PT2750713E - Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas - Google Patents

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John A Flygare
Janet L Gunzner-Toste
Pillow Thomas
Howard Philip Wilson
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Genentech Inc
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Description

DESCRIÇÃO
PIRROLOBENZODIAZEPINAS E CONJUGADOS DAS MESMAS A presente invenção refere-se às pirrolobenzodiazepinas (PBDs), especialmente a pirrolobenzodiazepinas tendo um grupo protetor N10 lábil, na forma de um ligante para um agente de ligação celular. Antecedentes da Invenção Pirrolobenzodiazepinas
Algumas pirrolobenzodiazepinas (PBDs) têm a capacidade de reconhecer e ligar-se a sequências especificas do ADN; a sequência preferida é PuGPu. 0 primeiro antibiótico antitumoral PBD, a antramicina, foi descoberto em 1965 (Leimgruber, et ai., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et ai., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)) . Desde então, uma série de PDBs naturais foi relatada e mais de 10 vias sintéticas foram desenvolvidas para uma variedade de análogos (Thurston, et ai., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. e Thurston, D.E., Chem.
Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). Os membros da família incluem abeimicina (Hochlowski, et ai., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), chicamicina (Konishi, et ai., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Patente Japonesa 58-180 487;
Thurston, et ai., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et ai., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, et ai., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicinas A e B (Takeuchi, et ai., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, et ai., J.
Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, et ai, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley e
Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hara, et ai., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988);
Itoh, et ai., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicina (Leber, et ai., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992- 2993 (1988)) e tomamicina (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). As PBDs são da estrutura geral:
Estas diferem no número, no tipo e na posição de substituintes, nos seus anéis aromáticos A e nos seus anéis pirrol C no grau de saturação do anel C. No anel B, há uma imina (N=C), uma carbinolamina (NH-CH(OH)) ou um éter metilico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) na posição N10-C11 que é o centro eletrofilico responsável pela alquilação do ADN. Todos os produtos naturais conhecidos possuem configuração (S) na posição quiral Cila que lhes torcem em direção ao lado direito quando vistos do anel C para o anel A. Isto confere-lhes a forma tridimensional apropriada para isohelicidade com a fenda menor do ADN de forma B, levando a um encaixe perfeito no sitio de ligação (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nova York, pág. 3-11 (1975); Hurley e Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)) . A sua capacidade para formar um aduto na fenda menor, permite-lhes interferir com o processamento do ADN, dai a sua utilização como agentes antitumorais.
Os presentes inventores divulgaram previamente no documento WO 2005/085251, compostos PBD diméricos portando substituintes arilo C2, como:
Estes compostos demonstraram serem agentes citotóxicos altamente úteis.
Um composto pirrolbenzodiazepinico especialmente vantajoso é descrito por Gregson et al. {Chem. Commun. 1999, 797-798), como composto 1, e por Gregson et al. (J.
Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) como composto 4a. Este composto, também conhecido como SJG-136, é mostrado abaixo:
Os presentes inventores descreveram previamente que compostos PBD podem ser empregues como profármacos quando protegidos na posição N10 com um grupo protetor de azoto que é removível in vivo (documento WO 00/12507) . Muitos destes grupos protetores são carbamatos, e são, por exemplo, da estrutura:
onde o asterisco (*) indica o ponto de ligação ao átomo N10 da PBD.
Os presentes inventores também descreveram a preparação de compostos PBD com um grupo protetor do azoto do carbamato na posição N10 (documento WO 2005/023814). Os grupos protetores podem ser removidos da posição N10 da fração PBD para deixar uma ligação imina N10-C11. Uma variedade de grupos de proteção é descrita, incluindo grupos que podem ser clivados pela ação de enzimas. O documento WO 2007/085930 descreve a preparação de compostos PBD diméricos com grupos ligantes para a conexão com um agente de ligação celular, tal como um anticorpo. O ligante está presente na ponte que liga as unidades monoméricas da PBD do dimero.
Conjugados anticorpo-fármaco A terapêutica antibiótica foi estabelecida para o tratamento direcionado de pacientes com cancro, transtornos imunológicos e angiogénicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). A utilização de conjugados antibiótico-fármaco (ADC), ou seja, imunoconjugados, para a libertação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, fármacos que eliminam ou inibem células tumorais no tratamento de cancro, direciona a libertação da fração do fármaco para tumores e a sua acumulação intracelular nesses locais, enquanto que a administração sistémica desses conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bem como às células tumorais que se procurava eliminar (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6) :3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9) :1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther.
Patents 15 (9) :1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614). A eficácia máxima com toxicidade mínima é assim procurada. Os esforços para criar e refinar os ADC têm sido concentrados na seletividade de anticorpos monoclonais (mAbs) , bem como no mecanismo de ação dos fármacos, na ligação do fármaco, na razão fármaco/anticorpo (carga) e nas propriedades de libertação dos fármacos (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8) : 925-932; Dornan et al (2009) Blood 114 (13) :2721-2729; US 7521541; US 7723485; W02009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7) : 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8) :1 — 8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070) . As frações do fármaco podem transmitir os seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem a ligação à tubulina, a ligação ao ADN ou a inibição da topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ficar inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos ou a ligantes de recetores proteicos de grandes dimensões.
Os presentes inventores desenvolveram uma nova abordagem para formar conjugados de PBD com agentes de ligação celular e, especialmente, conjugados de PBD e anticorpos.
Sumário da Invenção
Num aspeto geral, a presente invenção proporciona um conjugado que compreende um composto PBD dimérico conectado através da posição N10 por meio de um ligante especifico de enxofre a um agente de ligação celular. 0 agente de ligação celular é de preferência um anticorpo.
Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona novos compostos conjugados da Fórmula (A):
e sais e solvatos dos mesmos, em que: as linhas a tracejado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre Cl e C2 ou C2 e C3; R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-Rd, =C(Rd)2, 0-S02-R, C02R e COR, e opcionalmente selecionado ainda a partir de halo ou dihalo; em que RD é independentemente selecionado a partir de R, C02R, COR, CHO, C02H e halo; R6 e R9 são independentemente selecionados a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn e halo; R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn e halo; Y é selecionado a partir de uma ligação simples e um grupo das fórmulas AI ou A2:
onde N mostra onde o grupo se liga ao N10 da fração PBD; R e R são mdependentemente selecionados a partir de H e metilo ou, em conjunto com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados, formam um grupo ciclopropileno; CBA representa um agente de ligação celular; Q é independentemente selecionado a partir de 0, Se NH; R11 é H ou R ou, quando Q for 0, S03M, em que M é um catião metálico; R e R' são selecionados cada um independentemente a partir de grupos alquilo Ci-22, heterociclilo C3-20 e arilo C5-20 opcionalmente substituídos e, opcionalmente em relação ao grupo NRR', R e R', em conjunto com o átomo de azoto ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico opcionalmente substituído de 4, 5, 6 ou 7 membros;
-| Q -IT 1 Λ -l-T -T em que R , R , R e R são conforme definidos para R , R6, R9 e R7 respetivamente; em que R" é um grupo alquileno C3-22, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, 0, S, N (H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos; X e X' são independentemente selecionados a partir de 0, S e N (H) .
Por conseguinte, a fórmula A é selecionada a partir das Fórmulas A-I, A-II e A-III abaixo, dependendo de Y:
Nos compostos da fórmula A:
é o grupo de ligação de enxofre.
Um segundo aspeto da presente invenção diz respeito à utilização de um conjugado do primeiro aspeto para proporcionar um composto da fórmula (B) ou (C) numa localização alvo:
e sais e solvatos do mesmo, em que os grupos são conforme para o primeiro aspeto, exceto que Q é independentemente selecionado a partir de 0, Se NH; e R11 é H, ou R ou, onde Q for 0, SO3M, onde M é um catião metálico.
Um terceiro aspeto da presente invenção também proporciona compostos da fórmula (D) para utilização na preparação dos compostos conjugados da invenção:
e sais e solvatos dos mesmos, em que os grupos são conforme definidos no primeiro aspeto da invenção.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção proporciona um conjugado que compreende um dimero de PBD conectado através da posição N10 numa das frações PBD por meio de um ligante especifico a um agente de ligação celular. A presente invenção é adequada para utilização no fornecimento de um composto PBD a um sitio preferido num indivíduo. 0 conjugado permite a libertação de um composto PBD ativo que não retém qualquer parte do ligante. Não existe qualquer resto presente que pudesse afetar a reatividade do composto PBD.
Preferências
As preferências seguintes podem aplicar-se a todos os aspetos da invenção conforme descritos acima, ou podem referir-se a um único aspeto. As preferências podem ser combinadas em qualquer combinação.
Ligação dupla
Numa forma de realização, não há ligação dupla presente entre Cl e C2, e C2 e C3. Numa forma de realização, as linhas a tracejado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C2 e C3, como mostrado abaixo:
Numa forma de realização, uma ligação dupla está presente entre C2 e C3 quando R2 for arilo C5-2o ou alquilo
Cl-12 ·
Numa forma de realização, as linhas a tracejado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre Cl e C2, como mostrado abaixo:
Numa forma de realização, uma ligação dupla está presente entre Cl e C2 quando R2 for arilo C5-2o ou alquilo
Ci-i2 . R2
Numa forma de realização, R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(Rd)2, 0-S02-R, C02R e COR, e opcionalmente selecionado ainda a partir de halo ou dihalo. Numa forma de realização, R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-Rd, =C(Rd)2, 0-S02-R, C02R e COR.
Numa forma de realização, R2 é independentemente selecionado a partir de H, =0, =CH2, R, =CH-RD e =C(RD)2.
Numa forma de realização, R2 é independentemente H.
Numa forma de realização, R2 é independentemente =0.
Numa forma de realização, R2 é independentemente =CH2.
Numa forma de realização, R2 é independentemente =CH-RD. Dentro do composto PBD, o grupo =CH-RD pode ter qualquer uma das configurações mostradas abaixo:
Numa forma de realização, a configuração é a configuração (I).
Numa forma de realização, R2 é independentemente =C (RD)2.
Numa forma de realização, R2 é independentemente =CF2.
Numa forma de realização, R2 é independentemente R.
Numa forma de realização, R2 é independentemente arilo C5-20 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente alquilo C1-12 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente arilo C5-20 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente arilo C5-7 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente arilo Cs-io opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente fenilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente tienilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente naftilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente piridilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 é independentemente quinolinilo ou isoquinolinilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R2 carrega um a três grupos subst ituintes, sendo que 1 e 2 são mais preferidos, e grupos individualmente substituídos sendo os mais preferidos. Os substituintes podem estar em qualquer posição.
Quando R2 é um grupo arilo C5-7, um único substituinte está de preferência num átomo do anel que não seja adjacente da ligação ao restante do composto, ou seja, é preferivelmente β ou γ em relação à ligação ao restante do composto. Portanto, quando o grupo arilo C5-7 é fenilo, o substituinte está de preferência nas posições meta ou para e, mais preferivelmente, na posição para.
Numa forma de realização, R2 é selecionado a partir de:
em que o asterisco indica o ponto de ligação.
Quando R7 é um grupo arilo Cs-icu por exemplo, quinolinilo ou isoquinolinilo, este pode carregar qualquer número de substituintes em qualquer posição dos anéis quinolina ou isoquinolina. Em algumas formas de realização, o grupo carrega um, dois ou três subst ituintes, e estes podem estar no anel proximal e no distai ou em ambos (se mais de um substituinte).
Numa forma de realização, quando R2 é opcionalmente substituído, os substituintes são selecionados a partir daqueles substituintes fornecidos na seção de substituintes abaixo.
Quando R é opcionalmente substituído, os substituintes são preferivelmente selecionados a partir de:
Halo, hidroxilo, éter, formilo, acilo, carboxi, éster, aciloxi, amino, amido, acilamido, aminocarboniloxi, ureído, nitro, ciano e tioéter.
Numa forma de realização, quando R ou R2 é opcionalmente substituído, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR', NO2, halo, C02R, COR, CONH2, CONHR e CONRR' .
Quando R2 é alquilo Ci-i2, o substituinte opcional pode incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-2o e arilo C5- 20 ·
Quando R2 é heterociclilo C3-2or o substituinte opcional pode incluir adicionalmente grupos alquilo C1-12 e arilo C5-20 ·
Quando R2 é o grupo arilo C5-2or o substituinte opcional pode incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 e alquilo C1-12 ·
Entende-se que o termo "alquilo" abrange as subclasses alquenilo e alquenilo, bem como cicloalquilo. Por conseguinte, quando R2 é alquilo C1-12 opcionalmente substituído, entende-se que o grupo alquilo opcionalmente contém uma ou mais ligações duplas ou triplas carbono-carbono, as quais podem formar parte de um sistema conjugado. Numa forma de realização, o grupo alquilo C1-12 opcionalmente substituído contém ao menos uma ligação dupla ou tripla carbono-carbono, e essa ligação está conjugada com uma ligação dupla presente entre Cl e C2 ou C2 e C3. Numa forma de realização, o grupo alquilo C1-12 é um grupo selecionado a partir de alquilo C1-12, alquenilo C2-12, alquinilo C2-12 e cicloalquilo C3-i2 saturados.
Se um substituinte em R2 for halo, é de preferência F ou Cl, mais preferivelmente F.
Se um substituinte em R2 for éter, pode em algumas formas de realização, ser um grupo alcoxi, por exemplo, um grupo alcoxi Ci_7 (por exemplo, metoxi, etoxi) ou pode, em algumas formas de realização, ser um grupo ariloxi C5-7 (por exemplo, fenoxi, piridiloxi, furaniloxi).
Se um substituinte em R2 for alquilo C1-7, pode preferivelmente ser um grupo alquilo C1-4 (por exemplo, metilo, etilo, propilo, butilo).
Se um substituinte em R2 for C3-7 heterociclilo pode, em algumas formas de realização, ser o grupo heterociclilo C6 contendo azoto, por exemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estes grupos podem estar ligados ao resto da fração PBD através do átomo de azoto. Estes grupos podem ser ainda substituídos, por exemplo, com grupos alquilo C1-4.
Se um substituinte em R2 for bis-oxi-alquileno C1-3, é de preferência bis-oxi-metileno ou bis-oxi-etileno.
Substituintes especialmente preferidos para R2 incluem metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinilo, morfolino e metil-tienilo.
Grupos R2 substituídos especialmente preferidos incluem, entre outros, 4-metoxi-fenilo, 3-metoxifenilo, 4-etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-metil-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-cloro-fenilo, 3,4-bisoximetileno-fenilo, 4-metiltienilo, 4-cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo e quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinaftilo e naftilo.
Numa forma de realização, R2 é halo ou dihalo. Numa forma de realização, R2 é -F ou -F2, cujos subst ituintes estão ilustrados abaixo como (III) e (IV) respetivamente:
Em algumas formas de realização, é preferível que haja uma ligação dupla entre C2 e C3 ou o substituinte de C2 está ligado ao anel PBD por uma ligação dupla (ou seja, que o átomo de C em C2 seja um centro sp2) .
Rd
Numa forma de realização, RD é independentemente selecionado a partir de R, C02R, COR, CHO, C02H e halo.
Numa forma de realização, RD é independentemente R.
Numa forma de realização, RD é independentemente halo. R6
Numa forma de realização, R6 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn- e halo.
Numa forma de realização, R6 é independentemente selecionado a partir de H, OH, OR, SH, NH2, N02 e halo.
Numa forma de realização, R6 é independentemente selecionado a partir de H e halo.
Numa forma de realização, R6 é independentemente H.
Numa forma de realização, R6 e R7 em conjunto formam um grupo -0-(CH2) p-0-, onde pé 1 ou 2. R7 R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn e halo.
Numa forma de realização, R7 é independentemente OR.
Numa forma de realização, R e independentemente OR , em que R7A é independentemente alquilo Ci_6 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R7A é independentemente alquilo C3-6 saturado opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R7A é independentemente alquenilo C2-4 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R7A é independentemente Me.
Numa forma de realização, R7A é independentemente CH2Ph.
Numa forma de realização, R7A é independentemente alilo. R9
Numa forma de realização, R9 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn- e halo.
Numa forma de realização, R9 é independentemente H.
Numa forma de realização, R9 é independentemente R ou OR.
Grupo de ligação 0 grupo de ligação pode ser removido da posição N10 da fração PBD no conjugado da Fórmula A para deixar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina substituída, em que QR11 é OSO3M, um aduto bissulfeto, uma tiocarbinolamina, uma tiocarbinolamina substituída ou uma carbinalamina substituída (composto das Fórmulas B ou C) conforme ilustrados abaixo:
onde R e M são conforme definidos para os conjugados da invenção.
Numa forma de realização, o grupo de ligação pode ser removido da posição N10 da fração PBD para deixar uma ligação imina N10-C11. 0 elo específico entre o dímero PBD e o agente de ligação celular, por exemplo, anticorpo, na presente invenção é de preferência estável em meio extracelular. Antes de ser transportado ou libertado numa célula, o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é preferivelmente estável e permanece intacto, ou seja, o anticorpo permanece ligado à fração do fármaco. Os ligantes são estáveis fora do alvo celular e podem ser clivados com alguma taxa de eficiência no interior da célula. Um ligante eficaz: (i) manterá as propriedades de ligação específica do anticorpo; (ii) permitirá a libertação intracelular do conjugado ou da fração do fármaco; (iii) permanecerá estável e intacto, ou seja, não clivado, até que o conjugado tenha sido libertado ou transportado para o seu sítio alvo; e (iv) manterá um efeito citotóxico de eliminação celular ou um efeito citostático da porção do fármaco PBD. A estabilidade do ADC pode ser medida por técnicas analíticas padrão, como espectroscopia de massa, HPLC e a técnica de LC/MS de separação/análise. A distribuição dos compostos das fórmulas B ou C é alcançada no sitio de ativação desejado dos conjugados da Fórmula A pela ação de uma enzima no grupo de ligação. 0 S do conjugado da Fórmula A é ligado por uma ponte dissulfeto a um S livre (tiol ativo) no agente de ligação celular. 0 grupo de ligação pode ser clivável pela ação de uma enzima. Numa forma de realização, a enzima é uma tioredutase.
Certos anticorpos possuem dissulfetos entre a cadeia que podem ser reduzidos, ou seja, pontes de cisteina. Os anticorpos podem tornar-se reativos para a conjugação com reagentes ligantes pelo tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteina formará assim, teoricamente, dois nucleófilos reativos de tiol. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos por meio da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina num tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) introduzindo um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteina (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos do aminoácido cisteina não nativos). 0 documento US 7521541 ensina a construir anticorpos pela introdução de resíduos reativos de cisteina. R e R são selecionados a partir de H e metilo, ou em conjunto com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados formam a grupo ciclopropileno. Em algumas formas de realização, os dois são H. Noutra forma de realização, os dois são metilo. Em formas de realização adicionais, um é H e o outro é metilo; nessas formas de realização, o átomo de carbono ao qual se encontram ligados é um centro quiral.
Em algumas formas de realização, Y é uma ligação simples.
Em outras formas de realização, Y é >0
Ijí (AI}.
Em formas de realização adicionais, Y é
H (A2).
Q
Numa forma de realização, Q é selecionado a partir de 0, S ou N (H) .
De preferência, Q é 0. R11
Numa forma de realização, R11 é H ou R, ou, quando Q for 0, SO3M, em que M é um catião metálico.
Numa forma de realização, R11 é H.
Numa forma de realização, R11 é R.
Numa forma de realização, na qual Q é 0, R11 é S03M, em que M é um catião metálico. 0 catião pode ser Na+.
Agente de ligação celular
Um agente de ligação celular pode ser de qualquer tipo e inclui péptidos e não péptidos. Estes podem incluir anticorpos ou um fragmento de anticorpo que contenha pelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormonas, fatores de crescimento, moléculas de transporte de nutrientes ou qualquer outra molécula ou substância que se liga a células. 0 termo "anticorpo", no presente documento, é utilizado no sentido mais amplo, abrangendo especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dimeros, multimeros, anticorpos multiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos) e fragmentos de anticorpos, desde que estes exibam a atividade biológica desejada (Miller et al (2003) Jour, of Immunology 170:4854-4861). Os anticorpos podem ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunitário que é capaz de reconhecer e ligar-se a um antigénio específico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5- ed., Garland Publishing, Nova York). Um alvo antigénico possui geralmente inúmeros sítios de ligação, também denominados epítopos, reconhecidos por CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especif icamente a um epítopo diferente possui uma estrutura diferente. Assim, um antigénio pode ter mais de um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula completa de imunoglobulina ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula completa de imunoglobulina, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação a antigénio que se liga especificamente a um antigénio de um alvo de interesse ou parte deste, em que tais alvos incluem, entre outros, célula cancerosa ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. A imunoglobulina pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas a partir de qualquer espécie, inclusive de origem humana, murina ou de coelho. "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento completo, em geral a região de ligação a antigénio ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab,
Fab', F(ab')2 e Fv; diabodies; anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotipicos (anti-Id), CDR (região determinante de complementaridade) e fragmentos de ligação a epitopo de qualquer um dos precedentes que se liguem imunoespecificamente a antigénios de células cancerosas, antigénios virais ou antigénios microbianos, moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpos. 0 termo "anticorpo monoclonal" conforme utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população formada por anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto por mutações possíveis ocorridas naturalmente que podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e direcionam-se contra um único sitio antigénico. Além do mais, ao contrário de preparados de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a uma única determinante no antigénio. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos no sentido de que podem ser sintetizados sem a contaminação por outros anticorpos. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como tendo sido obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deverá ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al (1975) Nature 256:495, ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (veja-se, o documento US 4816567) . Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597.
Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou da leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que estes exibam a atividade biológica desejada (documento US 4816567; e Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos "primatizados" que compreendem sequências de ligação a antigénio de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do velho mundo ou símio) e sequências da região constante humana.
Um "anticorpo intacto" no presente documento é aquele que compreende domínios VL e VH, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequências nativas (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou de uma sequência variante de aminoácidos dos mesmos. 0 anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções efetoras" que se refiram àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc da sequência variante de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação a Clq; citotoxicidade dependente do complemento; ligação de Fc a recetores; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulação negativa de recetores da superfície celular tais como recetor de células B e BCR.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a "classes" diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE,
IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeias pesadas correspondentes às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respetivamente. As estruturas e configurações tridimensionais das subunidades de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
Exemplos de agentes de ligação celular incluem aqueles agentes descritos para utilização no documento WO 2007/085930. O agente de ligação celular pode ser ou compreender um polipéptido. O polipéptido pode ser um polipéptido cíclico. O agente de ligação celular pode ser um anticorpo. Portanto, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um conjugado anticorpo-fármaco (ADC).
Carga de fármaco
A carga de fármaco é o número médio de fármacos PBD por anticorpo. A carga de fármaco pode variar de 1 a 8 fármacos (D) por anticorpo (Ab), ou seja, em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 frações de fármaco estão ligadas covalentemente ao anticorpo. As composições de ADC incluem coleções de anticorpo conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 8. O número médio de fármacos por anticorpos em preparados de ADC provenientes de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA, eletroforese e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Pela técnica ELISA, o valor de p, calculado em média, numa determinada preparação de ADC pode ser determinado (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852) . Contudo, a distribuição de valores de p (fármaco) não é discernivel pela ligação de anticorpo-antigénio e por limitação da deteção pelo ensaio ELISA. Além disso, o ensaio ELISA para a deteção de conjugados anticorpo-fármaco não determina quando as frações de fármaco estão ligadas ao anticorpo, tais como fragmentos da cadeia pesada ou da cadeia leve, ou aos resíduos específicos de aminoácidos. Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de ADC homogéneo, quando p é um determinado valor de ADC com outras cargas de fármacos, podem ser alcançadas por meios como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ter apenas um ou diversos grupos tióis de cisteínas, ou pode ter apenas um ou diversos grupos tióis suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser ligado. Cargas mais altas de fármaco, por exemplo, p >5, podem provocar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda da permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco.
Tipicamente, menos do que o máximo teórico de frações de fármacos são conjugadas a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário do ligante de fármaco (D-L) ou o reagente do ligante. Somente os grupos mais reativos de lisina podem reagir com um reagente do ligante reativo a aminas. Além disso, somente os grupos mais reativos de tióis de cisteínas podem reagir com um ligante reativo a tióis. Em geral, os anticorpos não contêm muitos, se algum, grupos tióis livres e reativos de cisteínas que possam ser ligados a uma fração de fármaco. A maioria dos resíduos tióis de cisteínas nos anticorpos dos compostos existe como pontes dissulfetos que precisam ser reduzidos com um agente redutor como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, em condições redutoras parciais ou totais. A carga (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diversas maneiras diferentes, inclusive: (i) limitar o excesso molar de intermediário do ligante de fármaco (D-L) ou reagente do ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitar o tempo ou a temperatura da reação de conjugação e (iii) condições redutoras parciais ou limitantes para a modificação de tióis de cisteínas.
Aminoácidos cisteína podem ser manipulados em sítios reativos num anticorpo e que não formam ligações dissulfetos dentro da cadeia ou intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8) : 925-932; Dornan et al (2009) Blood 114 (13) :2721-2729; documento US 7521541; documento US 7723485; documento W02009/052249, Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52) . Os tióis de cisteínas construídas podem reagir com reagentes do ligante ou reagentes do fármaco-ligante da presente invenção que tenham grupos eletrofílicos reativos ao tiol tais como maleimida ou alfa-halo amidas para formar ADC com anticorpos manipulados com cisteínas (ThioMabs) e as frações PBD de fármacos. A localização da fração de fármaco pode ser assim desenhada, controlada e conhecida. A carga de fármaco pode ser controlada, pois os grupos tióis de cisteínas manipuladas reagem tipicamente com reagentes do ligante reativos ou reagentes do fármaco-ligante reativos ao tiol em alto rendimento. A manipulação de um anticorpo IgG para introduzir um aminoácido cisteína por substituição em um único sítio na cadeia pesada ou na leve fornece duas novas cisteínas no anticorpo simétrico. Uma carga de fármaco próxima de 2 pode ser alcançada e próxima da homogeneidade do ADC produzido pela conjugação.
Quando mais de um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo reage com um intermediário do fármaco-ligante, ou o reagente do ligante seguido pelo reagente da fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com porções distribuídas de fármacos ligadas a um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, etc. Métodos de cromatografia líquida, tais como de fase reversa polimérica (PLRP) e por interação hidrofóbica (HIC) podem separar os compostos na mistura por valor de carga de fármaco. Preparados de ADC com um único valor de carga de fármaco (p) podem ser isolados, contudo, estes ADCs de valor único de carga podem ainda ser misturas heterogéneas, pois as frações de fármaco podem estar ligadas, através do ligante, em diferentes sítios no anticorpo.
Dessa forma, as composições de conjugados anticorpo-fármaco da invenção incluem misturas de compostos de conjugados anticorpo-fármaco, em que o anticorpo possui uma ou mais porções de PBD e em que as frações de fármaco podem estar ligadas ao anticorpo em vários resíduos de aminoácidos.
Numa forma de realização, o número médio de grupos de dímeros de pirrolobenzodiazepina por agente de ligação celular está no intervalo de 1 até 20. Em algumas formas de realização, o intervalo é selecionado a partir de 1 a 8, 2 a 8, 2a6, 2a4e4a8.
Em algumas formas de realização, há um grupo de dímero de pirrolobenzodiazepina por agente de ligação celular. Péptidos
Numa forma de realização, o agente de ligação celular é um péptido linear ou cíclico compreendendo 4-20, de preferência 6-20 resíduos contíguos de aminoácidos. Nesta forma de realização, é preferível que um agente de ligação celular seja ligado a um composto monomérico ou dimérico de pirrolobenzodiazepina.
Numa forma de realização, o agente de ligação celular compreende um péptido que se liga a integrina ανβδ· 0 péptido pode ser seletivo para ανβ6 sobre XYS.
Numa forma de realização, o agente de ligação celular compreende o polipéptido A20FMDV-Cys. 0 A20FMDV-Cys possui a sequência: NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Alternativamente, uma variante da sequência A20FMDV-Cys pode ser utilizada, na qual um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácidos são substituídos por outro resíduo de aminoácido.
Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal; anticorpo quimérico; anticorpo humanizado; anticorpo inteiramente humano; ou um anticorpo de cadeia única. Numa forma de realização, o anticorpo é um fragmento desses anticorpos que tem atividade biológica. Exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv.
Nestas formas de realização, cada anticorpo pode ser ligado a um ou a diversos grupos de dimeros de pirrolobenzodiazepina. As razões preferidas de pirrolobenzodiazepina para agente de ligação celular são fornecidas acima. 0 anticorpo pode ser um anticorpo de domínio (DAB).
Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
Os anticorpos para utilização na presente invenção incluem aqueles anticorpos descritos no documento WO 2005/082023. São especialmente preferidos aqueles anticorpos para antigénios associados a tumores. Exemplos destes antigénios conhecidos na técnica incluem, entre outros, aqueles antigénios associados a tumores constantes no documento WO 2005/082023. Vejam-se, por exemplo, as páginas 41-55.
Os conjugados da invenção são desenhados contra células tumorais alvo através dos seus antigénios da superfície celular. Os antigénios são normalmente antigénios de superfície de células normais que estão superexpressos ou que são expressos em momentos anormais. De modo ideal, o alvo antigénico é expresso somente em células proliferativas (de preferência, células tumorais), contudo, na prática, isto é raramente observado. Como resultado, os alvos antigénicos são geralmente selecionados com base na expressão diferencial entre tecido proliferativo e tecido saudável.
Foram criados anticorpos contra alvos antigénicos relacionados a tumores específicos, incluindo:
Cripto, CD30, CD19, CD33, Glicoproteína NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (antigénio da membrana específico da próstata), BCMA, CD20, CD70, E-selectina, EphB2,
Melanotransferina, Mucl6 e TMEFF2.
Antigénios associados a tumores (TAA) são conhecidos na técnica e podem ser preparados para utilização na geração de anticorpos empregando métodos e informações que são bem conhecidos na técnica. Em tentativas para descobrir alvos celulares eficazes para o diagnóstico e a terapêutica de cancro, os investigadores procuraram identificar polipéptidos de transmembrana ou de outra forma associados a tumores que são especificamente expressos sobre a superfície de um ou mais tipos em particular de célula cancerosa, quando comparado à expressão sobre uma ou mais células normais não cancerosas. Frequentemente, tais polipéptidos associados a tumores são expressos mais abundantemente sobre a superfície das células cancerosas em comparação à expressão sobre a superfície das células não cancerosas. A identificação de tais polipéptidos antigénicos da superfície celular associados a tumores deu origem à capacidade para destruir especificamente células cancerosas alvo por meio de terapêuticas à base de anticorpos.
Exemplos de TAA incluem, entre outros, os TAA (1)-(36) listados abaixo. Por conveniência, as informações relativas a estes antigénios, todas as quais conhecidas na técnica, estão listadas abaixo e incluem nomes, nomes alternativos, números de acesso no Genbank e referências primárias, seguidos pelas convenções para identificação de sequências de ácidos nucleicos e de proteínas do National Center for Biotechnology Information (NCBI). As sequências de ácidos nucleicos e de proteínas correspondentes aos TAA (1)-(36) estão disponíveis em bancos de dados públicos tais como o GenBank. Os antigénios associados a tumores contra os quais são direcionados anticorpos incluem todas as variantes de sequências de aminoácidos e isoformas que possuem pelo menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência em relação às sequências identificadas nas referências citadas, ou que exibem substancialmente as mesmas propriedades ou características biológicas que um TAA cuja sequência se encontra nas referências citadas. Por exemplo, um TAA com uma sequência variante geralmente é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo que se liga especif icamente ao TAA com a sequência correspondente citada. ANTIGÉNIOS ASSOCIADOS A TUMORES (1)-(36): (I) BMPR1B (Recetor de proteínas morfogenéticas ósseas tipo IB, N— de acesso no GenBank NM_001203) ten Dijke,P., et ai Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (II) :1377-1382 (1997); W02004/063362 (Reivindicação 2); W02003/042661 (Reivindicação 12); US2003/134790-A1 (Página 38-39); W02002/102235 (Reivindicação 13; Página 296); W02003/055443 (Página 91-92); WO2002/99122 (Exemplo 2; Página 528-530); W02003/029421 (Reivindicação 6); W02003/024392 (Reivindicação 2; Figura 112); WO2002/98358 (Reivindicação 1; Página 183); W02002/54940 (Página 100-101); W02 002/59377 (Página 349-350); W02002/30268 (Reivindicação 27; Página 376); W02001/48204 (Exemplo; Figura 4); NP_001194 recetor de proteínas morfogenéticas ósseas, tipo IB /pid=NP_001194.1. Referências cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994 (2) E16 (LATI, SLC7A5, N£ de acesso no GenBank NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273; W02004/048938 (Exemplo 2); W02004/032842 (Exemplo IV); W02003/042661 (Reivindicação 12); W02003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/78524 (Exemplo 2); W02002/99074 (Reivindicação 19; Página 127-129); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); W02003/003906 (Reivindicação 10; Página 293); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 93-95); W02000/14228 (Reivindicação 5; Página 133-136); US2003/224454 (Figura 3); W02003/025138 (Reivindicação 12; Página 150); NP_003477 família 7 de portador de soluto (transportador de aminoácidos catiónicos, y+sistema), membro 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; Referências cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_0 0 34 8 6_1 (3) STEAP1 (antigénio epitelial de seis domínios transmembrana da próstata, N£ de acesso no GenBank NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96 (25):14523-14528; W02004/065577 (Reivindicação 6); W02004/027049 (Figura 1L) ; EP1394274 (Exemplo 11) ; W02004/016225 (Reivindicação 2); W02003/042661 (Reivindicação 12); US2003/157089 (Exemplo 5); US2003/185830 (Exemplo 5); US2003/064397 (Figura 2); WO2002/89747 (Exemplo 5; Página 618-619); W02003/022995 (Exemplo 9; Figura 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Figura 2A) ; NP_036581 antigénio epitelial de seis domínios transmembrana da próstata; Referências cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1 (4) 0772P (CA125, MUC16, N£ de acesso no GenBank AF 3 614 8 6); J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001); W02004/045553 (Reivindicação 14); WO2002/92836 (Reivindicação 6; Figura 12); WO2002/83866 (Reivindicação 15; Página 116-121); US2003/124140 (Exemplo 16); Referências cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1 (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócitos, mesotelina, N£ de acesso no GenBank NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96 (20):11531— 11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995); W02003/101283 (Reivindicação 14); W02002/102235 (Reivindicação 13; Página 287-288); W02002/101075 (Reivindicação 4; Página 308-309); WO2002/71928 (Página 320-321); WO94/10312 (Página 52-57); Referências cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1 (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família 34 de portador de soluto (fosfato de sódio), membro 2, transportador 3b dependente de fosfato de sódio tipo II, N£ de acesso no GenBank NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582; W02004/022778 (Reivindicação 2); EP1394274 (Exemplo 11); W02002/102235 (Reivindicação 13; Página 326); EP0875569 (Reivindicação 1; Página 17-19); W02001/57188 (Reivindicação 20; Página 329); W02004/032842 (Exemplo IV); W02001/75177 (Reivindicação 24; Página 139-140); Referências cruzadas: MIM:604217; NP_0 0 6415.1; NM_006424_1 (7) Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N£ de acesso no GenBank AB040878); Nagase T., et al (2000) DNA Res. 1 (2) :143-150; W02004/000997 (Reivindicação 1); W02003/003984 (Reivindicação 1); W02002/06339 (Reivindicação 1; Página 50); W02001/88133 (Reivindicação 1; Página 41-43, 48-58); W02003/054152 (Reivindicação 20); W02003/101400 (Reivindicação 11); Acesso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95 9 6 9.1. Genew; HGNC:10737 (8) PSCA hlg (27000 5 0C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gene RIKEN cDNA 2700050C12, N- de acesso no GenBank AY358628); Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003/129192 (Reivindicação 2); US2004/044180 (Reivindicação 12); US2004/044179 (Reivindicação 11); US2003/096961 (Reivindicação 11); US2003/232056 (Exemplo 5); W02003/105758 (Reivindicação 12); US2003/206918 (Exemplo 5); EP1347046 (Reivindicação 1); W02003/025148 (Reivindicação 20); Referências cruzadas: GI:37182378; AAQ 8 8 9 91.1; AY358628_1 (9) ETBR (Recetor tipo B de endotelina, N£ de acesso no
GenBank AY275463); Nakamuta M. , et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem.
Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al
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Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al
Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. Ill, 198-206; W02004/045516 (Reivindicação 1); W02004/048938 (Exemplo 2); W02004/040000 (Reivindicação 151); W02003/087768 (Reivindicação 1); W02003/016475 (Reivindicação 1); W02003/016475 (Reivindicação 1); W02002/61087 (Figura 1); W02003/016494 (Figura 6); W02003/025138 (Reivindicação 12; Página 144); W02001/98351 (Reivindicação 1; Página 124-125); EP0522868 (Reivindicação 8; Figura 2); W02001/77172 (Reivindicação 1; Página 297-299); US2003/109676; US6518404 (Figura 3); US5773223 (Reivindicação la; Col 31-34); W02004/001004 (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N£ de acesso no GenBank NM_017763); WO2003/104275 (Reivindicação 1); W02004/046342 (Exemplo 2); W02003/042661 (Reivindicação 12); W02003/083074 (Reivindicação 14; Página 61); W02003/018621 (Reivindicação 1); W02003/024392 (Reivindicação 2; Figura 93); WO2001/66689 (Exemplo 6); Referências cruzadas: LocusID:54 8 94; NP_060233.2; NM_017763_1 (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao cancro de próstata, proteína 1 associada ao cancro de próstata, antigénio epitelial de seis domínios transmembrana da próstata 2, proteína seis domínios transmembrana da próstata, N£ de acesso no GenBank AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002); W02003/087306; US2003/064397 (Reivindicação 1; Figura 1); WO2002/72596 (Reivindicação 13; Página 54-55); WO2001/72962 (Reivindicação 1; Figura 4B) ; W02003/104270 (Reivindicação 11); W02003/104270 (Reivindicação 16); US2004/005598 (Reivindicação 22); W02003/042661 (Reivindicação 12); US2003/060612 (Reivindicação 12; Figura 10); WO2002/26822 (Reivindicação 23; Figura 2); WO2002/16429 (Reivindicação 12; Figura 10); Referências cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1 (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catiões de potencial de recetor transiente , subfamilia M, membro 4, N- de acesso no GenBank NM_017636); Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19) :10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003); US2003/143557 (Reivindicação 4); W02000/40614 (Reivindicação 14; Página 100-103); W02002/10382 (Reivindicação 1; Figura 9A) ; W02003/042661 (Reivindicação 12); W02002/30268 (Reivindicação 27; Página 391); US2003/219806 (Reivindicação 4); WO2001/62794 (Reivindicação 14; Figura 1A-D); Referências cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1 (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N- de acesso no GenBank NP_003203 ou NM_003212); Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991); US2003/224411 (Reivindicação 1); W02003/083041 (Exemplo 1); W02003/034984 (Reivindicação 12); W02002/88170 (Reivindicação 2; Página 52-53); W02003/024392 (Reivindicação 2; Figura 58); W02002/16413 (Reivindicação 1; Página 94-95, 105); W02002/22808 (Reivindicação 2; Figura 1); US5854399 (Exemplo 2; Col 17-18); US5792616 (Figura 2); Referências cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1 (14) CD21 (CR2 (Recetor do complemento 2) ou C3DR (C3d/ recetor do virus Epstein Barr) ou Hs.73792 N£ de acesso no GenBank M26004); Fujisaku et al (1989) J. Blol. Chem. 264 (4) :2118-2125; Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; W02004/045520 (Exemplo 4); US2004/005538 (Exemplo 1); W02003/062401 (Reivindicação 9); W02004/045520 (Exemplo 4); WO91/02536 (Figura 9.1- 9.9); W02004/020595 (Reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1. (15) CD79b (CD79B, Οϋ79β, IGb (beta associado à imunoglobulina), B29, N£ de acesso no GenBank NM_000626 ou 11038674); Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625; W02004/016225 (Reivindicação 2, Figura 140); W02003/087768, US2004/101874 (Reivindicação 1, página 102); W02003/062401 (Reivindicação 9); WO2002/78524 (Exemplo 2); US2002/150573 (Reivindicação 5, página 15); US5644033; W02003/048202 (Reivindicação 1, páginas 306 e 309); WO 99/58658, US6534482 (Reivindicação 13, Figura 17A/B); WO2000/55351 (Reivindicação 11, páginas 1145- 1146); Referências cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_0 0 0 62 6_1 (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína la fosfatase contendo domínio SH2 de ancoragem), SPAP1B, SPAP1C, N£ de acesso no GenBank NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; W02004/016225 (Reivindicação 2); W02003/077836; W02001/38490 (Reivindicação 5; Figura 18D-1-18D-2); W02003/097803 (Reivindicação 12); W02003/089624 (Reivindicação 25); Referências cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1 (17) HER2 (ErbB2, N£ de acesso no GenBank M11730);
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139;
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Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; W02004/048938 (Exemplo 2); W02 004/027049 (Figura II); W02004/009622; W02003/081210; W02003/089904 (Reivindicação 9); W02003/016475 (Reivindicação 1); US2003/118592; W02003/008537 (Reivindicação 1); W02003/055439 (Reivindicação 29; Figura 1A-B); W02003/025228 (Reivindicação 37; Figura 5C) ; WO2002/22636 (Exemplo 13; Página 95-107); W02002/12341 (Reivindicação 68; Figura 7); WO2002/13847 (Página 71-74); W02002/14503 (Página 114-117); WO2001/53463 (Reivindicação 2; Página 41-46); W02001/41787 (Página 15); W02000/44899 (Reivindicação 52; Figura 7); W02000/20579 (Reivindicação 3; Figura 2); US5869445 (Reivindicação 3; Col 31-38); WO9630514 (Reivindicação 2; Página 56-61); EP1439393 (Reivindicação 7) ; W02004/043361 (Reivindicação 7); W02004/022709; W02001/00244 (Exemplo 3; Figura 4); Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1 (18) NCA (CEACAM6, N2 de acesso no GenBank M18728);
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; W02004/063709; EP1439393 (Reivindicação 7); W02004/044178 (Exemplo 4); W02004/031238; W02003/042661 (Reivindicação 12); WO2002/78524 (Exemplo 2); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Página 427); W02002/60317 (Reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728 (19) MDP (DPEP1, N2 de acesso no GenBank BC017023); Proc.
Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002); W02003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 85-87); JP05003790 (Figura 6- 8) ; W099/46284 (Figura 9); Referências cruzadas: MIM:17 97 8 0; AAH17023.1; BC017023_1 (20) IL2 0ROC (IL2 ORa, ZCYTOR7, N2 de acesso no GenBank AF184971); Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/005320 (Exemplo 5); W02003/029262 (Página 74-75); W02003/002717 (Reivindicação 2; Página 63); WO2002/22153 (Página 45-47); US2002/042366 (Página 20-21); W02001/46261 (Página 57-59); WO2001/46232 (Página 63-65); W098/37193 (Reivindicação 1; Página 55-59); Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1. (21) Brevican (BCAN, BEHAB, N£ de acesso no GenBank AF22 9 0 53) ; Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003/186372 (Reivindicação 11); US2003/186373 (Reivindicação 11); US2003/119131 (Reivindicação 1; Figura 52); US2003/119122 (Reivindicação 1; Figura52); US2003/119126 (Reivindicação 1); US2003/119121 (Reivindicação 1; Figura 52); US2003/119129 (Reivindicação 1); US2003/119130 (Reivindicação 1); US2003/119128 (Reivindicação 1; Figura 52); US2003/119125 (Reivindicação 1); W02003/016475 (Reivindicação 1); W02002/02634 (Reivindicação 1) (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, N£ de acesso no GenBank NM_004442); Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000); W02003042661 (Reivindicação 12); W0200053216 (Reivindicação 1; Página 41); W02004065576 (Reivindicação 1); W02004020583 (Reivindicação 9); W02003004529 (Página 128-132); W0200053216 (Reivindicação 1; Página 42); Referências cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1 (23) ASLG659 (B7h, N£ de acesso no GenBank AX092328); US2004/0101899 (Reivindicação 2); W02003104399 (Reivindicação 11); W02004000221 (Figura 3); US2003/165504 (Reivindicação 1); US2003/124140 (Exemplo 2); US2003/065143 (Figura 60); W02002/102235 (Reivindicação 13; Página 299); US2003/091580 (Exemplo 2); W02002/10187 (Reivindicação 6; Figura 10); W02001/94641 (Reivindicação 12; Figura 7b); W02002/02624 (Reivindicação 13; Figura 1A-1B) ; US2002/034749 (Reivindicação 54; Página 45-46); W02002/06317 (Exemplo 2; Página 320-321, Reivindicação 34; Página 321-322); WO2002/71928 (Página 468-469); W02002/02587 (Exemplo 1; Figura 1); W02001/40269 (Exemplo 3; Páginas 190-192); W02000/36107 (Exemplo 2; Página 205-207); W02004/053079 (Reivindicação 12); W02003/004989 (Reivindicação 1); WO2002/71928 (Página 233-234, 452-453); WO 01/16318 (24) PSCA (Precursor do antigénio de células estaminais da próstata, N£ de acesso no GenBank AJ297436); Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275 (3) : 783-788; W02 004/022709; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/018553 (Reivindicação 17); W02003/008537 (Reivindicação 1); WO2002/81646 (Reivindicação 1; Página 164); W02003/003906 (Reivindicação 10; Página 288); W02001/40309 (Exemplo 1; Figura 17); US2001/055751 (Exemplo 1; Figura lb) ; W02000/32752 (Reivindicação 18; Figura 1); WO98/51805 (Reivindicação 17; Página 97); W098/51824 (Reivindicação 10; Página 94); W098/40403 (Reivindicação 2; Figura 1B) ; Acesso: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1 (25) GEDA (N£ de acesso no GenBank AY260763); AAP14954 proteína semelhante ao parceiro de fusão HMGIC do lipoma /pid=AAP14954.1 - Homo sapiens (humana); W02003/054152 (Reivindicação 20); W02003/000842 (Reivindicação 1); W02003/023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US2003/194704 (Reivindicação 45); Referências cruzadas: GI : 30102449; AAP14954.1; AY260763_1 (26) BAFF-R (recetor do fator ativador de células B, recetor BLyS 3, BR3, N£ de acesso no GenBank AF116456); recetor BAFF /pid=NP_443177.1 - Homo sapiens: Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); W02004/058309; W02004/011611; W02003/045422 (Exemplo; Página 32-33); W02003/014294 (Reivindicação 35; Figura 6B) ; W02003/035846 (Reivindicação 70; Página 615-616); WO2002/94852 (Col 136-137); WO2002/38766 (Reivindicação 3; Página 133); W02002/24909 (Exemplo 3; Figura 3);
Referências cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052 94 5_1; AF132600 (27) CD22 (isoforma CD22-B do recetor de células B, BL- CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, N£ de acesso no GenBank AK026467); Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; W02003/072036 (Reivindicação 1; Figura 1);
Referências cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1 (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa associado à imunoglobulina, uma proteína específica de células B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo sobre a superfície com moléculas de Ig M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de células B) , pi: 4,84, MM: 25028 TM: 2 [P] Gene
Chromosome: 19ql3.2, N£ de acesso no GenBank NP_0 017 7 4.10); W02003/088808, US2003/0228319; W02003/062401 (Reivindicação 9); US2002/150573 (Reivindicação 4, páginas 13-14); W099/58658 (Reivindicação 13, Figura 16); WO92/07574 (Figura 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:1621-1625;
Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4) :287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141- 146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464 (29) CXCR5 (recetor 1 do linfoma de Burkitt, um recetor ligado à proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócitos e na defesa humoral, participa na infeção pelo VIH-2 e talvez no desenvolvimento da SIDA, linfoma, mieloma e leucemia); 372 aa, pi: 8,54 MM: 41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: llq23.3, N- de acesso no GenBank NP_001707.1; W02004/040000; W02004/015426; US2003/105292 (Exemplo 2); US6555339 (Exemplo 2); W02002/61087 (Figura 1); W02001/57188 (Reivindicação 20, página 269); W02001/72830 (Páginas 12-13); W02000/22129 (Exemplo 1, páginas 152- 153, Exemplo 2, páginas 254-256); W099/28468 (Reivindicação 1, página 38); US5440021 (Exemplo 2, col 49-52); W094/28931 (Páginas 56-58); W092/17497 (Reivindicação 7, Figura 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779 (30) HLA-DOB (subunidade beta de moléculas de MHC classe II (antigénio Ia) que se liga a péptidos e os apresenta a linfócitos T CD4 + ) ; 273 aa, pi: 6,56, MM: 30820. TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, N£ de acesso no GenBank NP_002111.1); Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Blol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sei USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Blol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; W099/58658 (Reivindicação 13, Figura 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168- 170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989)
Immunogenetics 30(1) : 66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119 (31) P2X5 (canal iónico 5 ativado por ligando de recetor purinérgico P2X , um canal iónico dependente de ATP extracelular, pode estar envolvido em transmissão sináptica e neurogénese, a deficiência pode contribuir para a fisiopatologia da instabilidade idiopática do detrusor); 422 aa, pi: 7,63, MM: 47206, TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17pl3.3, N£ de acesso no GenBank NP_002552.2) ; Le et al (1997) FEES Lett. 418(1-2):195-199; W02004/047749; W02003/072035 (Reivindicação 10);
Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; W02002/22660 (Reivindicação 20); W02003/093444 (Reivindicação 1); W02003/087768 (Reivindicação 1); W02003/029277 (Página 82) (32) CD72 (antigénio CD72 de diferenciação de células B,
Lyb-2); 359 aa, pi: 8,66, MM: 40225, TM: 1 [P] Gene Chromosome: 9pl3.3, N£ de acesso no GenBank NP_001773.1); W02004042346 (Reivindicação 65); W02003/026493 (Páginas 51-52, 57-58); W02000/75655 (Páginas 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12) :4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sei USA 99:16899-16903. (33) LY64 (antigénio 64 de linfócitos (RP105), proteína membranar de tipo I da família de repetições ricas em leucina (LRR), regula a ativação e a apoptose de células B, a perda da função está associada com atividade aumentada da doença em pacientes com lúpus eritematoso sistémico); 661 aa, pi: 6,20, MM: 74147 TM: 1 [P] Gene
Chromosome: 5ql2, N£ de acesso no GenBank NP_005573.1); US2002/193567; WO97/07198 (Reivindicação 11, páginas 39- 42); Miura et al (1996) Genomics 38 (3) : 299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; W02003/083047; W097/44452 (Reivindicação 8, páginas 57-61); W02000/12130 (Páginas 24-26) (34) FcRHl (proteína 1 semelhante ao recetor Fc, um suposto recetor do domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios C2 do tipo semelhante à Ig e ITAM, pode participar na diferenciação de linfócitos B); 429 aa, pi: 5,28, MM: 46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: Iq21-lq22, N2 de acesso no GenBank NP_443170.1) ; W02003/077836; W02001/38490 (Reivindicação 6, Figurai8E-1-18-E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; W02003/089624 (Reivindicação 8); EP1347046 (Reivindicação 1); W02003/089624 (Reivindicação 7) (35) IRTA2 (associado 2 à superfamilia de imunoglobulinas de translocação de recetores, um suposto imunoreceptor com possíveis funções no desenvolvimento de células B e linfomagénese; a desregulação do gene por translocação ocorre em algumas malignidades de células B); 977 aa, pi: 6,88, MM: 106468, TM: 1 [P] Gene Chromosome: lq21, N£ de acesso no GenBank Human:AF34 3 662, AF343663, AF343664, AF 3 4 3 6 6 5, AF 3 6 9 7 9 4, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AKO89756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; W02003/024392 (Reivindicação 2, Figura 97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277 (1) :124-127; W02003/077836; W02001/38490 (Reivindicação 3, Figura 18B-1-18B-2) (36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulina, TPEF, HPP1, TR, suposto proteoglicano transmembrana, relacionado à família de EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina); 374 aa, NCBI Acesso: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; N£ de acesso no GenBank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; W02004/074320; JP2004113151; W02003/042661; W02003/009814; EP1295944 (Páginas 69-70); W02002/30268 (Página 329); W02001/90304; US2004/249130; US2004/022727; W02004/063355; US2004/197325; US2003/232350; US2004/005563; US2003/124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2) : 178-84.
0 anticorpo de origem pode também ser uma proteína de fusão compreendendo uma sequência do péptido de ligação à albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A
General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Os anticorpos da invenção incluem proteínas de fusão com sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al (2002) J
Biol Chem. 277:35035-35043, nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 2004/0001827 em [0076]; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12-13.
Numa forma de realização, o anticorpo foi criado contra o alvo antigénico específico ανβ6 relacionado com tumores. O agente de ligação celular pode ser marcado, por exemplo, para auxiliar a deteção ou a purificação do agente antes da incorporação como conjugado ou como parte do conjugado. A marcação pode ser uma marcação com biotina. Noutra forma de realização, o agente de ligação celular pode ser marcado com um radioisótopo. R e R'
Numa forma de realização, R é independentemente selecionado a partir de grupos alquilo Ci_i2, heterociclilo C3-20 e arilo C5-20 opcionalmente substituídos. Estes grupos estão cada um definidos na seção de substituintes abaixo.
Numa forma de realização, R é independentemente alquilo C1-12 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R é independentemente heterociclilo C3-20 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R é independentemente arilo C5-20 opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, R é independentemente alquilo Ci_i2 opcionalmente substituído.
Em relação a R2, são descritas acima várias formas de realização relativas a grupos alquilo e arilo preferidos e à identidade e ao número de substituintes opcionais. As preferências constantes para R2, conforme se aplicam a R, podem ser aplicadas, quando apropriado, a todos os outros grupos R, para exemplos em que R6, R7, R8 ou R9 é R.
As preferências para R aplicam-se também a R'.
Em algumas formas de realização da invenção, é proporcionado um composto contendo um grupo substituinte -NRR' . Numa forma de realização, R e R' , juntamente com o átomo de azoto ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico opcionalmente substituído de 4, 5, 6 ou 7 membros. 0 anel pode conter mais um heteroátomo, por exemplo, N, 0 ou S.
Numa forma de realização, o anel heterocíclico em si é substituído com um grupo R. Onde um heteroátomo N adicional está presente, o substituinte pode ser no heteroátomo N. R" R" é um grupo alquileno C3-12, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, 0, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
Numa forma de realização, R" é um grupo alquileno C3-12, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina.
Numa forma de realização, o grupo alquileno é opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de 0, Se NMe e/ou anéis aromáticos, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
Numa forma de realização, o anel aromático é um grupo arileno C5-20/· em que o arileno pertence a uma fração divalente obtida removendo dois átomos de hidrogénio de dois átomos do anel aromático de um composto aromático, sendo que a fração possui de 5 a 20 átomos do anel.
Numa forma de realização, R" é um grupo alquileno C3_ 12, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, 0, S, N (H) , NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos com NH2.
Numa forma de realização, R" é um grupo alquileno C3- 12 ·
Numa forma de realização, R" é selecionado a partir de um grupo alquileno C3, C5, C7, C9 e um Cu.
Numa forma de realização, R" é selecionado a partir de um grupo alquileno C3, C5 e um C7.
Numa forma de realização, R" é selecionado a partir de um grupo alquileno C3 e um C5.
Numa forma de realização, R" é um grupo alquileno C3.
Numa forma de realização, R" é um grupo alquileno C5.
Os grupos alquileno listados acima podem ser opcionalmente interrompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
Os grupos alquileno listados acima podem ser opcionalmente interrompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina.
Os grupos alquileno listados acima podem ser grupos alquileno alifáticos lineares não substituídos.
X
Numa forma de realização, X é selecionado a partir de 0, S ou N (H) .
De preferência, X é 0.
Compostos preferidos
Numa forma de realização, o conjugado é um dimero em que cada uma das frações PBD possui um grupo metileno C2, ou seja, cada R2 é =CH2. É preferível que o agente de ligação celular seja um anticorpo.
Noutra forma de realização, o conjugado é um dimero em que cada um dos monómeros possui um grupo arilo C2, ou seja, cada R2 é arilo C5-20 opcionalmente substituído, e há uma ligação dupla entre C2 e C3 em cada fração PBD. É preferível que o agente de ligação celular seja um anticorpo.
Alquileno C2
Numa forma de realização, o conjugado é um composto:
e mais preferivelmente:
em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um péptido cíclico ou linear, e n é 0 ou 1. Y, Rl1 e Rl2 são conforme definidos previamente e RE e RE" são cada um independentemente selecionados a partir de H ou RD.
Para cada um dos compostos acima, as preferências seguintes podem aplicar-se, quando apropriado: n é 0; n é 1; RE é H;
Re é Rd, quando RD é alquilo opcionalmente substituído;
Re é Rd, quando RD é meti lo; CBA é um anticorpo; CBA é um péptido cíclico;
Rl1 e Rl2 são H;
Rl1 e Rl2 são Me.
Arilo C2
Numa forma de realização, o conjugado é um composto:
e mais preferivelmente:
em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um peptido cíclico ou linear, Y, R e R são conforme definidos previamente, Ar1 e Ar2 são cada um independentemente arilo C5-2o opcionalmente substituído e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser iguais ou diferentes.
Numa forma de realização, Ar1 e Ar2, em cada uma das formas de realização acima, são selecionados cada um independentemente a partir de fenilo, furanilo, tiofenilo e piridilo opcionalmente substituídos.
Numa forma de realização, Ar1 e Ar2, em cada uma das formas de realização acima, são fenilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, Ar1 e Ar2, em cada uma das formas de realização acima, são tien-2-ilo ou tien-3-ilo opcionalmente substituído.
Numa forma de realização, Ar1 e Ar2, em cada uma das formas de realização acima, são quinolinilo ou isoquinolinilo opcionalmente substituído. 0 grupo quinolinila ou isoquinolinila pode ser ligado ao núcleo PBD core através de qualquer posição disponível no anel. Por exemplo, o quinolinilo pode ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4-ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo e quinolin-8-ilo. Destes, quinolin-3-ilo e quinolin-6-ilo podem ser preferidos. 0 isoquinolinilo pode ser isoquinolin-l-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4-ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. Destes, isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo podem ser preferidos. Vinilo C2
Numa forma de realização, o conjugado é um composto:
e mais preferivelmente:
em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um peptido cíclico ou linear, Y, R and R são conforme definidos previamente, RV1 e Rv2 são independentemente selecionados a partir de H, metilo, etilo e fenilo (em que o fenilo pode ser opcionalmente substituído com flúor, especialmente na posição 4) e heterociclilo C5-6, e n é 0 ou 1. RV1 e Rv2 podem ser iguais ou diferentes.
Em algumas das formas de realização acima, RV1 e Rv2 podem ser independentemente selecionados a partir de H, fenilo e 4-fluorofenilo.
Intermediários preferidos A presente invenção também proporciona intermediários para utilização na preparação dos compostos conjugados descritos no presente documento.
Intermediários preferidos são descritos abaixo e correspondem de perto aos conjugados preferidos descritos acima.
Numa forma de realização, o intermediário é um composto:
e mais preferivelmente
em que n é 0 ou 1, Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente e RE e RE" são selecionados cada um independentemente a partir de H ou RD.
Numa forma de realização, o intermediário é um composto:
e mais preferivelmente:
em que Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente Ar1 e Ar2 são cada um independentemente arilo C5-2o opcionalmente substituído e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser iguais ou diferentes.
Numa forma de realização, o intermediário é um composto:
e mais preferivelmente:
em que Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente, RV1 e t m R são selecionados independentemente a partir de H, metilo, etilo e fenilo (cujo fenilo pode ser opcionalmente substituído com flúor, especialmente na posição 4) e heterociclilo C5-6 e n é 0 ou 1. RV1 e Rv2 podem ser iguais ou diferentes.
Substituintes A frase "opcionalmente substituído", como utilizado no presente documento, diz respeito a um grupo de origem que pode ser não substituído ou que pode ser substituído. A menos que especificado de outra forma, o termo "substituído", como utilizado no presente documento, diz respeito a um grupo de origem que carrega um ou mais substituintes. 0 termo "substituinte" é utilizado no presente documento no sentido convencional e refere-se a uma fração química que está covalentemente ligada ou, se apropriado, fundida a um grupo de origem. Uma grande variedade de substituintes é bem conhecida, e métodos para sua formação e introdução numa variedade de grupos de origem são também bem conhecidos.
Numa forma de realização preferida, os substituintes descritos no presente documento (os quais incluem substituintes opcionais) restringem-se àqueles grupos que não são reativos frente a um agente de ligação celular. 0 elo para o agente de ligação celular no presente caso é formado da posição N10 do composto PBD através de um grupo ligante (compreendendo, por exemplo, L1, L2 e A) ao agente de ligação celular. Grupos funcionais reativos situados em outras partes da estrutura PBD podem ser capazes de formar ligações adicionais com o agente de ligação celular (a isso se pode chamar reticulação). Essas ligações adicionais podem alterar o transporte e a atividade biológica do conjugado. Portanto, em algumas formas de realização, os substituintes adicionais limitam-se àqueles desprovidos de funcionalidade reativa.
Numa forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR', N02, halo, C02R, COR, CONH2, CONHR e CONRR' .
Numa forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR', N02, C02R, COR, CONH2, CONHR e CONRR'.
Numa forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR', N02 e halo.
Numa forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR' e N02.
Qualquer uma das formas de realização mencionadas acima pode aplicar-se a qualquer um dos substituintes descritos no presente documento. Alternativamente, os substituintes podem ser selecionados a partir de um ou mais dos grupos listados abaixo.
Exemplos de substituintes estão descritos mais detalhadamente abaixo.
Alquilo Ci-12: 0 termo "alquilo Ci-42", conforme utilizado no presente documento, pertence a uma fração monovalente obtida removendo um átomo de hidrogénio de um átomo de carbono de um composto hidrocarboneto contendo de 1 a 12 átomos de carbono, o qual pode ser alifático ou aliciclico e que pode ser saturado ou insaturado (por exemplo, parcialmente insaturado, totalmente insaturado). Portanto, o termo "alquilo" inclui as subclasses alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, etc., discutidas abaixo.
Exemplos de grupos alquilo saturados incluem, entre outros, metilo (Ci) , etilo (C2) , propilo (C3) , butilo (C4) , pentilo (C5) , hexilo (C6) e heptilo (C7) .
Exemplos de grupos alquilo lineares saturados incluem, entre outros, metilo (Ci) , etilo (C2) , n-propilo (C3) , n-butilo (C4) , n-pentilo (amila) (C5) , n-hexilo (C6) e n-heptilo (C7) . Exemplos de grupos alquilo ramificados saturados incluem iso-propilo (C3) , iso-butilo (C4) , sec-butilo (C4) , terc-butilo (C4) , iso-pentilo (C5) e neo-pentilo (C5) .
Um grupo alquilo pode ser opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de 0, N (H) e S. Tais grupos podem ser designados como "heteroalquilo".
Heteroalquilo C2-20: 0 termo "heteroalquilo C2-42", conforme utilizado no presente documento, pertence a uma fração monovalente obtida removendo um átomo de hidrogénio de um átomo de carbono de um composto hidrocarboneto contendo de 2 a 12 átomos de carbono e um ou mais heteroátomos selecionados a partir de 0, N (H) e S, de preferência 0 e S.
Exemplos de grupos heteroalquilo incluem, entre outros, aqueles que compreendem uma ou mais unidades de etilenoglicol do tipo -(OCH2CH2)-. A terminação de um grupo heteroalquilo pode ser a forma primária de um heteroátomo, por exemplo, -OH, -SH ou -NH2. Numa forma de realização preferida, a terminação é -CH3.
Alquenilo C2-42: 0 termo "alquenilo C2-42", como utilizado no presente documento, pertence a um grupo alquilo contendo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono .
Exemplos de grupos alquenilo insaturados incluem, entre outros, etenilo (vinilo, -CH=CH2) , 1-propenilo (-CH=CH-CH3) , 2-propenilal (alilo, -CH-CH=CH2) , isopropenilo (1-metilvinilo, -C (CH3) =CH2) , butenilo (C4) , pentenilo (C5) e hexenilo (C6) .
Alquinilo C2-42: 0 termo "alquinilo C2-42", conforme utilizado no presente documento, pertence a um grupo alquilo contendo uma ou mais ligações triplas carbono-carbono .
Exemplos de grupos alquenilo insaturados incluem, entre outros, etinilo (-C^CH) e 2-propinilo (propargilo, -CH2-C=CH).
Cicloalquilo C3-42: 0 termo "cicloalquilo C3-42", conforme utilizado no presente documento, pertence a um grupo alquilo que é também um grupo ciclilo; ou seja, uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidrogénio de átomo do anel aliciclico de um composto hidrocarboneto cíclico (carbocíclico), sendo que esta porção possui de 3 a 7 átomos de carbono, incluindo de 3 a 7 átomos do anel.
Exemplos de grupos cicloalquilo incluem, entre outros, aqueles derivados a partir de: compostos hidrocarbonetos monocíclicos saturados: ciclopropano (C3) , ciclobutano (C4) , ciclopentano (C5) , ciclohexano (C6) , cicloheptano (C7) , metilciclopropano (C4) , dimetilciclopropano (C5) , metilciclobutano (C5) , dimetilciclobutano (C6) , metilciclopentano (C6) , dimetilciclopentano (C7) e metilciclohexano (C7) ; compostos hidrocarbonetos monociclicos insaturados: ciclopropeno (C3) , ciclobuteno (C4) , ciclopenteno (C5) , ciclohexeno (C6) , metilciclopropeno (C4) , dimetilciclopropeno (C5) , metilciclobuteno (C5), dimetilciclobuteno (C6) , metilciclopenteno (C6) , dimetilciclopenteno (C7) e metilciclohexeno (C7) ; e compostos hidrocarbonetos policiclicos saturados: norcarano (C7) , norpinano (C7) , norbornano (C7) .
Heterociclilo C3-20: 0 termo "heterociclilo C3-20", conforme utilizado no presente documento, pertence a uma fração monovalente obtida removendo um átomo de hidrogénio de um átomo do anel de um composto heterociclico, sendo que esta fração possui de 3 a 20 átomos no anel, dos quais 1 a 10 são heteroátomos do anel. De preferência, cada anel possui de 3 a 7 átomos no anel, dos quais de 1 a 4 são heteroátomos do anel. Neste contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C3-7, C5-e, etc.) indicam o número de átomos do anel, ou o intervalo numérico de átomos do anel, sejam átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo "heterociclilo C5-5 ", conforme utilizado no presente documento, pertence a um grupo heterociclilo com 5 ou 6 átomos no anel.
Exemplos de grupos heterociclilo monociclicos incluem, entre outros, aqueles derivados de: N4: aziridina (C3) , azetidina (C4) , pirrolidina (tetrahidropirrol) (C5) , pirrolina (por exemplo, 3- pirrolina, 2,5-dihidropirrol) (C5) , 2H-pirrol ou 3H- pirrol (isopirrol, isoazol) (C5) , piperidina (C6) , dihidropiridina (Ce) , tetrahidropiridina (C6) , azepina (c7);
Oi: oxirano (C3) , oxetano (C4) , oxolano (tetrahidrofurano) (C5) , oxol (dihidrofurano) (C5) , oxano (tetrahidropirano) (C6) , dihidropirano (C6) , pirano (C6) , oxepina (C7) ;
Si: tiirano (C3) , tietano (C4) , tiolano (tetrahidrotiofeno) (C5) , tiano (tetrahidrotiopirano) (C6) , tiepano (C7) ; 02: dioxolano (C5) , dioxano (C6) e dioxepano (C7) ; 03: trioxano (C6) ; N2: imidazolidina (C5) , pirazolidina (diazolidina) (C5) , imidazolina (C5) , pirazolina (dihidropirazol) (C5) , piperazina (Ce) ;
Ni07: tetrahidro-oxazol (C5) , dihidro-oxazol (C5) , tetrahidroisoxazol (C5) , dihidroisoxazol (C5) , morfolina (C6) , tetrahidro-oxazina (C6) , dihidro-oxazina (C6) , oxazina (C6) ;
NiS7: tiazolina (C5) , tiazolidina (C5) , tiomorfolina (C6) ; N20i: oxadiazina (C6) ; O1S1: oxatiol (C5) e oxatiano (tioxano) (C6) ; e N101S1: oxatiazina (C6) .
Exemplos de grupos heterociclilo monociclicos substituídos incluem aqueles derivados de sacarídeos, em forma cíclica, por exemplo, furanoses (C5) , tais como arabinofuranose, lixofuranose, ribofuranose e xilofuranse, e piranoses (C6) , tais como alopiranose, altropiranose, glicopiranose, manopiranose, gulopiranose, idopiranose, galactopiranose e talopiranose.
Arilo C5-2o: 0 termo "arilo Cs-2o", conforme utilizado no presente documento, pertence a uma fração monovalente obtida removendo um átomo de hidrogénio de um átomo do anel aromático de um composto aromático, sendo que esta fração possui de 3 a 20 átomos do anel. De preferência, cada anel possui de 5 a 7 átomos no anel.
Neste contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C5-7, C5-6, etc.) indicam o número de átomos do anel, ou o intervalo numérico de átomos do anel, sejam átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo "arilo C5-6", conforme utilizado no presente documento, pertence a um grupo arilo contendo 5 ou 6 átomos no anel.
Os átomos do anel podem ser todos átomos de carbono, como em "grupos carboarilo".
Exemplos de grupos carboarilo incluem, entre outros, aqueles derivados de benzeno (ou seja, fenilo) (C6), naftaleno (Ci0) , azuleno (Ci0) , antraceno (Ci4) , fenantreno (Ci4) , naftaceno (Ci8) e pireno (Ci6) .
Exemplos de grupos arilo que compreendem anéis fundidos, sendo que ao menos um destes é um anel aromático, incluem, entre outros, grupos derivados de indano (por exemplo, 2,3-dihidro-lH-indeno) (C9) , indeno (C9) , isoindeno (C9) , tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (Cio) , acenafteno (C12) , fluoreno (C13) , fenaleno (C13) , acefenantreno (C15) e aceantreno (Ci6) .
Alternativamente, os anéis do anel podem incluir um ou mais heteroátomos, como em "grupos heteroarilo". Exemplos de grupos heteroarilo monocíclicos incluem, entre outros, aqueles derivados de:
Ni: pirrol (azol) (C5) , piridina (azina) (Ce);
Oi: furano (oxol) (C5) ;
Si: tiofeno (tiol) (C5) ;
NoOi: oxazol (C5) , isoxazol (C5) , isoxazina (C6) ; N20i: oxadiazol (furazano) (C5) ; N3O1: oxatriazol (C5) ; N1S1: tiazol (C5) , isotiazol (C5) ; N2: imidazol (1,3-diazol) (C5) , pirazol (1,2-diazol) (C5) , piridazina (1,2-diazina) (Ce), pirimidina (1,3 — diazina) (C6) (por exemplo, citosina, timina, uracilo), pirazina (1,4-diazina) (Ce); N3: triazol (C5) , triazina (Ce); e N4: tetrazol (C5) .
Exemplos de heteroarilo que compreendem anéis fundidos, incluem, C9 (com 2 anéis fundidos) derivados de benzofurano (02) , isobenzofurano (02) , indol (N2) , isoindol (Ni) , indolizina (N2) , indolina (N2) , isoindolina (N2) , purina (N4) (por exemplo, adenina, guanina) , benzimidazol (N2) , indazol (N2) , benzoxazol (N20i) , benzisoxazol (N20i) , benzodioxol (02) , benzofurazano (N202) , benzotriazol (N3) , benzotiofurano (Si) , benzotiazol (N2Si) , benzotiadiazol (N2S) ;
Cio (com 2 anéis fundidos) derivados de cromeno (02) , isocromeno (02) , cromano (02) , isocromano (02) , benzodioxano (02) , quinolina (N2) , isoquinolina (N2) , quinolizina (N2) , benzoxazina (N20i) , benzodiazina (N2) , piridopiridina (N2) , quinoxalina (N2) , quinazolina (N2) , cinolina (N2) , ftalazina (N2) , naftiridina (N2) , pteridina (N4) ;
Cn (com 2 anéis fundidos) derivados de benzodiazepina (N2) ; C13 (com 3 anéis fundidos) derivados de carbazol (N2) , dibenzofurano (02) , dibenzotiofeno (S2) , carbolina (N2) , perimidina (N2) , piridoindol (N2) ; e
Ci4 (com 3 anéis fundidos) derivados de acridina (N2) , xanteno (Cp) , tioxanteno (S2) , oxantreno (02) , fenoxantino (OiSi) , fenazina (N2) , fenoxazina (N20i) , fenotiazina (N2Si) , tiantreno (S2) , fenantridina (N2) , fenantrolina (N2) , fenazina (N2) .
Os grupos acima, isoladamente ou parte de outro substituinte, podem em si ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos selecionados a partir de si mesmos e os substituintes adicionais listados abaixo.
Halo: -F, -Cl, -Br e -I.
Hidroxi: -OH. Éter: -OR, em que R é um substituinte de éter, por exemplo, um grupo alquilo Ci-7 (também designado como um grupo Ci-7 alcoxi, discutido abaixo), um grupo heterociclilo C3-2o (também designado como um grupo heterocicliloxi C3-2 o) ou um grupo arilo Cs-2o (também designado como um grupo ariloxi Cs-2o) , de preferência um grupo alquilo Ci-7.
Alcoxi: -OR, em que R é um grupo alquila, por exemplo, um grupo Ci-7 alquila. Exemplos de grupos C2-7 alcoxi incluem, entre outros, -OMe (metoxi) , -OEt (etoxi) , -0 (nPr) (n- propoxi), -O(iPr) (isopropoxi), -0 (nBu) (n-butoxi), -O(sBu) (sec-butoxi), -O(iBu) (isobutoxi) e -0 (tBu) (terc-butoxi).
Acetal: -CHÍOR1) (OR2), em que R1 e R2 são independentemente substituintes de acetal, por exemplo, um grupo alquilo C2-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C2-7, ou, no caso de um grupo acetal "cíclico", R1 e R2, considerados em conjunto com os dois átomos de oxigénio aos quais se encontram ligados e os átomos de carbono aos quais se encontram ligados, formam um anel heterocíclico contendo de 4 a 8 átomos no anel. Exemplos de grupos acetal incluem, entre outros, -CH(0Me)2, -CH(0Et)2 e -CH(OMe) (OEt) .
Hemiacetal: -CH(OH)(OR1), em que R1 é um substituinte de hemiacetal, por exemplo, um grupo alquilo C2-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo Ci-7. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, entre outros, -CH(OH) (OMe) e -CH(OH) (OEt) .
Cetal: -CR (OR1) (OR2), em que R1 e R2 são conforme definidos para acetais, e R é um substituinte de cetal diferente de hidrogénio, por exemplo, um grupo alquilo
Ci-7 , um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo Cs-2o , de preferência um grupo alquilo C2-7. Exemplos de grupos cetal incluem, entre outros, -C(Me)(0Me)2, -C(Me)(0Et)2, -C(Me) (OMe) (OEt), -C (Et) (OMe)2, -C(Et)(0Et)2 e -C (Et) (OMe) (OEt) .
Hemicetal: -CR(OH) (OR1), em que R1 é conforme definido para hemiacetais e R é um substituinte de hemicetal diferente de hidrogénio, por exemplo, um grupo alquilo
Ci-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C2-7. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, entre outros, -C(Me)(OH)(OMe), C(Et) (OH) (OMe), -c(Me) (OH) (OEt) e -C(Et) (OH) (OEt).
Oxo (ceto, -ona): =0.
Tiona (tiocetona): =S.
Imino (imina): =NR, em que R é um substituinte de imino, por exemplo, hidrogénio, grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20/· de preferência hidrogénio ou um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos éster incluem, entre outros, =NH, =NMe, =NEt e =NPh. Formilo (carbaldeído, carboxaldeído): -C(=0)H.
Acilo (ceto) : -C(=0)R, em que R é um substituinte de acilo, por exemplo, um grupo alquilo C1-7 (também designado como alquilacilo Ci_7 ou alcanoílo Ci_7) , um grupo heterociclilo C3-2o (também designado como heterociclilacilo C3-2o) ou um grupo arilo C5-2o (também designado como arilacilo C5-20) , de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos acilo incluem, entre outros, -C(=0)CH3 (acetilo), -C(=0)CH2CH3 (propionilo) , -C (=0) C (CH3) 3 (t-butirilo) e -C(=0)Ph (benzoílo, fenona) . Carboxi (ácido carboxílico): -C(=0)0H.
Tiocarboxi (ácido tiocarboxílico): -C(=S)SH.
Tiolcarboxi (ácido tiolcarboxílico): -C(=0)SH. Tionocarboxi (ácido tionocarboxílico): -C(=S)0H. Ácido imidico: -C(=NH)0H. Ácido hidroxâmico: -C(=N0H)0H. Éster (carboxilato, éster do ácido carboxílico, oxicarbonilo) : -C (=0) OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2or de preferência um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos éster incluem, entre outros, -C(=0)0CH3, -C (=0) OCH2CH3, -C (=0) OC (CH3) 3 e -C(=0)OPh.
Aciloxi (éster invertido): -0C(=0)R, em que R é um substituinte de aciloxi, por exemplo, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20/· de preferência um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos aciloxi incluem, entre outros, -0C(=0)CH3 (acetoxi), -OC (=0) CH2CH3, -OC (=0) C (CH3) 3, -OC (=0) Ph e -OC (=0) CH2Ph . Oxicarboiloxi: -OC (=0) OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo alquilo C1-7 , um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20 , de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos éster incluem, entre outros, -OC (=0) 0CH3, -OC (=0) 0CH2CH3, -OC (=0) OC (CH3) 3 e -OC(=0)OPh.
Amino: -NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, por exemplo, hidrogénio, um grupo alquilo C1-7 (também designado como alquilamino C1-7 ou dialquilamino Ci_7) , um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2cu de preferência H ou um grupo alquilo C1-7, ou, no caso de um grupo amino "cíclico", R1 e R2, considerados em conjunto com o átomo de azoto ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico contendo de 4 a 8 átomos no anel. Os grupos amino podem ser primários (-NH2) , secundários (-NHR1) ou terciários (-NHR2R2) e, em forma catiónica, podem ser quaternários (-+NR2R2R3). Exemplos de grupos amino incluem, entre outros, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 e -NHPh.
Exemplos de grupos amino cíclicos incluem, entre outros, aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino e tiomorfolino.
Amido (carbamoílo, carbamilo, aminocarbonilo, carboxamida) : -C(=0)NR2R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupo amido incluem, entre outros, -C(=0)NH2, -C(=0)NHCH3, -C (=0) N (CH3) 2, -C (=0) NHCH2CH3 e -C (=0) N (CH2CH3) 2, bem como grupos amido nos quais R1 e R2, em conjunto com o átomo de azoto ao qual se encontram ligados, formam uma estrutura heterocíclica como em, por exemplo, piperidinocarbonilo, morfolinocarbonilo, tiomorfolinocarbonilo e piperazinocarbonilo.
Tioamido (tiocarbamilo) : -C( = S)NR2R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos amido incluem, entre outros, -C( = S)NH2, -C( = S)NHCH3, -C ( = S) N (CH3) 2 e -C ( = S) NHCH2CH3.
Acilamido (acilamino) : -NR1C(=0)R2, em que R1 é um substituinte de amida, por exemplo, hidrogénio, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-7, e R2 é um substituinte de acilo, por exemplo, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20, de preferência hidrogénio ou um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos acilamida incluem, entre outros, -NHC(=0)CH3, -NHC (=0) CH2CH3 e -NHC(=0)Ph. R1 e R2 podem em conjunto formar uma estrutura cíclica como em, por exemplo, succinimidilo, maleimidilo e ftalimidilo:
Aminocarboniloxi: -0C (=0) NR2R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos aminocarboniloxi incluem, entre outros, -0C(=0)NH2, OC(=0NHMe, -0C(=0)NMe2 e -0C(=0)NEt2.
Ureído: -N (R1) CONR2R3 em que R2 e R3 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino, e R1 é um substituinte de ureído, por exemplo, hidrogénio, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência hidrogénio ou um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos ureído incluem, entre outros, -NHC0NH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHC0NMe2, -NHC0NEt2, -NMeC0NH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeC0NMe2 e -NMeC0NEt2 .
Guanidino: -NH-C(=NH)NH2.
Tetrazolilo: um anel aromático de cinco membros contendo quatro átomos de azoto e um átomo de carbono,
Imino: =NR, em que R é um substituinte de imino, por exemplo, por exemplo, hidrogénio, um grupo alquilo Ci-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20, de preferência H ou um grupo alquilo Ci-7. Exemplos de grupos imino incluem, entre outros, =NH, =NMe e =NEt.
Amidina (amidino): -C(=NR)NR2, em que cada R é um substituinte de amidina, por exemplo, hidrogénio, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência H ou um grupo alquilo Ci-7. Exemplos de grupos amidina incluem, entre outros, -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 e -C(=NMe)NMe2 .
Nitro: -N02.
Nitroso: -NO.
Azido: —N3.
Ciano (nitrilo, carbonitrilo) : -CN.
Isociano: -NC.
Cianato: -OCN.
Isocianato: -NCO.
Tiociano (tiocianato): -SCN.
Isotiociano (isotiocianato): -NCS.
Sulfidrilo (tiol, mercapto): -SH.
Tioéter (sulfeto) : -SR, em que R é um substituinte de tioéter, por exemplo, um grupo alquilo Ci-7 (também designado como um grupo alquiltio Ci_7) , um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20 , de preferência um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos alquiltio Ci_7 incluem, entre outros, -SCH3 e -SCH2CH3.
Dissulfeto: -SS-R, em que R é um substituinte de dissulfeto, por exemplo, um grupo alquilo Ci-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo Ci_7 (também designado neste relatório descritivo como C1-7 alquil dissulfeto). Exemplos de grupos alquil C1-7 dissulfeto incluem, entre outros, -SSCH3 e -SSCH2CH3.
Sulfina (sulfinilo, sulfóxido) : -S(=0)R, em que R é um substituinte de sulfino, por exemplo, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20 , de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfina incluem, entre outros, -S (=0)CH3 e -S(=0)CH2CH3. Sulfona (sulfonilo) : -S(=0) 2R, em que R é um substituinte de sulfona, por exemplo, um grupo alquilo C2-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C1-7, incluindo, por exemplo, um grupo alquilo C1-7 fluorado ou perfluorado. Exemplos de grupos sulfona incluem, entre outros, -S (=0) 2CH3 (metanossulfonilo, mesilo), -S(=0) 2CF3 (triflilo), -S (=0) 2CH2CH3 (esilo) , -S (=0) 2C4F9 (nonaflilo) , -s (=0) 2CH2CF3 (tresilo) , -S (=0) 2CH2CH2NH2 (taurilo) , -S (=0)2Ph (fenilsulfonilo, besilo), 4-metilfenilsulfonilo (tosilo), 4-clorofenilsulfonilo (closilo), 4-bromofenilsulfonilo (brosilo), 4-nitrofenilo (nosilo), 2-naftalenossulfonato (napsilol) e 5-dimetilomino- naftalen-l-ilsulfonato (dansilo). Ácido sulfinico (sulfino): -S (=0)OH, -S02H. Ácido sulfónico (sulfo) : -S(=0) 20H, -S03H.
Sulfinato (éster do ácido sulfinico): -S(=0)OR; em que R é um substituinte de sulfinato, por exemplo, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-2o, de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfinato incluem, entre outros, -S(=0)0CH3 (metoxisulfinilo; sulfinato de metilo) e -S(=0)OCH2CH3 (etoxisulfinilo; sulfinato de etilo) .
Sulfonato (éster do ácido sulfónico) : -S (=0)20R, em que R é um substituinte de sulfonato, por exemplo, um grupo alquilo Ci-7 , um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20/· de preferência um grupo alquilo Ci_7. Exemplos de grupos sulfonato incluem, entre outros, -S(=0)2OCH3 (metoxisulfonilo; sulfonato de metilo) e -S (=0)2OCH2CH3 (etoxisulfonilo; sulfonato de etilo).
Sulfiniloxi: -0S(=0)R, em que R é um substituinte de sulfiniloxi, por exemplo, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfiniloxi incluem, entre outros, -OS(=0)CH3 e -OS(=0)CH2CH3. Sulfoniloxi: -OS (=0) 2R, em que R é um substituinte de sulfoniloxi, por exemplo, um grupo alquilo C2-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfoniloxi incluem, entre outros, -OS (=0)2CH3 (mesilato) e -OS (=0) 2CH2CH3 (esilato) .
Sulfato: -OS (=0) 20R; em que R é um substituinte de sulfato, por exemplo, um grupo Ci_7 alquilo, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfato incluem, entre outros, -OS(=0)2OCH3 e -SO(=0)2OCH2CH3.
Sulfamilo (sulfamoílo; amida do ácido sulfínico; sulfinamida) : -S(=0)NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamilo incluem, entre outros, -S(=0)NH2, -S (=0) NH (CH3) , -S(=0)N(CH3)2, -s (=0)NH(CH2CH3) , -s (=0)N(CH2CH3)2 e -S (=0)NHPh.
Sulfonamido (sulfinamoílo; amida do ácido sulfónico; sulfonamida) : -S (=0) 2NR2R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfonamido incluem, entre outros, -S(=0)2NH2, -S (=0) 2NH (CH3) , -S (=0)2N(CH3)2, -S (=0) 2NH (CH2CH3) , -S (=0) 2N (CH2CH3) 2 e -S (=0) 2NHPh.
Sulfamino: -NR1S (=0) 2OH, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamino incluem, entre outros, -NHS(=0)20H e -N (CH3) S (=0) 20H.
Sulfonamino: -NR1S (=0) 2R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino, e R é um substituinte de sulfonamino, por exemplo, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20,· de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfonamino incluem, entre outros, -NHS(=0) 2CH3 e -N(CH3) S (=0)2C6H5.
Sulfinamino: -NR1S(=0)R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino e R é um substituinte de sulfinamino, por exemplo, um grupo C1-7 alquilo, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2o, de preferência um grupo alquilo C1-7. Exemplos de grupos sulfinamino incluem, entre outros, -NHS(=0)CH3 e -N(CH3) S (=0)C6Hs.
Fosfino (fosfina) : -PR2, em que R é um substituinte de fosfino, por exemplo, -H, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-20 ou um grupo arilo C5-20, de preferência -H, um grupo alquilo Ci_7 ou um grupo arilo C5-2o· Exemplos de grupos fosfino incluem, entre outros, -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P (t-Bu) 2 e -P (Ph) 2.
Fosfo: -P (=0)2 ·
Fosfinilo (óxido de fosfina) : -P(=0)R2, em que R é um substituinte de fosfinilo, por exemplo, um grupo alquilo C1-7 , um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2or de preferência um grupo alquilo Ci_7 ou um grupo arilo C5-20· Exemplos de grupos fosfinilo incluem, entre outros, -P(=0) (CH3)2, -P (=0) (CH2CH3)2, -P (=0) (t-Bu) 2 e -P (=0) (Ph) 2 -Ácido fosfónico (fosfono) : -P (=0) (0H)2-
Fosfonato (éster de fosfono) : -P (=0) (0R)2, em que R é um substituinte de fosfonato, por exemplo, -H, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2o, de preferência -H, um grupo alquilo C1-7 ou um grupo arilo C5-2o· Exemplos de grupos fosfonato incluem, entre outros, -P (=0) (OCH3) 2, -P (=0) (OCH2CH3) 2, -P (=0) (0-t-Bu)2 e -P(=0) (OPh)2. Ácido fosfórico (fosfonooxi) : -0P(=0) (0H)2.
Fosfato (éster de fosfono-oxi): -OP(=0)(OR)2, em que R é um substituinte de fosfato, por exemplo, -H, um grupo alquilo Ci_7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20/· de preferência -H, um grupo alquilo C1-7 ou um grupo arilo C5-20· Exemplos de grupos fosfato incluem, entre outros, -0P (=0) (0CH3) 2, -0P (=0) (OCH2CH3) 2, -0P(=0) (O-t-Bu) 2 e -0P(=0) (OPh) 2. Ácido fosforoso: -0P(0H)2.
Fosfeto: -0P(0R)2f em que R é um substituinte de fosfeto, por exemplo, -H, um grupo alquilo C1-7, um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2or de preferência -H, um grupo alquilo Ci_7 ou um grupo arilo C5-2o· Exemplos de grupos fosfeto incluem, entre outros, -ΟΡ(ΟΟΗ3)2, -OP (OCH2CH3) 2, -OP (O-t-Bu) 2 e -0P(0Ph)2.
Fosf oramidite: -OP (OR1) -NR22, em que R1 e R2 são substituintes de fosforamidite, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila (opcionalmente substituído) , um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-2o/· de preferência -H, um grupo alquilo C1-7 ou um grupo arilo C5-20· Exemplos de grupos fosforamidite incluem, entre outros, -OP (OCH2CH3) -N (CH3) 2, -OP (OCH2CH3)-N (i-Pr) 2 e -0P (OCH2CH2CN) -N (i-Pr) 2 ·
Fosf oramidato: -OP (=0) (OR1)-NR22, em que R1 e R2 são substituintes de fosforamidato, por exemplo, -H, um grupo alquilo C1-7 (opcionalmente substituído) , um grupo heterociclilo C3-2o ou um grupo arilo C5-20/· de preferência -H, um grupo alquilo C1-7 ou um grupo arilo C5-2o· Exemplos de grupos fosforamidato incluem, entre outros, -0P(=0) (OCH2CH3)-N(CH3)2, -0P(=0) (OCH2CH3)-N(i-Pr)2 e -OP(=0) (OCH2CH2CN)-N(i-Pr) 2.
Alquileno C3-12 alquileno: 0 termo "alquileno C3_i2", conforme utilizado no presente documento, pertence a uma fração bidentada obtida removendo dois átomos de hidrogénio, sejam ambos do mesmo átomo de carbono ou cada um destes de dois diferentes átomos de carbono, de um composto hidrocarboneto contendo de 3 a 12 átomos de carbono (a menos que especificado de outra forma), que pode ser alifático ou alicíclico e que pode ser saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado. Portanto, o termo "alquileno" inclui as subclasses alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, etc., discutidas abaixo. Exemplos de grupos alquileno C3-i2 lineares saturados incluem, entre outros, — (CH2) n— em que n é um número inteiro de 3 a 12, por exemplo, -CH2CH2CH2- (propileno) , -CH2CH2CH2CH2- (butileno) , -CH2CH2CH2CH2CH2- (pentileno) e -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(heptileno).
Exemplos de grupos alquileno C3-22 ramificados saturados incluem, entre outros, -CH(CH3) CH2-, -CH (CH3) CH2CH2-, -CH (CH3) CH2CH2CH2-, -CH2CH (CH3) ch2-, -CH2CH (CH3) CH2CH2-, -CH (CH2CH3)-, -CH (CH2CH3) CH2- e -ch2ch (CH2CH3) ch2-.
Exemplos de grupos alquileno C3-32 lineares parcialmente insaturados (grupos alquenileno e alquinileno C3-22) incluem, entre outros, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -ch=ch-ch2-ch2-, -ch=ch-ch2-ch2-ch2-, -ch=ch-ch=ch-, -ch=ch-ch=ch-ch2-, -ch=ch-ch=ch-ch2-ch2-, -ch=ch-ch2-ch=ch-, -ch=ch-ch2-ch2-ch=ch- e -ch2-c=c-ch2-.
Exemplos de grupos alquileno C3-22 parcialmente insaturados (grupos alquenileno e alquinileno C3-22) incluem, entre outros, -C(CH3)=CH-, -C (CH3) =CH-CH2-, -CH=CH-CH (CH3) - e -C=C-CH (CH3) - .
Exemplos de grupos alquileno C3-22 alicíclicos saturados (cicloalquilenos C3-22) incluem, entre outros, ciclopentileno (por exemplo, ciclopent-1,3-ileno) e ciclohexileno (por exemplo, ciclohex-1,4-ileno).
Exemplos de grupos alquileno C3-i2 alicíclicos parcialmente insaturados (cicloalquilenos C3-12) incluem, entre outros, ciclopentenileno (por exemplo, 4-ciclopenten-1,3-ileno), ciclohexenileno (por exemplo, 2-ciclohexen-l,4-ileno; 3-ciclohexen-l,2-ileno; 2,5-ciclohexadien-l,4- ileno).
Outras formas incluídas A menos que especificado de outra forma, estão incluídas nos precedentes as formas iónicas bem conhecidas, de sal, solvato e protegidas desses substituintes. Por exemplo, uma referência ao ácido carboxílico (-COOH) também inclui a forma iónica (carboxilato) (-COCT) , um sal ou solvato deste, bem como formas protegidas convencionais. Do mesmo modo uma referência a um grupo amino inclui a forma protonada (-N+HR1R2), um sal ou solvato do grupo amino, por exemplo, um sal de cloridrato, bem como formas protegidas convencionais de um grupo amino. Do mesmo modo, uma referência a um grupo hidroxilo também inclui a forma aniónica (-CT), ou um sal ou solvato deste, bem como formas protegidas convencionais.
Sais
Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um sal correspondente do composto ativo, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge, et ai., J. Pharm. Sei., 66, 1-19 (1977).
Por exemplo, se o composto for aniónico ou possuir um grupo funcional que pode ser aniónico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-) , então um sal pode ser formado com um catião adequado. Exemplos de catiões inorgânicos adequados incluem, entre outros, iões de metais alcalinos como Na+ e K+, iões de metais alcalinos terrosos como Ca2+ e Mg2+ e outros catiões como Al+3. Exemplos de catiões orgânicos adequados incluem, entre outros, o ião amónio (ou seja, NH4+) e iões de amónio substituído (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+) . Exemplos de alguns iões de amónio substituído são aqueles derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um ião comum de amónio quaternário é N(CH3)4+.
Se o composto for catiónico ou possuir um grupo funcional que pode ser catiónico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+) , então um sal pode ser formado com um anião adequado. Exemplos de aniões inorgânicos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforoso.
Exemplos de aniões orgânicos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos orgânicos: ácido 2-acetoxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfónico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissulfónico, etanossulfónico, fumárico, glucoheptonico, glucónico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, maleico, málico, metansosulfónico, mucíco, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fenilsulfónico, propiónico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanilico, tartárico, toluenossulfónico, trifluoroacéico e valérico. Exemplos de aniões orgânicos poliméricos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos poliméricos: ácido tânico, carboximetilcelulose.
Solvatos
Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um solvato correspondente do composto ativo. 0 termo "solvato" é utilizado no presente documento no sentido convencional para se referir a um complexo de soluto (por exemplo, composto ativo, sal de composto ativo) e solvente. Se o solvente for água, o solvato pode ser convenientemente designado como hidrato, por exemplo, mono-hidrato, di-hidrato, tri-hidrato, etc. A invenção inclui compostos em que um solvente se soma na ligação imina da porção PBD, o que é ilustrado abaixo quando o solvente é água ou um álcool (RAOH, em que RA é alquilo C1-4) :
f H\ OH f f H\ ORA r vy y yVyl β*οη vyy
T6 r le Γ le f ^R
Estas formas podem ser denominadas as formas de éter de carbinolamina e carbinolamina da PBD (conforme descrito na seção acima relativa a R10) . 0 balanço destes equilíbrios depende das condições nas quais os compostos são encontrados, bem como da natureza da própria fração. Estes compostos específicos podem ser isolados em forma sólida, por exemplo, por liofilização.
Isómeros
Certos compostos da invenção podem existir em uma ou mais formas geométricas, óticas, enantioméricas, diastereoisómericas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas, conformacionais ou anoméricas em particular, inclusive, entre outras, formas cis e trans; formas E e Z; formas c, ter; formas endo e exo; formas R, S e meso; formas D e L; formas d e 1-; formas (+) e (-); formas ceto, enol e enolato; formas sin e anti; formas sinclinais e anticlinais; formas a e β; formas axiais e equatoriais; formas em bote, cadeira, torção, envelope e de meia-cadeira; e combinações destas, abaixo designadas coletivamente como "isómeros" (ou "formas isoméricas"). 0 termo "quiral" refere-se a moléculas que possuem a propriedade de não se sobreporem à imagem especular correspondente, enquanto o termo "aquiral" se refere a moléculas que podem ser sobrepostas à sua imagem especular correspondente. 0 termo "estereoisómeros" refere-se a compostos que possuem constituição química idêntica, mas diferem com respeito ao arranjo dos átomos ou dos grupos no espaço. "Diastereisómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra. Os diastereoisómeros possuem propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. As misturas de diastereoisómeros podem ser separadas em procedimentos analíticos de alta resolução como eletroforese e cromatografia. "Enantiómeros" refere-se a dois estereoisómeros de um composto cujas imagens especulares se sobrepõem uma à outra.
As definições e convenções estereoquímicas utilizadas no presente documento geralmente adotam os princípios de S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., Nova York, 1994. Os compostos da invenção podem conter centros assimétricos ou quirais e, portanto, existem em diferentes formas estereoisoméricas. Todas as formas estereoisoméricas dos compostos da invenção, incluindo, entre outros, diastereoisómeros, enantiómeros e atropisómeros, bem como suas misturas tais como misturas racémicas, destinam-se a fazer parte da presente invenção. Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, ou seja, possuem a capacidade para girar o plano da luz polarizada em plano. Quando um composto oticamente ativo é descrito, os prefixos D e L ou R e S são usados para indicar a configuração absoluta da molécula acerca de seu(s) centro (s) quiral (is) . Os prefixos d e 1 ou ( + ) e (-) são empregues para designar o sinal de rotação da luz polarizada em plano pelo composto, sendo que (-) ou 1 significa que o composto é levorotatório. Um composto com prefixo ( + ) ou d é dextrorotatório. Para uma dada estrutura química, esses estereoisómeros são idênticos exceto que são imagens especulares um do outro. Um estereoisómero específico pode ser também designado um enantiómero, sendo que uma mistura de tais isómeros é frequentemente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiómeros é designada como uma mistura racémica ou um racemato, a qual pode ocorrer quando não tiver havido estereosseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos "mistura racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de atividade ótica.
Notar que, exceto como discutido abaixo para formas tautoméricas, especificamente excluídas do termo, "isómeros", conforme utilizado no presente documento, são isómeros estruturais (ou constitucionais) (ou seja, isómeros que diferem nas conexões entre os átomos em vez de simplesmente pela posição dos átomos no espaço). Por exemplo, uma referência a um grupo metoxi, -OCH3, não deverá ser interpretada como uma referência a seu isómero estrutural, um grupo hidroximetilo, -CH2OH. Do mesmo modo, uma referência ao orto-clorofenilo não deverá ser interpretada como uma referência a seu isómero estrutural, meta-clorofenilo. Contudo, uma referência a uma classe de estruturas pode bem incluir formas estruturalmente isoméricas que se enquadram nessa classe (por exemplo, alquilo Ci_7 inclui n-propilo e iso-propilo; butilo inclui n-, iso-, see- e terc-butilo; metoxifenil inclui orto, meta e para-metoxifenilo) . A exclusão acima não diz respeito a formas tautoméricas, por exemplo, formas ceto, enol e enolato, como em, por exemplo, os seguintes pares tautoméricos: ceto/enol (ilustrado abaixo), imina/enamina, amida/imino álcool, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hidroxiazo e nitro/aci-nitro. V ,0 \ ,ΟΗ H+ v O-
—c—C C-C c=C I \ / \ H+ / \ ceto enol enolato 0 termo "tautómero" ou "forma tautomérica" refere-se a isómeros estruturais de diferentes energias que são interconversíveis via uma barreia de baixa energia. Por exemplo, tautómeros de protão (também conhecidos como tautómeros prototrópicos) incluem interconversões através da migração de um protão, tal como isomerizações de ceto-enol e imina-enamina. Tautómeros de valência incluem interconversões pela reorganização de alguns dos eletrões de ligação.
Notar que estão especificamente incluídos no termo "isómero" os compostos com uma ou mais substituições isotópicas. Por exemplo, H pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 4H, 2H (D) e 3H (T) ; C pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 12C, 13C e 14C; 0 pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 160 e 18°.
Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, flúor e cloro, tais como, entre outros 2H (deutério, D) , 3H (trítio) , 41C, 13C,
14C, 1SN, 18F, 31P, 32P, 35S, 36C1 e 125I. Vários compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais isótopos radioativos como 3H, 13C e 14C estão incorporados. Tais compostos marcados isotopicamente podem ser úteis em estudos metabólicos, estudos da cinética de reações, técnicas de deteção ou de imagem, como tomografia por emissão de positrões (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de fotão único (SPECT), incluindo ensaios de distribuição de fármaco ou substrato em tecidos, ou em tratamento radioativo de pacientes. Compostos terapêuticos marcados ou substituídos com deutério da invenção podem apresentar propriedades melhoradas de DMPK (metabolismo e farmacocinética do fármaco), relativas à distribuição, metabolismo e excreção (ADME). A substituição com isótopos mais pesados pode oferecer certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da semivida in vivo ou redução das necessidades de dose. Um composto marcado com 18F pode ser útil para estudos de PET ou SPECT. Os compostos marcados isotopicamente desta invenção e seus profármacos podem geralmente ser preparados executando os procedimentos descritos nos esquemas ou nos exemplos e preparações descritos abaixo, substituindo um reagente isotopicamente marcado de fácil disponibilidade por um reagente não isotopicamente marcado. Além do mais, a substituição com isótopos mais pesados, especialmente deutério (ou seja, 2H ou D) pode oferecer certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da semivida in vivo ou redução das necessidades de dose ou uma melhoria no índice terapêutico. Entende-se que o deutério, nesse contexto, é considerado um substituinte. A concentração de tal isótopo mais pesado, especificamente deutério, pode ser definida por um fator de enriquecimento isotópico. Nos compostos desta invenção, qualquer átomo não especificamente designado como um determinado isótopo destina-se a representar qualquer isótopo estável daquele átomo. A menos que especificado de outra forma, uma referência a um determinado composto inclui todas as tais formas isoméricas, inclusive misturas (total ou parcialmente) racémicas e outras destas formas. Os métodos de preparação (por exemplo, síntese assimétrica) e separação (por exemplo, cristalização fracionada e meios cromatográficos) de tais formas isoméricas são conhecidos na técnica ou são rapidamente obtidos adaptando os métodos aqui ensinados, ou métodos conhecidos em qualquer maneira conhecida.
Atividade biológica
Ensaios de proliferação celular in vitro
No geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é medida por: exposição de células de mamíferos que tenham proteínas recetoras, por exemplo, HER2, ao anticorpo do ADC num meio de cultura celular; cultivo das células por um período de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 dias; e medir a viabilidade celular. Ensaios celulares in vitro são utilizados para medir a viabilidade (proliferação), a citotoxicidade e a indução de apoptose (ativação de caspases) de um ADC da invenção. A potência in vitro de conjugados anticorpo-fármaco pode ser medida por um ensaio de proliferação celular. 0 ensaio de viabilidade CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay é um método de ensaio homogéneo disponível comercialmente (Promega Corp., Madison, WI) que se baseia na expressão recombinante da luciferase de Coleoptera (Patente U.S. N— 5583024; 5674713 e 5700670) . Esse ensaio
de proliferação celular determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et ai (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). O ensaio CellTiter-Glo® é conduzido em formato de 96 poços, tornando-o acessível ao rastreio automático de alto rendimento (HTS) (Cree et ai (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404) . O procedimento do ensaio homogéneo envolve adicionar o reagente único (CellTiter-Glo® Reagent) diretamente a células cultivadas em meio suplementado com soro. As etapas de lavagem das células, remoção do meio e as múltiplas de recolha com pipeta não são necessárias. 0 sistema deteta até 15 células/poço num formato de 384 poços em 10 minutos após a adição do reagente e a mistura. As células podem ser tratadas continuamente com o ADC, ou podem ser tratadas e separadas do ADC. Em geral, células tratadas por um período breve, ou seja, 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência que células tratadas continuamente. O formato homogéneo "adicionar-misturar-medir" resulta na lise das células e na geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. O ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente do "tipo incandescente", produzido pela reação com a luciferase, cuja semivida é geralmente maior do que cinco horas, dependendo do tipo de célula e do meio utilizados. As células viáveis são refletidas em unidades relativas de luminescência (RLU). O substrato, luciferina de abelha, é descarboxilado por oxidação pela luciferase recombinante de pirilampo com a conversão concomitante de ATP para AMP e a geração de fotões.
Eficácia in vivo A eficácia in vivo de conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção pode ser medida por estudos de xenoenxerto tumoral em ratinhos. Por exemplo, a eficácia in vivo de um ADC anti-HER2 da invenção pode ser medida por um modelo de explante em ratinhos transgénicos com alta expressão de HER2. Um aloenxerto é propagado a partir do ratinho transgénico Fo5 mmtv que não responde ou responde fracamente à terapêutica com HERCEPTIN®. Os ratinhos são tratados uma vez com ADC em certos níveis de dose (mg/kg) e de exposição ao fármaco PBD (pg/m2) ; e com tampão placebo controlo (veículo) e monitorizados durante duas semanas ou mais para medir o tempo em que tumor duplica de tamanho, a eliminação celular em log e a retração tumoral.
Utilização
Os conjugados da invenção podem ser utilizados para prover um composto PBD a uma localização alvo. A localização alvo é de preferência uma população de células proliferativas. 0 anticorpo é um anticorpo para um antigénio presente numa população de células proliferativas.
Numa forma de realização, o antigénio está ausente ou presente a um nível reduzido enuma população de células não proliferativas, quando comparado à quantidade de antigénio presente na população de células proliferativas, por exemplo, uma população de células tumorais.
Na localização alvo, o ligante pode ser clivado de modo a libertar um composto das Fórmulas B ou C. Desta forma, o conjugado pode ser utilizado para prover seletivamente um composto das Fórmulas B ou C à localização alvo. 0 ligante pode ser clivado por uma enzima presente na localização alvo. A localização alvo pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo.
Os compostos conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção incluem aqueles com utilidade para a atividade contra cancro. Especificamente, os compostos incluem um anticorpo conjugado, ou seja, ligado covalentemente por um ligante, a uma fração de fármaco PBD, ou seja, toxina. Quando o fármaco não está conjugado a um anticorpo, o fármaco PBD apresenta um efeito citotóxico. A atividade biológica da fração de fármaco PBD é assim modulada pela conjugação a um anticorpo. Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção libertam seletivamente uma dose eficaz de um agente citotóxico ao tecido tumoral, pelo qual pode ser alcançada seletividade maior, ou seja, uma dose eficaz menor.
Dessa forma, num aspeto, a presente invenção proporciona um composto conjugado conforme descrito para utilização em terapêutica.
Num aspeto adicional, é também proporcionado um composto conjugado para utilização no tratamento de uma doença proliferativa. Um segundo aspeto da presente invenção proporciona a utilização de um composto conjugado na produção de um medicamento para tratar uma doença proliferativa.
Um perito na especialidade é rapidamente capaz de determinar se um conjugado candidato trata ou não uma condição proliferativa de um determinado tipo celular. Por exemplo, ensaios que podem ser convenientemente utilizados para avaliar a atividade oferecida por um determinado composto estão descritos nos exemplos abaixo. 0 termo "doença proliferativa" pertence a uma proliferação celular indesejada ou descontrolada de células excessivas ou anormais que é indesejada, tal como, o crescimento neoplásico ou hiperplásico, seja in vitro ou in vi vo.
Exemplos de condições proliferativas incluem, entre outros, proliferação celular benigna, pré-maligna e maligna, incluindo, entre outros, neoplasias e tumores (por exemplo, histocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), cancros (por exemplo, cancro de pulmão, cancro de pulmão de pequenas células, cancro gastrointestinal, cancro intestinal, cancro de cólon, carcinoma mamário, carcinoma ovariano, cancro de próstata, cancro de testículo, cancro de fígado, cancro de rim, cancro de bexiga, cancro de pâncreas, cancro cerebral, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias, psoríase, doenças ósseas, transtornos fibroproliferativos (por exemplo, de tecidos conjuntivos) e aterosclerose. Cancros de interesse particular incluem, entre outros, leucemias e cancros ováricos .
Qualquer tipo de célula pode ser tratado, inclusive, entre outras, de pulmão, gastrointestinais (incluindo, por exemplo, do intestino, do cólon), da mama (mamárias), ováricas, da próstata, do fígado (hepáticas), do rim (renais), da bexiga, do pâncreas, do cérebro e da pele.
Numa forma de realização, o tratamento é de um cancro pancreático.
Numa forma de realização, o tratamento é de um tumor tendo uma ανβ6 integrina na superfície da célula. É contemplado que os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção possam ser utilizados para tratar várias doenças ou distúrbios, por exemplo, caracterizados pela superexpressão de um antigénio tumoral. Condições ou distúrbios hiperproliferativos exemplares incluem tumores benignos ou malignos, leucemia, malignidades hematológicas e linfoides. Outros exemplos incluem transtornos neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais, blastocísticos, inflamatórios, angiogénicos e imunológicos, inclusive autoimunes. No geral, a doença ou distúrbio a ser tratado é uma doença hiperproliferativa, tal como cancro. Exemplos do cancro a ser tratado no presente documento incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos de tais cancros incluem cancro de células escamosas (por exemplo, cancro de células escamosas epiteliais), cancro de pulmão, incluindo cancro pulmonar de pequenas células, cancro pulmonar de não pequenas células, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou do estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de fígado, cancro de bexiga, hepatoma, cancro de mama, cancro de cólon, cancro retal, cancro colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, cancro de rim ou renal, cancro de próstata, cancro de vulva, cancro de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pénis, bem como cancro de cabeça e pescoço.
As doenças autoimunes para as quais os compostos ADC podem ser utilizados no tratamento incluem transtornos reumatológicos (como, por exemplo, artrite reumatoide, sindrome de Sjõgren, esclerodermia, lúpus como lúpus eritematoso sistémico e nefrite lúpica, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, sindrome dos anticorpos anti-fosfolipidios e artrite psoriática), osteoartrite, transtornos gastrointestinais e hepáticos autoimunes (como, por exemplo, doenças intestinais inflamatórias (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (como, por exemplo, vasculite associada ao ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliarterite), distúrbios neurológicos autoimunes (como, por exemplo, esclerose múltipla, sindrome de opsoclonia-mioclonia, miastenia grave, neuromielite ótica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias autoimunes), distúrbios renais (como, por exemplo, glomerulonefrite, sindrome de Goodpasture e doença de Berger), distúrbios dermatológicos autoimunes (como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e lúpus eritematoso cutâneo), distúrbios hematológicos (como, por exemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura após transfusão e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveíte, doenças autoimunes relacionadas à audição (como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda auditiva), doença de Behcet, sindrome de Raynaud, transplante de órgãos e distúrbios endócrinos auditivos (como, por exemplo, doenças autoimunes relacionadas ao diabetes como diabetes mellitus insulinodependente (IDDM), doença de Addison e doença tiroideia autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). As doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada ao ANCA, lúpus, esclerose múltipla, sindrome de Sjõgren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite. Métodos de tratamento
Os conjugados da presente invenção podem ser utilizados num método de terapêutica. É também proporcionado um método de tratamento que compreende administrar a um indivíduo com necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conjugado da invenção. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e a taxa e o curso temporal de administração dependerão da natureza e da gravidade do que está em tratamento. A prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dose, faz parte da responsabilidade de clínicos gerais e de outros médicos especialistas.
Um composto da invenção pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, seja simultaneamente ou em sequência dependendo da condição a ser tratada. Exemplos de tratamentos e terapêuticas incluem, entre outros, quimioterapia (a administração de agentes ativos, inclusive, entre outros, fármacos, tais como quimioterápicos); cirurgia e radioterapia. "Agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de cancro, independentemente do mecanismo de ação. As classes de agentes quimioterápicos incluem, entre outras: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de venenos vegetais de evónimo, antibióticos citotóxicos/antitumorais, inibidores de topoisomerases, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores de quinases. Agentes quimioterápicos incluem compostos utilizados em "terapêutica direcionada" e na quimioterapia convencional.
Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, CAS N- 51-21-8), gencitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS N- 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatina(II), CAS N£ 15663-27-1), carboplatina (CAS N£ 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, CAS N£ 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(l,2-difenilbut-l-enil)fenoxi]-N, N-dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (Inibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (Inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (Inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca) , leucovorina (ácido folinico) , rapamicina (sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson &
Johnson), ABRAXANE™ (sem Cremofor), formulações em nanopartícuias de paclitaxel construídas com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), tensirolimo (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); alquil sulfonatos como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (especialmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas azotadas como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato do óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenosterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosoureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos da classe enedyne (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama II, caliqueamicina ómega II (Angew Chem. Inti. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enedina relacionados às cromoproteínas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, nemorrubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicosideo; ácido aminolevulinico; eniluracil; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarideo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitiina (DMFO); retinoides como ácido retinoico; e os sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos precedentes.
Estão também incluídos na definição de "agente quimioterápico": (i) agentes anti-hormonais que atuam na regulação ou inibição de ação hormonal sobre tumores tais como antiestrogénicos e moduladores seletivos de recetores estrogénicos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas adrenais, como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer) , formestanina, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrogénicos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo 1,3-dioxolano do nucleósido citosina); (iv) inibidores de proteínas quinases como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de lípido quinases; (vi) oligonucleotídeos antisense, especialmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas em proliferação celular anormal, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas como inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas como vacinas de terapias gênicas, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores da topoisomerase 1 como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangiogénicos como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos precedentes.
Estão também incluídos na definição de "agente quimioterápico" anticorpos terapêuticos tais como alentuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia) e o conjugado anticorpo-fármaco, gentuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
Anticorpos monoclonais humanizados com potencial terapêutico como agentes quimioterápicas em combinação com os conjugados da invenção incluem: alentuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gentuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab e visilizumab.
Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para utilização de acordo com a presente invenção podem compreender, além do ingrediente ativo, ou seja, um composto conjugado, um excipiente, veiculo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Tais materiais não devem ser tóxicos nem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veiculo ou de outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral ou por injeção, por exemplo, cutânea, subcutânea ou intravenosa.
Composições farmacêuticas para administração oral podem estar em forma de comprimido, cápsula, pó ou liquida. Um comprimido pode compreender um portador sólido ou um adjuvante. As composições farmacêuticas liquidas geralmente compreendem um veiculo liquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, solução de dextrose ou de outros sacarideos ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol podem estar incluídos. Uma cápsula pode compreender um portador sólido como gelatina.
Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no local de acometimento, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa aceitável para via parentérica que seja livre de agentes pirogénicos e com pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na especialidade são bem capazes de preparar soluções adequadas, utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como cloreto de sódio para injetáveis, solução de Ringer para injetáveis, solução de Ringer com lactato para injetáveis. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem estar incluídos, conforme necessário.
Formulações
Embora seja possível utilizar o composto conjugado isoladamente (por exemplo, administrado isoladamente), é muitas vezes preferível apresentá-lo em forma de composição ou formulação.
Numa forma de realização, a composição é uma composição farmacêutica (por exemplo, formulação, preparação, medicamento) compreendendo um composto conjugado, conforme descrito no presente documento, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Numa forma de realização, a composição é uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto conjugado, conforme descrito no presente documento, juntamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos peritos na especialidade, incluindo, entre outros, veículos, diluentes, excipientes, adjuvantes, materiais de preenchimento, tampões, conservantes, antioxidantes, lubrificantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioativos (por exemplo, agentes hidratantes), agentes de mascaramento, agentes corantes, agentes aromatizantes e agentes adoçantes farmaceuticamente aceitáveis.
Numa forma de realização, a composição compreende ainda outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes terapêuticos ou profiláticos.
Veículos, diluentes, excipientes, etc. adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão. Veja-se, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2-edição (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nova York, EUA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20- edição, ed. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2- edição, 1994.
Outro aspeto da presente invenção diz respeito a métodos para produzir uma composição farmacêutica que compreendem misturar pelo menos um composto conjugado ou do tipo conjugado [ 1:LC] -radiomarcado, conforme aqui definido, juntamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos peritos na especialidade, por exemplo, veículos, diluentes, excipientes, etc. Se formuladas como unidades distintas (por exemplo, comprimidos, etc.), cada unidade contém uma quantidade predeterminada (dose) do composto ativo. 0 termo "farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado no presente documento, diz respeito a compostos, ingredientes, materiais, composições, formas farmacêuticas, etc., que são, no âmbito abrangido pelo juízo médico fundamentado, adequados para utilização em contacto com os tecidos do indivíduo em questão (por exemplo, ser humano) sem causar toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurados com uma relação risco/benefício razoável. Cada veículo, diluente, excipiente, etc. têm também de ser "aceitáveis" no sentido de ser compatíveis com os outros ingredientes da formulação.
As formulações podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Tais métodos incluem a etapa de levar o composto ativo a associar-se com um veículo que constitua um ou mais ingredientes acessórios. No geral, as formulações são preparadas levando o composto ativo a associar-se uniforme e intimamente com veículos (por exemplo, veículos líquidos, portador sólido finamente dividido, etc.) e depois dando forma ao produto, se necessário. A formulação pode ser preparada para proporcionar a libertação rápida ou lenta; libertação imediata, retardada, sincronizada ou sustentada ou uma combinação destas.
Formulações adequadas para administração parentérica (por exemplo, por injeção) incluem líquidos estéreis aquosos ou não aquosos, isotónicos, livres de agentes pirogénicos (por exemplo, soluções, suspensões), nos quais o ingrediente ativo esteja dissolvido, suspenso ou de outra forma presente (por exemplo, em um lipossoma ou outro microparticulado) . Tais líquidos podem conter adicionalmente outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, como antioxidantes, tampões, conservantes, estabilizantes, bacteriostáticos, agentes de suspensão, agentes espessantes e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue (ou outro líquido corporal pertinente) do recetor pretendido. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e semelhantes. Exemplos de veículos isotónicos adequados para utilização em tais formulações incluem cloreto de sódio para injetáveis, solução de Ringer ou solução de Ringer com lactato para injetáveis. Tipicamente, a concentração do ingrediente ativo nos líquidos é de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 pg/ml, por exemplo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml. As formulações podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em condição liofilizada com necessidade somente da adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injetáveis, imediatamente antes da utilização. Soluções e suspensões extemporâneas para injeções podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.
Dose O perito na especialidade reconhecerá que as doses apropriadas do composto conjugado e das composições compreendendo o composto conjugado podem variar de paciente para paciente. A determinação da dose ideal envolverá geralmente contrabalançar o benefício terapêutico e qualquer risco de efeitos colaterais nocivos. O nível selecionado de dose dependerá de uma variedade de fatores, incluindo, entre outros, a atividade do composto específico, a via de administração, o horário de administração, a taxa de excreção do composto, a duração do tratamento, de outros fármacos, compostos, e/ou materiais combinados utilizados, a gravidade da condição e a espécie, o sexo, a idade, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico prévio do paciente. A quantidade de composto e a via de administração serão, no final, a critério do médico, do veterinário ou do clínico, embora geralmente a dose venha a ser selecionada para alcançar concentrações locais no sítio de ação que atinjam o efeito desejado sem causar efeitos colaterais nocivos ou deletérios substanciais. A administração pode ser efetuada numa dose, de modo contínuo ou intermitente (por exemplo, em doses divididas com intervalos apropriados) durante todo o ciclo de tratamento. Métodos para determinar o meio e a dose mais eficazes para a administração são bem conhecidos pelos peritos na especialidade e estes variarão com a formulação utilizada para a terapêutica, o objetivo da terapêutica, a(s) célula(s) alvo em tratamento e o indivíduo em tratamento. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível e o padrão de dose sendo selecionados pelo médico, veterinário ou clínico responsável pelo tratamento.
No geral, uma dose adequada do composto ativo está no intervalo de aproximadamente 100 ng até aproximadamente 25 mg (mais tipicamente de aproximadamente 1 pg até aproximadamente 10 mg) por quilograma de peso corporal do indivíduo ao dia. Quando o composto ativo é um sal, um éster, uma amida, um profármaco ou semelhantes, a quantidade administrada é calculada com base no composto de origem e assim o peso real a ser utilizado é aumentado proporcionalmente.
Numa forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 100 mg, 3 vezes ao dia.
Numa forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 150 mg, 2 vezes ao dia.
Numa forma de realização, é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 200 mg, 2 vezes ao dia.
Contudo, numa forma de realização, o composto conjugado é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 50 ou aproximadamente 75 mg, 3 ou 4 vezes ao dia.
Numa forma de realização, o composto conjugado é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 100 ou aproximadamente 125 mg, 2 vezes ao dia.
As quantidades de dose descritas acima podem aplicar-se ao conjugado (incluindo a porção PBD e o ligante ao anticorpo) ou a quantidade eficaz de composto PBD fornecido, por exemplo, a quantidade de composto que possa ser libertada após a clivagem do ligante.
Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dose apropriada de um ADC da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e da evolução da doença, seja a molécula administrada para fins preventivos ou terapêuticos, de terapêutica prévia, do histórico clinico e da resposta ao anticorpo do paciente e do critério do médico atendente. A molécula é adequadamente administrada ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, aproximadamente 1 μq/'kq a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de molécula é uma dose inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão continua. Uma dose diária típica poderia variar de aproximadamente 1 μρ/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dose exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está no intervalo de aproximadamente 0,1 até aproximadamente 10 mg/kg de peso do paciente. Para administrações repetidas durante vários dias ou por tempo mais longo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada de sintomas da doença. Um esquema de administração exemplar compreende uma dose inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por doses adicionais a cada semana, duas semanas ou três semanas de um ADC. Outros esquemas posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais.
Tratamento O termo "tratamento", conforme utilizado no presente documento no contexto de tratar uma condição, diz respeito geralmente a um tratamento e terapêutica, seja de um ser humano ou de um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), no qual algum efeito terapêutico desejado é alcançado, por exemplo, a inibição da progressão da condição, e inclui uma redução na taxa de progressão, uma paragem na taxa de progressão, a regressão da condição, a melhoria da condição e a cura da condição. O tratamento como medida profilática (ou seja, profilaxia, prevenção) está também incluído. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", conforme utilizado no presente documento, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou de um material, composição ou de dose compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurada com uma razão risco/beneficio razoável, quando administrada de acordo com um esquema de tratamento desejado.
Do mesmo modo, o termo "quantidade profilaticamente eficaz", conforme utilizado no presente documento, refere- se àquela quantidade de um composto ativo, ou de um material, composição ou de dose compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito profilático desejado, comensurada com uma razão risco/benefício razoável, quando administrada de acordo com um esquema de tratamento desejado.
Preparação de conjugados anticorpo-fármaco
Os conjugados anticorpo-fármaco podem ser preparados por diversas vias, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos pelos peritos na especialidade, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente bivalente do ligante, para formar um intermediário Ab-L anticorpo-ligante, através de uma ligação covalente, seguida pela reação com um reagente ativado da fração de fármaco; e (2) a reação de um reagente da fração de fármaco com um reagente do ligante para formar um reagente D-L ligante-fármaco, através uma ligação covalente, seguida pela reação com o nucleofílico de um anticorpo. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregues com uma variedade de anticorpos e ligantes para preparar os conjugados anticorpo-fármaco da invenção.
Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, entre outros, grupos tióis da cadeia lateral, por exemplo, da cisteína. Os grupos tióis são nucleofílicos e capazes de reagir e formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções de ligantes tais como aqueles da presente invenção. Certos anticorpos possuem dissulfetos na cadeia que podem ser reduzidos, ou seja, pontes de cisteína. É possível tornar os anticorpos reativos para conjugação com reagentes do ligante pelo tratamento com um agente redutor como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP (cloridrato de tris (2-carboxietil)fosfino; Getz et al (1999) Anal. Biochem., Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) . Cada ponte dissulfeto da cisteína formará, portanto, teoricamente, dois nucleófilos tióis reativos. Grupos nucleofilicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos pela reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina num tiol. O Indivíduo/Paciente 0 individuo/paciente pode ser um animal, mamífero, mamífero placentário, marsupial (por exemplo, canguru, vombate), monotremo (por exemplo, ornitorrinco), roedor (por exemplo, porquinho da índia, hamster, rato, ratinho), murino (por exemplo, ratinho), um lagomorfo (por exemplo, coelho), ave (por exemplo, pássaro) , canino (por exemplo, cão), felino (por exemplo, gato), equino (por exemplo, cavalo), suíno (por exemplo, porco), ovino (por exemplo, ovelha) , bovino (por exemplo, vaca), primata, símio (por exemplo, macaco ou símio), macaco (por exemplo, saguim, babuíno), símio (por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, gibão) ou um ser humano.
Além do mais, o individuo/paciente pode estar em qualquer uma de suas formas de desenvolvimento, por exemplo, de feto. Numa forma de realização preferida, o individuo/paciente é um ser humano.
Numa forma de realização, o paciente é uma população em que cada paciente é portador de um tumor com ανβ6 integrina na superfície da célula. Síntese
Uma possível via de síntese para um intermediário dimérico da fórmula VIII é mostrada abaixo:
No esquema acima, RL representa:
Em geral, dímeros não simétricos, com respeito às suas ligações N10-C11, podem ser preparados tratando compostos bis-amino da Fórmula IV com um equivalente de um reagente cloroformato disponível comercialmente (ou preparado rapidamente) a fim de quebrar a simetria das moléculas. A amina livre restante pode então ser funcionalizada independentemente para introdução do precursor do grupo de ligação (RL) . A manipulação adicional do grupo funcional para fechar o anel B de PBD, remover os grupos protetores fornece a molécula alvo.
Compostos da fórmula IV são tipicamente preparados pelo acoplamento de um fragmento adequadamente funcionalizado do anel C (I) a um núcleo do dímero contendo o anel A da fórmula II. Fragmentos do anel C podem ser preparados a partir de blocos de construção conhecidos de 4-oxoprolinato de metilo com carbamato protegido. A olefinação sob as condições de Wittig ou Horner-Emmons pode ser empregada para fornecer alcenos endo ou exo insaturados. Fragmentos do anel C e anel B podem ser acoplados sob condições padrão na presença de trietilamina, usando derivados de cloreto ácido dos fragmentos do anel A para fornecer moléculas da fórmula III. A simetria pode também ser quebrada nesse estágio pela introdução de diferentes anéis C. Compostos do tipo III podem ser reduzidos, sem afetar a insaturação endo ou exo do anel C, com zinco em ácido acético ou fórmico para fornecer moléculas da fórmula IV.
Alternativamente, um bloco de construção adequado de 4-hidroxi pirrolidina pode ser acoplado a um núcleo dimérico da fórmula II. Os grupos hidroxilo podem ser oxidados para cetonas e depois convertidos em enol triflatos. 0 acoplamento de Suzuki pode ser utilizado para introduzir os pró-substituintes C2 (por exemplo, arilo, alquenilo, etc.). Os grupos nitro podem depois ser reduzidos para aminas, uma amina é protegida deixando a outra livre para carregar o grupo ligante.
Carbamatos não simétricos do tipo VI podem ser preparados tratando bis-aminas do tipo IV com um único equivalente de um cloroformato disponível comercialmente (ou rapidamente preparado) na presença de piridina ou trietilamina. Os cloroformatos podem ser selecionados para que forneçam o carbamato apropriado com base em grupos protetores de azoto (ProtN) que são ortogonais em relação àqueles usados no grupo pró-ligante (RL) . 0 RL carbamato pode ser introduzido convertendo o grupo amino restante para um isotiocianato e atenuando-o com o álcool RL. Alternativamente, o álcool RL pode ser convertido em cloroformato ou um equivalente funcional (fluoroformato, p-nitrocarbonato, pentafluorocarbonato ou carbonato de hidroxibenzotriazol). Finalmente, o grupo amino restante pode ser convertido em um p-nitrocarbamato, pentafluorocarbamato ou carbamato de hidroxibenzotriazol reativos, os quais podem ser deslocados com o álcool RL para fornecer moléculas da Fórmula VI.
Moléculas da fórmula VII podem ser preparadas a partir de moléculas da fórmula VI removendo-se os grupos protetores de sililo com, por exemplo, ácido acético aquoso. A oxidação com periodinano de Dess-Martin (ou alternativamente TPAP/NMO, PDC ou sob as condições de Swern) fornece o produto de anel fechado.
Conjugados da fórmula V podem ser preparados a partir de moléculas da fórmula VII removendo-se grupo de proteção de azoto com base no carbamato.
Noutra forma de realização, um conjugado da fórmula XVIII pode ser preparado a partir do Composto IX como mostrado no Esquema 2.
Composto II A síntese de compostos da Fórmula (II) está descrita no pedido de patente anterior do requerente, WO 2006/111759 e também é descrita por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174). É feita referência também aos métodos conhecidos para sintetizar dímeros de PBD, incluindo aqueles revistos em Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864.
Outra divulgação relevante pode ser encontrada no documento WO 2010/091150. Os compostos intermediários descritos no documento WO 2010/091150 podem também ser empregues nos métodos descritos acima.
Por exemplo, o composto dimérico (15) mostrado no parágrafo [164] pode ser utilizado como o composto (III) no Esquema I acima. Esta e mais adaptações seriam evidentes para um perito na especialidade.
Exemplos Métodos experimentais gerais
As rotações óticas foram medidas num polarimetro ADP 220 (Bellingham Stanley Ltd.) e as concentrações (c) são fornecidas em g/100 ml. Os pontos de fusão foram medidos utilizando um aparelho digital para ponto de fusão (Electrothermal). Os espectros de IV foram registados num espectrómetro de IV Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT. Os espectros de RMN 3Η e 13C foram adquiridos a 300 K utilizando um espectrómetro de RMN Bruker Avance a 400 e 100 MHz, respetivamente. Os desvios químicos estão relatados em relação a TMS (δ = 0,0 ppm), e os sinais são designados como s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto) ou m (multipleto) , com as constantes de acoplamento fornecidas em Hertz (Hz) . Os dados de espectroscopia de massa (MS) foram recolhidos com equipamento Waters Micromass ZQ acoplado a Waters 2695 HPLC com e Waters 2996 PDA. Os parâmetros utilizados no Waters Micromass ZQ foram: Capilar (kV), 3,38; Cone (V), 35;
Extrator (V), 3,0; Temperatura da fonte (°C), 100;
Temperatura de dessolvatação (°C), 200; Vazão no cone (L/h), 50; Vazão de dessolvatação (L/h), 250. Os dados de espectroscopia de massa de alta resolução (HRMS) foram registados em Waters Micromass QTOF Global no modo positivo W, utilizando pontas de vidro de borossilicato revestidas com metal para introduzir as amostras no instrumento. A cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada em placas de alumínio de gel de sílica (Merck 60, F254) , e a cromatografia ultrarrápida utilizou gel de sílica (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Exceto para o HOBt (NovaBiochem) e reagentes suportados em sólido (Argonaut) , todas as outras substâncias químicas e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich e usados como fornecido sem purificação adicional.
Solventes anidros foram preparados por destilação sob uma atmosfera de azoto seco na presença de um agente apropriado de secagem, e foram armazenados sobre peneiras moleculares de 4 Â ou de fios de sódio. Éter de petróleo refere-se à fração com ebulição a 40-60°C.
Condições gerais de LC/MS: A HPLC (Waters Alliance 2695) foi realizada usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico a 0,1%) e acetonitrilo (B) (ácido fórmico a 0,1%) . Gradiente: Composição inicial B 5% durante 1,0 minutos e depois B 5% para B 95% dentro de 3 minutos. A composição foi mantida por 0,5 minutos com B a 95% e depois retornou para B 5% em 0,3 minutos. O tempo total de corrida do gradiente é de 5 minutos. Taxa de fluxo 3,0 ml/minuto, 400 μΐ foram divididos através de uma junta em T com volume morto zero que passa para dentro do espectrómetro de massa. Intervalo de deteção de comprimento de onda: 220 a 400 nm. Tipo de função: arranjo de diodo (535 varrimentos). Coluna: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
Exemplo 1 a) Cloreto de (S) -2-(metoxicarbonil)-4- metilenopirrolidínio (3)
(i) 4-metilenopirrolidina-l,2-dicarboxilato de (S)-l-terc-butilo (2)
Carbonato de potássio (19,92 g, 14 mmol, 3 eq.) foi adicionado a uma solução agitada do ácido carboxílico (1) (10,92 g, 48 mmol, 1 eq.) em DMF (270 ml) . A suspensão branca resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, em cujo momento iodometano (21,48 g, 9,5 ml, 151 mmol, 3,15 eq.) foi adicionado. A mistura de reação foi deixada agitando à temperatura ambiente durante 3 dias. 0 DMF foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer um resíduo amarelo que foi particionado entre etilacetato e água. A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com etilacetato. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura e secas com sulfato de magnésio. 0 etilacetato foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto em forma de óleo amarelo. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia ultrarrápida [n-hexano 85%/etilacetato 15 %] para fornecer o produto em forma de óleo incolor (Composto conhecido F Manfré et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-2065) (ii) cloreto de (S) -2- (metoxicarbonil) -4- metilenopirrolidlnio (3)
Uma solução de ácido clorídrico a 4 M em dioxano (63 ml, 254,4 mmol, 4,5 eq.) foi adicionada ao fragmento protegido por Boc do anel C (2) (13,67 g, 56,6 mmol, 1 eq.) à temperatura ambiente. Foi observada efervescência indicando a libertação de CCg e a remoção do grupo Boc. O produto precipitou em forma de sólido branco e foi acrescentado dioxano adicional para facilitar a agitação. A mistura de reação foi deixada agitando por uma hora e depois foi diluída com éter. O produto precipitado foi recolhido por filtração a vácuo e lavado com éter adicional. A secagem ao ar forneceu o produto desejado em forma de pó branco (9,42 g, 94%) (P Herdwijn et al., Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903-7) (b) (5- ((5- (5-amino-4-((S) -2-(((terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-l-carbonil) -2-metoxifenoxi)pentil) oxi)-2-( (S) -2- ( ( (terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-l-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de terc-butilo (9)
(i) (S) -(4,4'- (pentano-1,5-di-ilbis (oxi) )bis (5-metoxi-2- nitro-4, 1-fenileno))bis(((S)-2-(metoxicarbonil)-4-metilenopirrolidin-l-il)metanona) (5)
Uma quantidade catalítica de DMF anidro (0,5 ml) foi adicionada a uma suspensão agitada de cloreto de oxalilo (9,1 g, 6,25 ml, 71,7 mmol, 3 eq.) e o núcleo dimérico (4) (11,82 g, 23,9 mmol, 1 eq.) em DCM anidro (180 ml) à temperatura ambiente. Foi observada efervescência vigorosa após a adição de DMF e a mistura de reação foi deixada a agitar por 18 horas num balão de fundo redondo equipado com um tubo secador para cloreto de cálcio. A solução transparente resultante foi evaporada sob pressão reduzida e o sólido triturado com éter. O produto sólido foi recolhido por filtração a vácuo, lavado com éter adicional e seco in vacuo a 40 °C durante 1,5 horas. Este sólido foi depois adicionado em porções a uma suspensão do anel C (3) (9,35 g, 52,6 mmol, 2,2 eq.) em TEA (12,08 g, 119,6 mmol, 5 eq.) e DCM seco (110 ml), mantendo a temperatura entre -40 e -50 °C com o auxilio de um banho de gelo seco/acetonitrilo. A mistura de reação foi deixada agitando a -40 °C durante uma hora e depois deixada a aquecer até à temperatura ambiente, em cujo momento a LCMS indicou o consumo completo do material de partida. A mistura de reação foi diluída com DCM adicional e lavada sequencialmente com ácido clorídrico aquoso (1M, 2 x 200 mL) , bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 250 ml), água (250 ml) , salmoura (250 ml) e seca (MgSCq) . DCM foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto sob a forma de espuma amarela (13,94 g, 79 %) . Dados analíticos: TR 3,95 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 741 ([M + 1]+, 100) . (ii) (S) - (4, 4 ' - (pentano-1,5-di-ilbis (oxi)) bis (5-metoxi-2-nitro-4,1-fenileno))bis(((S)-2-(hidroximetil)-4-metilenopirrolidin-1-il)metanona) (6)
Boridreto de lítio sólido (0,093 g, 4,3 mmol, 3 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução do éster (5) (1,05 g, 142 mmol, 1 eq.) em THF seco (10 mL) sob uma atmosfera de azoto a 0 °C (banho de gelo) . A mistura de reação foi deixada a agitar a 0 °C durante 30 minutos e depois deixada a aquecer até à temperatura ambiente, em cujo momento, foi observada a precipitação de uma goma de cor laranja. A mistura de reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante mais 2 horas e depois foi arrefecida num banho de gelo e tratada com água (20 ml) para fornecer uma suspensão amarela. Ácido clorídrico (1 M) foi cuidadosamente adicionado (efervescência vigorosa!) até que a efervescência cessasse. A mistura de reação foi extraída com etilacetato (4 x 50 ml) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (100 ml), salmoura (100 ml) e secas (MgSCq) . Etilacetato foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para render o produto em forma de espuma amarela (0,96 g, 99%). A reação foi repetida em escala de 12,4 g para render 11,06 g de produto (96%). Dados analíticos: TR 3,37 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 685 {[M + H]+, 100) . (Hi) (S) - ( (pentano-1,5-di-ilbis (oxi) )bis (5-metoxi-2-nitro-4, 1-fenileno) )bis ( ( (S) -2- ( ((terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidin-l-il) metanona) (7)
Uma solução de álcool bis-nitro (6) (7,94 g, 11,6 mmol, 1 eq) , dimetilsililcloreto de terc-butilo (4,54 g, 30,15 mmol, 2,6 eq) e imidazol (4,1 g, 60,3 mmol, 5,2 eq) em DMF anidro (100 ml) sob uma atmosfera de árgon foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura de reação foi diluída com água (250 mL) e extraída com DCM (4 x 100 ml). Os extratos combinados foram lavados com água (200 ml), salmoura saturada (200 ml) , secos (MgS04) e evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato 50%/n-hexano 50% para etilacetato 100% em incrementos de 10 %] para fornecer o produto em forma de espuma amarela (10,0 g, 94%). Dados analíticos: TR 4,57 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 913 ([M + H]+, 100) . (iv) (S) - ( (pentano-1,5-di-ilbis (oxi) )bis (2-amino-5-metoxi-4, 1-fenileno) )bis ( ( (S) -2- ( ((terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidin-l-il) metanona) (8)
Solução de ácido fórmico (5% v/v, 15 ml) foi adicionada numa porção a uma mistura de pó de zinco (29,56 g, 0,45 mol, 40 eq.) e o composto (7) (10,34 g, 11,32 mmol, 1 eq.) em etilacetato/etanol (80 ml/150 ml). Uma exotermia de 12 °C foi observada. Depois de 15 minutos, a mistura de reação foi filtrada através de celite, lavando com etilacetato (em excesso) . O filtrado foi lavado com bicarbonato de sódio saturado (3 x 150 ml), água (200 ml), salmoura saturada (200 ml) , seco (MgS04) e evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato] forneceu o produto em forma de espuma branca (8,09 g, 84%). Dados analíticos: TR 4,43 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 853 {[M + H] +, 100) . (v) (5- ( (5- (5-amino-4- ((S) -2- (((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-l-carbonil)-2-metoxifenoxi)pentil)oxi)-2- ((S)-2- (((terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-l-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de terc-butilo (9)
Uma solução da bis-anilina (8) (6,02 g, 7,1 mmol, 1 eq.) e di-t-butil-dicarbonato (1,54 g, 7,1 mmol, 1 eq.) em THF anidro (50 ml) foi aquecida ao refluxo durante 16 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato 40%/n-hexano 60% para etilacetato 60%/40% n-hexano para etilacetato 100% etilacetato] para fornecer o produto sob forma de espuma branca (3,22 g, 48%). Dados analíticos: TR 4,27 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 953 ( [M + H]+, 100), MS (ES~) m/z (intensidade relativa) 951 ([M - H])“, 100). (c) ll-hidroxi-7-metoxi-8-((5- ( ((S)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2, 3, 5,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2, Ιο] [1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-5~oxo-2, 3,11, lla-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H) -carboxilato de (11S, llaS) -2- (piridin-2- ildisulfanil) etilo (14)
O Composto 10 foi preparado de acordo com Jones et al, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 6526-6527. (i) (2-(piridin-2-ildisulfanil) etil) ( (S) - (pentano-1,5-di- ilbis (oxi) )bis (2- ( (S) -2- ( ( (terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-l- carbonil)-4-metoxi~5,1-fenileno))dicarbamato de terc-butilo
(ID
Trietilamina (0,25 g, 0,34 ml, 2,42 mmol, 2,2 eq.) foi adicionada a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-Boc (9) (1,05 g, 1,1 mmol, 1,0 eq.) e trifosgénio (0,117 g, 0,4 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (10 mL) sob uma atmosfera de árgon à temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida até 40 °C e, depois de 5 minutos, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metilo. Dados analíticos: TR 4,37 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1011 ( [M + H]+, 100) .
Uma solução de 2-(piridin-2-ildisulfanil)etanol (10) (0,31 g, 1,65 mmol, 1,5 eq.) e trietilamina (0,17 g, 0,23 ml, 1,65 mmol, 1,5 eq.) em THF seco (10 ml) foi adicionada gota a gota ao isocianato recentemente preparado. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C por 1,5 horas, depois desse tempo, mais uma porção de trifosgénio (0,058 g, 0,2 mmol, 0,18 eq.) foi adicionada. Após mais 30 minutos, a mistura de reação foi deixada a arrefecer, foi filtrada para remover cloridrato de trietilamina e o filtrado foi evaporado até a dessecação completa para dar origem ao produto bruto sob a forma de óleo amarelo que foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 60%/etilacetato 40% mudando para n-hexano 55%/etilacetato 45%] para fornecer o produto desejado sob a forma de óleo incolor (0,63 g, 49%) . Dados analíticos: TR
4,50 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1166 ( [M + H]+, 100), MS (ES_) m/z (intensidade relativa) 1164 ( [M - Η] Γ, 70) . (ii) (2- (piridin-2-ildisulfanil) etil) ( (S) - (pentano-1,5-di-ilbis (oxi) )bis (2- ((S) -2- (hidroximetil) -4-metilenopirrolidina-1-carbonil)-4-metoxi-5,1 -fenileno))dicarbamato de terc-butilo (12)
Ac0H/H20 (3/1/) (8 ml) foi adicionado a uma solução do composto (11) (0,37 g, 0,32 mmol, 1 eq) em THF (2 ml) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. 0 pH da mistura de reação foi ajustado para pH 8 com solução saturada de NaHCCt. A mistura foi extraída com etilacetato (3 x 100 ml) e os extratos combinados foram lavados com solução saturada de NaHCCt (100 ml), água (100 ml), salmoura saturada (100 ml), secos (MgS04) e evaporados sob pressão reduzida. A purificação do resíduo por cromatografia ultrarrápida em coluna [gradiente de eluição: clorofórmio/metanol 0% para 5% em incrementos de 1%] forneceu o produto sob a forma de espuma branca (0,24 g, 81%). Dados analíticos: TR 3,08 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 938 {[M + H]+, 100), MS (ES~) m/z (intensidade relativa) 936 ([M - H])~, 100). (Hi) ll-hidroxi-8- ( (5-( ( (11S,llaS)-ll-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-10- ( (2- (piridin-2- ildisulfanil)etoxi)carbonil)-2,3, 5,10,11, 1la-hexahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,lla-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10(5H)-carboxilato de (11S, llaS)-terc-butilo (13)
Uma solução de DMSO (79 mg, 72 μΐ, 1,0 mmol, 4,4 eq) em DCM (5 ml) foi adicionada gota a gota a uma solução de cloreto de oxalilo (62 mg, 42 μΐ, 0,49 mmol, 2,15 eq.) em DCM (5 ml) sob uma atmosfera de árgon a -78 °C (gelo seco/acetona) . A solução foi agitada a -78 °C durante 15 minutos. Uma solução do composto (12) (0,214 g, 0,23 mmol, 1,0 eq.) em DCM (6 ml) foi adicionada gota a gota e a mistura foi agitada a -78 °C durante 45 minutos. Trietilamina (0,23 g, 0,32 ml, 2,28 mmol, 10 eq.) foi adicionada e, depois de 5 minutos, a mistura de reação foi deixada atingir a temperatura ambiente. A mistura de reação foi tratada com solução saturada de NH4C1 (15 ml), a porção orgânica foi separada e lavada com solução de ácido cítrico 1M (3 x 50 ml), solução saturada de NaHC03 (100 ml), água (100 ml), salmoura saturada (100 ml), foi seca (MgS04) e evaporada sob pressão reduzida para fornecer um óleo amarelo claro. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna forneceu o produto em forma de espuma branca (68 mg, 32%) . Dados analíticos: TR 2,90 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 933 ( [M + H]+, 50), MS (ES~) m/z (intensidade relativa) 935 ( [M - H])~, 55). (iv) ll-hidroxi-7-metoxi-8-((5- ( ((S)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3, 5,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2, Ια] [1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-5~oxo-2,3,11,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H) -carboxilato de (11S, llaS) -2- (piridin-2- ildisulfanil) etilo (14)
Uma solução fria (banho de gelo) de ácido trifluoroacético 95% (1 ml) foi adicionada ao composto 13 que tinha sido arrefecido num banho de gelo. A solução foi agitada a 0 °C durante 15 minutos, quando foi mostrado que estava concluída por LCMS. A mistura de reação foi adicionada gota a gota a uma mistura de gelo e solução saturada de NaHCCq para neutralizar a solução de ácido trif luoroacét ico. A mistura foi extraída com DCM (4 x 50 mL) e os extratos combinados foram lavados com salmoura saturada (100 ml), secos (MgS04) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto em forma de espuma branca (26 mg, 96%) . Dados analíticos: TR 2,72 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 816 ([M + H]+', 70), MS (ES~) m/z (intensidade relativa) 814 ([M - H])~, 40).
Exemplo 2 (a) (R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propan-l-ol (18)
(i) 2- (acetiltio)propanoato de (R)-metilo (16) Ácido tioacético (1,99 g, 1,86 ml, 26,1 mmol, 1,1 eq.) foi adicionado a uma suspensão de carbonato de césio (7,73 g, 23,72 mmol, 1,0 eg.) em DMF seco (40 ml). Depois de 30 minutos, 2-cloropropanoato de (S)-metil (15) foi adicionado e a mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura de reação foi particionada entre éter dietílico (150 ml) e água (150 ml); a água foi separada e lavada com uma porção adicional de éter dietílico (150 ml) . As porções orgânicas combinadas foram lavadas com água (6 x 100 ml), salmoura (200 ml), secas (MgSCg) e evaporadas sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato 10%/n-hexano 9 0 % ] forneceu o produto em forma de óleo incolor (3,01 g, 82%) . Dados analíticos: TR 2,25 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 163 ( [M + H]+, 10), 185 ( [M + Na]+, 65); [ Oí ] td = [ + 141 ] 11' 8°cd (c, 2,26 CHC13) . (ii) (R) -2-mercaptopropan-l-ol (17)
Uma solução de tioacetato (16) (0,57 g, 3,54 mmol, 1,0 eg.) em THF seco (10 ml) foi adicionada gota a gota a uma suspensão de hidreto de alumínio e litio (0,54 g, 14,15 mmol, 4,0 eg.) em THF seco (20 ml) ao refluxo sob uma atmosfera de árgon. Depois de 1 hora, a mistura de reação foi arrefecida até 0 °C e HC1 a 2 M foi adicionado gota a gota mantendo a temperatura abaixo de 30 °C até gue a efervescência cessasse. A mistura resultante foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 1 hora, depois foi filtrada através de celite, lavando com THF (40 ml) . O solvente foi evaporado; o resíduo voltou a ser dissolvido em DCM e seco (MgSCg) . A evaporação do DCM sob pressão reduzida seguida pela cromatografia em coluna do resíduo [n-hexano 60%/etilacetato 4 0 % ] forneceu o produto em forma de óleo amarelo claro (0,193 g, 58%). Dados analíticos: [a]td = [- 22] 17'2°cd (c, 0, 972 CHC13) . (iii) (R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propan-l-ol (18)
Cloreto de sulfurilo (1 M em DCM, 2,0 ml, 2,0 mmol, 1,1 eq.) foi adicionado gota a gota a uma solução de 2-mercaptopiridina (0,2 g, 1,81 mmol, 1,0 eq.) em DCM seco (5 ml) a 0 °C sob uma atmosfera de árgon. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e o DCM foi evaporado sob pressão reduzida para fornecer um sólido amarelo. O sólido foi suspenso em DCM seco (10 ml) e uma solução de (R)-2-mercaptopropan-l-ol (17) (0,18 g, 1,95 mmol, 1,08 eq.) em DCM seco (5 ml) foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas sob uma atmosfera de árgon. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida para fornecer uma goma amarela. A goma voltou a ser dissolvida em água e a solução foi basificada com solução de hidróxido de amónio, extraída com DCM (3 x 50 ml) e os extratos combinados foram lavados com água (100 ml), salmoura (100 ml) , secos (MgS04) e evaporados para fornecer um óleo amarelo. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 80%/etilacetato 20% para n-hexano 60%/etilacetato 40% em incrementos de 5%] forneceu o produto em forma de óleo incolor (0,213 g, 59%). Dados analíticos: TR 2,43 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 202 ( [M + H]+, 50); [a]^ = [+273] 26'2°cd (c, 0,28 CHCI3) . (b) ll-hidroxi-7-metoxi-8- ((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno~5-oxo-2,3, 5,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2,Ιο] [1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-5~oxo-2, 3,11,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H) -carboxilato de (IIS, llaS) - (R) -2- (piridin-2- ildisulfanil) propilo (22)
(ii) ((R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propil) ( (S)- (pentano- 1,5-di-ilbis(oxi))bis(2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-1-carbonil)-4-metoxi-5,1-fenileno))dicarbamato de terc-butil (19)
Trietilamina (0,28 g, 0,39 ml, 2,8 mmol, 2,2 eq.) foi adicionada a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-Boc (9) (1,21 g, 1,27 mmol, 1,0 eq.) e trifosgénio (0,136 g, 0,46 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (15 ml) sob uma atmosfera de árgon à temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida até 40 °C e, depois de 5 minutos, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metilo. Dados analíticos: TR 4,30 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1011 ( [M + H]+, 100) .
Uma solução de (R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propan-1- ol (18) (0,38 g, 1,91 mmol, 1,5 eq.) e trietilamina (0,19 g, 0,27 ml, 1,91 mmol, 1,5 eq.) em THF seco (10 ml) foi adicionada gota a gota ao isocianato recentemente preparado. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C durante 4 horas e depois agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura de reação foi filtrada para remover cloridrato de trietilamina e o filtrado foi evaporado até a dessecação completa para dar origem ao produto bruto em forma de óleo amarelo que foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 60%/etilacetato 40% para n-hexano 40%/etilacetato 60% em incrementos de 5%] para fornecer o produto desejado sob forma de espuma branca (0,75 g, 50%) . Dados analíticos: TR 4,50 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1180 ([M + H]+, 60); [a]td = [- 18] 21°cd (c, 0,28 CHC13) . (ii) ((R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propil) ( (S) - (pentano-1, 5-di-ilbis (oxi) )bis (2- ((S) -2- (hidroximetil) -4-metilenopirrolidina-1-carbonil)-4-metoxi-5,1 -fenileno))dicarbamato de terc-butilo (20) Ácido acético/H20 (3/1, 16 ml) foi adicionado a uma solução do bis-silil éter (19) (0,72 g, 0,61 mmol, 1 eq.) em THF (4 ml) . A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 8 com solução saturada de bicarbonato de sódio. A mistura foi extraída com etilacetato (4 x 150 ml) e os extratos combinados foram lavados com solução saturada de bicarbonato de sódio (2 x 150 ml), água (150 ml), salmoura (150 ml), secos (MgS04) e evaporados sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna forneceu o produto sob a forma de espuma branca (0,56 g, 96%) . Dados analíticos: TR 3,15 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 953 ( [M + H] +', 100); [0í]td = [-13,5 ] 26°cd (c, 0,22CHC13). (Hi) ll-hidroxi-8- ( (5-( ( (11S, llaS) -ll-hidroxi-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-10- ( ( (R) -2- (piridin-2- ildisulfanil)propoxi)carbonil)-2,3,5,10,11,lla-hexahidro-IH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,11,lla-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10(5H)-carboxilato de (11S, llaS) -terc-butilo (21)
Uma solução de DMSO (91 mg, 83 μΐ, 1,16 mmol, 4,4 eq.) em DCM anidro (5 ml) foi adicionada gota a gota a uma solução de cloreto de oxalilo (2,0 M em DCM, 318 μΐ, 0,635 mmol, 2,4 eq.) em DCM anidro (5 ml) a -40 °C sob uma atmosfera de árgon. A solução foi agitada a -40 °C durante 15 minutos. Uma solução do bis-álcool (20) (0,252 g, 0,26 mmol, 1 eq.) em DCM anidro (10 ml) foi adicionada gota a gota e a mistura resultante agitada a -40 °C durante 45 minutos. Durante esse tempo, a temperatura foi deixada atingir -25 °C. A temperatura foi reduzida para -35 °C e trietilamina (0,27 g, 0,36 mL, 2,6 mmol, 10 eq.) adicionada gota a gota. Depois de 5 minutos, a temperatura foi deixada atingir a temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM (50 ml) e extraída com solução de ácido cítrico a 1 M (3 x 150 ml), solução saturada de bicarbonato de sódio (150 ml), água (200 ml), salmoura (200 ml), seca (MgS04) e evaporada sob pressão reduzida para fornecer uma espuma amarela. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [clorofórmio/metanol 0% para 2% em incrementos de 0,5%] forneceu o produto em forma de espuma branca (0,137 g, 53%) . Dados analíticos: TR 3,17 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 948 ( [M + H]+, 100); [a] "d = [ + 17 0] 26°cd (c, 0,25 CHC13) . (iv) (ll-hidroxi-7-metoxi-8- ( (5- (( (S) -7-metoxi-2-metileno-5-oxo-2,3,5,1la-tetrahidro-lH-pirrol[2,Ιο] [1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno-5~oxo-2, 3, 11, 1la-tetrahidro-lH-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H) -carboxilato de (11S, llaS) - (R) -2- (piridin-2- ildisulfanil)propilo (22)
Uma solução fria (banho de gelo) de ácido trifluoroacético 95% (8,5 ml) foi adicionada ao composto (21) (0,221 g, 0,23 mmol, 1 eq.) que tinha sido arrefecido num banho de gelo. A solução foi agitada a 0 °C durante 25 minutos quando foi mostrado que estava concluída por LCMS. A mistura de reação foi adicionada gota a gota a uma mistura de gelo e solução saturada de bicarbonato de sódio (200 ml) para neutralizar a solução de ácido trif luoroacét ico. A mistura foi extraída com DCM (4 x 75 mL) e os extratos combinados foram lavados com água (100 mL) salmoura saturada (100 ml), secos (MgSCq) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [clorofórmio/metanol 0% para 3% em incrementos de 1%] forneceu o produto em forma de espuma branca (0,192 g, 99%). Dados analíticos: TR 3,00 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 830 {[M + H]+, 75); [ ot ] td = [ + 444] 22°cd (c, 0,26 CHC13) .
Exemplo 3: Determinação de citotoxicidade in vitro Células K562 de leucemia mieloide crónica humana foram mantidas em meio RPM1 1640, suplementado com soro fetal bovino a 10% e glutamina a 2 mM, a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo C02 a 5% e foram incubadas com uma dose especificada de fármaco durante 96 horas a 37 °C no escuro. A incubação foi finalizada por centrifugação (5 minutos, 300 g) e as células foram lavadas uma vez com meio livre do fármaco. Após o tratamento com o fármaco apropriado, as células foram transferidas para placas de microtitulação de 96 poços (104 células por poço, 8 poços por amostra). As placas foram depois mantidas no escuro a 37 °C em uma atmosfera humidificada contendo C02 a 5%. O ensaio baseia-se na capacidade de células viáveis reduzirem um sal solúvel amarelo de tetrazólio, brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-2i7-tetrazólio (MTT,
Aldrich-Sigma), para um precipitado insolúvel púrpura de formazan. Após a incubação das placas durante 4 dias (para permitir que células controlo aumentassem de número em aproximadamente 10 vezes) , 20 μΐ de solução com MTT (5 mg/ml em solução salina com tampão fosfato) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante mais 5 horas. As placas foram depois centrifugadas durante 5 minutos a 300 g e a massa do meio foi retirada com pipeta do sedimento celular deixando 10-20 μΐ por poço. DMSO (200 μΐ) foi adicionado a cada poço e as amostras foram agitadas para assegurar a mistura completa. A densidade foi lida depois a um comprimento de onda de 550 nm em um leitor de placa de ELISA Titertek Multiscan, e uma curva de dose-resposta foi construída. Para cada curva, foi obtido um valor de CI50 como a dose necessária para reduzir a densidade ótica final para 50% dor valor de controlo. Redução/Oxidação de ThioMabs para Conjugação
Anticorpos monoclonais completos construídos com cisteina (ThioMabs - Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8) :925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13) :2721-2729; US 7521541; US 7723485; W02009/052249,
Shen et al (2012) Nature Biotech., 30 (2) :184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52), expressos em células CHO, foram reduzidos com quantidade excedente em aproximadamente 20-40 vezes de TCEP (cloridrato de (tris (2-carboxietil)fosfino) ou DTT (ditiotreitol) em Tris a 50 mM, pH 7,5, com EDTA a 2 mM durante 3 horas a 37 °C ou durante a noite à temperatura ambiente.(Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) . O ThioMab reduzido foi diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio a 0,3 M. Alternativamente, o anticorpo foi acidificado pela adição de 1/20 do volume de ácido acético a 10%, diluído com succinato a 10 mM pH 5, carregado na coluna e depois lavado com 10 volumes da coluna de tampão succinato. A coluna foi eluída com Tris a 50 mM pH 7,5 e EDTA a 2 mM. 0 ThioMab reduzido eluído foi tratado com excesso molar de 15 vezes de DHAA (ácido desidroascórbico) ou sulfato de cobre aquoso a 200 nM (CuSCg) . A oxidação das ligações dissulfeto dentro da cadeia foi concluída em aproximadamente três horas ou mais. A oxidação ao ar ambiente foi também eficaz. O anticorpo novamente oxidado foi dialisado em succinato de sódio a 20 mM pH 5, NaCl a 150 mM, EDTA a 2 mM e armazenado congelado a -20 °C. Conjugação de Thio-Mabs com Compostos para preparar conjugados anticorpo-fármaco
Os tio-anticorpos (ThioMab) desbloqueados, novamente oxidados foram submetidos a reação com excedente molar de 6-8 vezes dos compostos acima (14, 22) (de uma solução mãe de DMSO a uma concentração de 20 mM) em Tris a 50 mM, pH 8, até que a reação estivesse concluída (16-24 horas), conforme determinado pela análise por LC-MS da mistura de reação.
Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) brutos foram depois aplicados a uma coluna de troca catiónica após a diluição com succinato de sódio a 20 mM, pH 5. A coluna foi lavada com pelo menos 10 volumes da coluna de succinato de sódio a 20 mM, pH 5, e o anticorpo foi eluído com PBS. Os conjugados anticorpo-fármaco foram formulados em His/acetato a 20 mM, pH 5, com sacarose a 240 mM utilizando colunas de filtração em gel. Os conjugados anticorpo-fármaco foram caracterizados por espectroscopia UV para determinar a concentração proteica, por SEC analítica (cromatografia de exclusão por tamanho) para análise de agregação e por LC-MS antes e depois do tratamento com Lisina C endopeptidase. A cromatografia de exclusão por tamanho foi realizada utilizando uma coluna Shodex KW802.5 em fosfato de potássio a 0,2 M, pH 6,2, com cloreto de potássio a 0,25 mM e IPA 15% a uma taxa de fluxo de 0,75 ml/minuto. O estado de agregação do conjugado foi determinado pela integração da absorbância da área do pico eluído a 280 nm. A análise por LC-MS foi realizada utilizando um aparelho Agilent QTOF 6520 ESI. Como exemplo, um conjugado anticorpo-fármaco gerado utilizando essa química foi tratado com Endoproteinase Lys C 1:500 p/p (Promega) em Tris, pH 7,5, durante 30 minutos a 37 °C. Os fragmentos resultantes da clivagem foram carregados numa coluna 1000A, 8 um PLRP-S aquecida até 80 °C e eluídos com gradiente de B 30% para B 40% em 5 minutos. A fase móvel A era H20 com TFA 0,05% e a fase móvel B era acetonitrilo com TFA 0,04%. A taxa de fluxo era 0,5 ml/minuto. A eluição de proteínas foi monitorizada por deteção da absorbância UV a 280 nm antes da ionização por electrospray e a análise por MS. A resolução cromatográfica do fragmento Fc não conjugado, do Fab residual não conjugado e do Fab com fármaco foi em geral alcançada. Os espectros m/Z obtidos foram deconvoluídos utilizando o software Mass Hunter™ (Agilent Technologies) para calcular a massa dos fragmentos do anticorpo.
Como exemplo, a massa molecular (MM) para thio-Tmab conjugado com 22 (adição de massa = 720 daltons) . Massas deconvoluídas observadas: 53.296 daltons correspondem a MM de fragmento Fc não conjugado 47.431 daltons correspondem a MM de fragmento Fab não conjugado 48.150 daltons correspondem a MM de fragmento Fab com fármaco
Portanto, o pico observado a 48.150 daltons corresponde ao fragmento Fab esperado (47.431 daltons) carregando um fármaco 22 (+720 daltons). ADC tio-conjugados com 22
Adição de massa 719,84
ADC tio-conjugados com 14 Adição de massa: 705,81
Os ensaios in vitro e in vivo a seguir estão também descritos em Phillips et al (2008) Cancer Res. 68(22) :9280-9290 .
Ensaio de proliferação celular in vitro A eficácia de ADC foi medida por um ensaio de proliferação celular que empregou o protocolo abaixo (CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488) . Todas as linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection: 1. Uma aliquota de 100 μΐ de cultura celular, contendo aproximadamente 104 células (por exemplo, KPL-4, uma linha celular de cancro de mama humano, Kurebayashi et al (1999) Brit. Jour. Cancer 79(5-6):707-717), SKBR-3 ou MCF7) no meio, foi depositada em cada poço de uma placa de paredes opacas com 96 poços. 2. Foram preparados poços controlo contendo o meio e sem células. 3. O ADC foi adicionado aos poços experimentais e incubado durante 3-5 dias. 4. As placas foram equilibradas para a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. 5. Um volume do reagente de CellTiter-Glo, equivalente ao volume do meio de cultura celular presente em cada poço, foi adicionado. 6. Os conteúdos foram misturados durante 2 minutos num agitador orbital para induzir lise celular. 7. A placa foi incubada à temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal da luminescência. 8. A luminescência foi registada e relatada em gráficos em RLU = unidades relativas de luminescência.
Certas células são semeadas em 1000-2000/poço ou 2000-3000/poço em uma placa de 96 poços, 50 ul/poço. Depois de um ou dois dias, ADC são adicionados em volumes de 50 μΐ para concentração final de 9000, 3000, 1000, 333, 111, 37, 12,4, 4,1 ou 1,4 ng/ml, com poços controlo "sem ADC" recebendo apenas o meio. As condições são em duplicado ou triplicado. Após 3-5 dias, Cell TiterGlo II 100 μΐΐ/ρορο é adicionado (ensaio à base de luciferase, proliferação medida por níveis de ATP), e as contagens de células são determinadas utilizando um luminómetro. Os dados são inseridos em gráfico como a média da luminescência para cada conjunto de réplicas, com barras de erro do desvio padrão. O protocolo é uma modificação do ensaio de viabilidade CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) : 1. Semear 1000 células/poço em 50 pL/poço do meio FBS/glutamina. Permitir às células que se liguem durante a noite. 2. ADC é diluído em série a 1:3 no meio, iniciando na concentração de trabalho 18 pg/ml (o resultado é uma concentração final de 9 pg/ml). 50 μΐ de ADC diluído são adicionados aos 50 μΐ de células e meio já no poço. 3. Incubar durante 72-96 horas (o padrão é 72 horas, mas prestar atenção na concentração de 0 pg/ml para interromper o ensaio quando as células estão 85-95% confluentes). 4. Adicionar 100 μΐ/poço do reagente Promega Cell Titer Glo, agitar durante 3 minutos e efetuar a leitura no luminómetro.
Resultados
Os conjugados anticorpo-fármaco, trastuzumab-14 (110) e trastuzumab-22 (101) foram testados contra as células SK-BR-3, KPL-4 e MCF-7 (Levenson et al (1997) Cancer Res. 57(15):3071-3078) para medir a viabilidade celular in vitro em estudos de cinco dias. O valor de CI50 (pg/ml) para 101 contra SK-BR-3 foi de 22,12. O valor de CI50 para 110 contra SK-BR-3 foi 102,78. As células SK-BR-3 apresentam expressão HER2+ e são sensíveis ao trastuzumab. Tanto 101 como 110 fo ram efetivamente inativos contra MCF-7, que é uma linhagem de adenocarcinoma mamário humano que não expressa HER2. Dessa forma, os, conjugados 101 e 110 demonstram potência para a eliminação celular direcionada. Inibição de crescimento tumoral, eficácia in vivo em ratinhos portadores de explantes transgénicos com alta expressão de HER2
Animais adequados para experiências transgénicos podem ser obtidos a partir de fontes comerciais padrão como a Taconic (Germantown, N.Y.). Muitas linhas são adequadas, mas ratinhos FVB fêmeas são preferidos por apresentarem alta suscetibilidade à formação de tumores. Machos FVB foram utilizados para o acasalamento e varões CD. 1 vasectomizados foram utilizados para estimular a pseudogravidez. Ratinhos vasectomizados podem ser obtidos de qualquer fornecedor comercial. Os fundadores foram criados com ratinhos FVB ou com ratinhos heterozigotos 129/BL6 x FVB p53. Os ratinhos com heterozigosidade no alelo p53 foram utilizados para aumentar potencialmente a formação de tumores. Contudo, isto provou ser desnecessário. Por conseguinte, alguns tumores F1 são de linhagem mista. Os tumores de fundadores são somente FVB. Seis fundadores foram obtidos com alguns tumores em desenvolvimento sem terem tido ninhadas.
Animais com tumores (aloenxerto propagado a partir dos ratinhos transgénicos Fo5 mmtv) foram tratados com uma dose única ou múltipla por injeção IV de ADC. 0 volume tumoral foi avaliado em vários momentos após a injeção.
Os tumores surgem rapidamente em ratinhos transgénicos que expressam uma forma ativada por mutação de neu, o homólogo de HER2 do rato, mas o HER2 que é superexpresso em cancros de mama humano não é mutante e a formação de tumores é muito menos robusta em ratinhos transgénicos que superexpressam o HER2 sem mutação (Webster et al (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76).
Para melhorar a formação de tumores com o HER2 não mutante, foram produzidos ratinhos transgénicos utilizando um ADNc plasmidico de HER2 no qual um ATG ascendente foi deletado para prevenir a iniciação da tradução de tais codões ATG ascendentes, os quais pelo contrário reduziriam a frequência da iniciação da tradução a partir do codão de iniciação autêntico em sentido descendente de HER2 (por exemplo, veja-se Child et al (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341) . Adicionalmente, um intrão quimérico foi adicionado à extremidade 5', o qual deve também aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman e Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836) . 0 intrão quimérico foi derivado de um vetor da Promega, o vetor de expressão Pci-neo em mamíferos (pb 890-1022) . A extremidade 3' do ADNc é flanqueada pelos exões 4 e 5 da hormona de crescimento humano e por sequências de poliadenilação. Além do mais, os ratinhos FVB foram utilizados porque esta linhagem é mais suscetível ao desenvolvimento de tumores. O promotor de MMTV-LTR foi utilizado para assegurar a expressão tecidual específica de HER2 na glândula mamária. Os animais foram alimentados com a dieta AIN 7 6A a fim de aumentar a suscetibilidade à formação de tumores (Rao et al (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158).
Modelo Fo5 de tumor mamário murino O modelo Fo5 é um modelo em ratinhos transgénicos no qual o gene HER2 humano, sob a regulação transcricional do promotor do virus do tumor mamário murino (MMTV-HER2), é superexpresso no epitélio mamário. A superexpressão provoca o desenvolvimento espontâneo de tumores mamários que superexpressam o recetor HER2 humano. O tumor mamário de um dos animais fundadores (fundador n£ 5 [Fo5]) foi propagado em gerações subsequentes de ratinhos FVB pelo transplante seriado de fragmentos tumorais. Antes de ser utilizado para um estudo de eficácia in vivo, o tumor mamário transgénico MMTV-HER2 Fo5 foi cirurgicamente transplantado na almofada adiposa mamária N2 2/3 de ratinhos nu/nu (do Charles River Laboratories) em fragmentos que mediam aproximadamente 2x2 mm. Quando os tumores atingiram os volumes desejados, os ratinhos portadores do tumor foram randomizados e receberam uma dose única por injeção IV do ADC.
Resultados A Figura 1 mostra um gráfico da alteração em volume tumoral médio in vivo ao longo do tempo no modelo de tumor de mama com aloenxertos de tumores mamários MMTV-HER2 Fo5 inoculados em ratinhos CRL nu/nu após a administração iv única no Dia 0 de: (1) Veículo: acetato de histidina a 20 mM, pH 5,5, sacarose a 240 mM, (2) xCD22-22 (103) a 10 mg/kg, (3) trastuzumab-22 (101) a 1 mg/kg, (4) trastuzumab-22 (101) a 3 mg/kg e (5) trastuzumab-22 (101) a 10 mg/kg. As linhas na figura estão indicadas com os símbolos seauintes:
Veículo ADC101 Tmab HC A118C, 1 mg/kg ADC101 Tmab HC A118C, 3 mg/kg ADC101 Tmab HC A118C, 10 mg/kg ADC103 CD22 HC A118C, 10 mg/kg A Figura 2 mostra um gráfico da alteração em volume tumoral médio in vivo ao longo do tempo no modelo de cancro de mama com aloenxertos do tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 inoculados em ratinhos CRL nu/nu após uma administração iv única no Dia 0 de: (1) Veículo: acetato de histidina a 20 mM, pH 5,5, sacarose a 240 mM, (2) xCD22-14 (112) a 6 mg/kg, (3) trastuzumab-14 (110) a 1 mg/kg, (4) trastuzumab-14 (110) a 3mg/kg, (5) trastuzumab-14 (110) a 6 mg/kg e (6) trastuzumab-22 (101) a 1 mg/kg. As linhas na figura estão indicadas com os símbolos seguintes:
Veiculo ADC101 Tmab HC A118C, 1 mg/kg ADC110 Tmab HC A118C, 1 mg/kg ADC110 Tmab HC A118C, 3 mg/kg ADC110 Tmab HC A118C, 6 mg/kg ADC112 CD22 HC A118C, 6 mg/kg Abreviaturas Ac acetilo
Acm acetamidometilo
Alloc aliloxicarbonila
Boc dicarbonato de di-terc-butilo t-Bu terc-butilo
Bzl benzilo, em gue Bzl-OMe é metoxibenzilo e Bzl-
Me é metilbenzeno
Cbz ou Z benziloxi-carbonilo, em que Z-Cl e Z-Br são cloro- e bromobenziloxi carbonilo respetivamente DMF N, N-dimetilformamida
Dnp dinitrofenilo DTT ditiotreitol
Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo imp grupo protetor de N-10 imina: 3-(2- metoxietoxi)propanoato-Val-Ala-PAB MC-OSu maleimidocaproil-O-iV-succinimida
Moc metoxicarbonilo MP maleimidopropanamida
Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonilo PAB para-aminobenziloxicarbonilo PEG etilenoxi PNZ carbamato de p-nitrobenzilo
Psec 2-(fenilsulfonil)etoxicarbonilo TBDMS terc-butildimetilsililo TBDPS terc-butildifenilsililo
Teoc 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo
Tos tosilo
Troe cloreto de 2,2,2-tricloretoxicarbonilo
Trt tritilo
Xan xantilo
Referências EP 0522868 EP 0875569 EP 1295944 EP 1347046 EP 1394274 EP 1394274 EP 1439393 JP 05003790 JP 2004113151 JP 58180487 US 2001/055751 US 2002/034749 US 2002/042366 US 2002/150573 US 2002/193567 US 2003/0228319 US 2003/060612 US 2003/064397 US 2003/065143 US 2003/091580 US 2003/096961 US 2003/105292 US 2003/109676 US 2003/118592 US 2003/119121 US 2003/119122 US 2003/119125 US 2003/119126 US 2003/119128 US 2003/119129 US 2003/119130 US 2003/119131 US 2003/124140 US 2003/124579 US 2003/129192 US 2003/1347 90-A1 US 2003/143557 US 2003/157089 US 2003/165504 US 2003/185830 US 2003/186372 US 2003/186373 US 2003/194704 US 2003/206918 US 2003/219806 US 2003/224411 US 2003/224454 US 2003/232056 US 2003/232350 US 20030096743 US 20030130189 US 2003096743 US 2003130189 US 2004/0001827 US 2004/005320 US 2004/005538 US 2004/005563 US 2004/005598 US 2004/0101899 US 2004/018553 US 2004/022727 US 2004/044179 US 2004/044180 US 2004/101874 US 2004/197325 US 2004/249130 US 20040018194 US 20040052793 US 20040052793 US 20040121940 US 2005/271615 US 2006/116422 US 4816567 US 5362852 US 5440021 US 5583024 US 5621002 US 5644033 US 5674713 US 5700670 US 5773223 US 5792616 US 5854399 US 5869445 US 5976551 US 6011146 US 6153408 US 6214345 US 6218519 US 6268488 US 6518404 US 6534482 US 6555339 US 6602677 US 6677435 US 6759509 US 6835807 US 7223837 US 7375078 US 7521541 US 7723485 WO 00/012508 WO 00/12507 WO 00/12508 WO 01/16318 WO 01/45746 WO 02/088172 WO 03/026577 WO 03/043583 WO 04/032828 WO 2000/12130 WO 2000/14228 WO 2000/20579 WO 2000/22129 WO 2000/32752 WO 2000/36107 WO 2000/40614 WO 2000/44899 WO 2000/55351 WO 2000/75655 WO 200053216 WO 2001/00244 WO 2001/38490 WO 2001/40269 WO 2001/40309 WO 2001/41787 WO 2001/46232 WO 2001/46261 WO 2001/48204 WO 2001/53463 WO 2001/57188 WO 2001/62794 WO 2001/66689 WO 2001/72830 WO 2001/72962 WO 2001/75177 WO 2001/77172 WO 2001/88133 WO 2001/90304 WO 2001/94641 WO 2001/98351 WO 2002/02587 WO 2002/02624 WO 2002/06317 WO 2002/06339 WO 2002/101075 WO 2002/10187 WO 2002/102235 WO 2002/10382 WO 2002/12341 WO 2002/13847 WO 2002/14503 WO 2002/16413 WO 2002/16429 WO 2002/22153 WO 2002/22636 WO 2002/22660 WO 2002/22808 WO 2002/24909 WO 2002/26822 WO 2002/30268 WO 2002/38766 WO 2002/54940 WO 2002/59377 WO 2002/60317 WO 2002/61087; WO 2002/64798 WO 2002/71928 WO 2002/72596 WO 2002/78524 WO 2002/81646 WO 2002/83866 WO 2002/86443 WO 2002/88170 WO 2002/89747 WO 2002/92836 WO 2002/94852 WO 2002/98358 WO 2002/99074 WO 2002/99122 WO 2003/000842 WO 2003/002717 WO 2003/003906 WO 2003/003984 WO 2003/004989 WO 2003/008537 WO 2003/009814 WO 2003/014294 WO 2003/016475 WO 2003/016494 WO 2003/018621 WO 2003/022995 WO 2003/023013 WO 2003/024392 WO 2003/025138 WO 2003/025148 WO 2003/025228 WO 2003/026493 WO 2003/029262 WO 2003/029277 WO 2003/029421 WO 2003/034984 WO 2003/035846 WO 2003/042661 WO 2003/045422 WO 2003/048202 WO 2003/054152 WO 2003/055439 WO 2003/055443 WO 2003/062401 WO 2003/062401 WO 2003/072035 WO 2003/072036 WO 2003/077836 WO 2003/081210 WO 2003/083041 WO 2003/083047 WO 2003/083074 WO 2003/087306 WO 2003/087768 WO 2003/088808 WO 2003/089624 WO 2003/089904 WO 2003/093444 WO 2003/097803 WO 2003/101283 WO 2003/101400 WO 2003/104270 WO 2003/104275 WO 2003/105758 WO 2003004529 WO 2003042661 WO 2003104399 WO 2004/000997 WO 2004/001004 WO 2004/009622 WO 2004/011611 WO 2004/015426 WO 2004/016225 WO 2004/020595 WO 2004/022709 WO 2004/022778 WO 2004/027049 WO 2004/031238 WO 2004/032828 WO 2004/032842 WO 2004/040000 WO 2004/043361 WO 2004/043963 WO 2004/044178 WO 2004/045516 WO 2004/045520 WO 2004/045553 WO 2004/046342 WO 2004/047749 WO 2004/048938 WO 2004/053079 WO 2004/063355 WO 2004/063362 WO 2004/063709 WO 2004/065577 WO 2004/074320 WO 2004000221 WO 2004020583 WO 2004042346 WO 2004065576 WO 2005/023814 WO 2005/082023 WO 2005/085251 WO 2006/111759 WO 2007/044515 WO 2007/085930 WO 2009/052249 WO 2010/091150 WO 91/02536 WO 92/07574 WO 92/17497 WO 94/10312 WO 94/28931 WO 9630514 WO 97/07198 WO 97/44452 WO 98/13059 WO 98/37193 WO 98/40403 WO 98/51805 WO 98/51824 WO 99/28468 WO 99/46284 WO 99/58658
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Lisboa, 14 de Dezembro de 2015

Claims (30)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um conjugado de fórmula (A):
    as linhas a tracejado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre Cl e C2 ou C2 e C3; R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-Rd, =C(Rd)2, 0-S02-R, C02R e COR, e ainda, opcionalmente selecionado a partir de halo ou dihalo; onde Rd é independentemente selecionado a partir de R, C02R, COR, CHO, C02H, e halo; R6 e R9 são independentemente selecionados a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' , N02, Me3Sn e halo; R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', N02, Me3Sn e halo; Y é selecionado a partir de uma ligação simples, e um grupo de fórmulas Ai ou A2:
    onde N mostra onde o grupo se liga a N10 da fração PBD; R e R são mdependentemente selecionados a partir de H e metilo, ou em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um grupo ciclopropileno; CBA representa um agente de ligação celular; Q é independentemente selecionado a partir de 0, Se NH; R11 é H, ou R ou, onde Q é 0, SO3M, onde M é um catião metálico; R e R' são cada um independentemente selecionado a partir dos grupos alquilo Ci-22, heterociclilo C3-20 e arilo C5-20, e opcionalmente, em relação ao grupo NRR', R e R' em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico opcionalmente substituído de 4, 5, 6 ou 7 membros; η g η r Ί q η η g em que R , R , R e R são conforme definido para R , R6, R9 e R7, respetivamente; em que R" é um grupo alquileno C3-22, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, 0, 5, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, cujos anéis são opcionalmente substituídos; X e X' são independentemente selecionados a partir de 0, S e N (H) .
  2. 2. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que Rl1 e Rl2 são ambos H.
  3. 3. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 1, em que um τι t 9 de R eR eHeo outro e metilo.
  4. 4. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Y é uma ligação simples.
  5. 5. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que R9 e R19 são H, e/ou R6 e R16 são H.
  6. 6. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das 7 17 7 Ά reivindicações 1 a 5, em que R e R são ambos OR , onde R7a é alquilo C1-4 opcionalmente substituído.
  7. 7. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 6, em que R7a é Me.
  8. 8. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que X é 0.
  9. 9. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que R11 é H.
  10. 10. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que existe uma ligação dupla entre C2 e C3 em cada unidade monomérica, e em que R2 e R12 são independentemente R.
  11. 11. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 10, em que R2 e R12 são independentemente arilo C5-2o opcionalmente substituído.
  12. 12. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que R2 e R12 são independentemente selecionados a partir de =0, =CH2, =CH-RD e =C(RD)2.
  13. 13. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 12, em que R2 e R12 são =CH2.
  14. 14. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que R" é um grupo alquileno C3 ou um grupo alquileno C5.
  15. 15. 0 conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o agente de ligação celular é um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo, e em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo para um antigénio associado a tumor.
  16. 16. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 15, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo que se liga a um ou mais antigénios associados a tumor ou recetores da superfície celular selecionados a partir de (D - (36) : (1) BMPRI B (de proteínas morfogenéticas ósseas tipo IB); (2) EI 6 (LATI, SLC7A5) ; (3) STEAP1 (antigénio epitelial de seis domínios transmembrana da próstata); (4) 0772P (CA125, MUC16); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócitos, mesotelina); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família 34 de portador de soluto (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato 3b dependente de sódio tipo II); (7) Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetiç4oes de trombospondina (tipo 1 e semelhante a tipo 1), domínio transmembranar (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B); (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gene RIKEN cDNA 2700050C12); (9) ETBR (Recetor de tipo B de endotelina); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315); (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao cancro da próstata, proteína 1 associada ao cancro da próstata, antigénio epitelial de seis domínios transmembrana da próstata 2, proteína da próstata de seis domínios transmembrana); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catiões de potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma); (14) CD21 (CR2 (Recetor de complemento 2) ou C3DR (C3d/Recetor do vírus Epstein Barr) ou Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (beta associado à imunoglobulina), B29); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAPlA (domínio SH2 contendo proteína la de ancoragem de fosfatase), SPAP1B, SPAP1C); (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL2 ORa; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (recetor de fator de ativação de células B, recetor 3 BLyS, BR3); (27) CD22 (isoforma CD22-B de recetor de células B); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa associado à imunoglobulina); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula de MHC de classe II (antigénio Ia)); (31) P2X5 (canal iónico 5 ativado por ligando de recetor purinérgico P2X); (32) CD72 (antigénio de diferenciação de células B CD72, Lyb-2); (33) LY64 (Antigénio linfocitário 64 (RP105), proteína membranar de tipo I da família de repetições ricas em leucina (LRR)); (34) FcRHl (proteína 1 semelhante a recetor Fc); (35) IRTA2 (associado 2 à superfamília de imunoglobulinas de translocação de recetores); e (36) TENB2 (suposto proteoglicano transmembrana).
  17. 17. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 15, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo manipulado com cisteína.
  18. 18. 0 conjugado de acordo com a reivinidicação 15 ou reivinidicação 17, em que o anticorpo é trastuzumab.
  19. 19. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 17, em que Ab é um anticorpo anti-HER2, um anti-Steap 1 ou um anti-CD22.
  20. 20. O conjugado de acordo com a reivindicação 15, em que a carga de fármaco (p) de fármacos (D) para anticorpo (Ab) é um número inteiro desde 1 até cerca de 8.
  21. 21. O conjugado de acordo com a reivindicação 20 que compreende uma mistura dos compostos de conjugado anticorpo-fármaco, em que a carga de fármaco média por anticorpo na mistura de compostos de conjugado anticorpo-fármaco é cerca de 2 até cerca de 5.
  22. 22. O conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, para utilização em terapêutica.
  23. 23. O conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, para utilização no tratamento de uma doença proliferativa num indivíduo.
  24. 24. 0 conjugado de acordo com a reivindicação 23, em que a doença é cancro.
  25. 25. Uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um diluente, portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  26. 26. A composição farmacêutica da reivindicação 25 que compreende adicionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico.
  27. 27. Um composto de fórmula (E):
    e sais e solvatos do mesmo, em que as linhas a tracejado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre Cl e C2 ou C2 e C3; R2, R6, R7, R9, R12, R16, R17, R19, X, X', R", Y, RL1 e RL2 e são conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
  28. 28. 0 composto de acordo com a reivindicação 27, que é:
  29. 29. 0 composto de acordo com a reivindicação 27, que é:
  30. 30. Um método de preparação de um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o método que compreende as etapas de submeter a reação um agente de ligação celular com o composto (D) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 27 a 29. Lisboa, 14 de Dezembro de 2015
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