CZ20032670A3 - Nový polynukleotid použitelný pro modulaci proliferace rakovinných buněk - Google Patents
Nový polynukleotid použitelný pro modulaci proliferace rakovinných buněk Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032670A3 CZ20032670A3 CZ20032670A CZ20032670A CZ20032670A3 CZ 20032670 A3 CZ20032670 A3 CZ 20032670A3 CZ 20032670 A CZ20032670 A CZ 20032670A CZ 20032670 A CZ20032670 A CZ 20032670A CZ 20032670 A3 CZ20032670 A3 CZ 20032670A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- polynucleotide
- sequence
- polynucleotide sequence
- protein
- Prior art date
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 201
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 201
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 201
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 166
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 145
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 182
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 173
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 172
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 55
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 53
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 28
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 24
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 131
- 238000000034 method Methods 0.000 description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- -1 thronine Chemical compound 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 2-heptylcyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCCCCCCC1=CCCCC1=O HBAHZZVIEFRTEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXGXEFXCWDTSQK-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 FXGXEFXCWDTSQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229920001367 Merrifield resin Polymers 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011256 aggressive treatment Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000033862 cellular protein localization Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- ZURGFCUYILNMNA-UHFFFAOYSA-N n-(7h-purin-6-yl)acetamide Chemical compound CC(=O)NC1=NC=NC2=C1NC=N2 ZURGFCUYILNMNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Předložený vynález se týká nového proteinu modulujícího proliferaci rakovinových buněk. S využitím proteinů kódovaných polynukleotidy sekvencí SEQ. ID NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 popsaných dále, je také možné určit stupeň malignity buněk s abnormální proliferaci.
Dosavadní stav techniky
Rakovina je celosvětově jeden z nejzávažnějších zdravotních problémů. I přes významné pokroky, které byly v posledních letech dosaženy v detekci a léčbě rakoviny, neexistuje v současné době žádná vakcina nebo jiný univerzální způsob léčby pro prevenci nebo léčbu rakoviny. Zvládání onemocnění spočívá v kombinaci diagnosticky tak časné, jak je to možné aagresivní léčby zahrnující řadu prvků, jako je chirurgie, radioterapie, chemoterapie nebo také hormonoterapie. Výběr léčby rakoviny je často volen na základě prognostických parametrů, mezi které spadá analýza specifických markérů nádorů. Nicméně použití uznávaných markérů vede často k výsledkům, které jsou obtížně interpretovatelné a stále je u četných pacientů s rakovinou pozorována zvýšená mortalita.
· »
9
999 ·
9« • «
9 ·
9999
9·99
Rakovina prsu a prostaty jsou nejčastější maligní nádory.
Ve Spojených státech je každý rok diagnostikováno 400 000 nový případů a přibližně 100 000 lidí na jejich onemocnění umírá (Harris a kol., New Eng. J. Med. (1992), 327, 319,
390 až 473).
Je uznáváno, že onemocnění se objevuje v průběhu multifaktoriálního procesu, který zahrnuje mutace v omezeném počtu genů, možná 10 nebo méně. Tyto mutace vyvolávají změny růstu a modulaci buněčná proliferace tkání, které jim umožňují růst nezávisle na normálním řízení buněk, vytváření metastáz a vymknutí se z imunitního dohledu. Třídy genů, které se účastní na vzniku rakoviny prsu a prostaty mohou být vysoce specifické pro tyto třídy nádorů. Zejména mutace genů podílejících se na hormonálních odezvách (receptory a ligandy třídy cestrogenů, progesteronu nebo také ještě testosteronu) jsou obzArláště důležité, protože povzbuzují pravděpodobně buňky k proliferaci a přitom je činí odolnými vůči protinádorovému účinku těchto hormonů.
Kromě toho změny v genech kódujících růstové faktory, molekulách přenášejících signály, stejně tak jako u faktorů transkripce se často podílí na těchto změnách a mají změny, které jsou samy součástí vývinu a postupu nádorů (King, Nátuře Genetics (1992), 2, 125).
Otázka, která dosud není vyřešena, je povaha změn v genové expresi, které se objevují v lidských nádorových buňkách ireverzibilním způsobem a vedou k buněčné diferenciaci.
·· ·· ·· • · · · ♦ · * • · · · • · ····
Tato informace je přitom velmi důležitá pro definici, na molekulární úrovni, schémat regulace exprese genů, podílejících se na růstu a buněčná diferenciace lidských buněk rakoviny . prostaty a prsu. Existuje proto naléhavá potřeba identifikace genových sekvencí, které se podílejí na ireverzibilní konečné diferenciaci.
V nedávné době, zatímco přihlašovatelé již objevili sekvenci označovanou dále v předloženém vynálezu jako SEQ. ID. NO. 4, byla tato publikována v databázi Genbank pod přístupovým kódem AK000755 a identifikačním číslem 7021039, aniž by byla jakkoli spojena s indikací aktivity proteinů, které mohou být kódovány touto sekvencí.
Předmět vynálezu
Předložený vynález se týká izolovaného polynukleotidu, obsahujícího polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5. Předložený vynález se také týká protisměrného polynukleotidu obsahujícího sekvence komplementární k výše uvedenému izolovanému polynukleotidu a obsahujícímu polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5.
Předložený vynález se také týká izolovaného polynukleotidu, obsahujícího alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polynukleotid je takový, že kóduje polypeptid, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s modulací • 9 buněčné proliferace. Předložený vynález se obzvláště týká izolovaného polypeptidů nukleotidové sekvence
SEQ. ID. NO. 9 nebo izolovaného polypeptidů, který má nukleotidovou sekvenci komplementární k nukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9.
9 9 9 9
9999 9 9 •
Předložený vynález se navíc týká izolovaného polypeptidů, obsahujícího alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s modulací buněčné proliferace. Výhodně uvedený izolovaný polypeptid obsahuje fragment, který má imunologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Předložený vynález se obzvláště týká proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8 (popsané dále) kódovaného fragmentem polynukleotidu polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 obsaženého mezi bázemi v polohách 420 (iniciační kodon ATG kódující methionin) a 861 (stop kodon UAA), to znamená polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 (popsanou dále).
Předložený vynález se také týká vektoru exprese, který obsahuje izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, polypeptid kódovaný uvedeným izolovaným • ·
polynukleotidem, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Předložený vynález se také týká hostitelské buňky transformované nebo transfektované uvedeným vektorem exprese.
Předložený vynález se také týká monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu antigenu uvedené protilátky, které specificky vážou izolovaný polypeptid popsaný výše, obzvláště monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu antigenu uvedené protilátky, které specificky vážou protein sekvence SEQ. ID. NO. 8.
Předložený vynález se dále týká, jako léčiva, izolovaného polypeptidů, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Uvedený fragment může být obzvláště fragment kódovaný polynukleotidem nukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9, jinak řečeno proteinem sekvence SEQ. ID. NO. 8. Předložený vynález se dále týká, jako léčiva, izolovaného polypeptidů, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Předložený vynález se ještě týká, jako léčiva, monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid, který obsahuje fragment proteinu kódovaného alespoň jeden polynukleotidovou SEQ. ID. NO. 5 polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo nebo sekvencí komplementární k sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo
SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Předložený vynález se obzvláště týká, jako léčiva, monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid, kódovaný polynukleotidem pnukleotidové sekvence
SEQ. ID. NO. 9 polynukleotidové protein sekvence nebo sekvencí komplementární k sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno SEQ. ID. NO. 8).
Předložený vynález se navíc týká farmaceutická kompozice, která obsahuje izolovaný polypeptid zahrnující:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5,
nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace; přitom kompozice obsahuje mimo to jeden nebo více farmaceuticky přijatelné excipienty.
týká farmaceutická protein, kódovaný
Předložený vynález se obzvláště kompozice, která obsahuje polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.
Alternativně farmaceutická kompozice podle předloženého vynálezu zahrnuje monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment antigenu, které se specificky vážou na izolovaný polypeptid, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, přitom kompozice obsahuje mimo to jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů.
Předložený vynález se obzvláště týká farmaceutické kompozice, která zahrnuje monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment antigenu, které se specificky vážou na protein, kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.
Ve výhodném provedení uvedené farmaceutické kompozice obsahují také aktivátor imunitní odezvy (kterým může být adj uvans) .
Dodatečným předmětem předloženého vynálezu je použití izolovaného polypeptidu pro přípravu léčiva určeného pro léčbu proliferativní onemocnění, přičemž izolovaný polypeptid obsahuje:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Předložený vynález se obzvláště týká použití izolovaného polypeptidu pro přípravu léčiva určeného pro léčbu
proliferativní onemocnění, přičemž izolovaný polypeptid je kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno se jedná o protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými excipienty.
je použití
5,
4,
9, liferativního
Dalším předmětem předloženého vynálezu izolovaného polynukleotidu, který obsahuje:
- buď polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO.
- nebo polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO.
- nebo polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu pro onemocnění.
Použitý izolovaný polynukleotid je výhodně představován polynukleotidem polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.
Uvedený izolovaný polynukleotid je výhodně přítomen ve virovém vektoru, přičemž virový vektor je například zvolen ze souboru, který zahrnuje adenovirus, asociovaný adenovirus, retrovirus a pox virus.
Alternativně se předložený vynález týká monoklonální protilátky nebo jejího vazebného fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a která může být používána pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.
Obzvláště mohou být monoklonální protilátka nebo její vazebný fragmentu antigenu, které specificky vážou izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno se jedná o protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) používány pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.
Ve výhodných provedeních výše uvedených použití je proliferativní onemocnění, které má být léčeno polypeptidem nebo polynukleotidem popsaným výše, rakovina. V ještě výhodnějších provedeních je rakovina zvolena ze souboru, zahrnujícího rakovinu prostaty, rakovinu prsu, rakovinu plic a kolorektální rakovinu.
Předložený vynález navíc přináší způsob určování, zda nádor u pacienta je maligní, přičemž uvedený způsob zahrnuje určení, ve vzorku nádoru, získaného od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Uvedený způsob určování se obzvláště týká určení, ve vzorku nádoru, získaného od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidů, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobu tento způsob zahrnuje uvedení do kontaktu vzorku nádoru s monoklonální protilátkou, která specificky rozpoznává výše uvedený izolovaný polypeptid (obzvláště izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8)).
Předložený vynález se také týká způsobu určování zda nádor u pacienta je malignní, přičemž uvedený způsob zahrnuje • · ·· · ···· • · · · · · ♦ · · · · · · • · ··· ··· ·«· ··· ·· ···· ·· · určení, v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace:
polynukleotidu s polynukleotidovou sekvencí
SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, nebo
- polynukleotidu, jehož nukleotídová sekvence je fragment polynukleotídové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo
SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený fragment kódujíce izolovaný polypeptid, který má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
Uvedený způsob obzvláště zahrnuje určování, v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Ve výhodném provedení posledně uvedeného způsobu tento způsob zahrnuje následující kroky:
(a) přípravu molekul cDNA vycházejíce z molekul RNA vzorku nádoru, a potom (b) specifickou amplifikaci molekul cDNA, které jsou schopny kódovat alespoň jednu část polypeptidu.
Předložený vynález se ještě týká způsobu sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:
• 9 ·· ·9 9 • · 9 9 9 · 9 ·· · · 9 9 · · 9 · 9 • · · · · · • 9 9··· 99 · (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) porovnávání koncentrací určených v kroku (a) v různých časových intervalech.
Uvedený způsob sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou zahrnuje obzvláště v kroku (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace izolovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Krok (a) výše uvedeného způsobu zahrnuje výhodně uvedení do kontaktu části biologického vzorku s monoklonální protilátkou, která specificky rozpoznává uvedený polypeptid (obzvláště protein sekvence SEQ. ID. NO. 8) . Ve výhodném • · ·· ·· ·· · ·» ·· · · · · · · · • · · · · ···· • 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 • · 9 9 9 9 9 9
999 999 99 9999 99 9 provedení výše uvedeného způsobu je biologický vzorek, získaný od pacienta, mimo jiné část nádoru.
Předložený vynález se dále týká způsobu sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta, postiženého rakovinou, který zahrnuje následující kroky:
(a) určení, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace RNA kódující izolovaný polypeptid, které zahrnuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) porovnávání koncentrací určených v kroku (a) v různých časových intervalech (a).
Uvedený způsob sledování postupu nebo regrese onemocnění u pacienta postiženého rakovinou zahrnuje obzvláště v kroku (a) určování, opakované ve zvolených časových intervalech a v biologickém vzorku získaném od pacienta, koncentrace RNA kódující izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k ·· ·» • · * 9 • · · • · · · · ·« ···» ·· * • 9 · • 9 19 • ····» • · · ·« · polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace RNA kódující protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobů sledování krok (a) zahrnuje výhodně:
(i) přípravu molekul cDNA, biologického vzorku, a (ii) specifickou amplifikaci schopny kódová alespoň jednu polypeptidu.
vycházejíce z molekul RNA molekul cDNA, které jsou část uvedeného izolovaného
Všechny způsoby určenování a/nebo sledování popsané výše jsou nástroje, které dovolí lékaři formulovat po analýze výsledků svoji diagnózu, týkající se závažnosti a/nebo postupu nebo regrese nádorů uvažovaného pacienta.
Předložený vynález se navíc týká soupravy pro diagnózu proliferativních onemocnění, která obsahuje:
(1) monoklonální protilátku, která váže specificky izolovaný polypeptid, obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 4, (2) druhou monoklonální protilátku nebo její fragment, která se váže buď k monoklonální protilátce, která byla definovaná v (1), nebo k izolovanému polypeptidu, který byl definovaný v (1), přičemž uvedená druhá monoklonální protilátka je konjugována s reportérovou skupinou.
Uvedená souprava pro diagnózu proliferativních onemocnění může obzvláště být zvolena tak, že fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 je izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno koncentrace RNA kódující protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Reportérové skupina soupravy pro diagnózu, uvedená výše, je výhodně skupina zvolená ze souboru sloučenin, kteý zahrnuje radioisotopy, fluorescenční skupiny, luminescenční skupiny, enzymy, biotin a obarvené částice.
Předložený vynález se navíc týká způsobu přípravy izolovaného polypeptidu, který obsahuje alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a uvedený způsob přípravy zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky: (a) kultivaci, v podmínkách vhodných pro dosažení exprese uvedeného polypeptidu v hostitelské buňce transformované nebo transfektované vektorem exprese, kde polypeptid zahrnuje izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený « · · · · · izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, a (b) izolace polypeptidu, vycházejíce z kultur hostitelských buněk.
Uvedený způsob se obzvláště týká způsobu přípravy izolovaného polypeptidu, kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Předložený vynález nakonec přináší způsob pro identifikaci sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci, který zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky:
(a) uvedení do kontaktu každé testované sloučeniny za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se použité činidlo vázalo na polypeptid, s izolovaným polypeptidem, který obsahuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein, související s podporou buněčného růstu a/nebo diferenciace, a (b) detekce vazby každé testované sloučeniny k uvedenému polypeptidu a identifikace, mezi testovanými sloučeninami, sloučenin schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci.
Uvedený způsob pro identifikaci sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci obsahuje ve svém kroku (a) obzvláště uvedení do kontaktu každé testované sloučeniny za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se použité činidlo vázalo na polypeptid, s izolovaným
polypeptidem, kódovaný | polynukleotidovou | sekvencí | |
SEQ. ID. NO. 9 nebo | sekvencí | komplementární k | |
polynukleotidové sekvenci | SEQ. ID. | NO. 9 (jinak | řečeno s |
proteinem sekvence SEQ. ID | . NO. 8) . | ||
Alternativní způsob identifikace | sloučenin | schopných | |
modulovat buněčný růst | a/nebo | diferenciaci | zahrnuj e |
následující po sobě jdoucí | kroky: |
(a) uvedení každé testované sloučeniny do kontaktu, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby testované činidlo a buňka mohly interagovat, s buňkou schopnou exprimovat izolovaný polypeptid, který obsahuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, • · · • · · · ·
přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein související s modulací buněčného růstu a/nebo diferenciace, a (b) určení účinku každé testované sloučeniny na buněčnou koncentraci polypeptid a identifikace sloučenin, schopných modulovat buněčný růst a/nebo diferenciaci, mezi testovanými sloučeninami.
Uvedený alternativní způsob ve svém kroku (a) obzvláště zahrnuje uvedení každé testované sloučeniny do kontaktu, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby testované činidlo a buňka mohly interagovat, s buňkou schopnou exprimovat izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno s buňkou schopnou exprimovat protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Ve výhodných způsobech provedení způsobů identifikace sloučenin schopných modulovat růst a/nebo diferenciaci popsané výše pocházejí testované sloučeniny z knihoven malých molekul, vytvořených způsoby kombinatorické chemie.
Předložený vynález se navíc týká polynukleotidu, který obsahuje endogenní promotor nebo regulační prvek proteinu související s diferenciací, kde protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci
SEQ. ID. NO. 5.
Předložený vynález se týká také polynukleotidu, který obsahuje detekční gen řízený endogenním promotorem nebo regulačními prvky proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, ve kterém protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5.
Předložený vynález se také týká buňky transformované nebo transfektované takovým polynukleotidem.
Předložený vynález se mimoto týká způsobu identifikace sloučenin schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulací buněčné proliferace, který zahrnuje následující po sobě jdoucí kroky:
(a) uvedení každé testované sloučeniny za takových podmínek a po takovou dobu, která je dostatečná k tomu, aby testovaná sloučenina interagovala s uvedeným promotorem nebo regulačním prvkem, do kontaktu s buňkou transformovanou nebo transfektovanou polynukleotidem, který obsahuje detekční gen pod kontrolou endogenního promotoru nebo regulačních prvků proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, ve kterém protein zahrnuje sekvenci kódovanou polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, (b) určení účinků každé testované sloučeniny na koncentraci detekčního proteinu produkovaného buňkou a identifikace sloučenin, schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace.
Ve výhodném provedení způsobu identifikace sloučenin schopných modulovat expresi proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, který byl uveden výše, pocházejí testované sloučeniny z knihoven malých molekul, vytvořených způsoby kombinatorické chemie.
Farmakologické vlastnosti polynukleotidu a polypeptidu podle předloženého vynálezu činí tyto polynukleotidy a polypeptidy vhodné pro farmaceutické použití. Izolované polypeptidy, které obsahuje alespoň:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, které mají alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein, podílející se na modulaci buněčné proliferace, stejně tak jako polynukleotidy kódující takové polypeptidy, mohou být podle předloženého vynálezu podávány pacientům trpícím rakovinou pro zpomalení rozvoje jejich nádorů nebo pro dosažení regrese uvedených nádorů.
Ve výše uvedených způsobech může být protein, podílející se na modulaci buněčné proliferace nebo diferenciace, obzvláště izolovaný polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 9 nebo sekvencí komplementární k
polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 9 (jinak řečeno protein sekvence SEQ. ID. NO. 8).
Různé pojmy uvedené výše jsou zřejmé pro odborníka v oboru na základě podrobného popisu různých aspektů předloženého vynálezu.
Podrobný popis různých aspektů předloženého vynálezu
Jako je uvedeno výše, předložený vynález se obecně týká produktů a způsobů určených k ovlivňování buněčného růstu a pro léčbu rakoviny.
Předložený vynález je částečně založen na identifikaci sekvencí souvisejících s modulací buněčné prolíferace, kterými jsou polypeptidové a polynukleotidové sekvence, související s modulací buněčné prolíferace. mRNA související s diferenciací je mRNA, která se nachází ve vyšší úrovni v diferenciovaných buňkách než v odpovídajících nediferenciovaných buňkách (to znamená, že hladina mRNA je alespoň dvakrát vyšší). Molekula cDNA související s diferenciací je sekvence odpovídající mRNA, související s diferenciací (a/nebo sekvence komplementární).
Takové molekuly cDNA mohou být připraveny vycházejíce z přípravy RNA nebo mRNA používajíce standardních způsobů, jako je inverzní transkripce. Obdobným způsobem protein nebo polypeptid související s diferenciací zahrnuje sekvence kódované mRNA související s buněčnou diferenciací.
Farmaceutické kompozice zde popsaný mohou obsahovat jeden nebo více polypeptidů, sekvence! nukleových kyselin a/nebo protilátek. Polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují alespoň jednu část proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace nebo jeho variantu. Sekvence nukleových kyselin podle předloženého vynálezu zahrnují sekvenci DNA nebo RNA, která kóduje alespoň jednu část polypeptidů nebo která je komplementární k takové kódující sekvenci.
Protilátky jsou proteiny imunitního systému nebo jejich fragmenty vazby antigenu, které jsou schopny vázat části polypeptidů, popsaných výše.
Alternativně může kompozice zahrnovat jedno nebo více činidel, které modulují expresi genu, souvisejícího s modulací buněčné proliferace.
Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu:
Předložený vynález se obzvláště týká polynukleotidů, které mají sekvence SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9, stejně tak jako polypeptidů, které mají sekvenci SEQ. ID. NO. 8.
Předložený vynález se také týká polynukleotidů, které mají polynukleotidové sekvence, které vykazují homologii alespoň 75 %, výhodněji alespoň 85 % a ještě výhodněji alespoň 90 %, například 95 % s polynukleotidovými sekvencemi popsanými • ·· · · výše, zejména se sekvencemi SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9. To dalších polynukleotidů, předloženého vynálezu, sekvenci SEQ. ID. NO. 8.
se také týká mutatis mutandis polypeptidu a proteinů podle zejména proteinů, které mají
Předložený vynález se také týká izolovaných polynukleotidů a polypeptidů. Polynukleotid nebo polypeptid se nazývá „izolovaný, pokud je vyjmut za svého původního prostředí. Polynukleotid nebo polypeptid se nazývá izolovaný zejména pokud je separován od biologického materiálu, se kterým koexistuje v přírodním systému.
Podle předloženého vynálezu mohou být polynukleotidové sekvence, které kódují polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu a jejich fragmenty nebo fúzované proteiny vycházející z těchto polypeptidů a proteinů, používány pro generování rekombinantních molekul DNA, které řídí expresí takových polypeptidů a proteinů, nebo jejich aktivních částí, ve vhodných hostitelských buňkách. Alternativně mohou být polynukleotidové sekvence, které hybridizují s částmi polynukleotidových sekvencí podle předloženého vynálezu také používány v testech hybridizace nukleových kyselin jako je například Southern blot, Nothern blot a podobně.
V důsledku degenerace genetického kódu mohou být i další polynukleotidové sekvence DNA, kódující v zásadě polypeptidy nebo proteiny podle předloženého vynálezu, použity pro klonování a expresi uvedených polypeptidů nebo
9 9 9 9 9 9
9 9 99 9·999
999 999 99 proteinů. Takové sekvence DNA zahrnují sekvence, které hybridizují s polynukleotidovými sekvencemi polynukleotidů podle předloženého vynálezu za jistých podmínek stringence, které mohou být upraveny různým způsobem. Tak například v průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) může být nastavena teplota, za které hybridizují primery s matricí a nebo koncentrace MgCl2 v reakčním pufru. Za podmínek používání radioaktivně označených fragmentů DNA nebo oligoneukleotidů pro sondování membrán, může být stringence nastavena změnou iontových sil promývacího roztoku nebo opatrným řízením promývací teploty.
Předložený vynález se obzvláště týká polynukleotidů, které vykazují homologií alespooň 75 % s polynukleotidy, keré mají sekvenci SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9. Stupeň homologie se vyjadřuje následujícím způsobem:
100 - 100 x (N'/N) kde N' představuje počet nukleotidů, které jsou pozměněny ve srovnání se sekvencemi SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9 a N je počet všech nukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.
Taková homologická nukleotidová sekvence výhodně k sekvenci hybridizuje se sekvencí komplementární SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID stringentních podmínek. Parametry definující
NO. 9 za stringenci závisejí na teplotě, za které se oddělí 50 % vláken (Tm) .
• 4 ·· ·· ·· · «· ·· ···« 4 9 · • · · · 4 4··· ♦ · · · 4 4·· ···· • · 4 4 4 9 19 • •4 ··· ·· ·«·· ·· ·
U molekul, které mají více než 30 bází je podle publikace
Sambrook a kol. (Molecular cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY,
1989) Tm definováno následujícím vztahem:
Tm = 81,5 + 0,41 x (% G+C) + 16,6 x (kationty) = 0,63 x (% formamidu) - (600/počet bází)
Pro potřeby výkladu v předložené přihlášce vynálezu se podmínky stringence nazývají „silné, pokud se používá teplota o 10 °C vyšší než je Tm a hybridizační pufr obsahující roztok 6 x SSC (chlorid sodný 0,9 M a citrát sodný 0,09 M). Za takových podmínek polynukleotidy nespecifických nehybridizuji s polynukleotidy sekvencí komplementárních k sekvencím SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5 nebo SEQ. ID. NO. 9.
Pozměněné sekvence, které mohou být používány podle předloženého vynálezu zahrnují sekvence, které vzniknou delecemi, insercemi nebo substitucemi různých nukleotidových zbytků, které kódují stejný genetický produkt nebo produkt s ekvivalentní funkcí. Produkt genu může také zahrnovat delece, inserce nebo substituce aminokyselinových zbytků v sekvencích proteinů podle předloženého vynálezu, které vedou na tak zvané tiché změny a tím vytvářejí polypeptidy a proteiny s ekvivalentními funkcemi.
Takové substituce aminokyselin mohou být provedeny na základě polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobního a hydrofilního charakteru a/nebo amfipatické povahy použitých aminokyselinových zbytků.
Tak například záporně nabité aminokyselinové zbytky zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou, kladně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin, aminokyseliny s polárními skupinami, které mají příbuzný hydrofobní charakter zahrnují leucin izoleuci a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; serin a threonin; fenylalanin, tyrosin.
Sekvence DNA podle předloženého vynálezu mohou být modifikovýny změnou polynukleotidových sekvencí podle předloženého vynálezu z řady různých důvodů, které zahrnují neomezujícím způsobem změny, které modifikují proces a expresi genového produktu. Například mohou být vytvořeny mutace provedené způsoby známými odborníkům v oboru, jako je řízaná mutageneze, vkládání nových restrikčních míst, změna glykosylace a fosforylace a podobně.
Konkrétně může v jistých systémech exprese, jako jsou kvasinky, hostitelská buňka nadměrně glykosylovat genový produkt. V takových systémech může být výhodné změnit polynukleotidové sekvence tak, aby byla eliminována glykosylační místa. Do rozsahu předloženého vynálezu spadají také modifikované polynukleotidové sekvence vztahující se k heterologickým sekvencím kódujícím fúzované proteiny. Fúzované proteiny mohou být modifikovány tak, aby
·· · obsahovaly místa štěpení lokalizované na sekvenci proteinu podle předloženého vynálezu (například na sekvenci SEQ.
ID.NO. 8) a sekvence heterologních proteinů, takovým způsobem, že sekvence proteinu podle předloženého vynálezu může potom být odštěpena z heterologního proteinu.
Polynukleotidy sosuvisející s modulací buněčné proliferace:
Předložený vynález pokrývá každý polynukleotid, kódující polypeptid související s modulací buněčné proliferace nebo jeho část nebo variantu, jak je zde popsán. Takové polynukleotidy mohou být jednoduchá vlákna (kódující nebo protisměrná) nebo dvojitá vlákna a mohou být představovány molekulami DNA (genomická, cDNA nebo syntetická) nebo molekulami RNA.
Polynukleotidy související s diferenciací mohou být připraveny používajíce libovolný způsob, který je dostupný pro odborníka v oboru. Například může být takový polynukleotid amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), vycházejíce z cDNA připravené z lidských buněk nebo tkání. Pro tento způsob mohou být navrženy, zakoupeny nebo syntetizovány specifické primery; tyto primers vycházejí ze sekvence uvedeného polynukleotidu. Amplifikovaná část může potom být použita pro izolaci úplného genu z knihovny lidské genomické DNA nebo z knihovny cDNA libovolné buňky nebo libovolné tkáně, ať je tato normální, nádorová nebo diferenciovaná, a to s použitím způsobů dobře známých odborníkům v oboru a stručně zopakovaných v následujícím textu. Alternativně může být úplný gen zkonstruován
- 29 vycházejíce z více fragmentů PCR. Molekuly cDNA kódující protein související s diferenciací nebo jeho část mohou také být připraveny prohledáváním knihovny cDNA získané například z mRNA buněk nebo tkání. Takové knihovny mohou být dostupné komerčně nebo mohou být připraveny používajíce klasické techniky (viz Sambrook a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Alternativně mohou být použity jiné techniky prohledávání, dobře známé odborníkům v oboru.
Molekula cDNA související s diferenciací může být sekvencována používajíce klasické techniky využívající enzymy, jako je Klenowův fragment DNA polymerázy I, Sekvenáza X (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Spojené státy), Taq polymeráza (Perkin Elmer, Foster City, CA, Spojené státy), termostabilní polymeráza T7 (Amersham, Chicago, IL, Spojené státy) nebo kombinace rekombinantních polymeráz a exonukleáz s aktivitou zpětného čtení jako je amplifikační systém Elongase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Spojené státy). Může být použit systém automatické sekvenace s použitím přístrojů dodávaných komerčními společnostmi jako je Perkin Elmer a Pharmacia.
Částečná sekvence cDNA může být použita pro identifikaci polynukleotidové sekvence, kódující úplný protein související s modulací buněčné proliferace, používajíce klasické techniky dobře známé odborníkům v oboru. Mezi těmito technikami je prohledávání knohoven cDNA s použitím • · · • · · · · · · • · · · · · ·····
jedné nebo více polynukleotidových sond, používajíce vlastnosti rekombinace RecA (ClonCapture cDNA Selection
Kit, Clontech Laboratories, Spojené státy).
Pro techniky hybridizace může být sekvence částečně radioaktivně označena (například translací přerušení nebo označením konců použitím 32P nebo 33P) používajíce klasické techniky. Knihovna bakterií nebo bakteriofágů se potom prohledává hybridizaci na filtrech obsahujících denaturované kolonie bakterií (nebo otisky obsahující plaky fágů) s označenou sondou (viz Sambrook a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Pozitivní kolonie nebo plaky se potom vyberou a amplifikuji a DNA se izoluje pro budoucí analýzy.
Úplná sekvence může potom být určena používajíce standardní techniky. Překrývající se sekvence se potom spojí do jediné souvislé sekvence. Úplná molekula cDNA může být generována ligaturou požadovaných fragmentů, používajíce klasické techniky.
Alternativně existuje řada způsobů založených na amplifikaci pro získání úplné kódující sekvence z částečné sekvence cDNA.
Amplifikace se obecně provádí pomocí PCR. Pro etapy amplifikace může být používána libovolná komerčně dostupná souprava. Les primers mohou být dessinées používajíce, například, des logiciels dobře známýs v le métier. Nukleotidové primery jsou výhodně molekuly obsahující 20 • ·
- 31 až 30 nukleotid, které mají obsah guaninu a cytosinu alespoň 50 % a které hybridizuí s cílovou sekvencí za teplot v rozmezí mezi 50 až 72 C. Amplifikovaná oblast může být sekvencována jako je popsáno výše a překrývající se sekvence mohou být spojeny do jedné souvislé sekvence.
Mezi alternativními přístupy mohou být sekvence sousedící s částečnou sekvencí amplifikovány primerem sekvence vazby a primerem specifickým pro známou oblast. Amplifikované sekvence se potom vystaví druhému cyklu amplifikace.
Dodatečné techniky zahrnují zachycující PCR (Lagerstrom a kol., PCR Methods Applic. (1991), 1,111-19) a progresivní PCR (Parker a kol., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-60). Mohou také být použity další způsoby používající amplifikaci, pro získání úplné sekvence cDNA.
Je možné získání sekvence úplné cDNA pomocí analýzy sekvencí deponovaných v bázi publikované Expressed Sequence Tags (EST), vycházejíce z GenBank. Průzkumy EST mohou být realizovány používajíce informatické programy, dobře známé odborníkům v oboru (například NCBI BLAST) a takové EST mohou být používány pro vytvoření úplné a souvislé sekvence.
Varianty polynukleotidových sekvencí popsaných výše (zejména sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5) spadají také do rozsahu předmětu předloženého vynálezu. Varianty polynukleotidových sekvencí mohou zahrnovat jednu nebo více substitucí, delecí nebo insercí, viz také část uvedená výše
a nazvaná „Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu.
Část sekvence komplementární ke kódující sekvenci (to znamená protisměrný polynukleotid) může také být použita jako sonda nebo jako modulátor exprese genu. cDNA konstrukty, které mohou být transkribovány do protisměrné RNA mohou být vloženy do buněk nebo do tkání pro usnadnění produkce protisměrné RNA. Protisměrný polynukleotid může být používán, jako je zde popsáno, pro inhibicí exprese genu souvisejícího s modulací buněčné proliferace. Protisměrná technologie může být použita pro řízení exprese genu vytvořením trojité šroubovice, což působí proti schopnosti dvojité šroubovice se dostatečně otevřít pro vazbu polymeráz, transkripčních faktoů nebo řídících molekul (viz Gee a kol. v Huber a Carr, Molecular and Immunologic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).
Alternativně může být protisměrná molekula použita pro hybridizaci s řídící oblastí genu (například promotor nebo iniciační místo transkripce) a blokovat transkripci genu nebo blokovat translaci inhibicí vazby ribosomů k transkriptu.
Polynukleotidy mohou potom být modifikovány pro zvýšení jejich stability in vivo.
Možné modifikace zahrnují neomezujícím způsobem: přidání sekvencí na konci 5' a/nebo 3'; použití fosforothioátu nebo 2' O-methylu namísto vazeb fosfodiesterázy ve skeletu; a/nebo vložení bází jako je inosine, kveosin a wybutosin, • · • ·
- 33 stejně tak jako acetyladenin, methylthioadenin a další modifikované formy adeninu, cytidin, guanin, thymin a uridin.
Další varianty polynukleotidů podle předloženého vynálezu již také byly popsány výše v části nazvané „Polynukleotidy, polypeptidy a proteiny podle předloženého vynálezu.
Sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu mohou být připojeny k dalším nukleotidovým sekvencím používajíce zavedené rekombinantní DNA techniky. Například polynukleotid může být klonován do velkého panelu vektorů exprese, v to počítaje plasmides, fagemidy, deriváty fágu lambda a kosmidy. Obzvláště zajímavé vektory zahrnují vektory exprese, vektory replikace a vektory sekvenace. Obecně vektor obsahuje počátek funkční replikace v alespoň jednom organismu, vhodná endonukleázová restrikční místa a jeden nebo více selekčních markérů. Použití dalších prvků závisí na požadovaném specifickém použití na odborník v oboru, který zvolí vlastnosti vektoru exprese v závislosti svých potřebách a dostupných technikách.
Polynukleotidy mohou být upraveny pro vstup do buňky a exprimování odpovídajícího polypeptidů. Takové přípravky jsou obzvláště vhodné pro použití pro způsoby léčby popsané dále.
Odborníkům v oboru je zřejmé, že existuje řada prostředků pro expresi polynukleotidů v cílové buňce a že libovolná z ospovídajících technik může být použita. Například • · · · · · · • · · · ·· ·«··« • · · · · · • · ···· · * · polynukleotid může být vložen do virového vektoru jako je adenovirus nebo retrovirus (ale také do dalších). Způsoby vložení DNA do takových vektorů jsou dobře známy odborníkům v oboru. Retrovirový vektor může přenášet nebo obsahovat gen pro selekční markér a/nebo cílící jednotku jako je gen kódující ligand receptorů specifického pro cílovou buňku s cílem vytvořit cílově specifický vektor.
Další polynukleotidové přípravky zahrnují systémy koloidní disperze jako jsou makromolekulám! komplexy, nano-kapsle, mikrosféry, kuličky a systémy založené na použití lipidů zahrnující emulze olej/voda, micely, smíšené micelly a liposomy. Koloidní systém výhodný pro použití pro podávání produktu in vitro a in vivo je liposom (to znamená umělá membránová vesikula).
Polypeptidy související s modulací buněčné proliferace:
V dalším popisu polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují alespoň jednu část proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace nebo jeho varianty, přičemž uvedená část je imunologicky a/nebo biologicky aktivní. Takové polypeptidy mohou mít libovolnou délku, včetně úplného proteinu, oligopeptidu (to znamená peptidu s relativně malým počtem aminokyselin, jako je 8-10 zbytků, spojených peptidovými vazbami) nebo peptid střední velikosti. Polypeptid může také zahrnovat dodatečné sekvence.
9 99 9 · 9 9 9
9 99 9 9 99 9 · 9 9 «
9 9 9 9 999
999 999 99 999· 99 9
Polypeptid je imunologicky aktivní v kontextu předloženého vynálezu, pokud je rozpoznáván povrchovým receptorem buněk B a/nebo T. Imunologická aktivita může být testována používajíce klasické techniky jako jsou způsoby shrnuté v monografii Paul, Fundamental Immunology, 3. vydání, 243-247 (Raven Press, 1993). Takové techniky zahrnují prohledávání polypeptidových derivátů původního polypeptidu pro určení jejich schopnosti reagovat s antigenově specifickým antisérem a/nebo linií buněk T nebo s klony, které mohou být připraveny obvyklými způsoby.
Imunologicky aktivní část proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné prolíferace, reaguje takovými antiséry a/nebo buňkami T a není významněji slabší než je réaktivita úplného polypeptidu (například v testu ELISA a/nebo v testu reaktivity buněk T) . Taková prohledávání mohou obecně být realizována používajíce způsoby dobře známé odborníkům v oboru jako je způsoby popsané v publikaci Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Epitopy buněk B a T mohou také být předpovšzeny používajíce informatických způsobů.
Alternativně mohou být imunogenní části identifikovány používajíce počítačovou analýzu, jako je program Tsites® (viz Rothbard a Taylor, EMBO J. (1988), 7, 93-100; Deavin a kol., Mol. Immunol. (1996), 33, 145-155), který hledá peptidové motivy, které mají schopnost vyvolat odezvu. Peptidové motivy vhodné pro vazbu k myšímu nebo lidskému hlavnímu komplexu histokompatibility třídy I nebo II (MHC)
00
0 0
0000
0
0« · • 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 0
000 000 00 0000 mohou být identifikovány způsobem BIMAS (Parker a kol., J. Immunol. (1994), 152: 163, 1994). Pro potvrzení imunogenicity může být peptid testován používajíce myší transgeniní HLA A2 a/nebo test in vitro stimulace s použitím dendritických buněk, fibroblastů nebo buněk periferní krve.
Stejným způsobem je polypeptid „biologicky aktivní, pokud obsahuje jednu nebo více strukturálních, regulačních a/nebo biochemických funkčních skupin původního proteinu souvisejícího s modulací buněčné proliferace. Existence biologické aktivity může být určena způsoby dobře známými odborníkům v oboru.
Například srovnávací studie sekvencí mohou indikovat zvláštní biologickou aktivitu proteinu. Testy zaměřují se na zhodnocení takové aktivita mohou potom být prováděny na základě způsobů testování známých v oboru.
Jisté části a další varianty takových proteinů by také měly vykazovat tyto vlastnosti v testech in vitro nebo in vivo.
Jak již bylo uvedeno výše, polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou zahrnovat jednu nebo více částí varianty endogenního proteinu, kde - část je biologicky aktivní imunologicky a/nebo (to znamená část vykazuje jednu nebo imunogenních a/nebo biologických více antigenních, vlastností úplného proteinu). Výhodně je taková část alespoň tak aktivní jako úplný protein v testech umožňujících detekci takových vlastností. Varianta
• | 9 99 99 | 99 | 9 | |
9 | 9 | 9 9 9 | 9 9 | • 9 |
9 | 9 9· 9 | 9 9 9 | 9999 | |
• | 9 | 9 9 9 | 9 9 | 9 |
··· | 999 | 99 9999 | 99 | 9 |
polypeptidu je polypeptid, který se liší od původního proteinu substitucemi, ínsercemi, delecemi a/nebo modifikacemi aminokyselin. Jisté varianty zahrnují konzervativní substituce. Konzervativní substituce je taková substituce, při které jw aminokyselina substituována jinou aminokyselinou, která má stejné vlastnosti, jako je určeno odborníkem v oboru, který nepozoruje žádné změny sekundární struktury ani hydropatické povahy polypeptidu. Substituce aminokyselin mohou obecně být prováděny na bázi podobné polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobního a hydrofilního charakteru a/nebo amfipatické povahy zbytků. Například záporně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou; kledně nabité aminokyseliny zahrnují lysin a arginin; a nenabité polární aminokyseliny, které mají podobné hodnoty hydrofobnosti zahrnují leucin, izoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; serin, thronine, fenylalanin a tyrosin. Další skupiny aminokyselin, které mohou představovat konzervativní změny jsou zejména následující: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; a (5) Phe, Tyr, Trp, His. Varianta může také a nebo alternativně obsahovat nekonzervativní změny.
Varianty představující část předloženého vynálezu zahrnují také polypeptidy ve kterých primární struktura původního proteinu se modifikuje případným vytvořením kovalentních konjugátů s dalšími polypeptidy nebo chemickými strukturami jako jsou lipidové skupiny nebo glykosylové skupiny nebo acetylfosfát.
Předložený vynález zahrnuje také polypeptidy, které mají nebo nemají glykosylační motivy. Polypeptidy exprimované v kvasinkových systémech exprese nebo v savčích buňkách mohou být, vyjádřeno v hodnotách molekulové hmotnosti a glykosylačního schématu, podobné nebo mírně odlišné od původní molekuly v závislosti na používaném systému exprese.
Exprese DNA v bakteriích jako je E. coli vede na neglykosylované molekuly. Místa N-glykosylace eukaryotních proteinů jsou charaktérizována aminokyselinovým tripletem Asn-Al-Z, kde Al je libovolná aminokyselina s výjimkou Pro, a Z je serin nebo threonin.
Předložený vynález zahrnuje také alely proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace. Alely jsou alternativní formy původního proteinu, které vznikají jednou nebo více mutacemi (které mohou vést na to, že aminokyselinový zbytek je odebrán, přidán nebo nahrazen), které vedou na změněnou RNA. Alelické proteiny se mohou lišit v sekvenci, ale globální struktura stejně tak jako funkce jsou v zásadně podobné. Protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, jeho varianty a části mohou obecně být připraveny z nukleových kyseliny, kódujících požadovaný polypeptid, používajíce klasické techniky. Pro přípravu endogenního proteinu může být používána izolovaná cDNA.
• · · · · · · • · · · · · • · · · 9 9 9 99
Pro přípravu polypeptidové varianty mohou být používány standardní techniky mutageneze, jako je řízená mutagenese používající řízený olígonukleotid.
Obecně mohou být pro exprimování rekombinantních polypeptidu podle předloženého vynálezu použity libovolné vektory exprese, známé odborníkům v oboru.
Exprese může být dosažena v libovolné hostitelské buňce, která byla transformována nebo transfektována vektorem exprese obsahujícím sekvenci DNA kódující rekombinantní polypeptid. Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryotní buňky, vyšší eukaryotní buňky nebo kvasinky. Výhodně jsou použity hostitelské buňky E. Coli, kvasinek nebo savčí buňky jako je COS, CHO, MCF7 (lidské nádorové buňky izolované z karcinomu prsu) nebo DU 145 (lidské nádorové buňky izolované z rakoviny prostaty).
Po dosažení exprese supernatant systémy hositel/vektor, který vylučuje rekombinantní protein nebo polypeptid v nejprve koncentrován, jako je alkoholová kultivačním používáj íce médiu může být klasické techniky precipitace nebo filtrace pomocí komerčních filtrů. Po kroku koncentrace může být vzniklý produkt aplikován na odpovídající purifikační matrici jako je afinitní matrice nebo iontoměničová pryskyřice. Jedna nebo více etap HPLC může být použito pro pokračování purifikace polypeptidu.
Jisté části a další varianty mohou také být generovány syntetickými způsoby, používajíce techniky dobře známé odborníkům v oboru. Například části a další varianty, • · · · 9···· • · 99 9 9 99 99999 • 9 9 9 · ···
999 999 99 9999 99 9 kterré mají méně než 500 aminokyselin, výhodně méně než 100 aminokyselin a výhodněji méně než 50 aminokyselin, mohou být syntetizovány chemickou cestou. Polypeptidy mohou být syntetizovány používajíce způsoby syntézy v pevné fází, které jsou komerčně dostupné, jako je způsob syntézy na Merrifieldově pryskyřici nebo se aminokyseliny sekvenčně přidávají k řetězci aminokyselinyv průběhu syntézy (viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149-2146). Četné další způsoby syntézy v pevné fázi jsou také dostupné (například způsob Roberge a kol., Science (1995), 269, 202204) . Přístroje pro automatickou syntézu polypeptidů jsou komerčně dostupné u dodavatelů jako je Applied Biosystems, lne. (Foster City, CA, Spojené státy); syntéza polypeptidů proto může být prováděna podle instrukcí výrobců.
Izolované polynukleotidy nebo polypeptidy:
Obecně se polypeptidy a polynukleotidy popsané v předloženém vynálezu izolují. Izolovaný polypeptid nebo polynukleotid je polynukleotid nebo peptid vyjmutý z jeho původního prostředí. Například přírodní protein se izoluje jestliže je oddělen od biologického materiálu, se kterým koexistuje v přírodním systému. Polynukleotid je považován za izolovaný, jestliže je například klonovaný do vektoru, který nepředstavuje jeho přirozené prostředí.
Signální sekvence:
Jsou k disposici způsoby předpovídání, zda protein obsahuje signální sekvenci, stejně tak jako způsoby předpovídání • · · · · · · místa štěpení této sekvence. Například způsob, který popsal McGeoch (Virus Res. (1985), 3, 271-285) používá informaci krátké nabité N-terminální sekvence v nenabité oblasti úplného (neštěpeného) proteinu. Způsob Von Heinje (Nucleic Acid Res. (1986), 14, 4683-4690) používá informaci o zbytcích, které obklopují místo štěpení. Přesnost předpovědi místa štěpení známých savčích vylučovaných protein§ pro každý z těchto způsobů 75-80 %. Nicméně však tyto dva způsoby nepředpovídají vždy stejná místa štěpení pro daný protein.
Sekvence aminokyselin vylučovaného polypeptidu podle předloženého vynálezu byla analyzována počítačovým programem nazývaným SignalP (Sequence Analysis Software Package of the Genetic Computer Group, University of Wísconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, Spojené státy). Tento počítačový předpovídá buněčnou lokalizaci proteinu založenou na sekvenci aminokyselin.
Je také známo, že v jistých případech štěpení signální sekvence vylučovaného proteinu není stejnoměrné, což vede k vytvoření více různých molekulárních druhů. Tyto polypeptidy a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy spadají do rozsahu předloženého vynálezu.
Kromě toho signální sekvence identifikované výše uvedenou analýzou nemohou být prediktivní pro přirozené signální sekvence. Například přirozená signální sekvence může být v přední nebo v zadní části sekvence. Nicméně je pravděpodobné, že uvedená signální sekvence bude schopna řídit vylučovaný protein do endoplasmiového retikula. Tyto polypeptidy a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy spadají do rozsahu předloženého vynálezu.
Místa štěpení závisí často na druhu a nemohou být předpovězena s dostatečnou jistotou.
Sekvence aminokyselin, počínající methioninem jsou identifikovány určenými sekvencemi kódovanými polynukleotidy, zatímco další fáze čtení mohou být snadno přeloženy používajíce technik molekulární biologie dobře známých odborníkům v oboru. Polypeptidy produkované těmito otevřenými fázemi alternativního čtení jsou také zahrnuty do předloženého vynálezu.
Protilátky a jejich fragmenty:
Předložený vynález se týká vazebných činidel, jako jsou protilátky, které vážou specificky protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Takové činidlo se označuje jako činidlo, které „specificky váže protein modulující buněčnou proliferaci, jestliže reaguje na detekovatelné úrovni (například určitelné testem ELISA) s proteinem podílejícím se na modulaci buněčné proliferace nebo s jeho částí nebo variantou a nereaguje na detekovatelné úrovni s dalšími proteiny. „Vazbou se označuje nekovalentní spojení mezi dvěma různými molekulami takovým způsobem, že se vytvoří komplex. Schopnost vazby může být ohodnocena například určením vazebné konstanty pro vytvoření komplexu.
· · · · · · •9 · 9 9 9 ····· • · · · 9 ·
Vazebná konstanta je hodnota, získaná z hodnoty koncentrace komplexu vydělené součinem hodnot koncentrací složek.
Obecně se dva produkty označují jako vázané, pokud vazebná konstanta dosáhne 103 1/mol. Vazebná konstanta může být určena používajíce způsoby dobře známé odborníkům v oboru.
Libovolné činidlo, které vbyhovuje výše uvedeným kritériím, může být považováno za vazebné činidlo.
Podle předloženého vynálezu je vazebné činidlo výhodně protilátka nebo její fragment. Protilátky mohou být připraveny libovolnými technikami dostupnými odborníkům v oboru (viz Harlow a Lané, Antibodies. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Obecně mohou být protilátky vytvářeny technikami buněčných kultur včetně vytváření monoklonálních protilátek nebo transfekcemi genů protilátky v hostitelských bakteriálních nebo savčích buňkách pro produkci rekombinantních protilátek.
Mezi různými technikami je výhodné používat způsoby popsané dále. Imunogen obsahující polypeptid se injektuje skupině savců (například myšis, krysy, králíci, ovce nebo kozy). V této etapě mohou polypeptidy podle předloženého vynálezu sloužit jako imunogeny bez modifikace.
Alternativně a obzvláště pro peptidy malé velikosti, může být vyšší imunitní odezva indukována pokud se polypeptid spojí s transportním proteinem jako je albumin hovězího séra nebo hemokyanin měkýše přílipky.
• · · · · · • · · · · · · · ·
Imunogen se injektuje hostitelskému zvířeti, výhodně podle předem určeného schématu a zvířatům je periodicky odebírána krev. Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid mohou být purifikovány, vycházejíce z takového antiséra, například afinitní chromatografií používajíce peptid vázaný na odpovídající pevný nosič.
Fúzované proteiny:
Libovolný fúzovaný protein může být vytvořen odborníkem pro analýzu sub-buněčné lokalizace proteinu podle předloženého vynálezu, zejména sub-buněčné lokalizace proteinu sekvence SEQ. ID. NO. 8. Komerčně jsou dostupné četné plasmidové konstrukty jako je protein Glutathion S Transferáza (GTS) nebo fluorescenční proteiny jako je Green Fluorescent Protein (GFP) nebo neomezujícím způsobem označování polyHistidinem.
Lidské eukaryotní hostitelské buňky (například HEK-293) se kultivují 24 hodin podle protokolu transfekce, který umožňujenormální metabolismus buněk a lepší účinnost transfekce. Rostoucí koncentrace (1, 5 a 10 μg) samotného vektoru obsahujícího značkující protein (GFP, GST nebo označení Histidinem) nebo polynukleotid, polynukleotid, vektoru obsahuj ícího který má sekvenci SEQ. ID. NO. 4, který má sekvenci SEQ. ID. NO. 5 nebo polynukleotid, který má sekvenci SEQ. ID. NO. 9, fúzované s značkovacím proteinem byly vytvořeny za pomoci činidla Effectene® podle instrukcí výrobce (Qiagen).
• · · • ···»
Buňky byly potom analyzovány například konfokálním mikroskopem pro detekci lokalizace proteinu. Pokud se předpokládá, že protein bude vylučován, je supernatant izolován, lyofilizován, vložen na akrylamidový gel a analyzován technikami jako je Western blot pomocí protilátek proti značkovacímu proteinu.
Farmaceutické kompozice:
Jisté předměty předloženého vynálezu, zahrnují vložení produktů jako jsou polypeptidy, protilátky a/nebo nukleové kyseliny do farmaceutických kompozic nebo vakcín. Farmaceutické kompozice obsahují jeden nebo více takových produktů a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů (transportních činidel).
Jisté farmaceutické kompozice popřípadě použitelné jako vakcíny mohou obsahovat jeden nebo více polypeptidů a aktivátor imunitní odezvy, jako je adjuvans nebo liposom (ve kterém je produkt obsažen).
Farmaceutické kompozice a vakcíny mohou navíc obsahovat systém podávání, jako jsou biologicky degradovatelné mikrosféry. Farmaceutické kompozice a vakcín podle předloženého vynálezu mohou také obsahovat další produkty, které mohou být biologicky aktivní nebo neaktivní.
Farmaceutická kompozice nebo vakcína může obsahovat DNA kódující jeden nebo více polypeptidů jako jsou polypeptidy popsané výše, a to takovým způsobem, že polypeptid je vytvořen in šitu. Jak je uvedeno výše, DNA může být přítomna v libovolné formě podávání známé odborníkům v
Μ ·· ·· 9 oboru, včetně bakteriálních nebo virových systémů exprese nukleové kyseliny. Vhodné systémy exprese nukleové kyseliny obsahující sekvenceDNA nutné pro expresi u pacienta.
• « 9 9 9 9 9 9 9
9999 99999999 · « · · 9 9 9
999 999 99 9999 99 9
Systémy podávání založené na bakteriích zahrnují podávání bakterie (jako je Bacillus-Calmette-Guerrin) která exprimuje část imunogenu polypeptidů na svém povrchu. Výhodně může být DNA zavedena používajíce virový systém exprese (například pox virus, retrovirus nebo adenovirus) implikující použití nepatogenních (defektních) činidel.
I když ve farmaceutických kompozicích podle předloženého vynálezu může být použito libovolné transportní činidlo, známé odborníkům v oboru, typ transportního činidla závisí na zvoleném způsobu podávání. Kompozice podle předloženého vynálezu mohou být připraveny pro každý způsob podávání, včetně například cesty topické, nasální, intravenózní, intrakraniílní, intramuskulární.
. intraperitoneální, subkutánní
Pro parenterální podávání jako je subkutánní injekce, obsahuje transportní činidlo výhodně vodu, sůl, alkohol, tuk, parafín nebo pufr. Pro orální podávání mohou být použita transportní činidla uvedená výše nebo pevné transportní činidlo jako je manitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, mastek, celulóza, glukóza, sacharóza a uhličitan hořečnatý. Biologicky degradovatelné mikrosféry mohou také být používáns jako transportní činidla pro farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu. Pro « · ·· »· ·· · ·· ·· · · · · «·· « · · 9 11119
1111 1111 1111 • · ··· 111
111 111 11 11·· ·· · jisté topické aplikace jsou výhodné přípravky jako jsou krémy nebo vody.
Takové kompozice mohou také obsahovat pufry (například neutrální solné nebo fosfátové roztoky), cukry (například glukózu, manózu, sacharózu nebo dextrany), manitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny jako je glycín, antioxidanty, chelační činidla jako je EDTA nebo glutathion, adjuvans (například hydroxid hlinitý) a/nebo ochranná činidla. Alternativně kompozice podle předloženého vynálezu mohou být v lyofilizované formě.
Produkty mohou také být uzavřeny v liposomech používajíce klasické technologie.
Podle předloženého vynálezu může být ve vakcínách použito pro vyvolání imunitní odezvy libovolné adjuvans. Většina adjuvans obsahuje látku chránící antigen proti rychlému katabolismu, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej stimulátor imunitní odezvy jako je lipid A, proteinové deriváty Bordetella Pertussis nebo Mycobacteium tuberculosis. Vhodné adjuvans jsou komerčně dostupné jako například: Freundův adjuvans a úplný adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MIY, Spojené státy; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ, Spojené státy)), biologicky degradovatelné mikrosféry; lipide A monofosforyl; a cytokiny jako je GM-CSF nebo interleukiny 2, -7 nebo -12.
Výše popsané kompozice mohou také být podávány ve formě přípravků se způžděným působením (to znamená přípravky jako • · · • · · · · • · je kapsle nebo houba, které zaručují pomalé uvolňování produktu podání). Takové přípravky mohou obecně být připraveny používajíce technologie dobře známé odborníkům v oboru a být podávány například cestou orální, rektální nebo podkožní implantací nebo implantací na požadované cílové místo. Přípravky s opožděným uvolňováním mohou obsahovat polypeptid, polynukleotid nebo protilátku dispergované v transporní matrici a/nebo být obsaženy chráněném difusní membránou. Transportní použití takových přípravků jsou biologicky slučitelné a měly by také být biologicky degradpvatelné; výhodně přípravek zaručuje relativně konstantní uvolňování aktivní složky. Množství aktivního produktu obsaženého v přípravku s opožděným uvolňováním závisí na místu implantace.
v reservoaru činidla pro
Protirakovinová terapie:
Předložený vynález se dále týká použití popsaných produktů v protirakovinové terapii. Polynukleotidy a polypeptidy související s modulací buněčné proliferace mohou být zejména používány pro inhibicí růstu a indukci modulace buněčné proliferace ve specifických nádorech prsu nebo prostaty.
Takové polypeptidy nebo polynukleotidy mohou také být používány pro terapie četných karcinomů, které zahrnují melanomy, různé formy glioblastomů, karcinomy plic stejně tak jako kolorektální rakoviny. Činidla aktivující expresi takových polypeptidů nebo polynukleotidů mohou také být použita v rámci těchto terapií.
Podle předloženého vynálezu také produkty (kterými mohou být polypeptidy nebo nukleové kyseliny) mohou být výhodně vloženy do farmaceutických kompozic popsaných výše.
Vhodnými pacienty pro terapie jsou všechna teplokrevná zvířata a výhodně člověk. Pacient pro terapii podle předloženého vynálezu může nebo nemusí být diagnostikován jako postižený rakovinou. Jinak řečeno, farmaceutické kompozice popsané výše mohou být používány pro inhibici vývinu rakoviny v různých stádiích onemocnění (pro prevenci objevení se rakoviny nebo pro léčbu pacienta postiženého rakovinou).
Farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu se podávají způsobem odpovídajícím pro každou specifickou léčenou rakovinu.
Způsob podávání, doba trvání a frekvence podávání se určeí typu a závažnosti Způsob podávání a v závislosti na stavu pacienta, onemocnění a na způsobu podávání, frekvence podávání se mohou mohou individuálně lišit. Obecně mohou být farmaceutické kompozice a vakcíny podávány injekcí (například cestou intrakutánní, intramuskulární, intravenózní nebo subkutánní) , cestou íntranasální (například inhalací) nebo cestou orální. Výhodně může být mezi 1 až 10 dávek podáváno v průběhu 52 týdnů. Alternativní protokoly mohou být vhodné pro každého individuálního pacienta.
• · • ·
Obecně vhodné dávkování a léčební režim zahrnují aktivní produkt v množství dostatečném pro dosažení příznivého účinku terapeutického a/nebo profylaktického. Taková odezva může být následována zlepšenou klinickou prognózou (například častější remise, následované úplným, částečným nebo dlouhodobým vymizením onemocnění) u ošetřovaných pacientů ve srovnání s pacienty neošetřovanými nebo ošetřovanými menšími dávkami.
Podle předloženého vynálezu polypeptid může být podáván v dávkách, které se mění od 100 μg do 5 mg. Molekuly DNA kódující takové polypeptidy mohou být obecně podávány v množství dostatečném pro vytvoření dostatečné hladiny polypeptidů.Vhodné dávky mohou obecně být určeny používajíce experimentální modely a/nebo klinické testy. Obecně je výhodné použití minimálních dávek dostatečných pro dosažení účinné terapie. Pacienti mohou obecně být sledováni z hlediska účinnosti terapie, používajíce testů odpovídájicích podmínkám léčby nebo prevence, které jsou známy odborníkům v oboru.
Způsoby detekce a sledování rakoviny:
Polypeptidy, polynukleotidy a protilátka popsané v předloženém vynálezu mohou být používány různými způsoby pro detekci rakoviny u pacienta. Přítomnost polypeptidů a/nebo polynukleotidů souvisejících s modulací buněčné prolíferace jako jsou látky popsané v předloženém vynálezu v buňkách hostitele je indikací diferenciace a zastavením buněčného růstu. Sekvence související s modulací buněčné ·
9 9 · • 99999 proliferace takto mohou být používány jako markéry rozdílu mezi normálními buňkami a buňkami maligními (a umožní lékaři, který bude interprotavet výsledky, diagnostikovat například karcinomy prostaty, prsu, plic a trakčníku). Sekvence související s modulací buněčné proliferace mohou také být používány jako markéry postupu léčby.
Způsoby zahrnující použití protilátky mohou umožnit experimentátorovi detekovat přítomnost nebo nepřítomnost polypeptidu popsaného v předloženém vynálezu v libovolném dostupném biologickém vzorku. Dostupné biologické vzorky zahrnují biopsie tkání nádorových a tkání zdravých, homogenáty nebo extrakty takových tkání získaných od pacienta. Existuje velký počet testů známých odborníkům v oboru pro použití protilátek pro detekce polypeptidových markérů ve vzorku (viz například Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Test může být například proveden technikou Western blot, ve které se přípravek s proteinem podrobí gelové elektroforéze, přenese se na odpovídající membránu a podrobí se reakci s protilátkou. Přítomnost protilátky na membráně může potom být detekována používajíce odpovídající detekční činidlo, jak je popsáno dále.
Další předmět předloženého vynálezu představuje test, zahrnující použití protilátka imobilizované na pevném nosiči vázaném na polypeptid. Vázaný polypeptid může být detekován používajíce druhou protilátku nebo další činidla obsahující detekční skupinu. Alternativně může být použit
kompetitivní test, ve kterém se polypeptid označí detekční skupinou a umožní se vazba na imobilizovanou protilátku po inkubaci protilátky se vzorkem. Schopnost, se kterou složky vzorku inhibují vazbu označeného polypeptidu s protilátkou indikuje reaktivitu vzorku s imobilizovanou protilátkou a tímto způsobem indikuje koncentraci polypeptidu ve vzorku.
Pevný nosič může být libovolný materiál, známý odborníkům v oboru, na kterém protilátka může být vázána. Pevný nosič může být například představován testovacími jamkami mikrotitrační destičky nebo nítrocelulózovým filtrem nebo jakoukoli jinou vhodnou membránou. Alternativně nosičem může být kulička, sklo, plast nebo latex jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Nosič může také být magnetická částečka.
Protilátka může být zmobilizována na pevném nosiči používajíce řadu technik známých odborníkům v oboru a široce popsaných ve vědecké literatuře. V kontextu předloženého vynálezu výraz „imobilizace znamená stejně tak nekovalentní spojení jako je adsorpce, jako vazbu kovalentní (kterou může být přímá vazba mezi antigenem a funkčními skupinami na nosiči nebo vazba využívající použití vazebného činidla).
Imobilizace adsorpcí jamkami mikrotitrační destičky nebo membránou je výhodná. V tomto případě adsorpce může být dosažena uvedením protilátky ve vhodném pufru do kontaktu s pevným nosičem po vhodnou dobu. Doba kontaktu závisí na teplotě, ale je typicky v rozmezí od 1 hodiny do 1 dne. Obecně uvedení do kontaktu s jamkami plastové mikrotitrační • · destičky (například polystyren nebo polyvinylchlorid) v množství protilátka od 1 pg do 10 ng a výhodně od 100 do
200 ng je dostatečné pro imobilizaci odpovídajícího množství polypeptidu.
Kovalentní vazba protilátky a pevného nosiče může také být dosažena reakcí nosiče s činidlo bifunkčním činidlem, které reaguje s nosičem a s funkční skupinou, jako je hydroxyle nebo aminovaná skupina na protilátce. Protilátka může být například vázána kovalentním způsobem na nosič pokrytý vhodným polymerem, používajíce benzochinon nebo kondenzací aldehydové skupiny na nosičs aminem a aktivovaným vodíkem na spolupůsobící látce, používajíce klasické techniky.
V jistých případech test pro detekci polypeptidu ve vzorku je test sendvičové dvojité protilátky. Tento může být realizován uvedením protilátky imobilizované na pevném nosiči, obvykle v jamkách mikrotitrační destičky, do kontaktu s biologickým vzorkem takovým způsobem, že polypeptid ve vzorku se může vázat na ímobílízovanou protilátku. Nevázané produkty se odstraní z komplexu polypeptid-protilátka a přidá se druhá protilátka (obsahující detekční skupiny) schopná se vázat na různá místa polypeptidu. Množství sekundární protilátky, která zůstane vázaná na pevný nosič se potom určení používajíce vhodný způsob specifický vůči detekčním skupinám.
Konkrétněji, pokud protilátka je imobilizovaná na nosič definovaný výše, vazebná místa proteinu jsou typicky blokována. Mmůže být používáno libovolné blokující činidlo, • · · • ·· ·
známé odborníkům v oboru, jako je albumin hovězího séra nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, Spojené státy).
Imobilizovaná protilátka se potom inkubuje se vzorkem a polypeptid může vázat protilátku. Vzorek může být před inkubací zředěn ve vhodném ředidle, jako je solný roztok pufrovaný fosfátem (PBS) .
Vhodná doba kontaktu (to znamená doba inkubace je obecně doba dostatečná pro detekci přítomností polypeptidu ve vzorku získaného od pacienta. Výhodně je doba takto definovaného kontaktu dostatečná pro dosažení úrovně vazby alespoň 95 % rovnovážné vazby mezi vázaným peptidem a nevázaným peptidem. Odborníkům v oboru je zřejmé, že doba nutná pro dosažení rovnováhy musí být určena měřením úrovně vazby, která je dosažena za jistou dobu za teploty okolí, přičemž inkubace 30 minut je obecně dostatečná.
Nevázané produkty mohou potom být odstraněny promýváním pevného nosiče vhodným pufrem jako je solný roztok pufrovaný fosfátem obsahující 0,1 % Tween 20™. Druhá protilátka, obsahující detekční skupinu, může potom být přidána na pevný nosič.
Detekční skupiny zahrnují výhodně enzymy peroxydáza), substráty kofaktorů, inhibitory luminescenční skupiny, fluorescenční skupiny Konjugace protilátky na detekční skupinu realizována používajíce standardní způsoby známé v oboru.
(jako je kolorantů, a biotin. může být odborníkům • · ·
Druhá protilátka se potom inkubuje s imobilizovaným komplexem protilátka-polypeptid po dobu dostatečnou k detekci vázaného polypeptidu.
Dostatečná doba může obecně být určena měřením úrovně vazby, ke které dojde za určenou dobu. Nevázaná druhá protilátka se potom odstraní a vázaná druhá protilátka se detekuje používajíce detekční skupinu. Způsob použitý pro detekci detekční skupiny závisí povaze této skupiny. Pro radioaktivní skupiny jsou obecně vhodné způsoby scintilační nebo auto-radiografické. Spektroskopické způsoby mohou být barviv a fluorescenčních nebo
Biotin může být detekován používajíce avidin vázaný na detekční skupinu (obvykle radioaktivní nebo fluorescenční skupina nebo enzym). Enzymatické detekční skupiny mohou obecně být detekovány přidáním substrátu (obecně po vhodnou dobu) s následnou spektroskopickou (nebo jinou) analýzou produktů reakce.
používány pro detekci luminescenčních skupin
Pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny se detekovaný signál detekční skupiny vázané na pevný nosič odpovídajícím hodnota Výhodně je hraniční obecně porovnává se signálem stanovené pro nenádorovou tkáň, hodnotou střední signál, získaný pokud se ímobílízovaná protilátka inkubuje se vzorky pacientů bez rakoviny. Obecně se vzorek generující signál o trojnásobek standardní odchylky větší nebo menší než hraniční předem určená hodnota považuje za indikativní.
99 9
9999
Pro další detaily se může odborník v oboru obrátit na následující publikaci: Sackett a kol., Clinical
Epidemiology. A basic Science for Clinical Medicine, str.
106-107 (Little Brown and Co., 1985).
Přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny u pacienta může také být určena zhodnocením množství mRNA kódující polypeptid podle předloženého vynálezu v biologickém vzorku (například biopsie) vzhledem k předem určené hraniční hodnotě.
Takové hodnocení může být provedeno používajíce velké množství způsobů známých odborníkům v oboru, jako například hybridizace sítu a amplifikace polymerázovou řetězovnou reakcí (PCR). Sondy a primery používané v takových způsobech mohou být obecně vytvořeny vycházejíce ze sekvencí uvedených v příkladech nebo vycházejíce z podobných sekvencí identifikovaných u jiných pacientů. Sondy mohou být používány v klasických hybridizačních technikách a mohou být označeny činidlem detekce pro usnadnění detekce sondy. Taková činidla zahrnují neomezujícím způsobem radionuklidy, fluorescenční barviva a enzymy schopné katalyzovat vytvoření detekovatelných produktů.
Primery mohou obecně být používány ve způsobech detekce zahrnujících polymerázovou řetězovou reakci (PCR) jako je RT-PCR, ve kterém se PCR aplikuje současně s inverzní transkripcí. Typicky se RNA extrahuje ze vzorku tkáně a inverzním způsobem se transkribuje pro získání molekul cDNA. Amplifikace PCR používající specifické primery • ·
generuje molekuly cDNA související s modulací buněčné proliferace, které mohou být odděleny a vizualižovány používajíce například gelovou elektroforézy. Amplifikace se typicky provádí na vzorcích získaných vycházejíce z párů nádorových a nenádorových tkání téhož pacienta nebo také vycházejíce z párů nádorových a nenádorových tkání různých pacientů. Reakce amplifikace může být prováděna na postupných ředěních cDNA pokrývajících dva řády. Modifikace exprese v poměru 2 nebo více v ředěních vzorku nádoru ve srovnání s ředěními nenádorového vzorku se typicky považuje za indikativní.
Jisté testy pro určení diagnózy mohou být kromě toho prováděny přímo na nádoru.
Takový test zahrnuje kontakt nádorových buněk s protilátkou nebo jejím fragmentem, který váže protein podílející se na modulaci buněčné proliferace. Vázaná protilátka nebo její fragment může být detekován přímo nebo nepřímo pomocí detekční skupiny. Takové protilátky mohou také být používány v histologických aplikacích. Alternativně může být v takových aplikacích používán protisměrný polynukleotid.
Podle dalšího předmětu předloženého vynálezu může být postup rakoviny a/nebo odezva na léčbu rakoviny sledován pomocí libovolného z výše popsaných testů po jistou dobu a zhodnocením změna úrovně odezvy (to znamená množství detekovaného polypeptidů nebo mRNA). Testy mohou být například prováděny každý měsíc po dobu od 1 do 2 let.
Obecně rakovina postupuje u pacientů u kterých hladina odezvy s časem klesá. Naopak rakovina nepostupuje, pokud detekovaný signál zůstává konstantní nebo se s časem zvyšuj e.
• 4 ·· 4» ·+ » ·· ·· · · · · · · · • 4 4 · · · · · · • * · · · 4 · · · «· · · • · 4 · · ··· ··· ··· ·· ···* ·« ·
Předložený vynález se také týká souprav pro použití souboru výše uvedenými diagnostickými způsoby. Takové soupravy zahrnují 2 (nebo více) složek, nutných pro provádění takových testů. Takové složky mohou být produkty, činidla a/nebo recipienty nebo zařízení. Recipient uvnitř soupravy může například obsahovat monoklonální protilátky nebo váže specificky polypeptid buněčné proliferace. Takové protilátky nebo fragmenty mohou být dodávány vázané na materiál nosiče, jak je výše uvedeno. Jeden nebo více dalších recipientů může obsahovat další prvky jako jsou činidla nebo pufry pro použité v testu. Takové soupravy mohou také obsahovat detekční činidlo (například protilátku), obsahující detekční skupiny vhodné pro přímou nebo nepřímou detekci vázané protilátky.
jejich fragment, který související s modulací
Způsoby pro lidentifikace vazebných činidel:
Předložený vynález kromě jiného přináší způsoby identifikace produktů, které se vážou a/nebo které modulují expresi proteinů souvisejících s modulací buněčné proliferace. Taková činidla mohou obecně být identifikována uvedení polypeptidů podle předloženého vynálezům do kontaktu s testovaným produktem/činidem za podmínek a po dobu dostatečnou pro dosažení interakce s polypeptidem •0 00 a/nebo jeho efektorem (například jeho receptorem). Každá obměna vazebných testů dobře známých odborníkům v oboru může takto být provedena pro testování schpnosti testovaného produktu vázat se na polypeptid nebo na jeho efektor (například jeho receptor).
• ·«
0 0
0 0 * 0
0 0
0000 • 0 · • 0 0 0
0 0000
0 0 ·· r
V jiných testech mohou být činidla prohledávána používajíce známých buněk, pro určení zda zvyšují expresi genu souvisejícího s modulací buněčná proliferace. Takové buňky mohou být uvedeny do kontaktu s testovanými činidly a exprese genu souvisejícího s modulací buněčná proliferace může být ohodnoceno vzhledem k expresi pozorované v nepřítomnosti testovaného činidla.
Alternativně mohou být testované produkty prohledávány s ohledem na jejich schopnost modulovat expresi (například transkripci) proteinu, podílejícího se na modulaci buněčné proliferace. Pro zhodnocení účinku testovaného činidla na expresi proteinu podílejícího se na modulaci buněčné proliferace, může být odpovídající promotor nebo regulační prvek vázán na detekční gen jak je popsáno výše. Takový konstrukt může být transfektován do vhodných hostitelských buněk, které se potom uvedou do kontaktu s testovaným činidlem.
Uvedené hostitelské buňky se výhodně používají pro prohledávání knihoven malých molekul vzniklých z programů kombinatorické chemie. V této výhodné variantě se buňky se inkubují s knihovnou; buňky se potom lyžují a supernatant
- so • · · · ··· ··· · · se analyzuje na aktivitu detekčního genu standardními protokoly.
Produkty které zvyšují aktivitu detekčního genu jsou induktory transkripce genu souvisejícího s modulací buněčné proliferace a mohou potom být používány pro inhibicí postupu rakoviny.
Pokud nejsou definovány jiným způsobem, všechny vědecké a technické výrazy zde používané mají stejný význam jako je význam, ve kterém jej běžně chápe obvyklý odborník v oboru, do kterého spadá předložený vynález. Kromě toho všechny publikace, přihlášky vynálezů, všechny vynálezy a všechny další reference zde uvedené jsou zahrnuty jako reference.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci výše uvedených způsobů a nemohou být v žádném případě považovány za omezení rozsahu předmětu předloženého vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace a charakterizace fragmentů DNA SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5
Sekvence DNA SEQ. ID. NO. 1, obsažená ve veřejné bázi obsahující EST uvažována (Genbank, přístupové číslo ΑΆ176076), a je uvedena dále:
ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt
ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga 121 agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag 181 gactcccctt ggcataaggg gtagtggctg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca 241 cagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct 301 ccgtctgctt cttgtttggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc 361 tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc 421 ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg 481 ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg 541 ncctgaagcc antttgcctc agagaagaga nagtcc
Vycházejíce z této sekvence byla syntetizována dvojice primerů 5' Fwdl a 3'Revl se sekvencemi SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3 (uvedené dále) pro získání sondy umožňující klonování úplné cDNA obsahující úplný otevřený čtecí rámec kódující odpovídající gen.
Sekvence SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3 jsou následující:
- SEQ. ID. NO. 2: 5'-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3'
- SEQ. ID. NO. 3: 5'-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3'
Polymerázová řetězová reakce sérii komerčně dostupných (PCR) se nejprve provede pro knihoven cDNA, používajíce
primery | sekvencí | SEQ. |
reakce | zahrnuj í | 0,5 |
(SEQ. ID | . NO. 3), | 200 |
dNTP: dATP, dCTP, | dGTP |
M Fwdl (SEQ. ID. NO. 2) a Revl trifosfátů deoxynukleotidů (neboli a dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, a 0,5 U Taq DNA polymerázy v konečném objemu 50 μΐ. Parametry tepelných cyklů zahrnují denaturaci za teploty 94 °C po dobu 30 sekund, hybridizaci primerů za teploty 60 °C po dobu 1 minuty a extenzi polymerace za • · · · · · · • · · · · · · · · • · ··· · · · ··· ··· ·· ···· ·· · teploty 72 °C po dobu 30 sekund (s konečnou extenzí 5 minut).
Produkty získané pomocí PCR se oddělí na agarózovém gelu 1 % a vizualizjí pomocí obarvení ethidiumbromidem. Výsledky ukazují pás 245 párů bází v knihovnách cDNA lidského mozku, hypofýzy, plic, ledvin a střeva (Quantum) a 290 párů bází v knihovně cDNA lidského prsu a prostaty. Tyto výsledky jsou uvedeny na Obr. 1.
Produkty takto získané pomocí PCR se purifikují elektroforézou a používají se jako sondy pro klonování cDNA obsahující úplný čtrecí rámec postupujíce podle doporučení výrobce pro použití klonovací soupravy cDNA ClonCapture (Clontech).
Sekvence nukleových kyselin pozitivních klonů se určení pomocí automatického sekvenačního zařízení. Jedná se o sekvence SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 uvedené dále:
- SEQ. ID. NO. 4:
aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa 61 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttcct 301 gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg 361 gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg 421 ctcctcatgc agcttcccct ttcccttgcg gggtgggggc tgggggtgcc aaggctccac 481 ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa « · • ·
541 ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag
601 gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cacacacaca cacacacacg cacacacaca
661 cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa
721 gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct gggcctgccc cattcttgga gtccccaggg
781 aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg
841 ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct
901 aatttccccc gaaggttcat gaagccagag gcatgccctt gggggttggt cgggagaagg
961 gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg cccctgctgc ctgcgattc
- SEQ. ID. NO. 5:
aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt
121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa
181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag
241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggcaa caggaaatag
301 ggtgtgggct gtagaccata gtgggtgggg tggtgcttcc gttcctgtga ggcccgcccc
361 cctgagcccc ctcgtctgct tcttgtttgg cagaaataga tgtggggcac agcccctaga
421 tgatgggaat ctgcccaagc tgtgtcctct ggggaatgaa atcttgctcc tcatgcagct
481 tcccctttcc cttgcggggt gggggctggg ggtgccaagg ctccaccctt ggagggggtt
541 gctgggggtg ccaaggctcc accctttgct cgctgggcag agggaaggaa gcacctccct
601 gtatgctctg caggggcccc tgcaggccac tttgcctcag aggaaggagg agaggtcccc
661 tgggaaaatg cgcacacaca cacacacaca cacacgcaca cacacacgca catgcacaca
721 cgcacgcatg cacacacaca cacatatgtg caggggtgca gcctaagtca gtggagccag
781 gactggctgc gcagctgggc ctgccccatt cttggagtcc ccagggaatg agcctcagga
841 tccacttcgt cccttgtttc taagccaggc tgcacggccg ttcctgggtg tgaaagcatt
901 ctgtcctgtc tccagtcaga gggaaccgcc cccaaactag aaagctaatt tcccccgaag
961 gttcatgaag ccagaggcat gcccttgggg gttggtcggg agaagggtga gaggcagtgc
1021 tgtggaaggg gcctggcccc tgctgcctgc gattc
Příklad 2:
Klonování sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID NO. 5 do vektoru exprese
• | • | • · · · | 9· · |
• | • | 9 9 · | • 9 9 9 |
• | • | • · · · · | 9 9 9 · 9 |
• · · | 9 9 9 | • · · · · · | 9 9 9 |
Ssekvence nukleových | kyselin | SEQ. ID. | NO. 4 a | |
SEQ. | ID. NO. 5 umožňují | syntetizovat | nové primery 5' El a | |
3 'R1 | odpovídáj ících | sekvencí | SEQ. ID. | NO. 6 a |
SEQ. | ID. NO. 7 (uvedených dále) . Tyto | sekvence | obsahuj ící |
restrikční místa HindlII respektive EcoRI.
Sekvence SEQ. ID. NO. 6 a SEQ. ID. NO. 7 jsou následující:
- SEQ. ID. NO. 6: 5'-GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G-3'
- SEQ. ID. NO. 7: 5'-CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG-3 '
Reakce PCR se provádí používajíce stejné reakční podmínky jako bylo popsáno v příkladu 1 s primery SEQ. ID. NO. 6 a SEQ. ID. NO. 7. Produkty získané uvedenou reakcí PCR mohou být vloženy přímo do vektoru exprese, který je neomezujícím způsobem typu pCDNA3.1 (InVitrogen).
Po kroku amplifikace pomocí PCR se produkty vystaví hydrolýze HindlII a EcoRI pro uvolnění konců obsahující tyto sekvence a potom se purifikují na agarózovém gelu elektroforézou.
Sekvence SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 se potom vloží do vektoru exprese jako je například pCDNA3.1 (Invitrogen). Analýza natrávením vhodnými restrikčními enzymy různých klonů bakterií dovoluje izolovat klony bakterií obsahující konstrukt „vektor exprese/SEQ ID NO 4 nebo „vektor exprese/SEQ ID NO 5.
Příprava velkého množství těchto plasmidových konstruktů byla provedena pomocí purifikační soupravy pro plasmidovou DNA (Qiagen).
• ♦ * · · · · • · · · ·· ·····
• · · · | • ······ ·· · | |||
Vlastnosti | polynukleotidů sekvencí | SEQ. | ID. NO. 4 a | |
SEQ. ID. | NO. | 5 | ||
Exprese | polynukleotidů sekvencí | SEQ. | ID. NO. 4 a | |
SEQ. ID. | NO. | 5 v lidských nádorových tkáních: | ||
Příprava | RNA | z buněčných kultur a nádorových | tkání | |
Buněčné | kultury nebo nádorové tkáně se | uchováváj í za | ||
teploty | -80 | °C před kroky extrakce | úplné | RNA. Extrakce |
úplné RNA se provádí způsoby popsanými ve vědecké literatuře (Chomczynski a Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162,156) za pomoci činidla Trizol (Gibco/BRL). Kvalita takto extrahované RNA se analyzje na agarózovém gelu 1 % v přítomnosti ethidiumbromidu.
Inverzní transkripce vycházejíce z RNA
Úplná RNA se transkribuje inverzním způsobem pomocí primerů Oligo (dT) používajíce inverzní transkriptázu Superscript® jak je navrženo v návodu výrobce (Gibco/BRL).
Polymerázová řetězová reakce (PCR) produktů získaných inverzní transkripcí
Analýza exprese sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo SEQ. ID. NO. 5 se provádí polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) aplikovanou na produkty inverzní transkripce používajíce primerů 5'Fwdl a 3'Revl o sekvencích SEQ. ID. NO. 2 a SEQ. ID. NO. 3.
• · · · ·· ··*·
Reakční podmínky zahrnují 0,5 μΜ Fwdl a Revl, 200 M dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,5 U Taq DNA polymerázy v konečném objemu 50 μΐ. Parametry tepelných cyklů zahrnují denaturaci za teploty 94 °C po dobu 30 sekund, hybridizaci primerů za teploty 60 °C po dobu 1 minuty a extenzi polymerace za teploty 72 °C po dobu 30 sekund (s konečnou extenzí 5 minut).
Produkty získané pomocí PCR se separují na agarózovém gelu 1 % a vizualizují obarvením ethidiumbromidem.
V jistých případech byla provedena analýza hybridizace na nylonové membráně používajíce jako sondu sekvenci SEQ. ID. NO. 4 označenou pomocí alphaP32-dCTP používajíce soupravu pro náhodné označování (Pharmacia). Membrána se potom promývá za podmínek slabé stringence (2 XSSC, 0,1 % SDS a 60 C) a potom za podmínek silné stringence (0,1 XSSC, 0,1 % SDS za teploty 65 °C). Membrána se potom exponuje na film Kodac XAR.
Analýza exprese polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 ve vzorcích nádorů prsu
Analýza exprese polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 byla realizována na 15 vzorcích nádorů získaných chirurgicky od pacientek postižených nádory prsu.
cDNA získaná . podle protokolu popsaného výše byla normalizována pomocí stabilním způsobem exprimovaného • * · · · · * markéru G3PDH (Glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza) pro řízení odchylek množství RNA nebo cDNA mezi vzorky.
Produkty reakce PCR potom byly hybridizovány na nylonové membráně výše uvedeným protokolem.
Získané výsledky, uvedené na Obr. 2, ukazují, že tímto způsobem může být přítomnost polynukleotidů sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5 vizualizována v nádorových vzorcích karcinomu prsu.
Inhibice buněčné proliferace polynukleotidy sekvencí SEQ. ID. NO. 4 a SEQ. ID. NO. 5.
Buňky nádoru prostaty DU 145 (kód ATCC) se kultivují v médiu DMEM (Eaglovo médium modifikované Dulbeco) obsahujícím 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml sulfátu streptomycinu, doplněné fetálním telecím sérem 10 %. Buňky se subkultivují 24 hodin před provedením protokolu transfekce, což umožňuje normální metabolismus buněk a lepší účinnost transfekce. Rostoucí koncentrace (1, 5 a 10 pig) samotného vektoru (pCDNA3.1) nebo vektoru obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 (1, 5 a 10 gg) nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 (1, 5 a 10 μg) byly provedeny používajíce činidlo Effectene® podle doporučení výrobce (Qiagen).
Buňky se izolují 48 hodin po transfekci zpracováním trypsinem a potom se počítají. Současně se buňky centrifugují při 5000 ot./min a potom se zmrazí na teplotu •9 ·· ·· · • · · · · · · · ···· • · ··· 4·· ··· ··· ·· ···· « ·
-80 °C pro extrakci RNA způsobem popsaným výše (viz část označená Příprava RNA z buněčných kultur a nádorových tkání).
Výsledky jsou uvedeny na Obr. 3 (polynukleotid sekvence
SEQ. ID. NO. 4) a Obr. 4 (polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5) . Výsledky indikují, že cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 jsou exprimovány způsobem, který je úměrný množství vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 (část A). Kromě toho výsledky indikují, že růst buněk je inhiován významným způsobem v přítomnosti rostoucích koncentrací vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 vzhledem k růstu buněk transfektovaných 10 pg samotným vektorem (část B) . Korelace mezi inhibici růstu nádorových buněk a množství transfektovaného vektoru obsahujícího sekvence SEQ. ID. NO. 4 nebo polynukleotid SEQ. ID. NO. 5 je rovna 1 respektive 0,96.
polynukleotid sekvence
Peptidy kódované fragmentem sekvence SEQ. IN. NO. 5
V sekvenci SEQ. IN. NO. 5 je možno pozorovat otevřený čtecí rámec obsahující iniciační kodon (ATG) kódující iniciační methionin v poloze 420 a stop kodon (UUA) v poloze 861. Takto přeložený polynukleotid odpovídá proteinu sekvence SEQ. IN. NO. 8, skládající se z 147 aminokyselin a je uvedený dále • · • · ·
MMGICPSCVLWGMKSCSSCSFPFPLRGGGW 30
GCQGSTLGGGCWGCQGSTLCSLGRGKEAPP 60
CMLCRGPCRPLCLRGRRRGPLGKCAHTHTH 90
THAHTHAHAHTHACTHTHICAGVQPKSVEP 120
GLAAQLGLPHSWSPQGMSLRIHFVPCF 147
Polynukleotid odpovídající sekvenci SEQ. IN. NO. sekvenci nukleotidů SEQ. IN. NO. 9 uvedenou dále:
ma atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt
121 tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggaagga agcacctccc
181 tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaagag gagaggtccc
241 ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac
301 acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca
361 ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg
421 atccacttcg tcccttgttt ctaa
Popis vyobrazení
Obr. 1 představuje výsledky získané pomocí PCR po separaci na agarózovém gelu 1 % a vizualizaci obarvením ethidiumbromidem.
Obr. 2 představuje výsledky získanýé přenosem Southern blot na 15 vzorcích karcinomu prsu (označené Sl až S15).
Obr. 3 představuje v části A expresi cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4 v buňkách DU 145 (nádor prostaty) a v části B inhibici růstu buněk v přítomnosti rostoucí koncentrace vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 4.
Nakonec Obr. 4 ukazuje v části A expresi cDNA kódující polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5 v buňkách DU 145 (nádor prostaty) a v části B inhibici růst buněk v přítomnosti rostoucí koncentrace vektoru exprese obsahujícího polynukleotid sekvence SEQ. ID. NO. 5.
Zastupuj e:
Dr. Otakar Švorčík
9 9 • 9 9 · 9
JUDr. Otakar Svorčík advokát
Hálkova 2,120 00 Praha 2
Claims (14)
1. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci SEQ. ID. NO. 5.
2. Protisměrný polynukleotid obsahující komplementární sekvenci k sekvenci polynukleotidu podle nároku 1.
3. Izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného
SEQ. ID. NO. 5 nebo polynukleotidovou sekvencí sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvencí SEQ. ID. NO. 5, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
4. Izolovaný polypeptid podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci SEQ. ID. NO. 8.
5. Monoklonální protilátka nebo její vazebný fragment antigenu, který váže specificky izolovaný polypeptid podle nároku 3 nebo 4.
6. Vektor exprese obsahující izolovaný polynukleotid obsahující alespoň jeden fragment polynukleotidové sekvence SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvence komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, přičemž polypeptid kódovaný uvedeným izolovaným polynukleotidem vykazuje alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace.
7. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektováná vektorem exprese podle nároku 6.
8. Izolovaný polypeptid podle nároku 3 nebo izolovaný polypeptid obsahující alespoň jeden fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, kde uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, jako léčivo.
9. Léčivo podle nároku 8, vyznačující se tím, že obshuje sekvenci SEQ. ID. NO. 8.
10. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný polypeptid obsahující:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotídové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace; přitom kompozice obsahuje mimo. to jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientů.
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že izolovaný polypeptid je polypeptid sekvence SEQ. ID. NO. 8.
12. Použití izolovaného polypeptidů, obsahujícího:
buď fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 5 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 5, nebo fragment proteinu, kódovaného polynukleotidovou sekvencí SEQ. ID. NO. 4 nebo sekvencí komplementární k polynukleotidové sekvenci SEQ. ID. NO. 4, přičemž uvedený izolovaný polypeptid má alespoň jednu imunologickou a/nebo biologickou aktivitu, charakteristickou pro protein podílející se na modulaci buněčné proliferace, pro přípravu léčiva, určeného pro léčbu proliferativního onemocnění.
13. Použití podle nároku 12, vyznačující se tím, že izolovaný polypeptid je polypeptid sekvence SEQ. ID. NO. 8.
·· « · · • ·· · · • ·
14. Použití podle nároku 12 nebo 13, ve kterém proliferativní onemocnění je rakovina.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0102801A FR2821624B1 (fr) | 2001-03-01 | 2001-03-01 | Nouveau polynucleotide utilisable pour moduler la proliferation des cellules cancereuses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20032670A3 true CZ20032670A3 (cs) | 2004-04-14 |
Family
ID=8860611
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20032670A CZ20032670A3 (cs) | 2001-03-01 | 2002-03-01 | Nový polynukleotid použitelný pro modulaci proliferace rakovinných buněk |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7214533B2 (cs) |
EP (1) | EP1368474B1 (cs) |
JP (1) | JP4190291B2 (cs) |
KR (1) | KR100869190B1 (cs) |
CN (1) | CN1289670C (cs) |
AT (1) | ATE351906T1 (cs) |
AU (1) | AU2002335492B2 (cs) |
BR (1) | BR0207253A (cs) |
CA (1) | CA2437535C (cs) |
CZ (1) | CZ20032670A3 (cs) |
DE (1) | DE60217651T2 (cs) |
ES (1) | ES2279877T3 (cs) |
FR (1) | FR2821624B1 (cs) |
HK (1) | HK1065334A1 (cs) |
HU (1) | HUP0303312A3 (cs) |
IL (1) | IL157091A0 (cs) |
MX (1) | MXPA03007694A (cs) |
NZ (1) | NZ527261A (cs) |
PL (1) | PL204844B1 (cs) |
RU (1) | RU2307666C2 (cs) |
WO (1) | WO2002070700A1 (cs) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2430194A4 (en) | 2009-05-11 | 2013-09-04 | Berg Pharma Llc | METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF ONCOLOGICAL ILLNESSES WITH EPIMETABOLIC SHIFTERS, MULTI-DIMENSIONAL INTRA CELLULAR MOLECULES OR AMBIENT INFLUENCES |
KR101933732B1 (ko) | 2011-04-04 | 2018-12-28 | 버그 엘엘씨 | 중추 신경 시스템 종양들의 치료 방법 |
AU2014251045B2 (en) | 2013-04-08 | 2019-06-13 | Berg Llc | Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies |
HUE050060T2 (hu) | 2013-09-04 | 2020-11-30 | Berg Llc | Eljárások rák kezelésére koenzim Q10 folyamatos infúziójával |
CA2975583A1 (en) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Voyager Therapeutics, Inc. | Modulatory polynucleotides |
EP3458588A4 (en) | 2016-05-18 | 2020-01-15 | Voyager Therapeutics, Inc. | MODULATING POLYNUCLEOTIDES |
IL297576B2 (en) * | 2016-05-18 | 2024-02-01 | Voyager Therapeutics Inc | Preparations and methods for treating Huntington's disease |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5637456A (en) * | 1995-02-17 | 1997-06-10 | The University Of Texas, Board Of Regents | Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation |
WO2000069454A1 (en) * | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Suppression of endogenous igfbp-2 to inhibit cancer |
-
2001
- 2001-03-01 FR FR0102801A patent/FR2821624B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-03-01 CN CNB02805623XA patent/CN1289670C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-01 PL PL365226A patent/PL204844B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-03-01 HU HU0303312A patent/HUP0303312A3/hu unknown
- 2002-03-01 US US10/467,436 patent/US7214533B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-01 KR KR1020037011444A patent/KR100869190B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-03-01 AU AU2002335492A patent/AU2002335492B2/en not_active Ceased
- 2002-03-01 DE DE60217651T patent/DE60217651T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-01 BR BR0207253-0A patent/BR0207253A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-03-01 NZ NZ527261A patent/NZ527261A/en unknown
- 2002-03-01 MX MXPA03007694A patent/MXPA03007694A/es active IP Right Grant
- 2002-03-01 CA CA2437535A patent/CA2437535C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-01 EP EP02748337A patent/EP1368474B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-01 WO PCT/FR2002/000740 patent/WO2002070700A1/fr active IP Right Grant
- 2002-03-01 CZ CZ20032670A patent/CZ20032670A3/cs unknown
- 2002-03-01 RU RU2003129163/13A patent/RU2307666C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-03-01 ES ES02748337T patent/ES2279877T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-01 AT AT02748337T patent/ATE351906T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-01 JP JP2002570725A patent/JP4190291B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-03-01 IL IL15709103A patent/IL157091A0/xx unknown
-
2004
- 2004-10-20 HK HK04108190A patent/HK1065334A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL157091A0 (en) | 2004-02-08 |
KR100869190B1 (ko) | 2008-11-18 |
DE60217651D1 (de) | 2007-03-08 |
KR20030090655A (ko) | 2003-11-28 |
MXPA03007694A (es) | 2004-03-16 |
BR0207253A (pt) | 2004-02-10 |
HUP0303312A2 (hu) | 2003-12-29 |
US20040197783A1 (en) | 2004-10-07 |
WO2002070700A1 (fr) | 2002-09-12 |
EP1368474B1 (fr) | 2007-01-17 |
HUP0303312A3 (en) | 2012-09-28 |
RU2003129163A (ru) | 2005-02-20 |
NZ527261A (en) | 2005-06-24 |
ES2279877T3 (es) | 2007-09-01 |
JP2004527240A (ja) | 2004-09-09 |
CA2437535C (fr) | 2011-05-10 |
EP1368474A1 (fr) | 2003-12-10 |
HK1065334A1 (en) | 2005-02-18 |
CN1289670C (zh) | 2006-12-13 |
AU2002335492B2 (en) | 2006-11-02 |
FR2821624A1 (fr) | 2002-09-06 |
CN1494591A (zh) | 2004-05-05 |
JP4190291B2 (ja) | 2008-12-03 |
ATE351906T1 (de) | 2007-02-15 |
DE60217651T2 (de) | 2007-10-18 |
PL365226A1 (en) | 2004-12-27 |
CA2437535A1 (fr) | 2002-09-12 |
US7214533B2 (en) | 2007-05-08 |
RU2307666C2 (ru) | 2007-10-10 |
FR2821624B1 (fr) | 2004-01-02 |
PL204844B1 (pl) | 2010-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU706451B2 (en) | Isolated nucleic acid molecule coding for tumor rejection antigen precursor dage and uses thereof | |
US7404270B2 (en) | Tumor antigen | |
JP2003520606A (ja) | 癌抗原nyeso−1由来の新規mhcクラスii拘束t細胞エピトープ | |
US6251603B1 (en) | Method for determining status of a cancerous condition by determining antibodies to NY-ESO-1 in a patient sample | |
CZ20013189A3 (cs) | Vakcína | |
US7291335B2 (en) | Isolated nucleic acid molecules encoding ESO-1 peptides and uses thereof | |
US7115729B2 (en) | Isolated nucleic acid molecules which encode peptides which bind to MHC class II molecules, such as HLA-DR53 | |
JP2003530088A (ja) | 新規化合物 | |
JP4097178B2 (ja) | 腫瘍抗原 | |
US7385044B2 (en) | Isolated peptides which bind to MHC Class II molecules, and uses thereof | |
CZ20032670A3 (cs) | Nový polynukleotid použitelný pro modulaci proliferace rakovinných buněk | |
KR20020026530A (ko) | T-세포 수용체 γ알터네이트 리딩 프레임단백질(TARP) 및 그 용도 | |
US8541202B2 (en) | Method for inducing cell lysis with immunogenic portions of NY-ESO-1 protein | |
JP2001503966A (ja) | 脳グリコーゲンホスホリラーゼ癌抗原 |