ES2238026T3 - Uso de polipeptidos casb616 y polinucleotidos para tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de cáncer de ovario o cáncer de colon, en el que el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o para un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

Description

Uso de polipéptidos CASB616 y polinucleótidos para tratamiento de cáncer.

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos (aquí denominados polipéptido(s) "CASB616" en el tratamiento de cáncer de ovario o cáncer de colon.

Se ha descubierto que CASB616 codifica un polipéptido que pertenece a la familia más numerosa de proteínas tirosina-quinasas asociadas a receptores, las EPH y los receptores relacionados con EPH. CASB616 se conoce también como EPHB2 (otras denominaciones: EBHB2, ERK, EPH3, EPHT3, DRT, HEK5) y EPHB2v.

Las EPH y los receptores relacionados con EPH han sido implicados en la mediación de eventos del desarrollo embrionario, en particular en el sistema nervioso. Los receptores en la subfamilia Eph típicamente tienen un único dominio asociado a quinasa y una región extracelular que contiene un dominio rico en Cys y 2 repeticiones de fibronectina de tipo III. Los ligandos de los receptores Eph han recibido la denominación de efrinas por el Comité de Nomenclatura de Eph (Cell 90:403-404, 1997; PubMed ID: 9267020). Sobre la base de sus estructuras y de las relaciones entre sus secuencias, las efrinas se dividen en efrinas de clase A (EFNA), que son efrinas ancladas a membrana por medio de una unión de glicosilfosfatidilinositol, y en efrinas de clase B (EFNB), que son proteínas de transmembrana. La familia Eph de receptores se dividen en dos grupos basados en la similitud de las secuencias de sus dominios extracelulares y en sus afinidades de unión a ligandos efrinas A y efrinas B. El Comité de Nomenclatura de Eph (1997) propuso que los receptores Eph que interaccionan preferentemente con proteínas efrinas A recibieran la denominación de EphA y que los receptores relacionados con Eph que interaccionan preferentemente con proteínas efrinas B recibieran la denominación de EphB.

Kiyokawa y col., (Cancer Research, 1994, 54:3645-3650) describen una secuencia de cDNA de ERK humana e informan sobre su distribución en tejidos. Iwase y col., (Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993, 194, 698-705) describen la clonación de genes erk de proteínas tirosina-quinasas, y sugieren el papel potencial de este gen en la embriogénesis y en la carcinogénesis de estómago.

El documento WO 00/30673 trata sobre agonistas y antagonistas de receptores Eph.

Ikegaki y col. (Hum. Molec. Genet. 4:2033-2045, 1995) mapearon el gen DRT, el gen de EPHB2, en 1p36.1-p35, mediante escrutinio por PCR de grupos híbridos de células somáticas de seres humanos/roedores y mediante hibridación in situ con fluorescencia. Debido a que el extremo distal de 1p suele estar delecionado en los neuroblastomas, el gen DRT puede desempeñar un papel en la tumorigénesis del neuroblastoma y del carcinoma de células pequeñas de pulmón (SCLC) (del inglés, " Small Cell Lung Carcinoma").

Fox Gary y col. (Oncogen, 1995, 10, 897-905) informan sobre la clonación del cDNA y la distribución en tejidos de varios genes, entre ellos el gen HEK5 y sobre su abundante expresión en células normales de tiroides, en células normales de colon y en células tumorales.

Mediante hibridación in situ con fluorescencia, Saito y col. (Genomics 26:382-384, 1995, PubMed ID:7601466) demostraron que el gen ERK está localizado en la región cromosómica 1p36.1. Estos autores mostraron que los genes homólogos están localizados en 4D2.2-D3 en ratón y en 5q36.13 en rata, ambas de las cuales son regiones con una homología de ligamiento conservada en relación con la región cromosómica 1p humana.

La invención se refiere al uso de anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos CASB616 según se describe con mayor detalle a continuación. La invención se refiere especialmente al uso de anticuerpos inmunoespecíficos para un polipéptido CASB616 codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3 o para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4.

Se cree que los polipéptidos y polinucleótidos CASB616 son inmunógenos importantes para una inmunización profiláctica o terapéutica específica contra tumores, debido a que se expresan de manera específica o se sobreexpresan a un nivel alto en tumores en comparación con células normales y pueden por ello ser elegidos como objetivo de mecanismos inmunitarios específicos de antígeno que conducen a la destrucción de las células tumorales. También se pueden utilizar para diagnosticar la presencia de células tumorales. Además, la expresión inapropiada de estos polipéptidos y polinucleótidos en determinadas circunstancias puede causar una inducción de respuestas inmunitarias inapropiadas y de respuestas autoinmunitarias, que se podrían corregir por medio de una vacunación apropiada usando los mismos polipéptidos o polinucleótidos. Con relación a esto, las actividades biológicas más importantes para los fines de la invención son las actividades antigénicas e inmunogénicas del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de la presente invención también puede exhibir al menos otra actividad biológica de un polipéptido CASB616, que podría cualificarlo como objetivo de intervenciones terapéuticas o profilácticas diferentes de las relacionadas con la respuesta inmunitaria.

En un primer aspecto de la invención se proporcionan usos de anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos CASB616.

La invención proporciona también usos de anticuerpos inmunoespecíficos para fragmentos inmunogénicos de un polipéptidos CASB616, es decir, de una porción contigua del polipéptido CASB616 que tiene la misma, o sustancialmente la misma, actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. Es decir, el fragmento (en caso necesario acoplado a un vehículo) es capaz de inducir una respuesta inmunitaria que reconoce al polipéptido CASB616. Ese fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido CASB616 que carece de secuencia conductora N-terminal, y/o de un dominio de transmembrana, y/o de un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de CASB616 comprende sustancialmente la totalidad del dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, muy preferiblemente una identidad de al menos el 97%-99%, con respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 4 a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO: 2 ó 4 respectivamente.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente igual a una parte pero no a la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de un polipéptido CASB616 según aquí se describe. Al igual que sucede con los polipéptidos CASB616, los fragmentos pueden ser "independientes", o pueden estar comprendidos en un polipéptido de mayor tamaño del que constituyen una parte o región, muy preferiblemente como una sola región continua en un polipéptido único más grande.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos truncados que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 o de una de sus variantes, tales como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino terminal y/o carboxi terminal. También son preferidas las formas resultantes de degradación de los polipéptidos de la invención, producidas por una célula hospedadora o producidas en ella. Son más preferidos los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden barriles beta, regiones de alfa-hélice y regiones formadoras de alfa-hélice, regiones de lámina beta y regiones formadoras de lámina beta, giros y regiones formadoras de giros, enrollamientos y regiones formadoras de enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficies, región de unión a sustratos y regiones de alto índice antigénico.

Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos procedentes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos, truncados o delecionados, procedentes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4.

Son particularmente preferidas las variantes en las que varios aminoácidos, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 se encuentran sustituidos, delecionados o adicionados en una combinación cualquiera.

Los polipéptidos o los fragmentos inmunogénicos pueden estar en la forma de la proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína más grande, tal como una proteína precursora o una proteína de fusión. Suele ser ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o secuencias conductoras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional responsable de la estabilidad durante la producción recombinante. Además, se considera también la adición de una cola polipeptídica o lipídica o de secuencias polinucleotídicas para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

Los polipéptidos se pueden preparar de cualquiera de las maneras adecuadas. Estos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados presentes en la naturaleza, polipéptidos producidos mediante técnicas recombinantes, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos métodos. Los medios para preparar estos polipéptidos son muy conocidos en la técnica.

La presente invención incluye también variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir, polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que un residuo es sustituido por otro residuo con características similares. Las sustituciones típicas tienen lugar entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o entre los residuos aromáticos Phe y Tyr.

En un aspecto más, la presente invención se refiere a los usos de anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos codificados por un polinucleótido que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 ó 3 que incluye un gen de longitud completa, o una de sus variantes.

Usando la información que aquí se proporciona, tal como la información sobre una secuencia polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1 ó 3, se puede obtener un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido CASB616 usando métodos estándar de clonación y escrutinio, a partir de una genoteca de cDNA derivada de mRNA de células de tejidos humanos de cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de útero y de tejidos fetales humanos. Las técnicas adecuadas se encuentran descritas en Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989). También se pueden obtener polinucleótidos como los que se describen en la invención a partir de fuentes naturales tales como genotecas de DNA genómico, o se pueden sintetizar usando técnicas muy conocidas y que se encuentran comercialmente disponibles.

Además, la secuencia de DNA expuesta en SEQ ID NO: 1 ó 3 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácido expuesto en SEQ ID NO: 2 ó 4, con un peso molecular deducido que se puede calcular usando los valores de los pesos moleculares de los residuos de aminoácidos, muy conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de SEQ ID NO: 1, entre el codón de iniciación situado en el nucleótido número 105 y el codón de terminación que comienza en el nucleótido número 3.066 de SEQ ID NO: 1, codifica el polipéptido de SEQ

\hbox{ID NO: 2.}

El polinucleótido de SEQ ID NO: 3, entre el codón de iniciación situado en el nucleótido número 26 y el codón de terminación que comienza en el nucleótido número 3.191 de SEQ ID NO: 3, codifica el polipéptido de SEQ ID

\hbox{NO: 4.}

Un polinucleótido que codifica un polipéptido, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de escrutar una genoteca adecuada en condiciones rigurosas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45ºC-65ºC y una concentración de SDS de 0,1%-1%) con una sonda marcada o detectable que consiste en, o que comprende, la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 3 o uno de sus fragmentos; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido CASB616 de SEQ ID NO: 2 ó 4 puede ser idéntica a la secuencia que codifica un polipéptido contenida en los nucleótidos del 105 al 3.068 de SEQ ID NO: 1, o a la secuencia que codifica un polipéptido contenida en los nucleótidos del 26 al 3.193 de SEQ ID NO: 3, respectivamente. Como alternativa, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degenaración) del código genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 4.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" según aquí se utiliza, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, en particular un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 ó 4. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o que incluyen regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, por una secuencia de inserción integrada, por una secuencia de un vector integrada, por una secuencia de un transposón integrada, o debidos la edición del RNA o a la reorganización del DNA genómico) junto con regiones adicionales; también puede contener secuencias codificadoras y/o secuencias no codificadoras.

La invención se refiere también a variantes de los polinucleótidos que aquí se describen, que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO: 2 ó 4. Se pueden utilizar fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

También son realizaciones particularmente preferidas los polinucleótidos que codifican variantes de CASB616, que tienen la secuencia de aminoácidos de un polipéptido CASB616 de SEQ ID NO: 2 ó 4, en la que algunos residuos de aminoácidos, no muchos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ninguno, están sustituidos, modificados, delecionados y/o adicionados, en una combinación cualquiera. Entre éstas son especialmente preferidas las sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades ni las actividades de un polipéptido CASB616.

Son realizaciones preferidas los polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un DNA de SEQ ID NO: 1 ó 3.

Una región codificadora de un gen de CASB616 se puede aislar mediante escrutinio, usando una secuencia de DNA proporcionada en SEQ ID NO: 1 ó 3 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención, se utiliza luego para escrutar una genoteca de cDNA, de DNA genómico o de mRNA, para determinar con qué miembros de la genoteca se hibrida la sonda.

Existen varios métodos disponibles y que son muy conocidos por los expertos en la técnica, para obtener los DNA de longitud completa, o DNA cortos extendidos, por ejemplo los basados en el método de la Amplificación Rápida de Extremos de cDNA (RACE) (Véase, por ejemplo, Frohman y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ilustradas mediante la tecnología de Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de cDNA más largos. En la tecnología de Marathon™, los cDNA se preparan a partir de mRNA extraído de un tejido determinado, y una secuencia de un "adaptador" se liga en cada uno de los extremos. Se lleva luego a cabo una amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del DNA, usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen y específicos para el adaptador. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "internos", es decir, cebadores diseñados para reasociarse dentro del producto amplificado (típicamente, un cebador específico para el adaptador que se reasocia más en 3' en la secuencia del adaptador, y un cebador específico del gen que se reasocia más en 5' en la secuencia del gen seleccionado). Los productos de esta reacción se pueden luego analizar mediante secuenciación del DNA y se puede entonces construir un DNA de longitud completa, ya sea uniendo directamente el producto al DNA existente para obtener una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR independiente de longitud completa usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador en 5'.

La invención también proporciona usos de anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos codificados por polinucleótidos, en los que el polipéptido es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino terminales o carboxil-terminales, o más aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Esas secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde la forma precursora hasta la forma madura, pueden permitir el transporte de la proteína, pueden alargar o acortar la semivida de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína durante su análisis o su producción, entre otras cosas. Al igual que en el caso de lo que generalmente sucede in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden separar de la proteína madura durante el procesamiento por acción de enzimas celulares.

Una proteína precursora, que lleva una forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se separan, esos precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden separar antes de la activación. Generalmente, esos precursores se denominan proproteínas.

Se pueden preparar polipéptidos recombinantes mediante procedimientos muy conocidos en la técnica a partir de células hospedadoras manipuladas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión.

En la producción recombinante, las células hospedadoras se pueden manipular por ingeniería genética para que incorporen sistemas de expresión, o porciones de los mismos, de los polinucleótidos de la presente invención. La introducción de polinucleótidos en células hospedadoras se puede efectuar mediante métodos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio tales como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology (1986), y Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Esos métodos preferidos incluyen, por ejemplo, la transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, introducción mediante raspado de la membrana celular (del inglés, "scrape loading"), introducción balística o infección.

Las proteínas preferiblemente se coexpresan con tiorredoxina en trans (TIT) (del inglés, " Thioredoxin In Trans"). Se prefiere la coexpresión de la tiorredoxina en trans frente a la coexpresión de la tiorredoxina en cis para mantener el antígeno libre de tiorredoxina sin necesidad de una proteasa. La coexpresión con tiorredoxina facilita la solubilización de las proteínas de la invención. La coexpresión con tiorredoxina tiene también un impacto importante sobre el rendimiento de la purificación de la proteína, sobre la solubilidad de la proteína purificada y sobre su calidad.

Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levaduras y células de Aspergillus; células de insectos, tales como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; células animales, tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales.

Se pueden usar una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episómicos y sistemas derivados de virus, p. ej. vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos de cromosomas de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tal como el SV40, del virus de la viruela vacuna, adenovirus, poxvirus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagómidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan al mismo tiempo que engendran la expresión. De manera general, se puede utilizar cualquier sistema o vector que es capaz de mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en un hospedador. La secuencia de nucleótidos apropiada se puede insertar en el sistema de expresión por medio de cualquiera de las diversas técnicas de rutina conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, (supra). Se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido deseado para permitir la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas en relación con el polipéptido, o pueden ser señales heterólogas.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus vivo recombinante o de una bacteria viva recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a una expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunitarias. Virus y bacterias usadas con este fin son por ejemplo: poxvirus (p. ej., virus de la viruela vacuna, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana) adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus) herpesvirus (virus de la varicela zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o pueden haber sido atenuados de diferentes maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Estas vacunas vivas también forman parte de la invención.

Los polipéptidos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos muy conocidos que incluyen la precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción en ácido, cromatografía de intercambio aniónico o de intercambio catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatrografía sobre hidroxilapatito y cromatografía en presencia de lectinas. Muy preferiblemente, la cromatografía de afinidad sobre iones metálicos (IMAC) se utiliza para la purificación. Se pueden utilizar técnicas muy conocidas de replegado de proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.

Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos o sus análogos, o las células que los expresan, se pueden también usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para polipéptidos de la presente invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos presentan una afinidad sustancialmente mayor por los polipéptidos de la invención que la afinidad que presentan por otros polipéptidos relacionados de la técnica anterior.

En un aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido según la invención o para uno de sus fragmentos inmunológicos según se han definido en lo que antecede. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Se pueden obtener anticuerpos generados contra polipéptidos de la presente invención administrando los polipéptidos o fragmentos, análogos o células que portan lo epítopos, a un animal, preferiblemente a un animal no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica de los hibridomas (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497), la técnica de los triomas, la técnica de hibridomas con células B humanas (Kozbor y col., Immunology Today (1983) 4:72) y la técnica de hibridomas con EBV (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc. 1985).

También se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios, tales como las descritas en la Patente de EE.UU. Núm. 4.946.778, para producir anticuerpos monocatenarios dirigidos contra polipéptidos de esta invención. Así mismo, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos anteriormente descritos se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar los polipéptidos mediante cromatografía de afinidad.

El anticuerpo de la invención también se puede emplear para prevenir o tratar cáncer de ovario y cáncer de colon.

"Aislada" significa alterada con respecto al estado natural "por la mano del hombre". Si una composición o sustancia "aislada" está presente en la naturaleza, ha sido cambiada o separada de su entorno habitual, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en la naturaleza en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales con los que coexiste en su estado natural, está "aislado", según se aplica aquí el término.

"Polinucleótido" en general se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificados, o RNA o DNA modificados, que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que conserva sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido de referencia diferente de él. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analizará más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia diferente de él. Generalmente, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en conjunto y, en muchas regiones, son idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, en una combinación cualquiera. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede ser o no un residuo codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o de un polipéptido puede ser una variante presente en la naturaleza tal como una variante alélica, o puede ser una variante de la que no se tiene conocimiento de que se encuentre en la naturaleza. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos no presentes en la naturaleza se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis dirigida.

"Identidad", según se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o entre dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada mediante comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de parentesco de las secuencias entre secuencias polipeptídicas o secuencias polinucleotídicas, según sea el caso, determinado mediante la coincidencia entre cadenas de esas secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, que incluyen, pero que no se limitan a ellos, los métodos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., redactores, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., redactores, Academic Press, Nueva York, 1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., redactores, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., redactores, M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias examinadas. Métodos para determinar la identidad y la similitud se encuentran codificados en programas de ordenador de disponibilidad pública. Los métodos preferidos de programas de ordenador, para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a ellos, el paquete de programas GCG (Devereaux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN Y FASTA (Atschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990). El programa BLAST X se encuentra a disposición pública procedente de NCBI y de otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH

\hbox{Bethesda,}

MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol., Biol. 215:403-410 (1990). El conocido algoritmo de Smith Waterman se puede también utilizar para determinar la identidad.

El algoritmo usado preferido es FASTA. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas usando este algoritmo incluyen los siguientes:

Penalización por salto: 12

Penalización por extensión del salto: 4

Tamaño de palabra: 2, máximo 6.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias polipeptídicas con otros métodos incluyen los siguientes:

1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992).

Penalización por salto: 12

Penalización por longitud del salto: 4

Un programa útil con estos parámetros se encuentra a disposición pública como el programa "gap" procedente de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de polipéptidos (junto con la no penalización por saltos en los extremos).

Los parámetros preferidos para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970).

	Matriz de comparación:	coincidencias = +10,
		no coincidencias = 0

Penalización por salto: 50

Penalización por longitud del salto: 3

Un programa útil con estos parámetros se encuentra a disposición pública como el programa "gap" procedente de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de polinucleótidos.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, que es ser idéntica en el 100%, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Esas alteraciones se seleccionan entre el grupo que consiste en la deleción de al menos un nucleótido, sustitución de al menos un nucleótido, incluyendo transición y transversión, o inserción de al menos un nucleótido, y en el que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones 5' terminal o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en un lugar cualquiera entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 por el porcentaje numérico del respectivo porcentaje de identidad (dividido entre 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y)

en donde n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, e y es, por ejemplo, 0,70 en el caso del 70%, 0,80 en el caso del 80%, 0,85 en el caso del 85%, 0,90 en el caso del 90%, 0,95 en el caso del 95%, etc., y en donde todo producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea por abajo al número entero más cercano antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, mutaciones erróneas o mutaciones por desplazamiento delmarco de lectura en esta secuencia codificadora y por ello pueden alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de estas alteraciones.

De manera similar, una secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2, que es ser idéntica en el 100%, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera tal que el % de identidad sea menor que el 100%. Esas alteraciones se seleccionan entre el grupo que consiste en la deleción de al menos un aminoácido, sustitución de al menos un aminoácido, incluyendo sustituciones conservadoras y sustituciones no conservadoras, o inserción de al menos un aminoácido, y en el que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones amino terminal o carboxi terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en un lugar cualquiera entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos correspondiente a un determinado % de identidad se determina multiplicando el número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 por el porcentaje numérico del respectivo porcentaje de identidad (dividido entre 100) y restando luego ese producto de dicho número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y)

en donde n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e y es, por ejemplo, 0,70 en el caso del 70%, 0,80 en el caso del 80%, 0,85 en el caso del 85%, etc., y en donde todo producto de x_{a} e y que no sea un número entero se redondea por abajo al número entero más cercano antes de restarlo de x_{a}.

"Homóloga" es un término genérico usado en la técnica para indicar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica que posee un alto grado de parentesco de la secuencia en relación con una secuencia en estudio. Ese parentesco se puede cuantificar determinando el grado de identidad y/o de similitud entre las secuencias que están siendo comparadas según se ha descrito en lo que antecede. Dentro de este término genérico, están los términos de "ortólogo", que se refiere a un polinucleótido o a un polipéptido que es el equivalente funcional de un polinucleótido o de un polipéptido de otra especie, y "paráloga" que se refiere a una secuencia funcionalmente similar cuando se considera dentro de la misma especie.

Ejemplos Ejemplo 1 Análisis de RT-PCR en tiempo real

La RT-PCR en tiempo real (U. Gibson. 1996. Genome Research: 6.996) se usa para comparar la abundancia de transcritos de mRNA del antígeno candidato en tejidos de colon normal y de colon tumoral emparejados procedentes de muchos pacientes. Además, los niveles de mRNA del gen candidato en un grupo de tejidos normales se evalúan por medio de esta estrategia.

El RNA total procedente de colon normal y de colon tumoral se extrae de biopsias sometidas a congelación rápida sobre plancha enfriada sobre nieve carbónica (del inglés, "snap frozen biopsies"), usando el reactivo TriPure (Boehringer). El RNA total procedente de tejidos normales se adquiere procedente de InVitrogen o se extrae de biopsias sometidas a congelación rápida usando el reactivo TriPure. El RNA-Poli A^{+} se purifica de entre el RNA total después de un tratamiento con DNasa usando bolitas magnéticas con oligo-dT (Dynal). La cuantificación del mRNA se realiza mediante espectrofluorimetría (VersaFluor, BioRad) utilizando el colorante SybrII (Molecular Probes). Los cebadores para la amplificación por PCR en tiempo real se diseñan con el programa Primer Express de Perkin Elmer usando opciones por defecto para las condiciones de la amplificación con TaqMan.

Las reacciones en tiempo real se montan conforme a protocolos de PCR estándar usando 2 ng de mRNA purificado en cada reacción. El colorante SybrI (Molecular Probes) se añade en una cantidad que alcance una dilución final de 1/75.000 para la detección en tiempo real. La amplificación (40 ciclos) y la detección en tiempo real se realizan en un sistema Biosystems PE7700 de Perkin Elmer usando los ajustes instrumentales convencionales. Los valores de Ct se calculan usando el programa PE7700 Sequence Detector. Se obtienen dos valores de Ct por cada muestra de los pacientes: el Ct de colon tumoral (CtT) y el Ct del colon normal emparejado (CtN). Los valores de Ct obtenidos en la PCR en tiempo real mantienen una relación lineal logarítmica con el número de copias del molde diana. Debido a que la eficiencia de la amplificación por PCR en las condiciones experimentales predominantes está cercana a la eficiencia teórica de la amplificación, 2^{(CtN-CtT)} es una estimación de los niveles relativos de transcritos en los dos tejidos (es decir, del número de veces de sobreexpresión de mRNA en tumor). Las reacciones de PCR en tiempo real se realizan en biopsias de 17 pacientes. El nivel de sobreexpresión de mRNA se calcula en cada paciente según se ha descrito. El nivel medio de sobreexpresión de mRNA correspondiente al antígeno candidato y la proporción de pacientes que sobreexpresan el antígeno candidato se calculan luego a partir de este grupo de datos.

En el caso de los tejidos normales, los valores de Ct del antígeno candidato se comparan con los correspondientes a actina obtenidos con la misma muestra de tejido.

Resultados de la PCR en tiempo real en muestras de colon tumoral/colon normal Sumario

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1

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Detalles de los 3 experimentos

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2

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Resultados de la PCR en tiempo real en tejidos normales Valores de Ct

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3

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm}Bl: vejiga; Bra: cerebro; Sk: piel; Ce:
cérvix; He:  corazón; Ki: riñón; Li: hígado; Lu: pulmón; Sp: bazo;
Pl: placenta; Re: recto; Te: testículo; Ao: aorta; Ad Gl: glándula
adrenal; Pr: próstata; Oe: esófago; St: estómago; Sk Mu: músculo
esquelético; Ov: ovario; Fa Tu: tubo de falopio. Muestras diferentes
del mismo tejido llevan un identificador numérico
adicional.\end{minipage} \cr}

Conclusión. El transcrito del gen CASB616 está significativamente sobreexpresado en comparación con el colon normal en todos los tumores colorrectales primarios examinados. La expresión en la mayoría de los tejidos normales parece ser muy baja.

Ejemplo 2 Microchips de DNA

Los microchips de DNA se usan para estudiar los perfiles de expresión de mRNA de grandes colecciones de genes en múltiples muestras. Esta información se usa para complementar los datos obtenidos en la PCR en tiempo real y proporciona una medida independiente de los niveles de expresión génica en tumores y en tejidos normales.

Ejemplos de tecnologías actuales para la producción de microchips de DNA incluyen: 1) Los chips "GeneChip" de Affymetrix en los que los oligonucleótidos se sintetizan sobre la superficie del chip mediante síntesis química en fase sólida utilizando un procedimiento fotolitográfico. 2) Tecnología de aplicación de depósitos de DNA, en la que pequeños volúmenes de una disolución de DNA se depositan por medio de un mecanismo robotizado y después se inmovilizan sobre la superficie de una fase sólida (p. ej., vidrio). En ambos casos, los chips se hibridan con cDNA o cRNA que se ha extraído del tejido de interés (p. ej., tejido normal, tumor, etc...) y se ha marcado con radiactividad o con una molécula de reporte fluorescente. El material marcado se hibrida con el chip y la cantidad de sonda unida a cada una de las secuencias presentes sobre el chip se determina utilizando un escáner especializado. El experimento se puede preparar con una única molécula de reporte fluorescente (o radiactiva) o, como alternativa, se puede realizar usando dos moléculas de reporte fluorescentes. En este último caso, cada una de las dos muestras está marcada con una sola de las moléculas de reporte. Las dos muestras marcadas se hibridan luego competitivamente a las secuencias dispuestas sobre el chip de DNA. La proporción de las dos señales fluorescentes se determina para cada una de las secuencias presentes sobre el chip. Esta proporción se usa para calcular la abundancia relativa del transcrito en las dos muestras. Existen disponibles protocolos detallados procedentes de varias fuentes que incluyen "DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1.999" y en la World Wide Web (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), (http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) y distribuidores especializados (p. ej., Affymetrix).

Ejemplo 3 Perfiles de EST

Una estrategia complementaria para la caracterización experimental de la expresión de antígenos en tejidos es explorar los bancos de datos de "Secuencias marcadoras expresadas" humanas (EST) (del inglés, " Expressed Sequence Tags"). Las EST son pequeños fragmentos de cDNA preparados a partir de una colección de mRNA extraídos de un tejido particular o de una línea celular particular. Esos bancos de datos actualmente proporcionan una cantidad masiva de EST (10^{6}) procedentes varios cientos de genotecas de cDNA en tejidos, que incluyen tejidos tumorales de diferentes tipos y estados patológicos. Por medio de herramientas informáticas, se lleva a cabo una búsqueda por comparación de la secuencia de CASB616 con el fin de tener un conocimiento aún mayor de su expresión en tejidos.

Resultados de la búsqueda en bancos de datos usando la secuencia de CASB616

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5

Ejemplo 4 Análisis de transferencias Northern-Southern

Cantidades limitadas de cDNA mezclados de un colon tumoral y de un colon normal emparejado se amplifican mediante Advantage PCR (véase lo que antecede). RNA mensajero procedente de múltiples tejidos normales se amplifica también utilizando el mismo procedimiento. El cDNA amplificado (1 \mug) se somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,2% y se transfiere a una membrana de nilón. La membrana se hibrida (AlkPhos Direct System) con una sonda preparada usando un fragmento del cDNA TAA candidato. El análisis Northern-Southern proporciona información sobre el tamaño de los transcritos, sobre la presencia de variantes de corte y empalme y sobre la abundancia de los transcritos en tejidos tumorales y normales.

Ejemplo 5 Análisis de transferencias Northern

Las transferencias Northern se producen conforme a protocolos estándar usando 1 \mug de mRNA poli A+. Las sondas radiactivas se preparan usando el sistema Ready-to-Go (Pharmacia).

Ejemplo 6 6.1 Expresión y purificación de antígenos específicos de tumores

La expresión en hospedadores microbianos se utiliza para producir el antígeno de la invención con fines vacunales y para producir fragmentos de proteína o la proteína completa para su purificación rápida y para la generación de los anticuerpos necesarios para la caracterización de la proteína expresada en la naturaleza mediante inmunohistoquímica o para el seguimiento de la purificación.

Las proteínas recombinantes se pueden expresar en dos hospedadores microbianos, E. coli y levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris). Esto permite la selección del sistema de expresión con las mejores características para esta producción del antígeno particular. En general, el antígeno recombinante se expresará en E. coli y la proteína reactivo se expresará en levadura.

La estrategia para la expresión implica primero el diseño de la estructura primaria del antígeno recombinante. En general una pareja de fusión para la expresión (EFP) (del inglés, " Expression Fusion Partner") se sitúa en el extremo N-terminal para mejorar los niveles de expresión, y puede incluir también una región útil para modular las propiedades inmunogénicas del antígeno, una pareja de fusión inmunitaria (IFP) (del inglés, " Immune Fusion Partner"). Además, una pareja de fusión de afinidad (AFP) (del inglés, " Affinity Fusion Partner") útil para facilitar la posterior purificación, se incluye en el extremo C-terminal.

Cuando las cepas recombinantes están dispuestas, el producto recombinante se caracteriza mediante la evaluación del nivel de expresión y la predicción de la nueva solubilidad de la proteína mediante análisis del comportamiento del extracto crudo.

Después de cultivar en un medio de cultivo apropiado y de la inducción de la proteína de expresión recombinante, los extractos totales se analizan mediante SDS-PAGE. Las proteínas recombinantes se visualizaron en geles teñidos y se identificaron mediante análisis de transferencia Western usando anticuerpos específicos.

Una evaluación comparativa de las diferentes versiones del antígeno expresado permitirá la selección del candidato más prometedor que se ha de utilizar en la posterior purificación y evaluación inmunológica.

El trabajo de purificación sigue una estrategia clásica basada en la presencia de una cola de afinidad de His en la proteína recombinante. En un experimento típico, las células rotas se filtran y los extractos acelulares se cargan en una Cromatografía de Afinidad sobre Iones Metálicos (IMAC; Ni^{++}NTA procedente de Qiagen) que retendrá de manera específica la proteína recombinante. Las proteínas retenidas se eluyen con un gradiente de Imidazol 0 mM-500 mM (posiblemente en presencia de un detergente) en un tampón de fosfato. Esta etapa óptimamente va seguida de una etapa de cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico y por una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño molecular dependiendo del éxito de la etapa de IMAC y de la naturaleza de los contaminantes.

6.2 Producción del anticuerpo e inmunohistoquímica

Se pueden usar cantidades pequeñas de la proteína relativamente purificada para generar herramientas inmunológicas con el fin de

a) detectar la expresión mediante inmunohistoquímica en secciones de tejidos normales y de tejidos tumorales;

b) detectar la expresión, y hacer el seguimiento de la proteína durante el procedimiento de purificación (ELISA/transferencia Western); o

c) caracterizar/cuantificar la proteína purificada (ELISA).

6.2.1 Anticuerpos policlonales Inmunización

Se inmunizan 2-3 conejos, por vía intramuscular (I.M.), 3 veces a intervalos de 3 semanas, con 100 \mug de proteína, formulada en el adyuvante 3D-MPL/QS21. Tres semanas después de cada inmunización, se recoge una muestra de sangre y se estima el título de anticuerpo en suero mediante ELISA, utilizando la proteína como antígeno de revestimiento siguiendo un protocolo estándar.

Elisa

Microplacas de 96 pocillos (maxisorb Nunc) se revisten con 5 \mug de proteína durante toda la noche a 4ºC. Después de 1 hora de saturación a 37ºC con NCS al 1% en PBS, se añade una dilución seriada de suero de conejo, durante 1 H 30, a 37ºC (comenzando con la dilución 1/10). Después de 3 lavados en PBS Tween, se añade un antisuero anti-conejo biotnilado (Amersham) (1/5.000). Las placas se lavan y se añade estreptavidina acoplada a peroxidasa (1/5.000) durante 30 min a 37ºC. Después de lavar, se añaden 50 \mul de TMB (BioRad) durante 7 min y la reacción se detiene luego con H_{2}SO_{4} 0,2 M. La OD se puede medir a 450 nm y se calculan las diluciones de punto medio mediante SoftmaxPro.

6.2.2 Anticuerpos monoclonales Inmunización

Cinco ratones Balb/c se inmunizan 3 veces a intervalos de 3 semanas con 5 \mug de proteína purificada. Las extracciones de sangre se realizan 14 días después de la inmunización II y una semana después de la inmunización 3. El suero se ensaya mediante la técnica ELISA, con la proteína purificada usada como antígeno de revestimiento. Sobre la base de estos resultados (dilución de punto medio > 10.000) se selecciona un ratón para la fusión.

Fusión/Selección en HAT

Se fusionan esplenocitos con el mieloma SP2/0 conforme a un protocolo estándar que utiliza PEG al 40% y DMSO al 5%. Las células se siembran a continuación en placas de 96 pocillos, 2,5 x 10^{4} - 10^{5} células/pocillo y los clones resistentes se seleccionarán en medio HAT. El sobrenadante de estos hibridomas se ensayará con respecto a su contenido en anticuerpos específicos y cuando sea positivo, se someterá a dos ciclos de dilución límite. Después de 2 rondas de escrutinio, se escogerán 3 hibridomas para la producción de las ascitis.

6.2.3 Inmunohistoquímica

Una vez disponibles los anticuerpos, se realiza una inmunotinción sobre secciones de tejido normal y de tejido tumoral, con el fin de determinar:

\bullet el nivel de expresión del antígeno de la invención en tejido tumoral en comparación con tejido normal, o

\bullet la proporción de un cáncer de un determinado tipo que expresa el antígeno,

\bullet si otros tipos de cáncer expresan también el antígeno,

\bullet la proporción de células que expresan el antígeno en un tejido tumoral.

Preparación de las muestras de tejido

Después de la disección, la muestra de tejido se monta sobre un disco de corcho en compuesto OCT y se congela rápidamente en isopentano previamente superenfriado en nitrógeno líquido (-160ºC). El bloque se conservará luego a -70ºC hasta el momento de su uso. Se harán secciones de 7 \mum - 10 \mum en una cámara criostática (-20ºC, -30ºC).

Tinción

Las secciones de tejido se secan durante 5 min a temperatura ambiente (RT) (del inglés, " Room Temperature"), se fijan en acetona durante 10 min a RT, se secan de nuevo, y se saturan con suero al 5% en BSA al 0,05% en PBS. Después de 30 min a RT, se lleva a cabo una tinción directa o indirecta usando anticuerpos específicos de antígeno. Una tinción directa produce una mejor especificidad pero una tinción menos intensa, mientras que una tinción indirecta produce una tinción más intensa pero menos específica.

6.4 Análisis de respuestas inmunitarias de células humanas frente al antígeno de la invención

La relevancia inmunológica del antígeno de la invención puede establecerse activando inmunológicamente in vitro de células T humanas. Todas las líneas linfocitarias de células T y las células dendríticas derivan de las PBMC (del inglés, " Peripheral Blood Mononuclear Cells") (células mononucleares de sangre periférica) de donantes sanos (siendo preferido el subtipo HLA-A2). Un ratón transgénico HLA-A2.1/K^{b} se utiliza también para el escrutinio de los péptidos HLA-A2.1.

Líneas de células T CD8+, específicas de antígeno, recién descubiertas, se inducen y mantienen con una estimulación semanal in vitro. La actividad lítica y la producción de IFN-\gamma de las líneas CD8 en respuesta al antígeno o a péptidos derivados del antígeno se determina usando procedimientos estándar.

Se usan dos estrategias para inducir las líneas de células T CD8+: una estrategia basada en péptidos y una estrategia basada en genes completos. Ambas estrategias requieren que el cDNA de longitud completa del antígeno recién descubierto, en el marco de lectura correcto, o bien se clone en un sistema de suministro apropiado, o bien se use para predecir la secuencia de péptidos que se unen a HLA.

Estrategia basada en péptidos

Las secuencias de los péptidos que se unan a HLA-A2 se predicen por medio del algoritmo de Parker. Los péptidos se someten luego a escrutinio en el modelo de ratones transgénicos HLA-A2.1/K^{b} (Vitiello y col.,). La secuencia usada para realizar la predicción es EPHB2v, ya que es idéntica a EPHB2 con una extensión C-terminal adicional de la secuencia.

Epítopos pronosticados que se unen al alelo HLA_A0201

6

Brevemente expuesto, los ratones transgénicos se inmunizan con péptidos HLA-A2 en un adyuvante, y los péptidos incapaces de inducir una respuesta de CD8 (definida por una lisis eficiente de esplenocitos autólogos pulsados con los péptidos) se analizarán posteriormente en el sistema humano.

Células dendríticas humanas (cultivadas conforme a Romani y col.,) se pulsarán con los péptidos y se usarán para estimular células T clasificadas como CD8 (mediante Facs). Después de varias estimulaciones semanales, las líneas CD8 se ensayarán primero con líneas BLCL (líneas celulares transformadas con EBV-B) autólogas, sometidas a pulsos con los péptidos. Para verificar el adecuado procesamiento del péptido in vivo, las líneas CD8 se ensayarán con células tumorales transfectadas con cDNA (células tumorales LnCaP, Skov3 o CAMA transfectadas con HLA-A2).

Estrategia basada en genes completos

Líneas de células T CD8+ se activarán inmunológicamente y se estimularán o con células dendríticas transfectadas por bombardeo genético, o con fibroblastos transfectados con B7,1 transducidos con retrovirus, o con células dendríticas infectadas con poxvirus recombinantes (Kim y col.,) o adenovirus (Butterfield y col.). Las células infectadas con virus son muy eficientes en la presentación de péptidos antigénicos debido a que el antígeno es expresado a un nivel alto pero solamente se pueden usar una vez para evitar el sobrecrecimiento de líneas de células T virales.

Después de estimulaciones alternas, las líneas CD8 se ensayan con células tumorales transfectadas con cDNA según se ha indicado anteriormente. Se determina la especificidad del péptido y la identidad para confirmar la validación inmunológica.

Referencias

Vitiello et al. (L. Sherman), J. Exp. Med., J. Exp. Med, 1991, 173:1007-1015.

Romani et al., J. Exp. Med., 1994, 180:83-93.

Kim et al., J. Immunother., 1997, 20:276-286.

Butterfield et al., J. Immunol., 1998, 161:5607-5613.

\newpage

INFORMACIÓN SOBRE LAS SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1

7

8

SEQ ID NO: 2

9

SEQ ID NO: 3

10

11

SEQ ID NO: 4

12

\newpage

SEQ ID NO: 5

MMMEDILRV

SEQ ID NO: 6

LLLPLLAAV

SEQ ID NO: 7

GLTEPRIYI

SEQ ID NO: 8

RQNDGQFTV

SEQ ID NO: 9

TLMDSTTAT

SEQ ID NO: 10

KLPGkREIFV

SEQ ID NO: 11

LLLLpLLAAV

SEQ ID NO: 12

QMMMeDILRV

SEQ ID NO: 13

WSYGiVMWEV

SEQ ID NO: 14

FLIAvVVIAI

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Nuevos usos

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> BC45244

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<160> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 3.768

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

13

14

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<210> 2

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<211> 986

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

15

16

17

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<210> 3

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<211> 3.949

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 3

18

19

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<210> 4

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<211> 1.055

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 4

20

21

22

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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\sa{Met Met Met Glu Asp Ile Leu Arg Val}

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 6

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\sa{Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 7

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\sa{Gly Leu Thr Glu Pro Arg Ile Tyr Ile}

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 8

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\sa{Arg Gln Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val}

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<210> 9

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Thr Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Lys Leu Pro Gly Arg Glu Ile Phe Val}

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<210> 11

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\newpage

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<400> 11

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\sa{Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val}

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 12

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\sa{Gln Met Met Met Asp Ile Leu Arg Val}

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\sa{Trp Ser Tyr Gly Val Met Trp Glu Val}

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<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<400> 14

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\sa{Phe Leu Ile Ala Val Val Ile Ala Ile}

Claims (3)

1. El uso de un anticuerpo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de cáncer de ovario o cáncer de colon, en el que el anticuerpo es inmunoespecífico para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o para un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

2. El uso de un anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de colon.

3. El uso de un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.