CZ20032670A3

CZ20032670A3 - Nový polynukleotid použitelný pro modulaci proliferace rakovinných buněk

Info

Publication number: CZ20032670A3
Application number: CZ20032670A
Authority: CZ
Inventors: Eric Ferrandis; Y Ferrer José Antonio Camara; Jean Martinez; Christophe Thurieau
Original assignee: Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.)
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2004-04-14
Also published as: EP1368474A1; JP2004527240A; CA2437535A1; JP4190291B2; BR0207253A; HUP0303312A2; US20040197783A1; PL365226A1; FR2821624B1; NZ527261A; CN1289670C; RU2003129163A; CA2437535C; ATE351906T1; RU2307666C2; FR2821624A1; EP1368474B1; ES2279877T3; KR100869190B1; US7214533B2

Description

Předložený vynález se týká nového proteinu modulujícího proliferaci rakovinových buněk. S využitím proteinů kódovaných polynukleotidy sekvencí SEQ. ID NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 popsaných dále, je také možné určit stupeň malignity buněk s abnormální proliferaci.

Dosavadní stav techniky

Rakovina je celosvětově jeden z nejzávažnějších zdravotních problémů. I přes významné pokroky, které byly v posledních letech dosaženy v detekci a léčbě rakoviny, neexistuje v současné době žádná vakcina nebo jiný univerzální způsob léčby pro prevenci nebo léčbu rakoviny. Zvládání onemocnění spočívá v kombinaci diagnosticky tak časné, jak je to možné aagresivní léčby zahrnující řadu prvků, jako je chirurgie, radioterapie, chemoterapie nebo také hormonoterapie. Výběr léčby rakoviny je často volen na základě prognostických parametrů, mezi které spadá analýza specifických markérů nádorů. Nicméně použití uznávaných markérů vede často k výsledkům, které jsou obtížně interpretovatelné a stále je u četných pacientů s rakovinou pozorována zvýšená mortalita.

· »

9

999 ·

9« • «

9 ·

9999

9·99

Rakovina prsu a prostaty jsou nejčastější maligní nádory.

Ve Spojených státech je každý rok diagnostikováno 400 000 nový případů a přibližně 100 000 lidí na jejich onemocnění umírá (Harris a kol., New Eng. J. Med. (1992), 327, 319,

390 až 473).

Je uznáváno, že onemocnění se objevuje v průběhu multifaktoriálního procesu, který zahrnuje mutace v omezeném počtu genů, možná 10 nebo méně. Tyto mutace vyvolávají změny růstu a modulaci buněčná proliferace tkání, které jim umožňují růst nezávisle na normálním řízení buněk, vytváření metastáz a vymknutí se z imunitního dohledu. Třídy genů, které se účastní na vzniku rakoviny prsu a prostaty mohou být vysoce specifické pro tyto třídy nádorů. Zejména mutace genů podílejících se na hormonálních odezvách (receptory a ligandy třídy cestrogenů, progesteronu nebo také ještě testosteronu) jsou obzA^rláště důležité, protože povzbuzují pravděpodobně buňky k proliferaci a přitom je činí odolnými vůči protinádorovému účinku těchto hormonů.

Kromě toho změny v genech kódujících růstové faktory, molekulách přenášejících signály, stejně tak jako u faktorů transkripce se často podílí na těchto změnách a mají změny, které jsou samy součástí vývinu a postupu nádorů (King, Nátuře Genetics (1992), 2, 125).

Otázka, která dosud není vyřešena, je povaha změn v genové expresi, které se objevují v lidských nádorových buňkách ireverzibilním způsobem a vedou k buněčné diferenciaci.

·· ·· ·· • · · · ♦ · * • · · · • · ····

Tato informace je přitom velmi důležitá pro definici, na molekulární úrovni, schémat regulace exprese genů, podílejících se na růstu a buněčná diferenciace lidských buněk rakoviny . prostaty a prsu. Existuje proto naléhavá potřeba identifikace genových sekvencí, které se podílejí na ireverzibilní konečné diferenciaci.

V nedávné době, zatímco přihlašovatelé již objevili sekvenci označovanou dále v předloženém vynálezu jako SEQ. ID. NO. 4, byla tato publikována v databázi Genbank pod přístupovým kódem AK000755 a identifikačním číslem 7021039, aniž by byla jakkoli spojena s indikací aktivity proteinů, které mohou být kódovány touto sekvencí.

Předmět vynálezu

Předložený vynález se týká izolovaného polynukleotidu, obsahujícího polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5. Předložený vynález se také týká protisměrného polynukleotidu obsahujícího sekvence komplementární k výše uvedenému izolovanému polynukleotidu a obsahujícímu polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5.

Předložený vynález se také týká izolovaného polynukleotidu, obsahujícího alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polynukleotid je takový, že kóduje polypeptid, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s modulací • 9 buněčné proliferace. Předložený vynález se obzvláště týká izolovaného polypeptidů nukleotidové sekvence

SEQ. ID. NO. 9 nebo izolovaného polypeptidů, který má nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9.

9 9 9 9

9999 9 9 •

Předložený vynález se navíc týká izolovaného polypeptidů, obsahujícího alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s modulací buněčné proliferace. Výhodně uvedený izolovaný polypeptid obsahuje fragment, který má imunologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

Předložený vynález se obzvláště týká proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8 (popsané dále) kódovaného fragmentem polynukleotidu polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 obsaženého mezi bázemi v polohách 420 (iniciační kodon ATG kódující methionin) a 861 (stop kodon UAA), to znamená polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 (popsanou dále).

Předložený vynález se také týká vektoru exprese, který obsahuje izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, polypeptid kódovaný uvedeným izolovaným • ·

polynukleotidem, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Předložený vynález se také týká hostitelské buňky transformované nebo transfektované uvedeným vektorem exprese.

Předložený vynález se také týká monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu antigenu uvedené protilátky, které specificky vážou izolovaný polypeptid popsaný výše, obzvláště monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu antigenu uvedené protilátky, které specificky vážou protein sekvence SEQ. ID. NO. 8.

Předložený vynález se dále týká, jako léčiva, izolovaného polypeptidů, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Uvedený fragment může být obzvláště fragment kódovaný polynukleotidem nukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9, jinak řečeno proteinem sekvence SEQ. ID. NO. 8. Předložený vynález se dále týká, jako léčiva, izolovaného polypeptidů, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

Předložený vynález se ještě týká, jako léčiva, monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid, který obsahuje fragment proteinu kódovaného alespoň jeden polynukleotidovou SEQ. ID. NO. 5 polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo nebo sekvencí komplementární k sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo

SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

Předložený vynález se obzvláště týká, jako léčiva, monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid, kódovaný polynukleotidem pnukleotidové sekvence

SEQ. ID. NO. 9 polynukleotidové protein sekvence nebo sekvencí komplementární k sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno SEQ. ID. NO. 8).

Předložený vynález se navíc týká farmaceutická kompozice, která obsahuje izolovaný polypeptid zahrnující:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5,

nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace; přitom kompozice obsahuje mimo to jeden nebo více farmaceuticky přijatelné excipienty.

týká farmaceutická protein, kódovaný

Předložený vynález se obzvláště kompozice, která obsahuje polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.

Alternativně farmaceutická kompozice podle předloženého vynálezu zahrnuje monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment antigenu, které se specificky vážou na izolovaný polypeptid, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, přitom kompozice obsahuje mimo to jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů.

Předložený vynález se obzvláště týká farmaceutické kompozice, která zahrnuje monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment antigenu, které se specificky vážou na protein, kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.

Ve výhodném provedení uvedené farmaceutické kompozice obsahují také aktivátor imunitní odezvy (kterým může být adj uvans) .

Dodatečným předmětem předloženého vynálezu je použití izolovaného polypeptidu pro přípravu léčiva určeného pro léčbu proliferativní onemocnění, přičemž izolovaný polypeptid obsahuje:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

Předložený vynález se obzvláště týká použití izolovaného polypeptidu pro přípravu léčiva určeného pro léčbu

proliferativní onemocnění, přičemž izolovaný polypeptid je kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno se jedná o protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.

je použití

5,

4,

9, liferativního

Dalším předmětem předloženého vynálezu izolovaného polynukleotidu, který obsahuje:

- buď polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO.

- nebo polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO.

- nebo polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu pro onemocnění.

Použitý izolovaný polynukleotid je výhodně představován polynukleotidem polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.

Uvedený izolovaný polynukleotid je výhodně přítomen ve virovém vektoru, přičemž virový vektor je například zvolen ze souboru, který zahrnuje adenovirus, asociovaný adenovirus, retrovirus a pox virus.

Alternativně se předložený vynález týká monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a která může být používána pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.

Obzvláště mohou být monoklonální protilátka nebo její vazebný fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno se jedná o protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) používány pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.

Ve výhodných provedeních výše uvedených použití je proliferativní onemocnění, které má být léčeno polypeptidem nebo polynukleotidem popsaným výše, rakovina. V ještě výhodnějších provedeních je rakovina zvolena ze souboru, zahrnujícího rakovinu prostaty, rakovinu prsu, rakovinu plic a kolorektální rakovinu.

Předložený vynález navíc přináší způsob určování, zda nádor u pacienta je maligní, přičemž uvedený způsob zahrnuje určení, ve vzorku nádoru, získaného od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň:

Uvedený způsob určování se obzvláště týká určení, ve vzorku nádoru, získaného od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidů, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobu tento způsob zahrnuje uvedení do kontaktu vzorku nádoru s monoklonální protilátkou, která specificky rozpoznává výše uvedený izolovaný polypeptid (obzvláště izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8)).

Předložený vynález se také týká způsobu určování zda nádor u pacienta je malignní, přičemž uvedený způsob zahrnuje • · ·· · ···· • · · · · · ♦ · · · · · · • · ··· ··· ·«· ··· ·· ···· ·· · určení, v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace:

polynukleotidu s polynukleotidovou sekvencí

SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, nebo

- polynukleotidu, jehož nukleotídová sekvence je fragment polynukleotídové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo

SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený fragment kódujíce izolovaný polypeptid, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

Uvedený způsob obzvláště zahrnuje určování, v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Ve výhodném provedení posledně uvedeného způsobu tento způsob zahrnuje následující kroky:

(a) přípravu molekul cDNA vycházejíce z molekul RNA vzorku nádoru, a potom (b) specifickou amplifikaci molekul cDNA, které jsou schopny kódovat alespoň jednu část polypeptidu.

Předložený vynález se ještě týká způsobu sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

• 9 ·· ·9 9 • · 9 9 9 · 9 ·· · · 9 9 · · 9 · 9 • · · · · · • 9 9··· 99 · (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) porovnávání koncentrací určených v kroku (a) v různých časových intervalech.

Uvedený způsob sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou zahrnuje obzvláště v kroku (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Krok (a) výše uvedeného způsobu zahrnuje výhodně uvedení do kontaktu části biologického vzorku s monoklonální protilátkou, která specificky rozpoznává uvedený polypeptid (obzvláště protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) . Ve výhodném • · ·· ·· ·· · ·» ·· · · · · · · · • · · · · ···· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 • · 9 9 9 9 9 9

999 999 99 9999 99 9 provedení výše uvedeného způsobu je biologický vzorek, získaný od pacienta, mimo jiné část nádoru.

Předložený vynález se dále týká způsobu sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta, postiženého rakovinou, který zahrnuje následující kroky:

(a) určení, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace RNA kódující izolovaný polypeptid, které zahrnuje alespoň:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) porovnávání koncentrací určených v kroku (a) v různých časových intervalech (a).

Uvedený způsob sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou zahrnuje obzvláště v kroku (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace RNA kódující izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k ·· ·» • · * 9 • · · • · · · · ·« ···» ·· * • 9 · • 9 19 • ····» • · · ·« · polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace RNA kódující protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobů sledování krok (a) zahrnuje výhodně:

(i) přípravu molekul cDNA, biologického vzorku, a (ii) specifickou amplifikaci schopny kódová alespoň jednu polypeptidu.

vycházejíce z molekul RNA molekul cDNA, které jsou část uvedeného izolovaného

Všechny způsoby určenování a/nebo sledování popsané výše jsou nástroje, které dovolí lékaři formulovat po analýze výsledků svoji diagnózu, týkající se závažnosti a/nebo postupu nebo regrese nádorů uvažovaného pacienta.

Předložený vynález se navíc týká soupravy pro diagnózu proliferativních onemocnění, která obsahuje:

(1) monoklonální protilátku, která váže specificky izolovaný polypeptid, obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, (2) druhou monoklonální protilátku nebo její fragment, která se váže buď k monoklonální protilátce, která byla definovaná v (1), nebo k izolovanému polypeptidu, který byl definovaný v (1), přičemž uvedená druhá monoklonální protilátka je konjugována s reportérovou skupinou.

Uvedená souprava pro diagnózu proliferativních onemocnění může obzvláště být zvolena tak, že fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 je izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace RNA kódující protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Reportérové skupina soupravy pro diagnózu, uvedená výše, je výhodně skupina zvolená ze souboru sloučenin, kteý zahrnuje radioisotopy, fluorescenční skupiny, luminescenční skupiny, enzymy, biotin a obarvené částice.

Předložený vynález se navíc týká způsobu přípravy izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a uvedený způsob přípravy zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky: (a) kultivaci, v podmínkách vhodných pro dosažení exprese uvedeného polypeptidu v hostitelské buňce transformované nebo transfektované vektorem exprese, kde polypeptid zahrnuje izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený « · · · · · izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) izolace polypeptidu, vycházejíce z kultur hostitelských buněk.

Uvedený způsob se obzvláště týká způsobu přípravy izolovaného polypeptidu, kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Předložený vynález nakonec přináší způsob pro identifikaci sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci, který zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky:

(a) uvedení do kontaktu každé testované sloučeniny za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se použité činidlo vázalo na polypeptid, s izolovaným polypeptidem, který obsahuje alespoň:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s podporou buněčného růstu a/nebo diferenciace, a (b) detekce vazby každé testované sloučeniny k uvedenému polypeptidu a identifikace, mezi testovanými sloučeninami, sloučenin schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci.

Uvedený způsob pro identifikaci sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci obsahuje ve svém kroku (a) obzvláště uvedení do kontaktu každé testované sloučeniny za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se použité činidlo vázalo na polypeptid, s izolovaným

polypeptidem, kódovaný	polynukleotidovou	sekvencí
SEQ. ID. NO. 9 nebo	sekvencí	komplementární k
polynukleotidové sekvenci	SEQ. ID.	NO. 9 (jinak	řečeno s
proteinem sekvence SEQ. ID	. NO. 8) .
Alternativní způsob identifikace	sloučenin	schopných
modulovat buněčný růst	a/nebo	diferenciaci	zahrnuj e
následující po sobě jdoucí	kroky:

(a) uvedení každé testované sloučeniny do kontaktu, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby testované činidlo a buňka mohly interagovat, s buňkou schopnou exprimovat izolovaný polypeptid, který obsahuje alespoň:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, • · · • · · · ·

přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein související s modulací buněčného růstu a/nebo diferenciace, a (b) určení účinku každé testované sloučeniny na buněčnou koncentraci polypeptid a identifikace sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci, mezi testovanými sloučeninami.

Uvedený alternativní způsob ve svém kroku (a) obzvláště zahrnuje uvedení každé testované sloučeniny do kontaktu, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby testované činidlo a buňka mohly interagovat, s buňkou schopnou exprimovat izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno s buňkou schopnou exprimovat protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Ve výhodných způsobech provedení způsobů identifikace sloučenin schopných modulovat růst a/nebo diferenciaci popsané výše pocházejí testované sloučeniny z knihoven malých molekul, vytvořených způsoby kombinatorické chemie.

Předložený vynález se navíc týká polynukleotidu, který obsahuje endogenní promotor nebo regulační prvek proteinu související s diferenciací, kde protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci

SEQ. ID. NO. 5.

Předložený vynález se týká také polynukleotidu, který obsahuje detekční gen řízený endogenním promotorem nebo regulačními prvky proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, ve kterém protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5.

Předložený vynález se také týká buňky transformované nebo transfektované takovým polynukleotidem.

Předložený vynález se mimoto týká způsobu identifikace sloučenin schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulací buněčné proliferace, který zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky:

(a) uvedení každé testované sloučeniny za takových podmínek a po takovou dobu, která je dostatečná k tomu, aby testovaná sloučenina interagovala s uvedeným promotorem nebo regulačním prvkem, do kontaktu s buňkou transformovanou nebo transfektovanou polynukleotidem, který obsahuje detekční gen pod kontrolou endogenního promotoru nebo regulačních prvků proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, ve kterém protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, (b) určení účinků každé testované sloučeniny na koncentraci detekčního proteinu produkovaného buňkou a identifikace sloučenin, schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace.

Ve výhodném provedení způsobu identifikace sloučenin schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, který byl uveden výše, pocházejí testované sloučeniny z knihoven malých molekul, vytvořených způsoby kombinatorické chemie.

Farmakologické vlastnosti polynukleotidu a polypeptidu podle předloženého vynálezu činí tyto polynukleotidy a polypeptidy vhodné pro farmaceutické použití. Izolované polypeptidy, které obsahuje alespoň:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, které mají alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein, podílející se na modulaci buněčné proliferace, stejně tak jako polynukleotidy kódující takové polypeptidy, mohou být podle předloženého vynálezu podávány pacientům trpícím rakovinou pro zpomalení rozvoje jejich nádorů nebo pro dosažení regrese uvedených nádorů.

Ve výše uvedených způsobech může být protein, podílející se na modulaci buněčné proliferace nebo diferenciace, obzvláště izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k

polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).

Různé pojmy uvedené výše jsou zřejmé pro odborníka v oboru na základě podrobného popisu různých aspektů předloženého vynálezu.

Podrobný popis různých aspektů předloženého vynálezu

Jako je uvedeno výše, předložený vynález se obecně týká produktů a způsobů určených k ovlivňování buněčného růstu a pro léčbu rakoviny.

Předložený vynález je částečně založen na identifikaci sekvencí souvisejících s modulací buněčné prolíferace, kterými jsou polypeptidové a polynukleotidové sekvence, související s modulací buněčné prolíferace. mRNA související s diferenciací je mRNA, která se nachází ve vyšší úrovni v diferenciovaných buňkách než v odpovídajících nediferenciovaných buňkách (to znamená, že hladina mRNA je alespoň dvakrát vyšší). Molekula cDNA související s diferenciací je sekvence odpovídající mRNA, související s diferenciací (a/nebo sekvence komplementární).

Takové molekuly cDNA mohou být připraveny vycházejíce z přípravy RNA nebo mRNA používajíce standardních způsobů, jako je inverzní transkripce. Obdobným způsobem protein nebo polypeptid související s diferenciací zahrnuje sekvence kódované mRNA související s buněčnou diferenciací.

Farmaceutické kompozice zde popsaný mohou obsahovat jeden nebo více polypeptidů, sekvence! nukleových kyselin a/nebo protilátek. Polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují alespoň jednu část proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace nebo jeho variantu. Sekvence nukleových kyselin podle předloženého vynálezu zahrnují sekvenci DNA nebo RNA, která kóduje alespoň jednu část polypeptidů nebo která je komplementární k takové kódující sekvenci.

Protilátky jsou proteiny imunitního systému nebo jejich fragmenty vazby antigenu, které jsou schopny vázat části polypeptidů, popsaných výše.

Alternativně může kompozice zahrnovat jedno nebo více činidel, které modulují expresi genu, souvisejícího s modulací buněčné proliferace.

Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu:

Předložený vynález se obzvláště týká polynukleotidů, které mají sekvence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9, stejně tak jako polypeptidů, které mají sekvenci SEQ. ID. NO. 8.

Předložený vynález se také týká polynukleotidů, které mají polynukleotidové sekvence, které vykazují homologii alespoň 75 %, výhodněji alespoň 85 % a ještě výhodněji alespoň 90 %, například 95 % s polynukleotidovými sekvencemi popsanými • ·· · · výše, zejména se sekvencemi SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9. To dalších polynukleotidů, předloženého vynálezu, sekvenci SEQ. ID. NO. 8.

se také týká mutatis mutandis polypeptidu a proteinů podle zejména proteinů, které mají

Předložený vynález se také týká izolovaných polynukleotidů a polypeptidů. Polynukleotid nebo polypeptid se nazývá „izolovaný, pokud je vyjmut za svého původního prostředí. Polynukleotid nebo polypeptid se nazývá izolovaný zejména pokud je separován od biologického materiálu, se kterým koexistuje v přírodním systému.

Podle předloženého vynálezu mohou být polynukleotidové sekvence, které kódují polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu a jejich fragmenty nebo fúzované proteiny vycházející z těchto polypeptidů a proteinů, používány pro generování rekombinantních molekul DNA, které řídí expresí takových polypeptidů a proteinů, nebo jejich aktivních částí, ve vhodných hostitelských buňkách. Alternativně mohou být polynukleotidové sekvence, které hybridizují s částmi polynukleotidových sekvencí podle předloženého vynálezu také používány v testech hybridizace nukleových kyselin jako je například Southern blot, Nothern blot a podobně.

V důsledku degenerace genetického kódu mohou být i další polynukleotidové sekvence DNA, kódující v zásadě polypeptidy nebo proteiny podle předloženého vynálezu, použity pro klonování a expresi uvedených polypeptidů nebo

9 9 9 9 9 9

9 9 99 9·999

999 999 99 proteinů. Takové sekvence DNA zahrnují sekvence, které hybridizují s polynukleotidovými sekvencemi polynukleotidů podle předloženého vynálezu za jistých podmínek stringence, které mohou být upraveny různým způsobem. Tak například v průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) může být nastavena teplota, za které hybridizují primery s matricí a nebo koncentrace MgCl₂ v reakčním pufru. Za podmínek používání radioaktivně označených fragmentů DNA nebo oligoneukleotidů pro sondování membrán, může být stringence nastavena změnou iontových sil promývacího roztoku nebo opatrným řízením promývací teploty.

Předložený vynález se obzvláště týká polynukleotidů, které vykazují homologií alespooň 75 % s polynukleotidy, keré mají sekvenci SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9. Stupeň homologie se vyjadřuje následujícím způsobem:

100 - 100 x (N'/N) kde N' představuje počet nukleotidů, které jsou pozměněny ve srovnání se sekvencemi SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9 a N je počet všech nukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.

Taková homologická nukleotidová sekvence výhodně k sekvenci hybridizuje se sekvencí komplementární SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID stringentních podmínek. Parametry definující

NO. 9 za stringenci závisejí na teplotě, za které se oddělí 50 % vláken (T_m) .

• 4 ·· ·· ·· · «· ·· ···« 4 9 · • · · · 4 4··· ♦ · · · 4 4·· ···· • · 4 4 4 9 19 • •4 ··· ·· ·«·· ·· ·

U molekul, které mají více než 30 bází je podle publikace

Sambrook a kol. (Molecular cloning: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,

1989) T_m definováno následujícím vztahem:

T_m = 81,5 + 0,41 x (% G+C) + 16,6 x (kationty) = 0,63 x (% formamidu) - (600/počet bází)

Pro potřeby výkladu v předložené přihlášce vynálezu se podmínky stringence nazývají „silné, pokud se používá teplota o 10 °C vyšší než je T_m a hybridizační pufr obsahující roztok 6 x SSC (chlorid sodný 0,9 M a citrát sodný 0,09 M). Za takových podmínek polynukleotidy nespecifických nehybridizuji s polynukleotidy sekvencí komplementárních k sekvencím SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.

Pozměněné sekvence, které mohou být používány podle předloženého vynálezu zahrnují sekvence, které vzniknou delecemi, insercemi nebo substitucemi různých nukleotidových zbytků, které kódují stejný genetický produkt nebo produkt s ekvivalentní funkcí. Produkt genu může také zahrnovat delece, inserce nebo substituce aminokyselinových zbytků v sekvencích proteinů podle předloženého vynálezu, které vedou na tak zvané tiché změny a tím vytvářejí polypeptidy a proteiny s ekvivalentními funkcemi.

Takové substituce aminokyselin mohou být provedeny na základě polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobního a hydrofilního charakteru a/nebo amfipatické povahy použitých aminokyselinových zbytků.

Tak například záporně nabité aminokyselinové zbytky zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou, kladně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin, aminokyseliny s polárními skupinami, které mají příbuzný hydrofobní charakter zahrnují leucin izoleuci a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; serin a threonin; fenylalanin, tyrosin.

Sekvence DNA podle předloženého vynálezu mohou být modifikovýny změnou polynukleotidových sekvencí podle předloženého vynálezu z řady různých důvodů, které zahrnují neomezujícím způsobem změny, které modifikují proces a expresi genového produktu. Například mohou být vytvořeny mutace provedené způsoby známými odborníkům v oboru, jako je řízaná mutageneze, vkládání nových restrikčních míst, změna glykosylace a fosforylace a podobně.

Konkrétně může v jistých systémech exprese, jako jsou kvasinky, hostitelská buňka nadměrně glykosylovat genový produkt. V takových systémech může být výhodné změnit polynukleotidové sekvence tak, aby byla eliminována glykosylační místa. Do rozsahu předloženého vynálezu spadají také modifikované polynukleotidové sekvence vztahující se k heterologickým sekvencím kódujícím fúzované proteiny. Fúzované proteiny mohou být modifikovány tak, aby

·· · obsahovaly místa štěpení lokalizované na sekvenci proteinu podle předloženého vynálezu (například na sekvenci SEQ.

ID.NO. 8) a sekvence heterologních proteinů, takovým způsobem, že sekvence proteinu podle předloženého vynálezu může potom být odštěpena z heterologního proteinu.

Polynukleotidy sosuvisející s modulací buněčné proliferace:

Předložený vynález pokrývá každý polynukleotid, kódující polypeptid související s modulací buněčné proliferace nebo jeho část nebo variantu, jak je zde popsán. Takové polynukleotidy mohou být jednoduchá vlákna (kódující nebo protisměrná) nebo dvojitá vlákna a mohou být představovány molekulami DNA (genomická, cDNA nebo syntetická) nebo molekulami RNA.

Polynukleotidy související s diferenciací mohou být připraveny používajíce libovolný způsob, který je dostupný pro odborníka v oboru. Například může být takový polynukleotid amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), vycházejíce z cDNA připravené z lidských buněk nebo tkání. Pro tento způsob mohou být navrženy, zakoupeny nebo syntetizovány specifické primery; tyto primers vycházejí ze sekvence uvedeného polynukleotidu. Amplifikovaná část může potom být použita pro izolaci úplného genu z knihovny lidské genomické DNA nebo z knihovny cDNA libovolné buňky nebo libovolné tkáně, ať je tato normální, nádorová nebo diferenciovaná, a to s použitím způsobů dobře známých odborníkům v oboru a stručně zopakovaných v následujícím textu. Alternativně může být úplný gen zkonstruován

- 29 vycházejíce z více fragmentů PCR. Molekuly cDNA kódující protein související s diferenciací nebo jeho část mohou také být připraveny prohledáváním knihovny cDNA získané například z mRNA buněk nebo tkání. Takové knihovny mohou být dostupné komerčně nebo mohou být připraveny používajíce klasické techniky (viz Sambrook a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Alternativně mohou být použity jiné techniky prohledávání, dobře známé odborníkům v oboru.

Molekula cDNA související s diferenciací může být sekvencována používajíce klasické techniky využívající enzymy, jako je Klenowův fragment DNA polymerázy I, Sekvenáza X (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Spojené státy), Taq polymeráza (Perkin Elmer, Foster City, CA, Spojené státy), termostabilní polymeráza T7 (Amersham, Chicago, IL, Spojené státy) nebo kombinace rekombinantních polymeráz a exonukleáz s aktivitou zpětného čtení jako je amplifikační systém Elongase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Spojené státy). Může být použit systém automatické sekvenace s použitím přístrojů dodávaných komerčními společnostmi jako je Perkin Elmer a Pharmacia.

Částečná sekvence cDNA může být použita pro identifikaci polynukleotidové sekvence, kódující úplný protein související s modulací buněčné proliferace, používajíce klasické techniky dobře známé odborníkům v oboru. Mezi těmito technikami je prohledávání knohoven cDNA s použitím • · · • · · · · · · • · · · · · ·····

jedné nebo více polynukleotidových sond, používajíce vlastnosti rekombinace RecA (ClonCapture cDNA Selection

Kit, Clontech Laboratories, Spojené státy).

Pro techniky hybridizace může být sekvence částečně radioaktivně označena (například translací přerušení nebo označením konců použitím ³²P nebo ³³P) používajíce klasické techniky. Knihovna bakterií nebo bakteriofágů se potom prohledává hybridizaci na filtrech obsahujících denaturované kolonie bakterií (nebo otisky obsahující plaky fágů) s označenou sondou (viz Sambrook a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Pozitivní kolonie nebo plaky se potom vyberou a amplifikuji a DNA se izoluje pro budoucí analýzy.

Úplná sekvence může potom být určena používajíce standardní techniky. Překrývající se sekvence se potom spojí do jediné souvislé sekvence. Úplná molekula cDNA může být generována ligaturou požadovaných fragmentů, používajíce klasické techniky.

Alternativně existuje řada způsobů založených na amplifikaci pro získání úplné kódující sekvence z částečné sekvence cDNA.

Amplifikace se obecně provádí pomocí PCR. Pro etapy amplifikace může být používána libovolná komerčně dostupná souprava. Les primers mohou být dessinées používajíce, například, des logiciels dobře známýs v le métier. Nukleotidové primery jsou výhodně molekuly obsahující 20 • ·

- 31 až 30 nukleotid, které mají obsah guaninu a cytosinu alespoň 50 % a které hybridizuí s cílovou sekvencí za teplot v rozmezí mezi 50 až 72 C. Amplifikovaná oblast může být sekvencována jako je popsáno výše a překrývající se sekvence mohou být spojeny do jedné souvislé sekvence.

Mezi alternativními přístupy mohou být sekvence sousedící s částečnou sekvencí amplifikovány primerem sekvence vazby a primerem specifickým pro známou oblast. Amplifikované sekvence se potom vystaví druhému cyklu amplifikace.

Dodatečné techniky zahrnují zachycující PCR (Lagerstrom a kol., PCR Methods Applic. (1991), 1,111-19) a progresivní PCR (Parker a kol., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-60). Mohou také být použity další způsoby používající amplifikaci, pro získání úplné sekvence cDNA.

Je možné získání sekvence úplné cDNA pomocí analýzy sekvencí deponovaných v bázi publikované Expressed Sequence Tags (EST), vycházejíce z GenBank. Průzkumy EST mohou být realizovány používajíce informatické programy, dobře známé odborníkům v oboru (například NCBI BLAST) a takové EST mohou být používány pro vytvoření úplné a souvislé sekvence.

Varianty polynukleotidových sekvencí popsaných výše (zejména sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5) spadají také do rozsahu předmětu předloženého vynálezu. Varianty polynukleotidových sekvencí mohou zahrnovat jednu nebo více substitucí, delecí nebo insercí, viz také část uvedená výše

a nazvaná „Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu.

Část sekvence komplementární ke kódující sekvenci (to znamená protisměrný polynukleotid) může také být použita jako sonda nebo jako modulátor exprese genu. cDNA konstrukty, které mohou být transkribovány do protisměrné RNA mohou být vloženy do buněk nebo do tkání pro usnadnění produkce protisměrné RNA. Protisměrný polynukleotid může být používán, jako je zde popsáno, pro inhibicí exprese genu souvisejícího s modulací buněčné proliferace. Protisměrná technologie může být použita pro řízení exprese genu vytvořením trojité šroubovice, což působí proti schopnosti dvojité šroubovice se dostatečně otevřít pro vazbu polymeráz, transkripčních faktoů nebo řídících molekul (viz Gee a kol. v Huber a Carr, Molecular and Immunologic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).

Alternativně může být protisměrná molekula použita pro hybridizaci s řídící oblastí genu (například promotor nebo iniciační místo transkripce) a blokovat transkripci genu nebo blokovat translaci inhibicí vazby ribosomů k transkriptu.

Polynukleotidy mohou potom být modifikovány pro zvýšení jejich stability in vivo.

Možné modifikace zahrnují neomezujícím způsobem: přidání sekvencí na konci 5' a/nebo 3'; použití fosforothioátu nebo 2' O-methylu namísto vazeb fosfodiesterázy ve skeletu; a/nebo vložení bází jako je inosine, kveosin a wybutosin, • · • ·

- 33 stejně tak jako acetyladenin, methylthioadenin a další modifikované formy adeninu, cytidin, guanin, thymin a uridin.

Další varianty polynukleotidů podle předloženého vynálezu již také byly popsány výše v části nazvané „Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu.

Sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu mohou být připojeny k dalším nukleotidovým sekvencím používajíce zavedené rekombinantní DNA techniky. Například polynukleotid může být klonován do velkého panelu vektorů exprese, v to počítaje plasmides, fagemidy, deriváty fágu lambda a kosmidy. Obzvláště zajímavé vektory zahrnují vektory exprese, vektory replikace a vektory sekvenace. Obecně vektor obsahuje počátek funkční replikace v alespoň jednom organismu, vhodná endonukleázová restrikční místa a jeden nebo více selekčních markérů. Použití dalších prvků závisí na požadovaném specifickém použití na odborník v oboru, který zvolí vlastnosti vektoru exprese v závislosti svých potřebách a dostupných technikách.

Polynukleotidy mohou být upraveny pro vstup do buňky a exprimování odpovídajícího polypeptidů. Takové přípravky jsou obzvláště vhodné pro použití pro způsoby léčby popsané dále.

Odborníkům v oboru je zřejmé, že existuje řada prostředků pro expresi polynukleotidů v cílové buňce a že libovolná z ospovídajících technik může být použita. Například • · · · · · · • · · · ·· ·«··« • · · · · · • · ···· · * · polynukleotid může být vložen do virového vektoru jako je adenovirus nebo retrovirus (ale také do dalších). Způsoby vložení DNA do takových vektorů jsou dobře známy odborníkům v oboru. Retrovirový vektor může přenášet nebo obsahovat gen pro selekční markér a/nebo cílící jednotku jako je gen kódující ligand receptorů specifického pro cílovou buňku s cílem vytvořit cílově specifický vektor.

Další polynukleotidové přípravky zahrnují systémy koloidní disperze jako jsou makromolekulám! komplexy, nano-kapsle, mikrosféry, kuličky a systémy založené na použití lipidů zahrnující emulze olej/voda, micely, smíšené micelly a liposomy. Koloidní systém výhodný pro použití pro podávání produktu in vitro a in vivo je liposom (to znamená umělá membránová vesikula).

Polypeptidy související s modulací buněčné proliferace:

V dalším popisu polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují alespoň jednu část proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace nebo jeho varianty, přičemž uvedená část je imunologicky a/nebo biologicky aktivní. Takové polypeptidy mohou mít libovolnou délku, včetně úplného proteinu, oligopeptidu (to znamená peptidu s relativně malým počtem aminokyselin, jako je 8-10 zbytků, spojených peptidovými vazbami) nebo peptid střední velikosti. Polypeptid může také zahrnovat dodatečné sekvence.

9 99 9 · 9 9 9

9 99 9 9 99 9 · 9 9 «

9 9 9 9 999

999 999 99 999· 99 9

Polypeptid je imunologicky aktivní v kontextu předloženého vynálezu, pokud je rozpoznáván povrchovým receptorem buněk B a/nebo T. Imunologická aktivita může být testována používajíce klasické techniky jako jsou způsoby shrnuté v monografii Paul, Fundamental Immunology, 3. vydání, 243-247 (Raven Press, 1993). Takové techniky zahrnují prohledávání polypeptidových derivátů původního polypeptidu pro určení jejich schopnosti reagovat s antigenově specifickým antisérem a/nebo linií buněk T nebo s klony, které mohou být připraveny obvyklými způsoby.

Imunologicky aktivní část proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné prolíferace, reaguje takovými antiséry a/nebo buňkami T a není významněji slabší než je réaktivita úplného polypeptidu (například v testu ELISA a/nebo v testu reaktivity buněk T) . Taková prohledávání mohou obecně být realizována používajíce způsoby dobře známé odborníkům v oboru jako je způsoby popsané v publikaci Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Epitopy buněk B a T mohou také být předpovšzeny používajíce informatických způsobů.

Alternativně mohou být imunogenní části identifikovány používajíce počítačovou analýzu, jako je program Tsites® (viz Rothbard a Taylor, EMBO J. (1988), 7, 93-100; Deavin a kol., Mol. Immunol. (1996), 33, 145-155), který hledá peptidové motivy, které mají schopnost vyvolat odezvu. Peptidové motivy vhodné pro vazbu k myšímu nebo lidskému hlavnímu komplexu histokompatibility třídy I nebo II (MHC)

00

0 0

0000

0

0« · • 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 0

000 000 00 0000 mohou být identifikovány způsobem BIMAS (Parker a kol., J. Immunol. (1994), 152: 163, 1994). Pro potvrzení imunogenicity může být peptid testován používajíce myší transgeniní HLA A2 a/nebo test in vitro stimulace s použitím dendritických buněk, fibroblastů nebo buněk periferní krve.

Stejným způsobem je polypeptid „biologicky aktivní, pokud obsahuje jednu nebo více strukturálních, regulačních a/nebo biochemických funkčních skupin původního proteinu souvisejícího s modulací buněčné proliferace. Existence biologické aktivity může být určena způsoby dobře známými odborníkům v oboru.

Například srovnávací studie sekvencí mohou indikovat zvláštní biologickou aktivitu proteinu. Testy zaměřují se na zhodnocení takové aktivita mohou potom být prováděny na základě způsobů testování známých v oboru.

Jisté části a další varianty takových proteinů by také měly vykazovat tyto vlastnosti v testech in vitro nebo in vivo.

Jak již bylo uvedeno výše, polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou zahrnovat jednu nebo více částí varianty endogenního proteinu, kde - část je biologicky aktivní imunologicky a/nebo (to znamená část vykazuje jednu nebo imunogenních a/nebo biologických více antigenních, vlastností úplného proteinu). Výhodně je taková část alespoň tak aktivní jako úplný protein v testech umožňujících detekci takových vlastností. Varianta

•	9 99 99	99	9
9	9	9 9 9	9 9	• 9
9		9 9· 9	9 9 9	9999
•	9	9 9 9	9 9	9
···	999	99 9999	99	9

polypeptidu je polypeptid, který se liší od původního proteinu substitucemi, ínsercemi, delecemi a/nebo modifikacemi aminokyselin. Jisté varianty zahrnují konzervativní substituce. Konzervativní substituce je taková substituce, při které jw aminokyselina substituována jinou aminokyselinou, která má stejné vlastnosti, jako je určeno odborníkem v oboru, který nepozoruje žádné změny sekundární struktury ani hydropatické povahy polypeptidu. Substituce aminokyselin mohou obecně být prováděny na bázi podobné polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobního a hydrofilního charakteru a/nebo amfipatické povahy zbytků. Například záporně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou; kledně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin; a nenabité polární aminokyseliny, které mají podobné hodnoty hydrofobnosti zahrnují leucin, izoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; serin, thronine, fenylalanin a tyrosin. Další skupiny aminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny jsou zejména následující: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; a (5) Phe, Tyr, Trp, His. Varianta může také a nebo alternativně obsahovat nekonzervativní změny.

Varianty představující část předloženého vynálezu zahrnují také polypeptidy ve kterých primární struktura původního proteinu se modifikuje případným vytvořením kovalentních konjugátů s dalšími polypeptidy nebo chemickými strukturami jako jsou lipidové skupiny nebo glykosylové skupiny nebo acetylfosfát.

Předložený vynález zahrnuje také polypeptidy, které mají nebo nemají glykosylační motivy. Polypeptidy exprimované v kvasinkových systémech exprese nebo v savčích buňkách mohou být, vyjádřeno v hodnotách molekulové hmotnosti a glykosylačního schématu, podobné nebo mírně odlišné od původní molekuly v závislosti na používaném systému exprese.

Exprese DNA v bakteriích jako je E. coli vede na neglykosylované molekuly. Místa N-glykosylace eukaryotních proteinů jsou charaktérizována aminokyselinovým tripletem Asn-Al-Z, kde Al je libovolná aminokyselina s výjimkou Pro, a Z je serin nebo threonin.

Předložený vynález zahrnuje také alely proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace. Alely jsou alternativní formy původního proteinu, které vznikají jednou nebo více mutacemi (které mohou vést na to, že aminokyselinový zbytek je odebrán, přidán nebo nahrazen), které vedou na změněnou RNA. Alelické proteiny se mohou lišit v sekvenci, ale globální struktura stejně tak jako funkce jsou v zásadně podobné. Protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, jeho varianty a části mohou obecně být připraveny z nukleových kyseliny, kódujících požadovaný polypeptid, používajíce klasické techniky. Pro přípravu endogenního proteinu může být používána izolovaná cDNA.

• · · · · · · • · · · · · • · · · 9 9 9 99

Pro přípravu polypeptidové varianty mohou být používány standardní techniky mutageneze, jako je řízená mutagenese používající řízený olígonukleotid.

Obecně mohou být pro exprimování rekombinantních polypeptidu podle předloženého vynálezu použity libovolné vektory exprese, známé odborníkům v oboru.

Exprese může být dosažena v libovolné hostitelské buňce, která byla transformována nebo transfektována vektorem exprese obsahujícím sekvenci DNA kódující rekombinantní polypeptid. Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryotní buňky, vyšší eukaryotní buňky nebo kvasinky. Výhodně jsou použity hostitelské buňky E. Coli, kvasinek nebo savčí buňky jako je COS, CHO, MCF7 (lidské nádorové buňky izolované z karcinomu prsu) nebo DU 145 (lidské nádorové buňky izolované z rakoviny prostaty).

Po dosažení exprese supernatant systémy hositel/vektor, který vylučuje rekombinantní protein nebo polypeptid v nejprve koncentrován, jako je alkoholová kultivačním používáj íce médiu může být klasické techniky precipitace nebo filtrace pomocí komerčních filtrů. Po kroku koncentrace může být vzniklý produkt aplikován na odpovídající purifikační matrici jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Jedna nebo více etap HPLC může být použito pro pokračování purifikace polypeptidu.

Jisté části a další varianty mohou také být generovány syntetickými způsoby, používajíce techniky dobře známé odborníkům v oboru. Například části a další varianty, • · · · 9···· • · 99 9 9 99 99999 • 9 9 9 · ···

999 999 99 9999 99 9 kterré mají méně než 500 aminokyselin, výhodně méně než 100 aminokyselin a výhodněji méně než 50 aminokyselin, mohou být syntetizovány chemickou cestou. Polypeptidy mohou být syntetizovány používajíce způsoby syntézy v pevné fází, které jsou komerčně dostupné, jako je způsob syntézy na Merrifieldově pryskyřici nebo se aminokyseliny sekvenčně přidávají k řetězci aminokyselinyv průběhu syntézy (viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2146). Četné další způsoby syntézy v pevné fázi jsou také dostupné (například způsob Roberge a kol., Science (1995), 269, 202204) . Přístroje pro automatickou syntézu polypeptidů jsou komerčně dostupné u dodavatelů jako je Applied Biosystems, lne. (Foster City, CA, Spojené státy); syntéza polypeptidů proto může být prováděna podle instrukcí výrobců.

Izolované polynukleotidy nebo polypeptidy:

Obecně se polypeptidy a polynukleotidy popsané v předloženém vynálezu izolují. Izolovaný polypeptid nebo polynukleotid je polynukleotid nebo peptid vyjmutý z jeho původního prostředí. Například přírodní protein se izoluje jestliže je oddělen od biologického materiálu, se kterým koexistuje v přírodním systému. Polynukleotid je považován za izolovaný, jestliže je například klonovaný do vektoru, který nepředstavuje jeho přirozené prostředí.

Signální sekvence:

Jsou k disposici způsoby předpovídání, zda protein obsahuje signální sekvenci, stejně tak jako způsoby předpovídání • · · · · · · místa štěpení této sekvence. Například způsob, který popsal McGeoch (Virus Res. (1985), 3, 271-285) používá informaci krátké nabité N-terminální sekvence v nenabité oblasti úplného (neštěpeného) proteinu. Způsob Von Heinje (Nucleic Acid Res. (1986), 14, 4683-4690) používá informaci o zbytcích, které obklopují místo štěpení. Přesnost předpovědi místa štěpení známých savčích vylučovaných protein§ pro každý z těchto způsobů 75-80 %. Nicméně však tyto dva způsoby nepředpovídají vždy stejná místa štěpení pro daný protein.

Sekvence aminokyselin vylučovaného polypeptidu podle předloženého vynálezu byla analyzována počítačovým programem nazývaným SignalP (Sequence Analysis Software Package of the Genetic Computer Group, University of Wísconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, Spojené státy). Tento počítačový předpovídá buněčnou lokalizaci proteinu založenou na sekvenci aminokyselin.

Je také známo, že v jistých případech štěpení signální sekvence vylučovaného proteinu není stejnoměrné, což vede k vytvoření více různých molekulárních druhů. Tyto polypeptidy a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Kromě toho signální sekvence identifikované výše uvedenou analýzou nemohou být prediktivní pro přirozené signální sekvence. Například přirozená signální sekvence může být v přední nebo v zadní části sekvence. Nicméně je pravděpodobné, že uvedená signální sekvence bude schopna řídit vylučovaný protein do endoplasmiového retikula. Tyto polypeptidy a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Místa štěpení závisí často na druhu a nemohou být předpovězena s dostatečnou jistotou.

Sekvence aminokyselin, počínající methioninem jsou identifikovány určenými sekvencemi kódovanými polynukleotidy, zatímco další fáze čtení mohou být snadno přeloženy používajíce technik molekulární biologie dobře známých odborníkům v oboru. Polypeptidy produkované těmito otevřenými fázemi alternativního čtení jsou také zahrnuty do předloženého vynálezu.

Protilátky a jejich fragmenty:

Předložený vynález se týká vazebných činidel, jako jsou protilátky, které vážou specificky protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Takové činidlo se označuje jako činidlo, které „specificky váže protein modulující buněčnou proliferaci, jestliže reaguje na detekovatelné úrovni (například určitelné testem ELISA) s proteinem podílejícím se na modulaci buněčné proliferace nebo s jeho částí nebo variantou a nereaguje na detekovatelné úrovni s dalšími proteiny. „Vazbou se označuje nekovalentní spojení mezi dvěma různými molekulami takovým způsobem, že se vytvoří komplex. Schopnost vazby může být ohodnocena například určením vazebné konstanty pro vytvoření komplexu.

· · · · · · •9 · 9 9 9 ····· • · · · 9 ·

Vazebná konstanta je hodnota, získaná z hodnoty koncentrace komplexu vydělené součinem hodnot koncentrací složek.

Obecně se dva produkty označují jako vázané, pokud vazebná konstanta dosáhne 103 1/mol. Vazebná konstanta může být určena používajíce způsoby dobře známé odborníkům v oboru.

Libovolné činidlo, které vbyhovuje výše uvedeným kritériím, může být považováno za vazebné činidlo.

Podle předloženého vynálezu je vazebné činidlo výhodně protilátka nebo její fragment. Protilátky mohou být připraveny libovolnými technikami dostupnými odborníkům v oboru (viz Harlow a Lané, Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Obecně mohou být protilátky vytvářeny technikami buněčných kultur včetně vytváření monoklonálních protilátek nebo transfekcemi genů protilátky v hostitelských bakteriálních nebo savčích buňkách pro produkci rekombinantních protilátek.

Mezi různými technikami je výhodné používat způsoby popsané dále. Imunogen obsahující polypeptid se injektuje skupině savců (například myšis, krysy, králíci, ovce nebo kozy). V této etapě mohou polypeptidy podle předloženého vynálezu sloužit jako imunogeny bez modifikace.

Alternativně a obzvláště pro peptidy malé velikosti, může být vyšší imunitní odezva indukována pokud se polypeptid spojí s transportním proteinem jako je albumin hovězího séra nebo hemokyanin měkýše přílipky.

• · · · · · • · · · · · · · ·

Imunogen se injektuje hostitelskému zvířeti, výhodně podle předem určeného schématu a zvířatům je periodicky odebírána krev. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid mohou být purifikovány, vycházejíce z takového antiséra, například afinitní chromatografií používajíce peptid vázaný na odpovídající pevný nosič.

Fúzované proteiny:

Libovolný fúzovaný protein může být vytvořen odborníkem pro analýzu sub-buněčné lokalizace proteinu podle předloženého vynálezu, zejména sub-buněčné lokalizace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8. Komerčně jsou dostupné četné plasmidové konstrukty jako je protein Glutathion S Transferáza (GTS) nebo fluorescenční proteiny jako je Green Fluorescent Protein (GFP) nebo neomezujícím způsobem označování polyHistidinem.

Lidské eukaryotní hostitelské buňky (například HEK-293) se kultivují 24 hodin podle protokolu transfekce, který umožňujenormální metabolismus buněk a lepší účinnost transfekce. Rostoucí koncentrace (1, 5 a 10 μg) samotného vektoru obsahujícího značkující protein (GFP, GST nebo označení Histidinem) nebo polynukleotid, polynukleotid, vektoru obsahuj ícího který má sekvenci SEQ. ID. NO. 4, který má sekvenci SEQ. ID. NO. 5 nebo polynukleotid, který má sekvenci SEQ. ID. NO. 9, fúzované s značkovacím proteinem byly vytvořeny za pomoci činidla Effectene® podle instrukcí výrobce (Qiagen).

• · · • ···»

Buňky byly potom analyzovány například konfokálním mikroskopem pro detekci lokalizace proteinu. Pokud se předpokládá, že protein bude vylučován, je supernatant izolován, lyofilizován, vložen na akrylamidový gel a analyzován technikami jako je Western blot pomocí protilátek proti značkovacímu proteinu.

Farmaceutické kompozice:

Jisté předměty předloženého vynálezu, zahrnují vložení produktů jako jsou polypeptidy, protilátky a/nebo nukleové kyseliny do farmaceutických kompozic nebo vakcín. Farmaceutické kompozice obsahují jeden nebo více takových produktů a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů (transportních činidel).

Jisté farmaceutické kompozice popřípadě použitelné jako vakcíny mohou obsahovat jeden nebo více polypeptidů a aktivátor imunitní odezvy, jako je adjuvans nebo liposom (ve kterém je produkt obsažen).

Farmaceutické kompozice a vakcíny mohou navíc obsahovat systém podávání, jako jsou biologicky degradovatelné mikrosféry. Farmaceutické kompozice a vakcín podle předloženého vynálezu mohou také obsahovat další produkty, které mohou být biologicky aktivní nebo neaktivní.

Farmaceutická kompozice nebo vakcína může obsahovat DNA kódující jeden nebo více polypeptidů jako jsou polypeptidy popsané výše, a to takovým způsobem, že polypeptid je vytvořen in šitu. Jak je uvedeno výše, DNA může být přítomna v libovolné formě podávání známé odborníkům v

Μ ·· ·· 9 oboru, včetně bakteriálních nebo virových systémů exprese nukleové kyseliny. Vhodné systémy exprese nukleové kyseliny obsahující sekvenceDNA nutné pro expresi u pacienta.

• « 9 9 9 9 9 9 9

9999 99999999 · « · · 9 9 9

999 999 99 9999 99 9

Systémy podávání založené na bakteriích zahrnují podávání bakterie (jako je Bacillus-Calmette-Guerrin) která exprimuje část imunogenu polypeptidů na svém povrchu. Výhodně může být DNA zavedena používajíce virový systém exprese (například pox virus, retrovirus nebo adenovirus) implikující použití nepatogenních (defektních) činidel.

I když ve farmaceutických kompozicích podle předloženého vynálezu může být použito libovolné transportní činidlo, známé odborníkům v oboru, typ transportního činidla závisí na zvoleném způsobu podávání. Kompozice podle předloženého vynálezu mohou být připraveny pro každý způsob podávání, včetně například cesty topické, nasální, intravenózní, intrakraniílní, intramuskulární.

. intraperitoneální, subkutánní

Pro parenterální podávání jako je subkutánní injekce, obsahuje transportní činidlo výhodně vodu, sůl, alkohol, tuk, parafín nebo pufr. Pro orální podávání mohou být použita transportní činidla uvedená výše nebo pevné transportní činidlo jako je manitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, mastek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Biologicky degradovatelné mikrosféry mohou také být používáns jako transportní činidla pro farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu. Pro « · ·· »· ·· · ·· ·· · · · · «·· « · · 9 11119

1111 1111 1111 • · ··· 111

111 111 11 11·· ·· · jisté topické aplikace jsou výhodné přípravky jako jsou krémy nebo vody.

Takové kompozice mohou také obsahovat pufry (například neutrální solné nebo fosfátové roztoky), cukry (například glukózu, manózu, sacharózu nebo dextrany), manitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycín, antioxidanty, chelační činidla jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (například hydroxid hlinitý) a/nebo ochranná činidla. Alternativně kompozice podle předloženého vynálezu mohou být v lyofilizované formě.

Produkty mohou také být uzavřeny v liposomech používajíce klasické technologie.

Podle předloženého vynálezu může být ve vakcínách použito pro vyvolání imunitní odezvy libovolné adjuvans. Většina adjuvans obsahuje látku chránící antigen proti rychlému katabolismu, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej stimulátor imunitní odezvy jako je lipid A, proteinové deriváty Bordetella Pertussis nebo Mycobacteium tuberculosis. Vhodné adjuvans jsou komerčně dostupné jako například: Freundův adjuvans a úplný adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MIY, Spojené státy; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ, Spojené státy)), biologicky degradovatelné mikrosféry; lipide A monofosforyl; a cytokiny jako je GM-CSF nebo interleukiny 2, -7 nebo -12.

Výše popsané kompozice mohou také být podávány ve formě přípravků se způžděným působením (to znamená přípravky jako • · · • · · · · • · je kapsle nebo houba, které zaručují pomalé uvolňování produktu podání). Takové přípravky mohou obecně být připraveny používajíce technologie dobře známé odborníkům v oboru a být podávány například cestou orální, rektální nebo podkožní implantací nebo implantací na požadované cílové místo. Přípravky s opožděným uvolňováním mohou obsahovat polypeptid, polynukleotid nebo protilátku dispergované v transporní matrici a/nebo být obsaženy chráněném difusní membránou. Transportní použití takových přípravků jsou biologicky slučitelné a měly by také být biologicky degradpvatelné; výhodně přípravek zaručuje relativně konstantní uvolňování aktivní složky. Množství aktivního produktu obsaženého v přípravku s opožděným uvolňováním závisí na místu implantace.

v reservoaru činidla pro

Protirakovinová terapie:

Předložený vynález se dále týká použití popsaných produktů v protirakovinové terapii. Polynukleotidy a polypeptidy související s modulací buněčné proliferace mohou být zejména používány pro inhibicí růstu a indukci modulace buněčné proliferace ve specifických nádorech prsu nebo prostaty.

Takové polypeptidy nebo polynukleotidy mohou také být používány pro terapie četných karcinomů, které zahrnují melanomy, různé formy glioblastomů, karcinomy plic stejně tak jako kolorektální rakoviny. Činidla aktivující expresi takových polypeptidů nebo polynukleotidů mohou také být použita v rámci těchto terapií.

Podle předloženého vynálezu také produkty (kterými mohou být polypeptidy nebo nukleové kyseliny) mohou být výhodně vloženy do farmaceutických kompozic popsaných výše.

Vhodnými pacienty pro terapie jsou všechna teplokrevná zvířata a výhodně člověk. Pacient pro terapii podle předloženého vynálezu může nebo nemusí být diagnostikován jako postižený rakovinou. Jinak řečeno, farmaceutické kompozice popsané výše mohou být používány pro inhibici vývinu rakoviny v různých stádiích onemocnění (pro prevenci objevení se rakoviny nebo pro léčbu pacienta postiženého rakovinou).

Farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu se podávají způsobem odpovídajícím pro každou specifickou léčenou rakovinu.

Způsob podávání, doba trvání a frekvence podávání se určeí typu a závažnosti Způsob podávání a v závislosti na stavu pacienta, onemocnění a na způsobu podávání, frekvence podávání se mohou mohou individuálně lišit. Obecně mohou být farmaceutické kompozice a vakcíny podávány injekcí (například cestou intrakutánní, intramuskulární, intravenózní nebo subkutánní) , cestou íntranasální (například inhalací) nebo cestou orální. Výhodně může být mezi 1 až 10 dávek podáváno v průběhu 52 týdnů. Alternativní protokoly mohou být vhodné pro každého individuálního pacienta.

• · • ·

Obecně vhodné dávkování a léčební režim zahrnují aktivní produkt v množství dostatečném pro dosažení příznivého účinku terapeutického a/nebo profylaktického. Taková odezva může být následována zlepšenou klinickou prognózou (například častější remise, následované úplným, částečným nebo dlouhodobým vymizením onemocnění) u ošetřovaných pacientů ve srovnání s pacienty neošetřovanými nebo ošetřovanými menšími dávkami.

Podle předloženého vynálezu polypeptid může být podáván v dávkách, které se mění od 100 μg do 5 mg. Molekuly DNA kódující takové polypeptidy mohou být obecně podávány v množství dostatečném pro vytvoření dostatečné hladiny polypeptidů.Vhodné dávky mohou obecně být určeny používajíce experimentální modely a/nebo klinické testy. Obecně je výhodné použití minimálních dávek dostatečných pro dosažení účinné terapie. Pacienti mohou obecně být sledováni z hlediska účinnosti terapie, používajíce testů odpovídájicích podmínkám léčby nebo prevence, které jsou známy odborníkům v oboru.

Způsoby detekce a sledování rakoviny:

Polypeptidy, polynukleotidy a protilátka popsané v předloženém vynálezu mohou být používány různými způsoby pro detekci rakoviny u pacienta. Přítomnost polypeptidů a/nebo polynukleotidů souvisejících s modulací buněčné prolíferace jako jsou látky popsané v předloženém vynálezu v buňkách hostitele je indikací diferenciace a zastavením buněčného růstu. Sekvence související s modulací buněčné ·

9 9 · • 99999 proliferace takto mohou být používány jako markéry rozdílu mezi normálními buňkami a buňkami maligními (a umožní lékaři, který bude interprotavet výsledky, diagnostikovat například karcinomy prostaty, prsu, plic a trakčníku). Sekvence související s modulací buněčné proliferace mohou také být používány jako markéry postupu léčby.

Způsoby zahrnující použití protilátky mohou umožnit experimentátorovi detekovat přítomnost nebo nepřítomnost polypeptidu popsaného v předloženém vynálezu v libovolném dostupném biologickém vzorku. Dostupné biologické vzorky zahrnují biopsie tkání nádorových a tkání zdravých, homogenáty nebo extrakty takových tkání získaných od pacienta. Existuje velký počet testů známých odborníkům v oboru pro použití protilátek pro detekce polypeptidových markérů ve vzorku (viz například Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Test může být například proveden technikou Western blot, ve které se přípravek s proteinem podrobí gelové elektroforéze, přenese se na odpovídající membránu a podrobí se reakci s protilátkou. Přítomnost protilátky na membráně může potom být detekována používajíce odpovídající detekční činidlo, jak je popsáno dále.

Další předmět předloženého vynálezu představuje test, zahrnující použití protilátka imobilizované na pevném nosiči vázaném na polypeptid. Vázaný polypeptid může být detekován používajíce druhou protilátku nebo další činidla obsahující detekční skupinu. Alternativně může být použit

kompetitivní test, ve kterém se polypeptid označí detekční skupinou a umožní se vazba na imobilizovanou protilátku po inkubaci protilátky se vzorkem. Schopnost, se kterou složky vzorku inhibují vazbu označeného polypeptidu s protilátkou indikuje reaktivitu vzorku s imobilizovanou protilátkou a tímto způsobem indikuje koncentraci polypeptidu ve vzorku.

Pevný nosič může být libovolný materiál, známý odborníkům v oboru, na kterém protilátka může být vázána. Pevný nosič může být například představován testovacími jamkami mikrotitrační destičky nebo nítrocelulózovým filtrem nebo jakoukoli jinou vhodnou membránou. Alternativně nosičem může být kulička, sklo, plast nebo latex jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Nosič může také být magnetická částečka.

Protilátka může být zmobilizována na pevném nosiči používajíce řadu technik známých odborníkům v oboru a široce popsaných ve vědecké literatuře. V kontextu předloženého vynálezu výraz „imobilizace znamená stejně tak nekovalentní spojení jako je adsorpce, jako vazbu kovalentní (kterou může být přímá vazba mezi antigenem a funkčními skupinami na nosiči nebo vazba využívající použití vazebného činidla).

Imobilizace adsorpcí jamkami mikrotitrační destičky nebo membránou je výhodná. V tomto případě adsorpce může být dosažena uvedením protilátky ve vhodném pufru do kontaktu s pevným nosičem po vhodnou dobu. Doba kontaktu závisí na teplotě, ale je typicky v rozmezí od 1 hodiny do 1 dne. Obecně uvedení do kontaktu s jamkami plastové mikrotitrační • · destičky (například polystyren nebo polyvinylchlorid) v množství protilátka od 1 pg do 10 ng a výhodně od 100 do

200 ng je dostatečné pro imobilizaci odpovídajícího množství polypeptidu.

Kovalentní vazba protilátky a pevného nosiče může také být dosažena reakcí nosiče s činidlo bifunkčním činidlem, které reaguje s nosičem a s funkční skupinou, jako je hydroxyle nebo aminovaná skupina na protilátce. Protilátka může být například vázána kovalentním způsobem na nosič pokrytý vhodným polymerem, používajíce benzochinon nebo kondenzací aldehydové skupiny na nosičs aminem a aktivovaným vodíkem na spolupůsobící látce, používajíce klasické techniky.

V jistých případech test pro detekci polypeptidu ve vzorku je test sendvičové dvojité protilátky. Tento může být realizován uvedením protilátky imobilizované na pevném nosiči, obvykle v jamkách mikrotitrační destičky, do kontaktu s biologickým vzorkem takovým způsobem, že polypeptid ve vzorku se může vázat na ímobílízovanou protilátku. Nevázané produkty se odstraní z komplexu polypeptid-protilátka a přidá se druhá protilátka (obsahující detekční skupiny) schopná se vázat na různá místa polypeptidu. Množství sekundární protilátky, která zůstane vázaná na pevný nosič se potom určení používajíce vhodný způsob specifický vůči detekčním skupinám.

Konkrétněji, pokud protilátka je imobilizovaná na nosič definovaný výše, vazebná místa proteinu jsou typicky blokována. Mmůže být používáno libovolné blokující činidlo, • · · • ·· ·

známé odborníkům v oboru, jako je albumin hovězího séra nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, Spojené státy).

Imobilizovaná protilátka se potom inkubuje se vzorkem a polypeptid může vázat protilátku. Vzorek může být před inkubací zředěn ve vhodném ředidle, jako je solný roztok pufrovaný fosfátem (PBS) .

Vhodná doba kontaktu (to znamená doba inkubace je obecně doba dostatečná pro detekci přítomností polypeptidu ve vzorku získaného od pacienta. Výhodně je doba takto definovaného kontaktu dostatečná pro dosažení úrovně vazby alespoň 95 % rovnovážné vazby mezi vázaným peptidem a nevázaným peptidem. Odborníkům v oboru je zřejmé, že doba nutná pro dosažení rovnováhy musí být určena měřením úrovně vazby, která je dosažena za jistou dobu za teploty okolí, přičemž inkubace 30 minut je obecně dostatečná.

Nevázané produkty mohou potom být odstraněny promýváním pevného nosiče vhodným pufrem jako je solný roztok pufrovaný fosfátem obsahující 0,1 % Tween 20™. Druhá protilátka, obsahující detekční skupinu, může potom být přidána na pevný nosič.

Detekční skupiny zahrnují výhodně enzymy peroxydáza), substráty kofaktorů, inhibitory luminescenční skupiny, fluorescenční skupiny Konjugace protilátky na detekční skupinu realizována používajíce standardní způsoby známé v oboru.

(jako je kolorantů, a biotin. může být odborníkům • · ·

Druhá protilátka se potom inkubuje s imobilizovaným komplexem protilátka-polypeptid po dobu dostatečnou k detekci vázaného polypeptidu.

Dostatečná doba může obecně být určena měřením úrovně vazby, ke které dojde za určenou dobu. Nevázaná druhá protilátka se potom odstraní a vázaná druhá protilátka se detekuje používajíce detekční skupinu. Způsob použitý pro detekci detekční skupiny závisí povaze této skupiny. Pro radioaktivní skupiny jsou obecně vhodné způsoby scintilační nebo auto-radiografické. Spektroskopické způsoby mohou být barviv a fluorescenčních nebo

Biotin může být detekován používajíce avidin vázaný na detekční skupinu (obvykle radioaktivní nebo fluorescenční skupina nebo enzym). Enzymatické detekční skupiny mohou obecně být detekovány přidáním substrátu (obecně po vhodnou dobu) s následnou spektroskopickou (nebo jinou) analýzou produktů reakce.

používány pro detekci luminescenčních skupin

Pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny se detekovaný signál detekční skupiny vázané na pevný nosič odpovídajícím hodnota Výhodně je hraniční obecně porovnává se signálem stanovené pro nenádorovou tkáň, hodnotou střední signál, získaný pokud se ímobílízovaná protilátka inkubuje se vzorky pacientů bez rakoviny. Obecně se vzorek generující signál o trojnásobek standardní odchylky větší nebo menší než hraniční předem určená hodnota považuje za indikativní.

99 9

9999

Pro další detaily se může odborník v oboru obrátit na následující publikaci: Sackett a kol., Clinical

Epidemiology. A basic Science for Clinical Medicine, str.

106-107 (Little Brown and Co., 1985).

Přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny u pacienta může také být určena zhodnocením množství mRNA kódující polypeptid podle předloženého vynálezu v biologickém vzorku (například biopsie) vzhledem k předem určené hraniční hodnotě.

Takové hodnocení může být provedeno používajíce velké množství způsobů známých odborníkům v oboru, jako například hybridizace sítu a amplifikace polymerázovou řetězovnou reakcí (PCR). Sondy a primery používané v takových způsobech mohou být obecně vytvořeny vycházejíce ze sekvencí uvedených v příkladech nebo vycházejíce z podobných sekvencí identifikovaných u jiných pacientů. Sondy mohou být používány v klasických hybridizačních technikách a mohou být označeny činidlem detekce pro usnadnění detekce sondy. Taková činidla zahrnují neomezujícím způsobem radionuklidy, fluorescenční barviva a enzymy schopné katalyzovat vytvoření detekovatelných produktů.

Primery mohou obecně být používány ve způsobech detekce zahrnujících polymerázovou řetězovou reakci (PCR) jako je RT-PCR, ve kterém se PCR aplikuje současně s inverzní transkripcí. Typicky se RNA extrahuje ze vzorku tkáně a inverzním způsobem se transkribuje pro získání molekul cDNA. Amplifikace PCR používající specifické primery • ·

generuje molekuly cDNA související s modulací buněčné proliferace, které mohou být odděleny a vizualižovány používajíce například gelovou elektroforézy. Amplifikace se typicky provádí na vzorcích získaných vycházejíce z párů nádorových a nenádorových tkání téhož pacienta nebo také vycházejíce z párů nádorových a nenádorových tkání různých pacientů. Reakce amplifikace může být prováděna na postupných ředěních cDNA pokrývajících dva řády. Modifikace exprese v poměru 2 nebo více v ředěních vzorku nádoru ve srovnání s ředěními nenádorového vzorku se typicky považuje za indikativní.

Jisté testy pro určení diagnózy mohou být kromě toho prováděny přímo na nádoru.

Takový test zahrnuje kontakt nádorových buněk s protilátkou nebo jejím fragmentem, který váže protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Vázaná protilátka nebo její fragment může být detekován přímo nebo nepřímo pomocí detekční skupiny. Takové protilátky mohou také být používány v histologických aplikacích. Alternativně může být v takových aplikacích používán protisměrný polynukleotid.

Podle dalšího předmětu předloženého vynálezu může být postup rakoviny a/nebo odezva na léčbu rakoviny sledován pomocí libovolného z výše popsaných testů po jistou dobu a zhodnocením změna úrovně odezvy (to znamená množství detekovaného polypeptidů nebo mRNA). Testy mohou být například prováděny každý měsíc po dobu od 1 do 2 let.

Obecně rakovina postupuje u pacientů u kterých hladina odezvy s časem klesá. Naopak rakovina nepostupuje, pokud detekovaný signál zůstává konstantní nebo se s časem zvyšuj e.

• 4 ·· 4» ·+ » ·· ·· · · · · · · · • 4 4 · · · · · · • * · · · 4 · · · «· · · • · 4 · · ··· ··· ··· ·· ···* ·« ·

Předložený vynález se také týká souprav pro použití souboru výše uvedenými diagnostickými způsoby. Takové soupravy zahrnují 2 (nebo více) složek, nutných pro provádění takových testů. Takové složky mohou být produkty, činidla a/nebo recipienty nebo zařízení. Recipient uvnitř soupravy může například obsahovat monoklonální protilátky nebo váže specificky polypeptid buněčné proliferace. Takové protilátky nebo fragmenty mohou být dodávány vázané na materiál nosiče, jak je výše uvedeno. Jeden nebo více dalších recipientů může obsahovat další prvky jako jsou činidla nebo pufry pro použité v testu. Takové soupravy mohou také obsahovat detekční činidlo (například protilátku), obsahující detekční skupiny vhodné pro přímou nebo nepřímou detekci vázané protilátky.

jejich fragment, který související s modulací

Způsoby pro lidentifikace vazebných činidel:

Předložený vynález kromě jiného přináší způsoby identifikace produktů, které se vážou a/nebo které modulují expresi proteinů souvisejících s modulací buněčné proliferace. Taková činidla mohou obecně být identifikována uvedení polypeptidů podle předloženého vynálezům do kontaktu s testovaným produktem/činidem za podmínek a po dobu dostatečnou pro dosažení interakce s polypeptidem •0 00 a/nebo jeho efektorem (například jeho receptorem). Každá obměna vazebných testů dobře známých odborníkům v oboru může takto být provedena pro testování schpnosti testovaného produktu vázat se na polypeptid nebo na jeho efektor (například jeho receptor).

• ·«

0 0

0 0 * 0

0 0

0000 • 0 · • 0 0 0

0 0000

0 0 ·· r

V jiných testech mohou být činidla prohledávána používajíce známých buněk, pro určení zda zvyšují expresi genu souvisejícího s modulací buněčná proliferace. Takové buňky mohou být uvedeny do kontaktu s testovanými činidly a exprese genu souvisejícího s modulací buněčná proliferace může být ohodnoceno vzhledem k expresi pozorované v nepřítomnosti testovaného činidla.

Alternativně mohou být testované produkty prohledávány s ohledem na jejich schopnost modulovat expresi (například transkripci) proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace. Pro zhodnocení účinku testovaného činidla na expresi proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, může být odpovídající promotor nebo regulační prvek vázán na detekční gen jak je popsáno výše. Takový konstrukt může být transfektován do vhodných hostitelských buněk, které se potom uvedou do kontaktu s testovaným činidlem.

Uvedené hostitelské buňky se výhodně používají pro prohledávání knihoven malých molekul vzniklých z programů kombinatorické chemie. V této výhodné variantě se buňky se inkubují s knihovnou; buňky se potom lyžují a supernatant

- so • · · · ··· ··· · · se analyzuje na aktivitu detekčního genu standardními protokoly.

Produkty které zvyšují aktivitu detekčního genu jsou induktory transkripce genu souvisejícího s modulací buněčné proliferace a mohou potom být používány pro inhibicí postupu rakoviny.

Pokud nejsou definovány jiným způsobem, všechny vědecké a technické výrazy zde používané mají stejný význam jako je význam, ve kterém jej běžně chápe obvyklý odborník v oboru, do kterého spadá předložený vynález. Kromě toho všechny publikace, přihlášky vynálezů, všechny vynálezy a všechny další reference zde uvedené jsou zahrnuty jako reference.

Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci výše uvedených způsobů a nemohou být v žádném případě považovány za omezení rozsahu předmětu předloženého vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a charakterizace fragmentů DNA SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5

Sekvence DNA SEQ. ID. NO. 1, obsažená ve veřejné bázi obsahující EST uvažována (Genbank, přístupové číslo ΑΆ176076), a je uvedena dále:

ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt

ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga 121 agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag 181 gactcccctt ggcataaggg gtagtggctg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca 241 cagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct 301 ccgtctgctt cttgtttggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc 361 tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc 421 ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg 481 ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg 541 ncctgaagcc antttgcctc agagaagaga nagtcc

Vycházejíce z této sekvence byla syntetizována dvojice primerů 5' Fwdl a 3'Revl se sekvencemi SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3 (uvedené dále) pro získání sondy umožňující klonování úplné cDNA obsahující úplný otevřený čtecí rámec kódující odpovídající gen.

Sekvence SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3 jsou následující:

- SEQ. ID. NO. 2: 5'-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3'

- SEQ. ID. NO. 3: 5'-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3'

Polymerázová řetězová reakce sérii komerčně dostupných (PCR) se nejprve provede pro knihoven cDNA, používajíce

primery	sekvencí	SEQ.
reakce	zahrnuj í	0,5
(SEQ. ID	. NO. 3),	200
dNTP: dATP, dCTP,	dGTP

M Fwdl (SEQ. ID. NO. 2) a Revl trifosfátů deoxynukleotidů (neboli a dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, a 0,5 U Taq DNA polymerázy v konečném objemu 50 μΐ. Parametry tepelných cyklů zahrnují denaturaci za teploty 94 °C po dobu 30 sekund, hybridizaci primerů za teploty 60 °C po dobu 1 minuty a extenzi polymerace za • · · · · · · • · · · · · · · · • · ··· · · · ··· ··· ·· ···· ·· · teploty 72 °C po dobu 30 sekund (s konečnou extenzí 5 minut).

Produkty získané pomocí PCR se oddělí na agarózovém gelu 1 % a vizualizjí pomocí obarvení ethidiumbromidem. Výsledky ukazují pás 245 párů bází v knihovnách cDNA lidského mozku, hypofýzy, plic, ledvin a střeva (Quantum) a 290 párů bází v knihovně cDNA lidského prsu a prostaty. Tyto výsledky jsou uvedeny na Obr. 1.

Produkty takto získané pomocí PCR se purifikují elektroforézou a používají se jako sondy pro klonování cDNA obsahující úplný čtrecí rámec postupujíce podle doporučení výrobce pro použití klonovací soupravy cDNA ClonCapture (Clontech).

Sekvence nukleových kyselin pozitivních klonů se určení pomocí automatického sekvenačního zařízení. Jedná se o sekvence SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 uvedené dále:

- SEQ. ID. NO. 4:

aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa 61 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttcct 301 gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg 361 gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg 421 ctcctcatgc agcttcccct ttcccttgcg gggtgggggc tgggggtgcc aaggctccac 481 ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa « · • ·

541 ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag

601 gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cacacacaca cacacacacg cacacacaca

661 cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa

721 gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct gggcctgccc cattcttgga gtccccaggg

781 aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg

841 ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct

901 aatttccccc gaaggttcat gaagccagag gcatgccctt gggggttggt cgggagaagg

961 gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg cccctgctgc ctgcgattc

- SEQ. ID. NO. 5:

aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt

121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa

181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag

241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggcaa caggaaatag

301 ggtgtgggct gtagaccata gtgggtgggg tggtgcttcc gttcctgtga ggcccgcccc

361 cctgagcccc ctcgtctgct tcttgtttgg cagaaataga tgtggggcac agcccctaga

421 tgatgggaat ctgcccaagc tgtgtcctct ggggaatgaa atcttgctcc tcatgcagct

481 tcccctttcc cttgcggggt gggggctggg ggtgccaagg ctccaccctt ggagggggtt

541 gctgggggtg ccaaggctcc accctttgct cgctgggcag agggaaggaa gcacctccct

601 gtatgctctg caggggcccc tgcaggccac tttgcctcag aggaaggagg agaggtcccc

661 tgggaaaatg cgcacacaca cacacacaca cacacgcaca cacacacgca catgcacaca

721 cgcacgcatg cacacacaca cacatatgtg caggggtgca gcctaagtca gtggagccag

781 gactggctgc gcagctgggc ctgccccatt cttggagtcc ccagggaatg agcctcagga

841 tccacttcgt cccttgtttc taagccaggc tgcacggccg ttcctgggtg tgaaagcatt

901 ctgtcctgtc tccagtcaga gggaaccgcc cccaaactag aaagctaatt tcccccgaag

961 gttcatgaag ccagaggcat gcccttgggg gttggtcggg agaagggtga gaggcagtgc

1021 tgtggaaggg gcctggcccc tgctgcctgc gattc

Příklad 2:

Klonování sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID NO. 5 do vektoru exprese

•	•	• · · ·	9· ·
•	•	9 9 ·	• 9 9 9
•	•	• · · · ·	9 9 9 · 9
• · ·	9 9 9	• · · · · ·	9 9 9

Ssekvence nukleových	kyselin	SEQ. ID.	NO. 4 a
SEQ.	ID. NO. 5 umožňují	syntetizovat	nové primery 5' El a
3 'R1	odpovídáj ících	sekvencí	SEQ. ID.	NO. 6 a
SEQ.	ID. NO. 7 (uvedených dále) . Tyto	sekvence	obsahuj ící

restrikční místa HindlII respektive EcoRI.

Sekvence SEQ. ID. NO. 6 a SEQ. ID. NO. 7 jsou následující:

- SEQ. ID. NO. 6: 5'-GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G-3'

- SEQ. ID. NO. 7: 5'-CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG-3 '

Reakce PCR se provádí používajíce stejné reakční podmínky jako bylo popsáno v příkladu 1 s primery SEQ. ID. NO. 6 a SEQ. ID. NO. 7. Produkty získané uvedenou reakcí PCR mohou být vloženy přímo do vektoru exprese, který je neomezujícím způsobem typu pCDNA3.1 (InVitrogen).

Po kroku amplifikace pomocí PCR se produkty vystaví hydrolýze HindlII a EcoRI pro uvolnění konců obsahující tyto sekvence a potom se purifikují na agarózovém gelu elektroforézou.

Sekvence SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 se potom vloží do vektoru exprese jako je například pCDNA3.1 (Invitrogen). Analýza natrávením vhodnými restrikčními enzymy různých klonů bakterií dovoluje izolovat klony bakterií obsahující konstrukt „vektor exprese/SEQ ID NO 4 nebo „vektor exprese/SEQ ID NO 5.

Příprava velkého množství těchto plasmidových konstruktů byla provedena pomocí purifikační soupravy pro plasmidovou DNA (Qiagen).

• ♦ * · · · · • · · · ·· ·····

			• · · ·	• ······ ·· ·
Vlastnosti	polynukleotidů sekvencí	SEQ.	ID. NO. 4 a
SEQ. ID.	NO.	5
Exprese	polynukleotidů sekvencí	SEQ.	ID. NO. 4 a
SEQ. ID.	NO.	5 v lidských nádorových tkáních:
Příprava	RNA	z buněčných kultur a nádorových	tkání
Buněčné	kultury nebo nádorové tkáně se	uchováváj í za
teploty	-80	°C před kroky extrakce	úplné	RNA. Extrakce

úplné RNA se provádí způsoby popsanými ve vědecké literatuře (Chomczynski a Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162,156) za pomoci činidla Trizol (Gibco/BRL). Kvalita takto extrahované RNA se analyzje na agarózovém gelu 1 % v přítomnosti ethidiumbromidu.

Inverzní transkripce vycházejíce z RNA

Úplná RNA se transkribuje inverzním způsobem pomocí primerů Oligo (dT) používajíce inverzní transkriptázu Superscript® jak je navrženo v návodu výrobce (Gibco/BRL).

Polymerázová řetězová reakce (PCR) produktů získaných inverzní transkripcí

Analýza exprese sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 se provádí polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) aplikovanou na produkty inverzní transkripce používajíce primerů 5'Fwdl a 3'Revl o sekvencích SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3.

• · · · ·· ··*·

Reakční podmínky zahrnují 0,5 μΜ Fwdl a Revl, 200 M dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,5 U Taq DNA polymerázy v konečném objemu 50 μΐ. Parametry tepelných cyklů zahrnují denaturaci za teploty 94 °C po dobu 30 sekund, hybridizaci primerů za teploty 60 °C po dobu 1 minuty a extenzi polymerace za teploty 72 °C po dobu 30 sekund (s konečnou extenzí 5 minut).

Produkty získané pomocí PCR se separují na agarózovém gelu 1 % a vizualizují obarvením ethidiumbromidem.

V jistých případech byla provedena analýza hybridizace na nylonové membráně používajíce jako sondu sekvenci SEQ. ID. NO. 4 označenou pomocí alphaP³²-dCTP používajíce soupravu pro náhodné označování (Pharmacia). Membrána se potom promývá za podmínek slabé stringence (2 XSSC, 0,1 % SDS a 60 C) a potom za podmínek silné stringence (0,1 XSSC, 0,1 % SDS za teploty 65 °C). Membrána se potom exponuje na film Kodac XAR.

Analýza exprese polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 ve vzorcích nádorů prsu

Analýza exprese polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 byla realizována na 15 vzorcích nádorů získaných chirurgicky od pacientek postižených nádory prsu.

cDNA získaná . podle protokolu popsaného výše byla normalizována pomocí stabilním způsobem exprimovaného • * · · · · * markéru G3PDH (Glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza) pro řízení odchylek množství RNA nebo cDNA mezi vzorky.

Produkty reakce PCR potom byly hybridizovány na nylonové membráně výše uvedeným protokolem.

Získané výsledky, uvedené na Obr. 2, ukazují, že tímto způsobem může být přítomnost polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 vizualizována v nádorových vzorcích karcinomu prsu.

Inhibice buněčné proliferace polynukleotidy sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5.

Buňky nádoru prostaty DU 145 (kód ATCC) se kultivují v médiu DMEM (Eaglovo médium modifikované Dulbeco) obsahujícím 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml sulfátu streptomycinu, doplněné fetálním telecím sérem 10 %. Buňky se subkultivují 24 hodin před provedením protokolu transfekce, což umožňuje normální metabolismus buněk a lepší účinnost transfekce. Rostoucí koncentrace (1, 5 a 10 pig) samotného vektoru (pCDNA3.1) nebo vektoru obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 (1, 5 a 10 gg) nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 (1, 5 a 10 μg) byly provedeny používajíce činidlo Effectene® podle doporučení výrobce (Qiagen).

Buňky se izolují 48 hodin po transfekci zpracováním trypsinem a potom se počítají. Současně se buňky centrifugují při 5000 ot./min a potom se zmrazí na teplotu •9 ·· ·· · • · · · · · · · ···· • · ··· 4·· ··· ··· ·· ···· « ·

-80 °C pro extrakci RNA způsobem popsaným výše (viz část označená Příprava RNA z buněčných kultur a nádorových tkání).

Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3 (polynukleotid sekvence

SEQ. ID. NO. 4) a Obr. 4 (polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5) . Výsledky indikují, že cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 jsou exprimovány způsobem, který je úměrný množství vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 (část A). Kromě toho výsledky indikují, že růst buněk je inhiován významným způsobem v přítomnosti rostoucích koncentrací vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 vzhledem k růstu buněk transfektovaných 10 pg samotným vektorem (část B) . Korelace mezi inhibici růstu nádorových buněk a množství transfektovaného vektoru obsahujícího sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid SEQ. ID. NO. 5 je rovna 1 respektive 0,96.

polynukleotid sekvence

Peptidy kódované fragmentem sekvence SEQ. IN. NO. 5

V sekvenci SEQ. IN. NO. 5 je možno pozorovat otevřený čtecí rámec obsahující iniciační kodon (ATG) kódující iniciační methionin v poloze 420 a stop kodon (UUA) v poloze 861. Takto přeložený polynukleotid odpovídá proteinu sekvence SEQ. IN. NO. 8, skládající se z 147 aminokyselin a je uvedený dále • · • · ·

MMGICPSCVLWGMKSCSSCSFPFPLRGGGW 30

GCQGSTLGGGCWGCQGSTLCSLGRGKEAPP 60

CMLCRGPCRPLCLRGRRRGPLGKCAHTHTH 90

THAHTHAHAHTHACTHTHICAGVQPKSVEP 120

GLAAQLGLPHSWSPQGMSLRIHFVPCF 147

Polynukleotid odpovídající sekvenci SEQ. IN. NO. sekvenci nukleotidů SEQ. IN. NO. 9 uvedenou dále:

ma atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt

121 tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggaagga agcacctccc

181 tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaagag gagaggtccc

241 ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac

301 acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca

361 ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg

421 atccacttcg tcccttgttt ctaa

Popis vyobrazení

Obr. 1 představuje výsledky získané pomocí PCR po separaci na agarózovém gelu 1 % a vizualizaci obarvením ethidiumbromidem.

Obr. 2 představuje výsledky získanýé přenosem Southern blot na 15 vzorcích karcinomu prsu (označené Sl až S15).

Obr. 3 představuje v části A expresi cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 v buňkách DU 145 (nádor prostaty) a v části B inhibici růstu buněk v přítomnosti rostoucí koncentrace vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4.

Nakonec Obr. 4 ukazuje v části A expresi cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 v buňkách DU 145 (nádor prostaty) a v části B inhibici růst buněk v přítomnosti rostoucí koncentrace vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5.

Zastupuj e:

Dr. Otakar Švorčík

9 9 • 9 9 · 9

JUDr. Otakar Svorčík advokát

Hálkova 2,120 00 Praha 2

Claims

1. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5.

2. Protisměrný polynukleotid obsahující komplementární sekvenci k sekvenci polynukleotidu podle nároku 1.

3. Izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného

SEQ. ID. NO. 5 nebo polynukleotidovou sekvencí sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

4. Izolovaný polypeptid podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci SEQ. ID. NO. 8.

5. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment antigenu, který váže specificky izolovaný polypeptid podle nároku 3 nebo 4.

6. Vektor exprese obsahující izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž polypeptid kódovaný uvedeným izolovaným polynukleotidem vykazuje alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.

7. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektováná vektorem exprese podle nároku 6.

8. Izolovaný polypeptid podle nároku 3 nebo izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, kde uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, jako léčivo.

9. Léčivo podle nároku 8, vyznačující se tím, že obshuje sekvenci SEQ. ID. NO. 8.

10. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný polypeptid obsahující:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace; přitom kompozice obsahuje mimo. to jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů.

11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že izolovaný polypeptid je polypeptid sekvence SEQ. ID. NO. 8.

12. Použití izolovaného polypeptidů, obsahujícího:

buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.

13. Použití podle nároku 12, vyznačující se tím, že izolovaný polypeptid je polypeptid sekvence SEQ. ID. NO. 8.

·· « · · • ·· · · • ·

14. Použití podle nároku 12 nebo 13, ve kterém proliferativní onemocnění je rakovina.