RS58873B1 - Antidll3-antitelo-pbd konjugati i njihova upotreba - Google Patents

Antidll3-antitelo-pbd konjugati i njihova upotreba

Info

Publication number
RS58873B1
RS58873B1 RS20190752A RSP20190752A RS58873B1 RS 58873 B1 RS58873 B1 RS 58873B1 RS 20190752 A RS20190752 A RS 20190752A RS P20190752 A RSP20190752 A RS P20190752A RS 58873 B1 RS58873 B1 RS 58873B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
dll3
drug conjugate
antibodies
Prior art date
Application number
RS20190752A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Torgov
Philip Wilson Howard
Original Assignee
Abbvie Stemcentrx Llc
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Stemcentrx Llc, Medimmune Ltd filed Critical Abbvie Stemcentrx Llc
Publication of RS58873B1 publication Critical patent/RS58873B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ova prijava se generalno odnosi na nova jedinjenja koja sadrže anti-DLL3 antitela ili njihove imunoreaktivne fragmente konjugovane na piroloobenzodiazepine (PBD) i njihovu upotrebu za tretman ili profilaksu raka i bilo kakvih njegovih recidiva ili metastaza.
STANJE TEHNIKE
[0002] Diferencijacija i proliferacija matičnih ćelija i progenitorskih ćelija su normalni tekući procesi koji deluju usklađeno da podrže rast tkiva tokom organogeneze, popravke ćelija i zamene ćelija. Sistem je strogo regulisan kako bi se osiguralo da se generišu samo odgovarajući signali na osnovu potreba organizma. Proliferacija i diferencijacija ćelija normalno se javljaju samo kada je to neophodno za zamenu oštećenih ili umirućih ćelija ili za rast. Međutim, poremećaj ovih procesa može biti izazvan mnogim faktorima, uključujući nedostatak ili preobilje različitih signalnih hemikalija, prisustvo izmenjenih mikro okruženja, genetske mutacije ili njihove kombinacije. Poremećaj normalne ćelijske proliferacije i/ili diferencijacije može dovesti do različitih poremećaja uključujući proliferativne bolesti kao što je rak.
[0003] Konvencionalni tretmani za rak uključuju hemoterapiju, radioterapiju i imunoterapiju. Često su ovi tretmani neefikasni i hirurška resekcija možda neće pružiti održivu kliničku alternativu. Ograničenja u sadašnjem standardu zdravstvene zaštite posebno su očigledna u slučajevima kada se pacijenti podvrgavaju tretmanima prve linije i nakon toga imaju recidiv. U takvim slučajevima često se javljaju refraktorni tumori, često agresivni i neizlečivi.
Ukupna stopa preživljavanja za mnoge čvrste tumore ostala je uglavnom nepromenjena tokom godina, što je barem delimično usled neuspeha postojećih terapija da se spreče recidiv, ponovno pojavljivanje tumora i metastaze. Terapijska ograničenja trenutno dostupnih tretmana ukazala su na potrebu za razvojem novih agenasa koji efikasno ciljaju na tumorogene ćelije i eliminišu ih sa kolateralnim oštećenjem kojim se može upravljati.
[0004] Jedna obećavajuća oblast za razvoj takvih agenasa i srodnih tretmana obuhvata ciljane terapije pomoću antitela. U tom smislu, terapija antitelima je uspostavljena za ciljani tretman pacijenata sa rakom, imunološkim i angiogenim poremećajima (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). Specifičnije, upotreba konjugata antitela i leka (tj. ADC ili imunokonjugati) koji sadrže komponentu za ciljanje agensa za vezivanje ćelija i komponentu nosača leka za lokalizovanu isporuku citotoksičnih ili citostatičkih agenasa je pokazala da promoviše intraćelijsku akumulaciju leka unutar ćelija tumora. Takva lokalizacija omogućava relativno visoke koncentracije leka unutar tumora, dok sistemsku primenu nekonjugovanog (tj. neciljanog) leka za postizanje iste koncentracije tumora može rezultovati neprihvatljivim nivoima toksičnosti za normalne ćelije (Xie i dr (2006) Expert. Opin. Biol. Ther.6(3):281-291; Kovtun i dr (2006) Cancer Res.66(6):3214-3121; Law i dr (2006) Cancer Res.
66(4):2328-2337; Wu i dr (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol.5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail i dr (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).
[0005] Sa kliničkog stanovišta, takvi konjugati antitela i leka mogu na taj način pružiti povećanu efikasnost uz odgovarajuće smanjenje toksičnosti. Napori pri dizajniranju i poboljšanju ADC su se fokusirali na selektivnost monoklonskih antitela (mAb) kao i na mehanizam delovanja lekova, tehnika konjugacije i veznika, odnosa lek/antitelo (opterećenje) i svojstva oslobađanja leka (Junutula, i dr., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249;
McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel.19(7): 299-307; Doronina i dr (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson i dr (2006) Cancer Res.66(8):1-8; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res.11:843-852; Jeffrey i dr (2005) J. Med. Chem.48:1344-1358; Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070). S obzirom na selektivnost antitela i lokalizaciju tumora, pokazalo se da su brojni poznati tumorski markeri neefikasni ciljevi ADC zbog niza razloga, uključujući nisko eksprimiranje, nedostatak internalizacije, odbacivanje, itd. U prošlosti su predloženi različiti agensi za upotrebu u ADC uključujući delove leka koji daju citotoksične i citostatičke efekte mehanizmima uključujući vezivanje tubulina, inhibiciju vezivanja DNK, inhibiciju proteazoma i/ili topoizomeraze. Uprkos određenom uspehu, određeni citotoksični lekovi imaju tendenciju da budu neaktivni ili manje aktivni kada su konjugovani sa velikim antitelima ili ligandima proteinskog receptora. Prema tome, izbor odgovarajućeg ciljanog ili agensa za vezivanje ćelija i efikasnog korisnog leka kao ADC konstituenata su važni za pružanje jedinjenja koja pokazuju željeni klinički profil.
[0006] Jedna klasa jedinjenja koja se pokazala obećavajućom kao potencijalne ADC isporuke su pirolobenzodiazepini (PBD). U tom smislu PBD imaju sposobnost da prepoznaju i vežu specifične sekvence DNK uključujući poželjnu sekvencu PuGPu. Prvi PBD antitumorski antibiotik, antramicin, otkriven je 1965 (Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Od tada je prijavljeno više prirodno prisutnih PBD, i razvijeno je više od 10 sintetičkih puteva za različite analoge (Thurston, i dr., Chem. Rev.1994, 433-465 (1994); Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). Članovi porodice uključuju abeimicin (Hochlowski, i dr., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), kicamicin (Konishi, i dr., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Japanese Patent 58-180487; Thurston, i dr., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, i dr., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramicin (Kuminoto, i dr., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicine A i B (Takeuchi, i dr., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicin (Tsunakawa, i dr., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protrakarcin (Shimizu, i dr, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicin (DC-102)(Hara, i dr., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, i dr., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), sibiromicin (Leber, i dr., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) i tomamicin (Arima, i dr., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)).
[0007] PBD imaju opštu strukturu:
[0008] Razlikuju se po broju, tipu i položaju supstituenata, kako u svojim aromatskim A prstenovima, tako i u pirolo C prstenovima, kao i u stepenu zasićenja C prstena. U B-prstenu postoje imin (N=C), karbinolamin (NH-CH(OH)), ili karbinolamin metil etar (NH-CH(OMe)) na N10-C11 položaju koji je elektrofilni centar odgovoran za alkilaciju DNK. Svi poznati prirodni proizvodi imaju (S)-konfiguraciju na hiralnom položaju C11a koja im daje desno obrtanje kada se gleda sa C prstena prema A prstenu. Ovo im daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa manjim žlebom B-oblika DNK, što dovodi do odgovarajućeg prijanjanja na mestu vezivanja (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp.3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Njihova sposobnost da formiraju adukt u malom žlebu, omogućava im da ometaju obradu DNK, pa stoga i njihovu upotrebu kao antitumorskih agenasa.
[0009] Posebno povoljno jedinjenje pirolobenzodiazepina je opisano od strane Gregson i dr. (Chem. Commun. 1999, 797-798) kao jedinjenje 1, i Gregson i dr. (J. Med. Chem.2001, 44, 1161-1174) kao jedinjenje 4a. Ovo jedinjenje, poznato i kao SG2000, prikazano je u nastavku:
[0010] WO 2007/085930 opisuje dobijanje dimernih PBD jedinjenja sa vezničkim grupama za povezivanje sa agensom za vezivanje ćelija, kao što je antitelo. Veznik je prisutan u mostu koji povezuje monomerne PBD jedinice dimera.
[0011] WO 2011/130598 opisuje dimerna PBD jedinjenja koja imaju vezničke veznik grupe sa agensom za vezivanje ćelija, kao što je antitelo. Veznik u ovim jedinjenjima je vezan za jedan od raspoloživih N10 položaja, i poželjno se cepa dejstvom enzima na vezničkoj grupi.
[0012] EP2530091 se odnosi na Anti-DLL3 antitelo.
[0013] Dok su se različiti PBD ADC pokazali obećavajući za tretman određenih proliferativnih poremećaja, u struci ostaje potreba za klinički efikasnim ciljanim jedinjenjima i postupcima upotrebe takvih jedinjenja za tretman proliferativnih poremećaja.
SAŽETAK PRONALASKA
[0014] Na osnovu predmetnog obelodanjenja, predmetni pronalazak daje predmet definisan u priloženim patentnim zahtevima.
[0015] Ovi i drugi ciljevi su predviđeni ovim obelodanjenjem koje je, u širem smislu, usmereno na postupke, jedinjenja, sastave i predmete proizvodnje koji sadrže određene konjugate antitela i leka koji sadrže izabrane PBD koji se mogu koristiti u tretmanu poremećaja povezanih sa DLL3 (npr. proliferativni poremećaji ili neoplastični poremećaji). U tom cilju, predmetni pronalazak pruža delta-nalik ligand 3 (ili DLL3) antitela konjugovana sa odabranim PBD koja efikasno ciljaju tumorske ćelije i/ili matične ćelije raka, i mogu se koristiti za tretman pacijenata koji pate od širokog spektra proliferativnih poremećaja i bilo koje njihove ekspanzije, recidiv, ponovne pojave ili metastaze. U širokom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na delta-nalik ligand 3 (DLL3) antitela konjugovana na odabrane piroloobenzodiazepine kako bi se dobili DLL3 imunokonjugati koji su značajno dati kao ADC 1 - 5 neposredno u nastavku. Prema tome, u jednom aspektu obelodanjenje se odnosi na konjugat izabran iz grupe koja se sastoji od
gde Ab sadrži anti-DLL3 antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment. Konjugacija sa veznik lek delom u svakom od konjugata je poželjno preko slobodnog tiola na anti-DLL3 antitelu.
[0016] U drugim aspektima, predmetni pronalazak obuhvata sastav koji sadrži ADC 1, sastav koji sadrži ADC 2, sastav koji sadrži ADC 3, sastav koji sadrži ADC 4 ili sastav koji sadrži ADC 5.
[0017] Kao što je naznačeno, takvi konjugati se mogu koristiti za tretman, upravljanje, ublažavanje ili profilaksu proliferativnih poremećaja ili njihovog ponavljanja ili napredovanja. Izabrani primeri predmetnog obelodanjenja pružaju upotrebu takvih DLL3 konjugata, za imunoterapijski tretman malignih bolesti, koji poželjno obuhvata smanjenje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor. Opisani ADC mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa širokim izborom agenasa protiv raka jedinjenja kao što su hemoterapijski ili imunoterapijski agensi (npr. terapeutska antitela) ili modifikatori biološkog odgovora. U drugim odabranim slučajevima, dva ili više konjugata DLL3 antitela i leka mogu se koristiti u kombinaciji kako bi se pružili pojačani antineoplastični efekti.
[0018] U drugom aspektu, koji je izložen u priloženim Primerima, opis pruža postupak za dobijanje ADC 1 - 5 koji sadrži konjugaciju jedinjenja izabranog iz grupe koja se sastoji od
sa anti-DLL3 antitelom ili njegovim imunoreaktivnim fragmentom. Za potrebe predmetne prijave DL će biti korišćena kao skraćenica za „lek-veznik“ i sadržaće veznike za lek 1 - 5 (tj., DL1, DL2, DL3, DL4 i DL5) kao što je navedeno iznad.
[0019] Podrazumeva se da se vezani veznički terminalni maleimido deo (DLl-DL3 i DL5) ili jodoacetamid deo (DL4) mogu konjugovati za slobodne sulfhidrile na izabranom DLL3 antitelu primenom tehnika priznatih u struci. Pored toga što je detaljnije razmatrano u daljem tekstu, put sinteze do svakog jedinjenja DL 1 - 5 dat je u Primeru 1 koji je ovde priložen, dok su specifični postupci konjugacije takvih jedinjenja kako bi se dobili ADC 1 - 5 prikazani u Primeru 7.
[0020] Treba primetiti da, za potrebe predmetne prijave, biće jasno da se izrazi „modulator“ i „antitelo“ mogu koristiti naizmenično, osim ako nije drugačije određeno kontekstom. Slično tome, izrazi „anti-DLL3 konjugat“ i „DLL3 konjugat“, ili jednostavno „konjugat“, svi se odnose na jedinjenja koja su navedena kao ADC 1 - 5 koja sadrže anti-DLL3 antitelo i mogu se koristiti naizmenično, osim ako nije drugačije određeno kontekstom.
[0021] U svakom slučaju, ovi i drugi ciljevi su pruženi predmetnim obelodanjenjem, koje je, u širem smislu, usmereno na gore pomenute DLL3 konjugate i povezane postupke, sastave i predmete proizvodnje koji se mogu koristiti u tretmanu poremećaja povezanih sa DLL3 (npr., proliferativni poremećaji ili neoplastični poremećaji). U tom cilju, predmetni pronalazak pruža nove konjugate delta-nalik ligand 3 (ili DLL3) antitela koji efikasno ciljaju tumorske ćelije i/ili matične ćelije raka, i mogu se koristiti za tretman pacijenata koji pate od velikog broja malignih oboljenja. Kao što će se ovde detaljnije diskutovati, postoje najmanje dva prirodno nastala DLL3 izoforma ili varijante, i obelodanjeni modulatori mogu sadržati ili se selektivno povezati sa jednim izoformom ili drugim ili sa oba. Štaviše, u određenim otelotvorenjima, opisani DLL3 modulatori mogu dalje da reaguju sa jednim ili više članova DLL porodice (npr. DLL1 ili DLL4) ili, u drugim otelotvorenjima, mogu biti generisani i odabrani tako da isključivo povezuju ili reaguju sa jednim ili više DLL3 izoformom.
[0022] Dalje će se razumeti da opisani konjugati antitela i leka mogu da sadrže bilo koji modulator, antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment koji prepoznaje, nadmeće se sa, agonizuje, antagonizuje, međusobno deluje, vezuje se ili je povezan sa DLL3 determinantom (ili njenim fragmentom) i moduliše, podešava, menja, reguliše, izmenjuje ili modifikuje uticaj DLL3 proteina na jedan ili više fizioloških puteva i/ili inhibira ili eliminiše ćelije koje su povezane sa DLL3. Prema tome, u širem smislu, predmetni pronalazak je generalno usmeren na DLL3 konjugate i njihovu upotrebu. Štaviše, kao što je detaljno razmatrano u daljem tekstu, takvi konjugati antitela i leka mogu da se koriste da pruže farmaceutske sastave korisne za profilaksu, dijagnostiku ili tretman proliferativnih poremećaja uključujući rak.
[0023] Što se tiče ADC 1 – 5, biće jasno da kompatibilna antitela mogu uzeti bilo koji od brojnih oblika uključujući, na primer, poliklonska i monoklonska antitela, himerna, CDR presađena, humanizovana i ljudska antitela i imunoreaktivne fragmente i/ili varijante svakog od gore navedenih. Poželjni primeri će sadržati antitela koja su relativno neimunogena, kao što su humanizovani ili potpuno ljudski konstrukti. Naravno, u pogledu predmetnog obelodanjenja, stručnjaci u oblasti mogu lako da identifikuju jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji su povezani sa varijabilnim regionima teškog i lakog lanca modulatora DLL3 antitela i koriste te CDR za projektovanje ili proizvodnju himernih, humanizovanih ili CDR transplantiranih antitela bez nepotrebnog eksperimentisanja. Prema tome, u određenim poželjnim primerima DLL3 antitelo komponenta opisanih ADC sadrži antitelo koje uključuje jedan ili više region za određivanje komplementarnosti (CDR), kao što je definisano na Slikama 3A i 3B i izvedeno iz primera susednih varijabilnih regiona mišjeg lakog (Slika 3A) ili teškog (Slika 3B) lanca (SEQ ID NO: 21 - 387, neparni brojevi) datih ovde. Primeri sekvenci varijabilnih regiona lakog i teškog lanca humanizovanog (CDR presađen) su takođe prikazani na SLICI 3 i sadrže SEQ ID NO: 389 - 407. U poželjnim otelotvorenjima antitela koja sadrže CDR data na Slikama 3A i 3B će sadržati monoklonska antitela i, u još poželjnijim otelotvorenjima, obuhvataće himerna, CDR presađena ili humanizovana antitela. Primeri sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju svaku od aminokiselinskih sekvenci prikazanih na Slikama 3A i 3B su priloženi u spisku sekvenci.
[0024] U još jednom slučaju, antitelo iz opisa obuhvata varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologne sekvencama aminokiselina ovde opisanih primera antitela, i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-DLL3 antitela iz opisa.
[0025] Posebno u odabranim slučajevima antitela uključena u bilo koji od ADC 1 - 5 mogu da sadrže antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment koji ima varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca gde pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60 % homologna aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113 , SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 381 i SEQ ID NO: 385 i gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% homologna aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 383 i SEQ ID NO: 387. U drugim poželjnim otelotvorenjima izabrani modulatori će sadržati varijabilne regione teškog i lakog lanca koji su 65, 70, 75 ili 80% homologni sa pomenutom mišjom sekvencom. U još nekim otelotvorenjima modulatori će sadržati aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca varijabilnog regiona koji su 85, 90 ili čak 95% homologni sa opisanim mišjim sekvencama. U tom smislu će biti razumljivo da humanizovana antitela izvedena iz mišjih izvornih antitela tipično imaju varijabilne regione teškog i lakog lanca koji su poželjno od približno 70% do približno 85% homologni u odnosu na izvorno antitelo. U svrhu poređenja, humanizovana antitela će tipično imati varijabilne regione teškog i lakog lanca, koji su poželjno od približno 80% do približno 95% homologni sa onima od akceptora ljudskog antitela.
[0026] U drugim poželjnim otelotvorenjima, izabrana antitela će sadržati jedan ili više CDR dobijen iz bilo koje od gore navedenih varijabilnih regiona lakog i teškog lanca aminokiselinskih sekvenci. Shodno tome, odabrani primeri obelodanjenja uključuju DLL3 modulator koji sadrži jedan ili više CDR iz bilo kog od SEQ ID NO: 21 do 387, neparni brojevi. Poželjno, antitela će sadržati tri CDR lakog lanca dobijena iz jedne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca prikazanog na SLICI 3A i tri CDR teškog lanca dobijena iz jedne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca datog na SLICI 3B. Na primer, antitela primera mogu da sadrže tri CDDR lakog lanca dobijena iz jedne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca datog na SLICI 3A i tri CDR teškog lanca iz jedne aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca prikazane na Slikama 3B, gde varijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca pripadaju istom klonu. U još nekim drugim otelotvorenjima, konjugati predmetnog pronalaska će sadržati bilo koje antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment koji se nadmeću za vezivanje sa bilo kojim od prethodnih modulatora.
[0027] Prema tome, drugi aspekt opisa sadrži ADC koji inkorporišu antitela dobijena ili izvedena iz SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150; ili bilo koja od prethodno identifikovanih antitela, ili njihove himerne ili humanizovane verzije. U drugim otelotvorenjima, ADC iz pronalaska će sadržati DLL3 antitelo koje ima jedan ili više CDR, na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR, od bilo kog od gore pomenutih modulatora.
[0028] U drugom aspektu, predmetni pronalazak će obuhvatiti konjugat gde anti-DLL3 antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca gde pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113 , SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 381 i SEQ ID NO: 385 i gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 383 i SEQ ID NO: 387. Na primer, takva antitela mogu da uključuju varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca istog klona koji je identifikovan na Slikama 3A i 3B.
[0029] U još nekim drugim kompatibilnim otelotvorenjima, konjugati antitela i leka iz predmetnog pronalaska će sadržati jedno od CDR graftovanog ili humanizovanog DLL3 antitela hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56.
[0030] Druga otelotvorenja su usmerene na ADC koji sadrže antitelo u kome pomenuto antitelo sadrži:
laki lanac antitela koji sadrži varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 408, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 409 i varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 410; i teški lanac antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 411, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 412 i varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 413.
[0031] U još jednom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na ADC koji sadrži antitelo, gde navedeno antitelo sadrži:
laki lanac antitela koji sadrži varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 414, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 415 i varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 416; i
teški lanac antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 417, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 418 i varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 419.
[0032] U još jednom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na ADC koji sadrži antitelo, gde navedeno antitelo sadrži:
laki lanac antitela koji sadrži varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 420, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 421 i varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 422; i
teški lanac antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 423, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 424 i varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 425.
[0033] U još jednom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na ADC koji sadrži antitelo, gde navedeno antitelo sadrži:
laki lanac antitela koji sadrži varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 426, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 427 i varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 428; i
teški lanac antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 429, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 430 i varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 431.
[0034] U još jednom otelotvorenju, pronalazak je usmeren na ADC koji sadrži antitelo, gde navedeno antitelo sadrži:
laki lanac antitela koji sadrži varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 432, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 433 i varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 434; i
teški lanac antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 435, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 436 i varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 437.
[0035] U određenim poželjnim otelotvorenjima svako od gore pomenutih antitela obuhvata humanizovana antitela. Štaviše, kao što je ovde opisano, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju takve varijabilne regione humanizovanog teškog i lakog lanca prikazane su u priloženom spisku sekvenci.
[0036] Pored toga, jedan aspekt opisa može obuhvatiti terapeutsku vezu DLL3 polipeptida sa matičnim ćelijama raka. Prema tome, u nekim drugim slučajevima obelodanjenje će obuhvatiti DLL3 konjugat od ADC 1 - 5 koji smanjuje učestalost ćelija koje iniciraju tumor nakon primene pacijentu. Poželjno je da se smanjenje učestalosti odredi korišćenjem in vitro ili in vivo analize limitirajućeg razblaživanja. U posebno poželjnim primerima takva analiza može biti izvedena upotrebom in vivo analiza limitirajućeg razblaženja koja obuhvata transplantaciju živih ćelija ljudskog tumora u imunokompromitovane miševe. Alternativno, analiza limitirajućih razblaženja može biti sprovedena korišćenjem in vitro analize limitirajućih razblaženja koja obuhvata ograničavanje taloženja živih ćelija ljudskog tumora u razblaženju in vitro uslovima za podršku kolonijama. U svakom slučaju, analiza, izračunavanje ili kvantifikacija smanjenja učestalosti će poželjno obuhvatiti upotrebu Poisson-ove distributivne statistike kako bi se omogućilo tačno računanje. Treba imati na umu da, dok su takvi postupci kvantifikacije poželjni, druge, manje radno intenzivne metodologije, kao što su protočna citometrija ili imunohistohemija, takođe se mogu koristiti da se dobiju željene vrednosti i, shodno tome, eksplicitno se razmatra kao da su unutar obima predmetnog obelodanjenja. U takvim slučajevima smanjenje učestalosti može se odrediti analizom protočne citometrije ili imunohistohemijskim detektovanjem markera površine ćelija tumora za koje se zna da obogaćuju ćelije koje iniciraju tumor.
[0037] U tom smislu biće jasno da se predmetni pronalazak zasniva, barem delimično, na otkriću da su DLL3 imunogeni terapeutski povezani sa ćelijama koje održavaju tumor (tj. matične ćelije raka) koje su uključene u etiologiju različitih proliferativnih poremećaja uključujući neoplazija. Specifičnije, predmetna prijava obelodanjuje da primena opisanih DLL3 konjugata može da posreduje, redukuje, iscrpljuje, inhibira ili eliminiše tumorogene signalizacije ćelijama koje iniciraju tumor (npr., smanjuje učestalost ćelija koje iniciraju tumor). Ovo redukovano signaliziranje, bilo osiromašenjem, neutralizacijom, redukcijom, eliminacijom, reprogramiranjem ili utišavanjem ćelija koje iniciraju tumor ili modifikovanjem morfologije tumorskih ćelija (npr. indukovana diferencijacija, poremećaj niše), zauzvrat omogućava efikasniji tretman poremećaja povezanih sa DLL3 inhibiranjem tumorogeneze, održavanjem tumora, ekspanzijom i/ili metastazom i recidivom.
[0038] Pored gore pomenute povezanosti sa matičnim ćelijama raka, postoje dokazi da DLL3 izoformi mogu biti uključeni u rast, recidiv ili metastatski potencijal tumora koji sadrže ili pokazuju neuroendokrine karakteristike ili fenotipske determinante. Za potrebe predmetnog pronalaska takvi tumori će obuhvatati neuroendokrine tumore i pseudo-neuroendokrine tumore. Intervencija u proliferaciji takvih tumorogenih ćelija upotrebom novih DLL3 konjugata koji su ovde opisani, može na taj način poboljšati ili tretirati poremećaj sa više od jednog mehanizma (npr., redukcija ćelija koje iniciraju tumor i poremećaj signalizacije onkogenih puteva) kako bi se pružili aditivni ili sinergetski efekti. Druga poželjna otelotvorenja mogu iskoristiti ćelijsku internalizaciju DLL3 proteina na ćelijskoj površini kako bi se pružio vezani agens protiv raka. U tom smislu biće jasno da predmetno obelodanjenje nije ograničeno bilo kojim posebnim mehanizmom delovanja, već obuhvata široku upotrebu opisanih modulatora za tretman poremećaja povezanih sa DLL3 (uključujući različite neoplazije).
[0039] U još nekim poželjnim otelotvorenjima modulatori će se povezati sa ili vezati za specifični epitop, deo, motiv ili domen DLL3. Kao što će biti u nastavku biti objašnjeno detaljnije, oba DLL3 izoforma inkorporiraju identičnu ekstracelularnu oblast (pogledati SLIKU 2) koja sadrži najmanje N-terminalni domen, DSL (Delta/Serrate/lag-2) domen i šest EGF-nalik domena (tj. EGF1 - EGF6). Shodno tome, u određenim aspektima modulatori će biti povezani sa ili se vezati za N-terminalni domen DLL3 (tj. aminokiseline 27-175 u zrelom proteinu) dok će u drugim izabranim otelotvorenjima modulatori biti povezani sa DSL domenom (tj. aminokiseline 176- 215 DLL3) ili epitopom u njemu. Drugi aspekti predmetnog obelodanjenja obuhvataju antitela koja su povezana sa ili se vezuju za specifični epitop koji se nalazi u određenom EGF-nalik domenu DLL3. U tom smislu, određeni modulator može da se poveže sa, ili da se veže za epitop koji se nalazi u EGF1 (aminokiseline 216-249), EGF2 (aminokiseline 274-310), EGF3 (aminokiseline 312-351), EGF4 (aminokiseline 353-389). EGF5 (aminokiseline 391-427) ili EGF6 (aminokiseline 429465). Naravno, biće jasno da svaki od gore pomenutih domena može da sadrži više od jednog epitopa i/ili više od jedne korpice. U posebno poželjnim primerima, obelodanjenje će sadržati antitelo koje se vezuje, reaguje ili asocira sa DSL domenom ili epitopom u njemu. U drugim poželjnim primerima, opis će obuhvatati antitela koja se vezuju, reaguju ili se povezuju sa određenim EGF-nalik domenom ili njegovim epitopom. U još nekim poželjnim otelotvorenjima modulatori će vezati, reagovati ili se povezati sa N-terminalnim domenom ili epitopom u njemu.
[0040] Što se tiče „korpica“ modulatora ili antitela, biće jasno da se DLL3 antigen može analizirati ili mapirati kroz vezivanje kompetitivnih antitela korišćenjem tehnika koje su priznate u struci kako bi se definisale specifične korpice smeštene na ili duž proteina. Iako su ovde detaljnije razmatrana i prikazana u Primerima u daljem tekstu, dva antitela (od kojih se jedno može nazvati „referentno antitelo,“ „antitelo za opisivanje korpica“ ili „antitelo za opisivanje“) mogu se smatrati da su u istoj korpici ako se nadmeću međusobno za vezivanje za ciljani antigen. U takvim slučajevima epitopi predmetnog antitela mogu biti identični, suštinski identični ili dovoljno bliski (bilo u linearnom smislu gde su razdvojeni sa nekoliko aminokiselina ili konformaciono) tako da su oba antitela sterički ili elektrostatski inhibirana ili im je onemogućeno vezivanje za antigen. Takve definisane korpice mogu biti generalno povezane sa određenim DLL3 domenima (npr. referentno antitelo će se vezati sa epitopom koji se nalazi u specifičnom domenu) iako korelacija nije uvek precizna (npr. može biti više od jedne korpice u domenu ili se korpica može definisati konformaciono i obuhvata više od jednog domena). Podrazumeva se da stručnjaci u oblasti mogu lako da odrede vezu između DLL3 domena i empirijski određenih korpica.
[0041] U vezi sa ovim pronalaskom, kompetitivna analiza vezivanja upotrebom tehnika priznatih u struci (npr., ELISA, površinska plazmonska rezonanca ili bio-slojna interferometrija) definisala je najmanje devet različitih ćelija, od kojih je za sve otkriveno da sadrže određeni broj modulatora antitela. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, devet korpica je nazvano korpica A do korpica I. Dakle, u odabranim slučajevima, predmetno obelodanjenje će sadržati konjugat antitela i leka od ADC 1 - 5 koji se nalazi u korpici izabranoj iz grupe koja se sastoji od korpice A, korpice B, korpice C, korpice D, korpice E, korpice F, korpice G, korpice H i korpice I.
[0042] U drugim otelotvorenjima, konjugati predmetnog pronalaska sadrže antitelo koje se nalazi u korpica definisano referentnim antitelom izabranim iz grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150. U još nekim otelotvorenjima ADC predmetnog pronalaska će obuhvatati antitela iz korpice A, antitela iz korpice B, antitela iz korpice C, antitela iz korpice D, antitela iz korpice E, antitela iz korpice F, antitela iz korpice G, antitela iz korpice H ili antitela iz korpice I. Još neke druge poželjna otelotvorenja će sadržati referentni modulator antitela i bilo koje antitelo koje se nadmeće sa referentnim antitelom.
[0043] Izraz „nadmetanje“ ili „kompetitivno antitelo“ kada se koristi u kontekstu obelodanjenih modulatora označava nadmetanje u vezivanju između antitela, kao što je određeno analizom u kojoj referentno antitelo ili imunološki funkcionalni fragment značajno sprečavaju ili inhibiraju (npr. više od 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ili 90%.) specifično vezivanje test antitela za zajednički antigen.
Kompatibilni postupci za određivanje takvog nadmetanja obuhvataju tehnike koje su poznate u struci, kao što su, na primer, biološka interferometrija, površinska plazmonska rezonanca, protočna citometrija, kompetitivna ELISA, itd.
[0044] Predmetni pronalazak takođe pruža komplete ili uređaje i pridružene postupke koje koriste ovde opisane DLL3 konjugate, i ovde opisane farmaceutske sastave DLL3 konjugata, koje su korisne za tretman poremećaja povezanih sa DLL3 kao što je rak. U tom smislu, predmetno obelodanjenje poželjno daje predmet proizvodnje koji je koristan za tretiranje poremećaja povezanih sa DLL3 koji sadrže kontejner koji sadrži konjugat antitela i leka ADC 1 - 5 i instrukcijske materijale za upotrebu konjugata za tretman, ublažavanje ili sprečavanje ili progresije ili ponovnog javljanja poremećaja povezanih sa DLL3.
KRATAK OPIS Slika
[0045]
Slika 1 pruža poravnanje sekvenci dva izoforma DLL3 proteina (SEQ ID NO: 1 i 2). Slika 2 daje šematski prikaz ekstracelularnog regiona DLL3 proteina koji ilustruje položaje različitih domena.
SLIKE 3A i 3B daju, u tabelarnom formatu, susedne aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 21-407, neparni brojevi) varijabilnih regiona lakog i teškog lanca brojnih mišjih i humanizovanih primera DLL3 antitela kompatibilnih sa opisanim konjugatima antitela i leka, koji su izolovani, klonirani i konstruisani kao što je opisano ovde u Primerima.
Slika 4 prikazuje, u šematskom obliku, rezultate analize mapiranja nivoa domena izolovanih, kloniranih i konstruisanih primernih DLL3 modulatora, kao što je opisano ovde u Primerima.
Slika 5 prikazuje biohemijske i imunološke osobine primernih DLL3 modulatora kao što je prikazano u tabelarnom formatu.
Slika 6 daje spisak primera konjugata antitela i leka generisanih prema predmetnom obelodanjenju.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Uvod
[0046] Bilo koji odeljci koji se ovde koriste su samo za organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisanog predmeta. Konačno, za svrhe predmetnog obelodanjenja svi Pristupni brojevi identifikacionih sekvenci mogu se naći u NCBI Reference Sequence (RefSeq) bazi podataka i/ili NCBI GenBank® arhivskoj bazi podataka sekvenci, ako nije drugačije naznačeno.
[0047] Kao što je razmotreno iznad, otkriveno je da su DLL3 fenotipske determinante klinički povezane sa različitim proliferativnim poremećajima, uključujući neoplaziju koja pokazuje neuroendokrine karakteristike, i da DLL3 protein i njegove varijante ili izoformi pružaju korisne tumorske markere koji se mogu koristiti u tretmanu srodnih bolesti. U ovom pogledu, predmetni pronalazak pruža određeni broj konjugata antitela i leka koji su navedeni kao ADC 1 - 5 iznad, koji sadrže anti-DLL3 agens za ciljanje antitela i PBD isporuku. Kao što je detaljnije objašnjeno u daljem tekstu i prikazano u priloženim primerima, opisani DLL3 ADC su posebno efikasni u eliminisanju tumorogenih ćelija, i prema tome korisni za tretman i profilaksu određenih proliferativnih poremećaja ili njihove progresije ili ponovne pojave.
[0048] Štaviše, kao što je prikazano u ovoj prijavi, otkriveno je da su DLL3 markeri ili determinante, kao što je DLL3 protein ćelijske površine, terapeutski povezani sa matičnim ćelijama raka (takođe poznatim kao ćelije koje održavaju tumor) i mogu biti efikasno iskorišćene da eliminišu ili utišaju iste. Sposobnost selektivnog smanjenja ili eliminacije matičnih ćelija raka upotrebom konjugovanih DLL3 modulatora, kao što je ovde opisano, iznenađujuće je po tome što se zna da su takve ćelije generalno rezistentne na mnoge konvencionalne tretmane. Naime, efikasnost tradicionalnih, kao i novijih ciljanih postupaka tretmana, često je ograničena postojanjem i/ili pojavom rezistentnih matičnih ćelija raka koje su sposobne da održe rast tumora čak i pred ovim različitim postupcima tretmana. Dalje, determinante povezane sa matičnim ćelijama raka su slabi terapeutski ciljevi zbog niskog ili nekonzistentnog eksprimiranja, neuspeha da ostanu povezane sa tumorogenom ćelijom ili neuspeha da budu prisutne na površini ćelije. U oštrom kontrastu sa saznanjima iz prethodnog stanja tehnike, predmetno obelodanjeni konjugati antitela i leka i postupci efikasno prevazilaze ovu inherentnu otpornost i specifično eliminišu, iscrpljuju, utišavaju ili promovišu diferencijaciju takvih matičnih ćelija raka i time negiraju njihovu sposobnost da održe ili ponovo indukuju rast tumora. Štaviše, kako je eksprimiranje DLL3 proteina u velikoj meri povezano sa intracelularnim lokacijama kao što je Goldži, bilo je neizvesno da se takve fenotipske determinante mogu uspešno iskoristiti kao terapeutski cilj za specifične ADC, kako je ovde opisano.
[0049] Prema tome, posebno je značajno da se DLL3 konjugati, kao što su oni ovde opisani, mogu pogodno koristiti u tretmanu i/ili prevenciji odabranih proliferativnih (npr., neoplastičnih) poremećaja ili njihovog napredovanja ili ponavljanja. Treba imati na umu da će, dok su poželjni primeri obelodanjenja detaljno opisani u daljem tekstu, naročito u pogledu određenih domena, regiona ili epitopa ili u kontekstu matičnih ćelija raka ili tumora koji sadrže neuroendokrine karakteristike i njihove interakcije sa opisanim konjugatima antitela i leka, stručnjaci u oblasti razumeti da predmetno obelodanjenje nije ograničeno takvim primerima. Umesto toga, većina ekspanzivnih primera predmetnog obelodanjenja su široko i eksplicitno usmereni na obelodanjene DLL3 konjugate i njihovu upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji različitih DLL3 povezanih ili posredovanih poremećaja, uključujući neoplastične ili ćelijske proliferativne poremećaje, bez obzira na bilo koji određeni mehanizam delovanja ili specifično ciljane tumore, ćelijske ili molekularne komponente.
[0050] U tu svrhu, i kao što je pokazano u ovoj prijavi, neočekivano je otkriveno da obelodanjeni DLL3 konjugati mogu efikasno da se koriste za ciljanje i eliminisanje ili na drugi način onesposobljavanje proliferativnih ili tumorogenih ćelija i tretman poremećaja povezanih sa DLL3 (npr., neoplazija). Kako se ovde koristi, „poremećaj povezan sa DLL3“ podrazumeva bilo koji poremećaj ili bolest (uključujući proliferativne poremećaje) koja je označena, dijagnostikovana, otkrivena ili identifikovana fenotipskom aberacijom DLL3 genetskih komponenti ili eksprimiranjem („determinanta DLL3“) tokom trajanja ili etiologiju bolesti ili poremećaja. U tom smislu, DLL3 fenotipska aberacija ili determinanta mogu, na primer, da sadrže povišene ili smanjene nivoe eksprimiranja DLL3 proteina, eksprimiranje abnormalnog DLL3 proteina na određenim populacijama ćelija koje se mogu definisati, ili abnormalno eksprimiranje DLL3 proteina u neprikladnoj fazi ili stupnju životnog ciklusa ćelije. Naravno, biće jasno da slični obrasci eksprimiranja genotipskih determinanti (npr., nivoi transkripcije mRNK) DLL3 mogu takođe da se koriste za klasifikaciju, detektovanje ili tretman DLL3 poremećaja.
[0051] U vezi sa opisanim konjugatima, prikazani pronalazak pruža PBD dimere sa veznikom koji je povezan sa položajem na jednoj od PBD grupa i konjugovan preko veznika na DLL3 modulator antitela. Kroz ove pažljivo konstruisane konfiguracije konjugat omogućava oslobađanje aktivnog PBD jedinjenja koje poželjno ne zadržava nijedan deo veznika. To jest, ne postoji prisutan odrezak ili veznički ostatak koji bi mogao negativno uticati na reaktivnost PDB isporuke. Prema tome, opisani DLL3 konjugati oslobađaju sledeća dimerna PBD jedinjenja nakon razdvajanja veznika.
[0052] Konjugat ADC 1 oslobađa jedinjenje PBD 1:
[0053] Konjugat ADC 2 oslobađa jedinjenje PBD 2:
[0054] Konjugat ADC 3 oslobađa jedinjenje PBD 3:
[0055] Konjugat ADC 4 oslobađa jedinjenje PBD 4:
[0056] Konjugat ADC 5 oslobađa jedinjenje PBD 5:
Shodno tome, isporuka toksičnih jedinjenja PBD 1, PBD 2, PBD 3, PBD 4 ili PBD 5 se postiže na željenom mestu aktivacije (tj. unutar tumorogene ćelije) pomoću ADC 1 - 5 kroz delovanje enzima, kao što je kao katepsin, na vezujućoj grupi, i posebno na inkorporiranoj valin-alanin dipeptidnoj grupi. Kao što je detaljnije razmatrano u daljem tekstu, lokalizovana isporuka opisanih PBD citotoksina može da pruži efikasnu eliminaciju nekoliko tipova tumorogenih ćelija sa znatno manje toksičnosti nego što je povezano sa neciljanim standardom nege za hemoterapije.
[0057] U ovom smislu, jedan aspekt opisa obuhvata isporuku jedinjenja izabranog iz grupe koja se sastoji od PBD1, PBD2, PBD3, PBD4 i PBD5, i sadrži korak primene DLL3 konjugata.
II. DLL3 fiziologija
[0058] Notch signalni put, prvi put identifikovan kod C. elegans i Drosophila, za koji se kasnije pokazalo da je evoluciono konzerviran od beskičmenjaka do kičmenjaka, učestvuje u nizu osnovnih bioloških procesa uključujući normalni embrionalni razvoj, homeostazu tkiva odraslih i održavanje matičnih ćelija (D'Souza i dr., 2010; Liu i dr., 2010). Notch signalizacija je kritična za različite tipove ćelija tokom specifikacije, uzorkovanja i morfogeneze. Često se to dešava kroz mehanizam lateralne inhibicije, u kom ćelije koje eksprimiraju Notch ligande prihvataju šablonsku sudbinu ćelija, dok ipak suzbijaju ovu sudbinu u susednim ćelijama putem stimulacije Notch signalizacije (Sternberg, 1988, Cabrera 1990). Ovaj izbor binarne ćelijske sudbine posredovan Notch signalizacijom ima ulogu u brojnim tkivima, uključujući razvoj nervnog sistema (de la Pompa i dr., 1997), hematopoetski i imuni sistem (Bigas and Espinosoa, 2012; Hoyne i dr, 2011; Nagase i dr., 2011), stomaka (Fre i dr., 2005; Fre i dr., 2009), endokrinog pankreasa (Apelqvist i dr., 1999; Jensen i dr., 2000), hipofize (Raetzman i dr., 2004), i difuznog neuroendokrinog sistema (Ito i dr., 2000; Schonhoff i dr, 2004). Generalizovani mehanizam za implementaciju ovog binarnog prekidača izgleda konzerviran uprkos širokom spektru razvojnih sistema u kojima Notch igra ulogu; npr. u ćelijama gde je izbor sudbine ćelija određen transkripcionim regulatorom poznatim kao osnovni spirala-petlja-spirala (bHLH) proteini, Notch signalizacija dovodi do aktivacije klase Notch odgovorajućih gena, što zauzvrat potiskuje aktivnost bHLH proteina (Ball, 2004). Ove binarne odluke se odvijaju u širem kontekstu razvojnih i signalnih signala koji omogućavaju Notch signalizaciji da izazove proliferaciju ili inhibiciju, i da potakne samo-obnavljanje ili ga inhibira.
[0059] Kod Drosophila, Notch signalizacija je posredovana primarno sa jednim Notch receptorskim genom i dva ligandna gena, poznatim kao Serrate i Delta (Wharton i dr, 1985; Rebay i dr., 1991). Kod ljudi postoje četiri poznata Notch receptora i pet DSL (Delta-Serrate LAG2) liganda - dva homologa Serrate-a, poznatih kao Jagged1 i Jagged 2, i tri homologa Delta, nazvana delta-nalik ligandi ili DLL1, DLL3 i DLL4. Generalno, Notch receptori na površini ćelije koja prima signal aktiviraju se interakcijama sa ligandima eksprimiranim na površini suprotne ćelije koja šalje signal (nazvano trans-interakcija). Ove trans-interakcije dovode do sekvence razdvajanja Notch receptora posredovanih proteazom. Kao posledica toga, Notch receptor intracelularni domen je slobodan da se translocira iz membrane u nukleus, gde se udružuje sa CSL porodicom transkripcionih faktora (RBPJ kod ljudi) i pretvara ih iz transkripcionih represora u aktivatore Notch odgovorajućih gena.
[0060] Od ljudskih Notch liganada, DLL3 je različit po tome što se čini nesposobnim za aktiviranje Notch receptora preko trans-interakcija (Ladi i dr., 2005). Notch ligandi mogu takođe da interakuju sa Notch receptorima u cis (na istoj ćeliji) što dovodi do inhibicije Notch signala, iako tačni mehanizmi cis-inhibicije ostaju nejasni i mogu da variraju u zavisnosti od liganda (na primer, pogledati Klein i dr., 1997; Ladi i dr., 2005; Glittenberg i dr., 2006). Dva hipotička načina inhibicije uključuju modulaciju Notch signalizacije na površini ćelije sprečavanjem trans-interakcija, ili smanjenjem količine Notch receptora na površini ćelije ometanjem obrade receptora, ili fizičkim izazivanjem retencije receptora u endoplazmatični retikulum ili Goldžija (Sakamoto i dr., 2002; Dunwoodie, 2009). Jasno je, međutim, da se stohastičke razlike u eksprimiranju Notch receptora i liganda na susednim ćelijama mogu pojačati i putem transkripcionih i ne-transkripcionih procesa, i suptilne ravnoteže cis- i transinterakcija mogu rezultovati finim podešavanjem Notch-posredovanog određivanja divergentnih sudbina ćelija u susednim tkivima (Sprinzak i dr., 2010).
[0061] DLL3 (takođe poznat kao Delta-nalik 3 ili SCDO1) je član Delta-nalik porodice Notch DSL liganda. Reprezentativni DLL3 proteinski ortologi uključuju, ali nisu ograničeni na, čoveka (pristupni brojevi NP_058637 i NP_982353), šimpanzu (pristupni broj XP_003316395), miša (pristupni broj NP_031892) i pacova (pristupni broj NP_446118). Kod ljudi, DLL3 gen se sastoji od 8 eksona raspona 9,5 kBp koji se nalaze na hromozomu 19q13. Alternativno splajsovanje unutar zadnjeg eksona dovodi do dva obrađena transkripta, jednog od 2389 baza (pristupni broj NM_016941) i jednog od 2052 baza (pristupni broj NM_203486). Prvi transkript kodira 618 aminokiselinski protein (pristupni broj NP_058637; Slika 1, SEQ ID NO: 1), dok drugi kodira 587 aminokiselinski protein (pristupni broj NP_982353; Slika 1, SEQ ID NO: 2). Ova dva proteinska izoforma DLL3 dele ukupno 100% identičnosti preko njihovih ekstracelularnih domena i njihovih transmembranskih domena, razlikuju se samo po tome što duži izoform sadrži prošireni citoplazmatični rep koji sadrži 32 dodatna ostatka na karboksi kraju proteina (Slika 1). Biološka relevantnost izoforma nije jasna, iako se oba izoforma mogu detektovati u tumorskim ćelijama.
[0062] Generalno, DSL ligandi su sastavljeni od niza strukturalnih domena: jedinstveni N-terminalni domen, praćen konzerviranim DSL domenom, višestrukim tandemskim epidermalnim faktorom rasta (EGF)-nalik ponavljanjima, transmembranskim domenom i citoplazmatičnim domenom koji nije visoko konzerviran preko liganda, ali koji sadrži višestruke lizinske ostatke koji su potencijalna mesta za ubikvitinaciju pomoću jedinstvenih E3 ubikvitinskih ligaza. DSL domen je degenerisani EGF-domen koji je neophodan, ali nije dovoljan za interakcije sa Notch receptorima (Shimizu i dr., 1999). Pored toga, prva dva EGF-nalik ponavljanja većine DSL liganda sadrže manji motiv sekvence proteina poznat kao DOS domen koji kooperativno interakuje sa DSL domenom kada aktivira Notch signalizaciju.
[0063] Slika 2 daje šematski dijagram ekstracelularnog regiona DLL3 proteina, koji ilustruje opšti jukstapoložaj šest EGF-nalik domena, jednog DSL domena i N-terminalnog domena. Generalno, EGF domeni se prepoznaju kao da se dešavaju oko aminokiselinskih ostataka 216-249 (domen 1), 274-310 (domen 2), 312-351 (domen 3), 353-389 (domen 4), 391-427 (domen 5) i 429-465 (domen 6), sa DSL domenom oko aminokiselinskih ostataka 176-215 i N-terminalnim domenom oko aminokiselinskih ostataka 27-175 od hDLL3 (SEQ ID NO: 1 i 2). Kao što je ovde detaljnije objašnjeno i prikazano u primerima u nastavku, svaki od EGF-nalik domena, DSL domen i N-terminalni domen, čine deo DLL3 proteina definisanog određenom aminokiselinskom sekvencom. Treba primetiti da, za potrebe predmetnog obelodanjenja, odgovarajući EGF-nalik domeni mogu biti nazvani EGF1 do EGF6 sa EGF1 koji je najbliži N-terminalnom delu proteina. Što se tiče strukturalnog sastava proteina, jedan značajan aspekt predmetnog obelodanjenja je da obelodanjeni DLL3 modulatori mogu biti generisani, proizvedeni, konstruisani ili odabrani tako da reaguju sa odabranim domenom, motivom ili epitopom. U određenim slučajevima takvi modulatori specifični za određeno mesto mogu da pruže povećanu reaktivnost i/ili efikasnost u zavisnosti od njihovog primarnog načina delovanja.
[0064] Treba primetiti da, kako se ovde koristi, izrazi „zreli protein“ ili „zreli polipeptid“, kako se ovde koriste, odnose se na oblike proteina proizvedenog eksprimiranjem u ćeliji sisara. Generalno se pretpostavlja da kada se započne izvoz rastućeg lanca proteina preko grubog endoplazmatičnog retikuluma, proteini koje luče ćelije sisara imaju sekvencu signalnog peptida (SP) koja se odvaja od kompletnog polipeptida kako bi se proizveo „zreli“ oblik proteina. U oba izoforma DLL3 zreli protein sadrži signalni peptid od 26 aminokiselina koje se mogu skratiti pre eksprimiranja ćelijske površine. Tako će se u zrelim proteinima N-terminalni domen protezati od položaja 27 u proteinu do početka DSL domena. Naravno, ako se protein ne obrađuje na ovaj način, N-terminalni domen će se protezati do položaja jednog od SEQ ID NO: 1 & 2.
[0065] Od različitih delta-nalik liganda, DLL3 je najviše divergentan od ostalih u porodici, pošto sadrži degenerisani DSL domen, nema DOS motive i intracelularni domen koji nema ostatke lizina. Degenerisani DSL i nedostatak DOS motiva su u skladu sa nemogućnošću DLL3 da pokrene Notch signalizaciju u transu (između ćelija), što sugeriše da DLL3, za razliku od DLL1 ili DLL4, deluje samo kao inhibitor Notch signalizacije (Ladi i dr., 2005). Istraživanja su pokazala da DLL3 može biti primarno prisutan u cis-Goldži (Geffers i dr., 2007), što bi bilo konzistentno sa hipotetičkom sposobnošću da zadrži Notch receptor intracelularno, ili da ometa obradu Notch receptora, sprečavajući izvoz u površinu ćelija i umesto toga se ponovo cilja na lizozom (Chapman i dr., 2011). Neki DLL3 proteini se mogu pojaviti na površini ćelije, međutim, kada je protein veštački prekomerno eksprimiran u modelnim sistemima (Ladi i dr., 2005), ali nije očigledno da bi to bio slučaj u normalnim biološkim kontekstima niti u tumorima u kojima transkript DLL3 mRNK je povišen; pomalo iznenađujuće, nivo proteina detektovan u tipovima tumora koji su ovde opisani ukazuje na značajan DLL3 protein koji izlazi na površinu ćelija različitih tumora.
[0066] Dalje, kao što je gore pomenuto, Notch signalizacija igra ulogu u razvoju i održavanju neuroendokrinih ćelija i tumora koji pokazuju neuroendokrine karakteristike. U tom smislu Notch signalizacija je uključena u širok spektar odluka o sudbini ćelija u normalnim endokrinim organima i u difuznom neuroendokrinskom sistemu. Na primer, u pankreasu, Notch signalizacija je potrebna da potisne razvoj podrazumevanog endokrinog fenotipa posredovanog bHLH transkripcionim faktorom NGN3 (Habener i dr, 2005). Slična Notch posredovana supresija sudbina endokrinih ćelija javlja se u enteroendokrinim ćelijama (Schonhoff i dr., 2004), štitaste parfolikularne ćelije (Cook i dr., 2010), u određivanju relativnih odnosa neuroendokrinih tipova ćelija u hipofizi (Dutta i dr., 2011), i verovatno je uključen u odluke ćelija u plućima da usvoje neuroendokrini ili ne-neuroendokrini feneotip (Chen i dr., 1997; Ito i dr., 2000; Sriuranpong i dr., 2002). Stoga je jasno da je u mnogim tkivima potiskivanje Notch signalizacije povezano sa neuroendokrinim fenotipovima.
[0067] Neodgovarajuća reaktivacija razvojnih signalnih puteva ili disregulacija normalnih signalnih puteva se obično primećuju u tumorima, i u slučaju Notch signalizacije, povezani su sa brojnim tipovima tumora (Koch i Radtke, 2010; Harris i dr., 2012). Notch put je proučavan kao onkogen u limfomima, kolorektalnom, rakom pankreasa i nekim tipovima nemalokularnog raka pluća (pogledati Zarenczan i Chen, 2010 i reference tamo). Suprotno tome, za Notch se navodi da deluje kao supresor tumora kod tumora sa neuroendokrinim osobinama (pogledati Zarenczan i Chen, 2010 supra). Tumori sa neuroendokrinim osobinama retko se javljaju u širokom rasponu primarnih lokacija, i iako njihova iscrpna klasifikacija ostaje problematična (Yao i dr., 2008; Klimstra i dr., 2010; Kloppel, 2011), mogu se svrstati u četiri glavna tipa: benigni karcinoidi niskog stepena, dobro diferencirani neuroendokrini tumori sa malignim ponašanjem, tumori sa mešovitim neuroendokrinim i epitelnim svojstvima, i slabo diferencirani neuroendokrini karcinomi visokog reda. Od ovih klasifikacija, slabo diferencirani neuroendokrini karcinomi, koji uključuju rak malih ćelija pluća (SCLC) i podgrupe rakova ne-malih ćelija pluća (NSCLC), su tipovi raka sa lošim prognozama. Pretpostavljeno je da je SCLC bronhogenog porekla, nastao delom iz plućnih neuroendokrinih ćelija (Galluzzo i Bocchetta, 2011). Bez obzira na specifičan ćelijski izvor porekla za svaki od ovih tumora koji poseduju neuroendokrini fenotip, može se očekivati da supresija Notch signalizacije, bilo direktnim lezijama u samim genima Notch puteva, ili aktivacijom drugih gena koji suzbijaju Notch signalizaciju, mogu dovesti do sticanja neuroendokrinog fenotipa ovih tumora. Prošireno, geni koji dovode do poremećaja Notch puta mogu da pruže terapeutske ciljeve za tretman tumora sa neuroendokrinim fenotipovima, posebno za indikacije koje trenutno imaju loše kliničke ishode.
[0068] ASCL1 je jedan takav gen koji izgleda da interakuje sa Notch signalnim putem preko DLL3. Jasno je da mnogi neuroendokrini tumori pokazuju slabo diferencirani (tj. delimično kompletan) endokrini fenotip; na primer, izraženo povećanje ili eksprimiranje raznih endokrinih proteina i polipeptida (npr. hromogranin A, CHGA; kalcitonin, CALCA; propiomelanokorin, POMC; somatostatin, SST), proteini povezani sa sekretornim vezikulama (npr. sinaptofizin, SIP) i geni uključeni u biohemijske puteve odgovorni za sintezu bioaktivnih amina (npr. dopa dekarboksilaza, DDC). Možda nije iznenađujuće da ovi tumori često prekomerno eksprimiraju ASCL1 (takođe poznat kao mASH1 kod miševa, ili hASH1 kod ljudi), poznati transkripcijski faktor koji igra ulogu u orkestriranju genskih kaskada što dovodi do neuronskih i neuroendokrinih fenotipova. Iako specifični molekularni detalji kaskade ostaju nedovoljno definisani, sve je jasnije da za određene tipove ćelija, posebno za pariflikularne ćelije štitne žlezde (Kameda i dr., 2007), hromafinske ćelije nadbubrežne medule (Huber i dr., 2002) i ćelije koje se nalaze u difuznom neuroendokrinom sistemu pluća (Chen i dr., 1997; Ito i dr., 2000; Sriuranpong i dr., 2002), ASCL1 je deo fino podešene razvojne regulacione petlje u kojoj su izbori sudbine ćelija posredovani ravnotežom ASCL1-posredovanih i Notch-posredovanih kaskada eksprimiranja gena. Na primer, ASCL1 je otkriven u eksprimiranju u normalnim mišjim pulmonarnim neuroendokrinim ćelijama, dok je Notch signalni efekt HES1 eksprimiran u pulmonarnim ne-neuroendokrinim ćelijama (Ito i dr., 2000). Sve se više shvata da su ove dve kaskade u delikatnoj ravnoteži sa potencijalnom unakrsnom regulacijom. Pokazano je da Notch efektor HES1 smanjuje eksprimiranje ASCL1 (Chen i dr., 1997; Sriuranpong i dr., 2002). Ovi rezultati jasno pokazuju da Notch signalizacija može suzbiti neuroendokrnu diferencijaciju. Međutim, demonstracija da ASCL1 vezivanje za DLL3 promoter aktivira eksprimiranje DLL3 (Henke i dr., 2009) i zapažanje da DLL3 atenuira Notch signalizaciju (Ladi i dr., 2005) zatvara genetski sklop za izbor sudbine ćelija između neuroendokrinih i ne-neuroendokrinih fenotipova.
[0069] S obzirom da se čini da je Notch signalizacija evoluirala kako bi pojačala suptilne razlike između susednih ćelija kako bi se dozvolili oštro ograničeni domeni tkiva sa divergentnim putevima diferencijacije (npr., „lateralna inhibicija“, kao što je opisano iznad), ovi podaci zajedno ukazuju da fino podešena razvojna regulatorna petlja postaje reaktivirana i neregulisana u raku sa neuroendokrinim fenotipovima. Iako nije očigledno da bi DLL3 pružio pogodan cilj ćelijske površine za razvoj terapeutika antitela, uzimajući u obzir njegovo normalno prebivalište unutar unutrašnjih membranskih pregradaka ćelije (Geffers i dr., 2007) i njegove pretpostavljene interakcije sa Notchom u njemu, moguće je da rezultujuće povećanje eksprimiranja DLL3 u neuroendokrinim tumorima može ponuditi jedinstveni terapeutski cilj za tumore sa neuroendokrinim fenotipom (npr. NET i pNET). Obično se primećuje da veliko prekomerno eksprimiranje proteina u laboratorijskim sistemima može izazvati pogrešnu lokalizaciju prekomerno eksprimiranog proteina u ćeliji. Stoga je razumna hipoteza, ali nije očigledna bez eksperimentalne verifikacije, da prekomerno eksprimiranje DLL3 u tumorima može dovesti do eksprimiranja proteina na određenoj površini ćelije i na taj način predstaviti cilj za obelodanjene ADC predmetnog obelodanjenja.
III. Matične ćelije raka
[0070] Kao što je gore pomenuto, iznenađujuće je otkriveno da je aberantno eksprimiranje DLL3 (genotipsko i/ili fenotipsko) povezano sa različitim subpopulacijama tumorogenih ćelija. U ovom pogledu, predmetni pronalazak pruža DLL3 konjugate antitela i leka koji mogu biti posebno korisni za ciljanje takvih ćelija (npr. matične ćelije raka), čime se olakšava tretman, upravljanje ili prevencija neoplastičnih poremećaja. Prema tome, u poželjnim primerima, obelodanjeni DLL3 ADC mogu biti pogodno korišćeni za smanjenje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor u skladu sa predmetnim razmatranjima, i na taj način olakšavaju tretman ili upravljanje proliferativnim poremećajima.
[0071] Za potrebe ove prijave, izraz „ćelije koje iniciraju tumor“ (TIC) obuhvata i „ćelije koje perpetuiraju tumor“ (TPC; tj. matične ćelije raka ili CSC) i visoko proliferativne „tumorske progenitorske ćelije“ (nazvane TProg), koje zajedno obično obuhvataju jedinstvenu subpopulaciju (tj.0,1-40%) ukupnog tumora ili mase. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, izrazi „ćelije koje perpetuiraju tumor“ i „matične ćelije raka“ ili „neoplastične matične ćelije“ su ekvivalentni i mogu se ovde koristiti naizmenično. TPC se razlikuje od TProg u tome što TPC može u potpunosti rekapitulirati sastav tumorskih ćelija koje postoje unutar tumora i imaju neograničen kapacitet samoobnavljanja kao što je dokazano serijskim transplantacijama (dva ili više prolaza kroz miševe) malog broja izolovanih ćelija, dok TProg neće prikazati neograničen kapacitet samo-obnove.
[0072] Stručnjaci u oblasti će razumeti da je sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) korišćenjem odgovarajućih markera ćelijske površine pouzdan postupak za izolovanje visoko obogaćenih subpopulacija matičnih ćelija raka (npr.,> 99,5% čistoće) zbog, barem delimično, sposobnosti razlikovanja između pojedinačnih ćelija i grupa ćelija (tj. dubleta, itd.). Koristeći takve tehnike pokazano je da kada se nizak broj ćelija sa visoko prečišćenim TProg ćelija transplantira u imunokompromitovane miševe, oni mogu povećati rast tumora u primarnoj transplantaciji. Međutim, za razliku od prečišćenih subpopulacija TPC, tumori generisani TProg-om ne odražavaju potpuno roditeljski tumor u heterogenosti fenotipske ćelije, i dokazano su neefikasni u ponovnom pokretanju serijske tumorogeneze u kasnijim transplantatima. Nasuprot tome, subpopulacije matičnih ćelija raka potpuno rekonstruišu ćelijsku heterogenost roditeljskih tumora i mogu efikasno inicirati tumore kada se serijski izoluju i transplantiraju. Prema tome, stručnjaci u oblasti će prepoznati da je definitivna razlika između TPC i TProg, iako oba mogu generisati tumore u primarnim transplantatima, jedinstvena sposobnost TPC da neprestano dovodi do heterogenog rasta tumora nakon serijske transplantacije pri niskom broju ćelija. Drugi uobičajeni pristupi za karakterizaciju TPC uključuju morfologiju i ispitivanje markera ćelijske površine, transkripcionog profila i odgovora na lek, iako se eksprimiranje markera može promeniti u uslovima kulture i prolazom ćelijske linije in vitro.
[0073] Prema tome, za potrebe predmetnog pronalaska ćelije tumora koje perpetuiraju tumore, kao što su normalne matične ćelije koje podržavaju ćelijsku hijerarhiju u normalnom tkivu, poželjno su definisane svojom sposobnošću da se samostalno obnavljaju neograničeno dok održavaju sposobnost za multilinijsku diferencijaciju. Ćelije koje perpetuiraju tumore su tako sposobne da generišu i tumorogeno potomstvo (tj. ćelije koje iniciraju tumor: TPC i TProg) i ne-tumorogeno (NTG) potomstvo. Kako se ovde koristi, „ne-tumorogene ćelije“ (NTG) se odnose na tumorsku ćeliju koja nastaje iz ćelija koje iniciraju tumor, ali sama po sebi nema sposobnost samoobnavljanja ili generisanja heterogenih linija tumorskih ćelija koje sadrže tumor. Eksperimentalno, NTG ćelije su nesposobne za reprodukovno formiranje tumora kod miševa, čak i kada su transplantirane pri velikom broju ćelija.
[0074] Kao što je naznačeno, TProg su takođe kategorizovane kao ćelije koje iniciraju tumor (ili TIC) zbog svoje ograničene sposobnosti da generišu tumore kod miševa. TProg su potomci TPC i obično su sposobni za konačan broj ne-samo-obnavljajućih podela ćelija. Štaviše, TProg ćelije mogu dalje biti podeljene na rane tumorske progenitorske ćelije (ETP) i kasne tumorske progenitorske ćelije (LTP), od kojih se svaka može razlikovati po fenotipu (npr., markeri ćelijske površine) i različitim kapacitetima za rekapitulaciju arhitekture tumorskih ćelija. Uprkos takvim tehničkim razlikama, i ETP i LTP se funkcionalno razlikuju od TPC po tome što su generalno manje sposobni da serijski rekonstituišu tumore kada su transplantirani pri niskom broju ćelija i obično ne odražavaju heterogenost roditeljskog tumora. Bez obzira na prethodne razlike, takođe je pokazano da razne TProg populacije mogu, u retkim slučajevima, steći sposobnosti samoobnavljanja koje se obično pripisuju matičnim ćelijama i same postaju TPC (ili CSC). U svakom slučaju, obe vrste ćelija koje iniciraju tumor su verovatno zastupljene u tipičnoj tumorskoj masi jednog pacijenta i podležu tretmanu sa modulatorima, kao što je ovde opisano. To jest, opisani sastavi su generalno efikasni u smanjenju učestalosti ili promeni hemosenzitivnosti takvih DLL3 pozitivnih ćelija koje iniciraju tumor, bez obzira na određeno otelotvorenje ili mešavinu predstavljenu u tumoru.
[0075] U kontekstu predmetnog pronalaska, TPC su više tumorogeni, relativno više miruju i često su više hemorezistentni od TProg (i ETP i LTP), NTG ćelija i ćelija koje infiltriraju tumor koje nisu izvedene iz TPC (npr., fibroblasti/stroma, endotelijalne i hematopoetske ćelije) koje čine glavninu tumora. Imajući u vidu da su konvencionalne terapije i režimi, u velikoj meri, dizajnirani kako za rasturanje tumora tako i za napad na brzo proliferirajuće ćelije, TPC će verovatno biti otporniji na konvencionalne terapije i režime nego brže proliferirajuće TProg i druge masovne populacije tumora. Dalje, TPC često izražavaju i druge karakteristike koje ih čine relativno hemorezistentnim prema konvencionalnim terapijama, kao što je povećano eksprimiranje transportera za otpornost na više lekova, poboljšani mehanizmi popravke DNK i anti-apoptotički proteini. Ove osobine, od kojih svaka doprinosi toleranciji leka od strane TPC, predstavljaju ključni razlog za neuspeh standardnih režima onkoloških tretmana da pruže dugoročnu korist većini pacijenata sa uznapredovalom neoplazijom; tj. neuspeh da se adekvatno ciljaju i iskorene one ćelije koje pokreću kontinuirani rast i ponavljanje tumora (tj. TPC ili CSC).
[0076] Za razliku od mnogih tretmana iz prethodnog stanja tehnike, novi konjugati antitela predmetnog pronalaska poželjno smanjuju učestalost ćelija koje iniciraju tumor nakon primene ADC pacijentu. Kao što je gore navedeno, smanjenje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor može se javiti kao rezultat a) eliminacije, osiromašenja, senzitizacije, utišavanja ili inhibicije ćelija koje iniciraju tumor; b) kontrolisanje rasta, ekspanzije ili ponovne pojave ćelija koje iniciraju tumor; c) prekidanje inicijacije, propagacije, održavanja ili proliferacije ćelija koje iniciraju tumor; ili d) na drugi način ometanja preživljavanja, regeneraciju i/ili metastaziranje tumorogenih ćelija. U nekim otelotvorenjima, smanjenje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor nastaje kao rezultat promene u jednom ili više fizioloških puteva. Promena putanje, bilo putem redukcije ili eliminacije ćelija koje iniciraju tumor ili modifikovanjem njihovog potencijala (npr. indukovana diferencijacija, poremećaj niše) ili na drugi način ometaju njihovu sposobnost da utiču na okruženje tumora ili druge ćelije, zauzvrat omogućava efikasniji tretman poremećaja povezanih sa DLL3 inhibicijom tumorogeneze, održavanjem tumora i/ili metastazom i recidivom.
[0077] Među poznatim postupcima koje se mogu koristiti za procenu takvog smanjenja učestalosti ćelija koje iniciraju tumor je takođe analize limitirajućeg razblaživanja in vitro ili in vivo, poželjno praćeno brojanjem pomoću Poisson-ove distributivne statistike ili procenom učestalosti unapred definisanih definitivnih događaja kao što je sposobnost generisanja tumora in vivo ili njen nedostatak. Iako takva analize limitirajućeg razblaživanja sadrži poželjne postupke za izračunavanje smanjenja učestalosti ćelija koje iniciraju tumor, drugi, manje zahtevni postupci, mogu se takođe koristiti da se efikasno odrede željene vrednosti, doduše nešto manje precizno, i potpuno su kompatibilni sa ovde datim saznanjima. Prema tome, kao što će biti razumljivo od strane stručnjaka u ovoj oblasti, takođe je moguće odrediti smanjenje vrednosti učestalosti putem dobro poznatih protočnih citometrija ili imunohistohemijskih načina. Što se tiče svih gore navedenih metoda, pogledati, na primer, Dylla i dr.2008, PMID: 18560594 & Hoey i dr.2009, PMID: 19664991.
[0078] Što se tiče analize limitirajućeg razblaživanja, in vitro nabrajanje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor može da se postigne deponovanjem bilo fragmentisanih ili nefragmentisanih ćelija ljudskog tumora (npr. Iz tretiranih i netretiranih tumora) u in vitro uslove rasta koji podstiču formiranje kolonija. Na ovaj način, ćelije koje formiraju kolonije mogu biti nabrojane jednostavnim brojanjem i karakterizacijom kolonija, ili analizom koja se sastoji, na primer, od taloženja ljudskih tumorskih ćelija u ploče u serijskim razblaženjima i bodovanjem svake komorice bilo kao pozitivne ili negativne za formiranje kolonije najmanje 10 dana nakon oblaganja. In vivo eksperimenti ili analize limitirajućeg razblaživanja, koji su generalno precizniji u svojoj sposobnosti da odrede učestalost ćelija koje iniciraju tumor, obuhvataju transplantaciju ljudskih tumorskih ćelija, bilo iz netretirane kontrole ili tretirane populacije, na primer, u imunokompromitovane miševe u serijskim razblaženjima, i zatim ocenjivanjem svakog miša bilo kao pozitivnog ili negativnog na nastanak tumora najmanje 60 dana nakon transplantacije. Izvođenje vrednosti učestalosti ćelija analizom limitirajućeg razblaživanja in vitro ili in vivo poželjno se izvršava primenom Poisson-ove statistike distribucije na poznatu učestalost pozitivnih i negativnih događaja, čime se pruža učestalost za događaje koji ispunjavaju definiciju pozitivnog događaja; u ovom slučaju, formiranje kolonije ili tumora.
[0079] Što se tiče drugih postupaka kompatibilnih sa predmetnim pronalaskom koji se mogu koristiti za izračunavanje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor, najčešće su kvantitativne tehnike protočne citometrije i procedure imunohistohemijskog bojenja. Iako nisu tako precizne kao tehnike analize limitirajućeg razblaživanja koje su opisane gore, ove procedure su mnogo manje intenzivne i daju razumne vrednosti u relativno kratkom vremenskom periodu. Prema tome, biće jasno da stručnjak može da koristi određivanje profila markera ćelijske površine protočne citometrija koristeći jedno ili više antitela ili reagensa koji vezuju proteine prepoznate na površini ćelije za koje se zna da obogaćuju ćelije koje iniciraju tumor (npr. potencijalno kompatibilni markeri kao što su postavljeni dalje u PCT objava WO 2012/031280) i na taj način mere nivoe TIC iz različitih uzoraka. U još jednom kompatibilnom postupku, stručnjak u oblasti može izračunati TIC učestalost in situ (npr. u delu tkiva) imunohistohemijom upotrebom jednog ili više antitela ili reagensa koji su sposobni da vezuju proteine ćelijske površine za koje se misli da demarkiraju ove ćelije.
[0080] Biće poznato da su brojni markeri (ili njihovo odsustvo) povezani sa različitim populacijama matičnih ćelija raka i da se koriste za izolaciju ili karakterizaciju subpopulacija tumorskih ćelija. U ovom pogledu, primere markera matičnih ćelija raka čine OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, transferrin receptor, JAM3, karboksipeptidaza M, ADAM9, onkostatin M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestin, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β-katenin, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, dekorin, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, i CD49f. Pogledati, na primer, Schulenburg i dr., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 i U.S.P.N.2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 i 2011/0020221. Dalje će se razumeti da svaki od gore pomenutih markera može takođe da se koristi kao sekundarni ciljani antigen u kontekstu bispecifičnih ili multispecifičnih antitela predmetnog obelodanjenja.
[0081] Slično tome, neograničavajući primeri fenotipova ćelijske površine koji su povezani sa matičnim ćelijama raka određenih tipova tumora uključuju CD44<hi>CD24<low>, ALDH<+>, CD133+ , CD123+ , CD34+CD38- , CD44+CD24- , CD46hiCD324+CD66c- , CD133+CD34+CD10-CD19- , CD138-CD34-CD19+ , CD133+RC2+ , CD44<+>α h
2β i1CD133+ , CD44+CD24+ESA+ , CD271+ , ABCB5+ kao i druge fenotipove površine matičnih ćelija raka koji su poznati u struci. Pogledati, na primer, Schulenburg i dr., 2010, supra, Visvader i dr., 2008, PMID: 18784658 i U.S.P.N.2008/0138313. Stručnjaci u oblasti će uvideti da se fenotipovi markera, kao što su oni koji su navedeni neposredno gore, mogu koristiti zajedno sa standardnom protočnom citometrijskom analizom i tehnikama za sortiranje ćelija kako bi se karakterisale, izolovale, prečistile ili obogatile TIC i/ili TPC ćelije ili ćelijske populacije za dalju analizu.. Od interesa za predmetni pronalazak, CD46, CD324 i opciono, CD66c su ili visoko ili heterogeno eksprimirani na površini mnogih ljudskih kolorektalnih ćelija
ćelija dojke („BR“), ne-malih ćelija pluća (NSCLC), malih ćelija pluća (SCLC), ćelija pankreasa („PA“), melanoma („Mel“), ćelija tumora glave i vrata („HN“), bez obzira da li se uzorci tumora koji se analiziraju bili primarni uzorci tumora pacijenta ili tumori pacijenta izvedeni iz netradicionalnih ksenografta (NTX).
[0082] Koristeći bilo koji od gore pomenutih postupaka i odabranih markera, kao što je poznato u struci, tada je moguće kvantifikovati smanjenje učestalosti TIC (ili TPC u njemu) pruženih obelodanjenim DLL3 modulatorima (uključujući one konjugovane sa citotoksičnim agensima) u skladu sa sa ovim razmatranjem. U nekim slučajevima, jedinjenja predmetnog obelodanjenja mogu smanjiti učestalost TIC ili TPC (različitim mehanizmima koji su gore pomenuti, uključujući eliminaciju, indukovanu diferencijaciju, poremećaj niše, utišavanje itd.) za 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ili čak 35%. U drugim slučajevima, smanjenje učestalosti TIC ili TPC može biti od 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%. U nekim slučajevima, obelodanjena jedinjenja smanjuju učestalost TIC ili TPC za 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili čak 95%. Naravno, biće jasno da bilo kakvo smanjenje učestalosti TIC ili TPC verovatno dovodi do odgovarajućeg smanjenja tumorogenosti, istrajnosti, recidiva i agresivnosti neoplazije.
IV. Agensi za vezivanje ćelija
1. Struktura antitela
[0083] Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, posebno poželjni primeri predmetnog obelodanjenja obuhvataju obelodanjene DLL3 konjugate sa agensom za vezivanje ćelija u obliku antitela, ili njegovog imunoreaktivnog fragmenta, koji se prvenstveno asocira sa jednim ili više domena izoforma DLL3 proteina i, opciono, druge članove DLL porodice. U tom smislu, antitela, i njihove varijante i derivati, uključujući prihvaćenu nomenklaturu i sisteme numerisanja, detaljno su opisani, na primer, kod Abbas i dr. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6. izd.), W.B. Saunders Company; or Murphey i dr. (2011), Janeway's Immunobiology (8. izd.), Garland Science.
[0084] „Antitelo“ ili „netaknuto antitelo“ tipično se odnosi na tetramerni protein u obliku slova Y koji sadrži dva teška (H) i dva laka (L) polipeptidna lanca koja se drže zajedno kovalentnim disulfidnim vezama i nekovalentnim interakcijama. Ljudski laki lanci obuhvataju varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL), gde se konstantni domen može lako klasifikovati kao kappa ili lambda na osnovu aminokiselinske sekvence i lokusa gena. Svaki teški lanac sadrži jedan varijabilni domen (VH) i konstantni region, koji u slučaju IgG, IgA i IgD, sadrži tri domena nazvana CH1, CH2, i CH3 (IgM i IgE imaju četvrti domen, CH4). U IgG, IgA i IgD klasama CH1 i CH2 domeni su odvojeni fleksibilnim zglobnim regionom, koji je prolinom i cisteinom bogat segment promenljive dužine (obično od oko 10 do oko 60 aminokiselina u IgG). Varijabilni domeni u lakom i teškom lancu su spojeni na konstantne domene sa „J“ regionom od oko 12 ili više aminokiselina, i teški lanac takođe ima „D“ region od oko 10 dodatnih aminokiselina. Svaka klasa antitela dalje sadrži među-lančane i intralančane disulfidne veze formirane uparenim cisteinskim ostacima.
[0085] Kako se ovde koristi, izraz „antitelo“ može biti konstruisan široko i uključuje poliklonska antitela, multiklonska antitela, monoklonska antitela, himerna antitela, humanizovana i primatizovana antitela, CDR graftovana antitela, ljudska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, intrabatela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, anti-idiotipska antitela, sintetička antitela, uključujući muteine i njihove varijante, fragmente imunospecifičnih antitela kao što su Fd, Fab, F(ab')2, F(ab') fragmenti, fragmente sa jednim lancem (npr. ScFv i ScFvFc); i njihove derivate, uključujući Fc fuzije i druge modifikacije, i bilo koju drugi imunoreaktivni molekul, sve dok pokazuje preferencijalnu asocijaciju ili vezivanje sa DLL3 determinantom. Štaviše, osim ako nije drugačije određeno kontekstualnim ograničenjima, izraz dalje obuhvata sve klase antitela (tj. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM) i sve izotipove (tj., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2). Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela obično se označavaju odgovarajućim malim slovnim grčkim slovom α, δ, ε, γ i µ, redom. Laki lanci antitela iz svih vrsta kičmenjaka mogu biti dodeljeni jednom od dva jasno odvojena tipa, nazvanim kappa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.
[0086] U odabranim otelotvorenjima, i kao što je prikazano u priloženim Primerima, CLdomen može sadržati kappa CLdomen. U drugim otelotvorenjima, izvorno antitelo može da sadrži lambda CLdomen. Kako su sekvence svih ljudskih IgG CLdomena dobro poznate, stručnjak može lako da analizira i lambda i kappa sekvence u skladu sa ovim pronalaskom, i da ih koristi da pruži kompatibilne konstrukte antitela. Slično tome, za potrebe objašnjenja i demonstracije, sledeća diskusija i priloženi primeri će prvenstveno sadržati antitela IgGl tipa (mišja ili ljudska). Kao i kod konstantnog regiona lakog lanca, sekvence konstantnog domena teškog lanca iz različitih izotipova (IgM, IgD, IgE, IgA) i potklase (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) su dobro poznate i karakterisane. Shodno tome, stručnjak može lako da iskoristi anti-DLL3 antitela koja sadrže bilo koji izotip ili potklasu i svaki konjugat sa opisanim PBD, kako je ovde opisano, kako bi se pružili konjugati antitela i leka iz predmetnog pronalaska.
[0087] Varijabilni domeni antitela pokazuju značajnu varijaciju u sastavu aminokiselina od jednog antitela do drugog, i primarno su odgovorni za prepoznavanje i vezivanje antigena. Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela tako da netaknuto IgG antitelo ima dva mesta vezivanja (tj. bivalentno). VHi VLdomeni obuhvataju tri regiona ekstremne varijabilnosti, koji se nazivaju hipervarijabilni regioni, ili češće, regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), uokvireni i razdvojeni sa četiri manja varijabilna regiona poznata kao okvirni regioni (FR). Nekovalentna veza između VHi VLregiona formira Fv fragment (kao „varijabilni fragment“) koji sadrži jedno od dva antigen-vezujuća mesta antitela. ScFv fragmenti (kao jednolančani varijabilni fragmenti), koji se mogu dobiti genetskim inženjeringom, povezuju se u jednom polipeptidnom lancu, VHi VLregion antitela, odvojeni peptidnim veznikom.
[0088] Kako se ovde koristi, dodeljivanje aminokiselina na svaki domen, okvirni region i CDR može biti u skladu sa jednom od šema numeracije koje su date kod Kabat i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5. izd.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH objava br.91-3242; Chothia i dr., 1987, PMID: 3681981; Chothia i dr., 1989, PMID: 2687698; MacCallum i dr., 1996, PMID: 8876650; ili Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3. izd., Wily-VCH Verlag GmbH and Co., ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinski ostaci koji sadrže CDR, kao što su definisani od Kabat, Chothia i MacCallum, kao što je dobijeno iz baze podataka Abysis vebsajta (infra.) su navedeni u nastavku
TABELA 1
[0089] Varijabilni regioni i CDR u sekvenci antitela mogu se identifikovati prema opštim pravilima koja su razvijena u struci (kao što je gore navedeno, kao što je, na primer, Kabat sistem numerisanja) ili poravnavanjem sekvenci sa bazom podataka poznatih varijabilnih regiona. Postupci za identifikaciju ovih regiona su opisani kod Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello i dr., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Primeri baza podataka o sekvencama antitela su opisani kod, i može se pristupiti preko vebsajta „Abysis“ na www.bioinf.org.uk/abs (koji je održavan od strane A.C. Martin in the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England) i VBASE2 vebsajta na www.vbase2.org, kako je opisano kod Retter i dr., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005). Poželjno je da se sekvence analiziraju korišćenjem Abysis baze podataka, koja integriše podatke o sekvenci od Kabata, IMGT i Protein Data Bank (PDB) sa strukturnim podacima od PDB. pogledati knjigu od Dr. Andrew C. R.
Martin's, poglavlje Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, takođe dostupno na sajtu bioinforg.uk/abs). Vebsajt Abysis baze podataka dalje uključuje opšta pravila koja su razvijena za identifikaciju CDR koji se mogu koristiti u skladu sa ovde datim uputstvima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi CDR koji su ovde izloženi izvedeni su u skladu sa Abysis bazom podataka prema Kabatu.
[0090] Za položaje aminokiselina konstantnog regiona teškog lanca koji se razmatraju u pronalasku, numerisanje je prema Eu indeksu koji je prvi opisan kod Edelman i dr., 1969, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85, opisujući aminokiselinsku sekvencu Eu mijeloma proteina, koji je po navodima bio prvi sekvenciran ljudski IgG1. Eu indeks od Edelman je takođe naveden kod Kabat i dr., 1991 (supra.). Prema tome, izrazi „EU indeks kao što je navedeno kod Kabata“ ili „EU indeks od Kabata“ u kontekstu teškog lanca odnosi se na sistem numerisanja ostataka baziran na na ljudskom IgG1 Eu antitelu od Edelman i dr. kao što je navedeno kod Kabat i dr., 1991 (supra.). Sistem numeracije koji se koristi za aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca je slično postavljen kod Kabat i dr., 1991. Primerne kappa CLi IgGl aminokiselinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca kompatibilne sa ovim pronalaskom su navedene kao SEQ ID NO: 5 i 6 u priloženom spisku sekvenci. Stručnjaci u ovoj oblasti će shvatiti da obelodanjene sekvence konstantnog regiona mogu biti spojene sa obelodanjenim varijabilnim regionima teškog i lakog lanca koristeći standardne tehnike molekularne biologije, kako bi pružile antitela pune dužine koja se mogu ugraditi u DLL3 konjugate predmetnog pronalaska.
[0091] Antitela ili imunoglobulini iz opisa mogu sadržati, ili mogu biti izvedeni iz bilo kog antitela koje specifično prepoznaje ili asocira sa bilo kojom determinantom DLL3. Kako se ovde koristi, „determinanta“ ili „meta“ označava bilo koju detektabilnu osobinu, svojstvo, marker ili faktor koji se može identifikovati ili specifično pronaći u ili na određenoj ćeliji, ćelijskoj populaciji ili tkivu. Odrednice ili ciljevi mogu biti morfološke, funkcionalne ili biohemijske prirode, i poželjno su fenotipske. U određenim poželjnim primerima, determinanta je protein koji je diferencijalno eksprimiran (prekomerno ili nedovoljno eksprimiran) od strane specifičnih tipova ćelija, ili ćelija pod određenim uslovima (npr., tokom specifičnih tačaka ćelijskog ciklusa ili ćelija u određenoj niši). Za potrebe predmetnog obelodanjenja, determinanta je poželjno različito eksprimirana na aberantnim ćelijama raka i može da sadrži DLL3 protein, ili bilo koju njegovu varijantu splajsovanja, izoforme ili članove porodice, ili njihove specifične domene, regione ili epitope. „Antigen“, „imunogena determinanta“, „antigena determinanta“ ili „imunogen“ označava bilo koji protein (uključujući DLL3) ili bilo koji njegov fragment, region, domen ili epitop koji može stimulisati imuni odgovor kada se uvede u imunokompetentnu životinju i prepoznaje se od strane antitela proizvedenih iz imunog odgovora životinje. Prisustvo ili odsustvo determinanti koje se ovde razmatraju može se koristiti za identifikaciju ćelije, ćelijske subpopulacije ili tkiva (npr. tumori, tumorogene ćelije ili CSC).
[0092] Kao što je u nastavku prikazano u Primerima, odabrani primeri opisa obuhvataju mišja antitela koja se imunospecifično vezuju za DLL3, što se može smatrati „izvornim“ antitelima. U drugim slučajevima, antitela predviđena ovim pronalaskom mogu biti izvedena iz takvih „izvornih“ antitela preko opcione modifikacije konstantnog regiona ili epitop-vezujućih aminokiselinskih sekvenci izvornog antitela. U jednom slučaju, antitelo je „izvedeno“ od izvornog antitela ako su odabrane aminokiseline u izvornom antitelu izmenjene brisanjem, mutacijom, supstitucijom, integracijom ili kombinacijom. U drugom slučaju, „izvedeno“ antitelo je ono u kome su fragmenti izvornog antitela (npr., jedan ili više CDR ili čitavog varijabilnog regiona) kombinovani sa ili inkorporirani u sekvencu akceptora antitela da pruže derivatno antitelo (npr. himerna, CDR graftovana ili humanizovana antitela). Ova „izvedena“ (npr. humanizovana ili CDR graftovana) antitela mogu biti generisana korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije iz različitih razloga, kao što je, na primer, poboljšanje afiniteta za determinantu; poboljšanje proizvodnje i prinosa u kulturi ćelija; za smanjenje imunogenost in vivo; za smanjenje toksičnosti; da olakša konjugaciju aktivne grupe; ili da se stvori multispecifično antitelo. Takva antitela mogu takođe biti izvedena iz izvornih antitela kroz modifikaciju zrelog molekula (npr., obrasci glikozilacije ili pegilacije) hemijskim načinima ili post-translacijskom modifikacijom.
[0093] U kontekstu predmetnog pronalaska, biće jasno da bilo koji od opisanih CDR lakog i teškog lanca izveden iz aminokiselinskih sekvenci mišjih varijabilnih regiona prikazanih na Slici 3A ili Slici 3B može biti kombinovan sa akceptorskim antitelima ili reorganizovan da pruži optimizovana anti-ljudska DLL3 (npr. humanizovana ili himerna anti-hDLL3) antitela u skladu sa trenutnim razmatranjem. To jest, jedan ili više CDR izveden ili dobijen iz aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona susednog lakog lanca prikazane na Slikama 3A ili aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona susednog teškog lanca prikazane n Slikama 3B (zajedno SEQ ID NO: 21-387, neparni brojevi) mogu biti inkorporirani u DLL3 modulator i, u posebno poželjnim otelotvorenjima, u CDR presađenom ili humanizovanom antitelu koje se imunospecifično povezuje sa jednim ili više DLL3 izoformom. Primeri „izvedenih“ aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakog i teškog lanca takvih humanizovanih modulatora su takođe prikazani na Slikama 3A i 3B (SEQ ID NO: 389 - 407, neparni brojevi).
[0094] Na Slikama 3A i 3B označene CDR i okvirne sekvence su definisane prema Kabatu korišćenjem vlasničke Abysis baze podataka. Međutim, kao što je ovde razmatrano, stručnjak u oblasti može lako da definiše, identifikuje, izvede i/ili nabroji CDR, kao što su definisali Kabat i dr., Chothia i dr. ili MacCallum i dr. za svaku odgovarajuću sekvencu teškog i lakog lanca prikazanu na Slici 3A ili Slici 3B. Shodno tome, svaki od predmetnih CDR i antitela koji sadrže CDR definisane sa svom takvom nomenklaturom su izričito obuhvaćeni obimom predmetnog obelodanjenja. U širem smislu, izrazi „aminokiselinski ostatak CDR varijabilnog regiona“ ili jednostavnije „CDR“ uključuju aminokiseline u CDR, kao što je identifikovano korišćenjem bilo kog postupka zasnovanog na sekvenci ili strukturi kao što je navedeno iznad. U ovom kontekstu Kabat CDR za primerna humanizovana antitela na Slikama 3A i 3B su dati u priloženom spisku sekvenci kao SEQ ID NO: 408-437.
[0095] U još nekim drugim slučajevima, kompatibilno DLL3 antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologne aminokiselinskim sekvencama ovde opisanih antitela (humanizovanih i mišjih), i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-DLL3 antitela iz opisa.
[0096] Na primer, kompatibilna DLL3 antitela mogu da sadrže antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment koji ima varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca gde pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% homologna sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113 , SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 381 i SEQ ID NO: 385 i gde je varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% homologna aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 383 i SEQ ID NO: 387.
[0097] U drugim otelotvorenjima, VHi/ili VLaminokiselinske sekvence mogu biti 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% homologne gore navedenim sekvencama. Antitelo sa VHi VLregionima koji imaju visoku (tj.80% ili veću) homologiju sa VHi VLregionima gore navedenih sekvenci, mogu se dobiti ili izvesti koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Na primer, kao što je prikazano u TABELI 4 u nastavku, humanizovano antitelo izvedeno kao što je prikazano u Primeru 4 iz izvornog mišjeg antitela će sadržati varijabilne regione teškog i lakog lanca koji su otprilike 75% do 85% homologni onima iz izvornog antitela.
[0098] Kako se ovde koristi, procenat homologija između dve aminokiselinske sekvence je ekvivalentna procentu identičnosti između dve sekvence. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele sekvence (tj.% homologije = # identičnih položaja/ukupan # položaja × 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koju treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se izvršiti korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano u ne-ograničavajućim primerima u nastavku.
[0099] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem algoritma od E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) koji je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0), koristeći PAM120 tabelu ostataka mase, gap length penalty od 12 i gap penalty od 4. Pored toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti upotrebom the Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritma koji je inkorporiran u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupan na www.gcg.com), koristeći bilo Blossum 62 matricu ili PAM250 matricu, i gap weight od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i length weight 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0100] Dodatno ili alternativno, proteinske sekvence iz predmetnog pronalaska mogu se dalje koristiti kao „sekvenca upita“ kako bi se izvršilo pretraživanje prema javnim bazama podataka, na primer, kako bi se identifikovale povezane sekvence. Takve pretrage se mogu izvršiti pomoću programa XBLAST (verzija 2.0) od Altschul, i dr. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-10. BLAST proteinske pretrage mogu biti izvedene sa XBLAST programom, score = 50, wordlength = 3, kako bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne molekulima antitela iz obelodanjenja. Kako bi se dobila poravnanja sa razmakom za svrhe poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano kod Altschul i dr., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST).
2. Generisanje antitela
a. Poliklonska antitela
[0101] Proizvodnja poliklonskih antitela kod različitih životinja domaćina, uključujući zečeve, miševe, pacove, itd. dobro je poznata u struci. U nekim slučajevima, poliklonski serum koji sadrži anti-DLL3 antitelo se dobija krvarenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti u istraživačke svrhe u obliku dobijenom od životinje ili, alternativno, anti-DLL3 antitela mogu biti delimično ili potpuno prečišćena kako bi se dobili fragmenti imunoglobulina ili homogeni preparati antitela.
[0102] Ukratko, odabrana životinja je imunizovana sa DLL3 imunogenom (npr., rastvorljivim DLL3 ili sDLL3) koji može, na primer, da sadrži izabrane izoforme, domene i/ili peptide, ili žive ćelije ili ćelijske preparate koji eksprimiraju DLL3 ili njegove imunoreaktivne fragmente. U struci poznati adjuvansi koji se mogu koristiti za povećanje imunološkog odgovora, u zavisnosti od inokuliranih vrsta, uključuju, ali nisu ograničeni na, Freund-ov (potpun i nepotpun), mineralne gelove kao što su aluminijum-hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli polianioni, peptidi, uljane emulzije, keyhole limpet hemocianine, dinitrofenol i potencijalno korisne ljudske adjuvanse kao BCG (bacil Calmette-Guerin) i corinebacterium parvum. Takvi adjuvansi mogu zaštititi antigen od brzog dispergiranja tako što ga odvoje od lokalnog depozita, ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina da izlučuje faktore koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunog sistema. Poželjno, raspored imunizacije će uključivati dve ili više primene odabranog imunogena raspoređenog tokom unapred određenog vremenskog perioda.
[0103] Aminokiselinska sekvenca DLL3 proteina prikazana na Slici 1 može da se analizira kako bi se izabrali specifični regioni DLL3 proteina za generisanje antitela. Na primer, hidrofobnost i hidrofilnost analiza DLL3 aminokiselinske sekvence se koriste za identifikaciju hidrofilnih regiona u DLL3 strukturi. Regioni DLL3 proteina koji pokazuju imunogenu strukturu, kao i drugi regioni i domeni, mogu se lako identifikovati korišćenjem drugih postupaka poznatih u struci, kao što Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz or Jameson-Wolf analiza. Prosečni profili fleksibilnosti mogu se generisati pomoću postupka od Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Profili beta skretanja se mogu generisati koristeći postupak od Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Prema tome, svaki DLL3 region, domen ili motiv identifikovan bilo kojim od ovih programa ili postupaka je unutar obima predmetnog obelodanjenja i može biti izolovan ili konstruisan da pruži imunogene koji daju porast modulatora koji sadrže željena svojstva. Poželjni postupci za generisanje DLL3 antitela su dalje ilustrovani pomoću ovde datih Primera. Postupci za pripremu proteina ili polipeptida za upotrebu kao imunogena su dobro poznati u struci. Takođe dobro poznati u struci su postupci za dobijanje imunogenih konjugata proteina sa nosačem, kao što je BSA, KLH ili drugi protein nosač. U nekim okolnostima, koristi se direktna konjugacija upotrebom, na primer, karbodiimidnih reagensa; u drugim slučajevima povezivanje reagensa je efikasno. Primena DLL3 imunogena se često sprovodi injekcijom u pogodnom vremenskom periodu i upotrebom pogodnog adjuvansa, kao što se podrazumeva u struci. Tokom rasporeda imunizacije, titri antitela se mogu uzeti kao što je opisano u primerima u nastavku, kako bi se odredila adekvatnost formiranja antitela.
b. Monoklonska antitela
[0104] Pored toga, u opisu se razmatra upotreba monoklonskih antitela. Kao što je poznato u struci, izraz „monoklonsko antitelo“ (ili mAb) se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije u suštini homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim za moguće mutacije (npr. Mutacije koje se prirodno javljaju), koje mogu biti prisutne u manjim količinama. U određenim slučajevima, takvo monoklonsko antitelo obuhvata antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja se vezuje ili asocira na antigen gde je antigen-vezujuća polipeptidna sekvenca dobijena postupkom koji uključuje odabir jedne polipeptidne sekvence koja vezuje cilj od mnoštva polipeptida sekvence.
[0105] Opšte uzevši, kao što je ovde prikazano, monoklonska antitela mogu biti pripremljena korišćenjem širokog spektra tehnika koje su poznate u struci, uključujući hibridomske tehnike, rekombinantne tehnike, tehnologije prikazivanja faga, transgene životinje (npr. XenoMouse®) ili neku kombinaciju od toga. Na primer, monoklonska antitela se mogu proizvesti upotrebom hibridomskih i u struci priznatih biohemijskih i tehnika genetskog inženjeringa, kao što je detaljnije opisano kod An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1. izd.2009; Shire i dr. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science Business Media LLC, 1. izd.2010; Harlow i dr., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988; Hammerling, i dr., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Treba razumeti da odabrana vezujuća sekvenca može biti dalje izmenjena, na primer, kako bi se poboljšao afinitet za cilj, kako bi se humanizovala ciljana vezujuća sekvenca, kako bi se poboljšala njegova proizvodnja u kulturi ćelija, kako bi se smanjila njegova imunogenost in vivo, kako bi se stvorilo multispecifično antitelo, itd., i da je antitelo koje sadrži izmenjenu ciljanu sekvencu vezivanja takođe antitelo predmetnog obelodanjenja.
c. Himerna i humanizovana antitela
[0106] U drugom slučaju, antitela iz opisa mogu da sadrže himerna antitela izvedena iz kovalentno spojenih segmenata proteina iz najmanje dve različite vrste ili klase antitela. Izraz „himerna“ antitela je usmeren na konstrukte u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od određene vrste ili pripada određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanaca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od drugih vrsta ili pripada drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela (U.S. P.N.4,816,567; Morrison i dr., 1984, PMID: 6436822).
[0107] U jednom otelotvorenju, himerno antitelo može da sadrži mišje aminokiselinske sekvence VHi VLi konstantne regione izvedene iz ljudskih izvora, na primer, humanizovana antitela kao što je opisano u nastavku. U nekim otelotvorenjima, antitela mogu biti „CDR-graftovana“, gde antitelo sadrži jedan ili više CDR iz određene vrste ili pripada određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca antitela identičan sa ili je homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima izvedenim od drugih vrsta ili koji pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela. Za upotrebu kod ljudi, odabrani CDR glodara, na primer, mišji CDR mogu biti ugrađeni u ljudsko antitelo, zamenjujući jedan ili više CDR koji se prirodno javljaju u ljudskom antitelu. Ovi konstrukti generalno imaju prednosti pružanja funkcija antitela pune snage, npr., citotoksičnost zavisne od komplementa (CDC) i citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela (ADCC) , uz istovremeno smanjenje neželjenih imunih odgovora na antitelo od strane pacijenta.
[0108] Slično CDR-graftovano antitelo je „humanizovano“ antitelo. Kako se ovde koriste, „humanizovani“ oblici ne-ljudskih (npr., mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže aminokiselinske sekvence izvedene iz jednog ili više ne-ljudskih imunoglobulina. U jednom aspektu, humanizovano antitelo je ljudski imunoglobulin (recipijent ili akceptor antitelo) u kojem su ostaci iz jednog ili više CDR primaoca zamenjeni ostacima iz jednog ili više CDR ne-ljudske vrste (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, zec ili primat. U određenim poželjnim otelotvorenjima, ostaci u jednoj ili više FR u varijabilnom domenu ljudskog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-ljudskim ostacima iz donorskog antitela kako bi se pomoglo održavanju odgovarajuće trodimenzionalne konfiguracije transplantiranih CDR, i na taj način poboljšao afinitet. Ovo se može nazvati uvođenjem „povratnih mutacija“. Dalje, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora, na primer, za dalje poboljšanje performansi antitela.
[0109] Različiti izvori se mogu koristiti za određivanje koje ljudske sekvence će se koristiti u humanizovanim antitelima. Takvi izvori uključuju ljudske sekvence germinativne linije koje su obelodanjene, na primer, kod Tomlinson, I. A. i dr. (1992) J. Mol. Biol.227:776-798; Cook, G. P. i dr. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. i dr. (1992) J. Mol. Biol.
227:799-817; i Tomlinson i dr. (1995) EMBO J 14:4628-4638; V-BASE directory (VBASE2 - Retter i dr., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005) koji pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnih regiona ljudskog imunoglobulina (sastavljen od strane Tomlinson, I. A. i dr. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK); ili konsenzus ljudskih FR opisan, na primer, u U.S.P.N.6,300,064.
[0110] CDR presađivanje i humanizovana antitela su opisana, na primer, u U.S.P.N.
6,180,370 i 5,693,762. Za više detalja, pogledati, npr., Jones i dr., 1986, PMID: 3713831); and U.S.P.N.6,982,321 i 7,087,409.
[0111] Drugi postupak se naziva „humaneering“ koji je opisan, na primer, kod U.S.P.N. 2005/0008625. U još jednom otelotvorenju, ne-ljudsko antitelo može biti modifikovano specifičnom brisanjem ljudskih epitopa za T-ćelije ili „deimunizacijom“ postupcima opisanim u WO 98/52976 i WO 00/34317.
[0112] Kao što je razmotreno iznad u odabranim otelotvorenjima, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% aminokiselinskih ostataka teških ili lakih lanaca humanizovanog ili CDR graftovanog antitela odgovaraće onima iz prijemnih ljudskih sekvenci. U drugim otelotvorenjima najmanje 83%, 85%, 87% ili 90% ostataka varijabilne regije humanizovanog antitela će odgovarati onima iz prijemnih ljudskih sekvenci. U sledećem poželjnom otelotvorenju, više od 95% svakog od varijabilnih regiona humanizovanog antitela će odgovarati onima iz prijemnih ljudskih sekvenci.
[0113] Identičnost sekvence ili homologija varijabilnog regiona humanizovanog antitela prema ljudskom akceptorskom varijabilnom regionu može se odrediti kao što je prethodno razmatrano i, kada se meri kao takva, poželjno će imati najmanje 60% ili 65% identičnosti sekvence, poželjnije najmanje 70%, 75%, 80%, 85% ili 90% identičnosti sekvence, još poželjnije najmanje 93%, 95%, 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence ili stepen sličnosti može se prilagoditi naviše kako bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije.
d. Ljudska antitela
[0114] U još jednom otelotvorenju, antitela mogu sadržati potpuno ljudska antitela. Izraz „ljudsko antitelo“ se odnosi na antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj od antitela koje proizvodi čovek i/ili je napravljeno korišćenjem bilo koje od tehnika za pravljenje ljudskih antitela.
[0115] Ljudska antitela se mogu proizvesti upotrebom različitih tehnika poznatih u struci. Jedna tehnika je prikaz faga u kojoj se na fagima sintetiše biblioteka (poželjno ljudskih) antitela, biblioteka se ispituje sa antigenom od interesa ili njegovim delom za vezivanje antitela, i fag koji se vezuje za antigen je izolovan, od čega se mogu dobiti imunoreaktivni fragmenti. Postupci za pripremu i skrining takvih biblioteka su dobro poznati u struci i kompleti za generisanje biblioteka prikaza faga su komercijalno dostupni (npr. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no.27-9400-01; i Stratagene SurfZAP™ komplet za prikaz faga., kataloški broj 240612). Takođe postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti za generisanje i skrining biblioteka za prikazivanje antitela (pogledati, npr. U.S.P.N.5,223,409; PCT objave br. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; i Barbas i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
[0116] U jednom slučaju, rekombinantna ljudska antitela mogu biti izolovana skriningom rekombinantne kombinatorne biblioteke antitela pripremljene kao iznad. U jednom slučaju, biblioteka je scFv biblioteka prikaza faga, generisana pomoću ljudskog VLi VHcDNK dobijenih iz mRNK izolovane iz B-ćelija.
[0117] Antitela proizvedena naivnim bibliotekama (prirodnim ili sintetičkim) mogu biti umerenog afiniteta ( Kaod oko 106 do 107 M<-1>), ali afinitetsko sazrevanje takođe može biti oponašano in vitro konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka kao što je opisano u struci. Na primer, mutacija se može uvesti nasumično in vitro korišćenjem polimeraze koja je sklona greškama (objavljeno u Leung i dr., Technique, 1:11-15 (1989)). Pored toga, sazrevanje afiniteta se može izvesti slučajnim mutiranjem jednog ili više CDR, npr. korišćenjem PCR sa prajmerima koji nose nasumičnu sekvencu koja obuhvata CDR od interesa, u odabranim individualnim Fv klonovima i skrining za klonove višeg afiniteta. WO 9607754 opisuje postupak za indukciju mutageneze u CDR lakog lanca imunoglobulina kako bi se stvorila biblioteka gena lakog lanca. Drugi efikasan pristup je rekombinacija VHili VLdomena odabranih sa prikazom faga sa repertoarima varijanti prirodnog V domena dobijenog od neimunizovanih donora, i skeniranje za veći afinitet u nekoliko krugova lančane rekonstrukcije kao što je opisano kod Marks i dr., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Ova tehnika omogućava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa konstantom disocijacije KD(koff/kon) oko 10-9 M ili manje.
[0118] U drugim slučajevima, slične procedure se mogu primeniti korišćenjem biblioteka koje sadrže eukariotske ćelije (npr. kvasac) koje eksprimiraju vezujuće parove na svojoj površini. Pogledati, na primer, U.S.P.N.7,700,302 i U.S.S.N.12/404,059. U jednom slučaju, ljudsko antitelo je izabrano iz biblioteke faga, gde ta biblioteka faga eksprimira ljudska antitela (Vaughan i dr. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998). U drugim slučajevima, ljudski vezujući parovi mogu biti izolovani iz kombinatornih biblioteka antitela generisanih u eukariotskim ćelijama kao što je kvasac. Pogledati npr. U.S.P.N.7,700,302. Takve tehnike pogodno omogućavaju skrining velikog broja modulatora kandidata i pružaju relativno laku
manipulaciju kandidat sekvencama (npr., afinitetnim sazrevanjem ili rekombinantnim mešanjem).
[0119] Ljudska antitela se takođe mogu napraviti uvođenjem ljudskih imunoglobulinskih lokusa u transgene životinje, npr. miševe u kojima su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili potpuno inaktivirani i uvedeni su ljudski imunoglobulinski geni. Posle izazivanja, primećuje se produkcija ljudskih antitela, koja je veoma slična onoj koja je viđena kod ljudi u svim aspektima, uključujući preraspodelu gena, sastavljanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, kod U.S.P.N.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i U.S.P.N.6,075,181 i 6,150,584 u vezi sa XenoMouse® tehnologijom; i Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.13:65-93 (1995). Alternativno, ljudsko antitelo može biti pripremljeno putem imortalizacije ljudskih B limfocita koji proizvode antitelo usmereno protiv ciljanog antigena (takvi B limfociti mogu da se dobiju od pojedinca koji pati od neoplastičnog poremećaja ili može biti imunizovan in vitro). Pogledati, npr. Cole i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner i dr., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); and U.S.P.N.5,750,373.
3. Rekombinantna proizvodnja antitela
[0120] Antitela i njihovi fragmenti mogu biti proizvedeni ili modifikovani korišćenjem genetskog materijala dobijenog iz ćelija koje proizvode antitela i rekombinantne tehnologije (pogledati, na primer, Berger i Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izd.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel i dr. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (supplemented through 2006); i U.S.P.N.7,709,611).
[0121] Specifičnije, drugi aspekt obelodanjenja se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela iz opisa. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je „izolovana“ ili „dobijena u suštini čista“ kada se prečisti iz drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalin/SDS tretman, CsCl vezivanje, kolonsku hromatografiju, elektroforezu agaroza gel i druge dobro poznate u struci. Nukleinska kiselina iz opisa može biti, na primer, DNK ili RNK i može ali ne mora da sadrži intronične sekvence. Uopšteno, izraz „nukleinska kiselina“, kako se ovde koristi, uključuje genomsku DNK, cDNK, RNK i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline), bilo da su jednolančane ili dvolančane. U poželjnom slučaju, nukleinska kiselina je molekul cDNK.
[0122] Nukleinske kiseline iz opisa mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela koja su eksprimirana hibridomima (npr. hibridomi pripremljeni od transgenih miševa koji nose ljudske gene imunoglobulina kao što je dalje opisano), cDNK koje kodiraju laki i teški lanci antitela napravljenih hibridomom mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke imunoglobulinskih gena (npr., korišćenjem tehnika prikazivanja faga), nukleinska kiselina koja kodira antitelo može se povratiti iz biblioteke.
[0123] Jednom kad se dobiju DNK fragmenti koji kodiraju VHi VLsegmente, ovi DNK fragmenti mogu biti dalje manipulisani standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer za konvertovanje gena varijabilnog regiona u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili na gen scFv. U ovim manipulacijama, VL- ili VH- kodirajući DNK fragment je operativno povezan sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni veznik. Izraz „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva DNK fragmenta spojena tako da aminokiselinske sekvence kodirane sa dva DNK fragmenta ostaju u okviru.
[0124] Izolovana DNK koja kodira VH region se može konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativno povezujući VH- kodirajuću DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence ljudskih gena konstantnog regiona teškog lanca su poznate u struci (pogledati npr. Kabat, E. A., i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH objava br.91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali najpoželjnije je da je konstantni region IgGl ili IgG4. Kao što je detaljnije razmatrano u daljem tekstu, jedan primer IgGl konstantnog regiona koji je kompatibilan sa ovde datim uputstvima prikazan je kao SEQ ID NO: 6 u priloženom redosledu sekvenci. Za gen fragmenta teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može biti operativno vezana za drugi DNK molekul koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0125] Izolovana DNK koja kodira VLregion može biti konvertovana u genu lakog lanca pune dužine (kao i Fab gen lakog lanac) operativno povezujući VL- kodirajuću DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona ljudskog lakog lanca su poznate u struci (pogledati npr. Kabat, E. A., i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH objava br.91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kappa ili lambda konstantni region, ali najpoželjnije je kappa konstantni region. U ovom smislu, primerni kompatibilni kappa konstantni region lakog lanca je prikazan kao SEQ ID NO: 5 u priloženom redosledu sekvenci.
[0126] Predmetni pronalazak takođe pruža vektore koji sadrže gore opisane nukleinske kiseline, koji mogu biti operativno povezani sa promoterom (pogledati, npr. WO 86/05807; WO 89/01036; i U.S.P.N.5,122,464); i druge transkripcione regulatorne i procesne elemente eukariotskog sekretornog puta. Obelodanjenje takođe pruža ćelije domaćina koje sadrže te vektore i sisteme eksprimiranja domaćina.
[0127] Kako se ovde koristi, izraz „sistem eksprimiranja domaćina“ uključuje bilo koji tip ćelijskog sistema koji može biti konstruisan da generiše bilo nukleinske kiseline ili polipeptide i antitela obelodanjenja. Takvi sistemi eksprimiranja domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme (npr. E. coli ili B. subtilis) transformisane ili transfektovane rekombinantnom DNK bakteriofaga ili plazmidnom DNK; kvasac (npr. Saccharomyces) transfektovan rekombinantnim vektorima eksprimiranja kvasca; ili ćelije sisara (npr. COS, CHO-S, HEK-293T, 3T3 ćelije) koje sadrže rekombinantne konstrukte eksprimiranja koji sadrže promotere izvedene iz genoma ćelija sisara ili virusa (npr., kasni promoter adenovirusa). Ćelija domaćin može biti ko-transfektovana sa dva vektora eksprimiranja, na primer, prvi vektor koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca.
[0128] Postupci transformisanja ćelija sisara su dobro poznati u struci. Pogledati, na primer, U.S.P.N.s. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Ćelija domaćin takođe može biti konstruisana da omogući proizvodnju molekula koji vezuje antigen sa različitim karakteristikama (npr. modifikovani glikoformi ili proteini koji imaju aktivnost GnTIII).
[0129] Za dugoročnu proizvodnju visokog prinosa rekombinantnih proteina poželjno je stabilno eksprimiranje. Prema tome, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju odabrano antitelo mogu biti konstruisane korišćenjem standardnih tehnika koje su priznate u struci i čine deo obelodanjenja. Umesto da se koriste vektori eksprimiranja koji sadrže virusni izvor replikacije, ćelije domaćini mogu biti transformisane sa DNK kontrolisanim odgovarajućim elementima za kontrolu eksprimiranja (npr., promoter ili pojačivač sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.), i markerom koji se može izabrati. Može se koristiti bilo koji od selekcionih sistema koji su dobro poznati u struci, uključujući sistem za eksprimiranje gena za glutamin sintetazu (GS sistem) koji pruža efikasan pristup za poboljšanje eksprimiranja pod određenim uslovima. GS sistem se razmatra u celini ili delimično u vezi sa njim EP 0216 846, EP 0256 055, EP 0323 997 i EP 0338 841 i U.S.P.N.s 5,591,639 i 5,879,936. Drugi poželjni sistem eksprimiranja za razvoj stabilnih ćelijskih linija je Freedom™ CHO-S Kit (Life Technologies).
[0130] Jednom kada je antitelo iz opisa proizvedeno rekombinantnom eksprimiranjem ili bilo kojom od opisanih tehnika, može se prečistiti ili izolovati postupcima poznatim u struci, što znači da je identifikovana i izdvojena i/ili izvučena iz prirodnog okruženja, i odvojena od kontaminanata koji bi ometali dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela. Izolovana antitela uključuju antitela in situ unutar rekombinantnih ćelija.
[0131] Ovi izolovani preparati mogu biti prečišćeni korišćenjem različitih tehnika koje su prepoznate u struci, kao što su, na primer, jonska izmena i hromatografija isključivanja po veličini, dijaliza, dijafiltracija i afinitetna hromatografija, naročito proteinski A ili proteinski G afinitetna hromatografija.
4. Izbor nakon proizvodnje
[0132] Bez obzira na to kako se dobijaju, ćelije koje proizvode antitela (npr. hibridomi, kolonije kvasca, itd.) mogu biti selektovane, klonirane i dalje skenirane za željene karakteristike uključujući, na primer, robustan rast, visoku proizvodnju antitela i poželjna svojstva antitela kao što je visok afinitet za antigen od interesa. Hibridomi se mogu proširiti in vitro u kulturi ćelija ili in vivo u singenskim imunokompromitovanim životinjama.
Postupci selekcije, kloniranja i ekspandiranja hibridoma i/ili kolonija su dobro poznati prosečnom stručnjaku. Kada se željena antitela identifikuju, odgovarajući genetski materijal može biti izolovan, manipulisan i eksprimiran korišćenjem uobičajene, u struci poznatih tehnika molekularne biologije i biohemije.
[0133] Antitela proizvedena naivnim bibliotekama (bilo prirodnim ili sintetičkim) mogu biti umerenog afiniteta (Ka od oko 106 do 107 M<-1>). Kako bi se poboljšao afinitet, sazrevanje afiniteta se može oponašati in vitro konstruisanjem biblioteka antitela (npr. uvođenjem nasumičnih mutacija in vitro korišćenjem polimeraze koja je sklona grešci) i ponovnom selekcijom antitela sa visokim afinitetom za antigen iz tih sekundarnih biblioteka (npr. korišćenjem prikaza faga ili kvasca). WO 9607754 opisuje postupak za indukovanje mutageneze u CDR lakog lanca imunoglobulina kako bi se stvorila biblioteka gena lakog lanca.
[0134] Različite tehnike se mogu koristiti za selekciju antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, prikaz faga ili kvasca u kojima se biblioteka ljudskih kombinatornih antitela ili scFv fragmenata sintetiše na fagima ili kvascima, biblioteka se ispituje sa antigenom od interesa ili njegovim delom za vezivanje antitela, i izolovan je fag ili kvasac koji vezuje antigen, od kojih se mogu dobiti antitela ili imunoreaktivni fragmenti (Vaughan i dr., 1996, PMID: 9630891; Sheets i dr., 1998, PMID: 9600934; Boder i dr., 1997, PMID: 9181578; Pepper i dr., 2008, PMID: 18336206). Kompleti za generisanje biblioteka za prikaz faga ili kvasca su komercijalno dostupni. Takođe postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti u generisanju i ispitivanju biblioteka displeja antitela (pogledati U.S.P.N. 5,223,409; WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; and Barbas i dr., 1991, PMID: 1896445). Takve tehnike pogodno omogućavaju skrining velikog broja antitela kandidata i omogućavaju relativno lako manipulisanje sekvencama (npr., rekombinantnim mešanjem).
5. Fragmenti i derivati antitela
a. Fragmenti
[0135] Bez obzira na to koji je oblik modulatora (npr. himerno, humanizovano, itd.) odabran kako bi se izveo predmetni pronalazak, jasno je da se imunoreaktivni fragmenti istog mogu koristiti u skladu sa ovde datim uputstvima. „Fragment antitela“ sadrži bar deo netaknutog antitela. Kako se ovde koristi, izraz „fragment“ molekula antitela uključuje fragmente antitela koji vezuju antigen, i izraz „fragment koji vezuje antigen“ se odnosi na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji se imunospecifično vezuje ili reaguje sa izabranim antigenom, ili je njegova imunogena determinanta, ili se nadmeće sa netaknutim antitelom iz koga su fragmenti izvedeni za specifično vezivanje antigena.
[0136] Primeri fragmenata obuhvataju: VL, VH, scFv, F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, fragmente jednodomenskog antitela, dijatela, linearna antitela, molekule jednolančanog antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Dodatno, aktivni fragment sadrži deo antitela koji zadržava svoju sposobnost interakcije sa antigenom/supstratima ili receptorima i modifikuje ih na način sličan onom kod netaknutog antitela (iako možda sa nešto manje efikasnosti).
[0137] U drugim otelotvorenjima, fragment antitela je onaj koji sadrži Fc region i koji zadržava najmanje jednu od bioloških funkcija normalno povezanih sa Fc regionom kada je prisutan u netaknutom antitelu, kao što je FcRn vezivanje, modulacija polu-života antitela, ADCC funkcija i vezivanje komplementa. U jednom otelotvorenju, fragment antitela je monovalentno antitelo koje ima in vivo polu-život u suštini sličan netaknutom antitelu. Na primer, takav fragment antitela može da sadrži krak koja se vezuje za antigen i koja je vezan za Fc sekvencu sposobnu za primenu in vivo stabilnosti fragmentu.
[0138] Kao što je dobro poznato stručnjacima, fragmenti se mogu dobiti hemijskim ili enzimatskim tretmanom (kao što je papain ili pepsin) netaknutog ili kompletnog antitela ili lanca antitela ili rekombinantnim načinima. Pogledati, npr. Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), za detaljniji opis fragmenata antitela.
b. Multivalentna antitela
[0139] U jednom slučaju, modulatori opisa mogu biti monovalentni ili multivalentni (npr., bivalentni, trovalentni, itd.). Kako se ovde koristi, izraz „valenca“ se odnosi na broj potencijalnih mesto vezivanja cilja povezanih sa antitelom. Svako mesto vezivanja cilja specifično vezuje jedan ciljani molekul ili specifičan položaj ili lokus na ciljanom molekulu.
Kada je antitelo monovalentno, svako vezujuće mesto molekula će se specifično vezati za jedan položaj antigena ili epitopa. Kada antitelo sadrži više od jednog mesto vezivanja cilja (multivalentno), svako mesto vezivanja cilja može specifično vezati iste ili različite molekule (npr., može se vezati za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope ili položaje na istom antigenu). Pogledati, na primer, U.S.P.N. 2009/0130105. U svakom slučaju, najmanje jedno od mesta vezivanja će sadržati epitop, motiv ili domen koji su povezani sa DLL3 izoformom.
[0140] U jednom otelotvorenju, modulatori su bispecifična antitela u kojima dva lanca imaju različite specifičnosti, kao što je opisano kod Millstein i dr., 1983, Nature, 305:537-539. Drugi primeri uključuju antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela. Drugi sofisticiraniji kompatibilni multispecifični konstrukti i postupci njihove proizvodnje su prikazani u U.S.P.N.2009/0155255, kao i WO 94/04690; Suresh i dr., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; i WO96/27011.
[0141] Kao što je aludirano na gore, multivalentna antitela se mogu imunospecifično vezati za različite epitope željenog ciljanog molekula ili se mogu imunospecifično vezati i za ciljani molekul, kao i za heterologni epitop, kao što je heterologni polipeptid ili čvrsti noseći materijal. Dok poželjni primeri anti-DLL3 antitela vezuju samo dva antigena (tj. bispecifična antitela), antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela su takođe obuhvaćena predmetnim obelodanjenjem. Bispecifična antitela takođe obuhvataju unakrsno vezana ili „heterokonjugovana“ antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti povezano sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (U.S.P.N.4,676,980), i za tretman HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373, i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu da se izrade korišćenjem bilo kog pogodnog postupka unakrsnog vezivanja. Pogodni agensi za unakrsno vezivanje su dobro poznati u struci i opisani su u U.S. P.N.4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama unakrsnog vezivanja.
[0142] U drugim otelotvorenjima, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta za kombinovanje antitela i antigena) su fuzionisani na sekvence konstantnog domena imunoglobulina, kao što je konstantni domen imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži bar deo zgloba, CH2, i/ili CH3 regione, koristeći postupke koje su dobro poznate prosečnom stručnjaku.
c. Modifikacije Fc regiona
[0143] Pored različitih modifikacija, supstitucija, umetanja ili brisanja varijabilnog ili vezujućeg regiona obelodanjenih antitela koja su gore navedena, stručnjaci u oblasti će razumeti da odabrana otelotvorenja predmetnog pronalaska mogu takođe obuhvatati supstitucije ili modifikacije konstantnog regiona (tj. Fc region). Preciznije, razmatra se da DLL3 modulatori opisa mogu sadržati, između ostalog, jednu ili više dodatnih supstitucija, mutacija i/ili modifikacija aminokiselinskih ostataka koji dovode do jedinjenja sa poželjnim karakteristikama uključujući, ali ne ograničavajući se na: promenjenu farmakokinetiku, povećani polu-život u serumu, povećanje afiniteta vezivanja, smanjenu imunogenost, povećanu proizvodnju, izmenjeno Fc ligand vezivanje za Fc receptor (FcR), pojačana ili redukovana „ADCC“ (citotoksičnost posredovana ćelijama zavisnim od antitela) ili (citotoksičnost zavisna od komplemenata) aktivnost, izmenjena glikozilacija i/ili disulfidne veze i modifikovana specifičnost vezivanja. U tom smislu biće jasno da se ove varijante Fc mogu korisno koristiti za poboljšanje efektivnih anti-neoplastičnih svojstava obelodanjenih modulatora.
[0144] U tom smislu, izvesna otelotvorenja predmetnog pronalaska mogu obuhvatati supstitucije ili modifikacije Fc regiona, na primer dodavanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka, supstitucija, mutacija i/ili modifikacija kako bi se dobilo jedinjenje sa pojačanim ili poželjnim Fc efektorskim funkcijama. Na primer, promene u aminokiselinskim ostacima koji su uključeni u interakciju između Fc domena i Fc receptora (npr. FcyRI, FcyRIIA i B, FcyRIII i FcRn) mogu dovesti do povećane citotoksičnosti i/ili izmenjene farmakokinetike, kao što je povećan polu-život u serumu (pogledati, na primer, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel i dr., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas i dr., J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995)).
[0145] U odabranim otelotvorenjima, antitela sa povećanim in vivo polu-životom mogu biti generisana modifikovanjem (npr., zamenom, brisanjem ili dodavanjem) aminokiselinskih ostataka koji su identifikovani kao uključeni u interakciji između Fc domena i FcRn receptora (pogledati, npr., međunarodne objave br. WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N.6,737,056 i U.S.P.N.2003/0190311. U vezi sa takvim otelotvorenjima, Fc varijante mogu pružiti poluživot u sisaru, poželjno čoveku, koji je duži od 5 dana, duži od 10 dana, duži od 15 dana, poželjno duži od 20 dana, duži od 25 dana, duži od 30 dana, duži od 35 dana, duži od 40 dana, duži od 45 dana, duži od 2 meseca, duži od 3 meseca, duži od 4 meseca, ili duži od 5 meseci. Povećani polu-život rezultuje višim serumskim titrom koji tako smanjuje učestalost primene antitela i/ili smanjuje koncentraciju antitela koja se primenjuju. Vezivanje za ljudski FcRn in vivo i polu-život u serumu ljudskih FcRn vezujućih polipeptida visokog afiniteta može se analizirati, npr., u transgenim miševima ili transfektovanim ljudskim ćelijskim linijama koje eksprimiraju ljudski FcRn, ili u primatima kojima se daju polipeptidi sa varijantom Fc regiona. WO 2000/42072 opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRns. Pogledati i, npr. Shields i dr. J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).
[0146] U drugim otelotvorenjima, Fc promene mogu dovesti do pojačane ili smanjene aktivnosti ADCC ili CDC. Kao što je poznato u struci, CDC se odnosi na liziranje ciljane ćelije u prisustvu komplementa, i ADCC se odnosi na oblik citotoksičnosti u kome se izlučeni Ig vezuje na FcR prisutan na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice, neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen, i zatim ubijaju ciljanu ćeliju sa citotoksinima. U kontekstu predmetnog pronalaska, varijante antitela su pružene sa „izmenjenim“ FcR vezujućim afinitetom, koji je ili pojačan ili smanjen u odnosu na roditeljsko ili nemodifikovano antitelo ili antitelo koje sadrži prirodnu sekvencu FcR. Takve varijante koje pokazuju smanjeno vezivanje mogu imati malo ili nikakvo značajno vezivanje, npr. 0-20% vezivanja za FcR u poređenju sa prirodnom sekvencom, npr. kako je određeno tehnikama dobro poznatim u struci. U drugim otelotvorenjima varijanta će pokazati pojačano vezivanje u poređenju sa prirodnim Fc domenom imunoglobulina. Treba imati na umu da se ovi tipovi Fc varijanti mogu pogodno koristiti za poboljšanje efektivnih anti-neoplastičnih svojstava obelodanjenih antitela. U još drugim otelotvorenjima, takve izmene dovode do povećanog afiniteta vezivanja, smanjene imunogenosti, povećane produkcije, promenjene glikozilacije i/ili disulfidne veze (npr., za mesta konjugacije), modifikovane specifičnosti vezivanja, povećane fagocitoze; i/ili smanjena regulacija receptora na površini ćelija (npr. receptor B ćelija; BCR), itd.
d. Izmenjena glikozilacija
[0147] Još neki slučajevi sadrže jedan ili više projektovanih glikoforma, tj. DLL3 modulator koji sadrži promenjeni glikozilacioni obrazac ili izmenjeni karbohidratnu sastav koji je kovalentno vezan za protein (npr. u Fc domenu). Pogledati, na primer, Shields, R. L. i dr. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740. Konstruisani glikoformi mogu biti korisni za različite svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na, poboljšanje ili smanjenje efektorske funkcije, povećanje afiniteta modulatora za cilj ili olakšavanje proizvodnje modulatora. U određenim otelotvorenjima gde je poželjna redukovana efektorska funkcija, molekul može biti konstruisan tako da eksprimira aglikozilovani oblik. Dobro su poznate supstitucije koje mogu rezultovati eliminacijom jednog ili više glikozilacionih mesta okvira varijabilnog regiona, kako bi se na taj način eliminisala glikozilacija na tom mestu (pogledati npr. U.S. P.N. 5,714,350 i 6,350,861). Obrnuto, pojačane efektorske funkcije ili poboljšano vezivanje mogu se dati molekulu koji sadrži Fc, inženjeringom u jednom ili više dodatnih mesta glikozilacije.
[0148] Druga otelotvorenja obuhvataju Fc varijantu koja ima izmenjenu glikozilacioni sastav, kao što je hipofukozilovano antitelo sa smanjenim količinama fukozilnih ostataka, ili antitelo koje ima povećanu bisekciju GlcNAc strukture. Takvi promenjeni obrasci glikozilacije su pokazali da povećavaju ADCC sposobnost antitela. Konstruisani glikoformi mogu biti generisani bilo kojim postupkom poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, na primer upotrebom veštačkih ili varijantnih eksprimirajućih sojeva, ko-eksprimiranjem sa jednim ili više enzima (na primer N-acetilglukozaminiltransferaza III (GnTI11)), eksprimiranjem molekula koji sadrži Fc region u različitim organizmima ili ćelijskim linijama iz različitih organizama, ili modifikovanjem ugljenih hidrata nakon što je molekul koji sadrži Fc region eksprimiran (pogledati, na primer, WO 2012/117002).
e. Dodatna obrada
[0149] Modulatori mogu biti različito modifikovani tokom ili nakon proizvodnje, npr., glikozilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim razdvajanjem, vezivanjem za molekul antitela ili drugim ćelijskim ligandom, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvesti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko razdvajanje cijanogen bromidom, tripsinom, himotripsinom, papainom, V8 proteazom, NaBH4, acetilacijom, formilacijom, oksidacijom, redukcijom, metaboličkom sintezom u prisustvu tunikamicina, itd.
[0150] Različite post-translacione modifikacije koje su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom obuhvataju, na primer, N-vezane ili O-vezane ugljenohidratne lance, obradu N-terminalnih ili C-terminalnih krajeva, vezivanje hemijskih grupa za aminokiselinski kostur, hemijske modifikacije N-vezanih ili O-vezanih ugljenohidratnih lanaca, i dodavanje ili brisanje N-terminalnog ostatka metionina kao rezultat eksprimiranja prokariotskih ćelija domaćina. Štaviše, modulatori mogu takođe biti modifikovani sa oznakom koja se može detektovati, kao što je enzimska, fluorescentna, radioizotopna ili afinitetna oznaka koja omogućava detektovanje i izolaciju modulatora.
6. Karakteristike antitela
[0151] Bez obzira na to kako je dobijen ili koji od gore pomenutih oblika modulator uzima, različiti primeri obelodanjenih modulatora mogu pokazivati određene karakteristike. U odabranim slučajevima, ćelije koje proizvode antitela (npr. hibridomi ili kolonije kvasca) mogu biti selektovane, klonirane i dalje skenirane za povoljne osobine uključujući, na primer, robustan rast, proizvodnju visokog modulatora i, kako je detaljnije objašnjeno u daljem tekstu, poželjne karakteristike modulatora. U drugim slučajevima karakteristike modulatora mogu biti usađene ili pod uticajem odabira određenog antigena (npr., specifičan DLL3 izoform) ili imunoreaktivnog fragmenta ciljanog antigena za inokulaciju životinje. U još nekim slučajevima izabrani modulatori mogu biti konstruisani kao što je gore opisano kako bi se poboljšale ili unapredile imunohemijske karakteristike kao što su afinitet ili farmakokinetika.
a. Neutralizujuća antitela
[0152] U određenim aspektima, konjugati će sadržati „neutralizujuća“ antitela ili njihove derivate ili fragmente. To jest, predmetni pronalazak može da sadrži molekule antitela koji vezuju specifične domene, motive ili epitope, i mogu da blokiraju, redukuju ili inhibiraju biološku aktivnost DLL3. Uopšteno, izraz „neutralizujuće antitelo“ se odnosi na antitelo koje se vezuje za, ili interakuje sa, ciljanim molekulom ili ligandom i sprečava vezivanje ili povezanost ciljanog molekula za vezujućeg partnera kao što je receptor ili supstrat, čime se prekida biološki odgovor, koji bi inače bio rezultat interakcija molekula.
[0153] Podrazumeva se da se testovi kompetitivnog vezivanja, poznati u struci, mogu koristiti za procenu vezivanja i specifičnosti antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog fragmenta ili derivata. U vezi sa ovim pronalaskom, smatraće se da antitelo ili fragment inhibiraju ili redukuju vezivanje DLL3 za vezujućeg partnera ili supstrat kada višak antitela smanjuje količinu vezujućeg partnera vezanog za DLL3 za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više, mereno, na primer, aktivnostima Notch receptora ili u in vitro testu kompetitivnog vezivanja. U slučaju antitela za DLL3, na primer, neutralizujuće antitelo ili antagonist poželjno će izmeniti aktivnost Notch receptora za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više. Treba imati na umu da se ova modifikovana aktivnost može meriti direktno upotrebom tehnika priznatih u struci, ili se može meriti uticajem koji izmenjena aktivnost ima nizvodno (npr. onkogeneza, preživljavanje ćelija ili aktivacija ili supresija gena koji reaguju na Notch). Poželjno, sposobnost antitela da neutrališe DLL3 aktivnost se procenjuje inhibicijom vezivanja DLL3 za Notch receptor, ili procenom njegove sposobnosti da oslobodi DLL3 posredovano potiskivanje Notch signalizacije.
b. Internalizacija antitela
[0154] Postoje dokazi da značajan deo eksprimiranog DLL3 proteina ostaje povezan sa površinom tumorogenih ćelija, čime se omogućava lokalizacija i internalizacija obelodanjenih modulatora. U poželjnim primerima takvi modulatori mogu biti povezani sa, ili konjugovani sa, antikancerogenim agensima kao što su citotoksični ostaci, koji ubijaju ćeliju nakon internalizacije. U posebno poželjnim primerima modulator će sadržati internalizujući konjugat antitela i leka.
[0155] Kao što se ovde koristi, modulator koji „internalizuje“ je onaj koji je uzet (zajedno sa bilo kojim sadržajem) od strane ćelije nakon vezivanja za pridruženi antigen ili receptor. Kao što će biti shvaćeno, internalizujući modulator može, u poželjnim primerima, da sadrži antitelo, uključujući fragmente antitela i njegove derivate, kao i konjugate antitela. Može doći do internalizacije in vitro ili in vivo. Za terapeutske primene, poželjno je da se pojavi internalizacija in vivo kod pacijenta kom je to potrebno. Broj internalizovanih molekula antitela može biti dovoljan ili adekvatan da ubije ćelije koje eksprimiraju antigen, posebno matične ćelije raka koje eksprimiraju antigen. U zavisnosti od jačine antitela ili konjugata antitela, u nekim slučajevima, unos jednog molekula antitela u ćeliju je dovoljan da ubije ciljanu ćeliju na koju se vezuje antitelo. Na primer, izvesni toksini su toliko snažno potentni da je internalizacija nekoliko molekula toksina konjugovanog sa antitelom dovoljna da ubije tumorsku ćeliju. Da li se antitelo internalizuje nakon vezivanja za ćeliju sisara može se odrediti pomoću različitih testova koji su priznati u struci, uključujući one koji su opisani u primerima dole. Postupci detekcije da li se antitelo internalizuje u ćeliju su takođe opisani u U.S.P.N. 7,619,068.
c. Iscrpljujuća antitela
[0156] U drugim otelotvorenjima antitela će sadržati iscrpljujuća antitela ili njihove derivate ili fragmente. Izraz „iscrpljujuće“ antitelo se odnosi na antitelo koje se poželjno vezuje za ili se povezuje sa antigenom na ili blizu površine ćelije i indukuje, promoviše ili uzrokuje smrt ili eliminaciju ćelije (npr., CDC, ADCC ili uvođenje citotoksičnog agensa). U nekim slučajevima, izabrana iscrpljujuća antitela će biti povezana ili konjugovana sa citotoksičnim agensom.
[0157] Poželjno, iscrpljujuće antitelo će biti u stanju da ukloni, onesposobi, eliminiše ili ubije najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ili 99% DLL3 tumorogenih ćelija u definisanoj ćelijskoj populaciji. U nekim otelotvorenjima, ćelijska populacija može da sadrži obogaćene, secirane, prečišćene ili izolovane ćelije koje održavaju tumore. U drugim otelotvorenjima, ćelijska populacija može obuhvatiti čitave uzorke tumora ili heterogene ekstrakte tumora koji sadrže ćelije koje produžavaju tumor. Stručnjaci u oblasti će razumeti da se standardne biohemijske tehnike, kao što je opisano u primerima u nastavku (npr., Primeri 8 do 10), mogu koristiti za praćenje i kvantifikovanje iscrpljivanja tumorogenih ćelija ili ćelija koje održavaju tumor, u skladu sa ovde datim uputstvima.
d. Binovanje i mapiranje epitopa
[0158] Dalje će se razumeti da će opisani modulatori anti-DLL3 antitela biti povezani sa, ili se vezati za, diskretne epitope ili imunogene determinante predstavljene odabranim ciljem ili njegovim fragmentom. U izvesnim otelotvorenjima, epitop ili imunogene determinante uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe, ili sulfonil grupe, i, u izvesnim otelotvorenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.
Prema tome, kako se ovde koristi, izraz „epitop“ uključuje bilo koju determinantu proteina sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor, ili na drugi način interakciju sa molekulom. U određenim aspektima, za antitelo se kaže da specifično vezuje (ili imunospecifično vezuje ili reaguje) antigen kada poželjno prepoznaje svoj ciljani antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. U poželjnim otelotvorenjima, za antitelo se kaže da specifično vezuje antigen kada je konstanta ravnoteže disocijacije (KD) manja ili jednaka 10-6M, ili manja ili jednaka 10<-7>M, poželjnije kada je konstanta ravnoteže disocijacije manja ili jednaka 10-8M, i još poželjnije kada je konstanta disocijacije manja ili jednaka 10-9M
[0159] Direktnije, izraz „epitop“ se koristi u svom zajedničkom biohemijskom smislu i odnosi se na onaj deo ciljanog antigena koji može biti prepoznat i specifično vezan za određeni modulator antitela. Kada je antigen polipeptid, kao što je DLL3, epitopi se generalno mogu formirati od susednih aminokiselina i nekontinuiranih aminokiselina jukstsapozicioniranih tercijarnim preklapanjem proteina („konformacioni epitopi“) . U takvim konformacionim epitopima tačke interakcije se javljaju preko aminokiselinskih ostataka na proteinu koji su linearno odvojeni jedan od drugog. Epitopi formirani od susednih aminokiselina (ponekad se nazivaju „linearni“ ili „kontinuirani“ epitopi) tipično se zadržavaju na denaturiranju proteina, dok se epitopi formirani tercijarnim preklapanjem tipično gube nakon denaturacije proteina. U svakom slučaju, epitop antitela obično uključuje najmanje 3, i još više, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0160] U ovom pogledu biće jasno da, u izvesnim otelotvorenjima, epitop može biti povezan sa, ili boraviti u, jednom ili više regiona, domena ili motiva DLL3 proteina (npr., aminokiseline 1-618 izoforma 1). Kao što je ovde detaljnije razmatrano, ekstracelularni region DLL3 proteina sadrži niz opštepoznatih domena uključujući šest EGF-nalik domena i DSL domen. Za potrebe predmetnog obelodanjenja, izraz „domen“ će biti korišćen u skladu sa svojim opšteprihvaćenim značenjem, i smatraće se da se odnosi na identifikovan ili definisan konzervativni strukturni entitet unutar proteina, koji pokazuje karakterističan sadržaj sekundarne strukture. U mnogim slučajevima, homologni domeni sa zajedničkim funkcijama obično pokazuju sličnosti sekvenci i mogu se naći u brojnim disparatnim proteinima (npr. EGF-nalik domeni su navodno pronađeni u najmanje 471 različitih proteina). Slično tome, izraz „motiv“, kako se prepoznaje u struci, koristiti će se u skladu sa svojim zajedničkim značenjem i generalno će se odnositi na kratko, konzervirano područje proteina koji je tipično deset do dvadeset kontinualnih aminokiselinskih ostataka. Kao što je razmatrano, odabrani slučajevi obuhvataju modulatore koji se povezuju sa, ili se vezuju za epitop unutar specifičnih regiona, domena ili motiva DLL3.
[0161] U svakom slučaju kada se odredi željeni epitop na antigenu, moguće je generisati antitela za taj epitop, npr. imunizacijom sa peptidom koji sadrži epitop koristeći tehnike opisane u ovom obelodanjenju. Alternativno, tokom procesa otkrivanja, generisanje i karakterizacija antitela mogu da razjasne informacije o poželjnim epitopima lociranim u specifičnim domenima ili motivima. Iz ovih informacija, tada je moguće da se kompetitivno ispitaju antitela za vezivanje za isti epitop. Pristup za postizanje ovog cilja je da se sprovedu studije nadmetanja kako bi se pronašla antitela koja se kompetitivno vezuju jedno za drugo, tj. antitela se nadmeću za vezivanje za antigen. Proces visoke propusnosti za binovanje antitela zasnovan na njihovom unakrsnom nadmetanju opisan je u WO 03/48731. Drugi postupci binovanja ili mapiranja na nivou domena ili epitopa koji obuhvataju modulatorsko nadmetanje ili eksprimiranje fragmenta antigena na kvascu prikazani su u primerima koji slede.
[0162] Kako se ovde koristi, izraz „binovanje“ se odnosi na postupke korišćene za grupisanje ili klasifikaciju antitela na osnovu njihovih karakteristika vezivanja antigena i nadmetanja. Dok su tehnike korisne za definisanje i kategorizaciju modulatora predmetnog obelodanjenja, korpice ne koreliraju uvek direktno sa epitopima, i takva početna određivanja vezivanja epitopa mogu se dalje prečistiti i potvrditi pomoću druge metodologije koja je priznata u struci, kao što je ovde opisano. Međutim, kao što je razmatrano i prikazano u primerima u nastavku, empirijsko dodeljivanje modulatora antitela na pojedinačne korpice pruža informacije koje mogu biti indikativne za terapeutski potencijal obelodanjenih modulatora.
[0163] Specifičnije, može se odrediti da li se odabrano referentno antitelo (ili njegov fragment) vezuje za isti epitop ili se unakrsno nadmeće za vezivanje sa drugim test antitelom (tj., nalazi se u istoj korpici) pomoću postupaka poznatih u struci i datih u Primerima. U jednom slučaju, referentni modulator antitela je povezan sa DLL3 antigenom u uslovima zasićenja, i tada je sposobnost sekundarnog ili test modulatora antitela da se vezuje za DLL3 određena korišćenjem standardnih imunohemijskih tehnika. Ako je test antitelo sposobno da se značajno veže za DLL3 istovremeno sa referentnim anti-DLL3 antitelom, onda se sekundarno ili test antitelo vezuje za različiti epitop od primarnog ili referentnog antitela. Međutim, ako test antitelo nije u stanju da se u velikoj meri istovremeno vezuje za DLL3, onda se test antitelo vezuje za isti epitop, epitop koji se preklapa, ili epitop koji je u neposrednoj blizini (barem sterički) epitopa vezanog primarnim antitelom. To jest, test antitelo se nadmeće za vezivanje antigena i nalazi se u istoj korpici kao i referentno antitelo.
[0164] Izraz „nadmetanje“ ili „kompetitivno antitelo“ kada se koristi u kontekstu opisanih modulatora označava nadmetanje između antitela, kako je određeno ispitivanjem u kom test antitelo ili imunološki funkcionalni fragment koji se testira sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen. Tipično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena (npr., DLL3 ili njegov domen ili fragment) vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od njih, neoznačeni test imunoglobulin i označeni referentni imunoglobulin. Kompetetivna inhibicija se meri određivanjem količine oznake koja je vezana za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test imunoglobulina. Obično je test imunoglobulin prisutan u višku i/ili mu je dopušteno da se prvi veže. Antitela identifikovana testom nadmetanja (kompetitivna antitela) obuhvataju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo, i antitela koja se vezuju za susedni epitop dovoljno proksimalan epitopu koji je vezan referentnim antitelom za steričku prepreku. Dodatni detalji u vezi sa postupcima za određivanje kompetitivnog vezivanja su ovde dati u Primerima. Obično, kada je kompetitivno antitelo prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 97% ili više.
[0165] Nasuprot tome, kada je referentno antitelo vezano, poželjno će inhibirati vezivanje naknadno dodatog test antitela (tj. DLL3 modulator) za najmanje 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekom slučaju, vezivanje test antitela je inhibirano najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 97% ili više.
[0166] U pogledu predmetnog pronalaska, i kako je izloženo u dole navedenim primerima, određeno je (preko površinske plazmonske rezonance ili bio-slojne interferometrije) da ekstracelularni domen DLL3 definiše najmanje devet komora pomoću kompetitivnog vezivanja ovde nazvanog „korpica A“ do „korpice I“. Imajući u vidu rezoluciju pruženu tehnikama binovanja modulatora, veruje se da ovih devet korpica čine većinu korpica koje su prisutne u ekstracelularnom regionu DLL3 proteina.
[0167] U tom smislu, i kao što je poznato u struci i detaljno opisano u dole navedenim primerima, željeni podaci o binovanju ili kompetitivnom vezivanju mogu se dobiti korišćenjem čvrste faze direktnog ili indirektnog radioimunotesta(RIA), direktnog ili indirektnog enzimske imunotesta (EIA ili ELISA), sendvič test nadmetanja, Biacore™ 2000 sistema (tj. površinska plazmonska rezonanca - GE Healthcare), ForteBio® Analyzer-a (tj. biološka interferometrija - ForteBio, Inc.) ili metodologije protočne citometrije. Izraz „površinska plazmonska rezonanca“, kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu specifičnih interakcija u realnom vremenu detektovanjem promena koncentracija proteina u biosenzorskoj matrici. Izraz „interferometrija bio-sloja“ se odnosi na optičku analitičku tehniku koja analizira obrazac interferencije bele svetlosti reflektovane sa dve površine: sloj imobilizovanog proteina na vrhu biosenzora i unutrašnji referentni sloj. Svaka promena u broju molekula vezanih za biosenzorski vrh izaziva promenu u obrascu interferencije koji se može meriti u realnom vremenu. U posebno poželjnim primerima, analiza (bilo da je površinska plazmonska rezonanca, bio-slojna interferometrija ili protočna citometrija) je izvedena upotrebom Biacore ili ForteBio instrumenta ili protočnog citometra (npr. FACSAria II), kao što je prikazano u primerima u nastavku.
[0168] Kako bi se dalje opisali epitopi sa kojima se obelodanjeni modulatori DLL3 antitela povezuju ili za koje se vezuju, mapiranje epitopa na nivou domena je izvedeno korišćenjem modifikacije protokola opisanog u Cochran i dr. (J Immunol Methods.287 (1-2):147-158 (2004)). Ukratko, pojedinačni domeni
DLL3 koji sadrži specifične aminokiselinske sekvence su eksprimirani na površini kvasca, i vezivanje pomoću svakog DLL3 antitela je određeno protočnom citometrijom. Rezultati su razmatrani u nastavku u Primeru 6 i prikazani na Slici 4.
[0169] Druge kompatibilne tehnike mapiranja epitopa uključuju mutante alanin skeniranja, peptidne mrlje (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), ili analizu peptidnog razdvajanja. Pored toga, mogu se primeniti postupci kao što je izrezivanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). U drugim otelotvorenjima, modifikovanje uz pomoć profilisanja (MAP), takođe poznato kao antigensko profilisanje na bazi antigenske strukture (ASAP), pruža postupak koji kategoriše veliki broj monoklonskih antitela (mAb) usmerenih protiv istog antigena u skladu sa sličnostima vezujućeg profila svakog antitela na hemijski ili enzimatski modifikovanoj površini antigena (U.S.P.N.2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop, koji se jasno razlikuje od epitopa ili druge kategorije. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih antitela, tako da se karakterizacija može fokusirati na genetski različita antitela. Razumeće se da se MAP može koristiti za sortiranje modulatora hDLL3 antitela obelodanjenja u grupe antitela koje vezuju različite epitope.
[0170] Agensi koji su korisni za promenu strukture imobilizovanog antigena uključuju enzime kao što su proteolitički enzimi (npr., tripsin, endoproteinaza Glu-C, endoproteinaza Asp-N, himotripsin, itd.). Agensi koji su korisni za promenu strukture imobilizovanog antigena mogu takođe biti hemijski agensi, kao što su sukcinimidil estri i njihovi derivati, jedinjenja koja sadrže primarne amine, hidrazine i ugljene hidrazine, slobodne aminokiseline, itd.
[0171] Protein antigena može biti imobilizovan na površinama biosenzora ili polistirenskih kuglica. Ovo poslednje može da se obradi, na primer, sa testom kao što je multipleks LUMINEX™ detekcioni test (Luminex Corp.). Zbog kapaciteta LUMINEX-a da rukuje multipleks analizom sa do 100 različitih tipova zrna, LUMINEX pruža gotovo neograničene površine antigena sa različitim modifikacijama, rezultujući poboljšanom rezolucijom u profiliranju epitopa antitela u odnosu na biosenzorski test.
e. Afinitet vezivanja
[0172] Pored specifičnosti epitopa, opisana antitela se mogu okarakterisati korišćenjem fizičkih karakteristika kao što su, na primer, afiniteti vezivanja. U ovom pogledu, predmetno obelodanjenje dalje obuhvata upotrebu antitela koja imaju visok afinitet vezivanja za jedan ili više DLL3 izoform ili, u slučaju pan-antitela, više od jednog člana DLL porodice. Kako se ovde koristi, izraz „visoki afinitet“ za IgG antitelo se odnosi na antitelo koje ima KDod 10-8 M ili manje, poželjnije 10<-9>M ili manje, i još poželjnije 10<-10>M ili manje za ciljani antigen. Međutim, vezivanje „visokog afiniteta“ može varirati za druge izotipove antitela. Na primer, vezivanje „visokog afiniteta“ za izotip IgM se odnosi na antitelo koje ima KDod 10-7 M ili manje, poželjnije 10<-8>M ili manje, još poželjnije 10<-9>M ili manje.
[0173] Izraz „KD“, kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena. Za antitelo iz opisa se kaže da imunospecifično vezuje svoj ciljani antigen kada je konstanta disocijacije K -7
D(koff/kon) ≤ 10 M. Antitelo specifično vezuje antigen sa visokim afinitetom kada je KD≤ 5x10-9M, i sa veoma visokim afinitetom kada je KD≤ 5x10-10M. U jednom aspektu pronalaska, antitelo ima KDod ≤ 10-9M i off-rate od oko 1x10-4/sekunda. U jednom otelotvorenju pronalaska, off-rate je 1x10-5/sekunda. U drugim otelotvorenjima pronalaska, antitela će se vezati za DLL3 sa KDod oko 10-7M i 10<-10>M, i u još jednom otelotvorenju će se vezati sa K 0
D≤ 2x10-1 M. Još neki odabrani primeri iz predmetnog pronalaska obuhvataju antitela koja imaju konstantu disasocijacije ili KD(koff/kon) manju od 10-2M, manju od 5x10-2M, manju od 10-3M, manju od 5x10-3M, manju od 10-4M, manju od 5x10-4M, manju od 10-5M, manju od 5x10-5M, manju od 10-6M, manju od 5x10-6M, manju od 10-7M, manju od 5x10-7M, manju od 10-8M, manju od 5x10-8M, manju od 10-9M, manju od 5x10-9M, manju od 10-10M, manju od 5x10-10M, manju od 10-11M, manju od 5x10-11M, manju od 10-12M, manju od 5x10-12M, manju od 10-13M, manju od 5x10- 13M, manju od 10-14M, manju od 5x10-14M, manju od 10-15M ili manju od 5x10-15M.
[0174] U određenim slučajevima, antitelo obelodanjenja koje se imunospecifično vezuje za DLL3 ima konstantu stope asocijacije ili kon(ili ka) stopa (DLL3 (Ab) antigen
(Ag)k -1
on←Ab-Ag) od barem 105M-1s-1 , barem 2x105M s-1 , barem 5x105M-1s-1 , barem 106M-1s-1 , barem 5x106M-1s-1 , barem 107M-1s-1 , barem 5x107M-1s-1 , ili barem 108M-1s-1.
[0175] U drugom slučaju, antitelo obelodanjenja koje se imunospecifično vezuje za DLL3 ima konstantu stope disasocijacije ili koff(ili kd) stopa (DLL3 (Ab) antigen (Ag)koff←Ab-Ag) manju od 10-1s-1 , manju od 5x10-1s-1 , manju od 10-2s-1 , manju od 5x10-2s-1 , manju od 10-3s-1 , manju od 5x10-3s-1 , manju od 10-4s-1 , manju od 5x10-4s-1 , manju od 10-5s-1 , manju od 5x10-5s-1 , manju od 10-6s-1 , manju od 5x10-6s-1 manju od 10-7s-1 , manju od 5x10-7s-1 , manju od 10-8s-1 , manju od 5x10-8s-1 , manju od 10-9s-1 , manju od 5x10-9s-1 ili manju od 10-10s-1.
[0176] U drugim izabranim otelotvorenjima predmetnog pronalaska anti-DLL3 antitela će imati konstantu afiniteta ili Ka(k 2
on/koff) od barem 10 M-1 , barem 5x102M-1 , barem 103M- 1 , barem 5x103M-1 , barem 104M-1 , barem 5x104M-1 , barem 105M-1 , barem 5x105M-1 , barem 106M-1 , barem 5x106M-1 , barem 107M-1 , barem 5x107M-1 , barem 108M-1 , barem 5x108M-1 , barem 109M-1 , barem 5x109M-1 , barem 1010M-1 , barem 5x1010M-1 , barem 1011M-1 , barem 5x1011M-1 , barem 1012M-1 , barem 5x1012M-1 , barem 1013M-1 , barem 5x1013M-1 , barem 1014M-1 , barem 5x1014M-1 , barem 1015M-1 ili barem 5x1015M-1.
[0177] Pored gore pomenutih karakteristika modulatora, antitela iz predmetnog pronalaska mogu dalje da se karakterišu korišćenjem dodatnih fizičkih karakteristika uključujući, na primer, termičku stabilnost (tj. temperaturu topljenja; Tm) i izoelektrične tačke. (Pogledati, npr. Bjellqvist i dr., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer i dr., 2000, Biophys. J.78:394404; Vermeer i dr., 2000, Biophys. J.79: 2150-2154).
V. Konjugati antitela i veznika i lek-veznik delovi
[0178] Podrazumeva se da DLL3 konjugati predmetnog pronalaska sadrže DLL3 agens za vezivanje ćelija, kovalentno vezan preko veznik grupe sa sadržajem PBD leka. Kao što je ovde razmatrano, DLL3 konjugati predmetnog pronalaska se mogu koristiti da pruže bilo koji od PBD 1, PBD 2, PBD 3, PBD 4 ili PBD 5 na ciljanom mestu (npr., tumorogene ćelije). Ovo se povoljno postiže opisanim ADC koji usmeravaju vezani sadržaj leka na ciljano mesto u relativno nereaktivnom, ne-toksičnom stanju, pre oslobađanja i aktiviranja sadržaja leka. Ovo ciljano oslobađanje toksičnog sadržaja je u velikoj meri postignuto preko veznika koji su inkorporirani u lek-veznik jedinjenja DL 1 - 5 koja su proizvedena tako da se ne mogu razdvojiti, i oslobađaju citotoksični dimerni PBD dok ADC ne dostigne tumorogenu ćeliju. Ovo povoljno pruža relativno visoke nivoe aktivnog PBD leka na mestu tumora, uz minimizovanje izloženosti neciljanih ćelija i tkiva.
1. Veznik jedinjenje
[0179] Preciznije, veznici inkorporirani u opisane ADC su poželjno stabilni ekstracelularno, sprečavaju agregaciju ADC molekula i održavaju ADC slobodno rastvorljivim u vodenom medijumu i u monomernom stanju. Pre transporta ili isporuke u ćeliju, konjugat antitela i leka (ADC) je poželjno stabilan i ostaje netaknut, tj. antitelo ostaje povezano sa delom leka. Dok su veznici stabilni izvan ciljane ćelije, dizajnirani su da se razdvoje pri nekoj efikasnoj stopi unutar ćelije. Prema tome, efektivni veznik će: (i) održavati specifična svojstva vezivanja antitela; (ii) omogućiti intracelularne isporuke konjugata ili dela leka; (iii) ostati stabilan i netaknut, tj. ne razdvaja se, sve dok konjugat nije isporučen ili transportovan na svoje ciljano mesto; i (iv) održava citotoksični efekat koji ubija ćelije ili citostatički efekat PBD leka. Stabilnost ADC može se meriti standardnim analitičkim tehnikama kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika razdvajanja/analize LC/MS. Kovalentno vezivanje antitela i delova leka zahteva da veznik ima dve reaktivne funkcionalne grupe, tj. vivalenciju u reaktivnom smislu. Poznati su bivalentni vezujući reagensi koji su korisni za vezivanje dva ili više funkcionalna ili biološki aktivna ostatka, kao što su peptidi, nukleinske kiseline, lekovi, toksini, antitela, hapteni i reporterske grupe, i postupci su opisane kao njihovi rezultujući konjugati (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242).
[0180] U tu svrhu DLL3 ADC predmetnog pronalaska sadrže veznike koji se mogu cepati agensom za razdvajanje koji je prisutan u intracelularnom okruženju (npr., unutar lizozoma ili endozoma ili kaveole). U slučaju ADC 1-5, veznik sadrži peptidilni veznik koji se razdvaja intracelularnom peptidazom ili enzimom proteaze, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lizosomalnu ili endosomalnu proteazu. U nekim otelotvorenjima, veznik koji se može razdvoji veznik je poželjno dug najmanje dve aminokiseline, ili u drugim varijantama najmanje tri aminokiseline. Agensi za razdvajanje mogu uključivati katepsine B i D i plazmin, od kojih je za svaki poznato da hidrolizuje derivate dipeptidnih lekova, što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka unutar ciljanih ćelija. U opisanim lek-veznik delovima DL1-DL5, veznik koji se može razdvoji veznik koji se može razdvojiti intracelularnom proteazom je valin-alanin dipeptidna grupa. Jedna prednost korišćenja intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog agensa je u tome što je agens tipično atenuiran kada je konjugovano, i serumske stabilnosti konjugata su obično visoke.
[0181] Pored dipeptidne jedinice koja se može razdvojiti enzimom, opisani veznici koji se nalaze u ADC 1 - 5 (ili DLl - DL5) svi uključuju spejser jedinicu, vezujući deo da poveže lek-veznik sa agensom za vezivanje ćelija i, bar u slučaju DL4 i DL5, samo-imolativna grupa koja pruža čisto rastavljanje PBD leka nakon razdvajanja veznika. Što se tiče samoimolativne grupe, i DL4 i DL5 sadrže istu grupu. U tu svrhu samo-imolativni veznik i dipeptid zajedno formiraju grupu -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, koja je ilustrovana u nastavku:
gde zvezdica označava tačku vezivanja za izabrani PBD citotoksični deo, i talasasta linija označava tačku vezivanja za preostali deo veznika (npr., segmenti za vezivanje antitela) koji mogu biti konjugovani sa antitelom. Posle enzimskog razdvajanja dipeptida, samo-imolativni veznik će omogućiti čisto oslobađanje zaštićenog jedinjenja (tj., toksični PBD dimer) kada se aktivira udaljeno mesto, postupajući duž linija prikazanih ispod:
gde je L * aktivirani oblik preostalog dela veznika koji sadrži sada razdvojenu peptidilnu jedinicu. Čisto oslobađanje PBD 4 i PBD 5 osigurava da će zadržati željenu toksičnu aktivnost.
[0182] Kao što će se detaljnije diskutovati u nastavku i biti dato u Primeru 7, veznici za lekove iz predmetnog pronalaska će biti povezani sa reaktivnim tiol nukleofilima. Antitela mogu biti reaktivna za konjugaciju sa veznik reagensima tretiranjem sa redukcionim agensom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će tako, teoretski, formirati dva reaktivna tiol nukleofila. U.S.P.N.7,521,541 govori o proizvodnji antitela uvođenjem reaktivnih cistein aminokiselina.
[0183] U DL1, DL2, DL3 i DL5 veza između agensa za vezivanje ćelija i lek-veznika dela je preko tiolnog ostatka agensa za vezivanje ćelija i terminalne maleimidne grupe prisutne na vezniku. U takvim slučajevima, veza između agensa za vezivanje ćelija i lek-veznika je:
gde zvezdica označava tačku vezivanja za preostali deo lek-veznika, i talasasta linija označava tačku vezivanja za preostali deo agensa za vezivanje ćelija. U ovom slučaju, S atom je tipično izveden iz DLL3 antitela.
[0184] Što se tiče DL4, vezujući deo sadrži terminalni jodoacetamid koji može da reaguje sa aktiviranim tiolima kako bi se dobio željeni ADC 4. Kao što je izloženo u Primeru 7 u nastavku, poželjna procedura konjugacije za DL4 je malo drugačija od poželjne procedure konjugacije za maleimid vezujuću grupu kakva je u drugim slučajevima. U svakom slučaju, stručnjak može lako da konjuguje svako od obelodanjenih lek-veznik jedinjenja sa kompatabilnim DLL3 modulatorom u smislu predmetnog obelodanjenja.
2. PBD jedinjenja
[0185] Kao što je razmotreno iznad i predstavljeno u primerima u nastavku, svako od obelodanjenih PBD jedinjenja (prikazano neposredno u nastavku) pokazuje citotoksična svojstva koja ga čine potencijalnim kandidatom koji se može ugraditi u ADC predmetnog obelodanjenja. Sinteza svakog od PBD 1 - 5 kao komponenta svakog od DL 1 - 5 je detaljno predstavljena u Primeru 1 u nastavku. U pogledu predmetnog obelodanjenja, toksična jedinjenja koja sadrže korisne osobine ADC predmetnog pronalaska mogu se lako generisati i upotrebiti kao što je ovde izloženo. PBD jedinjenja koja se oslobađaju iz ADC 1 - 5 nakon odvajanja veznika su prikazana neposredno u nastavku:
[0186] Isporuka i oslobađanje takvih jedinjenja na mestu tumora može se pokazati klinički delotvornim u tretmanu ili upravljanju proliferativnih poremećaja u skladu sa predmetnim obelodanjenjem. Što se tiče jedinjenja, biće jasno da svaka od obelodanjenih PBD ima dva sp2 centra u svakom C-prstenu, što može omogućiti jače vezivanje u malom žlebu DNK (a time i veću toksičnost), nego za jedinjenja sa samo jednim sp<2>centrom u svakom C-prstenu. Prema tome, kada se koriste u DLL3 ADC, kao što je ovde izloženo, obelodanjeni PBD mogu se pokazati kao posebno efikasni za tretman proliferativnih poremećaja.
3. Lek-veznik delovi
[0187] U skladu sa ovde opisanim, obelodanjeni PBD će biti kombinovani sa veznicima kao što je navedeno iznad kako bi se dobila lek-veznika jedinjenja, DLl-DL5, kao što je prikazano neposredno u nastavku. Detaljni protokoli za sintezu svakog od opisanih lek-veznika prikazani su u Primeru 1 u nastavku.
[0188] Što se tiče leka-veznika DL 1 - 5, biće jasno da svaki od DL1, DL2, DL3 i DL5 sadrži terminalnu maleimidnu grupu koja se može koristiti za konjugaciju jedinjenja sa odabranim DLL3 antitelima. Obrnuto, DL4 sadrži terminalnu jodoacetamidnu grupu koja se koristi za konjugaciju PDB isporuke sa ciljanim antitelom. Može biti da će, pod određenim uslovima, upotreba jodoacetamidne grupe izbeći određene neželjene sporedne reakcije i pružiti poboljšanu stabilnost ADC. Štaviše, biće jasno da DL 4 i DL 5 sadrže PBD koji su vezani za DLL3 modulator kroz N10 položaj na B prstenu, dok su DL1, DL2 i DL3 povezani sa odabranim antitelom preko C2 položaja na C prstenu. Što se tiče jedinjenja koja se povezuju preko N10 položaja, dalje će se napomenuti da veznici sadrže PABC samo-imolativni deo kako bi se pružilo čisto odvajanje sadržaja. Imajući u vidu trenutna razmatranja, stručnjak u ovoj oblasti lako može da odredi koji DL (i povezani ADC) će se pokazati efikasnim za tretman odabranih proliferativnih poremećaja.
4. Karakteristike jedinjenja
[0189] Sledeći primeri i varijacije prikazani neposredno u nastavku su primenljivi na opisane ADC, veznike leka i/ili PBD, i izričito se razmatraju kao da su unutar obima predmetnog obelodanjenja.
a. Solvati
[0190] Može biti pogodno ili poželjno da se pripremi, prečisti i/ili obradi odgovarajući solvat veznika leka, ADC ili PBD. Izraz „solvat“ se ovde koristi u konvencionalnom smislu, i odnosi se na kompleks supstance koja se rastvara (npr. aktivno jedinjenje, so aktivnog jedinjenja) i rastvarača. Ako je rastvarač voda, solvat se može pogodno označiti kao hidrat, na primer, monohidrat, dihidrat, trihidrat, itd.
[0191] Obelodanjenje obuhvata jedinjenja gde se rastvarač dodaje preko iminske veze PBD dela, što je ilustrovano u nastavku, gde je rastvarač voda ili alkohol (R<A>OH, gde R<A>je C1-4alkil):
[0192] Ovi oblici se mogu nazvati karbinolamin i karbinolamin etar oblici PBD (kao što je opisano u odeljku koji se odnosi na R10 iznad). Balans ovih ravnoteža zavisi od uslova u kojima se nalaze jedinjenja, kao i od prirode samog dela.
b. Izomeri
[0193] Određena jedinjenja iz obelodanjenja mogu postojati u jednom ili više specifičnih geometrijskih, optičkih, enantiomernih, dikastereomernih, epimernih, atropnih, stereoizomernih, tautomernih, konformacionih ili anomernih oblika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, cis- i trans-oblike; E- i Z-oblike; c-, t, i r-oblike; endo- i egzo-oblike; R-, S- i mezo-oblike; D- i L-oblike; d- i 1-oblike; (+) i (-) oblike; keto-, enol- i enolat-oblike; sin- i anti-oblike; sinklinalne i antiklinalne oblike; α- i β-oblike; aksijalne i ekvatorijalni oblici; brod- , stolica-, zavrtanj-, omotač- i polustolica-oblike; i njihove kombinacije, u daljem tekstu zajedno označene kao „izomeri“ (ili „izomerni oblici“) .
[0194] Izraz „hiralni“ odnosi se na molekule koji imaju svojstvo da se ne mogu preklopiti sa partnerom koji je odraz u ogledalu, dok se izraz „ahiralni“ odnosi na molekule koji se mogu preklopiti sa partnerom koji je odraz u ogledalu.
[0195] Izraz „stereoizomeri“ se odnosi na jedinjenja koja imaju identičnu hemijsku strukturu, ali se razlikuju u odnosu na raspored atoma ili grupa u prostoru.
[0196] „Dijastereomer“ se odnosi na stereoizomer sa dva ili više hiralnih centara, i čiji molekuli nisu odrazi u ogledalu jednih drugima. Dijastereomeri imaju različite fizičke osobine, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva i reaktivnost. Smeše dijastereomera mogu da se razdvoje pod analitičkim postupcima visoke rezolucije, kao što su elektroforeza i hromatografija.
[0197] „Enantiomeri“ se odnose na dva stereoizomera jedinjenja koja su odrazi u ogledalu koji se ne mogu preklopiti.
[0198] Stereohemijske definicije i konvencije koje se ovde koriste uglavnom prate S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Jedinjenja iz opisa mogu da sadrže asimetrične ili hiralne centre, i stoga postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Namera je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja prema pronalasku, uključujući, ali ne ograničavajući se na, dijastereomere, enantiomere i atropizomere, kao i njihove smeše kao što su racemske smeše, čine deo predmetnog obelodanjenja. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj. imaju sposobnost da rotiraju ravan polarizovane svetlosti. U opisivanju optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula oko njegovog hiralnog centra. Prefiksi d i 1 ili (+) i (-) se koriste za označavanje znaka rotacije ravnog polarizovanog svetla od strane jedinjenja, gde (-) ili 1 znači da je jedinjenje levo-rotatorno. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je desno-rotatorno. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični, osim što su odrazi u ogledalu jedan drugom. Specifični stereoizomer se takođe može označavati kao enantiomer, i smeša takvih izomera se često naziva enantiomerna smeša.50:50 smeša enantiomera se naziva racemska smeša ili racemat, i može se pojaviti tamo gde nije bilo stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Izrazi „racemska smeša“ i „racemat“ odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste, lišene optičke aktivnosti.
[0199] Treba primetiti da su, osim kako je razmatrano u daljem tekstu za tautomerne oblike, specifično isključene iz izraza „izomeri“, kako se ovde koriste, strukturni (ili konstitucionalni) izomeri (tj. izomeri koji se razlikuju u vezama između atoma, a ne samo položajem atoma u prostoru). Na primer, pozivanje na metoksi grupu, - OCH3, treba tumačiti kao pozivanje na njen strukturni izomer, hidroksimetil grupu, -CH2OH . Slično tome, pozivanje na orto-hlorofenil se ne treba tumačiti kao pozivanje na njegov strukturni izomer, meta-hlorofenil. Međutim, pozivanje na klasu struktura može uključiti strukturno izomerne oblike koji spadaju u tu klasu (npr. C1-7alkil uključuje n-propil i izo-propil; butil obuhvata n-, izo-, sek- i terc-butil; metoksifenil uključuje orto-, meta- i para-metoksifenil).
[0200] Gore navedeno isključenje se ne odnosi na tautomerne oblike, na primer, keto-, enol- i enolate-oblike, kao u, na primer, sledeće tautomerne parove: keto/enol (ilustrovano u nastaavku), imin/enamin, amid/imino alkohol, amidin/amidin, nitrozo/oksim, tioketon/enetiol, N-nitrozo/hidroksiazo i nitro/aci-nitro.
[0201] Izraz „tautomer“ ili „tautomerni oblik“ odnosi se na strukturne izomere različitih energija koje su interkonvertibilni preko barijere niske energije. Na primer, protonski tautomeri (takođe poznati kao prototropni tautomeri) uključuju interkonverzije preko migracije protona, kao što su keto-enol i imin-enamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju interkonverzije reorganizacijom nekih od vezujućih elektrona.
[0202] Treba napomenuti da su specifično uključena u izraz „izomer“ jedinjenja sa jednom ili više izotopnih supstitucija. Na primer, H može biti u bilo kojem izotopnom obliku, uključujući<1>H,<2>H (D), i<3>H (T); C može biti u bilo kojem izotopskom obliku, uključujući i 12C, 13C, and 14C; O može biti u bilo kojem izotopnom obliku, uključujući<16>O i<18>O; i slično.
[0203] Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja iz opisa uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, kao što su, ali bez ograničavanja na,<2>H (deuterijum, D), 3H (tricijum), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, i 125I. Različita izotopno označena jedinjenja iz predmetnog pronalaska, na primer ona u koja su inkorporirani radioaktivni izotopi kao što su 3H, 13C i 14C. Takva izotopno označena jedinjenja mogu biti korisna u metaboličkim studijama, kinetičkim studijama reakcija, detekcionim ili slikovnim tehnikama, kao što je tomografija emisije pozitrona (PET) ili kompjuterska tomografija sa jednom fotonskom emisijom (SPECT) uključujući testove distribucije leka ili supstrata u tkivu, ili u radioaktivnom tretmanu pacijenata. Deuterijumom označena ili supstituisana terapeutska jedinjenja iz opisa mogu imati poboljšana DMPK (metabolizam lekova i farmakokinetika) svojstva, koja se odnose na distribuciju, metabolizam i izlučivanje (ADME). Supstitucija težim izotopima, kao što je deuterijum, može da pruži određene terapeutske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećan polu-života in vivo ili smanjena potreba za doziranjem. Jedinjenje označeno sa 18F može biti korisno za PET ili SPECT studije. Izotopski označena jedinjenja iz predmetnog obelodanjenja i njihovi prolekovi mogu se generalno pripremiti sprovođenjem postupaka koji su opisani u šemama ili u primerima i preparatima koji su opisani u nastavku, zamenom lako dostupnog izotopno označenog reagensa za neizotopno označeni reagens. Dalje, supstitucija težim izotopima, naročito deuterijumom (tj., 2H ili D) može da pruži određene terapeutske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog polu-života in vivo ili smanjenih potreba za doziranjem ili poboljšanja terapijskog indeksa. Podrazumeva se da se deuterijum u ovom kontekstu smatra supstituentom.
Koncentracija takvog težeg izotopa, posebno deuterijuma, može se definisati pomoću faktora izotopskog obogaćivanja. U jedinjenjima iz predmetnog obelodanjenja, svaki atom koji nije specifično označen kao određeni izotop, treba da predstavlja bilo koji stabilan izotop tog atoma.
[0204] Ukoliko nije drugačije naznačeno, navođenje određenog jedinjenja uključuje sve takve izomerne oblike, uključujući (u potpunosti ili delimično) racemske i druge njihove smeše. Postupci za pripremu (npr. asimetrična sinteza) i odvajanje (npr. fragmentisana kristalizacija i hromatografski agensi) takvih izomernih oblika su ili poznati u struci ili se lako dobijaju prilagođavanjem ovde opisanih postupaka, ili poznatih postupaka, na poznati način.
5. Konjugati i opterećenje leka
[0205] Kao što je gore razmatrano, sledeći konjugati antitela i leka su pruženi predmetnim obelodanjenjem:
i
[0206] Jednom kada su modulatori i lek-veznici obelodanjenja generisani i/ili proizvedeni i odabrani u skladu sa ovde datim saznanjima, oni mogu biti povezani ili konjugovani da pruže obelodanjene ADC. Ovde korišćeni izrazi „konjugat“ ili „modulator konjugat“ ili „konjugat antitela“ ili „DLL3 konjugat“ ili „ADC“ ili će se koristiti naizmenično i smatrati da označavaju bilo koji od ADC 1, ADC 2, ADC 3, ADC 4 ili ADC 5. Primenjene tehnike mogu se koristiti za konjugaciju izabranog antitela i lek-veznika kako bi se dobio željeni ADC. Poželjni postupci konjugacije su prikazani u Primeru 7 u nastavku. Štaviše, variranjem uslova konjugacije kao što je poznato u struci ili selekcijom određenih konstrukata antitela, mogu se generisati ADC koji pokazuju različite stehiometrijske molarne odnose leka prema antitelima, i izričito su u okviru predmetnog pronalaska.
[0207] Opšte uzev, stručnjaci u oblasti će shvatiti da je na raspolaganju više različitih reakcija za vezivanje za, ili povezanost obelodanjenih lek-veznika sa, DLL3 vezujućim agensima. Na primer, nukleofilne grupe na antitelima uključuju, ali nisu ograničene na tiol grupe bočnog lanca, npr. cistein. Tiol grupe su nukleofilne i sposobne su da reaguju tako da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezničkim delovima kao što su oni iz predmetnog obelodanjenja. Poželjna antitela iz predmetnog pronalaska će imati redukovane međulančane disulfide, tj. cisteinske mostove koji pružaju takve nukleofilne grupe. Prema tome, u izvesnim slučajevima reakcija slobodnih sulfhidrilnih grupa modulatorskih cisteina i terminalnih maleimido ili jodoacetamidnih grupa opisanih lek-veznika će pružiti željenu konjugaciju. U takvim slučajevima antitela mogu biti reaktivna za konjugaciju sa veznik reagensima tretiranjem sa redukcionim agensom kao što je ditiotreitol (DTT) ili (tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP). Svaki cistein disulfidni most će, prema tome, formirati, teoretski, dva reaktivna tiol nukleofila. U drugim slučajevima, dodatne nukleofilne grupe mogu biti uvedene u antitela kroz reakciju lizina sa reagensima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 2-iminotiolan (Traut-ov reagens), SATA, SATP ili SAT(PEG)4, što rezultuje u konverziji amina u a tiol. Dok su takvi reagensi poželjni, biće jasno da se konjugacija opisanih lekveznika i DLL3 modulatora može izvršiti korišćenjem različitih reakcija, uslova i reagensa koji su poznati stručnjacima, i koji pružaju kovalentnu vezu nukleofilne grupe antitela ili agensa za vezivanje ćelija sa lek-veznik reagensom. Kao što je naznačeno, naročito poželjni postupci su detaljnije izloženi u Primeru 7 u nastavku.
[0208] ADC i ADC sastavi prema pronalasku mogu da sadrže delove antitela i leka u različitim stehiometrijskim molarnim odnosima, zavisno, bar delimično, od postupka koji se koristi da utiče na konjugaciju. Kako se ovde koristi, stehiometrijski molarni odnosi su definisani u izrazima „odnosi leka i antitela“, „DAR“ ili „opterećenje leka“. Drugim rečima, opterećenje leka ili DAR je ponderisani prosečan broj PBD lekova po agensu za vezivanje ćelija, npr. antitelo u sastavu. Tamo gde su PBD jedinjenja iz opisa konjugovana sa prirodnim cisteinima u IgGl, opterećenje leka može biti u opsegu od 1 do 8 lekova po agensu za vezivanje ćelija, tj. gde je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 lekovitih delova kovalentno vezano za svaki agens za vezivanje ćelija. Poželjno, DAR sastav predmetnog pronalaska će biti približno 2, 4 ili 6, i u posebno poželjnim otelotvorenjima DAR će obuhvatiti približno 2.
[0209] Specifičnije, konjugovani sastavi iz predmetnog pronalaska obuhvataju agense za vezivanje ćelija, npr. antitela, konjugovana sa nizom PBD jedinjenja, od 1 do 8 (u slučaju IgGl). Kao takvi, obelodanjeni sastavi konjugata antitela i leka obuhvataju smeše jedinjenja konjugata leka i antitela, gde je većina konstituentnih antitela kovalentno vezana za jedan ili više PBD delova leka, i gde delovi leka mogu biti vezani za antitelo na različitim aminokiselinskim ostacima. Naime, naredna konjugacija ADC sastava predmetnog pronalaska će sadržati smešu DLL3 konjugata sa različitim opterećenjima leka (npr., od 1 do 8 lekova po IgGl antitelu) u različitim koncentracijama. Koristeći uslove selektivne konjugacije i postupke prečišćavanja, konjugovani sastavi mogu biti dovedeni do tačke gde oni u velikoj meri sadrže jednu predominantnu željenu vrstu ADC (npr., sa opterećenjem leka od 2) sa relativno niskim nivoima drugih vrsta ADC (npr., sa opterećenjem leka od 1, 4, 6 itd.). Vrednost DAR predstavlja ponderisani prosek sadržaja leka za sastav kao celinu (tj. sve vrste ADC uzete zajedno). Zbog inherentne nesigurnosti u primenjenoj metodologiji kvantifikacije i poteškoća u potpunom uklanjanju ne-preovlađujućih ADC vrsta u komercijalnom okruženju, prihvatljive DAR vrednosti ili specifikacije često se prikazuju kao raspon ili distribucija (tj. DAR od 2 /- 0,5). Poželjno, sastavi koje sadrže izmereni DAR u opsegu (tj.1,5 do 2,5) bi se koristili u farmaceutskom okruženju.
[0210] Prema tome, u određenim poželjnim otelotvorenjima, predmetni pronalazak će obuhvatati sastave koje imaju DAR od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, svaki /- 0,4. U drugim poželjnim otelotvorenjima, predmetni pronalazak će obuhvatati DAR od 2, 4, 6 ili 8 /- 0,4. Konačno, u odabranim poželjnim otelotvorenjima, predmetni pronalazak će obuhvatati DAR od 2 /- 0,4. Podrazumeva se da opseg ili odstupanje može biti manje od 0,4 u određenim poželjnim otelotvorenjima. Tako, u drugim otelotvorenjima, sastavi će obuhvatati DAR od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, svaki, /- 0,3, DAR od 2, 4, 6 ili 8 /- 0,3 ili čak poželjnije DAR od 2 /-0,3. U drugim otelotvorenjima sastavi IgGl konjugata će poželjno obuhvatati sastav sa DAR od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, svaki /- 0,4 i relativno niske nivoe (tj. manje od 30%) nedominantne ADC vrste. U drugim poželjnim otelotvorenjima ADC sastav će obuhvatati DAR od 2, 4, 6 ili 8, svaki /- 0,4 sa relativno niskim nivoima (<30%) ne-dominantnih ADC vrsta. U posebno poželjnim otelotvorenjima ADC sastav će obuhvatati DAR od 2 /- 0,4 sa relativno niskim nivoima (<30%) ne-dominantnih ADC vrsta.
[0211] Distribucija lekova po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije može se karakterisati konvencionalnim agensima kao što su UV, reverzno fazna HPLC, HIC, masena spektroskopija, ELISA test i elektroforeza. Kvantitativna distribucija ADC u smislu lekova po antitelu se takođe može odrediti. Pomoću ELISA može se odrediti prosečna vrednost lekova po antitelu u određenom preparatu ADC (Hamblett i dr (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson i dr (2005) Clin. Cancer Res.11:843-852). Međutim, raspodela vrednosti leka po antitelu se ne može uočiti antitelo-antigen vezivanjem i ograničavanjem detektovanja od strane ELISA. Takođe, ELISA test za detektovanje konjugata antitela i leka ne određuje gde su delovi leka vezani za antitelo, kao što su fragmenti teškog ili lakog lanca, ili određeni aminokiselinski ostaci. U nekim slučajevima, separacija, prečišćavanje i karakterizacija homogenog ADC gde DAR sadrži određenu dobro definisanu vrednost od ADC sa drugim dozama leka može se postići pomoću agenasa kao što je HPLC sa reverznom fazom, ili elektroforeza. Takve tehnike su takođe primenljive i na druge tipove konjugata.
[0212] Kada više od jedne nukleofilne ili elektrofilne grupe antitela reaguje sa lek-veznik međuproizvodom, ili veznik reagensom praćenim reagensom dela leka, onda je rezultujući proizvod mešavina ADC jedinjenja sa distribucijom delova leka vezanih za antitelo, npr.1, 2, 3, itd. Postupci tečne hromatografije kao što su polimerna reverzna faza (PLRP) i hidrofobna interakcija (HIC) mogu razdvojiti jedinjenja u smeši vrednostima sadržaja leka. Preparati ADC sa jednom vrednošću sadržaja leka mogu biti izolovani, međutim, ovi ADC sa jednom vrednošću sadržaja mogu još uvek da sadrže heterogene smeše, jer delovi leka mogu biti vezani, preko veznika, na različitim mestima na antitelu.
[0213] Za neke konjugate antitela i leka, broj sadržaja leka može biti ograničen brojem mesta vezivanja antitela. Na primer, antitelo može imati samo jednu ili nekoliko cisteinskih tiolnih grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiolnih grupa preko kojih može biti vezan veznik. Veće opterećenje lekom, npr. > 5, može izazvati agregaciju, netopljivost, toksičnost ili gubitak propusnosti ćelija određenih konjugata antitela i leka.
[0214] Tipično, manje od teorijskog maksimuma delova leka je konjugovano sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može da sadrži, na primer, mnoge lizinske ostatke koji ne reaguju sa lek-veznik međuproizvodom ili veznik reagensom. Samo najreaktivnije lizinske grupe mogu reagovati sa reagensom za reaktivni amin. Takođe, samo najreaktivnije cistein tiol grupe mogu reagovati sa tiol-reaktivnim veznik reagensom. Generalno, antitela ne sadrže mnogo, ako uopšte, slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa delom leka. Većina ostataka cistein tiola u antitelima jedinjenja postoje kao disulfidni mostovi i moraju biti redukovani sa redukcionim agensom kao što je ditiotreitol (DTT) ili TCEP, pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima. Opterećenje (odnos lek/antitelo) ADC može se kontrolisati na nekoliko različitih načina, uključujući: (i) ograničavanje molarnog viška lek-veznik međuproizvoda ili veznik reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanje vremena reakcije konjugacije ili temperature i (iii) delimični ili ograničavajući reduktivni uslovi za modifikaciju cistein tiola.
[0215] Dalje će se razumeti da reaktivne tiol grupe mogu biti uvedene u antitelo (ili njegov fragment) inženjeringom jednog, dva, tri, četiri, ili više cisteinskih ostataka (npr., dobijanje mutantnih antitela koja sadrže jednu ili više ne-prirodnih cistein aminokiselina ostataka). To jest, cisteinske aminokiseline mogu biti konstruisane na reaktivnim mestima u antitelu, i one ne formiraju intrahainske ili intermolekularne disulfidne veze (Junutula, i dr., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Konstruisani cistein tioli mogu da reaguju sa reagensima za povezivanje ili reagensima lek-veznika iz predmetnog pronalaska koji imaju tiol-reaktivne, elektrofilne grupe kao što su maleimid ili alfa-jodni amidi da formiraju ADC sa cisteinom projektovanim antitelima i PBD lekovima. Položaj delova leka tako može biti dizajniran, kontrolisan i poznat. Opterećenje leka može da se kontroliše, jer projektovane cistein tiol grupe tipično reaguju sa visokim prinosom sa tiol-reaktivnim vezujućim reagensima ili lekveznik reagensima. Inženjering IgG antitela za uvođenje aminokiseline cisteina supstitucijom na jednom mestu na teškom ili lakom lancu daje dva nova cisteina na simetričnom antitelu. opterećenje leka u blizini 2 može se postići uz skoro homogenost proizvoda ADC konjugacije.
VI. Farmaceutski preparati i terapeutske upotrebe
1. Formulacije i putevi primene
[0216] U zavisnosti od oblika odabranog konjugata, načina predviđene isporuke, bolesti koja se tretira ili prati, i brojnih drugih promenljivih, sastavi pronalaska mogu biti formulisani kako je poželjno upotrebom tehnika priznatih u struci. U nekim otelotvorenjima, terapeutski sastavi prema pronalasku mogu biti primenjivani čisti ili sa minimalnim dodatnim komponenti, dok drugi mogu opciono biti formulisane tako da sadrže odgovarajuće farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijente i pomoćne agense koji su dobro poznati u struci (pogledati, npr. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20. izd. (2003); Ansel i dr., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. izd., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe i dr., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. izd., Pharmaceutical Press (2000)). Različiti farmaceutski prihvatljivi nosači, koji uključuju nosače, adjuvanse i razblaživače, lako su dostupni iz brojnih komercijalnih izvora. Pored toga, dostupan je i asortiman farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci, kao što su agensi za podešavanje pH i puferi, agensi za podešavanje toničnosti, stabilizatori, agensi za vlaženje i slično. Određeni neograničavajući primeri nosača uključuju fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije.
[0217] Određenije će se razumeti da, u nekim otelotvorenjima, terapeutski sastavi pronalaska mogu da se daju čisti ili sa minimalnim dodatnim komponentama. Suprotno tome, DLL3 ADC predmetnog pronalaska mogu opciono biti formulisani tako da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijente i pomoćne agense koji su dobro poznati u struci i relativno su inertne supstance koje olakšavaju primenu konjugata, ili koji pomažu obradu aktivnih jedinjenja u preparate koji su farmaceutski optimizovani za isporuku na mesto delovanja. Na primer, ekscipijent može dati oblik ili konzistenciju ili delovati kao razblaživač za poboljšanje farmakokinetike ili stabilnosti ADC. Pogodni ekscipijenti ili aditivi uključuju, ali nisu ograničeni na, stabilizujuće agense, agense za vlaženje i emulgatore, soli za različite osmolarnosti, agense za kapsuliranje, pufere i agense za poboljšanje prodiranja kože. U određenim poželjnim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi mogu biti pruženi u liofilizovanom obliku i rekonstituisane u, na primer, puferisanom fiziološkom rastvoru pre primene. Takvi rekonstituisani sastavi se poželjno primenjuju intravenozno.
[0218] Obelodanjeni ADC za sistemsku primenu mogu biti formulisani za enteralnu, parenteralnu ili topikalnu primenu. Zaista, sva tri tipa formulacije mogu se istovremeno koristiti za postizanje sistemske primene aktivnog sastojka. Ekscipijenti, kao i formulacije za parenteralnu i ne-parenteralnu isporuku leka su navedeni u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. izd. Mack Publishing (2000). Pogodne formulacije za parenteralnu primenu uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji je rastvorljiv u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja, kao što je pogodno za uljane suspenzije za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, na primer, heksilsupstituisani poli (laktid), sezamovo ulje ili estri sintetskih masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za injekcije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije i uključuju, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i/ili dekstran. Opciono, suspenzija može takođe da sadrži stabilizatore. lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsuliranje agenasa za isporuku u ćeliju.
[0219] Pogodne formulacije za enteralnu primenu uključuju tvrde ili meke želatinske kapsule, pilule, tablete, uključujući obložene tablete, eliksire, suspenzije, sirupe ili inhalacije i njihove oblike sa kontrolisanim oslobađanjem.
[0220] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu (npr., injekcijom), uključuju vodene ili nevodene, izotonične, sterilne tečnosti bez pirogena (npr. rastvore, suspenzije), u kojima je aktivni sastojak rastvoren, suspendovan ili na drugi način pružen (npr. u lipozomu ili drugim mikročesticama). Takve tečnosti mogu dodatno da sadrže druge farmaceutski prihvatljive sastojke, kao što su antioksidansi, puferi, konzervansi, stabilizatori, bakteriostati, agensi za suspendovanje, agensi za zgušnjavanje i rastvore koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju (ili drugim odgovarajućim telesnim fluidom) predviđenog primaoca. Primeri ekscipijenata uključuju, na primer, vodu, alkohole, poliole, glicerol, biljna ulja i slično. Primeri pogodnih izotoničnih nosača za upotrebu u takvim formulacijama uključuju injekciju natrijum hlorida, Ringer-ov rastvor ili injekciju Ringer-ov laktatni rastvor.
[0221] Kompatibilne formulacije za parenteralnu primenu (npr., intravenska injekcija) će sadržati ADC koncentracije od oko 10 µg/ml do oko 100 mg/ml. U određenim odabranim otelotvorenjima ADC koncentracije će sadržati 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300, µg/ml, 400 µg/ml, 500 µg/ml, 600 µg/ml, 700 µg/ml, 800 µg/ml, 900 µg/ml ili 1 mg/ml. U drugim poželjnim otelotvorenjima ADC koncentracije će sadržati 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 12 mg/ml, 14 mg/ml, 16 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml ili 100 mg/ml.
[0222] Uopšteno, jedinjenja i sastavi obelodanjenja, koji sadrže DLL3 ADC, mogu biti primenjivani in vivo, pacijentu kom je to potrebno, različitim putevima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, intravenski, intra-arterijski, subkutani, parenteralni, intranazalni, intramuskularni, intrakranijalni, intrakardijski, intraventrikularni, intratrahealni, bukalni, rektalni, intraperitonealni, intradermalni, lokalni, transdermalni, i intratekalni, ili na drugi način primene implantacijom ili inhalacijom. Predmetni sastavi mogu biti formulisani u preparate u čvrstim, polučvrstim, tečnim ili gasovitim oblicima; uključujući, ali ne ograničavajući se na, tablete, kapsule, praškove, granule, masti, rastvore, supozitorijume, klistere, injekcije, inhalante i aerosole. Odgovarajuća formulacija i put primene mogu biti izabrani u skladu sa predviđenom primenom i terapijskim režimom. U posebno poželjnim otelotvorenjima, jedinjenja predmetnog obelodanjenja biće dostavljena intravenozno.
2. Doziranje
[0223] Slično tome, određeni režim doziranja, tj., doza, vreme i ponavljanje, zavisiće od konkretnog pojedinca i njegove medicinske istorije, kao i od empirijskih razmatranja kao što su farmakokinetika (npr. polu-život, brzina klirensa, itd.). Učestalost primene može se odrediti i prilagoditi tokom terapije, i zasniva se na smanjenju broja proliferativnih ili tumorogenih ćelija, održavanju redukcije takvih neoplastičnih ćelija, smanjenju proliferacije neoplastičnih ćelija ili odlaganju razvoja metastaza. U drugim otelotvorenjima primenjena doza može biti podešena ili oslabljena kako bi se upravljalo potencijalnim sporednim efektima i/ili toksičnošću. Alternativno, mogu biti prikladne formulacije sa kontinuiranim oslobađanjem predmetnog terapeutskog sastava.
[0224] Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da odgovarajuće doze konjugatnog jedinjenja i sastava koji sadrže konjugatno jedinjenje mogu varirati od pacijenta do pacijenta.
Određivanje optimalne doze će generalno uključivati balansiranje nivoa terapeutske koristi protiv bilo kog rizika ili štetnih sporednih efekata. Izabrani nivo doze će zavisiti od različitih faktora uključujući, ali ne ograničavajući se na, aktivnost određenog jedinjenja, put primene, vreme primene, brzinu izlučivanja jedinjenja, trajanje tretmana, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji, težinu stanja i vrstu, pol, starost, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta. Količina jedinjenja i put primene će na kraju biti na diskreciji lekara, veterinara ili kliničara, iako će generalno doza biti odabrana kako bi se postigle lokalne koncentracije na mestu delovanja koje postižu željeni efekat bez izazivanja značajne štetnosti ili štetne posledice.
[0225] Generalno, ADC prema pronalasku mogu biti primenjivani u različitim rasponima. Oni obuhvataju oko 5 µg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine po dozi; oko 50 µg/kg telesne težine do oko 5 mg/kg telesne težine po dozi; oko 100 µg/kg telesne težine do oko 10 mg/kg telesne težine po dozi. Drugi reagensi obuhvataju oko 100 µg/kg telesne težine do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi i oko 0,5 mg/kg telesne težine do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi. U određenim otelotvorenjima, doza je barem oko 100 µg/kg telesne težine, barem oko 250 µg/kg telesne težine, barem oko 750 µg/kg telesne težine, barem oko 3 mg/kg telesne težine, barem oko 5 mg/kg telesne težine, barem oko 10 mg/kg telesne težine..
[0226] U odabranim otelotvorenjima, ADC će se primenjivati (poželjno intravenozno) pri približno 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 µg/kg telesne težine po dozi. Druga otelotvorenja će obuhvatiti primenu ADC na oko 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ili 2000 µg/kg telesne težine po dozi. U drugim poželjnim primerima, opisani konjugati će biti primenjivani pri 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,58, 9 ili 10 mg/kg. U još nekim drugim otelotvorenjima, konjugati mogu biti primenjivani pri 12, 14, 16, 18 ili 20 mg/kg telesne težine po dozi. U još nekim drugim otelotvorenjima, konjugati se mogu primenjivati pri 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 ili 100 mg/kg telesne težine po dozi. U ovim razmatranjima, stručnjak može lako da odredi odgovarajuće doze za različite ADC na osnovu predkliničkih studija na životinjama, kliničkih opservacija i standardnih medicinskih i biohemijskih tehnika i merenja. U posebno poželjnim otelotvorenjima, takve doze DLL3 konjugata će se davati intravenozno tokom vremenskog perioda. Štaviše, takve doze se mogu primenjivati više puta tokom definisanog tretmana.
[0227] Drugi režimi doziranja mogu biti zasnovani na proračunu telesne površine (BSA) kao što je prikazano u U.S.P.N.7,744,877. Kao što je dobro poznato, BSA se izračunava korišćenjem pacijentove visine i težine i pruža meru veličine pacijenta predstavljene površinom njegovog ili njenog tela. U nekim otelotvorenjima, konjugati se mogu primenjivati pri dozama od 1 mg/m2 to 800 mg/m2 , od 50 mg/m2 to 500 mg/m2 i pri dozama od 100 mg/m2 , 150 mg/m2 , 200 mg/m2 , 250 mg/m2 , 300 mg/m2 , 350 mg/m2 , 400 mg/m2 ili 450 mg/m2. Takođe će biti razumljivo da se tehnike iz struke i empirijske tehnike mogu primeniti za određivanje odgovarajuće doze.
[0228] U svakom slučaju, DLL3 ADC se poželjno primenjuju po potrebi pacijentima kojima je to potrebno. Određivanje učestalosti primene mogu izvršiti stručnjaci iz date struke, kao što je lekar koji tretira na osnovu razmatranja stanja koje se tretira, starost pacijenta koji se tretira, težine stanja koje se tretira, opšteg zdravstvenog stanja pacijent koji se tretira i slično. Generalno, efektivna doza DLL3 konjugata se daje pacijentu jednom ili više puta. Posebno, efektivna doza ADC se daje pacijentu jednom mesečno, više od jednom mesečno, ili manje od jednom mesečno. U izvesnim otelotvorenjima, efektivna doza DLL3 ADC može se primenjivati više puta, uključujući za periode od najmanje mesec dana, najmanje šest meseci, najmanje godinu dana, najmanje dve godine ili period od nekoliko godina. U drugim slučajevima, nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7), nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili nekoliko meseci (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili čak godinu ili nekoliko godina može da protekne između primene opisanih modulatora.
[0229] U određenim poželjnim otelotvorenjima, tok tretmana koji uključuje konjugovane modulatore će obuhvatati višestruke doze odabranog leka tokom perioda od nekoliko nedelja ili meseci. Specifičnije, konjugovani modulatori iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati jednom dnevno, svaka dva dana, svaka četiri dana, svake nedelje, svakih deset dana, svake dve nedelje, svake tri nedelje, svakog meseca, svakih šest nedelja, svaka dva meseca, svaki deset nedelja ili svaka tri meseca. U tom smislu će biti jasno da se doze mogu menjati ili da se interval može prilagoditi na osnovu odgovora pacijenta i kliničke prakse.
[0230] Doze i režimi se takođe mogu odrediti empirijski za otkrivene terapeutske sastave kod pojedinaca kojima je data jedna ili više primena. Na primer, pojedincima se mogu dati inkrementalne doze terapeutskog sastava proizvedenog kao što je ovde opisano. U odabranim otelotvorenjima, doza se može postepeno povećavati ili smanjivati ili oslabiti na osnovu empirijski određenih ili opaženih sporednih efekata ili toksičnosti. Kako bi se procenila efikasnost izabranog sastave, može se pratiti marker specifične bolesti, poremećaja ili stanja kao što je prethodno opisano. Za rak, ovo uključuje direktno merenje veličine tumora preko palpacije ili vizuelnog posmatranja, indirektno merenje veličine tumora pomoću rendgenskih ili drugih tehnika snimanja; poboljšanje procenjeno direktnom biopsijom tumora i mikroskopskim pregledom uzorka tumora; merenje indirektnog markera tumora (npr., PSA za rak prostate) ili tumorogenog antigena identifikovanog prema ovde opisanim postupcima, smanjenje bola ili paralize; poboljšan govor, vid, disanje ili druga neosposobljenost povezana s tumorom; povećan apetit; ili povećanje kvaliteta života mereno prihvaćenim testovima ili produžavanjem preživljavanja. Stručnjaku u ovoj oblasti biće jasno da će doza varirati u zavisnosti od pojedinca, tipa neoplastičnog stanja, stadijuma neoplastičnog stanja, da li je neoplastično stanje počelo metastazirati na drugo mesto u pojedincu, i prethodnog i istovremenog tretmana koji se koriste.
3. Kombinovane terapije
[0231] U skladu sa predmetnim pronalaskom kombinovane terapije mogu biti posebno korisne u smanjenju ili inhibiranju neželjene proliferacije neoplastičnih ćelija, smanjenju pojave raka, smanjenju ili sprečavanju ponovnog pojavljivanja raka, ili smanjenju ili sprečavanju širenja ili metastaza raka. U takvim slučajevima ADC predmetnog pronalaska mogu da funkcionišu kao agensi za senzibilizaciju ili hemosensitizaciju uklanjanjem CSC koji bi inače podupirali i perpetuirali tumorsku masu, i na taj način omogućavaju efikasnije korišćenje trenutnih standarda nege ili agenasa protiv raka. To jest, opisani ADC mogu, u izvesnim slučajevima, da pruže pojačani efekat (npr., aditivni ili sinergetski po prirodi) koji pojačava način delovanja drugog terapijskog agensa. U kontekstu predmetnog obelodanjenja „kombinovana terapija“ će se tumačiti široko, i samo se odnosi na primenu DLL3 ADC i jednog ili više agenasa protiv raka koji uključuju, ali nisu ograničeni na, citotoksične agense, citostatike, anti-angiogene agense, agensi za uklanjanje, hemoterapijske agense, radioterapiju i radioterapijske agensi, ciljane agense protiv raka (uključujući monoklonska antitela i entitete malih molekula), BRM, terapeutska antitela, vakcine protiv raka, citoksine, hormonske terapije, terapija zračenjem i antimetastatske agense i imunoterapijske agense, uključujući i specifične i nespecifične pristupe.
[0232] Ne postoji zahtev da kombinovani rezultati budu aditivni za efekte koji se primećuju kada se svaki tretman (npr. ADC i agens protiv raka) sprovodi odvojeno. Iako su bar aditivni efekti generalno poželjni, bilo koji povećani anti-tumorski efekat iznad jedne pojedinačne terapije je koristan. Dalje, pronalazak ne zahteva kombinovani tretman da ispoljava sinergetske efekte. Međutim, stručnjaci u oblasti će razumeti da se sa izvesnim odabranim kombinacijama koje sadrže poželjna otelotvorenja može primetiti sinergizam.
[0233] Pri izvođenju kombinovane terapije, DLL3 konjugat i agens protiv raka mogu se davati pacijentu istovremeno, bilo u jednoj sastavu, ili kao dva ili više različitih sastava koji koriste iste ili različite načine primene. Alternativno, ADC može prethoditi, ili slediti, tretman agensom protiv raka, npr., intervalima u rasponu od minuta do nedelja. Vremenski period između svake isporuke je takav da agens protiv raka i konjugat mogu da ispoljavaju kombinovani efekat na tumor. U najmanje jednom otelotvorenju, i agens protiv raka i ADC se daju u roku od oko 5 minuta do oko dve nedelje jedan od drugog. U još nekim otelotvorenjima, nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7), nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili nekoliko meseci (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) može da protekne između primene DLL3 ADC i agensa protiv raka.
[0234] Kombinovana terapija se može primenjivati jednom, dvaput ili barem u periodu vremena dok se stanje ne tretira, ublaži ili izleči. U nekim otelotvorenjima, kombinovana terapija se daje više puta, na primer, od tri puta dnevno do jednom svakih šest meseci.
Primena može biti po rasporedu, kao što je tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom svaka dva dana, jednom svaka tri dana, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca. jednom svakih šest meseci, ili se mogu primenjivati kontinualno preko minipumpe. Kombinovana terapija se može primenjivati bilo kojim putem, kao što je prethodno pomenuto. Kombinovana terapija se može primenjivati na mestu udaljenom od mesta tumora.
[0235] U jednom aspektu, ADC se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više agenasa protiv raka tokom kratki ciklus tretmana pacijentu kom je to potrebno. Pronalazak takođe razmatra diskontinuiranu primenu ili dnevne doze podeljene u nekoliko parcijalnih primena. Konjugat i agens protiv raka mogu se primenjivati naizmenično, na alternativne dane ili nedelje; ili se može dati sekvenca tretmana antitela, nakon čega sledi jedan ili više tretmana terapije protiv raka. U svakom slučaju, kao što će biti razumljivo stručnjacima, odgovarajuće doze hemoterapeutskih agenasa i opisanih konjugata će generalno biti oko onih koji su već primenjeni u kliničkim terapijama gde se hemioterapeutici primenjuju sami ili u kombinaciji sa drugim hemoterapeuticima.
[0236] U drugom poželjnom otelotvorenju, DLL3 konjugati predmetnog pronalaska mogu da se koriste u terapiji održavanja kako bi se smanjila ili eliminisala mogućnost recidiva tumora nakon početnog javljanja bolesti. Poželjno je da se poremećaj tretira i da se početna masa tumora eliminiše, smanji ili na drugi način poboljša, tako da je pacijent asimptomatski ili u remisiji. U takvom vremenu pacijentu mogu biti primenjene farmaceutski efikasne količine obelodanjenih DLL3 konjugata jedan ili više puta, iako postoji mala ili nikakva indikacija bolesti korišćenjem standardnih dijagnostičkih postupaka. U nekim otelotvorenjima, ADC će se primenjivati na regularnom rasporedu tokom perioda vremena, kao što je nedeljno, svake dve nedelje, mesečno, svakih šest nedelja, svaka dva meseca, svaka tri meseca, svakih šest meseci ili jednom godišnje. Imajući u vidu ovde navedena saznanja, stručnjak u oblasti može lako da odredi povoljne doze i režime doziranja kako bi smanjio potencijal recidiva bolesti. Štaviše, takvi tretmani se mogu nastaviti u periodu od nekoliko nedelja, meseci, godina ili čak i na neodređeno vreme u zavisnosti od odgovora pacijenta i kliničkih i dijagnostičkih parametara.
[0237] U još jednom poželjnom otelotvorenju ADC prema predmetnom pronalasku može se koristiti profilaktički, ili kao adjuvansna terapija za sprečavanje ili smanjivanje mogućnosti tumorskih metastaza nakon procedure uklanjanja. Kako se koristi u predmetnom obelodanjenju, „procedura uklanjanja“ je definisana široko i podrazumeva svaku proceduru, tehniku ili postupak koji eliminiše, redukuje, tretira ili poboljšava tumor ili proliferaciju tumora. Primeri postupaka uklanjanja uključuju, ali nisu ograničeni na, hirurgiju, tretman zračenjem (tj. tretman radijacijom), hemoterapiju, imunoterapiju ili ablaciju. U odgovarajućim vremenskim tačkama koje lako može odrediti stručnjak iz ove oblasti u pogledu predmetnog obelodanjenja, opisani ADC se mogu primeniti kao što su predloženi kliničkim, dijagnostičkim ili teagnostičkim postupcima kako bi se smanjila metastaza tumora. Konjugati se mogu primenjivati jednom ili više puta u farmaceutski efektivnim dozama koje su određene pomoću standardnih tehnika. Poželjno, režim doziranja će biti praćen odgovarajućim dijagnostičkim ili nadzornim tehnikama koje omogućavaju njegovo modifikovanje.
[0238] Još drugih primera opisa obuhvataju primenu obelodanjenih DLL3 konjugata pacijentima koji su asimptomatski, ali su pod rizikom od razvoja proliferativnog poremećaja. To jest, konjugati predmetnog pronalaska mogu se koristiti u zaista preventivnom smislu i dati pacijentima koji su ispitani ili testirani, i imaju jedan ili više navedenih faktora rizika (npr., genomske indikacije, porodična istorija, in vivo ili in vitro rezultati testa, itd.) ali nisu razvili neoplaziju. U takvim slučajevima, stručnjaci u ovoj oblasti bi mogli da odrede efikasan režim doziranja kroz empirijsko posmatranje ili putem prihvaćenih kliničkih praksi.
4. Agensi protiv raka
[0239] Kao što je razmatrano u ovoj prijavi, DLL3 konjugati predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa agensima protiv raka. Izraz „agens protiv raka“ ili „antiproliferativni agens“ označava bilo koje agens koje se može koristiti za tretman poremećaja ćelijske proliferacije, kao što je rak, i uključuje, ali nije ograničen na, citotoksične agense, citostatike, anti-angiogene agense, agensi za uklanjanje, hemoterapeutske agense, radioterapiju i radioterapijske agense, ciljane agense protiv raka, BRM, terapeutska antitela, vakcine protiv raka, citoksine, hormonske terapije, terapiju zračenjem i anti-metastatske agense i imunoterapijske agense.
[0240] Kako se ovde koristi, izraz „citotoksični agens“ označava supstancu koja je toksična za ćelije i smanjuje ili inhibira funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništenje ćelija. U nekim otelotvorenjima supstanca je prirodni molekul izveden iz živog organizma. Primeri citotoksičnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na toksine malih molekula ili enzimski aktivne toksine bakterija (npr., Diptheria toksin, Pseudomonas endotoksin i egzotoksin, Staphylococcal enterotoksin A), gljiva (npr., Α-sarcin, restrikocin), biljaka (npr. abrin, ricin, modecin, viskumin, anti-virusne proteine vinobojke, saporin, gelonin, momoridin, trihosantin, toksin ječma, Aleurites fordii proteine, proteine dijantina, Phytolacca mericana proteine (PAPI, PAPII i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitegelin, restrikocin, phenomicin, neomicin, i tricotecen) ili životinja (npr. citotoksične RNaze, kao ekstracelularne RNaze pankreasa; DNaza I, uključujući fragmente i/ili njihove varijante).
[0241] Za potrebe predmetnog pronalaska „hemoterapijski agens“ sadrži hemijsko jedinjenje koje ne-specifično smanjuje ili inhibira rast, proliferaciju i/ili preživljavanje ćelija raka (npr., citotoksični ili citostatički agensi). Takva hemijski agensi su često usmereni na intracelularne procese neophodne za rast ili deobu ćelija, i stoga su posebno efikasni protiv kancerogenih ćelija, koje generalno brzo rastu i brzo se dele. Na primer, vinkristin depolimerizuje mikrotubule i tako inhibira ulazak ćelija u mitozu. Generalno, hemoterapeutski agensi mogu uključiti bilo koji hemijski agens koje inhibira, ili je dizajniran da inhibira, ćeliju raka ili ćeliju koja će verovatno postati kancerogena ili generisati tumorogeno potomstvo (npr., TIC). Takva agensi se često primenjuju i često su najefikasniji u kombinaciji, npr. u režimima kao što su CHOP ili FOLFIRI.
[0242] Primeri agenasa protiv raka koji se mogu koristiti u kombinaciji sa DLL3 ADC predmetnog pronalaska su izabrani iz grupe koju, bez ograničenja, čine alkilirajući agensi, alkil sulfonati, aziridini, etilenimini i metilamelamine, acetogenine, kamptotecin, briostatin, kalistatin, CC-1065, kriptoficini, dolastatin, duokarmicin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodiktiin, spongistatin, azotni iperit, antibiotici, enedinski antibiotici, denimicin, bisfosfonati, esperamicin, hromoprotein-enedin-antiobiotski hromofori, aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, carzinofilin, hromomicin, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti, erlotinib, vemurafenib, krizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamid, analozi folne kiseline, analozi purina, androgeni, anti-adrenali, fenolna kiselina, aceglaton, aldofosfamid glikozid, aminolevulinska kiselina, eniluracil, amsakrin, bestrabucil, bisantrena, edatrakat, defofamin, demekolcin, dijazikuon, elfornitin, eliptinijum acetat, epotilon, etoglucid, galijum nitrat, hidroksiurea, lentinan, lonidainin, majtanzinoidi, mitoguzon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, losoksantron, podopilinska kiselina, 2-etilhidrazid, prokarbazin, PSK® polisaharid kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoksan; rizokin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triazihion; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verracurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); ciklofosfamid, tiotepa, takodidi, hloranbucil, GEMZAR® gemcitabin, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, analozi platine, vinblastin, platina, etopozid (VP-16), ifosfamid, mitoksantron, vinkristin, NAVELBINE® vinorelbin, novantron, tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibadronat; irinotekan (Camptosar, CPT-11), inhibitor topoizomeraze RFS 2000, difluorometilornitin, retinoidi, kapecitabin, komretretin, leucovorin, oksaliplatin, inhibitori PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR i VEGF-A koji smanjuju proliferaciju ćelija i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od gore navedenog. Takođe su uključeni u ovu definiciju kao anti-hormonalni agensi koji regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori receptora estrogena, inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, što reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, i anti-androgeni; kao i troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozida citozina); antisens oligonukleotidi, ribozimi kao inhibitor VEGF eksprimiranja i inhibitor HER2 eksprimiranja; vakcine, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; vinorelbin i esperamicini i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od gore navedenog.
[0243] Posebno poželjni agensi protiv raka obuhvataju komercijalno ili klinički dostupna jedinjenja kao što su erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), doketaksel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS No.51-21-8), gemcitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No.391210-10-9, Pfizer), cisplatin (cisdiamin, dihloroplatina(II), CAS No.15663-27-1), karboplatin (CAS No.41575-94-4), paclitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomid (4-metil-5-okso- 2,3,4,6,8-pentazabiciklo [4,3,0] nona-2,7,9-trien- 9-karboksamid, CAS No.85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoksifen ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoksi]-N,N-dimetiletanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®), i doksorubicin (ADRIAMYCIN®). Dodatni komercijalno ili klinički dostupni agensi protiv raka uključuju oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mesilat (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Mek inhibitor, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek inhibitor, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K inhibitor, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitor, Novartis), XL-147 (PI3K inhibitor, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leukovorin (folinic acid), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyet), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotekan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (bez Cremophor-a), nanočestične formulacije paklitaksela napravljene od albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), hloranmbucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyet), pazopanib (GlaxoSmithKline), kanfosfamid (TELCYTA®, Telik), tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®, NEOSAR®); vinorelbin (NAVELBINE®); kapecitabin (XELODA®, Roche), tamoksifen (uključujući NOLVADEX®; tamoksifen citrat, FARESTON® (toremifin citrat) MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (eksemestan; Pfizer), formestan, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), i ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca).
[0244] U drugim otelotvorenjima DLL3 konjugati predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa bilo kojim od brojnih antitela (ili imunoterapeutskih agenasa) trenutno u kliničkim ispitivanjima ili komercijalno dostupnim. U tu svrhu, opisani DLL3 konjugati se mogu koristiti u kombinaciji sa antitelom izabranim iz grupe koju čine abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksimab, anatumomab, arcitumomab, bavituksimab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuksimab, kantuzumab, katumaksomab, cetuksimab, citatuzumab, ciksutumumab, klivatuzumab, konatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeksimab, elotuzumab, ensituksimab, ertumaksomab, etaracizumab, farletuzumab, fiklatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuksimab, ganitumab, gemtuzumab, girentuksimab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuksimab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, leksatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moksetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, , nimotuzumab, nofetumomabn, okaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, ramucirumab, radretumab, rilotumumab, rituksimab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuksimab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituksimab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49, 3F8 i njihove kombinacije.
[0245] Još neki naročito poželjni slučajevi će obuhvatati upotrebu antitela u testiranju ili odobrena za terapiju raka, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rituksimab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuksetan, tositumomab, bevacizumab, cetuksimab, panitumumab, ramucirumab, ofatumumab, ipilimumab i brentuksimab vedotin. Stručnjaci u oblasti će moći lako da identifikuju dodatne agensi protiv raka koji su kompatibilna sa ovde opisanim saznanjima.
5. Radioterapija
[0246] predmetni pronalazak takođe pruža kombinaciju DLL3 konjugata sa radioterapijom (tj. bilo koji mehanizam za indukovanje oštećenja DNK lokalno unutar tumorskih ćelija kao što je gama-zračenje, rendgenski zraci, UV zračenje, mikrotalasi, elektronske emisije i slično). Kombinovana terapija upotrebom usmerene isporuke radioizotopa na tumorske ćelije je takođe razmatrana, i opisani konjugati se mogu koristiti u vezi sa ciljanim agensom protiv raka ili drugim agensima za ciljanje. Tipično, radioterapija se daje u impulsima tokom perioda vremena od oko 1 do oko 2 nedelje. Radioterapija se može primeniti kod pacijenata koji imaju rak glave i vrata oko 6 do 7 nedelja. Opciono, radioterapija se može primenjivati kao pojedinačna doza ili kao višestruke, uzastopne doze.
VII. Indikacije
[0247] Podrazumeva se da se ADC predmetnog pronalaska mogu koristiti za tretman, prevenciju, upravljanje ili inhibiciju pojave ili ponovne pojave bilo kog poremećaja povezanog sa DLL3. Shodno tome, bilo da se primenjuju sami ili u kombinaciji sa agensom protiv raka ili radioterapijom, ADC iz pronalaska su naročito korisni za opšti tretman neoplastičnih stanja kod pacijenata ili pacijenata koji mogu uključivati benigne ili maligne tumore (npr. rakovi bešike, jetre, bubrega, dojke, želuca, jajnika, kolorektalni rak, rak prostate, pankreasa, pluća, štitne žlezde, jetre, grlića materice, endometrijuma, jednjaka i materice; sarkomi; glioblastomi; i različiti tumori glave i vrata); leukemije i limfoidne malignosti; drugi poremećaje kao što su neuronski, glijalni, astrocitalni, hipotalamički i drugi žlezdani, makrofagalni, epitelni, stromalni i blastocelični poremećaji; i upalni, angiogeni, imunološki poremećaji i poremećaji uzrokovani patogenima. Naročito, ključni ciljevi za tretman su neoplastična stanja koja sadrže čvrste tumore, iako su hematološke malignosti u okviru predmetnog pronalaska.
[0248] Izraz „tretman“, kako se ovde koristi u kontekstu tretmana stanja, generalno se odnosi na tretman i terapiju, bilo da je reč o čoveku ili životinji (npr. u veterinarskim primenama), kod kojih se postiže željeni terapeutski efekat, na primer inhibicija napretka stanja i uključuje smanjenje stope napretka, zaustavljanje brzine napretka, regresiju stanja, poboljšanje stanja i izlečenje stanja. Tretman kao profilaktička mera (tj. profilaksa, prevencija) je takođe uključen.
[0249] Izraz „terapeutski efikasna količina“, kako se ovde koristi, odnosi se na onu količinu aktivnog jedinjenja, ili materijala, sastava ili doze aktivnog jedinjenja, koja je efikasna za proizvodnju nekog željenog terapeutskog efekta, srazmerno sa razumnom odnosu koristi/rizika, kada se primenjuje u skladu sa željenim režimom tretmana.
[0250] Slično tome, izraz „profilaktički efektivna količina“, kako se ovde koristi, odnosi se na onu količinu aktivnog jedinjenja, ili materijala, sastava ili oblika doziranja koja uključuje aktivno jedinjenje, koje je efikasno za proizvodnju nekog željenog profilaktičkog efekta, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika, kada se primenjuje u skladu sa željenim režimom tretmana.
[0251] Specifičnije, neoplastična stanja podvrgnuta tretmanu u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti izabrana iz grupe koja uključuje, ali nije ograničena na, tumore nadbubrežne žlezde, rak povezan sa AIDS-om, alveolarni sarkom mekog dela, astrocitne tumore, rak bešike (rak skvamoznih ćelija, i rak prelaznih ćelija), rak kostiju (adamantinoma, aneurizma koštane ciste, osteohondroma, osteosarkom), rak mozga i kičmene moždine, metastatski tumori mozga, rak dojke, tumori karotidnog tela, rak grlića materice, hondrosarkom, hordoma, hromofobni rak bubrežnih ćelija, rak bistrih ćelija, rak debelog creva, kolorektalni rak, kožni benigni fibrozni histiocitom, tumor desmoplastičnih malih okruglih ćelija, ependimoma, Ewing-ovi tumori, ekstraskeletni miksoidni hondrosarkom, fibrogeneza imperfecta ossium, fibrozna displazija kostiju, raka žučne kese, ćelijski tumori, rak glave i vrata, tumori ćelija ostrvaca, Kaposijev sarkom, rak bubrega (nebroblastom, papilarni rak bubrežnih ćelija), leukemija, lipom/benigni lipomatozni tumori, liposarkom/maligni lipomatozni tumori, rak jetre (hepatoblastom, hepatocelularni rak), limfomi, rak pluća (rak malih ćelija, adenokarcinom, rak skvamoznih ćelija, rak velikih ćelija i sl.), meduloblastom, melanomom, meningiomom, višestruka endokrina neoplazija, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom, neuroblastom, neuroendokrini tumori, rak jajnika, rak pankreasa, papilarni rak štitaste žlezde, tumor paratiroida, pedijatrijski rakovi, tumori perifernog nervnog omotača, feohromocitom, tumor hipofize, rak prostate, posteriozni melanom, retki hematološki poremećaji, bubrežni metastatski rak, rabdoidni tumor, rabdomisarkom, sarkomi, rak kože, sarkomi mekog tkiva, rak skvamoznih ćelija, rak želuca, sinovijalni sarkom, rak testisa, rak želuca, timom, metastatski rak štitaste žlezde i rak materice (rak grlića materice, endometrjalni rak i leiomijom).
[0252] U određenim poželjnim otelotvorenjima, proliferativni poremećaj će obuhvatiti čvrsti tumor uključujući, ali ne ograničavajući se na, adrenalni rak, rak jetre, bubrega, bešike, dojke, želuca, jajnika, grlića materice, materice, jednjaka, kolorektalni rak, rak prostate, pankreasa, pluća (kako malih, tako i ne-malih ćelija), štitne žlezde, karcinomi, sarkomi, glioblastomi i različiti tumori glave i vrata. U drugim poželjnim primerima, i kao što je prikazano u primerima u nastavku, opisani ADC su posebno efikasni u tretmanu raka malih ćelija pluća (SCLC) i raka ne-malih ćelija pluća (NSCLC) (npr. rak skvamoznh ne-malih ćelija pluća ili rak skvamoznh malih ćelija pluća) rak plućne ćelije malih ćelija pluća). U jednom otelotvorenju, rak pluća je otporan, recidiviran ili rezistentan na agens na bazi platine (npr., karboplatin, cisplatin, oksaliplatin, topotekan) i/ili taksan (npr., docetaksel, paklitaksel, larotaksel ili kabazitaksel).
[0253] U posebno poželjnim primerima, opisani ADC mogu biti korišćeni za tretman raka malih ćelija pluća. S obzirom na takve slučajeve, konjugovani modulatori mogu biti primenjivani pacijentima koji pokazuju ograničenu fazu bolesti. U drugim slučajevima, obelodanjeni ADC će biti primenjivani pacijentima koji pokazuju ekstenzivnu fazu bolesti. U drugim poželjnim primerima, opisani ADC će biti primenjivani refraktornim pacijentima (tj. oni kojima se rak ponavlja tokom ili kratko nakon završetka početnog toga terapije) ili rekurentni pacijenti sa rakom malih ćelija pluća. Još neki drugi slučajevi obuhvataju primenu obelodanjenih ADC osetljivim pacijentima (tj. oni čiji je recidiv duži od 2-3 meseca nakon primarne terapije. U svakom slučaju biće jasno da se kompatibilni ADC mogu koristiti u kombinaciji sa drugim agensima protiv raka u zavisnosti od odabranog režima doziranja i kliničke dijagnoze.
[0254] Kao što je gore razmatrano, opisani ADC mogu dalje da se koriste za prevenciju, tretman ili dijagnostikovanje tumora sa neuroendokrinim osobinama ili fenotipovima koji uključuju neuroendokrine tumore. Pravi ili kanonični neuroendokrini tumori (NET) koji potiču iz disperzovanog endokrinog sistema su relativno retki, sa učestalošću od 2-5 na 100,000 ljudi, ali su veoma agresivni. Neuroendokrini tumori se javljaju u bubregu, genitourinarnom traktu (bešika, prostata, jajnik, cerviks i endometrijum), gastrointestinalnom traktu (debelo crevo, stomak), štitnoj žlezdi (medularni rak štitne žlezde) i plućima (rak malih ćelija pluća i neuroendokrini rak velikih ćelija). Ovi tumori mogu da luče nekoliko hormona uključujući serotonin i/ili hromogranin A koji mogu izazvati iscrpljujuće simptome poznate kao karcinoidni sindrom. Takvi tumori mogu biti označeni pozitivnim imunohistohemijskim markerima kao što su neuronski specifična enolaza (NSE, takođe poznata kao gama enolaza, genski simbol = ENO2), CD56 (ili NCAM1), hromogranin A (CHGA), i sinaptofizin (SYP) ili genima za koje je poznato da pokazuju povećano eksprimiranje kao što je ASCL1.
Nažalost, tradicionalne hemioterapije nisu bile naročito efikasne u tretmanu NET i metastaza jetre je čest ishod.
[0255] Dok se opisani ADC mogu pogodno koristiti za tretman neuroendokrinih tumora, oni se takođe mogu koristiti za tretman, prevenciju ili dijagnostiku pseudo neuroendokrinih tumora (pNET) koji genotipski ili fenotipski oponašaju, liče ili pokazuju uobičajene osobine sa kanoničkim neuroendokrinim tumorima. Pseudo-neuroendokrini tumori ili tumori sa neuroendokrinim karakteristikama su tumori koji nastaju iz ćelija difuznog neuroendokrinog sistema ili iz ćelija u kojima je kaskada neuroendokrne diferencijacije nenormalno reaktivirana tokom onkogenog procesa. Takvi pNET obično dele određene fenotipske ili biohemijske karakteristike sa tradicionalno definisanim neuroendokrinim tumorima, uključujući sposobnost da proizvode podskupove biološki aktivnih amina, neurotransmitera i peptidnih hormona. Histološki, takvi tumori (NET i pNET) imaju zajednički izgled koji često pokazuje gusto povezane male ćelije sa minimalnom citoplazmom blage citopatologije i okruglim do ovalnim šupljim jezgrima. Za potrebe predmetnog pronalaska, uobičajeno eksprimirani histološki marker,i ili genetski markeri koji se mogu koristiti za definisanje neuroendokrinih i pseudo-neuroendokrinih tumora, uključuju, ali nisu ograničeni na, hromogranin A, CD56, sinaptofizin, PGP9.5, ASCL1 i neuronsko-specifičnu enolazu (NSE).
[0256] Prema tome, ADC predmetnog pronalaska mogu biti korisni za tretman kako pseudoneuroendokrinih tumora, tako i kanoničkih neuroendokrinih tumora. U tom smislu, ADC se mogu koristiti kao što je ovde opisano za tretman neuroendokrinih tumora (i NET i pNET) koji se javljaju u bubregu, genitourinarnom traktu (bešika, prostata jajnik, grlić materice i endometrijum), gastrointestinalnom traktu (debelo crevo, stomak), štitnoj žlezdi (medularni rak štitne žlezde) i plućima (rak malih ćelija pluća i neuroendokrini rak velikih ćelija). Pored toga, ADC predmetnog pronalaska se mogu koristiti za tretman tumora koji eksprimiraju jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od NSE, CD56, sinaptofizina, hromogranina A, ASCL1 i PGP9.5 (UCHL1). To jest, predmetni pronalazak se može koristiti za tretman pacijenta koji pati od tumora koji je NSE+ ili CD56+ ili PGP9,5+ ili ASCL1+ ili SYP+ ili CHGA+ ili neke njihove kombinacije.
[0257] Što se tiče hematoloških maligniteta, dalje će biti jasno da jedinjenja i postupci predmetnog pronalaska mogu biti posebno efikasni u tretmanu raznih B-ćelijskih limfoma, uključujući folikularne ćelije limfoma niskog stepena/NHL (FCC), limfo, plaštastih ćelija (MCL), difuzni limfom velikih ćelija (DLCL), mali limfocitni (SL) NHL, srednji/folikularni NHL, srednji difuzni NHL, snažni imunoblastični NHL, snažni limfoblastični NHL, snažni NHL malih nerazdvojenih ćelija, glomazna bolest NHL, Waldenstrom-ova makroglobulinemija, limfoplazmactoidni limfom (LPL), limfom ćelija limfoma (MCL), folikularni limfom (FL), difuzni limfom velikih ćelija (DLCL), Burkitt-ov limfom (BL), limfomi povezani sa AIDS-om, monocitni B-limfom, angioimunoblastična limfodenopatija, male limfocitne, folikularne, difuzne velike ćelije, difuzne male razdvojene ćelije, imunoblastični limfoblastom velikih ćelija, male, nerazdovjene, Burkitt-ove i ne-Burkitt-ove, folikularne, pretežno vleike ćelije; folikularne, pretežno male razdvojene ćelije; i folikularne, mešani limfom malih razdvojenih i velikih ćelija. Pogledati, Gaidono i dr., „Lymphomas“, IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol.2: 2131-2145 (DeVita i dr., eds., 5.sup.. izd.1997). Stručnjacima bi trebalo da bude jasno da će ti limfomi često imati različita imena zbog promene sistema klasifikacije, i da pacijenti koji imaju limfome klasifikovane pod različitim imenima mogu takođe imati koristi od kombinovanih terapijskih režima predmetnog pronalaska.
[0258] Predmetni pronalazak takođe pruža preventivni ili profilaktički tretman pacijenata koji su prisutni sa benignim ili pre-kanceroznim tumorima. Pored toga što je poremećaj povezan sa DLL3, ne veruje se da bilo koji određeni tip tumora ili proliferativnog poremećaja treba da bude isključen iz tretmana korišćenjem predmetnog pronalaska. Međutim, tip tumorskih ćelija može biti relevantan za upotrebu opisa u kombinaciji sa sekundarnim terapeutskim agensima, posebno hemoterapeutskim agensima i ciljanim agensima protiv raka.
[0259] Poželjno, „pacijent“ ili „bolesnik“ koji će se tretirati će biti čovek, iako, kako se ovde koristi, za izraze se eksplicitno smatra da sadrže bilo koju vrstu, uključujući sve sisare.
Shodno tome, pacijent/pacijent može biti životinja, sisar, placentalni sisar, torbar (npr. kengur, vombat), monotrem (npr. kljunar), glodar (npr. zamorac, hrčak, pacov, miš), mš, lagomorf (npr. zec), ptica, pas, mačka, konj, svinja, ovca, govedo (npr. krava), primat, majmun (npr. marmoset, babun), čovekoliki majmun (npr. gorila, šimpanza, orangutan, gibbn) ili čovek.
VIII. Predmeti proizvodnje
[0260] Takođe su pruženi farmaceutski paketi i kompleti koji sadrže jedan ili više kontejner, koji sadrži jednu ili više doza DLL3 ADC. U izvesnim otelotvorenjima, pružena je jedinična doza, gde jedinična doza sadrži prethodno određenu količinu sastava koji sadrži, na primer, anti-DLL3 konjugat, sa ili bez jednog ili više dodatnih agenasa. Za druga otelotvorenja, takva jedinična doza se isporučuje u napunjenom špricu za jednokratnu upotrebu za injekciju. U drugim otelotvorenjima, sastav sadržan u jediničnoj dozi može da sadrži fiziološki rastvor, saharozu ili slično; pufer, kao što je fosfat, ili slično; i/ili se formuliše u stabilnom i efektivnom pH opsegu. Alternativno, u izvesnim otelotvorenjima, sastav konjugata može biti pružen kao liofilizovani prašak koji se može rekonstituisati nakon dodavanja odgovarajuće tečnosti, na primer, sterilne vode ili slanog rastvora. U određenim poželjnim otelotvorenjima, sastav sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju agregaciju proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, saharozu i arginin. Bilo koja oznaka na, ili povezana sa kontejnerom, ukazuje da se zatvoren sastav koristi za tretman neoplastičnog stanja izabrane bolesti.
[0261] Predmetni pronalazak takođe pruža komplete za proizvodnju jedinica za primenu sa pojedinačnom dozom ili višestrukim dozama DLL3 konjugata i, opciono, jednog ili više agenasa protiv raka. Komplet sadrži kontejner i oznaku ili umetak pakovanja na ili povezan sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd.
Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika, i sadrže farmaceutski efikasnu količinu opisanih DLL3 konjugata u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku. U drugim poželjnim otelotvorenjima, kontejneri obuhvataju sterilni priključak za pristup (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti pomoću potkožne injekcione igle). Takvi kompleti će obično sadržati u pogodnom kontejneru farmaceutski prihvatljivu formulaciju DLL3 konjugata i, opciono, jedan ili više agenasa protiv raka u istim ili različitim kontejnerima. Kompleti mogu takođe da sadrže druge farmaceutski prihvatljive formulacije, bilo za dijagnostiku ili kombinovanu terapiju. Na primer, pored DLL3 konjugata pronalaska, takvi kompleti mogu da sadrže bilo koji ili više od niza agenasa protiv raka kao što su hemoterapijski ili radioterapijski lekovi; anti-angiogeni agensi; anti-metastatski agensi; ciljani agensi protiv raka; citotoksični agensi; i/ili drugi agensi protiv raka.
[0262] Specifičnije, kompleti mogu imati jedan kontejner koji sadrži DLL3 ADC, sa ili bez dodatnih komponenti, ili oni mogu imati različite kontejnere za svaki željeni agens. Kada su kombinovani terapeutici pruženi za konjugaciju, jedan rastvor može biti unapred pomešan, bilo u molarno ekvivalentnoj kombinaciji, ili tako da jedne komponente ima više od druge. Alternativno, DLL3 konjugati i bilo koji opcioni agens protiv raka u kompletu mogu se održavati odvojeno unutar različitih kontejnera pre primene pacijentu. Kompleti mogu takođe sadržati drugi/treći kontejner koji sadrži sterilan, farmaceutski prihvatljiv pufer ili drugi razblaživač kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BVFI), fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS), Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze.
[0263] Kada se komponente kompleta daju u jednom ili više tečnih rastvora, tečni rastvor je poželjno vodeni rastvor, sa posebno povoljnim sterilnim vodenim ili slanim rastvorom.
Međutim, komponente kompleta mogu biti pružene kao osušeni prašak. Kada su reagensi ili komponente pruženi kao suvi prašak, prašak se može rekonstituisati dodavanjem pogodnog rastvarača. Predviđeno je da se rastvarač takođe može pružiti u drugom kontejneru.
[0264] Kao što je ukratko naznačeno, kompleti mogu takođe da sadrže agens kojim će se konjugat antitela i bilo koje opcione komponente primeniti životinji ili pacijentu, npr., Jedna ili više igala, I.V. vrećice ili špricevi, ili čak kapi za oči, pipeta, ili drugi sličan aparat, iz kog se formulacija može ubrizgati ili uvesti u životinju ili naneti na bolesno područje tela.
Kompleti iz predmetnog pronalaska će takođe tipično uključivati način za držanje bočica, ili sličnih kontejnera, i druge komponente u bliskom ograničenju za komercijalnu prodaju, kao što su, na primer, injekcione ili duvanjem oblikovane plastične posude u koje se željene bočice i drugi uređaji se postavljaju i zadržavaju. Bilo koja oznaka ili umetak u pakovanju ukazuje da se DLL3 konjugat sastav koristi za tretman raka, na primer raka malih ćelija pluća.
[0265] U drugim poželjnim otelotvorenjima, konjugati predmetnog pronalaska mogu da se koriste zajedno sa ili sadrže dijagnostičke ili terapeutske uređaje koji su korisni u prevenciji ili tretmanu proliferativnih poremećaja. Na primer, u poželjnom slučaju, jedinjenja i sastavi predmetnog pronalaska mogu da se kombinuju sa određenim dijagnostičkim uređajima ili instrumentima koji se mogu koristiti za detektovanje, praćenje, kvantifikovanje ili profilisanje ćelija ili markerskih jedinjenja uključenih u etiologiju ili manifestaciju proliferativnih poremećaja. Za odabrane slučajeve, markerska jedinjenja mogu da sadrže NSE, CD56, sinaptofizin, hromogranin A i PGP9.5.
[0266] U posebno poželjnim primerima, uređaji se mogu koristiti da detektuju, prate i/ili kvantifikuju tumorske ćelije u cirkulaciji in vivo ili in vitro (pogledati, na primer, WO 2012/0128801). U još nekim poželjnim otelotvorenjima, i kao što je gore razmatrano, tumorske ćelije u cirkulaciji mogu da sadrže matične ćelije raka.
IX. Sažetak spiska sekvenci
[0267] Ovoj prijavi se dodaje spisak sekvenci koje sadrži niz sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselina. Sledeća Tabela 2 daje sažetak uključenih sekvenci.
TABELA 2
X. Razno
[0268] Osim ako nije drugačije definisano ovde, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u vezi sa ovim pronalaskom će imati značenja koja su obično razumljiva stručnjacima. Osim toga, osim ako se kontekst ne zahteva drugačije, izrazi u jednini uključuju množinu, i izrazi u množini uključuju jedninu. Konkretnije, kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „protein“ uključuje mnoštvo proteina; referenca na „ćeliju“ uključuje smeše ćelija i slično. Pored toga, rasponi dati u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima obuhvataju obe krajnje tačke, i sve tačke između krajnjih tačaka. Prema tome, opseg od 2,0 do 3,0 uključuje 2,0, 3,0 i sve tačke između 2,0 i 3,0.
[0269] Generalno, tehnike kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i hemije proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacije koje su ovde opisane i nomenklatura koja se koristi u vezi sa njima, su one koje su dobro poznate i obično se koriste u struci. Postupci i tehnike predmetnog pronalaska se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su dobro poznati u struci i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i razmatrane u ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Pogledati, npr. Abbas i dr., Cellular and Molecular Immunology, 6. izd., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel i dr., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); i Coligan i dr., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u struci ili kako je ovde opisano. Laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde, i nomenklatura koja se koristi u vezi sa njima, su one koje su dobro poznate, i koje se uobičajeno koriste u struci. Uz to, bilo koji odeljci koji se ovde koriste su samo za organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisanog predmeta.
[0270] Određene skraćenice koje se ovde koriste:
Ac
acetil
Acm
acetamidometil
Alloc
alliloksikarbonil
Boc
di-terc-butil dikarbonat
t-Bu
terc-butil
Bzl
benzil, gde je Bzl-OMe metoksibenzil i Bzl-Me je metilbenzen
Cbz ili Z
benziloksi-karbonil, gde Z-Cl i Z-Br are hloro- i bromobenziloksi karbonil respectively
DMF
N,N-dimetilformamid
Dnp
dinitrofenil
DTT
ditiotreitol
Fmoc
9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil
imp
N-10 imin zaštitna grupa: 3-(2-metoksietoksi)propanoat-Val-Ala-PAB MC-OSu
aleimidokaproil-O-N-sukcinimid
Moc
metoksikarbonil
MP
maleimidopropanamid
Mtr
4-metoksi-2,3,6-trimettilbenzensulfonil
PAB
para-aminobenziloksikarbonil
PEG
etilenoksi
PNZ
p-nitrobenzil karbamat
Psec
2-(fenilsulfonil)etoksikarbonil
TBDMS
terc-butildimetilsilil
TBDPS
terc-butildifenilsilil
Teoc
2-(trimetilsilil)etoksikarbonil
Tos
tosil
Troc
2,2,2-trihloretoksikarbonil hlorid
Trt
tritil
Xan
ksantil
PRIMERI
[0271] Predmetni pronalazak, uopšteno opisan iznad, biće lakše razumljiv upućivanjem na sledeće primere. Primeri koji se odnose na PBD 1-4 su ilustrativni primeri.
[0272] Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1
Izrada PBD lek-veznik jedinjenja
[0273] PBD jedinjenja leka-povezivač DL1-DL5 su sintetizovana na sledeći način:
A. Opšti postupci eksperimenta
[0274] Optičke rotacije su merene na ADP 220 polarimetru (Bellingham Stanley Ltd.) i koncentracije (c) su date u g/100mL. Tačke topljenja su merene korišćenjem digitalnog aparata za određivanje tačke topljenja (Electrothermal). IR spektri su snimljeni na Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR spektrometru.1H and 13C NMR spektri su dobijeni na 300 K koristeći Bruker Avance NMR spektrometar na 400 i 100 MHz, respektivno. Prikazani su hemijski pomaci u odnosu na TMS (δ = 0,0 ppm), i signali su označeni kao s (singlet), d (dublet), t (triplet), dt (dublet tripleta), dd (dublet dubleta), ddd (dublet dubleta dubleta) ili m (multiplet), sa konstantama vezivanja datim u Hertz (Hz). Podaci masene spektroskopije (MS) su sakupljeni korišćenjem Waters Micromass ZQ instrumenta uparenog sa Waters 2695 HPLC sa Waters 2996 PDA. Korišćeni parametri Waters Micromass ZQ su bili: Kapilarni (kV), 3,38; Konus (V), 35; Ekstraktor (V), 3,0; Temperatura izvora (°C), 100; Temperatura desolvatacije (°C), 200; Brzina protoka konusa (L/h), 50; Brzina protoka (L/h), 250. Podaci masene spektroskopije visoke rezolucije (HRMS) su snimljeni na Waters Micromass QTOF Global u pozitivnom W-modu koristeći metalne prevlake od borosilikatnog stakla za uvođenje uzoraka u instrument. Tankoslojna hromatografija (TLC) je izvedena na aluminijumskim pločama od silika gela (Merck 60, F254), i fleš hromatografija koristi silika gel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Osim HOBt (NovaBiochem) i reagensa na čvrstom nosaču (Argonaut), sve druge hemikalije i rastvarači su nabavljeni od Sigma-Aldrich i korišćeni su kao isporučeni bez daljeg prečišćavanja. Bezvodni rastvarači su pripremljeni destilacijom u atmosferi suvog azota u prisustvu odgovarajućeg agensa za sušenje, i bili su uskladišteni preko 4Å molekulskih sita ili natrijumske žice. Naftni etar se odnosi na fragment koja ključa na 40-60°C.
[0275] U generisanju obelodanjenih jedinjenja LC/MS je izvedena korišćenjem dva malo drugačija postupka. Podrazumevani postupak je prvi opisani postupak koji je korišćen osim ako nije drugačije naznačeno.
[0276] Postupak 1 (podrazumevani postupak, ako nije drugačije navedeno)- HPLC (Waters Alliance 2695) je izvršen koristeći mobilnu fazu vode (A) (mravlja kiselina 0,1%) i acetonitrila (B) (mravlja kiselina 0,1%). Gradijent: početni sastav 5% B održavana tokom 1,0 min, zatim poveća sa 5% B na 95% B tokom perioda od 3 min. Sastav je držana 0,1 minuta na 95% B, zatim vraćena na 5% B tokom 0,03 minuta i zadržana je 0,87 min. Ukupno trajanje gradijenta iznosi 5 minuta.
[0277] Postupak 2 HPLC (Waters Alliance 2695) je izvršen uz pomoć mobilne faze vode (A) (mravlja kiselina 0,1%) i acetonitrila (B) (mravlja kiselina 0,1%). Gradijent: početni sastav 5% B je održavana tokom 1,0 minuta, zatim povećan sa 5% B na 95% B tokom perioda od 2,5 minuta. Sastav je održavan 0,5 minuta na 95% B, zatim vraćena na 5% B tokom 0,1 minuta i tamo držan 0,9 min. Ukupno trajanje gradijenta iznosi 5 minuta.
[0278] Za oba postupka brzina protoka bila je 3,0 mL/min, 400 µL je podeljeno putem nula mrtve zapremine koja prelazi u maseni spektrometar. Domet detektovanja talasne dužine: 220 do 400 nm. Tip funkcije: diodni niz (535 skenova). Kolona: Phenomenex Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
[0279] Uslovi pročišćavanja sa obrnutom fazom su bili sledeći: Sistem fleš prečišćavanja (Varian 971-Fp) je izveden koristeći mobilnu fazu vode (A) i acetonitrila (B). Gradijent: početni sastav 5% B preko 20 C.V. (zapremina kolone) zatim 5% B do 70% B u roku od 60 C.V. Sastav je održavan za 15 C.V. na 95% B, i zatim se vratio na 5% B u 5 C.V. i održavan na 5% B za 10 C.V. Ukupno trajanje gradijenta iznosi 120 C.V. Brzina protoka 6,0 mL/min. Domet detekcije talasne dužine: 254 nm. Kolona: Agilent AX1372-1 SF10-5,5gC8.
[0280] Preparativna HPLC je izvedena na sledeći način: Reverzno-fazna tečna hromatografija (UPLC) je izvedena na Phenomenex Gemini NX 5µ C-18 kolonama sledećih dimenzija: 150 x 4,6 mm za analizu i 150 x 21,20 mm za pripremni rad. Svi UPLC eksperimenti su izvedeni sa gradijentnim uslovima. Eluenti koji su korišćeni su bili rastvarač A (H2O sa 0,1% mravlje kiseline) i rastvarač B (CH3CN sa 0,1% mravlje kiseline). Korišćene brzine protoka bile su 1,0 ml/min za analitičku i 20,0 ml/min za preparativnu HPLC. Detektovanje je bilo na 254 i 280 nm.
B. Sinteza lek-veznika DL1 (Način 1)
[0281]
(a) 1',3'-Bis[2-metoksi-4-(metoksikarbonil)fenoksi]propan (3)
[0282] Diizopropil azodikarboksilat (71,3 mL, 73,2 g, 362 mmol) je dodat kapanjem tokom perioda od 60 minuta unapred mešanom rastvoru metil vanilata 2 (60,0 g, 329 mmol) i Ph3P (129,4 g, 494 mmol) u nevodenom THF (800 mL) na 0-5°C (led/aceton) pod atmosferom azota. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 0-5°C tokom dodatnog 1 nakon čega je rastvor 1,3-propandiol (11,4 mL, 12,0 g, 158 mmol) u THF (12 mL) je dodat kapanjem tokom perioda od 20 minuta. Reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom 5 dana. Rezultujući beli talog 3 je prikupljen vakuumskim filtriranjem, opran sa THF i osušen u vakuumskom disekatoru do konstantne težine. Prinos = 54,7 g (84% na osnovu 1,3-propandiola). Čistoća je zadovoljavajuća pomoću LC/MS (3,20 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 427 ([M Na]+., 10); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,64 (dd, 2H, J = 1,8, 8,3 Hz), 7,54 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 6,93 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,30 (t, 4H, J = 6,1 Hz), 3,90 (s, 6H), 3,89 (s, 6H), 2,40 (p, 2H, J = 6,0 Hz).
(b) 1',3'-Bis[2-metoksi-4-(metoksikarbonil)-5-nitrofenoksi]propan (4)
[0283] Čvrsti Cu(NO3)2,3H2O (81,5 g, 337,5 mmol) je dodat polako unapred mešanoj suspenziji bis-estara 3 (54,7 g, 135 mmol) u sirćetnom anhidridu (650 mL) na 0-5°C (led/aceton). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša tokom 1 sata na 0-5°C i zatim joj je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Blagi egzoterm (ca. 40-50°C), praćen zgrušnjavanjem smeše i evolucijom NO2je primećen u ovoj fazi. Dodatni sirćetni anhidrid (300 mL) je dodat i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša tokom 16 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je sipana na led (∼ 1,5 L), mešana i omogućeno joj je da se vrati do sobne temperature. Rezultujući žuti talog je prikupljen vakuumskim filtriranjem i osušen u desikatoru kako bi se dobilo željeno bis-nitro jedinjenje 4 kao žutu čvrstu supstancu. Prinos = 66,7 g (100%). Čistoća je zadovoljavajuća pomoću LC/MS (3,25 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 517 ([M Na]+., 40); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,49 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 4,32 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,95 (s, 6H), 3,90 (s, 6H), 2,45-2,40 (m, 2H).
(c) 1',3'-Bis(4-karboksi-2-metoksi-5-nitrofenoksi) propan (5)
[0284] Suspenzija metil estara 4 (66,7 g, 135 mmol) u THF (700 mL) je tretirana sa IN NaOH (700 mL) i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša snažno na sobnoj temperaturi. Nakon 4 dana mešanja, suspenzija je postala tamno obojeni rastvor koji je podvrgnut rotacionom isparavanju pod redukovanim pritiskom kako bi se uklonio THF. Rezultujući vodeni ostatak je acidifikovan do pH 1 sa koncentrovanim HCl i bezbojni talog 5 je prikupljen i osušen temeljno u vakuumskoj peći (50 °C). Prinos = 54,5 g (87%). Čistoća je zadovoljavajuća pomoću LC/MS (2,65 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 489 ([M Na]+., 30)); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,62 (s, 2H), 7,30 (s, 2H), 4,29 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,85 (s, 6H), 2,30-2,26 (m, 2H).
(d) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis[(5-metoksi-2-nitro-1,4-fenilene)karbonil]]bis [(2S, 4R)-metil-4-hidroksipirolidin-2-karboksilat] (6)
[0285] Oksalil hlorid (24,5 mL, 35,6 g, 281 mmol) je dodat mešanoj suspenziji nitrobenzojeve kiseline 5 (43 g, 92,3 mmol) i DMF (6 mL) u nevodenom DCM (600mL). Nakon početne pobuđenosti reakciona suspenzija je postala rastvor i smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 sati. Konverzija do kiselog hlorida je potvrđena tretiranjem uzorka reakcione smeše sa MeOH i rezultujući bis-metil estar je primećen pomoću LC/MS. Veći deo rastvarača je uklonjen isparavanjem pod redukovanim pritiskom; rezultujući koncentrisani rastvor je ponovo rastvoren u minimalnoj količini suvog DCM i trituran sa dietil etrom. Rezultujući žuti talog je prikupljen filtriranjem, opran sa hladnim dietil etrom i osušen tokom 1 sata u vakuumskoj peći na 40°C. Čvrsta supstanca kiseli hlorid je dodat iz delova tokom perioda od 25 minuta mešanoj suspenziji od (2S,4R)-metil-4-hidroksipirolidin-2-karboksilat hidrohlorida (38,1 g, 210 mmol) i TEA (64,5 mL, g, 463 mmol) u DCM (400mL) na - 40°C (suvi led/CH3CN). Neposredno potom, reakcija je završena što je zaključeno pomoću LC/MS (2,47 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 721 ([M H]<+.>, 100). Smeša je rastvorena sa DCM (200 mL) i oprana sa 1N HCl (300 mL), zasićenim NaHCO3(300 mL), rasolom (400 mL), osušena (MgSO4), filtrirana i rastvarač je isparen u vakuumu kako bi se dobio čist proizvod 6 kao narandžasta čvrsta supstanca (66,7 g, 100%). [α]<22>1
D= -46,1° (c = 0,47, CHCl3); H NMR (400 MHz, CDCl3) (rotameri) δ 7,63 (s, 2H), 6,82 (s, 2H), 4,79-4,72 (m, 2H), 4,49-4,28 (m, 6H), 3,96 (s, 6H), 3,79 (s, 6H), 3,46-3,38 (m, 2H), 3,02 (d, 2H, J = 11,1 Hz), 2,48-2,30 (m, 4H), 2,29-2,04 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (rotameri) δ 172,4, 166,7, 154,6, 148,4, 137,2, 127,0, 109,7, 108,2, 69,7, 65,1, 57,4, 57,0, 56,7, 52,4, 37,8, 29,0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 721 ([M H]+., 47), 388 (80); HRMS [M H]+ . Teoretski C31H36N4O16m/z 721,2199, otkriven (ES+) m/z 721,2227.
(e) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS,2R)-2-(hidroksi)-7-metoksi-1,2,3,10,11,11aheksahidro-5H-pirolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (7)
[0286] Postupak A: Rastvor nitro-estara 6 (44 g, 61,1 mmol) u MeOH (2,8 L) je dodat sveže nabavljenom Raney® niklu (∼ 50 g od ∼ 50% suspenzija u H2O) i granulama protiv zgrušnjavanja u 5L bocu sa ravnim dnom i tri grla. Smeša je zagrejana na refluks i zatim tretirana kapanjem sa rastvorom hidrazin hidrata (21,6 mL, 22,2 g, 693 mmol) u MeOH (200 mL) i u tom trenutku je primećena snažna pobuđenost. Kada je dodavanje završeno (∼ 45 minuta) dodatni Raney® nikl je dodat pažljivo dok pobuđenosti nije prestala i početna žuta reakciona smeše je otpuštena. Smeša je zagrejana na refluks tokom dodatnih 5 minuta i u tom trenutku reakcija je procenjena da je završena pomoću TLC (90:10 v/v CHCl3/MeOH) i LC/MS (2,12 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 597 ([M H]<+.>, 100)). Reakciona smeša je filtrirana vruća neposredno potom kroz sinter levak koji sadrži celit sa vakuumskom sukcijom. Filtratu je redukovana zapremina isparavanjem u vakuumu i u tom trenutku bezbojni talog se formirao i prikupljen je filtriranjem i osušen u vakuumskom disekatoru kako bi se dobilo 7 (31 g, 85%). [α]<27>
D= 404° (c = 0,10, DMF); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,2 (s, 2H, NH), 7,26 (s, 2H), 6,73 (s, 2H), 5,11 (d, 2H, J = 3,98 Hz, OH), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,19-4,07 (m, 6H), 3,78 (s, 6H), 3,62 (dd, 2H, J = 12,1, 3,60 Hz), 3,43 (dd, 2H, J = 12,0, 4,72 Hz), 2,67-2,57 (m, 2H), 2,26 (p, 2H, J = 5,90 Hz), 1,99-1,89 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 169,1, 164,0, 149,9, 144,5, 129,8, 117,1, 111,3, 104,5, 54,8, 54,4, 53,1, 33,5, 27,5; IR (ATR, neat) 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 619 ([M Na]+., 10), 597 ([M H]+., 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M H]+ . Teoretski C29H32N4O10m/z 597,2191, otkriven (ES+) m/z 597,2205.
[0287] Postupak B: Suspenzija 10% Pd/C (7,5 g, 10% w/w) u DMF (40 mL) je dodata rastvoru nitro-estara 6 (75 g, 104 mmol) u DMF (360 mL). Suspenzija je hidrogenizovana u Parr uređaju za hidrogenizaciju tokom 8 sati. Napredak reakcije je praćen pomoću LC/MS nakon što je unos vodonika zaustavljen. Čvrsta supstanca Pd/C je uklonjen filtriranjem i filtrat je koncentrisani rotacionim isparavanjem pod vakuumom (ispod 10mbar) na 40°C kako bi se dobilo tamno ulje koji sadrži tragove od DMF i rezidualni ugalj. Ostatak je digestiran u EtOH (500 mL) na 40°C na vodenoj kadi (kada rotacionog isparavanja) i rezultujuća suspenzija je filtrirana kroz celit i oprana sa etanolom (500 mL) kako bi se dobio bistar filtrat. Hidrazin hidrat (10 mL, 321 mmol) je dodat rastvoru i reakciona smeša je zagrejana na refluks. Nakon 20 minuta formiranje belog taloga je primećeno i refluksu je omogućeno da nastavi tokom dodatnih 30 minuta. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i talog je prikupljen filtriranjem, opran sa dietil etrom (2:1 zapremina taloga) i osušen u vakuumskom disekatoru kako bi se dobilo 7 (50 g, 81%). Analitički podaci za postupak B: Identični gore dobijenim za Postupak A (optička rotacija,<1>H NMR, LC/MS i TLC).
(f) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (8)
[0288] TBSCl (27,6 g, 182,9 mmol) i imidazol (29,9 g, 438,8 mmol) su dodati maglovitom rastvoru tetralaktama 7 (21,8 g, 36,6 mmol) u nevodenom DMF (400 mL) na 0°C (led/aceton). Smeši je omogućeno da se meša pod atmosferom azota tokom 3 sata nakon čega je reakcija procenjena da je završena što je zaključeno pomoću LC/MS (3,90 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 825 ([M H]<+.>, 100). Reakciona smeša je sipana na led (∼ 1,75 L) i omogućeno joj je da se zagreje do sobne temperature sa mešanjem. Rezultujući beli talog je prikupljen vakuumskim filtriranjem, opran sa H2O, dietil etrom i osušen u vakuumskom desukatiru kako bi se dobio čist 8 (30,1 g, 99%). [α]<23>
D= 234° (c = 0,41, CHCl 1
3); H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,65 (s, 2H, NH), 7,44 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 4,50 (p, 2H, J = 5,38 Hz), 4,21-4,10 (m, 6H), 3,87 (s, 6H), 3,73-3,63 (m, 4H), 2,85-2,79 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 2H), 2,07-1,99 (m, 2H), 0,86 (s, 18H), 0,08 (s, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170,4, 165,7, 151,4, 146,6, 129,7, 118,9, 112,8, 105,3, 69,2, 65,4, 56,3, 55,7, 54,2, 35,2, 28,7, 25,7, 18,0, -4,82 i -4,86; IR (ATR, CHCl3) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 825 ([M H]+., 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M H]+ . Teoretski C41H60N4O10Si2m/z 825,3921, otkriven (ES+) m/z 825,3948.
(g) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS, R)-2-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (9)
[0289] Rastvor n-BuLi (68,3 mL od 1,6 M rastvor u heksanu, 109 mmol) je dodat kapanjem mešanoj suspenziji tetralaktama 8 (30,08 g, 36,4 mmol) u nevodenom THF (600 mL) na -30°C (suvi led/etilen glikol) pod atmosferom azota. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na ovoj temperaturi tokom 1 sata (sada crvenkasto narandžaste boje) i u tom trenutku rastvor SEMC1 (19,3 mL, 18,2 g, 109 mmol) u nevodenom THF (120 mL) je dodat kapanjem. Reakcionoj smeši je omogućeno do se polako zagreje do sobne temperature i mešana je tokom 16 sati pod atmosferom azota. Reakcija je procenjena da je završena što je zaključeno pomoću TLC (EtOAc) i LC/MS (4,77 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1085 ([M H]<+.>, 100). THF je uklonjen isparavanjem u vakuumu i rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc (750 mL), opran sa H2O (250 mL), rasolom (250 mL), osušen (MgSO4) filtriran i isparen u vakuumu kako bi se dobio sirov N10-SEM-zaštićen tetralaktam 9 kao ulje (maxm 39,5 g, 100%). Proizvod je prenesen u sledeći korak bez pročišćavanja. [α]<23>
D= 163° (c = 0,41, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 2H), 7,22 (s, 2H), 5,47 (d, 2H, J = 9,98 Hz), 4,68 (d, 2H, J = 9,99 Hz), 4,57 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 4,29-4,19 (m, 6H), 3,89 (s, 6H), 3,79-3,51 (m, 8H), 2,87-2,81 (m, 2H), 2,41 (p, 2H, J = 5,81 Hz), 2,03-1,90 (m, 2H), 1,02-0,81 (m, 22H), 0,09 (s, 12H), 0,01 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170,0, 165,7, 151,2, 147,5, 133,8, 121,8, 111,6, 106,9, 78,1, 69,6, 67,1, 65,5, 56,6, 56,3, 53,7, 35,6, 30,0, 25,8, 18,4, 18,1, -1,24, -4,73; IR (ATR, CHCl3) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1113 ([M Na]+., 48), 1085 ([M H]+., 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M H]+ . Teoretski C53H88N4O12Si4m/z 1085,5548, otkriven (ES+) m/z 1085,5542.
(h) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS,2R)-2-hidroksi-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,1]a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (10)
[0290] Rastvor TBAF (150 mL od 1,0 M rastvor u THF, 150 mmol) je dodat mešanom rastvoru sirovog bis-silil etara 9 [84,0 g (maxm 56,8 g), 52,4 mmol] u THF (800 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja tokom 1 sata, analiza reakcione smeše pomoću TLC (95:5 v/v CHCl3/MeOH) otkrila je završetak reakcije. THF je uklonjen isparavanjem pod redukovanim pritiskom na sobnoj temperaturi i rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc (500 mL) i opran sa NH4Cl (300 mL). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom (60 mL), osušeni (MgSO4), filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Pročišćavanje fleš hromatografijom (gradijent eluiranje: 100% CHCl3do 96:4 v/v CHCl3/MeOH) dalo je čist tetralaktam 10 kao belu penu (36,0 g, 79%). LC/MS 3,33 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 879 ([M Na]+., 100), 857 ([M H]<+.>, 40); [α]<23>
D= 202° (c = 0,34, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,28 (s, 2H), 7,20 (s, 2H), 5,44 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,72 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,61-4,58 (m, 2H), 4,25 (t, 4H, J = 5,83 Hz), 4,20-4,16 (m, 2H), 3,91-3,85 (m, 8H), 3,77-3,54 (m, 6H), 3,01 (br s, 2H, OH), 2,96-2,90 (m, 2H), 2,38 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 2,11-2,05 (m, 2H), 1,00-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 169,5, 165,9, 151,3, 147,4, 133,7, 121,5, 111,6, 106,9, 79,4, 69,3, 67,2, 65,2, 56,5, 56,2, 54,1, 35,2, 29,1, 18,4, -1,23; IR (ATR, CHCl3) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 885 ([M 29]+., 70), 857 ([M H]+., 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M H]+ . Teoretski C41H60N4O12Si2m/z 857,3819, otkriven (ES+) m/z 857,3826.
(i) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS)-7-metoksi-2-okso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,2,3,10,11,11a-heksahidro-5H-pirolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (11)
[0291] Diol 10 (25,6 g, 30 mmol, 1 ekvivalent), NaOAc (6,9 g, 84 mmol, 2,8 ekvivalent) i TEMPO (188 mg, 1,2 mmol, 0,04 ekvivalent) su rastvoreni u DCM (326 mL) pod Ar. Ovo je ohlađeno do -8°C (unutrašnja temperatura) i TCCA (9,7 g, 42 mmol, 1,4 ekvivalent) je dodat iz delova tokom 15 minuta. TLC (EtOAc) i LC/MS [3,60 minuta. (ES+) m/z (relativan intenzitet) 854,21 ([M H]+., 40), (ES-) m/z (relativan intenzitet) 887,07 ([M - H Cl]-., 10)] nakon 30 minuta su ukazali da je reakcija završena. Hladni DCM (200 mL) je dodat i smeša je filtrirana kroz celitnu ploču pre pranja sa rastvorom zasićenim natrijum vodonik karbonat/ natrijum tiosulfatom (1:1 v/v; 200 mL x 2). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu kako bi se dobio žuti/narandžasti sunđer (25,4 g, 99%). LC/MS [3,60 minuta. (ES+) m/z (relativan intenzitet) 854,21 ([M H]<+.>, 40); [α]<20>
D= 291° (c = 0,26, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,32 (s, 2H), 7,25 (s, 2H), 5,50 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,75 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,60 (dd, 2H, J = 9,85, 3,07 Hz), 4,31-4,18 (m, 6H), 3,89-3,84 (m, 8H), 3,78-3,62 (m, 4H), 3,55 (dd, 2H, J = 19,2, 2,85 Hz), 2,76 (dd, 2H, J = 19,2, 9,90 Hz), 2,42 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 0,98-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 206,8, 168,8, 165,9, 151,8, 148,0, 133,9, 120,9, 111,6, 107,2, 78,2, 67,3, 65,6, 56,3, 54,9, 52,4, 37,4, 29,0, 18,4, -1,24; IR (ATR, CHCl3) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm- 1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 881 ([M 29]+., 38), 853 ([M H]+., 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M H]+ . Teoretski C41H56N4O12Si2m/z 853,3506, otkriven (ES+) m/z 853,3502.
(j) 1,1'-[[(propan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS)-7-metoksi-2-[[(trifluorometil)sulfonil]oksi]-10((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,10,11,11a-tetrahidro-5H-pirolo[2,7-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-dion] (12)
[0292] Nevodeni 2,6-lutidin (5,15 mL, 4,74 g, 44,2 mmol) je injektiran iz jednog dela snažno mešanom rastvoru bis-ketona 11 (6,08 g, 7,1 mmol) u suvom DCM (180 mL) na -45°C (suvi led/acetonitril) pod atmosferom azota. Nevodeni trifilični anhidrid, uzet iz sveže otvorene ampule (7,2 mL, 12,08 g, 42,8 mmol), je injektiran brzo kapanjem, uz održavanje temperature na -40°C ili ispod. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na -45°C tokom 1 sata i u tom trenutku je TLC (50/50 v/v n-heksan/EtOAc) otkrio završenu potrošnju početnog materijala. Hladna reakciona smeša je neposredno potom rastvorena sa DCM (200 mL) i, uz snažno mešanje, oprana sa vodom (1 x 100 mL), 5% rastvorom limunske kiseline (1 x 200 mL) zasićenim NaHCO3(200 mL), rasolom (100 mL) i osušena (MgSO4). Filtriranje i isparavanje rastvarača pod redukovanim pritiskom dalo je sirov proizvod koji je pročišćen hromatografijom fleš kolone (gradijent eluiranje: 90:10 v/v n-heksan/EtOAc do 70:30 v/v nheksan/EtOAc) kako bi se dobilo bis-enol triflat 12 kao žuta pena (5,5 g, 70%). LC/MS 4,32 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1139 ([M Na]<+.>, 20); [α]<24>
D= 271° (c = 0,18, CHCl 1
3); H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,33 (s, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,14 (t, 2H, J = 1,97 Hz), 5,51 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,76 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,62 (dd, 2H, J = 11,0, 3,69 Hz), 4,32-4,23 (m, 4H), 3,94-3,90 (m, 8H), 3,81-3,64 (m, 4H), 3,16 (ddd, 2H, J = 16,3, 11,0, 2,36 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,85 Hz), 1,23-0,92 (m, 4H), 0,02 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,1, 162,7, 151,9, 148,0, 138,4, 133,6, 120,2, 118,8, 111,9, 107,4, 78,6, 67,5, 65,6, 56,7, 56,3, 30,8, 29,0, 18,4, -1,25; IR (ATR, CHCl3) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm-1; MS (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1144 ([M 28]+., 100), 1117 ([M H]+., 48), 1041 (40), 578 (8); HRMS [M H]+ . Teoretski C 91, otkriven (ES+
43H54N4O16Si2S2F6m/z 1117,24 ) m/z 1117,2465.
(a) (S)-8-(3-(((S)-2-(4-aminofenil)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il trifluorometansulfonat (13)
[0293] Pd(PPh3)4(116,9 mg, 0,101 mmol) je dodat mešanoj smeši bis-enol triflata 12 (5,65 g, 5,06 mmol), 4-Aminofenilboronska kiselina pinakol estara (1 g, 4,56 mmol), Na2CO3(2,46 g, 23,2 mmol), MeOH (37 mL), toluena (74 mL) i vode (37 mL). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 30°C pod atmosferom azota tokom 24 sata nakon čega je sav boronski estar potrošen. Reakciona smeša je zatim isparena do suvoće pre nego što je ostatak uzet u EtOAc (150 mL) i opran sa H2O (2 x 100 mL), rasolom (150 mL), osušen (MgSO4), filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Pročišćavanje fleš hromatografijom (gradijent eluiranje: 80:20 v/v heksan/EtOAc do 60:40 v/v heksan/EtOAc) dalo je proizvod 13 kao žućkastu penu (2,4 g, 45%). LC/MS 4,02 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1060,21 ([M H]+., 100); 1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7,40 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,27 (bs, 3H), 7,24 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,15 (t, 1H, J = 2,0 Hz), 6,66 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,52 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,77 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,76 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,62 (dd, 1H, J = 3,7, 11,0 Hz), 4,58 (dd, 1H, J = 3,4, 10,6 Hz), 4,29 (t, 4H, J = 5,6 Hz), 4,00-3,85 (m, 8H), 3,80 - 3,60 (m, 4H), 3,16 (ddd, 1H, J = 2,4, 11,0, 16,3 Hz), 3,11 (ddd, 1H, J = 2,2, 10,5, 16,1 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,9 Hz), 1,1-0,9 (m, 4H), 0,2 (s, 18H).13CNMR: (CDCl3, 100 MHz) δ 169,8, 168,3, 164,0, 162,7, 153,3, 152,6, 149,28, 149,0, 147,6, 139,6, 134,8, 134,5, 127,9, 127,5, 125,1, 123,21, 121,5, 120,5, 120,1, 116,4, 113,2, 108,7, 79,8, 79,6, 68,7, 68,5, 67,0, 66,8, 58,8, 58,0, 57,6, 32,8, 32,0, 30,3, 19,7, 0,25.
(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-5,11(10H,11aH)-dion (14)
[0294] Trifenilarsin (0,24 g, 0,8 mmol), srebro (I) oksid (1,02 g, 4,4 mmol), ciklopropilboronska kiselina (0,47 g, 5,5 mmol) i početni materijal 13 (1,15 g, 1,1 mmol) su rastvoreni u dioksanu (30 mL) pod atmosferom azota. Trobazni kalijum fosfat (2,8 g, 13,2 mmol) je zdrobljen sa tučkom i malterom i brzo dodat reakcionoj smeši. Reakciona smeša je evakuisana i isprana sa argonom 3 puta i zagrejana do 71°C. Paladijum (II) bis (benzonitril hlorid) (84 mg, 0,22 mmol) je dodat i reakciona posuda je evakuisana i isprana sa argonom 3 puta. Nakon 10 minuta mali uzorak je uzet za analizu pomoću TLC (80:20 v/v etil acetat/heksan) i LC/MS. Nakon 30 minuta reakcija je završena (LC/MS analiza je ukazala na završenu potrošnju početnog materijala) i reakcija je filtrirana kroz celit i filter ploču opranu sa etil acetatom (400 mL). Filtrat je opran sa vodom (2 x 200 mL) i rasolom (2 x 200 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (30:70 v/v heksan/etil acetat) dalo je proizvod 14 kao narandžasto/žutu čvrstu supstancu (0,66 g, 63%). Postupak 1, LC/MS (3,85 minuta (ES<+>) m/z (relativan intenzitet) 952,17 ([M H]+., 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,30 (s, 1H), 7,25 - 7,19 (m, 4H), 6,68 (s, 1H), 6,62 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,49 (dd, 2H, J = 5,6, 10,0 Hz), 4,73 (app. T, 2H, J = 10,8 Hz), 4,54 (dd, 1H, J = 3,2, 10,4 Hz), 4,40 (dd, 1H, J= 3,2, 10,4 Hz), 4,29 - 4,23 (m, 4H), 3,91 - 3,85 (m, 7H), 3,80 - 3,71 (m, 2H), 3,70 - 3,61 (m, 2H), 3,38 - 3,32 (m, 1H), 3,12 - 3,01 (m, 1H), 2,50 - 2,69 (m, 1H), 2,40 (q, 2H, J= 5,6 Hz), 1,50 - 1,43 (m, 1H), 0,99 - 0,71 (m, 6H), 0,54 - 0,59 (m, 2H), 0,00 (s, 18H) ppm. (c) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11aH)-on (15)
[0295] SEM dilaktam 14 (0,66 g, 0,69 mmol) je rastvoren u THF (23 mL) i ohlađen do -78°C pod atmosferom azota. Super-Hydride® rastvor (1,7 mL, 1 M u THF) je dodat kapanjem tokom 5 minuta uz praćenje temperature. Nakon 20 minuta mali uzorak je uzet i opran sa vodom za LC/MS analizu. Voda (50 mL) je dodata i hladna kada je uklonjena. Organski sloj je ekstrakovan i opran sa rasolom (60 mL). Kombinovani vodeni slojevi su oprani sa CH2Cl2/MeOH (90/10 v/v) (2 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirov proizvod je rastvoren u MeOH (48 mL), CH2Cl2(18 mL) i vodi (6 mL) i dovoljno silika gela je dodato kako bi se dobila gusta suspenzija. Nakon 5 dana mešanja, suspenzija je filtrirana kroz sinterovan levak i oprana je sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (∼ 200 mL) dok proizvod nije prestao da se eluira. Organski sloj je opran sa rasolom (2 x 70 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (100% CHCl3do 96/4 v/v CHCl3/MeOH) dalo je proizvod 15 kao žutu čvrstu supstancu (302 mg, 66%). Postupak 1, LC/MS (2,42 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 660,74 ([M H]+., 30).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,86 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,58 - 7,44 (m, 3H), 7,34 - 7,20 (m, 3H), 6,88 - 6,66 (m, 4H), 4,35 - 4,15 (m, 6H), 3,95 - 3,75 (m, 7H), 3,39 - 3,22 (m, 1H), 3,14 - 3,04 (m, 1H), 2,93 - 2,85 (m, 1H), 2,46 - 2,36 (m, 2H), 1,49 - 1,41 (m, 1H), 0,80 - 0,72 (m, 2H), 0,58 - 0,51 (app. S, 2H) ppm.
(d) Alil ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (16)
[0296] U degaziranoj boci sa okruglim dnom napunjenoj sa argonom, HO-Ala-Val-alloc (149,6 mg, 0,549 mmol) i EEDQ (135,8 mg, 0,549 mmol) su rastvoreni u 9:1 smeši suvog CH2Cl2/MeOH (5 mL). Boca je umotana u aluminijumsku foliju i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata pre nego što je početni materijal 15 (302 mg, 0,457 mmol) dodat. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom dodatnih 40 sati na sobnoj temperaturi pre nego što su isparljive supstance uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom (reakcija je praćena pomoću LC/MS, RT početni materijal 2,32 minuta, (ES+ 660,29 ([M+H]<+.>,100)). Sirov proizvod je direktno pročišćen hromatografijom silika gel kolone (100% CHCl3do 90/10 v/v CHCl3/MeOH) kako bi se dobilo čist proizvod (16) pri 42% prinosu (174 mg). Postupak 2 LC/MS (2,70 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 914,73 ([M+H]+., 60), 660,43 (60), 184,31 (100)).
(e) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (17)
[0297] Početni materijal 16 (170 mg, 0,185 mmol) je rastvoren u suvom CH2Cl2(5 mL) u boci sa okruglim dnom napunjenoj sa argonom, pre nego što je pirolidin (41 µL, 0,21 mmol) dodat. Boca je isprana/napunjena tri puta sa argonom pre nego što je Pd(PPh3)4(14 mg, 0,084 mmol) dodat i operacija ispiranja je ponovljena. Nakon 1 sata, primećeno je da je završena potrošnja početnog materijala ( reakcija je praćena pomoću LC/MS) i Et2O (50 mL) je dodat reakcionoj smeši kojoj je omogućeno da se meša dok sav proizvod nije ispao iz rastvora. Čvrsta supstanca je filtrirana kroz sinterovan levak i oprana dvaput sa Et2O (2 x 25 mL). Boca za prikupljanje je zamenjena i izolovana čvrsta supstanca je rastvorena u CHCl3(100 mL ili dok sav proizvod nije prošao kroz sinterovan levak). Isparljive supstance su zatim uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod 17 koji je direktno korišćen u sledećem koraku (168 mg). LC/MS postupak 2 (2,70 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 830,27 ([M+H]+., 50), 660,13 (80), 171,15 (100)). (f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptakosan-27-amid (18 ili DL1)
[0298] Početni materijal 17 (154 mg, 0,185 mmol) i EDCI.HCl (110 mg, 0,185 mmol) su suolubilizovani u suvom CH2Cl2(5 mL) u boci sa okruglim dnom ispranoj i napunjenoj sa argonom. Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata pre nego što je PEG8-maleimid (35,6 mg, 0,185 mmol) dodat i reakciona smeša mešana tokom dodatnih 16 sati (ili dok reakcija nije završena, praćeno pomoću LC/MS). Reakcioni rastvor je rastvoren sa CH2Cl2(50 mL) i organske materije su oprane sa H2O (50 mL) i rasolom (50 mL) pre nego što su osušene sa MgSO4, filtrirane i rastvarač uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Pročišćavanje na hromatografiji silika gel kolone (100% CHCl3do 85/15 v/v CHCl3/MeOH) dalo je željeni proizvod (135mg), međutim primećeni su preostali tragovi nereagovanog PEG8-maleimida (pomoću LC/MS, 2,21 minuta, postupak 2). Automatizovana reverzno fazna hromatografija silika gela (H2O/CH3CN) (pogledati opšte informacije za uslove) uspešno je uklonila nečistoće dajući čist finalni proizvod (18, 37mg čistog proizvoda počevši od 110mg, 33%). Ukupan prinos = 17%. Postupak 2 LC/MS (2,58 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1404,03 ([M+H]+., 20), 702,63 (100)).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 - 3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1, 4,1 Hz, 1H), 2,62 - 2,49 (m, 4H), 2,48 - 2,39 (m, 2H), 2,37 - 2,25 (m, 1H), 1,92 (s, 1H), 1,52 - 1,44 (m, 3H), 1,10 -0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH nije primećen.
C. Sinteza lek-veznika DL1 (Način 2)
[0299]
(a) (R)-2-((R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido) propanska kiselina (20b)
[0300] HO-Ala-Val-H 20a (350 mg, 1,86 mmol) i Na2CO3(493 mg, 4,65 mmol) su rastvoreni u destilovanoj H2O (15 mL) i smeša je ohlađena do 0°C pre nego što je dioksan (15 mL) dodat (javilo se delimično taloženje soli aminokiseline). Rastvor Fmoc-Cl (504 mg, 1,95 mmol) u dioksanu (15 mL) je dodat kapanjem sa snažnim mešanjem tokom 10 minuta. Rezultujuća smeša je mešana na 0°C tokom 2 sata pre nego što je ledena kada uklonjena i mešanje je održavano tokom 16 sati. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom i ostatak je rastvoren u vodi (150 mL). pH je prilagođen od 9 do 2 sa u HCl i vodeni sloj je potom ekstrakovan sa EtOAc (3x100 mL). Kombinovane organske materije su oprane sa rasolom (100 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i isparljive supstance su uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio čist HO-Ala-Val-Fmoc 20b (746 mg, 97% prinos). LC/MS 2,85 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 410,60 ; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,79 (d, J=7,77 Hz, 2H), 7,60(d, J=7,77 Hz, 2H), 7,43(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,34 (d, J=7,5 Hz, 2H), 6,30 (bs, 1H), 5,30 (bs, 1H), 4,71-7,56 (m, 1H), 4,54-4,36 (m, 2H), 4,08-3,91 (m, 1H), 2,21-2,07 (m, 1H), 1,50 (d, J=7,1 Hz, 3H), 1,06-0,90 (m, 6H).
(b) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-3-metil-1-okso-1-(((S)-1-okso-1-((4-(4,4, 5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)amino)propan-2-il)amino)butan-2-il)karbamat (20)
[0301] 4-Aminofenilboronska kiselina pinakol estart (146,9 mg, 0,67 mmol) je dodat rastvoru HO-Ala-Val-Fmoc 20b (330mg, 0,8 mmol), DCC (166 mg, 0,8 mmol) i DMAP (5 mg, katalizator) u suvi DCM (8 mL) prethodno mešan tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u boci ispranoj sa argonom. Reakcionoj smeši je zatim omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je praćena sa LCMS i TLC. Reakciona smeša je rastvorena sa CH2Cl2i organske materije su oprane sa H2O i rasolom pre nego što su osušene sa MgSO4, filtrirane i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je suv postavljen na hromatografiju silika gel kolone (heksan/EtOAc, 6:4) i čist proizvod 20 je izolovan kao bela čvrsta supstanca sa 88% prinosom (360 mg).
(c) 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoksi)karbonil)amino)-3-metilbutanamido)propanamido)fenil)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11atetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il trifluorometansulfonat (21)
[0302] Bis-triflat 12 (2,03g, 1,81 mmol), boronski pinakol estar (1g, 1,63 mmol) i Na2CO3(881 mg, 8,31 mmol) su rastvoreni u smeši toluen/MeOH/H2O, 2:1:1 (40 mL). Reakciona boca je isprana i napunjena sa argonom tri puta pre nego što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (41 mg, 0,035 mmol) dodat i reakciona smeša zagrejana do 30°C preko noći. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom i ostatak je uzet u H2O (100 mL) i ekstrakovan sa EtOAc (3 x 100 mL). Kombinovane organske materije su oprane sa rasolom (100 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i isparljive supstance su uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je pročišćen hromatografijom silika gel kolone (heksan/EtOAc, 8:2 do 25:75) kako bi se dobio čist 21 pri 33% prinosu (885 mg). LC/MS 3,85 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1452,90 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,78 - 7,16 (m, 17H), 7,13 (s, 1H), 6,51 - 6,24 (m, 1H), 5,51 (dd, J = 10,0, 5,1 Hz, 2H), 5,36 - 5,11 (m, 1H), 4,74 (dd, J = 10,1, 4,4 Hz, 2H), 4,70 - 4,53 (m, 2H), 4,47 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,37 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,27 (m, 4H), 4,20 - 4,14 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,77 (ddd, J = 16,7, 9,0, 6,4 Hz, 3H), 3,71 - 3,61 (m, 2H), 3,24 -2,91 (m, 3H), 2,55 - 2,33 (m, 2H), 2,22 - 2,07 (m, 1H), 1,52 - 1,37 (m, 3H), 1,04 - 0,86 (m, 10H), 0,00 (s, 18H).
(d) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (22)
[0303] Trifenilarsin (42 mg, 0,137 mmol) je dodat smeši PBD-triflata 21 (250 mg, 0,172 mmol), ciklopropilboronske kiseline (73,9 mg, 0,86 mmol), srebro oksida (159 mg, 0,688 mmol) i trobaznog kalijum fosfata (438 mg, 2,06 mmol) u suvom dioksanu (10 mL) pod atmosferom azota. Reakcija je isprana sa argonom 3 puta i bis(benzonitril)paladijum(II) hlorid (13,2 mg, 0,034 mmol) je dodat. Reakcija je isprana sa argonom još 3 puta pre nego što je zagrejana do 75°C i mešana je tokom 10 minuta. Reakciona smeša je filtrirana kroz celitnu ploču koja je potom isprana sa etil acetatom. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 1 % metanol/hloroform). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio željeni proizvod 22 (132 mg, 50 % prinos). LC/MS 3,83 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1345,91 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,88 - 7,14 (m, 17H), 6,69 (s, 1H), 6,45 -6,25 (m, 1H), 5,57 - 5,41 (m, 2H), 5,34 - 5,14 (m, 1H), 4,78 - 4,67 (m, 2H), 4,62 - 4,55 (m, 1H), 4,50 - 4,45 (m, 2H), 4,51 - 4,44 (m, 1H), 4,31 - 4,21 (m, 4H), 4,16 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,82 - 3,71 (m, 2H), 3,66 (m, 3H), 3,40 - 3,28 (m, 1H), 3,07 (m, 1H), 2,70 - 2,57 (m, 1H), 2,47 - 2,36 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,51 - 1,40 (m, 3H), 1,03 - 0,87 (m, 11H), 0,77 -0,71 (m, 2H), 0,60 - 0,54 (m, 2H), 0,00 (t, J = 3,0 Hz, 18H).
(e) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (23)
[0304] Rastvor Super-Hydride® (0,5 mL, 1M u THF) je dodat kapanjem rastvoru SEM dilaktama 22 (265 mg g, 0,19 mmol) u THF (10 mL) na -78°C pod atmosferom azota.
Dodavanje je završeno tokom 5 minuta kako bi se unutrašnja temperatura reakcione smeše održala konstantnom. Nakon 20 minuta, alikvot je ugašen sa vodom za LC/MS analizu, što je otkrilo da je reakcija završena. Voda (20 mL) je dodata reakcionoj smeši i hladna kada je uklonjena. Organski sloj je ekstrakovan sa EtOAc (3 x 30 mL) i kombinovane organske materije su oprane sa rasolom (50 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je rastvoren u MeOH (12 mL), CH2Cl2(6 mL), voda (2 mL) i dovoljno silika gela da se formira gusta suspenzija mešanja. Nakon 5 dana, suspenzija je filtrirana kroz sinterovan levak i opran sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (200 mL) dok eluiranje proizvoda nije završeno. Organski sloj je opran sa rasolom (2 x 70 mL), osušen sa MgSO4, filtrirana i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (100% CHCl3do 96% CHCl3/ 4% MeOH) dalo je proizvod 23 kao žutu čvrstu supstancu (162 mg, 78%). LC/MS 3,02 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1052,37.
(f) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (17)
[0305] Višak piperidina je dodat (0,2 mL, 2 mmol) rastvoru SEM-dilaktam 23 (76 mg, 0,073 mmol) u DMF (1 mL). Smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta, i u tom trenutku reakcija je završena (kako je praćeno pomoću LC/MS). Reakciona smeša je rastvorena sa CH2Cl2(75 mL) i organska faza je oprana sa H2O (3x75 mL) dok uklanjanje piperidina nije završeno. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana je i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod 17 koji je korišćen kao takav u sledećem koraku. LC/MS 2,32 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 830,00.
(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciklopropil-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptakosan-27-amid (18 ili DL 1)
[0306] EDCI hidrohlorid (14 mg, 0,0732 mmol) je dodat suspenziji Maleimid-PEG8-kiselina (43,4 mg, 0,0732 mmol) u suvom CH2Cl2(5 mL) pod atmosferom azota. Smeša je mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi pre nego što je PBD 17 (60,7 mg, 0,0732 mmol) dodat. Mešanje je održavano dok reakcija nije završena (obično 5 sati). Reakcija je rastvorena sa CH2Cl2i organska faza je oprana sa H2O i rasolom pre nego što je osušena preko MgSO4, filtrirana i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Proizvod je pročišćen pažljivom hromatografijom silika gela (sporo eluiranje počevši sa 100% CHCl3sve do 9:1 CHCl3/MeOH) praćeno hromatografijom reverzne faze kako bi se uklonila nereagovana maleimid-PEG8-kiselina. Proizvod 18 (DL1) je izolovan u 17,6% (21,8 mg). LC/MS 2,57 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1405,30 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,54 - 7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 -3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1, 4,1 Hz, 1H), 2,62 - 2,49 (m, 4H), 2,48 - 2,39 (m, 2H), 2,37 - 2,25 (m, 1H), 1,92 (s, 1H), 1,52 - 1,44 (m, 3H), 1,10 - 0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH nije primećen.
D. Sinteza lek-veznika DL2 (Način 1)
[0307]
(a) (S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il trifluorometansulfonat (24)
[0308] Pd(PPh3)4(20,6 mg, 0,018 mmol) je dodat mešanoj smeši bis-enol triflata 12 (500 mg, 0,44 mmol), N-metil piperazin boronskog estra (100 mg, 0,4 mmol), Na2CO3(218 mg, 2,05 mmol), MeOH (2,5 mL), toluena (5 mL) i vode (2,5 mL). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 30°C pod atmosferom azota tokom 24 sata nakon čega je sav boronski estar potrošen. Reakciona smeša je zatim isparena do suvoće pre nego što je ostatak uzet u EtOAc (100 mL) i opran sa H2O (2 x 50 mL), rasolom (50 mL), osušen (MgSO4), filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Pročišćavanje fleš hromatografijom (gradijent eluiranja: 80:20 v/v heksan/EtOAc do 60:40 v/v heksan/EtOAc) dalo je proizvod 24 kao žućkastu pena (122,6 mg, 25%).
LC/MS 3,15 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1144 ([M H]+., 20%).
(b) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11atetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5,11-diokso-10-((2(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (25)
[0309] PBD-triflat 24 (359 mg, 0,314 mmol), boronski pinakol estar 20 (250 mg, 0,408 mmol) i trietilamin (0,35 mL, 2,51 mmol) su rastvoreni u smeši toluen/MeOH/H2O, 2:1:1 (3 mL). Mikrotalasni sud je ispran i napunjen sa argonom tri puta pre nego što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (21,7 mg, 0,018 mmol) dodat i reakciona smeša je smeštena u mikrotalasnu na 80°C tokom 10 minuta. Potom, CH2Cl2(100 mL) je dodato i organske materije su oprane sa vodom (2 x 50 mL) i rasolom (50 mL) pre nego što su osušene sa MgSO4, filtrirane i isparljive supstance uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je pročišćen hromatografijom silika gel kolone (CHCl3/MeOH, 100% do 9:1) kako bi se dobio čist 25 (200 mg, 43% prinos). LC/MS 3,27 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1478 ([M H]+., 100%).
(c) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (26)
[0310] Rastvor Super-Hydride® (0,34 mL, 1M u THF) je dodat kapanjem rastvoru SEM-dilaktama 25 (200 mg, 0,135 mmol) u THF (5 mL) na -78°C pod atmosferom azota.
Dodavanje je završeno tokom 5 minuta kako bi se unutrašnja temperatura reakcione smeše održala konstantnom. Nakon 20 minuta, alikvot je ugašen sa vodom za LC/MS analizu, što je otkrilo da je reakcija završena. Voda (20 mL) je dodata reakcionoj smeši i hladna kada je uklonjena. Organski sloj je ekstrakovan sa EtOAc (3 x 30 mL) i kombinovane organske materije su oprane sa rasolom (50 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je rastvoren u MeOH (6 mL), CH2Cl2(3 mL), vodi (1 mL) i dovoljno silika gela da se formira gusta suspenzija mešanja. Nakon 5 dana, suspenzija je filtrirana kroz sinterovan levak i oprana sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) dok eluiranje proizvoda nije završeno. Organski sloj je opran sa rasolom (2 x 50 mL), osušeno sa MgSO4, filtrirano i rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (100% CHCl3do 96% CHCl3/ 4% MeOH) dalo je proizvod 26 kao žutu čvrstu supstancu (100 mg, 63%). LC/MS 2,67 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1186 ([M H]+., 5%).
(d) (S)-2-amino-N-((S)-]-((4-((R)-7-metoksi-8-(3-(((R)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (27)
[0311] Višak piperidina je dodat (0,1 mL, 1 mmol) rastvoru PBD 26 (36,4 mg, 0,03 mmol) u DMF (0,9 mL). Smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta, i u tom trenutku reakcija je završena (kako je praćeno pomoću LC/MS). Reakciona smeša je rastvorena sa CH2Cl2(50 mL) i organska faza je oprana sa H2O (3 x 50 mL) dok uklanjanje piperidina nije završeno. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod 27 koji je korišćen kao takav u sledećem koraku. LC/MS 2,20 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 964 ([M H]+., 5%).
(e) 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)heksanamid (28 ili DL 2).
[0312] EDCI hidrohlorid (4,7 mg, 0,03 mmol) je dodat suspenziji 6-maleimidoheksanoinske kiseline (6,5 mg, 0,03 mmol) u suvom CH2Cl2(3 mL) pod atmosferom azota. Smeša je mešana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi pre nego što je PBD 27 (34 mg, sirov) dodat. Mešanja je održavano dok reakcija nije završena (6 sati). Reakcija je rastvorena sa CH2Cl2i organska faza je oprana sa H2O i rasolom pre nego što su osušen preko MgSO4, filtrirana i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Proizvod je pročišćen pažljivom hromatografijom silika gela (sporo eluiranje počevši sa 100% CHCl3sve do 9:1 CHCl3/MeOH) praćeno hromatografijom reverzne faze kako bi se uklonio nereagovana maleimid-PEGg-kiselina. Proizvod 28 je izolovan u 41% iz dva koraka (14,6 mg). LC/MS 2,40 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1157 ([M H]+., 5%)
E. Sinteza lek-veznika DL2 (Način 2)
[0313]
[0314] PBD-triflat 21 (469 mg, 0,323 mmol), boronski pinakol estar (146,5 mg, 0,484 mmol) i Na2CO3(157 mg, 1,48 mmol) su rastvoreni u smeši toluen/MeOH/H2O, 2:1:1 (10 mL). Reakciona boca je isprana sa argonom tri puta pre nego što je tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (7,41 mg, 0,0064 mmol) dodat i reakciona smeša je zagrejana do 30°C preko noći. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom i ostatak je uzet u H2O (50 mL) i ekstrakovan sa EtOAc (3 x 50 mL). Kombinovane organske materije su oprane sa rasolom (100 mL), osušene sa MgSO4, filtrirane i isparljive supstance su uklonjene rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je pročišćen hromatografijom silika gel kolone (CHCl3100% do CHCl3/MeOH 95%:5%) kako bi se dobio čist 25 u 33% prinos (885 mg). LC/MS 3,27 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1478 ([M+ H]+., 100%).
F. Sinteza lek-veznika DL3 (Način 1)
[0315]
(a) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5,11(10H,11aH)-dion (29)
[0316] 3, 4-(Metilendioksi)fenil boronska kiselina (356 mg, 2,1 mmol, 1,3 ekvivalent), TEA (1,8 mL, 12,9 mmol, 8 ekvivalent) i triflat/anilin 13 (1,75 g, 1,7 mmol, 1 ekvivalent) su rastvoreni u smeši etanola (7 mL), toluena (13 mL) i vode (2 mL) pod Ar atmosferom.
Reakciona smeša je evakuisana i isprana sa Ar 3 puta, pre dodavanja tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0) (114 mg, 0,1 mmol, 0,06 ekvivalent). Boca je opet evakuisana i isprana sa Ar 3 puta i zagrejana u mikrotalasnoj na 80°C tokom 8 minuta sa 30 sekundi pred-mešanja. Analiza pomoću TLC (80:20 v/v etil acetat/heksan) je ukazala na završenu potrošnju početnog materijala. Reakciona smeša je rastvorena sa dihlorometanom (50 mL) i oprana sa vodom (50 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (60:40 do 20:80 v/v heksan/ etil acetat) dalo je proizvod 29 kao žutu čvrstu supstancu (1,21 g, 71%). LC/MS (3,92 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1032,44 ([M H]+., 100).
(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11adihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5(11aH)-on (30)
[0317] SEM dilaktam 29 (0,25 g, 0,24 mmol, 1 ekvivalent) je rastvoren u THF (8 mL) i ohlađen do -78°C pod Ar atmosferom. Super-Hydride® (0,6 mL, 1 M u THF, 2,5 ekvivalent) je dodat kapanjem tokom 5 minuta uz praćenje temperature. Nakon 20 minuta mali uzorak je uzet i obrađen za LCMS analizu. Voda (50 mL) je dodata, hladna kada je uklonjena i rastvor je opran sa etil acetatom (50 mL). Organski sloj je ekstrakovan i opran sa rasolom (60 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirov proizvod je rastvoren u EtOH (15 mL), CH2Cl2(7,5 mL) i voda (2,5 mL) i dovoljno silika gela je dodato dok nije postao gusta suspenzija. Nakon 5 dana mešanja, ovo je filtrirano kroz sinterovan levak i oprano sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) dok proizvod nije prestao da se eluira. Organski sloj je opran sa rasolom (2 x 50 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (CHCl3sa 1% do 4% MeOH gradijent) dalo je proizvod 30 kao žutu čvrstu supstancu (94 mg, 53%). LC/MS (2,53 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 739,64 ([M]+., 70).
(c) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (31)
[0318] Pod Ar atmosferom, Alanin-Valin-Alloc (180 mg, 0,66 mmol, 1,2 ekvivalent) je mešan sa EEDQ (163 mg, 0,66 mmol, 1,2 ekvivalent) u nevodenom CH2Cl2(21 mL) i metanolu (1 mL) tokom 1 sata. PBD 30 (407 mg, 0,55 mmol, 1 ekvivalent) je rastvoren u nevodenom CH2Cl2(21 mL) i metanol (1 mL) i dodat reakciji. LC/MS nakon 5 dana mešanja na sobnoj temperaturi pokazao je da se formirao veći deo proizvoda. Rastvarač je uklonjen u vakuumu pre pročišćavanja hromatografijom kolone (CH2Cl2sa 1% do 6% MeOH gradijent) kako bi se dobio proizvod 31 kao žuta čvrsta supstanca (184 mg, 34%). LC/MS (2,95 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 994,95 ([M H]+., 60).
(d) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (32)
[0319] Imin 31 (100 mg, 0,1 mmol, 1 ekvivalent) je rastvoren u nevodenom DCM (10 mL) (uz pomoć jedne kapi metanola kako bi se pomoglo rastvaranje) pod Ar atmosferom.
Pirolidin (30 µL, 0,15 mmol, 1,5 ekvivalent) je dodat kapanjem pre nego što je boca evakuisana i isprana sa Ar tri puta. Pd(PPh3)4(7 mg, 6 µmol, 0,06 ekvivalent) je dodat i boca je evakuisana i isprana sa Ar tri puta. LC/MS analiza nakon 1 sata ukazala je na formiranje proizvoda i zavšren gubitak početnog materijala. Et2O (60 mL) je dodat reakcionoj smeši i ostavljena je da se meša dok sav proizvod nije ispao iz rastvora. Talog je filtriran kroz sinterovan levak i opran dvaput sa Et2O (2 x 20 mL). Boca za prikupljenje je zamenjena i izolovana čvrsta supstanca je rastvorena i oprana kroz sinter sa CHCl3(100 mL). Rastvarač je uklonjen u vakuumu kako bi se dobio sirov proizvod 32 kao žutu čvrstu supstancu koji je direktno korišćen u sledećem koraku. LC/MS (1,14 minuta (ES<+>) m/z (relativan intenzitet) 910,40 ([M H]+., 67).
(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(Benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-oktaoksaheptakosan-27-amid (33 ili DL 3)
[0320] Imin 32 (92 mg, 0,1 mmol, 1,1 ekvivalent) je rastvoren u CHCl3(6 mL) sa jednom kapi nevodenog MeOH kako bi se pomoglo rastvaranje. Maleimid-PEG8-kiselina (53 mg, 0,09 mmol, 1 ekvivalent) je dodat praćeno sa EEDQ (33 mg, 0,14 mmol, 1,5 ekvivalent). Ovo je ostavljeno da se meša snažno na sobnoj temperaturi pod Ar tokom 4 dana dok LC/MS analiza nije pokazala da se formirao veći deo proizvoda. Rastvarač je uklonjen u vakuumu i sirov proizvod je delimično pročišćen hromatografijom silika gel kolone (CHC13 sa 1% do 10% MeOH gradijent) dajući kao prinos 33 (81mg). Materijal je pročišćen dalje preparativnom HPLC kako bi se dobio 33 kao žuta čvrsta supstanca (26,3 mg, 18%). Brz formični prolaz: LC/MS (1,39 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1485,00 ([M H]+., 64).
G. Sinteza lek-veznika DL3 (Način 2)
[0321]
(a) 9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5,11-diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (34)
[0322] Triflat 21 (0,5 g, 0,35 mmol, 1 ekvivalent), 3, 4-(metilendioksi)fenil boronska kiselina (75 mg, 0,45 mmol, 1,3 ekvivalent) i Na2CO3(0,17 g, 1,6 mmol, 4,5 ekvivalent) su rastvoreni u toluenu (11 mL), EtOH (5,5 mL) i vodi (5,5 mL) pod Ar atmosferom. Boca je evakuisana i isprana sa Ar tri puta. Pd(PPh3)4(24 mg, 0,02 mmol, 0,06 ekvivalent) je dodat i ponovo je boca evakuisana i isprana sa Ar tri puta. Ovo je zagrejano do 30°C i ostavljeno da se meša preko noći. Analiza pomoću LC/MS pokazala je završen gubitak početnog materijala.
Rastvarač je uklonjen u vakuumu i ostatak je rastvoren u vodi (60 mL) pre pranja sa etil acetatom (60 mL x 3). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom (50 mL), osušeni sa MgSO4, filtrirani i rastvarač uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom kolone (50:50 do 25:75 v/v heksan/ etil acetat) dalo je proizvod 34 kao žutu čvrstu supstancu (310 mg, 64%). LC/MS (1,44 minuta (ES-) m/z (relativan intenzitet) 1423,35 ([M - H]-., 79).
(b) (9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (35)
[0323] SEM dilaktam 34 (0,31 g, 0,22 mmol, 1 ekvivalent) je rastvoren u THF (10 mL) i ohlađen do -78°C pod Ar atmosferom. Super-Hydride® (0,5 mL, 1 M u THF, 2,5 ekvivalent) je dodat kapanjem tokom 5 minuta uz praćenje temperature. Nakon 30 minuta mali uzorak je uzet i obrađen za LC/MS analizu. Voda (50 mL) je dodata, hladna kada je uklonjena i rastvor je opran sa etil acetatom (50 mL). Organski sloj je ekstrakovan i opran sa rasolom (60 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirov proizvod je rastvoren u EtOH (13,2 mL), CH2Cl2(6,6 mL) i vodi (2,2 mL) i dovoljno silika gela je dodato dok nije postao gusta suspenzija. Nakon 5 dana mešanja, ovo je filtrirano kroz sinterovan levak i oprano sa CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 mL) dok proizvod nije prestao da se eluira. Organski sloj je opran sa rasolom (2 x 50 mL), osušen sa MgSO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje hromatografijom silika gel kolone (CHCl3sa 1% do 4% MeOH gradijent) dalo je čist proizvod 35 kao žutu čvrstu supstancu (185 mg, 75%). LC/MS (1,70 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1132,85 ([M H]+., 60).
(c) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,11a-dihidro-1H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)-3-metilbutanamid (32)
[0324] Imin 35 (82 mg, 0,07 mmol, 1 ekvivalent) je rastvoren u DMF (1 mL) pre nego što je piperidin (0,2 mL, 2 mmol, višak) dodat polako. Ovaj rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta dok LC/MS analiza nije pokazala da je završena potrošnja početnog materijala. Reakciona smeša je rastvorena sa CH2Cl2 (50 mL), oprana sa vodom (50 mL x 4), osušena sa MgSO4, filtrirana i rastvarač je uklonjen u vakuumu.
Proizvod 33 je korišćen bez daljeg pročišćavanja u sledećem koraku. LC/MS (1,15 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 910,60 ([M H]+., 58).
H. Sinteza lek-veznika DL5
(i) (S)-(2-amino-5-metoksi-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)(2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (49)
[0325]
(a) 5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzaldehid (42)
[0326] Uredan triizopropilsililhlorid (56,4 mL, 262 mmol) je dodat smeši imidazola (48,7 g, 715,23 mmol) i 4-hidroksi-5-metoksi-2-nitrobenzaldehida 41 (47 g, 238 mmol) (zdrobljeni zajedno). Smeša je zagrejana dok se fenol i imidazol nisu istopili i prešli u rastvor (100 °C). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša tokom 15 minuta i je zatim joj je omogućeno da se ohladi, nakon čega je primećeno da se čvrste supstance formiraju na dnu boce (imidazol hlorid). Reakciona smeša je rastvorena sa 5% EtOAc/ heksani i stavljena direktno na silika gel i ploča je eluirana sa 5% EtOAc/ heksani, praćeno sa 10% EtOAc/heksani (usled niskog viška višak, veoma malo nereagovanog TIPSCl je pronađeno u proizvodu). Željeni proizvod je eluiran sa 5 % etil acetatom u heksanu. Višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, praćeno sa sušenjem pod visokim vakuumom kako bi se dobila kristalna čvrsta supstanca osteljiva na svetlo (74,4 g, 88 %). Čistoća je zadovoljavajuća pomoću LC/MS (4,22 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 353,88 ([M H]<+.>, 100));<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,43 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 1,35 - 1,24 (m, 3H), 1,10 (m, 18H).
(b) 5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzojeva kiselina (43)
[0327] Rastvor natrijum hlorita (47,3 g, 523 mmol, 80 % tehnički kvalitet) i monobaznog natrijum divodonikfosfata (35,2 g, 293 mmol) (NaH2PO4) u vodi (800 mL) je dodat rastvoru jedinjenja 2 (74 g, 209 mmol) u tetrahidrofuranu (500 mL) na sobnoj temperaturi. Vodonik peroksid (60 % w/w, 140 mL, 2,93 mol) je neposredno potom dodat do snažno mešanoj dvofaznoj smeši. Reakciona smeša je evoluirala gas (kiseonik), početni materijal je rastvoren i temperatura reakcione smeše je porasla do 45°C. Nakon 30 minuta LC/MS je otkrio da je reakcija završena. Reakciona smeša je ohlađen u ledenoj kadi i hlorovodonična kiselina (1 M) je dodata kako bi se pH snizio do 3 (otkriveno je da je ovaj korak nepotreban u mnogo slučajeva, jer je pH na kraju reakcije već kiseo; proveriti pH pre ekstrakcije). Reakciona smeša je zatim ekstrakovana sa etil acetatom (1 L) i organske faze su oprane sa rasolom (2 x 100 mL) i osušene preko magnezijum sulfata. Organska faza je filtrirana i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 43 u kvantitativnom prinosu kao žuta čvrsta supstanca. LC/MS (3,93 minuta (ES-) m/z (relativan intenzitet) 367,74 ([M - H]-., 100)); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (s, 1H), 7,24 (s, 1H), 3,93 (s, 3H), 1,34 - 1,22 (m, 3H), 1,10 (m, 18H).
(c) ((2S,4R)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-hidroksipirolidin-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)metanon (45)
[0328] DCC (29,2 g, 141 mmol, 1,2 ekvivalent) je dodat rastvoru kiseline 3 (43,5 g, 117,8 mmol, l ekvivalent), i hidroksibenzotriazol hidrata (19,8 g, 129,6 mmol, 1,1 ekvivalent) u dihlorometanu (200 mL) na 0 °C. Hladna kada je uklonjena i reakciji je omogućeno da nastavi tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, i u tom trenutku rastvor (2S,4R)-2-tbutildimetilsililoksimetil-4-hidroksipirolidina 44 (30 g, 129,6 mmol, 1,1 ekvivalent) i trietilamina (24,66 mL, 176 mmol, 1,5 ekvivalent) u dihlorometanu (100 mL) je dodat brzo na -10 °C pod argonom (u velikoj razmeri, vreme dodavanja je moglo da se skrati daljim hlađenjem reakcione smeše. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 40 minuta do 1 sata i praćena je pomoću LC/MS i TLC (EtOAc). Čvrste supstance su uklonjene filtriranjem preko celita i organska faza je opran sa hladnim vodenim 0,1 M HCl dok je pH izmeren na 4 ili 5. Organska faza je zatim opran sa vodom, praćeno sa zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, filtriran i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent 40/60 etil acetat/heksan do 80/20 etil acetat/ heksan). Višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom što je dalo čist proizvod 45, (45,5 g čistog proizvoda 66%, i 17 g blago nečistog proizvoda, 90% ukupno). LC/MS 4,43 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 582,92 ([M H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,66 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,54 (s, 1H), 4,40 (s, 1H), 4,13 (s, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,77 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,36 (dd, J = 11,3, 4,5 Hz, 1H), 3,14 - 3,02 (m, 1H), 2,38 - 2,28 (m, 1H), 2,10 (ddd, J = 13,3, 8,4, 2,2 Hz, 1H), 1,36 - 1,19 (m, 3H), 1,15 - 1,05 (m, 18H), 0,91 (s, 9H), 0,17 - 0,05 (m, 6H), (prisustvo rotamera).
(d) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzoil)pirolidin-3-on (46)
[0329] TCCA (8,82 g, 40 mmol, 0,7 ekvivalent) je dodat mešanom rastvoru 45 (31,7 g, 54 mmol, 1 ekvivalent) i TEMPO (0,85 g, 5,4 mmol, 0,1 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (250 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je snažno mešana tokom 20 minuta, i u tom trenutku TLC (50/50 etil acetat/heksan) je otkrio da je završena potrošnja početnog materijala.
Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i filtrat opran sa vodenim zasićenim natrijum bikarbonatom (100 mL), natrijum tiosulfatom (9 g u 300 mL), rasolom (100 mL) i osušen preko magnezijum sulfata. Rotaciono isparavanje pod redukovanim pritiskom dalo je proizvod 46 u kvantitativnom prinosu. LC/MS 4,52 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 581,08 ([M H]+., 100);
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,78 - 7,60 (m, 1H), 6,85 - 6,62 (m, 1H), 4,94 (dd, J = 30,8, 7,8 Hz, 1H), 4,50 - 4,16 (m, 1H), 3,99 - 3,82 (m, 3H), 3,80 - 3,34 (m, 3H), 2,92 - 2,17 (m, 2H), 1,40 - 1,18 (m, 3H), 1,11 (t, J = 6,2 Hz, 18H), 0,97 - 0,75 (m, 9H), 0,15 - - 0,06 (m, 6H), (prisustvo rotamera).
(e) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirol-3-il trifluorometansulfonat (47)
[0330] tTifilični anhidrid (27,7 mL, 46,4 g, 165 mmol, 3 ekvivalent) je injektiran (kontrolisana temperatura) snažno mešanoj suspenziji ketona 46 (31,9 g, 55 mmol, 1 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (900 mL) u prisustvu 2,6-lutidina (25,6 mL, 23,5 g, 220 mmol, 4 ekvivalent, osušen pomoću sita) na -50 °C (aceton/suva ledena kada). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša tokom 1,5 sati kada je LC/MS, prateći mini obradu (voda/dihlorometan), otkrio da je reakcija završena. Voda je dodata još uvek hladnoj reakcionoj smeši i organski sloj je razdvojen i opran sa zasićenim natrijum bikarbonatom, rasolom i magnezijum sulfatom. Organska faza je filtrirana i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 10/90 v/v etil acetat/heksan), uklanjanje viška eluenta dalo je proizvod 47 (37,6 g, 96 %) LC/MS, postupak 2, 4,32 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 712,89 ([M H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,71 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,05 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,78 (dd, J = 9,8, 5,5 Hz, 1H), 4,15 - 3,75 (m, 5H), 3,17 (ddd, J = 16,2, 10,4, 2,3 Hz, 1H), 2,99 (ddd, J = 16,3, 4,0, 1,6 Hz, 1H), 1,45 - 1,19 (m, 3H), 1,15 - 1,08 (m, 18H), 1,05 (s, 6H), 0,95 - 0,87 (m, 9H), 0,15 - 0,08 (m, 6H).
(f) (S)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)metanon (48)
[0331] Trifenilarsin (1,71 g, 5,60 mmol, 0,4 ekvivalent) je dodat smeši triflata 47 (10,00 g, 14 mmol, l ekvivalent), metilboronske kiseline (2,94 g, 49,1 mmol, 3,5 ekvivalent), srebro oksida (13 g, 56 mmol, 4 ekvivalent) i trobaznog kalijum fosfata (17,8 g, 84 mmol, 6 ekvivalent) u suvom dioksanu (80 mL) pod atmosferom azota. Reakcija je isprana sa argonom 3 puta i bis(benzonitril)paladijum(II) hlorid (540 mg, 1,40 mmol, 0,1 ekvivalent) je dodat. Reakcija je isprana sa argonom još 3 puta pre nego što je zagrejana neposredno potom do 110°C (drysyn blok za zagrevanje je prethodno zagrejan do 110°C pre dodavanja boce). Nakon 10 minuta reakcija je ohlađena do sobne temperature i filtrirana kroz celitnu ploču. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 10 % etil acetat/heksan). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovan, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom, što je dalo proizvod 48 (4,5 g, 55 %). LC/MS, 4,27 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 579,18 ([M H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 (s, 1H), 6,77 (s, 1H), 5,51 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,77 - 4,59 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,92 - 2,65 (m, 1H), 2,55 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 1,62 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,40 - 1,18 (m, 3H), 1,11 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,11 (d, J = 2,3 Hz, 6H).
(g) (S)-(2-amino-5-metoksi-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)(2-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (49)
[0332] Cink prašak (28 g, 430 mmol, 37 ekvivalent) je dodat rastvoru jedinjenja 48 (6,7 g, 11,58 mmol) u 5% mravljoj kiselini u etanolu v/v (70 mL) na oko 15°C. Rezultujući egzoterm je kontrolisan koristeći ledenu kadu kako bi se održala temperatura reakcione smeše ispod 30°C. Nakon 30 minuta reakciona smeša je filtrirana kroz celitnu ploču. Filtrat je rastvoren sa etil acetatom i organska faza je oprana sa vodom, zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom.
Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 10 % etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 49 (5,1 g, 80 %). LC/MS, 4,23 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 550,21 ([M H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,28 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,19 (s, 1H), 4,64 - 4,53 (m, J = 4,1 Hz, 1H), 4,17 (s, 1H), 3,87 (s, 1H), 3,77 - 3,69 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,71 - 2,60 (m, 1H), 2,53 2,43 (m, 1H), 2,04 - 1,97 (m, J = 11,9 Hz, 1H), 1,62 (s, 3H), 1,26 - 1,13 (m, 3H), 1,08 - 0,99 (m, 18H), 0,82 (s, 9H), 0,03 - -0,03 (m, J = 6,2 Hz, 6H).
(ii) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-((5-jodopentil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat [0333]
(a) (S)-alil(2-(2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamat (50)
[0334] Alil hloroformat (0,30 mL, 3,00 mmol, 1,1 ekvivalent) je dodat rastvoru amina 49 (1,5 g, 2,73 mmol) u prisustvu suvog piridina (0,48 mL, 6,00 mmol, 2,2 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (20 mL) na -78°C (aceton/suvi ledena kada). Nakon 30 minuta, kada je uklonjena i reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Reakciona smeša je rastvorena sa dihlorometanom i zasićeni vodeni bakar sulfat je dodat. Organski sloj je zatim opran sekvencijalno sa zasićenim vodeni natrijum bikarbonat i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak rastvarača uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 50 koji je korišćen direktno u sledećoj reakciji. LC/MS, 4,45 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 632,91 ([M H]+., 100)
(b) (S)-alil(2-(2-(hidroksimetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamat (51)
[0335] Sirov 50 je rastvoren u 7:1:1:2 smeši sirćetna kiselina/metanol/ tetrahidrofuran/voda (28:4:4:8 mL) i omogućeno mu je da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 3 sata, završen je nestanak početnog materijala, što je primećeno pomoću LC/MS. Reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom i oprana sekvencijalno sa vodom (2 x 500 mL), zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom (200 mL) i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak etil acetat je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel, 25% etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio željeni proizvod 51 (1 g, 71 %). LC/MS, 3,70 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 519,13 ([M H]+., 95); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,34 (s, 1H), 7,69 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 5,95 (ddt, J = 17,2, 10,5, 5,7 Hz, 1H), 5,33 (dq, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,23 (ddd, J = 10,4, 2,6, 1,3 Hz, 1H), 4,73 (tt, J = 7,8, 4,8 Hz, 1H), 4,63 (dt, J = 5,7, 1,4 Hz, 2H), 4,54 (s, 1H), 3,89 - 3,70 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 16,5, 10,5 Hz, 1H), 2,19 (dd, J = 16,8, 4,6 Hz, 1H), 1,70 (d, J = 1,3 Hz, 3H), 1,38 - 1,23 (m, 3H), 1,12 (s, 10H), 1,10 (s, 8H).
(c) (11S, 11aS)-alil 11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11adihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (52)
[0336] Dimetil sulfoksid (0,35 mL, 4,83 mmol, 2,5 ekvivalent) je dodat kapanjem rastvoru oksalil hlorida (0,2 mL, 2,32 mmol, 1,2 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (10 mL) na -78°C (suvi led/aceton kada) pod atmosferom argona. Nakon 10 minuta rastvor 51 (1 g, 1,93 mmol) u suvom dihlorometanu (8 mL) je dodat polako uz temperaturu još uvek na -78°C. Nakon 15 minuta trietilamin (1,35 mL, osušen preko 4Å molekularnog sita, 9,65 mmol, 5 ekvivalent) je dodat kapanjem i suvi led/aceton kada je uklonjena. Reakcionoj smeši je omogućeno da dostigne sobnu temperaturu i je ekstrakovana sa hladnom hlorovodoničnom kiselinom (0,1 M), zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak dihlorometana je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 52 (658 mg, 66%). LC/MS, 3,52 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 517,14 ([M H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,20 (s, 1H), 6,75 - 6,63 (m, J = 8,8, 4,0 Hz, 2H), 5,89 - 5,64 (m, J= 9,6, 4,1 Hz, 2H), 5,23 - 5,03 (m, 2H), 4,68 - 4,38 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,83 - 3,77 (m, 1H), 3,40 (s, 1H), 3,05 - 2,83 (m, 1H), 2,59 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 1,78 (d, J = 1,3 Hz, 3H), 1,33 - 1,16 (m, 3H), 1,09 (d, J = 2,2 Hz, 9H), 1,07 (d, J = 2,1 Hz, 9H).
(d) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (53)
[0337] terc-butildimetilsililtriflat (0,70 mL, 3,00 mmol, 3 ekvivalent) je dodat rastvoru jedinjenja 52 (520 mg, 1,00 mmol) i 2,6-lutidina (0,46 mL, 4,00 mmol, 4 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (40 mL) na 0°C pod argonom. Nakon 10 minuta, hladna kada je uklonjena i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je ekstrakovana sa vodom, zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent, 10 % etil acetata u heksanu do 20 % etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 53 (540 mg, 85 %). LC/MS, 4,42 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 653,14 ([M Na]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,20 (s, 1H), 6,71 - 6,64 (m, J = 5,5 Hz, 2H), 5,83 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 5,80 - 5,68 (m, J = 5,9 Hz, 1H), 5,14 - 5,06 (m, 2H), 4,58 (dd, J = 13,2, 5,2 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 13,3, 5,5 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,71 (td, J = 10,1, 3,8 Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 1H), 2,36 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 1,75 (s, 3H), 1,31 - 1,16 (m, 3H), 1,12 - 1,01 (m, J = 7,4, 2,1 Hz, 18H), 0,89 -0,81 (m, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,19 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (54)
[0338] Litijum acetat (87 mg, 0,85 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 53 (540 mg, 0,85 mmol) u vlažnom dimetilformamidu (6 mL, 50:1 DMF/voda). Nakon 4 sata, reakcija je završena i reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (25 mL) i oprana sa vodenim rastvorom limunske kiseline (pH ∼ 3), vodom i rasolom. Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, filtriran, i višak etil acetat je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent, 25% do 75% etil acetata u heksanu). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 54 (400 mg, kvantitativno). LC/MS, (3,33 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 475,26 ([M+H]+ , 100).
(f) (11S,11aS)-alil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-((5-jodopentil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (55) [0339] Diiodopentan (0,63 mL, 4,21 mmol, 5 ekvivalent) i kalijum karbonat (116 mg, 0,84 mmol, 1 ekvivalent) su dodati rastvoru fenola 54 (400 mg, 0,84 mmol) u acetonu (4 mL, osušen preko molekularnog sita). Reakciona smeša je zatim zagrejana do 60°C i mešana je tokom 6 sati. Aceton je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom.
Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 50/50, v/v, heksan/etil acetat,). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen kako bi se dobilo 55 pri 90% prinosu. LC/MS, 3,90 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 670,91 ([M]+ , 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,23 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,87 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,83 - 5,68 (m, J = 5,6 Hz, 1H), 5,15 - 5,01 (m, 2H), 4,67 - 4,58 (m, 1H), 4,45 - 4,35 (m, 1H), 4,04 - 3,93 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,73 (td, J = 10,0, 3,8 Hz, 1H), 3,25 - 3,14 (m, J = 8,5, 7,0 Hz, 2H), 2,92 (dd, J = 16,8, 10,3 Hz, 1H), 2,38 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 1,95 -1,81 (m, 4H), 1,77 (s, 3H), 1,64 - 1,49 (m, 2H), 0,88 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,23 (s, 3H).
(iii) (11S,11as)-4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (70) [0340]
(a) Alil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1Hpirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oksopentanoat (56)
[0341] Trietilamin (2,23 mL, 18,04 mmol, 2,2 ekvivalent) je dodat mešanom rastvoru amina 49 (4 g, 8,20 mmol) i trifosgena (778 mg, 2,95 mmol, 0,36 ekvivalent) u suvom tetrahidrofuranu (40 mL) na 5 °C (ledena kada). Napredak reakcije izocijanata je praćen periodičnim uklanjanjem alikvota reakcione smeše i gašenjem sa metanolom i izvođenjem LC/MS analize. Nakon što je formiranje izocijanata završeno rastvor alloc-Val-Ala-PABOH (4,12 g, 12,30 mmol, 1,5 ekvivalent) i trietilamina (1,52 mL, 12,30 mmol, 1,5 ekvivalent) u suvom tetrahidrofuranu (40 mL) je brzo dodat injekcijom sveže pripremljenom izocijanatu. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 40 °C tokom 4 sata. Višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent, 1 % metanol do 5% metanol u dihlorometan). (Alternativni uslovi hromatografije koristeći EtOAc i heksan su takođe bili uspešni). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 56 (3,9 g, 50%). LC/MS, 4,23 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 952,36 ([M H]+· , 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,62 (br s, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,77 (br s, 1H), 7,53 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,57 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H), 6,03 - 5,83 (m, 1H), 5,26 (dd, J = 33,8, 13,5 Hz, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,70 - 4,60 (m, 2H), 4,58 (dd, J = 5,7, 1,3 Hz, 2H), 4,06 - 3,99 (m, 1H), 3,92 (s, 1H), 3,82 - 3,71 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,79 - 2,64 (m, 1H), 2,54 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,16 (dq, J = 13,5, 6,7 Hz, 1H), 1,67 (s, 3H), 1,46 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,35 - 1,24 (m, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,97 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,87 (s, 9H), 0,07 - -0,02 (m, 6H).
(b) Alil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(hidroksimetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil) hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oksopentanoat (57)
[0342] TBS etar 56 (1,32 g, 1,38 mmol) je rastvoren u 7:1:1:2 smeši sirćetna kiselina/metanol/tetrahidrofuran/voda (14:2:2:4 mL) i omogućeno mu je da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 3 sata nije primećeno više početnog materijala pomoću LC/MS. Reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (25 mL) i oprana sekvencijalno sa vodom, zasićenim vodeni natrijum bikarbonat i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak etil acetat uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel, 2% metanol u dihlorometanu). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio željeni proizvod 57 (920 mg, 80%). LC/MS, 3,60 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 838,18 ([M+H]+·, 100).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,55 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,77 (s, 1H), 6,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,13 (s, 1H), 5,97 - 5,82 (m, J = 5,7 Hz, 1H), 5,41 - 5,15 (m, 3H), 5,10 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 4,76 - 4,42 (m, 5H), 4,03 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 3,77 (s, 5H), 2,84 (dd, J = 16,7, 10,4 Hz, 1H), 2,26 - 2,08 (m, 2H), 1,68 (s, 3H), 1,44 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,30 (dt, J = 14,7, 7,4 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
(c) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3 il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11adihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (58)
[0343] Dimetil sulfoksid (0,2 mL, 2,75 mmol, 2,5 ekvivalent) je dodat kapanjem rastvoru oksalil hlorida (0,11 mL, 1,32 mmol, 1,2 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (7 mL) na -78°C (suvi led/aceton kada) pod atmosferom argona. Nakon 10 minuta rastvor 57 (920 mg, 1,10 mmol) u suvom dihlorometanu (5 mL) je dodat polako uz temperaturu još uvek na -78°C. Nakon 15 minuta trietilamin (0,77 mL, osušen preko 4Å molekularnog sita, 5,50 mmol, 5 ekvivalent) je dodat kapanjem i suvi led/aceton kada je uklonjen. Reakcionoj smeši je omogućeno da dostigne sobnu temperaturu i je ekstrakovana je sa hladnom hlorovodoničnom kiselinom (0,1 M), zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak dihlorometana je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent 2% metanol do 5 % metanol u dihlorometan). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i uklanjanje viška eluenta rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom dalo je proizvod 58 (550 mg, 60%). LC/MS, 3,43 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 836,01 ([M]+·, 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,39 (s, 1H), 7,52 - 7,40 (m, 2H), 7,21 - 7,08 (m, J = 11,5 Hz, 2H), 6,67 (s, 1H), 6,60 - 6,47 (m, J = 7,4 Hz, 1H), 5,97 - 5,83 (m, 1H), 5,79 - 5,66 (m, 1H), 5,38 - 4,90 (m, 6H), 4,68 - 4,52 (m, J = 18,4, 5,5 Hz, 4H), 4,04 - 3,94 (m, J = 6,5 Hz, 1H), 3,87 - 3,76 (m, 5H), 3,00 - 2,88 (m, 1H), 2,66 - 2,49 (m, 2H), 2,21 - 2,08 (m, 2H), 1,76 (s, 3H), 1,45 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,09 - 0,98 (m, J = 8,9 Hz, 18H), 0,96 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
(d) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(Aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (59)
[0344] terc-butildimetilsililtriflat (0,38 mL, 1,62 mmol, 3 ekvivalent) je dodat rastvoru jedinjenja 58 (450 mg, 0,54 mmol) i 2,6-lutidin (0,25 mL, 2,16 mmol, 4 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (5 mL) na 0°C pod argonom. Nakon 10 minuta, hladna kada je uklonjen i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je ekstrakovana sa vodom, zasićenim vodeni natrijum bikarbonatom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak rastvarača je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 50/50 v/v heksan/etil acetat). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 59 (334 mg, 65%). LC/MS, 4,18 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 950,50 ([M]+·, 100).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,53 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,44 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,08 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,72 - 6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, 1H), 5,97 - 5,79 (m, J = 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 - 5,08 (m, 5H), 4,86 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,69 - 4,60 (m, 1H), 4,57 (s, 1H), 4,03 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td, J = 9,6, 3,6 Hz, 1H), 2,43 - 2,09 (m, J = 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 - 1,21 (m, 3H), 0,97 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(Aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-((terc-butildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (60)
[0345] Litijum acetat (50 mg, 0,49 mmol) je dodat rastvoru jedinjenja 59 (470 mg, 0,49 mmol) u mokrom dimetilformamidu (4 mL, 50:1 DMF/voda). Nakon 4 sata, reakcija je završena i reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom i oprana sa limunskom kiselinom (pH ∼ 3), vodom i rasolom. Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, filtriran i višak etil acetat je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; gradijent, 50/50 do 25/75 v/v heksan/etil acetat). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 60 (400 mg, kvantitativno). LC/MS, 3,32 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 794,18 ([M+H]+·, 100).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,53 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,44 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,08 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,72 - 6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, 1H), 5,97 - 5,79 (m, J = 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 - 5,08 (m, 5H), 4,86 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,69 - 4,60 (m, 1H), 4,57 (s, 1H), 4,03 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td, J = 9,6, 3,6 Hz, 1H), 2,43 - 2,09 (m, J = 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 - 1,21 (m, 3H), 0,97 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
(iv) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-5-izopropil-2-metil-4,7,35-triokso-10,13,16,19,22,25,28,31-oktaoksa-3,6,34-triazaheptatriakontanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-(((S)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (64)
[0346]
(a) (11S)-alil 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil)oksi)karbonil)-11-((tertbutildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-11-((tertbutildimetilsilil)oksi)-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (61)
[0347] Kalijum karbonat (70 mg, 0,504 mmol, 1 ekvivalent) je dodat rastvoru 55 (370 mg, 0,552 mmol, 1,2 ekvivalent) i fenolu 60 (400 mg, 0,504 mmol) u suvom acetonu (25 mL).
Reakcija je mešana 8 sati na 70°C. LC/MS pokazala da nije sav početni materijal potrošen, tako da je reakciji omogućeno da se meša preko noći na sobnoj temperaturi i mešana je tokom dodatna 2 sata narednog dana. Aceton je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 80% etil acetata u heksanu do 100% etil acetat). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod 61 (385 mg, 57%). LC/MS, 4,07 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1336,55 ([M+H]+·, 50).
(b) (11S)-alil 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil)oksi)karbonil)-11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (62)
[0348] Tetra-n-butilamonijum fluorid (1M, 0,34 mL, 0,34 mmol, 2 ekvivalent) je dodat rastvoru 61 (230 mg, 0,172 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (3 mL). Početni materijal je potpuno potrošen nakon 10 minuta. Reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (30 mL) i oprana sekvencijalno sa vodom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak etil acetat je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak 62 je korišćen kao sirova smeša za narednu reakciju. LC/MS, 2,87 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1108,11 ([M+H]+·, 100).
(c) (11S)-4-(2-(1-((1-amino-3-metil-1-oksobutan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-((7-metoksi-2-metil-5-okso-5, 11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (63)
[0349] Tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (12 mg, 0,01 mmol, 0,06 ekvivalent) je dodat rastvoru sirovog 62 (0,172 mmol) i pirolidina (36 µL, 0,43 mmol, 2,5 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (10 mL). Reakciona smeša je mešana 20 minuta i rastvorena sa dihlorometanom i oprana sekvencijalno sa zasićenim vodeni amonijum hloridom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak dihlorometana je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak 63 je korišćen kao sirova smeša za narednu reakciju. LC/MS, 2,38 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 922,16 ([M+H]+., 40).
(d) (11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-5-izopropil-2-metil4,7,35-triokso-10,13,16,19,22,25,28,31-oktaoksa-3,6,34-triazaheptatriakontanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-((5-(((S)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-okso-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (64 ili DL5)
[0350] 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDCI, 33 mg, 0,172 mmol) je dodat rastvoru sirovog 63 (0,172 mmol) i Mal-(PEG)8-kiselina (100 mg, 0,172 mmol) u suvom dihlorometanu (10 mL). Reakcija je mešana tokom 2 sata i prisustvo početnog materijala nije više primećeno pomoću LC/MS. Reakcija je rastvorena sa dihlorometanom i oprana sekvencijalno sa vodom i rasolom. Organska faza je osušena preko magnezijum sulfata, filtrirana i višak dihlorometana je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je podvrgnut hromatografiji fleš kolone (silika gel; 100% hloroform do 10% metanol u hloroform). Čisti fragmenti su prikupljeni i kombinovani, i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 64 ili DL5 (60 mg, 25% tokom 3 koraka).
I. Sinteza lek-veznika DL4 (Način 1)
[0351]
Jedinjenje 65 je jedinjenje 79 iz WO 2011/130598
(11S)-4-(1-jodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-en-1-il)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-en-1-il)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (66 ili DL4)
[0352] N,N'-diizopropilkarbodiimid (DIC, 4,71 µL, 0,0304 mmol) je dodat rastvoru amina 65 (0,0276 mmol) i jodo-(PEG)4-kiseline (13,1 mg, 0,0304 mmol) u suvom dihlorometanu (0,8 mL). Reakcija je mešana tokom 3 sata i prisustvo početnog materijala nije više primećeno pomoću LC/MS. Reakciona smeša je direktno stavljena na ploču hromatografije tankog sloja (TLC) i pročišćena he pomoću prep-TLC (10% metanola u hloroformu). Čiste trake su sklonjene sa TLC ploče, uzete u 10% metanola u hloroformu, filtrirane i višak eluenta je uklonjen rotacionim isparavanjem pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 66 (D) (20,9 mg, 56%). LC/MS, postupak 2, 3,08 minuta (ES+) m/z (relativan intenzitet) 1361,16 ([M+H]+ , 100).
J. Sinteza lek-veznika DL4 (Način 2)
[0353] Sledeći postupci su korišćeni u ovom Primeru J.
[0354] LCMS podaci su dobijeni primenom Agilent 1200 serije LC/MS sa Agilent 6110 kvadrupolom MS, sa Elektrosprej jonizacijom. Mobilna faza A - 0,1% sirćetna kiselina u vodi. Mobilna faza B – 0,1% u acetonitrilu. Brzina protoka je 1,00ml/min. Gradijent od 5% B raste do 95% B tokom 3 minuta, ostajući na 95% B u trajanju od 1 minuta, i zatim nazad do 5% B tokom 6 sekundi. Ukupno vreme rada je 5 minuta. Kolona: Phenomenex Gemini-NX 3µm C18, 30 x 2,00mm. Hromatogrami bazirani na UV detekciji na 254 nm. Maseni spektri su postignuti upotrebom MS u pozitivnom modu. Vrednosti hemijskog pomaka protonske NMR merene su na delta skali na 400 MHz korišćenjem Bruker AV400. Korišćene su sledeće skraćenice: s, singlet; d, dublet; t, triplet; k, kvartet; m, multiplet; br, širok. Konstante spajanja su prikazane u Hz. Ukoliko nije drugačije navedeno, hromatografija na koloni (fleš postupkom) je izvedena na Merck Kieselgel silicijum dioksidu (Art.9385). Podaci masene spektroskopije (MS) su sakupljeni korišćenjem Waters Micromass LCT instrumenta uparenog sa Waters 2795 HPLC separacionim modulom. Tankoslojna hromatografija (TLC) je izvedena na aluminijumskim pločama od silika gela (Merck 60, F254). Sve druge hemikalije i rastvarači su nabavljeni od Sigma-Aldrich ili Fisher Scientific i korišćeni su kao isporučeni bez daljeg prečišćavanja.
[0355] Optičke rotacije su merene na ADP 220 polarimetru (Bellingham Stanley Ltd.) i koncentracijame (c) su u date g/100mL. Tačke topljenja su merene korišćenjem digitalnog aparata za određivanje tačke topljenja (Electrothermal). IR spektri su snimljeni na Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR spektrometru.1H i 13C NMR spektri su dobijeni na 300 K koristeći Bruker Avance NMR spektrometar na 400 i 100 MHz, respektivno. Prikazani su hemijski pomaci u odnosu na TMS (□ = 0,0 ppm), a signali su označeni kao s (singlet), d (dublet), t (triplet), dt (dublet tripleta), dd (dublet dubleta), ddd (dublet dubleta dubleta) ili m (multiplet), sa konstantama vezivanja datim u Hertz (Hz). Podaci masene spektroskopije (MS) su sakupljeni korišćenjem Waters Micromass ZQ instrumenta uparenog sa Waters 2695 HPLC sa Waters 2996 PDA. Korišćeni parametri Waters Micromass ZQ su bili: Kapilarni (kV), 3,38; Konus (V), 35; Ekstraktor (V), 3,0; Temperatura izvora (°C), 100; Temperatura desolvacije (°C), 200; Brzina protoka konusa (L/h), 50; Stopa protoka desolvacije (L/h), 250. Podaci masene spektroskopije visoke rezolucije (HRMS) su snimljeni na Waters Micromass QTOF Global u pozitivnom V-modu koristeći metalne prevlake od borosilikatnog stakla za uvođenje uzoraka u instrument. Tankoslojna hromatografija (TLC) je izvedena na aluminijumskim pločama od silika gela (Merck 60, F254), dok fleš hromatografija koristi silika gel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM). Osim HOBt (NovaBiochem) i reagensa na čvrstom nosaču (Argonaut), sve druge hemikalije i rastvarači su nabavljeni od Sigma-Aldrich i korišćeni su kao isporučeni bez daljeg prečišćavanja. Nevodeni rastvarači su pripremljeni destilacijom u atmosferi suvog azota u prisustvu odgovarajućeg agensa za sušenje, i bili su uskladišteni preko 4Å molekulskih sita ili natrijumove žice. Pretroleum etar se odnosi na fragment koji ključa na 40-60°C.
[0356] Opšti LC/MS uslovi: HPLC (Waters Alliance 2695) je izveden koristeći mobilnu fazu vode (A) (mravlja kiselina 0,1%) i acetonitrila (B) (mravlja kiselina 0,1%). Gradijent: početni sastav 5% B tokom 1,0 minuta zatim 5% B do 95% B tokom 3 minuta. Sastav je održavan tokom 0,5 minuta na 95% B, i zatim je vraćen na 5% B tokom 0,3 minuta. Ukupno trajanje gradijenta iznosi 5 minuta. Brzina protoka 3,0 mL/min, 400µL je podeljeno pomoću zero dead volume tee piece koja prelazi u maseni spektrometar. Domet detekcije talasne dužine: 220 do 400 nm. Tip funkcije: diodni niz (535 skenova). Kolona: Phenomenex® Onyx Monolithic C1850 x 4,60 mm
Najpre su pripremljeni sledeći međuproizvodi.
(a-i) (S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbuterna kiselina (I2)
[0357] Alil hloroformat (36,2 ml, 340,59 mmol, 1,2 ekvivalent) je dodat kapanjem mešanom rastvoru L-valina (I1)(33,25 g, 283,82 mmol, 1,0 ekvivalent) i kalijum karbonata (59,27 g, 425,74 mmol, 1,5 ekvivalent) u vodi (650 mL) i THF (650 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, zatim je rastvarač koncentrisan pod redukovanim pritiskom i preostali rastvor je ekstrakovan sa dietil etrom (3 x 100 mL). Vodeni deo je acidifikovan do pH 2 sa conc. HCl i ekstrakovan sa DCM (3 x 100 mL). Kombinovane organske materije su oprane sa rasolom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrisani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod kao bezbojno ulje (57,1 g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (1,966 minuta (ES+)), m/z: 202,1 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,57 (br s, 1H), 7,43 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 5,96 - 5,86 (m, 1H), 5,30 (ddd, 1H, J = 17,2, 3,4, 1,7 Hz), 5,18 (ddd, 1H, J = 10,4, 2,9, 1,6 Hz), 4,48 (dt, 2H, J = 5,3, 1,5 Hz), 3,85 (dd, 1H, J = 8,6, 6,0 Hz), 2,03 (oct, 1H, J = 6,6 Hz), 0,89 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,87 (d, 3H, J = 6,5 Hz).
(a-ii) (S)-2,5-dioksopirolidin-1-il 2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanoat (I3)
[0358] Mešanom rastvoru zaštićene kiseline I2 (60,6 g, 301,16 mmol, 1,0 ekvivalent) i N-hidroksisukcinimida (34,66 g, 301,16 mmol, 1,0 ekvivalent) u suvom THF (800 mL) dodat je dicikloheksilkarbodiimid (62,14 g, 301,16 mmol, 1 ekvivalent). Reakcija je mešana tokom 18 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim filtrirana, čvrsta supstanca oprana sa THF i kombinovani filtrat je koncentrisani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u DCM i ostavljen da miruje na 0°C tokom 30 minuta. Suspenzija je filtrirana i oprana sa hladnim DCM. Koncentrisanje filtrata pod redukovanim pritiskom dalo je proizvod kao viskozno bezbojno ulje (84,7 g, pretpostavljen 100% prinos) koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja. LC/MS (2,194 minuta (ES<+>)), m/z: 321,0 [M+Na]<+>.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,0 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 5,97 - 5,87 (m, 1H), 5,30 (ddd, 1H, J = 17,2, 3,0, 1,7 Hz), 5,19 (ddd, 1H, J = 10,4, 2,7, 1,4 Hz), 4,52 (dt, 2H, J = 5,3, 1,4 Hz), 4,32 (dd, 1H, J = 8,3, 6,6 Hz), 2,81 (m, 4H), 2,18 (oct, 1H, J = 6,7 Hz), 1,00 (d, 6H, J = 6,8 Hz), (a-iii) (S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanska kiselina (I4) [0359] Rastvor sukcinimid estra I3(12,99 g, 43,55 mmol, 1,0 ekvivalent) u THF (50 mL) je dodat rastvoru L-alanina (4,07 g, 45,73 mmol, 1,05 ekvivalent) i NaHCO3(4,02 g, 47,90 mmol, 1,1 ekvivalent) u THF (100 mL) i H2O (100 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 72 sata kada THF je uklonjen pod redukovanim pritiskom. pH je prilagođen do 3-4 sa limunskom kiselinom dok taloga u vidu bele gume. Nakon ekstrakcije sa etil acetatom (6 x 150 mL), kombinovane organske materije su oprane sa H2O (200 mL), osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrisane pod redukovanim pritiskom. Trituiranje sa dietil etrom dalo je proizvod kao beli prašak i prikupljen je filtriranjem i opran sa dietil etrom (5,78 g, 49%).
LC/MS (1,925 minuta (ES+)), m/z: 273,1 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,47 (br s, 1H), 8,17 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,16 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 5,95 - 5,85 (m, 1H), 5,29 (dd, 1H, J = 17,2, 1,7 Hz), 5,17 (dd, 1H, J = 10,4, 1,5 Hz), 4,46 (m, 2H), 4,18 (quin, 1H, J = 7,2 Hz), 3,87 (dd, 1H, J = 9,0, 7,1 Hz), 1,95 (oct, 1H, J = 6,8 Hz), 1,26 (d, 3H, J = 7,3 Hz), 0,88 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,83 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
(a-iv) Alil (S)-1-((S)-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-oksopropan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-ilkarbamat (I5)
[0360] EEDQ (5,51 g, 22,29 mmol, 1,05 ekvivalent) je dodat rastvoru p-aminobenzil alkohola (2,74 g, 22,29 mmol, 1,05 ekvivalent) i kiselina I4 (5,78 g, 21,23 mmol, 1 ekvivalent) u suvom THF (100 mL) i mešan je na sobnoj temperaturi tokom 72 sata.
Reakciona smeša je zatim koncentrisana pod redukovanim pritiskom i rezultujuća braon čvrsta supstanca je triturana sa dietil etrom i filtrirana uz naredno pranje sa viškom od dietil etra kako bi se dobio proizvod kao beličasta čvrsta supstanca (7,1 g, 88 %). LC/MS (1,980 minuta (ES+)), m/z: 378,0 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,89 (br s, 1H), 8,13 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 7,52 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,26 (m, 1H), 7,23 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,91 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,17 (m, 1H), 4,46 (m, 2H), 5,09 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,48 (m, 2H), 4,42 (m, 3H), 3,89 (dd, 1H, J = 8,6, 6,8 Hz), 1,97 (m, 1H), 1,30 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,88 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,83 (d, 3H, J = 6,7 Hz).
1-jodo-2-okso-6,9,12,15-tetraoksa-3-azaoktadekan-18-oinska kiselina (I7)
[0361] Rastvor jodosirćetnog anhidrida (0,250 g, 0,706 mmol, 1,1 ekvivalent) u suvom DCM (1 mL) je dodat amino-PEG(4)-kiselini I6 (0,170 g, 0,642 mmol, 1,0 ekvivalent) u DCM (1 mL). Smeša je mešana u mraku na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je oprana sa 0,1 M HCl, vodom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 3% MeOH i 0,1% mravlje kiseline u hloroformu do 10% MeOH i 0,1% mravlje kiseline u hloroformu) kako bi se dobio proizvod kao narandžasti ulje (0,118 g, 42%). LC/MS (1,623 minuta (ES<+>)), m/z: 433.,98 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,069 (s, 1H), 7,22 (br s, 1H), 3,79 (t, 2H, J = 5,8 Hz), 3,74 (s, 2H), 3,72 - 3,58 (m, 14H), 3,50 - 3,46 (m, 2H), 2,62 (t, 2H, J = 5,8 Hz).
(ii) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-(3-jodopropoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (74)
(a) (S)-5-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4-(triizopropilsililoksi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirol-3-il trifluorometansulfonat (47)
[0363] Trifilični anhidrid (28,4 g, 100,0 mmol, 3,0 ekvivalent) je dodat kapanjem, tokom 25 minuta, snažno mešanom rastvoru ketona 46 (19,5 g, 30,0 mmol, 1,0 ekvivalent) u DCM (550 mL) koji sadrži 2,6-lutidin (14,4 g, 130,0 mmol, 4,0 ekvivalent) na -50°C. Reakciona smeša je mešana tokom 1,5 sata kada LC/MS je ukazala na završenu reakciju. Organska faza je oprana sukcesivno sa vodom (100 mL), zasićenim natrijum bikarbonat (150 mL), rasolom (50 mL), i organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 90/10 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuto ulje (19,5 g, 82 %). LC/MS (4,391 minuta (ES<+>)), m/z: 713,25 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,68 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,02 (t, 1H, J = 1,9 Hz), 4,75 (m, 1H), 4,05 (m, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,15 (ddd, 1H, J = 16,2, 10,3, 2,3 Hz), 2,96 (ddd, 1H, J = 16,2, 4,0, 1,6 Hz), 1,28 - 1,21 (m, 3H), 1,07 (d, 18H, J = 7,2 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H).
(b) (S,E)-(2-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)(5-metoksi-2-nitro-4-(triizopropilsililoksi)fenil)metanon (67)
[0364] Tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (0,41 g, 0,35 mmol, 0,03 ekvivalent) je dodat smeši triflata 47 (8,4 g, 11,8 mmol, 1,0 ekvivalent), E-1-propen-1-ilboronske kiseline (1,42 g, 16,5 mmol, 1,4 ekvivalent) i kalijum fosfata (5,0 g, 23,6 mmol, 2,0 ekvivalent) u suvom dioksanu (60 mL) pod atmosferom azota. Smeša je mešana na 25°C tokom 120 minuta kada LC/MS je ukazala na završenu reakciju. Etil acetat (120 mL) i voda (120 mL) su dodati, organska faza je uklonjena, oprana sa rasolom (20 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 95/5 v/v n-heksan/EtOAc do 90/10 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao žuta pena (4,96 g, 70 %). LC/MS (4,477 minuta (ES<+>)), m/z: 605,0 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,67 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 5,93 (d, 1H, J = 15,4 Hz), 5,67 (s, 1H), 4,65 (m, 1H), 4,04 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 2,71 (m, 1H), 1,72 (dd, 3H, J = 6,8, 1,0 Hz), 1,30 - 1,22 (m, 3H), 1,07 (d, 18H, J = 7,2 Hz), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).
(c) (SE)-(2-amino-5-metoksi-4-(triizopropilsililoksi)fenil) (2-((tercbutildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-il)metanon (68)
[0365] Cink prašina (22,0 g, 0,33 mol, 37 ekvivalent) je dodata, iz delova tokom 20 minuta, rastvoru propenil međuproizvoda 67 (5,5 g, 9,1 mmol, 1,0 ekvivalent) u 5% v/v mravlja kiselina/etanola (55 mL), koristeći ledenu kada kako bi se održala temperatura između 25-30°C. Nakon 30 minuta, reakciona smeša je filtrirana kroz kratak ležaj od celite®. Celite® je opran sa etil acetatom (65 mL) i kombinovane organske materije su oprane sukcesivno sa vodom (35 mL), zasićenim natrijum bikarbonat (35 mL) i rasolom (10 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 90/10 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuto ulje (3,6 g, 69,0 %). LC/MS (4,439 minuta (ES<+>)), m/z: 575,2 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,75 (m, 1H), 6,40 (br s, 1H), 6,28 (m, 1H), 6,11 (d, 1H, J = 15,4 Hz), 5,53 (m, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,36 (m, 2H), 3,93 (br s, 1H), 3,84 (br s, 1H), 3,73 (s, 3H), 2,86 (dd, 1H, J = 15,7, 10,4 Hz), 2,73 (dd, 1H, J = 15,9, 4,5 Hz), 1,80 (dd, 3H, J = 6,8, 1,3 Hz), 1,35 - 1,23 (m, 3H), 1,12 (d, 18H, J = 7,3 Hz), 0,89 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).
(d) (S,E)-alil 2-(2-((terc-butildimetilsililoksi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-(triizopropilsililoksi)fenilkarbamat (69)
[0366] Alil hloroformat (0,83 g, 6,88 mmol, 1,1 ekvivalent) je dodat rastvoru amina 68 (3,6 g, 6,26 mmol, 1,0 ekvivalent) u suvom DCM (80 mL) koji sadrži suvi piridin (1,09 g, 13,77 mmol, 2,2 ekvivalent) na -78°C. Suvi led je uklonjen i reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Nakon mešanja tokom dodatnih 15 minuta, LC/MS je ukazala na završenu reakciju. Organska faza je oprana sukcesivno sa 0,01N HCl (50 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (50 mL), rasolom (10 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom kako bi ostavila bledo žuto ulje koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja (4,12g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (4,862 minuta (ES+)), m/z: 659,2 [M+H]+ .
(e)(S,E)-alil 2-(2-(hidroksimetil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-(triizopropilsililoksi)fenilkarbamat (70)
[0367] Sirov međuproizvod 69 (pretpostavljen 100% prinos, 4,12 g, 6,25 mmol, 1,0 ekvivalent) je rastvoren u smeši sirćetne kiseline (70 mL), metanola (10 mL), THF (10 mL) i vode (20 mL) i omogućeno mu je da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 6 sati reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (500 mL) i oprana sukcesivno sa vodom (2 x 500 mL), zasićenim natrijum bikarbonat (300 mL) i rasolom (50 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 1/99 v/v metanol/DCM do 5/95 v/v metanol/DCM) kako bi se dobio proizvod kao žuto ulje i dodatnih 1 g nereagovanog početnog materijala je prikupljeno. Ovaj materijal je podvrgnut istim uslovima reakcije kao iznad, ali je ostavljen da se meša tokom 16 sati. Nakon obrade i pročišćavanja, dodatni proizvod je izolovan (2,7 g, 79%, 2 koraka) LC/MS (3,742 minuta (ES+)), m/z: 545,2 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,38 (m, 1H), 7,72 (m, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,37 (m, 1H), 6,10 (d, 1H, J = 15,8 Hz), 5,97 (m, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,36 (ddd, 1H, J = 17,2, 3,1, 1,5 Hz), 5,25 (ddd, 1H, J = 10,4, 2,5, 1,3 Hz), 4,78 (m, 1H), 4,65 (dt, 2H, J = 5,7, 1,3 Hz), 3,84 (m, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,04 (dd, 1H, J = 16,7, 10,5 Hz), 2,40 (dd, 1H, J = 16,0, 4,5 Hz), 1,82 (dd, 3H, J = 6,8, 1,0 Hz), 1,36 - 1,26 (m, 3H), 1,14 (d, 18H, J = 7,3 Hz).
(f) (11S,11aS)-alil 11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (71)
[0368] Suvi dimetil sulfoksid (1,16 g, 14,87 mmol, 3,0 ekvivalent) je dodat kapanjem rastvoru oksalil hlorida (0,94 g, 7,43 mmol, 1,5 ekvivalent) u DCM (25 mL) na -78°C pod atmosferom azota. Uz održavanje temperature na -78°C, nakon 10 minuta je kapanjem dodat rastvor primarnog alkohola 70 (2,7 g, 4,96 mmol, 1,0 ekvivalent) u DCM (20 mL). Nakon dodatnih 15 minuta, suvi trietilamin (2,5g, 24,78 mmol, 5,0 ekvivalent) je dodat, i reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Reakciona smeša je oprana sukcesivno sa hladnim 0,1N HCl (50 mL), zasićenim natrijum vodonik karbonatom (50 mL) i rasolom (10 mL) i organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrisan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio proizvod kao žuto ulje koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja (2,68g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (3,548 minuta (ES+)), m/z: 543,2 [M+H]+ .
(g) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (72)
[0369] terc-butildimetilsililtrifluorometan sulfonat (3,93 g, 14,87 mmol, 3,0 ekvivalent) je dodat rastvoru karbinolamina 71 (pretpostavljen 100% prinos, 2,68 g, 4,96 mmol, 1,0 ekvivalent) i 2,6-lutidina (2,12 g, 19,83 mmol, 4,0 ekvivalent) u suvom DCM (40 mL) na 0°C pod atmosferom azota. Nakon 10 minuta, reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom dodatnih 60 minuta. Organska faza je oprana sukcesivno sa vodom (10 mL), zasićenim natrijum bikarbonatom (10 mL) i rasolom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, hloroform do 2/98 v/v Metanol/hloroform) kako bi se dobio proizvod kao žuto ulje (2,0g, 63%, 2 koraka). LC/MS (4,748 minuta (ES<+>)), m/z: 657,2 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,19 (s, 1H), 6,86 (m, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,22 (d, 1H, J = 15,4 Hz), 5,81 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 5,78 (m, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,11 (d, 1H, J = 50 Hz), 5,08 (m, 1H), 4,58 (dd, 1H, J = 13,4, 5,4 Hz), 4,35 (dd, 1H, J = 13,2, 5,7 Hz), 3,83 (s, 3H), 3,76 (s, 1H), 3,00 (dd, 1H, J = 15,6, 11,0 Hz), 2,53 (m, 1H), 1,81 (dd, 3H, J = 6,8, 0,9 Hz), 1,30 - 1,18 (m, 3H), 1,08 (d, 9H, J = 2,3 Hz), 1,06 (d, 9H, J = 2,3 Hz), 0,86 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,18 (s, 3H).
(h) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (73) [0370] Litijum acetat dihidrat (0,31 g, 3,04 mmol, 1,0 ekvivalent) je dodat rastvoru diazepina 72 (2,0 g, 3,04 mmol, 1,0 ekvivalent) u mokrom DMF (20 mL) na 25°C i mešan je tokom 4 sata. Reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (200 mL) i oprana sukcesivno sa 0,1M limunskom kiselinom (50 mL, pH 3), vodom (50 mL) i rasolom (10 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 50/50 v/v n-heksan/EtOAc do 25/75 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca (0,68g, 45 %). LC/MS (3,352 minuta (ES+)), m/z: 501,1 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,02 (s, 1H), 6,66 (m, 1H), 6,53 (s, 1H), 6,03 (d, 1H, J = 15,5 Hz), 5,80 (s, 1H), 5,63 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 5,55 (m, 1H), 5,29 (m, 1H), 4,87 (m, 2H), 4,39 (dd, 1H, J = 13,5, 4,2 Hz), 4,20 (dd, 1H, J = 13,2, 5,7 Hz), 3,73 (s, 3H), 3,59 (m, 1H), 2,81 (dd, 1H, J = 16,1, 10,5 Hz), 2,35 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 1,61 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,67 (s, 9H), 0,05 (s, 3H), 0,00 (s, 3H).
(i) (11S,11aS)-alil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-(3-jodopropoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (74)
[0371] Diiodopropan (0,295 g, 1,00 mmol, 5,0 ekvivalent) i kalijum karbonat (0,028 g, 0,20 mmol, 1,0 ekvivalent) su dodati rastvoru fenola 33 (0,100 g, 0,020 mmol, 1,0 ekvivalent) u suvom acetonu (5 mL). Reakciona smeša je zagrejana na 60°C tokom 6 sati kada je LC/MS pokazao da je završena reakcija. Reakciona smeša je koncentrisani do suvoće pod redukovanim pritiskom i ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 75/25 v/v nheksan/EtOAc do 50/50 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bezbojno ulje (0,074 g, 56%). LC/MS (3,853 minuta (ES+)), m/z: 669,0 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,26 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,24 (d, 1H, J = 15,3 Hz), 5,87 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 5,78 (m, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,12 (m, 2H), 4,65 (m, 2H), 4,41 (m, 1H), 4,11 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,81 (m, 1H), 3,40 (t, 2H, J = 6,7 Hz), 3,05 (dd, 1H, J = 16,3, 10,1 Hz), 2,57 (m, 1H), 2,34 (m, 2H), 1,84 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 0,92 (s, 9H), 0,28 (s, 3H), 0,26 (s, 3H).
(iii) (11S,11as)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat 79)
[0372]
(a) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)-4-((E)-prop-1-en-1-il)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (75)
[0373] Trietilamin (0,256 mL, 1,84 mmol, 2,2 ekvivalent) je dodat mešanom rastvoru amina 68 (0,480 g, 0,835 mmol, 1,0 ekvivalent) i trifosgena (0,089 g, 0,301 mmol, 0,36 ekvivalent) u suvom THF (15 mL) na 5°C (ledena kada). Napredak rekacije izocijanata je praćen periodičnim uklanjanjem alikvota reakcione smeše i gašenjem sa metanolom i izvođenjem LCMS analiza. Nakon što je reakcija izocijanata završena rastvor Alloc-Val-Ala-PABOH I5 (0,473 g, 1,25 mmol, 1,5 ekvivalent) i trietilamina (0,174 mL, 1,25 mmol, 1,5 ekvivalent) u suvom THF (10 mL) je brzo dodat injekcijom sveže pripremljenom izocijanatu. Reakciji je omogućeno da se meša na 40°C tokom 4 sata praćeno sa mešanjem na sobnoj temperaturi preko noći. Smeša je koncentrisani pod redukovanim pritiskom, i pročišćena fleš hromatografijom (silika gel, 20/80 v/v n-heksan/EtOAc do 50/50 v/v n-heksan/EtOAc, zatim 1/99 v/v DCM/MeOH do 5/95 v/v DCM/MeOH) kako bi se dobio proizvod kao žutu čvrstu supstancu (0,579 g, 71%). LC/MS (4,468 minuta (ES+)), m/z: 978,55 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,63 (br s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,78 (br s, 1H), 7,53 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,31 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 6,76 (s, 1H), 6,59 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,36 (br s, 1H), 6,04 (d, 1H, J = 15,9 Hz), 5,90 (m, 1H), 5,55 (m, 1H), 5,33 - 5,21 (m, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,66 (m, 2H), 4,57 (dd, 2H, J = 5,6, 1,0 Hz), 3,98 (dd, 1H, J = 7,3, 6,8 Hz), 3,90 (m, 1H), 3,81 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,82 (dd, 1H, J = 15,4, 9,6 Hz), 2,72 (dd, 1H, J = 15,9, 3,5 Hz), 2,17 (m, 1H), 1,78 (dd, 3H, J = 6,5, 0,8 Hz), 1,46 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 (d, 18H, J = 7,1 Hz), 0,97 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,83 (s, 9H), 0,04 (s, 3H), 0,01 (s, 3H).
(b) Alil ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(hidroksimetil)-4-((E)-prop-1-en-1-il)-2,3-dihidro-1H-pirol-1-karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (76)
[0374] Silil etar 75 (1,49 g, 1,52 mmol, 1,0 ekvivalent) je rastvoren u 7:1:1:2 smeši sirćetna kiselina/metanol/tetrahidrofuran/voda (14:2:2:4 mL) i omogućeno joj je da se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 2 sata reakcija je rastvorena sa EtOAc (100 mL), oprana sekvencijalno sa vodom, vodenim natrijum bikarbonatom, zatim rasolom. Organska faza je zatim osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 100/0 zatim 99/1 do 92/8 v/v DCM/MeOH) kako bi se dobio proizvod kao narandžasta čvrsta supstanca (1,2 g, 92%). LC/MS (3,649 minuta (ES<+>)), m/z: 865,44 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,44 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,69 (br s, 1H), 7,53 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,32 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,78 (s, 1H), 6,56 (m, 2H), 6,32 (br s, 1H), 6,05 (d, 1H, J = 14,9 Hz), 5,90 (m, 1H), 5,56 (m, 1H), 5,30 (m, 2H), 5,22 (m, 1H), 5,10 (d, 2H, J = 3,1 Hz), 4,73 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,57 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 4,01 (m, 1H), 3,79 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 2,98 (dd, 1H, J = 16,3, 10,2 Hz), 2,38 (dd, 1H, J = 16,6, 4,1 Hz), 2,16 (m, 1H), 1,78 (dd, 3H, J = 6,8, 0,9 Hz), 1,46 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 (d, 18H, J = 7,4 Hz), 0,97 (d, 3H, J = 6,7 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
(c) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (77)
[0375] Suvi dimetil sulfoksid (0,180 g, 2,3 mmol, 3,0 ekvivalent) je dodat kapanjem rastvoru oksalil hlorida (0,147 g, 1,1mmol, 1,5 ekvivalent) u DCM (10 mL) na -78°C pod atmosferom azota. Uz održavanje temperature na -78°C, nakon 20 minuta, rastvor primarnog alkohol 76 (0,666 g, 0,77 mmol, 1,0 ekvivalent) u DCM (10 mL) je dodat kapanjem. Nakon dodatnih 15 minuta, suvi trietilamin (0,390 g, 3,85 mmol, 5,0 ekvivalent) je dodat, i reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Reakciona smeši je oprana sukcesivno sa hladnim 0,1N HCl (10 mL), zasićenim natrijum vodonik karbonat (10 mL) i rasolom (5 mL).
Organski sloj je zatim osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrisani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je zatim pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 50/50 v/v nheksan/EtOAc do 25/75 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bela čvrsta supstanca (0,356g, 54 %). LC/MS (3,487 minuta (ES+)), m/z: 862,2 [M+H]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,34 (br s, 1H), 7,47 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,17 (s, 1H), 7,14 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 6,86 (br s, 1H), 6,65 (br s, 1H), 6,42 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,22 (d, 1H, J = 14,4 Hz), 5,80 (m, 1H), 5,40 (m, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,21 (d, 2H, J = 9,6 Hz), 5,06 (d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,90 (m, 1H), 4,58 (m, 3H), 3,98 (m, 1H), 3,84 (m, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,50 (m, 1H), 3,05 (dd, 1H, J = 16,0, 10,3 Hz), 2,76 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 1,80 (dd, 3H, J = 6,7, 0,8 Hz), 1,44 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,16 (m, 3H), 1,01 (d, 18H, J = 6,6 Hz), 0,96 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
(d) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (78)
[0376] terc-butildimetilsililtrifluorometan sulfonat (0,46 g, 1,74mmol, 3,0 ekvivalent) je dodat rastvoru sekundarnog alkohola 77 (0,5 g, 0,58 mmol, 1,0 ekvivalent) i 2,6-lutidina (0,25 g, 2,32 mmol, 4,0 ekvivalent) u suvom DCM (10 mL) na 0°C pod atmosferom azota. Nakon 10 minuta, reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom dodatnih 120 minuta. Organska faza je zatim opran sukcesivno sa vodom (10 mL), zasićenim natrijum bikarbonat (10 mL) i rasolom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 50/50 v/v n-heksan/EtOAc) kako bi se dobio proizvod kao bela čvrsta supstanca (0,320 g, 57 %). LC/MS (4,415 minuta (ES<+>)), m/z: 976,52 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,31 (br s, 1H), 7,48 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (s, 1H), 7,14 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,89 (s, 1H), 6,65 (s, 1H), 6,38 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 6,25 (d, 1H, J = 14,6 Hz), 5,93 (m, 1H), 5,85 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 5,50 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 5,24 (m, 2H), 5,15 (d, 1H, J = 12,5 Hz), 4,86 (d, 1H, J = 12,2 Hz), 4,62 (m, 3H), 4,01 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,78 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,20 (m, 1H), 1,84 (dd, 3H, J = 6,6, 0,7 Hz), 1,48 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,20 (m, 3H), 1,05 (d, 9H, J = 2,9 Hz), 1,03 (d, 9H, J = 2,9 Hz), 0,99 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,27 (s, 3H), 0,14 (s, 3H).
(e) (11S,11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-(terc-butildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7-metoksi5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (79)
[0377] Litijum acetat dihidrat (0,010 g, 0,10 mmol, 1,0 ekvivalent) je dodat rastvoru silil etra 78 (0,100 g, 0,10 mmol, 1,0 ekvivalent) u mokrom DMF (2 mL) na 25°C tokom 3 sata.
Reakciona smeša je zatim rastvorena sa etil acetatom (20 mL) i oprana sukcesivno sa 0,1M limunskom kiselinom (20 mL, pH 3), vodom (20 mL) i rasolom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, 5/95 v/v metanol/DCM) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuto ulje (0,070 g, 83 %). LC/MS (3,362 minuta (ES<+>)), m/z: 820,2 [M+H]<+>.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,39 (s, 1H), 7,48 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,25 (s, 1H), 7,12 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 6,88 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,47 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,24 (d, 1H, J = 15,2 Hz), 6,03 (s, 1H), 5,92 (m, 1H), 5,84 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 5,50 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 5,26 (m, 2H), 5,18 (d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,80 (d, 1H, J = 12,4 Hz), 4,66 - 4,60 (m, 3H), 4,02 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,81 (m, 1H), 3,03 (m, 1H), 2,57 (m, 1H), 2,19 (m, 1H), 1,84 (dd, 3H, J = 6,8, 0,8 Hz), 1,48 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,00 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,87 (s, 9H), 0,26 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
(iv) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-jodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (66 ili DL4)
[0378]
(a) (11S,11aS)-alil8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benziloksi)karbonil)-11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloksi)propoksi)-11-(terc-butildimetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (80)
[0379] Kalijum karbonat (0,030 g, 0,21 mmol, 1,0 ekvivalent) je dodat rastvoru fenola 79 (0,175 g, 0,21 mmol, 1,0 ekvivalent) i jodo veznika 74 (0,214 g, 0,32 mmol, 1,5 ekvivalent) u acetonu (10 mL). Reakciona smeša je zagrejana pod atmosferom azota na 75°C u zapečaćenoj boci tokom 17 sati. Reakciona smeša je koncentrisana do suvoće pod redukovanim pritiskom i pročišćena fleš hromatografijom (silika gel, 2/98 v/v metanol/DCM do 5/95 v/v metanol/DCM) kako bi se dobio proizvod kao bledo žuta čvrsta supstanca (0,100 g, 35%). LC/MS (4,293 minuta (ES+)), m/z: 1359,13 [M]+ .
(b) (11S, 11aS)-alil 8-(3-((11S, 11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(aliloksikarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)benziloksi)karbonil)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloksi)propoksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (81)
[0380] Tetra-n-butilamonijum fluorid (1M, 0,22 mL, 0,22 mmol, 2,0 ekvivalent) je dodat rastvoru silil etra 80 (0,150 g, 0,11 mmol, 1,0 ekvivalent) u suvom THF (2 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta, nakon čega je LC/MS ukazala na završenu reakciju. Reakciona smeša je rastvorena sa etil acetatom (10 mL) i oprana sekvencijalno sa vodom (5 mL) i rasolom (5 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom kako bi ostavila žutu čvrstu supstancu. Pročišćavanje fleš hromatografijom (silika gel, 6/94 v/v metanol/DCM do 10/90 v/v metanol/DCM) dalo je proizvod kao bledo žutu čvrstu supstancu (0,090 g, 73%). LC/MS (2,947 minuta (ES+)), m/z: 1154,0 [M+Na]+ .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,39 (br s, 1H), 7,39 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,18 (d, 2H, J = 10,6 Hz), 7,10 (m, 3H), 6,86 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 6,74 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 6,22 (dd, 2H, J = 15,3, 6,6 Hz), 5,85 (m, 2H), 5,74 (m, 3H), 5,52 (m, 2H), 5,22 (m, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,57 (m, 6H), 4,41 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 3,85 (m, 11H), 3,06 (m, 2H), 2,76 (m, 2H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,79 (d, 6H, J = 6,4 Hz), 1,40 (d, 3H, J = 6,1 Hz), 0,90 (m, 6H).
(c) (11S,11aS)-4-((R)-2-((R)-2-amino-3-metilbutanamido)propanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11adihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (65)
[0381] Tetrakis(trifenilfospen)paladijum(0) (0,005 g, 0,005 mmol, 0,06 ekvivalent) je dodat rastvoru bis-karbinolamin 81 (0,090 g, 0,08 mmol, 1,0 ekvivalent) i pirolidin (16 µL, 0,20 mmol, 2,5 ekvivalent) u suvom DCM (5 mL). Nakon 20 minuta, reakciona smeša je rastvorena sa DCM (10 mL) i oprana sekvencijalno sa zasićenim amonijum hloridom (5 mL) i rasolom (5 mL), osušena preko MgSO4, filtrirana i rastvarač je uklonjen pod redukovanim pritiskom kako bi ostavila sirov proizvod kao bledo žutu čvrstu supstancu koja je korišćen u sledećem koraku bez daljeg pročišćavanja (0,075 g, pretpostavljen 100% prinos). LC/MS (2,060 minuta (ES+)), m/z: 947,2 [M+H]+ .
(d) (11S,11aS)-4-((20S,23S)-1-jodo-20-izopropil-23-metil-2,18,21-triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetracosanamido)benzil 11-hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloksi)propoksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (66 ili DL4)
[0382] EDCI (0,015 g, 0,08 mmol, 1,0 ekvivalent) je dodat rastvoru amina 65 (pretpostavljen 100% prinos 0,075 g, 0,08 mmol, 1,0 ekvivalent) i jodoacetamid-PEG4-kiseline I7 (0,034 g, 0,08 mmol, 1,0 ekvivalent) u suvom dihlorometanu (5 mL) i reakcija je mešana u mraku. Nakon 50 minuta, dodatna količina jodoacetamid-PEG4-kiseline I7 (0,007 g, 0,016 mmol, 0,2 ekvivalent) je dodat zajedno sa dodatnom količinom EDCI (0,003 g, 0,016 mmol, 0,2 ekvivalent). Nakon ukupno2,5 sata, reakciona smeša je rastvorena sa dihlorometanom (15 mL) i oprana sekvencijalno sa vodom (10 mL) i rasolom (10 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrisana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je pročišćen fleš hromatografijom (silika gel, hloroform 100% do 90:10 v/v hloroform:Metanol). Čisti fragmenti su kombinovani kako bi se dobio proizvod (0,0254 g, 23%, 2 koraka). Sirov fragmenti su prikupljeni i pročišćeni preparativnom TLC (silika gel, 90:10 v/v hloroform:Metanol) kako bi se dobila druga serija proizvoda (0,0036 g, 3%, 2 koraka). LC/MS (2,689 minuta (ES+)), m/z: 681,01/2[M+2H]+ .
[0383] Razumeće se da jedinjenja sintetisana u ovom Primeru 1 mogu biti konjugovana sa anti-DLL3 antitelima kao što je obelodanjeno ovde kako bi se dobili obelodanjeni ADC 1 - 5.
Primer 2
Generisanje anti-DLL3 antitela
[0384] Mišja anti-DLL3 antitela su proizvedena na sledeći način. U prvoj kampanji imunizacije, tri miša (jedan od svakog od sledećih sojeva: Balb/c, CD-1, FVB) su inokulisani ljudskim DLL3-fc proteinom (hDLL3-Fc) emulgovanim sa jednakom zapreminom TiterMax® ili alum adjuvansa. HDLL3-Fc fuzioni konstrukt je nabavljen od Adipogen International (kataloški broj AG-40A-0113). Početna imunizacija je izvedena sa emulzijom od 10 µg hDLL3-Fc po mišu u TiterMax-u. Miševi su zatim pojačani dvonedeljno sa 5 µg hDLL3-Fc po mišu u alum adjuvansu. Poslednja injekcija pre fuzije je bila sa 5 µg hDLL3-Fc po mišu u PBS.
[0385] U drugoj kampanji imunizacije, šest miševa (po dva od sledećih sojeva: Balb/c, CD-1, FVB), su inokulisani ljudskim DLL3-His proteinom (hDLL3-His), emulgovanim sa jednakom zapreminom TiterMax® ili alum adjuvansa. Rekombinantni hDLL3-His protein je prečišćen od supernatanata CHO-S ćelija projektovanih da prekomerno eksprimiraju hDLL3-His. Početna imunizacija je bila sa emulzijom od 10 µg hDLL3-His po mišu u TiterMax-u. Miševi su zatim pojačani dvonedeljno sa 5 µg hDLL3-His po mišu u alum adjuvansu.
Poslednja injekcija je bila sa 2x105 HEK-293T ćelija su projektovanih da prekomerno eksprimiraju hDLL3.
[0386] ELISA testovi čvrste faze su korišćeni za pregled mišjeg seruma za mišja IgG antitela specifična za ljudski DLL3. Pozitivni signal iznad pozadine je bio indikativan za antitela specifična za DLL3. Ukratko, ploče sa 96 komorica (VWR International, Kat. # 610744) su obložene sa rekombinantnim DLL3-His od 0,5 µg/ml u ELISA obložnom puferu preko noći. Nakon ispiranja sa PBS koji sadrži 0,02% (v/v) Tween 20, komorice su blokirane sa 3% (v/v) BSA u PBS, 200 µL/komorica tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Mišji serum je titriran (1:100, 1:200, 1:400 i 1:800) i dodat na ploče obložene sa DLL3 pri 50 µL/komorica i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ploče se isperu i zatim inkubiraju sa 50 µL/komorica HRP-označenog kozjeg anti-mišji IgG razblaženog 1:10,000 u 3% BSA-PBS ili 2% FCS u PBS u toku 1 sata na RT. Ploče su ponovo isprane i dodato je 40 µL/komorica rastvora TMB supstrata (Thermo Scientific 34028) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon razvijanja, jednaka zapremina od 2N H2SO4doda se da se zaustavi razvoj supstrata i ploče se analiziraju spektrofotometrom na OD 450.
[0387] Sera-pozitivni imunizovani miševi su žrtvovani i drenirani limfni čvorovi (poplitealni, ingvinalni i medijalni ilijak) su secirani i korišćeni kao izvor za ćelije koje proizvode antitela. Ćelijske suspenzije B ćelija (približno 229x10<6>ćelije od hDLL3-Fc imunizovanih miševa, i 510x106 ćelije od hDLL3-His imunizovanih miševa) su fuzionisane sa ne-izlučujućim P3x63Ag8.653 ćelijama mijeloma u odnosu 1:1 pomoću elektro-ćelijske fuzije koristeći model BTX Hibrimmune Sistem (BTX Harvard Apparatus). Ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za selekciju hibridoma koji se sastoji od DMEM medijuma dopunjenog azaserinom, 15% fetalni klon I serumom, 10% BM Condimed (Roche Applied Sciences), 1 mM neesencijalnih aminokiselina, 1 mM HEPES, 100 IU penicilin-streptomicinom, i 50 µM 2-merkaptoetanola, i kultivisani su u četiri T225 boce u 100 mL medijuma za selekciju po boci. Boce su stavljene u vlažni inkubator na 37°C koji sadrži 5% CO2i 95% vazduha za šest do sedam dana.
[0388] Šestog ili sedmog dana posle fuzija, ćelije hibridomske biblioteke su sakupljene iz posuda i stavljene u jednu ćeliju po komorici (korišćenjem FACSAria I ćelijskog sortera) u 200 µL dopunjene hibridomske selekcione podloge (kao što je gore opisano) u 64 Falcon 96-komoričnih ploča, i 4896-komoričnih ploča za kampanju imunizacije hDLL3-His. Ostatak biblioteke je čuvan u tečnom azotu.
[0389] Hibridomi su kultivisani 10 dana i supernatanti su ispitivani na antitela specifična za hDLL3 korišćenjem protočne citometrije koja je izvršena na sledeći način.1x10<5>po komorici HEK-293T ćelija konstruisanih da prekomerno eksprimiraju ljudski DLL3, mišji DLL3 (prethodno obojen bojom), ili cinomolgus DLL3 (prethodno obojen sa Dylight800) su inkubirani tokom 30 minuta sa 25 µL supernatanta hibridoma. Ćelije su isprane sa PBS/2% FCS i zatim inkubirane sa 25 µL po uzorku DyeLight 649 označenim kozjim anti-mišjim IgG, Fc fragment specifičnim sekundarnim razblaženim 1:300 u PBS/2% FCS. Posle 15 minuta inkubacije ćelije su isprane dva puta sa PBS/2% FCS i ponovo suspendovane u PBS/2% FCS sa DAPI i analizirane protočnom citometrijom za fluorescenciju koja je veća od ćelija obojenih sa izotipom kontrolnog antitela. Preostale neiskorišćene ćelije biblioteke hibridoma su zamrznute u tečnom azotu za buduće testiranje biblioteka i skrining.
[0390] Kampanja imunizacije hDLL3-His dala je približno 50 mišjih anti-hDLL3 antitela i hDLL3-Fc kampanja imunizacije dala je približno 90 mišjih anti-hDLL3 antitela.
Primer 3
Sekvenciranje Anti-DLL3 antitela
[0391] Na osnovu prethodno navedenog, određen broj primera različitih monoklonskih antitela koja vezuju imobilizovane ljudske DLL3 ili h293-hDLL3 ćelije sa očigledno visokim afinitetom su odabrani za sekvenciranje i dalju analizu. Kao što je prikazano tabelarno na Slikama Slika 3A i 3B, analiza sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca (Slika 3A) i varijabilnih regiona teškog lanca (Slika 3B) iz odabranih monoklonskih antitela dobijenih u Primeru 2 potvrdila je da mnoga imaju nove regione za određivanje komplementarnosti i često prikazuju nove VDJ aranžmane. Treba primetiti da su regioni za određivanje komplementarnosti i okvirni regioni navedeni na Slikama 3A i 3B definisani prema Kabat i dr. (supra) koristeći vlasničku verziju Abysis baze podataka.
[0392] Početno odabrane hibridoma ćelije koje eksprimiraju željena antitela su lizirane u Trizol® reagensu (Trizol® Plus RNA Purification Sistem, Life Technologies) kako bi se pripremila RNK koja kodira antitela. Između 10<4>i 10<5>ćelije su ponovo suspendovane u 1 mL Trizola i snažno mućkane nakon dodavanja 200 µL hloroforma. Uzorci su zatim centrifugirani na 4°C tokom 10 minuta i vodena faza je prebačena u svežu epruvetu sa mikrofugom i dodata je jednaka zapremina 70% etanola. Uzorak je napunjen na RNeasy Mini spin kolonu, stavljen u epruvetu za sakupljanje od 2 mL i obrađen prema uputstvima proizvođača. Ukupna RNK je ekstrakovana eluiranjem, direktno u membranu spin kolone sa 100 µL RNaza-slobodne vode. Kvalitet RNK preparata je određen fragmentisanjem 3 µL u 1% agaroznom gelu pre skladištenja na -80°C do upotrebe.
[0393] Varijabilni region teškog lanca Ig svakog hibridoma je amplifikovan korišćenjem 5' prajmer mešavine koja sadrži 32 prajmera lidera sekvenci specifičnih za miša, kreiranih da ciljaju kompletan mišji VHrepertoar u kombinaciji sa 3' mišjim Cγ prajmerom specifičnim za sve mišje Ig izotipove. Slično, prajmer mešavina koja sadrži trideset dve 5' Vκ lider sekvence dizajnirane da amplifikuju svaku od Vκ porodica miša je korišćena u kombinaciji sa jednim obrnutim pragom specifičnim za mišji kappa konstantni region, kako bi se amplifikovao i sekvencirao kappa laki lanac. Za antitela koja sadrže lambda laki lanac, amplifikacija je izvedena korišćenjem tri 5' VLliderske sekvence u kombinaciji sa jednim obrnutim pragom specifičnim za konstantni region lambda miša. VHi VLtranskripti su amplifikovani iz 100 ng ukupne RNK korišćenjem Qiagen One Step RT-PCR kompleta kao što sledi. Izvršeno je ukupno osam RT-PCR reakcija za svaki hibridom, četiri za Vκ laki lanac i četiri za Vγ teški lanac. PCR reakcione smeše su uključivale 3 µL RNK, 0,5 µL od 100 µM prajmera teškog lanca ili prajmera kappa lakog lanca (prilagođene sintetizovane od strane Integrated Data Technologies), 5 µL 5 × RT-PCR pufera, 1 µL dNTP, 1 µL enzimske mešavine koja sadrži reverznu transkriptazu i DNK polimerazu, i 0,4 µL inhibitora ribonukleaze RNasin (1 jedinica). Program termalnog ciklera je bio RT korak 50°C tokom 30 minuta, 95°C tokom 15 minuta, praćeno sa 30 ciklusa (95°C u trajanju od 30 sekundi, 48°C u trajanju od 30 sekundi, 72°C u trajanju od 1 minuta). Zatim je završena inkubacija na 72°C u trajanju od 10 minuta.
[0394] Ekstrakovani PCR proizvodi su sekvencionirani korišćenjem istih specifičnih prajmera varijabilnih regiona kao što je gore opisano za amplifikaciju varijabilnih regiona. Kako bi se pripremili PCR proizvodi za direktno sekvencioniranje DNK, oni su prečišćeni korišćenjem QIAquick™ PCR kompleta za prečišćavanje (Qiagen) prema protokolu proizvođača. DNK je eluirana iz spin kolone korišćenjem 50 µL sterilne vode i zatim sekvencirana direktno iz oba lanca. Nukleotidne sekvence su analizirane korišćenjem IMGT alata za analizu sekvenci(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html) kako bi se identifikovale genomske linije V, D i J gena sa najvećom homologijom sekvence.
Izvedene sekvence su upoređene sa poznatim germlinijskim DNK sekvencama Ig V- i J-regiona poravnanjem VHi VLgena za bazu podataka mišjih germlinija koristeći vlasničku bazu podataka sekvenci antitela.
[0395] Tačnije, Slika 3A prikazuje susedne aminokiselinske sekvence brojnih novih varijabilnih regiona mišjeg lakog lanca iz anti-DLL3 antitela i primernih varijabilnih regiona humanizovanog lakog lanca izvedenih iz reprezentativnih mišjih lakih lanaca. Slično tome, Slika 3B prikazuje susedne aminokiselinske sekvence brojnih novih varijabilnih regiona mišjeg teškog lanca od istih anti-DLL3 antitela, i primerne varijabilne regione humanizovanog teškog lanca izvedenog iz istih mišjih antitela koji daje humanizovane lake lance. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona mišjeg lakog i teškog lanca date su u SEQ ID NO: 21 - 387, neparni brojevi, dok su aminokiselinske sekvence humanizovanih lakih i teških lanaca date u SEQ ID NO: 389 - 407, neparni brojevi.
[0396] Na taj način, uzete zajedno, Slike 3A i 3B daju anotirane sekvence brojnih operabilnih mišjih anti-DLL3 antitela (nazvana SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150) i primerna humanizovana antitela (nazvana hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56). Treba primetiti da se te iste oznake mogu odnositi na klon koji proizvodi predmetno antitelo i, kao takve, upotrebu bilo koje posebne oznake treba tumačiti u kontekstu obelodanjenja oko nje.
[0397] Za potrebe predmetne prijave, SEQ ID NO svakog pojedinačnog antitela su sekvencijalni neparni brojevi. Tako mAb SC16.3 sadrži aminokiseline SEQ ID NO: 21 i 23 za varijabilne regione lakog i teškog lanca. S tim u vezi, SC16.4 sadrži SEQ ID NO: 25 i 27, SC16.5 sadrži SEQ ID NO: 29 i 31, i tako dalje. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline za svaku aminokiselinsku sekvencu antitela je uključena u priloženi popis sekvenci i ima SEQ ID NO neposredno pre odgovarajuće aminokiseline SEQ ID NO. Tako, na primer, SEQ ID NO od VLi VHod SC16.3 antitela su 21 i 23, respektivno, i SEQ ID NO sekvence nukleinske kiseline od VLi VHod SC16.3 antitela su SEQ ID NO: 20 i 22, respektivno.
[0398] Što se tiče prijavljenih sekvenci, treba napomenuti da su, usled anomalija sekvenciranja, određene sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca bile prevremeno skraćene tokom procedure. Ovo je rezultovalo u izostavljanju jedne ili više aminokiselina u prikazanoj sekvenci okvira 4. U takvim slučajevima, kompatibilne aminokiseline (određene pomoću pregleda odgovarajućih sekvenci iz drugih klonova) su date u suštini za kompletiranje sekvence varijabilnog regiona pacijenta. Na primer, ostaci „IK“ su dodati na terminalni kraj sekvence lakog lanca SC16.22 na Slikama 3A (SEQ ID NO: 73) da pruže operabilni varijabilni region lakog lanca sa kompletnim okvirom 4. Baze koje kodiraju dodate aminokiseline su slično dodavane odgovarajućoj sekvenci nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 72) kako bi se osigurala konzistentnost. U svakom takvom slučaju na Slikama 3A i 3B (ali ne u priloženom spisku sekvenci) dodate aminokiseline su podvučene i podebljane kako bi se lako prepoznale.
Primer 4
Generisanje himernih i humanizovanih anti-DLL3 antitela
[0399] Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, određena mišja antitela iz Primera 2 (SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 i SC16.56) su korišćena za dobijanje himernih antitela koja sadrže ljudske konstantne regione sa mišjim varijabilnim regionima, i humanizovana antitela koja sadrže mišje CDR su transplantirane u ljudsko akceptorsko antitelo. U poželjnim primerima, ova izvedena antitela (himerna ili humanizovana) mogu biti inkorporirana u obelodanjene DLL3 konjugata.
[0400] Specifičnije himerna anti-DLL3 antitela su generisana korišćenjem tehnika koje su prepoznate u struci, kao što sledi. Ukupna RNK je ekstrakovana iz hibridoma i amplifikovana kao što je prikazano u Primeru 3. Podaci koji se odnose na segmente V, D i J gena od VHi VLlanaca mišjih antitela su dobijeni iz izvedenih sekvenci nukleinskih kiselina. Setovi prajmera specifični za lidersku sekvencu VHi VLlanca antitela su dizajnirani korišćenjem sledećih restrikcionih mesta: AgeI i XhoI za VHfragmente i XmaI i DraIII za VLfragmente. PCR proizvodi su prečišćeni QIAquick PCR kompletom za prečišćavanje (Qiagen), nakon čega je usledila digestija sa restrikcionim enzimima AgeI i XhoI za VHfragmente i XmaI i DraIII za VLfragmente. VHi VLdigestirani PCR proizvodi su prečišćeni i ligirani, respektivno, u ljudski IgGl (SEQ ID NO.6) vektor eksprimiranja konstantnog regiona teškog lanca ili kappa CL(SEQ ID NO.5) vektor eksprimiranja ljudskog konstantnog regiona lakog lanca.
[0401] Reakcije ligacije izvedene su na sledeći način u ukupnoj zapremini od 10 µL sa 200U T4-DNK ligazom (New England Biolabs), 7,5 µL digestiranog i prečišćenog gen-specifičnog PCR proizvoda i 25 ng linearizovanog DNK vektora. Kompetetivne E. coli DH10B bakterije (Life Technologies) su transformisane toplotnim šokom na 42°C sa 3 µL proizvodom ligacije i stavljene na ampicilinske ploče pri koncentraciji od 100 µg/mL. Posle prečišćavanja i razgradnje amplifikovanih proizvoda za ligaciju, VHfragment je kloniran u AgeI-XhoI restrikciona mesta pEE6.4HuIgG1 vektora eksprimiranja (Lonza) i VLfragment je kloniran u XmaI-DraIII restrikciona mesta pEE12.4Hu-Kappa vektora eksprimiranja (Lonza).
[0402] Himerna antitela su eksprimirana ko-transfekcijom HEK-293T ćelija sa pEE6.4HuIgG1 i pEE12.4Hu-Kappa vektorima eksprimiranja. Pre transfekcije, HEK-293T ćelije su kultivisane u pločama od 150 mm pod standardnim uslovima u Dulbecco modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog FCS, 100 µg/mL streptomicina i 100 U/mL penicilina G. Za transientnu transfekciju, ćelije su uzgajane do 80% konfluentnosti. 12,5 µg svake od pEE6.4HuIgG1 i pEE12.4Hu-Kappa vektorske DNK je dodato u 50 µL HEK-293T transfekcionog reagensa u 1,5 mL Opti-MEM.
Mešavina je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi i nanesena na ploču. Supernatanti su sakupljeni tri do šest dana nakon transfekcije. Supernanti za kulturu koji sadrže rekombinantna himerna antitela su očišćeni iz ćelijskih ostataka centrifugiranjem na 800×g tokom 10 minuta i čuvani na 4°C. Rekombinantna himerna antitela su prečišćena pomoću hromatografije afiniteta Proteina A.
[0403] Ista mišja anti-DLL3 antitela (npr. SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 i SC16.56) su takođe korišćena za dobijanje CDR-graftovanih ili humanizovanih antitela. U tom smislu, mišja antitela su humanizovana korišćenjem vlasničkog kompjuterski podržanog postupka CDR-graftovanja (Abysis Database, UCL Business) i standardnih tehnika molekularnog inženjersinga, kao što sledi. Ljudski okvirni regioni varijabilnih regiona su dizajnirani na osnovu najviše homologije između okvirnih sekvenci i CDR kanoničkih struktura sekvence ljudskih germinativnih antitela, i okvirnih sekvenci i CDR relevantnih mišjih antitela. Za svrhu analize, dodeljivanje aminokiselina na svaki od CDR domena je urađeno u skladu sa Kabat i dr. numerisanjem. Jednom kada su varijabilni regioni izabrani, oni su generisani iz sintetičkih genskih segmenata (Integrated DNA Technologies). Humanizovana antitela su klonirana i eksprimirana korišćenjem molekularnih postupaka opisanih iznad za himerna antitela.
[0404] Genetski sastav za izabrane ljudske akceptorske varijabilne regione prikazan je u TABELI 3 neposredno u nastavku za svako humanizovano antitelo. Sekvence opisane u TABELI 3 odgovaraju anotovanim sekvencama teškog i lakog lanca prikazanim na Slikama 3A i 3B za predmetne klonove. Specifičnije, unosi u TABELI 3 u nastavku odgovaraju sekvencama kontinualnog varijabilnog regiona koje su navedene SEQ ID NOS: 389 i 391 (hSC16.13), SEQ ID NOS: 393 i 395 (hSC16.15), SEQ ID NOS: 397 i 399 (hSC16.25), SEQ ID NOS: 401 i 403 (hSC16.34) i SEQ ID NOS: 405 i 407 (hSC16.56). Pored genetskog sastava, TABELA 3 pokazuje da, u ovim odabranim slučajevima, nisu bile potrebne nikakve promene okvira ili povratne mutacije kako bi se održala povoljna vezujuća svojstva izabranih antitela. Naravno, u drugim CDR graftovanim konstruktima biće jasno da takve promene okvira ili povratne mutacije mogu biti poželjne i kao takve, izričito se razmatraju kao da su unutar obima predmetnog obelodanjenja.
TABELA 3
[0405] Iako se u okvirnim regionima nisu menjali ostaci, u jednom od humanizovanih klonova (hSC16.13) mutacije su uvedene u CDR2 teškog lanca radi rešavanja problema stabilnosti. Afinitet vezivanja antitela sa modifikovanim CDR je proveravan da se osigura da je ekvivalentan ili odgovarajućem himernom ili mišjem antitelu.
[0406] Nakon humanizacije svih odabranih antitela pomoću CDR graftovanja, dobijene aminokiselinske sekvence lakog i varijabilnog regiona teškog lanca su analizirane kako bi se odredila njihova homologija u pogledu varijabilnih regiona mišjih donora i ljudskog akceptora lakih i teških lanaca. Rezultati, prikazani u TABELI 4 odmah ispod, otkrivaju da humanizovani konstrukti dosledno pokazuju višu homologiju u odnosu na ljudske akceptorske sekvence nego kod mišjih donorskih sekvenci. Preciznije, varijabilni regioni mišjeg teškog i lakog lanca pokazuju sličnu ukupnu procentualnu homologiju sa najbližim srodnim genima ljudskih germlinija (85% -93%) u poređenju sa homologijom humanizovanih antitela i donorskih hibridoma proteinskih sekvenci (74% - 83%).
TABELA 4
[0407] Posle testiranja, i kao što će biti detaljnije objašnjeno u daljem tekstu, svaki od izvedenih humanizovanih konstrukata pokazao je povoljne karakteristike vezivanja koje su otprilike slične onima koje su pokazala mišja roditeljska antitela.
Primer 5
Karakteristike Anti-DLL3 antitela
[0408] Korišćeni su različiti postupci za analizu vezujućih i imunohemijskih karakteristika odabranih modulatora DLL3 antitela generisanih kao što je gore navedeno. Specifično, brojni modulatori antitela su okarakterisani kao afinitet, kinetika, binovanje, vezujuće mesto i unakrsna reaktivnost u odnosu na ljudsko, cinomolgus, pacovsko i mišje prepoznavanje antigena (tj., upotrebom ćelija i DLL3 proteinskih konstrukata) postupcima priznatim u struci, uključujući protočnu citometriju. Afiniteti i kinetičke konstante koni koffodabranih modulatora su mereni korišćenjem interferometrijske analize na bio-sloju na ForteBio RED (ForteBio, Inc.) ili površinskoj plazmonskoj rezonanci korišćenjem Biacore 2000, sve prema uputstvima proizvođača.
[0409] Rezultati karakterizacije su prikazani u tabelarnom obliku na Slici 5 gde se može pogledati da su odabrani modulatori generalno pokazali relativno visok afinitet u nanomolarnom opsegu i, u mnogim slučajevima, bili su unakrsno reaktivni. Slika 5 dalje navodi empirijski određene korpice antitela, kao i DLL3 domen koji je vezan za predmetno antitelo, kao što je određeno korišćenjem eksprimiranja fragmenta antigena posredovanog kvascem, kao što je detaljnije opisano u Primeru 6 u nastavku.
[0410] Što se tiče izbacivanja antitela, korišćen je ForteBio RED po instrukcijama proizvođača kako bi se identifikovala antitela koja se nadmeću koja su vezana za iste ili različite korpice. Ukratko, referentno antitelo (Ab1) je uhvaćeno na anti-mišjem čipu za hvatanje, i zatim je korišćena visoka koncentracija nevezujućeg antitela za blokiranje čipa i sakupljena je osnovna linija. Monomerni, rekombinantni ljudski DLL3-Flag (Adipogen International) je zatim uhvaćen specifičnim antitelom (Ab1) i vrh je potopljen u komoricu sa istim antitelom (Ab1) kao kontrolom, ili u komoricu sa različitim test antitelom (Ab2). Ako je primećeno dodatno vezivanje sa novim antitelom, onda je određeno da su Ab1 i Ab2 u različitoj korpici. Ako nije došlo do daljeg vezivanja, što je određeno upoređivanjem nivoa vezivanja sa kontrolom Ab1, onda je određeno da je Ab2 u istoj korpici. Kao što je poznato u struci, ovaj proces se može proširiti tako da se skeniraju velike biblioteke jedinstvenih antitela upotrebom punog reda antitela koja predstavljaju jedinstvene korpice u ploči sa 96 komorica. U ovom slučaju, ovaj proces biniranja je pokazao da su antitela vezana za najmanje devet različitih ćelija (označenih kao Korpice A di I, na Slici 5) na DLL3 proteinu. Na osnovu primećene veličine DLL3 antigena (gde je ECD približno 56 kD) i rezolucije korišćenog postupka binovanja, veruje se da devet identifikovanih korpica predstavlja većinu korpica prisutnih na DLL3 ekstracelularnom antigenu.
[0411] Pored procene modulatora koji su dati kao primeri, kao što je gore prikazano, protočna citometrija je izvedena kako bi se potvrdilo da odabrani modulatori SC16 antitela mogu imunospecifično da se povezuju sa ljudskim DLL3, kako bi se odredilo da li ista antitela unakrsno reaguju sa cinomolgus, pacovskim i/ili mišjim DLL3. Preciznije, primerna mišja antitela su analizirana protočnom citometrijom korišćenjem FACSCanto II i 293 ćelija koje eksprimiraju mišji, pacovski, cinomolgus ili ljudski DLL3. U nekim slučajevima, primerni mišji modulatori su analizirani protočnom citometrijom korišćenjem FACSCanto II i ćelija kvasca koje prikazuju cinomolgus DLL3 koristeći postupke opisane od strane Cochran i dr. (J Immunol Methods. 287 (1-2):147-158 (2004).
[0412] Na osnovu protočne citometrije, otkriveno je da se svi selektovani modulatori antitela vezuju za ljudski DLL3 koji su prekomerno eksprimirani na 293 ćelijama (podaci nisu prikazani), dok je za određeni broj test antitela otkriveno da unakrsno reaguju sa cinomolgus i/ili mišjim DLL3 (sve antitela koja reaguju sa mišem takođe reaguju sa pacovima). U tom smislu, i kao što je navedeno na Slikama 5, otkriveno je da osam od trinaest modulatora koji reaguju imunospecifično sa ljudskim DLL3 takođe reaguju sa mišjim (ili pacovskim) DLL3. Naročito je utvrđeno da mAb SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 i SC16.56 unakrsno reaguju sa mišjim DLL3 u većoj ili manjoj meri dok mAb SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 i SC16.65 nisu značajno povezani sa mišjim DLL3. Takvi rezultati nisu neočekivani s obzirom da je mišji DLL3 približno 83% homologan sa izoformom 2 ljudskog DLL3. Treba imati na umu da se ova unakrsna reaktivnost može pogodno iskoristiti u kontekstu predmetnog pronalaska upotrebom životinjskih modela u otkrivanju i razvoju lekova.
[0413] Pored gore navedenih testova, analizirani su humanizovani konstrukti hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56 iz Primera 4 kako bi se odredilo da li je proces presađivanja CDR značajno promenio njihove karakteristike vezivanja. U ovom pogledu, humanizovani konstrukti (CDR graftovani) su upoređeni sa „tradicionalnim“ himernim antitelima koji sadrže varijabilni domen teškog i lakog lanca mišjeg roditelja (ili donora) i ljudski konstantni region koji je u suštini ekvivalentan onom koji se koristi u humanizovanim konstruktima. Sa ovim konstruktima, površinska plazmonska rezonanca (SPR) je sprovedena korišćenjem Biacore 2000 (GE Healthcare) kako bi se identifikovale bilo kakve suptilne promene u konstantama brzine koje je prouzrokovao proces humanizacije.
[0414] Na osnovu na seriji koncentracija od 25 i 12,5 nM ljudskog DLL3 antigena i upotrebom 1:1 Langmuir modela vezivanja, KDod SC16.15 antitela koja se vezuju za ljudski DLL3 antigen je procenjeno na 0,2 nM. Slični eksperimenti su zatim izvedeni sa drugim humanizovanim konstruktima i himernim konstruktima kako bi se pokazalo da zadržavaju vrednosti terapeutskog afiniteta (podaci nisu prikazani). Takvi rezultati pokazuju da proces humanizacije nije značajno uticao na afinitet modulatora, i ukazao je da su oni pogodni kandidati za upotrebu u otkrivenim DLL3 ADC.
Primer 6
Mapiranje domena i epitopa anti-DLL3 antitela
[0415] Kako bi se opisali i pozicionirali epitopi sa kojima su obelodanjeni konjugati DLL3 antitela i leka povezani ili za koje se vezuju, mapiranje epitopa na nivou domena je izvedeno na brojnim primernim antitelima koristeći modifikaciju protokola opisanog od strane Cochran i dr., 2004 (supra). Ukratko, pojedinačni domeni DLL3 koji sadrže specifične aminokiselinske sekvence su eksprimirani na površini kvasca, i vezivanje odabranim DLL3 antitelima je određeno protočnom citometrijom.
[0416] Konkretnije, plazmidni konstrukti za prikaz kvasca su kreirani za eksprimiranje sledećih konstrukata: DLL3 vanćelijski domen (aminokiseline 27-466); DLL1-DLL3 himera, koja se sastoji od N-terminalnog regiona i DSL domena od DLL1 (aminokiseline 22-225) fuzionisanog za EGF-nalik domene 1 do 6 DLL3 (aminokiseline 220-466); DLL3-DLL1 himera, koja se sastoji od N-terminalnog regiona i DSL domena od DLL3 (aminokiseline 27-214) fuzionisanog za EGF-nalik domene 1 do 8 od DLL1 (aminokiseline 222-518); EGF-nalik domen # 1 (aminokiseline 215-249); EGF-nalik domen # 2 (aminokiseline 274-310); EGF-nalik domeni # 1 i # 2 (aminokiseline 215-310); EGF-nalik domen # 3 (aminokiseline 312-351); EGF-nalik domen # 4 (aminokiseline 353-389); EGF-nalik domen # 5 (aminokiseline 391-427); i EGF-nalik domen # 6 (aminokiseline 429-465). (Za informacije o domenu pogledati generalno unos Q9NYJ7 UniProtKB/Swiss-Prot baze podataka. Treba imati na umu da je numerisanje aminokiselina u odnosu na neprerađeni DLL3 protein sa liderskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1). Za analizu N-terminalnog regiona ili EGF domena kao celine, upotrebljene su himere sa članom porodice DLL1 (DLL1-DLL3 i DLL3-DLL1), za razliku od fragmenata kako bi se minimizovali potencijalni problemi kod savijanja proteina. Pokazalo se da antitela koja su mapirana domenom ranije ne reaguju unakrsno sa DLL1, što ukazuje da se bilo koje vezivanje za ovih konstrukata odvija kroz povezivanje sa DLL3 delom konstrukta. Ovi plazmidi su transformisani u kvasac, koji je zatim uzgajan i indukovan kao što je opisano u Cochran i dr.
[0417] Kako bi se testiralo vezivanje za određeni konstrukt, 200.000 indukovanih ćelija kvasca koje eksprimiraju željeni konstrukt su dvaput isprane u PBS 1 mg/mL BSA (PBSA), i inkubirane u 50 µL PBSA sa biotinilovanim anti-HA klonom 3F10 (Roche Diagnostics) na 0,1 µg/mL, i bilo sa 50nM prečišćenim antitelom, ili sa 1:2 razblaženjem neprečišćenog supernatanta iz hibridoma kultivisanih tokom 7 dana. Ćelije su inkubirane 90 minuta na ledu, praćeno sa 2 ispiranja u PBSA. Ćelije su zatim inkubirane u 50 µL PBSA sa odgovarajućim sekundarnim antitelima: za mišja antitela, Alexa 488 konjugovani streptavidin i Alexa 647 konjugovani kozje anti mišje (oba od Life Technologies) su dodati po 1 µg/ml svaki, i za humanizovana ili himerna antitela, Alexa 647 konjugovani streptavidin (Life Technologies) i R-fikoeritrin konjugovano kozje anti ljudsko (Jackson Immunoresearch) su dodati po 1 µg/mL svaki. Posle dvadeset minuta inkubacije na ledu, ćelije su isprane dva puta sa PBSA i analizirane na FACS Canto II. Antitela koja su vezana za DLL3-DLL1 himeru su označena kao vezivanje za N-terminalni region DSL. Antitela koja su specifično vezana za epitop prisutan na određenom EGF-nalik domenu su označena kao vezujuća za njen odgovarajući domen.
[0418] Kako bi se epitop klasifikovao kao konformacioni (npr. diskontinuirani) ili linearni, kvasac koji prikazuje DLL3 ekstracelularni domen je toplotno tretiran 30 minuta na 80°C, zatim ispran dva puta u ledeno hladnom PBSA. Kvasac koji prikazuje denaturisani antigen (denaturisani kvasac) je zatim podvrgnut istom protokolu bojenja i analizi protočne citometrije, kao što je gore opisano. Antitela koja su vezana i za denaturisani i za prirodni kvasac su klasifikovana kao vezivanje za linearni epitop, dok su antitela koja su vezala prirodni kvasac, ali ne i denaturisani kvasac, klasifikovana kao konformaciono specifična.
[0419] Šematski rezime podataka mapiranja epitopa na nivou domena testiranih antitela prikazan je na Slikama 4, gde su antitela koja vezuju linearni epitop podvučena i, gde je određeno, odgovarajuća korpica je zabeležena u zagradi. Pregled Slike 4 pokazuje da većina modulatora ima tendenciju da mapira epitope pronađene u N-terminalnom/DSL regionu DLL3 ili u drugom EGF-nalik domenu. Kao što je prethodno pomenuto, Slika 5 prikazuje slične podatke u vezi određivanja korpice i mapiranja domena za određeni broj izabranih modulatora u tabelarnom obliku.
[0420] Mapiranje finih epitopa je dalje izvedeno na odabranim antitelima koristeći jedan od dva postupka. U prvom postupku korišćen je Ph.D-12 komplet peptidne bibilioteke za prikaz fag (New England Biolabs E8110S) koji je korišćen u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, antitelo za mapiranje epitopa je prekriveno preko noći na 50 µg/mL u 3 mL 0,1 M rastvora natrijum bikarbonata, pH 8, na Nunc MaxiSorp cevi (Nunc). Cev je blokirana sa 3% rastvorom BSA u rastvoru bikarbonata. Zatim, 1011 ulazni fag u PBS 0,1% Tween-20 je ostavljen da se veže, praćeno sa deset uzastopnih ispiranja na 0,1% Tween-20 kako bi se isprao ne-vezujući fag. Preostali fag je eluiran sa 1 mL 0,2 M glicina tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje, praćeno neutralizacijom sa 150 µL 1M Tris-HCl pH 9. Eluirani fagi su amplifikovani i ponovo ojačani sa 10<11>ulaznim fagom, koristeći 0,5% Tween-20 tokom koraka pranja, kako bi se povećala strogost selekcije. DNK iz 24 ploča eluiranog faga iz drugog kruga je izolovana korišćenjem Qiaprep M13 Spin kit (Qiagen) i sekvencirana. Vezivanje klonskog faga je potvrđeno korišćenjem ELISA testa, gde je mapirano antitelo ili kontrolno antitelo prevučeno na ELISA ploču, blokirano i izloženo svakom klonu faga. Vezanje faga je detektovano korišćenjem anti-M13 antitela konjugovanog peroksidazom rena (GE Healthcare) i 1-Step Turbo TMB ELISA rastvora (Pierce). Sekvence peptidnog faga iz specifičnog vezivanja faga su poravnate pomoću Vector NTI (Life Technologies) u odnosu na ECD peptidne sekvence antigena kako bi se odredio epitop vezivanja.
[0421] Alternativno, postupak prikazivanja kvasca (Chao i dr., Nat Protoc.1(2): 755-768, 2007) je korišćen za mapiranje epitopa odabranih antitela. Ukratko, biblioteke DLL3 ECD mutanata su generisane sa PCR koji je sklon grešci korišćenjem nukleotidnih analoga 8-okso-2'deoksigvanozin-5'-trifosfata i 2'-deoksi-p-nukleozid-5'-trifosfata (oba od TriLink Bio) za ciljanu stopu mutageneze jedne mutacije aminokiseline po klonu. Oni su transformisani u formu prikaza kvasca. Koristeći gore opisanu tehniku za mapiranje na nivou domena, biblioteka je obojena za HA i vezivanje antitela na 50 nM. Koristeći FACS Aria (BD), klonovi koji pokazuju gubitak vezivanja u poređenju sa divljim tipom DLL3 ECD su sortirani. Ovi klonovi su ponovo uzgajani i podvrgnuti drugom krugu FACS sortiranja za gubitak vezivanja za ciljano antitelo. Koristeći Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep komplet (Zymo Research), pojedinačni ECD klonovi su izolovani i sekvencirani. Tamo gde je bilo potrebno, mutacije su preoblikovane kao jedno-mutantni ECD klonovi korišćenjem Quikchange kompleta mutageneze usmerene na mesto (Agilent).
[0422] Pojedinačni ECD klonovi su zatim pregledani kako bi se utvrdilo da li je gubitak vezivanja posledica mutacije u epitopu ili mutacije koja je izazvala pogrešno savijanje. Mutacije koje su uključivale cistein, prolin i zaustavne kodone su automatski odbačene zbog velike verovatnoće mutacije pogrešnog savijanja. Preostali ECD klonovi su zatim ispitani za vezivanje za ne-kompetetivno, konformaciono specifično antitelo. Zaključeno je da ECD klonovi koji su izgubili vezivanje za ne-kompetetivna, konformaciono specifična antitela sadrže mutacije pogrešnog savijanja, dok je za ECD klonove koji zadržavaju ekvivalentno vezivanje za DLL3 ECD divljeg tipa zaključeno da su pravilno savijeni. Zaključeno je da su mutacije u ECD klonovima u drugoj grupi u epitopu. Rezultati su navedeni u TABELI 5 u nastavku.
TABELA 5
[0423] Specifičnije, rezime odabranih antitela sa njihovim izvedenim epitopima koji sadrže aminokiselinske ostatke koji su uključeni u vezivanje antitela su navedeni u TABELI 5. U ovom pogledu, antitela SC16.34 i SC16.56 očigledno interakuju sa uobičajenim aminokiselinskim ostacima, što je u skladu sa informacijama o binovanju, i rezultatima mapiranja domena prikazanim na Slici 4. Štaviše, za SC16.23 je otkriveno da stupa u interakciju sa različitim kontinualnim epitopom i otkriveno je da ne binuje sa SC16.34 ili SC16.56.
Primer 7
Priprema konjugata DLL3 antitela
[0424] Kako bi se dalje pokazala raznovrsnost predmetnog obelodanjenja, konjugati anti-DLL3 antitela i leka koji su u suštini postavljeni u ADC 1 - 5 se pripremaju konjugovanjem jedinjenja DLl-DL5 sa DLL3 antitelima kao što su ona koja su ovde opisana. U tom smislu, biće jasno da se, zbog veze koja je izabrana za DL4, primenjuju dve neznatno različite konjugacione procedure kako bi se pružili opisani konjugati. Specifičnije, ADC 1 - 3 i 5 se poželjno pripremaju koristeći prvu proceduru konjugacije u nastavku i ADC 4 je poželjno pripremljen koristeći drugu proceduru u daljem tekstu.
(a) Maleimido konjugacija
[0425] Specifičnije, konjugati DLL3 antitela i leka se pripremaju i sadrže veznik i pirolobenzodiazepinske (PBD) dimere navedene u DL1-DL3 i DL5 kovalentno su vezani za obelodanjena antitela (pogledati, generalno U.S.P.N.2011/0256157 i 2012/0078028 i U.S.P.N 6,214,345).
[0426] Kombinacije leka i veznika DLl-DL3 i DL5 su sintetizovane i prečišćene su u suštini, kao što je opisano u Primeru 1 iznad, i korišćenjem tehnika koje su prepoznate u struci. Posle pripreme jedinice leka i veznika koja sadrži terminalni maleimido deo je konjugovana sa slobodnim sulfhidrilom na odabranom DLL3 antitelu. U tom smislu, DLL3 konjugati su pripremljeni preko delimične redukcije izabranog DLL3 antitela sa tris (2-karboksietil)-fosfinom (TCEP), praćeno reakcijom redukovanih Cys ostataka sa maleimido-veznik sadržajem.
[0427] Određenije, odabrani modulator DLL3 antitela je redukovan sa 1,3 mola tris (2-karboksietil)-fosfinom (TCEP) po molu mAb tokom 90 minuta na 20°C u 200 mM Tris, pH 7,5 i 32 mM EDTA pufera. Reakcija je ostavljena da se ohladi na 15°C, i korisni sadržaj veznika je rastvoren u DMA i zatim se dodaje u odnosu 3,2 mol/mol mAb čemu prethodi dodatna količina DMA do konačne koncentracije od 6% (v/v). Reakcija se ostavi da traje 30 minuta. Neizreagovani lek-veznik je ograničen dodavanjem ekvivalentnog molarnog viška N-acetil cisteina. Konjugati, suštinski kao što je dato u ADC 1-3 i 5, se zatim prečiste kolonom za jonoizmenjivanje korišćenjem AKTA Explorer FPLC sistema (G.E. Healthcare) kako bi se uklonila agregirana antitela visoke molekulske težine, ko-rastvarač i mali molekuli. Eluirani konjugat je zatim puferom razmenjen pomoću tangencijalne protočne filtracije (TFF) u formulacionom puferu, što praćeno podešavanjem koncentracije i dodatkom deterdženta. Konačni konjugat je analiziran na koncentraciju proteina (merenjem UV), agregaciju (SEC), odnosom leka i antitela (DAR) pomoću HPLC reverzne faze (RP), prisustvo nekonjugovanog antitela pomoću hromatografije hidrofobne interakcije (HIC) HPLC, ne-proteinskog materijala pomoću RP HPLC i in vitro citotoksičnost upotrebom ćelijske linije koja eksprimira DLL3.
(b) Konjugacija jodoacetamida
[0428] ADC 4 je pripremljen suštinski na sledeći način. DL4 je sintetizovan i pružen kao što je prikazano u Primeru 1. Nakon pripreme, citotoksin-veznik jedinica koja sadrži terminalnu jodoacetamidnu grupu je konjugovana sa slobodnim sulfhidrilom na odabranom DLL3 antitelu. U tom smislu, DLL3 konjugati su pripremljeni putem delimične redukcije odabranog DLL3 antitela sa tris (2-karboksietil)-fosfinom (TCEP), praćeno reakcijom redukovanih Cys ostataka sa korisnim sadržajem jodoacetamid-veznika.
[0429] Posebno, selektovani modulator DLL3 antitela je redukovan sa 1,8 mol TCEP po molu mAb tokom 90 minuta na 20°C u PBS pH 7,2 i 5 mM EDTA puferu. Smanjeni rastvor antitela se zatim podesi na pH 8,5 sa 100 mM natrijum borata i doda se korisni sadržaj veznika u DMSO pri odnosu od najmanje 5 mol/mol mAb, čemu prethodi dodatna količina DMSO do konačne koncentracije od 6% (v/v). Reakcija je zatim ostavljena da se odvija preko noći na 20°C. Konjugat je zatim puferom razmenjen pomoću tangencijalne protočne filtracije (TFF) u dijafiltracionom puferu, što praćeno podešavanjem koncentracije i dodatkom deterdženta. Konačni konjugat se zatim analizira za koncentraciju proteina (merenjem UV), agregaciju (SEC), odnos leka i antitela (DAR) pomoću reverzne faze (RP) HPLC, i in vitro citotoksičnost upotrebom ćelijske linije koja eksprimira DLL3.
[0430] Koristeći gore pomenute procedure, ili suštinski sličnu metodologiju poznatu u struci, generiše se i karakteriše veliki broj konjugata koji sadrže kombinacije različitih modulatora DLL3 antitela i DL delova kao što je ovde opisano. U tom pogledu, Slika 6 daje rezime ADC koji se mogu generisati u skladu sa predmetnim obelodanjenjem konjugovanjem specifičnog antitela (npr. SC16.3) sa odabranim lek-veznikom (npr. DL1) kako bi se pružio odgovarajući ADC (tj. SC16.3-DL1 ili SC16.3-ADC1). Stručnjaci u oblasti će uvideti da svaka oznaka antitela u konstrukcijama primera sa Slike 6, osim onih identifikovanih kao humanizovanih (npr. HSC16.34-DL4), može predstavljati bilo koji tip antitela (himerne, humanizovane, ljudske, IgGl, IgG3, itd. verzije identifikovanih mišjih klonova) ili njegov imunoreaktivni fragment. Pored toga, biće jasno da su primeri ADC1, ADC2, ADC3 i ADC5 jedinjenja konjugovani korišćenjem protokola izloženog u Primeru 7(a), dok su primeri ADC4 jedinjenja konjugovani korišćenjem protokola izloženog u Primeru 7(b). Podrazumeva se da u odabranim aspektima predmetni pronalazak sadrži konjugat kao što je prikazano na Slici 6.
Primer 8
In Vitro ispitivanje ubijanja ćelija tumora korišćenjem konjugata DLL3 antitela i leka [0431] Kako bi se pokazalo da su DLL3 ADC predmetnog pronalaska sposobni da posreduju u isporuci citotoksičnog agensa živim ćelijama, in vitro testovi ubijanja ćelija se izvode korišćenjem odabranih DLL3 konjugata pripremljenih prema prethodnim Primerima.
[0432] DLL3 ciljani ADC naoružani sa jednim od nekoliko PBD korisnih sadržaja (tj. PBD 1 - PBD 5) su procenjeni in vitro i vezuju se, sa nanomolarnim afinitetom, specifično za DLL3 na ljudskim 293 ćelijama konstruisanim da prekomerno eksprimiraju ljudske DLL3, ali ne naivne roditeljske 293 ćelije. Kako bi se ispitao citotoksični potencijal odabranih ADC 1 - 5 in vitro, procenjuje se njihova sposobnost da ubijaju 293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju DLL3. Specifično, roditeljske 293T ćelije ili 293T ćelije projektovane da eksprimiraju DLL3 su inkubirane sa razblaženjima odabranih ADC 1 - 5 tokom perioda od 48-72 sata pre procenjivanja održivosti ćelija korišćenjem Cell Titer Glo® (Promega) prema uputstvima proizvođača. ADC koji ubijaju 293 ćelije prekomerno eksprimiraju DLL3 sa IC50 od 0,1 -100 pM, ali koji pokazuju malu do nimalo sposobnosti ubijanja naivnih roditeljskih 293 ćelija, odabrani su kao pretklinički kandidati.
[0433] Na osnovu 293 testova citotoksičnosti, konjugati su izabrani za dalje ispitivanje sa tumorskim ćelijama. Prvobitno 2,500 ćelija/komorica ljudskog KDY66, NET NTX bubrega koji eksprimira endogeni DLL3, disociraju se u suspenziju sa jednom ćelijom i nanose se na BD Primaria™ ploče (BD Biosciences) u medijumu bez dodatnog seruma koji je poznat u struci. Posle perioda od 24 sata, različite koncentracije (0,1 - 100 pM) prečišćenih konjugata DLL3 antitela, na primer, SC16.26-DL1, SC16.81-DL2, SC16.118-DL4 i SC16.67-DL5, zajedno sa odgovarajućim kontrolama (npr., ne-vezujući IgGl-DL konjugati) se dodaju kulturama. Posle perioda od sedam dana, ploče su ispitane kako bi se odredio uticaj konjugata DLL3 antitela na vitalnost ćelija. Sposobnost konjugata leka i antitela da internalizuju i ubiju tumorske ćelije određuje se brojenjem broja živih ćelija korišćenjem Cell Titer Glo® prema uputstvima proizvođača. Neobrađeni broj luminescencije upotrebom kultura koje sadrže ćelije izložene kontroli konjugata izotipa antitela je postavljen kao 100% referentne vrednosti, i sve druge tačke su izračunate u skladu sa tim. Očekuje se da neki ili svi DLL3 konjugati ubijaju KDY66 tumorske ćelije sa IC50 između 0,1 pM i 100 pM, i da kontrole izotipskog konjugata pokazuju ekstremno visoke IC50 vrednosti.
[0434] Aktivni konjugati DLL3 antitela su testirani u testu razređenja kako bi se odredile vrednosti EC50 za aktivnost. Korišćenjem istog testa kao što je opisano neposredno iznad, konjugati odabranih antitela i odgovarajuće kontrole konjugata se inkubiraju sa nanesenim tumorskim ćelijama jajnika (npr. OV26, NET NTX tumor jajnika). Očekuje se da neki od ovih konjugata pokazuju efikasno ubijanje ćelija tumora jajnika sa izmerenim vrednostima EC50 u pikomolarnom ili subpikomolarnom opsegu. Suprotno tome, od kontrolnih ADC se očekuje da pokazuju relativno visoke EC vrednosti koje ukazuju na to da nisu efektivno internalizovane i da konjugovani lek ostaje u neaktivnom stanju.
[0435] Kako bi se dalje pokazala raznovrsnost obelodanjenja, tumorske ćelije izvedene iz neuroendokrinog raka velikih ćelija pluća (LU37) izložene su odabranim konjugatima (npr. SC16.26-DL1, SC16.81-DL2 i SC16.67-DL5) u skladu sa ovde datim uputstvima. Još specifičnije, 2.500 LU37 NTX ćelija po komorici je naneseno na ploču (BD Primaria™ ploče) u medijumu bez faktora rasta koji je dopunjen medijumom bez seruma jedan dan pre dodavanja konjugovanih DLL3 antitela i konjugovanih kontrolnih izotipova. Nanesene ćelije su izložene različitim koncentracijama DLL3 konjugata i kontrolnim konjugatima tokom sedam dana. Nakon izlaganja, vijabilnost ćelija se određuje brojem vitalnih ćelija pomoću Cell Titer Glo® kao što je opisano iznad. Od DLL3 konjugata se očekuje da efikasno eliminišu tumorske ćelije u klinički relevantnim koncentracijama. Na primer, očekuje se da DLL3 konjugati poseduju sposobnost da ubiju 50% LU37 ćelija in vitro u koncentracijama manjim od oko 100 pM, dok konjugati kontrolnih izotipa zahtevaju koncentracije od > 1 nM kako bi se ubilo 50% tumorskih ćelija.
[0436] Takvi rezultati bi ukazali da su opisani konjugati korisni za tretman različitih neoplastičnih poremećaja.
Primer 9
In Vivo ispitivanje suzbijanja rasta tumora korišćenjem konjugata DLL3 antitela i leka [0437] S obzirom na prethodno navedene in vitro rezultate, eksperimenti su sprovedeni kako bi se procenila sposobnost obelodanjenih DLL3 ADC da in vivo umanjuju i suzbijaju rast ljudskih tumora koji eksprimiraju DLL3. Posebno odabrani DLL3 konjugati koji sadrže i mišje i humanizovane modulatore su testirani kako bi se pokazala njihova sposobnost da suzbijaju rast tumora ljudskog NTX u imunodeficijentnim miševima.
[0438] Kako bi se pripremili za eksperimente, NTX tumori(LU37, LU73 i OV26) izvađeni iz pacijenta su uzgajani subkutano u bokovima ženki NOD/SCID miševa primaoca upotrebom tehnika priznatih u struci. Zapremine tumora i težine miša prate se dva puta nedeljno. Kada zapremina tumora dostigne 150-250 mm<3>, miševi su nasumično raspoređeni u grupe za tretman i date su injekcije sa različitim dozama DLL3 konjugata, na primer, SC16.21-DL2, SC16.144-DL4, hSC16.34-DL5, hSC16.56-DL1, ili izotipske kontrole koje sadrže iste DL (svaki je proizveden suštinski kao što je opisano gore u Primeru 7) putem intraperitonealne injekcije. Miševima su date tri jednake injekcije ADC pri 0,1-1 mg/kg, raspoređene ravnomerno tokom sedam dana. Nakon tretmana, praćene su zapremine tumora i težine miša dok tumori ne pređu 800 mm<3>, ili dok se miševi ne razbole.
[0439] U većoj ili manjoj meri se očekuje da izabrani DLL3 konjugati pokažu sposobnost da redukuju zapreminu tumora ili potiskuju rast tumora. U nekim slučajevima, očekuje se da suzbijanje rasta tumora, na primer, u traje 30 dana, 40 dana, 50 dana, 60 dana ili duže. u odnosu na svaku od tri različite tumorske ćelijske linije. Sposobnost određenog broja konjugovanih modulatora, uključujući humanizovane konjugate, da usporavaju ili suzbijaju rast tumora in vivo tokom dužeg perioda dalje bi potvrdila upotrebu obelodanjenih DLL3 konjugata kao terapeutskih agenasa za tretman proliferativnih poremećaja.
Primer 10
Ispitivanje redukcije učestalosti matičnih ćelija raka korišćenjem konjugata DLL3 antitela i leka
[0440] Kao što je izloženo u prethodnim primerima, očekuje se da su opisani DLL3 konjugati efikasni u suzbijanju rasta tumora. Štaviše, kao što je razmotreno iznad, eksprimiranje DLL3 je povezano sa matičnim ćelijama raka, za koje je opšte poznato da su otporne na lekove i da podstiču povratak tumora i metastaze. Shodno tome, kako bi se pokazalo da tretman sa DLL3-ADC smanjuje potencijal ponavljanja NTX linija, in vivo testovi limitirajućeg razblaživanja (LDA) se izvode kako bi se odredila učestalost matičnih ćelija raka u malim tumorima tumora pluća nakon tretmana sa DLL3 konjugatima, na primer, hSC16.13-DL2 ili hSC16.34-DL5.
[0441] Ksenograft tumor raka malih ćelija pluća izvađen iz pacijenta (LU95) i ksenograft izvađen iz pacijenta iz raka papilarnih bubrežnih ćelija (KDY66) se uzgajaju subkutano u imunodeficijentnim miševima domaćinima. Kada su zapremine tumora 150 mm<3>- 250 mm<3>, miševi su nasumično razdvojeni u dve grupe od sedam miševa. Pomoću intraperitonealne injekcije, miševi su injektirani na dane 0, 4 i 7, bilo sa ljudskim IgG1-DL2 ili ljudskim IgG1-DL5 (1 mg/kg; n = 7 miševa svaki) kao negativne kontrole, ili sa DLL3 konjugatima, na primer, hSC16.13-DL2 ili hSC16.34-DL5 (1 mg/kg; n = 7 miševa svaki). Na dan 8, dva reprezentativna miševa iz svake grupe (ukupno četiri) su eutanazirana i njihovi tumori su sakupljeni i dispergovani u suspenzije sa jednom ćelijom. Očekuje se da tumori tretirani sa kontrolnim konjugatima izotipa nastave da rastu u pet preostalih miševa, dok se zapremine tumora tretiranih sa DLL3 konjugatima redukuju do nule ili skoro do nule u pet preostalih miševa.
[0442] Koristeći standardne tehnike protočne citometrije i označeno anti-DLL3 antitelo, sakupljeni tumori iz svake od četiri tretirane grupe su procenjeni kako bi se potvrdilo pozitivno eksprimiranje DLL3. Tumorske ćelije iz svake odgovarajuće tretirane grupe su zatim sakupljene i žive ljudske ćelije su izolovane pomoću FACS koristeći FACSAria III (Becton Dickinson) u skladu sa uputstvima proizvođača i tehnikama koje su priznate u struci. Ukratko, ćelije su označene sa FITC konjugovanim anti-mišjim H2Kd i anti-mišjim CD45 antitelima (oba od BioLegend, Inc.) i zatim resuspendovane u 1 µg/ml DAPI. Dobijena suspenzija se zatim sortira pod standardnim uslovima, gde se DAPI- , mH2Kd- i mCD45-ljudske ćelije se sakupljaju, i mišje ćelije se odbacuju.
[0443] Kohorte pet miševa primalaca su zatim transplantirane sa 2000, 500, 120 ili 30 sortiranih živih ljudskih ćelija iz tumora tretiranih sa DLL3 konjugatima. Za poređenje, kohorte pet miševa primalaca su transplantirane sa 1000, 250, 60 ili 15 sortiranih živih ćelija iz tumora tretiranih sa odgovarajućom kontrolom izotipskog konjugata. Tumori kod miševa primalaca se mere nedeljno, i pojedinačni miševi su eutanazirani pre nego što tumori dostignu 1500mm<3>. Posle početka rasta tumora, studija je završena nakon četiri uzastopne nedelje bez pojavljivanja novog tumora u bilo kom dodatnom mišu. U to vreme, miševi primaoci su zabeleženi kao pozitivni ili negativni za rast tumora, sa pozitivnim rastom koji ima zapremine veće od 100 mm<3>. Očekuje se da primaoci LU95 ili KDY66 ćelija tretiranih sa DLL3 konjugatima proizvode manje tumora u poređenju sa primaocima LU95 ili KDY66 ćelija tretiranih sa kontrolom DL2 izotipa.
[0444] Koristeći Poisson-ovu distribucionu statistiku (L-Calc softver, Stemcell Technologies), injektirane doze ćelija primalaca sa i bez tumora na 18 nedelja posle transplantacije koriste se za izračunavanje učestalost ćelija koje iniciraju tumor u svakoj populaciji. Očekuje se da će se broj TIC na 10,000 živih ljudskih ćelija u uzorcima LU95 ili KDY66 značajno smanjiti kod životinja tretiranih sa DLL3 konjugatima, na primer, najmanje oko 10-struko smanjenje, ili 20-struko smanjenje, ili 50-struko smanjenje ili 100-struko smanjenje. Značajno smanjenje učestalosti matičnih ćelija raka ukazuje na to da modulatori predmetnog obelodanjenja mogu značajno i specifično smanjiti populacije rakavih matičnih ćelija i, logičnim sledom, recidiv, metastaziranje ili potencijalni ponovni rasta tumora.

Claims (30)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat antitela i leka (ADC) koji sadrži DLL3 agens za vezivanje ćelija kovalentno vezan preko veznika za pirolobenzodiazepin (PBD), gde je DLL3 agens za vezivanje ćelija anti-DLL3 antitelo, i gde je PBD:
  2. 2. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde veznik sadrži veznik koji se može razdvojiti.
  3. 3. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 2, gde veznik koji se može razdvojiti sadrži peptidilni veznik koji sadrži najmanje dve aminokiseline.
  4. 4. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 3, gde peptidilni veznik sadrži valinalanin dipeptid.
  5. 5. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji obuhvata strukturu:
    gde zvezdica označava tačku vezivanja za PBD, i gde talasasta linija označava tačku vezivanja za preostali deo veznika.
  6. 6. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde je veza između anti-DLL3 antitela i veznika formirana reakcijom sa maleimidnom grupom veznika.
  7. 7. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde ADC ima opterećenje leka koje iznosi 2.
  8. 8. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde su PBD 1 do 8 kovalentno vezani za anti-DLL3 antitelo.
  9. 9. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde je konjugat antitela i leka ADC5:
    gde Ab sadrži anti-DLL3 antitelo.
  10. 10. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde ADC je ADC5, i gde ADC ima opterećenje leka koje iznosi 2.
  11. 11. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 1, gde ADC je ADC5, i gde su PBD 1 do 8 kovalentno vezani za Ab.
  12. 12. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, gde je anti-DLL3 antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od monoklonskog antitela, himernog antitela, CDR-graftovanog antitela, humanizovanog antitela, ljudskog antitela, multispecifičnog antitela, bispecifičnog antitela, monovalentnog antitela, multivalentnog antitela, Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, Fv fragmenta i ScFv fragmenta; ili njihovog imunoreaktivnog fragmenta.
  13. 13. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, gde se anti-DLL3 antitelo specifično vezuje za epitop unutar DSL domena od DLL3 proteina koji je naveden u SEQ ID NO: 1 ili 2.
  14. 14. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 13, gde se anti-DLL3 antitelo specifično vezuje za epitop koji sadrži aminokiseline G203, R205 i P206 (SEQ ID NO: 4).
  15. 15. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, gde ADC je ADC5 i anti-DLL3 antitelo sadrži ili se nadmeće za vezivanje za ljudski DLL3 protein sa antitelom koji sadrži varijabilni region lakog lanca dat kao SEQ ID NO: 149 i varijabilni region teškog lanca dat kao SEQ ID NO: 151.
  16. 16. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 15, gde anti-DLL3 antitelo sadrži tri CDR varijabilnog regiona lakog lanca datog kao SEQ ID NO: 149 i tri CDR varijabilnog regiona teškog lanca datog kao SEQ ID NO: 151.
  17. 17. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 16, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 24-34 od SEQ ID NO: 149 za CDR-L1, ostatke 50-56 od SEQ ID NO: 149 za CDR-L2, ostatke 89-97 od SEQ ID NO: 149 za CDR-L3, ostatke 31-35 od SEQ ID NO: 151 za CDR-H1, ostatke 50-65 od SEQ ID NO: 151 za CDR-H2, i ostatke 95-102 od SEQ ID NO: 151 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema Kabatu.
  18. 18. Konjugat antitela i leka prema patentnom zahtevu 15, gde anti-DLL3 antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao SEQ ID NO: 405 i varijabilni region teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao SEQ ID NO : 407.
  19. 19. Farmaceutski sastav koja sadrži (a) konjugat antitela i leka prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 18, i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač.
  20. 20. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 19, koji obuhvata odnos leka prema antitelu (DAR) od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, svi /- 0,4.
  21. 21. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 20, koji obuhvata DAR od 2 /- 0,4.
  22. 22. Farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 19 do 21, koji obuhvata manje od 30% nepreovlađujućih ADC vrsta.
  23. 23. Komplet koji sadrži (a) jedan ili više kontejnera koje sadrže konjugat antitela i leka prema bilo kom patentnih zahteva od 1 do 18; i (b) oznaku ili uputstvo za upotrebu koji su na, ili koji su u vezi sa jednim ili više kontejnera, gde oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje da je konjugat antitela i leka namenjen za tretman raka.
  24. 24. Komplet koji sadrži (a) jedan ili više kontejnera koji sadrži farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 19 do 22; i (b) oznaku ili uputstvo za upotrebu koji su na, ili koji su u vezi sa jednim ili više kontejnera, gde oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje da je konjugat antitela i leka namenjen za tretman raka.
  25. 25. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 19 do 22, za upotrebu u tretmanu raka u pacijentu.
  26. 26. Konjugat antitela i leka ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 25, gde rak obuhvata rak malih ćelija pluća, rak prostate, rak štitne žlezde ili neuroendokrini karcinom velikih ćelija.
  27. 27. Konjugat antitela i leka ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 25, gde rak obuhvata rak malih ćelija pluća.
  28. 28. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 19 do 22, za upotrebu u smanjenju učestalosti ćelija koje iniciraju tumor kod pacijenta.
  29. 29. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili farmaceutski sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 19 do 22, za primenu u isporuci PBD u ćeliju raka.
  30. 30. Konjugat antitela i leka prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 18, ili farmaceutski sastav prema bilo kom patentnom zahtevu od 19 do 22, za upotrebu u terapiji.
RS20190752A 2013-02-22 2014-02-21 Antidll3-antitelo-pbd konjugati i njihova upotreba RS58873B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361768368P 2013-02-22 2013-02-22
PCT/US2014/017810 WO2014130879A2 (en) 2013-02-22 2014-02-21 Novel antibody conjugates and uses thereof
EP14753730.2A EP2958944B1 (en) 2013-02-22 2014-02-21 Antidll3-antibody-pbd conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58873B1 true RS58873B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=51391975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190752A RS58873B1 (sr) 2013-02-22 2014-02-21 Antidll3-antitelo-pbd konjugati i njihova upotreba

Country Status (32)

Country Link
US (2) US9968687B2 (sr)
EP (2) EP3556400A1 (sr)
JP (2) JP6462591B2 (sr)
KR (1) KR20160037130A (sr)
CN (1) CN105164159A (sr)
AR (1) AR094867A1 (sr)
AU (2) AU2014218730B2 (sr)
BR (1) BR112015019909A2 (sr)
CA (1) CA2901114C (sr)
CL (3) CL2015002357A1 (sr)
CY (1) CY1121907T1 (sr)
DK (1) DK2958944T3 (sr)
ES (1) ES2731681T3 (sr)
HR (1) HRP20191169T1 (sr)
HU (1) HUE043851T2 (sr)
IL (1) IL240438A0 (sr)
LT (1) LT2958944T (sr)
ME (1) ME03394B (sr)
MX (1) MX2015010682A (sr)
PE (1) PE20151901A1 (sr)
PH (1) PH12015501846A1 (sr)
PL (1) PL2958944T3 (sr)
PT (1) PT2958944T (sr)
RS (1) RS58873B1 (sr)
RU (2) RU2019109456A (sr)
SA (1) SA515360928B1 (sr)
SG (1) SG11201506650PA (sr)
SI (1) SI2958944T1 (sr)
SM (1) SMT201900339T1 (sr)
TR (1) TR201908761T4 (sr)
TW (1) TWI670081B (sr)
WO (1) WO2014130879A2 (sr)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
ES2623057T3 (es) 2010-04-15 2017-07-10 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas usadas para tratar enfermedades proliferativas
KR101772354B1 (ko) 2010-04-15 2017-08-28 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
EP2605652B1 (en) 2010-08-18 2017-11-08 Samumed, LLC Diketones and hydroxyketones as catenin signaling pathway activators
WO2013041606A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
BR112014008888A2 (pt) 2011-10-14 2017-04-18 Seattle Genetics Inc pirrolobenzodiazepinas
US9526798B2 (en) 2011-10-14 2016-12-27 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
MX358757B (es) 2011-10-14 2018-09-03 Seattle Genetics Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados dirigidos.
US9388187B2 (en) 2011-10-14 2016-07-12 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
EP3093294A1 (en) 2012-02-24 2016-11-16 Stemcentrx, Inc. Dll3 modulators and methods of use
US9758591B2 (en) 2012-08-24 2017-09-12 The Regents Of The University Of California Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
AU2013328673B2 (en) 2012-10-12 2017-07-13 Medimmune Limited Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
HRP20190366T1 (hr) 2012-10-12 2019-04-19 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
KR101645905B1 (ko) 2012-10-12 2016-08-04 스피로즌 살 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
KR20150104117A (ko) 2012-12-18 2015-09-14 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
ES2709824T3 (es) 2013-02-22 2019-04-17 Samumed Llc Gamma-dicetonas como activadores de la ruta de señalización Wnt/beta-catenina
RU2019109456A (ru) 2013-02-22 2019-04-10 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые конъюгаты антител и их применения
JP6445519B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
WO2014140862A2 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
WO2014207670A1 (en) * 2013-06-25 2014-12-31 Council Of Scientific & Industrial Research Simulated carbon and proton nmr chemical shifts based binary fingerprints for virtual screening
WO2015031698A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Site-specific antibody conjugation methods and compositions
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
KR20170008202A (ko) 2014-02-21 2017-01-23 애브비 스템센트알엑스 엘엘씨 흑색종에 사용하기 위한 항-ｄｌｌ3 항체 및 약물 접합체
DK3206686T3 (da) 2014-08-20 2019-12-16 Samumed Llc Gamma-diketoner til behandling og forebyggelse af ældning af huden og rynker
SG11201701328XA (en) * 2014-09-02 2017-03-30 Immunogen Inc Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2015314954B2 (en) 2014-09-12 2021-05-13 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibodies and immunoconjugates
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10780096B2 (en) 2014-11-25 2020-09-22 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
MA41613A (fr) * 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
MA41645A (fr) * 2015-03-04 2018-01-09 Abbvie Stemcentrx Llc Anticorps issus de génie génétique spécifiques au site et méthodes d'utilisation
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
TW201709932A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
JP2018524313A (ja) * 2015-06-23 2018-08-30 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト キネシンスピンドルタンパク質（ｋｓｐ）阻害剤の抗ｂ７ｈ３抗体との抗体薬物複合体
JP2018529656A (ja) * 2015-08-20 2018-10-11 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー 抗ｄｌｌ３抗体薬物コンジュゲートおよび使用方法
NZ741261A (en) 2015-10-02 2019-11-29 Genentech Inc Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN109071666B (zh) 2016-03-01 2022-06-28 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 人脊髓灰质炎病毒受体(pvr)特异性抗体
US10934347B2 (en) 2016-04-04 2021-03-02 Genzyme Corporation Anti-complement factor BB antibodies and uses thereof
WO2017184942A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-bmpr1b antibodies and methods of use
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
US10143695B2 (en) 2016-05-18 2018-12-04 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA3024723A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Robert B. Dubridge Single domain serum albumin binding protein
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
JP7049276B2 (ja) 2016-06-24 2022-04-06 メルサナ セラピューティクス インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンおよびその結合体
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201619490D0 (en) * 2016-11-17 2017-01-04 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3558387B1 (de) * 2016-12-21 2021-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
UA125198C2 (uk) 2017-02-08 2022-01-26 Ейдісі Терапьютікс Са Кон'югати піролобензодіазепін-антитіло
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2018187706A2 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
SI3612537T1 (sl) 2017-04-18 2022-10-28 Medimmune Limited Konjugati pirolobenzodiazepina
BR112020003003A2 (pt) 2017-08-18 2020-08-11 Medimmune Limited conjugados de pirrolobenzodiazepina
CN117003875A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体或其功能性片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、糖链重构抗体、药物组合物、应用
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
JP7084990B2 (ja) 2017-10-13 2022-06-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性タンパク質と使用方法
US11638760B2 (en) 2017-11-27 2023-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
JP2021506883A (ja) 2017-12-21 2021-02-22 メルサナ セラピューティクス インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピン抗体結合体
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
MX2020010110A (es) 2018-03-28 2020-11-06 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Conjugados de farmacos de agentes de union monoclonales de cmet, y usos de los mismos.
US20190300610A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
WO2019195408A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting dll3, and use thereof
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
BR112020021280A2 (pt) 2018-05-08 2021-01-26 Phanes Therapeutics, Inc. anticorpos anti-dll3 e usos dos mesmos
WO2019222283A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
EP3810634A4 (en) 2018-06-21 2022-07-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mosaic influenza virus hemagglutinin polypeptides and uses thereof
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2020028832A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
EP3882349A4 (en) 2018-11-14 2023-04-05 Daiichi Sankyo Company, Limited (ANTI-CDH6 ANTIBODY)-(PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE) CONJUGATE
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
MX2021010477A (es) 2019-03-15 2021-10-01 Medimmune Ltd Dimeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento de cancer.
SG11202109860VA (en) 2019-03-25 2021-10-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
TWI856078B (zh) 2019-03-25 2024-09-21 日商第一三共股份有限公司 抗體–吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途
BR112021017350A2 (pt) 2019-03-27 2021-11-16 Daiichi Sankyo Co Ltd Combinação de conjugado de anticorpo-derivado de pirrolobenzodiazepina e inibidor de parp
EP3959216A4 (en) 2019-04-24 2023-01-11 Icahn School of Medicine at Mount Sinai ANTI-INFLUENZA B VIRUS NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND USES THEREOF
US12516128B2 (en) 2019-05-14 2026-01-06 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
JP7754506B2 (ja) 2019-10-08 2025-10-15 ネクチン セラピューティクス エルティーディー． ポリオウイルス受容体（ｐｖｒ）に対する抗体およびその使用
CN114933655B (zh) * 2019-11-12 2024-04-05 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 抗cd123抗体及其应用
EP4084823A4 (en) 2020-01-03 2024-05-15 Marengo Therapeutics, Inc. ANTI-TCR ANTIBODY MOLECULES AND THEIR USES
JP7557274B2 (ja) * 2020-04-06 2024-09-27 旭化成株式会社 検体中のレジオネラ菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いてレジオネラ菌を検出するための方法、試薬、及びキット
WO2021216458A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Genzyme Corporation Humanized anti-complement factor bb antibodies and uses thereof
AU2021338014A1 (en) 2020-09-02 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel endo-β-N-acetylglucosaminidase
CA3204731A1 (en) * 2021-01-13 2022-07-21 John T. POIRIER Anti-dll3 antibody-drug conjugate
TW202237135A (zh) * 2021-01-13 2022-10-01 紀念斯隆凱特琳癌症中心 抗體-吡咯并苯并二氮呯衍生物結合物
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
JP2024525608A (ja) 2021-07-09 2024-07-12 ダイン セラピューティクス，インコーポレーテッド ジストロフィン異常症を処置するための筋標的化複合体および製剤
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
IL312728A (en) 2021-11-30 2024-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Protease-cleavable masked antibodies
EP4477674A1 (en) 2022-02-09 2024-12-18 Daiichi Sankyo Company, Limited Environmentally responsive masked antibody and use thereof
JPWO2023167238A1 (sr) 2022-03-02 2023-09-07
IL316143A (en) 2022-04-15 2024-12-01 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and formulations for the treatment of myotonic dystrophy
US20250339570A1 (en) * 2022-05-20 2025-11-06 The Regents Of The University Of California Radioimmunoconjugates and therapeutic uses thereof
IL319125A (en) 2022-08-22 2025-04-01 Abdera Therapeutics Inc DLL3 binding molecules and their uses
CN116253798B (zh) * 2022-12-15 2023-10-27 华中农业大学 一株针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体
WO2024230301A1 (zh) * 2023-05-09 2024-11-14 诺灵生物医药科技(北京)有限公司 一种抗体偶联药物及其用途

Family Cites Families (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
AU8295491A (en) 1990-06-29 1992-01-23 Biosource Technologies Incorporated Melanin production by transformed microorganisms
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
CA2196200A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Michael Joseph Browne Novel compounds
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
ATE234635T1 (de) 1995-12-22 2003-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
US20030180784A1 (en) 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
DE69839060T2 (de) 1997-11-03 2009-01-15 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, ein inhibitor der angiogenese und des tumorwachstums
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
CA2341471C (en) 1998-08-27 2009-04-07 Spirogen Limited Pyrrolbenzodiazepines
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6908748B2 (en) 1999-07-29 2005-06-21 Kenji Sobue Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells
WO2001012664A2 (en) 1999-08-19 2001-02-22 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
US6703221B1 (en) 1999-08-19 2004-03-09 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
AU2001280471A1 (en) 2000-08-11 2002-02-25 Eli Lilly And Company Novel secreted proteins and their uses
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
US6362331B1 (en) 2001-03-30 2002-03-26 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of antitumor agents
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
JP2005533001A (ja) 2002-03-04 2005-11-04 メディミューン，インコーポレーテッド インテグリンαｖβ３アンタゴニストを他の物質と併用投与する癌の予防または治療方法
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
MXPA05003884A (es) 2002-10-16 2005-10-05 Euro Celtique Sa Anticuerpos que enlazan polipeptidos ca 125/0772p a celulas asociadas y metodos de uso de los mismos.
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
GB0226593D0 (en) 2002-11-14 2002-12-24 Consultants Ltd Compounds
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
EP1633784B1 (en) 2003-05-09 2011-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
EP1654383A1 (en) 2003-08-08 2006-05-10 Licentia, Ltd. Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis, and therapy
GB0321295D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Spirogen Ltd Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
CA2558195C (en) 2004-03-01 2012-11-06 Spirogen Limited 11-hydroxy-5h-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one derivatives as key intermediates for the preparation of c2 substituted pyrrolobenzodiazepines
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
FR2869231B1 (fr) 2004-04-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition therapeutique contenant au moins un derive de la pyrrolobenzodiazepine et la fludarabine
MX2007001221A (es) 2004-08-04 2007-03-23 Amgen Inc Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
DE602006021205D1 (de) 2005-10-07 2011-05-19 Exelixis Inc Azetidine als mek-inhibitoren bei der behandlung proliferativer erkrankungen
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
BRPI0620695A2 (pt) 2005-12-16 2011-11-22 Genentech, Inc método para tratar um tumor do tipo glioma, métodos de prognóstico e/ou diagnóstico de glioma, método de monitoramento ou diagnóstico, método para inibir o tamanho ou crescimento de um tumor do tipo glioma, métodos para tratar terapeuticamente, método para determinar o nìvel de expressão de marcadores determinantes de glioma ("gdm") de pn, prolif ou mes, método para prognosticar o tempo de sobrevida, método para diagnosticar a severidade de um tumor do tipo glioma e uso
WO2007080597A2 (en) 2006-01-16 2007-07-19 Compugen Ltd. Polynucleotide and polypeptide sequences and methods for diagnosis
SI1813614T1 (sl) 2006-01-25 2012-01-31 Sanofi 174 Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomajmicinske derivate
US8133857B2 (en) 2006-03-07 2012-03-13 The Brigham and Women's FHospital, Inc. NOTCH inhibition in the treatment of atherosclerosis
CA2658003A1 (en) 2006-06-06 2007-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Compositions enriched in neoplastic stem cells and methods comprising same
PL3207941T6 (pl) 2006-09-07 2020-11-16 Scott & White Memorial Hospital Sposoby i kompozycje oparte na koniugacie ludzkiej interleukiny (IL)-3 z toksyną błoniczą
US7825267B2 (en) 2006-09-08 2010-11-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of FR901464 and analogs with antitumor activity
US20100061933A1 (en) 2006-10-20 2010-03-11 Naoki Kimura Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
US8309354B2 (en) 2007-01-22 2012-11-13 Macrogenics West, Inc. Human cancer stem cells
AR066476A1 (es) 2007-05-08 2009-08-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugaods de anticuerpos y farmacos
WO2009012357A2 (en) 2007-07-17 2009-01-22 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
EP2022848A1 (en) 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
US20090130105A1 (en) 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
US20090155255A1 (en) 2007-09-27 2009-06-18 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
CA2698541C (en) 2007-10-19 2018-01-09 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
WO2009124931A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof
US8384551B2 (en) 2008-05-28 2013-02-26 MedHab, LLC Sensor device and method for monitoring physical stresses placed on a user
WO2010037134A2 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
US8788213B2 (en) 2009-01-12 2014-07-22 Intrexon Corporation Laser mediated sectioning and transfer of cell colonies
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
LT2530091T (lt) 2010-01-29 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-dll3 antikūnas
KR101772354B1 (ko) 2010-04-15 2017-08-28 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
ES2623057T3 (es) * 2010-04-15 2017-07-10 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas usadas para tratar enfermedades proliferativas
GB201006340D0 (en) 2010-04-15 2010-06-02 Spirogen Ltd Synthesis method and intermediates
CN106434561A (zh) 2010-09-03 2017-02-22 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 细胞亚群的鉴定和富集
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
MX347954B (es) 2010-09-29 2017-05-19 Agensys Inc Conjugados de anticuerpo farmaco (adc) que enlazan a proteinas 191p4d12.
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
BR112013021460B1 (pt) 2011-03-02 2022-12-20 Roche Glycart Ag Anticorpos, composição e uso do anticorpo
WO2013041606A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
WO2013055987A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EP3093294A1 (en) 2012-02-24 2016-11-16 Stemcentrx, Inc. Dll3 modulators and methods of use
KR101645905B1 (ko) 2012-10-12 2016-08-04 스피로즌 살 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
AU2013328673B2 (en) 2012-10-12 2017-07-13 Medimmune Limited Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
RU2019109456A (ru) 2013-02-22 2019-04-10 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые конъюгаты антител и их применения
US9683039B2 (en) 2013-03-14 2017-06-20 New York University Notch agonists for the treatment of cancer
KR20160047567A (ko) 2013-08-28 2016-05-02 스템센트알엑스 인코포레이티드 조작된 항-dll3 접합체 및 사용 방법
WO2015031698A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Site-specific antibody conjugation methods and compositions
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9950078B2 (en) 2013-10-11 2018-04-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054984A1 (en) 2013-10-11 2016-08-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
KR20170008202A (ko) 2014-02-21 2017-01-23 애브비 스템센트알엑스 엘엘씨 흑색종에 사용하기 위한 항-ｄｌｌ3 항체 및 약물 접합체
EP3209334A2 (en) 2014-10-20 2017-08-30 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
CL2017002110A1 (es) 2018-05-04
ME03394B (me) 2020-01-20
JP2016510002A (ja) 2016-04-04
CL2019000334A1 (es) 2019-06-07
RU2019109456A (ru) 2019-04-10
AU2019201688A1 (en) 2019-04-04
HUE043851T2 (hu) 2019-09-30
US10478509B2 (en) 2019-11-19
SI2958944T1 (sl) 2019-08-30
CN105164159A (zh) 2015-12-16
AU2014218730A1 (en) 2015-10-08
WO2014130879A3 (en) 2014-10-16
SA515360928B1 (ar) 2018-10-04
EP2958944A4 (en) 2016-08-24
CY1121907T1 (el) 2020-10-14
TW201442728A (zh) 2014-11-16
JP2019069983A (ja) 2019-05-09
PL2958944T3 (pl) 2019-09-30
CA2901114A1 (en) 2014-08-28
US20180318441A1 (en) 2018-11-08
ES2731681T3 (es) 2019-11-18
SMT201900339T1 (it) 2019-07-11
PT2958944T (pt) 2019-06-27
US20160015828A1 (en) 2016-01-21
KR20160037130A (ko) 2016-04-05
CL2015002357A1 (es) 2016-03-11
TR201908761T4 (tr) 2019-07-22
MX2015010682A (es) 2016-05-31
DK2958944T3 (da) 2019-06-24
EP2958944A2 (en) 2015-12-30
LT2958944T (lt) 2019-07-10
JP6462591B2 (ja) 2019-01-30
SG11201506650PA (en) 2015-09-29
HK1217956A1 (en) 2017-01-27
TWI670081B (zh) 2019-09-01
AR094867A1 (es) 2015-09-02
RU2684468C2 (ru) 2019-04-09
US9968687B2 (en) 2018-05-15
AU2014218730B2 (en) 2018-12-13
PE20151901A1 (es) 2016-01-13
BR112015019909A2 (pt) 2017-08-29
WO2014130879A2 (en) 2014-08-28
EP2958944B1 (en) 2019-03-27
PH12015501846A1 (en) 2015-12-07
RU2015140122A (ru) 2017-03-28
CA2901114C (en) 2020-01-07
EP3556400A1 (en) 2019-10-23
IL240438A0 (en) 2015-09-24
HRP20191169T1 (hr) 2019-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10478509B2 (en) Anti-DLL3 antibody drug conjugates for treating cancer
US9334318B1 (en) Multivalent DLL3 antibodies
US20170073430A1 (en) Novel anti-rnf43 antibodies and methods of use
WO2015095766A2 (en) Novel anti-lingo1 antibodies and methods of use
EP3452511A1 (en) Novel anti-tnfrsf21 antibodies and methods of use
US20250051463A1 (en) Cd123 antibody-drug conjugates and methods of using the same
HK1217956B (en) Antidll3-antibody-pbd conjugates and uses thereof
HK1200174B (en) Dll3 modulators and methods of use