Cys 565 570 575 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ala His Glu Ser Ser Glu Ser Asp Leu Val 580 585 590 Asp Asp lie Ser Gln Asp Leu Asp Asn Asn Ser Lys Asp Phe Gly Gln 595 600 605 Leu Ala Leu Glu Leu Leu Asp Gln Ser Tyr Lys His Asp Glu Gln lie 610 615 620 Ala Met Lys Leu Leu Thr Tyr Glu Leu Lys Asn Trp Ser Asn Ser Thr 625 630 635 64C Cys Leu Lys Leu Ala Val Ala Ala Lys His Arg Asp Phe lie Ala His 645 650 655 Thr Cys Ser Gln Met Leu Leu Thr Asp Met Trp Met Gly Arg Leu Arg 660 665 670 Met Arg Lys Asn Pro Gly Leu Lys Val lie Met Gly lie Leu Leu Pro 675 680 685 Pro Thr lie Leu Phe Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Asp Asp Phe Ser Tyr 690 695 700 Gln Thr Ser Lys Glu Asn Glu Asp Gly Lys Glu Lys Glu Glu Glu Asn 705 710 715 720 Thr Asp Ala Asn Ala Asp Ala Gly Ser Arg Lys Gly Asp Glu Glu Asn 725 730 735 Glu His Lys Lys Gln Arg Ser Tle Pro lie Gly Thr Lys lie Cys Glu 740 745 750 Phe Tyr Asn Ala Pro lie Val Lys Phe Trp Phe Tyr Thr lie Ser Tyr 755 760 765 Leu Gly Tyr Leu Leu Leu Phe Asn Tyr Val tle Leu Val Arg Met Asp 770 775 780 Gly Trp Pro Ser Leu Gln Glu Trp lie Val lie Ser Tyr lie Val Ser 785 790 795 B00 Leu Ala Leu Glu Lys l e Arg Glu lie Leu Met Ser Glu Pro Gly Lys 805 810 815 Leu Ser Gln Lys lie Lys Val Trp Leu Gln Glu Tyr Trp Asn lie Thr 820 825 830 Asp Leu Val Ala lie Ser Thr Phe Met lie Gly Ala lie Leu Arg Leu 835 840 B45 Gln Asn Gln Pro Tyr Met Gly Tyr Gly Arg Val lie Tyr Cys Val Asp S5C 855 860 lie lie Phe Trp Tyr He Arg Val Leu Asp lie Phe Gly Val Asn Lys 865 870 875 880 Tyr Leu Gly Pro Tyr Val Met Met lie Gly Lys Met Met He Asp Met 885 890 895 Leu Tyr Phe Val Val He Met Leu Val Val Leu Met Ser Phe Gly Val 900 905 910 Ala Arg Gln Ala He Leu His Pro Glu Glu Lys Pro Ser Trp Lys Leu 915 920 925 Ala Arg Asn He Phe Tyr Met Pro Tyr Trp Met He Tyr Gly Clu Val 930 935 940 Phe Ala Asp Gln He Asp Leu Tyr Ala Met Glu He Asn Pro Pro Cys 945 950 955 960 Gly Glu Asn Leu Tyr Asp Glu Glu Gly Lys Arg Leu Pro Pro Cys He 965 970 975 Pro Gly Ala Trp Leu Thr Pro Ala Leu Met Ala Cys Tyr Leu Leu Val 980 985 990 Ala Asn He Leu Leu Val Asn Leu Leu lie Ala Val Phe Asn Asn Thr 995 1000 1005 Phe Phe Glu Val Lys Ser He Ser Asn Gln Val Trp Lys Phe Glr. Arg 1010 1015 1020 Tyr Gln Leu He Met Thr Phe His Asp Arg Pro Val Leu Pro Pro Pro 1025 1030 1035 1040 Met He He Leu Ser His He Tyr He He He Met Arg Leu Ser Gly 1045 1050 1055 Arg Cys Arg Lys Lys Arg Glu Gly Asp Gln Glu Glu Arg Asp Arg Gly 1060 1065 1070 Leu Lys Leu Phe Leu Sez Asp Glu Glu Leu Lys Arg Leu His Glu Phe 1075 1060 1085 Glu Glu Gln Cys Val Gln Glu His Phe Arg Glu Lys Glu Asp Glu Gln 1090 1095 1100 Gln Ser Ser Ser Asp Glu Arg He Arg Val Thr Ser Glu Arg Val Glu 1105 1110 1115 1120 Asn Met Ser Met Arg Leu Glu Glu He Asn Glu Arg Glu Thr Phe Met 1125 1130 1135 Lys Thr Ser Leu Gln Thr Val Asp Leu Arg Leu Ala Gln Leu Glu Glu 1140 1145 1150 Leu Ser Asn Arg Met Val Asn Ala Leu Glu Asn Leu Ala Gly He Asp 1155 1160 1165 Arg Ser Asp Leu lie Gln Ala Arg Ser Arg Ala Ser Ser Glu Cys Glu 1170 1?5 1180 Ala Thr Tyr Leu Leu Arg Gln Ser Ser lie Asn Ser Ala Asp Gly Tyr 1185 1190 1195 1200 Ser Leu Tyr Arg Tyr His Phe Asn Gly Glu Glu Leu Leu Phe Glu Asp 1205 1210 121b Thr Ser Leu Ser Thr Ser Pro Gly Thr Gly Val Arg Lys Lys Thr Cys 1220 1225 1230 Ser Phe Arg lie Lys Glu Glu Lys Asp Val Lys Thr His Leu Val Pro 1235 1240 1245 Glu Cys Gln Asn Ser Leu His Leu Ser Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ala 1250 1255 1260 Thr Pro Asp Gly Ser His Leu Ala Val Asp Asp Leu Lys Asn Ala Glu 1265 1270 1275 1280 Glu Ser Lys Leu Gly Pro Asp lie Gly lie Ser Lys Glu Asp Asp Glu 1285 1290 1295 Arg Gln Thr Asp Ser Lys Lys Glu Glu Thr lie Ser Pro Ser Leu Asn 1300 1305 1310 Lys Thr Asp Val lie His Gly Gln Asp Lys Ser Asp Val Gln Asn Thr 1315 1320 1325 Gln Leu Thr Val Glu Thr Thr Asn lie Glu Gly Thr lie Ser Tyr Pro 1330 1335 1340 Leu Glu Glu Thr Lys lie Thr Arg Tyr Phe Pro Asp Glu Thr lie Asn 1345 1350 1355 1360 Ala Cys Lys Thr Met Lys Ser Arg Ser Phe Val Tyr Ser Arg Gly Arg 1365 1370 1375 Lys Leu Val Gly Gly Val Asn Gln Asp Val Glu Tyr Ser Ser lie Thr 1380 1385 1390 Asp Gln Gln Leu Thr Thr Glu Trp Gln Cys Gln Val Gln Lys lie Thr 1395 1400 1405 Arg Ser fiis Ser Thr Asp lie Pro Tyr lie Val Ser Glu Ala Ala Val 1410 1415 1420 Gln Ala Glu Gln Lys Glu Gln Phe Ala Asp Met Gln Asp Glu His His 1425 1430 1435 1440 Val Ala Glu Ala lie Pro Arg lie Pro Arg Leu Ser Leu Thr lie Thr 1445 1450 1455 Asp Arg Asn Gly Met Glu Asn Leu Leu Ser Val Lys Pro Asp Gln Thr 1460 1465 1470 Leu Gly Phe Pro Ser Leu Arg Ser Lys Ser Leu His Gly His P?o Arg 1475 1480 1485 Asn Val Lys Ser lie Gin Gly Lys Leu Asp Arg Ser Gly His Ala Ser 1490 1495 1500 Ser Val Ser Ser Leu Val lie Val Ser Gly Met Thr Aia Glu Glu Lys 1505 1510 1515 1520 Lys Val Lys Lys Glu Lys Ala Ser Thr Glu Thr Glu Cys 1525 1530 <210> 2 <211> 756 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Tyr lie Arg Val Ser Tyr Asp Thr Lys Pro Asp Ser Leu Leu His 1 5 10 15 Leu Mee Val Lys Asp Trp Gln Leu Glu Leu Pro Lys Leu Leu lie Ser 20 25 30 Val His Gly Gly Leu Gln Asn Phe Glu Met Gln Pro Lys Leu Lys Gln 35 40 45 Val Phe Gly Lys Gly Leu lie Lys Ala Ala Met Thr Thr Gly Ala Trp 50 55 60 lie Phe Thr Gly Gly Val Ser Thr Gly Val lie Ser His Val Gly Asp 65 70 75 B0 Ala Leu Lys Asp His Ser Ser Lys Ser Arg Gly Arg Val Cys Ala lie 85 90 95 Gly lie Ala Pro Trp Gly lie Val Glu Asn Lys Glu Asp Leu Vai Gly 100 105 110 Lys Asp al Thr Arg Val Tyr Gln Thr Met Ser Asn Pro Leu Ser Lys 115 120 125 Leu Ser Val Leu Asn Asn Ser His Thr His Phe lie Leu Ala Asp Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Gly Lys Tyr Gly Ala Glu Val Lys Leu Arg Arg Leu Leu 145 150 155 ICO Glu Lys His lie Ser Leu Gln Lys lie Asn Thr Arg Leu Gly Gln Gly 165 170 175 Val Pro Leu Val Gly Leu Val Val Glu Gly Gly Pro Asn Val Val Ser 180 185 190 lie Val Leu Glu Tyr Leu Gln Glu Glu Pro Pro lie Pro Val Val He 155 200 205 Cys Asp Gly Ser Gly Arg Ala Ser Asp He Leu Ser Phe Aia His Lys 210 215 220 Tyr Cys Glu Glu Gly Gly He He Asn Glu Ser Leu Arg Glu Gln Leu -25 230 235 40 Leu Val Thr lie Gln Lys Thr Phe Asn Tyr Asn Lys Ala Glr. Ser His 245 250 2bb Gln Leu Phe Ala lie lie Met Glu Cys Met Lys Lys Lys Glu Leu Val 260 265 270 Thr Val Phe Arg Met Gly Ser Glu Gly Gln Gln Asp lie Glu Met Aid 275 280 285 lie Leu Thr Ala Leu Leu Lys Gly Thr Asn Val Ser Ala Pro Asp Gln 290 295 300 Leu Ser Leu Ala Leu Ala Trp Asn Arg Val Asp lie Ala Arg Ser Gln 305 310 315 320 lie Phe Val Phe Gly Pro His Trp Thr Pro Leu Gly Ser Leu Ala Pro 325 330 33b Pro Thr Asp Ser Lys Ala Thr Glu Lys Glu Lys Lys Pro Pro Met Ala 340 345 350 Thr Thr Lys Gly Giy Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Lys 355 360 365 Val Lys Glu Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp Pro Arg Lys lie Glu Leu 370 375 380 Leu Asn Trp Val Asn Ala Leu Glu Gln Ala Met Leu Asp Ala Leu Val 385 " 390 395 400 Leu Asp Arg Val Asp Phe Val Lys Leu Leu lie Glu Asn Gly Val Asn 405 410 415 Met Gln His Phe Leu Thr lie Pro Arg Leu Glu Glu Leu Tyr Asn Thr 420 425 430 Arg Leu Gly Pro Pro Asn Thr Leu His Leu Leu Val Arg Asp Val Lys 435 440 445 Lys Ser Asn Leu Pro Pro Asp Tyr His lie Ser Leu lie Asp lie Gly 450 455 460 Leu Val Leu Glu Tyr Leu Met Gly Gly Ala Tyr Arg Cys Asn Tyr Thr 465 470 475 480 Arg Lys Asn Phe Arg Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Phe Gly Pro Lys Arg 485 490 4¾5 Pro Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly Met Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala 500 505 510 Lys Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu lie Asp lie 515 520 525 Asp Val Asp Asp Pro Ala Val Ser Arg Phe Gln Tyr Pro Phe His Glu 530 535 540 Leu Met Val Trp Ala Val Leu Met Lys Arg Gln Lys Met Ala Val Phe 545 550 555 3b Leu Trp Gln Arg Gly Glu Glu Ser Met Ala Lys Ala Leu Val Ala Cys 565 570 S7=> Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ala His Glu Ser Ser Glu Ser Asp Leu Val 580 585 590 Asp Asp lie Ser Gln Asp Leu Asp Asn Asn Ser Lys Asp Phe Gly Gln 595 600 605 Leu Ala Leu Glu Leu Leu Asp Gln Ser Tyr Lys His Asp Glu Gln lie 610 615 620 Ala Met Lys Leu Leu Thr Tyr Glu Leu Lys Asn Trp Ser Asn Ser Thr 625 630 635 640 Cys Leu Lys Leu Ala Val Ala Ala Lys His Arg Asp Phe lie Ala His 645 650 655 Thr Cys Ser Gln Met Leu Leu Thr Asp Met Trp Met Gly Arg Leu Arg 660 665 670 Met Arg Lys Asn Pro Gly Leu Lys Val lie Met Gly lie Leu Leu Pro 675 680 685 Pro Thr lie Leu Phe Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Asp Asp Phe Ser Tyr 690 695 700 Glr. Thr Ser Lys Glu Asn Glu Asp Gly Lys Glu Lys Glu Glu Glu Asn 705 710 715 720 Thr Asp Ala Asn Ala Asp Ala Gly Ser Arg Lys Gly Asp Giu Glu Asn 725 730 735 Glu His Lys Lys Gln Arg Ser lie Pro lie Gly Thr Lys lie Cys Glu 740 745 750 Phe Tyr Asn Ala 755 <210> 3 <2l > 761 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Tyr lie Arg Val Ser Tyr Asp Thr Lys Pro Asp Ser Leu Leu His 1 5 10 1 Leu Met Val Lys Asp Trp Gln Leu Glu Leu Pro Lys Leu Leu lie Ser 20 25 30 Val His Gly Gly Leu Gln Asn Phe Glu Met Gln Pro Lys Leu Lys Gln 35 40 45 Val Phe Gly Lys Gly Leu lie Lys Ala Ala Met Thr Thr Gly Ala Trp 50 55 60 lie Phe Thr Gly Gly Val Ser Thr Gly Val lie Ser His Val Gly Asp 65 70 75 80 Ala Leu Lys Asp His Ser Ser Lys Ser Arg Gly Arg Val Cys Ala lie 85 90 95 Gly lie Ala Pro Trp Gly lie Val Glu Asn Lys Glu Asp Leu Val Gly 100 105 110 Lys Asp Val Thr Arg Val Tyr Gln Thr Met Ser Asn Pro Leu Ser Lys 115 120 125 Leu Ser Val Leu Asn Asn Ser His Thr His Phe lie Leu Ala Asp Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Gly Lys Tyr Gly 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Lys Gly Lys Lys Lys Gly Lys 355 360 365 Val Lys Glu Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp Pro Arg Lys He Glu Leu 370 375 380 Leu Asn Trp Val Asn Ala Leu Glu Gln Ala Met Leu Asp Ala Leu Val 385 390 395 400 Leu Asp Arg Val Asp Phe Val Lys Leu Leu lie Glu Asn Gly Val Asn 405 410 415 Met Gln His Phe Leu Thr lie Pro Arg Leu Glu Glu Leu Tyr Asn Thr 420 425 430 Arg Leu Gly Pro Pro Asn Thr Leu His Leu Leu Val Arg Asp Val Lys 435 440 445 Lys Ser Asn Leu Pro Pro Asp Tyr His lie Ser Leu lie Asp lie Gly 450 455 460 Leu Val Leu Glu Tyr Leu Met Gly Gly Ala Tyr Arg Cys Asn Tyr Thr 465 470 475 480 Arg Lys Asn Phe Arg Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Phe Gly Pro Lys Arg 485 490 495 Pro Lys Ala Leu Lys Leu Leu Gly Met Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala 500 505 510 Lys Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu lie Asp lie 515 520 525 Asp Val Asp Asp Pro Ala Val Ser Arg Phe Gln Tyr Pro Phe His Glu 530 535 540 Leu Met Val Trp Ala Val Leu Met Lys Arg Gln Lys Met Ala Val Phe 545 550 555 560 Leu Trp Gln Arg Gly Glu Glu Ser Met Ala Lys Ala Leu Val Ala Cys 565 570 575 Lys Leu Tyr Lys Ala Met Ala His Glu Ser Ser Glu Ser Asp Leu Val 580 585 590 Asp Asp lie Ser Gln Asp Leu Asp Asn Asn Ser Lys Asp Phe Gly Gln 595 600 605 Leu Ala Leu Glu Leu Leu Asp Gln Ser Tyr Lys His Asp Glu Gln lie 610 615 620 Ala Met Lys Leu Leu Thr Tyr Glu Leu Lys Asn Trp Ser Asn Ser Thr 625 630 635 640 Cys Leu Lys Leu Ala Val Ala Ala Lys His Arg Asp Phe lie Ala His 645 650 655 Thr Cys Ser Gln Met Leu Leu Thr Asp Met Trp Met Gly Arg Leu Arg 660 665 670 Met Arg Lys Asn Pro Gly Leu Lys Val lie Met Gly lie Leu Leu Pro 675 680 685 Pro Thr lie Leu Phe Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Asp Asp Phe Ser Tyr 690 695 700 uo Gln Thr Ser Lys Glu Asn Glu Asp Gly Lya Glu Lys Glu Glu Glu Asn 705 710 715 720 Thr Asp Ala Asn Ala Asp Ala Gly Ser Arg Lys Gly Asp Glu Glu Asn 725 730 735 Glu Hls Lys Lys Gln Arg Ser lie Pro lie Gly Thr Lys lie Cys Glu 740 745 750 Phe Tyr Asn Ala Pro lie Val Lys Phe 755 760 <210> 4 <211> 518 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Asn Gln Val Trp Lys Phe Gln Arg Tyr Gln Leu lie Met Thr Phe 1 5 10 15 His Asp Arg Pro Val Leu Pro Pro Pro Met lie lie Leu Ser His lie 20 25 30 Tyr lie lie lie Met Arg Leu Ser Gly Arg Cys Arg Lys Lys Arg Glu 35 40 45 Gly Asp Gln Glu Glu Arg Asp Arg Gly Leu Lys Leu Phe Leu Ser Asp 50 55 60 Glu Glu Leu Lys Arg Leu His Glu Phe Glu Glu Gln Cys Val Gln Glu 65 70 75 80 Hls Phe Arg Glu Lys Glu Asp Glu Gln Gln Ser Ser Ser Asp Glu Arg 85 90 95 lie Arg Val Thr Ser Glu Arg Val Glu Asn Met Ser Met Arg Leu Glu 100 105 110 Glu lie Asn Glu Arg Glu Thr Phe Met Lys Thr Ser Leu Gln Thr Val 115 120 125 Asp Leu Arg Leu Ala Gln Leu Glu Glu Leu Ser Asn Arg Met Val Asn 130 135 140 Ala Leu Glu Asn Leu Ala Gly lie Asp Arg Ser Asp Leu lie Gln Ala 145 150 155 160 Arg Ser Arg Ala Ser Ser Glu Cys Glu Ala Thr Tyr Leu Leu Arg Gln 165 170 175 Ser Ser lie Asn Ser Ala Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Arg Tyr His Phe 180 185 190 Asn Gly Glu Glu Leu Leu Phe Glu Asp Thr Ser Leu Ser Thr Ser Pro 195 200 205 Gly Thr Gly Val Arg Lys Lys Thr Cys Ser Phe Arg lie Lys Glu Glu 210 215 220 Lys Asp Val Lys Thr His Leu Val Pro Glu Cys Gln Asn Ser Leu His 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr Pro Asp Gly Ser His Leu 245 250 255 Ala Val Asp Asp Leu Lys Asn Ala Glu Glu Ser Lys Leu Gly Pro Asp 260 265 270 lie Gly lie Ser Lys Glu Asp Asp Glu Arg Gln Thr Asp Ser Lys Lys 275 280 285 Glu Glu Thr lie Ser Pro Ser Leu Asn Lys Thr Asp Val lie His Gly 290 295 300 Gln Asp Lys Ser Asp Val Gln Asn Thr Gln Leu Thr Val Glu Thr Thr 305 310 315 320 Asn tle Glu Gly Thr lie Ser Tyr Pro Leu Glu Glu Thr Lys lie Thr 325 330 335 Arg Tyr Phe Pro Asp Glu Thr lie Asn Ala Cys Lys Thr Met Lys Ser 340 345 350 Arg Ser Phe al Tyr Ser Arg Gly Arg Lys Leu Val Gly Gly Val Asn 355 360 365 Gln Asp Val Glu Tyr Ser Ser lie Thr Asp Gln Gln Leu Thr Thr Glu 370 375 380 Trp Gln Cys Gln Val Gln Lys lie Thr Arg Ser His Ser Thr Asp lie 365 390 395 400 Pro Tyr lie Val Ser Glu Ala Ala Val Gln Ala Glu Gln Lys Glu Gln 405 410 415 Phe Ala Asp Met Gln Asp Glu His His Val Ala Glu Ala lie Pro Arg 420 425 430 lie Pro Arg Leu Ser Leu Thr lie Thr Asp Arg Asn Gly Mee Glu Asn 435 440 445 Leu Leu Ser Val Lys Pro Asp Gln Thr Leu Gly Phe Pro Ser Leu Arg 450 455 460 Ser Lys Ser Leu His Gly His Pro Arg Asn Val Lys Ser lie Gln Gly 465 470 475 480 Leu Asp Arg Ser Gly His Ala Ser Ser Val Ser Ser Leu Val II 485 490 495 Val Ser Gly Met Thr Ala Glu Glu Lys Lys Val Lys Lys Glu Lys Ala 500 505 510 Ser Thr Glu Thr Glu Cys 515 <210> 5 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Glu Val Lys Ser lie Ser Asn Gln Val Trp Lys Phe Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Leu lie Met Thr Phe His Asp Arg Pro Val Leu Pro Pro Pro Met 20 25 30 lie lie Leu Ser His lie Tyr lie lie lie Met Arg Leu Ser Gly Arg 35 40 45 Cys Arg Lys Lys Arg Glu Gly Asp Gln Glu Glu Arg Asp Arg Gly Leu 50 55 60 Lys Leu Phe Leu Ser Asp Glu Glu Leu Lys Axg Leu His Glu Phe Glu 65 70 75 80 Glu Gln Cys Val Gln Glu His Phe Arg Glu Lys Glu Asp Glu Gln Gln 85 90 95 Ser Ser Ser Asp Glu Arg lie Arg Val Thr Ser Glu Arg Val Glu Asn 100 105 110 Met Ser Met Arg Leu Glu Glu lie Asn Glu Arg Glu Thr Phe Met Lys 115 120 125 Thr Ser Leu Gln Thr Val Asp Leu Arg> Leu Ala Gln Leu Glu Glu Leu 130 135 140 Ser Asn Arg Met Val Asn Ala Leu Glu Asn Leu Ala Gly lie Asp Arg 145 150 155 160 Ser Asp Leu lie Gln Ala Arg Ser Arg Ala Ser Ser Glu Cys Glu Ala 165 170 175 Thr Tyr Leu Leu Arg Gln Ser Ser lie Asn Ser Ala Asp Gly Tyr Ser 180 185 190 Leu Tyr Arg Tyr His Phe Asn Gly Glu Glu Leu Leu Phe Glu Asp Thr 195 200 205 Ser Leu Ser Thr Ser Pro Gly Thr Gly Val Arg Lys Lys Thr Cys Ser 210 215 220 Phe Arg l e Lys Glu Glu Lys Asp Val Lys Thr His Leu Val Pro Glu 225 230 235 240 Cys Gln Asn Ser Leu His Leu Ser Leu Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr 245 250 255 Pro Asp Gly Ser His Leu Ala Val Asp Asp Leu Lys Asn Ala Glu Glu 260 265 270 Ser Lys Leu Gly Pro Asp lie Gly lie Ser Lys Glu Asp Asp Glu Arg 275 280 285 Gln Thr Asp Ser Lys Lys Glu Glu Thr lie Ser Pro Ser Leu Asn Lys 290 295 300 Thr Asp Val lie His Gly Gln Asp Lys Ser Asp Val Gln Asn Thr Gln 305 310 315 320 Leu Thr Val Glu Thr Thr Asn lie Glu Gly Thr lie Ser Tyr Pro Leu 325 330 335 Glu Glu Thr Lys lie Thr Arg Tyr Phe Pro Asp Glu Thr lie Asn Ala 340 345 350 Cys Lys Thr Met Lys Ser Arg Ser Phe Val Tyr Ser Arg Gly Arg Lys 355 360 365 Leu Val Gly Gly Val Asn Gln Asp Val Glu Tyr Ser Ser lie Thr Asp 370 375 380 Gln Gln Leu Thr Thr Glu Trp Gln Cys Gln Val Gln Lys lie Thr Arg 385 390 395 400 Ser His Ser Thr Asp lie Pro Tyr lie Val Ser Glu Ala Ala Val Gln 405 410 415 Ala Glu Gln Lys Glu Gln Phe Ala Asp Met Gln Asp Glu His His Val 420 425 430 Ala Glu Ala lie Pro Arg lie Pro Arg Leu Ser Leu Thr lie Thr Asp 435 440 445 Arg Asn Gly Met Glu Asn Leu Leu Ser Val Lys Pro Asp Gln Thr Leu 450 455 460 Gly Phe Pro Ser Leu Arg Ser Lys Ser Leu His Gly His Pro Arg Asn 465 470 475 480 Val Lys Ser lie Gln Gly Lys Leu Asp Arg Ser Gly His Ala Ser Ser 485 490 495 Val Ser Ser Leu Val lie Val Ser Gly Met Thr Ala Glu Glu Lys Lys 500 505 510 Val Lys Lys Glu Lys Ala Ser Thr Glu Thr Glu Cys 515 520 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Gly Lys Met Met lie Asp Met Leu Tyr 130 135 140 Phe Val Val lie Met Leu Val Val Leu Met Ser Phe Gly Val Ala Arg 145 150 155 160 Gln Ala lie Leu His Pro Glu Glu Lys Pro Ser Trp Lys Leu Ala Arg 165 170 175 Asn lie Phe Tyr Met Pro Tyr Trp Met lie Tyr Gly Glu Val Phe Ala 180 185 190 Asp Gln lie Asp Leu Tyr Ala Met Glu lie Aen Pro Pro Cys Gly Glu 195 200 205 Asn Leu Tyr Asp Glu Glu Gly Lys Arg Leu Pro Pro Cys lie Pro Gly 210 215 220 Ala Trp Leu Thr Pro Ala Leu Met Ala Cys Tyr Leu Leu Val Ala Asn 225 230 235 240 lie Leu Leu Val Asn Leu Leu lie Ala Val Phe Asn Asn Thr Phe Phe 245 250 255 Val Lys Ser lie Ser Asn 260 <210> 20 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 His Pro Glu Glu Lys Pro Ser Trp Lys Leu Ala Arg Asn lie Phe Tyr 1 5 10 15 Met Pro Tyr Trp Met lie Tyr Gly Glu Val Phe Ala Asp Gln lie Asp 20 25 30 Leu Tyr Ala Met Glu lie Asn Pro Pro Cys Gly Glu Asn Leu Tyr Asp 35 40 45 Glu Glu Gly Lys Arg Leu Pro Pro Cys lie Pro Gly Ala Trp Leu 50 55 60 <210> 21 <2U> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Lys Pro Ser Trp Lys Leu Ala Arg Asn lie Phe Tyr Met Pro Tyr 1 5 10 15 Trp Met lie Tyr Gly Glu Val 20 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asn Pro Pro Cys Gly Glu Asn Leu Tyr Asp Glu Glu Gly Lys Arg Leu 1 5 10 15 Pro Pro Cys lie Pro Gly Ala Trp Leu Thr Pro Ala 20 25 <210> 23 <211> 4602 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 atgtatatcc gtgtatccta tgacaccaag ccagactcac tgctccatct catggtgaaa 60 gattggcagc tggaactccc caagctctta atatctgtgc atggaggcct ccagaacttt 120 gagatgcagc ccaagctgaa acaagtcttt gggaaaggcc tgatcaaggc tgctatgacc 180 accggggcct ggatcttcac cgggggtgtc agcacaggtg ttatcagcca cgtaggggat 240 gccttgaaag accactcctc caagtccaga ggccgggttt gtgctatagg aattgctcca 300 tggggcatcg tggagaataa ggaagacctg gttggaaagg atgtaacaag agtgtaccag 360 accatgtcca accccctaag taagctctct gtgctcaaca actcccacac ccacttcatc 420 ctggctgaca atggcaccct gggcaagtat ggcgccgagg tgaagctgcg aaggctgctg 480 gaaaagcaca tctccctcca gaagatcaac acaagactgg ggcagggcgt gcccctcgtg 540 ggtctcgtgg tggagggggg ccctaacgtg gtgtccatcg tcttggaata cctgcaagaa 600 gagcctccca tccctgtggt gatttgtgat ggcagcggac gtgcctcgga catcctgtcc 660 tttgcgcaca agtactgtga agaaggcgga ataataaatg agtccctcag ggagcagctt 720 ctagttacca ttcagaaaac atttaattat aataaggcac aatcacatca gctgtttgca 780 attataatgg agtgcatgaa gaagaaagaa ctcgtcactg tgttcagaat gggttctgag 840 ggccagcagg acatcgagat ggcaatttta actgccctgc tgaaaggaac aaacgtatct 900 gctccagatc agctgagctt ggcactggct tggaaccgcg tggacatagc acgaagccag 960 atctttgtct ttgggcccca ctggacgccc ctgggaagcc tggcaccccc gacggacagc 1020 aaagccacgg agaággagaa gaagccaccc atggccacca ccaagggagg aagaggaaaa 1080 gggaaaggca agaagaaagg gaaagtgaaa gaggaagtgg aggaagaaac tgacccccgg 1140 aagatagagc tgctgaactg ggtgaatgct ttggagcaag cgatgctaga tgctttagtc 1200 ttagatcgtg tcgactttgt gaagctcctg attgaaaacg gagtgaacat geaacacttt 1260 ctgaccattc cgaggctgga ggagctctat aacacaagac tgggtccacc aaacacactt 1320 catctgctgg tgagggatgt gaaaaagagc aaccttccgc ctgattacca catcagcctc 1380 atagacatcg ggctcgtgct ggagtacctc atgggaggag cctaccgctg caactacact 1440 cggaaaaact t cggaccct ttacaacaac ttgtttggac caaagaggcc taaagctctt 1500 aaacttctgg gaatggaaga tgatgagcct ccagctaaag ggaagaaaaa aaaaaaaaag 1560 aaaaaggagg aagagatcga cattgatgtg gacgaccctg ccgtgagtcg gttccagtat 1620 cccttccacg agctgatggt gtgggcagtg ctgatgaaac gccagaaaat ggcagtgttc 1680 ctctggcagc gaggggaaga gagcatggcc aaggccctgg tggcctgcaa gctctacaag 1740 gccatggccc acgagtcctc cgagagtgat ctggtggatg acatctccca ggacttggat 1800 aacaattcca aagacttcgg ccagcttgct ttggagttat tagaccagtc ctataagcat 1860 gacgagcaga tcgctatgaa actcctgacc tacgagctga aaaactggag caactcgacc 1920 tgcctcaaac tggccgtggc agccaaacac cgggacttca ttgctcacac ctgcagccag 1980 atgctgctga ccgatatgtg gatgggaaga ctgcggatgc ggaagaaccc cggcctgaag 2040 gttatcatgg ggattcttct accccccacc atcttgtttt tggaatttcg cacatatgat 2100 gatttctcgt atcaaacatc caaggaaaac gaggatggca aagaaaaaga agaggaaaat 2160 acggatgcaa atgcagatgc tggctcaaga aagggggatg aggagaacga gcataaaaaa 2220 cagagaagta ttcccatcgg aacaaagatc tgtgaattct ataacgcgcc cattgtcaag 2280 ttctggtttt acacaatatc atacttgggc tacctgctgc tgtttaacta cgtcatcctg 2340 gtgcggatgg atggctggcc gtccctccag gagtggatcg tcatctccta catcgtgagc 2400 ctggcgttag agaagatacg agagatcctc atgtcagaac caggcaaact cagccagaaa 2460 atcaaagttt ggcttcagga gtactggaac atcacagatc tcgtggccat ttccacattc 2520 atgattggag caattcttcg cctacagaac cagccctaca tgggctatgg ccgggtgatc 2580 tactgtgtgg atatcatctt ctggtacatc cgtgtcctgg acatctttgg tgtcaacaag 2640 tatctggggc catacgtgat gatgattgga aagatgatga tcgacatgct gtactttgtg 2700 gtcatcatgc tggtcgtgct catgagtttc ggagtagccc gtcaagccat tctgcatcca 2760 gaggagaagc cctcttggaa actggcccga aacatcttct acatgcccta ctggatgatc 2820 tatggagagg tgtttgcaga ccagatagac ctctacgcca tggaaattaa tcctccttgt 2880 ggtgagaacc tatatgatga ggagggcaag cggcttcctc cctgtatccc cggcgcctgg 2940 ctcactccag cactcatggc gtgctatcta ctggtcgcca acatcctgct ggtgaacctg 3000 ctgattgctg tgttcaacaa tactttcttt gaagtaaaat caatatccaa ccaggtgtgg 3060 aagttccagc 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acgaagccag 960 atctttgtct ttgggcccca ctggacgccc ctgggaagcc tggcaccccc gacggacagc 1020 aaagccacgg agaaggagaa gaagccaccc atggccacca ccaagggagg aagaggaaaa 1080 gggaaaggca agaagaaagg gaaagtgaaa gaggaagtgg aggaagaaac tgacccccgg 1140 aagatagagc tgctgaactg ggtgaatgct ttggagcaag cgatgctaga tgctttagtc 1200 ttagatcgtg tcgactttgt gaagctcctg attgaaaacg gagtgaacat gcaacacttt 1260 ctgaccattc cgaggctgga ggagctctat aacacaagac tgggtccacc aaacacactt 1320 catctgctgg tgagggatgt gaaaaagagc aaccttccgc ctgattacca catcagcctc 1380 atagacatcg ggctcgtgct ggagtacctc atgggaggag cctaccgctg caactacact 1440 cggaaaaact ttcggaccct ttacaacaac ttgtttggae caaagaggcc taaagctctt 1500 aaacttctgg gaatggaaga tgatgagcct ccagctaaag ggaagaaaaa aaaaaaaaag 1560 aaaaaggagg aagagatcga cattgatgtg gacgaccctg ccgtgagtcg gttccagtat 1620 cccttccacg agctgatggt gtgggcagtg ctgatgaaac gccagaaaat ggcagtgttc 1680 ctctggcagc gaggggaaga gagcatggcc aaggccctgg tggcctgcaa gctctacaag 1740 gccatggccc acgagtcctc cgagagtgat ctggtggatg acatctccca ggacttggat 1800 aacaattcca aagacttcgg ccagcttgct ttggagttat tagaccagtc ctataagcat 1860 gacgagcaga tcgctatgaa actcctgacc tacgagctga aaaactggag caactcgacc 1920 tgcctcaaac tggccgtggc agccaaacac cgggacttca ttgctcacac ctgcagccag 1980 atgctgctga ccgatatgtg gatgggaaga ctgcggatgc ggaagaaccc cggcctgaag 2040 gtcatcaegg ggattcttct accccccacc atcttgtttt tggaatttcg cacatatgat 2100 gatttctcgt atcaaacatc caaggaaaac gaggatggca aagaaaaaga agaggaaaat 2160 acggatgcaa atgcagatgc tggctcaaga aagggggatg aggagaacga gcataaaaaa 2220 cagagaagta ttcccatcgg aacaaagatc tgtgaattct ataacgcg 2268 <210> 25 <211> 22B3 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 atgtatatcc gtgtatccta tgacaccaag ccagactcac tgctccatct catggtgaaa 60 gattggcagc tggaactccc caagctctta atatctgtgc atggaggcct ccagaacttt 120 gagatgcagc ccaagctgaa acaagtcttt gggaaaggcc tgatcaaggc tgctatgacc 180 accggggcct ggatcttcac cgggggtgtc agcacaggtg ttatcagcca cgtaggggat 240 gccttgaaag accactcctc caagtceaga ggccgggttt gtgctatagg aattgctcca 300 tggggcatcg tggagaataa ggaagacctg gttggaaagg atgtaacaag agtgtaccag 360 accatgtcca accctctaag taagctctct gtgctcaaca actcccacac ccacttcatc 420 ctggctgaca atggcaccct gggcaagtat ggcgccgagg tgaagctgcg aaggctgctg 480 gaaaagcaca tctccctcca gaagatcaac acaagactgg ggcagggcgt gcccctcgtg 540 ggtctcgtgg tggagggggg ccctaacgtg gtgtccatcg tcttggaata cctgcaagaa 600 gagcctccca tccctgtggt gatttgtgat ggcagcggac gtgcctcgga catcctgtcc 660 tttgcgcaca agtactgtga agaaggcgga ataataaatg agtccctcag ggagcagctt 720 ctagttacca ttcagaaaac atttaattat aataaggcac aatcacatca gctgtttgca 780 attataatgg agtgcatgaa gaagaaagaa ctcgtcactg tgttcagaat gggttctgag 840 ggccagcagg acatcgagat ggcaatttta actgccctgc tgaaaggaac aaacgtatct 900 gctccagatc agctgagctt ggcactggct tggaaccgcg tggacatagc acgaagccag 960 atctttgtct ttgggcccca ctggacgccc ctgggaagcc tggcaccccc gacggacagc 1020 aaagccacgg agaaggagaa gaagccaccc atggccacca ccaagggagg aagaggaaaa 1080 gggaaaggca agaagaaagg gaaagtgaaa gaggaagtgg aggaagaaac tgacccccgg 1140 aagatagagc tgctgaactg ggtgaatgct ttggagcaag cgatgctaga tgctttagtc 1200 ttagatcgtg tcgactttgt gaagctcctg attgaaaacg gagtgaacat gcaacacttt 1260 ctgaccattc cgaggctgga ggagctctat aacacaagac tgggtccacc aaacacactt 1320 catctgctgg tgagggatgt gaaaaagagc aaccttccgc ctgattacca catcagcctc 1380 atagacatcg ggctcgtgct ggagtacctc atgggaggag cctaccgctg caactacact 1440 cggaaaaact ttcggaccct ttacaacaac ttgtttggac caaagaggcc taaagctctt 1500 aaacttctgg gaatggaaga tgatgagcct ccagctaaag ggaagaaaaa aaaaaaaaag 1560 aaaaaggagg aagagatcga cattgatgtg gacgaccctg ccgtgagtcg gttccagtat 1620 cccttccacg agctgatggt gtgggcagtg ctgatgaaac gccagaaaat ggcagtgttc 1680 ctctggcagc gaggggaaga gagcatggcc aaggccctgg tggcctgcaa gctctacaag 1740 gccatggccc acgagtcctc cgagagtgat ctggtggatg acatctccca ggacttggat 1800 aacaattcca aagacttcgg ccagcttgct ttggagttat tagaccagtc ctataagcat 1860 gacgagcaga tcgctatgaa actcctgacc tacgagctga aaaactggag caactcgacc 1920 tgcctcaaac tggccgtggc agccaaacac cgggacttca ttgctcacac ctgcagccag 1980 atgctgctga ccgatatgtg gatgggaaga ctgcggatgc ggaagaaccc cggcctgaag 2040 gttatcatgg ggattcttct accccccacc atcttgtttt tggaatttcg cacatatgat 2100 gatttctcgt atcaaacatc caaggaaaac gaggatggca aagaaaaaga agaggaaaat 2160 acggatgcaa atgcagatgc tggctcaaga aagggggatg aggagaacga gcataaaaaa 2220 cagagaagta ttcccatcgg aacaaagatc tgtgaattct ataacgcgcc cattgtcaag 2280 ttc 2283 <210> 26 <211> 1554 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 26 tccaaccagg tgtggaagtt ceagcgatat cagctgatta tgacatttca tgacaggcca 60 gtcctgcccc caccgatgat cattttaagc cacatctaca tcatcattat gcgtctcagc 120 ggccgctgca ggaaaaagag agaaggggac caagaggaac gggatcgtgg attgaagctc 160 ttccttagcg acgaggagct aaagaggctg catgagttcg aggagcagtg cgtgcaggag 240 cacttccggg agaaggagga tgagcagcag tcgtecagcg acgagcgcat ccgggtcact 300 tctgaaagag ttgaaaatat gtcaatgagg ttggaagaaa tcaatgaaag agaaactttt 360 atgaaaactt ccctgcagac tgttgacctt cgacttgctc agctagaaga attatctaac 420 agaatggtga atgctcttga aaatcttgcg ggaatcgaca ggtctgacct gatccaggca 480 cggtcccggg cttcttctga atgtgaggca acgtatcttc tccggcaaag cagcatcaat 540 agcgctgatg gctacagctt gtatcgatat cattttaacg gagaagagtt attatttgag 600 gataeatctc tctccacgtc accagggaca ggagtcagga aaaaaacctg ttccttccgt 660 ataaaggaag agaaggacgt gaaaacgcac ctagtcccag aatgtcagaa cagtcttcac 720 ctttcactgg gcacaagcac atcagcaacc ccagatggca gtcaccttgc agtagatgac 780 ttaaagaacg ctgaagagtc aaaattaggt ccagatattg ggatttcaaa ggaagatgat 840 gaaagacaga cagactctaa aaaagaagaa actatttccc caagtttaaa taaaacagat 900 gtgatacatg gacaggacaa atcagatgtt caaaacactc agctaacagt ggaaacgaca 960 aatatagaag gcactatttc ctatcccctg gaagaaacca aaattacacg ctatttcccc 1020 gatgaaacga tcaatgcttg taaaacaatg aagteeagaa gcttcgteta ttcccgggga 1060 agaaagctgg tcggtggggt taaccaggat gtagagtaca gttcaatcac ggaccagcaa 1140 ttgacgacgg aatggcaatg ccaagttcaa aagatcacgc gctctcatag cacagatatt 1200 ccttacattg tgtcggaagc tgcagtgcaa gctgagcaaa aagagcagtt tgcagatatg 1260 caagatgaac accatgtcgc tgaagcaatt cctcgaatcc ctcgcttgtc cctaaccatt 1320 actgacagaa atgggatgga aaacttactg tctgtgaagc cagatcaaac tttgggattc 1380 ccatctctca ggtcaaaaag tttacatgga catcctagga atgtgaaatc cattcaggga 1440 aagttagaca gatctggaca tgccagtagt gtaagcagct tagtaattgt gtctggaatg 1500 acagcagaag aaaaaaaggt taagaaagag aaagcttcca cagaaactga atgc 1554 <210> 27 <211> 1575 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tttgaagtaa aatcaatatc caaccaggtg tggaagttcc agcgatatca gctgattatg 60 acatttcatg acaggccagt cctgccccca ccgatgatca ttttaagcca catctacatc 120 atcattatgc gtctcagcgg ccgctgcagg aaaaagagag aaggggacca agaggaacgg 180 gatcgtggat tgaagctctt ccttagcgac gaggagctaa agaggctgca tgagttcgag 240 gagcagtgcg tgcaggagca cttccgggag aaggaggatg agcagcagtc gtccagcgac 300 gagcgcatcc gggtcacttc tgaaagagtt gaaaatatgt caatgaggtt ggaagaaatc 360 aatgaaagag aaacttttat gaaaacttcc ctgcagactg ttgaccttcg acttgctcag 420 ctagaagaat tatctaacag aatggtgaat gctcttgaaa atcttgcggg aatcgacagg 480 tctgacctga tccaggcacg gtcccgggct tcttctgaat gtgaggcaac gtatcttctc 540 cggcaaagca gcatcaatag cgctgatggc tacagcttgt atcgatatca ttttaacgga 600 gaagagttat tatttgagga tacatctctc tccacgtcac cagggacagg agtcaggaaa 660 aaaacctgtt ccttccgtat aaaggaagag aaggacgtga aaacgcacct agtcccagaa 720 tgtcagaaca gtcttcacct ttcactgggc acaagcacat cagcaacccc agatggcagt 780 caccttgcag tagatgactt aaagaacgct gaagagtcaa aattaggtcc agatattggg 840 atttcaaagg aagatgatga aagacagaca gactctaaaa aagaagaaac tatttcccca 900 agtttaaata aaacagatgt gatacatgga caggacaaat cagatgttca aaacactcag 960 ctaacagtgg aaacgacaaa tatagaaggc actatttcct atcccctgga agaaaccaaa 1020 attacacgct atttccccga tgaaacgatc aatgcttgta aaacaatgaa gtccagaagc 1080 ttcgtctatt cccggggaag aaagctggtc ggtggggtta accaggatgt agagtacagt 1140 tcaatcacgg accagcaatt gacgacggaa tggcaatgcc aagttcaaaa gatcacgcgc 1200 tctcatagca cagatattcc ttacattgtg tcggaagctg cagtgcaagc tgagcaaaaa 1260 gagcagtttg cagacatgca agatgaacac catgtcgctg aagcaattcc tcgaatccct 1320 cgcttgtccc taaccattac tgacagaaat gggatggaaa acttactgtc tgtgaagcca 1380 gatcaaactt tgggattccc atctctcagg tcaaaaagtt tacatggaca tcctaggaat 1440 gtgaaatcca ttcagggaaa gttagacaga tctggacatg ccagtagtgt aagcagctta 1500 gtaattgtgt ctggaatgac agcagaagaa aaaaaggtta agaaagagaa agcttccaca 1560 gaaactgaat gctag 1575 <210> 2B <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 atgtcagaac caggcaaact cagccagaaa atcaaagttt ggcttcagga g 51 <210> 29 <211> 63 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 atcctcatgt cagaaccagg caaactcagc cagaaaatca aagtttggct tcaggagtac 60 tgg 63 <210> 30 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 30 aacaagtatc tggggccata cgtgatgatg attggaaag 39 <210> 31 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 ggtgtcaaca agtatctggg gccatacgtg atgatgattg gaaagatgat g 51 <210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 cggatggatg gctggccgtc cctc 24 <210> 33 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 ctggtgcgga tggatggctg gccgtccctc caggag 36 <210> 34 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 aaccagccct acatgggcta tggccgg 27 <210> 35 <2U> 39 <212> ADN <2 3> Homo sapiens <400> 35 ctacagaacc agccctacat gggctatggc cgggtgatc 39 <210> 36 <211> 216 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 gcccgtcaag ccattctgca tccagaggag aagccctctt ggaaactggc ccgaaacatc 60 ttctacatgc cctactggat gatctatgga gaggtgtttg cagaccagat agacctctac 120 gccatggaaa ttaatcctcc ttgtggtgag aacctatatg atgaggaggg caagcggctt 1T0 cctccctgta tccccggcgc ctggctcact ccagca 216 <210> 37 <211> 228 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 ggagtagccc gtcaagccat tctgcatcca gaggagaagc cctcttggaa actggcccga 60 aacatcttct acatgcccta ctggatgatc tatggagagg tgtttgcaga ccagatagac 120 ctctacgcca tggaaattaa tcctccttgt ggtgagaacc tatatgatga ggagggcaag 180 cggcttcctc cctgtatccc cggcgcctgg ctcactccag cactcatg 228 <210> 38 <211> 57 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 ccagaggaga agccctcttg gaaactggcc cgaaacatct tctacatgcc ctactgg 57 <210> 39 <211> 777 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 39 cccattgtca agttctggtt ttacacaata tcatacttgg gctacctgct gctgtttaac 60 tacgtcatcc tggtgcggat ggatggctgg ccgtccctcc aggagtggat cgtcatctcc 120 tacatcgtga gcctggcgtt agagaagata cgagagatcc tcatgtcaga accaggcaaa 180 ctcagccaga aaatcaaagt ttggcttcag gagtactgga acatcacaga tctcgtggcc 240 atttccacat tcatgattgg agcaattctt cgcctacaga accagcccta catgggctat 300 ggccgggtga tctactgtgt ggatatcatc ttctggtaca tccgtgtcct ggacatcttt 360 ggtgtcaaca agtatctggg gccatacgtg atgatgattg gaaagatgat gatcgacatg 420 ctgtactttg tggtcatcat gctggtcgtg ctcatgagtt tcggagtagc ccgtcaagcc 480 attctgcatc cagaggagaa gccctcttgg aaactggccc gaaacatctt ctacatgccc 540 tactggatga tctatggaga ggtgtttgca gaccagatag acctctacgc catggaaatt 600 aatcctcctt gtggtgagaa cctatatgat gaggagggca agcggcttcc tccctgtatc 660 cccggcgcct ggctcactcc agcactcatg gcgtgctatc tactggtcgc caacatcctg 720 ctggtgaacc tgctgattgc tgtgttcaac aatactttct ttgaagtaaa atcaata 777 <210> 40 <211> 789 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 40 aacgcgccca ttgtcaagtt ctggttttac acaatatcat acttgggcta cctgctgctg 60 tttaactacg tcatcctggt geggatggat ggctggccgt ccctccagga gtggatcgtc 120 atctcctaca tcgtgagcct ggcgttagag aagatacgag agatcctcat gtcagaacca 180 ggcaaactca gccagaaaat caaagtttgg cttcaggagt actggaacat cacagatctc 240 gtggccattt ccacattcat gattggagca attcttcgcc tacagaacca gccctacatg 300 ggctatggcc gggtgatcta ctgtgtggat atcatcttct ggtacatccg tgtcctggac 360 atctttggtg tcaacaagta tctggggcca tacgtgatga tgattggaaa gatgatgatc 420 gacatgctgt actttgtggt catcatgctg gtcgtgctca tgagtttcgg agtagcccgt 480 caagccattc tgcatccaga ggagaagccc tcttggaaac tggcccgaaa catettctac 540 atgccctact ggatgatcta tggagaggtg tttgcagacc agatagacct ctacgccatg 600 gaaattaatc ctccttgtgg tgagaaccta tatgatgagg agggcaagcg gcttcctccc 660 tgtatccccg gcgcctggct cactccagca ctcatggcgt gctatctact ggtcgccaac 720 atcctgctgg tgaacctgct gattgctgtg ttcaacaata ctttctttga agtaaaatca 780 atatccaac 789 <210> 41 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: promotor <400> 41 ttacagaaaa tataagtggc ggggagtcat tgcccaactc attttatgag <210> 42 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: promotor <400> 42 attaaaaata caaaaaaatt ggccgggcgt ggtggcaggc acctgtagtc 50 <210> 43 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: promotor <400> 43 gactgctcct cttaaagggt gggccctcct cacccagctc cctgccctgg SO <210> 44 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótido <400> 44 tgaagtaaaa tcaatatcca accagg 26 <210> 45 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótido <400> 45 gcactgctcc tcgaactcat gcagcc 26 <210> 46 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótido <400> 46 tccaaccagg tgtggaagtt ccagcg <210> 47 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 47 ggaagtgctc ctgcacgcac tgctcc 26 <210> 48 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 48 ctggtggaag aagaggacgt ceat 24 <210> 49 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido <400> 49 tctgggacat acattctgag acat 24

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama . como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- El uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifique para una lsnl de humano, o una secuencia complementaria a la misma, en el cual el ácido nucleico codificador codifica para un polipéptido que tiene las siguientes características: (1) la región N-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleotidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleotidos que codifican para las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl, (2) Una región de transmembrana que codifica para seis dominios de extensión de membrana, codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleotidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región C-terminal, y (3) una región C-terminal codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleotidos, localizada en el extremo 3 ' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región N-terminai y la región de transmembrana de Mlsnl. 2. - El uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que tenga por lo menos 80% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID No. 23 o una secuencia complementaria a la misma.
3. - El uso de cualquier péptido purificado o aislado que codifica para una Mlsnl de humano o un fragmento de la misma, en la cual, el péptido tiene las siguientes características: (1) la región N-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en el extremo N-terminal con respecto a las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl, (2) una región de transmembrana que forma seis dominios de extensión de membrana, que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos, locallizada en el extremo C-terminal con respecto a la región N-terminal, y en el extremo N-terminal con respecto a la región C-terminal y (3) una región C-terminal que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal con respecto a las regiones del extremo N-terminal y de transmembrana.
4. - El uso de cualquier péptido purificado o aislado que codifique para Mlsnl de humano de la reivindicación 3, en el cual dicho polipéptido tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con la secuencia de SEQ ID No. 1 un fragmento de la misma.
5.- El uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifique para una Mlsnl de humano o para una secuencia complementaria a la misma para el diagnóstico de trastornos asociados con la función de Icrac aberrante en las células del sistema inmune, en él cual el ácido nucleico codificador codifica para un polipéptido que tiene las siguientes características: (1) la región N-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleotidos, localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleotidos que codifican para las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl, (2) una región de transmembrana que codifica para seis dominios de extensión de membrana, codificados por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleotidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región C-terminal y (3) una región C-terminal codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleotidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleotidos que codifican para la región N-terminal y la región de transmembrana.
6. - El uso de cualquier ácido nucleico purificado o aislado que codifique para una Mlsnl de humano de la reivindicación 5, en el cual dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO. 23 o una secuencia complementaria a la misma.
7. - El uso de cualquier péptido purificado o aislado que codifique para Mlsnl de humano o fragmentos de la misma para el diagnóstico de trastornos asociados con la función de Icrac aberrante en células del sistema inmune, en el cual el péptido tiene las siguientes características: (1) la región N-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en la región N-terminal con respecto a las regiones de transmembrana y C-terminal de la proteína Mlsnl, (2) una región de transmembrana que forma seis dominios de extensión de membrana que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal con respecto a la región N-terminal y en el extremo N-terminal con respecto a la región C-terminal, y (3) una región C-terminal que comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en la región C-terminal, con respecto a las regiones N-terminal y de transmembrana.
8. - El uso de cualquier péptido aislado o purificado que codifique para Mlsnl de humano de la reivindicación 7, en el cual dicho polipéptido tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma.
9. - Una región de polipéptido N-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, en la cual la región N-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en la región N-terminal de la primer región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
10. - Una región de polipéptido N-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha región N-terminal tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de aminoácido de SEQ ID No. 2 ó 3, o fragmentos de las mismas.
11. - Una región de polipéptido C-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque dicha región C-terminal comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 25 aminoácidos, localizada en la región C-terminal de la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
12.- Una región de polipéptido C-terminal de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque el polipéptido C-terminal tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con cualquiera de los péptidos de la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 4 o 5, o fragmentos de la misma.
13.- Una región de polipéptido de bucle 1 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque la región de bucle 1 intracelular comprende una secuencia consecutiva por lo menos 7 aminoácidos, localizada en la región C-terminal de la segunda región de transmembrana y en la región N-terminal con respecto a la tercer región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
14.- Una región de bucle 1 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicho polipéptido de bucle 1 intracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de los péptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 6 ó 7, o fragmentos de las mismas.
15. - Una región de polipéptido de bucle 2 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque la región de polipéptido de bucle 2 intracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 7 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la cuarta región de transmembrana y en la región N-terminal de la quinta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
16. - .Una región de bucle 2 intracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho polipéptido de la región de bucle 2 intracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de los polipéptidos de las secuencias de aminoácido de SEQ ID No. 8 o 9 o fragmentos de las mismas.
17. - Una región de polipéptido de bucle 1 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque la región de bucle 1 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 5 aminoácidos localizada en el extremo C- terminal de la primer región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la segunda región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
18.- Una región de bucle 1 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque dicho polipéptido de la región de bucle 1 extracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de los polipéptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 10 o 11, o fragmentos de las mismas.
19.- Una región de polipéptido de bucle 2 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque la región de bucle 2 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 5 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la tercer región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la cuarta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
20.- Una región de bucle 2 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque dicho polipéptido de la región de bucle 2 extracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de los polipéptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 12 o 13 o fragmentos de las mismas.
21. - Una región de polipeptido de bucle 3 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada, caracterizada además porque la región de bucle 3 extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 7 aminoácidos, localizada en el extremo C-terminal de la quinta región de transmembrana y en el extremo N-terminal de la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl .
22. - Una región de bucle 3 extracelular de Mlsnl de humano purificada o aislada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque dicho polipeptido de la región de bucle 3 extracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácido con cualquiera de los polipéptidos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 14, 15, 16 ó 17 o fragmentos de las mismas.
23.- Un polipéptido de Mlsnl de humano purificado o aislado que contiene las regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares , caracterizado además porque dicha región de bucle intracelular y extracelular comprende una secuencia consecutiva de por lo menos 50 aminoácidos localizada en la región C-terminal hacia la región N-terminal y en la región N-terminal hacia la región C-terminal de la proteína Mlsnl.
24.- Un péptido de Mlsnl de humano purificado o aislado, que contiene las regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho polipéptido de la región de bucle intracelular y extracelular tiene por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con cualquiera de los polipép idos de las secuencias de aminoácido SEQ ID No. 18 o 19, o fragmentos de las mismas.
25. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región N-terminal de Mlsnl de humano, caracterizado porque la región N-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la primer región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
26. - Un ácido nucleico purificado o aislado, que codifica para la región N-terminal de Mlsnl de humano de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótido de SEQ ID No. 24 ó 25, o una secuencia complementaria a las mismas.
27. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región C- terminal de Mlsnl de humano, carac erizado porque la región C-terminal es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 75 nucleótidos localizada en el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
28. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región C-terminal de Mlsnl de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID No. 26 ó 27, o de una secuencia complementaria a la misma .
29. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-l intracelular de Mlsnl de humano caracterizado porque la región de bucle 1 intracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la segunda región de transmembrana y hacia al extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la tercer región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
30. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle- 1 intracelular de Mlsnl de humano de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID No. 28 ó 29, o una secuencia complementaria a las mismas.
31. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-2 intracelular de Mlsnl de humano, caracterizado porque la región de bucle-2 intracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la cuarta región transmembrana, y hacia el extremo 5' con respecto los nucleótidos que codifican para la quinta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
32. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-2 intracelular de Mlsnl de humano de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias SEQ ID No. 30 ó 31, o una secuencia complementaria a las mismas.
33. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle- 1 extracelular de Mlsnl de humano, caracterizado porque la región de bucle-1 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 15 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la primer región de transmembrana y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la segunda región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
34. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle- 1 extracelular de Mlsnl de humano de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID No. 32 ó 33, o una secuencia complementaria a las mismas.
35. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-2 extracelular de Mlsnl de humano, caracterizado porque dicha región de bucle-2 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 15 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la tercer región de transmembrana y hacia el extremo 5 ' con respecto a los nucleótidos que codifican para la cuarta región de ransmembrana de la proteína Mlsn.
36. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-2 extracelular de Mlsnl de humano de conformidad con . la reivindicación 35, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótido de SEQ ID No. 34 ó 35, o una secuencia complementaria a las.mismas.
37. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-3 extracelular de Mlsnl de humano caracterizado porque la región de bucle-3 extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 21 nucleótidos, localizada en el extremo 3' con respecto a los nucleótidos que codifican para la quinta región de transmembrana y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la sexta región de transmembrana de la proteína Mlsnl.
38. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para la región de bucle-3 extracelular de Mlsnl de humano de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dichho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótido de SEQ ID No. 36, 37 ó 38, o una secuencia complementaria a las mismas.
39. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para un polipéptido de Mlsnl de humano que contiene regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares , caracterizado porque dicha región de bucle intracelular y extracelular es codificada por una secuencia consecutiva de por lo menos 150 nucleótidos, localizada en el extremo 3" con respecto a los nucleótidos que codifican para la región N-terminal y hacia el extremo 5' con respecto a los nucleótidos que codifican para la región C-terminal de la proteína Mlsnl.
40. - Un ácido nucleico purificado o aislado que codifica para el polipéptido de Mlsnl que contiene regiones de bucle tanto intracelulares como extracelulares de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque dicho ácido nucleico tiene por lo menos 80% de identidad de ácido nucleico con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO. 39 ó 40 o una secuencia complementaria a las mismas.
41. - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID No. 41 o una secuencia complementaria a la misma.
42. - Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada además porque tiene por lo menos 80% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID No. 41 o una secuencia complementaria a la misma.
43. - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID No. 42 o una secuencia complementaria a la misma.
44. - Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque tiene por lo menos 80% de identidad de nucleótido con la secuencia de nucleótido de SEQ ID No. 42 o una secuencia complementaria a la misma.
45. - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para un promotor de transcripción de Mlsnl de SEQ ID No. 43 o una secuencia complementaria a la misma.
46.- Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque tiene por lo menos 80% de identidad de nucleótido con la secuencia .de nucleótido de SEQ ID No. 43 o una secuencia complementaria a la misma.
47.- Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 46.
48.- Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de Mlsnl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 24.
49.- Un célula hospedera recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 46 o un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 o 48. ¦
50. - Un célula hospedera recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de Mlsnl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 24.
51. - Un método para producir un polipéptido de Mlsnl, caracterizado porque dicho método comprende los pasos de: a) cultivar, en un medio de cultivo apropiado, una célula hospedera transformada o transfectada previamente con un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 48, b) cosechar el medio de cultivo acondicionado de esta manera o lisar la célula hospedera por ejemplo mediante sonicación o mediante choque osmótico; y c) separa o purificar, a partir de dicho medio de cultivo, o a partir de la pella del material lisado resultante, el polipéptido de Mlsnl de interés que se produjo.
52. - Un métodos para seleccionar sustancias o moléculas de ligando que se puedan unir a una Mlsnl, o fragmento de la misma, o a los elementos de promotor de transcripción de Mlsnl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, comprendiendo dicho método: a) poner en contacto un compuesto de prueba con un gen para Mlsnl o un producto del gen para Mlsnl, o un elemento promotor de transcripción de Mlsnl, y b) medir la capacidad de dicho compuesto de prueba para interactuar con el gen para Mlsnl o un producto del gen para Mlsnl o un elemento promotor de transcripción de Mlsnl (por ejemplo, mediante pruebas de unión) .
53. - Un método para seleccionar sustancias o moléculas de ligando que puedan modular la actividad biológica de Mlsnl, o un fragmento de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, comprendiendo dicho método: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que exprese a Mlsnl, y b) determinar la capacidad de dicho compuesto para afectar la actividad del gen para Mlsnl o de un producto del gen para Mlsnl dentro de la célula.
54. - Un método para seleccionar sustancias o moléculas de ligando que puedan modular la actividad biológica de Mlsnl, o un fragmento de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, comprendiendo dicho método: a) obtener una célula recombinante que exprese al gen para Mlsnl o a un producto del gen, b) exponer dicha célula recombinante a una molécula o sustancia que se va a probar; y c) medir el cambio en el flujo o en el potencial de activación dentro de la célula recombinante expuesta .
55.- Un método para seleccionar sustancias o moléculas de ligando que puedan modular la actividad biológica de Mlsnl, o un fragmento de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46, comprendiendo dicho método: a) obtener una célula recombinante que exprese una molécula reportera bajo el control de un promotor de transcripción de Mlsnl o de un para Mlsnl, b) exponer dicha célula recombinante a una molécula o sustancia que se va a probar; y c) medir el cambio en la expresión o actividad de la molécula reportera en dicha célula recombinante.
56.- Un método para seleccionar sustancias o moléculas de ligando que puedan unirse a Mlsnl, o que puedan modular la actividad biológica de Mlsnl, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55, caracterizado además porque se agrega un ligando competidor de unión a Mlsnl, que se selecciona de preferencia de la clase de compuestos de tipo pirazol tales como SEW04225, KM02940, KM03000 o GK02421, y se determina la unión de dicho competidor en presencia o en ausencia de un compuesto de prueba .
57. - Un método para detectar a cualquiera de los ácidos nucleicos de las reivindicaciones 6, 8, o 25 a 50, en una muestra de sangre, comprendiendo dicho método: (a) obtener una muestra de sangre, (b) en forma opcional separar las células del sistema inmune de los otros componentes de la sangre, (c) transcribir a la inversa el ARN celular hasta ADNc, y (d) amplificar el ácido nucleico para Mlsnl obtenido en el paso (c) mediante PCR con una pluralidad de oligonucleó idos específicos para Mlsnl que se puedan hibridar, bajo condiciones astringentes a los ácidos nucleicos para Mlsnl y caracterizar el producto de PCR.
58. - El uso de un gen para Mlsnl, un producto del gen o un elemento de transcripción, para seleccionar compuestos que modulen la actividad de una célula que presente al antígeno, en particular de macrófagos, más en particular la maduración de macrófagos.
59. - El uso de un compuesto que module la actividad del gen para Mlsnl, un producto del gen o un elemento de transcripción, para fabricar una composición que regule la actividad de una célula que presente al antígeno, en particular de macrófagos , más en particular la maduración de macrófagos .
60. - Una molécula de ácido nucleico de antisentido que comprende una región de secuencia que es complementaria a por lo menos una región de un ácido nucleico para Mlsnl de conformidad con las reivindicaciones 225 a 40.
61. - El uso de un compuesto activo como el identificado, seleccionado ó caracterizado por el método de selección descrito en las reivindicaciones 52 a 56 para preparar compuestos composiciones farmacéuticas que se unan y/o modulen la actividad biológica de Mlsnl.