KR20030090655A - 암세포 증식 조절에 유용한 폴리뉴클레오티드 - Google Patents
암세포 증식 조절에 유용한 폴리뉴클레오티드 Download PDFInfo
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
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Abstract
본 발명은 암 세포 증식을 조절하는 신규한 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질에 의해 비정상적 세포 증식의 악성 정도를 결정하는 것도 가능하다.
Description
본 발명은 암세포 증식을 조절하는 신규한 단백질에 관한 것이다. 본원에서 설명되는 서열 4, 5 및 9의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질에 의해 비정상적 세포 증식의 악성 정도를 결정하는 것도 가능하다.
암은 세계적으로 주요한 건강상의 문제이다. 지난 수년 동안 암의 진단 및 치료에 대한 상당한 발전이 이루어졌지만, 암의 예방 또는 치료를 위한 백신 또는 다른 보편적인 치료법이 현재 존재하지 않는다. 암의 제어는 가능한 한 조기 진단과 수술, 방사선 치료, 화학 치료 또는 호르몬 치료와 같은 다양한 치료법을 포함하는 적극적인 치료를 동시에 수반한다. 제시된 암에 대한 치료법의 진행은 종양의 특정 마커의 분석을 포함하는 예후 파라미터를 기초로 하여 선택된다. 그러나, 특정 마커의 사용은 종종 이해하기 어려운 결과를 야기하고, 많은 암 환자에서 사망율의 증가가 계속 관찰된다.
유방암 및 전립선암은 가장 잘 발생하는 악성 종양이다. 미국에서 400,000명의 새로운 환자가 매년 진단되고 있고, 약 100,000명의 남녀가 상기 질병으로 매년 사망한다 (Harris et al., New Eng. J Med. (1992), 327, 319, 390 and 473).
상기 질병은 아마도 10개 이하의 제한된 수의 유전자의 돌연변이를 수반하는다인자 프로세스 동안 발생하는 것으로 생각된다. 이들 돌연변이는 조직의 성장 및 세포 증식을 변경시켜 조직이 정상 세포 조절과는 무관하게 성장하고, 전이시키고 면역 기능 수행을 차단시킨다. 유방암 및 전립선암에 수반되는 유전자의 종류는 상기 종류의 종양에 매우 특이적일 수 있다. 특히, 호르몬 반응에 관여하는 유전자 (에스트로겐, 프로게스테론 또는 테스토스테론의 수용체 및 리간드)의 돌연변이는 이들이 이들 호르몬의 항종양 효과에 저항하도록 만들어 세포를 증식시킬 수 있기 때문에 특히 중요하다.
또한, 성장인자, 시그날 해독 분자 및 전사 인자를 코딩하는 유전자의 변화가 종종 관련되고, 종양 발생 및 진행에 수반되는 변이를 갖는다 (King, Nature Genetics (1992), 2.125).
최근까지 미해결된 문제는 세포 분화를 야기하는 비가역적 방식으로 인간 종양 세포에서 발생하는 유전자 발현 변화의 특성이다. 이 정보는 전립선 및 유방암의 인간 세포의 성장 및 분화에 관련되는 유전자 발현의 분자 수준에서의 조절 다이아그램의 규명에 매우 중요하다. 따라서, 비가역적 말단 분화에 관련되는 유전자 서열을 확인해야할 긴박한 필요성이 존재한다.
보다 최근에 본 출원인이 이하에서 설명하는 발명의 권리자일 때 서열 4에 의해 코딩될 수 있는 단백질의 활성을 표시하지 않은 상태로 서열 4를 수탁번호 AK000755 및 확인 번호 7021039로서 진뱅크 (Genbank) 데이타베이스에 개시한 있다.
본 발명의 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 5를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5를 포함하는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보성인 서열을 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 9의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열 9에 상보성인 뉴클레오티드 서열의 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 면역학적 활성 특징을 갖는 단편을 포함한다.
특히, 본 발명은 위치 420 (메티오닌을 코딩하는 개시 코돈 ATG)과 위치 861 (정지 코돈 UAA) 사이에 포함되는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 단편에 의해, 즉 폴리뉴클레오티드 서열 9 (이하에서 설명함)에 의해 코딩되는 서열 8 (이하에서 설명함)의 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이와 유사하게, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 대상은 상기한 바와 같은 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 특히 서열 8의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는, 의약으로서의 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 상기 단편은 뉴클레오티드 서열 9의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 9의 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단편, 즉 서열 8의 단백질일 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는, 의약으로서의 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 의약으로서의 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드(즉, 서열 8의 단백질)에 특이적으로 결합하는 의약으로서의 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질 (즉, 서열 8의 단백질) 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
별법으로, 본 발명에 따른 제약 조성물은 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
특히, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질 (즉, 서열 8의 단백질)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
바람직한 실시태양에 따르면, 상기 제약 조성물은 면역 반응 활성화제 (어쥬번트일 수 있음)를 또한 포함한다.
본 발명의 추가의 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드의 증식성 질병 치료용 의약의 제조를 위한 용도이다.
특히, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (즉, 서열 8의 단백질)과 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제의 증식성 질병 치료용 의약의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드의 증식성 질병 치료용 의약의 제조를 위한 용도이다.
바람직하게는, 사용되는 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 폴리뉴클레오티드로 구성될 것이다.
상기 사용되는 단리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 아데노바이러스, 복합 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 수두 바이러스로 이루어지는 군 중에서 선택되는 바이러스 벡터에 존재하는 것이 바람직하다.
별법으로, 본 발명에 따르면 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편이 증식성 질병 치료용 의약 제조에 사용될 수 있다.
특히, 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편 (즉, 서열 8의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편)이 증식성 질병 치료용 의약 제조에 사용될 수 있다.
상기한 용도의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 치료되는 증식성 질병은 암이다. 보다 바람직한 실시태양에 따르면, 암은 전립선암, 유방암, 폐암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
또한, 본 발명은 환자로부터 얻은 종양 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 5또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 적어도 포함하는, 세포 증식의 조절에 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 환자의 종양이 악성인지를 결정하는 방법을 제공한다.
특히, 상기 결정 방법은 환자로부터 얻은 종양 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드의 농도 (즉, 서열 8의 단백질의 농도)를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 언급한 방법의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 방법은 종양 시료를 앞서 언급한 단리된 폴리펩티드 (및 특히 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (즉, 서열 8의 단백질))를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 서열 4의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 뉴클레오티드 서열이 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 서열 4의 단편 (상기 단편은 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드를 코딩한다)인 폴리뉴클레오티드의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 환자의 종양이 악성인지를 결정하는 방법에 관한 것이다.
특히, 상기 결정 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드의 농도 (즉, 서열 8의 단백질의 농도)를 측정하는 것을 포함한다.
상기한 방법의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 방법은 (a) 종양 시료의 RNA 분자로부터 cDNA 분자의 제조, 이어서 (b) 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩할 수 있는 cDNA 분자의 특이적인 증폭을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 적어도 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드의 농도를 일정 시간에 걸쳐 선택된 시간 간격으로 반복하여 측정하는 단계, 및 (b) (a)에서 측정된 농도를 일정 시간에 걸쳐 비교하는 단계를 포함하는, 암 환자에서 질병의 진행 또는 회복을 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
특히, 암 환자에서 질병의 진행 또는 회복을 모니터링하기 위한 상기 방법은 단계 (a)에서 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드의 농도 (즉, 서열 8의 단백질의 농도)를 일정 시간에 걸쳐 선택된 시간 간격으로 반복하여 측정하는 것을 포함할 것이다.
상기 방법의 단계 (a)는 바람직하게는 생물학적 시료의 일부를 상기 폴리펩티드 (특히 서열 8의 단백질)를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 접촉시키는 것을 포함할 것이다. 상기 방법의 바람직한 실시형태에 따르면, 환자로부터 얻은 생물학적 시료는 또한 종양의 일부이다.
또한 본 발명에 따라, 암 환자에서 질병의 진행 또는 회복을 모니터링하기 위한 다른 방법은 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 적어도 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 농도를 일정 시간에 걸쳐 선택된 시간 간격으로 반복하여 측정하는 단계, 및 (b) (a)에서 측정된 농도를 일정 시간에 걸쳐 비교하는 단계를 포함할 것이다.
특히, 암 환자에서 질병의 진행 또는 회복을 모니터링하기 위한 상기 방법은 단계 (a)에서 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의, 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 농도 (즉, 서열 8의 단백질을 코딩하는 RNA의 농도)를 일정 시간에 걸쳐 선택된 시간 간격으로 반복하여 측정하는 것을 포함할 것이다.
상기한 모니터링 방법의 바람직한 실시형태에 따라, 단계 (a)는 바람직하게는 (i) 생물학적 시료 중의 RNA 분자로부터 cDNA 분자의 제조, 및 (ii) 상기 단리된 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩할 수 있는 cDNA 분자의 특이적인 증폭을 포함한다.
상기한 모든 결정 및(또는) 모니터링 방법은 의사가 결과를 분석한 후 관련 환자의 종양의 심각성 및(또는) 진행 또는 회복을 진단하도록 허용하는 도구이다.
본 발명은 또한 (1) 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 서열 4, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, (2) (1)에 정의한 바와 같은 모노클로날 항체에 또는 (1)에 정의된 바와 같은 단리된 폴리펩티드와 결합하는 제2 모노클로날 항체 또는 그의 단편 (상기 제2 모노클로날 항체는 태그 (tag) 잔기에 컨쥬게이션된다)를 포함하는, 증식성 질병 진단용 키트에 관한 것이다.
특히, 상기 증식성 질병 진단용 키트는 폴리뉴클레오티드 서열 5에 의해 코딩되는 단백질의 단편이 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (즉, 서열 8의 단백질)가 되도록 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 진단 키트의 태그 잔기는 방사성 동위원소, 형광기, 발광기, 효소, 비오틴 및 염색 입자로 이루어진 군 중에서 선택된다.
또한, 본 발명에서는 (a) 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계,및 (b) 숙주 세포의 배양물로부터 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
특히, 상기 방법의 대상은 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드의 제조 (즉, 서열 8의 단백질의 제조)이다.
본 발명은 또한 (a) 각 후보 화합물을 후보 물질이 폴리펩티드에 결합하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 적어도 포함하는, 세포 성장 및(또는) 분화의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 폴리펩티드에 대한 각 후보 화합물의 결합을 검출하고 후보 화합물로부터 세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다.
특히, 상기한 세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물의 확인 방법은 단계 (a)에서 각 후보 화합물을 후보 물질이 폴리펩티드에 결합하기에 충분한조건 하에 및 시간 동안 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (즉, 서열 8의 단백질)와 접촉시키는 것을 포함할 것이다.
세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물의 다른 확인 방법은 (a) 각 후보 화합물을 후보 물질과 세포가 상호작용하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편을 적어도 포함하는, 세포 성장 및(또는) 분화의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계, 및 (b) 폴리펩티드의 세포 농도에 대한 각 후보 화합물의 영향을 측정하고, 후보 화합물로부터 세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
특히, 상기 방법은 단계 (a)에서 각 후보 화합물을 후보 물질과 세포가 상호작용하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 (즉, 서열 8의 단백질을 발현할 수 있는 세포)와 접촉시키는 것을 포함할 것이다.
상기한 세포 성장 및(또는) 분화를 조절할 수 있는 화합물의 확인 방법의 바람직한 실시태양에 따르면, 후보 화합물은 조합 화학 프로그램으로부터 기원하는소분자 라이브러리로부터 가져올 것이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 서열을 포함하는, 분화와 관련된 단백질의 내인성 프로모터 또는 조절 성분을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 서열을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 내인성 프로모터 또는 조절 성분의 제어 하에 태그 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 형질감염된 세포에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 (a) 각 후보 화합물을 각 후보 화합물이 그의 프로모터 또는 조절 성분과 상호작용하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 서열을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 내인성 프로모터 또는 조절 성분의 제어 하에 태그 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환 또는 형질감염된 세포와 접촉시키는 단계, 및 (b) 세포에 의해 생산된 태그 단백질의 농도에 대한 각 후보 화합물의 영향을 측정하고 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 발현을 조절할 수 있는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 발현을 조절할 수 있는 화합물의 확인 방법에 관한 것이다.
상기한 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 발현을 조절할 수 있는 화합물의 확인을 위한 방법의 바람직한 실시태양에 따르면, 후보 화합물은 조합 화학 프로그램으로부터 기원하는 소분자 라이브러리로부터 가져온다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대해 얻어진 제약학적 특성으로 이들은 제약학적 용도에 적합하게 된다. 실제로, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는,
- 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편, 또는
- 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 단편
을 적어도 포함하는 단리된 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따라 종양의 진행을 느리게 하거나 종양을 퇴행시키기 위해 암 환자에게 투여될 수 있다.
상기 방법에서, 세포 증식 또는 분화의 조절과 관련된 단백질은 특히 폴리뉴클레오티드 서열 9 또는 폴리뉴클레오티드 서열 9의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (즉, 서열 8의 단백질)일 수 있다.
상기 언급된 상이한 성분은 본 발명의 상이한 측면의 보다 상세한 설명을 통해 당업계의 숙련인에게 명백해질 것이다.
본 발명의 상이한 측면의 상세한 설명
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 세포 성장을 조절하고 암을 치료하기 위한 생성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 세포 증식의 조절과 관련된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열인 "세포 증식의 조절과 관련된 서열"의 확인에 부분적으로 기초한다. 분화와 관련된 mRNA는 상응하는 비분화된 세포 내에서보다 분화된 세포 내에 더 높은 수준으로 존재하는 mRNA이다 (즉, mRNA의 수준은 적어도 2배 더 높다). 분화와 관련된 cDNA 분자는 분화와 관련된 mRNA에 대응하는 서열 (및(또는) 상보적인 서열)이다.
그러한 cDNA 분자는 역전사와 같은 표준 기술을 사용하여 RNA 또는 mRNA의 제제로부터 제조할 수 있다. 유사하게, 분화와 관련된 단백질 또는 폴리펩티드는 세포 분화와 관련된 mRNA에 의해 코딩되는 서열을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 1종 이상의 폴리펩티드, 핵산 서열 및(또는) 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 적어도 일부 또는 그의 변이체를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 적어도 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열 또는 상기 코딩 서열에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
항체는 면역계의 단백질 또는 그의 항원 결합 단편이며, 이들의 상기한 폴리펩티드의 일부에 결합할 수 있다.
별법으로, 조성물은 세포 증식의 조절과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질
특히, 본 발명은 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 서열 8의 폴리펩티드 또는 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기한 폴리뉴클레오티드의 서열, 특히 서열 4, 서열 5 및서열 9에 적어도 75％, 바람직하게는 적어도 85％ 및 또한 더욱 바람직하게는 적어도 90％, 심지어 95％ 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이는 또한 본 발명의 일부를 형성하는 다른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질, 특히 서열 8의 단백질에도 필요시 변경되어 (mutatis mutandis) 적용된다.
본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그의 원래의 환경으로부터 제거된 경우 "단리된" 것으로 불린다. 특히, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 자연계에 공존하는 생물학적 물질로부터 분리되는 경우 단리된 것이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 및 이들 폴리펩티드 또는 단백질의 단편 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 숙주 세포 내에서 이들 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 활성 부분의 발현을 지시하는 재조합 DNA의 분자를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 일부와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 핵산 혼성화 시험, 서던 블롯, 노던 블롯 등에서 사용될 수 있다.
유전 암호의 다의성 (degeneracy) 때문에, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 실질적으로 코딩하는 다른 DNA 서열이 상기한 폴리펩티드 또는 단백질의 클로닝 및 발현을 위해 사용될 수 있다. 그러한 DNA 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열을 몇가지 방식으로 조정될 수 있는 특정 엄격도 조건 하에 혼성화시킬 수 있는 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 동안, 프라이머가 매트릭스에 혼성화하는 온도 또는 반응 완충액 중의 MgCl2의 농도가 조정될 수 있다. 방사성 표지된 DNA의 단편 또는 멤브레인을 프로빙하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용 동안, 엄격도는 세척액의 이온 강도를 변화시킴으로써 또는 세척 온도를 주의깊게 조절함으로써 조정될 수 있다.
본 발명은 특히 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 폴리뉴클레오티드와 적어도 75％의 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. ％로 표시되는 상동성의 정도는 다음 식과 같이 계산한다.
100 - 100 ×(N'/N)
상기 식에서, N'는 서열 4, 서열 5 또는 서열 9에 대하여 변형된 뉴클레오티드의 수를 나타내고, N은 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.
바람직하게는, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건 하에 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 상보성 서열과 특이적으로 혼성화한다. 엄격도 조건을 정의하는 파라미터는 쌍을 이룬 스트랜드의 50％가 분리되는 온도 (Tm)에 따른다.
30개 이상의 염기를 포함하는 서열에 대해 문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY 1989]에 따라, Tm은 하기 관계식으로 정의된다.
Tm= 81.5 + 0.41 ×(％ G+C) + 16.6 ×log[양이온] - 0.63 ×(％ 포름아미드) - (600/염기의 수)
본 발명에 있어서, 엄격도 조건은 Tm보다 10℃ 낮은 혼성화 온도 및 용액 6×SSC (0.9 M 염화나트륨 및 0.09 M 시트르산나트륨)를 함유하는 혼성화 완충액이 사용될 때 "강한" 것으로 불린다. 그러한 조건 하에, 비특이적 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 4, 서열 5 또는 서열 9의 상보적 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하지 않는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 변형 DNA는 유전자의 동일한 생성물 또는 동등한 기능을 코딩하는 서열을 생성시키는 상이한 뉴클레오티드 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 포함한다. 유전자의 생성물은 또한 본 발명의 단백질의 서열에서 아미노산 잔기의 결실, 부가 또는 치환을 함유할 수 있으며, 이는 침묵(silence)으로 불리는 변화를 일으켜, 동등한 기능의 폴리펩티드 및 단백질을 생성시킨다.
상기 아미노산 치환은 관여된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양쪽성에 기초하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 음으로 대전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고, 양으로 대전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며, 근접한 소수성 값을 갖는 극성기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 페닐알라닌, 타이로신을 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은 유전자 생성물의 프로세싱 및 발현을 변경하는 비제한적인 방식의 변형을 포함하는 많은 이유로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 기술, 예를 들어 특정 부위 (directed) 돌연변이, 신규한 제한효소 부위의 삽입, 글리코실화의 변경, 포스포릴화 등을 사용하여 돌연변이가 도입될 수 있다.
특히, 효모와 같은 특정 발현 시스템에서, 숙주 세포는 유전자 생성물을 과글리코실화시킬 수 있다. 그러한 시스템에서, 글리코실화 위치를 제거하기 위해 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 명세서의 범위 내에, 융합 단백질을 코딩하는 이종 서열에 연결된 변형된 폴리뉴클레오티드 서열도 포함된다. 융합 단백질은 본 발명에 따른 단백질 서열이 이종 부분으로부터 절단될 수 있도록 본 발명에 따른 단백질의 서열 (예를 들어, 서열 8)과 이종 단백질의 서열 사이에 위치하는 절단 위치를 함유하도록 변형될 수 있다.
세포 증식의 조절과 관련된 폴리뉴클레오티드
본원에 기재한 바와 같은 세포 증식의 조절과 관련된 폴리펩티드 또는 그의 일부 또는 변이체를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다.
분화와 관련된 폴리뉴클레오티드는 당업계의 숙련인이 이용가능한 임의의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA로부터 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭될 수 있다. 상기 방법을 위해, 특이적인 프라이머를 설계하여 주문하거나 합성할 수 있고; 이들 프라이머는 상기 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한다. 이어서 증폭된 부분은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 기술 및 아래에서 간단히 설명하는 기술에의해 정상, 종양 또는 분화된 세포 또는 조직의 인간 게놈 DNA 뱅크 또는 cDNA 뱅크로부터 완전 유전자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 완전 유전자는 몇개의 PCR 단편으로부터 제작할 수 있다. 분화와 관련된 단백질을 코딩하는 cDNA 분자 또는 그의 일부는 예를 들어 세포 또는 조직의 mRNA으로부터 얻은 cDNA 뱅크를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 상기 라이브러리는 상업적으로 입수가능하거나 또는 표준 기술에 의해 제조할 수 있다 (Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조).
별법으로, 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 다른 스크리닝 기술이 사용될 수 있다.
분화와 관련된 cDNA의 분자는 표준 효소 기술, 예를 들어 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 (Klenow) 단편, 시퀀나제 (Sequenase) X (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, USA), Taq 폴리머라제 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA), 열안정성 폴리머라제 T7 (Amersham, Chicago, IL, USA) 또는 재조합 폴리머라제와 사슬연장효소 (Elongase) 증폭 시스템 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 같은 재판독 활성을 갖는 엑소뉴클레아제의 조합물을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 및 파마시아 (Pharmacia)와 같은 상업적 공급회사로부터 입수가능한 기구를 이용하는 자동화 시퀀싱 시스템이 사용될 수 있다.
cDNA의 부분 서열은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 표준 기술에 의해 세포 증식의 조절과 관련된 완전 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하기위해 사용할 수 있다. 이들 기술 중에서, cDNA 라이브러리는 RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, USA)의 재조합 특성을 이용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 스크리닝한다 .
혼성화 기술을 위해, 부분 서열은 표준 기술을 이용하여 방사성 표지할 수 있다 (예를 들어 닉 (nick) 번역에 의해 또는32P 또는33P를 사용하여 말단을 표지함으로써). 이어서 박테리아 또는 박테리오파지의 라이브러리는 표지된 프로브를 사용하여 변성 박테리아 콜로니를 함유하는 필터 (또는 파지 평판을 함유하는 프린트) 상의 혼성화에 의해 스크리닝한다 (Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조). 이어서 포지티브 콜로니 또는 평판을 선택하고 증폭시키며, DNA는 장래의 분석을 위해 단리시킨다.
이어서 완전 서열은 표준 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 이어서 겹치는 서열들을 조합하여 단일 연속 서열을 생성한다. 완전 cDNA의 분자는 표준 기술을 이용하여 목적하는 단편의 라이게이션에 의해 생성시킬 수 있다.
별법으로, cDNA의 부분 서열로부터 완전 코딩 서열을 얻기 위해 증폭에 기초하는 수많은 기술이 존재한다. 이들 중에서, 증폭은 일반적으로 PCR를 통해 수행된다. 상업적으로 입수가능한 모든 키트가 증폭 단계에 사용될 수 있다. 프라이머는 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있다. 뉴클레오티드 프라이머는 바람직하게는 적어도 50％의 구아닌과 시토신 함량을 갖고50 내지 72℃의 온도에서 표적 서열과 혼성화하는 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진 분자이다. 증폭된 영역은 상기한 바와 같이 시퀀싱될 수 있고, 겹치는 서열들을 조합하여 연속 서열을 생성한다.
대안적인 연구들 중에서, 부분 서열에 인접한 서열은 결합 서열의 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 프라이머를 사용하는 증폭에 의해 발견할 수 있다. 이어서 증폭된 서열은 제2 증폭 사이클로 보내진다.
추가의 기술은 캡쳐 (capture) PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. (1991), 1, 111-19) 및 프로그래시브 (progressive) PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-60)를 포함한다. 증폭을 이용하는 다른 방법도 또한 완전 cDNA 서열을 얻기 위해 사용될 수 있다.
진뱅크 (GenBank)로부터 입수가능한 공개 데이타베이스 "발현 서열 태그 (Expressed Sequence Tag; EST)"에 기탁된 서열을 분석함으로써 완전 cDNA 서열을 얻는 것이 가능하다. EST에 대한 연구는 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있는 컴퓨터 프로그램 (예를 들어 NCBI BLAST)을 이용하여 수행할 수 있으며 상기 EST는 연속 완전 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
상기한 폴리뉴클레오티드 서열 (특히 서열 4, 서열 5 및 서열 9)의 변이체가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다 (또한 상기한 "본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질" 부분 참조).
코딩 서열의 상보적 서열의 일부 (즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드)가 또한프로브로서 또는 유전자 발현의 조절자로서 사용될 수 있다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 구조체는 안티센스 RNA의 생산을 용이하게 하기 위해 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재하는 바와 같이 세포 증식의 조절과 관련된 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 기술은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자에 결합하기 위해 충분히 개방되는 이중 나선구조의 능력을 손상시키는 삼중-나선구조를 형성함으로써 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다 (Gee et al. in Huber and Carr, Molekular and Immunologic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY 참조). 별법으로, 유전자의 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 위치)과 혼성화시키고 유전자의 전사를 차단시키거나 또는 리보솜의 전사체와의 결합을 억제함으로써 번역을 차단시키기 위해 안티센스 분자를 사용할 수 있다.
이어서 폴리뉴클레오티드는 생체내 안정성을 증가시킴으로써 변형될 수 있다. 가능한 변형은 5' 및(또는) 3' 말단에 서열의 부가; 골격 내의 포스포디에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및(또는) 이노신, 쿠에오신 및 와이부토신과 같은 염기, 유사하게 아세틸아데닌, 메틸티오아데닌 및 다른 변형된 형태의 아데닌, 사이티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 도입을 포함한다 (그러나 이에 제한되지는 않는다).
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 다른 변형은 이미 "본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질" 부분에 기재하였다.
본 발명에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드의 서열은 확립된 재조합 DNA 기술을 이용하여 다른 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파지미드, 람다 파지의 유도체 및 코스미드를 포함하는 큰 패널의 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다. 일반적으로, 벡터는 적어도 하나의 유기체 내의 기능적 복제 기점 (origin), 적합한 엔도뉴클레아제 제한효소 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 함유한다. 다른 성분의 존재는 그들의 요구조건과 이용가능한 기술에 따라 발현 벡터의 특징을 선택할 당업계의 숙련인이 요구하는 특수한 용도에 따를 것이다.
폴리뉴클레오티드는 세포 내로 도입하고 상응하는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 제형화될 수 있다. 상기 제형은 후술하는 바와 같이 치료제에서 특히 유용하다.
당업계의 숙련인은 표적 세포 내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 몇가지 수단이 존재하며, 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 (또한 다른 것들) 내에 포함시킬 수 있다. 상기 벡터 내에 DNA를 포함시키기 위한 기술은 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 레트로바이러스 벡터는 벡터를 표적-특이적으로 만들기 위해 표적 세포의 특이적 수용체의 리간드를 코딩하는 유전자로서 선별 마커를 위한 유전자 및(또는) 표적물의 유전자를 전달하거나 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 위한 다른 제형은 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들어거대분자 복합체, 나노-캡슐, 미세구, 비드, 및 오일/물 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질의 사용에 기초한 시스템을 포함한다. 제품을 시험관내 및 생체내 전달하기 위해 사용되는 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀 (즉, 인조 멤브레인 베지클)이다.
세포 증식의 조절과 관련된 폴리펩티드
본 명세서의 범위 내에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성을 갖는 일부 또는 그의 변이체를 적어도 포함한다. 상기한 폴리펩티드는 완전 단백질, 올리고펩티드 (즉, 펩티드 결합으로 연결된 8-10 잔기와 같은 비교적 제한된 수의 아미노산으로 이루어짐) 또는 중간 크기의 펩티드를 포함한 임의의 길이일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 부가적인 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 본 발명의 문맥에서 B 및(또는) T 세포의 표면 수용체에 의해 인지된다면 면역학적으로 활성이다. 면역 활성은 문헌 [Paul, Fundamental Immunology, 3rded., 243-247 (Raven Press, 1993)]에 의해 요약된 바와 같은 표준 기술을 이용하여 시험할 수 있다. 상기한 기술은 항원-특이적 항혈청 및(또는) T 세포주 또는 표준법에 따라 제조될 수 있는 클론과 반응할 수 있는 그의 능력을 측정하기 위하여 천연 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드의 스크리닝을 포함한다. 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 면역 활성 부분은 상기한 항혈청 및(또는) T 세포와 반응하며, 완전 폴리펩티드의 반응성보다 유의하게 더 약하지는 않다 (예를들어, ELISA 시험에서 및(또는) T 세포 반응성 시험에서). 상기한 스크리닝은 일반적으로 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
B 및 T 세포의 에피토프는 또한 컴퓨터 기술을 이용하여 예측할 수 있다.
별법으로, 면역원성 부분은 반응 유도능을 갖는 펩티드 단위를 조사하는 프로그램 치테스 (등록상표, Tsites) (참조, Rothbard and Taylor, EMBO J (1988), 7, 93-100; Deavin et al., Mol. Immunol. (1996), 33, 145-155)과 같은 컴퓨터 분석을 이용하여 확인될 수 있다. 클래스 I 또는 II의 쥐 또는 인간 주조직 적합 복합체(MHC)에 결합하기에 적합한 펩티드 단위는 BIMAS 방법 (Parker et al., J. Immunol. (1994), 152: 163, 1994)에 따라 확인할 수 있다. 면역원성을 확인하기 위해, 펩티드는 HLA A2 트랜스제닉 마우스 및(또는) 수지상 (dendritic) 세포, 섬유아세포 또는 말초 혈액 세포를 이용하는 시험관내 모의시험에 의해 시험할 수 있다.
유사하게, 폴리펩티드는 세포 증식의 조절과 관련된 천연 단백질로부터의 하나 이상의 구조적, 조절적 및(또는) 생화학적 기능을 갖는다면 "생물학적 활성"이다. 생물학적 활성의 존재는 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 방법에 따라 측정할 수 있다.
예를 들어, 서열 비교 연구는 단백질의 특정한 생물 활성을 보여줄 수 있다. 상기 활성의 평가 시험은 당업계에 이미 알려진 시험 베이스에서 사용될 수 있다.상기 단백질의 특정 부분 및 다른 변이체도 또한 시험관내 또는 생체내 시험에 따라 상기 특성을 보일 것이다.
이미 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 내인성 단백질의 변이체의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있으며, 상기 부분은 면역학적 및(또는) 생물학적 활성을 갖는다 (즉, 상기 부분은 완전 단백질의 항원성, 면역원성 및(또는) 생물학적 특징을 갖는다). 바람직하게는, 상기 부분은 또한 상기한 특성의 검출을 허용하는 시험 동안 적어도 전체 단백질만큼 활성이다. 폴리펩티드 "변이체"는 아미노산 치환, 삽입, 결실 및(또는) 변형에 의해 천연 단백질과 상이한 폴리펩티드이다. 특정 변이체는 보존적 치환을 포함한다. "보존적 치환"은 아미노산이 폴리펩티드의 2차 구조 뿐만 아니라 친수성에서도 변화가 없는 것으로 예상되는 당업계의 숙련인에 의해 결정되는 것과 같이 동일한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 치환이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양쪽성의 유사성에 기초하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 음으로 대전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고, 양으로 대전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며, 유사한 소수성 값을 갖는 대전되지 않은 극성 아미노산은 류신, 이소류신과 발린; 글리신과 알라닌; 아스파라긴과 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌과 타이로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타날 수 있는 다른 군의 아미노산은 특히 (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His 및 (5) Phe, Tyr, Trp, His이다. 변이체는 또한 또는 별법으로 비보존적 변화를포함할 수 있다.
본 발명의 일부를 형성하는 변이체는 또한 천연 단백질의 1차 구조가 지질기 또는 글리코실 또는 포스페이트 아세틸기와 같은, 다른 폴리펩티드 또는 화학 구조체와의 공유 또는 비공유 콘쥬게이트의 형성에 의해 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 글리코실화 단위를 갖거나 갖지 않는 폴리펩티드를 포함한다. 효모 발현 시스템 또는 포유동물 세포에서 발현된 폴리펩티드는 사용된 발현 시스템에 따라 분자량 및 글리코실화 패턴에 있어서 천연 분자와 유사하거나 약간 상이할 수 있다.
이. 콜라이 (E. coli)와 같은 박테리아에서 DNA의 발현은 글리코실화되지 않은 분자를 생성시킨다. 진핵 단백질의 N-글리코실화 위치는 아미노산 트리플렛 Asn-A1-Z (여기서 A1은 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고, Z는 세린 또는 트레오닌이다)에 의해 특성화된다.
세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 대립유전자가 또한 본 발명에 포함된다. 대립유전자는 변형된 RNA를 유도하는 하나 이상의 돌연변이 (억제, 부가 또는 치환된 아미노산일 수 있는)로 생성된 천연 단백질의 다른 형태이다. 대립유전자의 단백질은 서열에서 상이할 수 있지만, 전체적인 구조와 기능은 실질적으로 유사하다. 세포 증식의 조절과 관련된 단백질, 그의 변이체 및 일부는 일반적으로 표준 기술을 사용하여 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로부터 제조할 수 있다. 내인성 단백질을 제조하기 위해, 단리된 cDNA를 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 단백질의 다른 변형은 이미 "본 발명의 폴리펩티드 및 뉴클레오티드" 부분에 기재하였다
폴리펩티드 변이체를 제조하기 위해, 표준 돌연변이 기술, 예를 들어 특정 부위 지정 (directed) 올리고뉴클레오티드를 이용하는 특정 부위 돌연변이를 이용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 임의의 적절한 숙주 세포에서 얻을 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵, 고등 진핵 또는 효모 세포를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 숙주 세포는 이. 콜라이 (E. coli), 효모 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들어 COS, CHO, MCF7 (유방암에서 단리된 인간 종양 세포) 또는 DU 145 (전립선암에서 단리된 인간 종양 세포)이다.
발현시킨 후, 첫번째 경우 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 배양 배지 내에 분비하는 숙주/벡터 시스템의 상등액을 알콜 침전법 또는 시판 필터를 사용하는 여과법과 같은 표준 기술에 의해 농축시킬 수 있다. 농축 단계 이후, 생성된 제품을 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 매트릭스에 도포할 수 있다. 폴리펩티드의 순도를 모니터링하기 위해 1회 이상의 HPLC 단계를 사용할 수 있다.
특정 부분 및 다른 변이체는 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있는 기술을 사용하는 합성 수단으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 500 미만의 아미노산,바람직하게는 100 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50 미만의 아미노산을 갖는 부분 및 다른 변이체는 화학적 경로로 합성할 수 있다. 폴리펩티드는 아미노산이 합성 동안 아미노산 사슬에 순차적으로 부가되는 메리필드 (Merrifield) 수지 상에서의 합성 방법과 같은 상업적으로 이용가능한 고체상 상에서의 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다 (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2146 참조). 고체상 상에서의 수많은 다른 합성 기술이 또한 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Roberge et al., Science (1995), 269, 202-204)]의 방법). 폴리펩티드의 자동 합성을 위한 장비는 어플라이드 바이오시스템즈 인크. (Applied Biosystems, Inc.; Foster City, CA, USA)과 같은 공급회사로부터 입수가능하며, 이어서 폴리펩티드의 합성은 제조회사의 권장사항에 따라 수행할 수 있다.
단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드:
일반적으로, 본 발명에 기술된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 단리될 수 있다. "단리된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 원래의 환경으로부터 제거된 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드이다. 예를 들어, 천연 단백질은 자연계에 공존하는 생물학적 물질로부터 분리되는 경우 단리된 것이다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자연 환경의 일부가 아닌 벡터 내에서 클로닝되는 경우 단리된 것으로 간주된다.
시그날 서열:
단백질이 시그날 서열을 갖는지 여부를 예측하기 위한 방법이 상기 서열에 대한 절단 지점을 예측하기 위한 방법과 유사하게 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[McGeoch, Virus Res. (1985), 3, 271-286]의 방법에서는 완전 단백질 (전달되지 않은)의 대전되지 않은 영역의 짧은 N-말단의 대전된 서열에 대한 정보를 이용한다. 문헌 [Von Heinje, Nucleic Acid Res. (1986), 14, 4683-4690]의 방법에서는 절단 위치를 에워싸는 잔기에 대한 정보를 이용한다. 이들 각 방법에 대한 포유동물의 공지의 분비 단백질의 절단 위치 예측 정확도는 75-80％이다. 그러나, 두가지 방법이 항상 주어진 단백질에 대한 동일한 절단 위치를 예측하는 것은 아니다.
본 발명의 경우에서, 분비되는 폴리펩티드의 추정 아미노산 서열은 SignalP (Sequence Analysis Software Package of the Genetic Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA)로 불리는 컴퓨터 프로그램에 의해 분석하였다. 상기 컴퓨터 프로그램은 아미노산 서열에 기초하여 단백질의 세포내 위치를 예측한다.
몇몇 경우에 분비형 단백질의 시그날 서열 절단은 균일하지 않으며, 따라서 몇가지 분자종을 형성시키는 것으로 또한 인정된다. 상기 폴리펩티드와 이들 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.
더욱이, 상기 언급된 분석에 의해 확인된 시그날 서열은 천연 시그날 서열을 예측할 수 없다. 예를 들어, 천연 시그날 서열은 예측된 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 그러나, 상기 시그날 서열이 분비되는 단백질을 소포체를 향해 지향시킬 가능성이 있다. 상기 폴리펩티드와 이들 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.
절단 위치는 때때로 종들마다 다르며 정확하게 예측될 수 없다.
메티오닌으로 시작하는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 결정된 서열에 의해 확인되는 반면, 다른 판독 프레임은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 분자 생물학 기술을 이용하여 쉽게 번역된다. 이들 별도의 개방 판독 프레임에 의해 생산된 폴리펩티드도 또한 본 발명에서 고안된다.
항체 및 그의 단편
본 발명은 세포 증식의 조절과 관련된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합제를 제공한다. 상기 결합제는 세포 증식의 조절과 관련된 단백질 또는 그의 일부 또는 변이체와 (예를 들어 ELISA 시험에 의해) 검출가능한 수준으로 반응하고 다른 단백질과는 검출가능한 방식으로 반응하지 않는 경우 세포 증식을 조절하는 단백질에 "특이적으로 결합하는" 것으로 칭해진다. "결합"은 복합체를 형성시키는 2개의 별개의 분자 사이의 비공유 회합을 의미한다. 결합 능력은 예를 들어 복합체의 형성에 대한 결합 상수의 결정에 의해 평가할 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도를 각 성분들의 농도의 값의 합으로 나누어 얻은 값이다. 일반적으로, 2개의 분자는 결합 상수가 103 l/mol에 도달할 때 "결합된" 것으로 불린다. 결합 상수는 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
상기 기준을 만족시킬 수 있는 모든 물질이 결합제로서 간주될 수 있다.
본 발명에서, 결합제는 바람직하게는 항체 또는 그의 단편이다. 항체는 당업계의 숙련인에게 이용가능한 임의의 기술로 제조할 수 있다 (Harlow and Lane, Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조). 일반적으로, 항체는 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에 의해 또는재조합 항체를 생산하기 위하여 박테리아 또는 포유동물의 숙주 세포에 대한 항체 유전자의 형질감염을 통해 생산될 수 있다.
다른 기술들 중에서, 이하 기재된 기술을 사용하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드를 함유하는 면역원을 일군의 포유동물 (예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소)에 주입한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형없이 면역원으로서 역할을 할 수 있다. 별법으로, 특히 작은 펩티드에 대해 폴리펩티드가 소 혈청 알부민 또는 삿갓조개 (limpet) 헤모시아닌과 같은 수송 단백질에 연결되면 뛰어난 면역 반응이 유발될 수 있다. 면역원은 바람직하게는 소정 스케줄에 따라 숙주 동물에 주입되고, 상기 동물은 주기적으로 출혈시킨다. 따라서 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체는 예를 들어 적합한 고체 지지체에 연결된 펩티드를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
융합 단백질:
본 발명에 따른 단백질의 세포내 (subcellular) 위치, 특히 서열 8의 단백질의 세포내 위치를 분석하기 위하여 임의의 융합 유전자가 당업계의 숙련인에 의해 생산될 수 있다. 많은 플라스미드 구조물, 예를 들어 단백질 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST) 또는 그린 플루오레슨트 단백질 (GFP)와 같은 형광 단백질 또는 또한 비소모적인 방식으로 폴리-히스티딘 마킹이 상업적으로 입수가능하다.
인간 진핵 숙주 세포 (예를 들어 HEK-293)를 세포의 정상 대사작용 및 보다 우수한 형질감염 효율을 허용하는 형질감염 프로토콜 이전에 24시간 동안 2차배양한다. 증가하는 농도 (1, 5 및 10 ㎍)의 태그 단백질 (GFP, GST 또는 태그 히스티딘)을 함유하는 벡터 단독, 또는 태그 단백질과 융합된 서열 4의 폴리뉴클레오티드, 서열 5의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 9의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제조회사(Qiagen)의 권장사항에 따라 시약 이펙텐 (등록상표, Effectene)을 사용하여 생산한다.
이어서 단백질의 위치를 검출하기 위하여 공초점 현미경으로 세포를 분석한다. 예를 들어 단백질이 분비되는 것으로 의심되는 경우, 상등액을 회수하고 동결건조시켜 아크릴아미드 겔에 적용하고, 태그 단백질에 대항하여 작용하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 기술로 분석한다.
제약 조성물:
본 발명의 특정 측면에 따라, 폴리펩티드, 항체 및(또는) 핵산과 같은 생성물을 제약 조성물 또는 백신에 포함시킬 수 있다. 제약 조성물은 1종 이상의 이들 생성물과 1종 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 (담체)를 포함한다. 선택적으로 백신으로 사용될 수 있는 몇몇 제약 조성물은 1종 이상의 폴리펩티드 및 면역 반응 활성화제, 예를 들어 어쥬번트 또는 리포좀 (그 내부에 생성물이 포함된다)을 포함할 수 있다. 제약 조성물 및 백신은 또한 투여 시스템, 예를 들어 생분해성 미세구를 함유할 수 있다. 본 발명의 명세서의 범위 내의 제약 조성물 및 백신은 또한 생물학적 활성 또는 불활성일 수 있는 다른 생성물을 함유할 수 있다.
제약 조성물 또는 백신은 상기 기재된 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유할 수 있어서, 상기 폴리펩티드가 계내에서(in situ) 생성되도록 한다. 앞서 언급한 바와 같이, DNA는 핵산, 박테리아 또는 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당업계의 숙련인에게 알려진 임의의 투여 형태로 존재할 수 있다. 적절한 핵산 발현 시스템은 환자에서 발현에 필요한 DNA 서열을 함유한다.
박테리아에 기초한 투여 시스템은 그 표면에서 폴리펩티드의 면역원 부분을 발현하는 박테리아 (예를 들어 Bacillus-Calmette-Guerrin)의 투여를 포함한다. 바람직하게는, DNA는 비병원성 (결함) 제제의 사용을 포함하는 바이러스 발현 시스템 (예를 들어 수두 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입시킬 수 있다.
당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본 발명의 제약 조성물에서 사용될 수 있지만, 담체의 종류는 선택된 투여 방법에 따라 변할 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, 외용, 비강, 정맥내, 두개내, 복막내, 피하 및 근육내 경로를 포함하는 각각의 적절한 투여 방법을 위해 제형화될 수 있다.
피하 주사와 같은 비경구 투여를 위해, 담체는 바람직하게는 물, 염, 알코올, 지방, 파라핀 또는 완충액을 함유한다. 경구 투여를 위해, 상기 언급된 임의의 담체 또는 고체 담체, 예를 들어 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 및 탄산마그네슘이 사용될 수 있다. 생분해성 미세구가 또한 본 발명의 제약 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 몇몇 외용 적용을 위해, 크림 또는 로션과 같은 제형이 바람직하다.
상기한 조성물은 또한 완충액 (예를 들어 중성 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물 (예를 들어 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글라이신, 항산화제, 킬레이팅제, 예를 들어EDTA 또는 글루타티온, 어쥬번트 (예를 들어 수산화알루미늄) 및(또는) 보존제를 포함할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물 형태로 존재할 수 있다. 생성물은 또한 표준 기술을 이용하여 리포좀 내에 캡슐화시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 면역 반응을 유발시키기 위해 다양한 어쥬번트가 각각 백신에서 사용될 수 있다. 대부분의 어쥬번트는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하는 물질, 예를 들어 수산화알루미늄 또는 광유 및 면역 반응 자극제, 예를 들어 리피드 A, 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacteium tuberculosis)로부터 유래된 단백질을 함유한다. 예를 들어 프로인트 (Freund) 어쥬번트 및 완전 어쥬번트 (Difco Laboratories, Detroit, MIY, USA; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ, USA)), 생분해성 미세구; 모노포스포릴 리피드 A 및 사이토카인, 예를 들어 GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 적합한 어쥬번트가 상업적으로 입수가능하다.
상기한 조성물은 또한 지연 제형 (즉, 투여후 물질의 느린 방출을 일으키는 캡슐 또는 스폰지와 같은 제형)의 형태로 투여될 수 있다. 상기 제형은 일반적으로 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 기술을 사용하여 제조되어 예를 들어 경구, 직장 경로 또는 피하 이식 또는 목적하는 표적 위치에서의 이식에 의해 투여될 수 있다. 지연 제형은 담체 매트릭스에 분산되고(되거나) 확산 멤브레인에 의해 보호된 저장기 내에 함유된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 함유할 수 있다. 상기 제형에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고, 또한 생분해성이어야 하며, 바람직하게는 상기 제형은 비교적 일정한 활성 성분 방출 수준을 제공한다. 지연 제형에 함유된 활성 생성물의 양은 이식 위치에 따른다.
항암 치료:
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기한 생성물은 항암 치료에 사용될 수 있다. 특히, 세포 증식의 조절과 관련된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 특발성 유방암 또는 전립선암에서 성장을 억제하고 세포 증식의 조절을 유발시키기 위해 사용될 수 있다.
상기한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 흑색종, 다중 형태의 교모세포종, 폐암 뿐만 아니라 결장직장암을 포함하는 수많은 암종의 치료를 위해 사용될 수 있다. 상기한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 활성화시키는 물질이 또한 상기 치료의 틀 내에서 사용될 수 있다.
본 발명의 이들 측면에 따라, 생성물 (폴리펩티드 또는 핵산일 수 있음)은 바람직하게는 상기한 제약 조성물에 포함된다.
치료에 적합한 환자는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 인간이다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 환자는 암에 걸린 것으로 진단되거나 진단되지 않을 수 있다. 즉, 상기한 제약 조성물은 상이한 질병 단계에서 암의 발생을 억제하기 위해 사용될 수 있다 (암의 출현을 예방하기 위해 또는 암으로 고통받는 환자를 치료하기 위해).
본 발명의 제약 조성물은 치료하기 위한 각각의 특정한 암에 적절한 방식으로 투여된다.
투여 경로, 지속기간 및 빈도는 환자의 상태, 질병의 종류와 심도 및 투여 방법에 기초하여 결정될 것이다. 투여 경로와 빈도는 개인마다 다를 수 있다. 일반적으로, 제약 조성물 및 백신은 주사에 의해 (예를 들어 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하 경로), 비강내 경로로 (예를 들어 흡입에 의해) 또는 경구 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10회 투여량을 52주 기간에 걸쳐 투여할 수 있다. 대안적인 프로토콜이 각 환자에 대해 개별적으로 적절할 수 있다.
일반적으로, 적절한 복용량과 치료 체제는 활성 생성물을 치료 및(또는) 예방상 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 함유한다. 이에 의해 치료받지 않거나 보다 낮은 투여량으로 치료받는 환자에 비교하여 치료받는 환자에서 개선된 임상 성과의 확립을 이끌 수 있다 (예를 들어 보다 빈번한 완화, 완전, 부분 또는 보다 긴 질병 부재 상태에서 생존).
본 발명의 다른 측면에 따라, 폴리펩티드는 100 ㎍ 내지 5 mg의 투여량으로 투여할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 분자는 일반적으로 상당한 폴리펩티드 수준을 생성시키기에 충분한 양으로 투여할 수 있다. 적절한 투여량은 일반적으로 실험 모델 및(또는) 임상 시험을 이용하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 효과적인 치료를 제공하기에 충분한 최소 투여량의 사용이 바람직하다. 환자를 일반적으로 당업계의 숙련인에게 친숙할 것임에 분명한 치료 또는 예방 조건에 적합한 시험을 이용하여 치료의 유효성에 관하여 모니터링할 수 있다.
암의 검출 및 모니터링 방법:
본 발명에 기재된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체는 환자에서 암의검출을 위한 많은 방법에서 사용될 수 있다. 숙주 세포에서 본 발명에서 기재한 바와 같은 세포 증식의 조절과 관련된 폴리펩티드 및(또는) 폴리뉴클레오티드의 존재는 분화와 세포 성장의 중단의 지표이다. 따라서, 세포 증식의 조절과 관련된 서열은 정상 세포와 악성 세포를 구별하는 마커로서 사용될 수 있다 (그리고 의사는 그 결과를 예를 들어, 전립선암, 유방암, 폐암 및 결장암의 진단에 이용할 수 있다). 세포 증식의 조절과 관련된 서열은 또한 치료를 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.
항체의 사용을 포함하는 방법은 연구자가 임의의 이용가능한 생물학적 시료에서 본 발명에 기재된 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하도록 허용할 수 있다. 이용가능한 생물학적 시료는 종양 조직 및 건강한 조직의 생체검사물, 환자로부터 얻은 상기 조직으로부터의 균질화물 또는 추출물을 포함한다. 시료 내에서 폴리펩티드 마커의 검출을 위한 항체의 사용에 대해 매우 많은 종류의 시험이 당업계의 숙련인에게 알려져 있다 (예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조).
예를 들어, 시험은 단백질 제제를 전기영동 겔에 적용하고, 적합한 멤브레인에 옮기고 항체와 반응시키는 웨스턴 블롯 기술에 따라 수행할 수 있다. 이어서 멤브레인 상의 항체의 존재는 후술하는 바와 같이 적합한 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 폴리펩티드에 결합된 고체 지지체 상에 고정된 항체의 사용을 포함하는 시험을 수행할 수 있다. 결합된 폴리펩티드는 제2 항체또는 태그 잔기를 함유하는 다른 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 폴리펩티드를 태그 잔기로 마킹하고, 항체를 시료와 함께 인큐베이션한 후 고정된 항체에 결합시키는 경쟁적 시험을 이용할 수 있다. 항체에 대한 마킹된 폴리펩티드의 결합을 억제하는 시료의 성분의 능력이 시료와 고정된 항체와의 반응성의 표지이고, 따라서 시료 내 폴리펩티드의 농도의 표지이다.
고체 지지체는 그 위에 항체가 부착될 수 있는 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 미세적정판 내의 시험 웰 또는 니트로셀룰로스로 제조된 필터 또는 임의의 다른 적합한 멤브레인일 수 있다. 별법으로, 지지체는 비드, 유리, 플라스틱 물질 또는 라텍스, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드일 수 있다. 지지체는 또한 자성 입자일 수 있다.
항체는 당업계의 숙련인에게 공지되고 과학 문헌에 널리 기재된 다양한 기술을 이용하여 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 본 발명의 문맥 내에서, 용어 "고정"은 비공유 회합, 예를 들어 흡착 및 공유 결합 (항원과 지지체 상의 관능기 사이의 직접 결합 또는 결합제를 사용하여 형성된 결합일 수 있음) 모두를 의미한다. 미세적정판의 웰 또는 멤브레인에 대한 흡착에 의한 고정이 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 항체를 적합한 완충액 중에 고체 지지체의 존재 하에 적합한 시간 동안 놓아둠으로써 달성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 변하지만, 대개 1 시간 내지 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 (예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드) 미세적정판의 웰을 1 pg 내지 10 ng, 바람직하게는 100 내지 200 ng의 항체의 존재 하에 놓아두는 것이 적합한 양의 폴리펩티드를 고정시키기에 충분하다.
고체 지지체에 대한 항체의 공유 결합은 또한 지지체를 지지체와 항체 상의 관능기, 예를 들어 히드록실 또는 아미노기와 반응하는 이중관능성 시약과 반응시킴으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체는 벤조퀴논을 사용하여 또는 표준 기술에 따라 지지체 상의 알데히드기와 아민 및 파트너 상의 활성화된 수소의 축합에 의해 적절한 중합체로 덮힌 지지체에 공유 방식으로 결합될 수 있다.
몇몇 경우, 시료 내의 폴리펩티드의 검출을 위한 방법은 이중 항체 "샌드위치 (sandwich)" 시험이다. 상기 시험은 시료 중의 폴리펩티드가 고정된 항체에 결합할 수 있도록, 미세적정판 웰과 함께 고체 지지체 상에 고정된 항체를 생물학적 시료의 존재 하에 놓음으로써 수행할 수 있다. 비결합된 생성물은 폴리펩티드-항체 복합체로부터 제거되고, 폴리펩티드의 상이한 부위에 결합할 수 있는 제2 항체 (태그 잔기를 함유하는)를 첨가한다. 이어서 고체 지지체에 결합되어 유지되는 제2 항체의 양은 태그 잔기에 특이적인 적절한 방법을 이용하여 측정한다.
보다 구체적으로, 항체를 상기한 지지체에 고정시킬 때, 단백질 결합 위치는 대개 차단된다. 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 차단제, 예를 들어 소 혈청 알부민 또는 트윈 (Tween) 20™ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA)을 사용할 수 있다. 이어서 고정된 항체를 시료와 함께 인큐베이션시키며, 폴리펩티드는 항체에 결합할 수 있다. 시료는 인큐베이션하기 전에 인산염 완충 염수 (PBS) 용액과 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다.
일반적으로, 적절한 접촉 시간 (즉, 인큐베이션 시간)은 개체로부터 얻은 시료 내의 폴리펩티드의 존재의 검출을 위해 충분한 시간이다. 바람직하게는, 그렇게 한정된 접촉 시간은 결합된 펩티드와 비결합된 펩티드 사이의 평형에 도달한 수준의 적어도 95％의 결합 수준에 도달하기에 충분하다. 당업계의 숙련인은 평형에 도달하기 위해 필요한 시간은 일정 시간에 걸쳐 결합 수준을 측정함으로써 결정되어야 함을 알 것이다. 주변 온도에서, 30분의 인큐베이션 시간이 일반적으로 충분하다. 이어서 비결합된 생성물은 고체 지지체를 0.1％의 트윈 (Tween) 20™을 함유하는 인산염 완충 염수와 같은 적절한 완충액으로 세척함으로써 제거할 수 있다. 이어서 태그 잔기를 함유하는 제2 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다.
태그 잔기는 바람직하게는 효소 (예를 들어 퍼옥시다제), 코팩터 기질, 염색 억제제, 발광기, 형광기 및 비오틴을 포함한다. 태그 잔기에 대한 항체의 결합은 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 방법을 이용하여 달성할 수 있다.
이어서 제2 항체를 항체-폴리펩티드 고정된 복합체와 함께 결합된 폴리펩티드의 검출을 허용하는 충분한 시간 동안 인큐베이션한다.
적절한 시간은 일반적으로 일정 기간에 걸쳐 결합 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이어서 비결합된 제2 항체는 제거되고, 결합된 제2 항체를 태그 잔기를 사용하여 검출한다. 태그 잔기의 검출을 위해 사용된 방법은 태그 잔기의 성질에 따른다. 방사성기에 있어서, 신틸레이션 또는 자동-방사선사진 계수법이 일반적으로 적절하다. 염색제, 형광 또는 발광기를 검출하기 위해 분광법이 사용될 수 있다. 비오틴은 태그 잔기에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다 (방사성 또는 형광기 또는 효소와 함께). 효소 활성의 태그 잔기는 일반적으로 기질을 첨가한 후 (일반적으로 적합한 시간에 걸쳐), 반응 산물의 분광 (또는 다른) 분석에 의해 검출할 수 있다.
암의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 고체 지지체에 결합된 태그 잔기에 의해 검출되는 시그날을 일반적으로 비종양 조직으로부터 확립된 값에 대응하는 시그날과 비교한다. 바람직하게는, 한계값은 비고정된 항체를 암이 없는 환자로부터의 시료와 함께 인큐베이션할 때 얻은 평균 시그날이다. 일반적으로, 소정의 한계값의 표준 편차의 3배 이상 또는 3배 미만에 대응하는 시그날을 생성하는 시료가 표지 시료인 것으로 간주된다.
보다 상세한 내용에 대해서는, 당업계의 숙련인은 문헌[Sackett et al., Clinicat Epidemiotogy. A basic Science for Clinical Medicine, p. 106-107 (Little Brown and Co., 1985)]을 참조할 것이다.
환자에서 암의 존재 또는 부재는 또한 소정의 한계값에 비해 생물학적 시료 (예를 들어 생체검사물) 내의 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준을 평가하여 결정할 수 있다.
상기 평가는 예를 들어 계내 혼성화 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭과 같은 당업계의 숙련인에게 공지된 많은 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 상기한 방법에 사용되는 프로브 및 프라이머는 일반적으로 실시예에 나열된 서열 또는 다른 개체에서 확인된 유사한 서열로부터 생성시킬 수 있다. 프로브는 표준 혼성화 기술에서 사용될 수 있으며, 프로브의 검출을 용이하게 하기 위해 검출제로 마킹될 수 있다. 상기 시약은 방사성핵종, 형광 염색제 및 검출가능한 생성물의형성을 촉매할 수 있는 효소를 포함한다 (이에 제한되지는 않는다).
프라이머는 일반적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 예를 들어 PCR이 역전사와 연합하여 사용되는 RT-PCR을 포함한 검출 방법에서 사용될 수 있다. 전형적으로, RNA는 시료 조직으로부터 추출되며, cDNA 분자의 생산을 위해 역방식으로 전사된다. 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 증폭으로 세포 증식의 조절과 관련된 cDNA 분자를 생성하며, 상기 분자는 예를 들어 전기영동 겔을 사용하여 분리하고 가시화될 수 있다. 증폭은 대개 동일 개체의 종양 및 비종양 조직쌍 또는 또한 상이한 개체의 종양 및 비종양 조직쌍으로부터 얻은 시료에 대해 수행한다. 증폭 반응은 2차 배수를 적용하는 cDNA의 연속 희석액에서 수행할 수 있다. 비종양 시료의 동일한 희석액과 비교시에 종양 시료의 희석액에서의 2 이상의 인수 발현에 의한 변형이 일반적으로 표지로 간주된다.
진단을 확정하는 것을 목표로하는 몇몇 시험은 종양에 대해 직접 수행할 수 있다.
상기 시험은 종양 세포와 세포 증식의 조절과 관련된 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 단편과의 접촉을 포함한다. 결합된 항체 또는 그의 단편은 태그 잔기를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있다. 상기 항체는 또한 조직학적 용도에서 사용될 수 있다. 별법으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드가 상기 용도에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 암의 진행 및(또는) 치료에 대한 반응은 상기한 임의의 시험을 일정 시간에 걸쳐 수행하고 반응 수준 (즉, 검출된 폴리펩티드또는 mRNA의 양)의 변화를 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 시험은 1 내지 2년의 기간에 걸쳐 매달 수행할 수 있다. 일반적으로, 반응 수준이 시간에 걸쳐 감소하는 환자에서 암은 진행한다. 역으로, 검출된 시그날이 시간에 걸쳐 일정하게 유지되거나 증가할 때 암은 진행하지 않는다.
본 발명에서는 또한 상기한 모든 진단 방법의 사용을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기한 시험을 수행하기 위해 필요한 2가지 성분 (또는 그 이상)을 포함한다. 상기 성분은 생성물, 시약 및(또는) 저장기 또는 장비일 수 있다. 예를 들어, 키트 내부의 저장기는 세포 증식의 조절과 관련된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 상기 항체 또는 단편은 상기한 바와 같이 지지체 물질에 부착되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 부가적인 저장기는 시험에서 사용될 시약 또는 완충액과 같은 성분을 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 결합된 항체의 직접 또는 간접 검출에 적합한 태그 잔기를 함유하는 검출 시약 (예를 들어 항체)를 함유할 수 있다.
결합 또는 조절제의 확인 방법:
본 발명에서는 또한 세포 증식의 조절과 관련된 단백질에 결합하고(하거나) 그의 발현을 조절하는 생성물의 확인 방법을 제공한다. 상기 물질은 일반적으로 본 발명에서 제공된 폴리펩티드를 폴리펩티드 및(또는) 그의 이펙터 (예를 들어, 그의 수용체)와의 상호작용을 허용하기에 충분한 조건 하에 및 충분한 시간 동안 후보 생성물/물질과 접촉시킬 때 확인될 수 있다. 따라서 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 다양한 각각의 결합 시험은 폴리펩티드 또는 그의 이펙터 (예를 들어, 수용체)와 결합되는 후보 생성물의 능력을 시험하기 위해 수행할 수 있다.
다른 시험에서, 상기 물질을 세포 증식의 조절과 관련된 유전자의 발현이 증가하는 것으로 공지된 세포를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 상기 세포는 후보 물질과 접촉될 수 있고, 세포 증식의 조절과 관련된 유전자의 발현은 후보 물질의 부재 하에 관찰된 발현에 대해 평가한다.
별법으로, 후보 물질을 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 발현 (예를 들어, 전사)를 조절하는 그의 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 발현에 대한 후보 물질의 효과를 평가하기 위해, 그의 프로모터 또는 조절 성분을 상기한 바와 같은 태그 유전자에 결합시킬 수 있다. 상기한 구조체는 적합한 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있고, 이후 상기 숙주 세포는 후보 물질과 접촉된다.
상기 숙주 세포는 바람직하게는 조합 화학 프로그램으로부터 기원하는 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된다. 상기 발명직한 실시태양에 따라, 세포를 라이브러리와 함께 인큐베이션한 후에 세포를 용해시키고 상등액을 표준 프로토콜에 따라 태그 유전자의 활성에 대해 분석한다.
태그 유전자의 활성을 증가시키는 생성물은 세포 증식의 조절과 관련된 유전자의 전사의 인듀서이며, 따라서 암의 진행을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
달리 명시하지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 보통 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, 본원에 언급된 모든 문헌, 특허 출원과 모든 특허 및 모든 다른 참고문은참고로 포함된다.
하기 실시예는 상기 절차를 설명하기 위해 제시되며 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
도 1은 1％ 아가로스겔 상에서 분리 및 에티듐 브로마이드 염색을 이용한 가시화 후에 PCR에 의해 얻은 결과를 나타낸다.
도 2는 15개 시료의 유방암 (S1 내지 S15로 칭함)에 대해 서던 블롯으로 얻은 결과를 나타낸다.
도 3은 파트 A에서는 DU 145 (전립선암) 세포 내에서 서열 4의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA의 발현을, 파트 B에서는 서열 4의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 농도가 증가하는 발현 벡터의 존재 하에 세포 성장의 억제를 보여준다.
마지막으로, 도 4는 파트 A에서는 DU 145 (전립선암) 세포 내에서 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA의 발현을, 파트 B에서는 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 농도가 증가하는 발현 벡터의 존재 하에 세포 성장의 억제를 보여준다.
실시예 1:
cDNA 단편 서열 4 및 서열 5의 단리 및 특성화
EST를 함유하는 공개 데이타베이스에 존재하는 DNA 서열 1(Genbank, 수탁번호 AA176076)을 채택하였고, 그 서열은 다음과 같다.
상기 서열로부터, 대응 유전자를 코딩하는 완전 개방 판독 프레임을 함유하는 완전 cDNA의 클로닝을 허용하는 프로브를 얻기 위해 각각 서열 2 및 서열 3 (아래에 나타냄)의 한쌍의 프라이머 5' Fwd1 및 3' Rev1를 합성하였다.
서열 2 및 서열 3은 다음과 같다.
개시기에, 서열 2 및 서열 3의 프라이머를 사용하여 상업적으로 입수가능한일련의 cDNA 뱅크에 대해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하였다. 반응 조건은 0.5 μM의 Fwd1 (서열 2) 및 Rev1 (서열 3), 200 μM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (또는 dNTPs: dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2및 0.5 U Taq DNA 폴리머라제를 최종 부피 50 ㎕ 중에 포함한다. 열 사이클 파라미터는 94℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 1분간 프라이머의 혼성화 및 72℃에서 30초 동안 중합 신장 (5분의 최종 신장과 함께)을 포함한다.
PCR에 의해 얻은 생성물을 1％ 아가로스겔 상에서 분리하고 에티듐 브로마이드 염색을 이용하여 가시화하였다. 그 결과는 인간 대뇌, 뇌하수체, 폐, 신장 및 내장 (Quantum)으로부터의 cDNA 뱅크에서 245 염기쌍과 인간 유방 및 전립선으로부터 cDNA 뱅크에서 290 염기쌍의 밴드를 보여주었다. 이들 결과를 도 1에 도시하였다.
이와 같이 PCR에 의해 얻은 생성물을 전기-용출에 의해 정제하여 ClonCapture cDNA 클로닝 키트 (Clontech)의 사용에 대한 제조회사의 권장사항을 사용하여 완전 개방 판독 프레임을 함유하는 cDNA의 클로닝을 위한 프로브로서 사용하였다.
포지티브 클론의 핵산 서열을 자동화 시퀀서를 사용하여 결정하였다. 이들은 아래에 나타낸 서열 4 및 서열 5이었다.
-서열 4:
-서열 5:
실시예 2
서열 4 및 서열 5의 발현 벡터내 클로닝
서열 4 및 서열 5의 핵산 서열을 기초로 서열 6 및 서열 7 (아래에 나타냄)의 각각의 서열의 신규한 프라이머 5' F1 및 3' R1을 합성한다. 이들 서열은 각각HindIII 및 EcoRI 제한효소 부위를 함유한다.
서열 6 및 서열 7은 다음과 같다.
프라이머 서열 6 및 서열 7을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 동일한 반응 조건을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응에 의해 얻은 생성물을 pCDNA3.1 (InVitrogen) 종류의 발현 벡터 내로 직접 그러나 비배타적인 방식으로 삽입시킬 수 있다. PCR 증폭 단계 이후, 이들 서열을 함유하는 말단을 방출시키기 위해 생성물을 HindIII 및 EcoRI으로 가수분해시킨 다음 전기용출에 의해 아가로스겔로부터 정제하였다.
이어서 서열 4 및 서열 5를 예를 들어 pCDNA3.1 (InVitrogen)과 같은 발현 벡터 내로 삽입시켰다. 상기 발현 벡터를 수용한 상이한 박테리아 클론을 적합한 제한 효소에 의한 소화작용에 의해 분석함으로써 신규한 "발현 벡터/서열 4" 또는 "발현 벡터/서열 5" 구조체를 함유하는 박테리아 클론을 단리하는 것이 가능해진다.
다량의 이들 플라스미드 구조체의 제조를 플라스미드 DNA 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행하였다.
<서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 특성>
인간 종양 조직 내에서의 서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 발현
세포 배양물 및 종양 조직으로부터 RNA의 제조
배양물 또는 종양 조직 내의 세포를 전체 RNA의 추출 단계 이전에 -80℃에서 유지시켰다. 전체 RNA의 추출은 시약 Trizol (Gibco/BRL)을 사용하는 학술 문헌 (Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162, 156)에 기재된 기술에 기초하였다. 이렇게 추출된 RNA의 양을 에티듐 브로마이드의 존재 하에 1％ 아가로스겔 상에서 분석하였다.
RNA로부터 역전사
전체 RNA를 제조회사 매뉴얼 (Gibco/BRL)에 제시된 바와 같이 수퍼스크립트 (등록상표, Superscript) 역전사효소를 사용함으로써 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 역방식으로 전사하였다.
역전사로부터 얻은 생성물에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)
서열 4 또는 서열 5의 발현은 각각 서열 2 및 서열 3의 프라이머 5' Fwd1 및 3' Rev1을 사용하여 역전사 생성물에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 분석하였다. 반응 조건은 0.5 μM의 Fwd1과 Rev1, 200 μM의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2및 0.5 U Taq DNA 폴리머라제를 최종 부피 50 ㎕ 중에 포함한다. 열 사이클 파라미터는 94℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 1분간 프라이머의 혼성화 및 72℃에서 30초 동안 중합 신장 (5분의 최종 신장과 함께)을 포함한다.
PCR에 의해 얻은 생성물을 1％ 아가로스겔 상에서 분리하고 에티듐 브로마이드 염색을 이용하여 가시화하였다.
몇몇 경우에, 랜덤 표지 키트 (Pharmacia)를 사용하여 alphaP32-dCTP로 마킹된 서열 4를 프로브로서 사용하여 나일론 멤브레인 상에서의 혼성화 분석을 수행하였다. 이어서 멤브레인을 저엄격도 조건 (2 XSSC, 0.1％ SDS, 60℃에서) 하에 이어서 고염격도 조건 (0.1 XSSC, 0.1％ SDS, 65℃에서) 하에 세척하였다. 이어서 멤브레인을 코닥 (Kodac) XAR 필름에 노출시켰다.
유방암 시료에서 서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 발현의 분석
서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 발현의 분석은 유방암 환자로부터 외과적으로 제거한 15개의 종양 시료에서 수행하였다.
상기한 프로토콜에 따라 얻은 cDNA는 시료들 사이의 RNA 또는 cDNA의 양의 변동을 조절하기 위해 안정한 방식으로 발현된 G3PDH (글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제) 마커를 사용하여 표준화시켰다. 이어서 PCR 반응 생성물을 상기한 프로토콜에 따라 나일론 멤브레인 상에서 혼성화시켰다.
도 2에 나타낸 수득한 결과는 본 연구에 의해 서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드의 존재가 유방암으로부터의 종양 시료에서 가시화될 수 있음을 보여준다.
서열 4 및 서열 5의 폴리뉴클레오티드에 의한 세포 증식의 억제
DU 145 (Code ATCC) 전립선암 세포를 100 U/ml의 페니실린과 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 술페이트를 함유하고 10％ 태송아지 혈청을 보충한 DMEM 배지 (둘베코 개질 이글 배지) 내에서 배양하였다. 세포를 세포의 정상 대사작용 및 보다 우수한 형질감염 효율을 허용하는 형질감염 프로토콜 이전에 24시간 동안 2차배양하였다. 증가하는 농도 (1, 5 및 10 ㎍)의 벡터 단독 (pCDNA3.1), 또는 서열 4의 폴리뉴클레오티드 (1, 5 및 10 ㎍) 또는 서열 5의 폴리뉴클레오티드 (1, 5 및 10 ㎍)를 함유하는 벡터를 제조회사(Qiagen)의 권장사항에 따라 시약 이펙텐 (등록상표, Effectene)을 사용하여 수득하였다.
세포를 트립신 처리에 의해 형질감염시키고, 48시간 후에 회수한 다음 계수하였다. 동일한 온도에서, 상기한 바와 같이 RNA의 추출을 위해 세포를 5000 rpm으로 원심분리한 다음 -80℃에서 동결시켰다 ("세포 배양물 및 종양 조직으로부터 RNA의 제조" 부분 참조).
결과를 도 3 (서열 4의 폴리뉴클레오티드) 및 도 4 (서열 5의 폴리뉴클레오티드)에 나타냈다. 도면들은 서열 4의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA 또는 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 cDNA가 서열 4의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 양에 비례하여 발현되는 것을 보여준다 (파트 A). 더욱이, 그 결과는 10 ㎍의 벡터 단독으로 형질감염된 세포의 성장에 대하여 세포의 성장이 농도가 증가하는 서열 4의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 존재 하에 유의하게 억제되는 것을 보여준다 (파트 B). 종양 세포 성장의 억제와 서열 4의 폴리뉴클레오티드 또는 서열 5의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 형질감염된 벡터의 양 사이의 상관성은 각각 1 또는 0.96이다.
서열 5의 단편으로부터 코딩된 폴리펩티드
서열 5에서, 위치 420에서 개시 메티오닌을 코딩하는 개시 코돈 (ATG) 및 위치 861에서 정지 코돈 (UAA)의 존재 하에 개방 판독 프레임이 관찰된다. 147개의아미노산으로 이루어진 서열 8의 단백질은 번역된 폴리뉴클레오티드에 상응하고 다음과 같다.
서열 8의 단백질이 대응하는 폴리뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 9의 뉴클레오티드를 갖는다.
Claims (8)
- 폴리뉴클레오티드 서열 5를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 서열을 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드.
- 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 서열 8을 갖는 것인 단리된 폴리펩티드.
- 제3항 또는 제4항에 따른 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 폴리뉴클레오티드 서열 5 또는 폴리뉴클레오티드 서열 5의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 폴리펩티드를코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 의약으로서의 제3항에 따른 단리된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4 또는 폴리뉴클레오티드 서열 4의 상보성 서열에 의해 코딩되는 단백질의 하나 이상의 단편을 포함하는, 세포 증식의 조절과 관련된 단백질의 하나 이상의 면역학적 및(또는) 생물학적 활성 특징을 갖는 단리된 폴리펩티드.
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