CN114341162A - 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及例如拓扑异构酶I抑制剂的细胞毒素的肽缀合物，其适用于治疗例如癌症的疾病。

Description

作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
技术领域
本发明涉及例如拓扑异构酶I抑制剂的细胞毒素的肽缀合物，其适用于治疗例如癌症的疾病。
发明背景
癌症是一组以细胞生长的异常控制为特征的疾病。仅在美国，癌症的年发病率估计超过160万。尽管手术、放射、化学疗法和激素已用于治疗癌症，但其仍是美国第二大主要死因。据估计每年约600,000名美国人将死于癌症。
通过全身施用医药剂来治疗人类的癌症通常通过减缓或终止作为癌细胞特征的不受控复制来起作用。一类此类药剂是拓扑异构酶I抑制剂。拓扑异构酶1酶类用于松弛超螺旋DNA和减轻DNA螺旋约束并在转录调节中起作用。参见Li,M.,Genomics ProteomicsBioinformatics 14(2016),166-171。拓扑异构酶I因其在DNA复制和转录中的动态功能，而对哺乳动物系统的发育至关重要。然而，由于其在转录调节中的直接作用，拓扑异构酶I功能障碍可导致细胞功能异常。参见Li,M.,Genomics Proteomics Bioinformatics 14(2016),166-171。因此，若干人类疾病(例如癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病)与拓扑异构酶I调节和活性有关。
已开发出拓扑异构酶I的抑制剂并且将继续开发为抗癌剂。特别是，拓扑异构酶I抑制剂广泛用于治疗结肠直肠癌、胃癌和其他癌症。参见Ogitani,Bioorg.Med.Chem.Lett.26(2016),5069-5072。尽管拓扑异构酶I抑制剂可用于治疗癌症，但所述化合物也表现出包括嗜中性粒细胞减少症和严重腹泻的副作用。将拓扑异构酶抑制剂优先递送至这些患病组织可避免这些严重副作用。因此，需要将拓扑异构酶I抑制剂更具选择性地递送至患病组织。
发明内容
本公开尤其提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中构成变量在本文中进行定义。
本公开进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开的化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开还提供了通过向需要治疗的人类或其他哺乳动物施用治疗有效量的本公开的化合物来治疗疾病或疾患(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，所述疾病或疾患的特征在于酸性或缺氧性患病组织。
本公开还提供了本文所描述的化合物的用途，其用以制造用于疗法的药剂。本公开还提供了适用于疗法的本文所描述的化合物。
本公开还提供了用于合成本公开的化合物的方法和可用于这些方法的中间体。
附图说明
图1示出在大鼠中在单一IV给药5mg/kg的化合物11之后，化合物11和释放的依喜替康(exatecan)的血浆浓度的曲线图(数据表示为平均值±SEM)。
图2示出在小鼠中在单一IP给药10mg/kg的化合物11之后，肿瘤和骨髓中的肽浓度的曲线图(数据表示为平均值±SEM)。
图3示出在给药2.6和5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于10、20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于1.15和2.3mg/kg依喜替康)，每天一次给药四天之后，荷瘤裸小鼠的股骨的总骨髓计数的图表(数据表示为平均值±SEM)。
图4A示出在给药媒介物或5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于2.3mg/kg依喜替康)，每天一次给药四天之后所切除的荷瘤裸小鼠的胃。
图4B示出在给药5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于2.3mg/kg依喜替康)，每天一次给药持续四天之后的原位荷瘤裸小鼠的胃。
图5A示出在荷有HCT116结肠直肠侧腹肿瘤的裸小鼠中，由给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11产生的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。
图5B显示在荷有HCT116结肠直肠侧腹肿瘤的裸小鼠中，给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11的卡普兰迈耶(Kaplan Meier)生存曲线。
图6A示出化合物11在荷有MKN45 HER2阴性胃癌侧腹肿瘤的裸小鼠中的单一药剂功效。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续两周。
图6B显示在荷有MKN45 HER2阴性胃癌侧腹肿瘤的裸小鼠中，给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11的卡普兰迈耶生存曲线。
图7A示出在荷有JIMT-1HER2中度乳腺癌侧腹肿瘤的SCID小鼠中，由给药化合物11产生的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。
图7B示出在用化合物11给药的荷有JIMT-1HER2中度乳腺癌侧腹肿瘤的SCID小鼠中的体重变化百分比的曲线图。
图8A示出在用化合物11给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠中的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。
图8B示出在用化合物11给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠中，相对于第0天的体重变化百分比的曲线图。
图9A示出用化合物11和他拉唑帕尼(talazoparib)给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠的平均肿瘤体积的曲线图。动物用化合物11经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周并且用他拉唑帕尼经口给药每天一次，持续18天。
图9B示出用化合物11和他拉唑帕尼给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠的相对于第0天的体重变化百分比的曲线图。
图10示出在16h内由用10mM谷胱甘肽处理引起的化合物11和化合物29的降解的图表。如图10中所展示，在类似谷胱甘肽暴露下，化合物29比化合物11释放得更快。
具体实施方式
本文提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8是小分子拓扑异构酶I靶向部分，其结合至拓扑异构酶I；并且
Q是接头，其共价连接至部分R7和R8。
本文还提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是能够选择性地递送R8Q-穿过具有pH小于约6.0的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜的肽；
R8是小分子拓扑异构酶I靶向部分，其结合至拓扑异构酶I；并且
Q是接头，其共价连接至部分R7和R8。
本文提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000051
Figure BDA0003506402190000061
Figure BDA0003506402190000071
Figure BDA0003506402190000081
Figure BDA0003506402190000091
Figure BDA0003506402190000101
Figure BDA0003506402190000111
Figure BDA0003506402190000121
Q是接头，其共价连接至部分R7和R8。
本文提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000122
Figure BDA0003506402190000131
Figure BDA0003506402190000141
Figure BDA0003506402190000151
Figure BDA0003506402190000161
Figure BDA0003506402190000171
Figure BDA0003506402190000181
并且
Q是接头，其共价连接至部分R7和R8。
本文提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000182
Figure BDA0003506402190000191
Figure BDA0003506402190000201
Figure BDA0003506402190000211
Figure BDA0003506402190000221
Figure BDA0003506402190000231
Figure BDA0003506402190000241
Q选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000242
Figure BDA0003506402190000251
Figure BDA0003506402190000261
Figure BDA0003506402190000271
Figure BDA0003506402190000281
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9、R10、R11和R12各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-10元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R5和R6与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
R13是H或C1-6烷基；
A是H或C1-4烷基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤烷基、OH、CN、NO2和CO2CH3；其中所述C1-6烷基和C2-6烯基各自任选地被OH、CN、NO2或CO2CH3取代；
Figure BDA0003506402190000301
是C6-10芳基或5-10元杂芳基；其中所述5-10元杂芳基具有至少一个成环碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的成环杂原子；
环G是C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
[N,O,S]是NH、O或S；
[N,O]是NH或O；
[C,N,O]是CRXRY、NH或O；并且
每个RX和RY独立地选自H和C1-4烷基。
本文提供了一种式(I)化合物：
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000311
Figure BDA0003506402190000321
Figure BDA0003506402190000331
Figure BDA0003506402190000341
Figure BDA0003506402190000351
Figure BDA0003506402190000361
Q选自由以下组成的组：
Figure BDA0003506402190000362
Figure BDA0003506402190000371
Figure BDA0003506402190000381
Figure BDA0003506402190000391
Figure BDA0003506402190000401
Figure BDA0003506402190000411
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9、R10、R11和R12各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基和5-10元杂芳基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R5和R6与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
R13是H或C1-6烷基；
A是H或C1-4烷基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤烷基、OH、CN、NO2和CO2CH3；其中所述C1-6烷基和C2-6烯基各自任选地被OH、CN、NO2或CO2CH取代；
Figure BDA0003506402190000421
是C6-10芳基或5-10元杂芳基；其中所述5-10元杂芳基具有至少一个成环碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的成环杂原子；
[N,O,S]是NH、O或S；
[N,O]是NH或O；
[C,N,O]是CRXRY、NH或O；并且
每个RX和RY独立地选自H和C1-4烷基。
在一些实施方案中，Q的左手侧连接至R8并且Q的右手侧连接至R7。
在一些实施方案中，Q的二硫化物部分的硫原子是R7的半胱氨酸残基的一部分。
如本文所使用，“肽”是指由天然存在的氨基酸残基和任选地一个或多个非天然存在的氨基酸构成的包含10-50个氨基酸序列的靶向部分。在一些实施方案中，R7的肽是20至40个、20至30个氨基酸或30至40个残基的肽。适用于本发明的化合物的肽是可经由响应于环境pH变化的构象变化或二级结构变化而插入细胞膜的那些肽。以这种方式，肽可靶向酸性组织并且响应于低胞外pH将极性、细胞不可渗透分子选择性地易位穿过细胞膜。在一些实施方案中，肽能够将缀合部分(例如，R8Q-)选择性地递送穿过具有pH小于约6.0的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜。在一些实施方案中，肽能够将缀合部分(例如，R8Q-)选择性地递送穿过具有pH小于约6.5的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜。在一些实施方案中，肽能够将缀合部分(例如，R8Q-)选择性地递送穿过具有pH小于约5.5的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜。在一些实施方案中，肽能够将缀合部分(例如，R8Q-)选择性地递送穿过具有pH在约5.0与约6.0之间的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜。
在某些实施方案中，R7的肽包括半胱氨酸残基，所述残基可形成与待递送穿过细胞膜的有效负载部分(例如，R8Q-)连接的位点。在一些实施方案中，R7经由R7的半胱氨酸残基连接至Q。在一些实施方案中，半胱氨酸残基的硫原子可形成含二硫键的接头Q的二硫键的一部分。
可基于pH发生构象变化并插入细胞膜的合适的肽描述于例如美国专利8,076,451和9,289,508(其中的每一者通过引用整体并入本文)。其他合适的肽描述于例如Weerakkody等人,PNAS 110(15),5834-5839(2013年4月9日)，其也通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，R7是包含以下序列中的至少一者的肽：
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO.1；Pv1)、
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO.2；Pv2)，和
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ ID NO.3；Pv3)；
Ac-AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTKCG(SEQ ID NO.4；Pv4)；和
AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTC(SEQ ID No.5；Pv5)；
其中R7经由R7的半胱氨酸残基连接至Q。
在一些实施方案中，R7是包含以下序列中的至少一者的肽：
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO.1；Pv1)、
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO.2；Pv2)，和
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ ID NO.3；Pv3)，
其中R7经由R7的半胱氨酸残基连接至Q。
在一些实施方案中，R7是包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ IDNO.1；Pv1)的肽。
在一些实施方案中，R7是包含序列AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQID NO.2；Pv2)的肽。
在一些实施方案中，R7是包含序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ IDNO.3；Pv3)的肽。
在一些实施方案中，R7是包含序列Ac-AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTKCG(SEQ ID NO.4；Pv4)的肽。
在一些实施方案中，R7是包含序列AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTC(SEQ ID NO.5；Pv5)的肽。
在一些实施方案中，R7是由序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO.1；Pv1)组成的肽。
在一些实施方案中，R7是由序列AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ IDNO.2；Pv2)组成的肽。
在一些实施方案中，R7是由序列ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ IDNO.3；Pv3)组成的肽。
在一些实施方案中，R7是由序列Ac-AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTKCG(SEQ ID NO.4；Pv4)组成的肽。
在一些实施方案中，R7是由序列AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTC(SEQID NO.5；Pv5)组成的肽。
在一些实施方案中，R7是包含至少一个选自如表1中所示的SEQ ID NO:6至SEQ IDNO:311的序列的肽。
在一些实施方案中，R7是由选自如表1中所示的SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:311的序列组成的肽。
表1.额外的R7序列
Figure BDA0003506402190000461
Figure BDA0003506402190000471
Figure BDA0003506402190000481
Figure BDA0003506402190000491
Figure BDA0003506402190000501
Figure BDA0003506402190000511
Figure BDA0003506402190000521
Figure BDA0003506402190000531
Figure BDA0003506402190000541
通过用半胱氨酸代替非半胱氨酸残基或将半胱氨酸残基附加至N末端或C末端，可用于本发明的所述肽中的任一者可经修饰以包括半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，R7的肽是构象上受限的肽。构象上受限的肽可包括例如巨环肽和钉合肽(stapled peptide)。钉合肽是由两个氨基酸侧链之间的共价键约束从而形成肽巨环的肽。构象上受限的肽描述于例如Guerlavais等人,Annual Reports in MedicinalChemistry 2014,49,331-345；Chang等人,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(2013),110(36),E3445-E3454；Tesauro等人,Molecules 2019,24,351-377；Dougherty等人,Journal of Medicinal Chemistry(2019),62(22),10098-10107；和Dougherty等人,Chemical Reviews(2019),119(17),10241-10287中，所述文献中的每一者通过引用整体并入本文。
术语“小分子拓扑异构酶I靶向部分”或“拓扑异构酶I抑制剂”是指结合至拓扑异构酶I的化学基团。小分子拓扑异构酶I靶向部分可为衍生自抑制拓扑异构酶I的活性的化合物的基团。拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱(camptothecin)及其衍生物和类似物，例如奥波替康(opotecan)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、司拉替康(silatecan)(DB-67，AR-67)、科西替康(cositecan)(BNP-1350)、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)(ST1481)、贝洛替康(belotecan)(CKD-602)、卢比替康(rubitecan)、拓扑替康(topotecan)、德鲁替康(deruxtecan)和依喜替康。拓扑异构酶抑制剂描述于例如Ogitani,Bioorg.Med.Chem.Lett.26(2016),5069-5072；Kumazawa,E.,Cancer ChemotherPharmacol 1998,42:210-220；Tahara,M,Mol Cancer Ther 2014,13(5):1170-1180；Nakada,T.,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 2016,26:1542-1545中。
部分Q是共价连接充当肽与拓扑异构酶I抑制剂之间的系链的R7和R8的连接基团，当缀合物或其部分在细胞内部时，所述系链可被裂解。在一些实施方案中，Q是具有1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5个链原子的链，其任选地被1至10个Rq取代基取代，并且其中Q的一个或多个链碳原子可被氧化以形成羰基(C＝O)，并且其中一个或多个N和S链原子可各自任选地被氧化以形成氧化胺、亚砜或磺酰基；其中
每个Rq独立地选自OH、CN、-COOH、NH2、卤基、C1-6卤烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤烷氧基、C1-6烷硫基、苯基、5-6元杂芳基、4-6元杂环烷基、C3-6环烷基、NH(C1-6烷基)和N(C1-6烷基)2，其中Rq的C1-6烷基、苯基、C3-6环烷基、4-6元杂环烷基和5-6元杂芳基各自任选地被卤基、OH、CN、-COOH、NH2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷基、C1-4卤烷氧基、苯基、C3-10环烷基、5元或6元杂芳基或4-6元杂环烷基取代；并且
两个Rq基团与其所连接的链原子一起可形成苯基、5-6元杂芳基、4-6元杂环烷基或C3-6环烷基环。
在一些实施方案中，Rq独立地选自OH、CN、-COOH、NH2、卤基、C1-6卤烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤烷氧基、NH(C1-6烷基)和N(C1-6烷基)2。
在一些实施方案中，Q选自：
Figure BDA0003506402190000561
Figure BDA0003506402190000571
Figure BDA0003506402190000581
Figure BDA0003506402190000591
Figure BDA0003506402190000601
在一些实施方案中，Q是：
Figure BDA0003506402190000602
在一些实施方案中，Q是：
Figure BDA0003506402190000611
在一些实施方案中，Q是：
Figure BDA0003506402190000612
在一些实施方案中，Q是：
Figure BDA0003506402190000613
在一些实施方案中，Q是：
Figure BDA0003506402190000614
在一些实施方案中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H和C1-4烷基、卤基、CN、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
在一些实施方案中：
R1、R2、R3和R4各自独立地选自H和C1-4烷基；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-10环烷基或4-10元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
在一些实施方案中，R1和R2各自独立地选自H和甲基，并且R3、R4、R5和R6各自是氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自H和甲基，并且R5和R6各自是氢。
在一些实施方案中，R1和R2各自独立地选自H和甲基。
在一些实施方案中，R3和R4各自独立地选自H和甲基。
在一些实施方案中，R1和R2各自是H。
在一些实施方案中，R1和R2与其所连接的碳原子一起形成任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代的C3-7环烷基：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
在一些实施方案中，R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基。
在一些实施方案中，R1和R2与其所连接的碳原子一起形成环丁基。
在一些实施方案中，R3和R4各自是H。
在一些实施方案中，R1和R3与其所连接的碳原子一起形成任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代的C3-7环烷基：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
在一些实施方案中，R1和R3与其所连接的碳原子一起形成环戊基、环己基、环庚基、1,2,3,4-四氢萘基、四氢呋喃基或四氢吡喃基。
在一些实施方案中，R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基。
在一些实施方案中，R1和R3与其所连接的碳原子一起形成环己基。
在一些实施方案中，R2和R4各自是H。
在一些实施方案中，R5和R6各自是H。
在一些实施方案中，R9、R10、R11和R12各自独立地选自H和甲基。
在一些实施方案中，本发明的化合物是式(II)化合物：
Figure BDA0003506402190000651
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8是拓扑异构酶I抑制剂；
环Z是单环C5-7环烷基环或单环5-7元杂环烷基环；
每个RZ独立地选自C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或两个相邻RZ与其所连接的原子一起形成稠合单环C5-7环烷基环、稠合单环5-7元杂环烷基环、稠合C6-10芳环或稠合6-10元杂芳环，其中的每一者任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、OH、CN和NO2；并且
n是0、1、2或3。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R7是包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列的肽。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R7是Pv1、Pv2、Pv3、Pv4或Pv5。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R7经由R7的半胱氨酸残基连接至核，其中式II中的二硫化物部分的硫原子中的一者衍生自半胱氨酸残基。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R8是喜树碱、奥波替康、伊立替康(CPT-11)、司拉替康(DB-67，AR-67)、科西替康(BNP-1350)、勒托替康、吉马替康(ST1481)、贝洛替康(CKD-602)、卢比替康、拓扑替康、德鲁替康或依喜替康。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R8是依喜替康。
在式(II)化合物的一些实施方案中，R8经由N原子连接至核。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是单环C5-7环烷基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是环戊基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是环己基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是环庚基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是单环5-7元杂环烷基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是5元杂环烷基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是6元杂环烷基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，环Z是7元杂环烷基环。
在式(II)化合物的一些实施方案中，两个相邻RZ与其所连接的原子一起形成稠合单环C5-7环烷基环、稠合单环5-7元杂环烷基环、稠合C6-10芳环或稠合6-10元杂芳环，其中的每一者任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
在式(II)化合物的一些实施方案中，n是0。
在式(II)化合物的一些实施方案中，n是1。
在式(II)化合物的一些实施方案中，n是2。
在式(II)化合物的一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，本发明的化合物是式(III)、式(IV)或式(V)的化合物：
Figure BDA0003506402190000681
或其药学上可接受的盐，其中R7、R8、RZ和n如上文关于式(II)的实施方案中的任一者中所定义。
在一些实施方案中，式(I)化合物选自：
Figure BDA0003506402190000682
Figure BDA0003506402190000691
Figure BDA0003506402190000701
或前述中的任一者的药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)化合物选自：
Figure BDA0003506402190000702
Figure BDA0003506402190000711
Figure BDA0003506402190000721
Figure BDA0003506402190000731
Figure BDA0003506402190000741
Figure BDA0003506402190000751
在一些实施方案中，本文提供了一种具有式(IIA)的化合物：
Figure BDA0003506402190000752
或其盐，其中：
Cy1是C6-10芳基或5-10元杂芳基；其中所述5-10元杂芳基具有至少一个成环碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的成环杂原子；并且其中所述C6-10芳基和5-10元杂芳基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、OH、C1-6烷氧基、CN和NO2；
并且R8、环Z、RZ和n如本文所定义。
在一些实施方案中，Cy1是5-10元杂芳基。在一些实施方案中，Cy1是吡啶基。在一些实施方案中，Cy1是苯基。
在一些实施方案中，式(IIA)化合物具有结构：
Figure BDA0003506402190000761
或其盐。
在一些实施方案中，本文提供了一种式(IIA)化合物：
Figure BDA0003506402190000762
或其盐，其用于制备本发明的化合物(例如，式(I)或式(II)的化合物)，其中Cy1、R8、环Z、RZ、Ra1、Rb1、Rc1、Rd1和n如本文所定义。
在一些实施方案中，本文提供了一种具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003506402190000771
或其盐，其用于制备本发明的化合物(例如，式(I)或式(II)的化合物)。
本发明的分子可例如用诸如荧光团、放射性同位素等的探针标记。在一些实施方案中，探针是荧光探针，例如LICOR。荧光探针可包括在光激发时可重新发射光的任何部分(例如，荧光团)。
氨基酸由如下IUPAC缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、缬氨酸(Val；V)。
术语“Pv1”意指ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:1)。
术语“Pv2”意指AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO:2)。
术语“Pv3”意指ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ ID NO:3)。
术语“Pv4”意指ID NO:4)。
术语“Pv5”意指AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTC(SEQ ID NO:5)。
在本发明的化合物中，肽R7通过包含硫原子的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)连接至接头Q中的二硫化物部分。通常，作为与肽R7的连接点的接头Q中的二硫化物部分的硫原子衍生自肽的氨基酸残基，例如衍生自半胱氨酸残基。
术语“酸性和/或缺氧性外套膜”是指所讨论的患病组织中细胞的环境，其具有低于7.0并且优选低于6.5的pH。酸性或缺氧性外套膜更优选具有约5.5的pH并且最优选具有约5.0的pH。式(I)化合物以pH依赖性方式插入具有酸性和/或缺氧性外套膜的细胞膜以将R8Q插入至细胞中，随即裂解二硫键接头以递送游离R8H。由于式(I)化合物是pH依赖性的，因此其仅在细胞周围存在酸性或缺氧性外套膜的情况下优先插入细胞膜而不插入不具有酸性或缺氧性外套膜的“正常”细胞的细胞膜。具有酸性或缺氧性外套膜的细胞的实例是癌细胞。
如本文所使用的术语“pH敏感性”或“pH依赖性”是指肽R7或者是指将肽R7或本发明的化合物插入细胞膜的模式，意指所述肽对具有酸性或缺氧性外套膜的细胞膜脂质双层比在中性pH下的膜脂质双层具有更高亲和力。因此，当细胞膜脂质双层具有酸性或缺氧性外套膜(“患病”细胞)时，本发明的化合物优先插入穿过细胞膜以将R8Q插入至细胞内部(并因此如上文所描述递送R8H)，但当外套膜(细胞膜脂质双层的环境)并非酸性或缺氧性时(“正常”细胞)，不插入穿过细胞膜。据认为这种优先插入是由于肽R7形成螺旋构型而实现的，其有助于膜插入。
进一步应了解，出于清楚起见而描述于单独实施方案的上下文中的某些本发明特征也可以组合形式提供于单一实施方案中(同时实施方案旨在是组合的，如同以多种相关形式书写)。相反，为简洁起见而描述于单一实施方案的上下文中的各种本发明特征也可单独地或以任何适合的子组合形式提供。因此，考虑描述为式(I)化合物的实施方案的特征可以任何合适的组合形式组合。
在本说明书中的不同位置处，化合物的某些特征以组或范围形式公开。具体来说，期望此公开内容包括此类组和范围的成员的每一个别子组合。例如，具体来说，术语“C1-6烷基”旨在个别地公开(但不限于)甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
其中n是整数的术语“n元”通常描述部分中成环原子的数目，其中成环原子的数目是n。例如，哌啶基是6元杂环烷基环的实例，吡唑基是5元杂芳环的实例，吡啶基是6元杂芳环的实例并且1,2,3,4-四氢-萘是10元环烷基的实例。
在本说明书中的不同位置处，可描述定义二价连接基团的变量。具体来说，期望每个连接取代基包括连接取代基的前向和后向形式。例如，-NR(CR'R”)n-包括-NR(CR'R”)n-和-(CR'R”)nNR-并且旨在个别地公开每一种形式。当结构需要连接基团时，针对所述基团所列的马库什变量(Markush variable)应理解为连接基团。例如，如果结构需要连接基团并且所述变量的马库什组定义列出“烷基”或“芳基”，则应理解，“烷基”或“芳基”分别表示亚烷基连接基团或亚芳基连接基团。
术语“被取代”意指原子或原子团作为连接至另一基团的“取代基”在形式上置换氢。除非另外指示，否则术语“被取代”是指任何水平的取代，例如单取代、二取代、三取代、四取代或五取代，其中准许此类取代。独立地选择取代基，并且取代可位于任何可以化学方式接近的位置。应理解，给定原子处的取代受价数限制。应理解，给定原子处的取代产生化学稳定分子。短语“任选地被取代”意指未被取代或被取代。术语“被取代”意指氢原子被去除并且被取代基置换。单个二价取代基(例如，氧代基)可置换两个氢原子。
术语“Cn-m”指示包括端点的范围，其中n和m是整数并且指示碳原子数目。实例包括C1-4、C1-6等。
单独或与其他术语组合使用的术语“烷基”是指可为直链或支链的饱和烃基。术语“Cn-m烷基”是指具有n至m个碳原子的烷基。烷基在形式上对应于一个C-H键被烷基与化合物的其余部分的连接点置换的烷烃。在一些实施方案中，烷基含有1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子或1至2个碳原子。烷基部分的实例包括(但不限于)化学基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；高碳数同源物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。
单独或与其他术语组合使用的术语“烯基”是指对应于具有一个或多个碳碳双键的烷基的直链或支链烃基。烯基在形式上对应于一个C-H键被烯基与化合物的其余部分的连接点置换的烯烃。术语“Cn-m烯基”是指具有n至m个碳的烯基。在一些实施方案中，烯基部分含有2至6个、2至4个或2至3个碳原子。实例烯基包括(但不限于)乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、仲丁烯基等。
单独或与其他术语组合使用的术语“炔基”是指对应于具有一个或多个碳碳三键的烷基的直链或支链烃基。炔基在形式上对应于一个C-H键被烷基与化合物的其余部分的连接点置换的炔烃。术语“Cn-m炔基”是指具有n至m个碳的炔基。实例炔基包括(但不限于)乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基等。在一些实施方案中，炔基部分含有2至6个、2至4个或2至3个碳原子。
单独或与其他术语组合使用的术语“亚烷基”是指二价烷基连接基团。亚烷基在形式上对应于两个C-H键被亚烷基与化合物的其余部分的连接点置换的烷烃。术语“Cn-m亚烷基”是指具有n至m个碳原子的亚烷基。亚烷基的实例包括(但不限于)乙-1,2-二基、乙-1,1-二基、丙-1,3-二基、丙-1,2-二基、丙-1,1-二基、丁-1,4-二基、丁-1,3-二基、丁-1,2-二基、2-甲基-丙-1,3-二基等。
术语“氨基”是指式-NH2的基团。
单独或与其他术语组合使用的术语“羰基”是指-C(＝O)-基团，其也可书写为C(O)。
术语“氰基”或“腈”是指式-C≡N的基团，其也可书写为-CN。
单独或与其他术语组合使用的术语“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。在一些实施方案中，“卤基”是指选自F、Cl或Br的卤素原子。在一些实施方案中，卤基是F。
如本文所使用的术语“卤烷基”是指其中氢原子中的一者或多者已被卤素原子置换的烷基。术语“Cn-m卤烷基”是指具有n至m个碳原子和至少一个至多{2(n-m)+1}个可相同或不同的卤素原子的Cn-m烷基。在一些实施方案中，卤素原子是氟原子。在一些实施方案中，卤烷基具有1至6个或1至4个碳原子。实例卤烷基包括CF3、C2F5、CHF2、CH2F、CCl3、CHCl2、C2Cl5等。在一些实施方案中，卤烷基是氟烷基。
单独或与其他术语组合使用的术语“卤烷氧基”是指式-O-卤烷基的基团，其中卤烷基如上文所定义。术语“Cn-m卤烷氧基”是指其中卤烷基具有n至m个碳的卤烷氧基。实例卤烷氧基包括三氟甲氧基等。在一些实施方案中，卤烷氧基具有1至6个、1至4个或1至3个碳原子。
术语“氧代基”是指作为二价取代基的氧原子，其在连接至碳时形成羰基，或连接至杂原子而形成亚砜或砜基团或N-氧化物基团。在一些实施方案中，杂环基可任选地被1或2个氧代(＝O)取代基取代。
关于成环N原子的术语“被氧化”是指成环N-氧化物。
关于成环S原子的术语“被氧化”是指成环磺酰基或成环亚磺酰基。
术语“芳族”是指具有一个或多个具有芳族特性(即，具有(4n+2)个离域π(pi)电子，其中n是整数)的多不饱和环的碳环或杂环。
单独或与其他术语组合使用的术语“芳基”是指可为单环或多环(例如，具有2个稠环)的芳族烃基。术语“Cn-m芳基”是指具有n至m个环碳原子的芳基。芳基包括例如苯基、萘基等。在一些实施方案中，芳基具有6至约10个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有6个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有10个碳原子。在一些实施方案中，芳基是苯基。
单独或与其他术语组合使用的术语“杂芳基”或“杂芳族”是指具有至少一个选自硫、氧和氮的杂原子环成员的单环或多环芳族杂环。在一些实施方案中，杂芳环具有1、2、3或4个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基部分中的任何成环N可为N-氧化物。在一些实施方案中，杂芳基具有5-14个环原子，其包括碳原子和1、2、3或4个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基具有5-10个环原子，其包括碳原子和1、2、3或4个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基具有5-6个环原子和1或2个独立地选自氮、硫和氧的杂原子环成员。在一些实施方案中，杂芳基是五元或六元杂芳环。在其他实施方案中，杂芳基是八元、九元或十元稠合双环杂芳环。
五元杂芳环是具有五个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如，1、2或3个)环原子独立地选自N、O和S。
六元杂芳环是具有六个环原子的杂芳基，其中一个或多个(例如，1、2或3个)环原子独立地选自N、O和S。
单独或与其他术语组合使用的术语“环烷基”是指非芳族烃环系(单环、双环或多环)，其包括环化的烷基和烯基。术语“Cn-m环烷基”是指具有n至m个环成员碳原子的环烷基。环烷基可包括单环或多环(例如，具有2、3或4个稠环)基团和螺环。环烷基可具有3、4、5、6或7个成环碳(C3-7)。在一些实施方案中，环烷基具有3至6个环成员、3至5个环成员或3至4个环成员。在一些实施方案中，环烷基是单环。在一些实施方案中，环烷基是单环或双环。在一些实施方案中，环烷基是C3-6单环环烷基。环烷基的成环碳原子可任选地被氧化以形成氧代基或硫离子基。环烷基也包括亚环烷基。在一些实施方案中，环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。环烷基的定义中还包括具有一个或多个稠合至环烷基环(即，与环烷基环具有共同键)的芳族环的部分，例如环戊烷、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的环烷基可经由包括稠合芳族环的成环原子的任何成环原子连接。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基等。在一些实施方案中，环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
单独或与其他术语组合使用的术语“杂环烷基”是指非芳族环或环系，其可任选地含有一个或多个作为环结构的部分的亚烯基，其具有至少一个独立地选自氮、硫、氧和磷的杂原子环成员，并且其具有4-10个环成员、4-7个环成员或4-6个环成员。术语“杂环烷基”内包括单环4元、5元、6元和7元杂环烷基。杂环烷基可包括单环或双环(例如，具有两个稠合或桥接环)环系或螺环环系。在一些实施方案中，杂环烷基是具有1、2或3个独立地选自氮、硫和氧的杂原子的单环基团。杂环烷基的成环碳原子和杂原子可任选地被氧化以形成氧代基或硫离子基或其他氧化键(例如，C(O)、S(O)、C(S)或S(O)2、N-氧化物等)或氮原子可被季铵化。杂环烷基可经由成环碳原子或成环杂原子连接。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至3个双键。在一些实施方案中，杂环烷基含有0至2个双键。杂环烷基的定义中还包括具有一个或多个稠合至杂环烷基环(即，与杂环烷基环具有共同键)的芳族环的部分，例如哌啶、吗啉、氮呯等的苯并或噻吩基衍生物。含有稠合芳族环的杂环烷基可经由包括稠合芳族环的成环原子的任何成环原子连接。杂环烷基的实例包括2-吡咯烷基；吗啉基；氮杂环丁烷基；和哌嗪基。
在某些地方，定义或实施方案是指特定环(例如，氮杂环丁烷环、吡啶环等)。除非另外指示，否则这些环可连接至任何环成员，条件是不超出原子的价数。例如，氮杂环丁烷环可在环的任何位置连接，而氮杂环丁烷-3-基环在3位连接。
本文所描述的化合物可为不对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。除非另外指示，否则所有立体异构体，例如对映异构体和非对映异构体都是意指的。含有不对称取代的碳原子的本发明的化合物可以光学活性或外消旋形式分离。本领域中已知如何从光学非活性起始材料制备光学活性形式的方法，例如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可存在于本文所描述的化合物中，并且所有此类稳定异构体都涵盖于本发明中。本发明的化合物的顺式和反式几何异构体经描述并且可以异构体混合物形式或分开的异构体形式分离。
化合物的外消旋混合物的拆分可通过本领域中已知的众多方法中的任一者来进行。一种方法包括使用手性拆分酸进行分步重结晶，所述手性拆分酸是光学活性成盐有机酸。用于分步重结晶方法的合适拆分剂是例如光学活性酸，例如酒石酸的D和L形式、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、杏仁酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性樟脑磺酸(例如β-樟脑磺酸)。适用于分步结晶方法的其他拆分剂包括α-甲基苯甲胺的立体异构纯形式(例如，S和R形式，或非对映异构纯形式)、2-苯基甘氨醇、降麻黄碱(norephedrine)、麻黄碱(ephedrine)、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1,2-二氨基环己烷等。
外消旋混合物的拆分也可通过装填有光学活性拆分剂(例如，二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组合物可通过本领域技术人员来确定。
在一些实施方案中，本发明的化合物具有(R)-构型。在其他实施方案中，化合物具有(S)-构型。在具有超过一个手性中心的化合物中，除非另外指示，否则化合物中的手性中心中的每一者可独立地是(R)或(S)。
本发明的化合物也包括互变异构形式。互变异构形式由单键与相邻双键的交换以及伴随的质子迁移而产生。互变异构形式包括处于具有相同经验式和总电荷的异构质子化状态的质子转移互变异构体。实例质子转移互变异构体包括酮-烯醇对、酰胺-亚氨酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对和其中质子可占据杂环系统的两个或更多个位置的环形形式，例如1H-咪唑和3H-咪唑、1H-1,2,4-三唑、2H-1,2,4-三唑和4H-1,2,4-三唑、1H-异吲哚和2H-异吲哚以及1H-吡唑和2H-吡唑。互变异构形式可处于平衡状态或通过适当取代而在空间上锁定为一种形式。
本发明的化合物也可包括中间体或最终化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同但质量数不同的那些原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。本发明的化合物的一个或多个组成原子可被天然或非天然丰度的原子同位素置换或取代。在一些实施方案中，化合物包括至少一个氘原子。例如，本公开的化合物中的一个或多个氢原子可被氘置换或取代。在一些实施方案中，化合物包括两个或更多个氘原子。在一些实施方案中，化合物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氘原子。使有机化合物中包括同位素的合成方法是本领域中已知的(Alan F.Thomas的Deuterium Labeling in Organic Chemistry(NewYork,N.Y.,Appleton-Century-Crofts,1971；Jens Atzrodt,Volker Derdau,ThorstenFey和Jochen Zimmermann的The Renaissance of H/D Exchange,Angew.Chem.Int.Ed.2007,7744-7765；James R.Hanson的The Organic Chemistry ofIsotopic Labelling,Royal Society of Chemistry,2011)。经同位素标记的化合物可用于各种研究中，例如NMR光谱法、代谢实验和/或测定法。
被例如氘的较重同位素取代可获得由较大代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求，并且因此在某些情况下可为优选的。(A.Kerekes等人,J.Med.Chem.2011,54,201-210；R.Xu等人,J.Label Compd.Radiopharm.2015,58,308-312)。
如本文所使用的术语“化合物”意指包括所描绘结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。术语也意指本发明的化合物，无论其如何例如以合成方式、经由生物过程(例如，代谢或酶转化)或其组合制备。
所有化合物和其药学上可接受的盐均可与例如水和溶剂(例如，水合物和溶剂化物)的其他物质一起存在或可经分离。当呈固态时，本文所描述的化合物及其盐可以各种形式存在，并且可例如呈溶剂化物(包括水合物)的形式。化合物可呈任何固态形式，例如多晶型物或溶剂化物，因此除非另外明确指示，否则本说明书中对化合物及其盐的提及应理解为涵盖化合物的任何固态形式。
在一些实施方案中，本发明的化合物或其盐基本上被分离。“基本上被分离”意指化合物至少部分或基本上与其形成或检测所在的环境分离。部分分离可包括例如富含本发明的化合物的组合物。基本上分离可包括含有按本发明的化合物的重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的组合物或其盐。
短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理益处/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如本文所使用的表述“环境温度”和“室温”是本领域中所理解的，并且通常是指约为进行反应的房间温度的温度，例如反应温度，例如约20℃至约30℃的温度。
本发明也包括本文所描述的化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式而经修饰。药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属盐或有机盐；等等。本发明的药学上可接受的盐包括例如由无毒性无机酸或有机酸形成的母体化合物的无毒性盐。本发明的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性部分或酸性部分的母体化合物合成。一般来说，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸于水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；一般来说，非水性介质如醚、乙酸乙酯、醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(MeCN)是优选的。合适的盐的列表见于Remington's PharmaceuticalSciences,第17版,(Mack Publishing Company,Easton,1985),第1418页；Berge等人,J.Pharm.Sci.,1977,66(1),1-19中，并且见于Stahl等人,Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,and Use,(Wiley,2002)中。在一些实施方案中，本文所描述的化合物包括N-氧化物形式。
合成
本发明的化合物(包括其盐)可使用已知有机合成技术制备，并且可根据众多可能合成路线(例如下文方案中的那些路线)中的任一者合成。
用于制备本发明化合物的反应可在可由有机合成领域的技术人员容易选择的合适溶剂中进行。在进行反应的温度(例如，范围可为溶剂冻结温度至溶剂沸腾温度的温度)下，合适的溶剂可与起始材料(反应物)、中间体或产物基本上不反应。给定反应可在一种溶剂或超过一种溶剂的混合物中进行。取决于特定反应步骤，适用于特定反应步骤的溶剂可由熟练技术人员选择。
本发明化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可容易地确定对保护和脱保护的需求和适当保护基的选择。保护基的化学性质描述于例如Kocienski,Protecting Groups,(Thieme,2007)；Robertson,Protecting GroupChemistry,(Oxford University Press,2000)；Smith等人,March's Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第6版(Wiley,2007)；Peturssion等人,“Protecting Groups in Carbohydrate Chemistry”,J.Chem.Educ.,1997,74(11),1297；和Wuts等人,Protective Groups in Organic Synthesis,第4版,(Wiley,2006)中。
反应可根据本领域中已知的任何合适的方法来进行监测。例如，产物形成可通过光谱手段(例如核磁共振光谱法(例如，1H或13C)、红外光谱法、分光光度法(例如，UV-可见光)、质谱法)或通过色谱方法(例如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法(TLC))来进行监测。
以下方案提供关于制备本发明的化合物的一般指导。本领域技术人员将理解，可使用有机化学的常识修改或优化方案中所示的制备，以制备各种本发明化合物。
可例如使用如以下方案中所说明的方法制备式(I)化合物。
方案1：碳酸酯和氨基甲酸酯连接的化合物的合成
Figure BDA0003506402190000881
由正交离去基团侧接的中间体II可与亲核R8H化合物反应以得到中间体III。中间体III接着可与参与二硫化物交换反应的含硫醇肽(HS-R7)反应以得到最终化合物。下文描述合适的离去基团。
方案2：硫代丙酸酯连接的缀合物的合成1
Figure BDA0003506402190000891
具有先前安装的离去基团1和2的丙酸酯二硫化物IV可选择性地与亲核R8-H反应以得到V。这种化合物接着可与R7-SH反应以提供所需缀合物。
方案3：硫代丙酸酯连接的缀合物的合成2
Figure BDA0003506402190000892
硫代酯VI可与亲核R8-H反应以得到丙酸酯硫醇VII。这种化合物可参与二硫化物交换反应以提供中间体VIII。可用R7-SH处理此化合物以提供所需缀合物。
方案4：对苯甲基连接的缀合物的合成1
Figure BDA0003506402190000901
可选择性地保护对氨基苯甲基醇IX的醇基以得到中间体X。此中间体接着可在苯胺位置处与中间体II反应以提供氨基甲酸芳酯XI。可移除保护基得到游离醇XII，其可用活化剂处理以提供含有正交离去基团的中间体XIII。中间体XIII与R8-H的反应可提供中间体XIV，随后用R7-SH处理可得到所需对苯甲基连接的缀合物。
方案5：对苯甲基连接的缀合物的合成
Figure BDA0003506402190000911
4-巯基苄醇XV可在二硫化物交换反应中反应以得到含有离去基团2的4-巯基苯甲醇二硫化物XVI。其余苯甲醇可用适当的羰基化合物处理以提供活化的化合物XVII。此中间体可进一步选择性地与亲核R8-H反应以提供中间体XVIII，其可用R7-SH处理以得到所需缀合物。
方案6：邻苯甲基连接的缀合物的合成
Figure BDA0003506402190000921
2-巯基苯甲醇XXIII可如先前所描述反应以得到所需缀合物。
方案7：肽缀合物的裂解
Figure BDA0003506402190000922
通过在37℃下温育的缓冲液中用过量谷胱甘肽(GSH)处理化合物可实现最终化合物的裂解以释放R8-H。在所需时程下的反相HPLC分析用于追踪裂解的过程。
肽R7可使用首先由Merrifield在J.A.C.S.,第85卷,第2149-2154页(1963)中所描述的固相合成方法来制备，但也可采用其他本领域已知的方法。Merrifield技术是众所周知的并且是制备肽的常用方法。用于固相肽合成的有用技术描述于若干书籍(例如Bodanszky,Springer Verlag 1984的文本“Principles of Peptide Synthesis”)中。这种合成方法涉及将受保护氨基酸逐步加成到通过共价键结合至固体树脂颗粒的生长肽链。通过此程序，通过过滤去除试剂和副产物，因此消除纯化中间体的必要性。这种方法的一般概念取决于链的第一个氨基酸通过共价键连接至固体聚合物，随后以逐步方式一次一个地添加后续受保护氨基酸直至所需序列被组装。最后，从固体树脂支撑物去除受保护肽并裂解掉保护基。
肽R7也可通过发酵，例如通过大肠杆菌(E.coli)的修饰产生。可控制大肠杆菌中的蛋白质生产以产生具有本文公开的R7肽的序列的重组多肽。大肠杆菌中的重组多肽生产描述于以下参考文献中：Zhao,Q.,Xu,W.,Xing,L.等人,Recombinant production ofmedium-to large-sized peptides in Escherichia coli using a cleavable self-aggregating tag.Microb Cell Fact 15,136(2016)；de Marco,Recombinantpolypeptide production in E.coli:towards a rational approach to improve theyields of functional proteins；Microbial Cell Factories 2013,12:101；和Kleine-Grote G.M.,Risse,J.M.,Friehs,K；Secretion of recombinant proteins from E.coli；Eng.Life Sci.2018,18,532-550，其中的每一者通过引用整体并入本文。
氨基酸可连接至任何合适的聚合物。聚合物必须不溶于所使用的溶剂，必须具有稳定的物理形式以便随时过滤，并且必须含有第一个受保护氨基酸可通过共价键紧紧连接的官能团。各种聚合物适用于此目的，例如纤维素、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。
使用方法
本文提供了式(I)化合物在治疗疾病(例如癌症或神经退行性疾病)中的用途。本发明的另一方面是式(I)化合物在治疗涉及酸性或缺氧性患病组织的疾病(例如癌症或神经退行性疾病)中的用途。缺氧和酸中毒是许多疾病过程(包括癌症)的生理标志。在癌症中，缺氧是造成实体肿瘤内酸环境发展的一个机制。因此，氢离子必须从细胞去除(例如，通过质子泵)以维持细胞内的正常pH。由于氢离子的此输出，在与正常细胞相比时，癌细胞在细胞膜脂质双层上的pH梯度通常增加并且胞外环境的pH降低。一种改善细胞毒性剂的功效和治疗指数的方法是充分利用此生理特征以提供将化合物选择性递送至健康组织内的缺氧性细胞。
在本发明的治疗方法中，可以单一药剂形式或与其他形式的疗法(例如在癌症的情况下的电离辐射或细胞毒性剂)组合施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在组合疗法中，如由本领域技术人员将了解，可在其他治疗模式之前、同时或之后施用式(I)化合物。任一治疗方法(单一药剂或与其他形式的疗法的组合)可作为涉及多个剂量或在一段时间内的治疗的治疗过程施用。
可使用本公开的化合物治疗的癌症的实例包括(但不限于)结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌瘤(carcinoma of the endometrium)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或尿道癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)和所述癌症的组合。
在一些实施方案中，可用本公开的化合物治疗的癌症包括膀胱癌、骨癌、神经胶质瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、胰腺癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道肿瘤、头颈癌(上呼吸消化癌)、肠癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、腺癌)、黑素瘤、前列腺癌、直肠癌、肾透明细胞癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌。
在一些实施方案中，可用本公开的化合物治疗的癌症包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如，非小细胞肺癌和小细胞肺癌)。另外，本公开包括可使用本公开的化合物抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。
在一些实施方案中，可使用本公开的化合物治疗的癌症包括(但不限于)实体肿瘤(例如，前列腺癌、结肠癌、食道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、甲状腺癌、神经胶母细胞瘤、肉瘤、膀胱癌等)、血液癌(例如，淋巴瘤、白血病(例如急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、DLBCL、套细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(包括复发性或难治性NHL和复发性滤泡)、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤)和所述癌症的组合。
包含衍生自拓扑异构酶I抑制剂(例如，依喜替康)的拓扑异构酶I靶向部分的本发明的化合物(例如，式(I)化合物)可表现出优于拓扑异构酶I抑制剂自身的某些治疗优势。例如，与施用相应拓扑异构酶I抑制剂(例如，依喜替康)相比，施用式(I)化合物可显示降低的毒性(例如，骨髓或胃毒性)。在一些实施方案中，骨髓毒性是通过受试者样品的总骨髓计数(例如，小鼠股骨中的总骨髓计数)来测量。在一些实施方案中，骨髓毒性是通过骨髓组织中的PAR基化来测量。在一些实施方案中，骨髓毒性是根据总有核骨髓细胞来测量。在一些实施方案中，使用原位和离体两者拍摄的受试者(例如，小鼠)的胃的相片来评定胃毒性。
在某些实施方案中，式(I)化合物或其药学上可接受的盐可与化学治疗剂、靶向癌症疗法、免疫疗法或放射疗法组合使用。药剂可以单一剂型与本发明化合物组合，或药剂可以单独剂型同时或依序施用。在一些实施方案中，与当与相应拓扑异构酶抑制剂(例如，R8-H)组合施用时相比，当与式(I)化合物或其药学上可接受的盐一起施用时，化学治疗剂、靶向癌症疗法、免疫疗法或放射疗法对患者的毒性较低，例如展示降低的骨髓或胃毒性。
合适的化学治疗剂或其他抗癌剂包括例如烷基化剂(包括(但不限于)氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、磺酸烷酯、亚硝基脲和三氮烯)，例如尿嘧啶氮芥、氮芥(chlormethine)、环磷酰胺(CytoxanTM)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、哌泊溴烷(pipobroman)、三亚乙基-三聚氰胺、三亚乙基硫代磷胺、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链脲霉素(streptozocin)、达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)。
与本发明的化合物组合使用的其他合适的药剂包括：达卡巴嗪(DTIC)，任选地与其他化学疗法药物(例如卡莫司汀(BCNU)和顺铂(cisplatin))一起；“达特茅斯方案(Dartmouth regimen)”，其由DTIC、BCNU、顺铂和他莫昔芬(tamoxifen)组成；顺铂、长春碱(vinblastine)和DTIC的组合；或替莫唑胺。根据本发明的化合物也可与免疫疗法药物组合，包括细胞因子，例如干扰素α、白细胞介素2和肿瘤坏死因子(TNF)。
合适的化学治疗剂或其他抗癌剂包括例如抗代谢物(包括(但不限于)叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、喷司他丁(pentostatine)和吉西他滨(gemcitabine)。
合适的化学治疗剂或其他抗癌剂还包括例如某些天然产物和其衍生物(例如，长春花生物碱(vinca alkaloid)、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin))，例如长春碱、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、阿糖胞苷(ara-C)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOLTM)、光神霉素(mithramycin)、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、L-天冬酰胺酶、干扰素(尤其是IFN-a)、依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。
可与本发明的化合物组合施用的其他细胞毒性剂包括例如诺维本(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和屈洛昔芬(droloxafine)。
此外合适的是细胞毒性剂，例如表叶毒素(epidophyllotoxin)；抗赘生性酶；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼(procarbazine)；米托蒽醌(mitoxantrone)；铂配位复合物，例如顺铂和卡铂(carboplatin)；生物反应调节剂；生长抑制剂；抗激素治疗剂；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；喃氟啶(tegafur)；和造血生长因子。
其他抗癌剂包括抗体治疗剂，例如曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin))；共刺激分子(例如CTLA-4、4-1BB和PD-1)的抗体；或细胞因子(IL-10、TGF-α等)的抗体。
其他抗癌剂也包括阻断免疫细胞迁移的那些抗癌剂，例如针对趋化因子受体(包括CCR2和CCR4)的拮抗剂。
其他抗癌剂也包括增强免疫系统的那些抗癌剂，例如佐剂或过继性T细胞转移。
可与本发明的化合物组合施用的抗癌疫苗包括例如树突状细胞、合成肽、DNA疫苗和重组病毒。
与本发明的化合物组合使用的其他合适的药剂包括化学疗法组合，例如用于肺癌和其他实体肿瘤的基于铂的双联体(顺铂或卡铂加吉西他滨；顺铂或卡铂加多烯紫杉醇(docetaxel)；顺铂或卡铂加太平洋紫杉醇；顺铂或卡铂加培美曲塞(pemetrexed))或吉西他滨加太平洋紫杉醇结合颗粒
Figure BDA0003506402190000981
本发明的化合物可有效地与抗激素剂组合以用于治疗乳腺癌和其他肿瘤。合适的实例是抗雌激素剂，包括(但不限于)他莫昔芬和托瑞米芬(toremifene)；芳香酶抑制剂，包括(但不限于)来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)和依西美坦(exemestane)；肾上腺皮质类固醇(例如，强的松(prednisone))；孕激素(例如，醋酸甲地孕酮(megastrolacetate))；和雌激素受体拮抗剂(例如，氟维司群(fulvestrant))。适用于治疗前列腺癌和其他癌症的抗激素剂也可与本发明的化合物组合。这些包括抗雄激素，其包括(但不限于)氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)和尼鲁胺(nilutamide)；促黄体素释放激素(LHRH)类似物，包括亮丙瑞林(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、曲普瑞林(triptorelin)和组氨瑞林(histrelin)；LHRH拮抗剂(例如，地加瑞克(degarelix))；雄激素受体阻断剂(例如，恩杂鲁胺(enzalutamide))；和抑制雄激素产生的药剂(例如，阿比特龙(abiraterone))。
本发明的化合物可与其他针对膜受体激酶的药剂组合或依序施用，尤其用于对靶向疗法已产生原发性或获得性耐药性的患者。这些治疗剂包括针对EGFR、Her2、VEGFR、c-Met、Ret、IGFR1或Flt-3和针对癌症相关融合蛋白激酶(例如Bcr-Abl和EML4-Alk)的抑制剂或抗体。针对EGFR的抑制剂包括吉非替尼(gefitinib)和埃罗替尼(erlotinib)，并且针对EGFR/Her2的抑制剂包括(但不限于)达可替尼(dacomitinib)、阿法替尼(afatinib)、拉匹替尼(lapitinib)和来那替尼(neratinib)。针对EGFR的抗体包括(但不限于)西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)和耐昔妥珠单抗(necitumumab)。c-Met的抑制剂可与本发明的化合物组合使用。这些包括奥妥珠单抗(onartumzumab)、替伐尼布(tivantnib)和INC-280。针对Abl(或Bcr-Abl)的药剂包括伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)和普纳替尼(ponatinib)并且针对Alk(或EML4-ALK)的那些药剂包括克唑替尼(crizotinib)。
血管生成抑制剂与本发明的化合物组合可在一些肿瘤中有效。这些包括针对VEGF或VEGFR的抗体或VEGFR的激酶抑制剂。针对VEGF的抗体或其他治疗蛋白包括贝伐单抗(bevacizumab)和阿柏西普(aflibercept)。VEGFR激酶的抑制剂和其他抗血管生成抑制剂包括(但不限于)舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、布立尼布(brivanib)和凡德他尼(vandetanib)。
胞内信号通路的活化在癌症中是常见的，并且靶向这些通路的组分的药剂已与受体靶向剂组合以增强功效并降低耐药性。可与本发明的化合物组合的药剂的实例包括PI3K-AKT-mTOR通路的抑制剂、Raf-MAPK通路的抑制剂、JAK-STAT通路的抑制剂和蛋白质伴随蛋白和细胞周期进程的抑制剂。
针对PI3激酶的药剂包括(但不限于)皮拉昔布(pilaralisib)、艾德昔布(idelalisib)、布帕昔布(buparlisib)。mTOR的抑制剂(例如雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(sirolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)和依维莫司(everolimus))可与本发明的化合物组合。其他合适的实例包括(但不限于)维罗非尼(vemurafenib)和达拉非尼(dabrafenib)(Raf抑制剂)和曲美替尼(trametinib)、司美替尼(selumetinib)和GDC-0973(MEK抑制剂)。一种或多种JAK(例如，卢利替尼(ruxolitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、托法替尼(tofacitinib))、Hsp90(例如，坦螺旋霉素)、周期蛋白依赖性激酶(例如，帕博西尼(palbociclib))、HDAC(例如，帕比司他(panobinostat))、PARP(例如，奥拉帕尼(olaparib))和蛋白酶体(例如，硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib))的抑制剂也可与本发明的化合物组合。可与本发明的化合物组合的PARP抑制剂的另一实例是他拉唑帕尼。
安全且有效施用大部分这些化学治疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，其施用描述于标准文献中。例如，许多化学治疗剂的施用描述于“Physicians'DeskReference”(PDR,例如1996年版,Medical Economics Company,Montvale,NJ)中，其公开内容如同整体阐述一样通过引用并入本文。
短语化合物(治疗剂、活性成分、药物等)的“治疗有效量”是指根据待治疗的病症或疾患的临床上可接受标准，向需要缓解症状、改善疾患或减缓疾病状况发作的疗法或治疗的受试者施用的化合物的量。例如，治疗有效量可为已在体外测定、体内动物测定或临床试验中证实具有所需治疗作用的量。治疗有效量可基于特定剂型、施用方法、治疗方案、待治疗的特定疾病或疾患、益处/风险比等以及众多其他因素而变化。
所述治疗有效量可获自临床试验、动物模型或体外细胞培养测定法。本领域中已知可由从动物模型或体外细胞培养测定法测定的有效量来计算适合于人类使用的有效量。例如，如通过Reagan-Shaw等人,FASEB J.2008:22(3)659-61所报道，“μg/ml”(基于体外细胞培养测定法的有效量)＝“毫克/千克体重/天”(小鼠的有效量)。此外，基于小鼠的代谢速率比人类的代谢速率快6倍的事实，可由小鼠的有效量计算人类的有效量。
作为使用式(I)化合物与细胞毒性剂的组合进行治疗的一个实例，可向患有癌症的患者施用治疗有效量的式(I)化合物作为治疗方案的一部分，所述治疗方案也涉及治疗有效量的电离辐射或细胞毒性剂。在这种治疗方案的情形中，术语“治疗有效”量应理解为意指在组合疗法中有效。癌症治疗领域中的技术人员应理解如何调节剂量以实现最佳治疗结果。
类似地，医学领域中的技术人员可容易地确定用于治疗非癌性疾病或疾患(例如心血管疾病)的本发明的化合物的适当剂量。
如本文所使用的术语“治疗”包括施用化合物或组合物，相对于未接受化合物或组合物的受试者，所述化合物或组合物降低受试者中涉及酸性或缺氧性患病组织的疾病(例如癌症、中风、心肌梗塞或长期神经退行性疾病)的症状的频率、延迟其发作或减少其进展。这可包括以改善或稳定受试者疾患的方式逆转、减少或抑制症状、临床征象或疾患的潜在病变(例如，肿瘤生长、癌症的消退或减少或改善心肌梗塞、中风或类似心血管疾病中的心肌缺血再灌注损伤)。术语“抑制”或“减少”用于癌症是指与未经治疗对照群体相比，抑制或减少群体中的肿瘤生长(例如，减小肿瘤大小)的方法。
本文所提及的所有出版物(包括专利)均通过引用并入本文，用于描述和公开例如出版物中描述的构建体和方法，所述构建体和方法可结合本文所描述的公开内容使用。通篇讨论的出版物仅为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。
本文公开了若干类型的范围。当公开或要求保护任何类型的范围时，意图是单独地公开或要求保护此范围可合理涵盖的每个可能的数字，包括所述范围的端点以及其中涵盖的任何子范围和子范围的组合。例如，当公开或要求保护活性成分的治疗有效量的范围时，意图是单独地公开或要求保护所述范围可涵盖的与本文公开内容一致的每一个可能的数字。例如，公开化合物的治疗有效量可在约1mg/kg至约50mg/kg(受试者体重)的范围内。
制剂、剂型和施用
为制备本发明的药物组合物，根据常规医药混配技术，将式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分与药物载体紧密掺合而进行组合，所述载体可根据施用所需的制剂形式(例如，口服或肠胃外)而采用广泛多种形式。在制备呈口服剂型的组合物时，可采用常见药物介质中的任一者，在口服液体制剂例如悬浮液、酏剂和溶液的情况下，例如水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或在口服固体制剂例如散剂、胶囊和片剂的情况下，例如淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等的载体。由于片剂和胶囊易于施用，因此它们代表最有利的口服单位剂型，在此情况下显然采用固体药物载体。如果需要的话，片剂可通过标准技术包覆糖衣或包覆肠溶包衣。对于肠胃外施用时，载体将通常包含无菌水，但可包括其他成分，例如用于促进溶解或防腐目的。也可制备可注射悬浮液，在此情况下，可采用适当液体载体、悬浮剂等。制药和医学领域的技术人员将能够容易地确定用于待治疗的特定疾病或疾患的本发明的药物组合物的适合剂量。
实施例
如本文所使用，所有缩写、符号和惯例均与当代科学文献中所使用的那些缩写、符号和惯例一致。参见例如Janet S.Dodd编,The ACS Style Guide:A Manual for Authorsand Editors,第2版,Washington,D.C.:American Chemical Society,1997。以下定义描述本文所使用的术语和缩写：
·盐水：饱和NaCl水溶液
·DCM：二氯甲烷
·TFA：三氟乙酸
·DIPEA：二异丙基乙胺
·DMA：二甲基乙酰胺
·DME：二甲氧基乙烷
·DMF：二甲基甲酰胺
·DMSO：甲基亚砜
·DTT：二硫苏糖醇
·MSD：质谱检测器
·Et2O：乙醚
·EtOAc：乙酸乙酯
·EtOH：乙醇
·HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
·HOBt：1-羟基苯并三唑
·RP：反相
·HPLC：高效液相色谱法
·IPA：异丙醇
·LAH：氢化锂铝
·N-BuLi：正丁基锂
·LC-MS：液相色谱-质谱
·LDA：二异丙基乙酰胺锂
·Me：甲基
·MeOH：甲醇
·MTBE：甲基叔丁基醚
·NMP：N-甲基吡咯烷
·Ph：苯基
·PNPC：对硝基苯氯甲酸酯
·RT或rt：室温
·SFC：超临界流体色谱法
·TBAI：碘化四丁铵
·TBME：叔丁基甲基醚
·tBu：叔丁基
·THF：四氢呋喃
·TEA：三乙胺
·TMEDA：四甲基乙二胺
·GSH：谷胱甘肽
·GS：硫上键合的谷胱甘肽
·LiOH：氢氧化锂
·DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物
·Sn(Bu)2(月桂酸)2：二月桂酸二丁基锡
·PBS：磷酸盐缓冲盐水
·ACN：乙腈
·AcOH：乙酸
·EEDQ：N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉
·DMAP：4-二甲氨基吡啶
·EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺
实施例中采用的起始材料的来源在下表中阐述。
表2.R8的起始材料
Figure BDA0003506402190001051
Figure BDA0003506402190001061
Figure BDA0003506402190001071
Figure BDA0003506402190001081
表3.用于接头的起始材料
Figure BDA0003506402190001082
Figure BDA0003506402190001091
*随机指定的绝对构型
下文阐述所采用的HPLC方法：
HPLC方法
A：Sunfire C18 150×4.6mm；含TFA改性剂(0.05％)的H2O/乙腈；流速：1ml/min；波长＝217nM。
B：Ace Equivalence 250×4.6mm；含TFA改性剂(0.05％)的H2O/乙腈；流速：1ml/min；波长＝217nM。
C：Sunfire C18 150×30mm；含TFA改性剂(0.05％)的H2O/乙腈；流速：30ml/min；波长＝217nM。
质谱方法
在Applied Biosystems Voyager System 6268上测量Maldi-TOF(基质辅助激光解吸附/电离-飞行时间)质谱。样品作为α-氰基羟基肉桂酸的基质在AB Science板(部件编号V700666)上制备。
电喷雾电离(ESI)质谱是在具有1946MSD的Agilent 1100系列LC-MS或WatersXevo Qtof高分辨率MS(都提供质量/电荷物质(m/z＝3))上测量。
顺式-硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(L-4和L-5)的合成
Figure BDA0003506402190001101
在室温下，向反式-2,3-二甲基环氧乙烷(5.0g，69.3mmol)于水(50mL)中的经搅拌溶液中添加硫代乙酸(5.8mL，76.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)淬灭并用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并且接着减压蒸发，得到呈油性化合物的顺式-硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(4.0g，粗物质)。MS m/z 149.0[M+H]+。
顺式-3-巯基丁-2-醇的合成
Figure BDA0003506402190001111
在0℃下，向硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(4g，26.9mmol)于THF(40mL)中的经搅拌溶液中滴加氢化锂铝(1M溶液于THF中)(27mL，26.9mmol)。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌3小时。将反应混合物在0℃下用1N HCl缓慢淬灭并且将pH调节至2-3。将反应混合物在乙酸乙酯(50mL)中萃取并且将有机层经无水硫酸钠干燥并蒸发，获得呈粗油性化合物的顺式-3-巯基丁-2-醇。
反式-硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(L-6和L-7)的合成
Figure BDA0003506402190001112
在室温下，向顺式-2,3-二甲基环氧乙烷(1.0g，13.9mmol)于水(15mL)中的经搅拌溶液中添加硫代乙酸(1.1mL，15.6mmol)并搅拌16h。将反应混合物用碳酸氢钠溶液(10mL)淬灭并用乙酸乙酯(20mL)萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并且接着减压蒸发，得到呈黄色油状物的反式-硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(0.7g粗物质)。
反式-3-巯基丁-2-醇的合成
Figure BDA0003506402190001113
在0℃下，向反式-硫乙酸S-(3-羟基丁-2-基酯)(700mg，4.72mmol)于THF(10mL)中的经搅拌溶液中滴加氢化锂铝(1M溶液于THF中)(4.8mL，4.72mmol)并且在相同温度下搅拌3h。将反应混合物在0℃下用1N HCl淬灭，接着将pH调节至2-3。将反应混合物用CH2Cl2(10mL)萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并且直接用于下一步骤。
反式-硫乙酸S-(2-羟基环己基酯)(L-8和L-9)的合成
Figure BDA0003506402190001121
向7-氧杂双环[4.1.0]庚烷(5.0g，51.0mmol)于水(50.0mL)中的经搅拌溶液中添加硫代乙酸(4.92mL，61.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成后，将反应混合物用二乙醚稀释。将有机层分离并用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到呈棕色液体的反式-硫乙酸S-(2-羟基环己酯)(3.8g粗物质)。
反式-2-巯基环己-1-醇的合成
Figure BDA0003506402190001122
在0℃下，向反式-硫乙酸S-(2-羟基环己酯)(3.8g，21.8mmol)于THF(20.0mL)中的经搅拌溶液中添加含1M LiAH4的THF(21.8mL，21.8mmol)。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌1h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物冷却至室温并用1.0N HCl(30mL)淬灭。将反应混合物在CH2Cl2(30.0mL)中萃取。将有机层用盐水溶液(30.0mL)洗涤，浓缩并且将粗制反式-2-硫基环己醇用于下一步骤。(2.88g，粗物质)。
从L合成中间体I
Figure BDA0003506402190001131
Figure BDA0003506402190001132
合成中间体I-1：(2R)-2-(2-吡啶基二硫基)丙-1-醇
Figure BDA0003506402190001141
以逐滴方式向用N2脱气的含2-(2-吡啶基二硫基)吡啶(5.00g，22.7mmol)的40mlMeOH中添加(2R)-2-硫基丙-1-醇(0.75g，8.14mmol)。将混合物在N2下搅拌2h。将混合物浓缩至干并且直接装载至SiO2快速柱上并用0-50％EtOAc/己烷洗脱，得到1.17g，71％的(2R)-2-(2-吡啶基二硫基)丙-1-醇。MS m/z 202.1[M+H]+。
以类似方式由L-2制备中间体I-2。
合成中间体I-3：[1-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]环丁基]甲醇
Figure BDA0003506402190001142
以逐滴方式向5-硝基-2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]吡啶(17.4g，56.0mmol)于脱气(N2)MeOH(100mL)中的溶液中添加(1-巯基环丁基)甲醇(8.3mL，70.0mmol)(用N2脱气)并在室温下在N2气氛下搅拌16h。将反应混合物在真空下浓缩至干。通过柱色谱法使用30％EtOAc/己烷纯化所得粗物质，得到呈黄色液体的[1-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫基]环丁基]甲醇(9.0g，46％产率)。MS m/z 272.9[M+H]+。
合成I-4和I-5：3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇异构体1和异构体2
Figure BDA0003506402190001151
用氮气吹扫2,2-二吡啶基二硫化物(520mg，2.35mmol)于MeOH(15mL)中的经搅拌溶液5min。在0℃下向其中添加顺式-3-巯基丁-2-醇(500mg)于CH2Cl2(10mL)中的氮气吹扫溶液。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌16h。将反应混合物减压浓缩，得到粗物质，通过柱色谱法使用30-40％EA/己烷对其进行纯化。用手性制备型HPLC(CHIRALPAK IG；100mm×4.6mm×3mic；流动相：正己烷:乙醇80:20，含0.1％DEA；流速：1.0mL/min)分离外消旋产物以分离各个对映异构体。去除溶剂，获得(2S,3S)-3-(2-吡啶基二硫基)丁-2-醇*(140mg，异构体-1)MS m/z 216.1[M+H]+和(2R,3R)-3-(2-吡啶基二硫基)丁-2-醇(140mg，异构体-2)。MS m/z 216.1[M+H]+。
合成I-6和I-7：3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇异构体1和异构体2
Figure BDA0003506402190001152
用氮气吹扫2,2-二吡啶基二硫化物(520mg，2.35mmol)于MeOH(15mL)中的经搅拌溶液5min。在0℃下向其中添加顺式-3-巯基丁-2-醇(500mg)于CH2Cl2(10mL)中的氮气吹扫溶液。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌16h。将反应混合物减压浓缩，得到粗物质，通过柱色谱法使用30-40％EA/己烷对其进行纯化。用手性制备型HPLC(柱：CHIRALPAK IG(100mm×4.6mm×3mic)，流动相：正己烷:含有0.1％DEA的乙醇(80:20)，流速：1.0mL/min)分离外消旋产物以分离各个对映异构体。去除溶剂，获得呈油性化合物的(2R,3S)-3-(2-吡啶基二硫基)丁-2-醇*(0.6g，异构体-I)MS m/z 215.9[M+H]+和(2S,3R)-3-(2-吡啶基二硫基)丁-2-醇*(0.6g，异构体-II)MS m/z 216.2[M+H]+。
合成中间体I-6：反式-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇
Figure BDA0003506402190001161
向1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(2.41g，10.9mmol)于MeOH(用N2脱气)(30mL)中的溶液中滴加反式-2-硫基环己醇(2.88g，21.0mmol)(用N2脱气)并在室温下在N2气氛下搅拌16h。将反应混合物在真空下浓缩至干。通过柱色谱法使用30％的EtOAc/己烷纯化所得粗物质，得到呈黄色液体的反式-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇。
Figure BDA0003506402190001162
手性分离是使用正己烷:含有0.1％二乙胺的IPA(80:20)通过chiralpak IG(100mm×4.6mm×3mic)进行，得到(1R,2R)-2-(2-吡啶基二硫基)环己醇*异构体-1(350mg)和(1S,2S)-2-(2-吡啶基二硫基)环己醇*异构体-2(400mg)。
来自XXI的中间体XV
Figure BDA0003506402190001171
中间体 R<sup>5</sup>,R<sup>6</sup> R<sup>9</sup>,R<sup>10</sup>,R<sup>11</sup>,R<sup>12</sup> MH<sup>+</sup>
XV-1 H,H H,H,H,H 250.1
合成中间体XV-1：[4-(2-吡啶基二硫基)苯基]甲醇
Figure BDA0003506402190001172
1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(2.68g，12.1mmol)于AcOH:乙醇(5mL，1:10)溶剂的混合物中的经搅拌溶液在N2下脱气。此后经20min滴加含(4-巯基苯基)甲醇(0.74g，5.2mmol)的AcOH/乙醇(5mL)溶剂的混合物并在室温下在N2气氛下搅拌12h。将反应物减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱色谱法(SiO2，60-70％EtOAc/己烷)纯化，得到呈无色液体的[4-(2-吡啶基二硫基)苯基]甲醇(800mg，61％产率)。
来自中间体I的碳酸酯离去基团中间体II
Figure BDA0003506402190001173
Figure BDA0003506402190001181
合成II-1：碳酸(4-硝基苯基)[(2R)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯]
Figure BDA0003506402190001182
在N2下向含(2R)-2-(2-吡啶基二硫基)丙-1-醇(0.39g，1.94mmol)的THF中添加吡啶(0.16mL，1.94mmol)和氯甲酸(4-硝基苯酯)(0.59g，2.91mmol)。将混合物在N2下搅拌16h。将混合物用EtOAc稀释并用20mL的饱和NH4Cl淬灭。将混合物用水和盐水洗涤并浓缩有机层。通过柱色谱法(SiO2，0-50％EtOAc/己烷)纯化粗混合物，得到0.59g，83％的碳酸(4-硝基苯酯)[(2R)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯]。MS m/z实验值367.1[M+H]+。
类似于II-1合成中间体II-2和II-3。
合成II-4：碳酸4-硝基苯酯((2R,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)
Figure BDA0003506402190001191
在室温下，向(2R,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇(140mg，0.651mmol)于CH2Cl2(2.0mL)中的经搅拌溶液中添加吡啶(0.11mL，1.43mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(150mg，0.781mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。将反应混合物用CH2Cl2(10mL)稀释并且接着用水(10mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗物质，通过柱色谱法使用30-40％乙酸乙酯/己烷对其进行纯化。浓缩出洗脱份，获得粗物质，其经C18反相柱进一步纯化。浓缩纯洗脱份，获得呈油性化合物的碳酸4-硝基苯酯((2R,3R)-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丁-2-基酯)(70mg，28％)。MS m/z 381.0[M+H]+。
合成II-5：碳酸4-硝基苯酯((2S,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)
Figure BDA0003506402190001192
在室温下，向(2S,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇(80mg，0.372mmol)于CH2Cl2(1.0mL)中的经搅拌溶液中添加吡啶(0.066mL，0.818mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(89mg，0.446mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。将反应混合物用CH2Cl2(5mL)稀释并且接着用水(5mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗标题产物，通过柱色谱法使用30-40％乙酸乙酯/己烷对其进行纯化。将洗脱份浓缩，获得粗物质，其经C18反相柱进一步纯化。浓缩纯洗脱份，获得呈油性化合物的碳酸4-硝基苯酯((2S,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)(140mg，58％)。MS m/z 381.0[M+H]+。
合成II-6：碳酸4-硝基苯酯((2R,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)
Figure BDA0003506402190001201
在0℃下，向(2R,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇(0.4g，1.86mmol)于CH2CL2(10mL)中的经搅拌溶液中添加吡啶(0.36mL，4.09mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(0.44g，2.32mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释并用水(20mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗物质，通过硅胶快速柱色谱法使用30-40％乙酸乙酯/己烷对其进行纯化。在30％EtOAc:己烷中洗脱出呈混合物形式的化合物。将洗脱份浓缩，获得粗物质，其经C18反相柱进一步纯化。将纯洗脱份蒸发掉，获得呈油性化合物的碳酸4-硝基苯酯((2R,3S)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)(0.17g，24.2％)。MS m/z 381.0[M+H]+。
合成II-7：碳酸4-硝基苯酯((2S,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)
Figure BDA0003506402190001211
在0℃下，向(2S,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-醇(0.4g，1.86mmol)于CH2Cl2(10mL)中的经搅拌溶液中添加吡啶(0.36mL，4.09mmol)、氯甲酸4-硝基苯酯(0.44g，2.32mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释并用水(20mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗物质，通过硅胶快速柱色谱法使用30-40％乙酸乙酯/己烷对其进行纯化。在30％EtOAc:己烷中洗脱出呈混合物形式的化合物。将洗脱份浓缩，获得粗物质，其经C18反相柱进一步纯化。将纯洗脱份浓缩，获得呈油性化合物的碳酸4-硝基苯酯((2S,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯)(0.18g，26％)。MS m/z 381.0[M+H]+。
合成II-8：碳酸(4-硝基苯酯)[(1R,2R)-2-(2-吡啶基二硫基)环己酯]
Figure BDA0003506402190001212
在室温下，向(1R,2R)-2-(2-吡啶基二硫基)环己醇*(130.0mg，0.5mmol)于THF(3.0mL)中的溶液中添加碳酸钾(0.20g，1.5mmol)、催化量的DMAP和氯甲酸4-硝基苯酯(0.21g，0.10mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成后，将反应混合物用水(20.0mL)淬灭并用EtOAc(20.0mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱色谱法使用20-30％的EtOAc/己烷纯化，得到呈灰白色固体的碳酸(4-硝基苯酯)[(1R,2R)-2-(2-吡啶基二硫基)环己酯]*(89mg，40％产率)。MS m/z 407.0[M+H]+。
合成II-9：碳酸(4-硝基苯酯)[(1S,2S)-2-(2-吡啶基二硫基)环己酯]
Figure BDA0003506402190001221
在室温下，向(1S,2S)-2-(2-吡啶基二硫基)环己醇*(0.42g，1.7mmol)于THF(10.0mL)中的溶液中添加碳酸钾(0.70g，5.1mmol)、催化量的DMAP和氯甲酸4-硝基苯酯(0.69g，3.4mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌48h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成后，将反应混合物用水(20.0mL)淬灭并用EtOAc(20.0mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱色谱法使用20-30％的EtOAc/己烷纯化，得到呈灰白色固体的碳酸(4-硝基苯酯)[(1R,2R)-2-(2-吡啶基二硫基)环己酯]*(250mg，35％产率)。MS m/z 406.7[M+H]+。
来自XIV的碳酸酯离去基团中间体XV
Figure BDA0003506402190001222
中间体 R<sup>5</sup>,R<sup>6</sup> R<sup>9</sup>,R<sup>10</sup>,R<sup>11</sup>,R<sup>12</sup> X MH<sup>+</sup>
XV-1 H,H H,H,H,H H 415.0
合成XV-1：碳酸(4-硝基苯酯)[4-(2-吡啶基二硫基)苯基]甲酯
Figure BDA0003506402190001231
在0℃下，向(4-(吡啶-2-基二硫基)苯基)甲醇(0.40g，1.60mmol)于CH2Cl2(10mL)中的经搅拌溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.65g，3.2mmol)、吡啶(0.25mL，3.20mmol)、催化量的DMAP(0.005g)。将混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物用1.5N HCl溶液淬灭。将有机层分离并用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过柱色谱法(SiO2，20-30％的EtOAc/己烷)纯化粗产物，得到呈无色液体的碳酸(4-硝基苯酯)[4-(2-吡啶基二硫基)苯基]甲酯(600mg，91％产率)；MS m/z 415.0[M+H]-。
碳酸酯和氨基甲酸酯连接的中间体III
Figure BDA0003506402190001232
Figure BDA0003506402190001233
合成III-1：N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧 杂-4,15二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16 (24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2S)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯]
Figure BDA0003506402190001241
向1-羟基苯并三唑水合物(8.64mg，0.0564mmol)、细粉状分子筛
Figure BDA0003506402190001242
(50mg)(10S,23S)-23-氨基-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-5,9-二酮甲磺酸(25.0mg，0.0470mmol)和吡啶(0.0190mL，0.235mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加碳酸(4-硝基苯酯)[(2S)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯](19.0mg，0.0517mmol)。在室温下搅拌16h后，过滤混合物并浓缩溶液。通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2S)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯](29.0mg，产率：93.0％)。MS m/z 663.0[M+H]+。
类似于III-1由II-2至II-9制备中间体III-2至III-9。
碳酸酯和氨基甲酸酯连接的中间体XVI
Figure BDA0003506402190001251
Figure BDA0003506402190001252
类似于III-1由XV-1制备中间体XVI-1。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001253
步骤1：合成外消旋反式-硫乙酸(4-羟基四氢呋喃-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001254
向3,6-二氧杂双环[3.1.0]己烷(5.0g，0.051mol)于水(40.0mL)中的经搅拌溶液中添加硫代乙酸(4.98mL，0.069mol)并且将所得反应混合物在室温下搅拌16h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物用二乙醚稀释并用10％碳酸氢钠溶液洗涤。将有机层分离并用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱色谱法使用20％EtOAc:正己烷纯化，获得呈棕色液体的标题产物(4.0g，产率42％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.35-4.28(m,2H),4.02-3.98(m,1H),3.81-3.73(m,2H),3.69-3.62(m,1H),2.37(s,3H)。
步骤2：合成外消旋反式-4-巯基四氢呋喃-3-醇
Figure BDA0003506402190001261
在0℃下，在氮气气氛下，以逐滴方式向外消旋反式-硫乙酸(4-羟基四氢呋喃-3-基酯)(4.0g，24.7mmol)于无水THF(20.0mL)中的经搅拌溶液中添加LAH(1M于THF中)(27.1mL，27.1mmol)。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌2h。通过TLC(20％EtOAc:正己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物冷却至室温并用1.0N HCl(50mL)淬灭。将反应混合物萃取至DCM(3×20mL)中，将有机层用盐水溶液(20mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，部分蒸馏并按原样用于下一步骤。(2.9g，粗物质)。
步骤3：合成反式-(4RS,3RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇和反式-(4SR,3SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇
Figure BDA0003506402190001271
向2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(0.9g，21.7mmol)于MeOH(用N2脱气)(10mL)中的溶液中滴加4-硫基氧杂环戊-3-醇(2.9g，24.1mmol)(用N2脱气)并在室温下在氮气气氛下搅拌16h。将反应混合物在真空下浓缩至干。通过快速柱色谱法使用30％的EtOAc:正己烷纯化所得粗物质，得到呈黄色油状物的标题化合物4-(吡啶-2-基二硫基)氧杂环戊-3-醇(外消旋混合物)。通过手性制备型HPLC分离异构体。
手性制备型HPLC条件：
柱：Chiralpak IA(250mm×20mm×5mic)
流动相：含有0.1％DEA的EtOH(90:10)
流速：19mL/min
从手性制备型HPLC收集经拆分异构体的经分离洗脱份并减压蒸发，得到呈异构体1(600mg)和异构体2(620mg)形式的标题化合物。
异构体1：(反式-(4RS,3RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇)：C9H11NO2S2的LC-MS m/z计算值为229；实验值为230[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.53-8.52(m,1H),7.67-7.63(m,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.23-7.19(m,1H),4.45-4.48(m,1H),4.25(t,J＝8.8Hz,1H),4.12(t,J＝6.8Hz,1H),3.74-3.67(m,2H),3.48-3.41(m,1H)。
异构体2：(反式-(4SR,3SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇)：C9H11NO2S2的LC-MS m/z计算值为229；实验值为230[M+H]+。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.54-8.53(m,1H),7.68-7.64(m,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.23-7.20(m,1H),4.49-4.45(m,1H),4.25(t,J＝7.6Hz,1H),4.12-4.10(m,1H),3.74-3.67(m,2H),3.47-3.44(m,1H)。
任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤4：合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001281
在室温下，在氮气气氛下，向反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇(0.61g，2.69mmol)于DMF(10mL)中的经搅拌溶液中添加DIPEA(1.45mL，8.08mmol)和碳酸双(4-硝基苯酯)(1.64g，5.38mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌12h。通过TLC(20％EtOAc:正己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物用水(20mL)淬灭并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过快速柱色谱法使用20-30％的EtOAc:正己烷纯化，得到呈灰白色固体的碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-基酯)(790mg，77％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.50(d,J＝4.4Hz,1H),8.27(d,J＝8.8Hz,2H),7.67-7.59(m,2H),7.36(d,J＝8.8Hz,2H),7.15(t,J＝5.2Hz,1H),5.44-5.43(m,1H),4.40-4.25(m,2H),4.03(d,J＝11.2Hz,1H),3.92-3.86(m,1H),3.85-3.79(m,1H)；C16H14N2O6S2的LC-MS m/z计算值为394；实验值为395[M+H]+。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001291
在室温下，在氮气下，向反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-醇(550mg，2.46mmol)于DMF(10.0mL)中的经搅拌溶液中添加DIPEA(1.32mL，7.38mmol)和碳酸双(4-硝基苯酯)(1.5g，4.92mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌12h。通过TLC(20％EtOAc:正己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物用水(20mL)淬灭并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过快速柱色谱法使用20-30％的EtOAc:正己烷纯化，得到呈灰白色固体的碳酸4-硝基苯酯(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢呋喃-3-基酯)(0.6g，70％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.85(d,J＝4.4Hz,1H),8.26(d,J＝8.8Hz,2H),7.68-7.59(m,2H),7.35(d,J＝8.8Hz,2H),7.14(t,J＝5.2Hz,1H),5.44-5.43(m,1H),4.40-4.25(m,2H),4.03(d,J＝11.2Hz,1H),3.92-3.86(m,1H),3.85-3.79(m,1H)；C16H14N2O6S2的LC-MS m/z计算值为394；实验值为395[M+H]+。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊酯)
Figure BDA0003506402190001301
步骤1：合成外消旋反式-硫乙酸(5-羟基环戊-1-基酯)
Figure BDA0003506402190001302
在室温下，向6-氧杂双环[3.1.0]己烷(3.0g，mmol)于水(30mL)中的经搅拌溶液中添加硫代乙酸(3mL，39.2mmol)并搅拌16h。将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并用乙酸乙酯(3×10mL)萃取。将有机层分离并用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到呈油性化合物的外消旋反式-硫乙酸(5-羟基环戊-1-基酯)(2.6g，粗物质)。C7H12O2S的LC-MS m/z计算值为160.2；实验值为143.3[M+H-17]+。
步骤2：合成外消旋反式-2-巯基环戊-1-醇
Figure BDA0003506402190001303
在0℃下，在氮气气氛下，以逐滴方式向外消旋反式-硫乙酸(5-羟基环戊-1-基酯)(2.6g，16.2mmol)于THF(20mL)中的经搅拌溶液中添加LAH(1M于THF中)(24mL，24.3mmol)。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌2h。通过TLC(20％EtOAc:正己烷)监测反应进程。反应完成时，将反应混合物冷却至室温并用1N HCl溶液淬灭并在DCM中萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并部分蒸发并且使粗外消旋反式-2-巯基环戊-1-醇进行下一步骤(1.9g，粗物质)。
步骤3：合成反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇和反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇
Figure BDA0003506402190001311
在0℃下，在氮气气氛下，以逐滴方式向2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(2.1g，9.65mmol)于MeOH(10mL)中的经搅拌溶液中添加外消旋反式-2-巯基环戊-1-醇(1.9g，16.1mmol)。使反应混合物逐渐升温至室温并搅拌16h。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩至干。通过硅胶快速柱色谱法纯化所得粗物质。在15％EtOAc:正己烷中洗脱出化合物。将含有所需产物的洗脱份合并并减压蒸发，得到呈黄色液体的标题化合物(外消旋混合物)。通过手性制备型HPLC分离异构体。
手性制备型HPLC条件：
柱：Chiralpak IA(250mm×20mm×5mic)
流动相：含有0.1％DEA的EtOH(70:30)
流速：19mL/min
从手性制备型HPLC收集经分离异构体的经分离洗脱份并减压蒸发，得到呈无色油状物的异构体1(300mg)和异构体2(300mg)形式的标题化合物。
异构体1(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇)：C10H13NOS2的LC-MS m/z计算值为227.34；实验值228.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.51-8.50(m,1H),7.61-7.57(m,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),4.03-3.97(m,1H),3.0-2.87(m,1H),2.11-2.02(m,3H),1.75-1.65(m,4H)。
异构体2(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇)：C10H13NOS2的LC-MS m/z计算值为227.34；实验值228.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.51-8.50(m,1H),7.61-7.57(m,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),4.03-3.97(m,1H),3.0-2.87(m,1H),2.11-2.02(m,3H),1.75-1.65(m,4H)。
任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤4：合成碳酸4-硝基苯酯((1R,2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊酯)
Figure BDA0003506402190001321
在室温下，在氮气气氛下，向反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇(0.3g，1.34mmol)于DMF(10mL)中的经搅拌溶液中添加DIPEA (0.65mL，3.96mmol)和碳酸双(4-硝基苯酯)(0.8g，2.64mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌16h。将反应混合物用水(20mL)淬灭并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，通过硅胶快速柱色谱法对其进行纯化。在10％EtOAc:正己烷中洗脱出呈混合物形式的化合物。将洗脱份蒸发掉，获得粗化合物，其经反相柱色谱法纯化。将含有产物的洗脱份减压蒸发，获得呈无色油状物的碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊酯)(305mg，59％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.46(d,J＝4.1Hz,1H),8.25(d,J＝6.8Hz,2H),7.66-7.62(m,2H),7.34(d,J＝6.4Hz,2H),7.10-7.08(m,1H),5.29-5.10(m,1H),3.52-3.45(m,1H),2.32-2.28(m,2H),1.9-1.76(m,4H)。C17H16N2O5S2的LC-MS m/z计算值为392.44；实验值为393.0[M+H]+。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊酯)
Figure BDA0003506402190001331
在室温下，在氮气气氛下，向(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊-1-醇(0.26g，1.14mmol)于DMF(10.0mL)中的经搅拌溶液中添加DIPEA (0.57mL，3.43mmol)和碳酸双(4-硝基苯酯)(0.7g，2.29mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌16h。将反应混合物用水(20.0mL)淬灭并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，通过硅胶快速柱色谱法对其进行纯化。在10％EtOAc:正己烷中洗脱出呈混合物形式的化合物。将洗脱份蒸发掉，获得粗化合物，其经反相柱色谱法纯化。将含有产物的洗脱份减压蒸发，获得呈无色油状物的碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环戊酯)(330mg，73.5％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.46(d,J＝4Hz,1H),8.25(d,J＝6.8Hz,2H),7.66-7.62(m,2H),7.34(d,J＝6.4Hz,2H),7.10-7.08(m,1H),5.29-5.10(m,1H),3.52-3.45(m,1H),2.32-2.28(m,2H),1.9-1.76(m,4H)。C17H16N2O5S2的LC-MS m/z计算值为392.44；实验值为393.0[M+H]+。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘- 2-基酯)
Figure BDA0003506402190001341
步骤1：合成1aH,2H,7H,7aH-萘并[2,3-b]环氧乙烯
Figure BDA0003506402190001342
在0℃下，在氮气气氛下向1,4-二氢萘(100mg，768μmol)于二氯甲烷(2.00ml)中的经搅拌溶液中逐批添加3-氯苯-1-过氧甲酸(199mg，1.5当量，1.15mmol)并在室温下搅拌16h。通过TLC监测反应进程。反应完成后，将反应块状物过滤并用二氯甲烷萃取，用碳酸氢钠溶液，随后水和盐水洗涤。将两个层分离并且将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到粗产物，通过硅胶快速柱色谱法对其进行纯化。在10％EtOAc和正己烷中洗脱出产物(产物为UV非活性)，收集洗脱份并在真空下干燥，获得呈油性化合物的1aH,2H,7H,7aH-萘并[2,3-b]环氧乙烯(85.0mg，581μmol)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.14(t,J＝3.2Hz,2H),7.05(t,J＝3.2Hz,2H),3.48(s,2H),3.32(d,J＝17.6Hz,2H),3.19(d,J＝17.6Hz,2H)。
步骤2：合成外消旋[反式-(3-羟基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)硫基](苯基)甲酮
Figure BDA0003506402190001343
在氮气气氛下，向1aH,2H,7H,7aH-萘并[2,3-b]环氧乙烯(100mg，684μmol)于乙氧乙烷(4.00mL)中的经搅拌溶液中添加氧化铝(1.00g)(酸性)。将溶液冷却至0℃。接着，将硫代苯甲酸(482mg，5.1当量，3.49mmol)添加至反应混合物中并在室温下搅拌24h。反应完成后(通过TLC监测反应进程)，将反应混合物过滤并用碳酸氢钠溶液洗涤，随后用水和盐水溶液洗涤，得到粗产物。通过硅胶快速柱色谱法使用纯化粗产物并且在20％EtOAc:正己烷中洗脱出产物，获得呈无色液体的外消旋[反式-(3-羟基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)硫基](苯基)甲酮(125mg，440μmol)。
1HNMR(400MHz,DMSO):δ7.89(d,J＝7.2Hz,2H),7.66(t,1H),7.53(d,J＝7.2Hz,2H),7.09(m,4H),5.39(s,1H),4.00(s,2H),3.42(d,J＝17.6Hz,1H),3.12(t,J＝16Hz,1H),2.81(t,J＝18.4Hz,2H)。
步骤3：合成外消旋反式-3-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇
Figure BDA0003506402190001351
向[(3-羟基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)硫基](苯基)甲酮(115mg，404μmol)于甲醇(3.00mL)中的经搅拌溶液中添加K2CO3(113mg，2当量，809μmol)并且将反应混合物在室温下搅拌0.5h。通过TLC监测反应进程。反应完成后，将反应块状物浓缩(以除去甲醇)并且接着用1NHCl溶液酸化直至pH达到2-3，获得外消旋反式-3-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(70.0mg，388μmol)，其按原样进一步用于下一步骤。
步骤4：合成反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇和反式-(2SR,3SR)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇
Figure BDA0003506402190001361
在氮气气氛下，向外消旋反式-3-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(350mg，1.94mmol)于甲醇(2.50ml)中的经搅拌溶液中添加2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(428mg，1当量，1.94mmol)并在室温下搅拌16h。通过TLC和LC-MS监测反应进程。反应完成后，将反应块状物浓缩并且接着用DCM稀释，用水，随后盐水洗涤并经硫酸钠干燥。通过硅胶快速柱色谱法纯化获得的粗产物。在20％EtOAc:己烷中洗脱出所需产物。通过反相柱色谱法(10-20％的0.1％甲酸/水/乙腈)再纯化产物。收集含有所需产物的洗脱份并在真空下蒸发掉，获得呈黄色固体的3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(350mg，1.21mmol)。通过手性制备型HPLC分离异构体。
1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.44(d,J＝4.4Hz,1H),7.79(d,J＝3.2Hz,2H),7.26-7.24(m,1H),7.06(s,4H),5.61(s,1H),3.91-3.80(m,1H),3.31-3.19(m,2H),3.13-3.07(m,1H),2.92-2.84(m,1H),2.75-2.65(m,1H)。
制备型条件：
柱：CHIRALPAK IA(250mm×420mm×5mic)
流动相：正己烷:含有0.1％DEA的乙醇(50:50)
流速：19mL/min
分离异构体并且将从手性制备型HPLC收集的各个洗脱份合并并蒸发，得到各个异构体。首先收集异构体1并将其指定为反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇。其次收集异构体2并将其指定为反式-(2SR,3SR)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇。任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤5：合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)
向反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(150mg，518μmol)于二甲基甲酰胺(3.00ml，38.7mmol)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(315mg，2当量，1.04mmol)，随后添加N,N-二异丙基乙胺(271μL，3当量，1.55mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应块状物用水淬灭，用DCM(3×5)萃取，将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物。将粗产物通过硅胶快速柱色谱法(0-40％EtOAc:正己烷)纯化并且也通过反相柱色谱法(10-50％的0.1％甲酸/水:ACN)再纯化，得到呈灰白色固体的碳酸(反式-(2RS,3RS)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)(133mg，293μmol)。
1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.44(d,1H),8.30(d,J＝9.2Hz,2H),7.80-7.76(m,2H),7.54(d,J＝9.2Hz,2H),7.26-7.24(m,1H),7.14-7.06(m,4H),5.21-5.19(m,1H),3.78-3.77(m,1H),3.45-3.25(m,2H),3.10-3.01(m,2H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(2SR,3SR)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘- 2-基酯)
Figure BDA0003506402190001371
向反式-(2SR,3SR)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(130mg，449μmol)于二甲基甲酰胺(2.60ml，33.6mmol)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(273mg，2当量，898μmol)，随后添加二异丙基乙胺(13.0mL，3当量，74.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后(通过TLC监测反应进程)，将反应块状物用水淬灭，用DCM(3×5)萃取，将合并的有机相经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法(0-40％EtOAc:正己烷)对其进行纯化。通过反相柱色谱法(10-50％的0.1％甲酸/水:ACN)再纯化产物，得到呈灰白色固体的碳酸4-硝基苯酯(反式-(2SR,3SR)-3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)(30.0mg，66.0μmol)。
1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.44(d,1H),8.30(d,J＝9.2Hz,2H),7.80-7.76(m,2H),7.54(d,J＝9.2Hz,2H),7.26-7.24(m,1H),7.14-7.06(m,4H),5.21-5.19(m,1H),3.78-3.77(m,1H),3.45-3.25(m,2H),3.10-3.01(m,2H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)氧杂环己-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001381
步骤1：合成3,7-二氧杂双环[4.1.0]庚烷
Figure BDA0003506402190001382
在0℃下，向3,6-二氢-2H-吡喃(2.0g，23.8mmol)于二氯甲烷(20.0mL)中的经搅拌溶液中逐份缓慢添加3-氯苯-1-过氧甲酸(4.92g，1.2当量，28.5mmol)并且在室温下在氮气气氛下搅拌16h。通过TLC监测反应进程。反应完成后，将反应块状物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭，并且将有机层分离并用水，随后盐水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到呈无色油状物的标题化合物3,7-二氧杂双环[4.1.0]庚烷(1.00g，9.99mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):4.03-3.94(m,2H),3.55-3.49(m,1H),3.46-3.41(m,1H),3.35(m,1H),3.18(m,1H),2.00(m,2H)。
步骤2：合成外消旋[反式-(3-羟基四氢吡喃-4-基)硫基](苯基)甲酮：
Figure BDA0003506402190001391
在室温下，向3,7-二氧杂双环[4.1.0]庚烷(1.00g，9.99mmol)于乙氧乙烷(40mL)中的经搅拌溶液中添加单硫代苯甲酸(5.88mL，5当量，49.9mmol)，随后添加硅烷二酮(3.00g，5当量，49.9mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌12h。通过TLC监测反应进程，起始材料完成时，将反应块状物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并且接着用乙酸乙酯(2×10mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并接着减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法(0-30％EtOAc:正己烷)对其进行纯化。化合物在20％EtOAc:正己烷中洗脱。收集纯洗脱份并蒸发，得到外消旋[反式-(3-羟基四氢吡喃-4-基)硫基](苯基)甲酮(2.0g，8.39mmol)。
C12H14O3S的LC-MS m/z计算值；238.3，实验值239.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.43(d,J＝7.6Hz,2H),7.09(t,J＝17.2Hz,1H),6.93(t,J＝8.0Hz,2H),3.55(dd,J＝4.0Hz,4.0Hz,1H),3.37(d,J＝11.2Hz,1H),3.28-3.24(m,1H),3.22-3.18(m,1H),3.01(t,J＝10.8Hz,1H),2.83(t,J＝12.4Hz,1H),1.36-1.27(m,1H),1.27(s,2H)。
步骤3：合成外消旋反式-4-硫基氧杂环己-3-醇
Figure BDA0003506402190001401
在室温下，向外消旋[反式-3-羟基四氢吡喃-4-基)硫基](苯基)甲酮(2.50g，10.5mmol)于二氯甲烷(25mL)中的经搅拌溶液中缓慢添加水合肼(5.15mL，10当量，105mmol)并且将反应混合物搅拌1h。通过TLC监测反应进程，反应完成时，将反应块状物用1N HCl淬灭使得将pH调节至2-3。将两个层分离并且将有机层经硫酸钠干燥，过滤并部分蒸发，并且将粗外消旋反式-4-硫基四氢吡喃-3-醇用于下一步骤。
步骤4：合成反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇和反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇
Figure BDA0003506402190001402
在0℃下，向2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(1.85g，0.8当量，8.41mmol)于甲醇(40mL)中的经搅拌溶液中添加含外消旋反式-4-硫基四氢吡喃-3-醇(1.41g，10.5mmol)的DCM并且接着将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成时，将完成的反应块状物减压蒸发，得到粗物质，通过快速柱色谱法对其进行纯化。在20％EtOAc:正己烷中洗脱出产物，收集纯洗脱份并蒸发，得到标题产物4-(吡啶-2-基二硫基)氧杂环己-3-醇(外消旋混合物)。通过手性制备型HPLC分离异构体。
手性制备型HPLC条件：
柱：CHIRALPAK IA(250mm×20mm×5mic)
流动相：正己烷:含有0.1％DEA的IPA(90:10)
流速：19mL/min
将异构体分离并且从手性制备型HPLC收集各个洗脱份。合并洗脱份并蒸发，得到各个异构体。
(异构体1-350mg，异构体2-350mg)C10H13NO2S2的LC-MS m/z计算值；243.34，实验值244[M+H]+。
异构体1(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇)：
1H-NMR(400MHz,DMSO):δ8.53(s,1H),7.60(t,J＝6.40Hz,1H),7.40(d,J＝7.2Hz,1H),7.23(t,J＝20.8Hz,1H),4.28-4.06(m,1H),3.94(d,J＝12Hz,1H),3.54-3.40(m,3H),3.33-3.21(m,1H),3.07-2.74(m,1H),2.04-1.94(m,2H)。
异构体2(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇)
1H-NMR(400MHz,DMSO):δ8.52(d,J＝2.8Hz,1H),7.61(t,J＝6.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,1H),7.18(t,J＝5.2Hz,1H),4.12-4.09(m,1H),3.94(d,J＝12Hz,1H),3.53-3.47(m,1H),3.47-3.37(m,1H),3.25(t,J＝10.4Hz,1H),2.80-2.73(m,1H),1.96-1.42(m,1H),1.20(d,J＝6.0Hz,2H)。
任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤5：合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-基酯)
向(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇)(300mg，1.23mmol)于DMF(8mL)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(750mg，2当量，2.47mmol)并且接着在室温下随后添加二异丙基乙胺(644μL，3当量，3.70mmol)持续12h。反应完成时，将反应块状物在水与DCM之间分配。将有机层分离并用盐水溶液洗涤并经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗物质，通过快速柱色谱法对其进行纯化。在25％EtOAc:正己烷中洗脱呈混合物形式的所需化合物。通过反相柱色谱法(10-60％的0.1％甲酸/水/ACN)纯化混合物。合并含有所需产物的洗脱份并蒸发，得到碳酸4-硝基苯酯(反式-(3RS,4RS)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-基酯)(270mg，0.66mmol)。C17H16N2O6S2的LC-MS m/z计算值；408.4，实验值409.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.46(d,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,2H),7.64-7.52(m,2H),7.41(d,J＝8.8Hz,2H),7.09(s,1H),4.87(d,J＝2.8Hz,1H),4.25-4.18(m,1H),3.91(d,J＝11.6Hz,1H),3.52-3.42(m,1H),3.20(d,J＝2.8Hz,1H),2.21(d,J＝12.4Hz,1H),1.98(d,J＝7.6Hz,1H),1.25(s,1H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-基酯)
Figure BDA0003506402190001421
向(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-醇)(340mg，1.40mmol)于DMF(8mL)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(850mg，2当量，2.79mmol)，随后在室温下添加二异丙基乙胺(730μL，3当量，4.19mmol)持续12h。起始材料完成时，将反应混合物在水与DCM之间分配。将有机层分离并用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法(0-40％EtOAc:正己烷)对其进行纯化。将所需产物以混合物形式洗脱出并且接着通过反相柱色谱法(10-50％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化。合并含有所需产物的洗脱份并蒸发，得到碳酸4-硝基苯酯(反式-(3SR,4SR)-4-(吡啶-2-基二硫基)四氢吡喃-3-基酯)(300mg，735μmol)。C17H16N2O6S2的LC-MS m/z计算值；408.4，实验值409.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO):δ8.46(d,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,2H),7.66-7.58(m,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(s,1H),4.87(d,J＝3.6Hz,1H),4.25-4.22(m,1H),3.91(d,J＝11.6Hz,1H),3.52-3.42(m,2H),3.20(d,J＝3.6Hz,1H),2.21(d,J＝12.0Hz,1H),1.98-1.95(m,1H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚酯)
Figure BDA0003506402190001431
步骤1：合成8-氧杂双环[5.1.0]辛烷
Figure BDA0003506402190001432
在0℃下，向环庚烯(1.0g，10.4mmol)于二氯甲烷(10mL)中的经搅拌溶液中添加3-氯苯-1-过氧甲酸(2.15g，1.2当量，12.5mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1h并且接着在室温下搅拌16h。通过TLC监测反应进程。反应完成时，将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液缓慢淬灭并且将混合物剧烈搅拌约30min。将两个层分离，将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到呈无色液体的所需产物(700mg，6.24mmol)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ3.07(s,2H),1.93-1.86(m,4H),1.60-1.43(m,4H),1.21-1.17(m,2H)。
步骤2：合成外消旋[反式-(2-羟基环庚基)硫基](苯基)甲酮
Figure BDA0003506402190001441
在室温下，在氮气气氛下，向8-氧杂双环[5.1.0]辛烷(3.00g，26.7mmol)于甲苯(60mL)中的经搅拌溶液中添加单硫代苯甲酸(4.72mL，1.5当量，40.1mmol)，随后添加氯化2-甲基丙-2-铵(293mg，0.1当量，2.67mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌16h(通过TLC监测反应进程)。反应完成时，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并且接着用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法对其进行纯化。在20％EtOAc:正己烷中洗脱出所需产物，收集纯洗脱份并蒸发，得到标题化合物外消旋[反式-(2-羟基环庚基)硫基](苯基)甲酮(3.0g，12.0mmol)。C14H18O2S的LC-MS m/z计算值；250.4，1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.96(d,J＝8.0Hz,2H),7.57(t,J＝6.8Hz,1H),7.4(t,J＝7.6Hz,2H),3.88-3.85(m,1H),3.81-3.77(m,1H),2.09-2.05(m,1H),2.04-1.62(m,8H),1.55-1.53(m,2H)。
步骤3：合成外消旋反式-4-硫基环庚-3-醇
Figure BDA0003506402190001442
在室温下，在氮气气氛下，向外消旋[反式-(2-羟基环庚基)硫基](苯基)甲酮(2.80g，11.2mmol)于二氯甲烷(25mL)中的经搅拌溶液中添加1,4-二硫基丁-2,3-二醇(173mg，0.1当量，1.12mmol)，随后添加水合肼(1.37mL，2.5当量，28.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h(通过TLC监测反应进程)。反应完成时，将反应混合物用1N HCl淬灭并用DCM(2×30ml)萃取。将有机层合并并经硫酸钠干燥，过滤，将有机层部分蒸发并且直接将粗外消旋反式-4-硫基环庚-3-醇用于下一步骤。
步骤4：合成反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇和反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇
Figure BDA0003506402190001451
在0℃下，在氮气气氛下，向2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(1.73g，0.7当量，7.85mmol)于甲醇(25mL)中的经搅拌溶液中添加含外消旋反式-4-硫基环庚-3-醇(1.64g，11.2mmol)的DCM并且将反应混合物在室温下搅拌12h。通过TLC和LCMS监测反应进程并且将反应块状物减压蒸发。通过快速柱色谱法纯化粗产物并且在20％EtOAc:正己烷中洗脱出所需产物。当产物作为混合物收集时，将其通过反相柱色谱法(10-50％的0.1％甲酸/水:乙腈)再纯化，得到外消旋反式-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇(1.5g，52％)(外消旋混合物)。通过手性制备型HPLC分离异构体。
(异构体-1：550mg，异构体-2：550mg)。
手性制备型HPLC条件：
柱：CHIRALPAK IA(250mm×20mm×5mic)
流动相：正己烷:含有0.1％DEA的IPA(90:10)
流速：19mL/min
将异构体分离并且从手性制备型HPLC收集各个洗脱份。分别蒸发所述洗脱份，得到各个异构体。
异构体1(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇)：
C12H17NOS2的LC-MS m/z计算值；255.4，实验值256.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.49(s,1H),7.56(d,J＝6.8Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,1H),7.13(s,1H),6.17(s,1H),3.51(m,1H),2.75-2.73(m,1H),2.08-1.95(m,2H),1.82-1.67(m,4H),1.57-1.25(m,4H)。
异构体2(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇)：
C12H17NOS2的LC-MS m/z计算值；255.4，实验值256.2[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.50(d,J＝4.40Hz,1H),7.58(t,J＝8.0Hz,1H),7.38(d,J＝8.40Hz,1H),7.13(t,J＝6.4Hz,1H),6.18(s,1H),3.53-3.49(m,1H),2.77-2.72(m,1H),2.11-2.08(m,1H),2.00-1.96(m,1H),1.84-1.67(m,4H),1.59-1.45(m,4H)。
任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤5：合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚酯)
在氮气气氛下，向反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇(500mg，1.96mmol)于DMF(10mL)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(1.49g，2.5当量，4.89mmol)，随后在室温下添加二异丙基乙胺(1.02mL，3当量，5.87mmol)。将反应混合物搅拌12h。反应完成时，将反应混合物在水与DCM之间分配。将两个层分离并且将有机层用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法对其进行纯化。在23％EtOAc:正己烷中洗脱出呈混合物形式的所需产物。通过反相柱色谱法(10-60％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化混合物，得到标题产物碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚酯)(450mg，1.07mmol)。C19H20N2O5S2的LC-MS m/z计算值；420.5，实验值421.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(s,1H),8.27(d,J＝8.8Hz,2H),7.73(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(t,J＝7.6Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),7.09(m,1H),5.04-5.03(m,1H),3.22(m,1H),2.15-2.00(m,3H),1.87-1.79(m,2H),1.72-1.63(m,4H),1.54-1.49(m,2H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚酯)
Figure BDA0003506402190001471
在氮气气氛下，向反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚-1-醇(580mg，2.27mmol)于DMF(10mL)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(1.73g，2.5当量，5.68mmol)，随后添加二异丙基乙胺(1.38mL，3.5当量，7.95mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成时，通过TLC监测，将反应混合物在水与DCM之间分配。将两个层分离并且将合并的有机层用盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发。通过快速柱色谱法纯化粗产物。在23-25％EtOAc:正己烷中洗脱出呈混合物形式的所需产物。通过反相柱色谱法(10-60％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化产物，得到标题化合物碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-2-(吡啶-2-基二硫基)环庚酯)(450mg，1.07mmol)。C19H20N2O5S2的LC-MS m/z计算值；420.5，实验值421.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.46(s,1H),8.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,1H),7.12(m,1H),5.04-5.03(m,1H),3.23(m,1H),2.12-2.00(m,2H),1.87-1.79(m,3H),1.63-1.49(m,6H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘- 2-基酯)
Figure BDA0003506402190001481
步骤1：合成1aH,2H,3H,7bH-萘并[1,2-b]环氧乙烯
Figure BDA0003506402190001482
向1,2-二氢萘(2.0g，15.4mmol)于二氯甲烷(75mL)中的经搅拌溶液中添加饱和碳酸氢钠的饱和溶液(75mL)。将混合物冷却至0℃。在30min的时间段内，向此混合物中逐份添加3-氯苯-1-过氧甲酸(5.30g，2当量，30.7mmol)。在添加后，将反应块状物在室温下搅拌16h。通过TLC监测反应。在反应完成后，将两个层分离并且将有机层经硫酸钠干燥并减压浓缩，得到1aH,2H,3H,7bH-萘并[1,2-b]环氧乙烯(2.77g)。获得的粗产物不经任何进一步纯化即直接用于下一步骤。
步骤2：合成外消旋[反式-(2-羟基-1,2,3,4-四氢萘-1-基)硫基](苯基)甲酮
Figure BDA0003506402190001483
向1aH,2H,3H,7bH-萘并[1,2-b]环氧乙烯(2.25g，15.4mmol)于乙氧乙烷(20mL)中的经搅拌溶液中滴加硅烷二酮(4.50g，74.9mmol)和单硫代苯甲酸(9.06mL，5当量，77.0mmol)。使混合物在室温下搅拌16h。通过TLC和LCMS监测反应进程。在反应完成后，将反应混合物用饱和碳酸钠溶液(25mL)淬灭并用乙酸乙酯(2×20mL)萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤并且经硫酸钠干燥并减压浓缩，获得粗物质，其通过柱色谱法纯化，得到呈黄色液体的外消旋[反式-(2-羟基-1,2,3,4-四氢萘-1-基)硫基](苯基)甲酮(1.57mg，35.87％)。
步骤3：合成外消旋反式-1-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇
Figure BDA0003506402190001491
向外消旋反式-[(2-羟基-1,2,3,4-四氢萘-1-基)硫基](苯基)甲酮(1.40g，4.92mmol)于二氯甲烷(25.0mL)中的经搅拌溶液中添加(2R,3R)-1,4-二硫基丁-2,3-二醇(144mg，0.19当量，935μmol)和水合肼(60.4μL，0.25当量，1.23mmol)。将反应块状物在室温下搅拌3h。通过TLC监测反应。在反应完成后，将反应混合物用HCl溶液(pH＝1～2)淬灭。将DCM层分离并经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到外消旋反式-1-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，其按原样用于下一步骤。
步骤4：合成反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇和反式-(1SR,2SR)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇
Figure BDA0003506402190001492
在0℃下，向2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(867mg，0.8当量，3.94mmol)于甲醇(5mL)中的经搅拌溶液中。向其中滴加获自前一步骤的含外消旋反式-1-硫基-1,2,3,4-四氢萘-2-醇的DCM。使反应物在室温下搅拌16h。通过LCMS和TLC监测反应。在反应完成后，将反应块状物减压浓缩，得到粗物质，其通过柱色谱法纯化，得到呈黄色油状物的外消旋1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇，其通过反相柱色谱法进一步纯化，得到无色油状物(380mg，26.69％)。通过手性色谱法分离获得的外消旋产物，得到异构体-1：130mg；异构体-2：190mg。
制备型条件：
柱：CHIRALPAK IA(250mM×420mm×5mic)
流动相：正己烷:含有0.1％DEA的乙醇(50:50)
流速：19mL/min
异构体-1(反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇)：
C15H15NOS2的LC-MS m/z计算值；289.4，实验值290.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.07(d,J＝7.2Hz,2H),7.61-7.57(m,1H),7.48-7.44(m,2H),7.36-7.34(m,1H),7.18-7.13(m,3H),4.98(d,J＝4.4Hz,1H),4.24(m,1H),3.07-2.99(m,1H),2.91-2.80(m,1H)。
异构体-2(反式-(1SR,2SR)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇)
C15H15NOS2的LC-MS m/z计算值；289.4，实验值290.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.55(d,J＝4.0Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),7.26-7.17(m,3H),7.08(d,J＝7.2Hz,1H),4.15(d,J＝8.0Hz,1H),3.97-3.93(m,1H),2.89(d,J＝4.8Hz,2H),2.32-2.28(m,1H),1.97-1.87(m,2H)。
任意指定异构体的绝对立体化学。
步骤5.合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)
在室温下，向反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(170mg，587μmol)于N,N-二甲基甲酰胺(2.50mL)中的经搅拌溶液中滴加碳酸双(4-硝基苯酯)(447mg，2.5当量，1.47mmol)，随后添加二异丙基乙胺(307μL，3当量，1.76mmol)。在密封管中，将反应混合物在室温下搅拌12h。通过TLC和LCMS监测反应。在反应完成后，将反应块状物在水(5mL)与DCM(5mL)之间分配。将有机层经硫酸钠干燥并减压蒸发，得到粗物质，其通过快速柱色谱法(0-40％EA/己烷)纯化并且也通过反相柱色谱法(10-70％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化，得到呈无色胶状固体的碳酸4-硝基苯酯(反式-(1RS,2RS)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)(70.0mg，154μmol)(70mg，26.22％)。C22H18N2O4S2的LC-MS m/z计算值；454.5，实验值455.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.73(d,J＝20.4Hz,1H),8.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(s,2H),7.50(m,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.25-7.16(m,4H),5.51(s,1H),4.52(s,1H),3.01-2.85(m,2H),2.63(m,1H),2.26-2.22(m,1H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘- 2-基酯)
Figure BDA0003506402190001511
在室温下，向反式-(1SR,2SR)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(120mg，415μmol)于N,N-二甲基甲酰胺(1.50mL)中的经搅拌溶液中滴加碳酸双(4-硝基苯酯)(315mg，2.5当量，1.04mmol)，随后添加二异丙基乙胺(217μL，3当量，1.24mmol)。在密封管中，将反应混合物在室温下搅拌12h。通过TLC和LCMS监测反应进程。在反应完成后，将反应块状物在水(5mL)与DCM(5mL)之间分配，将有机层经硫酸钠干燥并减压蒸发，得到粗物质，所述粗物质通过快速柱色谱法(0-40％EA/己烷)纯化并且也通过反相柱色谱法(10-70％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化，得到呈无色胶状固体(65mg，34.49％)的碳酸4-硝基苯酯(反式-(1SR,2SR)-1-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基酯)(65.0mg，143μmol)。
C22H18N2O4S2的LC-MS m/z计算值；454.5，实验值455.3[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.55(m,1H),8.22(d,J＝7.6Hz,2H),7.69(s,2H),7.51(m,1H),7.32(d,J＝7.6Hz,2H),7.25-7.16(m,4H),5.51(s,1H),4.52(s,1H),3.01-2.86(m,2H),2.62(m,1H),2.26(m,1H)。
合成碳酸4-硝基苯酯(反式-4-(吡啶-2-基二硫基)环己基酯)
Figure BDA0003506402190001521
步骤1：合成反式-4-巯基环己-1-醇
Figure BDA0003506402190001522
向7-氧杂双环[2.2.1]庚烷(1.00g，10.2mmol)于乙醇(10mL)中的经搅拌溶液中添加4-甲基苯-1-磺酸(2.63g，1.5当量，15.3mmol)、硫脲(1.16g，1.5当量，15.3mmol)并且将反应块状物加热至80℃持续24h。接着，将反应块状物冷却至室温并且将50％氢氧化钠水溶液(1.30g，3.2当量，32.6mmol)添加至反应块状物中并在100℃下加热2h。反应完成后，将反应块状物冷却至室温，减压浓缩并用10％H2SO4溶液酸化。接着，将反应块状物用DCM萃取并原样用于下一步骤。
步骤2：合成反式-4-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇
Figure BDA0003506402190001531
在0℃下，将2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(1.60g，0.8当量，7.26mmol)于甲醇(10.0mL)中的经搅拌溶液添加至来自(步骤1)4-硫基环己-1-醇(1.20g，9.08mmol)的有机层中。添加完成后，使反应块状物在室温下搅拌16h。反应完成后，将反应块状物浓缩并通过柱色谱法(使用0-40％EtOAc:正己烷)纯化粗产物，得到所需产物。通过反相柱色谱法使用0.1％甲酸和ACN再纯化产物。收集含有所需产物的洗脱份并减压浓缩，得到呈黄色油状物的标题产物(1.60g，73％产率)。C11H15NOS2的LC-MS m/z计算值，241；实验值242[M+H]+。
步骤3：合成碳酸4-硝基苯酯(反式-4-(吡啶-2-基二硫基)环己酯)
在氮气气氛下，向反式-4-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇(400mg，1.66mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的经搅拌溶液中添加碳酸双(4-硝基苯酯)(907mg，1.8当量，2.98mmol)、乙基双(丙-2-基)胺(892μL，3当量，4.97mmol)并在室温下搅拌16h。通过TLC监测反应进程。反应完成后，将反应块状物用水(15mL)淬灭并用DCM(3×10mL)萃取。将两个层分离并且将合并的有机层用水，随后盐水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过快速柱色谱法(0-30％EtOAc:正己烷)纯化获得的粗产物。通过反相柱色谱法使用0.1％甲酸和ACN再纯化产物。收集含有所需产物的洗脱份并减压浓缩，得到呈黄色油状物的碳酸4-硝基苯酯(反式-4-(吡啶-2-基二硫基)环己酯)(0.3g，73％产率)。C18H18N2O5S2的LC-MS m/z计算值为407；实验值407[M+H]+；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.49-8.42(m,1H),8.26(d,J＝8.0Hz,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.65-7.60(m,1H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.12-7.05(m,1H),4.75-4.65(m,1H),2.98-2.87(m,1H),2.28-2.18(m,4H),1.68-1.50(m,4H)。
合成碳酸(2R)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁酯4-硝基苯酯
Figure BDA0003506402190001541
步骤1.合成苯甲酰基硫化铯
Figure BDA0003506402190001542
在氮气气氛下，在10-15min内，向单硫代苯甲酸(5.00g，36.2mmol)于甲醇(40.0mL)中的经搅拌溶液中逐份添加碳酸铯(7.72g，1.1当量，39.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。反应完成(如通过TLC判定)后，将反应混合物减压浓缩。将固体残余物用10mL的丙酮稀释并且过滤出白色固体(CsHCO3)。将此过程重复两次以确保除去所有CsHCO3。接着浓缩丙酮，得到呈无色固体的苯甲酰基硫化铯(9.50g，35.2mmol)。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.08(d,J＝6.8Hz,2H),7.37-7.27(m,3H)。
步骤2.合成(2R)-2-(苯甲酰基硫基)-3-甲基丁酸
Figure BDA0003506402190001543
向(2S)-2-溴-3-甲基丁酸(2.00g，11.0mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(14.0mL)中的经搅拌溶液中添加苯甲酰基硫化铯(2.98g，11.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌20h。通过TLC监测反应进程，反应完成后，将反应混合物用二乙醚(3×15mL)稀释并用水(3×15mL)洗涤。将醚层分离，经硫酸钠干燥并减压浓缩。从正己烷重结晶获得的残余物，得到呈油性化合物的(2R)-2-(苯甲酰基硫基)-3-甲基丁酸(2.50g，10.5mmol)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.93(s,1H),7.92(d,J＝7.2Hz,2H),7.69(t,J＝7.6Hz,1H),7.55(t,J＝7.2Hz,2H),4.14(d,J＝6.8Hz,1H),2.30-2.22(m,1H),1.01-0.89(m,6H)。
步骤3.合成(2R)-3-甲基-2-硫基丁-1-醇
Figure BDA0003506402190001551
在0℃下，在氮气气氛下，向(2R)-2-(苯甲酰基硫基)-3-甲基丁酸(2.50g，10.5mmol)于乙氧乙烷(50.0mL)中的经搅拌溶液中以逐滴方式添加氢化铝锂(52.5mL，5当量，52.5mmol)。添加完成后，移除冰浴并且将反应混合物在室温下搅拌2h。通过TLC监测反应进程。在起始材料完成之后，在0℃下将反应混合物在冰浴中冷却并用1.0N HCl(30mL)淬灭。将反应混合物用DCM(20mL)萃取并且因LAH还原的剩余凝胶状材料用二乙醚(10mL)洗涤。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并且进一步进行下一步骤。
步骤4.合成(2R)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁-1-醇
Figure BDA0003506402190001552
在氮气气氛下，向(2R)-3-甲基-2-硫基丁-1-醇(1.20g，9.98mmol)于MeOH(5mL)中的经搅拌溶液中添加2-(吡啶-2-基二硫基)吡啶(1.76g，0.8当量，7.99mmol)并在室温下搅拌16h。通过TLC和LC-MS监测反应进程。反应完成后，将反应块状物浓缩，并且接着用DCM萃取。将两个层分离并且将合并的有机层用水，随后盐水洗涤并且经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过硅胶快速柱色谱法(使用12g柱)纯化粗产物，所述粗产物是在50％EtOAc:正己烷中洗脱出并且也通过反相柱色谱法(10-20％的0.1％甲酸/水/乙腈)再纯化。收集含有产物的洗脱份并在真空下蒸发掉，获得标题产物。通过制备型HPLC再纯化产物。
制备型HPLC条件：
柱：X-BridgeC-18(250mm×4.6mm×5mic)
流动相(A)：0.1％氨水
流动相(B)：乙腈
流速：19mL/min
梯度B：0/10，12/60，22/95，25/95，27/10，30/10
将从制备型HPLC收集的洗脱份合并并蒸发，得到呈黄色固体的标题产物3-(吡啶-2-基二硫基)-1,2,3,4-四氢萘-2-醇(350mg，1.21mmol)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.49(d,J＝4Hz,1H),7.55-7.54(m,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.13(t,J＝6.4Hz,1H),3.82(dd,J＝12.4Hz,1H),3.66-3.60(m,1H),2.75-2.70(m,1H),2.01-1.92(m,1H),1.10-1.01(m,7H)。
步骤5.碳酸(2R)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁酯4-硝基苯酯
在室温下，向(2R)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁-1-醇(800mg，3.49mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(2.50mL)中的经搅拌溶液中添加双碳酸(4-硝基苯酯)(2.12g，2当量，6.98mmol)，随后添加二异丙基乙胺(1.82mL，3当量，10.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应块状物在水与DCM之间分配。将两个层分离并且将有机层经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，通过快速柱色谱法(0-40％EtOAc:正己烷)对其进行纯化。通过反相色谱法(10-70％的0.1％甲酸/水/ACN)再纯化产物，获得呈无色胶状物的标题产物碳酸(2R)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁酯4-硝基苯酯(600mg，1.52mmol)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(d,J＝4.0Hz,1H),8.26(d,J＝9.2Hz,2H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.2Hz,1H),7.35(d,J＝9.2Hz,2H),7.08(t,J＝6.8Hz,1H),4.59-4.48(m,2H),3.08(q,J＝6.0Hz,1H),2.21-2.13(m,1H),1.14-1.06(m,6H)。
从步骤2，遵循同一程序使用(2R)-2-溴-3-甲基丁酸来合成碳酸(2S)-3-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)丁酯4-硝基苯酯。
从中间体III-2合成实施例2的化合物
Figure BDA0003506402190001571
向含有Pv2(25.0mg，0.061mmol；呈自由流动固体)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2S)-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯](6.03mg，0.091mmol)的小瓶中添加1mL的CH3CN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(22.7mg，0.224mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，P repSlope_4min，20-85％CH3CN/H2O+0.05％TFA，15min)直接纯化反应混合物，得到所需产物(13.0mg，产率：47.0％)。
分别从中间体III-1和III-3至III-9类似于实施例2的化合物合成实施例1和3-9的化合物(参见下表4)。
从中间体XVI-1合成实施例10的化合物
Figure BDA0003506402190001581
使用N2气流将DMF和PBS脱气30min。在独立小瓶中置放Pv2(25.0mg，0.061mmol；呈自由流动固体)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[4-(2-吡啶基二硫基)苯基]甲酯(6.5mg，0.09mmol)、1.5mL的DMF和0.5mL的PBS。向其中添加CH3CO2H(0.0347mL，0.606mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(PrepSlope_4min，30-100％CH3CN/H2O+0.05％TFA，18min)纯化反应混合物，得到所需产物(3.0mg，产率：10.7％)。
下文呈现本发明的化合物和分析数据。
表4.实施例化合物
Figure BDA0003506402190001582
Figure BDA0003506402190001591
Figure BDA0003506402190001601
Figure BDA0003506402190001611
实施例11：化合物11的合成
Figure BDA0003506402190001612
步骤1.合成2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇
Figure BDA0003506402190001613
向1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(15.2g，68.9mmol)于MeOH(用N2脱气)(30mL)中的溶液中滴加(1-巯基环丁基)甲醇(11.4g，86.2mmol)(用N2脱气)并在室温下在N2气氛下搅拌16h。将反应混合物在真空下浓缩至干。通过柱色谱法使用30％EtOAc/己烷纯化所得粗物质，得到呈黄色液体的标题化合物。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.54-8.53(m,1H),7.60-7.56(m,1H),7.40-7.38(m,1H),7.17-7.14(m,1H),3.38-3.34(m,1H),2.62-2.57(m,1H),2.11-2.02(m,1H),1.75-1.74(m,2H),1.61-1.60(m,1H),1.42-1.24(m,4H)。
使标题化合物进行手性制备型HPLC条件(Chiralpak IG：250mm×20mm×5mic；正己烷:含有0.1％二乙胺的IPA(80:20)；19mL/min；25℃(室温))。首先洗脱(1R,2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇(4.5g，18.6mmol)(保留时间：3.9分钟)，随后洗脱(1S,2S)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇(保留时间：11.3分钟)。通过将步骤2的产物与具有报告的绝对立体化学的手性材料比较来确认绝对立体化学(参见Monaco,M.R.；J.Am.Chem.Soc.2014,136,49,16982-16985)。
步骤2.合成碳酸4-硝基苯酯((1S,2S)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己酯)。
Figure BDA0003506402190001621
在室温下，向(1R,2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇(4.5g，18.6mmol)于DMF(90.0mL)中的溶液中添加DIPEA(10.3mL，56.0mmol)和碳酸双(4-硝基苯酯)(11.35g，27.3mmol)。将反应容器密封并在室温下搅拌12h。通过TLC(20％EtOAc/己烷)监测反应进程。反应完成后，将反应混合物用水(20.0mL)淬灭并用EtOAc(20.0mL)萃取。将有机层分离，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗产物，所述粗产物通过柱色谱法使用20-30％EtOAc/己烷纯化，得到呈灰白色固体的标题产物(5.0g，66％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.44(d,J＝4Hz,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,2H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.61-7.57(t,J＝7.6Hz,1H),7.41(d,J＝9.6Hz,2H),7.08-7.05(t,J＝5.2Hz,1H),4.85-4.74(m,1H),3.03-2.92(m,1H),2.28(d,J＝9.6Hz,1H),2.20-2.12(m,1H),1.85-1.62(m,3H),1.45-1.25(m,3H)。LC-MS m/z计算值：406.7；实验值：407.4[M+H]+。
步骤3.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24)17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(1S,2S)-2-(2-吡啶基二硫基)环己酯]。
Figure BDA0003506402190001631
向含(10S,23S)-23-氨基-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-5,9-二酮甲磺酸(250mg，0.470mmol)的10mL无水DMF中添加(1R,2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己-1-醇(来自步骤2；191mg，0.470mmol)、N,N-二异丙基乙胺(122mg，0.941mmol)和DMAP(115mg，0.941mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示已形成所需偶联产物。接着将反应混合物用EtOAc稀释，用饱和NH4Cl水溶液、H2O和盐水洗涤。将混合物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法使用0-5％MeOH/二氯甲烷纯化粗残余物，得到72.6％产率(240mg)的240mg所需产物。
步骤4.与Pv1偶联(化合物11)
在小瓶中添加Pv1(275mg，.0811mmol)、步骤3的化合物(74.1mg，0.105mmol)、乙腈(10mL)和水(5mL)。将n-甲基吗啉(0.303g，.0030mol)添加至此混合物中。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示已形成所需偶联产物。
通过反相HPLC(20-85％乙腈/水，0.5％乙酸于Sunfire制备型C18柱(10μm，50×150mm)上，保留时间：7.022min)直接纯化反应混合物，得到68％产率(213mg)的213mg所需产物。ESI(M+3H/3)3+:1291.6
实施例12：化合物12的合成
Figure BDA0003506402190001641
步骤1.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(1R,2R)-1-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯]
向1-羟基苯并三唑水合物(8.64mg，0.0564mmol)、细粉状分子筛
Figure BDA0003506402190001642
(50mg)和(10S,23S)-23-氨基-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-5,9-二酮甲磺酸(25.0mg，0.0470mmol)和吡啶(0.0190mL，0.235mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加碳酸[(1R,2R)-1-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯](4-硝基苯酯)(19.7mg，0.470mmol)(参见合成II-4：碳酸4-硝基苯酯((2R,3R)-3-(吡啶-2-基二硫基)丁-2-基酯))。在室温下搅拌16h后，过滤混合物，并且浓缩溶液。接着通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(35.0mg，0.0517mmol，产率：110％)。
步骤2.与肽Pv1偶联(化合物12)
在小瓶中置放肽Pv1(50.0mg，14.7e-5mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(1R,2R)-1-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丙酯](0.013g，1.92e-5mol)、2mL的ACN和1mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.060mL，0.000545mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-85％ACN/H2O+0.05％TFA，13min；保留时间：6.95min)直接纯化反应混合物，得到化合物12(0.0350g，9.10e-6mol，产率：61.8％)。ESI(M+3H/3)3+:1281.9
实施例13：化合物13的合成
Figure BDA0003506402190001651
化合物13是以类似于化合物11的方式制得，在步骤2中用碳酸((1R,2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己酯)代替碳酸((1S,2S)-2-(吡啶-2-基二硫基)环己酯)。Sunfire制备型C18柱(10μm，50×150mm)(20-85％乙腈/水，0.5％乙酸)；保留时间：6.609分钟。ESI(M+3H/3)3+:1290.3
实施例14：化合物14的合成
Figure BDA0003506402190001661
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯]
根据化合物11的合成中所描述的类似合成方法，使用有待从外消旋反式-2-(2-吡啶基二硫基)环戊基的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊-1-醇)来合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)、DMAP(23.0mg，0.188mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯](40.6mg，0.103mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(33.0mg，0.0479mmol，产率：50.9％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物14)
在小瓶中置放肽Pv1(50.0mg，1.47e-5mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯](0.0124g，1.80e-5mol)、2mL的ACN和1mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.060mL，0.000545mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-90％ACN/H2O+0.05％TFA，16min；保留时间：6.761min)直接纯化反应混合物，得到化合物14(0.0360g，9.34e-6mol，产率：63.3％)。ESI(M+3H/3)3+:1286.3。
实施例15：化合物15的合成
Figure BDA0003506402190001671
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-2-(2-吡啶基二硫基)环戊基的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊-1-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)、DMAP(23.0mg，0.188mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯](38.2mg，0.0974mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(29.0mg，0.0421mmol，产率：44.8％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物15)
在小瓶中置放肽Pv1(50.0mg，1.47e-5mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸反式-[(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环戊酯](0.0124g，1.80e-5mol)、2mL的ACN和1mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.060mL，0.000545mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-90％ACN/H2O+0.05％TFA，16min；保留时间：6.883min)直接纯化反应混合物，得到化合物15(0.0280g，7.26e-6mol，产率：49.3％)。ESI(M+3H/3)3+:1285.9。
实施例16：化合物16的合成
Figure BDA0003506402190001691
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-醇的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)、DMAP(23.0mg，0.188mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯](38.2mg，0.0969mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(40.0mg，0.0579mmol，产率：61.6％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物16)
在小瓶中置放肽Pv1(50.0mg，1.47e-5mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯](0.0124g，1.80e-5mol)、2mL的ACN和1mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.060mL，0.000545mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-80％ACN/H2O+0.05％TFA，15min；保留时间：6.633min)直接纯化反应混合物，得到化合物16(0.0290g，7.52e-6mol，产率：51.0％)。ESI(M+3H/3)3+:1286.4。
实施例17：化合物17的合成
Figure BDA0003506402190001701
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-醇的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)、DMAP(23.0mg，0.188mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯](38.2mg，0.0969mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯](31.0mg，0.0449mmol，产率：47.7％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物17)
在小瓶中置放肽Pv1(50.0mg，1.47e-5mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢呋喃-3-基酯](0.0124g，1.80e-5mol)、2mL的ACN和1mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.060mL，0.000545mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-85％ACN/H2O+0.05％TFA，13min；保留时间：6.670min)直接纯化反应混合物，得到化合物17(0.0170g，4.41e-6mol，产率：29.9％)。ESI(M+3H/3)3+:1286.7。
实施例18：化合物18的合成
Figure BDA0003506402190001721
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(2RS,3RS)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(2RS,3RS)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(2RS,3RS)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(2RS,3RS)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](32.1mg，0.0705mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(26.0mg，0.0346mmol，产率：73.6％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物18)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(2RS,3RS)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](0.00719g，9.58e-6mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.851min)直接纯化反应混合物，得到化合物18(0.0080g，2.04e-6mol，产率：27.7％)。ESI(M+3H/3)3+:1307.4。
实施例19：化合物19的合成
Figure BDA0003506402190001731
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](32.1mg，0.0705mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](10.0mg，0.0133mmol，产率：28.3％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物19)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(2SR,3SR)-3-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](0.010g，1.33e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。
通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.855)直接纯化反应混合物，得到化合物19(0.0060g，1.33e-5mol，产率：20.8％)。ESI(M+3H/3)3+:1307.6。
实施例20：化合物20的合成
Figure BDA0003506402190001751
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-醇的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(2RS,3RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](23.1mg，0.0564mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](30.0mg，0.0426mmol，产率：90.5％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物20)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3RS,4RS)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](0.00779g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，30-85％ACN/H2O+0.05％TFA，13min；保留时间：6.380)直接纯化反应混合物，得到化合物20(0.0060g，1.55e-6mol，产率：21.0％)。ESI(M+3H/3)3+:1292.3。
实施例21：化合物21的合成
Figure BDA0003506402190001761
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-醇的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(2SR,3SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](23.1mg，0.0564mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](25.0mg，0.0355mmol，产率：75.4％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物21)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(3SR,4SR)-4-(2-吡啶基二硫基)四氢吡喃-3-基酯](0.00779g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。
通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-70％ACN/H2O+0.05％TFA，17min；保留时间：6.765min)直接纯化反应混合物，得到化合物21(0.021g，5.42e-6mol，产率：73.6％)。ESI(M+3H/3)3+:1291.1。
实施例22：化合物22的合成
Figure BDA0003506402190001781
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-2-(2-吡啶基二硫基)环庚-1-醇的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚-1-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯](23.7mg，0.0564mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(29.0mg，0.0405mmol，产率：86.0％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物22)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1RS,2RS)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯](0.00792g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-70％ACN/H2O+0.05％TFA，17min；保留时间：6.868min)直接纯化反应混合物，得到化合物22(0.020g，5.15e-6mol，产率：69.9％)。ESI(M+3H/3)3+:1296.3。
实施例23：化合物23的合成
Figure BDA0003506402190001791
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-2-(2-吡啶基二硫基)环庚-1-醇的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚-1-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯](23.7mg，0.0564mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(31.0mg，0.0432mmol，产率：91.9％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物23)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1SR,2SR)-2-(2-吡啶基二硫基)环庚酯](0.00792g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-88％ACN/H2O+0.05％TFA，17min；保留时间：7.178min)直接纯化反应混合物，得到化合物23(0.020g，5.15e-6mol，产率：69.9％)。ESI(M+3H/3)3+:1296.0。
实施例24：化合物24的合成
Figure BDA0003506402190001811
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-1-(1RS,2RS)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇的手性色谱法分离洗脱的第一立体异构体(指定为反式-(1RS,2RS)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1RS,2RS)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-1-(1RS,2RS)-2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](32.1mg，0.0705mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(20.0mg，0.0266mmol，产率：56.6％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(实施例24)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-1-(1RS,2RS)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](0.0083g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.968)直接纯化反应混合物，得到化合物24(0.012g，3.06e-6mol，产率：41.6％)。ESI(M+3H/3)3+:1307.2
实施例25：化合物25的合成
Figure BDA0003506402190001821
步骤1.合成碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
使用化合物11的合成中所描述的类似合成方法，由有待从外消旋反式-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇的手性色谱法分离洗脱的第二立体异构体(指定为反式-(1SR,2SR)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-醇)合成标题化合物。
步骤2.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1SR,2SR)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](25mg，0.0470mmol)、DMAP(11.5mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[反式-(1SR,2SR)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](32.1mg，0.0705mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(18μL，0.941mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(22.0mg，0.0293mmol，产率：62.3％)。
步骤3.与肽Pv1偶联(化合物25)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-(1SR,2SR)-1-(2-吡啶基二硫基)四氢萘-2-基酯](0.0083g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。
通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.944)直接纯化反应混合物，得到化合物25(0.013g，3.32e-6mol，产率：45.0％)。ESI(M+3H/3)3+:1307.0
实施例26：化合物26的合成
Figure BDA0003506402190001841
步骤1.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-4-(2-吡啶基二硫基)环己酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)[4-(2-吡啶基二硫基)环己酯](由市售反式-4-巯基环己-1-醇合成)(42.1mg，0.103mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(45.0mg，0.0640mmol，产率：68.1％)。
步骤2.与肽Pv1偶联(化合物26)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[反式-4-(2-吡啶基二硫基)环己酯](0.00777g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。
通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.593min)直接纯化反应混合物，得到化合物26(0.028g，7.23e-6mol，产率：98.2％)。ESI(M+3H/3)3+:1291.0。
实施例27：化合物27的合成
Figure BDA0003506402190001851
步骤1.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2S)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)和碳酸[(2S)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯](4-硝基苯酯)(由L-缬氨酸合成，参见J.Org.Chem.1990,55,2286-2288)(40.8mg，0.103mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(48.0mg，0.0695mmol，产率：73.9％)。
步骤2.与肽Pv1偶联(化合物27)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6mol)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2S)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯](0.00764g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.773min)直接纯化反应混合物，得到化合物27(0.024g，6.22e-6mol，产率：84.4％)。ESI(M+3H/3)3+:1286.8。
实施例28：化合物28的合成
Figure BDA0003506402190001861
步骤1.合成N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2R)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯]
向甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](50mg，0.0941mmol)和碳酸(4-硝基苯酯)(2R)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯](由D-缬氨酸合成，参见J.Org.Chem.1990,55,2286-2288)(40.8mg，0.103mmol)于2mL无水DMF中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(35μL，0.188mmol)。在室温下搅拌16h后，将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用30mL的饱和NH4Cl、30mL的水和20mL的盐水洗涤。浓缩有机层并且通过柱色谱法(0-3％MeOH/DCM)纯化残余物，得到标题化合物(41.0mg，0.0594mmol，产率：63.1％)。
步骤2.与肽Pv1偶联(化合物28)
在小瓶中置放肽Pv1(25.0mg，7.37e-6)、N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂己环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.020,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16(24),17,19-庚烯-23-基]氨基甲酸[(2R)-3-甲基-2-(2-吡啶基二硫基)丁酯](0.00764g，1.11e-5mol)、1mL的ACN和0.5mL的水。向其中添加N-甲基吗啉(0.030mL，0.000273mol)。将混合物在室温下搅拌65h。LC-MS指示反应完全。通过反相HPLC(Waters SunfirePrep C18，PrepSlope_4min，20-95％ACN/H2O+0.05％TFA，20min；保留时间：6.708min)直接纯化反应混合物，得到化合物28(0.012g，3.08e-6mol，产率：41.8％)。ESI(M+3H/3)3+:1287.8。
实施例29：化合物29的合成
Figure BDA0003506402190001871
分析方法：在Agilent 1200系列、1100系列或6130系列LC/MS系统上使用MerckChromolith RP-18e分析型HPLC柱(整体式，50×2mm)和以下分析型HPLC方法来测定色谱纯度：注射体积5μL；流速1mL/min；含有0.05％AcOH(方法A)或0.05％TFA(方法B)的5→95％乙腈/水，历时5分钟；在l＝254、220或195nm下的Agilent二极管阵列检测器；室温。
步骤1.制备N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[去]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺
将3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2,5-二氧代基吡咯烷-1-基酯(180mg，0.576mmol)于DMF(4mL)中的溶液添加至固体甲磺酸依喜替康[CAS：169869-90-3](80mg，0.150mmol)中，接着添加水性PBS缓冲液(4mL，pH＝7.4，50mM)并且声波处理约5分钟。将浑浊混合物在环境温度下搅拌2小时，并确定反应完成约25％。添加乙酸铵(11mg，0.143mmol)和额外2mL的DMF，并且将所得混合物在环境温度下搅拌18小时。用TFA(80mL，0.98mmol)使混合物呈酸性，并分成2等份。每个个别部分在Redi-Sep C18 50g滤筒上纯化并用含有TFA(0.05％v/v)的乙腈(5％至95％)/水的梯度洗脱。将合并的洗脱份冷冻并冻干，得到呈淡黄色固体的标题化合物(42mg，44％)。在254nm处的HPLC纯度：97％。保留时间：2.50min(方法A)。MS数据，633.2(M+H)+。
步骤2.与肽Pv1偶联(化合物29)
将固体肽Pv1(168.4mg，0.0480mmol)添加至固体N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[去]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺(30.5mg，0.0482mmol)中并且在声波处理(约1分钟)下溶解于DMF(2mL)中并用氮气冲洗。添加4-甲基吗啉(20mL，0.182mmol)并且将溶液在环境温度下保持18h。用乙酸(17mL，0.296mmol)使溶液呈酸性，将其施加至Biotage C18 300A 25g反相柱并用含有TFA (0.05％v/v)的乙腈(25％至95％)/水的梯度洗脱。将合并的洗脱份冷冻并冻干，得到淡黄色固体。将产物溶解于DMSO(3mL)中并且将1mL份溶液在Biotage C18 300A 25g反相柱上单独地纯化，用含有乙酸铵(10mM)的溶液(乙腈/水/2-丙醇，3/2/1)/水的梯度(25％至95％)洗脱。将合并的洗脱份冷冻并冻干，得到淡黄色固体，将其溶解于含有0.4％TFA的水/乙腈(2/1)中，转移至称过皮重的小瓶中并冻干成固体，化合物29(128mg，66％)。在254nm处的HPLC纯度：>95％。保留时间：3.19min(方法B)，MS数据：1900.6(M+2H/2)2+，1267.3(M+3H/3)3+。
实施例A.生长延迟测定
在含有10％FBS的生长培养基中，将细胞接种于96孔黑色壁透明底板(Griener)中，以2500个细胞/孔接种DLD-1WT细胞，以5000个细胞/孔接种FaDu和HeLa细胞，并且以3000个细胞/孔接种HCT116。使细胞在室温下粘附60分钟，随后返回至37C、5％CO2温育箱。在24小时后，移除培养基并用含有各种药物浓度的新鲜生长培养基替换。一式三份地添加每个药物浓度。未经药物处理的对照仅含有生长培养基。使细胞返回至温育箱。在添加药物后九十六小时，将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟并用1μg/mL的Hoechst染色。板在Cytation 5自动成像仪(BioTek)上成像并使用CellProfiler(http://cellprofiler.org)计数细胞。计算细胞生长延迟百分比并使用GraphPad Prism绘制数据。
Figure BDA0003506402190001891
*IC＝不完全曲线。
Figure BDA0003506402190001892
Figure BDA0003506402190001901
实施例B：化合物11在大鼠模型中的血浆药物动力学
动物给药
雄性Sprague Dawley大鼠在装运之前在Envigo Labs进行颈静脉套管插入术和插入血管进入按钮(VAB，Instech Labs目录号VABR1B/22)。磁性铝盖(Instech Labs目录号VABRC)用于保护颈静脉导管的进入口，使动物在研究之前的4-5天内，在玉米芯垫料上每笼圈养2只。向大鼠施用单一静脉内剂量5mg/kg的在5％甘露醇于柠檬酸盐缓冲液中的媒介物中制备的化合物11。在化合物施用后1、2、4、8、24和30小时，将来自喂养大鼠的血液(250μL)收集至填充有K2EDTA的微量容器中。通过离心分离血浆并且将100μL等分试样转移至干冰上的96孔聚丙烯板。样品在-80℃下储存直至通过ELISA对总肽进行定量处理并通过LC-MS/MS对释放的依喜替康进行定量处理。
总肽血浆浓度的ELISA测量
将96孔板用100微升/孔的在0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.4)中制备的0.1μM BSA标记的肽包被并在4℃下温育过夜。将板用ELISA洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤4次，在室温下用封闭缓冲液(PBS+5％干乳+0.05％Tween 20)(300微升/孔)温育2小时并用ELISA洗涤缓冲液再次洗涤4次。同时，对照血浆和研究血浆样品中的2×化合物11标准品与1-10ng/mL的对Pv1肽具有特异性的初级抗体在室温下预温育30分钟。将预温育的样品以100微升/孔添加至预包被、预封闭测定板并在室温下温育1小时。将板用ELISA洗涤缓冲液洗涤4次并在室温下与100微升/孔的次级山羊抗小鼠IgG HRP抗体(在抗体稀释剂中为1:5,000)温育1小时。将板用ELISA洗涤缓冲液洗涤4次并在室温下在平缓振荡下与100微升/孔的SuperSignal底物温育1分钟。在BioTek Cytation 5读板器上读取板的发光。
依喜替康血浆浓度的LC-MS/MS测量
对于依喜替康的定量，将20μL血浆样品添加至聚丙烯自动取样器小瓶中。将20μLPPT-IS(ACN:H2O(50:50)+0.5％FA，其含有1000ng/mL内标物)和20μl稀释液(ACN:H2O(50:50)+0.5％FA)添加至每个样品中。随后添加120μl的ACN+5％FA。将小瓶封盖并涡旋2分钟。将样品以3700rpm离心5-10分钟，接着经由液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。
图1示出在大鼠中在单一IV给药5mg/kg的化合物11之后，化合物11和释放的依喜替康的血浆浓度的曲线图(数据表示为平均值±SEM)。如图1中所示，在循环30h后，释放小于0.002％的依喜替康弹头。图1证实化合物11在血浆中稳定至少30h。
实施例C：化合物11在小鼠模型中的肿瘤和骨髓药物动力学
动物给药
六周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Taconic Labs(目录号NCRNU-F)并且在一次性笼框系统(Innovive)中的Alpha-Dri垫料上每笼圈养5只。衍生自结肠直肠癌的人类HCT116癌细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2.5×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到300mm3的最小体积时，向小鼠施用单一腹膜内注射10mg/kg在5％甘露醇于柠檬酸盐中的媒介物中制备的化合物11。在化合物施用后1、2、4、8、16、24、32和48小时，从喂养的麻醉小鼠收集肿瘤和骨髓样品。经由ELISA测定肿瘤和骨髓中的总肽浓度。
总肽组织浓度的ELISA测量
将96孔板用100微升/孔的在0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4中制备的0.1μMBSA标记的肽包被并在4℃下温育过夜。将板用ELISA洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤4次，在室温下用封闭缓冲液(PBS+5％干乳+0.05％Tween 20)(300微升/孔)温育2小时并用ELISA洗涤缓冲液再次洗涤4次。同时，将2×化合物11标准品(在相应组织基质中)或用抗体稀释剂(PBS+2％干乳+0.05％Tween 20)稀释的样品肿瘤匀浆或骨髓样品与1-10ng/mL的对Pv1肽具有特异性的初级抗体在室温下预温育30分钟。将预温育的样品以100微升/孔添加至预包被、预封闭测定板并在室温下温育1小时。将板用ELISA洗涤缓冲液洗涤4次并在室温下与100微升/孔的次级山羊抗小鼠IgG HRP抗体(在抗体稀释剂中为1:5,000)温育1小时。将板用ELISA洗涤缓冲液洗涤4次并在室温下在平缓振荡下与100微升/孔的SuperSignal底物温育1分钟。在BioTek Cytation 5读板器上读取板的发光。
图2示出在小鼠中在单一IP给药10mg/kg的化合物11之后，肿瘤和骨髓中的肽浓度的曲线图(数据表示为平均值±SEM)。图2证实化合物11有效地靶向肿瘤。
实施例D：小鼠模型中的骨髓毒性研究
动物给药
六周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Taconic Labs(目录号NCRNU-F)并且在一次性笼框系统(Innovive)中的Alpha-Dri垫料上每笼圈养5只。衍生自结肠直肠癌的人类HCT116癌细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2.5×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到200mm3的最小体积时，向小鼠施用腹膜内剂量的媒介物或2.6或5.2微摩尔/千克的未缀合依喜替康(分别等效于1.15或2.3mg/kg依喜替康)或化合物11(分别等效于10或20mg/kg化合物11)。化合物是每天一次施用，持续4天。
骨髓收集
最后一次给药后6小时通过颈椎脱位术将荷瘤小鼠安乐死。移除股骨，并通过用安装于含有PBS+2％胎牛血清的5cc注射器上的23号针头冲洗骨头而将骨髓挤出至50mL锥形管中。骨髓通过轻轻移液均质化并经由100μm尼龙网过滤器过滤并且细胞通过在4℃下以1200rpm离心5分钟粒化。在室温下将红细胞用3mL的裂解缓冲液裂解2分钟。将PBS添加至25mL的体积中并且通过如上文所描述的离心将细胞再粒化。将细胞团粒悬浮于5mL的PBS中并通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)评定细胞计数。对四个独立研究的细胞计数进行平均化并绘图。
图3示出在给药2.6和5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于10、20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于1.15和2.3mg/kg依喜替康)，每天一次给药持续四天后的荷瘤裸小鼠的股骨的总骨髓计数的图表。(数据表示为平均值±SEM)。化合物11并未显示限制依喜替康的临床效用的骨髓毒性。
实施例E：小鼠模型中的胃毒性研究
动物给药和胃成像
六周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Taconic Labs(目录号NCRNU-F)并且在一次性笼框系统(Innovive)中的Alpha-Dri垫料上每笼圈养5只。衍生自结肠直肠癌的人类HCT116细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2.5×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到300mm3的最小体积时，向小鼠施用腹膜内剂量的媒介物或5.2微摩尔/千克的未缀合依喜替康(等效于2.3mg/kg依喜替康)或化合物11(等效于20mg/kg化合物11)。化合物是每天一次施用，持续4天。施用最后一个剂量后6小时，通过颈椎脱位术使小鼠安乐死并进行大体尸检。拍摄胃的原位和离体照片。
图4A示出在给药媒介物或5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于2.3mg/kg依喜替康)，QD×4给药之后所切除的荷瘤裸小鼠的胃。图4B示出在给药5.2微摩尔/千克的化合物11(等效于20mg/kg缀合物)或游离依喜替康(等效于2.3mg/kg依喜替康)，每天一次给药持续四天后的原位荷瘤裸小鼠的胃。化合物11并未显示限制依喜替康的临床效用的胃毒性。
实施例F：化合物11在HCT116结肠直肠癌模型中的功效
六周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Taconic Labs(目录号NCRNU-F)并且在一次性笼框系统中的Alpha-Dri垫料上每笼圈养5只。衍生自结肠直肠癌的人类HCT116细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2.5×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到100-200mm3的平均体积时，将小鼠随机分为多组并按下表中详述进行治疗。向小鼠施用腹膜内(IP)剂量的媒介物或2.6或5.2微摩尔/千克的未缀合依喜替康(分别等效于1.15或2.3mg/kg依喜替康)或化合物11(分别等效于10或20mg/kg化合物11)。剂量是通过在含5％甘露醇的柠檬酸盐缓冲液中稀释0.1mg/μL DMSO储备液来制备并以12mL/kg的体积(每25g小鼠300μL)施用QD×4/周，持续三周。异种移植肿瘤是通过测径规测量并且体积是使用椭球体积等式计算：体积＝π/6×(长度)×(宽度)2。动物因死亡、肿瘤大小超过2000mm3或体重减轻>20％而从研究中移除。下表示出各个治疗组的给药时程。
Figure BDA0003506402190001951
图5A示出在荷有HCT116结肠直肠侧腹肿瘤的裸小鼠中，由给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11产生的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。图5B显示在荷有HCT116结肠直肠侧腹肿瘤的裸小鼠中，给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11的卡普兰迈耶生存曲线。数据表示为平均值±SEM。这些数据证实化合物11在临床前结肠直肠癌模型中显示有效抗肿瘤活性。
实施例G：化合物11在MKN45 HER2阴性胃癌模型中的功效
六周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Taconic Labs(目录号NCRNU-F)并且在一次性笼框系统中的Alpha-Dri垫料上每笼圈养5只。衍生自胃癌的人类MKN45细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到100-200mm3的平均体积时，将小鼠随机分为多组并按下表中详述进行治疗。向小鼠施用腹膜内(IP)剂量的媒介物或2.6或5.2微摩尔/千克的未缀合依喜替康(分别等效于1.15或2.3mg/kg依喜替康)或化合物11(分别等效于10或20mg/kg化合物11)。剂量是通过在含5％甘露醇的柠檬酸盐缓冲液中稀释0.1mg/μL DMSO储备液来制备并以12mL/kg的体积(每25g小鼠300μL)施用QD×4/周，持续两周。异种移植肿瘤是通过测径规测量并且体积是使用椭球体积等式计算：体积＝π/6×(长度)×(宽度)2。动物因死亡、肿瘤大小超过2000mm3或体重减轻>20％而从研究中移除。下表示出各个治疗组的给药时程。
Figure BDA0003506402190001961
图6A示出化合物11在荷有MKN45 HER2阴性胃癌侧腹肿瘤的裸小鼠中的单一药剂功效。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续两周。图6B显示在荷有MKN45 HER2阴性胃癌侧腹肿瘤的裸小鼠中，给药等摩尔量的游离依喜替康或化合物11的卡普兰迈耶生存曲线。数据表示为平均值±SEM。这些数据证实化合物11在临床前胃癌模型中显示有效抗肿瘤活性。
图6B.卡普兰-迈耶分析用于评估基于死亡或从研究移除的存活率。
实施例H：化合物11在JIMT-1HER2中度乳腺癌模型中的功效
五至六周龄的雌性NOD.SCID小鼠获自Beijing Anikeeper Biotech Co.,Ltd(Beijing,China)。衍生自乳腺癌的人类J1MT-1细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以5×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到100mm3的平均体积时，将小鼠随机分为多组并按下表中详述进行治疗。向小鼠施用腹膜内(IP)剂量的媒介物或2.6或5.2微摩尔/千克的化合物11(分别等效于10或20mg/kg化合物11)。剂量是通过在含5％甘露醇的柠檬酸盐缓冲液中稀释0.1mg/μL DMSO储备液来制备并以12mL/kg的体积(每25g小鼠300μL)施用QD×4/周，持续三周。异种移植肿瘤是通过测径规测量并且体积是使用椭球体积等式计算：体积＝π/6×(长度)×(宽度)2。在肿瘤体积评定的同时测量动物的体重。动物因死亡、肿瘤大小超过2000mm3或体重减轻>20％而从研究中移除。下表示出各个治疗组的给药时程。
Figure BDA0003506402190001971
图7A示出在荷有JIMT-1HER2中度乳腺癌侧腹肿瘤的SCID小鼠中，由给药化合物11产生的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。图7B示出在用化合物11给药的荷有JIMT-1HER2中度乳腺癌侧腹肿瘤的SCID小鼠中的体重变化百分比的曲线图。数据表示为平均值±SEM。这些数据证实化合物11在临床前乳腺癌模型中显示有效抗肿瘤活性。
实施例I：化合物11在MDA-MB-231三阴性乳腺癌模型中的功效
三至四周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Envigo Labs。衍生自乳腺癌的人类MDA-MB-231细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到50-100mm3的平均体积时，将小鼠随机分为多组并按下表中详述进行治疗。向小鼠施用腹膜内(IP)剂量的媒介物或5、10或20mg/kg化合物11。剂量是通过在含5％甘露醇的柠檬酸盐缓冲液中稀释0.1mg/μL DMSO储备液来制备并以12mL/kg的体积(每25g小鼠300μL)施用QD×4/周，持续三周。异种移植肿瘤是通过测径规测量并且体积是使用椭球体积等式计算：体积＝π/6×(长度)×(宽度)2。在肿瘤体积评定的同时测量动物的体重。动物因死亡、肿瘤大小超过2000mm3或由于体重减轻>20％而从研究中移除。下表显示各个治疗组的给药时程。
Figure BDA0003506402190001981
图8A示出在用化合物11给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠中的平均肿瘤体积的曲线图。动物经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周。图8B示出在用化合物11给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠中，相对于第0天的体重变化百分比的曲线图。数据表示为平均值±SEM。这些数据证实化合物11在临床前乳腺癌模型中显示有效抗肿瘤活性。
实施例J：化合物11和他拉唑帕尼在MDA-MB-231三阴性乳腺癌模型中的组合功效
三至四周龄的雌性无胸腺裸Foxnnu小鼠获自Envigo Labs。衍生自乳腺癌的人类MDA-MB-231细胞在不含酚红的基质胶中1:1稀释并以2×106个细胞/100μL的密度皮下植入至每只小鼠的左侧腹中。当异种移植物达到50-100mm3的平均体积时，将小鼠随机分为多组并按下表中详述进行治疗。向小鼠施用腹膜内(IP)剂量的媒介物或单独的5mg/kg化合物11或与口服(PO)剂量的0.33mg/kg他拉唑帕尼组合。剂量是通过在含5％甘露醇的柠檬酸盐缓冲液中稀释0.1mg/μLDMSO储备液来制备。化合物11是以12mL/kg的体积(每25g小鼠300μL)施用QD×4/周，持续三周，并且他拉唑帕尼是每天一次施用，持续15天。异种移植肿瘤是通过测径规测量并且体积是使用椭球体积等式计算：体积＝π/6×(长度)×(宽度)2。在肿瘤体积评定的同时测量动物的体重。动物因死亡、肿瘤大小超过2000mm3或由于体重减轻>20％而从研究中移除。下表示出各个治疗组的给药时程。
Figure BDA0003506402190001991
图9A示出用化合物11和他拉唑帕尼给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠的平均肿瘤体积的曲线图。动物用化合物11经肠胃外给药每天一次，每周四次，持续三周并且用他拉唑帕尼经口给药每天一次，持续18天。图9B示出用化合物11和他拉唑帕尼给药的荷有MDA-MB-231三阴性乳腺癌侧腹肿瘤的裸小鼠的相对于第0天的体重变化百分比的曲线图。
实施例K：谷胱甘肽裂解研究
在100％DMSO中制备20mM缀合物储备液。随后在100mM Tris(pH 7.5)中稀释储备液，得到500μM的中间稀释液，随后在100mM Tris(pH 7.5)中进行1:5额外稀释，得到最终浓度为100μM的缀合物。在即将用于H2O之前立即制备100mM谷胱甘肽并且在激发样品(challenge sample)中1:10稀释，最终谷胱甘肽激发浓度为10mM。样品通过倒置混合并在37℃下温育至多24小时。在时间0、4和24小时，将50μL样品等分至硅化微量离心管中并立即在-80℃下冷冻。
样品如下解冻并提取：将8μL的25％磷酸，随后117μL的100％乙腈/0.1％TFA添加至每个样品中，混合并以13000×G离心10分钟。将上清液吸移至0.2mL HPLC小瓶中并置放于Perkin Elmer Flexar HPLC自动取样器上。下表概述HPLC条件：
Figure BDA0003506402190002001
通过计算化合物的减少百分比(裂解缀合物的保留时间峰面积/缀合物在时间0的保留时间峰面积)×100来分析数据。
图10示出在16h内由用10mM谷胱甘肽处理引起的化合物11和化合物29的降解的图表。如图10中所示，在类似谷胱甘肽暴露下，化合物29比化合物11释放得更快。
下表概述上文描述的在4h和24h测量的化合物11至化合物29针对10mM谷胱甘肽暴露条件的降解数据。
Figure BDA0003506402190002011
实施例L：血浆稳定性研究
在100％DMSO中制备20mM缀合物储备液。随后在100mM Tris(pH 7.5)中稀释储备液，得到500μM的中间稀释液，并且接着1:5直接稀释至大鼠血浆中，得到最终浓度为100μM的缀合物。样品通过倒置混合并在37℃下温育至多24h。在时间0、4和24h，将50μL样品等分至硅化微量离心管中并立即在-80℃下冷冻。
样品如下解冻并提取：将8μL的25％磷酸，随后117μL的100％乙腈/0.1％TFA添加至每个样品中，混合并以13000×G离心10分钟。将上清液吸移至0.2mL HPLC小瓶中并置放于Perkin Elmer Flexar HPLC自动取样器上。下表概述HPLC条件：
Figure BDA0003506402190002021
通过计算化合物的减少百分比(温育缀合物的保留时间峰面积/缀合物在时间0的保留时间峰面积)×100来分析数据。研究的结果示于下表中。
Figure BDA0003506402190002022
Figure BDA0003506402190002031
除本文所描述的那些修改之外，根据前述描述，本发明的各种修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。此类修改也旨在处于所附权利要求的范围内。本申请中所引用的每个参考文献(包括但不限于所有专利、专利申请和公开)通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 赛博克萨2公司(Cybrexa 2, Inc.)
<120> 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
<130> 43236-0009WO1
<150> 62/872,643
<151> 2019-07-10
<150> 63/040,859
<151> 2020-06-18
<160> 311
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Ala Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp Cys Gly
20 25
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Cys Gly
35
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Ala Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp Asp Ala Asp Glu Cys Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 4
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys
35
<210> 6
<211> 39
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：pH敏感性膜多肽
<400> 6
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 7
<211> 35
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 7
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 8
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 9
<211> 35
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 9
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 10
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 11
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 12
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 12
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 13
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 13
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 14
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 15
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 15
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 16
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 16
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Cys Thr
35
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 17
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 18
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Lys Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 19
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 19
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asn Ala
20 25 30
Asn Gln Gly Thr
35
<210> 20
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 20
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 21
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 22
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Ala Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 23
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 24
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 25
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 25
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Asp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Val Asp Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 26
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 27
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 27
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 28
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 29
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 30
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Trp Asp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 31
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 32
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 32
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 33
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Gly Cys Thr
35
<210> 34
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 34
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 35
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 35
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 36
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 37
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 38
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Trp Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Cys Gly
20 25 30
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Glu Cys Gly
20 25 30
<210> 43
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 45
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
20 25
<210> 46
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Thr Glu Asp Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Asp Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Phe Leu Trp Asp Ala Tyr Arg Ala Trp Tyr Pro Asn Gln Glu
20 25 30
Cys Ala
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 47
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu
20
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 48
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Cys Leu
20
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 49
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu
20
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 50
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu
20
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
Lys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 53
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp
20
<210> 54
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 55
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 57
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 58
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 58
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Thr
35
<210> 59
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 60
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 60
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr
35
<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 62
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 62
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Cys Thr
35
<210> 65
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Ala Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 66
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 66
Ala Cys Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 67
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 68
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 68
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 69
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Trp Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 70
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 72
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 72
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 73
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 73
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Glu Cys Gly
20 25 30
<210> 74
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 74
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 75
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 75
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 76
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 76
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Asp Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Gly
20 25 30
<210> 77
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Thr Glu Asp Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Asp Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Phe Leu Trp Asp Ala Tyr Arg Ala Trp Tyr Pro Asn Gln Glu
20 25 30
Cys Ala
<210> 78
<211> 36
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 78
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu
20
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Cys Leu
20
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu
20
<210> 82
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu
20
<210> 83
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
20 25
<210> 84
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu Leu Trp
20 25
<210> 85
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu
20 25
<210> 86
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Cys Asp Asn Asn Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Trp
20
<210> 87
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 88
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp
20
<210> 89
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 90
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 91
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Trp
20
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Lys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Thr Leu Trp
20
<210> 93
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 94
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 94
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 95
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 95
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 96
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 96
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 97
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 97
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 98
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 98
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 99
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 99
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Thr
35
<210> 100
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 100
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 101
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 101
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 102
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 102
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 103
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 103
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Trp Asp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 104
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 104
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 105
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 105
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 106
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 107
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 107
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 108
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 108
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 109
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 109
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 110
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 110
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 111
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 111
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 112
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 112
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 113
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 114
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 114
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 115
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 115
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 116
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 116
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asn Ala
20 25 30
Asn Gln Gly Thr
35
<210> 117
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 117
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 118
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 118
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 119
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 120
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 120
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 121
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 121
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 122
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 122
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 123
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 123
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asn Ala
20 25 30
Asn Gln Gly Thr
35
<210> 124
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 124
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 125
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 126
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 126
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Lys Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 127
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 127
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 128
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 128
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 129
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 130
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 130
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 131
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 131
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Asp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val
20 25 30
Asp Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 132
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 132
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 133
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 133
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 134
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 134
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 135
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 135
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 136
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 136
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
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Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 138
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 138
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 139
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 139
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 140
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
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<400> 140
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 141
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 141
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 142
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 142
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 143
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 143
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 144
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 144
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 145
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 145
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Thr
35
<210> 146
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 146
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
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35
<210> 147
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 147
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
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35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 148
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asn Ala
20 25 30
Asn Gln Gly Thr
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 149
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
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35
<210> 150
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 150
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
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35
<210> 151
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 151
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 152
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 152
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
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20 25 30
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35
<210> 153
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 153
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 154
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 154
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 155
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 155
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
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35
<210> 156
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 156
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 157
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 157
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
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35
<210> 158
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 158
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 159
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 159
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 160
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 160
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 161
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 161
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 162
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 162
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 163
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 163
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 164
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 164
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 165
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 165
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 166
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 166
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 167
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 167
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 168
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 168
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 169
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 169
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 170
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 170
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asn Ala
20 25 30
Asn Gln Gly Thr
35
<210> 171
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 171
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 172
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 172
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 173
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 173
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 174
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 174
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 175
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 175
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Cys Thr
35
<210> 176
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 176
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 177
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 177
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
<210> 178
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 178
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Cys Thr
35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 179
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
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35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 180
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
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35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 181
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 182
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Trp Asp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 183
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 184
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 185
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 186
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 186
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 187
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 188
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 188
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 189
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
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Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
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35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 190
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 191
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 191
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 192
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 192
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 193
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 193
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 194
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 194
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 195
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 195
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
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35
<210> 196
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 196
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 197
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 197
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 198
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 198
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 199
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 199
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 200
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 200
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
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35
<210> 201
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 201
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 202
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 202
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 203
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 203
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1 5
<210> 204
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 204
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 205
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 205
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 206
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 206
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 207
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 207
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 208
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 208
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 209
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 209
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Asp Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu Val
20 25 30
Asp Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 210
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 210
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 211
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 211
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 212
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 212
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Gln Asp Tyr Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 213
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 213
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Ala Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 214
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 214
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 215
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 215
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 216
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 216
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 217
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 217
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 218
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 218
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 219
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Lys(罗丹明)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Cys(鬼笔环肽)
<400> 219
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 220
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 220
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Lys Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 221
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 221
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 222
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 222
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Ala Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 223
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 223
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 224
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 224
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Phe
20
<210> 225
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 225
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 226
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 226
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Thr
35
<210> 227
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 227
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 228
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 228
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 229
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 229
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Lys Cys Gly
35
<210> 230
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 230
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Cys Thr
35
<210> 231
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 231
cctcttacct cagttaca 18
<210> 232
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 232
cctcttacct cagttaca 18
<210> 233
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 233
cctcttacct cagttaca 18
<210> 234
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 234
cctcttacct cagttaca 18
<210> 235
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 235
cctctgacct catttaca 18
<210> 236
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 236
cctcttacct cagttaca 18
<210> 237
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 237
cctctgacct catttaca 18
<210> 238
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 肽核酸
<400> 238
cctcttacct cagttaca 18
<210> 239
<211> 38
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：pH敏感性膜多肽
<400> 239
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 240
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 240
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Trp Leu Phe Thr
1 5 10 15
Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Cys Gly
20 25 30
<210> 241
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 241
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Glu Cys Gly
20 25 30
<210> 242
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 242
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr
35
<210> 243
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 243
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Thr
35
<210> 244
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 244
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 245
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 245
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 246
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 246
Ala Glu Asp Gln Asn Asp Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Gly
20 25 30
<210> 247
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 247
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 248
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 248
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 249
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 249
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Phe Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Trp Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Thr
<210> 250
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 250
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr
35
<210> 251
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 251
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Cys
20 25 30
Gly Thr
<210> 252
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 252
Ala Glu Asp Gln Asn Asp Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Glu
20 25 30
Cys Gly Thr
35
<210> 253
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 253
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 254
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 254
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr
35
<210> 255
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 255
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 256
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 256
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Asp Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Gly
20 25 30
<210> 257
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 257
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Cys
35
<210> 258
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 258
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Cys
20 25 30
<210> 259
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 259
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Glu Cys
20 25 30
<210> 260
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 260
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 261
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 261
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 262
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 262
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 263
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 263
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
20 25
<210> 264
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 264
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu Leu Trp
20 25
<210> 265
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 265
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu
20 25
<210> 266
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 266
Cys Asp Asn Asn Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Trp
20
<210> 267
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 267
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 268
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 268
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Ala Gln Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 269
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 269
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 270
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 270
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp
20
<210> 271
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 271
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 272
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 272
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 273
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 273
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 274
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 274
Thr Glu Asp Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Asp Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Phe Leu Trp Asp Ala Tyr Arg Ala Trp Tyr Pro Asn Gln Glu
20 25 30
Cys Ala
<210> 275
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 275
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 276
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 276
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Pro
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 277
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 277
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Cys Thr
35
<210> 278
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 278
Ala Lys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly
35
<210> 279
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 279
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 280
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 280
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Thr
35
<210> 281
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 281
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Thr
35
<210> 282
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 282
Cys Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Asp Ala Asp Glu Thr
35
<210> 283
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 283
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 284
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 284
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asp Glu Gly Thr
35
<210> 285
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 285
Asp Asp Asp Glu Asp Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala His Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Leu Leu Val Asn
20 25 30
Ala Asn Glu Gly Thr
35
<210> 286
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 286
Ala Lys Glu Asp Gln Asn Asp Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Gly
20 25 30
<210> 287
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 287
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Cys Gly
20 25 30
<210> 288
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 288
Ala Lys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp Cys
20 25
<210> 289
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 289
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu Leu Trp
20 25
<210> 290
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 290
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu
20 25
<210> 291
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 291
Cys Asp Asn Asn Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Trp
20
<210> 292
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 292
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Ala Gln Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 293
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 293
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 294
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 294
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 295
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 295
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Pro
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu
35
<210> 296
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 296
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Phe Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 297
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 297
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Phe
20
<210> 298
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 298
Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 299
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 299
Lys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Thr Leu Trp
20
<210> 300
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 300
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Gln Ala Glu Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 301
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 301
Ala Ala Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 302
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 302
Ala Lys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 303
<211> 38
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 303
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly Gly
35
<210> 304
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ala或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ala、Asp或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Tyr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Ala、Asp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Asp、Asn、Glu、His、Lys、Ala或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Trp或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Thr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Pro、Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Leu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Asp, Leu, Asn、Glu、His、Lys或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Leu、Asp或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Gly或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> Gly或Cys
<400> 304
Xaa Xaa Glu Xaa Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Phe Thr Xaa Xaa Leu Leu Leu Xaa Xaa Xaa Ala Leu Leu Val Xaa Ala
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Gly
35
<210> 305
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 305
Asp Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
1 5 10 15
Leu Phe Thr Thr Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Val Asp Ala Asp Glu Gly Thr Lys Gly Gly
35 40
<210> 306
<211> 38
<212> PRT
<213> 未知物(Unknown)
<220>
<223> 未知物的描述：野生型pH敏感性膜多肽
<400> 306
Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Gly Gly
35
<210> 307
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gly、Asp或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Gly、Asp或Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gln或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Arg或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Tyr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Ala、Asp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Asp、Asn、Glu、His、Lys、Ala或Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Trp或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Thr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Pro、Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Leu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Asp、Leu、Asn、Glu、His、Lys或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Leu、Asp或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Gly或Cys
<400> 307
Xaa Xaa Glu Xaa Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Phe Thr Xaa Xaa Leu Leu Leu Xaa Xaa Xaa Ala Leu Leu Val Xaa Ala
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Thr Gly Gly
35
<210> 308
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> 可能存在或可能不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (42)..(42)
<223> Lys、Cys或不存在
<400> 308
Asp Gly Gly Glu Gln Asn Asp Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Leu Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu
20 25 30
Leu Val Asp Ala Asp Glu Gly Cys Thr Xaa Gly Gly
35 40
<210> 309
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽，其在CYS、肽的残基37处被修饰，其中S-S-接头连接至氨基-鬼笔环肽的氮
<400> 309
Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr Cys Gly
35
<210> 310
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用连接至2-氨基鬼笔环肽的S-S接头修饰Cys残基30，用连接至罗丹明的烷基接头修饰Lys残基29，并且用COCH3基团修饰丙氨酸
残基1。
<400> 310
Ala Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Asp Trp Leu Phe Thr
1 5 10 15
Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Cys Gly
20 25 30
<210> 311
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 311
Gly Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Glu Gly Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Gly Leu Trp Leu Gly Leu Glu Leu Glu
20 25 30
Gly Asn

Claims (55)

1.一种式(I)化合物，
R8-Q-R7 (I)
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure FDA0003506402180000011
Figure FDA0003506402180000021
Figure FDA0003506402180000031
Figure FDA0003506402180000041
Figure FDA0003506402180000051
Figure FDA0003506402180000061
Figure FDA0003506402180000071
Q选自由以下组成的组：
Figure FDA0003506402180000072
Figure FDA0003506402180000081
Figure FDA0003506402180000091
Figure FDA0003506402180000101
Figure FDA0003506402180000111
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9、R10、R11和R12各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基、4-10元杂环烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、C3-10环烷基、5-10元杂芳基和4-10元杂环烷基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R5和R6与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
R13是H或C1-6烷基；
A是H或C1-4烷基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤烷基、OH、CN、NO2和CO2CH3；其中所述C1-6烷基和C2-6烯基各自任选地被OH、CN、NO2或CO2CH3取代；
Figure FDA0003506402180000131
是C6-10芳基或5-10元杂芳基；其中所述5-10元杂芳基具有至少一个成环碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的成环杂原子；
环G是C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
[N,O,S]是NH、O或S；
[N,O]是NH或O；
[C,N,O]是CRXRY、NH或O；并且
每个RX和RY独立地选自H和C1-4烷基。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8选自由以下组成的组：
Figure FDA0003506402180000141
Figure FDA0003506402180000151
Figure FDA0003506402180000161
Figure FDA0003506402180000171
Figure FDA0003506402180000181
Figure FDA0003506402180000191
Q选自由以下组成的组：
Figure FDA0003506402180000192
Figure FDA0003506402180000201
Figure FDA0003506402180000211
Figure FDA0003506402180000221
Figure FDA0003506402180000231
Figure FDA0003506402180000241
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9、R10、R11和R12各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基和5-10元杂芳基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R2和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R3和R4与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或R5和R6与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基，其任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
R13是H或C1-6烷基；
A是H或C1-4烷基；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤烷基、OH、CN、NO2和CO2CH3；其中所述C1-6烷基和C2-6烯基各自任选地被OH、CN、NO2或CO2CH取代；
Figure FDA0003506402180000251
是C6-10芳基或5-10元杂芳基；其中所述5-10元杂芳基具有至少一个成环碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的成环杂原子；
[N,O,S]是NH、O或S；
[N,O]是NH或O；
[C,N,O]是CRXRY、NH或O；并且
每个RX和RY独立地选自H和C1-4烷基。
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是能够选择性地递送R8Q-穿过具有pH小于约6.0的酸性或缺氧性外套膜的细胞膜的肽。
4.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是包含以下序列中的至少一者的肽：
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:1；Pv1)；
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO:2；Pv2)；
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ ID NO:3；Pv3)；
Ac-AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTKCG(SEQ ID NO:4；Pv4)；和
AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTC(SEQ ID No.5；Pv5)；
并且其中R7经由R7的半胱氨酸残基连接至Q。
5.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是包含以下序列中的至少一者的肽：
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:1；Pv1)、
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO:2；Pv2)，和
ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWDADECG(SEQ ID NO:3；Pv3)，
并且其中R7经由R7的半胱氨酸残基连接至Q。
6.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是包含以下序列的肽：ADDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLWCG(SEQ ID NO:1；Pv1)。
7.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是包含以下序列的肽：AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADECG(SEQ ID NO:2；Pv2)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是：
Figure FDA0003506402180000271
9.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基、5-10元杂芳基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1，其中所述C1-4烷基、C1-4烯基、C6-10芳基和5-10元杂芳基各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
10.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-14环烷基或4-14元杂环烷基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
11.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R3与其所连接的碳原子一起形成环戊基、环己基、环庚基、1,2,3,4-四氢萘基、四氢呋喃基或四氢吡喃基。
12.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R3与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基。
13.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R3与其所连接的碳原子一起形成环己基。
14.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是：
Figure FDA0003506402180000281
15.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是：
Figure FDA0003506402180000291
16.如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自H和甲基，并且R3、R4、R5和R6各自是H。
17.如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地选自H和甲基。
18.如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自是H。
19.如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起形成C3-7环烷基。
20.如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起形成环丁基。
21.如权利要求1-8和16-20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3和R4各自是H。
22.如权利要求1-8和16-20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2和R4各自是H。
23.如权利要求1-8和16-20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5和R6各自是H。
24.如权利要求1-23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R9、R10、R11和R12各自独立地选自H和甲基。
25.如权利要求1-23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R9、R10、R11和R12各自是H。
26.如权利要求1-25中任一项所述的化合物，其中R8是：
Figure FDA0003506402180000301
27.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(II)：
Figure FDA0003506402180000302
或其药学上可接受的盐，其中：
R7是肽；
R8是拓扑异构酶I抑制剂；
环Z是单环C5-7环烷基环或单环5-7元杂环烷基环；
每个RZ独立地选自C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
或两个相邻RZ与其所连接的原子一起形成稠合单环C5-7环烷基环、稠合单环5-7元杂环烷基环、稠合C6-10芳环或稠合6-10元杂芳环，其中的每一者任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1；
Ra1、Rb1、Rc1和Rd1各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基，其各自任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：卤基、OH、CN和NO2；并且
n是0、1、2或3。
28.如权利要求27所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列的肽。
29.如权利要求27所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是Pv1、Pv2、Pv3、Pv4或Pv5。
30.如权利要求27-29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7经由R7的半胱氨酸残基连接至核，其中式II中的二硫化物部分的硫原子中的一者衍生自所述半胱氨酸残基。
31.如权利要求27-30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R8是喜树碱、奥波替康、伊立替康(CPT-11)、司拉替康(DB-67，AR-67)、科西替康(BNP-1350)、勒托替康、吉马替康(ST1481)、贝洛替康(CKD-602)、卢比替康、拓扑替康、德鲁替康或依喜替康。
32.如权利要求27-30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R8是依喜替康。
33.如权利要求27-31中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R8经由N原子连接至核。
34.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是单环C5-7环烷基环。
35.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是环戊基环。
36.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是环己基环。
37.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是环庚基环。
38.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是单环5-7元杂环烷基环。
39.如权利要求27-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是5元杂环烷基环。
40.如权利要求27-30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是6元杂环烷基环。
41.如权利要求27-30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环Z是7元杂环烷基环。
42.如权利要求27-41中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中两个相邻RZ与其所连接的原子一起形成稠合单环C5-7环烷基环、稠合单环5-7元杂环烷基环、稠合C6-10芳环或稠合6-10元杂芳环，其中的每一者任选地被1、2或3个独立地选自以下的取代基取代：C1-4烷基、卤基、CN、NO2、ORa1、SRa1、C(O)Rb1、C(O)NRc1Rd1、C(O)ORa1、OC(O)Rb1、OC(O)NRc1Rd1、NRc1Rd1、NRc1C(O)Rb1、NRc1C(O)ORa1和NRc1C(O)NRc1Rd1。
43.如权利要求27-41中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是0。
44.如权利要求27-41中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是1。
45.如权利要求27-42中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是2。
46.如权利要求27-42中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是3。
47.如权利要求27-33和42-46所述的化合物，其中所述化合物具有式(III)、式(IV)或式(V)：
Figure FDA0003506402180000331
Figure FDA0003506402180000341
或其药学上可接受的盐。
48.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
Figure FDA0003506402180000342
Figure FDA0003506402180000351
49.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
Figure FDA0003506402180000352
Figure FDA0003506402180000361
Figure FDA0003506402180000371
Figure FDA0003506402180000381
Figure FDA0003506402180000391
Figure FDA0003506402180000401
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-49中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
51.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1-49中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、骨癌、神经胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道肿瘤、头颈癌、肠癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、直肠癌、肾透明细胞癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌和胃癌。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
55.一种化合物，所述化合物具有结构：
Figure FDA0003506402180000411
或其盐。
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