CZ20013189A3

CZ20013189A3 - Vakcína

Info

Publication number: CZ20013189A3
Application number: CZ20013189A
Authority: CZ
Inventors: Y De Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2002-02-13
Also published as: AU2915300A; HK1043729B; EP1466616A2; DE60019273T2; TR200102577T2; NO20014292L; EP1466616A3; AU766789B2; ES2238026T3; CA2362370A1; US20050129717A1; CN1374869A; HK1043729A1; GB9905124D0; NO20014292D0; PT1162993E; IL145046A0; BR0008784A; JP2002538218A; CY1105585T1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobů použití polypeptidů a polynukleotidů (dále označovaných jako polypeptid (polypeptidy) „CASB616“ a polynukleotid (polynukleotidy) „CASB616“), včetně léčení rakoviny a autoimunitních onemocnění a dalších souvisejících stavů. V dalším provedení se vynález týká způsobů identifikace agonistů a antagonistů/inhibitorů použitím látek poskytovaných vynáelzem, a léčení stavů souvisejících s nerovnováhou polypeptidu CASB616 pomocí sloučenin podle vynálezu. V ještě dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci onemocnění spojených s nevhodnou aktivitou nebo hladinami polypeptidu CASB616.

Dosavadní stav techniky

Bylo zjištěno, že CASB616 kóduje polypeptid náležející do nejširší skupiny proteinových receptorů - tyrosinkináz, receptorů EPH a receptorů souvisejících s EPH. CASB616 je jinak známý jako EPHB2 (jinak jako: EBHB2, ERK, EPH3, EPHT3, DRT, HEK5) a EPHB2v.

Receptory EPH a receptory příbuzné EPH se podle předpokladů účastní zprostředkování vývojových dějů, zvláště v nervovém systému. Receptory podskupiny Eph mají typicky jedinou kinázovou doménu a extracelulární oblast obsahující doménu bohatou na Cys a dvě opakující se oblasti fibronektinu typu lil. Ligandy receptoru Eph byly nazvány výborem Eph Nomenclature Committee (článek 90: 403 - 404, 1997; PubMed ID: 9267020) efriny (ephrins). Na základě příbuznosti jejich struktur a sekvencí se efriny dělí do třídy efrinů-A (EFNA), které jsou k membráně ukotveny glykosylfosfatidylinositolovou vazbou, a do třídy efrinů-B (EFNB), což jsou transmembránové proteiny. Třída • · · · ·· ·· • · · · · · · · · ·

receptorů Eph se dělí do dvou skupin na základě podobnosti sekvencí svých extracelulárních domén a svých afinit pro vazbu ligandů efrinu-A a efrinu-B. Výbor Eph Nomenclature Committee (1997) navrhl, že receptory Eph reagující přednostně s proteiny typu efrin-A se budou nazývat EphA a receptory Eph reagující přednostně s proteiny typu efrin-B se budou nazývat EphB.

Ikegaki a další (Hum. Molec. Genet. 4: 2033 - 2045, 1995) mapovali DRT, gen EPHB2, do chromozomální oblast 1p36.1-p35 pomocí PCR screeningu hybridních panelů lidských/hlodavčích somatických buněk a fluorescenční hybridizací in sítu. Protože vzdálenější konec 1p u neuroblastomů často chybí, gen DRT může mít úlohu při tumorogenezi neuroblastomu a karcinomu malých plicních buněk (SCLC).

Fluorescenční hybridizací in sítu ukázali Saito a další (Genomics 26: 382 - 384, 1995 PubMed ID: 7601466), že gen ERK je umístěn v oblasti chromozomu 1p36.1. Ukázali, že homologní geny jsou umístěny v myší oblasti 4D2.2-D3 a krysí oblasti 5q36.13, což jsou obě oblasti s konzervovanou homologií vazby na lidský chromozom 1p.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití polypeptidů a polynukleotidů CASB616 popsaných podrobněji dále. Vynález se zvláště týká použití CASB616 s nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No. 1 nebo 3, popřípadě SEQ ID No. 2 nebo 4.

Vynález se tále týká použití polynukleotidů a polypeptidů, které mají identitu alespoň 85%, s výhodou alespoň 90%, výhodněji alespoň 95%, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu se sekvencemi identifikovanými v SEQ ID No. 1 nebo 3 a SEQ ID No. 2 nebo 4.

Předpokládá se, že polypeptidy a polynukleotidy CASB616 jsou důležitými imunogeny pro specifickou profylaktickou nebo terapeutickou imunizaci proti tumorům, protože jsou specificky exprimovány nebo jsou velmi vysoce nadměrně exprimovány v tumorech ve srovnání s normálními buňkami, a mohou tak být zaměřovány imunitními mechanismy specifickými pro antigeny, což vede k destrukci tumorové buňky. Mohou být také použity pro diagnózu výskytu tumorových buněk. Navíc může jejich nevhodná exprese za určitých okolností způsobit indukci autoimunitních, nesprávných imunitních odpovědí, které by mohly být korigovány pomocí vhodné vakcinace s použitím stejných polypeptidů nebo polynukleotidů. Z tohoto hlediska jsou pro účely předkládaného vynálezu nejdůležitejšími biologickými aktivitami antigenní a imunogenní aktivity polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Polypeptid podle předkládaného vynálezu může mít také alespoň jednu další biologickou aktivitu polypeptidů CASB616, což by mohlo polypeptid kvalifikovat jako cíl pro terapeutický nebo profylaktický zásah různý od zásahu svázaného s imunitní odpovědí.

V prvním provedení vynálezu se poskytují použití polypeptidů stejně jako jejich biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelných variant, a prostředků s jejich obsahem.

Předkládaný vynález dále poskytuje použití pro:

(a) izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 85% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitou se SEQ ID No. 2 nebo 4;

(b) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci s alespoň 85% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitou se SEQ ID No. 1 nebo 3 po celé délce SEQ ID No. 1 nebo 3; nebo

(c) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s alespoň 85% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4.

Vynález také poskytuje použití imunogenních fragmentů polypeptidů CASB616, který je souvislou částí polypeptidů CASB616, která má stejnou nebo v podstatě stejnou imunogenní aktivitu jako peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo 4. Lze tedy říci, že fragment (v případě nutnosti navázaný na nosič) je schopen zvýšit imunitní odpověď, která rozpoznává polypeptid CASB616. Takový imunogenní fragment může například obsahovat polypeptid CASB616 postrádající N-koncovou úvodní sekvenci, a/nebo transmembránovou doménu a/nebo C-koncovou ukotvující doménu. Ve výhodném provedení obsahuje imunogenní fragment CASB616 podle vynálezu v podstatě veškerou extracelulární doménu polypeptidů, který má alespoň 85% identitu, s výhodou alespoň 90% identitu, výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% identitu se SEQ ID No. 2 nebo 4 po celé délce SEQ ID No. 2, popřípadě 4.

Fragment je polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která je úplně stejná jako část, ale nezahrnuje veškeré aminokyselinové sekvence jakéhokoli polypeptidů podle vynálezu. Stejně jako u polypeptidů CASB616, fragmenty mohou být „volné“ (free-standing) nebo obsažené ve větším polypeptidů, z něhož tvoří část nebo oblast, nejvýhodněji jako jediná souvislá oblast v jediném větším polypeptidů.

Výhodné fragmenty zahrnují například zkrácené polypeptidy obsahující část aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4 nebo její varianty, jako je souvislá řada zbytků, která zahrnuje aminoa/nebo karboxykoncovou aminokyselinovou sekvenci. Výhodné jsou také degradační formy polypeptidů podle vynálezu produkované

hostitelskou buňkou nebo v hostitelské buňce. Dále jsou výhodné fragmenty charakterizované strukturními nebo funkčními vlastnostmi jako jsou fragmenty obsahující beta-válce (barrels), alfa-šroubovice a oblasti tvořící alfa-šroubovici, beta-list a oblasti tvořící beta-list, ohyb a oblasti tvořící ohyb, šroubovici a oblasti tvořící šroubovici, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, alfa-amfipatické oblasti, beta-amfipatické oblasti, flexibilní oblasti, oblasti vytvářející povrch, oblasti vázající substrát a oblasti s vysokým antigenním indexem.

Další výhodné fragmenty zahrnují izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 spojitými aminokyselinami z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci s alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 spojitými aminokyselinami zkrácenými nebo deletovanými z aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 2 nebo 4.

Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých se vyskytuje substituce, delece nebo adice několika, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 nebo 1 aminokyseliny v jakékoli kombinaci.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty pro použití v rámci vynálezu mohou být ve formě „zralého“ (maturního) proteinu nebo mohou být částí většího proteinu jako je prekurzor nebo fuzní protein. Často je výhodné přidávat další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo úvodní sekvence, prosekvence, sekvence napomáhající purifikaci jako jsou vícečetné histidinové zbytky nebo další sekvence pro zajištění stability v průběhu výroby rekombinantního produktu. Navíc je také možné přidání exogenního polypeptidu nebo lipidového zakončení nebo polynukleotidových sekvencí pro dosažení zvýšení imunogenního potenciálu hotové molekuly.

V jednom provedení se vynález týká použití rozpustných fuzních proteinů získaných metodami genetického inženýrství obsahujících

• · · · • ·♦

9 ·

polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragment a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště lgG1, kde fúze probíhá v ohybové (hinge) oblasti. Ve zvláštním provedení může být část Fc odstraněna jednoduše zavedením štěpící sekvence, která může být rozštěpena faktorem srážlivosti krve Xa.

Příklady z technologie fuzních proteinů je možno nalézt v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/29458 a WO 94/22914.

Proteiny mohou být chemicky konjugovány nebo exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující produkci zvýšených hladin v expresním systému ve srovnání s nefúzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhat při poskytování T-helperových epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou T-helperových epitopů rozpoznávaných člověkem, nebo napomáhat při expresi proteinu (zesilovač exprese) s vyššími výtěžky, než je tomu u nativního rekombinantního proteinu. Fúzní partner bude s výhodou jak imunologický fúzní partner, tak i partner zesilující expresi.

Mezi fúzní partnery je možno zařadit protein D z Haemophilus influenzae a nestrukturní protein z viru chřipky, NS1 (hemaglutinin). Další fúzní partner je protein známý jako LytA. S výhodou se používá C-koncová část molekuly. Lyta je odvozený ze Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu LytA (kódovaná genem lytA {Gen, 43 (1986) str. 265 - 272}), autolyzin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LytA je odpovědná za afinitu k cholinu nebo některým analogům cholinu jako je DEAE. Tato vlastnost se využívala pro vývoj expresních plasmidů E. coli C-LytA použitelných pro expresi fúzních proteinů. Purifikace hybridních proteinů

obsahujících fragment C-LytA na aminovém konci byla již popsána {Biotechnology: 10 (1992) str. 795 - 798}. Je možné používat opakující se část molekuly LytA, která se nalézá na C-konci počínaje zbytkem 178, například zbytky 188 až 305.

Předkládaný vynález také zahrnuje varianty výše uvedených polypeptidů, tj. polypeptidy, které se od referenčních polypeptidů odlišují konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž jeden zbytek je substituován za jiný s podobnými vlastnostmi. Typicky takové substituce probíhají mezi Ala, Val, Leu a Ile; mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr.

Polypeptidy pro použití v předkládaném vynálezu mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem. Mezi tyto polypeptidy patří izolované v přírodě se vyskytující polypeptidy, rekombinantně produkované polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací těchto metod. Prostředky pro přípravu takových polypeptidů jsou v oboru dobře známy.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká použití polynukleotidů, které kódují polypeptidy CASB616, zvláště polynukleotidů, které kódují polypeptid zde označovaný CASB616, pro použití při přípravě vakcinačních prostředků popsaných dále.

Ve zvláště výhodném provedení obsahuje polynukleotid oblast kódující polypeptidy CASB616 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3, která zahrnuje gen s úplnou délkou, nebo její variantu.

Použitím zde poskytovaných informací, jako je polynukleotidové sekvence uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 může být získán polynukleotid podle vynálezu kódující polypeptid CASB616 s použitím standardních metod klonování a screeningu, z knihovny cDNA odvozené z mRNA v buňkách lidské rakoviny tlustého střeva, rakoviny plic, rakoviny dělohy a fetálních tkání. Vhodné techniky se popisují

v publikaci Maniatis, T., Fritsch, E. F. a Sambrook a další, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. vyd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Polynukleotidy popisované ve vynálezu mohou být také získány z přirozených zdrojů jako jsou knihovny genomické DNA, nebo mohou být syntetizovány použitím známých a komerčně dostupných technik.

Navíc obsahuje sekvence DNA uvedená v SEQ ID No. 1 nebo 3 otevřený čtecí rámec kódující protein, který obsahuje přibližný počet aminokyselinových zbytků uvedených v SEQ ID No. 2 nebo 4, s odvozenou molekulovou hmotností, která může být vypočtena pomocí hodnot molekulové hmotnosti aminokyselinových zbytků, které jsou odborníkům v oboru známy.

Polynukleotid se SEQ ID No. 1, mezi startovacím kodonem na nukleotidu číslo 105 a stop kodonem, který začíná na nukleotidu číslo 3066 SEQ ID No. 1, kóduje polypeptid SEQ ID No. 2.

Polynukleotid se SEQ ID No. 3, mezi startovacím kodonem na nukleotidu číslo 26 a stop kodonem, který začíná na nukleotidu číslo 3191 SEQ ID No. 3, kóduje polypeptid SEQ ID No. 4.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález použití izolovaného polynukleotidu, který obsahuje nebo který se skládá z:

(a) polynukleotidové sekvence s alespoň 85% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitou se SEQ ID No. 1 nebo 3 po celé délce SEQ ID No. 1 nebo 3; nebo (b) polynukleotidové sekvence kódující polypeptid s alespoň 85% identitou, výhodněji alespoň 90% identitou, ještě výhodněji alespoň 95% identitou, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo 100% identitou, s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4 po celé délce SEQ ID No. 2 nebo 4.

*· < ·· ·» · • · · · · · 9 ·*· • · · ·»··».

• 1 · Q ·_ ·· · · · · ·· ** »»»·· ·· «··

Polynukleotid kódující polypeptid pro použití v předkládaném vynálezu může být získán procesem, který zahrnuje kroky screeningu vhodné knihovny za stringentních podmínek hybridizace (například s použitím teploty v rozmezí 45 až 65 °C a koncentrace SDS 0,1 až 1 %) se značenou nebo detekovatelnou sondou složenou z nebo obsahující sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo její fragment; a izolace genu s úplnou délkou a/nebo genomických klonů obsahujících uvedenou polynukleotidovou sekvenci.

Vynález poskytuje použití polynukleotidové sekvence identické po celé její délce s kódující sekvenci (otevřený čtecí rámec) v SEQ ID No. 1 nebo 3. Vynález také poskytuje použití kódující sekvence pro zralý polypeptid nebo jeho fragment, samostatně stejně jako kódující sekvence pro zralý polypeptid nebo fragment v čtecím rámci s další kódující sekvencí, jako je sekvence kódující úvodní nebo sekreční sekvenci, pre-, nebo pro- nebo preproproteinovou sekvenci, nebo další části fúzního peptidu. Polynukleotid může také obsahovat alespoň jednu nekódující sekvenci, včetně například bez omezení alespoň jedné nekódující 5’ a 3’ sekvence, jako jsou přepisované, ale nepřekládané sekvence, terminační signály (jako jsou ró-dependentní a ró-independentní terminační signály), ribozomální vazebná místa, Kozákovy sekvence, sekvence stabilizující mRNA, introny a polyadenylační signály. Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující sekvence kódující další aminokyseliny. Může být například kódována markerová sekvence, která umožňuje purifikaci fúzovaného polypeptidu. V určitých provedeních vynálezu je markerovou sekvencí hexahistidinový peptid tak jak je poskytován vektorem pQE (Qiagen, lne.), který je popsán v Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 86: 821 - 824 (1989), nebo HA peptidový tag (Wilson a další, Cell 37: 767 (1984), přičemž obě tyto sekvence mohou být použitelné při purifikaci s nimi fúzované polypeptidové sekvence. Polynukleotidy pro použití v rámci vynálezu také zahrnují bez omezení

000000 · 0 0 ·· • 00 φ 0 φ * 0·· ••Φ ΦΦΦ 00 polynukleotidy obsahující strukturní gen a jeho přirozeně asociované sekvence, které řídí expresi genu.

Nukleotidová sekvence kódující polypeptid CASB616 se SEQ ID No. 2 nebo 4 může být identická se sekvencí kódující polypeptid obsaženou v nukleotidech 105 až 3068 SEQ ID No. 1, nebo sekvencí kódující polypeptid obsaženou v nukleotidech 26 až 3193 SEQ ID No.

3. Alternativně jí může být sekvence, která je výsledkem redundance (degenerace) genetického kódu, která rovněž kóduje polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid“, jak se zde používá, zahrnuje polynukleotidy, které obsahují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4. Tento termín také zahrnuje polynukleotidy, které obsahují jedinou souvislou oblast nebo nesouvislé oblasti kódující polypeptid (například polynukleotidy přerušené integrovaným fágem, integrovanou inzerční sekvencí, integrovanou vektorovou sekvencí, integrovanou transpozonovou sekvencí, nebo v důsledku editace RNA nebo reorganizace genomické DNA) spolu s dalšími oblastmi, které mohou také obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález se dále týká variant zde popisovaných polynukleotidů, které kódují varianty polypeptidů s odvozenou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4. Fragmenty polynukleotidů podle vynálezu mohou být použity například pro syntézu polynukleotidů podle vynálezu s úplnou délkou.

Další zvláště výhodná provedení jsou polynukleotidy kódující varianty CASB616, které mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidů CASB616 SEQ ID No. 2 nebo 4, ve kterých je provedena substituce, modifikace, delece a/nebo adice několika, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádného aminokyselinového zbytku, v jakékoli kombinaci. Mezi ···· ·· * φφ·· • · Φ »···· φ » • · Μή» · « · «.

··“ ΟΙ ” ··· ··>φ·· těmito molekulami jsou zvláště výhodné „mlčící“ substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidů CASB616.

Dále jsou pro použití v předkládaném vynálezu výhodné polynukleotidy, které jsou z alespoň 85 % identické po celé jejich délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid CASB616 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 2 nebo 4, a polynukleotidy, které jsou s těmito polynukleotidy komplementární. Alternativně jsou nejvýhodnější polynukleotidy, které obsahují oblast s alespoň 90% identitou po celé její délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid CASB616 a s ním komplementární polynukleotidy. V této souvislosti jsou zvláště výhodné polynukleotidy s alespoň 95% identitou po celé jejich délce. Navíc jsou mezi těmito polynukleotidy s identitou alespoň 95% velmi výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 97%, a mezi těmito polynukleotidy jsou zvláště výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 98% a alespoň 99%, přičemž výhodnější jsou polynukleotidy s identitou alespoň 99%.

Výhodná provedení jsou polynukleotidy kódující polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu, jako zralý polypeptid kódovaný DNA SEQ ID No. 1 nebo 3.

Podle určitých výhodných provedení tohoto vynálezu se poskytují použití polynukleotidů, které hybridizují, zvláště za stringentních podmínek, s polynukleotidovými sekvencemi CASB616, jako jsou polynukleotidy SEQ ID No. 1 nebo 3.

Vynález se dále týká použití polynukleotidů, které hybridizují se zde poskytovanými polynukleotidovými sekvencemi. V této souvislosti se vynález zvláště týká použití polynukleotidů, které hybridizují za stringentních podmínek se zde popisovanými polynukleotidy. Jak se zde používá, termíny „stringentní podmínky“ a „stringentní podmínky hybridizace“, znamenají hybridizaci, ke které dochází pouze při alespoň 95%, a s výhodou alespoň 97% identitě mezi sekvencemi. Specifickým příkladem stringentních hybridizačních podmínek je ···· 44 « 44 44 ··· 44 44 ttt • · ·12* - · · ♦ · · · inkubace přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím: 50% formamid, 5 x SSC (150mM NaCI, 15mM citrát trojsodný), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% sulfát dextranu a 20 pg/ml denaturované, mechanicky rozbité DNA lososího spermatu, s následným promytím hybrídizačního nosiče v 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Podmínky hybridizace a promývání jsou dobře známé a jako příklady se uvádějí v publikaci Sambrook, a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor, N. Y, (1989), zvláště kapitola 11. Pro polynukleotidové sekvence poskytované vynálezem se může také použití hybridizace v roztoku.

Kódující oblast genu CASB616 může být izolována screeningem s použitím sekvence DNA SEQ ID No. 1 nebo 3, pro syntézu oligonukleotidové sondy. Potom se značený oligonukleotid se sekvencí komplementární s genem podle vynálezu použije pro screening knihovny cDNA, genomické DNA nebo mRNA pro zjištění, které vzorky z knihovny s touto sodnou hybridizují.

K dispozici je několik metod, které jsou odborníkům v oboru dobře známé, pro získání DNA s úplnou délkou nebo pro prodloužení krátkých DNA, například metody založené na článku Rapid Amplification of cDNA ends (RACE) (viz například Frohman, a další, PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). Poslední modifikace této techniky, jejichž příkladem je například technologie Marathon™ technology (Clontech Laboratories lne.), výrazně zjednodušily hledání delších molekul cDNA. Při použití technologie Marathon™ byly cDNA připravovány z mRNA extrahované ze zvolené tkáně a „adaptorové“ sekvence navázané na každý její konec. Potom se provede amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro zesílení „chybějícího“ 5’konce DNA s použitím kombinace oligonukleotidových primerů specifických pro gen a adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím „nested“ primerů, tj. primerů navržených pro teplotní hybridizaci s amplifikovaným produktem (typicky primer specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále ve směru 3’ v adaptorové

ΦΦΦΦ	ΦΦ	•
♦	9	Φ	Φ Φ	Φ	Φ
Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ

♦ · φηοφ * φ · ·· “ ΦΦΦ »φ

ΦΦ Φ • ΦΦΦ « Φ φ • Φ φ

Φ Φ ΦΦΦ sekvenci a primer specifický pro gen, který teplotně hybridizuje dále ve směru 5’ ve zvolené genové sekvenci). Produkty této reakce mohou být potom analyzovány sekvenováním DNA a DNA s úplnou délkou může být zkonstruována buď připojením produktu přímo k existující DNA za získání úplné sekvence, nebo provedením oddělené PCR pro úplnou délku s použitím nové sekvenční informace pro navržení 5’ primerů.

Vynález také poskytuje použití polynukleotidů, které kódují polypeptid, kterým je zralý protein plus další amino- nebo karboxykoncové aminokyseliny, nebo aminokyseliny uvnitř zralého polypeptidů (například jestliže zralá forma má více než jeden polypeptidový řetězec). Tyto sekvence mohou mít úlohu při zpracování (procesování) proteinu z prekurzoru do zralé formy, mohou umožnit transport proteinu, mohou prodloužit nebo zkrátit poločas proteinu nebo mohou umožnit manipulaci s proteinem mj. pro účely testování nebo výroby. Jak je tomu obecně in vivo, dodatečné aminokyseliny mohou být z maturního proteinu odděleny při zpracování buněčnými enzymy.

Prekurzorový protein, ve kterém je zralá forma polypeptidů fúzována s jednou nebo více prosekvencemi, může být inaktivní forma polypeptidů. Jestliže se prosekvence odstraní, tyto inaktivní prekurzory se obecně aktivuji. Některé nebo všechny z těchto prosekvencí mohou být před aktivací odstraněny. Obecně se takové prekurzory nazývají proproteiny.

Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připravovány způsoby dobře známými v oboru z hostitelských buněk obsahujících expresní systémy, upravených metodami genetického inženýrství, podle dalšího provedení se tedy předkládaný vynález týká expresního systému, který obsahuje polynukleotid podle předkládaného vynálezu, hostitelských buněk, které jsou upraveny metodami genetického inženýrství, obsahujících

• ·· ♦ ·« • ·· •· · · to ·· • ·· ·· tyto expresní systémy, a produkce polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami. Pro výrobu takových proteinů mohou být také použity bezbuněčné translační systémy s použitím RNA odvozených z konstruktů DNA podle předkládaného vynálezu.

Pro rekombinantní výrobu mohou být hostitelské buňky zpracovány metodami genetického inženýrství pro zabedení expresních systémů nebo jejich částí pro polynukleotidy podle předkládaného vynálezu. Zavedení polynukleotidů do hostitelských buněk může být provedeno způsoby popisovanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis a další, Basic Methods in Molecular Biology (1986) a Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). Takové výhodné metody zahrnují například transfekci s použitím fosforečnanu vápenatého, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem, transfekci, mikroinjekci, transfekci zprostředkovanou kationtovým lipidem, elektroporaci, transdukci, vnášení škrabáním, balistické vnášení nebo infekci.

Proteiny podle vynálezu se s výhodou společně exprimují s thioredoxinem in trans (TIT). Společná exprese s thioredoxin in trans proti in cis je výhodná pro udržení antigenu bez přítomného thioredoxinu, aniž by bylo potřeba proteázy. Společná exprese s thioredoxinem usnadňuje solubilizaci proteinů podle vynálezu. Společná exprese s thioredoxinem má také významný dopad na výtěžek purifikovaného proteinu a na rozpustnost a jakost purifikovaného proteinu.

Mezi reprezentativní příklady vhodných hostitelů patří bakteriální buňky jako jsou streptokoky, stafylokoky, buňky E. coli, streptomycety a buňky Bacíllus subtilis; buňky hub jako jsou kvasinky a buňky Aspergillus; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera • φφφ • · • · φ· • ♦ · φ

Ί.5· Sf9; živočišné buňky jako jsou buňky CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a buňky Bowesova melanomu; a rostlinné buňky.

Může být použita celá řada expresních systémů, například chromosomální, episomální a z virů odvozené systémy, například vektory odvozené od bakteriálních plasmidů, od bakteriofágů, od transposonů, od kvasinkových episomů, od inzerčních prvků, od kvasinkových chromosomálních prvků, od virů jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako je SV40, virů vakcinie, adenovirů, virů drůbežích neštovic, virů pseudorabies a retrovirů a vektorů odvozených z jejich kombinací, jako jsou viry odvozené z plasmidových a bakteriofágových genetických prvků, jako jsou kosmidy a fágmidy. Expresní systémy mohou obsahovat řídící oblasti, které regulují a vyvolávají expresi. Obecně může být použit jakýkoli systém nebo vektor, který je schopen udržovat, podporovat nebo exprimovat polynukleotid pro produkci polypeptidů v hostiteli. Vhodná nukleotidová sekvence může být do expresního systému vložena jakoukoli z řady známých a rutinních technik, jako se například popisuje v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (výše). Do požadovaného polypeptidů mohou být zařazeny vhodné sekreční signály pro umožnění sekrece překládaného proteinu do lumen endoplasmatického retikula, periplasmatického prostoru nebo extracelulárního prostředí. Tyto signály mohou být pro polypeptid endogenní nebo může jít o heterologní signály.

Expresním systémem může také být rekombinantní živý mikroorganismus, jako je virus nebo bakterie. Sledovaný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Zaočkování a infekce in vivo takovým živým vektorem povede k expresi antigenu in vivo a indukci imunitních odpovědí. Viry a bakterie používané k tomuto účelu jsou například poxaviry (například vakcinie, drůbeží neštovice, kanárčí neštovice), alfaviry (virus Sindbis, Semliki Forest Virus, Venezuelian Echin Encephalitis Virus), adenoviry, viry související s adenoviry, pikornaviry (poliovirus, rhinovirus), herpesviry (virus varicella zoster atd.), bakterie Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Tyto viry a bakterie mohou být virulentní nebo různými způsoby oslabené pro získání živých vakcín. Tyto živé vakcíny tvoří také část vynálezu.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a purifikovány z rekombinantních buněčných kultur dobře známými způsoby včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakce kyselinou, aniontové nebo kationtové iontoměničové chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie na bázi hydrofobních interakcí, afinitní chromatografie, chromatografie na hydroxylapatitu a lektinové chromatografie. Nejvýhodněji se pro čištění používá afinitní chromatografie s kovovými ionty (IMAC). Pro skládání proteinů do správné konformace (refolding) mohou být použity dobře známé způsoby pro regeneraci aktivní konformace, jestliže je polypeptid v průběhu intracelulární syntézy, izolace a/nebo purifikace denaturován.

Další důležitý aspekt vynálezu se týká způsobu indukce, zesílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce fragmentem celého polypeptidů nebo polynukleotidu podle vynálezu, kterým je možno dosáhnout produkci protilátky a/nebo T-buněčné imunitní odpovědi, pro prevenci nebo pro terapii rakoviny a autoimunitního onemocnění a souvisejících stavů. Ještě další aspekt vynálezu se týká způsobu indukce, posílení nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje dodání polypeptidů podle předkládaného vynálezu prostřednictvím vektoru nebo buňky řídící expresi polynukleotidu a kódující polypeptid in vivo pro indukci takové imunologické odpovědi pro poskytnutí imunitních odpovědí pro prevenci nebo léčení nemocí u těchto savců.

Další provedení vynálezu se týká imunologické/vakcinační formulace (prostředku), která po zavedení do savčího hostitele indukuje, zesiluje nebo moduluje imunologickou odpověď v tomto savci ···♦ · «· ·· • · ♦ ·«·· · · · • · · · · · 4 4 na polypeptid podle předkládaného vynálezu, přičemž tento prostředek obsahuje polypeptid nebo polynukleotid podle vynálezu nebo jeho imunologický fragment tak jak bylo definováno výše. Vakcinační formulace může dále obsahovat vhodný nosič. Protože polypeptid může být v žaludku rozkládán, s výhodou se podává parenterálně (například subkutánní, intramuskulární, intravenózní nebo intradermální injekcí). Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické látky a rozpuštěné látky, které nastavují osmotický tlak prostředku do isotonického stavu s krví příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující prostředky nebo zahušťovadla. Formulace mohou být v nádobkách pro jednu dávku nebo více dávek, například uzavřených ampulích a lahvičkách, a mohou být uchovávány v lyofilizovaném stavu, který vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

Ddalší provedení vynálezu se týká indukce imunitních odpovědí in vitro na fragment nebo celý polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu nebo molekulu obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s použitím buněk z imunitního systému savce, a opětné infuze těchto aktivovaných imunitních buněk savce pro léčení onemocnění. Aktivace buněk z imunitního systému se dosahuje inkubací s úplným polypeptidem nebo polynukleotidem podle předkládaného vynálezu nebo molekulou obsahující polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu in vitro v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých imunomodulačních molekul. Další provedení vynálezu se týká imunizace savce podáváním buněk prezentujících antigen modifikovaných vnesením části nebo úplného polypeptidů podle předkládaného vynálezu nebo molekuly obsahující polypeptid podle předkládaného vynálezu in vitro a podáním imunogenním způsobem in vivo. alternativně mohou být buňky prezentující antigen transfekovány

9· · ·» • · ·· ·« • · ·· · • · · · « « • · · * · 9 * *· · in vitro vektorem obsahujícím fragment nebo úplný polynukleotid podle předkládaného vynálezu, nebo molekulu obsahující polynukleotid podle předkládaného vynálezu, například pro expresi odpovídajícího polypeptidu, a podány imunogenním způsobem in vivo.

Vakcinační formulace podle vynálezu může také obsahovat adjuvantní systémy pro zesílení imunogenicity formulace. S výhodou adjuvantní systém preferenčně zesiluje TH1 typ odpovědi.

Imunitní odpověď je možno v nejširším smyslu rozlišovat na dvě extrémní kategorie, kterými jsou humorální nebo buněčné imunitní odpovědi (tradičně charakterizovány protilátkovým, popřípadě buněčně-efektorovým mechanismem ochrany). Tyto kategorie odpovědi byly nazývány odpovědi typu TH1 (odpověď zprostředkovaná buňkami) a imunitní odpovědi typu TH2 (humorální odpověď).

Extrémní imunitní odpovědi typu TH1 mohou být charakterizovány tvorbou pro antigen specifických, haplotypově omezených cytotoxických T-lymfocytů a odpovědí přirozených buněk zabíječů. U myší jsou odpovědi typu TH1 často charakterizovány tvorbou protilátek subtypu lgG2a, zatímco u člověka odpovídají tyto odpovědi typu protilátek lgG1. Imunitní odpovědi typu TH2 jsou charakterizovány vytvářením širokého rozsahu imunoglobulinových isotypů, včetně u myší lgG1, IgA, a IgM.

Dá se předpokládat, že hnací síla, která stojí za vývojem těchto dvou typů imunitních odpovědí, jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TH1 mají sklon upřednostňovat indukci imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami za poskytnutí antigenu, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 vedou k přednostní indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.

Rozlišováni imunitních odpovědí typů TH1 a TH2 není absolutní.

Ve skutečnosti bude jednotlivec podporovat imunitní odpověď, která se popisuje jako převážně TH1 nebo převážně TH2. Často je však vhodné uvažovat rodiny cytokinů v kategoriích popisovaných u klonů ·· • · • ·

•4

444 •4

44 •4 •·

4« • 44 myších T-buněk CD4+ve Mosmannem a Coffmanem (Mosmann, T. R. a Coffman, R. L. (1989) TH1 a TH2 celíš: different patterns of lymphokin secretion lead to differentfunctional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145 - 173). Tradičně jsou odpovědi typu TH1 spojovány s produkcí cytokinů INF-γ a IL-2 T-lymfocyty. Další cytokiny jsou často přímo spojeny s indukcí imunitních odpovědí typu TH1 a nejsou produkovány T-buňkami, jako například IL-12. Naopak odpovědi typu TH2 jsou asociovány se sekrecí IL-4, lL-5, IL-6 a IL-13.

Je známo, že některé adjuvantní látky pro vakcíny jsou zvláště vhodné pro stimulaci odpovědí cytokinů buď typu TH1 nebo TH2. Tradičně patří mezi nejlepší indikátory rovnováhy TH1 : TH2 imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci přímé měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 T-lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem a/nebo měření poměru lgG1 : lgG2a protilátkových odpovědí specifických pro antigen.

Adjuvans typu TH1 je tedy látka, která preferenčně stimuluje populace izolovaných T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu TH1, jestliže jsou restimulovány antigenem in vitro, a podporuje vývoj jak CD8+ cytotoxických T-lymfocytů, tak i imunoglobulinových odpovědí specifických pro antigen asociovaných s isotypem typu TH1.

Adjuvantní látky, které jsou schopny preferenční stimulace buněčné odpovědi typu TH1 se popisují v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/00153 a WO 95/17209.

Jedním takovým adjuvans je 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Tato látka je známa z patentu GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci a je dodávána firmou Ribi Immunochem, Montana. Výhodná forma 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A se popisuje v evropském patentu 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

•4·· ··

999 ·· •9

9· •· •·

Částice 3D-MPL jsou s výhodou dostatečně malé, aby je bylo možno sterilně filtrovat přes membránu 0,22 pm (evropský patent č. 0 689 454).

3D-MPL bude přítomen v množství 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, jestliže bude antigen typicky přítomen v rozmezí množství 2 až 50 pg.

Dalším výhodným adjuvans je QS21, netoxická frakce čištěná HPLC odvozená z kůry Quillaja Saponaria Molina. Toto adjuvans může popřípadě být ve směsi s 3-DeO-acylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL), popřípadě spolu s nosičem.

Způsob výroby QS21 je popsán v US patentu No. 5,057,540.

Dříve již byly popsány nereaktogenní adjuvantní formulace obsahující QS21 (WO 96/33739). Tyto formulace obsahující QS21 a cholesterol byly ukázány jako úspěšná stimulační adjuvans TH1 při formulaci společně s antigenem.

Mezi další adjuvans, která jsou preferenčnímu stimulátory buněčné odpovědi TH1, patří imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, jak se popisuje ve WO 96/02555.

Při poskytování adjuvans, které je preferenčním stimulátorem buněčné odpovědi TH1, jsou také uvažovány kombinace různých TH1stimulujících adjuvans, jako jsou kombinace uvedené výše. Například QS21 je možno formulovat společně s 3D-MPL. Poměr QS21 : 3DMPL bude typicky řádově od 1 : 10 do 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodná rozmezí pro optimální synergický účinek jsou 2,5 : 1 až 1 : 1 3D-MPL : QS21.

Ve vakcinačním prostředku podle předkládaného vynálezu je také s výhodou přítomen nosič. Nosičem může být emulze typu olej ve vodě nebo sůl hliníku jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze typu olej ve vodě zahrnuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení jsou antigeny ve vakcinačním prostředku podle vynálezu kombinovány s QS21 a 3D-MPL právě v takové emulzi. Navíc může emulze typu olej ve vodě obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

Pro podávání člověku budou látky QS21 a 3D-MPL přítomny ve vakcíně v rozmezí množství 1 pg až 200 pg, jako je 10 až 100 pg, s výhodou 10 až 50 pg na dávku. Typicky bude emulze oleje ve vodě obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, 2 až 10 % alfa-tokoferolu a 0,3 až 3 % Tweenu 80. S výhodou je poměr skvalen : alfa-tokoferol roven nebo nižší než 1, protože takto se získávají stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v koncentraci 1 %. V některých případech může být výhodné, jestliže vakcíny podle předkládaného vynálezu navíc obsahují stabilizátor.

Netoxické emulze typu olej ve vodě obsahují s výhodou netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80, ve vodném nosiči. Vodný nosič může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.

Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě, se popisuje ve WO 95/17210.

Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcinační prostředek obsahující vakcinační formulaci podle vynálezu v kombinaci s dalšími antigeny, zvláště antigeny použitelnými pro léčení rakovin, autoimunitních onemocnění a souvisejících stavů. Tyto polyvalentní vakcinační prostředky mohou obsahovat adjuvans indukující TH-1, jak bylo popsáno výše.

Vynález se tako týká použití polynukleotidů ve formě primeru odvozených od polynukleotidů podle předkládaného vynálezu, a polypeptidů ve formě protilátek nebo reagencií specifických pro polypeptid podle předkládaného vynálezu jako diagnostických činidel.

- 22: · ::;··· · ·· ·♦ ··· ·· ·· ···

Identifikace genetických nebo biochemických markérů v krvi nebo tkáních, která umožní detekci velmi časných změn biochemických dějů souvisejících s karcinogenezí bude pomáhat při určování nejlepšího způsobu léčení pacienta. Pro diagnózu různých forem a stavů rakoviny mohou být použity náhradní tumorové markéry, jako je exprese polynukleotidů. Identifikace hladin exprese polynukleotidů podle vynálezu bude použitelná jak při určení stupně rakovinného onemocnění, tak i k zařazení rakovinné tkáně podle její povahy. Určení stupně procesu monitoruje vývoj rakovinného onemocnění a určuje se v přítomnosti nebo nepřítomnosti maligní tkáně v oblastech s provedenou biopsií. Polynukleotidy podle vynálezu mohou napomáhat přesnému zjištění stupně vývoje identifikací markérů pro agresivitu rakoviny, například přítomnost v různých částech těla. Rozdělování rakoviny podle stupňů (grading) popisuje, jak blízce se podobá nádor normální tkáni stejného typu, a zjišťuje se buněčnou morfologií a jinými diferenciačními markéry. Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použitelné při určení stupně nádoru, protože mohou napomáhat při zjištění stavu tumorových buněk z hlediska diferenciace. Na druhé straně může být polypeptid podle vynálezu produkován stromatickými buňkami, přičemž v tomto případě je jeho specifická exprese nebo odlišná exprese markérem průběhu onemocnění.

Diagnostické testy poskytují způsob diagnózy nebo zjištění vnímavosti na rakoviny, autoimunitní onemocnění a související stavy pomocí diagnózy metodami, které zahrnují zjištění abnormálně snížené nebo zvýšené hladiny polypeptidu nebo mRNA ve vzorku odvozeném z pacienta. Tento způsob diagnózy je znám jako diferenciální exprese. Exprese konkrétního genu se porovnává mezi nemocnou tkání a normální tkání. Rozdíl mezi genem souvisejícím s polynukleotidem, mRNA nebo proteinem v těchto dvou tkáních se srovnává například z hlediska molekulové hmotnosti, aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence nebo relativního nadbytku a ukazuje na ······ · ·· ·· • · φ ···· ··· změnu genu nebo příslušného regulačního genu ve tkáni člověka, u kterého je podezření na onemocnění.

Snížená nebo zvýšená exprese může být měřena na základě hladiny RNA. Z těchto dvou tkání se nejprve izoluje polyA RNA a mRNA kódovaná genem odpovídajícím odlišně exprimovanému polynukleotidu podle vynálezu může být detekována například hybridizací in šitu v tkáňových řezech, PCR s reverzní transkriptázou, použitím northernových přenosů obsahujících póly A+mRNA, nebo jakoukoli jinou přímou nebo nepřímou metodou detekce RNA. Zvýšená nebo snížená exprese dané RNA v postižené tkáni v porovnání s normální tkání ukazuje, že transkript a/nebo exprimovaný protein mají úlohu v onemocnění. Detekce vyšší nebo nižší hladiny mRNA odpovídající SEQ ID No. 1 nebo 3 vzhledem k normální hladině tedy ukazuje na přítomnost rakovinného onemocnění u pacienta.

Hladiny exprese mRNA ve vzorku mohou být zjištěny vytvořením knihovny specifických exprimovaných sekvencí (expressed sequence tags, EST) ze vzorku. Relativní zastoupení EST v knihovně může být použito pro zjištění relativního zastoupení genového transkriptu ve výchozím vzorku. Analýza EST v testu může být potom porovnána s analýzou EST referenčního vzorku pro zjištění relativních hladin exprese sledovaného polynukleotidu.

Další analýzy mRNA mohou být prováděny použitím metody sériové analýzy genové exprese (SAGE) (Velculescu a další, Science (1995), 270: 484), metody nazvané „differential display methodology“ (například US 5,776,683) nebo hybridizační analýzou, která je založena na specificitě interakcí nukleotidů.

Porovnání může být alternativně prováděno na úrovni proteinů. Velikosti proteinů ve dvou tkáních mohou být porovnávány použitím protilátek pro detekci polypeptidů ve westernových přenosech proteinových extraktů ze dvou tkání. Expresní hladiny a subcelulární lokalizace mohou být také detekovány imunologicky s použitím

protilátek proti odpovídajícímu proteinu. Další testovací metody, které mohou být použity pro zjištění hladin proteinu, jako je polypeptid podle předkládaného vynálezu, ve vzorku odvozeném od hostitele, jsou odborníkům v oboru dobře známé. Zvýšená nebo snížená úroveň exprese polypeptidů v postižené tkáni ve srovnání s úrovní exprese stejného proteinu v normální tkáni ukazuje, že tento protein se může účastnit v onemocnění.

V testech podle předkládaného vynálezu může být diagnóza určována detekcí úrovní exprese genového produktu kódovaného alespoň jednou sekvencí uvedenou v SEQ ID No. 1 nebo 3. Porovnání hladin mRNA nebo proteinu v nemocné tkáni se zdravou tkání může být také použito pro sledování postupu nebo ústupu onemocnění.

Velký počet polynukleotidových sekvencí ve vzorku může být testován použitím polynukleotidových polí (arrays). Ta mohou být použita pro zjištění diferenciální exprese genů a pro zjištění funkce genu. Například pole polynukleotidových sekvencí SEQ ID No. 1 nebo 3 mohou být použita pro zjištění, zda je některý z polynukleotidů exprimován odlišně v normální a rakovinné tkáni. V jednom provedení vynálezu může být vytvořeno pole oligonukleotidových sond obsahující nukleotidové sekvence SEQ ID No. 1 nebo 3 nebo jejich fragmenty pro provedení účinného screeningu například genetických mutací. Metody využívající technologie polí jsou dobře známy a mají obecnou použitelnost a mohou být použity pro řešení řady otázek v oboru molekulární genetiky včetně genové exprese, genetického propojení a genetické variability (viz například: M. Chee a další, Science, díl 274, str. 610 - 613 (1996)).

„Diagnóza“, jak se zde používá, zahrnuje určení vnímavosti subjektu na onemocnění, zjištění, zda subjekt má v současnosti onemocnění a také zjištění prognózy subjektu postiženého onemocněním.

• ΦΦΦ φφ φ φφ Φ· • φ · φ · · · φ · φ

Předkládaný vynález se dále týká diagnostického kitu pro provádění diagnostického testu, který zahrnuje:

(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s výhodou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 1 nebo 3, nebo její fragment;

(b) nukleotidovou sekvenci komplementární se sekvencí podle bodu (a);

(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, s výhodou polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku proti polypeptidu podle předkládaného vynálezu, s výhodou proti polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu jsou také cenné pro lokalizaci chromosomů. Sekvence je specificky zacílena na určité umístění a může hybridizovat s určitým umístěním na jednotlivém chromosomů člověka. Toto mapování příslušných sekvencí na chromosomy podle předkládaného vynálezu je důležitým prvním krokem při korelaci těchto sekvencí s onemocněním spojeným s genem. Jakmile byla sekvence namapována na přesné místo v chromosomů, může být provedena korelace fyzické polohy sekvence na chromosomů s údaji genetické mapy. Tyto údaje je možno nalézt například v: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupné on line prostřednictvím Johns Hopkins University Welch Medical Library). Vztah mezi geny a onemocněními, která byla mapována do stejné oblasti chromosomů, jsou potom identifikovány pomocí analýzy souvislosti (linkage analysis, souvislost fyzicky sousedících genů). Rozdíly v sekvenci cDNA nebo genomu mezi postiženými a nepostiženými jednotlivci mohou být zjišťovány také.

Polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty nebo analogy nebo buňky exprimující tyto polypeptidy mohou být také použity jako imunogeny pro výrobu protilátek imunospecifických pro polypeptidy podle předkládaného vynálezu. Termín „imunospecifický“ znamená, že ······ · ·· ·· · • · · ··· « · · ·· _Λ · ·· ··· · * ·

- 26 : · :::·:: : •· · · ··· · · ·· ··· protilátky mají podstatně vyšší afinitu k polypeptidům podle vynálezu než je jejich afinita pro jiné příbuzné polypeptidy podle dosavadního stavu techniky.

V dalším provedení poskytuje vynález protilátku, která je imunospecifická pro polypeptid podle vynálezu nebo jeho imunologický fragment, jak bylo definováno výše. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům podle předkládaného vynálezu mohou být získány podáním polypeptidů nebo fragmentů nesoucích epitop, analogů nebo buněk živočichovi, s výhodou živočichovi odlišnému od člověka, použitím rutinních protokolů. Pro přípravu monoklonálních protilátek může být použita jakákoli technika, která poskytne protilátky produkované kulturami kontinuálních buněčných linií. Mezi příklady patří technologie hybridomů (Kohler, G. a Milstein, C., Nátuře (1975), 256: 495 - 497), triomová technologie, technologie hybridomů lidských B-buněk (Kozbor a další, Immunology Today (1983), 4: 72) a technologie hybridomů EBV (Col a další, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77 - 96, Alan R. Liss, lne., 1985).

Pro produkci jednořetězcových protilátek proti polypeptidům podle předkládaného vynálezu mohou být také použity technologie výroby jednořetězcových protilátek, jako jsou způsoby popisované v US patentu No. 4,946,778. Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být také použity transgenní myši nebo jiné organismy včetně dalších savců.

Výše popsané protilátky mohou být použity pro izolaci nebo pro identifikaci klonů exprimujících polypeptid nebo pro purifikaci polypeptidů afinitní chromatografií. Protilátka podle vynálezu může být také použita pro prevenci nebo léčení rakoviny, zvláště rakoviny vaječníků a tlustého střeva, autoimunitních onemocnění a souvisejících stavů.

• ·· ·· * · * φ φ * φ

φφφ φ φ φ φφφ φφ φφ φφφ

Další provedení vynálezu se týká způsobu indukce nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje zaočkování savce polypeptidem podle předkládaného vynálezu, který je vhodný pro produkci protilátky a/nebo T-buněčné odpovědi na ochranu nebo zmírnění příznaků nebo postupu onemocnění. Ještě další provedení vynálezu se týká způsobu indukce nebo modulace imunologické odpovědi u savce, který zahrnuje dodání polypeptidu podle předkládaného vynálezu prostřednictvím vektoru řídícího expresi polynukleotidu a kódujícího polypeptid in vivo, pro indukci imunologické odpovědi pro dosažení produkce protilátky pro ochranu uvedeného živočicha před onemocněním.

Bude zřejmé, že předkládaný vynález poskytne způsob léčení abnormálních stavů jako je například rakovina a autoimunitní onemocnění, zvláště rakovina vaječníků a tlustého střeva, souvisejících buď s přítomností nebo nadbytkem nebo sníženou expresí polypeptidové aktivity CASB616.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob screeningu sloučenin pro identifikace látek, které stimulují nebo inhibují funkci polypeptidu CASB616. Obecně mohou být pro léčebné a preventivní účely u výše zmíněných onemocnění látky s agonistickými nebo antagonistickými účinky. Sloučeniny mohou být identifikovány z řady zdrojů, například buněk, bezbuněčných preparátů, chemických knihoven a směsí přírodních produktů. Tyto látky s agonistickým, antagonistickým nebo inhibičním účinkem identifikované uvedenými způsoby mohou být přírodní nebo modifikované substráty, ligandy, receptory, enzymy atd. podle jednotlivých případů, tohoto polypeptidu; nebo jej mohou napodobovat strukturou nebo funkcí (viz Coligan a další, Current Protocols in Immunology 1 (2): kapitola 5 (1991)). Metody screeningu budou odborníkům v oboru známé. Další metody screeningu je možno nalézt například v článku D. Bennett a další, J. Mol. Recognition, 8: 52 - 58 (1995); a K. Johanson a další, J. Biol. Chem., 270 (16): 9459 - 9471 (1995) a tam uvedených odkazech.

• · Φ · « 9· · • · · · ·9 • · Φ · Φ ΦΦ • · · Φ Φφ ··· ΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ

Předkládaný vynález tedy poskytuje metodu screeningu pro identifikaci sloučenin, které stimulují nebo které inhibují funkci polypeptidu podle vynálezu, která zahrnuje způsob zvolený ze skupiny:

(a) měření vazby testované (candidate) sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid), nebo jeho fúzní protein pomocí značky, která je přímo nebo nepřímo spojena s testovanou sloučeninou;

(b) měření vazby testované sloučeniny na polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein v přítomnosti značeného kompetitoru;

(c) ztištění, zda testovaná sloučenina poskytne signál vytvořený aktivací nebo inhibici polypeptidu s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky nebo buněčné membrány nesoucí polypeptid;

(d) míšení testované sloučeniny s roztokem obsahujícím polypeptid podle nároku 1 za vytvoření směsi, měření aktivity polypeptidu ve směsi a porovnání aktivity směsi se standardem; nebo (e) detekce vlivu testované sloučeniny na produkci mRNA kódující uvedený polypeptid a uvedený polypeptid v buňkách, s použitím například testu ELISA.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být použity pro identifikaci membrány navázané na rozpustné receptory, pokud existují, prostřednictvím standardních technik vazby receptoru známých v oboru. Pro identifikaci agonistů a antagonistů polypeptidu podle vynálezu soutěžících s vazbou polypeptidu podle vynálezu na jeho receptory, pokud existují, mohou být také použity dobře známé metody screeningu.

V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká kitu pro screening pro identifikaci agonistů, antagonistů, ligandů, receptorů, substrátů, enzymů apod. pro polypeptidy podle předkládaného

9	99	• 99	99
•	• 9	9 9 9 9	• ·	9 ·
	• 9	9 9 9	9 9
•	“· ·	9 9 9	• 9
	9«	999 99	• ·	• 9

vynálezu; nebo sloučenin, které snižují nebo zesilují produkci těchto polypeptidů, který obsahuje:

(a) polypeptid podle předkládaného vynálezu;

(b) rekombinantní předkládaného vynálezu;	buňku	exprimující	polypeptid	podle
(c) buněčnou membránu předkládaného vynálezu; nebo	exprimující	polypeptid	podle

(d) protilátku proti polypeptidů podle předkládaného vynálezu;

přičemž polypeptidem je s výhodou polypeptid se sekvencí SEQ ID No. 2.

Odborníkům v oboru bude zřejmé, že polypeptid podle předkládaného vynálezu může být také použit při metodě návrhu agonistů, antagonistů nebo inhibitorů polypeptidů na základě struktury, přičemž se:

(a) určí v prvním případě trojrozměrná struktura polypeptidů;

(b) odvodí se trojrozměrná struktura pro pravděpodobně reaktivní vazebné místo nebo vazebná místa agonisty, antagonisty nebo inhibitoru;

(c) syntetizují se vhodné sloučeniny, u kterých se předpokládá, že se vážou nebo reagují s odvozeným vazebným nebo reakčním místem; a (d) testuje se, zda jsou tyto sloučeniny skutečně agonisty, antagonisty nebo inhibitory.

Pro uskutečnění endogenní produkce polypeptidů CASB616 příslušnými buňkami v organismu může být také použita genová terapie. Přehled genové terapie je možno nalézt v kapitole 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (a tam citované reference) v publikaci Human Molecular Genetics, T. Strachan a A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996).

• 999 99 * 99 99

9 9 9 9 9 9 ·

Příprava vakcín se obecně popisuje v knize Pharmaceutícal Biotechnology, díl 61, Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, ed. Powell a Newman, Plenům Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdřování do liposomů se popisuje například v Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje například v Likhite, US patent 4,372,945 a Armor a další, US patent 4,474,757.

Množství proteinu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď v typických vakcínách bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude lišit v závislosti na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg. Optimální množství pro určitou vakcínu se bude zjišťovat standardními studiemi zahrnujícími sledování titrů protilátek a jiných odpovědí pacientů. Po počáteční vakcinaci může pacient dostat zesilující dávku po přibližně čtyřech týdnech.

„Izolovaný“ znamená změněný „zásahem člověka“ z přírodního stavu. Jestliže se „izolovaná“ směs nebo látka vyskytuje v přírodě, byla změněna nebo vyjmuta ze svého původního prostředí, nebo byly provedeny oba tyto zásahy. Například polynukleotid nebo polypeptid vyskytující se přirozeně v živočichovi není „izolovaný“, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od koexistujících materiálů svého přirozeného stavu je „izolovaný“ v tom smyslu, který se zde používá.

„Polynukleotid“ obecně označuje jakýkoli polyribonukleotid nebo nebo polydeoxribonukleotid, kterým může být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RNA nebo DNA včetně jednořetězcových a dvojřetězcových oblastí.

···· ·· · ·· «· * ·»· »·»· · · *· ·»· ····(·

- 31 ·» · * · * * * * · :

·· ·· · · · ·♦ ·♦ ··· „Varianta“ označuje polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidů, ale zachovává si nezbytné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu má odlišnou nukleotidovou sekvenci od jiného, referenčního polynukleotidu. Změny v nukleotidové sekvenci varianty mohou nebo nemusí měnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidů kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím, delecím aminokyselin, a fúzím a zkrácením polypeptidů kódovaného referenční sekvencí, jak bude diskutováno dále. Typická varianta polypeptidů se odlišuje aminokyselinovou sekvencí od dalšího, referenčního polypeptidů. Obecně jsou rozdíly omezeny tak, aby byly celkově sekvence referenčního polypeptidů a varianty úzce podobné, a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid mohou mít odlišnou aminokyselinovou sekvenci jednou nebo více substitucemi, adicemi a delecemi v jakékoli kombinaci. Substituovaný nebo vložený aminokyselinový zbytek může nebo nemusí být zbytek kódovaný genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidů se může vyskytovat v přírodě jak je tomu u allelické varianty, nebo může jít o variantu, o které není známo, že by se vyskytovala v přírodě. Varianty polynukleotidů a polypeptidů, které se v přírodě nevyskytují, mohou být vyrobeny technikami mutageneze nebo přímou syntézou.

„Identita“, tak jak je známo v oboru, je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi, nebo dvěma nebo více polynukleotidovými sekvencemi zjištěním porovnání sekvencí. V oboru znamená výraz „identita“ také stupeň sekvenční příbuznosti mezi polypeptidovými nebo polynukleotidovými sekvencemi při zjištění souhlasu mezi řetězci těchto sekvencí. „Identita“ a „podobnost“ může být snadno vypočtena známými metodami, včetně bez omezení metod popsaných v (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M, ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academie Press, New York, ·«·· ·· ♦ · t • · ·

- 32:: : · ♦ · 94

1993; Computer Analysis of Sequence Data, část I, Griffin, A. M., a Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. a Devereux, J., ed., M. Stockton Press, New York, 1991; a Carillo, H., a Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Výhodné metody pro určení identity jsou navrženy tak, aby poskytly nejvyšší možný souhlas mezi testovanými sekvencemi. Metody pro určení identity a podobnosti jsou zakódovány ve veřejně dostupných počítačových programech. Výhodné počítačové programy pro zjištění identity a podobnosti mezi dvěma sekvencemi zahrnují bez omezení programový balík GCG (Devereux, J., a další, Nukleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN a FASTA (Atschul, S. F. a další, J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Program BLAST X je veřejně dostupný u NCBI a jiných zdrojů (BLAST Manual, Altschul, S., a další, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., a další, J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Pro zjištění identity může být také použit dobře známý Smith Watermanův algoritmus.

Výhodný algoritmus používaný podle vynálezu je FASTA. Výhodné parametry pro porovnání polypeptidové nebo polynukleotidové sekvence s použitím algoritmu zahrnují následující parametry programu:

Gap Penalty: 12

Gap extension penalty: 4

Word size: 2, max 6

Výhodné parametry pro porovnání polypeptidových sekvencí dalšími metodami zahrnují následující:

1) Algoritus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970) porovnávací matrice: BLOSSUM62, Hentikoff a Hentikoff, Proč.

Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915 - 10919 (1992) φφφφ φφ · φφ φφ φ »♦· 99 9 9 ♦ 9 φφ _Λ1. · ♦ 9 9 9 9 9 9

- «33. <«* **·*«· * ·· ♦ ♦ ... ·· »· ***

Gap Penalty: 12

Gap Length Penalty: 4

Program použitelný s těmito parametry je veřejně dostupný jako program „gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison Wl.Výše uvedené parametry jsou výchozí nastavené parametry pro porovnání polypeptidů (přičemž zároveň platí podmínka programu „no penalty for end gaps“).

Výhodné parametry pro porovnání polynukleotidů zahrnují následující:

1) Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970) porovnávací matrice: shody = +10, neshody = 0

Gap Penalty: 50

Gap Length Penalty: 3

Program použitelný s těmito parametry je veřejně dostupný jako program „gap“ u firmy Genetics Computer Group, Madison Wl. Výše uvedené parametry jsou výchozí nastavené parametry pro porovnávání polynukleotidů.

Jako příklad, polynukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 1, tj. mít 100% identitu, nebo může zahrnovat až do určitého celočíselného počtu nukleotidových změn ve srovnání s referenční sekvencí. Tyto změny jsou zvoleny ze skupiny alespoň jedné nukleotidové delece, substituce, včetně tranzice a transverze, nebo inzerce, přičemž uvedené změny se mohou vyskytovat na 5’ nebo 3’ koncových polohách referenční nukleotidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozprostřené buď jednotlivě mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo ve formě jedné nebo více spojiných skupin uvnitř referenční sekvence. Počet nukleotidových změn je určen vynásobením celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1 číselným ♦··· ·· · ·· ·· • · · ·· · · · • · · ··· ··*

- 34 ·-· · ♦ ····· ♦· ·· ··· ·· ·* ·*· procentem případného procenta identity (vyděleným 100) a odečtením tohoto výsledku od celkového počtu nukleotidů v SEQ ID No. 1, neboli:

n_n < x_n - (x_n . y), kde n_n je počet nukleotidových změn, x_n je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No. 1, a y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 %, 0,90 pro 90 %, 0,95 pro 95 % atd. a kde jakýkoli neceločíselný výsledek x_n a y je před odečtením od x_n zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo. Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID No. 2 mohou vytvořit nesmyslné mutace, mutace s chybným smyslem nebo mutace s posunem rámce v této kódující sekvenci a tím změnit polypeptid kódovaný polynukleotidem po těchto změnách.

Podobně může být polypeptidová sekvence podle předkládaného vynálezu identická s referenční sekvencí SEQ ID No. 2, tj. může být 100% identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu aminokyselinových změn ve srovnání s referenční sekvencí, takže procento identity je nižší než 100 %. Tyto změny jsou zvoleny ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci, substituci, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce, nebo inzerci aminokyseliny, přičemž k uvedeným změnám může dojít na aminokoncových nebo karboxykoncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoliv mezi těmito koncovými polohami, buď rozptýleně jednotlivě mezi aminokyselinami referenční sekvence nebo ve formě jedné nebo více spojitých skupin uvnitř referenční sekvence. Počet aminokyselinových změn pro dané procento identity je určen vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2 číselným procentem případně identity v procentach (vyděleným 100) a potom odečtením výsledku od celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No. 2, neboli:

n_a < x_a- (x_a. y),

• ·

00 ·· f ♦ · · · 0 0 00 • · · 0 · 0 • 0 0 0 0 · 0 ♦ 00 0* 0

0<· «0 00 0·0 kde n_a je počet aminokyselinových změn, x_a je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No, 2, a y je například 0,70 pro 70 %, 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., přičemž jakýkoli neceločíselný výsledek x_a a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x_a.

„Homolog“ je obecný termín používaný v oboru pro označení polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence, která má vysoký stupeň sekvenční příbuznosti s danou sekvencí. Tato příbuznost může být kvantifikována zjištěním stupně identity a/nebo podobnosti mezi porovnávanými sekvencemi tak jak bylo popsáno výše. Do tohoto obecného termínu spadají termíny „ortholog“, což znamená polynukleotid nebo polypeptid, který je funkčním ekvivalentem polynukleotidů nebo polypeptidů v jiném druhu a „paralog“, což znamená funkčně podobnou sekvenci v rámci stejného druhu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Analýza RT-PCR v reálném čase

Analýza RT-PCR v reálném čase (U. Gibson, 1996, Genome Research: 6, 996) se používá pro porovnání množství transkriptu mRNA testovaného antigenu v odpovídajících tumorových a normálních tkáních tlustého střeva od většího počtu pacientů. Navíc je možno tímto způsobem vyhodnotit hladiny mRNA testovaného genu v souboru normálních tkání.

Celková RNA z normální tkáně a tumorové tkáně tlustého střeva se extrahuje z rychle zmrazených biopsií s použitím činidla TriPure (Boehringer). Celková RNA z normálních tkání může být získána od firmy InVitrogen nebo se extrahuje z rychle zmrazených biopsií použitím činidla TriPure. Poly-A+ mRNA se vyčistí z celkové RNA po štěpení DNAázou s použitím oligo-dT magnetických kuliček (Dynal). Kvantifikace mRNA se provede spektrofluorimetricky (VersaFluor, ··♦· ·Φ · ΦΦ Φ· ' «φφ Φ· φ φ φ φ ·· φφφ · φ · ···

- 36 »»· ****·« :

·· ·· *···· ·« *«·

BioRad) s použitím barviva Sybrll (Molecular Probes). Primery pro amplífikaci PCR v reálném čase jsou navrhovány pomocí softwaru Perkin-Elmer Primer Express s použitím přednastavených podmínek pro podmínky amplifikace TaqMan.

Reakce v reálném čase se provádějí podle standardních protokolů PCR s použitím 2 ng čištěné mRNA pro každou reakci. Pro detekci v reálném čase se přidá barvivo Sybrl (Molecular Probes) s konečným ředěním 1/75000. Amplifikace (40 cyklů) a detekce v reálném čase se provádí na systému Perkin-Elmer Biosystems PE7700 s obvyklým nastavením přístroje. Hodnoty Ct se vypočtou s použitím softwaru PE7700 Sequence Detector software. Pro každý vzorek pacienta se získají dvě hodnoty Ct: hodnota Ct tumoru (CtT) a odpovídající hodnota Ct normální tkáně tlustého střeva (CtN). Hodnoty Ct získané PCR v reálném čase souvisí logaritmicko-lineárně s počtem kopií cílového templátu. Protože účinnost amplifikace PCR za převládajících podmínek experimentu je blízká teoretické účinnosti amplifikace, 2^(CtN’^ctT) je odhadem relativních hladin transkriptu v těchto dvou tkáních (tj. násobek nadměrné exprese mRNA v tumoru). Reakce PCR v reálném čase se provádějí na biopsiích od 17 pacientů. Míra nadměrné exprese mRNA se vypočte pro každého pacienta tak jak bylo popsáno výše. Z tohoto souboru údajů sep otom vypočte průměrná míra nadměrné exprese mRNA pro testovaný antigen a podíl pacientů s nadměrnou expresí testovaného antigenu.

Pro normální tkáně se hodnoty Ct pro testovaný antigen porovnávají s hodnotami aktinu získaného u stejného vzorku tkáně.

··♦· ·· • · · · ·

Výsledky PCR v reálném čase ve vzorku normální/rakovinné tkáně tlustého střeva

Souhrn

Pacienti s nadměrnou expresí CASB616 v tumorech tlustého střeva (%)	Průměrná míra nadměrné exprese v tumorech tlustého střeva (násobek)
17/17 (100 %)	17

Podrobnosti tří experimentů

Experiment 1 (6 vzorků)
	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	(CtN- CtT) (střed)	Nadměrná exprese T (násobek, střed)
CASB616* sonda 1	30 - 34,5	32,3	28,5 - 31	29,8	2,5	5,7
sonda 2		26,3		26	4	16
sonda 3		26,6		27,1	2,7	6,5
Experiment 2 (5 vzorků)
	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	(CtN- CtT) (střed)	Nadměrná exprese T (násobek, střed)
CASB616	34 - 39	37,5	28 - 34,5	31	4,7	26
Experiment 3 (6 vzorků)
	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	CtN (rozmezí)	CtN (střed)	(CtN- CtT) (střed)	Nadmérnáexpres e T (násobek, střed)
CASB616	38 - 40	39	29,5 - 35,5	32,5	7,7	207

V tomto prvním experimentu byly použity tri různé páry sond ···· 04 « ·· ·» » • f · ·9 · · «« ·· • · · · · · ··· 88» ··* ··»*♦· Z ·· ·· ··· «· ·· ··<

Výsledky PCR v reálném čase pro normální tkáně

Hodnoty Ct

	Bl	Bra	Sk	Ce	He	Ki	Li	Lu	Sp	Pl	Re	tE
CASB616	31,5	29,5	20	32,5	34,5	31,5	30,5	31	30	29,5	28,5	31
Aktin	16	17	18,5	17,5	17,5	17	15,5	16,5	30	16	16,5	16,5

	Ao	Ad	Lu2	Pr	Te2	Oe	St	Co	Sk Mu	Ov	Fa Tu	Ce2
CASB616	24	30	21	29	22,5	33,5	30,5	22	30,5	24,5	25,5	28,5
Aktin	40	28,5	28,5	27	25,5	26	28	33,5	29	30,5	28,5	23,5

Bl: měchýř; Bra: mozek; Sk: kůže; Ce: čípek; He: srdce; Ki: ledvina; Li: játra; Lu: plíce; Sp: slezina; Pl: placenta; Re: rektum; Te: testis; Ao: aorta; Ad GI: nadledvina; Pr: prostata; Oe: jícen; St: žaludek; SkMu: kosterní sval; Ov: vaječník; FaTu: vejcovod. Různé vzorky ze stejné tkáně mají dodatečný číselný identifikátor.

Závěr

Transkript genu CASB616 je výrazně nadměrně exprimován ve všech vyšetřovaných primárních kolorektálních tumorech vzhledem k normálnímu tlustému střevu. Exprese ve většině normálních tkání se zdá být velmi nízká.

•Vil t < ·

• · · · · ♦ 9 9 9 9 9

9 9 9 9

Příklad 2

Mikrosoubory DNA

Mikrosoubory DNA (DNA micro-arrays) se používají pro zjišťování profilů exprese mRNA ve velkých souborech genů ve velkém počtu vzorků. Tato informace se používá pro doplnění údajů získaných PCR v reálném čase a poskytuje nezávislé měřítko hladin genové exprese v tumorech a normálních tkáních.

Příklady běžných technologií pro produkci mikrosouborů DNA zahrnují 1) soubory Affymetrix „GeneChip“, ve kterých se oligonukleotidy syntetizují na povrchu čipu chemickou syntézou na pevné fázi použitím fotolitografického procesu, 2) technologii tečkování DNA, při které se pomocí robotu ukládají malé objemy roztoku DNA a potom se imobilizují na povrchu pevné fáze (například skla). V obou případech se čipy hybridizují s cDNA nebo cRNA, které byly extrahovány z tkáně, o kterou jde (například normální tkáň, tumor atd.) a značeny radioaktivně nebo pomocí fluorescenční reportérové molekuly. Značený materiál se hybridizuje k čipu a množství sondy navázané ke každé sekvenci na čipu se určí pomocí speciálního skeneru. Tento experiment může být konfigurován s jediným fluorescenčním reportérem (nebo radioaktivitou), nebo může být alternativně prováděn použitím dvou fluorescenčních reportérů. V tomto druhém případě se každý ze dvou vzorků značí jednou z reportérových molekul. Dva označené vzorky se potom kompetitivně hybridizují k sekvencím na čipu DNA. Pro každou sekvenci na čipu se stanoví poměr fluorescenčních signálů. Poměr se použije pro výpočet relativního množství transkriptu ve dvou vzorcích. Podrobné protokoly jsou dostupné z řady zdrojů včetně „DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999“ a internetu (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) a specializovaných distributorů (např. Affymetrix).

• ··		•
·· »	•	•	•	··
• ·	•	•	•	•
• ·	to	to ·	•	•
• to	•	•	•	to
• toto ··		toto		···

Příklad 3

Profily EST

Komplementární přístup k charakterizaci experimentálního antigenu z hlediska exprese je použití databáze lidských exprimovaných sekvencí „Expressed Sequence Tags“ (EST). EST jsou malé fragmenty cDNA připravené ze souboru mRNA extrahovaných z příslušné tkáně nebo buněčné linie. Tato databáze v současnosti poskytuje velké množství EST (10⁶) z několika set knihoven tkáňové cDNA, včetně tumorových tkání z různých typů a stavů onemocnění. Pomocí nástrojů pro zpracování informací se provádí srovnávací průzkum sekvence CASB616 s cílem získat další pohled na expresi ve tkáních.

Výsledky prohledávání databáze s použitím sekvence CASB616

Databáze EST	ID knihovny ATG	Popis	Kateg.*
NCBI: 580826	424	fetální srdce	F
NCBI: 581388	424	fetální srdce	F
NCBI: 584556	424	fetální srdce	F
NCBI: 1160708	882	NCI_CGAP_Co3 (12 spojených tumorů tlustého střeva)	TC
NCBI:1150180	895	NCI_CGAP_Br2 (spojené tumorové tkáně prsu)	TB
NCBI:1150189	895	NCI_CGAP_Br2 (spojené tumorové tkáně prsu)	TB

φ φ

ΦΦΦ

NCBI:1150229	895	NCI_CGAP_Br2 (spojené tumorové tkáně prsu)	TB
NCBI:1150370	895	NCI_CGAP_Br2 (spojené tumorové tkáně prsu)	TB
NCBI:1777532	843	Fetus	F
NCBI:2127996	1541	NCI_CGAP_Lu25	Tlg
NCBI:2129674	1541	NCI_CGAP_Lu25	Tlg
NCBI:129684	1541	NCI_CGAP_Lu25	Tlg
NCBI:2649403	1540	NCI_CGAP_Co16	TC
NCBI:3415191	1918	Schneiderův fetální mozek 00004	F
NCBI:24019	2	fetální mozek	F
NCBL1942	2	fetální mozek	F
NCBI:79438	226	lidská placenta	N
NCBI.982827	695	fetální ledvina	F

*F: knihovny fetálních tkání; TC: knihovny tumorů tlustého střeva; TB: knihovny tumoru prsu; Tlg: knihovny tumoru plic; N: knihovny normálních tkání.

Příklad 4

Analýzy northern-Southernovým přenosem

Omezená množství cDNA směsné tumorové tkáně a odpovídající normální tkáně tlustého střeva se amplifikují PCR Advantage (viz výše). Mediátorová RNA z většího počtu normálních tkání se rovněž amplifikuje použitím stejného postupu. Amplifikovaná cDNA (1 pg) se čistí elektroforézou na 1,2 % agarózovém gelu a

převede se na nylonovou membránu. Tato membrána se hybridizuje (AlkPhos Direct Systém) se sondou připravenou použitím fragmentu testované TAA cDNA. Northern-southernova analýza poskytne informace o velikosti transkriptu přítomnosti rozštěpených variant a zastoupení transkriptu v tumorové a normální tkáni.

Příklad 5

Analýza northernovým přenosem

Northernové přenosy se připravují podle standardních protokolů s použitím 1 pg póly A+ mRNA. Radioaktivní sondy se připravují s použitím systému Ready-to-Go (Pharmacia).

Příklad 6

6:1 Exprese a purifikace antigenu specifických pro tumor

Pro produkci antigenu podle vynálezu pro vakcinační účely a pro výrobu proteinových fragmentů nebo úplného proteinu pro rychlou purifikaci a tvorbu protilátek nutných pro charakterizaci přirozeně exprimovaného proteinu imunohistochemicky nebo pro sledování čištění se používá exprese v mikrobiálních hostitelích.

Rekombinantní proteiny mohou být exprimovány ve dvou mikrobiálních hostitelích, E. coli a v kvasinkách (jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris) Pichia. To umožňuje volbu expresního systému s nejlepšími vlastnostmi pro produkci daného antigenu. Obecně se bude rekombinantní antigen exprimovat v E. coli a protein jako reakční činidlo v kvasinkách.

Strategie exprese zahrnuje nejprve návrh primární struktury rekombinantního antigenu. Obecně se umístí expresní fúzní partner (EFP) v N-koncové oblasti pro zvýšení hladin exprese, která by měla také zahrnovat oblast použitelnou pro modulaci imunogenních

vlastností antigenu, imunitního fúzního partnera (IFP). Navíc je na Ckonci obsažen afinitní fúzní partner (AFP) využitelný pro usnadnění další purifikace.

Jestliže jsou dostupné rekombinantní kmeny, rekombinantní produkt je charakterizován vyhodnocením hladiny exprese a předpovědí další rozpustnosti proteinu analýzou chování v surovém extraktu.

Po růstu na vhodném kultivačním médiu a indukci exprese rekombinantního proteinu se celkové extrakty analyzují SDS-PAGE. Rekombinantní proteiny se vizualizují v barvených gelech a identifikují analýzou westernovým přenosem s použitím specifických protilátek.

Srovnávací vyhodnocení různých verzí exprimovaného antigenu umožní volbu nejslibnějšího kandidáta, který má být použit pro další čištění a hodnocení z imunologického hlediska.

Práce na čištění probíhá klasickým způsobem na základě přítomnosti afinitního zakončení His na rekombinantním proteinu. V typickém experimentu se rozbité buňky filtrují a bezbuněčné extrakty se nanášejí na chromatografií typu Ion Metal Affinity Chromatography (IMAC; Ni⁺⁺NTA, Qiagen), která specificky zachytí rekombinantní protein. Zachycené proteiny se eluují 0 až 500 mM imidazolovým gradientem (podle potřeby v přítomnosti detergentu) ve fosfátovém pufru. Po tomto kroku za optimálních podmínek následuje krok chromatografie na aniontové pryskyřici a chromatografie typu size exclusion v závislosti na úspěšnosti kroku IMAC a povaze kontaminujících látek.

6.2 Produkce protilátek a imunohistochemie

Malá množství relativně vyčištěného proteinu mohou být použita pro vytvoření imunologických nástrojů s cílem

a) detekovat expresi imunohistochemickými metodami v řezech normální nebo rakovinné tkáně;

b) detekovat expresi a sledovat protein v průběhu purifikačního procesu (ELISA/westernový přenos); nebo

c) charakterizovat/kvantifikovat vyčištěný protein (ELISA).

6.2.1 Polyklonální protilátky

Imunizace

Dva až tři králíci se imunizují intramuskulárně (i.m.) třikrát v intervalu tří týdnů 100 pg proteinu formulovaného v adjuvans 3DMPL/QS21. Tři týdny po každé imunizaci se odebere vzorek krve a stanoví se titr protilátky v séru metodou ELISA s použitím proteinu antigenu povlaku, podle standardního protokolu.

ELISA

96-jamkové mikrotitrační destičky (maxisorb Nunc) se potáhnou 5 pg proteinu přes noc při 4 °C. Po 1 hod saturace při 37 °C PBS NCS 1%, se přidá sériové ředění králičího séra na 1,5 hod při 37 °C (začíná se ředěním 1/10). Po třech promytích v PBS Tweenu se přidá biotinylované protikráličí antisérum (Amersham) (1/5000). Destičky se promyjí a přidá se streptavidin s navázanou peroxidázou (1/5000) ma 30 min při 37 °C. Po promytí se na 7 min přidá 50 pl TMB (BioRad) a reakce se zastaví 0,2M H2SO4. OD je možno měřit při 450 nm a zředění ve středním bodu je možno vypočíst pomocí softwaru SoftmaxPro.

6.2.2 Monoklonální protilátky

Imunizace

Pět myší BALB/c se imunizuje třikrát v intervalu tří týdnů 5 pg čištěného proteinu. Vzorky krve se odebírají 14 dnů po II a jeden týden

po III. Séra se testují metodou Elisa na čištěném proteinu použitém jako potahovací antigen. Na základě těchto výsledků (střední ředění je >10000) se vybere jedna myš pro fúzi.

Fúze/selekce HAT

Buňky sleziny se fúzují s myelomem SP2/0 podle standardního protokolu s použitím PEG 40% a DMSO 5%. Buňky se potom zaočkují do 96-jamkových destiček v množství 2,5 x 10⁴ - 10⁵ buněk/jamku a rezistentní klony se vybírají v médiu HAT. Supernatant z těchto hybridomů se testuje na obsah specifických protilátek a jestliže je pozitivní, provedou se dva cykly omezeného ředění. Po dvou cyklech screeningu se vyberou tři hybridomy pro produkci v ascitech.

6.2.3 Imunohistochemie

Když jsou dostupné protilátky, provede se imunologické barvení na řezech normální nebo rakovinné tkáně pro zjištění:

* hladiny exprese antigenu podle vynálezu v rakovinné tkání ve srovnání s normální tkání, nebo * podíl rakovinné tkáně určitého typu exprimující antigen, * zda antigen exprimují také další typy rakovinné tkáně, * podíl buněk exprimujících antigen v rakovinné tkáni.

Příprava vzorku tkáně

Po odběru se vzorek tkáně připevní na korkový kotouč ve směsi OCT a rychle zmrazí v isopentanu, který byl předem podchlazen v kapalném dusíku (-160 °C). Blok bude potom konzervován do použití při -70 °C. Řezy o tloušťce 7 až 10 pm se provádějí v kryostatické komoře (-20, -30 °C).

Barvení

Tkáňové řezy se suší 5 min při teplotě laboratoře (RT), fixují se v acetonu 10 min při teplotě laboratoře RT, znovu suší a nasytí PBS s 0,5% BSA a 5% sérem. Po 30 min při teplotě laboratoře se provádí buď přímé nebo nepřímé barvení s použitím protilátek specifických pro antigen. Přímé barvení vede k lepší specificitě, ale méně intenzivnímu zbarvení, zatímco nepřímé barvení vede k intenzivnějšímu, ale méně specifickému zbarvení.

6.4 Analýza buněčných imunitních odpovědí člověka na antigen podle vynálezu

Imunologická relevance antigenu podle vynálezu může být testována in vitro primingem lidských T-buněk. Všechny lymfocytové linie T-buněk a dendritické buňky se odvozují od PBMC (mononukleární buňky periferní krve) zdravých dárců (výhodně subtyp HLA-A2). Pro screening peptidu HLA-A2.1 se používají transgenní myši HLA-A2.1/K^b.

Vypěstují se linie CD8+ T-buněk specifické pro nově objevený antigen, které se týdně udržují stimulací in vitro. Lytická aktivita a produkce γ-IFN linií CD8 jako odpověď na antigen nebo peptidy odvozené z antigenu se testují za použití standardních postupů.

Používají se dvě strategie pro vytvoření linií CD8+ T-buněk: přístup založený na peptidech a přístup založený na úplném genu. Oba přístupy vyžadují cDNA s úplnou délkou nově objeveného antigenu ve správném čtecím rámci, buď klonovanou ve vhodném dodávacím systému, nebo pro použití pro předpovězení sekvence peptidů vázajících se na HLA.

Přístup založeny na peptidu

Peptidové sekvence, které se vážou na HLA-A2, se předpovídají

Parkerovým algoritmem. Potom se provede screening peptidů

’ · · ···*·· ♦ ···* ······ ·

- 47 ** ·· ··· ·· ·· ·ΐ.

v modelu transgenních myší HLA-A2.1/K^b (Vitiello a další (L. Sherman), J. Exp. Med., J. Exp. Med., 1991, 173: 1007 - 1015). Pro předpověď se použije sekvence EPHB2v, protože je identická se sekvencí EPHB2 s dodatečným prodloužením C-koncové sekvence.

Předpovězené epitopy, které se vážou na allelu HLA_A0201:

SEQ ID No.	Poloha startu	Výpis zbytků subsekvence	Hodnocení*
5	948	MMMEDILRV	2979,496
6	11	LLLPLLAAV	1006,209
7	387	GLTEPRIYI	235,260
8	712	RQNDGQFTV	167,692
9	22	TLMDSTTAT	113,047
10	641	KLPGkREIFV	1338,876
11	10	LLLLpLLAAV	1006,209
12	947	QMMMeDILRV	427,474
13	810	WSYGiVMWEV	115,285
14	554	FLIAvVVIAI	110,379

*Odhad poločasu disasociace molekuly obsahující tuto sekvenci

Ve stručnosti, transgenní myši se imunizují adjuvantními peptidy HLA-A2, a ty, které jsou neschopné indukovat odpověď CD8 (jak je definováno účinnou lyží autologních slezinných buněk po pulsním přídavku peptidu), se budou dále analyzovat v lidském systému.

K lidským dendritickým buňkám (kultivovaným podle Romani a další, J. Exp. Med., 1994, 180: 83 - 93) se budou pulsně přidávat peptidy a buňky se budou používat ke stimulaci T-buněk třídy CD8 (metodou Facs). Po několika týdenních stimulacích budou linie buněk

CD8 nejprve testovány na autologní BLCL (EBV-B transformované φφφ buněčné linie) po pulsním přídavku peptidu. Pro ověření správného zpracování peptidu in vivo se budou linie CD8 testovat na cDNAtransfekované tumorové buňky (tumorové buňky LnCaP, Skov3 nebo CAMA transfekované HLA-A2).

Přístup založeny na úplném genu

Linie CD8+ T-buněk budou aktivovány a stimulovány buď dendritickými buňkami transfekovanými metodou gene-gun, retrovirově transdukovanými B7.1- transfekovanými fibroblasty, rekombinantním virem neštovic (Kim a další, J. Immunother., 1997, 20: 276 - 286) nebo dendritickými buňkami infikovanými adenovirem (Butterfield a další, J. Immunol., 1998, 161: 5607 - 5613). Buňky infikované virem jsou velmi účinné pro prezentování antigenních peptidů, protože antigen je exprimován s vysokými hladinami, ale mohou být použity pouze jednou pro zabránění nadměrnému růstu linií virových T-buněk.

Po střídavých stimulacích se linie CD8 testují na tumorové buňky transfekované cDNA jak bylo uvedeno výše. Určí se specificita a identita peptidu pro potvrzení imunologického ověření.

Odkazy

Všechny publikace včetně bez omezení patentů a patentových přihlášek, citované v této přihlášce, jsou zařazeny ve svém celku odkazem.

• ··

Výpis sekvencí :

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

<120> Novel Uses <13 0> BC45244 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 3763 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 1 aacaaaagct ggagctccac cgcggcggcg gccgctctag cccctggttc ggcccacccc tgaaggrccc agaaccgaca gcgaactcgE ggggaagcgc agccatggct cngcggaggc egggggccgc gccgctgccg ctgccgctgc tcgccgccgt ggaagaaacg ceaatggact ccaotacagc gactgccgag ctgggctgga tggcgcaccc tccatcaggg tgggaagagg tgagcggata cgatgagaac acgaacacga tccgcacgsa ccaggtgtgo aacgtgttttg agEcaagcca gaacaacrgg ctacggacca agttcacccg gcgccgrggc gcccaccgca cccacgcgga gaegaagttt tcggtgcgtg actgcagcag cacccccagc gcgcctggct cctgcaagga gaccEEcaac ctccatfiacc atgaggctga ccctgactcg gccaccaaga cctcccccaa ctggatggag aatccatggg tgaaggcgga taccategca gccgacgaga gctEcEccca ggtggacctg ggrggccgcg tcaúgaaaat caacaccgag gegcggagct tcggacctgt gtcccgcagc ggcctctacc EggcctEcca ggaceaúggc ggcegcatgt cccncatcgc cgtgcgrgtc ttccaccgca agtgcccccg catcatcoag aatggcgcca tcEEccagga aacccEgtcg ggggccgaga gcacatcgct ggtggctgcc cggggcagct gcaccgccaa cgcggaagag gsggaegcac ccatcaagct cnactgtaac ggggacggcg agEggccggt gcccatcggg cgctgcatgt gcaaagcagg cttcgaggcc gttgagaatg gcaccgtccg ccgaggtcgt ccaeceggga cttEcaaggc caaccaaggg gacgaggcct gtacccaceg tcccatcaac agccggacca cttctgaagg ggccaccaac egtgccEgcc gcaasggcta ctacagagca gacctggacc ccctggacaE gccccgcaca accatcccce ccgcgcccca ggctgtgatE tccagtgcca atgagacctc cctcasgctg gagtggaccc cEccccgcga ctccggaggc cgagaggacc tcgtctacaa catcaEctgc aagagctgtg gccogggccg gggcgccEgc acccgctgcg gggacaatgt acagtacgca ccacgccagc taggcccgac cgagccacgc atctacatca gcgaccsgcE ggcccacaco oagtacaccn tcgagatcca ggctgtgaac ggcgctaccg accagagccc cEEcecgcct cagttcgcct cEgtgaacat caccaccaac caggcagccc caccggcags gtccatcatg catcaggtga gccgcaccgt ggacagcatE accctgtcgt ggtcccagcc agaccagccc aacggcgtga tccEggacta tgagccgcag tactaegaga aggagcEcag tgagtacaac gccacagcca taaaaagccc caccaacacg gEcaccgcgc agggccEcaa agccggcgcc atceatgtct Eacaggtgog ggcacgcacc gEggcaggct acgggcgcca cagcggcaag atgtacttcc agaccatgac agaagccgag Eaccagacaa gcaCccagga gaagEEgcea cccatcaccg gcecctcggc cgctggcctg grcttcctca ttgccgnggc tgtcaccgcc accgcgtgca acagaagacg ggggCEEgag cgtgcEgacf cggagtacac ggacaagcng caacacsaca ccagEggcca cacgacccca ggcatgaaga tctacatcga ecctctcacc tacgaggacc ccaacgaggc agtgcgggag tctgccaagg aaattgacat ctcctgtgtc aaaattgagc aggtgaccgg agcaggggag cccggcgagg tctgcagtgg ccaccrgaag cngccaggca agagagagac ctttgcggcc ascaagacgc tcaagtcggg ctacacggag aagcagcgcc gggacttcct gagcgaagcc tccatcaegg gccagttcga ccaccccaac gtoatccaco tggagggtgt cgcgaccaag agcacacctg tgatgatcat caccgagttc aeggagaacg gctccctgga ctcctttctc cggcaaaacg acgggcagtt cacagccáec cagctggcgg gcasgcEEcg gggcatcgca gceggcatga agcacctggc agacatgaac taegttcacc gtgacccggc tgcccgcaac accctcgtca acagcaacct ggtctgcaag gtgtcggact ctgggccctc acgcttttcta gaggacgasa cctcagaccc cacctacacc agtgccctgg gcggaaagat ccccatccgc tggacagccc cggaagccac ccagtaccgg· aagttcaccc cggccagtga tgtgtggagc tacggcattg tcatgtggga ggtgatgncc taeggggagc ggcccEactg ggacatgacc aaccaggacg taatcaacgc cattgagcag gactatcggc

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640

tgccaccgcc aggaccgcaa gcaatcccaa tggaccgcac tcaagatggg tgtctcagat aaaaaaccct aggtttgaca acgtgccggc gggccacggg caaacgacgg aaatacaagg ggggataaaa tctctocaac caaatgcgaa cctcacccaa acccctctgg tggagagcat gaaaggggct catggactgc ecaccggccc cagccccaaa gatccccgac gcagtacaag gatgatggag gaacagtatc ttcacctgcc cctcctggtg aagaaccaag aaaaaaaaag aatattttet aagggcttgg tccctctggg ggggagagac caacoaagcg gaaaatctat tttagaaact tttgtcctcc ccgagcgccc aagttcggcc gccatggcgc tacaccagct gagagcttcg gacattctcc caggtgatgc tcggctcacc ctctatccac cggtgccagc ggaacgggaa aaagaggattt gagattcatg aaggtgacct aggggccgcc cctggaggac tcctgccacc ccaatgaaag tgggtcaggg tgcaccaact aaattgtcaa CCCtCtCCtC ttaacacggt ccaatgccgg gggttgggcs gggcgcagat tcttcotcca tgcagggcca cacgagacgt aaaagaaaac ctcataagga cgatgtgtcc ggccagagcc cttggctcct gggacagacg -gacagacagc actgggcaaa acactgtttc agaacgcggg catgctggac cacgctagac tggcatcaac agacgagtgg ctttacctcc cactttogct gaaccagacc agccccgccc gccactcgcc caecaagaaa agatcctggg aagcaacgac aatcggagac aagaaacact gtccctgctg cagaagaaEc tcctgttggc gaccccag

2700

2750

2320

2880

2940

3000

3060 ' 3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3768 <210> 2<211> 986 <212> PRT <213 > homo sapiens <400> 2

Met Ala Leu Arg Arg	Leu	Gly	Ala Ala	Leu Leu Leu Leu	Pro	Leu	Leu
1 5				10		15
Ala Ala Val Glu Glu	Thr	Leu	Met Asp	Ser Thr Thr Ala	Thr	Ala	Glu
20			25		30
Leu Gly Trp Met Val	His	Pro	Pro Ser	Gly Trp Glu Glu	Val	Ser	Gly
35			40	45
Tyr Asp Glu Asn Met	Asn	Thr	Ile Arg	Thr Tyr Gla Val	Cys	Asa	Val
50		55		60
Phe Glu Ser Ser Gin	Asn	Asn	Trp Leu	Arg Thr Lys Phe	Ile	Arg	Arg
65	70			75			80
Arg Gly Ala His Arg	Ile	His	Val Glu	Met Lys Phe Ser	Val	Arg	Asp
85				90		95
Cys Ser Ser Ile Pro	Ser	Val	Pro Gly	Ser Cys Lys Glu	Thr	Phe	Asn
100			105		110
Leu Tyr Tyr Tyr Glu	Ala	Asp	Phe Asp	Ser Ala Thr Lys	Thr	Phe	Pro
115			120	125
Asn Trp Met Glu Asn	Pro	Trp	Val Lys	Val Asp Thr Ile	Ala	Ala	Asp
130		135		140
Glu Ser Phe Ser Gin	Val	Asp	Leu Gly	Gly Arg Val Met	Lys	Ile	Asn
145	150			155			160
Thr Glu Val Arg Ser	Phe	Gly	Pro Val	Ser Arg Ser Gly	Phe	Tyr	Leu
165				170		17S
Ala Phe Gla Asp Tyr Gly Gly	Cys Met	Ser Leu Ile Ala	Val	Arg	Val
180			135		190
Phe Tyr Arg Lys Cys	Pro	Arg	Ile Ile	Gla Asn Gly Ala	Ile	Phe	Gla
195			200	205
Glu Thr Leu Ser Gly	Ala	Glu	Ser Thr	Ser Leu. Val Ala	Ala	Arg	Gly
210		215		220
Ser Cys Ile Ala Asn	Ala	Glu	Glu Val	Asp Val Pro Ile	Lys	Leu	Tyr
22S	23 0			235			240
Cys Asn Gly Asp Gly	Glu	Trp	Leu Val	Pro Ile Gly Arg	Cys	Met	Cys
245				250		255
Lys Ala Gly Phe Glu	Ala	Val	Glu Asn	Gly Thr Val Cys	Arg	Gly	Cys
260			265		270
Pro Ser Gly Thr Phe	Lys	Ala	Asn Gin	Gly Asp Glu Ala	Cys	Thr	His
275			280	285
Cys Pro Ile Asn Ser	Arg	Thr	Thr Ser	Glu Gly Ala Thr	Asa.	cys	Val
290		295		300

I

Cys

Arg

Asn

Gly

Tyr

Arg

Ala

Asp

Leu

Asp

Pro

Leu

Asp

Met

Pro

305

310

315

320

cys

Thr

Ile

Pro

Ser

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Ile

Ser

Val

Asn

325

330

335

Glu

Thr

Ser

Leu

Met

Leu

Glu

Trp

Thr

Pro

Arg Asp

Ser

Gly Gly

340

345

350

Arg

Glu

Asp

Leu

Val

Tyr

Asn

Ile

cys

Lys

Ser

Cys

Gly

Ser

Gly

355

360

365

Arg

Gly

Ala

Cys

Thr

Arg. Cys

Gly

Asp

Asn

Val

Gin

Tyr

Ala

Pro

Arg

3 70

375

330

Gin

Leu

Gly

Leu

Thr

Glu

Pro

Arg

Ile

Tyr

Ile

Ser

Asp

Leu

Ala

335

390

395

400

His

Thr

Gin

Tyr

Thr

Phe

Glu

Ile

Gin

Ala

Val

Asn

Gly

Val

Thr

Asp

405

410

415

Gin

Ser

Pro

Phe

Ser

Pro

Gin

Phe

Ala

Ser

Val

Asn

Ile

Thr

Asn

420

425

430

Gin

Ala

Pro

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

Met

His

Gin

Val

Ser

Arg

Thr

43 S

440

445

Val

Asp

Ser

Ile

Thr

Leu

Ser

Trp

Ser

Gin

Pro

Asp

Gin

Pro

Asn

Gly

450

455

460

Val

Ile

Leu

Asp

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Glu

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

455

470

475

430

Tyr

Asn

Ala

Thr

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Thr

Asn

Thr

Val

Thr

Val

Gin

485

490

495

Gly

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Tyr

Val

Phe

Gin

Val

Arg

Ala

Arg

Thr

500

505

510

Val

Ala

Gly Tyr

Gly Arg

Tyr

Ser

Gly

Lys

Mee

Tyr

Phe

Gin

Thr

Met

515

520

525

Thr

Glu

Ala

Glu

Tyr

Gin

Thr

Ser

Ile

Gin

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Ile

530

535

540

Ile

Gly

Ser

Ala

Gly

Leu

Val

Phe

Leu

Ile

Ala

Val

545

550

555

560

Ile

Ala

Ile

Val

Cys

Asn

Arg

Gly

Phe

Glu

Arg

Ala

Asp

Ser

Glu

565

570

575

Tyr

Thr

Asp

Lys

Leu

Gla

His

Tyr

Thr

Ser

Gly

His

Met

Thr

Pro

Gly

580

5BS

590

Met

Lys

Ile

Tyr

Ile

Asp

Pro

Phe

Thr

Tyr

Glu

Asp

Pro

Asn

Glu

Ala

595

600

605

Val

Arg

Glu

Phe

Ala

Lys

Glu

Ile

Asp

Ile

Ser

Cys

Val

Lys

Ile

Glu

610

615

620

Gin

Val

Ile

Gly

Ala

Gly

Glu

Phe

Gly

Glu

Val

Cys

Ser

Gly

His

Leu

625

630

635

640

Lys

Leu

Pro

Gly

Lys

Arg

Glu

Ile

Phe

Val

Ala

Ile

Lys

Thr

Leu

Lys

645

650

655

Ser

Gly

Tyr

Thr

Glu

Lys

Gin

Arg Arg

Asp

Phe

Leu

Ser

Glu

Ala

Ser

660

665

670

Ile

Met

Gly

Gla

Phe

Asp

His

Pro

Asn

Val

Ile

His

Leu

Glu

Gly

Val

675

680

685

Val

Thr

Lys

Ser

Thr

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Glu

Phe

Met

Glu

Asn

690

695

700

Gly

Ser

Leu

Asp

Ser

Phe

Leu

Arg

Gin

Asn

Asp

Gly

Gin

Phe

Thr

Val

705

710

715

720

Ile

Gin

Leu

Val

Gly

Met

Leu

Arg

Gly

Ile

Ala

Gly

Met

Lys

Tyr

725

730

735

Leu

Ala

Asp

Met

Asn

Tyr

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Arg

Asn

Ile

740

745

750

Leu

.Val

Asn

Ser

Asn

Leu

Val

Cys

Lys

Val

Ser

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

755

760

765

Arg

Phe

Leu

Glu

Asp

Thr

Ser

Asp

Pro

Thr

Tyr

Thr

Ser

Ala

Leu

770

775

780

Gly Gly

Lys

Ile

Pro

Ile

Arg Trp

Thr

Ala

Pro

Glu Ala

Ile

Gin

Tyr

785

790

795

800

Arg Lys

Phe

Thr

Ser

Ala

Ser Asp

Val

Trp

Ser

Tyr Gly

Ile

Val

Met

805

810

815

Trp Glu Val Met

Ser

Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Mec Thr Asn

820

825

830

Gin

Asp

Val

Ile

Asn

Ala

Ile

Glu

Gin

Asp

Tyr Arg

Leu

Pro

835

840

845

Mec

Asp

Cys

Pro

Ser

Ala

Leu

His

Gin

Leu

Met

Leu

Asp

Cys

Trp

Gin

8S0

855

860

Lys

Asp

Arg

Asn

His

Arg

Pro

Lys

Phe

Gly

Gin

Ile

Val

Asn

Thr

Leu

865

870

875

880

Asp

Lys

Met

Ile

Arg

Asn

Pro

Asn

Ser

Leu

Lys

Ala

Met

Ala

Pro

Leu

885

890

895

Ser

Gly

Ile

Asn

Leu

Pro

Leu

Asp

Arg

Thr

Ile

Pro

Asp

Tyr

900

905

910

Thr

Ser

Phe

Asn

Thr

Val

Asp

Glu

Trp

Leu

Glu

Ala

Ile

Lys

Met

Gly

915

920

925

Gin

Tyr

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala

Asn

Ala

Gly

Phe

Thr

Ser

Phe

Asp

Val

930

935

940

Val

Ser

Gin

Met

Glu

Asp

Ile

Leu

Arg

Leu

Gly

Val

Thr

Leu

945

950

955

960

Ala

Gly

His

Gin

Lys

Ile

Leu

Asn

Ser

Ile

Gin

Val

Met

Arg

Ala

965

970

975

Gin

Met

Asn

Gin

Ile

Gin

Ser

Val

Glu

Val

980

985

<210> 3 <211» 3949 <212» DNA <213» herno sapiens <4Q0> 3 gaattccgcc gctgccgctg gctgggctgg catgaacacg gctacggacc ttcggcgcgt cctctattac gaatccatgg gggtggccgo cggcttctac cttccaccga gggggctgag ggtggatgta gcgctgcatg tccatctggg cagccggacc agacctggac ttccagtgtc ccgagaggac cacccgctgc catttacatc cggcgttacE ccaggcagct taccctgtcg gtactatgag ggtcaccgtg cgtggcaggc gtaccagaca ggtcttcctc tgctgactcg catgaagatc tgccaaggaa tggcgaggtc caagacgctc caccacgggc ccgggaagcg ctcgccgccg atggtgcatc atccgcacgt aagtttatcc gactgcagca tatgaggctg gtgaaggtgg gtcatgaaaa ctggccttco aagtgccccc agcacatcgc cccatcaagc tgcaaagcag actttcaagg acttctgaag cccctggaca aatgagacct ctcgtctaca ggggacaatg agtgacctgc gaccagagcc ccatcggcag tggtcccagc aaggagctca cagggcctca Eacgggcgct agcatccagg attgctgtgg gagtacacgg tacatcgatc attgacatct tgcagtggcc aagtcgggct cagstcgacc cagccatggc tggaagaaac ctccatcagg accaggtgtg ggcgccgtgg gcacacccag actttgactc acaccatcgc tcaacaccga aggactatgg gcatcatcca tggtggctgc tctactgtaa gcEEcgaggc ccaaccaagg gggccaccaa tgccctgcac ccotcatgct aoaccaECEg tacagtacgc tggcccacac CCEECECgCC tgtccatcat cagaccagcc gtgagtacaa aagccggcgc acagcggcaa agaagttgcc ttgtcatcgc acaagctgca ccttcaccta cctgtgCcaa acctgaagct acacggagaa atcccaacgc tctgcggagg gotaatggac gtgggaagag caacgtgttt cgcccaccgc cgtgcccggc ggccaccaag agccgacgag ggtgcggagc cggccgcatg gaatggcgcc ccggggcagc cggggacggc cgttgagaac ggatgaggcc ctgtgtctgc aaccatcccc ggagcggacc caagagctgt accacgccag ccagtacacc tcagttcgcc gcatcaggtg caatggcgtg cgccacagcc catctaegtc gatgtacttc actcatcatc catcgtgtgt acacEacacc cgaggacccc aattgagcag gccaggcaag gcagcgccgg catccacctg cEgggggccg tccactacag gtgagtggct gagtcaagcc atccacgtgg toctgcaagg acottcccca agcttctccc ttcggacctg tocctcatcg atcttccagg tgcatcgcca gagtggctgg ggoaccgtct tgtacccact cgcaatggct tccgcgcccc cccccccgcg ggcccgggcc ctaggcctga EEcgagatcc totgtgaaca agccgcaccg atoatggacc ataaaaagcc teccaggcgc cagaccatga ggctcctcgg aacagacggg agtggccaca aacgaggcag gtgaccggag agagagarct gacttcctga gagggtgtcg cgctgctgct cgactgctga acgatgagaa agaacaactg agatgaagtt agaccttcaa actggatgga aggtggacct tgtcccgcag ccgtgcgtgt aaaccctgtc atgcggaaga tgcccaEcgg gccgaggttg gtcccatcaa actacagagc aggctgcgat actccggagg ggggtgcctg ccgagccacg aggctgEgaa tcaccaccaa cggacagcac atgagctgca ccaccaacac gggcacgcac cagaagccga ccgctggcct ggtttgagcg tgaccccagg tgcgggagtt caggggagtt ttgtggccat gcgaagcctc tgaccaagag so

120

180

240

300

360

420 480 540 600 660 720 780 840

900

960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 15001560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 ···» ·♦ • · · *· •* ** »» « · · cacacccgEg acgaccacca ccgagEEcaE ggagaacggc cccsEggacE crEEEctccg gcaaaacgac gggcagtcca cagtcatcca gcEggrgggc aogcEEcggg gcancgcagc eggcacgaag tacccggcag acacgaacta cgttcaccgt gacccggceg cscgcaacac ccccgtcaac agcaacccgg tcegeaaggc gtcggacttt gggcscccac gcoE-Eocaga ggacgacacc tcagacccca cccacaccag EgccoEcggc ggaaagaocc ccacccgccg gacagccccg gaagccatcc ageaccggaa gttcac==c= gccagcgacg tgzggagcca cggcaEcgEO acgcgggagg cgatgcccca tggggagcgg ccccactggg acacgaccaa ccaggacgca atcaatgcca EEgagcagga coaEcggctg ccaccgccca Cggactgccc gagcgccoog caccaactca tgccggacrg ecggeagaag gaccgcaacc acrggoocaa gcccggccaa atcgccaaca cgccagacaa gacgatscgc aaEcccaaca gccccaaagc Gacggcgccc ccccccectg gcaccaaccu gccgcEgcrg gaccgcacga Eccocgacoa caccagcEEC aacacggtgg acgagcggcE ggaggesats aagacggggc agnacaagga gagcEEogcc aacgccggcc EcaccEccEE tgacgtcgts Eoscagaoga tgacggagga cacccrcsgg gEEggggtca cEEEggctgg ccaccagaaa aaaaccccga acagcatcca ggcgacgcgg gcgcagatga accagatcca gtctgtggag ggccagccac ccgcsaggag gccacgggcc acgggaagaa ccaagcggtg ccagccacga gacgtcacca agaaaacatg caacEcaaac gacggaaaaa aaaagggaac gggaaaaaag aaaacagaec cegggagggg gcgggaaaca caaggaacaE Ettttaaaga ggatscxcac aaggaaagca acgaccgnnc togcggggga taaaaaaggg cttgggagat tcatgcgaeg tgcccaaccg gagacaaaag cagcccccct ccaacccccc ctgggaaggr gaccEggcca gagccaagaa acacctecag aaaaacaaac gogaagggga gagacagggg ccacccEEgg oEsoEgEccc EgcngcEccE cEaggccEca cccaacaacc aagcgcccgg aggacgcgac agacggacag acagccaccc Egagaaccco ccegggaaaa tccaescccg ccaccactgg gcaaacagaa gaaCEtEECE gcccccggag agraEEEEag aaacoccaaE gaaagacacE grEEcEccEg EEggctcaca gggccgaaag gggcEEEEgE ccECCEgggE cagggagaac gcggggaccc cagaaaggnc agccEEacEg aggatgggca acccccaggs cEgcagcEos aggoacaEaE cacgcgcaca gccEggcagc csggcccEcc Eggcgcccac Ecccgcsagc eesEgccEcg aggacrgaca cEgcagcgac Egccgccagc occgactgcc gcsgagaagg gEEgacecsg caccEgggoE EgtEEacagc aaccccEgga cEcgggggra EEEEggEcac agggrggcEE EggxEEaggg egeEEgECEg EEgggEEgEE EEECgEEEEE EggEEEEEEE EaaEgacaas gaagcgacac CEEgacaEEE ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa

2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2530 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3949 <210> 4 <21X> 1055 <212> PRT <213> homo sapiens <40Q> 4

MeE

Ala

Leu

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Pro

Lau

Leu

1

5

10

15

Ala

Val

Glu

Thr

Leu

MeE

Asp

Ser

Thr

Ala

Thr

Ala

Glu

20

25

30

Leu

Gly

Trp

MeE

Val

His

Pro

Ser

Gly

Tr?

Glu

Val

Ser

Gly

35

40

45

Ty?

Asp

Glu

Asn

MeE .

Asn

Thr

Ile

Arg

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

Asn

Val

50*

55

60

Phe

Glu

Ser

Gin

Asn

Trp

Leu

Arg

Th—

Lys

Phe

Ile

Arg

65

70

75

80

Arg

Gly

Ala

His

Arg

Ile

His

Val

Glu

Met

Lys

Phe

Ser

Val

Arg

Asp

35

90

95

Cys

Ser

Ile

Pro

Ser

Val

Pro

Gly

Ser

cys

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

100

105

110

Leu

Tyr

Glu

Ala

Asp

Phe

Asp

Ser

Ala

Thr

Lys

Thr

Phe

Pro

115

120

12S

Asn

Trp

MeE

Glu

Asn

Pro

Trp

Val

Lys

Val

Asp

Thr

Ile

Ala

Asp

130

135

140

Glu

Ser

Phe

Ser

Gin

Val

Asp

Leu

Gly Gly Am

Val

MeE

Lys

Ile

Asn

145

150

155

160

Thr

Glu

Val

Arg

Ser

Phe

Gly

Pro

Val

Ser

Arg

Ser

Gly

Phe

Tyr

Leu

165

170

175

Ala

Phe

Gin

Asp

Tyr Gly Gly Cys

Met

Ser Leu

Ile

Ala

Val

Arg-

Val

180

ias

190

Phe

Tyr

Arg

Lys

Cys

Pro Arg Ile

Ile

Gin Asn Gly Ala

Ile

Phe

Gin.

155 200 205 ··!· ·9 ♦ ·

Glu

Thr Leu Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ser Leu Val Ala Ala Arg· Gly

210

215

220

Ser

Cys

Ile

Ala

Asn

Ala

Glu

Val

Asp

Val

Pro

Ile

Lys

Leu

Tyr

225

230

235

240

Cys

Asn

Gly Asp

Gly

Glu

Trp

Leu

Val

Pro

Ile

Gly Arg

Cys

Met

Cys

245

250

255

Lys

Ala

Gly

Phe

Glu

Ala

Val

Glu

Asn

Gly

Thr

Val

Cys

Arg

Gly

Cys

260

265

270

Pra

Ser

Gly

Thr

Phe

Lys

Ala

Asn

Gin

Gly Asp

Glu

Ala

cys

Thr

His

275

280

285

Cys

Pro

Ile

Asn.

Ser

Arg

Thr

Ser

Glu

Gly

Ala

Thr

Asn

cys

Val

290

295

300

Cys

Arg

Asn

Gly-Tyr

Tyr

Arg

Ala

Asp

Leu

Asp

Pro

Leu

Asp

Met

Pro

305

310

315

320

Cys

Thr

Ile

Pro

Ser

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Ile

Ser

Val

Asn

325

330

335

Glu

Thr

Ser

Leu

Met

Leu

Glu

Trp

Thr

Pro

Arg

Asp

Ser

Gly

340

345

350

Arg

Glu

Asp

Leu

Val

Tyr

Asn

Ile

Cys

Lys

Ser

Cys

Gly

Ser

Gly

355

360

365

Arg·

Gly

Ala

Cys

Thr

Arg

Cys

Gly

Asp

Asn

Val

Gin

Tyr

Ala

Pro

Arg

370

375

380

Gin

Leu

Gly

Leu

Thr

Glu

Pro

Arg

Ile

Tyr

Ile

Ser

Asp

Leu

Ala

385

390

395

400

His

Thr

Gin

Tyr

Thr

Phe

Glu

Ile

Gin

Ala

Val

Asn

Gly

Val

Thr

Asp

405

410

415

Gin

Ser

Pro

Phe

Ser

Pro

Gin

Phe

Ala

Ser

Val

Asn

Ile

Thr

Asn

420

425

430

Gin

Ala

Pro

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

Met

His

Gin

Val

Ser

Ar?

Thr

435

440

445

Val

Asp

Ser

Ile

Thr

Leu

Ser

Trp

Ser

Gin

Pro

Asp

Gin

Pro

Asn

Gly

450

455

460

Val

Ile

Leu

Asp

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Glu

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

465

470

475

480

Tyr

Asn

Ala

Thr

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Thr

Asn

Thr

Val

Thr

Val

Gin

485

490

495

Gly

Leu

Lys

Ala

Gly

Ala

Ile

Tyr

Val

Phe

Gin

Val

Arg

Ala

Arg

Thr

500

505

510

Val

Ala

Gly

Tyr

Gly Arg

Tyr

Ser

Gly

Lys

Met

Tyr

Phe

Gin

Thr

Met

51S

520

525

Thr

Glu

Ala

Glu

Tyr

Gin

Thr

Ser

Ile

Gin

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Ile

530

53S

540

Ile

Gly

Ser

Ala

Gly

Leu

Val

Phe

Leu

Ile

Ala

Val

545

550

555

560

Ile

Ala

Ile

Val

Cys

Asn

Arg

Gly

Phe

Glu

Arg

Ala

Asp

Ser

Glu

565'

570

575

Tyr

Thr

Asp

Lys

Leu

Gin

His

Tyr

Thr

Ser

Gly

His

Met

Thr

Pro

Gly

580

585

590

Met

Lys

Ile

Tyr

Ile

Asp

Pro

Phe

Thr

Tyr

Glu

Asp

Pro

Asn

Glu

Ala

S95

600

605

Val

Arg

Glu

Phe

Ala

Lys

Glu

Ile

Asp

Ile

Ser

Cys

Val

Lys

Ile

Glu

610

615

620

Gin

Val

Ile

Gly

Ala

Gly

Glu

Phe

Gly

Glu

Val

Cys

Ser

Gly

His

Leu

625

630

635

540

Lys

Leu

Pro

Gly

Lys

Arg

Glu

Ile

Phe

Val

Ala

Ile

Lys

Thr

Leu

Lys

645

650

655

Ser

Gly Tyr

Thr

Glu

Lys

Gin

Arg

Ar?

Asp

Phe

Leu

Ser

Glu

Ala

Ser

660

665

670

Ile

Met

Gly

Gin

Phe

Asp

His

Pro

Asn

Val

Ile

His

Leu

Glti

Gly

Val

675

680

685

Val

Thr

Lys

Ser

Thr

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Glu

Phe

Meh

Glu Asn

690

695

700

Gly

Ser

Leu

Asp

Ser

Phe

Leu

Ar?

Gin.

Asn.

Asp

Gly

Gin.

Phe

Thr

Val

705

710

715

720

«··· ··

•	*«
··	•	•
•	•	•
•	•	• *
•	•	Φ
···	··

··	•
•	♦	··
• ·	•
•	•	•
•	♦	•
··	• 9»

Ile

Gin Leu Val

Gly 725

Met

Leu

Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr

73 0

735

Leu

Ala

Asp

Met 740

Asn

Tyr

Val

His

Arg 745

Asp

Leu

Ala

Arg 7S0

Asn

XI e

Leu

Val

Asn 755

Ser

Asn

Leu

Val

Cys 750

Lys

Val

Ser

Asp

Phe 755

Gly

Leu

Ser

Arg

Phe 770

Leu

Glu

Asp

Thr 775

Ser

Asp

Pro

Thr

Tyr 780

Thr

Ser

Ala

Leu

Gly Gly 785

Lys

Ile

Pro

Ile 790

Arg

Trp

Thr

Ala

Pro 795

Glu

Ala

Ile

Gin

Tyr 800

Arg

Lys

Phe

Thr

Ser 805

Ala

Ser

Asp

Val

Trp 810

Ser

Tyr

Gly

Ile

Val 815

Met

Trp

Glu

Val

Met 820

Ser

Tyr

Gly

Glu

Arg 825

Pro

Tyr

Trp

Asp

Met 830

Thr

Asn

Gin

Asp

Val 835

Ile

Asn

Ala

Ile

Glu 840

Gin

Asp

Tyr Arg

Leu 845

Pro

Met

Asp 850

Cys

Pro

Ser

Ala

Leu 855

His

Gin

Leu

Met

Leu 850

Asp

cys

Trp.

Gin

Lys 865

Asp

Arg

Asn

His

Arg 870

Pro

Lys

Phe

Gly

Gin 875

Ile

Val

Asn

Thr

Leu 880

Asp

Lys

Met

Ile

Arg 885

Asn

Pro

Asn

Ser

Leu 890

Lys

Ala

Met

Ala

Pro 895

Leu

Ser

Gly

Ile 900

Asn

Leu

Pro

Leu

Leu 905

Asp

Arg

Thr

Ile

Pro 910

Asp

Tyr

Thr

Ser

Phe 915

Asn

Thr

Val

Asp

Glu 920

Trp

Leu

Glu

Ala

Ile 925

Lys

Met

Gly

Gin

Tyr 930

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala 935

Asn

Ala

Gly

Phe

Thr 940

Ser

Phe

Asp

Val

Val 945

Ser

Gin

Met

Met 950

Glu

Asp

Ile

Leu

Arg 955

Val

Gly

Val

Thr

Leu 950

Ala

Gly

His

Gin

Lys 955

Lys

Ile

Leu

Asn

Ser 970

Ile

Gin

Val

Met

Arg 975

Ala

Gin

Met

Asn

Gin 980

Ile

Gin

Ser

Val

Glu 985

Gly

Gin

Pro

Leu

Ala 990

Arg

Pro

Arg

Ala 995

Thr

Gly Arg

Thr

Lys Arg 1000

Cys

Gin

Pro

Arg Asp 1005

Val

Thr

Lys

Lys Thr 1010

Cys

Asn

Ser

Asn Asp 1015

Gly

Lys

Lys Gly 1020

Met

Gly

Lys

Lys Lys 1025

Thr

Asp

Pro

Gly Arg Gly 1030

Arg

Glu

Ile Gin Gly 1035

Ile

Phe

Phe 104

Lys

Glu

Asp

Ser

His Lys 1045

Glu

Ser

Asn

Asp Cys 1050

Ser

cys

Gly Gly 1055

<210 > 5 <211> 9 <212> PRT <213 > Artificial Seauence <400> 5

Met Met Met Glu.. Asp Ile Leu Arg- Val 1 5 <210 > 6 <211» 9 <212 > PRT <213 Artificial Sequence <400 > S

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala Val 1 S <210> 7 <211> 9

• ···	··	•	·· «·	•
• ♦	•	··	• · » «	• ·
• ·		•	• · · *	•
56 ·.	• · •	• •	• · · · 9 f · · ·	• •
·♦	·«	···	♦ ♦ ··	999

	<212> PRT <213 > Artificial Sequence
	<400»	7
Gly	Leu Thr	Glu Pro Arg Ile Tyr	Ile
1		S
	<210»	s
	<211»	9
	<212»	PRT
	<213»	Artificial Sequence
	<400»	8
Arg	Gin Asn	Asp Gly Gin Phe Thr	Val
1		5
	<210»	9
	<211»	9
	<212»	PRT
	<213»	Artificial Sequence
	<400»	9
Thr	Leu Met	Asp Ser Thr Thr Ala	Thr
1		5
	<210»	10
	<211»	9
	<212»	PRT
	<213»	Artificial Sequence
	<400»	10
Lys	Leu Pro	Gly Arg Glu Ile Phe	Val
1		5
	<210»	11
	<211»	9
	<212»	PRT
	<213»	Artificial Sequence
	<400»	11
Leu.	Leu Leu	Leu Leu Leu Ala Ala	Val
1		5
	<210»	12
	<211»	9
	<212»	PRT
	<213»	Artificial Sequence
	<400»	12
Gin	Met Met	Met Asp Ile Leu Arg	Val
1		S

<210> 13 <•211 > 9 <212» PRT <213» Artificial Sequence <400» 13

Trp Ser Tyr Gly Val Meč Trp Glu. Val

5 <210> 14 <21X» 9 <212» PRT

♦ ·· * «« ♦ · · · · · · · > • · · · · · * j -S7-ÍÍÍ· ·····♦ w / * · · · ·«· · · ·♦ ·· ··· ·· ·*

<213> Artificial Sequence <400> 14

Phe Leu Ile Ala Val Val Ile Ala Ile

	s
Novel Uses	nová použití
Artificial Sequence	uměle vytvořená sekvence

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY • · ♦ · ·

1. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci s alespoň 85% identitou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo jejím imunogenním fragmentem, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e aminokyselinová sekvence má alespoň 95% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo jejím imunogenním fragmentem.
3. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci s alespoň 85% identitou s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No. 1, 3 nebo jejím fragmentem, který kóduje imunogenní peptid, spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
4. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství buněk prezentujících antigen modifikovaných vnesením polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4 in vitro, nebo geneticky modifikovaných in vitro pro expresi polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4, a farmaceuticky přijatelný nosič.
5. Vakcína podle některého z nároků 1až4, vyznačující se tím, že navíc obsahuje adjuvans indukující odpověď TH-1.

• ·
6. Vakcína podle nároku 5, tím, ž e adjuvans indukující odpověď TH-1 je zvoleno ze skupiny adjuvans zahrnující: 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterolu, a oligonukleotid CpG.
7. Protilátka imunospecifická pro polypeptid nebo imunologický fragment definovaný v některém z nároků 1 až 6.
8. Způsob screeningu pro identifikaci sloučenin, které stimulují nebo které inhibují funkci polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4, vyznačující se tím, že zahrnuje způsob zvolený z následující skupiny:

(a) měří se vazba testované sloučeniny na uvedený polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein pomocí značky, která je přímo nebo nepřímo asociována s testovanou sloučeninou;

(b) měří se vazba testované sloučeniny na uvedený polypeptid (nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid) nebo jeho fúzní protein v přítomnosti značeného kompetitoru;

(c) testuje se, zda testovaná sloučenina poskytne signál vytvořený aktivací nebo inhibici uvedeného polypeptidu, s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky nebo buněčné membrány nesoucí polypeptid;

(d) testovaná sloučenina se mísí s roztokem obsahujícím polypeptid SEQ ID No. 2 nebo 4 za vytvoření směsi, měří se aktivita polypeptidu ve směsi a aktivita směsi se porovná se standardem; nebo

- 60.

···· φ* • φ φ φ

- · · φ φ φ • φ ·· φφφ (e) detekuje se účinek testované sloučeniny na produkci mRNA kódující uvedený polypeptid a uvedený polypeptid v buňkách, s použitím například testu ELISA.
9. Způsob léčení pacienta imunoprofylaxí nebo terapií zahrnující indukci imunitních odpovědí na molekulu kterékoli ze SEQ ID No. 1 až 4 in vitro, s použitím inkubace in vitro polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4, nebo polynukleotidu SEQ ID No. 1 nebo 3, s buňkami imunitního systému savce, a zpětnou infuzi těchto aktivovaných imunitních buněk do savce pro léčení onemocnění.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se provádí léčení rakoviny vaječníků nebo tlustého střeva.
11. Agonista nebo antagonista polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4.
12. Sloučenina, kterou je:

(a) agonista nebo antagonista polypeptidu SEQ ID No. 2 nebo 4;

(b) izolovaný polynukleotid SEQ ID No. 1 nebo 3; nebo (c) molekula nukleové kyseliny, která moduluje expresi nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle některé ze sekvencí SEQ ID No. 2 nebo 4;

pro použití v lékařství.
13. Způsob diagnózy onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění u pacienta souvisejících s expresí nebo aktivitou polypeptidu

SEQ ID No. 2 nebo 4 u pacienta, který zahrnuje analýzu přítomnosti nebo množství uvedeného polypeptidu ve vzorku odvozeném z uvedeného pacienta.

···· ·* • * · * <» ·· ♦· · · * ₉ • • · 61 t · « - · · · · • · · · · • · · t · · • • · · 4 • · > · » • ·· ·· 999 ·· «φ «W·
14. Způsob diagnózy onemocnění nebo vnímavosti k onemocnění u pacienta souvisejících s expresí nebo aktivitou polynukleotidu SEQ ID No. 1 nebo 3 u pacienta, který zahrnuje analýzu přítomnosti nebo množství uvedeného polynukleotidu ve vzorku odvozeném z uvedeného pacienta.
15. Způsob podle nároku 13, kde uvedeným onemocněním je rakovina tlustého střeva.
16. Způsob podle nároku 14, kde uvedeným onemocněním je rakovina tlustého střeva.