BR112014009050B1 - Conjugado anticorpo-fármaco de pirrolbenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende o mesmo, bem como compostos de pirrolbenzodiazepinas - Google Patents
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Abstract
PIRROLBENZODIAZEPINAS E CONJUGADOS DESTAS Conjugado da Fórmula (A): em que as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre Cl e C2 ou C2 e C3; R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =0, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcionalmente ainda selecionado a partir de halo ou dihalo; onde RD é independentemente selecionado a partir de R, CO2R, COR, CHO, CO2H e halo; R6 e R9 são independentemente selecionados a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn e halo; R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NOz, MesSn e halo; Y é selecionado a partir de uma ligação simples e um grupo das Fórmulas A1 ou A2: (A") (A2) em que N mostra onde o grupo liga-se ao N10 da porção PBD; RL1 e RL2 são independentemente selecionados a partir de H e metila ou juntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados formam um grupo ciclopropileno; CBA representa um agente de ligação celular; Q é independentemente selecionado a partir de O, S (...).
Description
[001] A presente invenção diz respeito às pirrolbenzodiazepinas (PBDs), es-pecialmente a pirrolbenzodiazepinas tendo um grupo protetor N10 lábil, na forma de um ligador para um agente de ligação celular.
[002] Algumas pirrolbenzodiazepinas (PBDs) têm a capacidade para reconhecer e se ligar a sequências específicas do DNA; a sequência preferida é PuGPu. O primeiro antibiótico antitumoral PBD, a antramicina, foi descoberto em 1965 (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Desde então, uma série de PDBs naturais foi relatada e mais de 10 vias sintéticas foram desenvolvidas para uma variedade de análogos (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. e Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). Os membros da família incluem abeimicina (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), chicamicina (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Patente Japonesa 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicinas A e B (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley e Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicina (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) e tomamicina (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). As PBDs são da estrutura geral:
[003] Estas diferem no número, no tipo e na posição de substituintes, em seus anéis aromáticos A e em seus anéis pirrol C no grau de saturação do anel C. No anel B, há uma imina (N=C), uma carbinolamina (NH-CH(OH)) ou um éter metíli- co de carbinolamina (NH-CH(OMe)) na posição N10-C11 que é o centro eletrofílico responsável pela alquilação do DNA. Todos os produtos naturais conhecidos possuem configuração (S) na posição quiral C11a que lhes torcem em direção ao lado direito quando vistos do anel C para o anel A. Isso lhes fornece a forma tridimensional apropriada para isohelicidade com a fenda menor da forma B-DNA, levando a um ajuste confortável no sítio de ligação (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nova York, pág. 3-11 (1975); Hurley e Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230- 237 (1986)). A sua capacidade para formar um aduto na fenda menor, lhes permite interferir com o processamento do DNA, daí o seu uso como agentes antitumorais.
[004] Os presentes inventores descreveram previamente em WO 2005/085251, compostos PBD diméricos portando substituintes C2 arila, como:
[005] Esses compostos demonstraram serem agentes citotóxicos altamente úteis.
[006] Um composto pirrolbenzodiazepínico especialmente vantajoso é des-crito por Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797-798), como composto 1, e por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) como composto 4a. Este com-posto, também conhecido como SJG-136, é mostrado abaixo:
[007] Os presentes inventores descreveram previamente que compostos PBD podem ser empregados como pró-fármacos quando protegidos na posição N10 com um grupo protetor de nitrogênio que é removível in vivo (WO 00/12507). Muitos desses grupos protetores são carbamatos, e são, por exemplo, da estrutura:
[008] onde o asterisco (*) indica o ponto de ligação ao átomo N10 da PBD.
[009] Os presentes inventores também descreveram o preparo de compostos PBD com um grupo protetor do nitrogênio do carbamato na posição N10 (WO 2005/023814). Os grupos protetores podem ser removidos da posição N10 da porção PBD para deixar uma ligação imina N10-C11. Uma variedade de grupos de proteção é descrita, incluindo grupos que podem ser clivados pela ação de enzimas.
[010] O documento WO 2007/085930 descreve o preparo de compostos PBD diméricos com grupos ligadores para a conexão com um agente de ligação celular, tal como um anticorpo. O ligador está presente na ponte que liga as unidades monoméricas da PBD do dímero.
[011] A terapia antibiótica foi estabelecida para o tratamento direcionado de pacientes com câncer, transtornos imunológicos e angiogênicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). O uso de conjugados antibiótico-fármaco (ADC), ou seja, imunoconjugados, para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, fármacos que eliminam ou inibem células tumorais no tratamen-to de câncer, direciona a liberação da porção do fármaco para tumores e o seu acú- mulo intracelular nesses locais, enquanto que a administração sistêmica desses con-jugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade a células normais, bem como às células tumorais que se procurava eliminar (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):1137- 1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos e Epene- tos (1999) Anticancer Research 19:605-614).
[012] A eficácia máxima com toxicidade mínima é assim procurada. Os es-forços para criar e refinar os ADC têm sido concentrados na seletividade de anticor-pos monoclonais (mAbs), bem como no mecanismo de ação dos fármacos, na ligação do fármaco, na razão fármaco/anticorpo (carga) e nas propriedades de liberação dos fármacos (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070). As porções do fármaco podem transmitir seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem a ligação à tubulina, a ligação ao DNA ou a inibição da topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ficar inativos ou menos ativos quando conjugados a anticorpos ou a ligantes de receptores proteicos de grandes dimensões.
[013] Os presentes inventores desenvolveram uma nova abordagem para formar conjugados de PBD com agentes de ligação celular e, especialmente, conju-gados de PBD e anticorpos.
[014] Em um aspecto geral, a presente invenção provê um conjugado que compreende um composto PBD dimérico conectado através da posição N10 por meio de um ligante específico de enxofre a um agente de ligação celular. O agente de ligação celular é de preferência um anticorpo.
[015] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê novos compostos conjugados da Fórmula (A):
e seus sais e solvatos, e: a.as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla en-tre C1 e C2 ou C2 e C3; b.R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcionalmente selecionado ainda a partir de halo ou dihalo; c.em que RD é independentemente selecionado a partir de R, CO2R, COR, CHO, CO2H e halo; i .R6 e R9 são independentemente selecionados a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo; ii .R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo; iii .Y é selecionado a partir de uma ligação simples e um grupo das Fórmulas A1 ou A2: 
iv .em que N mostra onde o grupo se liga ao N10 da porção PBD; d.RL1 e RL2 são independentemente selecionados a partir de H e metila ou, juntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados, formam um grupo ciclopropileno; i .CBA representa um agente de ligação celular; ii .Q é independentemente selecionado a partir de O, S e NH; iii .R11 é H ou R ou, quando Q for O, SO3M, em que M é um cátion de metal; iv .R e R’ são selecionados cada um independentemente a partir de grupos C1-12 alquila, C3-20 heterociclila e C5-20 arila opcionalmente substituídos e, opcionalmente em relação ao grupo NRR’, R e R’, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcional-mente substituído; v .em que R12, R16, R19 e R17 são conforme definidos para R2, R6, R9 e R7 res-pectivamente; vi .em que R" é um grupo C3-12 alquileno, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe (N-metila) e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos; e.X e X’ são independentemente selecionados a partir de O, S e N(H).
[016] Por conseguinte, a Fórmula A é selecionada a partir das Fórmulas A-I, A-II e A-III abaixo, dependendo de Y:
[017] Em compostos da Fórmula A:
[018] é o grupo de ligação de enxofre.
[019] Um segundo aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de um conjugado do primeiro aspecto para prover um composto da Fórmula (B) ou (C) em um local-alvo:
[020] e seus sais e solvatos, em que os grupos são conforme para o primeiro aspecto, exceto que: a.Q é independentemente selecionado a partir de O, S e NH; e i.R11 é H ou R ou, quando Q for O, SO3M, em que M é um cátion de metal.
[021] Um terceiro aspecto da presente invenção também provê compostos da Fórmula (D) para uso no preparo dos compostos conjugados da invenção:
[022] e seus sais e solvatos, em que os grupos são conforme definidos no primeiro aspecto da invenção.
[023] Nos compostos acima, os anéis de 5 membros representados por
podem ser substituídos por um anel selecionado a partir de: a.(a) 
(E), onde R2 com qualquer um de R1 ou R3, juntamente com os átomos de carbono do anel C aos quais se encontram ligados, formam um anel benzeno opcionalmente substituído; b.V e W são selecionados cada um a partir de (CH2)n, O, S, NR, CHR e CRR’, em que n é 1, 2 ou 3; exceto que V é C, quando R1 e R2, juntamente com os átomos de carbono do anel C aos quais se encontram ligados, formam um anel ben-zeno opcionalmente substituído, e W é C quando R3 e R2, juntamente com os áto-mos de carbono do anel C aos quais se encontram ligados, formarem um anel ben-zeno opcionalmente substituído; e c.(b) 
(F), onde T é selecionado a partir de CH2, NR, CO, BH, SO e SO2; d.U é selecionado a partir de CH2, NR, O e S; e.Y é (CH2)n, em que n é 1, 2, 3 ou 4; f.exceto que T, U e Y não são todos CH2.
[024] A presente invenção provê um conjugado que compreende um dímero de PBD conectado através da posição N10 em uma das porções PBD por meio de um ligador especificado a um agente de ligação celular.
[025] A presente invenção é adequada para uso em prover um composto PBD a um sítio preferido em um indivíduo. O conjugado permite a liberação de um composto PBD ativo que não retém qualquer parte do ligador. Não há resto presente que pudesse afetar a reatividade do composto PBD.
[026] As preferências seguintes podem aplicar-se a todos os aspectos da in-venção conforme descritos acima, ou podem relacionar-se a um único aspecto. As preferências podem ser combinadas junto em qualquer combinação.
[027] Em uma modalidade, não há ligação dupla presente entre C1 e C2, e C2 e C3.
[028] Em uma modalidade, as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C2 e C3, como mostrado abaixo:
[029] Em uma modalidade, uma ligação dupla está presente entre C2 e C3 quando R2 for C5-20 arila ou C1-12 alquila.
[030] Em uma modalidade, as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2, como mostrado abaixo:
[031] Em uma modalidade, uma ligação dupla está presente entre C1 e C2 quando R for C5-20 arila ou C1-12 alquila.
[032] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcio-nalmente selecionado ainda a partir de halo ou dihalo.
[033] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado a partir de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR.
[034] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado a partir de H, =O, =CH2, R, =CH-RD e =C(RD)2.
[035] Em uma modalidade, R2 é independentemente H.
[036] Em uma modalidade, R2 é independentemente =O.
[037] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CH2.
[038] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CH-RD. Dentro do composto PBD, o grupo =CH-RD pode ter qualquer uma das configurações mostra-das abaixo:
[039] Em uma modalidade, a configuração é a configuração (I).
[040] Em uma modalidade, R2 é independentemente =C(RD)2.
[041] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CF2.
[042] Em uma modalidade, R2 é independentemente R.
[043] Em uma modalidade, R2 é independentemente C5-20 arila opcionalmen-te substituído.
[044] Em uma modalidade, R2 é independentemente C1-12 alquila opcional-mente substituído.
[045] Em uma modalidade, R2 é independentemente C5-20 arila opcionalmen-te substituído.
[046] Em uma modalidade, R2 é independentemente C5-7 arila opcionalmente substituído.
[047] Em uma modalidade, R2 é independentemente C8-10 arila opcionalmen-te substituído.
[048] Em uma modalidade, R2 é independentemente fenila opcionalmente substituído.
[049] Em uma modalidade, R2 é independentemente tienila opcionalmente substituído.
[050] Em uma modalidade, R2 é independentemente naftila opcionalmente substituído.
[051] Em uma modalidade, R2 é independentemente piridila opcionalmente substituído.
[052] Em uma modalidade, R2 é independentemente quinolinila ou isoquino- linila opcionalmente substituído.
[053] Em uma modalidade, R2 carrega um a três grupos substituintes, sendo que 1 e 2 são mais preferidos, e grupos individualmente substituídos sendo os mais preferidos. Os substituintes podem estar em qualquer posição.
[054] Quando R2 é um grupo C5-7 arila, um único substituinte está de prefe-rência em um átomo do anel que não seja adjacente da ligação ao restante do com-posto, ou seja, é preferivelmente β ou Y em relação à ligação ao restante do com- posto. Portanto, quando o grupo C5-7 arila é fenila, o substituinte está de preferência nas posições meta ou para e, mais preferivelmente, na posição para.
[055] Em uma modalidade, R2 é selecionado a partir de:
[056] em que o asterisco indica o ponto de ligação.
[057] Quando R2 é um grupo C8-10 arila, por exemplo, quinolinila ou isoquino- linila, este pode carregar qualquer número de substituintes em qualquer posição dos anéis quinolina ou isoquinolina. Em algumas modalidades, o grupo carrega um, dois ou três substituintes, e estes podem estar no anel proximal e no distal ou em ambos (se mais de um substituinte).
[058] Em uma modalidade, quando R2 é opcionalmente substituído, os subs- tituintes são selecionados a partir daqueles substituintes fornecidos na seção abaixo de substituintes.
[059] Quando R é opcionalmente substituído, os substituintes são preferi-velmente selecionados a partir de: i.Halo, hidroxila, éter, formila, acila, carboxi, éster, aciloxi, amino, amido, aci- lamido, aminocarboniloxi, ureído, ciano e tioéter.
[060] Em uma modalidade, quando R ou R2 é opcionalmente substituído, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR’, NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[061] Quando R2 é C1-12 alquila, o substituinte opcional pode incluir adicio-nalmente grupos C3-20 heterociclila e C5-20 arila.
[062] Quando R2 é C3-20 heterociclila, o substituinte opcional pode incluir adi-cionalmente grupos C1-12 alquila e C5-20 arila.
[063] Quando R2 é grupo C5-20 arila, o substituinte opcional pode incluir adi-cionalmente grupos C3-20 heterociclila e C1-12 alquila.
[064] Entende-se que o termo “alquila” abrange as subclasses alquenila e alquenila, bem como ciclo cicloalquila. Por conseguinte, quando R2 é C1-12 alquila opcionalmente substituído, entende-se que o grupo alquila opcionalmente contém uma ou mais ligações duplas ou triplas carbono-carbono, as quais podem formar parte de um sistema conjugado. Em uma modalidade, o grupo C1-12 alquila opcio-nalmente substituído contém ao menos uma ligação dupla ou tripla carbono- carbono, e essa ligação está conjugada com uma ligação dupla presente entre C1 e C2 ou C2 e C3. Em uma modalidade, o grupo C1-12 alquila é um grupo selecionado a partir de C1-12 alquila, C2-12 alquenila, C2-12 alquinila e C3-12 cicloalquila saturados.
[065] Se for halo, o substituinte em R2 é de preferência F ou Cl, mais preferi-velmente F.
[066] Se for éter, o substituinte em R2 pode, em algumas modalidades, ser um grupo alcóxi, por exemplo, um grupo C1-7 alcóxi (por exemplo, metoxi, etoxi) ou pode, em algumas modalidades, ser um grupo C5-7 ariloxi (por exemplo, fenoxi, piri- diloxi, furaniloxi).
[067] Se for C1-7 alquila, o substituinte em R2 pode preferivelmente ser um grupo C1-4 alquila (por exemplo, metila, etila, propila, butila).
[068] Se for C3-7 heterociclila, o substituinte em R2 pode, em algumas moda-lidades, ser grupo C6 heterociclila contendo nitrogênio, por exemplo, morfolino, tio- morfolino, piperidinila, piperazinila. Esses grupos podem estar ligados ao resto da porção PBD através do átomo de nitrogênio. Esses grupos podem ser ainda substi-tuídos, por exemplo, com grupos C1-4 alquila.
[069] Se for bis-oxi-C1-3 alquileno, o substituinte em R2 é de preferência bis- oxi-metileno ou bis-oxi-etileno.
[070] Substituintes especialmente preferidos para R2 incluem metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinila, morfolino e metil-tienila.
[071] Grupos R2 substituídos especialmente preferidos incluem, entre outros, 4-metoxi-fenila, 3-metoxifenila, 4-etoxi-fenila, 3-etoxi-fenila, 4-metil-fenila, 4-fluoro- fenila, 4-cloro-fenila, 3,4-bisoximetileno-fenila, 4-metiltienila, 4-cianofenila, 4- fenoxifenila, quinolin-3-ila e quinolin-6-ila, isoquinolin-3-ila e isoquinolin-6-ila, 2- tienila, 2-furanila, metoxinaftila e naftila.
[072] Em uma modalidade, R2 é halo ou dihalo. Em uma modalidade, R2 é -F ou -F2, em que esses substituintes estão ilustrados abaixo como (III) e (IV) respecti- vamente:
[073] Em algumas modalidades, é preferível que haja uma ligação dupla en-tre C2 e C3 ou o substituinte de C2 está ligado ao anel PBD por uma ligação dupla (ou seja, que o átomo de C em C2 seja um centro sp2).
[074] RD
[075] Em uma modalidade, RD é independentemente selecionado a partir de R, CO2R, COR, CHO, CO2H e halo.
[076] Em uma modalidade, RD é independentemente R.
[077] Em uma modalidade, RD é independentemente halo.
[078] R6
[079] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn- e halo.
[080] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado a partir de H, OH, OR, SH, NH2, NO2 e halo.
[081] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado a partir de H e halo.
[082] Em uma modalidade, R6 é independentemente H.
[083] Em uma modalidade, R6 e R7 em conjunto formam um grupo -O- (CH2)p-O-, em que p é 1 ou 2.
[084] R7
[085] R7 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo.
[086] Em uma modalidade, R7 é independentemente OR.
[087] Em uma modalidade, R7 é independentemente OR7A, em que R7A é in-dependentemente C1-6 alquila opcionalmente substituído.
[088] Em uma modalidade, R7A é independentemente C1-6 alquila saturado opcionalmente substituído.
[089] Em uma modalidade, R7A é independentemente C2-4 alquenila opcio-nalmente substituído.
[090] Em uma modalidade, R7A é independentemente Me.
[091] Em uma modalidade, R7A é independentemente CH2Ph.
[092] Em uma modalidade, R7A é independentemente alila.
[093] R9
[094] Em uma modalidade, R9 é independentemente selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn- e halo.
[095] Em uma modalidade, R9 é independentemente H.
[096] Em uma modalidade, R9 é independentemente R ou OR.
[097] Grupo de ligação
[098] O grupo de ligação pode ser removido da posição N10 da porção PBD no conjugado da Fórmula A para deixa uma ligação N10-C11 imina, uma carbinola- mina substituída, em que QR11 é OSO3M, um aduto bissulfeto, uma tiocarbinolamina, uma tiocarbinolamina substituída ou uma carbinalamina substituída (composto das Fórmulas B ou C) conforme ilustrados abaixo:
[0100] onde R e M são conforme definidos para os conjugados da invenção.
[0101] Em uma modalidade, o grupo de ligação pode ser removido da posi-ção N10 da porção PBD para deixar uma ligação N10-C11 imina.
[0102] O elo específico entre o dímero PBD e o agente de ligação celular, por exemplo, anticorpo, na presente invenção é de preferência estável em meio ex- tracelular. Antes de ser transportado ou liberado em uma célula, o conjugado anti- corpo-fármaco (ADC) é preferivelmente estável e permanece intacto, ou seja, o anti-corpo permanece ligado à porção do fármaco. Os ligadores são estáveis fora do alvo celular e podem ser clivados com alguma taxa de eficiência no interior da célula. Um ligador eficaz: (i) manterá as propriedades de ligação específica do anticorpo; (ii) permitirá a liberação intracelular do conjugado ou da porção do fármaco; (iii) perma-necerá estável e intacto, ou seja, não clivado, até que o conjugado tenha sido libera-do ou transportado para seu sítio direcionado; e (iv) manterá um efeito citotóxico de eliminação celular ou um efeito citostático da porção do fármaco PBD. A estabilidade do ADC pode ser medida por técnicas analíticas padrão, como espectroscopia de massa, HPLC e a técnica de LC/MS de separação/análise.
[0103] A liberação dos compostos das Fórmulas B ou C é alcançada no sítio desejado de ativação dos conjugados da Fórmula A pela ação de uma enzima no grupo de ligação. O S do conjugado da Fórmula A é ligado por uma ponte dissulfeto a um S livre S (tiol ativo) no agente de ligação celular.
[0104] O grupo de ligação pode ser clivável pela ação de uma enzima. Em uma modalidade, a enzima é uma tioredutase.
[0105] Certos anticorpos possuem dissulfetos entre a cadeia que podem ser reduzidos, ou seja, pontes de cisteína. Os anticorpos podem se tornarem reativos para a conjugação com reagentes ligadores pelo tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará assim, teoricamente, dois nucleófilos reativos de tiol. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por meio da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut), resultando na conversão de uma amina em um tiol. Grupos tióis reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) introduzindo um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorpos mutantes compreen-dendo um ou mais resíduos do aminoácido cisteína não nativos). O documento US 7521541 ensina construir anticorpos pela introdução de resíduos reativos de cisteí- na.
[0106] RL1 e RL2 são selecionados a partir de H e metila, ou juntamente com o átomo de carbono ao qual se encontram ligados formam a grupo ciclopropileno. Em algumas modalidades, os dois são H. Em outra modalidade, os dois são metila. Em modalidades adicionais, um é H e o outro é metila; nessas modalidades, o átomo de carbono ao qual se encontram ligados é um centro quiral.
[0107] Em algumas modalidades, Y é uma ligação simples.
[0108] Em outras modalidades, Y é
(A1).
[0109] Em modalidades adicionais, Y é
(A2).
[0110] Q
[0111] Em uma modalidade, Q é selecionado a partir de O, S ou N(H).
[0112] De preferência, Q é O.
[0113] R11
[0114] Em uma modalidade, R11 é H ou R, ou, quando Q for O, SO3M, em que M é um cátion de metal.
[0115] Em uma modalidade, R11 é H.
[0116] Em uma modalidade, R11 é R.
[0117] Em uma modalidade, na qual Q é O, R11 é SO3M, em que M é um cá- tion de metal. O cátion pode ser Na+.
[0118] Um agente de ligação celular pode ser de qualquer tipo e inclui peptí- deos e não peptídeos. Estes podem incluir anticorpos ou um fragmento de anticorpo que contenha ao menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, fatores de cres-cimento, moléculas de transporte de nutrientes ou qualquer outra molécula ou subs-tância que se liga a células.
[0119] O termo “anticorpo”, neste relatório descritivo, é usado no sentido mais amplo, abrangendo especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos poli- clonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que estes exibam a atividade bio-lógica desejada (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Os anticor-pos podem ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a ed., Garland Publishing, Nova York). Um alvo antigênico possui geralmente inúmeros sítios de ligação, também denominados epítopos, reconhecidos por CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente possui uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode ter mais de um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula completa de imunoglobulina ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula completa de imunoglobulina, ou seja, uma molécula que contém um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um antígeno de um al-vo de interesse ou parte deste, em que tais alvos incluem, entre outros, célula can-cerosa ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doen-ça autoimune. A imunoglobulina pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou sub-classe de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas a partir de qualquer espécie, inclusive de origem humana, murina ou de coelho.
[0120] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anti-corpo completo, em geral a de ligação a antígeno ou sua região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diabodi- es; anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (região determinante de complementa-ridade) e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos precedentes que se liguem imunoespecificamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multi- específicos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0121] O termo “anticorpo monoclonal” neste relatório descritivo refere-se a um anticorpo obtido de uma população formada por anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto por mutações possíveis ocorridas naturalmente que podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente es-pecíficos e se direcionam contra um único sítio antigênico. Além do mais, ao contrá-rio de preparados de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direci-onados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é di-recionado um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anti- corpos monoclonais são vantajosos no sentido de que podem ser sintetizados sem a contaminação por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” indica o caráter de o anticorpo ter sido obtido a partir uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deverá ser interpretado como o de exigir a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al (1975) Nature 256:495, ou po-dem ser preparados por métodos do DNA recombinante (ver, US 4816567). Os anti-corpos monoclonais podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al (1991) Nature, 352:624628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597.
[0122] Os anticorpos monoclonais neste relatório descritivo incluem especifi-camente anticorpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou da leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertençam a uma determinada classe ou sub-classe de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que estes exibam a atividade biológica desejada (US 4816567; e Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos “primatizados” que compreendem sequências de ligação a antígeno do domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do velho mundo ou símio) e sequências da região constante humana.
[0123] “Anticorpo intacto” neste relatório descritivo é aquele que compreende domínios VL e VH, bem como domínio constante da cadeia leve (CL) e domínios constantes da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequências nativas (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou de uma sequência variante de aminoácidos destes. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais “funções efetoras” que se refiram àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc da sequência variante de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação a C1q; citotoxicidade dependente do complemento; ligação de Fc a receptores; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulação negativa de receptores da superfície celular tais como receptor de células B e BCR.
[0124] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser designados para “classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ainda ser divididas em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeias pesadas correspondentes às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As estruturas e configurações tridimensionais das su- bunidades de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0125] Exemplos de agentes de ligação celular incluem aqueles agentes descritos para uso em WO 2007/085930, cujo conteúdo é aqui incorporado neste pedido de patente.
[0126] O agente de ligação celular pode ser ou compreender um polipeptí- deo. O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo cíclico. O agente de ligação celular pode ser um anticorpo. Portanto, em uma modalidade, a presente invenção provê um conjugado anticorpo-fármaco (ADC).
[0127] A carga de fármaco é o número médio de fármacos PBD por anticor-po. A carga de fármaco pode variar de 1 a 8 fármacos (D) por anticorpo (Ab), ou seja, em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 porções de fármaco estão ligadas covalentemente ao anticorpo. As composições de ADC incluem coleções de anticorpo conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 8. O número médio de fármacos por anti-corpos em preparados de ADC provenientes de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA, eletroforese e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Pela técnica ELISA, o valor de p, calculado em média, em um determinado preparado de ADC pode ser determinado (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843852). Contudo, a distribuição de valores de p (fármaco) não é discernível pela ligação de anticorpo-antígeno e por limitação da detecção pelo ensaio ELISA. Além disso, o ensaio ELISA para a detecção de conjugados anticorpo-fármaco não determina quando as porções de fármaco estão ligadas ao anticorpo, tais como fragmentos da cadeia pesada ou da cadeia leve, ou aos resíduos específicos de aminoácidos. Em alguns casos, a separação, a purificação e a caracterização de ADC homogêneo, quando p é um determinado valor de ADC com outras cargas de fármacos, podem ser alcançadas por meios como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
[0128] Para alguns conjugados anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de acoplamento no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ter apenas um ou diversos grupos tióis de cisteínas, ou pode ter apenas um ou diversos grupos tióis suficientemente reativos através dos quais um ligador pode ser acopla-do. Cargas mais altas de fármaco, por exemplo, p >5, podem provocar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda da permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco.
[0129] Tipicamente, menos do que o máximo teórico de porções de fárma- cos são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticor-po pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o in-termediário do ligador de fármaco (D-L) ou o reagente do ligador. Somente os gru- pos mais reativos de lisina podem reagir com um reagente do ligador reativo a ami-nas. Além disso, somente os grupos mais reativos de tióis de cisteínas podem reagir com um ligador reativo a tióis. Em geral, os anticorpos não contêm muitos, se algum, grupos tióis livres e reativos de cisteínas que possam ser ligados a uma porção de fármaco. A maioria dos resíduos tióis de cisteínas nos anticorpos dos compostos existe como pontes dissulfetos que precisam ser reduzidos com um agente redutor como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, em condições redutoras parciais ou totais. A carga (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diversas maneiras diferentes, inclusive: (i) limitar o excesso molar de intermediário do ligador de fárma- co (D-L) ou reagente do ligador em relação ao anticorpo, (ii) limitar o tempo ou a temperatura da reação de conjugação e (iii) condições redutoras parciais ou limitan- tes para a modificação de tióis de cisteínas.
[0130] Aminoácidos cisteína podem ser construídos em sítios reativos de um anticorpo e que não formem ligações dissulfetos dentro da cadeia ou intermolecula- res (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). Os tióis de cisteínas construídas podem reagir com reagentes do ligador ou reagentes do fármaco-ligador da presente invenção que tenham grupos eletrofíli- cos reativos ao tiol tais como maleimida ou alfa-halo amidas para formar ADC com anticorpos construídos com cisteínas (ThioMabs) e as porções PBD de fármacos. A localização da porção de fármaco pode ser assim desenhada, controlada e conheci-da. A carga de fármaco pode ser controlada, pois os grupos tióis de cisteínas cons-truídas reagem tipicamente com reagentes do ligador reativos ou reagentes do fár- maco-ligador reativos ao tiol em alto rendimento. A construção de um anticorpo IgG para introduzir um aminoácido cisteína por substituição em um único sítio na cadeia pesada ou na leve fornece duas novas cisteínas no anticorpo simétrico. Uma carga de fármaco próxima de 2 pode ser alcançada e próxima da homogeneidade do ADC produzido pela conjugação.
[0131] Quando mais de um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo re-age com um intermediário do fármaco-ligador, ou o reagente do ligador seguido pelo reagente da porção de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de com-postos ADC com porções distribuídas de fármacos acopladas a um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, etc. Métodos de cromatografia líquida, tais como de fase reversa polimérica (PLRP) e por interação hidrofóbica (HIC) podem separar os compostos na mistura por valor de carga de fármaco. Preparados de ADC com um único valor de carga de fármaco (p) podem ser isolados, contudo, estes ADCs de valor único de carga podem ainda ser misturas heterogêneas, pois as porções de fármaco podem estar acopladas, via o ligador, em diferentes sítios no anticorpo.
[0132] Dessa forma, as composições de conjugados anticorpo-fármaco da invenção incluem misturas de compostos de conjugados anticorpo-fármaco, em que o anticorpo possui uma ou mais porções de PBD e em que as porções de fármaco podem estar acopladas ao o anticorpo em vários resíduos de aminoácidos.
[0133] Em uma modalidade, o número médio de grupos de dímeros de pir- rolbenzodiazepina por agente de ligação celular está na faixa de 1 a 20. Em algumas modalidades, a faixa é selecionada a partir de 1 a 8, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 4 e 4 a 8.
[0134] Em algumas modalidades, há um grupo de dímero de pirrolbenzodia- zepina por agente de ligação celular.
[0135] Em uma modalidade, o agente de ligação celular é um peptídeo linear ou cíclico compreendendo 4-20, de preferência 6-20 resíduos contíguos de aminoá- cidos. Nessa modalidade, é preferível que um agente de ligação celular seja ligado a um composto monomérico ou dimérico de pirrolbenzodiazepina.
[0136] Em uma modalidade, o agente de ligação celular compreende um peptídeo que liga integrina αvβ6. O peptídeo pode ser seletivo para αvβ6 sobre XYS.
[0137] Em uma modalidade, o agente de ligação celular compreende o poli- peptídeo A20FMDV-Cys. O A20FMDV-Cys possui a sequência: NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Alternativamente, uma variante da sequência A20FMDV-Cys pode ser usada, na qual um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácidos são substituídos por outro resíduo de aminoá- cido.
[0138] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal; anticor-po quimérico; anticorpo humanizado; anticorpo inteiramente humano; ou um anticor-po de cadeia única. Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento desses anti-corpos que tem atividade biológica. Exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv.
[0139] Nestas modalidades, cada anticorpo pode ser ligado a um ou a diver-sos grupos de dímeros de pirrolbenzodiazepina. As razões preferidas de pirrolben- zodiazepina para agente de ligação celular são fornecidas acima.
[0140] O anticorpo pode ser um anticorpo de domínio (DAB).
[0141] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0142] Os anticorpos para uso na presente invenção incluem aqueles anti-corpos descritos em WO 2005/082023, cujo conteúdo é aqui incorporado neste pe-dido de patente. São especialmente preferidos aqueles anticorpos para antígenos associados a tumores. Exemplos destes antígenos conhecidos na técnica incluem, entre outros, aqueles antígenos associados a tumores constantes em WO 2005/082023. Ver, por exemplo, as páginas 41-55.
[0143] Os conjugados da invenção são desenhados contra células tumorais alvo via seus antígenos da superfície celular. Os antígenos são normalmente antí- genos de superfície de células normais que estão superexpressos ou que são ex-pressos em momentos anormais. De modo ideal, o alvo antigênico é expresso so- mente em células proliferativas (de preferência, células tumorais), contudo, na práti-ca, isso é raramente observado. Como resultado, os alvos antigênicos são geral-mente selecionados com base na expressão diferencial entre tecido proliferativo e tecido sadio.
[0144] Foram criados anticorpos contra alvos antigênicos relacionados a tu-mores específicos, incluindo:
[0145] Cripto, CD30, CD19, CD33, Glicoproteína NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (antígeno da membrana específico da próstata), BCMA, CD20, CD70, E- selectina, EphB2, Melanotransferina, Muc16 e TMEFF2.
[0146] Antígenos associados a tumores (TAA) são conhecidos na técnica e podem ser preparados para uso em gerar anticorpos empregando métodos e infor-mações que são bem conhecidos na técnica. Em tentativas para descobrir alvos ce-lulares eficazes para o diagnóstico e a terapia de câncer, os pesquisadores busca-ram identificar polipeptídeos transmembranas ou de outra forma associados a tumo-res que são especificamente expressos sobre a superfície de um ou mais tipos em particular de célula cancerosa, quando comparado à expressão sobre uma ou mais células normais não cancerosas. Frequentemente, tais polipeptídeos associados a tumores são expressos mais abundantemente sobre a superfície das células cance-rosas em comparação à expressão sobre a superfície das células não cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos antigênicos da superfície celular associados a tu-mores deu origem à capacidade para destruir especificamente células cancerosas alvo por meio de terapias à base de anticorpos.
[0147] Exemplos de TAA incluem, entre outros, os TAA (1)-(36) listados abaixo. Por conveniência, as informações relativas a esses antígenos, todas as quais conhecidas na técnica, estão listadas abaixo e incluem nomes, nomes alterna-tivos, números de acesso no Genbank e referências primárias, seguidos pelas con- venções para identificação de sequências de ácidos nucleicos e de proteínas do Na-tional Center for Biotechnology Information (NCBI). As sequências de ácidos nuclei- cos e de proteínas correspondentes aos TAA (1)-(36) estão disponíveis em bancos de dados públicos tais como o GenBank. Os antígenos associados a tumores contra os quais são direcionados anticorpos incluem todas as variantes de sequências de aminoácidos e isoformas que possuem pelo menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência em relação às sequências identifica-das nas referências citadas, ou que exibem substancialmente as mesmas proprieda-des ou características biológicas que um TAA cuja sequência encontra-se nas refe-rências citadas. Por exemplo, um TAA com uma sequência variante geralmente é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo que se liga especificamente ao TAA com a sequência correspondente citada. As sequências e o conteúdo da refe-rência especificamente aqui recitadas são expressamente incorporadas por referên-cia neste pedido de patente.
[0148] (1) BMPR1B (Receptor de proteínas morfogenéticas ósseas tipo IB, No de acesso no GenBank NM_001203) ten Dijke,P., et al Science 264 (5155):101- 104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997); WO2004/063362 (Reivindicação 2); WO2003/042661 (Reivindicação 12); US2003/134790-A1 (Página 38-39); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 296); WO2003/055443 (Página 91-92); WO2002/99122 (Exemplo 2; Página 528-530); WO2003/029421 (Reivindicação 6); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 112); WO2002/98358 (Reivindicação 1; Página 183); WO2002/54940 (Página 100-101); WO2002/59377(Página 349-350); WO2002/30268 (Reivindicação 27; Página 376); WO2001/48204 (Exemplo; Figura 4); NP_001194 receptor de proteínas morfogenéticas ósseas, tipo IB /pid=NP_001194.1. Referências cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
[0149] (2) E16 (LAT1, SLC7A5, No de acesso no GenBank NM_003486) Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273; WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/032842 (Exemplo IV); WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/78524 (Exemplo 2); WO2002/99074 (Reivindicação 19; Página 127-129); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); WO2003/003906 (Reivindicação 10; Página 293); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 93-95); WO2000/14228 (Reivindicação 5; Página 133-136); US2003/224454 (Figura 3); WO2003/025138 (Reivindicação 12; Página 150); NP_003477 família 7 de carreador de soluto (transportador de aminoá- cidos catiônicos, y+sistema), membro 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; Refe-rências cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
[0150] (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata, No de acesso no GenBank NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528; WO2004/065577 (Reivindicação 6); WO2004/027049 (Figura1L); EP1394274 (Exemplo 11); WO2004/016225 (Reivindicação 2); WO2003/042661 (Reivindicação 12); US2003/157089 (Exemplo 5); US2003/185830 (Exemplo 5); US2003/064397 (Figura 2); WO2002/89747 (Exemplo 5; Página 618-619); WO2003/022995 (Exemplo 9; Figura 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Figura 2A); NP_036581 antíge- no epitelial de seis transmembranas da próstata; Referências cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
[0151] (4) 0772P (CA125, MUC16, No de acesso no GenBank AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001); WO2004/045553 (Reivindicação 14); WO2002/92836 (Reivindicação 6; Figura 12); WO2002/83866 (Reivindicação 15; Página 116-121); US2003/124140 (Exemplo 16); Referências cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
[0152] (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacarióci- to, mesotelina, No de acesso no GenBank NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995); WO2003/101283 (Reivindicação 14); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 287-288); WO2002/101075 (Reivindicação 4; Página 308-309); WO2002/71928 (Página 320-321); WO94/10312 (Página 52-57); Referências cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
[0153] (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família 34 de carreador de soluto (fosfato de sódio), membro 2, transportador 3b dependente de fosfato de sódio tipo II, No de acesso no GenBank NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665- 19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582; WO2004/022778 (Reivindicação 2); EP1394274 (Exemplo 11); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Página 326); EP0875569 (Reivindicação 1; Página 17-19); WO2001/57188 (Reivindicação 20; Página 329); WO2004/032842 (Exemplo IV); WO2001/75177 (Reivindicação 24; Página 139-140); Referências cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
[0154] (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, No de acesso no GenBank AB040878); Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150; WO2004/000997 (Reivindicação 1); WO2003/003984 (Rei-vindicação 1); WO2002/06339 (Reivindicação 1; Página 50); WO2001/88133 (Rei-vindicação 1; Página 41-43, 48-58); WO2003/054152 (Reivindicação 20); WO2003/101400 (Reivindicação 11); Acesso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737
[0155] (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 gene, No de acesso no GenBank AY358628); Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003/129192 (Reivin-dicação 2); US2004/044180 (Reivindicação 12); US2004/044179 (Reivindicação 11); US2003/096961 (Reivindicação 11); US2003/232056 (Exemplo 5); WO2003/105758 (Reivindicação 12); US2003/206918 (Exemplo 5); EP1347046 (Reivindicação 1); WO2003/025148 (Reivindicação 20); Referências cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
[0156] (9) ETBR (Receptor de endotelina tipo B, No de acesso no GenBank AY275463); Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffen- berger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 24072409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206; WO2004/045516 (Reivindicação 1); WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/040000 (Reivindicação 151); WO2003/087768 (Reivindicação 1); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/61087 (Figura 1); WO2003/016494 (Figura 6); WO2003/025138 (Reivindicação 12; Página 144); WO2001/98351 (Reivindicação 1; Página 124-125); EP0522868 (Reivindicação 8; Figura2); WO2001/77172 (Reivindicação 1; Página 297-299); US2003/109676; US6518404 (Figura 3); US5773223 (Reivindicação 1a; Col 31-34); WO2004/001004
[0157] (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, No de acesso no GenBank NM_017763); WO2003/104275 (Reivindicação 1); WO2004/046342 (Exemplo 2); WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2003/083074 (Reivindicação 14; Página 61); WO2003/018621 (Reivindicação 1); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 93); WO2001/66689 (Exemplo 6); Referências cruzadas: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
[0158] (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao câncer de próstata, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata 2, proteína proteína das seis transmembranas da próstata da próstata, No de acesso no GenBank AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002); WO2003/087306; US2003/064397 (Reivindicação 1; Figura 1); WO2002/72596 (Reivindicação 13; Página 54-55); WO2001/72962 (Reivindicação 1; Figura 4B); WO2003/104270 (Reivindicação 11); WO2003/104270 (Reivindicação 16); US2004/005598 (Reivindicação 22); WO2003/042661 (Reivindicação 12); US2003/060612 (Reivindicação 12; Figura 10); WO2002/26822 (Reivindicação 23; Figura 2); WO2002/16429 (Reivindicação 12; Figura 10); Referências cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
[0159] (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor de po-tencial transitório de canais de cátions, subfamília M, membro 4, No de acesso no GenBank NM_017636); Xu, X.Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692- 10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003); US2003/143557 (Reivindicação 4); WO2000/40614 (Reivindicação 14; Pági-na 100-103); WO2002/10382 (Reivindicação 1; Figura 9A); WO2003/042661 (Rei-vindicação 12); WO2002/30268 (Reivindicação 27; Página 391); US2003/219806 (Reivindicação 4); WO2001/62794 (Reivindicação 14; Figura 1A-D); Referências cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
[0160] (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado do teratocarcinoma, No de acesso no GenBank NP_003203 ou NM_003212); Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991); US2003/224411 (Reivindicação 1); WO2003/083041 (Exemplo 1); WO2003/034984 (Reivindicação 12); WO2002/88170 (Reivindicação 2; Página 52-53); WO2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 58); WO2002/16413 (Rei-vindicação 1; Página 94-95, 105); WO2002/22808 (Reivindicação 2; Figura 1); US5854399 (Exemplo 2; Col 17-18); US5792616 (Figura 2); Referências cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
[0161] (14) CD21 (CR2 (Receptor do complemento 2) ou C3DR (C3d/ recep-tor do vírus Epstein Barr) ou Hs.73792 No de acesso no GenBank M26004); Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125; Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol. 150, 53115320; WO2004/045520 (Exemplo 4); US2004/005538 (Exemplo 1); WO2003/062401 (Reivindicação 9); WO2004/045520 (Exemplo 4); WO91/02536 (Figura 9.1-9.9); WO2004/020595 (Reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
[0162] (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (associado à imunoglobulina beta), B29, No de acesso no GenBank NM_000626 ou 11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625; WO2004/016225 (Reivindicação 2, Figura 140); WO2003/087768, US2004/101874 (Reivindicação 1, página 102); WO2003/062401 (Reivindicação 9); WO2002/78524 (Exemplo 2); US2002/150573 (Reivindicação 5, página 15); US5644033; WO2003/048202 (Reivindicação 1, pági- nas 306 e 309); WO 99/58658, US6534482 (Reivindicação 13, Figura 17A/B); WO2000/55351 (Reivindicação 11, páginas 1145-1146); Referências cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
[0163] (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de ancoragem de fosfatase contendo domínio SH2), SPAP1B, SPAP1C, No de acesso no GenBank NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004/016225 (Reivindicação 2); WO2003/077836; WO2001/38490 (Reivindicação 5; Figura 18D-1-18D-2); WO2003/097803 (Reivindicação 12); WO2003/089624 (Reivindicação 25); Referências cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
[0164] (17) HER2 (ErbB2, No de acesso no GenBank M11730); Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139; Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; WO2004/048938 (Exemplo 2); WO2004/027049 (Figura 1I); WO2004/009622; WO2003/081210; WO2003/089904 (Reivindicação 9); WO2003/016475 (Reivindicação 1); US2003/118592; WO2003/008537 (Reivindica-ção 1); WO2003/055439 (Reivindicação 29; Figura 1A-B); WO2003/025228 (Reivin-dicação 37; Figura 5C); WO2002/22636 (Exemplo 13; Página 95-107); WO2002/12341 (Reivindicação 68; Figura 7); WO2002/13847 (Página 71-74); WO2002/14503 (Página 114-117); WO2001/53463 (Reivindicação 2; Página 41-46); WO2001/41787 (Página 15); WO2000/44899 (Reivindicação 52; Figura 7); WO2000/20579 (Reivindicação 3; Figura 2); US5869445 (Reivindicação 3; Col 31-38); WO9630514 (Reivindicação 2; Página 56-61); EP1439393 (Reivindicação 7); WO2004/043361 (Reivindicação 7); WO2004/022709; WO2001/00244 (Exemplo 3; Figura 4); Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1
[0165] (18) NCA (CEACAM6, No de acesso no GenBank M18728); Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Com- mun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:1689916903, 2002; WO2004/063709; EP1439393 (Reivindicação 7); WO2004/044178 (Exemplo 4); WO2004/031238; WO2003/042661 (Reivindicação 12); WO2002/78524 (Exemplo 2); WO2002/86443 (Reivindicação 27; Página 427); WO2002/60317 (Reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
[0166] (19) MDP (DPEP1, No de acesso no GenBank BC017023); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/64798 (Reivindicação 33; Página 85-87); JP05003790 (Figura 6-8); WO99/46284 (Figura 9); Referências cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
[0167] (20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, No de acesso no GenBank AF184971); Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/005320 (Exemplo 5); WO2003/029262 (Página 74-75); WO2003/002717 (Reivindicação 2; Página 63); WO2002/22153 (Página 45-47); US2002/042366 (Página 20-21); WO2001/46261 (Página 57-59); WO2001/46232 (Página 63-65); WO98/37193 (Reivindicação 1; Página 55-59); Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
[0168] (21) Brevican (BCAN, BEHAB, No de acesso no GenBank AF229053); Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003/186372 (Reivindicação 11); US2003/186373 (Reivindicação 11); US2003/119131 (Reivindicação 1; Figura 52); US2003/119122 (Reivindicação 1; Fi- gura52); US2003/119126 (Reivindicação 1); US2003/119121 (Reivindicação 1; Figu- ra52); US2003/119129 (Reivindicação 1); US2003/119130 (Reivindicação 1); US2003/119128 (Reivindicação 1; Figura 52); US2003/119125 (Reivindicação 1); WO2003/016475 (Reivindicação 1); WO2002/02634 (Reivindicação 1)
[0169] (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, No de acesso no GenBank NM_004442); Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000); WO2003042661 (Reivindicação 12); WO200053216 (Reivindicação 1; Página 41); WO2004065576 (Reivindicação 1); WO2004020583 (Reivindicação 9); WO2003004529 (Página 128-132); WO200053216 (Reivindicação 1; Página 42); Referências cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
[0170] (23) ASLG659 (B7h, No de acesso no GenBank AX092328); US2004/0101899 (Reivindicação 2); WO2003104399 (Reivindicação 11); WO2004000221 (Figura 3); US2003/165504 (Reivindicação 1); US2003/124140 (Exemplo 2); US2003/065143 (Figura 60); WO2002/102235 (Reivindicação 13; Pági-na 299); US2003/091580 (Exemplo 2); WO2002/10187 (Reivindicação 6; Figura 10); WO2001/94641 (Reivindicação 12; Figura 7b); WO2002/02624 (Reivindicação 13; Figura 1A-1B); US2002/034749 (Reivindicação 54; Página 45-46); WO2002/06317 (Exemplo 2; Página 320-321, Reivindicação 34; Página 321-322); WO2002/71928 (Página 468-469); WO2002/02587 (Exemplo 1; Figura 1); WO2001/40269 (Exemplo 3; Páginas 190-192); WO2000/36107 (Exemplo 2; Página 205-207); WO2004/053079 (Reivindicação 12); WO2003/004989 (Reivindicação 1); WO2002/71928 (Página 233-234, 452-453); WO 01/16318
[0171] (24) PSCA (Precursor do antígeno de células-tronco da próstata, No de acesso no GenBank AJ297436); Reiter R.E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004/022709; EP1394274 (Exemplo 11); US2004/018553 (Reivindicação 17); WO2003/008537 (Reivindicação 1); WO2002/81646 (Reivindicação 1; Página 164); WO2003/003906 (Reivindicação 10; Página 288); WO2001/40309 (Exemplo 1; Figura 17); US2001/055751 (Exemplo 1; Figura 1b); WO2000/32752 (Reivindicação 18; Figura 1); WO98/51805 (Reivindica-ção 17; Página 97); WO98/51824 (Reivindicação 10; Página 94); WO98/40403 (Rei-vindicação 2; Figura 1B); Acesso: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1
[0172] (25) GEDA (No de acesso no GenBank AY260763); AAP14954 prote-ína semelhante à parceira de fusão HMGIC do lipoma /pid=AAP14954.1 - Homo sa-piens (humana); WO2003/054152 (Reivindicação 20); WO2003/000842 (Reivindica-ção 1); WO2003/023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US2003/194704 (Reivindi-cação 45); Referências cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
[0173] (26) BAFF-R (receptor do fator ativador de células B, receptor BLyS 3, BR3, No de acesso no GenBank AF116456); receptor BAFF /pid=NP_443177.1 - Homo sapiens: Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004/058309; WO2004/011611; WO2003/045422 (Exemplo; Página 32-33); WO2003/014294 (Reivindicação 35; Figura 6B); WO2003/035846 (Reivindicação 70; Página 615-616); WO2002/94852 (Col 136-137); WO2002/38766 (Reivindicação 3; Página 133); WO2002/24909 (Exemplo 3; Figura 3); Referências cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
[0174] (27) CD22 (isoforma CD22-B do receptor de células B, BL-CAM, Lyb- 8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, No de acesso no GenBank AK026467); Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; WO2003/072036 (Reivindicação 1; Figura 1); Re- ferências cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
[0175] (28) CD79a (CD79A, CD79α, associado à imunoglobulina alfa, uma proteína específica de células B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo sobre a superfície com moléculas de Ig M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de células B), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gene Chromosome: 19q13.2, No de acesso no GenBank NP_001774.10); WO2003/088808, US2003/0228319; WO2003/062401 (Reivindicação 9); US2002/150573 (Reivindicação 4, páginas 13-14); WO99/58658 (Reivindicação 13, Figura 16); WO92/07574 (Figura 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Müller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud’homme et al (1992) Clin. Exp. Im-munol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
[0176] (29) CXCR5 (receptor 1 do linfoma de Burkitt, um receptor acoplado à proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfóci- tos e na defesa humoral, participa na infecção pelo HIV-2 e talvez no desenvolvi-mento da AIDS, linfoma, mieloma e leucemia); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: 11q23.3, No de acesso no GenBank NP_001707.1; WO2004/040000; WO2004/015426; US2003/105292 (Exemplo 2); US6555339 (Exemplo 2); WO2002/61087 (Figura 1); WO2001/57188 (Reivindicação 20, página 269); WO2001/72830 (Páginas 12-13); WO2000/22129 (Exemplo 1, páginas 152153, Exemplo 2, páginas 254-256); WO99/28468 (Reivindicação 1, página 38); US5440021 (Exemplo 2, col 49-52); WO94/28931 (Páginas 56-58); WO92/17497 (Reivindicação 7, Figura 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Ba- rella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779
[0177] (30) HLA-DOB (subunidade beta de moléculas de MHC classe II (an- tígeno Ia) que liga peptídeos e os apresenta a linfócitos T CD4+); 273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, No de acesso no GenBank NP_002111.1); Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Nar- use et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; WO99/58658 (Reivindicação 13, Figura 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119
[0178] (31) P2X5 (Receptor purinérgico P2X tipo 5 de canais iônicos ativa-dos por ligantes, um canal iônico dependente de ATP extracelular, pode estar envol-vido em transmissão sináptica e neurogênese, a deficiência pode contribuir para a fisiopatologia da instabilidade idiopática do detrusor); 422 aa, pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17p13.3, No de acesso no GenBank NP_002552.2); Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; WO2004/047749; WO2003/072035 (Reivindicação 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; WO2002/22660 (Reivindicação 20); WO2003/093444 (Reivindicação 1); WO2003/087768 (Reivindicação 1); WO2003/029277 (Página 82)
[0179] (32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciação de células B, Lyb-2); 359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 1 [P] Gene Chromosome: 9p13.3, No de acesso no GenBank NP_001773.1); WO2004042346 (Reivindicação 65); WO2003/026493 (Páginas 51-52, 57-58); WO2000/75655 (Páginas 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903.
[0180] (33) LY64 (antígeno 64 de linfócitos (RP105), proteína da membrana tipo I da família de repetições ricas em leucina (LRR), regula a ativação e a apoptose de células B, a perda da função está associada com atividade aumentada da doença em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 5q12, No de acesso no GenBank NP_005573.1); US2002/193567; WO97/07198 (Reivindicação 11, páginas 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003/083047; WO97/44452 (Reivindicação 8, páginas 57-61); WO2000/12130 (Páginas 24-26)
[0181] (34) FcRH1 (proteína 1 semelhante ao receptor Fc, um suposto re-ceptor do domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios C2 do tipo semelhan-te à Ig e ITAM, pode participar na diferenciação de linfócitos B); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21-1q22, No de acesso no GenBank NP_443170.1); WO2003/077836; WO2001/38490 (Reivindicação 6, Figura18E-1-18- E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003/089624 (Reivindicação 8); EP1347046 (Reivindicação 1); WO2003/089624 (Reivindicação 7)
[0182] (35) IRTA2 (superfamília de receptores de imunoglobulinas associa-dos à translocação 2, um suposto imunoreceptor com possíveis funções no desen-volvimento de células B e linfomagênese; a desregulação do gene por translocação ocorre em algumas malignidades de células B); 977 aa, pI: 6.88, MW: 106468, TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21, No de acesso no GenBank Human:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; WO2003/024392 (Reivindicação 2, Figura 97); Nakayama et al (2000) Biochem. Bi-ophys. Res. Commun. 277(1):124-127; WO2003/077836; WO2001/38490 (Reivindi-cação 3, Figura 18B-1-18B-2)
[0183] (36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulina, TPEF, HPP1, TR, proteoglicano transmembrana putativo, relacionado à família de EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina); 374 aa, NCBI Acesso: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; No de acesso no GenBank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004/074320; JP2004113151; WO2003/042661; WO2003/009814; EP1295944 (Páginas 69-70); WO2002/30268 (Página 329); WO2001/90304; US2004/249130; US2004/022727; WO2004/063355; US2004/197325; US2003/232350; US2004/005563; US2003/124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Can-cer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84.
[0184] O anticorpo de origem pode também ser uma proteína de fusão com-preendendo uma sequência do peptídeo de ligação à albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Os anticorpos da inven-ção incluem proteínas de fusão com sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043, nas Tabelas III e IV, página 35038; (ii) US 2004/0001827 em [0076]; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12-13, e todos os quais são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.
[0185] Em uma modalidade, o anticorpo foi criado contra o alvo antigênico específico αvβ6 relacionado a tumores.
[0186] O agente de ligação celular pode ser marcado, por exemplo, para au-xiliar a detecção ou a purificação do agente antes da incorporação como conjugado ou como parte do conjugado. A marcação pode ser uma marcação com biotina. Em outra modalidade, o agente de ligação celular pode ser marcado com um radioisóto- po.
[0187] R e R’
[0188] Em uma modalidade, R é independentemente selecionado a partir de grupos C1-12 alquila, C3-20 heterociclila e C5-20 arila opcionalmente substituídos. Esses grupos estão cada um definidos na seção de substituintes abaixo.
[0189] Em uma modalidade, R é independentemente C1-12 alquila opcional- mente substituído.
[0190] Em uma modalidade, R é independentemente C3-20 heterociclila opci-onalmente substituído.
[0191] Em uma modalidade, R é independentemente C5-20 arila opcionalmente substituído.
[0192] Em uma modalidade, R é independentemente C1-12 alquila opcional-mente substituído.
[0193] Em relação a R2, são descritas acima várias modalidades relativas a grupos alquila e arila preferidos e à identidade e ao número de substituintes opcio-nais. As preferências constantes para R2, conforme se aplicam a R, podem ser apli-cadas, quando apropriado, a todos os outros grupos R, para exemplos em que R6, R7, R8 ou R9 é R.
[0194] As preferências para R aplicam-se também a R’.
[0195] Em algumas modalidades da invenção, é provido um composto con-tendo um grupo substituinte -NRR’. Em uma modalidade, R e R’, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído. O anel pode conter mais um hete- roátomo, por exemplo, N, O ou S.
[0196] Em uma modalidade, o anel heterocíclico em si é substituído com um grupo R. Quanto mais um heteroátomo N está presente, o substituinte pode ser no heteroátomo N.
[0197] R”
[0198] R" é um grupo C3-12 alquileno, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
[0199] Em uma modalidade, R" é um grupo C3-12 alquileno, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina.
[0200] Em uma modalidade, o grupo alquileno é opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, S e NMe e/ou anéis aro-máticos, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
[0201] Em uma modalidade, o anel aromático é um grupo C5-20 arileno, em que o arileno pertence a uma porção divalente obtida removendo dois átomos de hidrogênio de dois átomos do anel aromático de um composto aromático, sendo que a porção possui de 5 a 20 átomos do anel.
[0202] Em uma modalidade, R" é um grupo C3-12 alquileno, cuja cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que estes anéis são opcio-nalmente substituídos com NH2.
[0203] Em uma modalidade, R" é um grupo C3-12 alquileno.
[0204] Em uma modalidade, R" é selecionado a partir de um grupo C3, C5, C7, C9 e um C11 alquileno.
[0205] Em uma modalidade, R" é selecionado a partir de um grupo C3, C5 e um C7 alquileno.
[0206] Em uma modalidade, R" é selecionado a partir de um grupo C3 e um C5 alquileno.
[0207] Em uma modalidade, R" é um grupo C3 alquileno.
[0208] Em uma modalidade, R" é um grupo C5 alquileno.
[0209] Os grupos alquileno listados acima podem ser opcionalmente inter-rompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benze-no ou piridina, em que estes anéis são opcionalmente substituídos.
[0210] Os grupos alquileno listados acima podem ser opcionalmente inter-rompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, por exemplo, benze-no ou piridina.
[0211] Os grupos alquileno listados acima podem ser grupos alquileno alifá- ticos lineares não substituídos.
[0212] X
[0213] Em uma modalidade, X é selecionado a partir de O, S ou N(H).
[0214] De preferência, X é O.
[0215] E
[0216] Os compostos em que um ou mais anéis C é substituído por um anel da Fórmula E possuem um grupo R2 que, com qualquer um de R1 ou R3, juntamente com os átomos de carbono do anel C ao qual se encontram ligados, formam um anel benzeno opcionalmente substituído. O anel benzeno opcionalmente substituído pode ser considerado como fundido ao anel C da pirrolbenzodiazepina. O anel benzeno fundido pode ser designado o anel D. A estrutura do anel fundido é ilustrada abaixo:
[0217] em que cada um de D1, D2, D3 e D4 representa H ou um substituinte.
[0218] Em uma modalidade, o anel benzeno é não substituído.
[0219] Em uma modalidade, o anel benzeno é opcionalmente substituído com um, dois, três ou quatro grupos selecionados a partir de OH, CN, R, OR, O-SO2-R, CO2R, COR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo.
[0220] Em uma modalidade, o anel benzeno é monossubstituído. The mo- nossubstituinte pode ser qualquer um de D1, D2, D3 ou D4 (o resto sendo H). Em uma modalidade o anel benzeno é substituído em D2, e D1, D3 e D4 são cada um H. Em uma modalidade, o anel benzeno é substituído em D3, e D1, D2 e D4 são cada um H.
[0221] Em uma modalidade, R2 com R1, juntamente com os átomos de car-bono do anel C aos quais se encontram ligados, formam um anel benzeno opcio- nalmente substituído.
[0222] As preferências para V e W são apresentadas abaixo.
[0223] F
[0224] Nos compostos em que um ou ambos os anéis C são substituídos por um anel da Fórmula F:
[0225] Em uma modalidade, U é CH2 quando T é NR, BH, SO ou SO2.
[0226] Em uma modalidade, T é CH2 ou CO quando U é NR, O ou S.
[0227] Em uma modalidade, T é selecionado a partir de CH2 e CO.
[0228] Em uma modalidade, U é selecionado a partir de NR, O e S.
[0229] Em uma modalidade, Y é (CH2)n, em que n é 1 ou 2.
[0230] Em uma modalidade, o anel C do composto A-B possui uma estrutura selecionada partir daquelas mostradas abaixo:
[0231] V e W
[0232] V e W são cada um selecionados a partir de (CH2)n, O, S, NR, CHR e CRR’, em que n é 2,3 ou 4, exceto que V é C quando R1 e R2, juntamente com os átomos de carbono do anel C aos quais se encontram ligados, formarem um anel benzeno opcionalmente substituído, e W é C quando R3 e R2, juntamente com os átomos de carbono do anel C aos quais se encontram ligados, formarem um anel benzeno opcionalmente substituído.
[0233] Em uma modalidade, quando um de V e W é C, o outro de V e W é selecionado a partir de CH2 e NR.
[0234] Em uma modalidade, quando um de V e W é C, o outro de V e W é CH2.
[0235] Em uma modalidade, o conjugado é um dímero em que cada uma das porções PBD possui um grupo C2 metileno, ou seja, cada R2 é =CH2. É preferí- vel que o agente de ligação celular seja um anticorpo.
[0236] Em outra modalidade, o conjugado é um dímero em que cada um dos monômeros possui um grupo C2 arila, ou seja, cada R2 é C5-20 arila opcionalmente substituído, e há uma ligação dupla entre C2 e C3 em cada porção PBD. É preferível que o agente de ligação celular seja um anticorpo.
[0237] C2 alquileno
[0238] Em uma modalidade, o conjugado é um composto:
[0239] e mais preferivelmente:
[0240] em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um peptídeo cíclico ou linear, e n é 0 ou 1. Y, RL1 e RL2 são conforme definidos pre-viamente e RE e RE” são cada um independentemente selecionados a partir de H ou RD
[0241] Para cada um dos compostos acima, as preferências seguintes po- dem aplicar-se, quando apropriado:
[0242] n é 0;
[0243] n é 1;
[0244] RE é H;
[0245] RE é RD, quando RD é alquila opcionalmente substituído;
[0246] RE é RD, quando RD é metila;
[0247] CBA é um anticorpo;
[0248] CBA é um peptídeo cíclico;
[0249] RL1 e RL2 são H;
[0250] RL1 e RL2 são Me.
[0251] C2 arila
[0252] Em uma modalidade, o conjugado é um composto:
[0253] e mais preferivelmente:
[0254] em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um peptídeo cíclico ou linear, Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente, Ar1 e Ar2 são cada um independentemente C5-20 arila opcionalmente substituído e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser iguais ou diferentes.
[0255] Em uma modalidade, Ar1 e Ar2, em cada uma das modalidades acima, são selecionados cada um independentemente a partir de fenila, furanila, tiofeni- la e piridila opcionalmente substituídos.
[0256] Em uma modalidade, Ar1 e Ar2, em cada uma das modalidades acima, são fenila opcionalmente substituído.
[0257] Em uma modalidade, Ar1 e Ar2, em cada uma das modalidades acima, são tien-2-ila ou tien-3-ila opcionalmente substituído.
[0258] Em uma modalidade, Ar1 e Ar2, em cada uma das modalidades acima, são quinolinila ou isoquinolinila opcionalmente substituído.
[0259] O grupo quinolinila ou isoquinolinila pode ser ligado ao núcleo PBD core através de qualquer posição disponível no anel. Por exemplo, o quinolinila pode ser quinolin-2-ila, quinolin-3-ila, quinolin-4ila, quinolin-5-ila, quinolin-6-ila, quinolin-7- ila e quinolin-8-ila. Destes, quinolin-3-ila e quinolin-6-ila podem ser preferidos. O iso- quinolinila pode ser isoquinolin-1-ila, isoquinolin-3-ila, isoquinolin-4ila, isoquinolin-5- ila, isoquinolin-6-ila, isoquinolin-7-ila e isoquinolin-8-ila. Destes, isoquinolin-3-ila e isoquinolin-6-ila podem ser preferidos.
[0260] C2 vinila
[0261] Em uma modalidade, o conjugado é um composto:
[0262] e mais preferivelmente:
[0263] em que CBA é um agente de ligação celular tal como um anticorpo ou um peptídeo cíclico ou linear, Y, RL1 and RL2 são conforme definidos previamente, RV1 e RV2 são independentemente selecionados a partir de H, metila, etila e fenila (em que o fenila pode ser opcionalmente substituído com flúor, especialmente na posição 4) e C5-6 heterociclila, e n é 0 ou 1. RV1 e RV2 podem ser iguais ou diferentes.
[0264] Em algumas das modalidades acima, RV1 e RV2 podem ser indepen- dentemente selecionados a partir de H, fenila e 4-fluorofenila.
[0265] Intermediários preferidos
[0266] A presente invenção também provê intermediários para uso no prepa-ro dos compostos conjugados aqui descritos.
[0267] Intermediários preferidos são descritos abaixo e correspondem de perto aos conjugados preferidos descritos acima.
[0268] Em uma modalidade, o intermediário é um composto:
[0269] e mais preferivelmente
[0270] em que n é 0 ou 1, Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente e RE e RE” são selecionados cada um independentemente a partir de H ou RD
[0271] Em uma modalidade, o intermediário é um composto:
[0272] e mais preferivelmente:
[0273] em que Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente Ar1 e Ar2 são cada um independentemente C5-20 arila opcionalmente substituído e n é 0 ou 1. Ar1 e Ar2 podem ser iguais ou diferentes.
[0274] Em uma modalidade, o intermediário é um composto:
[0275] e mais preferivelmente:
[0276] em que Y, RL1 e RL2 são conforme definidos previamente, RV1 e RV2 são selecionados independentemente a partir de H, metila, etila e fenila (em que o fenila pode ser opcionalmente substituído com flúor, especialmente na posição 4) e C5-6 heterociclila e n é 0 ou 1. RV1 e RV2 podem ser iguais ou diferentes.
[0277] O termo “opcionalmente substituído”, neste relatório descritivo, diz respeito a um grupo de origem que pode ser não substituído ou que pode ser substi-tuído.
[0278] A menos que especificado de outra forma, o termo “substituído”, neste relatório descritivo, diz respeito a um grupo de origem que carrega um ou mais substituintes. O termo “substituinte” é usado neste relatório descritivo no sentido convencional e se refere a uma porção química que está covalentemente ligada ou, se apropriado, fundida a um grupo de origem. Uma grande variedade de substituin- tes é bem conhecida, e métodos para sua formação e introdução em uma variedade de grupos de origem são também bem conhecidos.
[0279] Em uma modalidade preferida, os substituintes aqui descritos (os quais incluem substituintes opcionais) restringem-se àqueles grupos que não são reativos frente a um agente de ligação celular. O elo para o agente de ligação celular no presente caso é formado da posição N10 do composto PBD através de um grupo ligador (compreendendo, por exemplo, L1, L2 e A) ao agente de ligação celular. Gru- pos funcionais reativos situados em outras partes da estrutura PBD podem ser ca-pazes de formar ligações adicionais com o agente de ligação celular (a isso se pode chamar reticulação). Essas ligações adicionais podem alterar o transporte e a ativi-dade biológica do conjugado. Portanto, em algumas modalidades, os substituintes adicionais se limitam àqueles desprovidos de funcionalidade reativa.
[0280] Em uma modalidade, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR’, NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[0281] Em uma modalidade, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR’, NO2, CO2R, COR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[0282] Em uma modalidade, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR’, NO2 e halo.
[0283] Em uma modalidade, os substituintes são selecionados a partir do grupo constituído por R, OR, SR, NRR’ e NO2.
[0284] Qualquer uma das modalidades mencionadas acima pode aplicar-se a qualquer um dos substituintes aqui descritos. Alternativamente, os substituintes podem ser selecionados a partir de um ou mais dos grupos listados abaixo.
[0285] Exemplos de substituintes estão descritos mais detalhadamente abai-xo.
[0286] C1-12 alquila: O termo “C1-12 alquila”, neste relatório descritivo, pertence a uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono de um composto hidrocarboneto contendo de 1 a 12 átomos de carbono, o qual pode ser alifático ou alicíclico e pode ser saturado ou insaturado (por exemplo, parcialmente insaturado, totalmente insaturado). Portanto, o termo “alquila” inclui as subclasses alquenila, alquinila, cicloalquila, etc., discutidas abaixo.
[0287] Exemplos de grupos alquila saturados incluem, entre outros, metila (C1), etila (C2), propila (C3), butila (C4), pentila (C5), hexila (C6) e heptila (C7).
[0288] Exemplos de grupos alquila lineares saturados incluem, entre outros, metila (C1), etila (C2), n-propila (C3), n-butila (C4), n-pentila (amila) (C5), n-hexila (C6) e n-heptila (C7).
[0289] Exemplos de grupos alquila ramificados saturados incluem iso-propila (C3), iso-butila (C4), sec-butila (C4), terc-butila (C4), iso-pentila (C5) e neo-pentila (C5).
[0290] Um grupo alquila pode ser opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, N(H) e S. Tais grupos podem ser de-signados como “heteroalquila”.
[0291] C2-20 heteroalquila: O termo “C2-12 heteroalquila”, neste relatório des-critivo, pertence a uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidro-gênio de um átomo de carbono de um composto hidrocarboneto contendo de 2 a 12 átomos de carbono e um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, N(H) e S, de preferência O e S.
[0292] Exemplos de grupos heteroalquila incluem, entre outros, aqueles que compreendem uma ou mais unidades de etilenoglicol do tipo -(OCH2CH2)-. A termi-nação de um grupo heteroalquila pode ser a forma primária de um heteroátomo, por exemplo, -OH, -SH ou -NH2. Em uma modalidade preferida, a terminação é -CH3.
[0293] C2-12 alquenila: O termo “C2-12 alquenila”, neste relatório descritivo, pertence a um grupo alquila contendo uma ou mais ligações duplas carbono- carbono.
[0294] Exemplos de grupos alquenila insaturados incluem, entre outros, ete- nila (vinila, -CH=CH2), 1-propenila (-CH=CH-CH3), 2-propenilal (alila, -CH-CH=CH2), isopropenila (1-metilvinila, -C(CH3)=CH2), butenila (C4), pentenila (C5) e hexenila (C6).
[0295] C2-12 alquinila: O termo “C2-12 alquinila”, neste relatório descritivo, per-tence a um grupo alquila contendo uma ou mais ligações triplas carbono-carbono.
[0296] Exemplos de grupos alquenila insaturados incluem, entre outros, etini- la (-C=CH) e 2-propinila (propargila, -CH2-C=CH).
[0297] C3-12 cicloalquila: O termo “C3-12 cicloalquila”, neste relatório descritivo, pertence a um grupo alquila que é também um grupo ciclila; ou seja, uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidrogênio de átomo do anel alicíclico de um composto hidrocarboneto cíclico (carbocíclico), sendo que esta porção possui de 3 a 7 átomos de carbono, incluindo de 3 a 7 átomos do anel.
[0298] Exemplos de grupos cicloalquila incluem, entre outros, aqueles deri-vados de
[0299] ciclopropano (C3), ciclobutano (C4), ciclopentano (C5), ciclohexano (C6), cicloheptano (C7), metilciclopropano (C4), dimetilciclopropano (C5), metilciclobu- tano (C5), dimetilciclobutano (C6), metilciclopentano (C6), dimetilciclopentano (C7) e metilciclohexano (C7);
[0300] ciclopropeno (C3), ciclobuteno (C4), ciclopenteno (C5), ciclohexeno (C6), metilciclopropeno (C4), dimetilciclopropeno (C5), metilciclobuteno (C5), dimetilci- clobuteno (C6), metilciclopenteno (C6), dimetilciclopenteno (C7) e metilciclohexeno (C7); e
[0301] norcarano (C7), norpinano (C7), norbornano (C7).
[0302] C3-20 heterociclila: O termo “C3-20 heterociclila”, neste relatório descriti-vo, pertence a uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidrogênio de um átomo do anel de um composto heterocíclico, sendo que esta porção possui de 3 a 20 átomos no anel, dos quais 1 a 10 são heteroátomos do anel. De preferên-cia, cada anel possui de 3 a 7 átomos no anel, dos quais de 1 a 4 são heteroátomos do anel.
[0303] Nesse contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C3-7, C5-6, etc.) indi-cam o número de átomos do anel, ou a faixa numérica de átomos do anel, sejam átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo “C5-6heterociclila”, neste relatório descritivo, pertence a um grupo heterociclila com 5 ou 6 átomos no anel.
[0304] Exemplos de grupos heterociclila monocíclicos incluem, entre outros, aqueles derivados de:
[0305] N1: aziridina (C3), azetidina (C4), pirrolidina (tetrahidropirrol) (C5), pir- rolina (por exemplo, 3-pirrolina, 2,5-dihidropirrol) (C5), 2H-pirrol ou 3H-pirrol (isopirrol, isoazol) (C5), piperidina (C6), dihidropiridina (C6), tetrahidropiridina (C6), azepina (C7);
[0306] O1: oxirano (C3), oxetano (C4), oxolano (tetrahidrofurano) (C5), oxol (dihidrofurano) (C5), oxano (tetrahidropirano) (C6), dihidropirano (C6), pirano (C6), oxepina (C7);
[0307] S1: tiirano (C3), tietano (C4), tiolano (tetrahidrotiofeno) (C5), tiano (te- trahidrotiopirano) (C6), tiepano (C7);
[0308] O2: dioxolano (C5), dioxano (C6) e dioxepano (C7);
[0309] O3: trioxano (C6);
[0310] N2: imidazolidina (C5), pirazolidina (diazolidina) (C5), imidazolina (C5), pirazolina (dihidropirazol) (C5), piperazina (C6);
[0311] N1O1: tetrahidro-oxazol (C5), dihidro-oxazol (C5), tetrahidroisoxazol (C5), dihidroisoxazol (C5), morfolina (C6), tetrahidro-oxazina (C6), dihidro-oxazina (C6), oxazina (C6);
[0312] N1S1: tiazolina (C5), tiazolidina (C5), tiomorfolina (C6);
[0313] N2O1: oxadiazina (C6);
[0314] O1S1: oxatiol (C5) e oxatiano (tioxano) (C6); e
[0315] N1O1S1: oxatiazina (C6).
[0316] Exemplos de grupos heterociclila monocíclicos substituídos incluem aqueles derivados de sacarídeos, em forma cíclica, por exemplo, furanoses (C5), tais como arabinofuranose, lixofuranose, ribofuranose e xilofuranse, e piranoses (C6), tais como alopiranose, altropiranose, glicopiranose, manopiranose, gulopiranose, idopiranose, galactopiranose e talopiranose.
[0317] C5-20 arila: O termo “C5-20 arila”, neste relatório descritivo, pertence a uma porção monovalente obtida removendo um átomo de hidrogênio de um átomo do anel aromático de um composto aromático, sendo que essa porção possui de 3 a 20 átomos do anel. De preferência, cada anel possui de 5 a 7 átomos no anel.
[0318] Nesse contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C5-7, C5-6, etc.) indi-cam o número de átomos do anel, ou a faixa numérica de átomos do anel, sejam átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo “C5-6 arila”, neste relatório descritivo, pertence a um grupo arila contendo 5 ou 6 átomos no anel.
[0319] Os átomos do anel podem ser todos átomos de carbono, como em “grupos carboarila”.
[0320] Exemplos de grupos carboarila incluem, entre outros, aqueles deriva-dos de benzeno (ou seja, fenila) (C6), naftaleno (C10), azuleno (C10), antraceno (C14), fenantreno (C14), naftaceno (C18) e pireno (C16).
[0321] Exemplos de grupos arila que compreendem anéis fundidos, sendo que ao menos um destes é um anel aromático, incluem, entre outros, grupos deriva-dos de indano (por exemplo, 2,3-dihidro-1H-indeno) (C9), indeno (C9), isoindeno (C9), tetralina (1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (C10), acenafteno (C12), fluoreno (C13), fenaleno (C13), acefenantreno (C15) e aceantreno (C16).
[0322] Alternativamente, os anéis do anel podem incluir um ou mais heteroá- tomos, como em “grupos heteroarila”. Exemplos de grupos heteroarila monocíclicos incluem, entre outros, aqueles derivados de:
[0323] N1: pirrol (azol) (C5), piridina (azina) (C6);
[0324] O1: furano (oxol) (C5);
[0325] S1: tiofeno (tiol) (C5);
[0326] N1O1: oxazol (C5), isoxazol (C5), isoxazina (C6);
[0327] N2O1: oxadiazol (furazano) (C5);
[0328] N3O1: oxatriazol (C5);
[0329] N1S1: tiazol (C5), isotiazol (C5);
[0330] N2: imidazol (1,3-diazol) (C5), pirazol (1,2-diazol) (C5), piridazina (1,2- diazina) (C6), pirimidina (1,3-diazina) (C6) (por exemplo, citosina, timina, uracila), pi- razina (1,4-diazina) (C6);
[0331] N3: triazol (C5), triazina (C6); e
[0332] N4: tetrazol (C5).
[0333] Exemplos de heteroarila que compreendem anéis fundidos, incluem, entre outros:
[0334] C9 (com 2 anéis fundidos) derivados de benzofurano (O1), isobenzofurano (O1), indol (N1), isoindol (N1), indolizina (N1), indolina (N1), isoindolina (N1), puri- na (N4) (por exemplo, adenina, guanina), benzimidazol (N2), indazol (N2), benzoxazol (N1O1), benzisoxazol (N1O1), benzodioxol (O2), benzofurazano (N2O1), benzotriazol (N3), benzotiofurano (S1), benzotiazol (N1S1), benzotiadiazol (N2S);
[0335] C10 (com 2 anéis fundidos) derivados de cromeno (O1), isocromeno (O1), cromano (O1), isocromano (O1), benzodioxano (O2), quinolina (N1), isoquinolina (N1), quinolizina (N1), benzoxazina (N1O1), benzodiazina (N2), piridopiridina (N2), quinoxalina (N2), quinazolina (N2), cinolina (N2), ftalazina (N2), naftiridina (N2), pteri- dina (N4);
[0336] C11 (com 2 anéis fundidos) derivados de benzodiazepina (N2);
[0337] C13 (com 3 anéis fundidos) derivados de carbazol (N1), dibenzofurano (O1), dibenzotiofeno (S1), carbolina (N2), perimidina (N2), piridoindol (N2); e
[0338] C14 (com 3 anéis fundidos) derivados de acridina (N1), xanteno (O1), tioxanteno (S1), oxantreno (O2), fenoxantino (O1S1), fenazina (N2), fenoxazina (N1O1), fenotiazina (N1S1), tiantreno (S2), fenantridina (N1), fenantrolina (N2), fenazina (N2).
[0339] Os grupos acima, isoladamente ou parte de outro substituinte, podem em si ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos selecionados a partir de si mesmos e os substituintes adicionais listados abaixo.
[0340] Halo: -F, -Cl, -Br e -I.
[0341] Hidróxi: -OH.
[0342] Éter: -OR, em que R é um substituinte de éter, por exemplo, um grupo C1-7 alquila (também designado como um grupo C1-7 alcoxi, discutido abaixo), um grupo C3-20 heterociclila (também designado como um grupo C3-20 heterocicliloxi) ou um grupo C5-20 arila (também designado como um grupo C5-20 ariloxi), de preferência um grupo C1-7alquila.
[0343] Alcoxi: -OR, em que R é um grupo alquila, por exemplo, um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos C1-7 alcoxi incluem, entre outros, -OMe (metoxi), -OEt (etoxi), -O(nPr) (n-propoxi), -O(iPr) (isopropoxi), -O(nBu) (n-butoxi), -O(sBu) (sec-butoxi), -O(iBu) (isobutoxi) e -O(tBu) (terc-butoxi).
[0344] Acetal: -CH(OR1)(OR2), em que R1 e R2 são independentemente substituintes de acetal, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heteroci- clila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila, ou, no caso de um grupo acetal “cíclico”, R1 e R2, considerados em conjunto com os dois átomos de oxigênio aos quais se encontram ligados e os átomos de carbono aos quais se en-contram ligados, formam um anel heterocíclico contendo de 4 a 8 átomos no anel. Exemplos de grupos acetal incluem, entre outros, -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 e -CH(OMe)(OEt).
[0345] Hemiacetal: -CH(OH)(OR1), em que R1 é um substituinte de hemiace-tal, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, entre outros, -CH(OH)(OMe) e -CH(OH)(OEt).
[0346] Cetal: -CR(OR1)(OR2), em que R1 e R2 são conforme definidos para acetais, e R é um substituinte de cetal diferente de hidrogênio, por exemplo, um gru-po C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos cetal incluem, entre outros, -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 e -C(Et)(OMe)(OEt).
[0347] Hemicetal: -CR(OH)(OR1), em que R1 é conforme definido para hemi- acetais e R é um substituinte de hemicetal diferente de hidrogênio, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, entre outros, -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) e -C(Et)(OH)(OEt).
[0348] Oxo (ceto, -ona): =O.
[0349] Tiona (tiocetona): =S.
[0350] Imino (imina): =NR, em que R é um substituinte de imino, por exem-plo, hidrogênio, grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 ari- la, de preferência hidrogênio ou um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos éster incluem, entre outros, =NH, =NMe, =NEt e =NPh.
[0351] Formila (carbaldeído, carboxaldeído): -C(=O)H.
[0352] Acila (ceto): -C(=O)R, em que R é um substituinte de acila, por exem-plo, um grupo C1-7 alquila (também designado como C1-7 alquilacila ou C1-7 alcanoíla), um grupo C3-20 heterociclila (também designado como C3-20 heterociclilacila) ou um grupo C5-20 arila (também designado como C5-20 arilacila), de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos acila incluem, entre outros, -C(=O)CH3 (acetila), -C(=O)CH2CH3 (propionila), -C(=O)C(CH3)3 (t-butirila) e -C(=O)Ph (benzoíla, fenona).
[0353] Carboxi (ácido carboxílico): -C(=O)OH.
[0354] Tiocarboxi (ácido tiocarboxílico): -C(=S)SH.
[0355] Tiolcarboxi (ácido tiolcarboxílico): -C(=O)SH.
[0356] Tionocarboxi (ácido tionocarboxílico): -C(=S)OH.
[0357] Ácido imídico: -C(=NH)OH.
[0358] Ácido hidroxâmico: -C(=NOH)OH.
[0359] Éster (carboxilato, éster do ácido carboxílico, oxicarbonila): -C(=O)OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos éster incluem, entre outros, -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 e -C(=O)OPh.
[0360] Acilóxi (éster invertido): -OC(=O)R, em que R é um substituinte de aciloxi, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos aciloxi incluem, entre outros, -OC(=O)CH3 (acetoxi), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph e -OC(=O)CH2Ph.
[0361] Oxicarboiloxi: -OC(=O)OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos éster incluem, entre ou-tros, -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 e -OC(=O)OPh.
[0362] Amino: -NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, por exemplo, hidrogênio, um grupo C1-7 alquila (também designado como C1-7 alquilamino ou di-C1-7 alquilamino), um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência H ou um grupo C1-7 alquila, ou, no caso de um grupo amino “cíclico”, R1 e R2, considerados em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual se encontram ligados, formam um anel heterocíclico contendo de 4 a 8 átomos no anel. Os grupos amino podem ser primários (-NH2), secundários (-NHR1) ou terciários (- NHR1R2) e, em forma catiônica, podem ser quaternários (-+NR1R2R3). Exemplos de grupos amino incluem, entre outros, -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 e -NHPh. Exemplos de grupos amino cíclicos incluem, entre outros, aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino e tiomorfolino.
[0363] Amido (carbamoíla, carbamila, aminocarbonila, carboxamida): -C(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, con-forme definidos para grupos amino. Exemplos de grupo amido incluem, entre outros, -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 e -C(=O)N(CH2CH3)2, bem como grupos amido nos quais R1 e R2, em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual se encontram ligados, formam uma estrutura heterocíclica como em, por exemplo, piperidinocarbonila, morfolinocarbonila, tiomorfolinocarbonila e piperazino- carbonila.
[0364] Tioamido (tiocarbamila): -C(=S)NR1R2, em que R1 e R2 são indepen-dentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exem-plos de grupos amido incluem, entre outros, -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 e -C(=S)NHCH2CH3.
[0365] Acilamido (acilamino): -NR1C(=O)R2, em que R1 é um substituinte de amida, por exemplo, hidrogênio, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência hidrogênio ou um grupo C1-7 alquila, e R2 é um substituinte de acila, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência hidrogênio ou um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos acilamida incluem, entre outros, -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 e -NHC(=O)Ph. R1 aend R2 podem em conjunto formar uma estrutura cíclica como em, por exemplo, succinimidila, maleimidila e ftalimidila:
[0366] Aminocarboniloxi: -OC(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são independen-temente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos aminocarboniloxi incluem, entre outros, -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2 e -OC(=O)NEt2.
[0367] Ureído: -N(R1)CONR2R3 em que R2 e R3 são independentemente substituintes de amino, conforme definidos para grupos amino, e R1 é um substituin- te de ureído, por exemplo, hidrogênio, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heteroci- clila ou um grupo C5-20 arila, de preferência hidrogênio ou um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos ureído incluem, entre outros, -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 e -NMeCONEt2.
[0368] Guanidino: -NH-C(=NH)NH2.
[0369] Tetrazolila: um anel aromático de cinco membros contendo quatro átomos de nitrogênio e um átomo de carbono,
[0370] Imino: =NR, em que R é um substituinte de imino, por exemplo, por exemplo, hidrogênio, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência H ou um grupo C1-7alquila. Exemplos de grupos imino in-cluem, entre outros, =NH, =NMe e =NEt.
[0371] Amidina (amidino): -C(=NR)NR2, em que cada R é um substituinte de amidina, por exemplo, hidrogênio, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência H ou um grupo C1-7 alquila. Exemplos de gru-pos amidina incluem, entre outros, -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 e -C(=NMe)NMe2.
[0372] Nitro: -NO2.
[0373] Nitroso: -NO.
[0374] Azido: -N3.
[0375] Ciano (nitrila, carbonitrila): -CN.
[0376] Isociano: -NC.
[0377] Cianato: -OCN.
[0378] Isocianato: -NCO.
[0379] Tiociano (tiocianato): -SCN.
[0380] Isotiociano (isotiocianato): -NCS.
[0381] Sulfidrila (tiol, mercapto): -SH.
[0382] Tioéter (sulfeto): -SR, em que R é um substituinte de tioéter, por exemplo, um grupo C1-7 alquila (também designado como um grupo C1-7alquiltio), um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos C1-7 alquiltio incluem, entre outros, -SCH3 e -SCH2CH3.
[0383] Dissulfeto: -SS-R, em que R é um substituinte de dissulfeto, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila (também designado neste relatório descritivo como C1-7 alquil dissulfeto). Exemplos de grupos C1-7 alquil dissulfeto incluem, entre outros, -SSCH3 e -SSCH2CH3.
[0384] Sulfina (sulfinila, sulfóxido): -S(=O)R, em que R é um substituinte de sulfina, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfina incluem, entre outros, -S(=O)CH3 e -S(=O)CH2CH3.
[0385] Sulfona (sulfonila): -S(=O)2R, em que R é um substituinte de sulfona, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila, incluindo, por exemplo, um grupo C1-7 al-quila fluorado ou perfluorado. Exemplos de grupos sulfona incluem, entre outros, -S(=O)2CH3 (metanossulfonila, mesila), -S(=O)2CF3 (triflila), -S(=O)2CH2CH3 (esila), -S(=O)2C4F9 (nonaflila), -S(=O)2CH2CF3 (tresila), -S(=O)2CH2CH2NH2 (taurila), -S(=O)2Ph (fenilsulfonila, besila), 4-metilfenilsulfonila (tosila), 4-clorofenilsulfonila (closila), 4-bromofenilsulfonila (brosila), 4-nitrofenila (nosila), 2-naftalenossulfonato (napsilal) e 5-dimetilamino-naftalen-1-ilsulfonato (dansila).
[0386] Ácido sulfínico (sulfino): -S(=O)OH, -SO2H.
[0387] Ácido sulfônico (sulfo): -S(=O)2OH, -SO3H.
[0388] Sulfinato (éster do ácido sulfínico): -S(=O)OR; em que R é um substi- tuinte de sulfinato, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfi- nato incluem, entre outros, -S(=O)OCH3 (metoxisulfinila; sulfinato de metila) e -S(=O)OCH2CH3 (etoxisulfinila; sulfinato de etila).
[0389] Sulfonato (éster do ácido sulfônico): -S(=O)2OR, em que R é um substituinte de sulfonato, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 hetero- ciclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfonato incluem, entre outros, -S(=O)2OCH3 (metoxisulfonila; sulfonato de metila) e -S(=O)2OCH2CH3 (etoxisulfonila; sulfonato de etila).
[0390] Sulfiniloxi: -OS(=O)R, em que R é um substituinte de sulfiniloxi, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfiniloxi incluem, entre outros, -OS(=O)CH3 e -OS(=O)CH2CH3.
[0391] Sulfoniloxi: -OS(=O)2R, em que R é um substituinte de sulfoniloxi, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfoniloxi incluem, entre outros, -OS(=O)2CH3 (mesilato) e -OS(=O)2CH2CH3 (esilato).
[0392] Sulfato: -OS(=O)2OR; em que R é um substituinte de sulfato, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfato incluem, entre ou-tros, -OS(=O)2OCH3 e -SO(=O)2OCH2CH3.
[0393] Sulfamila (sulfamoíla; amida do ácido sulfínico; sulfinamida): -S(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, con-forme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamila incluem, entre outros, -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 e -S(=O)NHPh.
[0394] Sulfonamido (sulfinamoíla; amida do ácido sulfônico; sulfonamida): -S(=O)2NR1R2, em que R1 e R2 são independentemente substituintes de amino, con- forme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfonamido incluem, entre outros, -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 e -S(=O)2NHPh.
[0395] Sulfamino: -NR1S(=O)2OH, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamino incluem, en-tre outros, -NHS(=O)2OH e -N(CH3)S(=O)2OH.
[0396] Sulfonamino: -NR1S(=O)2R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino, e R é um substituinte de sulfonamino, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfonamino incluem, en-tre outros, -NHS(=O)2CH3 e -N(CH3)S(=O)2C6H5.
[0397] Sulfinamino: -NR1S(=O)R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definidos para grupos amino e R é um substituinte de sulfinamino, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila. Exemplos de grupos sulfinamino incluem, entre outros, -NHS(=O)CH3 e -N(CH3)S(=O)C6H5.
[0398] Fosfino (fosfina): -PR2, em que R é um substituinte de fosfino, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosfino incluem, entre outros, -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 e -P(Ph)2.
[0399] Fosfo: -P(=O)2.
[0400] Fosfinila (óxido de fosfina): -P(=O)R2, em que R é um substituinte de fosfinila, por exemplo, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosfinila incluem, entre outros, -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 e -P(=O)(Ph)2.
[0401] Ácido fosfônico (fosfono): -P(=O)(OH)2.
[0402] Fosfonato (éster de fosfono): -P(=O)(OR)2, em que R é um substituin- te de fosfonato, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosfonato incluem, entre outros, -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 e -P(=O)(OPh)2.
[0403] Ácido fosfórico (phosphonooxi): -OP(=O)(OH)2.
[0404] Fosfato (éster de fosfono-oxi): -OP(=O)(OR)2, em que R é um substi- tuinte de fosfato, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosfato incluem, entre outros, -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 e -OP(=O)(OPh)2.
[0405] Ácido fosforoso: -OP(OH)2.
[0406] Fosfeto: -OP(OR)2, em que R é um substituinte de fosfeto, por exem-plo, -H, um grupo C1-7 alquila, um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosfeto incluem, entre outros, -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 e -OP(OPh)2.
[0407] Fosforamidita: -OP(OR1)-NR22, em que R1 e R2 são substituintes de fosforamidita, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila (opcionalmente substituído), um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosforamidita incluem, entre ou-tros, -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 e -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
[0408] Fosforamidato: -OP(=O)(OR1)-NR22, em que R1 e R2 são substituintes de fosforamidato, por exemplo, -H, um grupo C1-7 alquila (opcionalmente substituído), um grupo C3-20 heterociclila ou um grupo C5-20 arila, de preferência -H, um grupo C1-7 alquila ou um grupo C5-20 arila. Exemplos de grupos fosforamidato incluem, entre ou- tros, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 e -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
[0409] Alquileno
[0410] C3-12 alquileno: O termo “C3-12 alquileno”, neste relatório descritivo, pertence a uma porção bidentados obtidos removendo dois átomos de hidrogênio, sejam ambos do mesmo átomo de carbono ou cada um destes de dois diferentes átomos de carbono, de um composto hidrocarboneto contendo de 3 a 12 átomos de carbono (a menos que especificado de outra forma), que pode ser alifático ou alicí- clico e que pode ser saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado. Portanto, o termo “alquileno” inclui as subclasses alquenileno, alquinileno, cicloalqui- leno, etc., discutidas abaixo.
[0411] Exemplos de grupos C3-12 alquileno lineares saturados incluem, entre outros, -(CH2)n- em que n é um número inteiro de 3 a 12, por exemplo, -CH2CH2CH2- (propileno), -CH2CH2CH2CH2- (butileno), -CH2CH2CH2CH2CH2- (pentileno) e -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2- (heptileno).
[0412] Exemplos de grupos C3-12 alquileno ramificados saturados incluem, entre outros, -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- e -CH2CH(CH2CH3)CH2-.
[0413] Exemplos de grupos linear C3-12 alquileno lineares parcialmente in- saturados (grupos C3-12 alquenileno e alquinileno) incluem, entre outros, -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH- CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- e -CH2-CEC-CH2-.
[0414] Exemplos de grupos C3-12 alquileno parcialmente insaturados (grupos C3-12 alquenileno e alquinileno) incluem, entre outros, -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3)- e -CEC-CH(CH3)-.
[0415] Exemplos de grupos C3-12 alquileno alicíclicos saturados (C3-12 cicloal- quilenos) incluem, entre outros, ciclopentileno (por exemplo, ciclopent-1,3-ileno) e ciclohexileno (por exemplo, ciclohex-1,4-ileno).
[0416] Exemplos de grupos C3-12 alquileno alicíclicos parcialmente insatura- dos (C3-12 cicloalquilenos) incluem, entre outros, ciclopentenileno (por exemplo, 4- ciclopenten-1,3-ileno), ciclohexenileno (por exemplo, 2-ciclohexen-1,4-ileno; 3-ciclohexen-1,2-ileno; 2,5-ciclohexadien-1,4-ileno).
[0417] A menos que especificado de outra forma, estão incluídas nos prece-dentes as formas bem conhecidas iônicas, de sal, solvato e protegidas desses subs- tituintes. Por exemplo, uma referência ao ácido carboxílico (-COOH) também inclui a forma iônica (carboxilato) (-COO-), um sal ou solvato deste, bem como formas prote-gidas convencionais. Do mesmo modo uma referência a um grupo amino inclui a forma protonada (-N+HR1R2), um sal ou solvato do grupo amino, por exemplo, sal cloridrato, bem como formas protegidas convencionais de um grupo amino. Do mesmo modo, uma referência a um grupo hidroxila também inclui a forma aniônica (-O-), ou um sal ou solvato deste, bem como formas protegidas convencionais.
[0418] Sais
[0419] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um sal correspondente do composto ativo, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).
[0420] Por exemplo, se o composto for aniônico ou possuir um grupo funcio-nal que pode ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-), então um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, entre outros, íons de metais alcalinos como Na+ e K+, íons de metais alcalinos terrosos como Ca2+ e Mg2+ e outros cátions como Al+3. Exemplos de cá- tions orgânicos adequados incluem, entre outros, o íon amônio (ou seja, NH4+) e íons de amônio substituído (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons de amônio substituído são aqueles derivados de: etilamina, dietilami- na, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietano- lamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um íon comum de amônio quaternário é N(CH3)4+.
[0421] Se o composto for catiônico ou possuir um grupo funcional que pode ser catiônico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+), então um sal pode ser formado com um ânion adequado. Exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforoso.
[0422] Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos orgânicos: ácido 2-acetoxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfônico, cinâmico, cítrico, edético, etanodis- sulfônico, etanossulfônico, fumárico, glucoheptonico, glucônico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, maleico, málico, metansosulfônico, mucíco, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pan- totênico, fenilacético, fenilsulfônico, propiônico, pirúvico, salicílico, esteárico, succíni- co, sulfanílico, tartárico, toluenossulfônico, trifluoroacéico e válerico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, entre outros, aqueles derivados dos seguintes ácidos poliméricos: ácido tânico, carboximetilcelulose.
[0423] Solvatos
[0424] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um solvato correspondente do composto ativo. O termo “solvato” é usado neste rela-tório descritivo no sentido convencional para se referir a um complexo de soluto (por exemplo, composto ativo, sal de composto ativo) e solvente. Se o solvente for água, o solvato pode ser convenientemente designado como hidrato, por exemplo, mono- hidrato, di-hidrato, tri-hidrato, etc.
[0425] A invenção inclui compostos em que um solvente soma-se na ligação imina da porção PBD, o que é ilustrado abaixo quando o solvente é água ou um ál- cool (RAOH, em que RA é C1-4 alquila):
[0426] Essas formas podem ser denominadas as formas de éter de carbino- lamina e carbinolamina da PBD (conforme descrito na seção acima relativa a R10). O balance desse equilíbrio depende das condições nas quais os compostos são en- contrados, bem como da natureza da própria porção.
[0427] Esses compostos específicos podem ser isolados em forma sólida, por exemplo, por liofilização.
[0428] Certos compostos da invenção podem existir em uma ou mais formas geométricas, ópticas, enantioméricas, diasterioisoméricas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas, conformacionais ou anoméricas em particular, in-clusive, entre outras, formas cis e trans; formas E e Z; formas c, t e r; formas endo e exo; formas R, S e meso; formas D e L; formas d e l-; formas (+) e (-); formas ceto, enol e enolato; formas sin e anti; formas sinclinais e anticlinais; formas α e β; formas axiais e equatoriais; formas em bote, cadeira, torção, envelope e de meia-cadeira; e combinações destas, abaixo designadas coletivamente como “isômeros” (ou “formas isoméricas”).
[0429] O termo “quiral” refere-se a moléculas que possuem a propriedade de não se sobreporem à imagem especular correspondente, enquanto o termo “aquiral” refere-se a moléculas que podem ser sobrepostas à sua imagem especular corres-pondem.
[0430] O termo “estereoisômeros” refere-se a compostos que possuem cons-tituição química idêntica, mas diferem com respeito ao arranjo dos átomos ou dos grupos no espaço.
[0431] “Diastereisômero” refere-se a um estereoisômeros com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da ou-tra. Os diastereoisômeros possuem propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. As mis-turas de diastereoisômeros podem ser separadas em procedimentos analíticos de alta resolução como eletroforese e cromatografia.
[0432] “Enantiômero” refere-se a dois estereoisômeros de um composto cu-jas imagens especulares se sobrepõem uma à outra.
[0433] As definições e convenções estereoquímicas usadas neste relatório descritivo geralmente adotam os princípios de S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictio-nary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. and Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, 1994. Os compostos da invenção podem conter centros assimétricos ou quirais e, portanto, existem em diferentes formas estereoisoméricas. Todas as formas estereoisoméricas dos compostos da invenção, incluindo, entre outros, diaste- reoisômeros, enantiômeros e atropisômeros, bem como suas misturas tais como misturas racêmicas, destinam-se a fazer parte da presente invenção. Muitos com-postos orgânicos existem em formas opticamente ativas, ou seja, possuem a capa-cidade para girar o plano da luz polarizada em plano. Quando um composto optica- mente ativo é descrito, os prefixos D e L ou R e S são usados para indicar a configu-ração absoluta da molécula acerca de seu(s) centro(s) quiral(is). Os prefixos d e l ou (+) e (-) são empregados para designer o sinal de rotação da luz polarizada em plano pelo composto, sendo que (-) ou l significa que o composto é levorotatório. Um composto com prefixo (+) ou d é dextrorotatório. Para uma dada estrutura química, esses estereoisômeros são idênticos exceto que são imagens especulares um do outro. Um estereoisômero específico pode ser também designado um enantiômero, sendo que uma mistura de tais isômeros é frequentemente denominada uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é designada como uma mistura racêmica ou um racemato, a qual pode ocorrer quando não tiver havido estereosse- leção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos “mistura racêmica” e “racemato” referem-se a uma mistura equimolar de duas espé-cies enantioméricas, desprovidas de atividade óptica.
[0434] Notar que, exceto como discutido abaixo para formas tautoméricas, especificamente excluídas do termo, “isômeros”, neste relatório descritivo, são isô- meros estruturais (ou constitucionais) (ou seja, isômeros que diferem nas conexões entre os átomos em vez de simplesmente pela posição dos átomos no espaço). Por exemplo, uma referência a um grupo metoxi, -OCH3, não deverá ser interpretada como uma referência a seu isômero estrutural, um grupo hidroximetila, -CH2OH. Do mesmo modo, uma referência ao orto-clorofenila não deverá ser interpretada como uma referência a seu isômero estrutural, meta-clorofenila. Contudo, uma referência a uma classe de estruturas pode bem incluir formas estruturalmente isoméricas que se enquadram nessa classe (por exemplo, C1-7 alquila inclui n-propila e iso-propila; buti- la inclui n-, iso-, sec- e terc-butila; metoxifenila inclui orto, meta e para-metoxifenila).
[0435] A exclusão acima não diz respeito a formas tautoméricas, por exem-plo, formas ceto, enol e enolato, como em, por exemplo, os seguintes pares tauto- méricos: ceto/enol (ilustrado abaixo), imina/enamina, amida/imino álcool, amidi- na/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hidroxiazo e nitro/aci-nitro.
[0436] O termo “tautômero” ou “forma tautomérica” refere-se a isômeros es-truturais de diferentes energias que são interconversíveis via uma barreia de baixa energia. Por exemplo, tautômeros de próton (também conhecidos como tautômeros prototrópicos) incluem interconversões via a migração de um próton, tal como isome- rizações de ceto-enol e imina-enamina. Tautômeros de valência incluem intercon- versões pela reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
[0437] Notar que estão especificamente incluídos no termo “isômero” os compostos com uma ou mais substituições isotópicas. Por exemplo, H pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 1H, 2H (D) e 3H (T); C pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 12C, 13C e 14C; O pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 16O e 18O; e semelhantes.
[0438] Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor e cloro, tais como, entre outros 2H (deutério, D), 3H (trítio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl e 125I. Vários compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais isótopos radioativos como 3H, 13C e 14C estão incorporados. Tais compostos marcados isotopicamente podem ser úteis em estudos metabólicos, estudos da cinética de reações, técnicas de detecção ou de imagem, como tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), incluindo ensaios de distribuição de fár- maco ou substrato em tecidos, ou em tratamento radioativo de pacientes. Compostos terapêuticos marcados ou substituídos com deutério da invenção podem apresentar propriedades melhoradas de DMPK (metabolismo e farmacocinética do fár- maco), relativas à distribuição, metabolismo e excreção (ADME). A substituição com isótopos mais pesados pode oferecer certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da meia-vida in vivo ou redução das necessidades de dose. Um composto marcado com 18F pode ser útil para estudos de PET ou SPECT. Os compostos marcados isotopicamente desta invenção e seus pró-fármacos podem geralmente ser preparados executando os procedimen- tos descritos nos esquemas ou nos exemplos e preparos descritos abaixo, substi-tuindo um reagente isotopicamente marcado de fácil disponibilidade por um reagente não isotopicamente marcado. Além do mais, a substituição com isótopos mais pesados, especialmente deutério (ou seja, 2H ou D) pode oferecer certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da meia-vida in vivo ou redução das necessidades de dose ou uma melhora no índice terapêutico. Entende-se que o deutério, nesse contexto, é considerado um substi- tuinte. A concentração de tal isótopo mais pesado, especificamente deutério, pode ser definida por um fator de enriquecimento isotópico. Nos compostos desta invenção, qualquer átomo não especificamente designado como um determinado isótopo destina-se a representar qualquer isótopo estável daquele átomo.
[0439] A menos que especificado de outra forma, uma referência a um de-terminado composto inclui todas as tais formas isoméricas, inclusive misturas (total ou parcialmente) racêmicas e outras destas formas. Os métodos de preparo (por exemplo, síntese assimétrica) e separação (por exemplo, cristalização fracionada e meios cromatográficos) de tais formas isoméricas são conhecidos na técnica ou são rapidamente obtidos adaptando os métodos aqui ensinados, ou métodos conhecidos em qualquer maneira conhecida.
[0440] Em geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado anti- corpo-fármaco (ADC) é medida por: expor células de mamíferos que tenham proteí-nas receptoras, por exemplo, HER2, ao anticorpo do ADC em um meio de cultura celular; cultivar as células por um período de aproximadamente 6 horas a aproxima-damente 5 dias; e medir a viabilidade celular. Ensaios celulares in vitro são usados para medir a viabilidade (proliferação), a citotoxicidade e a indução de apoptose (ati-vação de caspases) de um ADC da invenção.
[0441] A potência in vitro de conjugados anticorpo-fármaco pode ser medida por um ensaio de proliferação celular. O ensaio de viabilidade CellTiter-Glo® Lumi-nescent Cell Viability Assay é um método de ensaio homogêneo disponível comerci-almente (Promega Corp., Madison, WI) que se baseia na expressão recombinante da luciferase de Coleoptera (Patente U.S. Nos 5583024; 5674713 e 5700670). Esse ensaio de proliferação celular determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). O ensaio CellTiter-Glo® é conduzido em formato de 96 poços, tornando-o acessível ao rastreio automático de alto rendimento (HTS) (Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398404). O procedimento do ensaio homogêneo envolve adicionar o reagente único (CellTiter-Glo® Reagent) diretamente a células cultivadas em meio suplementado com soro. As etapas de lavagem das células, remoção do meio e as múltiplas de coleta com pipeta não são necessárias. O sistema detecta até 15 células/poço em um formato de 384 poços em 10 minutos após a adição do reagente e a mistura. As células podem ser tratadas continuamente com o ADC, ou podem ser tratadas e se-paradas do ADC. Em geral, células tratadas por um período breve, ou seja, 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência que células tratadas continuamente.
[0442] O formato homogêneo “adicionar-misturar-medir” resulta em lise das células e na geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. O ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente do “tipo incandescente”, produzido pela reação com a luciferase, cuja meia-vida é geralmen-te maior do que cinco horas, dependendo do tipo de célula e do meio usados. As células viáveis são refletidas em unidades relativas de luminescência (RLU). O substrato, luciferina de abelha, é descarboxilado por oxidação pela luciferase recombi- nante de vagalume com a conversão concomitante de ATP para AMP e a geração de fótons.
[0443] A eficácia in vivo de conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da inven-ção pode ser medida por estudos de xenoenxerto tumoral em camundongos. Por exemplo, a eficácia in vivo de um ADC anti-HER2 da invenção pode ser medida por um modelo de explante em camundongos transgênicos com alta expressão de HER2. Um aloenxerto é propagado a partir do camundongo transgênico Fo5 mmtv que não responde ou responde fracamente à terapia com HERCEPTIN®. Os ca-mundongos são tratados uma vez com ADC em certos níveis de dose (mg/kg) e de exposição ao fármaco PBD (μg/m2); e com tampão placebo controle (veículo) e mo-nitorados durante duas semanas ou mais para medir o tempo em que tumor dobra de tamanho, a eliminação celular em log e a retração tumoral.
[0444] Os conjugados da invenção podem ser usados para prover um com-posto PBD a um local alvo.
[0445] O local alvo é de preferência uma população de células proliferativas. O anticorpo é um anticorpo para um antígeno presente em uma população de célu-las proliferativas.
[0446] Em uma modalidade, o antígeno está ausente ou presente em um ní-vel reduzido em uma população de células não proliferativas, quando comparado à quantidade de antígeno presente na população de células proliferativas, por exem-plo, uma população de células tumorais.
[0447] No local alvo, o ligador pode ser clivado de modo a liberar um com-posto das Fórmulas B ou C. Dessa forma, o conjugado pode ser utilizado para prover seletivamente um composto das Fórmulas B ou C ao local alvo.
[0448] O ligador pode ser clivado por uma enzima presente no local alvo.
[0449] O local alvo pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo.
[0450] Os compostos conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção in-cluem aqueles com utilidade para a terapia contra câncer. Especificamente, os com-postos incluem um anticorpo conjugado, ou seja, acoplado covalentemente por um ligante, a uma porção de fármaco PBD, ou seja, toxina. Quando o fármaco não está conjugado a um anticorpo, o fármaco PBD apresenta um efeito citotóxico. A atividade biológica da porção de fármaco PBD é assim modulada pela conjugação a um anticorpo. Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da invenção liberam seletiva-mente uma dose eficaz de um agente citotóxico ao tecido tumoral, pelo qual pode ser alcançada seletividade maior, ou seja, uma dose eficaz menor.
[0451] Dessa forma, em um aspecto, a presente invenção provê um compos-to conjugado conforme aqui descrito para uso em terapia.
[0452] Em um aspecto adicional, é também provido um composto conjugado para uso no tratamento de uma doença proliferativa. Um segundo aspecto da pre-sente invenção provê o uso de um composto conjugado na produção de um medi-camento para tratar uma doença proliferativa.
[0453] Qualquer técnico no assunto é rapidamente capaz de determinar se um conjugado candidato trata ou não uma condição proliferativa de um determinado tipo celular. Por exemplo, ensaios que podem ser convenientemente usados para avaliar a atividade oferecida por um determinado composto estão descritos nos exemplos abaixo.
[0454] O termo “doença proliferativa” pertence a uma proliferação celular in- desejada ou descontrolada de células excessivas ou anormais que é indesejada, tal como, o crescimento neoplásico ou hiperplásico, seja in vitro ou in vivo.
[0455] Exemplos de condições proliferativas incluem, entre outros, prolifera-ção celular benigna, pré-maligna e maligna, incluindo, entre outros, neoplasias e tu-mores (por exemplo, histocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), cânceres (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer gastroi ntestinal, câncer intestinal, câncer de cólon, carcinoma mamário, carcinoma ovaria- no, câncer de próstata, câncer de testículo, câncer de fígado, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer cerebral, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias, psoríase, doenças ósseas, transtornos fibroproli- ferativos (por exemplo, de tecidos conjuntivos) e aterosclerose. Cânceres de interes-se particular incluem, entre outros, leucemias e cânceres ovarianos.
[0456] Qualquer tipo de célula pode ser tratado, inclusive, entre outras, de pulmão, gastrointestinais (incluindo, por exemplo, do intestino, do cólon), da mama (mamárias), ovarianas, da próstata, do fígado (hepáticas), do rim (renais), da bexiga, do pâncreas, do cérebro e da pele.
[0457] Em uma modalidade, o tratamento é de um câncer pancreático.
[0458] Em uma modalidade, o tratamento é de um tumor tendo uma αvβ6 in- tegrina na superfície da célula.
[0459] É contemplado que os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) da pre-sente invenção possam ser usados para tratar várias doenças ou transtornos, por exemplo, caracterizados pela superexpressão de um antígeno tumoral. Condições ou transtornos hiperproliferativos exemplares incluem tumores benignos ou malig-nos, leucemia, malignidades hematológicas e linfoides. Outros exemplos incluem transtornos neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofagianos, epiteliais, estromais, blastocísticos, inflamatórios, angiogênicos e imunológicos, in-clusive autoimunes.
[0460] Em geral, a doença ou transtorno a ser tratado é uma doença hiper- proliferativa, tal como câncer. Exemplos do câncer a ser tratado neste relatório des-critivo incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer pulmonar de pequenas células, câncer pulmonar de não pequenas células, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, bem como câncer de cabeça e pescoço.
[0461] As doenças autoimunes para as quais os compostos ADC podem ser utilizados no tratamento incluem transtornos reumatológicos (como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lúpus como lúpus eritemato- so sistêmico e nefrite lúpica, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome dos anticorpos anti-fosfolipídios e artrite psoriática), osteoartrite, transtornos gas-trointestinais e hepáticos autoimunes (como, por exemplo, doenças intestinais infla-matórias (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (como, por exemplo, vasculite associada ao ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliarteri- te), transtornos neurológicos autoimunes (como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclonia-mioclonia, miastenia grave, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias autoimunes), transtornos renais (como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture e doença de Berger), transtornos dermatológicos autoimunes (como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e lúpus eritematoso cutâneo), transtornos hematológicos (como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura após transfusão e anemia hemolítica autoimune), aterosclerose, uveíte, doenças autoimunes relacionadas à audição (como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda auditiva), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, trans-plante de órgãos e transtornos endócrinos auditivos (como, por exemplo, doenças autoimunes relacionadas ao diabetes como diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM), doença de Addison e doença tireoidiana autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). As doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada ao ANCA, lúpus, esclerose múlti-pla, síndrome de Sjogren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite.
[0462] Os conjugados da presente invenção podem ser usados em um mé-todo de terapia. É também provido um método de tratamento que compreende ad-ministrar a um indivíduo com necessidade de tratamento uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um composto conjugado da invenção. O termo “quantidade tera- peuticamente eficaz” é uma quantidade suficiente para mostrar benefício a um paci-ente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e a taxa e o curso temporal de administração depende-rão da natureza e da gravidade do que está em tratamento. A prescrição de trata-mento, por exemplo, decisões sobre a dose, faz parte da responsabilidade de clínicos gerais e de outros médicos especialistas.
[0463] Um composto da invenção pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, seja simultaneamente ou em sequência dependendo da condição a ser tratada. Exemplos de tratamentos e terapias incluem, entre outros, quimioterapia (a administração de agentes ativos, inclusive, entre ou-tros, fármacos, tais como quimioterápicos); cirurgia e radioterapia.
[0464] “Agente quimioterápico” é um composto químico útil no tratamento de câncer, independentemente do mecanismo de ação. As classes de agentes quimio- terápicos incluem, entre outras: agentes alquilantes, antimetabólitos, alcaloides de venenos vegetais do fuso, antibióticos citotóxicos/antitumorais, inibidores de to-poisomerases, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores de quinases. Agentes quimioterápicos incluem compostos usados em “terapia direcionada” e na quimiote-rapia convencional.
[0465] Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5- FU (fluorouracila, 5-fluorouracila, CAS No 51-21-8), gencitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatina(II), CAS No 15663-27-1), carboplatina (CAS No 41575-94-4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genen- tech), temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9-trieno- 9-carboxamida, CAS No 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoxi]-N,N-dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
[0466] Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatini- be (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (Inibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (Inibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (Inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lo- nafarnibe (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenibe (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnibe (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (sem Cremofor), formulações em nanopartículas de paclitaxel cons-truídas com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), vande- tanibe (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), tensirolimo (TORISEL®, Wyeth), pazopanibe (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); alquil sulfonatos como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelami- nas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfo- ramida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); crip- toficinas (especialmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas nitrogenadas como clorambucil, clornafazi- na, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato do óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenosterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosoureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomusti- na, nimustina e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos da classe enedyne (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gama 1I, caliqueamicina ômega I1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfos- fonatos, como clodronato; esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enedina relacionados às cromoproteínas), aclacinomisi- nas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorru- bicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirubicina, esorubici- na, idarubicina, nemorrubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, áci- do micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabólitos como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; an- sacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; len- tinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxan- trona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espiro- germânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabino- sídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; teni- posídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitiina (DMFO); retinoides como ácido retinoico; e os sais, ácidos e derivados farmaceuti- camente aceitáveis de qualquer um dos precedentes.
[0467] Estão também incluídos na definição de “agente quimioterápico”: (i) agentes anti-hormonais que atuam na regulação ou inibição de ação hormonal sobre tumores tais como antiestrogênicos e moduladores seletivos de receptores estrogê- nicos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestani- na, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrogênicos como flutamida, nilutamida, bicalu- tamida, leuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo 1,3-dioxolano do nucleosídeo citosina); (iv) inibidores de proteínas quinases como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de lipídio quinases; (vi) oligonucleotídeos antisense, especialmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas em proliferação celular anormal, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas como inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas como vacinas de terapias gênicas, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores da topoisomerase 1 como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangio- gênicos como bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos precedentes.
[0468] Estão também incluídos na definição de “agente quimioterápico” anti-corpos terapêuticos tais como alentuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); cetuximabe (ERBITUX®, Imclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Am-gen), rituximabe (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumabe (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), tosi- tumomabe (Bexxar, Corixia) e o conjugado anticorpo-fármaco, gentuzumabe ozoga- micina (MYLOTARG®, Wyeth).
[0469] Anticorpos monoclonais humanizados com potencial terapêutico co-mo agentes quimioterápicas em combinação com os conjugados da invenção inclu-em: alentuzumabe, apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzumabe, bevaci- zumabe, bivatuzumabe mertansina, cantuzumabe mertansina, cedelizumabe, certoli- zumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzumabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizu- mabe, epratuzumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gentuzumabe ozo- gamicina, inotuzumabe ozogamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, ma- tuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzu- mabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizumabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzumabe, pertuzumabe, pexelizumabe, ralivi- zumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizumabe, resivizumabe, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzumabe, tacatuzumabe tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazumabe, tocilizumabe, toralizumabe, trastuzumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusituzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe e visili- zumabe.
[0470] Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para uso segundo a presente invenção podem compreender, além do ingrediente ativo, ou seja, um composto conjugado, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Tais materiais não devem ser tóxicos nem interferir com a eficácia do in-grediente ativo. A natureza precisa do veículo ou de outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral ou por injeção, por exemplo, cutânea, subcutâ-nea ou intravenosa.
[0471] Composições farmacêuticas para administração oral podem estar em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquida. Um comprimido pode compreender um carreador sólido ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas geralmen-te compreendem um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vege-tais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, solução de dextrose ou de outros sacarídeos ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietileno- glicol podem estar incluídos. Uma cápsula pode compreender um carreador sólido como gelatina.
[0472] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no local de acometimento, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa acei-tável para via parenteral que seja livre de pirógenos e com pH, isotonicidade e esta-bilidade adequados. Os técnicos com competência nesse assunto são bem capazes de preparar soluções adequadas, usando, por exemplo, veículos isotônicos tais co-mo cloreto de sódio para injetáveis, solução de Ringer para injetáveis, solução de Ringer com lactato para injetáveis. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxi- dantes e/ou outros aditivos podem estar incluídos, conforme necessário.
[0473] Embora seja possível usar o composto conjugado isoladamente (por exemplo, administrado isoladamente), é muitas vezes preferível apresentá-lo em forma de composição ou formulação.
[0474] Em uma modalidade, a composição é uma composição farmacêutica (por exemplo, formulação, preparado, medicamento) compreendendo um composto conjugado, conforme aqui descrito, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuti- camente aceitável.
[0475] Em uma modalidade, a composição é uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto conjugado, conforme aqui descrito, jun-tamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem co-nhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo, entre outros, veículos, diluentes, ex- cipientes, adjuvantes, materiais de preenchimento, tampões, conservantes, antioxi- dantes, lubrificantes, estabilizantes, solubilizantes, surfactantes (por exemplo, agen-tes hidratantes), agentes de mascaramento, agentes corantes, agentes de sabor e agentes adoçantes farmaceuticamente aceitáveis.
[0476] Em uma modalidade, a composição compreende ainda outros agen-tes ativos, por exemplo, outros agentes terapêuticos ou profiláticos.
[0477] Veículos, diluentes, excipientes, etc. adequados podem ser encontra-dos em textos farmacêuticos padrão. Ver, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a edição (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nova York, EUA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edição, ed. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edição, 1994.
[0478] Outro aspecto da presente invenção diz respeito a métodos para pro-duzir uma composição farmacêutica que compreendem misturar pelo menos um composto conjugado ou do tipo conjugado [11C]-radiomarcado, conforme aqui defini-do, juntamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, veículos, diluentes, excipi- entes, etc. Se formuladas como unidades distintas (por exemplo, comprimidos, etc.), cada unidade contém uma quantidade predeterminada (dose) do composto ativo.
[0479] O termo “farmaceuticamente aceitável”, neste relatório descritivo, diz respeito a compostos, ingredientes, materiais, composições, formas farmacêuticas, etc., que são, no âmbito abrangido pelo juízo médico fundamentado, adequados pa-ra uso em contato com os tecidos do indivíduo em questão (por exemplo, humano) sem causar toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurados com uma relação risco/benefício razoável. Cada veícu-lo, diluente, excipiente, etc. precisam também ser “aceitáveis” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação.
[0480] As formulações podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na arte da farmácia. Tais métodos incluem a etapa de levar o composto ativo a se associar com um veículo que constitua um ou mais ingredientes acessó-rios. Em geral, as formulações são preparadas levando o composto ativo a se asso-ciar uniforme e intimamente com veículos (por exemplo, veículos líquidos, carreador sólido finamente dividido, etc.) e depois dando forma ao produto, se necessário.
[0481] A formulação pode ser preparada para oferecer liberação rápida ou lenta; liberação imediata, retardada, sincronizada ou sustentada ou uma combinação destas.
[0482] Formulações adequadas para administração parenteral (por exemplo, por injeção) incluem líquidos estéreis aquosos ou não aquosos, isotônicos, livres de pirógenos (por exemplo, soluções, suspensões), nos quais o ingrediente ativo esteja dissolvido, suspenso ou de outra forma presente (por exemplo, em um lipossomo ou outro microparticulado). Tais líquidos podem conter adicionalmente outros ingredien-tes farmaceuticamente aceitáveis, como antioxidantes, tampões, conservantes, es- tabilizantes, bacteriostáticos, agentes de suspensão, agentes espessantes e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue (ou outro líquido corporal pertinen-te) do receptor pretendido. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e semelhantes. Exemplos de veículos isotô- nicos adequados para uso em tais formulações incluem cloreto de sódio para injetá-veis, solução de Ringer ou solução de Ringer com lactato para injetáveis. Tipicamen-te, a concentração do ingrediente ativo nos líquidos é de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 10 μg/mL, por exemplo de aproximadamente 10 ng/mL a apro-ximadamente 1 μg/mL. As formulações podem ser apresentadas em recipientes la-crados de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em condição liofilizada com necessidade somente da adi-ção do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injetáveis, imediatamente an-tes do uso. Soluções e suspensões extemporâneas para injeções podem ser prepa radas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.
[0483] O técnico no assunto reconhecerá que as doses apropriadas do com-posto conjugado e das composições compreendendo o composto conjugado podem variar de paciente para paciente. A determinação da dose ideal envolverá geralmen-te contrabalançar o benefício terapêutico e qualquer risco de efeitos colaterais noci-vos. O nível selecionado de dose dependerá de uma variedade de fatores, incluindo, entre outros, a atividade do composto específico, a via de administração, o horário de administração, a taxa de excreção do composto, a duração do tratamento, de outros fármacos, compostos, e/ou materiais combinados usados, a gravidade da condição e a espécie, o sexo, a idade, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico prévio do paciente. A quantidade de composto e a via de administração serão, no final, a critério do médico, do veterinário ou do clínico, embora geralmente a dose venha a ser selecionada para alcançar concentrações locais no sítio de ação que atinjam o efeito desejado sem causar efeitos colaterais nocivos ou deletérios substanciais.
[0484] A administração pode ser efetuada em uma dose, de modo contínuo ou intermitente (por exemplo, em doses divididas com intervalos apropriados) duran-te todo o ciclo de tratamento. Métodos para determinar o meio e a dose mais eficazes para a administração são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e estes variarão com a formulação usada para a terapia, o objetivo da terapia, a(s) célula(s) alvo em tratamento e o indivíduo em tratamento. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível e o padrão de dose sendo selecionados pelo mé-dico, veterinário ou clínico responsável pelo tratamento.
[0485] Em geral, uma dose adequada do composto ativo está na faixa de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 25 mg (mais tipicamente de aproxi-madamente 1 μg a aproximadamente 10 mg) por quilograma de peso corporal do indivíduo ao dia. Quando o composto ativo é um sal, um éster, uma amida, um pró- fármaco ou semelhantes, a quantidade administrada é calculada com base no com-posto de origem e assim o peso real a ser usado é aumentado proporcionalmente.
[0486] Em uma modalidade, o composto ativo é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 100 mg, 3 vezes ao dia.
[0487] Em uma modalidade, o é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 150 mg, 2 vezes ao dia.
[0488] Em uma modalidade, é administrado a um paciente humano de acor-do com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 200 mg, 2 vezes ao dia.
[0489] Contudo, em uma modalidade, o composto conjugado é administrado a um paciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproxima-damente 50 ou aproximadamente 75 mg, 3 ou 4 vezes ao dia.
[0490] Em uma modalidade, o composto conjugado é administrado a um pa-ciente humano de acordo com o seguinte esquema posológico: aproximadamente 100 ou aproximadamente 125 mg, 2 vezes ao dia.
[0491] As quantidades de dose descritas acima podem aplicar-se ao conju-gado (incluindo a porção PBD e o ligador ao anticorpo) ou a quantidade eficaz de composto PBD fornecido, por exemplo, a quantidade de composto que possa ser liberada após a clivagem do ligador.
[0492] Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dose apropriada de um ADC da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da gravidade e da evolução da doença, seja a molécula administrada para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico e da resposta ao anticorpo do paciente e do critério do médico atendente. A molécula é adequa-damente administrada ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamen- tos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, aproximadamente 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de molécula é uma dose inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações se-paradas ou por infusão contínua. Uma dose diária típica poderia variar de aproxima-damente 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dose exemplar de ADC a ser administrada a um paciente está na faixa de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso do paciente. Para ad-ministrações repetidas durante vários dias ou por tempo mais longo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada de sinto-mas da doença. Um esquema de administração exemplar compreende uma dose inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por doses adicionais a cada semana, duas semanas ou três semanas de um ADC. Outros esquemas posológicos podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[0493] O termo “tratamento”, usado neste relatório descritivo no contexto de tratar uma condição, diz respeito geralmente a um tratamento e terapia, seja de um humano ou de um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), no qual algum efeito terapêutico desejado é alcançado, por exemplo, a inibição da progressão da condição, e inclui uma redução na taxa de progressão, uma parada na taxa de pro-gressão, a regressão da condição, a melhora da condição e a cura da condição. O tratamento como medida profilática (ou seja, profilaxia, prevenção) está também in-cluído.
[0494] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, neste relatório descri-tivo, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou de um material, compo-sição ou de dose compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurada com uma razão risco/benefício ra zoável, quando administrada de acordo com um esquema de tratamento desejado.
[0495] Do mesmo modo, o termo “quantidade profilaticamente eficaz”, neste relatório descritivo, refere-se àquela quantidade de um composto ativo, ou de um material, composição ou de dose compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito profilático desejado, comensurada com uma razão ris- co/benefício razoável, quando administrada de acordo com um esquema de trata-mento desejado.
[0496] Os conjugados anticorpo-fármaco podem ser preparados por diversas vias, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos pelos técnicos no assunto, incluindo: (1) a reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente bivalente do ligador, para formar um intermediário Ab-L anticorpo-ligador, via uma ligação covalente, seguida pela reação com um reagente ativado da porção de fármaco; e (2) a reação de um reagente da porção de fármaco com um reagente do ligador para formar um reagente D-L ligador-fármaco, via uma ligação covalente, seguida pela reação com o nucleofílico de um anticorpo. Os mé-todos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma variedade de anti-corpos e ligadores para preparar os conjugados anticorpo-fármaco da invenção.
[0497] Grupos nucleofílicos em anticorpos incluem, entre outros, grupos tióis da cadeia lateral, por exemplo, da cisteína. Os grupos tióis são nucleofílicos e capa-zes de reagir e formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções de ligadores tais como aqueles da presente invenção. Certos anticorpos possuem dis- sulfetos na cadeia que podem ser reduzidos, ou seja, pontes de cisteína. É possível tornar os anticorpos reativos para conjugação com reagentes do ligador pelo trata-mento com um agente redutor como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfino; Getz et al (1999) Anal. Biochem., Vol 273:7380; Soltec Ventures, Beverly, MA). Cada ponte dissulfeto da cisteína formará, portan- to, teoricamente, dois nucleófilos tióis reativos. Grupos nucleofílicos adicionais po-dem ser introduzidos em anticorpos pela reação de lisinas com 2-iminotiolano (rea-gente de Traut) resultando em conversão de uma amina em um tiol.
[0498] O indivíduo/paciente pode ser um animal, mamífero, mamífero pla- centário, marsupial (por exemplo, canguru, vombate), monotremo (por exemplo, orni-torrinco), roedor (por exemplo, cobaia, hamster, rato, camundongo), murino (por exemplo, camundongo), a lagomorfo (por exemplo, coelho), ave (por exemplo, pás-saro), canino (por exemplo, cão), felino (por exemplo, gato), equino (por exemplo, cavalo), suíno (por exemplo, porco), ovino (por exemplo, ovelha), bovino (por exem-plo, vaca), primata, símio (por exemplo, macaco ou símio), macaco (por exemplo, mico, babuíno), símio (por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, gibão) ou hu-mano.
[0499] Além do mais, o indivíduo/paciente pode estar em qualquer uma de suas formas de desenvolvimento, por exemplo, de feto. Em uma modalidade preferi-da, o indivíduo/paciente é um humano.
[0500] Em uma modalidade, o paciente é uma população em que cada paci-ente é portador de um tumor com αvβ6 integrina na superfície da célula.
[0501] Uma possível via de síntese para um intermediário dimérico da Fór- mula VIII é mostrada abaixo:
[0502] No esquema acima, RL representa:
[0503] Em geral, dímeros não simétricos, com respeito a suas ligações N10- C11, podem ser preparados tratando compostos bis-amino da Fórmula IV com um equivalente de um reagente cloroformato disponível comercialmente (ou preparado rapidamente) a fim de quebrar a simetria das moléculas. A amina livre restante pode então ser funcionalizada independentemente para introdução do precursor do grupo de ligação (RL). A manipulação adicional do grupo funcional para fechar o anel B de PBD, remover os grupos protetores fornece a molécula alvo.
[0504] Compostos da Fórmula IV são tipicamente preparados pelo acopla-mento de um fragmento adequadamente funcionalizado do anel C (I) a um núcleo do dímero contendo o anel A da Fórmula II. Fragmentos do anel C podem ser preparados a partir de blocos de construção conhecidos de 4-oxoprolinato de metila com carbamato protegido. A olefinação sob as condições de Wittig ou Horner-Emmons pode ser empregada para fornecer alcenos endo ou exo insaturados. Fragmentos do anel C e anel B podem ser acoplados sob condições padrão na presença de trietila- mina, usando derivados de cloreto ácido dos fragmentos do anel A para fornecer moléculas da Fórmula III. A simetria pode também ser quebrada nesse estágio pela introdução de diferentes anéis C. Compostos do tipo III podem ser reduzidos, sem afetar a insaturação endo ou exo do anel C, com zinco em ácido acético ou fórmico para fornecer moléculas da Fórmula IV.
[0505] Alternativamente, um bloco de construção adequado de 4-hidroxi pir- rolidina pode ser acoplado a um núcleo dimérico da Fórmula II. Os grupos hidroxila podem ser oxidados para cetonas e depois convertidos em enol triflatos. O acopla-mento de Suzuki pode ser usado para introduzir os pró-substituintes C2 (por exem-plo, arila, alquenila, etc.). Os grupos nitro podem depois ser reduzidos para aminas, uma amina é protegida deixando a outra livre para carregar o grupo ligador.
[0506] Carbamatos não simétricos do tipo VI podem ser preparados tratando bis-aminas do tipo IV com um único equivalente de um cloroformato disponível co-mercialmente (ou rapidamente preparado) na presença de piridina ou trietilamina. Os cloroformatos podem ser selecionados para que forneçam o carbamato apropriado com base em grupos protetores de nitrogênio (ProtN) que são ortogonais em relação àqueles usados no grupo pró-ligador (RL). O RL carbamato pode ser introduzido con-vertendo o grupo amino restante para um isotiocianato e atenuando-o com o álcool RL. Alternativamente, o álcool RL pode ser convertido em cloroformato ou um equiva-lente funcional (fluoroformato, p-nitrocarbonato, pentafluorocarbonato ou carbonato de hidroxibenzotriazol). Finalmente, o grupo amino restante pode ser convertido em um p-nitrocarbamato, pentafluorocarbamato ou carbamato de hidroxibenzotriazol reativos, os quais podem ser deslocados com o álcool RL para fornecer moléculas da Fórmula VI.
[0507] Moléculas da Fórmula VII podem ser preparadas a partir de moléculas da Fórmula VI removendo-se os grupos protetores de silila com, por exemplo, ácido acético aquoso. A oxidação com periodinano de Dess-Martin (ou alternativamente TPAP/NMO, PDC ou sob as condições de Swern) fornece o produto de anel fechado.
[0508] Conjugados da Fórmula V podem ser preparados a partir de molécu-las da Fórmula VII removendo-se grupo de proteção de nitrogênio com base no car- bamato.
[0509] Em outra modalidade, um conjugado da Fórmula XVIII pode ser pre-parado a partir do Composto IX como mostrado no Esquema 2.
[0510] A síntese de compostos da Fórmula (II) está descrita no pedido de patente anterior do requerente, WO 2006/111759 e também é descrita por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174). O preparo do composto (II), como ali descrito, é aqui especificamente incorporado por referência neste pedido de patente.
[0511] É feita referência também aos métodos conhecidos para sintetizar dímeros de PBD, incluindo aqueles revisados em Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864.
[0512] Outra descrição relevante pode ser encontrada em WO 2010/091150. Os compostos intermediários descritos em WO 2010/091150 podem também ser empregados nos métodos descritos acima.
[0513] Por exemplo, o composto dimérico (15) mostrado no parágrafo [164] pode ser utilizado como o composto (III) no Esquema I acima. Esta e mais adapta-ções seriam evidentes para o técnico no assunto.
[0514] As rotações ópticas foram medidas em um polarímetro ADP 220 (Bel-lingham Stanley Ltd.) e as concentrações (c) são fornecidas em g/100 mL. Os pontos de fusão foram medidos com um aparelho digital para ponto de fusão (Electrother-mal). Os espectros de IR foram registrados em um espectrômetro Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR. Os espectros de 1H e 13C NMR foram adquiridos a 300 K utili-zando um espectrômetro Bruker Avance NMR a 400 e 100 MHz, respectivamente. Os desvios químicos estão relatados em relação a TMS (δ = 0,0 ppm), e os sinais são designados como s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto) ou m (multipleto), com as constantes de acopla- mento fornecidas em Hertz (Hz). Os dados de espectroscopia de massa (MS) foram coletados com equipamento Waters Micromass ZQ acoplado a Waters 2695 HPLC com e Waters 2996 PDA. Os parâmetros usados no Waters Micromass ZQ foram: Capilar (kV), 3,38; Cone (V), 35; Extrator (V), 3,0; Temperatura da fonte (°C), 100; Temperatura de dessolvatação (°C), 200; Vazão no cone (L/h), 50; Vazão de dessol- vatação (L/h), 250. Os dados de espectroscopia de massa de alta resolução (HRMS) foram registrados em Waters Micromass QTOF Global no modo positivo W, utilizando pontas de vidro de borossilicato revestidas com metal para introduzir as amostras no instrumento. A cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada em placas de alumínio de sílica gel (Merck 60, F254), e a cromatografia ultrarrápida utilizou sílica gel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Exceto para o HOBt (NovaBiochem) e reagentes suportados em sólido (Argonaut), todas as outras substâncias químicas e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich e usados como fornecidos sem purificação adicional. Solventes anidros foram preparados por destilação sob uma atmosfera de nitrogênio seco na presença de um agente apropriado de secagem, e foram arma-zenados sobre peneiras moleculares de 4A ou de fios de sódio. Éter de petróleo re-fere-se à fração com ebulição a 40-60°C.
[0515] Condições gerais de LC/MS: A HPLC (Waters Alliance 2695) foi reali-zada usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1%) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1%). Gradiente: Composição inicial B 5% durante 1,0 minutos e de-pois B 5% para B 95% dentro de 3 minutos. A composição foi mantida por 0,5 minu-tos com B a 95% e depois retornou para B 5% em 0,3 minutos. O tempo total de cor-rida do gradiente é de 5 minutos, vazão 3,0 mL/minutos, 400 μL foram divididos uma junta em T com volume morto zero que passa no espectrômetro de massa. Faixa de detecção de comprimento de onda de detecção: 220 a 400 nm. Tipo de função: ar-ranjo de diodo (535 varreduras). Coluna: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm. Exemplo 1 a)Cloreto de (S)-2-(metoxicarbonil)-4-metilenopirrolidínio (3)
[0516] Carbonato de potássio (19,92 g, 14 mmol, 3 eq.) foi adicionado a uma solução agitada do ácido carboxílico (1) (10,92 g, 48 mmol, 1 eq.) em DMF (270 mL). A suspensão branca resultante foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos, em cujo momento iodometano (21,48 g, 9,5 mL, 151 mmol, 3,15 eq.) foi adicionado. A mistura de reação foi deixada agitando à temperatura ambiente durante 3 dias. O DMF foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer um resíduo amarelo que foi particionado entre etilacetato e água. A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com etilacetato. As camadas orgânicas com-binadas foram lavadas com água, salmoura e secas com sulfato de magnésio. O etilacetato foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto em forma de óleo amarelo. O produto bruto foi purificado por croma- tografia ultrarrápida [n-hexano 85%/etilacetato 15%] para fornecer o produto em for-ma de óleo incolor (Composto conhecido F Manfré et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2060-2065)
[0517] Uma solução de ácido clorídrico 4 M em dioxano (63 mL, 254,4 mmol, 4,5 eq.) foi adicionada ao fragmento protegido por Boc do anel C (2) (13,67 g, 56,6 mmol, 1 eq.) à temperatura ambiente. Foi observada efervescência indicando a libe-ração de CO2 e a remoção do grupo Boc. O produto precipitou em forma de sólido branco e foi acrescentado dioxano adicional para facilitar a agitação. A mistura de reação foi deixada agitando por uma hora e depois foi diluída com éter. O produto precipitado foi coletado por filtração a vácuo e lavado com éter adicional. A secagem ao ar forneceu o produto desejado em forma de pó branco (9,42 g, 94%) (P Herdwijn et al., Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903-7)
[0518] (b) (5-((5-(5-amino-4-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4- metilenopirrolidina-1-carbonil)-2-metoxifenoxi)pentil)oxi)-2-((S)-2-(((terc- butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metilenopirrolidina-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamato de terc-butila (9)
[0519] Uma quantidade catalítica de DMF anidro (0,5 mL) foi adicionada a uma suspensão agitada de cloreto de oxalila (9,1 g, 6,25 mL, 71,7 mmol, 3 eq.) e o núcleo dimérico (4) (11,82 g, 23,9 mmol, 1 eq.) em DCM anidro (180 mL) à tempera-tura ambiente. Foi observada efervescência vigorosa após a adição de DMF e a mis-tura de reação foi deixada agitando por 18 horas em um balão de fundo redondo equipado com um tubo secador para cloreto de cálcio. A solução transparente resul-tante foi evaporada sob pressão reduzida e o sólido triturado com éter. O produto sólido foi coletado por filtração a vácuo, lavado com éter adicional e seco in vacuo a 40°C durante 1,5 horas. Este sólido foi depois adicionado em porções a uma sus- pensão do anel C (3) (9,35 g, 52,6 mmol, 2,2 eq.) em TEA (12,08 g, 119,6 mmol, 5 eq.) e DCM seco (110 mL), mantendo a temperatura entre -40 e -50 °C com o auxílio de um banho de gelo seco/acetonitrila. A mistura de reação foi deixada agitando a - 40 °C por uma hora e depois deixada aquecer-se para a temperatura ambiente, em cujo momento a LCMS indicou o consumo completo do material de partida. A mistura de reação foi diluída com DCM adicional e lavada sequencialmente com ácido clorídrico aquoso (1M, 2 x 200 mL), bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 250 mL), água (250 mL), salmoura (250 mL) e seca (MgSO4). DCM foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para fornecer o produto em forma de espuma amarela (13.94 g, 79 %). Dados analíticos: RT 3,95 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 741 ([M + 1]+, 100).
[0520] Boridreto de lítio sólido (0,093 g, 4,3 mmol, 3 eq.) foi adicionado em uma porção a uma solução do éster (5) (1,05 g, 142 mmol, 1 eq.) em THF seco (10 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio a 0°C (banho de gelo). A mistura de reação foi deixada agitando a 0 °C por 30 minutos e depois deixada aquecer-se para a tempe-ratura ambiente, em cujo momento, foi observada a precipitação de uma goma de cor laranja. A mistura de reação foi deixada agitando à temperatura ambiente por mais 2 horas e depois foi resfriada em um banho de gelo e tratada com água (20 mL) para fornecer uma suspensão amarela. Ácido clorídrico (1M) foi cuidadosamente adicionado (efervescência vigorosa!) até que a efervescência cessasse. A mistura de reação foi extraída com etilacetato (4 x 50 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (100 mL), salmoura (100 mL) e secas (MgSO4). Etila- cetato foi removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida para render o produto em forma de espuma amarela (0,96 g, 99%). A reação foi repetida em escala de 12,4 g para render 11,06 g de produto (96%). Dados analíticos: RT 3,37 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 685 ([M + H]+, 100).
[0521] Uma solução de álcool bis-nitro (6) (7,94 g, 11,6 mmol, 1 eq), dimetil- sililcloreto de terc-butila (4,54 g, 30,15 mmol, 2,6 eq) e imidazol (4,1 g, 60,3 mmol, 5,2 eq) em DMF anidro (100 mL) sob uma atmosfera de argônio foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A mistura de reação foi diluída com água (250 mL) e extraída com DCM (4 x 100 mL). Os extratos combinados foram lavados com água (200 mL), salmoura saturada (200 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilaceta- to 50%/n-hexano 50% para etilacetato 100% em incrementos de 10%] para fornecer o produto em forma de espuma amarela (10,0 g, 94%). Dados analíticos: RT 4,57 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 913 ([M + H]+, 100).
[0522] Solução de ácido fórmico (5% v/v, 15 mL) foi adicionada em uma por-ção a uma mistura de pó de zinco (29,56 g, 0,45 mol, 40 eq.) e o composto (7) (10,34 g, 11,32 mmol, 1 eq.) em etilacetato/etanol (80 mL/150 mL). Uma exotermia de 12 °C foi observada. Depois de 15 minutos, a mistura de reação foi filtrada através de celite, lavando com etilacetato (em excesso). O filtrado foi lavado com bicarbonato de sódio saturado (3 x 150 mL), água (200 mL), salmoura saturada (200 mL), seco (MgSO4) e evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato] forneceu o produto em forma de espuma branca (8,09 g, 84%). Dados analíticos: RT 4,43 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 853 ([M + H]+, 100).
[0523] Uma solução da bis-anilina (8) (6,02 g, 7,1 mmol, 1 eq.) e di-t-butil- dicarbonato (1,54 g, 7,1 mmol, 1 eq.) em THF anidro (50 mL) foi aquecida ao refluxo durante 16 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi pu-rificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato 40%/n-hexano 60% pa-ra etilacetato 60%/40% n-hexano para etilacetato 100% etilacetato] para fornecer o produto em forma de espuma branca (3,22 g, 48%). Dados analíticos: RT 4,27 minu-tos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 953 ([M + H]+, 100), MS (ES-) m/z (intensi- dade relativa) 951 ([M - H])-, 100).
[0524] (c) 11-hidroxi-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno- 5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-2-(piridin-2-ildisulfanil)etila (14)
[0525] O Composto 10 foi preparado de acordo com Jones et al, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 6526-6527.
[0526] Trietilamina (0,25 g, 0,34 mL, 2,42 mmol, 2,2 eq.) foi adicionado a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-Boc (9) (1,05 g, 1,1 mmol, 1,0 eq.) e trifosgênio (0,117 g, 0,4 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (10 mL) sob uma atmosfera de argônio à temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida para 40 °C e, depois de 5 minutos, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metila. Dados analíticos: RT 4.37 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1011 ([M + H]+, 100).
[0527] Uma solução de 2-(piridin-2-ildisulfanil)etanol (10) (0,31 g, 1,65 mmol, 1,5 eq.) e trietilamina (0,17 g, 0,23 mL, 1,65 mmol, 1,5 eq.) em THF seco (10 mL) foi adicionada gota a gota ao isocianato recentemente preparado. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C por 1,5 horas, depois desse tempo, mais uma porção de trifos- gênio (0,058 g, 0,2 mmol, 0,18 eq.) foi adicionada. Após mais 30 minutos, a mistura de reação foi deixada resfriar-se, foi filtrada para remover cloridrato de trietilamina e o filtrado foi evaporado até a dessecação completa para dar origem ao produto bruto em forma de óleo amarelo que foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 60%/etilacetato 40% mudando para n-hexano 55%/etilacetato 45%] para fornecer o produto desejado em forma de óleo incolor (0,63 g, 49%). Dados analíticos: RT 4,50 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1166 ([M + H]+, 100), MS (ES-) m/z (intensidade relativa) 1164 ([M - H])-, 70).
[0528] AcOH/H2O (3/1/) (8 mL) foi adicionado a uma solução do composto (11) (0,37 g, 0,32 mmol, 1 eq) em THF (2 mL) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 8 com solução saturada de NaHCO3. A mistura foi extraída com etilacetato (3 x 100 mL) e os extratos combinados foram lavados com solução saturada de NaHCO3 (100 mL), água (100 mL), salmoura saturada (100 mL), secos (MgSO4) e evapora- dos sob pressão reduzida. A purificação do resíduo por cromatografia ultrarrápida em coluna [gradiente de eluição: clorofórmio/metanol 0% para 5% em incrementos de 1%] forneceu o produto em forma de espuma branca (0,24 g, 81%). Dados analíticos: RT 3,08 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 938 ([M + H]+, 100), MS (ES-) m/z (intensidade relativa) 936 ([M - H])-, 100).
[0529] Uma solução de DMSO (79 mg, 72 μL, 1,0 mmol, 4,4 eq) em DCM (5 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de cloreto de oxalila (62 mg, 42 μL, 0,49 mmol, 2,15 eq.) em DCM (5 mL) sob uma atmosfera de argônio a -78 °C (gelo seco/acetona). A solução foi agitada a -78 °C por 15 minutos. Uma solução do com-posto (12) (0,214 g, 0,23 mmol, 1,0 eq.) em DCM (6 mL) foi adicionada gota a gota e a mistura foi agitada a -78 °C por 45 minutos. Trietilamina (0,23 g, 0,32 mL, 2,28 mmol, 10 eq.) foi adicionada e, depois de 5 minutos, a mistura de reação foi deixada atingir a temperatura ambiente. A mistura de reação foi tratada com solução saturada de NH4Cl (15 mL), a porção orgânica foi separada e lavada com solução de ácido cítrico 1M (3 x 50 mL), solução saturada de NaHCO3 (100 mL), água (100mL), salmoura saturada (100 mL), foi seca (MgSO4) e evaporada sob pressão reduzida para fornecer um óleo amarelo claro. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna forneceu o produto em forma de espuma branca (68 mg, 32%). Dados analíticos: RT 2,90 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 933 ([M + H]+, 50), MS (ES-) m/z (intensidade relativa) 935 ([M - H])-, 55).
[0530] Uma solução fria (banho de gelo) de ácido trifluoroacético 95% (1 mL) foi adicionada ao composto 13 que havia sido resfriado em um banho de gelo. A so-lução foi agitada a 0 °C por 15 minutos, quando foi mostrado que estava concluída por LCMS. A mistura de reação foi adicionada gota a gota a uma mistura de gelo e solução saturada de NaHCO3 para neutralizar a solução de ácido trifluoroacético. A mistura foi extraída com DCM (4 x 50 mL) e os extratos combinados foram lavados com salmoura saturada (100 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto em forma de espuma branca (26 mg, 96%). Dados analíticos: RT 2,72 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 816 ([M + H]+., 70), MS (ES-) m/z (intensidade relativa) 814 ([M - H])-, 40). Exemplo 2 (a) (R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propan-1-ol (18)
[0531] Ácido tioacético (1,99 g, 1,86 mL, 26,1 mmol, 1,1 eq.) foi adicionado a uma suspensão de carbonato de césio (7,73 g, 23,72 mmol, 1,0 eq.) em DMF seco (40 mL). Depois de 30 minutos, 2-cloropropanoato de (S)-metil (15) foi adicionado e a mistura foi deixada agitando à temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi particionada entre éter dietílico (150 mL) e água (150 mL); a água foi separada e lavada com uma porção adicional de éter dietílico (150 mL). As porções orgânicas combinadas foram lavadas com água (6 x 100 mL), salmoura (200 mL), secas (MgSO4) e evaporadas sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [etilacetato 10%/n-hexano 90%] forneceu o produto em forma de óleo incolor (3,01 g, 82%). Dados analíticos: RT 2,25 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 163 ([M + H]+, 10), 185([M + Na]+, 65); [α]td = [+141]17,8°Cd (c, 2,26 CHCl3).
[0532] Uma solução de tioacetato (16) (0,57 g, 3,54 mmol, 1,0 eq.) em THF seco (10 mL) foi adicionada gota a gota a uma suspensão de hidreto de alumínio e lítio (0,54 g, 14,15 mmol, 4,0 eq.) em THF seco (20 mL) ao refluxo sob uma atmosfera de argônio. Depois de 1 hora, a mistura de reação foi resfriada para 0 °C e HCl 2M foi adicionado gota a gota mantendo a temperatura abaixo de 30 °C até que a efervescência cessasse. A mistura resultante foi deixada agitando à temperatura ambiente por 1 hora, depois foi filtrada através de celite, lavando com THF (40 mL). O solvente foi evaporado; o resíduo voltou a ser dissolvido em DCM e seco (MgSO4). A evaporação do DCM sob pressão reduzida seguida pela cromatografia em coluna do resíduo [n-hexano 60%/etilacetato 40%] forneceu o produto em forma de óleo amarelo claro (0,193 g, 58%). Dados analíticos: [α]td = [-22]17,2°Cd (c, 0,972 CHCl3).
[0533] Cloreto de sulfurila (1M em DCM, 2,0 mL, 2,0 mmol, 1,1 eq.) foi adici-onado gota a gota a uma solução de 2-mercaptopiridina (0,2 g, 1,81 mmol, 1,0 eq.) em DCM seco (5 mL) a 0 °C sob uma atmosfera de argônio. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas e o DCM foi evaporado sob pressão redu-zida para fornecer um sólido amarelo. O sólido foi suspenso em DCM seco (10 mL) e uma solução de (R)-2-mercaptopropan-1-ol (17) (0,18 g, 1,95 mmol, 1,08 eq.) em DCM seco (5 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 18 horas sob uma atmosfera de argônio. A mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida para fornecer uma goma amarela. A goma voltou a ser dissolvida em água e a solução foi basificada com solução de hidróxido de amônio, extraída com DCM (3 x 50 mL) e os extratos combinados foram lavados com água (100 mL), salmoura (100 mL), secos (MgSO4) e evaporados para fornecer um óleo amarelo. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 80%/etilacetato 20% para n-hexano 60%/etilacetato 40% em incrementos de 5%] forneceu o produto em forma de óleo incolor (0,213 g, 59%). Dados analíticos: RT 2,43 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 202 ([M + H]+, 50); [α]td = [+273]26,2°Cd (c, 0,28 CHCl3).
[0534] (b) 11-hidroxi-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metileno-5-oxo- 2,3,5,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-2-metileno- 5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-(R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propila (22)
[0535] Trietilamina (0,28 g, 0,39 mL, 2,8 mmol, 2,2 eq.) foi adicionada a uma solução agitada da bis-anilina protegida com mono-Boc (9) (1,21 g, 1,27 mmol, 1,0 eq.) e trifosgênio (0,136 g, 0,46 mmol, 0,36 eq.) em THF seco (15 mL) sob uma at- mosfera de argônio à temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida para 40 °C e, depois de 5 minutos, uma amostra foi tratada com metanol e analisada por LCMS como o carbamato de metila. Dados analíticos: RT 4,30 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1011 ([M + H]+, 100).
[0536] Uma solução de (R)-2-(piridin-2-ildisulfanil)propan-1-ol (18) (0,38 g, 1,91 mmol, 1,5 eq.) e trietilamina (0,19 g, 0,27 mL, 1,91 mmol, 1,5 eq.) em THF seco (10 mL) foi adicionada gota a gota ao isocianato recentemente preparado. A mistura de reação foi aquecida a 40 °C por 4 horas e depois agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura de reação foi filtrada para remover cloridrato de trietila- mina e o filtrado foi evaporado até a dessecação completa para dar origem ao produto bruto em forma de óleo amarelo que foi purificado por cromatografia ultrarrápida em coluna [n-hexano 60%/etilacetato 40% para n-hexano 40%/etilacetato 60% em incrementos de 5%] para fornecer o produto desejado em forma de espuma branca (0,75 g, 50%). Dados analíticos: RT 4,50 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 1180 ([M + H]+, 60); [α]td = [-18]21°Cd (c, 0,28 CHCl3).
[0537] Ácido acético/H2O (3/1, 16 mL) foi adicionado a uma solução do bis- silil éter (19) (0,72 g, 0,61 mmol, 1 eq.) em THF (4 mL). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 8 com solução saturada de bicarbonato de sódio. A mistura foi extraída com etilacetato (4 x 150 mL) e os extratos combinados foram lavados com solução saturada de bicarbonato de sódio (2 x 150 mL), água (150 mL), salmoura (150 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna forneceu o produto em forma de espuma branca (0,56 g, 96%). Dados analíticos: RT 3,15 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 953 ([M + H]+., 100); [α]td = [-13,5]26°Cd (c, 0,22 CHCl3).
[0538] Uma solução de DMSO (91 mg, 83 μL, 1,16 mmol, 4,4 eq.) em DCM anidro (5 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de cloreto de oxalila (2,0 M em DCM, 318 μL, 0,635 mmol, 2,4 eq.) em DCM anidro (5 mL). a -40 °C sob uma atmosfera de argônio. A solução foi agitada a -40 °C por 15 minutos. Uma solução do bis-álcool (20) (0,252 g, 0,26 mmol, 1 eq.) em DCM anidro (10 mL) foi adicionada gota a gota e a mistura resultante agitada a -40 °C por 45 minutos. Durante esse tempo, a temperatura foi deixada atingir -25 °C. A temperatura foi baixada para -35 °C e trietilamina (0,27 g, 0,36 mL, 2,6 mmol, 10 eq.) adicionada gota a gota. Depois de 5 minutos, a temperatura foi deixada atingir a temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM (50 mL) e extraída com solução de ácido cítrico 1M (3 x 150 mL), solução saturada de bicarbonato de sódio (150 mL), água (200 mL), salmoura (200 mL), seca (MgSO4) e evaporada sob pressão reduzida para fornecer uma espuma amarela. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [cloro- fórmio/metanol 0% para 2% em incrementos de 0,5%] forneceu o produto em forma de espuma branca (0,137 g, 53%). Dados analíticos: RT 3,17 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 948 ([M + H]+, 100); [α]td = [+170]26°Cd (c, 0,25 CHCl3).
[0539] Uma solução fria (banho de gelo) de ácido trifluoroacético 95% (8,5 mL) foi adicionada ao composto (21) (0,221 g, 0,23 mmol, 1 eq.) que havia sido res-friado em um banho de gelo. A solução foi agitada a 0 °C por 25 minutos quando foi mostrado que estava concluída por LCMS. A mistura de reação foi adicionada gota a gota a uma mistura de gelo e solução saturada de bicarbonato de sódio (200 mL) para neutralizar a solução de ácido trifluoroacético. A mistura foi extraída com DCM (4 x 75 mL) e os extratos combinados foram lavados com água (100 mL) salmoura saturada (100 mL), secos (MgSO4) e evaporados sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia ultrarrápida em coluna [cloro- fórmio/metanol 0% para 3% em incrementos de 1%] forneceu o produto em forma de espuma branca (0,192 g, 99%). Dados analíticos: RT 3,00 minutos; MS (ES+) m/z (intensidade relativa) 830 ([M + H]+, 75); [α]td = [+444]22°Cd (c, 0,26 CHCl3).
[0540] Células K562 de leucemia mieloide crônica humana foram mantidas em meio RPM1 1640, suplementado com soro fetal bovino 10% e glutamina 2 mM, a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo CO2 5% e foram incubadas com uma dose especificada de fármaco por 96 horas a 37 °C no escuro. A incubação foi finali-zada por centrifugação (5 minutos, 300 g) e as células foram lavadas uma vez com meio livre do fármaco. Após o tratamento com o fármaco apropriado, as células foram transferidas para placas de microtitulação de 96 poços (104 células por poço, 8 poços por amostra). As placas foram depois mantidas no escuro a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo CO2 5%. O ensaio baseia-se na capacidade de células viáveis reduzirem um sal solúvel amarelo de tetrazólio, brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT, Aldrich-Sigma), para um precipitado insolúvel púrpura formazan. Após a incubação das placas por 4 dias (para permitir que células controle aumentassem de número em aproximadamente 10 vezes), 20 μL de solução com MTT (5 mg/mL em solução salina com tampão fosfato) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por mais 5 horas. As placas foram depois centrifugadas durante 5 minutos a 300 g e a massa do meio foi retirada com pipeta do sedimento celular deixando 10-20 μL por poço. DMSO (200 μL) foi adicionado a cada poço e as amostras foram agitadas para assegurar a mistura completa. A densidade foi lida depois a um comprimento de onda de 550 nm em um leitor de placa Titertek Multiscan ELISA, e uma curva de dose-resposta foi construída. Para cada curva, foi obtido um valor de IC50 como a dose necessária para reduzir a densidade óptica final para 50% dor valor de controle.
[0541] Anticorpos monoclonais completos construídos com cisteína (Thi- oMabs - Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249, Shen et al (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula et al (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52), expressos em células CHO, foram reduzidos com quantidade excedente em aproximadamente 20-40 vezes de TCEP (cloridrato de (tris(2-carboxietil)fosfino) ou DTT (ditiotreitol) em Tris 50 mM, pH 7,5, com EDTA 2 mM durante 3 horas a 37 °C ou durante a noite à temperatura ambiente.(Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). O ThioMab reduzido foi diluído e carregado em uma coluna HiTrap S em acetato de sódio 10 mM, pH 5, e eluído com PBS contendo cloreto de sódio 0,3 M. Alternativamente, o anticorpo foi acidificado pela adição de 1/20o do volume de ácido acético 10%, diluído com succinato 10 mM pH 5, carregado na coluna e depois lavado com 10 volumes da coluna de tampão succina- to. A coluna foi eluída com Tris 50 mM, EDTA 2 mM.
[0542] O ThioMab reduzido eluído foi tratado com excesso molar de 15 vezes de DHAA (ácido dehidroascórbico) ou sulfato de cobre aquoso 200 nM (CuSO4). A oxidação das ligações dissulfeto dentro da cadeia foi concluída em aproximadamente três horas ou mais. A oxidação ao ar ambiente foi também eficaz. O anticorpo novamente oxidado foi dialisado em succinato de sódio 20 mM pH 5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM e armazenado congelado a -20 °C.
[0543] Conjugação de Thio-Mabs com compostos para preparar conjugados anticorpo-fármaco
[0544] Os tio-anticorpos (ThioMab) desbloqueados, novamente oxidados fo-ram reagidos com excedente molar de 6-8 vezes dos compostos acima (14, 22) (de um estoque de DMSO a uma concentração de 20 mM) em Tris 50 mM, pH 8, até que a reação estivesse concluída (16-24 horas), conforme determinado pela análise por LC-MS da mistura de reação.
[0545] Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) brutos foram depois aplicados a uma coluna de troca catiônica após a diluição com succinato de sódio 20 mM, pH 5. A coluna foi lavada com pelo menos 10 volumes da coluna de succinato de sódio 20 mM, pH 5, e o anticorpo foi eluído com PBS. Os conjugados anticorpo- fármaco foram formulados em His/acetato 20 mM, pH 5, com sacarose 240 mM utilizando colunas de filtração em gel. Os conjugados anticorpo-fármaco foram caracterizados por espectroscopia UV para determinar a concentração proteica, por SEC analítica (cromatografia de exclusão por tamanho) para análise de agregação e por LC-MS antes e depois do tratamento com Lisina C endopeptidase.
[0546] A cromatografia de exclusão por tamanho foi realizada utilizando uma coluna Shodex KW802.5 em fosfato de potássio 0,2M, pH 6,2, com cloreto de potássio 0,25 mM e IPA 15% a uma vazão de 0,75 mL/minuto. O estado de agregação do conjugado foi determinado pela integração da absorbância da área do pico eluído a 280 nm.
[0547] A análise por LC-MS foi realizada utilizando um aparelho Agilent QTOF 6520 ESI. Como exemplo, um conjugado anticorpo-fármaco gerado utilizando essa química foi tratado com Endoproteinase Lys C 1:500 p/p (Promega) em Tris, pH 7,5, durante 30 minutos a 37 °C. Os fragmentos resultantes da clivagem foram carregados em uma coluna 1000A, 8 um PLRP-S aquecida para 80 °C e eluídos com gradiente de B 30% para B 40% em 5 minutos. A fase móvel A era H2O com TFA 0,05% e a fase móvel B era acetonitrila com TFA 0,04%. A vazão era 0,5 mL/minute. A eluição de proteínas foi monitorada por detecção da absorbância UV a 280nm antes da ionização por electrospray e a análise por MS. A resolução cromatográfica do fragmento Fc não conjugado, do Fab residual não conjugado e do Fab com fármaco foi em geral alcançada. Os espectros m/Z obtidos foram deconvoluídos utilizando o software Mass Hunter™ (Agilent Technologies) para calcular a massa dos fragmentos do anticorpo.
[0548] Como exemplo, a massa molecular (MW) para thio-Tmab conjugado com 22 (adição de massa = 720 daltons). Massas deconvoluídas observadas:
[0549] 53.296 daltons correspondem a MW de fragmento Fc não conjugado
[0550] 47.431 daltons correspondem a MW de fragmento Fab não conjugado
[0551] 48.150 daltons correspondem a MW de fragmento Fab com fármaco
[0552] Portanto, o pico observado a 48.150 daltons corresponde ao fragmento Fab esperado (47.431 daltons) carregando um fármaco 22 (+720 daltons).
[0553] ADC tio-conjugados com 22
[0554] Adição de massa: 719,84
ADC tio-conjugados com 14 Adição de massa: 705,81 
[0555] Os ensaios in vitro e in vivo a seguir estão também descritos em Phil-lips et al (2008) Cancer Res. 68(22):9280-9290.
[0556] A eficácia de ADC foi medida por um ensaio de proliferação celular que empregou o protocolo abaixo (CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488). Todas as linhagens celulares foram obtidas da American Type Culture Collection:
[0557] I.Uma alíquota de 100 μL de cultura celular, contendo aproximada-mente 104 células (por exemplo, KPL-4, uma linhagem celular de câncer de mama humano, Kurebayashi et al (1999) Brit. Jour. Cancer 79(5-6):707-717), SKBR-3 ou MCF7) no meio, foi depositada em cada poço de uma placa de paredes opacas com 96 poços.
[0558] 2.Foram preparados poços controle contendo o meio e sem células.
[0559] 3.O ADC foi adicionado aos poços experimentais e incubado por 3-5 dias.
[0560] 4.As placas foram equilibradas para a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
[0561] 5.Um volume do reagente de CellTiter-Glo, equivalente ao volume do meio de cultura celular presente em cada poço, foi adicionado.
[0562] 6.Os conteúdos foram misturados por 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise celular.
[0563] 7.A placa foi incubada à temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal da luminescência.
[0564] 8.A luminescência foi registrada e relatada em gráficos em RLU = unidades relativas de luminescência.
[0565] Certas células são semeadas em 1000-2000/poço ou 2000-3000/poço em uma placa de 96 poços, 50 uL/poço. Depois de um ou dois dias, ADC são adici-onados em volumes de 50 μL para concentração final de 9000; 3000; 1000. 333; 111; 37; 12,4; 4,1 ou 1,4 ng/mL, com poços controle "sem ADC" recebendo apenas o meio. As condições são em duplicata ou triplicada. Após 3-5 dias, Cell TiterGlo II 100 μL/poço é adicionado (ensaio à base de luciferase, proliferação medida por níveis de ATP), e as contagens de células são determinadas usando um luminômetro. Os dados são inseridos em gráfico como a média da luminescência para cada conjunto de réplicas, com barras de erro do desvio padrão. O protocolo é uma modificação do ensaio de viabilidade CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega):
[0566] 1. Semear 1000 células/poço em 50 μL/poço do meio FBS/glutamina. Deixar às células que se liguem durante a noite.
[0567] 2. ADC é diluído em série 1:3 no meio, iniciando na concentração de trabalho 18 μg/mL (o resultado é uma concentração final de 9 μg/mL). 50 μL de ADC diluído são adicionados aos 50 μL de células e meio já no poço.
[0568] 3. Incubar por 72-96 horas (o padrão é 72 horas, mas prestar atenção na concentração de 0 ug/mL para interromper o ensaio quando as células estão 85-95% confluentes).
[0569] 4. Adicionar 100 μL/poço do reagente Promega Cell Titer Glo, agitar por 3 minutos e efetuar a leitura no luminômetro.
[0570] Os conjugados anticorpo-fármaco, trastuzumabe-14 (110) e trastuzu- mabe-22 (101) foram testados contra as células SK-BR-3, KPL-4 e MCF-7 (Leven- son et al (1997) Cancer Res. 57(15):3071-3078) para medir a viabilidade celular in vitro em estudos de cinco dias. O valor de IC50 (μg/mL) para 101 contra SK-BR-3 foi de 22,12. O valor de IC50 para 110 contra SK-BR-3 foi 102,78. As células SK-BR-3 apresentam expressão HER2+ e são sensíveis ao trastuzumabe. Tanto 101 como 110 foram efetivamente inativos contra MCF-7, que é uma linhagem de adenocarcinoma mamário humano que não expressa HER2. Dessa forma, os, conjugados 101 e 110 demonstram potência para a eliminação celular direcionada.
[0571] Inibição de crescimento tumoral, eficácia in vivo em camundongos portadores de explantes transgênicos com alta expressão de HER2
[0572] Animais adequados para experimentos transgênicos podem ser obtidos de fontes comerciais padrão como a Taconic (Germantown, N.Y.). Muitas linhagens são adequadas, mas camundongos FVB fêmeas são preferidos por apresentarem alta suscetibilidade à formação de tumores. Machos FVB foram utilizados para o acasalamento e varões CD.1 vasectomizados foram usados para estimular a pseu- dogravidez. Camundongos vasectomizados podem ser obtidos de qualquer fornece-dor comercial. Os fundadores foram criados com camundongos FVB ou com camun-dongos heterozigotos 129/BL6 x FVB p53. Os camundongos com heterozigosidade no alelo p53 foram usados para aumentar potencialmente a formação de tumores. Contudo, isso provou ser desnecessário. Por conseguinte, alguns tumores F1 são de linhagem mista. Os tumores de fundadores são somente FVB. Seis fundadores foram obtidos com alguns tumores em desenvolvimento sem terem tido ninhadas.
[0573] Animais com tumores (aloenxerto propagado a partir dos camundongos transgênicos Fo5 mmtv) foram tratados com uma dose única ou múltipla por injeção IV de ADC. O volume tumoral foi avaliado em vários momentos após a injeção.
[0574] Os tumores surgem rapidamente em camundongos transgênicos que expressam uma forma ativada por mutação de neu, o homólogo de HER2 do rato, mas o HER2 que é superexpresso em cânceres de mama humano não é mutante e a formação de tumores é muito menos robusta em camundongos transgênicos que superexpressam o HER2 sem mutação (Webster et al (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76).
[0575] Para melhorar a formação de tumores com o HER2 não mutante, foram produzidos camundongos transgênicos usando um cDNA plasmidial de HER2 no qual um ATG ascendente foi deletado para prevenir a iniciação da tradução de tais codons ATG ascendentes, os quais do contrário reduziriam a frequência da iniciação da tradução a partir do códon de iniciação autêntico em sentido descendente de HER2 (por exemplo, ver Child et al (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341). Adi-cionalmente, um intron quimérico foi adicionado à extremidade 5’, o qual deve tam-bém aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman e Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836). O intron quimérico foi derivado de um vetor da Promega, o vetor de expressão Pci-neo em mamíferos (bp 890-1022). A extremidade 3’ do cDNA é flanqueada pelos exons 4 e 5 do hormônio de crescimento humano e por sequências de poliadenilação. Além do mais, os camundongos FVB foram usados porque esta linhagem é mais suscetível ao de-senvolvimento de tumores. O promotor de MMTV-LTR foi utilizado para assegurar a expressão tecidual específica de HER2 na glândula mamária. Os animais foram ali-mentados com a dieta AIN 76A a fim de aumentar a suscetibilidade à formação de tumores (Rao et al (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158).
[0576] O modelo Fo5 é um modelo em camundongos transgênicos no qual o gene HER2 humano, sob a regulação transcricional do promotor do vírus do tumor mamário murino (MMTV-HER2), é superexpresso no epitélio mamário. A superex- pressão provoca o desenvolvimento espontâneo de tumores mamários que superex- pressam o receptor HER2 humano. O tumor mamário de um dos animais fundadores (fundador no 5 [Fo5]) foi propagado em gerações subsequentes de camundongos FVB pelo transplante seriado de fragmentos tumorais. Antes de ser usado para um estudo de eficácia in vivo, o tumor mamário transgênico MMTV-HER2 Fo5 foi cirurgicamente transplantado no coxim de gordura da mama No 2/3 de camundongos nu/nu (do Charles River Laboratories) em fragmentos que mediam aproximadamente 2x2 mm. Quando os tumores atingiram os volumes desejados, os camundongos portadores do tumor foram randomizados e receberam uma dose única por injeção IV do ADC.
[0577] A Figura 1 mostra um gráfico da alteração em volume tumoral médio in vivo ao longo do tempo no modelo de tumor de mama com aloenxertos de tumores mamários MMTV-HER2 Fo5 inoculados em camundongos CRL nu/nu após a administração iv única no Dia 0 de: (1) Veículo: acetato de histidina 20 mM, pH 5,5, sacarose 240 mM, (2) xCD22-22 (103) a 10mg/kg, (3) trastuzumabe-22 (101) a 1 mg/kg, (4) trastuzumabe-22 (101) a 3mg/kg e (5) trastuzumabe-22 (101) a 10 mg/kg. As linhas na figura estão indicadas com os símbolos seguintes:
[0578] A Figura 2 mostra um gráfico da alteração em volume tumoral médio in vivo ao longo do tempo no modelo de câncer de mama com aloenxertos do tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 inoculados em camundongos CRL nu/nu após uma ad-ministração iv única no Dia 0 de: (1) Veículo: acetato de histidina 20 mM, pH 5,5, sacarose 240 mM, (2) xCD22-14 (112) a 6 mg/kg, (3) trastuzumabe-14 (110) a 1 mg/kg, (4) trastuzumabe-14 (110) a 3mg/kg, (5) trastuzumabe-14 (110) a 6 mg/kg e mg/kg. As linhas na figura estão indicadas com os símbolos seguintes:
Abreviações Ac acetila Acm acetamidometila Alloc aliloxicarbonila Boc dicarbonato de di-terc-butila t-Bu terc-butila Bzl benzila, em que Bzl-OMe é metoxibenzila e Bzl-Me é metilbenzeno Cbz ou Zbenziloxi-carbonila, em que Z-Cl e Z-Br são cloro- e bromobenziloxi carbonila respectivamente DMF N,N-dimetilformamida Dnp dinitrofenila DTT ditiotreitol Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonila imp grupo protetor de N-10 imina: 3-(2-metoxietoxi)propanoato-Val-Ala- PAB MC-OSumaleimidocaproil-O-N-succinimida Moc metoxicarbonila MP maleimidopropanamida Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila PAB para-aminobenziloxicarbonila PEG etilenoxi PNZ carbamato de p-nitrobenzila Psec 2-(fenilsulfonil)etoxicarbonila TBDMSterc-butildimetilsilila TBDPS terc-butildifenilsilila Teoc 2-(trimetilsilil)etoxicarbonila Tos tosila Troc cloreto de 2,2,2-tricloretoxicarbonila Trt tritila Xan xantila
[0579] As referências seguintes são aqui incorporadas em sua totalidade por referência neste pedido de patente: EP 0522868 EP 0875569 EP 1295944 EP 1347046 EP 1394274 EP 1394274 EP 1439393 JP 05003790 JP 2004113151 JP 58180487 US 2001/055751 US 2002/034749 US 2002/042366 US 2002/150573 US 2002/193567 US 2003/0228319 US 2003/060612 US 2003/064397 US 2003/065143 US 2003/091580 US 2003/096961 US 2003/105292 US 2003/109676 US 2003/118592 US 2003/119121 US 2003/119122 US 2003/119125 US 2003/119126 US 2003/119128 US 2003/119129 US 2003/119130 US 2003/119131 US 2003/124140 US 2003/124579 US 2003/129192 US 2003/134790-A1 US 2003/143557 US 2003/157089 US 2003/165504 US 2003/185830 US 2003/186372 US 2003/186373 US 2003/194704 US 2003/206918 US 2003/219806 US 2003/224411 US 2003/224454 US 2003/232056 US 2003/232350 US 20030096743 US 20030130189 US 2003096743 US 2003130189 US 2004/0001827 US 2004/005320 US 2004/005538 US 2004/005563 US 2004/005598 US 2004/0101899 US 2004/018553 US 2004/022727 US 2004/044179 US 2004/044180 US 2004/101874 US 2004/197325 US 2004/249130 US 20040018194 US 20040052793 US 20040052793 US 20040121940 US 2005/271615 US 2006/116422 US 4816567 US 5362852 US 5440021 US 5583024 US 5621002 US 5644033 US 5674713 US 5700670 US 5773223 US 5792616 US 5854399 US 5869445 US 5976551 US 6011146 US 6153408 US 6214345 US 6218519 US 6268488 US 6518404 US 6534482 US 6555339 US 6602677 US 6677435 US 6759509 US 6835807 US 7223837 US 7375078 US 7521541 US 7723485 WO 00/012508 WO 00/12507 WO 00/12508 WO 01/16318 WO 01/45746 WO 02/088172 WO 03/026577 WO 03/043583 WO 04/032828 WO 2000/12130 WO 2000/14228 WO 2000/20579 WO 2000/22129 WO 2000/32752 WO 2000/36107 WO 2000/40614 WO 2000/44899 WO 2000/55351 WO 2000/75655 WO 200053216 WO 2001/00244 WO 2001/38490 WO 2001/40269 WO 2001/40309 WO 2001/41787 WO 2001/46232 WO 2001/46261 WO 2001/48204 WO 2001/53463 WO 2001/57188 WO 2001/62794 WO 2001/66689 WO 2001/72830 WO 2001/72962 WO 2001/75177 WO 2001/77172 WO 2001/88133 WO 2001/90304 WO 2001/94641 WO 2001/98351 WO 2002/02587 WO 2002/02624 WO 2002/06317 WO 2002/06339 WO 2002/101075 WO 2002/10187 WO 2002/102235 WO 2002/10382 WO 2002/12341 WO 2002/13847 WO 2002/14503 WO 2002/16413 WO 2002/16429 WO 2002/22153 WO 2002/22636 WO 2002/22660 WO 2002/22808 WO 2002/24909 WO 2002/26822 WO 2002/30268 WO 2002/38766 WO 2002/54940 WO 2002/59377 WO 2002/60317 WO 2002/61087; WO 2002/64798 WO 2002/71928 WO 2002/72596 WO 2002/78524 WO 2002/81646 WO 2002/83866 WO 2002/86443 WO 2002/88170 WO 2002/89747 WO 2002/92836 WO 2002/94852 WO 2002/98358 WO 2002/99074 WO 2002/99122 WO 2003/000842 WO 2003/002717 WO 2003/003906 WO 2003/003984 WO 2003/004989 WO 2003/008537 WO 2003/009814 WO 2003/014294 WO 2003/016475 WO 2003/016494 WO 2003/018621 WO 2003/022995 WO 2003/023013 WO 2003/024392 WO 2003/025138 WO 2003/025148 WO 2003/025228 WO 2003/026493 WO 2003/029262 WO 2003/029277 WO 2003/029421 WO 2003/034984 WO 2003/035846 WO 2003/042661 WO 2003/045422 WO 2003/048202 WO 2003/054152 WO 2003/055439 WO 2003/055443 WO 2003/062401 WO 2003/062401 WO 2003/072035 WO 2003/072036 WO 2003/077836 WO 2003/081210 WO 2003/083041 WO 2003/083047 WO 2003/083074 WO 2003/087306 WO 2003/087768 WO 2003/088808 WO 2003/089624 WO 2003/089904 WO 2003/093444 WO 2003/097803 WO 2003/101283 WO 2003/101400 WO 2003/104270 WO 2003/104275 WO 2003/105758 WO 2003004529 WO 2003042661 WO 2003104399 WO 2004/000997 WO 2004/001004 WO 2004/009622 WO 2004/011611 WO 2004/015426 WO 2004/016225 WO 2004/020595 WO 2004/022709 WO 2004/022778 WO 2004/027049 WO 2004/031238 WO 2004/032828 WO 2004/032842 WO 2004/040000 WO 2004/043361 WO 2004/043963 WO 2004/044178 WO 2004/045516 WO 2004/045520 WO 2004/045553 WO 2004/046342 WO 2004/047749 WO 2004/048938 WO 2004/053079 WO 2004/063355 WO 2004/063362 WO 2004/063709 WO 2004/065577 WO 2004/074320 WO 2004000221 WO 2004020583 WO 2004042346 WO 2004065576 WO 2005/023814 WO 2005/082023 WO 2005/085251 WO 2006/111759 WO 2007/044515 WO 2007/085930 WO 2009/052249 WO 2010/091150 WO 91/02536 WO 92/07574 WO 92/17497 WO 94/10312 WO 94/28931 WO 9630514 WO 97/07198 WO 97/44452 WO 98/13059 WO 98/37193 WO 98/40403 WO 98/51805 WO 98/51824 WO 99/28468 WO 99/46284 WO 99/58658 Am. 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Claims (29)
1. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que possui a Fórmula (A):
em que as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3; R2 é independentemente selecionado dentre H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcionalmente ainda selecionado dentre halo ou dihalo; em que RD é independentemente selecionado dentre R, CO2R, COR, CHO, CO2H e halo; R6 e R9 são independentemente selecionados dentre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo; R7 é independentemente selecionado dentre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, C3H9Sn e halo; Y é selecionado dentre uma ligação simples e um grupo das Fórmulas A1 ou A2: 
em que N mostra onde o grupo se liga ao N10 da porção PBD; RL1 e RL2 são independentemente selecionados dentre H e metila, ou junta-mente com o átomo de carbono ao qual eles são ligados formam um grupo ciclopro- pileno; CBA representa um agente de ligação celular que é um anticorpo ou um fra-gmento ativo do mesmo; Q é independentemente selecionado dentre O, S e NH; R11 é H ou R ou, quando Q for O, SO3M, em que M é um cátion de metal; cada R e R’ é independentemente selecionado dentre os grupos C1-12 alqui-la, C3-20 heterociclila e C5-20 arila opcionalmente substituídos, e opcionalmente em relação ao grupo NRR’, R e R’ juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído; em que R12, R16, R19 e R17 são conforme definidos para R2, R6, R9 e R7, res-pectivamente; em que R" é um grupo C3-12 alquileno, cuja cadeia pode estar interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), N-metila e/ou anéis aromá-ticos, por exemplo, benzeno ou piridina, em que os anéis são opcionalmente substi-tuídos; X e X’ são independentemente selecionados dentre O, S e N(H).
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fa-to de que ambos RL1 e RL2 são H.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fa-to de que um dentre RL1 e RL2 é H e o outro é metila.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é uma ligação simples.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que R9e R19 são H, e/ou R6 e R16 são H.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que R7 e R17 são ambos OR7A, em que R7A é C1-4 alquila opcionalmente substituída.
7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fa-to de que R7A é metila.
8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que X é O.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que R11 é H.
10. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que há uma ligação dupla entre C2 e C3 em cada unidade monomérica, e em que R2 e R12 são independentemente R.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R12 são independentemente C5-20 arila opcionalmente substituída.
12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R12 são independentemente selecionados dentre =O, =CH2, =CH-RD e =C(RD)2.
13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R12 são =CH2.
14. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que R" é um grupo C3 alquileno ou um grupo C5 alquileno.
15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação celular é um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo, e em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo para um antígeno associado a tumor.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo que se liga a um ou a mais antígenos associados a tumor ou receptores da superfície celular, selecio-nados dentre (1)-(36): (1) BMPR1B (receptor de proteínas morfogenéticas ósseas tipo IB); (2) E16 (LAT1, SLC7A5); (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata); (4) 0772P (CA125, MUC16); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, me- sotelina); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família carreadora de solutos 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador 3b de fosfato dependente de sódio tipo II); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semafo- rina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semafori- na) 5B); (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 gene); (9) ETBR (receptor de endotelina tipo B); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao câncer de próstata, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata 2, proteína das seis trans- membranas da próstata); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor de potencial transitório de canais de cátions, subfamília M, membro 4); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento deri-vado do teratocarcinoma); (14) CD21 (CR2 (receptor do complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor do ví-rus Epstein Barr) ou Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (associado à imunoglobulina beta), B29); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de ancoragem fosfatase contendo domínio SH2), SPAP1B, SPAP1C); (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20Rα; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (receptor do fator ativador de células B, receptor BLyS 3, BR3); (27) CD22 (isoforma CD22-B do receptor de células B); (28) CD79a (CD79A, CD79α, associado à imunoglobulina alfa); (29) CXCR5 (receptor 1 do linfoma de Burkitt); (30) HLA-DOB (subunidade beta de moléculas de MHC classe II (antígeno Ia)); (31) P2X5 (Receptor purinérgico P2X tipo 5 de canais iônicos ativados por li- gantes); (32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciação de células B, Lyb-2); (33) LY64 (antígeno 64 de linfócitos (RP105), proteína da membrana tipo I da família de repetições ricas em leucina (LRR)); (34) FcRH1 (proteína 1 semelhante ao receptor Fc); (35) IRTA2 (superfamília de receptores de imunoglobulinas associados à translocação 2); e (36) TENB2 (proteoglicano transmembrana putativo).
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo construído com cisteína.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é trastuzumab.
19. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o Ab é um anticorpo anti-HER2, um anti-Steap1 ou um anti-CD22.
20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga de fármaco (p) de fármacos (D) para o anticorpo (Ab) é um nú-mero inteiro de 1 a 8.
21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma mistura dos compostos conjugados anticorpo-fármaco, em que a carga média de fármaco por anticorpo na mistura de compostos conjuga-dos anticorpo-fármaco é de 2 a 5.
22. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em terapia.
23. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença proli- ferativa em um indivíduo.
24. Conjugado, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é câncer.
25. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende o conjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um agente quimioterápico.
27. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que possui a Fórmula (D):
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: as linhas tracejadas indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3; R2, R6, R7, R9, R12, R16, R17, R19, X, X’, R’’, Y, RL1 e RL2 são conforme defini-dos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
28. Composto, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que é:
29. Composto, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que é:
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Ipc: A61K 47/68 (2017.01), C07D 487/04 (2006.01), C07D |
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B25C | Requirement related to requested transfer of rights |
Owner name: SPIROGEN SARL (CH) ; GENENTECH, INC (US) Free format text: A FIM DE ATENDER A TRANSFERENCIA, REQUERIDA ATRAVES DA PETICAO NO 860160061517 DE 18/03/2016, E NECESSARIO APRESENTAR A TRADUCAO JURAMENTADA DO DOCUMENTO, ALEM DA GUIA DE CUMPRIMENTO DE EXIGENCIA. |
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| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: GENENTECH, INC (US) ; MEDIMMUNE LIMITED (GB) |
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
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| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/10/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |