KR20010102507A - 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진단학에 사용되는 CASB616의 용도, 및 암, 특히 결장암, 자가면역 질병 및 관련 질환을 위한 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 암 및 자가면역 질병 및 그 밖의 관련된 질환을 치료하는 방법을 포함하는, 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 (본원에서는 "CASB616" 폴리펩티드(들) 및 "CASB616" 폴리누클레오티드(들)로서 일컬어짐)를 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 가지 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 물질을 사용하여 작용제 및 길항제/억제제를 확인하는 방법 및 확인된 화합물로 CASB616 폴리펩티드 불균형과 관련된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 부적당한 CASB616 폴리펩티드 활성 또는 수준과 관련된 질병을 검출하기 위한 진단용 검정에 관한 것이다.
CASB616은 수용체 단백질-티로신 키나아제의 가장 큰 패밀리인 EPH 및 EPH 관련된 수용체에 속하는 폴리펩티드를 코드화하는 것으로 발견되었다. CASB616은 다르게는 EPHB2 (별칭: EBHB2, ERK, EPH3, EPH3, EPHT3, DRT, HEK5) 및 EPHB2v로서 알려져 있다.
EPH 및 EPH 관련된 수용체는 특히 신경계에서 발달 사건을 매개하는 것에 관련되어 왔다. Eph 서브패밀리에 속하는 수용체는 전형적으로 하나의 키나제 도메인, 및 Cys 풍부 도메인과 2 피브로넥틴 타입 III 반복체를 함유하는 세포외 영역을 지닌다. Eph 수용체에 대한 리간드는 Eph 명명 위원회에 의해 에프린(ephrin)으로 명명되었다 (Cell 90: 403-404, 1997; PubMed ID : 9267020). 구조 및 서열관계를 기초로 하여, 에프린은 글리코실포스파티딜리노시톨 결합에 의해 막에 앵커링된 에프린-A (EFNA) 클래스와 트랜스멤브레인 단백질인 에프린-B (EFNB)로 나뉘어진다. 수용체의 Eph 패밀리는 세포외 도메인 서열의 유사성 및 에프린-A와 에프린-B 리간드에 대한 친화성을 기초로 하여 두 그룹으로 나뉘어진다. Eph 명명 위원회 (1997)는 에프린-A 단백질과 우선적으로 상호작용하는 Eph 수용체를 EphA라 명명하고, 에프린-B 단백질과 우선적으로 상호작용하는 Eph 수용체를 EphB라 명명할 것을 제안하였다.
이케가키(Ikegaki) 등 (Hum. Molec. Genet. 4: 2033-2045, 1995)은 인간/설치류 체세포 하이브리드 패널의 PCR 스크리닝 및 인 시튜 하이브리드화 형광에 의해 EPHB2 유전자인 DRT를 1p36.1-p35로 맵핑하였다. 1p의 원위 단부가 신경모세포종에서 종종 결실되므로, DRT 유전자는 신경모세포종 및 소(小)세포 폐암종 (SCLC) 종양형성에 영향을 미칠 수 있다.
인 시튜 하이브리드화 형광에 의해, 사이토(Saito) 등 (Genomics 26:382-384, 1995 PubMed ID: 7601466)은 ERK 유전자가 염색체 영역 1p36.1에 위치하고 있음을 입증하였다. 이들은 상동 유전자가 마우스 4D2.2-D3 및 래트 5q36.13에 위치하며, 이 둘 모두는 인간 염색체 1p에 대한 보존된 결합 상동성을 지니는 영역임을 밝혀내었다.
본 발명은 하기 상세히 기술되는 CASB616 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각각 SEQ ID NO:1 또는 3 및 SEQ ID NO:2 또는 4에 나타나 있는 누클레오티드 및 아미노산 서열을 지니는 CASB616의 용도에관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:1 또는 3 및 SEQ ID NO:2 또는 4에서 확인된 서열과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97% 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 지니는 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
CASB616 폴리펩티드와 폴리누클레오티드는 종양에 대한 특이적인 예방용 또는 치료용 면역화를 위한 중요한 면역원인 것으로 믿어지는데, 이는 이들이 정상 세포에 비해 종양에서 특이적으로 발현되거나 고도로 과발현됨으로써 항원 특이적 면역 메카니즘에 의해 표적화되어 종양 세포의 파괴를 유도할 수 있기 때문이다. 이들은 종양 세포의 발생을 진단하는 데에 또한 사용될 수 있다. 또한, 특정 환경에서의 이들의 부적당한 발현은 부적당한 면역 반응인 자가면역을 일으킬 수 있으며, 이는 동일한 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 사용하는 적합한 백신접종을 통해 바로잡아질 수 있다. 이 점에 있어서, 본 발명의 목적에 대한 가장 중요한 생물학적 활성은 본 발명의 폴리펩티드의 항원성 및 면역원성 활성이다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 CASB616 폴리펩티드의 하나 이상의 다른 생물학적 활성을 나타낼 수 있으며, 이는 이러한 폴리펩티드가 면역 반응과 결합된 개입과는 상이한 예방적 또는 치료적 개입을 위한 표적이 될 수 있도록 해준다.
본 발명의 또 다른 일면에 있어서, CASB616 폴리펩티드 뿐만 아니라 이들의 생물학적으로, 진단학적으로, 예방학적으로, 임상학적으로 또는 치료학적으로 유용한 변이체의 용도 및 이들을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한 하기 폴리펩티드의 용도를 제공한다:
(a) SEQ ID NO:2 또는 4의 서열과 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97% 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;
(b) 각각 SEQ ID NO:1 또는 3의 전장에 걸쳐서 SEQ ID NO:1 또는 3과 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 지니는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드; 또는
(c) SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 지니는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 면역원 활성을 지니는 CASB616 폴리펩티드의 연속 부분인 CASB616 폴리펩티드의 면역원성 단편의 용도를 제공한다. 즉, 단편 (필요에 따라 캐리어에 커플링됨)은 CASB616 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 면역원성 단편으로는, 예를 들어 N-말단 리더 서열, 및/또는 트랜스멤브레인 도메인 및/또는 C-말단 앵커 도메인이 결여된 CASB616 폴리펩티드가 있을 수 있다. 한 가지 바람직한 일면에 있어서, 본 발명에 따른 CASB616의 면역원성 단편은 각각 SEQ ID NO:2 또는 4의 전장에 걸쳐서 SEQ ID NO:2 또는 4의 서열과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상의 동일성, 적어도 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 99 내지 99% 이상의 동일성을 지니는 폴리펩티드의 세포외 도메인을 실질질으로 전부 포함한다.
단편은 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 임의의 아미노산 서열의 전부가 아닌 일부와 완전히 동일한 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드이다. CASB616 폴리펩티드의 경우, 단편은 "자립형(free-standing)"이거나, 이들이 영역의 일부를 구성하는 거대한 폴리펩티드내에 포함된 형태일 있으며, 가장 바람직하게는 하나의 거대한 폴리펩티드내에 하나의 연속 영역으로서 존재한다.
바람직한 단편으로는 예를 들어, 아미노- 및/또는 카르복실-말단 아미노산 서열을 포함하는 연속된 일련의 잔기와 같은, SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열의 일부를 지니는 절단 폴리펩티드가 있다. 숙주세포에 의해 또는 숙주세포내에서 생성된 본 발명의 폴리펩티드의 분해 형태가 또한 바람직하다. 구조적 또는 기능적 속성을 특징으로 하는 단편, 예를 들어 베타-배럴(beta-barrel), 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역, 베타-시트 및 베타-시트 형성 영역, 턴앤턴(turn and turn) 형성 영역, 코일 및 코일 형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양친매성 영역, 베타 양친매성 영역, 가요성 영역, 표면 형성 영역, 기질 결합 영역 및 높은 항원성 인덱스 영역을 포함하는 단편이 바람직하다.
또 다른 바람직한 단편으로는 SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열로부터의 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 이상의 연속 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열로부터 절단되거나 결실된 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 있다.
수 개의, 즉, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개 또는 1개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 변이체가 특히 바람직하다.
본 발명에 사용되는 폴리펩티드 또는 면역원성 단편은 "성숙한(mature)" 단백질의 형태이거나, 전구체 또는 융합 단백질과 같은 거대한 단백질의 일부일 수 있다. 분비 또는 리더 서열, pro-서열, 다수의 히스티딘 잔기와 같은 정제를 보조해주는 서열, 또는 재조합 생성 도중의 안정성을 위한 추가 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열을 포함시키는 것이 종종 유리하다. 또한, 외인성 폴리펩티드 또는 지질 꼬리 또는 폴리누클레오티드를 첨가시켜서 최종 분자의 면역원성 잠재성을 증가시키는 것이 또한 고려된다.
한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 다양한 서브클래스(IgG, IgM, IgA, IgE)의 면역글로불린이 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다수의 부분을 포함하는 유전공학처리된 가용성 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 융합이 힌지 영역에서 일어나는 경우, 인간 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변 영역이 면역글로불린으로서 바람직하다. 한 가지 특정 양태에 있어서, Fc부분은 혈액 응고 인자 Xa로 분해될 수 있는 분해 서열을 혼입시킴으로써 제거될 수 있다.
융합 단백질 기술의 예들은 국제 특허 출원 번호 WO94/29458 및 WO94/22914에서 발견될 수 있다.
단백질은 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 융합되지 않은 단백질과 비교하여 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성될 수 있도록 해주는 재조합 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프 (면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 인간에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 보조해주거나, 천연 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질 (발현 인핸서)를 발현하는 것을 보조해줄 수 있다. 바람직하게는, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 인핸싱(enhancing) 파트너 둘 모두일 것이다.
융합 파트너로는 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D 및 인플루엔자 바이러스로부터의 비구조 단백질인 NS1 (헤마글루티닌)이 있다. 또 다른 융합 파트너는 LytA로서 알려진 단백질이다. 바람직하게는, 분자의 C 말단 부분이 사용된다. Lyta는 펩티도글리칸 주쇄 중의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 자가용해소인 N-아세틸-L-알라닌 아미다제 LytA (lytA 유전자에 의해 코딩됨 {Gene, 43 (1986) page 265-272})를 합성하는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 몇몇 콜린 유사체에 대한 친화성을 담당한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LytA 발현 플라스미드를 개발하기 위해이용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질을 정제하는 것은 문헌{Biotechnology: 10, (1992) page 795-798}에 설명되어 있다. 잔기 178에서 출발하여 C 말단에서 발견되는 LytA의 반복 부분, 예를 들어 잔기 188 내지 305를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 언급된 폴리펩티드의 변이체, 즉, 하나의 잔기가 유사한 특성을 지닌 또 다른 잔기로 치환되는 보존적 아미노산 치환에 의해 지시물과 달라지는 폴리펩티드를 또한 포함한다. 전형적인 이러한 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile 사이에서; Ser 및 Thr 사이에서; 산성 잔기 Asp 및 Glu 사이에서; Asn 및 Gln 사이에서; 및 염기성 잔기 Lys 및 Arg 사이에서; 또는 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 사이에서 이루어진다.
본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 임의의 적당한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드, 재조합적으로 생성된 폴리펩티드, 합성적으로 생성된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다.
한 가지 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 백신 조성물에 사용하거나 이의 제조에 사용하기 위한 CASB616 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드, 특히, 본원에서 CASB616으로 표시되는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다.
한 가지 바람직한 양태에 있어서, 폴리누클레오티드는 전장 유전자를 포함하는 SEQ ID NO:1 또는 3으로 표시된 서열을 포함하는 CASB616 폴리펩티드 또는 이의변이체를 코드화하는 영역을 포함한다.
SEQ ID NO:1 또는 3으로 표시된 폴리누클레오티드 서열과 같은 본원에 제공된 정보를 이용하는 경우, CASB616 폴리펩티드를 코드화하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 인간 결장암, 폐암, 난소암 및 태아 조직의 세포내의 mRNA로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 표준 클로닝 및 스크리닝 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 적합한 기법은 마니아티스, 티. (Maniatis, T.), 프리취, 이.에프. (Fritsch, E.F.) 및 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술되어 있다. 본 발명에 기술된 폴리누클레오티드는 또한 게놈 DNA 라이브러리와 같은 천연 공급원으로부터 수득되거나 널리 공지되고 상용화된 기법을 사용하여 합성될 수 있다.
더욱이, SEQ ID NO:1 또는 3으로 표시된 DNA 서열은 대략 SEQ ID NO:2 또는 4로 표시된 아미노산 잔기의 갯수와 당업자에게 잘 알려진 아미노산 잔기 분자량 값을 사용하여 계산될 수 있는 추론된 분자량을 지니는 단백질을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
SEQ ID NO:1의 누클레오티드 번호 105에 있는 개시 코돈 및 누클레오티드 번호 3066에서 시작하는 정지 코돈 사이에 있는, SEQ ID NO:1의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 코드화한다.
SEQ ID NO:3의 누클레오티드 번호 26에 있는 개시 코돈 및 누클레오티드 번호 3191에서 시작하는 정지 코돈 사이에 있는, SEQ ID NO:3의 폴리누클레오티드는SEQ ID NO:4의 폴리펩티드를 코드화한다.
한 가지 또 다른 일면에 있어서, 하기 폴리누클레오티드를 포함하거나 이들로 구성된 단리된 폴리누클레오티드의 용도를 제공한다:
(a) SEQ ID NO:1 또는 3의 전장에 걸쳐서 SEQ ID NO:1 또는 3과 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 지니는 폴리누클레오티드 서열; 또는
(b) SEQ ID NO:2 또는 4의 전장에 걸쳐서 SEQ ID NO:2 또는 4와 85% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱더 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 100% 정확한 동일성을 지니는 폴리누클레오티드 서열.
본 발명에 사용되는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드는 엄격한 하이브리드화 조건 (예를 들어, 45 내지 65℃ 범위의 온도 및 0.1 내지 1%의 SDS 농도를 사용함)하에서 적합한 라이브러리를 SEQ ID NO:1 또는 3의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 표지되거나 검출가능한 프로브로 스크리닝하는 단계; 및 상기 폴리누클레오티드 서열을 함유하는 전장 유전자 및/또는 게놈 클론을 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 3의 코딩 서열 (오픈 리딩 프레임)과 이의 전장에 걸쳐서 동일한 폴리누클레오티드 서열의 용도를 제공한다. 성숙한 폴리펩티드 또는 이의 단편 단독에 대한 코딩 서열의 용도 뿐만 아니라 리더 또는 분비 서열,pre-서열, 또는 pro- 또는 prepro-단백질 서열, 또는 그 밖의 융합 펩티드 부분을 코드화하는 서열과 같은 또 다른 코딩 서열을 리딩 프레임에 지니는 성숙한 폴리펩티드 또는 단편에 대한 코딩 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 폴리누클레오티드는, 예를 들어 전사되지만 번역되지 않는 서열, 종결 신호 (예를 들어, rho-의존성 및 rho-비의존성 종결 신호), 리보솜 결합 부위, 코자크 서열, mRNA를 안정화시키는 서열, 인트론, 및 폴리아데닐화 신호와 같은 하나 이상의 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 비-코딩 서열을 또한 함유할 수 있다. 폴리누클레오티드 서열은 추가의 아미노산을 코드화하는 추가의 코딩 서열을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진시켜주는 마커 서열이 코드화될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 마커 서열은 pQE 벡터 (Qiagen, Inc.)에 제공되고 겐츠(Gentz) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad Sci., USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 헥사-히스티딘 펩티드 또는 HA 펩티드 태그 (Wilsonet al., Cell 37: 767 (1984))이며, 이 둘 모두는 이들에 융합된 폴리펩티드 서열을 정제하는 데에 유용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 폴리누클레오티드는 구조 유전자 및 유전자 발현을 조절하는 이의 천연 관련 서열을 또한 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
SEQ ID NO:2 또는 4의 CASB616 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:1의 누클레오티드 105 내지 3068에 함유된 폴리펩티드 코드화 서열 또는 SEQ ID NO:3의 누클레오티드 26 내지 3193에 함유된 폴리펩티드 코드화 서열과 동일할 수 있다. 대안적으로, 이러한 서열은 유전 코드의 중복(축중)의 결과로써 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드를 또한 코드화하는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드"는 본 발명의 폴리펩티드, 특히, SEQ ID NO:2 또는 4로 표시된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 이 용어는 또한 폴리펩티드를 코드화하는 하나의 연속 영역 또는 불연속 영역 (예를 들어, 통합된 파지, 통합된 삽입 서열, 통합된 벡터 서열, 통합된 트랜스포손 서열에 의해 단절되거나 RNA 편집 또는 게놈 DNA 재조직화로 인해 단절된 폴리누클레오티드)을 코딩 및/또는 비코딩 서열을 또한 함유할 수 있는 추가 영역과 함께 포함하는 폴리누클레오티드를 또한 포함한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2 또는 4의 추론된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드의 변이체를 코드화하는 본원에 기술된 폴리누클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편은, 예를 들어 본 발명의 전장 폴리누클레오티드를 합성하기 위해 사용될 수 있다.
또한 특히 바람직한 양태는 다수의, 몇몇, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 2개, 1개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환되고, 변형되고, 결실되고/되거나 첨가되거나 이러한 변화가 전혀없는 SEQ ID NO:2 또는 4의 CASB616 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지닌 CASB616 변이체를 코드화는 폴리누클레오티드이다. 이들 변화 중에서, CASB616 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변경시키지 않는 사일런트 치환, 첨가 및 결실이 특히 바람직하다.
본 발명에 사용되는 폴리누클레오티드 가운데 SEQ ID NO:2 또는 4로 표시된아미노산 서열을 지닌 CASB616 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드와 전장에 걸쳐서 85% 이상 동일한 폴리누클레오티드, 및 이러한 폴리누클레오티드와 상보적인 폴리누클레오티드가 추가로 바람직하다. 대안적으로, CASB616 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드와 전장에 걸쳐서 95% 이상 동일한 영역을 포함하는 폴리누클레오티드 및 이와 상보적인 폴리누클레오티드가 가장 바람직하다. 이 점에 있어서, SEQ ID NO:2 또는 4의 서열과 전장에 걸쳐서 95% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 95% 이상을 지니는 서열 중에서 97% 이상을 지니는 서열이 매우 바람직하고, 이들 중에서, 98% 이상 및 99% 이상을 지니는 서열이 특히 매우 바람직하며, 99% 이상을 지니는 서열이 더욱 바람직하다.
바람직한 양태는 SEQ ID NOl:1 또는 3에 의해 코드화된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드이다.
본 발명의 몇몇 바람직한 양태에 따르면, SEQ ID NO:1 또는 3의 폴리누클레오티드와 같은 엄격한 조건하에서 CASB616 폴리누클레오티드에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 이 점에 있어서, 특히, 본 발명은 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 폴리누클레오티드에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용되는 용어 "엄격한 조건" 및 "엄격한 하이브리드화 조건"은 서열들 사이에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이존재하는 경우에만 일어나는 하이브리드화를 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건의 한 가지 특정한 예는 50% 포름아미드, 5xSSC (150mM NaCl, 15mM 시트르산 삼나트륨), 50mM 인산나트륨 (pH7.6), 5x덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 변성되고 전단된 연어 정자 DNA 20㎍/㎖를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 약 65℃에서 0.1xSSC로 하이브리드화 지지체를 세척하는 것이다. 하이브리드화 및 세척 조건은 잘 알려져 있으며, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); 특히, Chapter 11]에 예시되어 있다. 용액 하이브리드화는 또한 본 발명에 의해 제공된 폴리누클레오티드 서열과 함께 사용될 수 있다.
CASB616 유전자의 코딩 영역은 올리고누클레오티드 프로브를 합성하기 위해 SEQ ID NO:1 또는 3에 제공된 DNA 서열을 사용하여 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 그 후, 본 발명의 유전자의 서열과 상보적인 서열을 지닌 표지된 올리고누클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 프로브가 라이브러리의 어느 구성원에 하이브리드화되는 지를 결정하기 위해 사용된다.
전장 DNA를 수득하거나 짧은 DNA를 늘리기 위한 당업자가 이용할 수 있고 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법이 존재하며, 예를 들어 라피드 앰플리피케이션 오브 cDNA 엔즈 (Rapid Amplification of cDNA ends;RACE)의 방법을 기초로 한 방법이 있다 (참조: Frohman,et al., PNAS USA85: 8998-9002, 1988). 예를 들어 마라톤(MarathonTM) 기술 (Clontech Laboratories Inc.)에 의해 예시된 기법의 최근변형법은 긴 cDNA에 대한 검색을 현저하게 단순화시켰다. 마라톤 기술에 있어서, cDNA는 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA로부터 준비되었고, '어댑터' 서열이 각각의 단부에 연결되었다. 그 후, 유전자 특이적 및 어댑터 특이적 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 (PCR)이 수행되어 DNA의 "결손(missing)" 5' 단부를 증폭시킨다. 그 후, PCR 반응은 "네스팅된(nested)" 프라이머, 즉, 증폭된 생성물내에서 어닐링하도록 고안된 프라이머 (전형적으로 어댑터 서열에서 추가의 3'를 어닐링하는 어댑터 특이적 프라이머 및 선택된 유전자 서열에서 추가의 5'를 어닐링하는 유전자 특이적 프라이머)를 사용하여 반복된다. 그 후, 이러한 반응의 생성물은 DNA 시퀀싱에 의해 분석될 수 있고, 전장 DNA는 완전한 서열을 제공하기 위해 생성물을 기존의 DNA에 직접 결합시키거나 5' 프라이머의 고안을 위해 새로운 서열 정보를 사용하여 별도의 전장 PCR을 수행함으로써 구성될 수 있다.
본 발명은 성숙한 단백질과 추가의 아미노 또는 카르복실-말단 아미노산 또는 성숙한 폴리펩티드의 내측의 아미노산 (예를 들어 성숙한 형태가 1개가 넘는 폴리펩티드 사슬을 지니는 경우)으로 구성된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드의 용도를 또한 제공한다. 이러한 서열은 특히 단백질을 전구체로부터 성숙한 형태로 프로세싱하는 데에 있어서 영향을 미칠 수 있거나, 단백질 수송을 가능하게 해주거나, 단백질 반감기를 연장시키거나 단축시킬 수 있거나, 검정 또는 제조를 위한 단백질의 조작을 촉진시켜줄 수 있다. 생체내에서 흔히 그렇듯이, 추가의 아미노산은 세포 효소에 의해 성숙한 단백질로부터 프로세싱되어 분리될 수 있다.
하나 이상의 pro서열에 융합된 폴리펩티드의 성숙한 형태를 지니는 전구체단백질은 비활성 형태의 폴리펩티드일 수 있다. pro서열이 제거된 경우, 이러한 비활성 전구체는 일반적으로 활성화된다. pro서열의 일부 또는 전부는 활성화 전에 제거될 수 있다. 일반적으로, 이러한 전구체는 pro단백질로 명명된다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전공학처리된 숙주 세포로부터 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 한 가지 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전공학처리된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생성시키기 위해 무세포 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다.
재조합적 제조를 위해, 숙주 세포는 본 발명의 폴리누클레오티드를 위한 발현 시스템 또는 이의 일부를 혼입하도록 유전공학처리될 수 있다. 숙주 세포내로 폴리누클레오티드를 도입시키는 것은 데이비스(Davis) 등의 문헌[Basic Methods in Molecular Biology (1986)] 및 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]과 같은 다수의 표준 실험 매뉴얼에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 이러한 방법으로는 예를 들어 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 중재된 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 마이크로인젝션, 양이온성 지질 중재된 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 스크레입(scrape) 로딩, 탄도 도입 또는 감염이 있다.
바람직하게는 본 발명의 단백질은 트랜스 형태의 티오레독신 (thioredoxin in trans; TIT)와 코익스프레션(coexpression)된다. 트랜스 형태 대 시스 형태의 티오레독신을 코익스프레션시키는 것은 프로테아제에 대한 필요없이 항원을 티오레독신이 없는 상태로 유지시키기 위해 바람직하다. 티오레독신 코익스프레션은 본 발명의 단백질의 용해화를 용이하게 해준다. 티오레독신 코익스프레션은 단백질 정제 수율, 정제된 단백질 용해도 및 특성에 또한 상당한 영향을 미친다.
적합한 숙주의 대표적인 예로는 세균 세포, 예를 들어 스트렙토코시, 스타필로코시, 대장균, 스트렙토마이세스 및 바실루스 서브틸리스 세포; 진균 세포, 예를 들어 효모 세포 및 아스퍼길루스 세포; 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 및 보우스(Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포가 있다.
매우 다양한 발현 시스템이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래된 시스템, 예를 들어 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포손, 효모 에피솜, 곤충 엘리먼트, 효모 염색체 엘리먼트, 바이러스, 예를 들어 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스, 예를 들어 SV40, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 수두 바이러스, 슈도라비스 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합물로부터 유래된 벡터, 예를 들어 코스미드 및 파지미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 엘리먼트로부터 유래된 벡터가 있다. 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐만 아니라 이를 야기시키는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 생성시키도록 폴리누클레오티드를 유지시키거나, 증식시키거나 발현시킬 수 있는 임의의 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 누클레오티드 서열은 다수의 널리 공지되고 일상적인 기법, 예를 들어 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual (상기 참조)]에 기재된 기법에 의해 발현 시스템내로 삽입될 수 있다. 번역된 단백질을 형질내세망의 관강, 원형질막 주위공간 또는 세포외 환경내로 분비시킬 수 있도록 적합한 분비 신호가 원하는 폴리펩티드내로 혼입될 수 있다. 이러한 신호는 폴리펩티드에 대해 내인성이거나 이종 신호일 수 있다.
발현 시스템은 또한 바이러스 또는 세균과 같은 재조합 생 미생물일 수 있다. 관심있는 유전자는 재조합 생 미생물 또는 세균의 게놈내로 삽입될 수 있다. 이러한 생 벡터에 의한 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응의 유도를 일으킬 것이다. 이를 위해 사용되는 바이러스 및 세균은 예를 들어 폭스바이러스 (예를 들어, 우두, 수두, 카나리아발진병), 알파바이러스 (신드비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 (Semliki Forest Virus), 베네주엘리안 에퀸 엔세팔리티스 바이러스 (Venezuelian Equine Encephalitis Virus)), 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스, 피코르나바이러스 (폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤르페스바이러스 (바리셀라 조스터 바이러스 (varicella zoster virus) 등), 리스테리아, 살모넬라, 시겔라, BCG 이다. 이러한 바이러스 및 세균은 독성이거나 생 백신을 수득하기 위해 다수의 방법으로 약독될 수 있다. 이러한 생 백신은 또한 본 발명의 일부를 구성한다.
본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이온 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)가 정제를 위해 사용된다. 폴리펩티드가 세포내 합성, 단리 및/또는 정제 도중에 변성되는 경우 활성 입체형태를 재생시키기 위해 단백질을 리폴딩(refolding)시키기 위한 널리 공지된 기법이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 일면은 암 및 자가면역 질병 및 관련 질환의 예방 또는 치료적 처리를 위한 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성시키기에 적합하도록 본 발명의 단편 또는 전체 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드로 포유동물을 접종시키는 것을 포함하여 포유동물에게서 면역학적 반응을 유도하거나, 강화시키거나 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일면은 면역학적 반응을 유도하여 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료를 위한 면역 반응을 생성시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 생체내에서 이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드의 벡터 또는 세포 유도성 발현을 통해 전달하는 것을 포함하여 포유동물에게서 면역학적 반응을 유도하거나, 강화시키거나 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일면은, 포유동물 숙주내로 도입되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이 포유동물의 면역학적 반응을 유도하거나, 강화시키거나 조절하는 면역학적/백신 제형(조성물)에 관한 것이며, 상기 조성물은 앞서 규정된 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 또는 이의 면역학적 단편을 포함한다. 백신 제형은 적합한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 위에서 분해될 수 있으므로, 제형은 비경구적으로 (예를 들어, 피하, 근내, 정맥내 또는 피내 주사) 투여되는 것이 바람직하다. 비경구적 투여를 위해 적합한 제형은 산화방지제, 완충제, 정균제 및 제형이 수용자의 혈액과 등장이 되도록 해주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다회-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알의 형태로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 캐리어의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된 상태로 저장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 포유동물의 면역계로부터의 세포를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 단편이나 전부 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 포함하는 분자에 대한 면역 반응을 시험관내 유도하고, 질병의 치료를 위해 이렇게 활성화된 포유동물의 면역 세포를 재주입시키는 것에 관한 것이다. 면역계로부터의 세포의 활성화는 다수의 면역조절제 분자의 존재 또는 부재하에서 본 발명의 전체 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 포함하는 분자로 시험관내 접종시킴으로써 달성된다. 본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 전부 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 분자로 시험관내 로딩시킴으로써 변형되고 면역원성 방식으로 생체내 투여되는 항원 제공 세포를 투여함으로써 포유동물을 면역시키는 것에 관한 것이다. 대안적으로, 항원 제공 세포는 상응하는 폴리펩티드를 발현시키도록 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편 또는 전부 또는 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 분자를 함유하는 벡터로 시험관내 트랜스펙션될 수 있고, 면역원성 방식으로 생체내 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 제형은 제형의 면역원성을 향상시키기 위해 애주반트 시스템을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 애주반트 시스템은 TH1 타입 반응을 우선적으로 일으킨다.
면역 반응은 두 가지의 극단적 카테고리, 즉, 체액성 면역 반응 또는 세포 매개성 면역 반응 (통상적으로 각각 항체 및 세포 이펙터 보호 메카니즘을 특징으로 함)으로 광범위하게 구별될 수 있다. 반응의 이러한 카테고리는 TH1-타입 반응 (세포 매개성 반응) 및 TH2-타입 면역 반응 (체액성 반응)으로 일컬어져 왔다.
극단적 TH1-타입 면역 반응은 항원 특이적인 반수체 제한적 세포독성 T 림프구의 발생 및 천연 킬러 세포 반응을 특징으로 한다. 마우스의 경우, TH1-타입 반응은 IgG2a 서브타입의 항체의 발생을 종종 특징으로 하는데, 인간의 경우, 이러한 항체는 IgG1 타입 항체에 상응한다. TH2-타입 면역 반응은 마우스 IgG1, IgA 및 IgM을 포함하는 광범위한 면역글로불린 이소타입의 발생을 특징으로 한다.
이러한 두 가지 타입의 면역 반응의 발생의 배후에 있는 구동력은 시토카인인 것으로 간주될 수 있다. 고수준의 TH1-타입 시토카인은 주어진 항원에 대한 세포 매개성 면역 반응의 유도를 유리하게 해주는 경향이 있는 반면, 고수준의 TH2-타입 시토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 유리하게 해주는 경향이 있다.
TH1 및 TH2-타입 면역 반응의 구별은 절대적이지 않다. 실제로, 개체는 TH1우세한 또는 TH2 우세한으로서 기술되는 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Mosmann)과 코프만(Coffman)에 의해 쥐과동물 CD4 +ve T 세포 클론에서 기술된 것을 기초로 시토카인의 패밀리를 고려하는 것이 종종 편리하다 (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). 통상적으로, TH1-타입 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 시토카인의 생성과 관련된다. TH1-타입 면역 반응의 유도와 종종 직접 관련된 그 밖의 시토카인은 IL-12와 같은 T-세포에 의해 생성되지 않는다. 대조적으로, TH2-타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13의 분비와 관련된다.
몇몇 백신 애주반트가 TH1 또는 TH2-타입 시토카인 반응의 자극에 특히 적합한 것으로 알려져 있다. 통상적으로, 백신접종 또는 감염 후의 면역 반응의 TH1:TH2 균형의 최상의 지표는 항원에 의한 재자극 후의 시험관내에서의 림프구에 의한 TH1 또는 TH2 시토카인의 생성의 직접적 측정 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비의 측정을 포함한다.
따라서, TH1-타입 애주반트는 시험관내에서 항원에 의해 재자극되는 경우 고수준의 TH1-타입 시토카인을 생성시키도록 단리된 T-세포 집단을 우선적으로 자극하고, CD8+ 세포독성 T 림프구 및 TH1-타입 이소타입과 관련된 항원 특이적 면역글로불린 반응 둘 모두의 발생을 촉진시키는 애주반트이다.
TH1 세포 반응을 우선적으로 자극시킬 수 있는 애주반트는 국제 특허 출원 번호 WO 94/00153 및 WO 95/17209에 기술되어 있다.
3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)은 하나의 이러한 애주반트이다. 이것은 GB 2220211 (Ribi)로부터 알려져 있다. 화학적으로, 이것은 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이며, 리비 이뮤노켐 (Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조된다. 한 가지 바람직한 형태의 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A가 유럽 특허 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA)에 기술되어 있다.
바람직하게는, 3D-MPL의 입자는 0.22 마이크론 막을 통해 멸균 여과될 정도로 충분히 작다 (유럽 특허 제 0 689 454호). 3D-MPL은 용량 당 10㎍ 내지 100㎍, 바람직하게는 25㎍ 내지 50㎍의 범위로 존재하며, 항원은 전형적으로 용량 당 2 내지 50㎍의 범위로 존재할 것이다.
또 다른 바람직한 애주반트는 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 수피로부터 유래된 Hplc 정제된 무독성 분획인 QS21을 포함한다. 임의로, 이것은 임의로 캐리어와 함께 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)과 혼합될 수 있다.
QS21의 정제 방법은 미국 특허 제 5,057,540호에 기술되어 있다.
QS21을 함유하는 비-리액토제닉(non-reactogenic) 제형은 이미 공지되었다 (WO 96/33739). QS21과 콜레스테롤을 포함하는 이러한 제형은 항원과 함께 제형화되는 경우 성공적인 TH1 자극성 애주반트인 것으로 밝혀졌다.
TH1 세포 반응의 우선적 자극제인 추가의 애주반트로는 면역조절성 올리고누클레오티드, 예를 들어 WO 96/02555에 기술된 메틸화되지 않은 CpG 서열이 있다.
상기 언급된 바와 같은 다수의 TH1 자극성 애주반트의 조합물이 TH1 세포 반응의 우선적 자극제인 애주반트를 제공하는 것으로 또한 고려된다. 예를 들어, QS21은 3D-MPL와 함께 제형화될 수 있다. QS21:3D-MPL의 비는 전형적으로 약 1:10 내지 10:1; 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1일 것이다. 최적 상승작용을 위한 3D-MPL:QS21의 바람직한 범위는 2.5:1 내지 1:1 이다.
바람직하게는, 캐리어가 본 발명에 따른 백신 조성물에 또한 존재한다. 캐리어는 수중유 에멀션, 또는 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄과 같은 알루미늄염일 수 있다.
바람직한 수중유 에멀션은 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 Tween 80과 같은 대사성 오일을 포함한다. 한 가지 특히 바람직한 일면에 있어서, 본 발명에 따른 백신 조성물 중의 항원은 이러한 에멀션 중에서 QS21과 3D-MPL과 조합된다. 또한, 수중유 에멀션은 스팬 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
전형적으로, 인간 투여의 경우, QS21 및 3D-MPL은 용량 당 1㎍ 내지 200㎍, 예를 들어 10 내지 100㎍, 바람직하게는 10㎍ 내지 50㎍의 범위로 백신에 존재할 것이다. 전형적으로, 수중유 에멀션은 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 tween 80을 포함할 것이다. 바람직하게는, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비는 더욱 안정한 에멀션을 제공한다는 이유로 1 이하이다. 스팬 85는 1%의 수준으로 또한 존재할 수 있다. 몇몇 경우, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
비독성 수중유 에멀션은 바람직하게는 비독성 오일, 예를 들어 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 에멀션화제, 예를 들어 Tween 80을 수성 캐리어 중에 함유할 수 있다. 수성 캐리어는 예를 들어 인산염 완충 식염수일 수 있다.
수중유 에멸션 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 한 가지 특히 강력한 애주반트 제형이 WO 95/17210에 기술되어 있다.
본 발명은 본 발명의 백신 제형과 함께 그 밖의 항원, 특히 암, 자가면역 질병 및 관련 질환을 치료하는데 유용한 항원을 포함하는 다가의 백신 조성물을 또한 제공한다. 이러한 다가의 백신 조성물은 상기 기술된 TH-1 유도성 애주반트를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리누클레오티드로부터 유래된 프라이머 형태의 폴리누클레오티드, 및 본 발명의 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 시약 형태의 폴리펩티드의 진단 시약으로서의 용도에 관한 것이다.
발암 경로에 따른 매우 초기의 변화의 검출을 가능하게 해주는 혈액 또는 조직 중의 유전적 또는 생화학적 마커를 확인하는 것은 환자를 위한 최상의 치료법을 결정하는 것을 도울 것이다. 폴리누클레오티드 발현과 같은 대용 종양 마커는 다양한 형태 및 상태의 암을 진단하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 발현 수준을 확인하는 것은 암성 질환의 병기결정 및 암성 조직의 성질의 등급결정 둘 모두에서 유용할 것이다. 병기결정 프로세스는 암의 진전을 모니터링하고, 생검된 부위에서의 악성 조직의 존재 또는 부재에 따라 결정된다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 암의 공격성에 대한 마커를 확인함으로써 (예를 들어, 신체의 다양한 부위에서의 존재에 대해) 병기결정 프로세스를 완전하게 하는 것을 도울수 있다. 암의 등급결정은 종양이 이와 동일한 타입의 정상 조직과 어느 정도로 가깝게 유사한 지를 설명해주고, 이는 이의 세포 형태학 및 분화의 다른 마커에 의해 평가된다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 이들이 종양을 지닌 세포의 분화 상태를 결정하는 것을 도울 수 있으므로 종양 등급을 결정하는 데에 유용할 수 있다. 다른 한편, 본 발명의 폴리펩티드는 간질세포에 의해 생성될 수 있으며, 이 경우, 이의 특이적 발현 또는 감별 발현은 질병 상태의 마커이다.
진단용 검정은 피검자로부터 유래된 샘플로부터 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준의 폴리펩티드 또는 mRNA를 측정하는 것을 포함하는 방법에 의한 진단을 통해, 암, 자가면역 질병 및 관련 질환을 진단하거나 이에 대한 감수성을 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 진단 방법은 감별 발현으로서 알려져 있다. 한 가지 특정 유전자의 발현은 질병 조직 및 정상 조직 사이에서 비교된다. 두 조직내의 폴리누클레오티드 관련된 유전자, mRNA, 또는 단백질 사이의 차는 예를 들어, 분자량, 아미노산 또는 누클레오티드 서열에 대해 비교되거나, 상대적 과다는 질병에 걸린 것으로 추측되는 인간의 조직내의 유전자 또는 이를 조절하는 유전자의 변화를 나타낸다.
감소되거나 증가된 발현은 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 먼저 폴리A RNA가 두 조직으로부터 단리되고, 본 발명의 감별적으로 발현된 폴리누클레오티드에 상응하는 유전자에 의해 코드화된 mRNA의 검출이, 예를 들어 조직 구획내에서의 인 시튜 하이브리드화, 역전사효소-PCR, 폴리 A+ mRNA를 함유하는 노던 블롯, 또는 임의의 그 밖의 직접적 또는 간접적 RNA 검출법에 의해 검출될 수 있다. 정상 조직과비교되는 질병 조직에서의 주어진 RNA의 증가되거나 감소된 발현은 전사체 및/또는 발현된 단백질이 질병에 영향을 미침을 제시한다. 따라서, 정상 수준에 비해 높거나 낮은 수준의 SEQ ID NO 1 또는 3에 상응하는 mRNA의 검출은 환자 체내의 암의 존재를 나타낸다.
샘플내의 mRNA 발현 수준은 샘플로부터의 발현된 서열 태그 (EST)의 라이브러리를 발생시킴으로써 측정될 수 있다. 라이브러리 중의 EST의 상대적 표현은 출발 샘플내의 유전자 전사체의 상대적 표현을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 그 후, 시험의 EST 분석이 기준 샘플의 EST 분석과 비교되어, 관심있는 폴리누클레오티드의 상대적 발현 수준을 측정할 수 있다.
그 밖의 mRNA 분석이 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE) 방법 (Velculescu et Al. Science (1995) 270:484), 감별 디스플레이 방법 (예를 들어, US 5,776,683) 또는 누클레오티드 상호작용의 특이성에 의존하는 하이브리드화 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
대안적으로, 비교는 단백질 수준에서 이루어질 수 있다. 두 조직내의 단백질 크기는 두 조직으로부터의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯으로 폴리펩티드를 검출하기 위해 항체를 사용하여 비교될 수 있다. 발현 수준 및 세포하 정위는 상응하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역학적으로 또한 검출될 수 있다. 숙주로부터 유래된 샘플내의 본 발명의 폴리펩티드와 같은 단백질의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 추가의 검정 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 정상 조직내의 동일한 단백질 발현 수준과 비교되는 질병 조직내의 폴리펩티드 발현의 증가되거나 감소된 수준은 발현된 단백질이 질병에 관여할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 검정에 있어서, 진단은 SEQ ID NO:1 또는 3으로 표시된 하나 이상의 서열에 의해 코드화된 유전자 생성물 발현 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다. 질병 조직 대 정상 조직내의 mRNA 또는 단백질 수준의 비교는 질병의 진행 또는 완화를 추적하기 위해 또한 사용될 수 있다.
샘플내의 다수의 폴리누클레오티드 서열은 폴리누클레오티드 어레이를 이용하여 검정될 수 있다. 이러한 서열은 유전자의 감별 발현을 조사하고 유전자 기능을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리누클레오티드 서열 SEQ ID NO:1 또는 3의 어레이는 폴리누클레오티드 중 어느 것이 정상 세포와 암세포 사이에서 감별 발현되는 지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태에 있어서, SEQ ID NO:1 또는 3 누클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 올리고누클레오티드 프로브의 어레이는, 예를 들어 유전자 돌연변이의 효율적인 스크리닝을 수행하기 위해 구성될 수 있다. 어레이 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적 이용가능성을 지니며, 유전자 발현, 유전적 결합 및 유전적 가변성을 포함하는 분자 유전학에서의 다양한 문제점을 해결하기 위해 사용될 수 있다 (참조: M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)).
본원에 사용된 "진단"은 질병에 대한 피검자의 감수성의 결정, 피검자가 현재 질병에 걸려있는 지에 관한 결정, 및 질병에 걸린 피검자의 예후도 포함한다.
본 발명은 또한 하기 성분을 포함하는 진단용 검정을 수행하기 위한 진단 키트에 관한 것이다:
(a) 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:1 또는 3의 누클레오티드 서열, 또는 이의 단편;
(b) (a)의 폴리누클레오티드와 상보적인 누클레오티드 서열;
(c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드, 또는 이의 단편; 또는
(d) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드에 대한 항체.
본 발명의 누클레오티드 서열은 염색체 정위를 위해 또한 유용하다. 이 서열은 개개의 인간 염색체상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되고, 이와 하이브리드화될 수 있다. 본 발명에 따른 염색에 대한 관련 서열의 맵핑은 이러한 서열을 유전자 관련 질병과 상관시키는 데에 있어서 중요한 첫번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치에 맵핑된 경우, 염색체상의 서열의 물리적 위치는 유전자 맵 데이터와 상관될 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어 [V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man] (존스 홉킨스 유니버시티 웰치 메디칼 라이브러리 (Johns Hopkins University Welch Medical Library)를 통해 온라인으로 이용가능함)에서 발견된다. 그 후, 동일한 염색체 영역으로 맵핑된 유전자 및 질병 사이의 관계는 결합 분석 (물리적으로 인접한 유전자의 공동유전형질)을 통해 확인된다. 질병에 걸린 개체와 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차가 또한 측정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 단편 또는 이들의 유사체, 또는 이들을발현하는 세포는 본 발명의 폴리펩티드에 대해 면역특이적인 항체를 생성시키기 위해 면역원으로서 또한 사용될 수 있다. "면역원성"이란 용어는 항체가 그 밖의 관련된 종래의 폴리펩티드에 대한 친화도 보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 더 큰 친화도를 지님을 의미한다.
한 가지 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 규정된 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이의 면역학적 단편에 대해 특이적인 항체를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드 또는 에피토프 함유 단편, 유사체 또는 세포를 일상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 인간 이외의 동물에 투여함으로써 수득될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 경우, 연속 세포주 배양에 의해 생성되는 항체를 제공하는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예로는 하이브리도마 기법 (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497), 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법 (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법 (Cole et al., Monoclonal Antibodieds and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)이 있다.
미국 특허 제 4,946,778호에 기술된 기법과 같은 단일 사슬 항체의 제조를 위한 기법이 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일 사슬 항체를 생성시키도록 또한 변형될 수 있다. 또한, 유전자이식 마우스, 또는 그 밖의 포유동물을 포함하는 그 밖의 생물체가 인간화된 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 기술된 항체는 폴리펩티드를 발현시키는 클론을 단리하거나 확인하기위해 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 특히 난소암 및 결장암, 자가면역 질병 및 관련 질환을 예방하거나 치료하기 위해 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 질병의 증상 또는 진행을 보호하거나 개선시키기 위한 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성시키기에 적합하도록 본 발명의 폴리펩티드로 포유동물을 접종시키는 것을 포함하여, 포유동물에게서 면역학적 반응을 유도하거나 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일면은 면역학적 반응을 유도하여 질병으로부터 동물을 보호하기 위해 생체내에서 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드의 벡터 유도성 발현을 통해 본 발명의 폴리펩티드를 전달하는 것을 포함하여 포유동물에게서 면역학적 반응을 유도하거나 조절하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명이 CASB616 폴리펩티드 활성의 존재, 과다 또는 저발현과 관련된, 암 및 자가면역 질병, 특히 난소암 및 결장암과 같은 비정상적 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것으로 인식될 것이다.
본 발명은 CASB616 폴리펩티드의 기능을 자극하거나 억제하는 화합물을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 또한 제공한다. 일반적으로, 작용제 또는 길항제가 상기 언급된 질병에 대한 치료적 및 예방적 목적으로 사용될 수 있다. 화합물은 다양한 공급원, 예를 들어 세포, 무세포 표본, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물로부터 확인될 수 있다. 이렇게 확인된 이러한 작용제, 길항체 또는 억제제는 경우에 따라서 폴리펩티드의 천연 또는 개질된 기질, 리간드, 수용체, 효소 등일 수 있거나; 이들의 구조적 또는 기능적 유사물질(mimetic)일 수 있다 (참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)). 스크리닝 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또 다른 스크리닝 방법은 예를 들어 디. 벤네트 (D. Bennett) 등의 문헌[J Mol Recognition, 8:52-58 (1995)]; 및 케이. 요한슨 (K. Johanson) 등의 문헌[J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)] 및 여기에 인용된 참고문헌에서 발견될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 자극하거나 억제하는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법으로서,
(a) 후보 화합물에 직접 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해, 상기 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 막) 또는 이의 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 측정하는 방법;
(b) 표지된 경쟁물질의 존재하에서, 상기 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 막) 또는 이의 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 측정하는 방법;
(c) 상기 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 세포막에 적합한 검출 시스템을 사용하여, 후보 화합물이 상기 폴리펩티드의 활성화 또는 억제에 의해 발생되는 신호를 생성시키는 지의 여부를 시험하는 방법;
(d) 후보 화합물을 제 1항의 폴리펩티드를 함유하는 용액과 혼합시킴으로써 혼합물을 생성시키고, 혼합물내의 폴리펩티드의 활성을 측정하고, 혼합물의 활성을 표준과 비교하는 방법; 또는
(e) 예를 들어 ELISA 검정을 사용하여, 세포내에서 상기 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA 및 상기 폴리펩티드를 생성시키는 것에 대한 후보 화합물의 효과를 검출하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 막 결합된 수용체 또는 가용성 수용체 (존재하는 경우)를 당 분야에 공지된 표준 수용체 결합 기법을 통해 확인하기 위해 사용될 수 있다. 널리 공지된 스크리닝 방법은 본 발명의 폴리펩티드가 이의 수용체에 결합하는 것과 경쟁하는 (존재하는 경우) 본 발명의 폴리펩티드의 작용제 및 길항제를 확인하기 위해 또한 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 작용제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소 등; 또는 이러한 폴리펩티드의 생성을 감소시키거나 향상시키는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 키트로서,
(a) 본 발명의 폴리펩티드;
(b) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포;
(c) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포막; 또는
(d) 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
당업자는 본 발명의 폴리펩티드가,
(a) 첫째로 폴리펩티드의 3차원 구조를 결정하고;
(b) 작용제, 길항제 또는 억제제의 유망한 반응 또는 결합 부위(들)에 대해 3차원 구조를 추론하고;
(c) 추론되 결합 또는 반응 부위에 결합하거나 이와 반응하는 것으로 예측되는 후보 화합물을 합성하고;
(d) 후보 화합물이 진정한 작용제, 길항제 또는 억제제인 지의 여부를 시험함으로써, 폴리펩티드의 작용제, 길항제 또는 억제제의 구조-기반 고안을 위한 방법에 또한 사용될 수 있는 것으로 용이하게 인식할 것이다.
유전자 요법은 피검자내에서 관련 세포에 의한 CASB616 폴리펩티드의 내인적 생성을 수행하기 위해 또한 사용될 수 있다. 유전자 요법의 개요에 관해서는, 다음 문헌을 참조하라 [Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (and references cited therein) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)].
백신 제조는 문헌[Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 일반적으로 기술되어 있다. 리포솜내에 캡슐화시키는 것은 예를 들어 릭하이트(Likhite)의 미국 특허 제 4,372,945호 및 아모르(Armor) 등의 미국 특허 제 4,474,757호에 기술되어 있다.
각각의 백신 용량 중의 단백질의 양은 전형적인 백신접종자에게서 현저한 불리한 부작용을 일으킴이 없이 면역보호 반응을 유도시키는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 사용되는 특정 면역원에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 각각의 용량은 단백질 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 2 내지 100㎍, 가장 바람직하게는 4 내지 40㎍을 포함할 것이다. 한 가지 특정한 백신을 위한 최적량은 피검자내에서의 항체 역가 및 그 밖의 반응의 관찰을 포함하는 표준 실험에 의해 확정될 수 있다. 초기 백신접종 후, 피검자는 약 4주 후에 부스트 접종을 받을 수 있다.
"단리된"이란 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변화됨을 의미한다. "단리된" 조성물 또는 물질이 자연계에 존재하는 경우, 이것은 이의 최초 환경으로부터 변화되거나 분리되거나, 이 둘 모두가 일어난 것이다. 예를 들어, 살아있는 동물 체내에 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 이의 천연 상태의 공존 물질과 분리된 동일한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 본원에 사용되는 바와 같이 "단리된" 것이다.
"폴리누클레오티드"는 일반적으로, 단일 가닥 및 이중 가닥 영역을 포함하는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 임의의 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드를 의미한다.
"변이체"는 기준 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하지만 본질적인 특성을 보유하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리누클레오티드의 전형적인 변이체는 또 다른 기준 폴리누클레오티드와 누클레오티드 서열이 상이하다. 변이체의 누클레오티드 서열의 변화는 기준 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다. 누클레오티드 변화는 하기 논의된 바와 같이 기준 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 생성시킬 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 또 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 기준 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전반적으로 매우 유사하고 다수의 영역에서 동일하게 되도록 차이가 제한된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 임의의 조합의 하나 이상의 치환, 첨가, 결실에 의해 아미노산 서열이 달라질 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 코드화된 잔기이거나 그렇지 않을 수 있다. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립형질 변이체와 같이 자연 발생할 수 있거나, 이것은 자연 발생하는 것으로 공지되지 않은 변이체일 수 있다. 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 자연 발생하지 않는 변이체는 돌연변이유발 기법 또는 직접 합성에 의해 제조될 수 있다.
당 분야에 공지된 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리누클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당 분야에 있어서, "동일성"은 경우에 따라 서열의 문자열 사이의 매치에 의해 결정된, 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 또한 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 하기 문헌에 기술된 방법을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다 (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Seqeunce Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; andSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAMJ. Applied Math., 48: 1073 (1988)). 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이에 최대의 매치를 제공하도록 고안된다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 집대성되어 있다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCC 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol.215:403-410 (1990))를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 그 밖의 정보원 (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))으로부터 공개적으로 입수가능하다. 널리 공지된 스미쓰 워터만 (Smith Waterman) 알고리듬이 동일성을 결정하기 위해 또한 이용될 수 있다.
사용된 바람직한 알고리듬은 FASTA 이다. 이 알고리듬을 사용하는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다:
갭 패널티: 12
갭 확장 패널티: 4
단어 크기: 2, 최대 6
그 밖의 방법을 사용하는 폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는다음을 포함한다:
1) 알고리듬: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
비교 매트릭스: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
갭 패널티: 12
갭 길이 패널티: 4
이러한 파라미터와 관련하여 유용한 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭(gap)" 프로그램으로서 공개적으로 입수가능하다. 상기 언급된 파라미터는 폴리펩티드 비교를 위한 디폴트 파라미터이다 (말단 갭에 대한 패널티는 없음).
폴리누클레오티드 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다:
1) 알고리듬: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
비교 매트릭스: matches = +10, mismatch = 0
갭 패널티: 12
갭 길이 패널티: 4
이러한 파라미터와 관련하여 유용한 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭(gap)" 프로그램으로서 공개적으로 입수가능하다. 상기 언급된 파라미터는 폴리누클레오티드 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
예로서, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 기준 서열과 동일할 수 있거나(즉, 100% 동일할 수 있다), 기준 서열과 비교하여 특정한 정수 이하의 누클레오티드 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 누클레오티드 결실, 트랜지션과 트랜스버젼을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변화는, 기준 서열내의 누클레오티드 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속 그룹에 산재된 형태로, 기준 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나 이러한 말단 위치 사이에 있는 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 누클레오티드 변화의 갯수는, SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수와 각각의 동일성 퍼센트의 수치 퍼센트 (100으로 나눈 값)을 곱한 후, SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수에서 이러한 적(積)을 빼냄으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:
n n≤x n- (x n·y)
상기 식에서,n n은 누클레오티드 변화의 갯수이고,x n는 SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수이고,y는, 예를 들어, 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95 등이고,x n과y의 임의의 정수가 아닌 적은x n로부터 이것을 빼내기 전에 우수리를 잘라서 최근접 정수가 되게 한다. SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열의 변화는 이러한 코딩 서열에서 넌센스, 미스센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이를 생성시킴으로써, 이러한 변화가 일어난 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드를 변화시킬 수 있다.
유사하게는, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:2의 기준 서열과 동일할 수 있거나(즉, 100% 동일할 수 있다), % 동일성이 100% 미만이 되도록 기준 서열과 비교하여 특정한 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 아미노산 결실, 보존적 치환 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 변화는 기준 서열의 아미노산 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 위치 또는 카르복시-말단 위치에서 일어날 수 있거나 이러한 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 주어진 % 동일성에 대한 아미노산 변화의 갯수는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수와 각각의 퍼센트 동일성의 수치 퍼센트 (100으로 나눈 값)를 곱한 후, SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수로부터 이러한 적을 빼냄으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다.
n a≤x a- (x a·y)
상기 식에서,n a는 아미노산 변화의 갯수이고,x a는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수이고,y는, 예를 들어, 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85 등 이고,x a과y의 임의의 정수가 아닌 적은x a로부터 이것을 빼내기 전에 우수리를 잘라서 최근접 정수가 되게 한다.
"상동체"는 당해 서열과 고도의 서열 관련성 지닌 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 나타내기 위해 당 분야에 사용되는 일반 용어이다. 이러한 관련성은상기 기술된 바와 같이 비교되는 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성의 정도를 결정함으로써 정량될 수 있다. 이러한 일반 용어에 속하는 용어로는 또 다른 종의 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능적 균등물인 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미하는 "오토로그(ortholog)" 및 동일한 종내에서 고려되는 경우 기능적으로 유사한 서열을 의미하는 "파라로그(paralog)"가 있다.
실시예
실시예 1
실시간 RT-PCR 분석
실시간 RT-PCR (U. Gibson. 1996. Genome Research: 6,996)을 사용하여 다수의 환자로부터의 매칭된 종양 및 정상 결장 조직내의 후보 항원의 mRNA 전사체 과다를 비교한다. 또한, 정상 조직의 패널 중의 후보 유전자의 mRNA 수준을 이 방법에 의해 평가한다.
정상 결장 및 종양 결장으로부터의 전체 RNA를 트리퓨어(TriPure) 시약 (Boehringer)를 사용하여 스냅 동결된 생검물로부터 추출한다. 정상 조직으로부터의 전체 RNA는 인비트로겐(InVitrogen)으로부터 구입하거나, 트리퓨어 시약을 사용하여 스냅 동결된 생검물로부터 추출한다. 폴리-A+mRNA는 올리고-dT 자기 비드 (Dynal)를 사용하여 DNAase 처리한 후 전체 RNA로부터 정제한다. mRNA의 정량은 SybrII 염료 (Molecular Probes)를 사용하여 분광형광측정법 (VersaFluor, BioRad)에 의해 수행한다. 실시간 PCR 증폭을 위한 프라이머는 TaqMan 증폭 조건에 관한 디폴트 옵션을 사용하여 퍼킨-엘머 프라이머 익스프레스 소프트웨어로 고안한다.
실시간 반응은 각각의 반응에 대해 정제된 mRNA 2ng을 사용하여 표준 PCR 프로토콜에 따라 어셈블링한다. SybrI 염료 (Molecular Probes)를 실시간 검출을 위해 1/75000의 최종 희석율로 첨가한다. 증폭 (40 사이클) 및 실시간 검출을 통상적인 기기 셋팅을 사용하여 퍼킨-엘머 바이오시스템즈 PE7700 시스템으로 수행한다. Ct 값은 PE7700 시퀀스 디텍터 (Sequence Detector) 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 두 개의 Ct 값이 각각의 환자 샘플에 대해 수득된다: 종양 Ct (CtT) 및 매칭된 정상 결장 Ct (CtN). 실시예 PCR에 의해 수득된 Ct 값은 표적 주형의 복사체 갯수에 로근 선형적으로 관련된다. 일반적 실험 조건하에서의 PCR 증폭의 효율이 이론적 증폭 효율에 가까운 경우, 2(CtN-CtT)가 두 조직내의 상대적 전사체 수준의 추정치이다 (즉, 종양에서의 배수(fold) mRNA 과발현). 실시간 PCR 반응은 17명의 환자로부터의 생검물로 수행한다. mRNA 과발현의 수준은 각각의 환자에 대해 기술된 바와 같이 수행한다. 그 후, 후보 항원에 대한 mRNA 과발현의 평균 수준 및 후보 항원을 과발현하는 환자의 비율을 이러한 데이터 세트로부터 계산한다.
정상 조직의 경우, 후보 항원에 대한 Ct 값은 동일한 조직 샘플로 수득되는 액틴의 값에 필적한다.
결장암/정상 결장 샘플에서의 실시간 PCR 결과
요약
| 결장 종양에서 CASB616를 과발현하는 환자 (%) | 결장 종양에서의 과발현의 평균 수준 (배수) |
| 17/17 (100%) | 17 |
3회 실험의 상세한 내용
정상 조직에서의 실시간 PCR 결과
Bl: 방광;Bra: 뇌;Sk: 피부;Ce: 경부;He: 심장;Ki: 신장;Li: 간;Lu: 폐;Sp: 비장;Pl: 태반;Re: 직장;Te: 고환;Ao: 대동맥;Ad Gl: 부신;Pr: 전립선;Oe: 식도;St: 위;Sk Mu: 골격근;Ov: 난소;Fa Tu: 난관. 동일한 조직의 상이한 샘플은 추가의 수치 식별기호를 지닌다.
결론. CASB616 유전자 전사체는 조사된 모든 원발성 결장직장 종양에서 정상결장에 비해 현저하게 과발현된다.
실시예 2.
DNA 마이크로어레이
DNA 마이크로-어레이를 사용하여 다수의 샘플내의 유전자의 거대한 수집물의 mRNA 발현 프로파일을 조사한다. 이러한 정보는 실시간 PCR에 의해 수득한 데이터를 보충하는데 사용되고, 종양 및 정상 조직내의 유전자 발현 수준의 독립적 기준을 제공한다.
DNA 마이크로-어레이의 생성을 위한 현재의 기술의 예로는 1) 올리고누클레오티드가 사진석판 처리를 사용하여 고체상 화학 합성법에 의해 칩의 표면상에서 합성되는 아피메트릭스(Affymetrix) "유전자칩(GeneChip)" 어레이 및 2) 작은 부피의 DNA 용액이 로봇에 의해 증착된 후 고체상(예를 들어, 유리)의 표면상에 고정되는 DNA 스폿팅 기술이 있다. 둘 모두의 경우, 칩은 관심있는 조직 (예를 들어, 정상 조직, 종양 등)으로부터 추출하여 방사능 또는 형광 리포터 분자에 의해 표지시킨 cDNA 또는 cRNA와 하이브리드화된다. 표지된 물질은 칩에 하이브리드화되고, 칩상의 각각의 서열에 결합된 프로브의 양은 특수 스캐너를 사용하여 결정된다. 실험은 하나의 형광 리포터 (또는 방사능)에 의해 셋업될 수 있거나, 두 개의 형광 리포터를 사용하여 수행될 수 있다. 후자의 경우, 두 샘플 각각은 리포터 분자 중의 하나에 의해 표지된다. 그 후, 두 개의 표지된 샘플은 DNA 칩상의 서열에 경쟁적으로 하이브리드화된다. 두 개의 형광 신호의 비는 칩상의 각각의 서열에 대해 결정된다. 이러한 비는 두 샘플내의 전사체의 상대적 과다를 계산하기 위해 사용된다. 상세한 프로토콜은 "DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999" 및 월드 와이드 웹 (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html), http://arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/) 및 전문 디스트리뷰터 (예를 들어, Affymetrix)를 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수할 수 있다.
실시예 3.
EST 프로파일
실험적 항원 조직 발현 특징화에 대한 보완적인 방법은 인간 "발현된 서열 태그" (EST) 데이터베이스를 조사하는 것이다. EST는 특정 조직 또는 세포주로부터 추출된 mRNA의 수집물로부터 만들어진 cDNA의 작은 단편이다. 이러한 데이터베이스는 현재 다양한 타입 및 상태의 질병으로부터의 종양 조직을 포함하는 수 백개의 cDNA 조직 라이브러리로부터의 대량의 EST (106)를 제공한다. 정보학 도구에 의해, 조직 발현에 대한 추가의 통찰력을 수득하도록 CASB616 서열의 비교 검색이 수행된다.
CASB616 서열을 사용하는 데이터베이스 검색의 결과
| DbEST | ATG lib ID | 설명 | 카테고리* |
| NCBI:580826 | 424 | 태아 심장 | F |
| NCBI:581388 | 424 | 태아 심장 | F |
| NCBI:584556 | 424 | 태아 심장 | F |
| NCBI:1160708 | 882 | NCI CGAP Co3 (12개로 풀링된 종양 결장) | TC |
| NCBI:1150180 | 895 | NCI CGAP Br2 (풀링된 유방 종양 조직) | TB |
| NCBI:1150189 | 895 | NCI CGAP Br2 (풀링된 유방 종양 조직) | TB |
| NCBI:1150229 | 895 | NCI CGAP Br2 (풀링된 유방 종양 조직) | TB |
| NCBI:1150370 | 895 | NCI CGAP Br2 (풀링된 유방 종양 조직) | TB |
| NCBI:1777532 | 843 | 태아 | F |
| NCBI:2127996 | 1541 | NCI CGAP Lu25 | Tlg |
| NCBI:2129674 | 1541 | NCI CGAP Lu25 | Tlg |
| NCBI:2129684 | 1541 | NCI CGAP Lu25 | Tlg |
| NCBI:2649403 | 1540 | NCI CGAP Co16 | TC |
| NCBI:3415191 | 1918 | 슈나이더(Schneider) 태아 뇌 00004 | F |
| NCBI:24019 | 2 | 태아 뇌 | F |
| NCBI:1942 | 2 | 태아 뇌 | F |
| NCBI:79438 | 226 | 인간 태반 | N |
| NCBI:982827 | 695 | 태아 신장 | F |
*F: 태아 조직 라이브러리; TC: 결장 종양 라이브러리; TB: 유방 종양 라이브러리; Tlg: 폐 종양 라이브러리; N: 정상 조직 라이브러리.
실시예 4
노던-서던 블롯 분석
제한된 양의 혼합된 종양 및 미스매칭된 정상 결장 cDNA를 어드밴티지(Advantage) PCR (상기 참조)에 의해 증폭시킨다. 다수의 정상 조직으로부터의 전령 RNA를 또한 동일한 과정을 사용하여 증폭시킨다. 증폭된 cDNA (1㎍)를1.2% 아가로스겔에서 전기영동시키고, 나일론 막으로 옮긴다. 막을 후보 TAA cDNA의 단편을 사용하여 제조한 프로브와 하이브리드화시킨다 (AlkPhos Direct System). 노던-서던 분석은 종양 조직 및 정상 조직내의 전사체 크기, 스플라이스 변이체의 존재 및 전사체 과다에 관한 정보를 제공한다.
실시예 5
노던 블롯 분석
노던 블롯을 1㎍의 poly A + mRNA를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 생성시킨다. 방사능 프로브는 레디-투-고 (Ready-to-Go) 시스템 (Pharmacia)을 사용하여 제조한다.
실시예 6:
6.1 종양 특이적 항원의 발현 및 정제
미생물에서의 발현을 사용하여, 백신용의 본 발명의 항원을 생성시키고, 면역조직화학에 의한 천연 발현된 단백질의 특징화에 필요한 항체의 신속한 정제 및 발생 또는 정제의 추적조사를 위해 단백질 단편 또는 전체 단백질을 생성시킨다.
재조합 단백질은 두 가지 미생물 숙주, 즉, 대장균 및 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris))에서 발현될 수 있다. 이는 이러한 특정 항원 생성을 위한 최상의 특징을 지니는 발현 시스템의 선택을 가능하게 해준다. 일반적으로, 재조합 항원은 대장균에서 발현되고, 시약 단백질은 효모에서 발현될 것이다.
발현 방법은 먼저 재조합 항원의 1차 구조를 고안하는 것을 포함한다. 일반적으로, 항원의 면역원성 특성을 조절하는데 유용한 영역을 또한 포함할 수 있는 (면역 융합 파트너 (IFP)), 발현 융합 파트너 (EFP)는 발현의 수준을 개선시키기 위해 N 말단 단부에 정위된다. 또한, 추가의 정제를 용이하게 하는데 유용한 친화성 융합 파트너 (AFP)가 C-말단 단부에 포함된다.
재조합 스트레인이 이용가능한 경우, 재조합 생성물은 미정제 추출물의 거동의 분석에 의해 단백질의 발현 수준을 평가하고 단백질의 추가의 용해도를 추측함으로써 특징화된다.
적합한 배양 배지에서 성장시키고 재조합 단백질 발현을 유도시킨 후, 전체 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 재조합 단백질은 염색된 겔에서 가시화되고, 특정 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된다.
발현된 항원의 다수의 변형체를 비교 평가하는 것은 추가의 정제 및 면역학적 평가에서 사용되는 가장 유망한 후보물질의 선택을 가능하게 해줄 것이다.
정제 작업은 재조합 단백질내의 His 친화성 꼬리의 존재를 기초로 하는 통상적인 방법을 따른다. 한 가지 전형적인 실험에 있어서, 파괴된 세포는 여과되고, 무세포성 추출물은 재조합 단백질을 특이적으로 보유하는 이온 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC; Ni++NTA (Qiagen))상으로 로딩된다. 보유된 단백질은 인산염 완충액에서 0 내지 500 mM 이미다졸 구배 (아마도 세정제의 존재하에서)에 의해 용리된다. 이 단계 후에는 Imac 단계의 성공 여부 및 오염물의 성질에 따라 음이온 교환 수지 단계 및 크기 배제 크로마토그래피 단계가 이어지는 것이 최적이다.
6.2 항체 생성 및 면역조직화학
소량의 비교적 정제된 단백질은,
a) 정상 또는 암 조직 구획내에서 면역조직화학에 의해 발현을 검출하거나;
b) 발현을 검출하고, 정제 과정 (ELISA/웨스턴 블롯) 동안 단백질을 추적하거나;
c) 정제된 단백질을 특징화/정량하기 위한 (ELISA), 면역학적 도구를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
6.2.1 폴리클로날 항체:
면역화
2 내지 3마리의 토끼를 애쥬반트 3D-MPL/QS21 중에 제형화된 100㎍의 단백질로 3주 간격으로 3회 근내 (I.M.) 면역시킨다. 각각의 면역 후 3주째에 혈액 샘플을 취하고, 항체 역가를 표준 프로토콜에 따라 코팅 항원으로서 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 혈청내에서 평가한다.
ELISA
96 웰 마이크로플레이트 (maxisorb Nunc)를 5㎍의 단백질로 4℃에서 밤새 코팅한다. PBS NCS 1%로 37℃에서 1시간 동안 포화시킨 후, 토끼 혈청의 연속 희석물을 37℃에서 1시간 30분간 첨가한다 (1/10에서 출발). PBS Tween에서 3회 세척한 후, 항 토끼 비오티닐화된 항 혈청 (Amersham)을 첨가한다 (1/5000). 플레이트를 세척하고, 퍼옥시다제 커플링된 스트렙타비딘 (1/5000)을 37℃에서 30분간 첨가한다. 세척한 후, 50㎕의 TMB (BioRad)를 7분간 첨가한 후, 반응을 H2SO40.2M로 중지시킨다. OD는 450nm에서 측정될 수 있고, 중간점 희석은 소프트맥스프로(SoftmaxPro)에 의해 계산될 수 있다.
6.2.2 모노클로날 항체:
면역화
5 BALB/c 마우스를 5㎍의 정제된 단백질로 3주 간격으로 3회 면역시킨다. 채혈을 postII 후 14일째 및 post 3 후 1주째에 수행한다. 혈청을 코팅된 항원으로서 사용되는 정제된 단백질에서 Elisa에 의해 시험한다. 이러한 결과를 기초로 하여 (중간점 희석 > 10000), 하나의 마우스가 융합을 위해 선택된다.
융합/HAT선택
비장 세포를 PEG 40% 및 DMSO 5%를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 SP2/0 골수종과 융합시킨다. 그 후, 세포는 웰 당 2.5 x 104내지 105개로 96 웰 플레이트에 시딩되고, 내성 클론은 HAT 배지에서 선택된다. 이러한 하이브리도마의 상층액은 특정 항체내의 이들의 함량에 대해 시험되며, 포지티브인 경우, 제한된 희석의 2회 사이클에 적용된다. 2 라운드의 스크리닝 후, 3개의 하이브리도마가 복수 생성에 대해 선택된다.
6.2.3 면역조직화학
항체가 이용가능한 경우, 하기 사항을 결정하기 위해 면역 염색이 정상 또는 암조직 구획에서 수행된다:
●정상 조직에 비교되는 암조직에서의 본 발명의 항원의 발현 수준 또는
●항원을 발현하는 특정 타입의 암의 비율
●그 밖의 암 타입이 또한 항원을 발현하는 지의 여부
●암조직에서의 항원을 발현하는 세포의 비율
조직 샘플 준비
절개 후, 조직 샘플을 OCT 화합물 중의 코르크 디스크에 마운팅하고, 액체 질소로 미리 과냉각시킨 (-160℃) 이소펜탄 중에서 신속하게 동결시킨다. 그 후, 블록은 사용할 때까지 -70℃에서 보존된다. 7 내지 10㎛ 구획은 저온유지 챔버 (-20, -30℃)에서 원상태로 된다.
염색
조직 구획을 실온 (RT)에서 5분간 건조시키고, RT에서 10분간 아세톤으로 고정시키고, 재건조시키고, PBS 0.5% BSA 5% 혈청으로 포화시킨다. RT에서 30분 후, 직접 또는 간접 염색을 항원 특이적 항체를 사용하여 수행한다. 직접 염색이 특이성은 더 우수하지만 덜 짙은 염색을 유도하는 반면, 간접 염색은 특이성은 덜 하지만 더욱 짙은 염색을 유도한다.
6.4 본 발명의 항원에 대한 인간 세포 면역 반응의 분석
본 발명의 항원의 면역학적 관련성은 인간 T 세포의 시험관내 프라이밍에 의해 평가될 수 있다. 모든 T 세포 림프구 라인(line) 및 수상 세포는 건강한 도너 (HLA-A2 서브타입이 바람직함)의 PBMC (말초혈 단핵 세포)로부터 유래된다. HLA-A2.1/Kb유전자이식 마우스는 HLA-A2.1 펩티드를 스크리닝하기 위해 또한 사용된다.
새로 발견된 항원 특이적 CD8+ T 세포주가 생성되고, 매주 시험관내 자극에 의해 유지된다. 항원 또는 항원 유도된 펩티드에 반응하는 CD8 라인의 용균 활성 및 γ-IFN 생성은 표준 과정을 사용하여 시험된다.
CD8+ T 세포주를 생성시키기 위한 두 가지 방법이 사용된다: 펩티드 기초 방법 및 전체 유전자 기초 방법. 두 방법은 모두 적합한 전달 시스템으로 클로닝하거나 HLA 결합 펩티드의 서열을 추정하는데 사용하기 위해 정확한 리딩 프레임으로 된 새로 발견된 항원의 전장 cDNA를 필요로 한다.
펩티드 기초 방법
HLA-A2 결합 펩티드 서열은 파커(Parker) 알고리듬에 의해 추정된다. 그 후, 펩티드는 HLA-A2.1/Kb유전자이식 마우스 모델 (Vitiello et al.)에서 스크리닝된다. 추정을 수행하기 위해 사용되는 서열은 EPHB2v이며, 이는 EPHB2와 동일하면서 추가의 C-말단 서열 신장을 지닌다.
HLA A0201 대립형질과 결합하는 추정된 에피토프:
| SEQ ID NO | 출발 위치 | 서브서열(Subsequence) 잔기 목록 | 스코어* |
| 8 | 948 | MMMEDILRV | 2979.496 |
| 6 | 11 | LLLPLLAAV | 1006.209 |
| 7 | 387 | GLTEPRIYI | 235.260 |
| 8 | 712 | RQNDGQFTV | 167.692 |
| 9 | 22 | TLMDSTTAT | 113.047 |
| 10 | 641 | KLPGkREIFV | 1338.876 |
| 11 | 10 | LLLLpLLAAV | 1006.209 |
| 12 | 947 | QMMMeDILRV | 427.474 |
| 13 | 810 | WSYGiVMWEV | 115.285 |
| 14 | 554 | FLIAvVVIAI | 110.379 |
* 이러한 서브서열을 함유하는 분자의 반(伴)분해시간의 평가치
요약하면, 유전자이식 마우스는 보조제 첨가된 HLA-A2 펩티드로 면역되고, CD8 반응 (펩티드 펄싱된 자가 비장 세포의 효율적 용균에 의해 규정됨)을 유도시킬 수 없는 마우스는 인간 시스템에서 추가로 분석된다.
인간 수상 세포 (로마니(Romani) 등에 따라 배양됨)는 펩티드로 펄싱되어,CD8-분류된 T 세포 (Facs에 의해)를 자극시키기 위해 사용된다. 다수의 매주 자극 후, 먼저 CD8 라인을 펩티드 펄싱된 자가 BLCL (EBV-B 형질전환된 세포주)에 대해 시험한다. 펩티드의 적합한 생체내 프로세싱을 입증하기 위해, CD8 라인을 cDNA 트랜스펙션된 종양 세포 (HLA-A2 트랜스펙션된 LnCaP, Skov3 또는 CAMA 종양 세포)에 대해 시험한다.
전체 유전자 기초 방법
CD8+ T 세포주를 프라이밍하고, 유전자-건 트랜스펙션된 수상 세포, 레트로바이러스 형질도입된 B7.1-트랜스펙션된 섬유아세포, 재조합 폭스 바이러스 (Kim et al.) 또는 아데노바이러스 (Butterfield et al.) 감염된 수상 세포로 자극시킨다. 바이러스 감염된 세포는 항원성 펩티드를 제공하기에 매우 효율적인데, 이는 항원이 높은 수준으로 발현되지만 바이러스 T 세포주의 과성장을 방지하기 위해 단 한번만 사용될 수 있기 때문이다.
교대 자극 후, CD8 라인을 상기 나타낸 바와 같이 cDNA-트랜스펙션된 종양 세포에 대해 시험한다. 펩티드 특이성 및 동일성이 면역학적 유효성을 확인하기 위해 결정된다.
참고문헌
Vitiello et al. (L. Sherman), J. Exp. Med., J. Exp. Med, 1991, 173:1007-1015.
Romani et al., J. Exp. Med., 1994, 180:83-93.
Kim et al., J. Immunother., 1997, 20:276-286.
Butterfield et al., J. Immunol., 1998, 161:5607-5613.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허출원을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 모든 문헌은, 각각의 개개의 문헌이 상세히 나타난 것처럼 본원에 참고문헌으로 포함되는 것으로 특이적으로 및 개별적으로 표시된 것과 같이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
Claims (16)
- SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편과 85% 이상의 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 폴리펩티드와, 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
- 제 1항에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2 또는 4의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편과 95% 이상의 동일성을 지님을 특징으로 하는 백신 조성물.
- SEQ ID NO:1 또는 3의 누클레오티드 서열 또는 면역원성 폴리펩티드를 코드화하는 이의 단편과 85% 이상의 동일성을 지니는 누클레오티드 서열을 포함하는 유효량의 폴리누클레오티드와, 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
- SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드와 함께 시험관내에서 로딩시킴으로써 변형되거나 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드를 발현하도록 시험관내에서 유전적으로 변형된 유효량의 항원 제시 세포와, 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, TH-1 유도성 애쥬반트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신.
- 제 5항에 있어서, TH-1 유도성 애쥬반트가 3D-MPL, QS21, QS21과 콜레스테롤의 혼합물 및 CpG 올리고누클레오티드를 포함하는 애쥬반트의 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 백신.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 규정된 폴리펩티드 또는 면역학적 단편에 대해 면역특이적인 항체.
- SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드의 기능을 자극하거나 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,(a) 후보 화합물에 직접 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해, 상기 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 막) 또는 이의 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 측정하는 방법;(b) 표지된 경쟁물질의 존재하에서, 상기 폴리펩티드 (또는 이러한 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 막) 또는 이의 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 측정하는 방법;(c) 상기 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 세포막에 적합한 검출 시스템을 사용하여, 후보 화합물이 상기 폴리펩티드의 활성화 또는 억제에 의해 발생되는 신호를 생성시키는 지의 여부를 시험하는 방법;(d) 후보 화합물을 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드를 함유하는 용액과 혼합시킴으로써 혼합물을 생성시키고, 혼합물내의 폴리펩티드의 활성을 측정하고, 혼합물의 활성을 표준과 비교하는 방법; 또는(e) 예를 들어 ELISA 검정을 사용하여, 세포내에서의 상기 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA 및 상기 폴리펩티드의 생성에 대한 후보 화합물의 효과를 검출하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 포함하는 방법.
- SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:1 또는 3의 폴리누클레오티드를 포유동물의 면역계로부터의 세포와 시험관내에서 인큐베이션시키고, 질병의 치료를 위해 이렇게 활성화된 면역 세포를 포유동물에 재주입시킴으로써 SEQ ID NO:1 내지 4 중 어느 하나의 분자에 대한 면역 반응을 시험관내에서 유도시키는 것을 포함하여, 면역예방 또는 치료에 의해 피검자를 치료하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 치료가 난소암 또는 결장암을 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
- SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드에 대한 작용제 또는 길항제.
- (a) SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드에 대한 작용제 또는 길항제;(b) SEQ ID NO:1 또는 3의 단리된 폴리누클레오티드; 또는(c) SEQ ID NO:2 또는 4 중의 어느 하나의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열의 발현을 조절하는 핵산 분자인, 치료용 화합물.
- 피검자로부터 유래된 샘플내의 폴리펩티드의 존재 또는 양을 분석하는 것을 포함하여, 피검자에서의 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드의 발현 또는 활성과 관련된 피검자내의 질병 또는 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
- 피검자로부터 유래된 샘플내의 폴리누클레오티드의 존재 또는 양을 분석하는 것을 포함하여, 피검자에서의 SEQ ID NO:1 또는 3의 폴리누클레오티드의 발현 또는 활성과 관련된 피검자내의 질병 또는 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
- 피검자로부터 유래된 샘플내의 폴리펩티드의 존재 또는 양을 분석하는 것을 포함하여, 피검자에서의 SEQ ID NO:2 또는 4의 폴리펩티드의 발현 또는 활성과 관련된 피검자내의 결장암 또는 결장암에 대한 감수성의 존재를 진단하는 방법.
- 피검자로부터 유래된 샘플내의 폴리누클레오티드의 존재 또는 양을 분석하는 것을 포함하여, 피검자에서의 SEQ ID NO:1 또는 3의 폴리누클레오티드의 발현 또는 활성과 관련된 피검자내의 결장암 또는 결장암에 대한 감수성의 존재를 진단하는 방법.
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