TWI670081B - 新穎抗體結合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供新穎抗體藥物結合物(antibody drug conjugates；ADC)，及使用該等ADC治療增生性病症之方法。

Description

新穎抗體結合物及其用途 交叉引用申請案

本申請案主張2013年2月22日申請之美國臨時申請案第61/768368號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。

序列表

本申請案含有經EFS-Web以ASCII格式提交且在此以全文引用的方式併入本文中之序列表。該ASCII複本(2014年2月15日建立)之名稱為S69697_1110WO_ST25.txt且尺寸為582KB(596,345位元組)。

本申請案大體上係關於新穎化合物，其包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段與吡咯并苯并二氮呯(PBD)之結合物，及該等化合物用於治療或預防癌症及癌症之任何復發或轉移之用途。

幹細胞及祖細胞之分化及增殖為正常的進行性過程，其共同起作用以支援器官發生期間之組織生長、細胞修復及細胞置換。緊密地調節系統以確保基於生物之需要而僅產生適當的信號。細胞增殖及分化通常僅視需要發生以用於置換受損或死亡細胞或用於生長。然而，可由多種因素引起該等過程之破壞，包括各種信號傳導化學物之不足或過量、存在微環境改變、遺傳突變或其組合。正常細胞增殖及/或分化之破壞可引起各種病症，包括增生性疾病，諸如癌症。

癌症之習知治療包括化學療法、放射線療法及免疫療法。通常 該等治療不起作用且外科切除可能無法提供可行的臨床替代手段。現有護理標準之侷限性在患者經歷第一線治療且接著復發之情況下尤其明顯。在該等情況下，頻繁地出現頑抗性腫瘤，其通常為侵襲性及不可治癒的。至少部分地歸因於現有療法在防止復發、腫瘤再發生及轉移方面的不足，許多實體腫瘤之整體存活率近年來仍然基本無變化。現有治療之治療侷限性使發展可有效靶向致瘤細胞且在可管理的附帶損害下消除致瘤細胞之新穎試劑的需要變得顯著。

一種發展該等試劑及相關治療之有前景的領域包含使用抗體之靶向療法。在此方面，已公認將抗體療法用於癌症、免疫學及血管生成病症之患者之靶向治療(Carter,P.(2006)Nature Reviews Immunology 6：343-357)。更特定言之，已證實使用包含細胞結合劑靶向組分及藥物有效負載組分之抗體藥物結合物(亦即ADC或免疫結合物)進行細胞毒性劑或細胞生長抑制劑之局部遞送可促進腫瘤細胞內藥物之細胞內積聚。該局部化可使腫瘤內藥物之濃度相對較高，而實現相同腫瘤濃度之未結合(亦即非靶向)之藥物之全身投與可引起正常細胞不可接受的毒性程度(Xie等人(2006)Expert.Opin.Biol.Ther. 6(3)：281-291；Kovtun等人(2006)Cancer Res. 66(6)：3214-3121；Law等人(2006)Cancer Res. 66(4)：2328-2337；Wu等人(2005)Nature Biotech. 23(9)：1137-1145；Lambert J.(2005)Current Opin.in Pharmacol. 5：543-549；Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15(9)：1087-1103；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Trail等人(2003)Cancer Immunol.Immunother. 52：328-337；Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614)。

由臨床觀點出發，該等抗體藥物結合物可因此提供增強之功效及毒性之相應降低。設計及改進ADC之努力集中於單株抗體(mAb)之選擇性以及藥物作用機制、結合技術及連接子、藥物/抗體比率(負載) 及藥物釋放性質(Junutula等人，2008b Nature Biotech.,26(8)：925-932；Dornan等人(2009)Blood 114(13)：2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249；McDonagh(2006)Protein Eng.Design & Sel.19(7)：299-307；Doronina等人(2006)Bioconj.Chem.17：114-124；Erickson等人(2006)Cancer Res. 66(8)：1-8；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res. 11：843-852；Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem. 48：1344-1358；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res. 10：7063-7070)。關於抗體選擇性及腫瘤定位，已證實多種已知腫瘤標記出於多種原因(包括低表現、內化作用不足、脫落等)而為無效的ADC目標。過去，亦證實合適ADC藥物成分之選擇存在問題。已提議將多種試劑用於ADC，包括藉由包括微管蛋白結合、DNA結合、蛋白酶體及/或拓撲異構酶抑制之機制來提供細胞毒性及細胞生長抑制作用的藥物部分。儘管一些試劑獲得成功，但某些細胞毒性藥物在與大型抗體或蛋白質受體配位體結合時傾向於為惰性或活性不足。因此，選擇適當的靶向或細胞結合劑及有效藥物有效負載作為ADC成分對於提供呈現所需臨床概況之化合物而言係重要的。

一種有希望作為潛在ADC有效負載之化合物為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在此方面，PBD具有識別及結合於DNA之特定序列(包括較佳序列PuGPu)的能力。第一種PBD抗腫瘤抗生素，蒽黴素(anthramycin)，發現於1965年(Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc. ,87 ,5793-5795(1965)；Leimgruber等人，J.Am.Chem.Soc. ,87 ,5791-5793(1965))。自那時起，已報導了許多天然存在的PBD，且針對多種類似物已開發了10種以上的合成路徑(Thurston等人，Chem.Rev. 1994 ,433-465(1994)；Antonow,D.及Thurston,D.E.,Chem.Rev. 2011 111(4),2815-2864)。家族成員包括赤黴素(abbeymycin)(Hochlowski等人，J.Antibiotics ,40 ,145-148(1987))、奇卡黴素(chicamycin)(Konishi等人，J.Antibiotics, 37 ,200-206(1984))、DC-81(日本專利58-180 487；Thurston等人，Chem.Brit. ,26 ,767-772(1990)；Bose等人，Tetrahedron ,48 ,751-758(1992))、甲基氨茴黴素(mazethramycin)(Kuminoto等人，J.Antibiotics ,33 ,665-667(1980))、新絲拉黴素A(neothramycin A)及新絲拉黴素B(Takeuchi等人，J.Antibiotics ,29 ,93-96(1976))、泊羅黴素(porothramycin)(Tsunakawa等人，J.Antibiotics ,41 ,1366-1373(1988))、普斯卡星(prothracarcin)(Shimizu等人，J.Antibiotics ,29 ,2492-2503(1982)；Langley及Thurston,J.Org.Chem. ,52 ,91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara等人，J.Antibiotics ,41 ,702-704(1988)；Itoh等人，J.Antibiotics ,41 ,1281-1284(1988))、西伯利亞黴素(sibiromycin)(Leber等人，J.Am.Chem.Soc. ,110 ,2992-2993(1988))及托馬黴素(tomamycin)(Arima等人，J.Antibiotics ,25 ,437-444(1972))。

PBD具有通式結構：

其差別在於在其芳族A環和吡咯并C環兩者中取代基的數目、類型及位置，以及在於C環的飽和度。在B環中，在N10-C11位置處，存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))，其為負責烷基化DNA之親電子中心。所有已知的天然產物均在對掌性C11a位置具有(S )組態，當自C環朝向A環看時，所述組態為其提供了右手轉動(right-handed twist)。此賦予其適當三維形狀以與B型DNA之小溝具有相同螺旋性，引起在結合位點處滑動配合(Kohn,InAntibiotics III. Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res. ,19 ,230-237(1986))。PBD 在小溝中形成加合物的能力使其能夠干擾DNA加工，因此其用作抗腫瘤劑。

尤其有利的吡咯并苯并二氮呯化合物係由Gregson等人(Chem.Commun. 1999 ,797-798)描述為化合物1，及由Gregson等人(J.Med.Chem. 2001 ,44 ,1161-1174)描述為化合物4a。此化合物，亦稱為SG2000，展示如下：

WO 2007/085930描述二聚體PBD化合物之製備，該等化合物具有用於連接至細胞結合劑(諸如抗體)之連接基團。連接子存在於連接二聚體之單體PBD單元之橋中。

WO 2011/130598描述二聚體PBD化合物，其具有用於連接至細胞結合劑(諸如抗體)之連接基團。此等化合物中之連接子連接至一個可用N10位置且較佳藉由連接基團上酶之作用而裂解。

儘管多種PBD ADC有希望用於治療某些增生性病症，但在此項技術中仍需要臨床有效靶向化合物及使用該等化合物治療增生性病症之方法。

提供本發明以實現此等及其他目標，本發明在廣義上係關於方法、化合物、組合物及製品，其包含有包含所選PBD之某些抗體藥物結合物，該等抗體藥物結合物可用於治療DLL3相關病症(例如增生性病症或贅生性病症)。為此，本發明提供δ樣配位體3(或DLL3)抗體與所選PBD之結合物，該等結合物有效靶向腫瘤細胞及/或癌症幹細胞且可用於治療罹患多種增生性病症及該等病症之任何擴增、再發生、復發或轉移之患者。在廣泛態樣中，本發明係關於δ樣配位體3 (DLL3)抗體與所選吡咯并苯并二氮呯之結合物，其提供以下ADC 1-5中實質上闡述之DLL3免疫結合物。因此，在一個態樣中，本發明係關於選自由以下組成之群的結合物 及 其中Ab包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段。各結合物中與連接子藥物部分之結合較佳係經由抗DLL3抗體上之游離硫醇實現。

在其他態樣中，本發明包含以下組合物：包含ADC 1之組合物、包含ADC 2之組合物、包含ADC 3之組合物、包含ADC 4之組合物或包含ADC 5之組合物。

如所指示，該等結合物可用於治療、管理、改善或預防增生性病症或其復發或發展。本發明之所選實施例提供該等DLL3結合物之用途，其係用於惡性腫瘤之免疫治療性治療，較佳包含腫瘤引發細胞出現率之降低。所揭示之ADC可單獨使用或與多種抗癌症化合物結合使用，諸如化學治療劑或免疫治療劑(例如治療性抗體)或生物反應修飾劑。在其他所選實施例中，兩種或兩種以上離散DLL3抗體藥物結合物可組合使用以提供增強之抗贅生作用。

在另一態樣中，如隨附實例中所闡述，本發明提供製備ADC 1-5之方法，其包含使選自由以下組成之群之化合物與抗DLL3抗體或其免疫反應性片段結合： 及

為達成本申請案之目的，DL將用作「藥物連接子」之縮寫且將包含如上文所闡述之藥物連接子1-5(亦即DL1、DL2、DL3、DL4及DL5)。

應瞭解，可使用此項技術中公認的技術使連接子所附之末端馬來醯亞胺部分(DL1-DL3及DL5)或碘乙醯胺部分(DL4)與所選DLL3抗體上之游離巰基結合。除在下文中更詳細論述之外，DL 1-5之各化合物之合成途徑提供於本文中之隨附實例1中，而結合該等化合物以提供ADC 1-5之特定方法闡述於實例7中。

應注意，為達成本申請案之目的，應瞭解，除非上下文另有指示，否則術語「調節子」及「抗體」可互換地使用。類似地，術語「抗DLL3結合物」及「DLL3結合物」或僅「結合物」均係指闡述為包含抗DLL3抗體之ADC 1-5之化合物且除非上下文另有指示，否則其可互換地使用。

在任何情況下，提供本發明以達成此等及其他目標，本發明在廣義上係關於上述DLL3結合物及相關方法、組合物及製品，其可用於治療DLL3相關病症(例如增生性病症或贅生性病症)。為此，本發明提供新穎的δ樣配位體3(或DLL3)抗體結合物，其有效靶向腫瘤細胞及/或癌症幹細胞且可用於治療罹患多種惡性腫瘤之患者。如本文中 將更詳細論述，存在至少兩種天然存在之DLL3同功異型物或變異體且所揭示之調節子可包含一種同功異型物或另一種同功異型物或其兩者或與其選擇性相關聯。此外，在某些實施例中，所揭示之DLL3調節子可進一步與一或多種DLL家族成員(例如DLL1或DLL4)反應，或在其他實施例中，可經產生及選擇以獨佔地與一或多種DLL3同功異型物相關聯或反應。

亦應瞭解，所揭示之抗體藥物結合物可包含任何可滿足以下條件之調節子、抗體或其免疫反應性片段：識別DLL3決定子(或其片段)、與DLL3決定子(或其片段)競爭、對抗DLL3決定子(或其片段)、拮抗DLL3決定子(或其片段)、與DLL3決定子(或其片段)相互作用、結合DLL3決定子(或其片段)或與DLL3決定子(或其片段)相關聯及調整、調控、改變、調節、改變或改良DLL3蛋白質對一或多種生理途徑之影響及/或抑制或消除DLL3相關細胞。因此，在廣義上，本發明大體上係關於DLL3結合物及其用途。此外，如下文廣泛論述，該等抗體藥物結合物可用於提供適用於預防、診斷或治療增生性病症(包括癌症)之醫藥組合物。

關於ADC 1-5，應瞭解，相容抗體可具有多種形式中之任一種，包括例如多株及單株抗體、嵌合抗體、CDR接枝抗體、人類化抗體及人類以及前述各者中之每一者之免疫反應性片段及/或變異體。較佳實施例將包含相對非免疫原性抗體，諸如人類化或完全人類構築體。當然，在本發明中，熟習此項技術者可容易地鑑別與DLL3抗體調節子之重鏈及輕鏈可變區相關聯的一或多個互補決定區(CDR)及使用該等CDR在無不當實驗的情況下工程改造或製造嵌合、人類化或CDR接枝抗體。因此，在某些較佳實施例中，所揭示之ADC之DLL3抗體組分包含合併有一或多個互補決定區(CDR)之抗體，該一或多個互補決定區係如圖3A及3B中所定義且來源於其中闡述之例示性鄰接輕鏈(圖 3A)或重鏈(圖3B)鼠類可變區(SEQ ID NO：21-387，單號)。圖3中亦展示例示性人類化(CDR接枝)輕鏈及重鏈可變區序列，包含SEQ ID NO：389-407。在較佳實施例中，包含圖3A及3B中闡述之CDR的抗體將包含單株抗體，且在更佳實施例中，將包含嵌合、CDR接枝或人類化抗體。編碼圖3A及3B中闡述之各胺基酸序列之例示性核酸序列隨附於本文中之序列表中。

在另一實施例中，本發明之抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其包含與本文中所描述之例示性抗體之胺基酸序列同源的胺基酸序列，且其中抗體保留本發明之抗DLL3抗體之所需功能性。

更特定言之，在所選實施例中，ADC 1-5中之任一者中所包括之抗體可包含具有輕鏈可變區及重鏈可變區之抗體或其免疫反應性片段，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%同源的胺基酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：225、 SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：381及SEQ ID NO：385，且其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%同源的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：383及SEQ ID NO：387。在其他較佳實施例中，所選調節子將包含與上述鼠類序列65%、70%、75%或80%同源的重鏈及輕鏈可變區。在其他實施例中，調節子將包含與所揭示之鼠類序列85%、90%或甚至95%同源的重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列。在此方面，應瞭解，來源於鼠類來源抗體之人類化抗體典型地具有較佳與源抗體約70%至約85%同源的重鏈及輕鏈可變區。藉由比較，人類化抗體將典型地具有較佳與受體人類抗體約80%至約95%同源的重鏈及輕鏈可變區。

在其他較佳實施例中，所選抗體將包含一或多個自上述輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列中之任一者獲得之CDR。因此，本發明之所選實施例包括DLL3調節子，其包含一或多個來自SEQ ID NO：21至387(單號)中之任一者之CDR。抗體較佳將包含三個自圖3A中闡述之單一輕鏈可變區胺基酸序列獲得之輕鏈CDR及三個自圖3B中闡述之單一重鏈可變區胺基酸序列獲得之重鏈CDR。在其他實施例中，本發明之結合物將包含任何與任一種上述調節子就結合進行競爭之抗體或其免疫反應性片段。

因此，本發明之另一態樣包含ADC，其合併有自以下獲得或來源之抗體：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。在其他實施例中，本發明之ADC將包含DLL3抗體，其具有一或多個來自上述調節子中之任一者的CDR。

在另一態樣中，本發明將包含結合物，其中抗DLL3抗體或其免疫反應性片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含來源於選自由以下組成之群之胺基酸序列的胺基酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：381及SEQ ID NO：385，且其中該重鏈可變區包含來源於選自由以下組成之群之胺基酸序列的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：383及SEQ ID NO：387。

在其他相容實施例中，本發明之抗體藥物結合物將包含CDR接枝或人類化DLL3抗體hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56中之一者。

其他實施例係關於包含抗體之ADC，其中該抗體包含：抗體輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO：408之輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：409之輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：410之輕鏈 可變區CDR3；及抗體重鏈，其包含有包含SEQ ID NO：411之重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：412之重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：413之重鏈可變區CDR3。

在另一實施例中，本發明係關於包含抗體之ADC，其中該抗體包含：抗體輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO：414之輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：415之輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：416之輕鏈可變區CDR3；及抗體重鏈，其包含有包含SEQ ID NO：417之重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：418之重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：419之重鏈可變區CDR3。

在另一實施例中，本發明係關於包含抗體之ADC，其中該抗體包含：抗體輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO：420之輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：421之輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：422之輕鏈可變區CDR3；及抗體重鏈，其包含有包含SEQ ID NO：423之重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：424之重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：425之重鏈可變區CDR3。

在另一實施例中，本發明係關於包含抗體之ADC，其中該抗體包含：抗體輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO：426之輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：427之輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：428之輕鏈可變區CDR3；及抗體重鏈，其包含有包含SEQ ID NO：429之重鏈可變區CDR1、 包含SEQ ID NO：430之重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：431之重鏈可變區CDR3。

在另一實施例中，本發明係關於包含抗體之ADC，其中該抗體包含：抗體輕鏈，其包含有包含SEQ ID NO：432之輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：433之輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：434之輕鏈可變區CDR3；及抗體重鏈，其包含有包含SEQ ID NO：435之重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：436之重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：437之重鏈可變區CDR3。

在某些較佳實施例中，上述抗體中之每一者均包含人類化抗體。此外，如本文中所描述，編碼該等例示性人類化重鏈及輕鏈可變區之核酸序列闡述於隨附序列表中。

此外，本發明之一個態樣可包含DLL3多肽與癌症幹細胞之治療性關聯。因此，在某些其他實施例中，本發明將包含ADC 1-5之DLL3結合物，其在投與個體時降低腫瘤引發細胞之出現率。較佳使用活體外或活體內有限稀釋分析測定出現率之降低。在尤其較佳實施例中，該分析可使用活體內有限稀釋分析進行，其包含將活的人類腫瘤細胞移植至免疫功能不全之小鼠中。或者，有限稀釋分析可使用活體外有限稀釋分析進行，其包含支援病狀之活體外群落中活的人類腫瘤細胞之有限稀釋沈積。在任一種情況下，出現率降低之分析、計算或定量將較佳包含使用泊松分佈統計(Poisson distribution statistics)以提供精確計算。應瞭解，儘管該等定量方法為較佳，但其他勞動密集度較低的方法(諸如流動式細胞測量術或免疫組織化學)亦可用於提供所需值且因此明確地涵蓋於本發明之範疇內。在該等情況下，出現率之降低可使用已知針對腫瘤引發細胞富集之腫瘤細胞表面標記之流動式細胞 測量分析或免疫組織化學偵測來測定。

在此方面，應瞭解，本發明係至少部分基於發現DLL3免疫原與腫瘤永續細胞(亦即癌症幹細胞)在治療學上相關聯，該等腫瘤永續細胞與各種增生性病症(包括贅瘤形成)之病源學有關。更特定言之，本申請案揭示投與所揭示之DLL3結合物可介導、降低、消耗、抑制或消除由腫瘤引發細胞引起之致瘤信號傳導(例如降低腫瘤引發細胞之出現率)。此降低之信號傳導(無論藉由腫瘤引發細胞之消耗、中和、減少、消除、重新程式化或靜止或藉由改良腫瘤細胞形態(例如誘導之分化、幹細胞微環境破壞(niche disruption))又可藉由抑制腫瘤形成、腫瘤保持、擴增及/或轉移及復發而更有效地治療DLL3相關病症。

除與癌症幹細胞之上述關聯外，有證據表明DLL3同功異型物可能與包含或呈現神經內分泌特徵或表現型決定子之腫瘤之生長、復發或轉移潛力有關。為達成本發明之目的，該等腫瘤將包含神經內分泌腫瘤及偽神經內分泌腫瘤。藉此，使用本文中所描述之新穎DLL3結合物介入該等致瘤細胞之增殖可藉由一種以上機制(例如腫瘤引發細胞降低及破壞致癌途徑信號傳導)改善或治療病症，從而提供累加或協同效應。其他較佳實施例可利用細胞表面DLL3蛋白質之細胞內化作用來遞送所連接之抗癌劑。在此方面，應瞭解，本發明不受任何特定作用機制限制，而是涵蓋所揭示之調節子治療DLL3相關病症(包括各種贅瘤形成)之廣泛用途。

在其他較佳實施例中，調節子將與DLL3之特定抗原決定基、部分、主結構或結構域締合或結合。如下文將詳細論述，兩種DLL3同功異型物合併有相同的細胞外區域(參見圖2)，該細胞外區域至少包含一個N端結構域、一個DSL(δ/鋸齒狀/lag-2)結構域及六個EGF樣結構域(亦即EGF1-EGF6)。因此，在某些實施例中，調節子將與DLL3 之N端結構域(亦即成熟蛋白質中之胺基酸27-175)結合或締合，而在其他所選實施例中，調節子將與DSL結構域(亦即DLL3之胺基酸176-215)或其中抗原決定基締合。本發明之其他態樣包含與位於DLL3之特定EGF樣結構域中之特定抗原決定基締合或結合的抗體。在此方面，特定調節子可與位於EGF1(胺基酸216-249)、EGF2(胺基酸274-310)、EGF3(胺基酸312-351)、EGF4(胺基酸353-389)、EGF5(胺基酸391-427)或EGF6(胺基酸429-465)中之抗原決定基締合或結合。當然，應瞭解，上述結構域中之每一者可包含一個以上抗原決定基及/或一個以上倉室。在尤其較佳實施例中，本發明將包含與DSL結構域或其中抗原決定基結合、反應或締合之抗體。在其他較佳實施例中，本發明將包含與特定EGF樣結構域或其中抗原決定基結合、反應或締合之抗體。在其他較佳實施例中，調節子將與N端結構域或其中抗原決定基結合、反應或締合。

關於調節子或抗體「倉室」，應瞭解，可使用此項技術中公認的技術經由競爭性抗體結合來分析或定位DLL3抗原，以便界定位於蛋白質上或沿蛋白質定位之特定倉室。儘管本文中更詳細地論述且在以下實例中展示，但若兩個抗體(其中一個可稱為「參考抗體」、「倉室定界抗體」或「定界抗體」)彼此競爭結合目標抗原，則可認為其位於同一個倉室中。在該等情況下，標的抗體抗原決定基可相同、實質上相同或足夠靠近(線性含義(當其由少數胺基酸分隔時)或構形性),使得兩種抗體被以位阻或靜電方式抑制或妨礙與抗原結合。該等界定之倉室可大體上與某些DLL3結構域相關聯(例如參考抗體將與特定結構域中所含抗原決定基結合)，但相關性並不總是精確(例如結構域中可能存在一個以上倉室或倉室可以構形方式界定且包含一個以上結構域)。應瞭解，熟習此項技術者可容易地確定DLL3結構域之間的關係且憑經驗確定倉室。

在本發明中，使用此項技術中公認之技術(例如ELISA、表面電漿子共振或生物層干涉術)之競爭性結合分析界定至少九個相異的倉室，發現其中每個倉室均含有多個抗體調節子。為達成本發明之目的，將九個倉室稱為倉室A至倉室I。因此，在所選實施例中，本發明將包含駐留於選自由以下組成之群之倉室中的ADC 1-5之抗體藥物結合物：倉室A、倉室B、倉室C、倉室D、倉室E、倉室F、倉室G、倉室H及倉室I。

在其他實施例中，本發明之結合物包含駐留於由選自由以下組成之群之參考抗體界定的倉室中之抗體：SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。在其他實施例中，本發明之ADC將包含來自倉室A之抗體、來自倉室B之抗體、來自倉室C之抗體、來自倉室D之抗體、來自倉室E之抗體、來自倉室 F之抗體、來自倉室G之抗體、來自倉室H之抗體或來自倉室I之抗體。其他較佳實施例將包含參考抗體調節子及任何與參考抗體競爭之抗體。

當在所揭示之調節子之上下文中使用時，術語「競爭」或「競爭抗體」意謂抗體之間的結合競爭，如由其中參考抗體或免疫功能性片段實質上組織或抑制(例如大於30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)測試抗體與共同抗原之特異性結合的分析法確定。用於確定該競爭之相容方法包含此項技術中已知的技術，諸如生物層干涉術、表面電漿子共振、流動式細胞測量術、競爭性ELISA等。

本發明亦提供適用於治療DLL3相關病症(諸如癌症)之套組或裝置及相關方法。為此，本發明較佳提供適用於治療DLL3相關病症之製品，其包含容器，該容器含有ADC 1-5與教示材料之抗體藥物結合物，其係用於使用該等結合物治療、改善或預防DLL3相關病症或其發展或復發。

以上為概述且因此必然含有細節之簡化、一般化及遺漏；因此，熟習此項技術者應瞭解，概述僅為說明性且不意欲造成任何限制。本文中所描述之方法、組合物及/或裝置及/或其他標的物之其他態樣、特徵及優點將自本文中闡述之教示變得顯而易見。提供概述以按簡化形式引入概念之選擇，該等概念進一步描述於以下實施方式中。此概述不意欲鑑別所主張標的物之關鍵特徵或基本特徵，亦不意欲用作確定所主張標的物之範疇的輔助物。

圖1提供DLL3蛋白質之兩個同功異型物(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)之序列比對。

圖2提供DLL3蛋白質之細胞外區域之示意圖，其說明各種結構域 之位置。

圖3A及3B以表格形式提供與所揭示之抗體藥物結合物相容之多種鼠類及人類化例示性DLL3抗體之輕鏈及重鏈可變區之鄰接胺基酸序列(SEQ ID NO：21-407，單號)，其係如本文中之實例中所描述經分離、選殖及工程改造。

圖4示意性描繪如本文中之實例中所描述經分離、選殖及工程改造之例示性DLL3調節子之結構域含量定位分析。

圖5闡述如表格中呈現之例示性DLL3調節子之生物化學及免疫學性質。

圖6提供根據本發明產生之例示性抗體藥物結合物之列表。

I. 前言

本文中揭示可例示本發明之原理的本發明之特定說明性實施例，但本發明可以多種不同形式實施。應強調的是，本發明不限於所說明之特定實施例。此外、本文中所使用之任何章節標題係僅用於組織目的且不應視為限制所描述之標的物。最終，為達成本發明之目的，除非另有說明，否則所有鑑別序列寄存編號可見於NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank^® 存檔序列資料庫中。

如上文所論述，已發現DLL3表現型決定子臨床上與各種增生性病症(包括呈現神經內分泌特徵之贅瘤形成)相關聯，且DLL3蛋白質及其變異體或同功異型物提供可用於治療相關疾病之有效腫瘤標記。在此方面，本發明提供上文闡述為ADC 1-5之多種抗體藥物結合物，其包含抗DLL3抗體靶向劑及PBD有效負載。如下文更詳細論述及隨附實例中所闡述，所揭示之DLL3 ADC尤其可有效消除致瘤細胞且因此適用於治療及預防某些增生性病症或其發展或復發。

此外，如本申請案中所示，已發現DLL3標記或決定子(諸如細胞 表面DLL3蛋白質)在治療學上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永續細胞)相關聯且可有效用於消除癌症幹細胞或使其靜止。經由使用本文中揭示之結合之DLL3調節子選擇性降低或消除癌症幹細胞之能力的驚人之處在於已知該等細胞通常對許多習知治療具有抗性。亦即，傳統的以及最近關注的治療方法之有效性通常受到抗性癌症幹細胞之存在及/或出現的限制，該等抗性癌症幹細胞即使在面對此等不同的治療方法時仍能夠使腫瘤永久生長。此外，由於較低的或不一致的表現，與癌症幹細胞相關聯之決定子通常產生弱治療目標，無法保持與致瘤細胞相關聯或無法存在於細胞表面。與先前技術之教示明顯不同，本發明所揭示之抗體藥物結合物及方法可有效克服此固有抗性且特定消除、消耗該等癌症幹細胞、使該等癌症幹細胞靜止或促進該等癌症幹細胞之分化，藉此消除其維持或重新誘導潛在腫瘤生長之能力。此外，由於DLL3蛋白質之表現與細胞內位置(諸如高基體(Golgi))顯著相關，因此不確定該等表現型決定子可成功用作本文中教示之特定ADC之治療目標。

因此，尤其值得注意的是，DLL3結合物(諸如本文中揭示之DLL3結合物)可有利地用於治療及/或預防所選增生性(例如贅生性)病症或其發展或復發。應瞭解，儘管下文將尤其根據特定結構域、區域或抗原決定基或在包含神經內分泌特徵之癌症幹細胞或腫瘤及其與所揭示之抗體藥物結合物之相互作用的情形中廣泛論述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應瞭解，本發明之範疇不受該等例示性實施例限制。實情為，本發明之最廣泛實施例及隨附申請專利範圍係廣泛及明確地針對所揭示之DLL3結合物及其在治療及/或預防多種DLL3相關或介導之病症(包括贅生性或細胞增生性病症)中的用途，而與任何特定作用機制或特定目標腫瘤、細胞或分子組分無關。

為此且如本申請案中說明，意外發現所揭示之DLL3結合物可有 效用於靶向及消除增生性或致瘤細胞或以其他方式剝奪其能力以及治療DLL3相關病症(例如贅瘤形成)。如本文中所用，「DLL3相關病症」應始終意謂任何在疾病或病症之病程或病源學期間由DLL3遺傳組分或表現(「DLL3決定子」)之表現型畸變標記、診斷、偵測或鑑別之病症或疾病(包括增生性病症)。在此方面，DLL3表現型畸變或決定子可例如包含DLL3蛋白質表現量升高或降低、某些可定義之細胞群體上之異常DLL3蛋白質表現或細胞生命循環中之不當時期或階段時的異常DLL3蛋白質表現。當然，應瞭解，DLL3之遺傳型決定子之類似表現模式(例如mRNA轉錄量)亦可用於分類、偵測或治療DLL3病症。

關於所揭示之結合物，本發明提供PBD二聚體，其中一個連接子連接至一個PBD部分上之位置且經由連接子與DLL3抗體調節子結合。經由此等經小心地工程改造之組態，結合物允許較佳不保留連接子之任何部分的活性PBD化合物之釋放。亦即，不存在可不利地影響PBD有效負載之反應性的殘株或連接子殘餘物。因此，所揭示之DLL3結合物在連接子裂解時釋放以下二聚型PBD化合物。

ADC 1之結合物釋放化合物PBD 1：

ADC 2之結合物釋放化合物PBD 2：

ADC 3之結合物釋放化合物PBD 3：

ADC 4之結合物釋放化合物PBD 4：

ADC 5之結合物釋放化合物PBD 5：

因此，PBD 1、PBD 2、PBD 3、PBD 4或PBD 5之毒性化合物之遞送係由ADC 1-5經由連接基團上，且詳言之，合併之纈胺酸-丙胺酸二肽部分上之酶(諸如組織蛋白酶)之作用在所需活化位點(亦即在致瘤細胞內)實現。如下文更詳細論述，所揭示之PBD細胞毒素之局部遞送可以實質上低於相關非靶向護理化學療法標準之毒性提供若干類型之致瘤細胞之有效消除。

在此方面，本發明之一個態樣包含遞送選自由PBD 1、PBD 2、PBD 3、PBD 4及PBD 5組成之群之化合物，其包含投與DLL3結合物之步驟。

II. DLL3生理學

洛奇(Notch)信號傳導途徑(首先在線蟲(C.elegans )及果蠅(Drosophila )中發現且接著證實自無脊椎動物至脊椎動物具有進化保守性)參與一系列基本生物過程，包括正常胚胎發育、成年人組織恆定及幹細胞保持(D'Souza等人，2010；Liu等人，2010)。在特異性作用、成型及形態發生期間，洛奇信號傳導對於多種細胞類型而言為關鍵的。通常，此係經由側抑制機制發生，其中表現洛奇配位體之細胞採用預設細胞命運，從而又經由洛奇信號傳導之刺激來抑制相鄰細胞中之此命運(Sternberg,1988,Cabrera 1990)。發現此由洛奇信號傳導介導之二元細胞命運選擇在許多組織中起作用，包括正在發育的神經 系統(de la Pompa等人，1997)、造血及免疫系統(Bigas及Espinosoa,2012；Hoyne等人，2011；Nagase等人，2011)、腸管(Fre等人，2005；Fre等人，2009)、內分泌胰臟(Apelqvist等人，1999；Jensen等人，2000)、垂體(Raetzman等人，2004)及彌漫性神經內分泌系統(Ito等人，2000；Schonhoff等人，2004)。儘管洛奇信號傳導在多種發育系統中起作用，但用於實施此二元切換之一般化機制呈現保存性；例如在預設細胞命運選擇係由稱為基本螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白質之轉錄調節子確定之細胞中，洛奇信號傳導引起一類洛奇響應基因之活化，其又抑制bHLH蛋白質之活性(Ball,2004)。此等二元決策在發育及信號傳導插入物之更廣泛情形中發生，從而允許洛奇信號傳導實現增殖或抑制增殖，及引起自我更新或抑制自我更新。

在果蠅中，洛奇信號傳導係主要由一個洛奇接受基因及兩個配位體基因(稱為鋸齒狀及δ)介導(Wharton等人，1985；Rebay等人，1991)。在人類中，存在四種已知洛奇受體及五種DSL(δ-鋸齒狀LAG2)配位體--鋸齒狀之兩種同系物，稱為Jagged 1及Jagged 2，及δ之三種同系物，稱為δ樣配位體或DLL1、DLL3及DLL4。通常，信號接收細胞表面上之洛奇受體係藉由與表現於相反的、信號發送細胞表面上之配位體的相互作用(稱為反式相互作用)而活化。此等反式相互作用引起洛奇受體之一系列蛋白酶介導之裂解。因此，洛奇受體細胞內結構域自由地自細胞膜易位至細胞核，其在細胞核中與轉錄因子之CSL家族(人類中之RBPJ)搭配且將其自轉錄抑制因子轉化為洛奇響應基因之活化子。

在人類洛奇配位體中，DLL3之不同之處在於其似乎不能經由反式相互作用活化洛奇受體(Ladi等人，2005)。儘管順式抑制之確切機制尚不清楚且可視配位體而變化，但洛奇配位體亦可以順式(相同細胞上)與洛奇受體相互作用，引起洛奇信號之抑制(例如參見Klein等 人，1997；Ladi等人，2005；Glittenberg等人，2006)。兩種假設抑制模式包括藉由阻止反式相互作用來調節細胞表面之洛奇信號傳導，或藉由擾亂受體處理或藉由實體上引起內質網或高基體中受體之滯留來降低細胞表面上洛奇受體之量(Sakamoto等人，2002；Dunwoodie,2009)。然而，顯然相鄰細胞上洛奇受體及配位體之表現之隨機差異可經由轉錄及非轉錄過程擴增，且順式相互作用與反式相互作用之微妙平衡可引起相鄰組織中不同細胞命運之洛奇介導之區隔之精細調諧(Sprinzak等人，2010)。

DLL3(亦稱為δ樣3或SCDO1)為洛奇DSL配位體之δ樣家族之成員。代表性DLL3蛋白質直系同源物包括(但不限於)人類(寄存編號NP_058637及NP_982353)、黑猩猩(chimpanzee)(寄存編號XP_003316395)、小鼠(寄存編號NP_031892)及大鼠(寄存編號NP_446118)。在人類中，DLL3基因由位於染色體19q13上之8個外顯子(跨度9.5 kBp)組成。最後一個外顯子內之替代性剪接產生兩種經加工之轉錄物，一種具有2389個鹼基(寄存編號NM_016941)且一種具有2052個鹼基(寄存編號NM_203486)。前一種轉錄物編碼618胺基酸蛋白質(寄存編號NP_058637；圖1，SEQ ID NO：1)，而後一種轉錄物編碼587胺基酸蛋白質(寄存編號NP_982353；圖1，SEQ ID NO：2)。DLL3之此兩種蛋白質同功異型物在其細胞外結構域及其跨膜結構域中共有共100%一致性，不同之處僅在於較長的同功異型物含有經擴展之細胞質尾端，該尾端在蛋白質之羧基端含有32個額外殘基(圖1)。儘管可在腫瘤細胞中偵測到兩種同功異型物，但同功異型物之生物學相關性尚不清楚。

通常，DSL配位體係由一系列結構域構成：唯一的N端結構域，接著為保存性DSL結構域、多個串聯表皮生長因子(EGF)樣重複體、跨膜結構域及細胞質域，該細胞質域在配位體內保存性不高，其含有 多個離胺酸殘基，該等離胺酸殘基為獨特E3泛素連接酶之潛在泛素化位點。DSL結構域為退化性EGF結構域，其為與洛奇受體之相互作用所必需但不足以單獨實現該相互作用(Shimizu等人，1999)。此外，大部分DSL配位體中之開頭兩個EGF洋重複體含有稱為DOS結構域之較小蛋白質序列主結構，其在活化洛奇信號傳導時與DSL結構域以共同操作方式相互作用。

圖2提供DLL3蛋白質之細胞外區域之示意圖，其說明六個EGF樣結構域、單一DSL結構域及N端結構域之一般鄰接位置。通常，認為EGF結構域存在於約胺基酸殘基216-249(結構域1)、274-310(結構域2)、312-351(結構域3)、353-389(結構域4)、391-427(結構域5)及429-465(結構域6)處，且DSL結構域存在於約胺基酸殘基176-215及hDLL3之約胺基酸殘基27-175之N端結構域處(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)。如本文中更詳細論述及以下實例中所展示，各EGF樣結構域、DSL結構域及N端結構域均包含如由相異胺基酸序列所界定之DLL3蛋白質之一部分。應注意，為達成本發明之目的，可將各別EGF樣結構域稱為EGF1至EGF6，其中EGF1最靠近蛋白質之N端部分。關於蛋白質之結構組成，本發明之一個重要態樣為所揭示之DLL3調節子經產生、製造、工程改造或選擇以與所選結構域、主結構或抗原決定基反應。在某些情況下，該等位點特異性調節子可視其主要作用方式而提供增強之反應性及/或功效。

應注意，如本文中所用，如本文中所用之術語「成熟蛋白質」或「成熟多肽」係指由哺乳動物細胞中之表現產生之蛋白質之形式。通常假設一旦起始跨越粗內質網之正在生長的蛋白質鏈之輸出，則由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽(SP)序列，該信號肽序列係由完整多肽裂解以產生蛋白質之「成熟」形式。在DLL3之兩種同功異型物中，成熟蛋白質包含26個胺基酸之信號肽，其可在細胞表面表現 之前剪裁。因此，在成熟蛋白質中，N端結構域將自蛋白質中之位置27延伸至DSL結構域之開始處。當然，若蛋白質並非以此方式加工，則N端結構域將保持延伸至SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中之位置1。

在各種δ樣配位體中，DLL3與家族中之其他成員差別最大，因為其含有退化型DSL結構域、無DOS主結構且含有缺乏離胺酸殘基之細胞內結構域。退化型DSL及缺乏DOS主結構與DLL3不能以反式(細胞之間)引起洛奇信號傳導一致，表明DLL3(與DLL1或DLL4不同)僅充當洛奇信號傳導之抑制劑(Ladi等人，2005)。研究表明DLL3可主要駐留於順式高基體中(Geffers等人，2007)，其將與假設之細胞內保留洛奇受體或妨礙洛奇受體之加工、防止輸出至細胞表面及改為將其重新靶向溶酶體之能力一致(Chapman等人，2011)。然而，當蛋白質在模型系統中經人工過表現時(Ladi等人，2005)，一些DLL3蛋白質可在細胞表面呈現，但顯然此並非正常生物學情形或DLL3 mRNA轉錄物升高之腫瘤中之情況；稍微意外的是，本文中揭示之腫瘤類型中偵測到的蛋白質含量表明大量DLL3蛋白質逃逸至各種腫瘤之細胞表面。

此外，如上文所論述，洛奇信號傳導在呈現神經內分泌特徵之神經內分泌細胞及腫瘤之發展及維持中起作用。在此方面，洛奇信號傳導與正常內分泌器官及彌漫型神經內分泌系統中之廣泛細胞命運決策有關。舉例而言，在胰臟中，需要洛奇信號傳導抑制由bHLH轉錄因子NGN3介導之預設內分泌表現型之發展(Habener等人，2005)。類似的洛奇介導之內分泌細胞命運之抑制可在暢內分泌細胞(Schonhoff等人，2004)、甲狀腺甲狀濾泡旁細胞(Cook等人，2010)、垂體中指定相對比率之神經內分泌細胞類型(Dutta等人，2011)中發生，且可能與肺內之細胞採用神經內分泌或非神經內分泌表現型之決策有關(Chen等人，1997；Ito等人，2000；Sriuranpong等人，2002)。因此，顯然在許多組織中，洛奇信號傳導之抑制與神經內分泌表現型有關。

通常在腫瘤中觀測到發展信號傳導途徑之不當再活化或正常信號傳導途徑之失調，且在洛奇信號傳導情況下，與許多腫瘤類型相關聯(Koch及Radtke,2010；Harris等人，2012)。已研究發現洛奇途徑為淋巴瘤、結腸直腸癌、胰臟癌及一些類型之非小細胞肺癌中之致癌基因(參見Zarenczan及Chen,2010及其中參考文獻)。相反，報導洛奇在具有神經內分泌特徵之腫瘤中充當腫瘤抑制劑(參見Zarenczan及Chen,2010，見上文)。具有神經內分泌特徵之腫瘤通常不出現在廣泛範圍之原發性位點，且其詳盡分類仍存在問題(Yao等人，2008；Klimstra等人，2010；Klöppel,2011)，其可分類為四種主要類型：低級良性類癌瘤、具有惡性性質之低級分化良好型神經內分泌腫瘤、具有混合型神經內分泌及上皮特徵之腫瘤及高級分化不良神經內分泌癌瘤。在此等分類中，分化不良型神經內分泌癌瘤(其包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)之子集)為具有不良預後之癌症類型。已假設SCLC為支氣管源起源，部分由肺神經內分泌細胞產生(Galluzzo及Bocchetta,2011)。與此等具有神經內分泌表現型之腫瘤中之每一者之起源之特定細胞來源無關，預期抑制洛奇信號傳導(藉由洛奇途徑基因本身中之直接病變或其他抑制洛奇信號傳導之基因之活化)可引起此等腫瘤之神經內分泌表現型之獲取。藉由擴展，引起洛奇途徑擾動之基因可產生用於治療具有神經內分泌表現型之腫瘤的治療性目標，尤其用於當前具有弱臨床結果之適應症。

ASCL1為一種該類基因，其似乎經由DLL3與洛奇信號傳導途徑相互作用。顯然許多神經內分泌腫瘤均展示分化不良(亦即部分完成)的內分泌表現型；舉例而言，經標記之各種內分泌蛋白質及多肽(例如嗜鉻粒蛋白A，CHGA；降血鈣素，CALCA；原嗎啡黑色素皮質素，POMC；生長抑素，SST)、與分泌小泡有關之蛋白質(例如突觸素，SYP)及與負責生物活性胺合成之生物化學途徑有關之基因(例如 多巴脫羧酶，DDC)之升高或表現。或許不意外的是，此等腫瘤通常過表現ASCL1(亦稱為mASH1(小鼠中)或hASH1(人類中))，ASCL1為已知在編排引起神經及神經內分泌表現型之基因級聯中起作用的轉錄因子。儘管級聯之特定分子細節尚不清楚，但越來越清楚的是，對於某些細胞類型，尤其是甲狀腺甲狀濾泡旁細胞(Kameda等人，2007)、腎上腺髓質之嗜鉻細胞(Huber等人，2002)及在肺之彌漫性神經內分泌系統中發現的細胞(Chen等人，1997；Ito等人，2000；Sriuranpong等人，2002)，ASCL1為精細調諧之發展調節迴路之一部分，其中細胞命運選擇係由ASCL1介導及洛奇介導之基因表現級聯之平衡介導。舉例而言，發現ASCL1表現於正常小鼠肺神經內分泌細胞中，而洛奇信號傳導效應子HES1表現於肺非神經內分泌細胞中(Ito等人，2000)。越來越瞭解到此兩個級聯與潛在交叉調節處於精細平衡。已證實洛奇效應子HES1可下調ASCL1表現(Chen等人，1997；Sriuranpong等人，2002)。此等結果明確表明洛奇信號傳導可抑制神經內分泌分化。然而，結合於DLL3啟動子之ASCL1活化DLL3表現之證明(Henke等人，2009)及DLL3使洛奇信號傳導降低之觀測結果(Ladi等人，2005)否定了神經內分泌表現型與非神經內分泌表現型之間細胞命運選擇之遺傳迴路。

鑒於洛奇信號傳導似乎演化為放大相鄰細胞之間的細微差異以實現具有不同分化路徑(例如，如上文所描述之「側抑制」)之清晰界定之組織結構域，此等資料共同表明在具有神經內分泌表現型之癌症中，精細調諧之發展調節迴路變為再活化及失調。儘管不明顯的是，鑒於DLL3在細胞之內膜區室內之正常駐留(Geffers等人，2007)及假設其與內膜區室內中之洛奇相互作用，DLL3將提供抗體治療劑發展之合適細胞表面目標，神經內分泌腫瘤中DLL3表現升高之結果可提供用於具有神經內分泌表現型(例如NET及pNET)之腫瘤之唯一的治療性目標。通常發現實驗室系統中蛋白質之大量過表現可引起細胞內過表 現之蛋白質之錯誤定位。因此，存在以下合理的，但在無實驗檢查下不明顯的假設：腫瘤中DLL3之過表現可引起蛋白質之一些細胞表面表現，且藉此呈現用於本發明之所揭示之ADC的目標。

III.癌症幹細胞

如上文所提及，意外發現異常DLL3表現(遺傳型及/或表現型)與各種致瘤細胞亞群相關聯。在此態樣中，本發明提供DLL3抗體藥物結合物，其可尤其適用於靶向該等細胞(例如癌症幹細胞)，藉此促進贅生性病症之治療、管理或預防。因此，在較佳實施例中，根據本發明之教示，所揭示之DLL3 ADC可有利地用於降低腫瘤引發細胞出現率且藉此促進增生性病症之治療或管理。

為達成本申請案之目的，術語「腫瘤引發細胞」(TIC)涵蓋「腫瘤永續細胞」(TPC；亦即癌症幹細胞或CSC)及高增生性「腫瘤祖細胞」(稱為TProg)，其通常共同包含主體腫瘤或腫瘤塊之唯一亞群(亦即0.1%-40%)。為達成本發明之目的，術語「腫瘤永續細胞」及「癌症幹細胞」或「贅生性幹細胞」為等效物且在本文中可互換地使用。TPC與TProg之不同之處在於TPC可完全概括存在於腫瘤內之腫瘤細胞之組成且具有無限自我更新能力，如由少數經分離細胞之連續移植(經由小鼠之兩次或兩次以上繼代)證明，而TProg不會顯示無限自我更新能力。

熟習此項技術者應瞭解，至少部分歸因於區分單細胞與細胞叢集(亦即細胞對等)之能力，使用合適細胞表面標記之螢光活化細胞分類(FACS)為分離高度富集之癌症幹細胞亞群(例如純度>99.5%)之可靠方法。使用該等技術已顯示，當將低細胞數目之高度純化TProg細胞移植於免疫功能不全小鼠中時，其可刺激原發性移植物中腫瘤生長。然而，不同於經純化之TPC亞群，產生TProg之腫瘤並不完全反映母體腫瘤之表型細胞異質性且明確無效地重新起始後續移植物中之連續 腫瘤形成。相反，癌症幹細胞亞群完全復原母體腫瘤之細胞多相性且在連續分離及移植時可有效引發腫瘤。因此，熟習此項技術者應認識到，儘管TPC與TProg皆可在原發性移植物中產生腫瘤，但兩者之間的明確差異為TPC具有在以低細胞數目連續移植後持久刺激異源腫瘤生長之獨特能力。表徵TPC之其他常見方法包含細胞表面標記之形態及檢查、轉錄型態及藥物反應，但標記表現可隨培養條件及活體外細胞株繼代而變。

因此，為達成本發明之目的，腫瘤永續細胞(與負載正常組織中細胞階層之正常幹細胞相同)較佳係由其無限自我更新，同時能夠保持多譜系分化之能力定義。因此，腫瘤永續細胞能夠產生腫瘤形成子代(亦即腫瘤起始細胞：TPC及TProg)與非腫瘤形成(NTG)子代。如本文中所使用，非腫瘤形成細胞(NTG)係指由腫瘤引發細胞產生、但自身不能自我更新或產生構成腫瘤之腫瘤細胞異源譜系的腫瘤細胞。在實驗上，即使以過量細胞數目移植，NTG細胞仍無法在小鼠中再現腫瘤形成。

如所指示，TProg亦根據其在小鼠中產生腫瘤之能力有限而歸類為腫瘤引發細胞(或TIC)。TProg為TPC之子代且通常能夠進行有限次數之非自我更新細胞分裂。此外，TProg細胞可進一步分成早期腫瘤祖細胞(ETP)及晚期腫瘤祖細胞(LTP)，其每一者可由表現型(例如細胞表面標記物)及再現腫瘤細胞架構之不同能力來區分。儘管存在該等技術性差異，但ETP與LTP在功能上亦與TPC不同，因為當以低細胞數目移植時其一般不太能夠連續重構腫瘤且通常不反映母體腫瘤之異質性。儘管存在上述區別，但亦已顯示各種TProg群體可在個別情況下獲得通常歸於幹細胞之自我更新能力且自身變成TPC(或CSC)。在任何情況下，兩種類型之腫瘤引發細胞均很可能在單一患者之典型腫瘤塊中呈現且可使用如本文所揭示之調節劑治療。亦即，所揭示之 組合物在降低出現率或改變該等DLL3陽性腫瘤引發細胞之化學敏感性中通常有效，而與腫瘤中所出現之特定實施例或混合物無關。

在本發明之上下文中，與構成腫瘤塊之TProg(ETP與LTP)、NTG細胞及浸潤腫瘤之非TPC來源細胞(例如纖維母細胞/基質、內皮及造血細胞)相比，TPC更具腫瘤形成性，相對更靜止且通常更具化學抗性。假設習知療法及方案大部分已設計成使腫瘤減積且侵襲快速增殖細胞，與較快增殖之TProg及其他塊狀腫瘤細胞群體相比，TPC很可能對習知療法及方案更具抗性。此外，TPC通常表現使其對習知療法具有相對化學抗性之其他特徵，諸如多重抗藥性轉運蛋白之表現增加、DNA修復機制增強及抗細胞雕亡蛋白。此等性質(每一者均造成TPC之耐藥性)構成標準腫瘤學治療方案無法確保大部分晚期贅瘤形成患者長期受益之關鍵原因；亦即無法適當地靶向及去除刺激持續腫瘤生長及再發之細胞(亦即TPC或CSC)。

與許多先前治療不同，本發明之新穎抗體藥物結合物在投與ADC之個體時較佳降低腫瘤引發細胞之出現率。如上文所述，腫瘤引發細胞出現率之降低可因以下而出現：a)消除、耗盡、敏化、靜止或抑制腫瘤引發細胞；b)控制腫瘤引發細胞之生長、擴大或再發；c)中斷腫瘤引發細胞之引發、繁殖、維持或增殖；或d)以其他方式阻礙腫瘤形成細胞之存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，腫瘤引發細胞出現率之降低因一或多個生理學路徑變化而出現。途徑之變化(無論由腫瘤引發細胞之降低或消除或由改良其潛力(例如誘導分化、幹細胞微環境破壞)或以其他方式妨礙其影響腫瘤環境或其他細胞之能力引起)又可藉由抑制腫瘤形成、腫瘤保持及/或轉移及復發而實現DLL3相關病症之更有效治療。

此項技術中公認的可用於評估腫瘤引發細胞之該出現率降低之方法包括活體外或活體內有限稀釋分析，較佳接著使用泊松分佈統計 進行計算，或評估預定的確定事件之出現率，諸如活體內或活體外產生腫瘤之能力。儘管該有限稀釋分析包含計算腫瘤引發細胞出現率降低之較佳方法，但其他亦可使用其他的需求不高的方法有效地確定所需值(儘管精確度略低)且與本文中之教示完全相容。因此，如熟習此項技術者將瞭解，亦可經由熟知的流動式細胞測量或免疫組織化學方法確定出現率值之降低。關於所有上述方法，參見例如Dylla等人2008,PMID：18560594及Hoey等人2009,PMID：19664991；其均以全文且尤其針對所揭示之方法引用的方式併入本文中。

關於有限稀釋分析，腫瘤引發頻率之活體外計算可由將分化或未分化之人類腫瘤細胞(例如分別來自經處理及未經處理之腫瘤)沈積於促進群落形成之活體外生長條件中來完成。。藉此，群落形成細胞可藉由群落之簡單計數及表徵，或由例如將人類腫瘤細胞以連續稀釋物形式沈積於板中且在塗佈後至少10天對各孔進行評分(如對群落形成為陽性或陰性)組成之分析來計算。活體內限制稀釋實驗或分析(一般其測定腫瘤引發細胞出現率之能力更加精確)涵蓋例如將來自未經處理之對照或經處理之群體的人類腫瘤細胞之連續稀釋液移植於免疫功能不全小鼠中，隨後在移植後至少60天評定各小鼠為腫瘤形成陽性或陰性。藉由活體外或活體內有限稀釋分析推導細胞出現率值較佳藉由將泊松分佈統計應用於陽性及陰性事件之已知出現率，藉此得出滿足陽性事件(在此情況下分別為群落或腫瘤形成)定義之事件的出現率來進行。

關於與本發明相容之可用於計算腫瘤引發細胞出現率的其他方法，最常見方法包含可定量流動式細胞測量術及免疫組織化學染色程序。儘管不如上文剛剛描述之有限稀釋分析技術精確，但此等程序之勞動密集性小得多且可在相對短之時間範圍內提供合理的值。因此，應瞭解，熟習此項技術者可使用流動式細胞測量細胞表面標記概況測 定，其使用一或多種結合於此項技術中公認的已知針對腫瘤引發細胞富集之細胞表面蛋白質的抗體或試劑(例如PCT申請案2012/031280中闡述之可能相容標記，其全部併入本文中)且藉此量測來自各種樣品之TIC含量。在另一個相容方法中，熟習此項技術者可藉由使用一或多種能夠結合據信可區分此等細胞之細胞表面蛋白質的抗體或試劑之免疫組織化學來計算原位(例如組織切片中)TIC出現率。

應認識到，多種標記(或其不存在)與癌症幹細胞之各種群體相關聯且用於分離或表徵腫瘤細胞亞群。在此態樣中，例示性癌症幹細胞標記物包含OCT4、Nanog、STAT3、EPCAM、CD24、CD34、NB84、TrkA、GD2、CD133、CD20、CD56、CD29、B7H3、CD46、轉鐵蛋白受體、JAM3、羧肽酶M、ADAM9、抑瘤素M(oncostatin M)、Lgr5、Lgr6、CD324、CD325、巢蛋白(nestin)、Sox1、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarckA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、(TCF4)SLC7A8、IL1RAP、TEM8、TMPRSS4、MUC16、GPRC5B、SLC6A14、SLC4A11、PPAP2C、CAV1、CAV2、PTPN3、EPHA1、EPHA2、SLC1A1、CX3CL1、ADORA2A、MPZL1、FLJ10052、C4.4A、EDG3、RARRES1、TMEPAI、PTS、CEACAM6、NID2、STEAP、ABCA3、CRIM1、IL1R1、OPN3、DAF、MUC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP-4、β-索烴素、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、 CD74、CD90、CXCR4、修飾素(decorin)、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b及CD49f。參見例如Schulenburg等人，2010,PMID：20185329,U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221，其均以引用的方式併入本文中。此外應瞭解，上述標記中之每一者在本發明之雙特異性或多特異性抗體之情形中亦可用作次要目標抗原。

類似地，與某些腫瘤類型之癌症幹細胞相關聯之細胞表面表現型之非限制性實例包括CD44^高 CD24^低 、ALDH⁺ 、CD133⁺ 、CD123⁺ 、CD34⁺ CD38^- 、CD44⁺ CD24^- 、CD46^高 CD324⁺ CD66c^- 、CD133⁺ CD34⁺ CD10^- CD19^- 、CD138^- CD34^- CD19⁺ 、CD133⁺ RC2⁺ 、CD44⁺ α₂ β₁ ^高 CD133⁺ 、CD44⁺ CD24⁺ ESA⁺ 、CD271⁺ 、ABCB5⁺ 以及此項技術中已知的其他癌症幹細胞表面表現型。參見例如Schulenburg等人，2010，見上文；Visvader等人，2008,PMID：18784658及U.S.P.N.2008/0138313，其均以全文引用的方式併入本文中。熟習此項技術者應瞭解，諸如上文剛剛所例示之標記物表現型可結合標準流動式細胞測量分析及細胞分選技術使用以表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體以供進一步分析。本發明所關注的是CD46、CD324及視情況存在之CD66c在許多人類結腸直腸癌(「CR」)、乳癌(「BR」)、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胰臟癌(「PA」)、黑色素瘤(「Mel」)、卵巢癌(「OV」)及頭頸部癌(「HN」)腫瘤細胞之表面上高度或異源表現，不管所分析之腫瘤試樣為原發性患者腫瘤試樣還是來源於患者之NTX腫瘤。

使用以上參考之方法中之任一種及此項技術中已知的選擇標記，可根據本文中之教示對由所揭示之DLL3調節子(包括與細胞毒性劑結合物之調節子)引起之TIC(或其中TPC)之出現率之降低進行定 量。在一些情況下，本發明之化合物可降低使TIC或TPC降低(藉由上文說明之多種機制，包括消除、誘導分化、幹細胞微環境破壞、靜止等)達10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，TIC或TPC之出現率可降低約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示之化合物可使TIC或TPC之出現率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。當然，應瞭解，TIC或TPC之出現率之任何降低可能引起贅瘤形成之致腫瘤性、持續性、復發及侵襲性相應降低。

IV. 細胞結合劑

1.抗體結構

如上文所提及，本發明之尤其較佳實施例包含具有呈抗體或其免疫反應性片段形式之細胞結合劑的DLL3結合物，其優先與DLL3蛋白質及視情況其他DLL家族成員之同功異型物之一或多個結構域締合。在此方面，抗體以及其變異體及衍生物(包括認可的命名法及編號系統)已廣泛描述於例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology (第6版)，W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology (第8版)，Garland Science中。

「抗體」或「完整抗體」典型地係指Y形四聚蛋白，其包含兩個重(H)多肽鏈及兩個輕(L)多肽鏈，該等多肽鏈由共價雙硫鍵及非共價相互作用結合在一起。人類輕鏈包含可變域(V_L )及恆定域(C_L )，其中恆定域可基於胺基酸序列及基因座容易地分類為κ或λ。各重鏈包含一個可變域(V_H )及及一個恆定區，該恆定區在IgG、IgA及IgD情況下包含三個名為C_H 1、C_H 2及C_H 3之結構域(IgM及IgE具有第四個結構域C_H 4)。在IgG、IgA及IgD類別中，C_H 1及C_H 2結構域係由可撓性絞鏈區分離，該可撓性絞鏈區為具有可變長度(在IgG中通常為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈中之可變域 藉由具有約12個或12個以上胺基酸之「J」區域與恆定域接合，且重鏈亦具有「D」區域，其具有約10個額外胺基酸。各類別之抗體進一步包含由配對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內雙硫鍵。

如本文中所用，術語「抗體」可廣泛解釋且包括多株抗體、多選殖抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長類動物化抗體、CDR接枝抗體、人類抗體、以重組方式產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體(包括突變蛋白質及其變異體)、免疫特異性抗體片段(諸如Fd、Fab、F(ab')₂ 、F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其呈現與DLL3決定子之優先締合或結合即可。此外，除非由上下文約束條件說明，否則該術語進一步包含所有類別之抗體(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有同型(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體類別之重鏈恆定域典型地分別由相應小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。來自任何脊椎動物物種之抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而指定為兩種明確相異類型(稱為κ及λ)中之一種。

在所選實施例中且如隨附實例中所示，C_L 結構域可包含κ C_L 結構域。在其他實施例中，源抗體可包含λ C_L 結構域。如所有人類IgG C_L 結構域之序列已為吾人所熟知，熟習此項技術者可根據本發明容易地分析λ及κ序列且使用其提供相容抗體構築體。類似地，處於說明及例示的目的，以下論述及隨附實例將主要表徵IgG1(鼠類或人類)型抗體。與輕鏈恆定區相同，來自不同同型(IgM、IgD、IgE、IgA)及子類(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)之重鏈恆定域序列已為吾人所熟知及表徵。因此，熟習此項技術者可容易地開發包含任何同型或子類之抗DLL3抗體且如本文中教示使其中每一者與所揭示之PBD結 合以產生本發明之抗體藥物結合物。

在不同抗體中，抗體之可變域展示顯著的胺基酸組成變化且主要負責抗原識別及結合。各輕鏈/重鏈配對之可變區形成抗體結合位點，使得完整IgG抗體具有兩個結合位點(亦即其為二價的)。V_H 及V_L 結構域包含三個具有極高可變性之區域，其稱為高變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其由四個可變性較低的區域(稱為構架區(FR))構架及分離。V_H 區域與V_L 區域之間的非共價締合形成Fv片段(對於「可變片段」)，其含有抗體之兩個抗原結合位點中之一個。ScFv片段(對於單鏈可變片段)，其可由遺傳工程改造獲得，在單一多肽鏈(由肽連接子分離之抗體之V_H 區及V_L 區)中締合。

如本文中所用，除非另有說明，否則將胺基酸指派至各結構域、構架區域及CDR可根據由以下文獻提供之編號方案中的一種來進行：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版)，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編，(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies ，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。包含如由Kabat、Chothia及MacCallum定義之CDR的胺基酸殘基(如自Abysis網站資料庫(見下文)獲得)陳述於下文中。

抗體序列中之可變區及CDR可根據在此項技術中已開發的一般規則(如上文陳述，例如Kabat編號系統)或藉由將序列針對可變區之資料 庫比對來鑑別。用於鑑別此等區域之方法描述於Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中。抗體序列之例示性資料庫描述於「Abysis」網站，www.bioinf.org.uk/abs(由A.C.Martin,Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England維護)及VBASE2網站，www.vbase2.org(如Retter等人，Nucl.Acids Res.,33(資料庫問題)：D671-D674(2005)中描述)中且可由其獲得。較佳序列係使用Abysis資料庫分析，其整合來自整合來自Kabat、IMGT及Protein Data Bank(PDB)之資料與來自PDB.之結構資料。參見Dr.Andrew C.R.Martin's book chapterProtein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In：Antibody Engineering Lab Manual (Duebel,S.及Kontermann,R.編，Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547，亦可自網站bioinforg.uk/abs獲得)。Abysis資料庫網站進一步包括已開發用於鑑別可根據本文中之教示使用之CDR的一般規則。除非另有說明，否則本文中闡述之所有CDR均係根據Abysis資料庫網站按照卡拜特衍生。

對於本發明中論述之重鏈恆定區胺基酸位置，編號係根據首先描述於Edelman等人，1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中之Eu索引進行，其描述據稱為第一個定序之人類IgG1之骨髓瘤蛋白Eu之胺基酸序列。Edelman之Eu索引亦闡述於Kabat等人，1991(見上文)中。因此，重鏈之上下文中之術語「如Kabat中闡述之EU索引」或「Kabat之EU索引」係指基於如Kabat等人，1991(見上文)中闡述之Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體之殘基編號系統。用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統類似地闡述於Kabat等人，1991中。與本發明相容之例示性κ C_L 及IgG1重鏈恆定區胺基酸序列係如隨附序列表中之SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6中所闡述。熟習此項技術者應瞭解，可使用標準分子生物學技術使所揭示之恆定區序列與所揭示之重鏈及輕鏈可變區接合以產生全長抗體，其可併入本發明之DLL3結合物中。

本發明之抗體或免疫球蛋白可包含或來源於任何特異性識別任何DLL3決定子或與任何DLL3決定子締合之抗體。如本文中所用，「決定子」或「目標」意謂任何可偵測的特性、性質、標記或因子，其可與特定細胞、細胞群體或組織相關聯地鑑別或特定地在特定細胞、細胞群體或組織之中或之上發現。決定子或目標在性質上可為形態學、功能性或生物化學且較佳為表現型。在某些較佳實施例中，決定子為由特定細胞類型或在某些條件下(例如在特定幹細胞微環境中之細胞週期或細胞之特定時間點期間)由細胞不同地表現(過表現或表現不足)之蛋白質。為達成本發明之目的，決定子較佳不同地表現於異常癌細胞上且可包含DLL3蛋白質或其任一種剪接變異體、同功異型物或家族成員，或其特定結構域、區域或抗原決定基。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意謂任何在引入免疫活性動物中且由動物之免疫反應產生之抗體識別時可刺激免疫反應之蛋白質(包括DLL3)或其任何片段、區域、結構域或抗原決定基。存在或不存在本文中預期之決定子可用於鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、致瘤細胞或CSC)。

如以下實例所闡述，本發明之所選實施例包含免疫特異性結合於DLL3之鼠類抗體，其可視為「源」抗體。在其他實施例中，本發明涵蓋之抗體可經由源抗體之恆定區或抗原決定基結合胺基酸序列之視情況選用之修飾而自該等「源」抗體獲得。在一個實施例中，若源抗體中之所選胺基酸係經由缺失、突變、取代、整合或組合而改變，則抗體係自源抗體「衍生」。在另一實施例中，「衍生」抗體為其中源抗體之片段(例如一或多個CDR或整個可變區)與受體抗體序列組合或 併入受體抗體序列中以提供衍生物抗體(例如嵌合、CDR接枝或人類化抗體)之抗體。出於各種原因(例如改良對決定子之親和力；改良細胞培養物中之產量及產率；降低活體內免疫原性；降低毒性；促進活性部分之結合；或產生多特異性抗體)，此等「衍生」(例如人類化或CDR接枝)抗體可使用標準分子生物學技術產生。該等抗體亦可藉由化學方法或轉譯後修飾經由成熟分子(例如糖基化作用模式或聚乙二醇化作用)之修飾自源抗體衍生。

在本發明之情形中，應瞭解，任一個來源於圖3A或圖3B中闡述之鼠類可變區胺基酸序列的輕鏈及重鏈CDR均可根據本發明之教示與受體抗體組合或重新排列以提供最佳化抗人類DLL3(例如人類化或嵌合抗hDLL3)抗體。亦即，可將自圖3A中闡述之鄰接輕鏈可變區胺基酸序列或圖3B中闡述之鄰接重鏈可變區胺基酸序列(共同為SEQ ID NO：21-387，單號)衍生或獲得之一或多個CDR併入DLL3調節子中，且尤其在較佳實施例中，併入與一或多個DLL3同功異型物免疫特異性締合之CDR接枝或人類化抗體中。該等人類化調節子之「衍生」輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列之實例亦闡述於圖3A及圖3B(SEQ ID NO：389-407，單號)中。

在圖3A及圖3B中，經標註之CDR及構架序列係使用專有Abysis資料庫根據Kabat定義。然而，如本文中所論述，熟習此項技術者可容易地定義、鑑別、衍生及/或枚舉圖3A或圖3B中闡述之每一個各別重鏈及輕鏈序列之CDR，如由Kabat等人、Chothia等人或MacCallum等人所定義。因此，包含由所有該等命名法定義之CDR的每一種標的CDR及抗體均包括於本發明之範疇內。更廣泛言之，術語「可變區CDR胺基酸殘基」或更簡單言之，「CDR」包括如使用以上闡述之任何基於序列或結構之方法鑑別之CDR中之胺基酸。在此情形中，圖3A及圖3B中之例示性人類化抗體之Kabat CDR係作為SEQ ID NO：408- 437提供於隨附序列表中。

在其他實施例中，相容DLL3抗體包含重鏈及輕鏈可變區，該等重鏈及輕鏈可變區包含與本文中所描述之例示性抗體之胺基酸序列同源的胺基酸序列(人類化及鼠類)，且其中抗體保留本發明之抗DLL3抗體之所需功能性。

舉例而言，相容DLL3抗體可包含具有輕鏈可變區及重鏈可變區之抗體或其免疫反應性片段，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%同源的胺基酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：273、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：285、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：293、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：301、SEQ ID NO：305、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：321、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：333、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：365、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：373、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：381及SEQ ID NO：385，且其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%同源的胺基酸序列：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：263、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：271、SEQ ID NO：275、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：283、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：295、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：315、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：323、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：331、SEQ ID NO：335、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：351、SEQ ID NO：355、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：363、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：371、SEQ ID NO：375、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：383及SEQ ID NO：387。

在其他實施例中，V_H 及/或V_L 胺基酸序列可與上文闡述之序列65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源。具有與上文闡述之序列之V_H 及V_L 區具有高(亦即80%或大於80%)同源性的V_H 及V_L 區域之抗體可使用標準分子生物學技術獲得或衍生。舉例而言，如以下表4中所示，如實例4中闡述之自鼠類源抗體衍生之人類化抗體將包含與源抗體之重鏈及輕鏈可變區具有約75%至85%同源性的重鏈及輕鏈可變區。

如本文中所用，兩個胺基酸序列之間的同源性百分比與兩個序列之間的一致性百分比等效。兩個序列之間的一致性百分比為由序列共有的相同位置之數目的函數(亦即同源性%=相同位置數目/總位置數目×100)，其考慮實現兩個序列之最佳比對所需引入的間隙之數目及各間隙之長度。序列之比較及兩個序列之間一致性百分比之測定可使用如以下非限制性實例中所描述之數學演算法實現。

亦可使用已合併入ALIGN程式(2.0版本)中之E.Meyers及W.Miller之演算法(Comput.Appl.Biosci. ,4：11-17(1988))、使用PAM120權數殘基表、間隙長度處罰12及間隙處罰4來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。此外，可使用已併入GCG套裝軟體(可自www.gcg.com獲得)中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol. 48：444-453(1970))演算法、使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣 及空隙權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。

或者或另外，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以進行針對公共資料庫之搜尋，以便例如鑑別相關序列。該等搜尋可使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol. 215：403-10之XBLAST程式(2.0版本)進行。BLAST蛋白質搜尋可藉由XBLAST程式、分數=50、字長=3進行以獲得與本發明之抗體分子同源的胺基酸序列。為獲得間隙比對以用於比較目的，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25(17)：3389-3402中所描述利用Gapped BLAST。當利用BLAST及Gapped BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。

2.抗體產生

a. 多株抗體

在各種宿主動物(包括兔、小鼠、大鼠等)中產生多株抗體在此項技術中已為吾人所熟知。在一些實施例中，含有多株抗DLL3抗體之血清係藉由使動物出血或處死動物而獲得。血清可以自動物獲得之形式用於研究目的，或在替代例中，抗DLL3抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或均質性抗體製劑。

簡言之，用DLL3免疫原(例如可溶性DLL3或sDLL3)(其可例如包含所選同功異型物、結構域及/或肽)或表現DLL3或其免疫反應性片段之活細胞或細胞製劑使所選動物免疫。視接種之物種而定，此項技術中已知的可用於提高免疫學反應的佐劑包括(但不限於)弗氏(Freund's)(完全及不完全)佐劑、礦物質凝膠(諸如氫氧化鋁)、表面活性物質(諸如溶血卵磷脂)、複合多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔螺血氰蛋白、二硝基酚及可能有效的人類佐劑，諸如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))及小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。該 等佐劑可保護抗原免於因在局部沈積中螯合而快速分散，或其可含有刺激宿主分泌針對巨噬細胞及免疫系統之其他組分具有趨化性之因子的物質。免疫程序較佳將涉及經預定時間週期進行的所選免疫原之兩次或兩次以上投與。

可分析如圖1中所示之DLL3蛋白質之胺基酸序列以選擇用於產生抗體之DLL3蛋白質之特異性區域。舉例而言，使用DLL3胺基酸序列之疏水性及親水性分析來鑑別DLL3結構中之親水性區域。DLL3蛋白質中展示免疫原性結構之區域以及其他區域及結構域可使用此項技術中已知的各種其他方法容易地鑑別，諸如舒-法斯曼(Chou-Fasman)、加尼爾-羅布森(Garnier-Robson)、凱特-杜立德(Kyte-Doolittle)、埃森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-舒爾茨(Karplus-Schultz)或詹姆士-沃夫(Jameson-Wolf)分析。平均可撓性概況可使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255之方法產生。β-小彎(Beta-turn)概況可使用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1：289-294之方法產生。因此，由此等程式或方法中之任一者鑑別之各DLL3區域、結構域或主結構均屬於本發明之範疇且可經分離或工程改造以提供免疫原，從而產生包含所需性質之調節子。用於產生DLL3抗體之較佳方法進一步由本文中提供之實例說明。用於製備用作免疫原之蛋白質或多肽的方法在此項技術中已為吾人所熟知。此項技術中亦熟知用於製備蛋白質與載體(諸如BSA、KLH或其他載體蛋白)之免疫原性結合物的方法。在一些情況下，使用直接結合，其使用例如碳化二亞胺試劑；在其他情況下，連接試劑可為有效的。如在此項技術中理解，DLL3免疫原之投與通常藉由經合適時間週期之注射且使用合適佐劑進行。在免疫程序期間，可如以下實例中所描述獲得抗體之效價以確定抗體形成之適當性。

b.單株抗體

此外，本發明涵蓋使用單株抗體。如此項技術中已知，術語「單株抗體」(或mAb)係指自實質上均質性抗體之群體(亦即組成該群體之個別抗體除可能少量存在的可能突變(例如天然存在之突變)以外為相同的)獲得之抗體。在某些實施例中，該單株抗體包括包含與抗原結合或締合之多肽序列的抗體，其中抗原結合多肽序列係藉由包括自複數個多肽序列選擇單一目標結合多肽序列之方法獲得。

一般而言且如本文中之實例中所闡述，單株抗體可使用此項技術中已知的多種技術製備，包括融合瘤技術、重組型技術、噬菌體呈現技術、轉殖基因動物(例如XenoMouse^® )或其某一組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤及此項技術中公認的生物化學及遺傳工程技術產生，諸如以下文獻中更詳細地描述，其均以全文引用的方式併入本文中：An,Zhigiang(編)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic ,John Wiley and Sons，第1版2009；Shire等人(編)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing ,Springer Science+Business Media LLC，第1版2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988；Hammerling等人，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。應理解，可進一步改變所選結合序列例如以改良對目標之親和力、人類化目標結合序列、改良其在細胞培養物中之產量、降低其活體內免疫原性、產生多特異性抗體等，且包含經改變之目標結合序列之抗體亦為本發明之抗體。

c. 嵌合及人類化抗體

在另一實施例中，本發明之抗體可包含來源於共價接合蛋白質區段之嵌合抗體，該等共價接合蛋白質區段係來自至少兩個不同種類或類別之抗體。術語「嵌合」抗體係關於滿足以下條件之構築體：其 中一部分重鏈及/或輕鏈與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段中之相應序列一致或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人，1984,PMID：6436822)。

在一個實施例中，嵌合抗體可包含鼠類V_H 及V_L 胺基酸序列以及來源於人類來源之恆定區，例如如下文描述之人類化抗體。在一些實施例中，抗體可為「CDR接枝」抗體，其中該抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之CDR，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源。對於在人類中使用，可將所選嚙齒動物CDR(例如小鼠CDR)接枝至人類抗體中，置換人類抗體中一或多個天然存在之CDR。此等構築體通常具有提供完全強度抗體功能(例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))同時降低個體對抗體之不良免疫反應之優點。

「人類化」抗體與CDR接枝抗體類似。如本文中所用，非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為嵌合抗體，其包含來源於一或多個非人類免疫球蛋白之胺基酸序列。在一個實施例中，人類化抗體為人免疫球蛋白(受體或接受體抗體)，其中來自受體之一或多個CDR之殘基由來自非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之一或多個CDR之殘基置換。在某些較佳實施例中，人免疫球蛋白之可變域中之一或多個FR中之殘基由來自供體抗體之相應非人類殘基置換，以便幫助保持接枝CDR之適當三維組態且藉此改良親和力。此可稱為引入「回復突變」。此外，人類化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現之殘基以例如進一步改進抗體效能。

可使用各種來源以確定在人類化抗體中使用何種人類序列。該 等來源包括人類生殖系序列，例如Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol. 227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol. 227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14：4628-4638中所揭示；V-BASE目錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)，其提供人免疫球蛋白可變區序列之綜合性目錄(由Tomlinson,I.A.等人編譯，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)；或共同人類FR，例如U.S.P.N.6,300,064中所描述。

CDR接枝及人類化抗體描述於例如U.S.P.N.6,180,370及5,693,762中。關於其他細節，參見例如Jones等人，1986,PMID：3713831；及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。

另一方法稱為「人類工程改造(humaneering)」，其描述於例如U.S.P.N.2005/0008625中。在另一實施例中，非人類抗體可由人類T細胞抗原決定基之特定缺失或藉由WO 98/52976及WO 00/34317中揭示之方法進行「去免疫」來修飾。

如上文所論述，在所選實施例中，至少60%、65%、70%、75%或80%人類化或CDR接枝抗體重鏈或輕鏈可變區胺基酸殘基將與受體人類序列之重鏈或輕鏈可變區胺基酸殘基相對應。在其他實施例中，至少83%、85%、87%或90%人類化抗體可變區殘基將與受體人類序列之可變區殘基相對應。在另一較佳實施例中，每一個人類化抗體可變區中之超過95%的部分將與受體人類序列相對應。

人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如先前所論述來確定，且當以此方式量測時，較佳共有至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不一致之殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守性胺基酸取代」為 其中胺基酸殘基藉由具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守性胺基酸取代應實質上不改變蛋白之功能特性。在兩個或兩個以上胺基酸序列之保守性取代彼此不同之情況下，序列一致性百分比或相似度可上調以校正取代之保守性質。

d. 人類抗體

在另一實施例中，抗體可包含完全人類抗體。術語「人類抗體」係指具有與由人類產生及/或使用任一種用於產生人類抗體之技術產生之抗體之胺基酸序列對應的胺基酸序列之抗體。

人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術產生。一種技術為噬菌體呈現，其中在噬菌體上合成(較佳人類)抗體之文庫，用相關抗原或其抗體結合部分篩檢文庫，且分離結合抗原之噬菌體，由此可獲得免疫反應性片段。用於製備及篩檢該等文庫之方法在此項技術中已為吾人所熟知，且用於產生噬菌體呈現文庫之套組係可商購的(例如Pharmacia重組型噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAP^TM 噬菌體呈現套組，目錄號240612)。亦存在其他可用於產生及篩檢抗體呈現文庫之方法及試劑(參見例如U.S.P.N.5,223,409；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號；及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。

在一個實施例中，可藉由篩檢如上製備之重組型組合抗體文庫來分離重組型人類抗體。在一個實施例中，文庫為scFv噬菌體呈現文庫，其係使用人類V_L 及V_H cDNA產生。該等人類V_L 及V_H cDNA係由自B細胞分離之mRNA製備。

由未經處理之文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力 (K_a 為約10⁶ M^-1 至10⁷ M^-1 )，但如此項技術中所描述，親和力成熟亦可藉由自二級文庫構築及重新選擇來活體外模仿。舉例而言，可藉由使用易錯聚合酶活體外隨機引入突變(Leung等人，Technique ,1：11-15(1989)中報導)。此外，可藉由例如用具有跨越所關注之CDR之隨機序列的引子、使用PCR在所選個別Fv純系中使一或多個CDR隨機突變且篩選較高親和力純系來進行親和力成熟。WO 9607754描述用於誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR中之突變誘發以產生輕鏈基因之文庫的方法。另一有效方法係將噬菌體呈現所選擇之V_H 域或V_L 域與獲自未免疫供者之天然存在V域變異體譜系重組且在若干輪鏈改組中針對較高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol.,10：779-783(1992)所述。此技術允許產生解離常數K_D (k_off /k_on )為約10^-9 M或更小之抗體及抗體片段。

在其他實施例中，可使用包含在表面上表現結合配對之真核細胞(例如酵母)的文庫來使用類似程序。參見例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一個實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人NatureBiotechnology 14：309-314(1996)；Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6157-6162(1998))。在其他實施例中，人類結合配對可自諸如酵母之真核細胞中所產生的組合性抗體文庫分離。參見例如U.S.P.N.7,700,302。該等技術有利地允許篩選大量候選調節子且可相對容易地操作候選序列(例如藉由親和力成熟或重組型改組)。

人類抗體亦可藉由將人免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如小鼠)中來產生，該等轉殖基因動物中之內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化且已引入人免疫球蛋白基因。在攻擊時，觀察人類抗體產生，其在各方面均密切地類似於人類中所見，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如與XenoMouse^® 技術有關的U.S.P.N. 5,545,807；U.S.P.N.5,545,806；U.S.P.N.5,569,825；U.S.P.N.5,625,126；U.S.P.N.5,633,425；U.S.P.N.5,661,016以及U.S.P.N.6,075,181及U.S.P.N.6,150,584；以及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol. 13：65-93(1995)中。或者，人類抗體可經由使產生針對目標抗原之抗體的人類B-淋巴細胞(該等B淋巴細胞可自罹患贅生性病症之個體回收或可在活體外進行免疫接種)永生化來製備。參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol ,147(1)：86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。

3.抗體之重組型產生

抗體及其片段可使用自抗體產生細胞獲得之遺傳物質及重組型技術產生或修飾(參見例如Berger及Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology 第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Sambrook及Russell(編)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual (第3版)，NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology ,Wiley,John & Sons,Inc.(2006年增刊)；及U.S.P.N.7,709,611)。

更特定言之，本發明之另一態樣係關於編碼本發明之抗體之核酸分子。核酸可存在於全細胞中、細胞溶胞物中或以部分純化或實質上純形式存在。當核酸藉由標準技術(包括鹼性/SDS處理、CsCl結合、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術)自其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)純化時，其係「經分離」或「變成實質上純的」。本發明之核酸可為例如DNA或RNA，且可能含有或可能不含有內含子序列。更一般而言，如本文中 所用之術語「核酸」包括基因組DNA、cDNA、RNA及其人工變異體(例如肽核酸)(無論單股或雙股)。在較佳實施例中，核酸為cDNA分子。

本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於經融合瘤(例如下文中進一步描述之由帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備的融合瘤)表現之抗體而言，編碼由該融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可經由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫獲得之抗體(例如使用噬菌體呈現技術)，編碼抗體之核酸可自文庫回收。

一旦獲得編碼V_H 及V_L 區段之DNA片段，該等DNA片段可進一步藉由標準重組DNA技術處理，例如以使該等可變區基因轉化為全長抗體鏈基因，轉化為Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，使編碼V_L 或V_H 之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如上下文中所用之術語「可操作地連接」欲意謂接合該等兩個DNA片段以便使由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列在框架中保留。

可藉由將編碼V_H 之DNA可操作地連接至另一編碼重鏈恆定區(C_H 1、C_H 2及C_H 3)之DNA分子而將編碼V_H 區之經分離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)且涵蓋該等區域之DNA片段可由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。如下文更詳細論述，與本文中之教示相容的例示性IgG1恆定區係作為SEQ ID NO：6闡述於隨附序列表中。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼V_H 之DNA操作性連接至另 一僅編碼重鏈C_H 1恆定區之DNA分子。

可藉由使V_L 編碼DNA與編碼輕鏈恆定區(C_L )之另一DNA分子可操作地連接將編碼V_L 區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)且涵蓋此等區域之DNA片段可由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。在此態樣中，例示性相容κ輕鏈恆定區係作為SEQ ID NO：5闡述於隨附序列表中。

本發明亦提供包含上述該等核酸之載體，其可操作地連接至啟動子(參見例如WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；以及真核生物的分泌途徑之其他轉錄調節及處理控制元件。本發明亦提供具有該等載體及宿主表現系統之宿主細胞。

如本文中所用，術語「宿主表現系統」包括任何類型之可經工程改造以產生本發明之核酸或多肽及抗體之細胞系統。該等宿主表現系統包括(但不限於)經重組型噬菌體DNA或質體DNA轉型或轉染之微生物(例如大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；經重組型酵母表現載體轉染之酵母(例如酵母菌(Saccharomyces))；或具有重組型表現構築體之哺乳動物細胞(例如COS、CHO-S、HEK-293T、3T3細胞)，該等重組型表現構築體含有來源於哺乳動物細胞或病毒之基因組的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子)。宿主細胞可經兩種表現載體共轉染，例如第一載體編碼重鏈衍生之多肽且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。

轉型哺乳動物細胞之方法在此項技術中已為吾人所熟知。參見例如U.S.P.N.4,399,216、U.S.P.N.4,912,040、U.S.P.N.4,740,461及U.S.P.N.4,959,455。宿主細胞亦可經工程改造以允許產生具有各種特 徵之抗原結合分子(例如經修飾之具有GnTIII活性之糖型或蛋白質)。

為以長期高產率產生重組蛋白質，穩定表現為較佳。因此，穩定表現所選抗體之細胞株可使用此項技術中認可的標準技術工程改造且形成本發明的一部分。宿主細胞可經受適當表現控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺嘌呤位點等)調控之DNA及可選標記物轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。可使用此項技術中熟知的任一種選擇系統，包括麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供用於在某些條件下增強表現之有效方法。GS系統係完全或部分結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841以及U.S.P.N.5,591,639及U.S.P.N.5,879,936而論述。另一鐘用於發展穩定細胞株之較佳表現系統為Freedom^TM CHO-S套組(Life Technologies)。

一旦藉由重組型表現或任何其他所揭示之技術產生本發明之抗體，其可由此項技術中已知的方法純化或分離，意謂其經鑑別且自其天然環境分離及/或回收且與將妨礙抗體之診斷或治療性用途之污染物分離。經分離之抗體包括重組型細胞內之原位抗體。

此等經分離之製劑可使用此項技術中認可的各種技術純化，諸如離子交換及尺寸排阻層析、透析、滲濾及親和層析，尤其為蛋白質A或蛋白質G親和層析。

4.產生後選擇

不管如何獲得，抗體產生細胞(例如融合瘤、酵母群落等)可針對所需特徵(包括例如穩定生長、高抗體產量及所需抗體特徵，諸如針對相關抗原之高親和力)而經選擇、選殖及進一步篩檢。融合瘤可在細胞培養物中活體外擴增或可在同基因免疫功能不全之動物中活體內擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤及/或群落之方法已為一般熟習此項技術者所熟知。一旦鑑別所需抗體，則可使用常用、此項技術中認可 的分子生物學及生物化學技術分離、操作及表現相關遺傳物質。

由未經處理之文庫產生之抗體(或天然或合成)可具有中等親和力(K_a 為約10⁶ M^-1 至10⁷ M^-1 )。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如藉由使用易錯聚合酶活體外引入隨機突變)及自該等二級文庫選擇針對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母呈現)來活體外模仿親和力成熟。WO 9607754描述用於誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR中之突變誘發以產生輕鏈基因之文庫的方法。

可使用多種技術選擇抗體，包括(但不限於)噬菌體或酵母呈現，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，用相關抗原或其抗體結合部分篩檢文庫，及分離結合抗原之噬菌體或酵母，由此可獲得抗體或免疫反應性片段(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於產生噬菌體或酵母呈現文庫之套組係可商購的。亦存在其他可用於產生及篩檢抗體呈現文庫之方法及試劑(參見U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。該等技術有利地允許篩檢大量候選抗體且提供相對容易的序列操作(例如藉由重組型改組)。

5.抗體片段及衍生物

a. 片段

無論選擇何種形式之調節子(例如嵌合、人類化等)實踐本發明，應瞭解，均可根據本文中之教示使用其免疫反應性片段。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文中所用，術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體之多肽片段，其免疫特異性結合於所選抗原或免疫原 性決定子或與所選抗原或免疫原性決定子反應或與衍生該等片段之完整抗體就特異性抗原結合而競爭。

例示性片段包括：V_L 、V_H 、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單域抗體片段、雙功能抗體、線抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。此外，活性片段包含一部分抗體，該部分抗體保留其與抗原/受質或受體相互作用且以與完整抗體類似之方式(儘管效率可能稍微較低)修飾抗原/受質或受體之能力。

在其他實施例中，抗體片段為包含Fc區域且保留當以完整抗體形式存在時通常與Fc區域相關聯之生物功能(諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)中之至少一種的片段。在一個實施例中，抗體片段為單價抗體，其具有與完整抗體實質上類似的活體內半衰期。舉例而言，該抗體片段可包含連接至能夠賦予片段活體內穩定性之Fc序列的抗原結合臂。

如熟習此項技術者將公認，可經由完整或完全抗體之化學或酶促處理(諸如木瓜酶或胃蛋白酶)或藉由重組型方法獲得片段。關於抗體片段之更詳細描述，參見例如Fundamental Immunology,W.E.Paul編，Raven Press,N.Y.(1999)。

b. 多價抗體

在一個實施例中，本發明之調節子可為單價或多價(例如二價、三價等)。如本文中所用，術語「原子價」係指與抗體相關聯之潛在目標結合位點之數目。各目標結合位點特異性結合一個目標分子或目標分子上之特定位置或基因座。當抗體為單價時，分子之各結合位點將特異性結合於單一抗原位置或抗原決定基。當抗體包含一個以上目標結合位點(多價)時，各目標結合位點可特異性結合同一個或不同分子(例如可結合於不同配位體或不同抗原，或同一個抗原上之不同抗原決定基或位置)。參見例如U.S.P.N.2009/0130105。在各種情況下， 至少一個結合位點將包含與DLL3同功異型物相關聯的抗原決定基、主結構或結構域。

在一個實施例中，調節子為雙特異性抗體，其中兩個鏈具有不同特異性，如Millstein等人，1983,Nature ,305：537-539中所描述。其他實施例包括具有其他特異性之抗體，諸如三特異性抗體。其他更複雜的相容多特異性構築體及其製造方法闡述於U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology ,121：210；及WO 96/27011中。

如上文所提及，多價抗體可免疫特異性結合於所需目標分子之不同抗原決定基，或可免疫特異性結合於目標分子以及異源抗原決定基，諸如異源多肽或固體載體物質。儘管抗DLL3抗體之較佳實施例僅結合兩個抗原(亦即雙特異性抗體)，但本發明亦涵蓋具有其他特異性之抗體(諸如三特異性抗體)。雙特異性抗體亦包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言，異結合物中之抗體中之一者可與抗生物素蛋白偶合，另一者與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向非吾人所樂見之細胞(U.S.P.N.4,676,980)及用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異結合抗體可使用任何便利的交聯方法製備。合適交聯劑以及多種交聯技術在此項技術中已為吾人所熟知，且揭示於U.S.P.N.4,676,980中。

在其他實施例中，使用一般熟習此項技術者熟知的方法使具有所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恆定域序列(諸如包含鉸鏈、C_H 2及/或C_H 3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定域)融合。

c. Fc區修飾

除上文闡述之所揭示之抗體之可變區或結合區之各種修飾、取代、添加或缺失以外，熟習此項技術者應瞭解，本發明之所選實施例 亦可包含恆定區(亦即Fc區)之取代或修飾。更特定言之，預期本發明之DLL3調節子可尤其含有一或多種其他胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其產生具有較佳特徵之化合物，該等特徵包括(但不限於)：藥物動力學改變、血清半衰期延長、結合親和力增加、免疫原性降低、產量增加、Fc配位體與Fc受體(FcR)之結合改變、增強或降低之「ADCC」(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)或「CDC」(補體依賴性細胞毒性)活性、改變之糖基化作用及/或雙硫鍵及經改良之結合特異性。在此方面，應瞭解，此等Fc變異體可有利地用於增強所揭示之調節子之有效抗贅生性質。

為此，本發明之某些實施例可包含Fc區之取代或修飾，例如添加一或多種胺基酸殘基、取代、突變及/或修飾以用於產生具有增強或較佳Fc效應子功能之化合物。舉例而言，與Fc結構域與Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間的相互作用有關的胺基酸殘基之變化可引起細胞毒性增加及/或藥物動力學改變，諸如血清半衰期延長(參見例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)，其均以引用的方式併入本文中)。

在所選實施例中，可藉由修飾(例如取代、刪除或添加)經鑑別與Fc結構域與FcRn受體之間的相互作用有關的胺基酸殘基來產生活體內半衰期延長之抗體(參見例如國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。關於該等實施例，Fc變異體在哺乳動物(較佳為人類)中之半衰期可大於5天、大於10天、大於15天、較佳大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月或大於5個月。半衰期延長可引起較高血清效價，其因此降低抗體之投與 頻率及/或降低所投與之抗體之濃度。可在例如轉殖基因小鼠或經轉染之表現人類FcRn之人類細胞株中，或在接受具有變異型Fc區之多肽之投與的靈長類動物中分析活體內與人類FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2000/42072描述與FcRn之結合改良或減少之抗體變異體。亦參見例如Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

在其他實施例中，Fc變化可引起ADCC或CDC活性增強或降低。如此項技術中已知，CDC係指目標細胞在補體存在下之溶解，且ADCC係指細胞毒性之一種形式，其中結合於某些細胞毒素細胞(例如自然殺手細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之FcR上的所分泌之Ig使此等細胞毒素效應細胞能夠特異性結合於負載抗原之目標細胞且接著殺死具有細胞毒素之目標細胞。在本發明之情形中，抗體變異體具有「改變」之FcR結合親和力，其與親本或未經修飾之抗體或包含原生序列FcR之抗體相比為增強或降低之結合。該等顯示降低之結合之變異體可具有極少或不具有可感知的結合，例如與FcR之結合為原生序列之0-20%，例如由此項技術中熟知的技術測定。在其他實施例中，與原生免疫球蛋白Fc結構域相比，變異體將呈現增強之結合。應瞭解，該等類型之Fc變異體可有利地用於增強所揭示之抗體之有效抗贅生性質。在其他實施例中，該等變化引起結合親和力增加、免疫原性降低、產量增加、糖基化作用改變及/或雙硫鍵(例如對於結合位點)、改良之結合特異性、吞噬作用增加；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。

d. 糖基化作用改變

其他實施例包含一或多種經工程改造之糖型，亦即包含改變之糖基化作用模式或改變之碳水化合物組成之DLL3調節子，其共價連接至蛋白質(例如在Fc結構域中)。參見例如Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem. 277：26733-26740。經工程改造之糖型可適用於多種目的，包括(但不限於)增強或降低效應子功能、增加調節子對目標之親和力或促進調節子產生。在某些需要降低效應子功能之實施例中，分子可經工程改造以表現糖基化形式。已熟知可引起消除一或多個可變區構架糖基化作用位點藉此消除該位點處之糖基化作用的取代(參見例如U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反，可藉由在一或多個其他糖基化作用位點處進行工程改造來賦予含有Fc之分子增強之效應子功能或改良之結合。

其他實施例包括Fc變異體，其具有改變之糖基化組成，諸如具有降低之海藻糖基殘基量之次海藻糖基化抗體或具有增加之平分型GlcNAc結構之抗體。已證明該等改變之糖基化作用模式可增加抗體之ADCC能力。經工程改造之糖型可由熟習此項技術者已知的任何方法產生，例如藉由使用經工程改造或變異型表現品系、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTI11))共表現、藉由在各種生物體或來自各種生物體之細胞株中表現包含Fc區之分子或藉由在包含Fc區之分子經表現後修飾碳水化合物(參見例如WO 2012/117002)。

e. 其他處理

調節子可在產生期間或產生後經不同修飾，例如藉由糖基化作用、乙醯化作用、磷酸化作用、醯胺化作用、由已知保護基/封端基團進行之衍生作用、蛋白水解分裂、與抗體分子或其他細胞配位體連接等。多種化學修飾中之任一種均可藉由已知技術進行，包括(但不限於)由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜酶、V8蛋白酶、NaBH₄ 進行之特異性化學裂解；乙醯化作用；甲醯化作用；氧化；還原；在衣黴素存在下之代謝性合成等。

本發明亦涵蓋各種轉譯後修飾，包括例如N-連接或O-連接之碳水化合物鏈、N端或C端之處理、化學部分與胺基酸主結構之連接、 N-連接或O-連接之碳水化合物鏈之化學修飾以及由原核宿主細胞表現引起之N端甲硫胺酸殘基之添加或缺失。此外，調節子亦可經可偵測之標記(諸如酶、螢光、放射性同位素或親和標記)修飾以允許偵測及分離調節子。

6.抗體特徵

無論調節子係以何種方式獲得或其呈上述哪一種形式，所揭示之調節子之各種實施例均可呈現某些特徵。在所選實施例中，可針對有利性質來選擇、選殖及進一步篩檢抗體產生細胞(例如融合瘤或酵母群落)，該等有利性質包括例如穩定生長、高調節子產量及如下文更詳細論述，所需調節子特徵。在其他情況下，可藉由針對動物之接種選擇特定抗原(例如特異性DLL3同功異型物)或目標抗原之免疫反應性片段來賦予或影響調節子之特徵。在其他實施例中，所選調節子可如上文所描述經工程改造以增強或改進免疫化學特徵，諸如親和力或藥物動力學。

a. 中和抗體

在某些實施例中，結合物將包含「中和」抗體或其衍生物或片段。亦即，本發明可包含抗體分子，其結合特定結構域、主結構或抗原決定基且能夠阻斷、降低或抑制DLL3之生物活性。更一般而言，術語「中和抗體」係指滿足以下條件之抗體：其結合於目標分子或配位體或與目標分子或配位體相互作用且阻止目標分子與結合搭配物(諸如受體或受質)之結合或締合，藉此中斷生物反應，否則該生物反應將由分子之相互作用引起。

應瞭解，可使用此項技術中已知的競爭性結合分析法評估抗體或其免疫功能性片段或衍生物之結合及特異性。在本發明中，當過量的抗體使結合於DLL3之結合搭配物之量降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99% 以上時(如例如由洛奇受體活性或在活體外競爭性結合分析法中量測)，本發明抗體或片段將保持抑制或降低DLL3與結合搭配物或受質之結合。在例如針對DLL3之抗體的情況下，中和抗體或拮抗劑將較佳使洛奇受體之活性改變達至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99%以上。應瞭解，此改良之活性可使用此項技術中認可的技術直接量測或可由活性改變對下游之影響(例如腫瘤發生、細胞存活或洛奇反映基因之活化或抑制)來量測。抗體中和DLL3活性之能力較佳係藉由抑制DLL3與洛奇受體之結合來評估或藉由抗體緩解DLL3介導之洛奇信號傳導之抑制的能力來評估。

b. 內化抗體

有證據表明大部分經表現之DLL3蛋白質保持與致瘤細胞表面締合，藉此允許所揭示之調節子之局部化及內化作用。在較佳實施例中，該等調節子可與抗癌症劑(諸如在內化時殺死細胞之細胞毒素部分)締合或結合。在尤其較佳實施例中，調節子將包含內化抗體藥物結合物。

如本文中所用，「內化」調節子為在與相關抗原或受體結合時由細胞吸收(以及任何有效負載)之調節子。如將瞭解，在較佳實施例中，內化調節子可包含抗體以及抗體結合物，該抗體包括抗體片段及其衍生物。內化作用可在活體外或活體內發生。對於治療性應用，內化作用將較佳在有需要之個體中在活體內發生。內化之抗體分子之數目可充分或足以殺死抗原表現細胞，尤其抗原表現癌症幹細胞。視抗體或抗體結合物之效能而定，在一些情況下，細胞中吸收單一抗體分子足以殺死抗體結合之目標細胞。舉例而言，某些毒素之有效性很高，使得少量的與抗體結合之毒素之分子之內化作用便足以殺死腫瘤細胞。可藉由此項技術中認可的分析法(包括以下實例中描述之分析 法)確定抗體在與哺乳動物細胞結合時是否內化。偵測抗體是否內化於細胞中之方法亦描述於U.S.P.N.7,619,068中，其以全文引用的方式併入本文中。

c. 消耗抗體

在其他實施例中，抗體將包含消耗抗體或其衍生物或片段。術語「消耗」抗體係指較佳與細胞表面上或附近的抗原結合或締合且誘導、促進或引起細胞之死亡或消除(例如藉由CDC、ADCC或引入細胞毒性劑)之抗體。在一些實施例中，所選消耗抗體將與細胞毒性劑締合或結合。

較佳消耗抗體將能夠移除、消除或殺死預定細胞群體中之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99% DLL3致瘤細胞或使其失能。在一些實施例中，細胞群體可包含經濃縮、切片、純化或分離之腫瘤永續細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含完全腫瘤樣品或異源腫瘤提取物，該等提取物包含腫瘤永續細胞。熟習此項技術者應瞭解，如以下實例(例如實例8至10)中所描述之標準生物化學技術可用於根據本文中之教示監測及定量致瘤細胞或腫瘤永續細胞之消耗。

d. 分級及抗原決定基映射

應進一步瞭解，所揭示之抗DLL3抗體調節子將與由所選目標或其片段呈現之離散抗原決定基或免疫原性決定子締合或結合。在某些實施例中，抗原決定基或免疫原性決定子包括分子之化學活性表面分組，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或比電荷特徵。因此，如本文中所用，術語「抗原決定基」包括任何能夠特異性結合於免疫球蛋白或T細胞受體或以其他方式與分子相互作用的蛋白質決定子。在某些實施例中，當抗體優先識別蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之其目標抗原 時，則認為抗體與抗原特異性結合(或免疫特異性結合或反應)。在較佳實施例中，當平衡解離常數(K_D )小於或等於10^-6 M或小於或等於10^-7 M，更佳當平衡解離常數小於或等於10^-8 M，且甚至更佳當解離常數小於或等於10^-9 M時，認為抗體與抗原特異性結合。

更直接的是，術語「抗原決定基」係以其常用生物化學含義使用且係指目標抗原中能夠由特定抗體調節子識別及特異性結合之部分。當抗原為多肽(諸如DLL3)時，抗原決定基通常可由鄰接胺基酸及由於蛋白質之三級摺疊而相鄰的非接觸胺基酸形成(「構形抗原決定基」)。在該等構形抗原決定基中，存在跨越蛋白質上胺基酸殘基之相互作用點，該等相互作用點彼此線性分離。由鄰接胺基酸形成之抗原決定基(有時稱為「線狀」或「連續」抗原決定基)通常在蛋白質變性時保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基通常在蛋白質變性時損失。在任何情況下，抗體抗原決定基在唯一空間構形中典型地包括至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。

在此態樣中，應瞭解，在某些實施例中，抗原決定基可與DLL3蛋白質之一或多個區域、結構域或主結構(例如同功異型物1之胺基酸1-618)締合或駐留於其中。如本文中更詳細論述，DLL3蛋白質之細胞外區域包含一系列通常經識別之結構域，包括六個EGF樣結構域及DSL結構域。為達成本發明之目的，術語「結構域」將根據其公認含義使用且將始終指蛋白質內之可識別或可定義的保守性結構實體，其呈現獨特的二級結構含量。在許多情況下，具有共同功能之同源結構域將通常展示序列相似性且可在多種不同蛋白質中發現(例如EGF樣結構域據稱可在至少471種不同蛋白質中發現)。類似地，此項技術中認可的術語「主結構」將根據其常用含義使用且應通常指蛋白質之短的、保守性區域，其典型地具有十至二十個鄰接胺基酸殘基。如本文中所論述，所選實施例包含調節子，其與DLL3之特定區域、結構域 或主結構內的抗原決定基締合或結合。

在任何情況下，一旦確定抗原上之所需抗原決定基，則可產生針對該抗原決定基之抗體，例如藉由使用本發明中描述之技術用包含抗原決定基之肽進行免疫。或者，在發現過程期間，抗體之產生及表徵可說明與位於特定結構域或主結構中之所需抗原決定基有關的資訊。由此資訊，則可針對與相同抗原決定基之結合來以競爭方式篩檢出抗體。一種實現此目的之方法為進行競爭研究，從而發現彼此競爭性結合之抗體，亦即抗體競爭結合抗原。用於基於抗體之交叉競爭而對抗體進行分級之高通量過程描述於WO 03/48731中。其他分級或結構域含量或抗原決定基定位之方法(包含調節子競爭或酵母上之抗原片段表現)闡述於以下實例中。

如本文中所用，術語「分級」係指用於基於抗體之抗原結合特徵及競爭而將抗體分組或分類之方法。儘管該等技術適用於對本發明之調節子進行定義及分類，但分級並非始終與抗原決定基直接相關且該等抗原決定基結合之初始測定可由本文中所描述之此項技術中認可的其他方法改進及證實。然而，如以下實例中論述及展示，憑經驗將抗體調節子分配至個別區間可提供可指示所揭示之調節子之治療潛力的資訊。

更特定言之，可使用此項技術中已知及本文中之實例中闡述之方法確定所選參考抗體(或其片段)是否結合於相同抗原決定基或交叉競爭結合第二測試抗體(亦即處於相同區間)。在一個實施例中，參考抗體調節子與DLL3抗原在飽和條件下締合，且接著使用標準免疫化學技術測定二級或測試抗體調節子結合於DLL3之能力。若測試抗體能夠實質上與參考抗DLL3抗體同時結合於DLL3，則與初級或參考抗體相比，二級或測試抗體結合於不同抗原決定基。然而，若測試抗體不能實質上同時結合於DLL3，則測試抗體結合於相同抗原決定基、 重疊抗原決定基或與由初級抗體結合之抗原決定基緊鄰(至少位阻上)的抗原決定基。亦即，測試抗體就抗原結合進行競爭且與參考抗體處於同一區間。

當在所揭示之調節子之情形中使用時，術語「競爭」或「競爭抗體」意謂抗體之間的競爭，如由其中測試抗體或所測試之免疫功能性片段阻止或抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合的分析法所測定。通常，該分析法涉及使用經純化之結合於固體表面或載有該等物質中之任一者之抗原(例如DLL3或其結構域或片段)、未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白。藉由在測試免疫球蛋白存在下測定結合於固體表面或細胞之標記量來量測競爭性抑制。通常，測試免疫球蛋白係以過量存在及/或允許首先結合。由競爭分析法鑑別之抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合於同一抗體決定基之抗體，及與由參考抗體結合之抗體決定基足夠近的相鄰抗體決定基結合從而發生位阻之抗體。關於測定競爭性結合之方法的其他細節提供於本文實例中。通常，當競爭抗體以過量存在時，其將抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合達至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，結合受抑制達至少80%、85%、90%、95%或97%或97%以上。

相反，當參考抗體結合時，其較佳抑制隨後添加之測試抗體(亦即DLL3調節子)之結合達至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，測試抗體之結合受抑制達至少80%、85%、90%、95%或97%或97%以上。

在本發明中且如以下實例中所闡述，已測定(經由表面電漿子共振或生物層干涉測量術)DLL3之細胞外結構域由競爭性結合定義至少九個區間，本文中稱為「區間A」至「區間I」。鑒於由調節子分級技術提供之解析，咸信該九個區間包含DLL3蛋白質之細胞外區域中的 大部分區間。

在此態樣中，且如此項技術中已知及以下實例中詳細描述，所需分級或競爭性結合資料可使用固相直接或間接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析法(EIA或ELISA)、夾心競爭分析法、Biacore^TM 2000系統(亦即表面電漿子共振-GE Healthcare)、ForteBio^® Analyzer(亦即生物層干涉測量術-ForteBio,Inc.)或流動式細胞測量方法獲得。如本文中所用之術語「表面電漿子共振」係指允許藉由偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析即時特定相互作用的光學現象。術語「生物層干涉測量術」係指光學分析技術，其分析自兩個表面反射之白光之干涉圖案：生物感測器尖端上固定之蛋白質之層，及內部參考層。結合於生物感測器尖端之分子數目之任何變化均引起干涉圖案偏移，該偏移可即時量測。在尤其較佳實施例中，分析(無論表面電漿子共振、生物層干涉測量術或流動式細胞測量術)係使用Biacore或ForteBio器具或流式細胞儀(例如FACSAria II)進行，如以下實例中說明。

為了進一步表徵與所揭示之DLL3抗體調節子締合或結合之抗原決定基，使用由Cochran等人(J Immunol Methods.287(1-2)：147-158(2004)描述之方案(其以引用的方式併入本文中)之改良版本進行結構域含量抗原決定基定位。簡言之，DLL3中包含特定胺基酸序列之個別結構域表現於酵母表面上且經由流動式細胞測量術測定與各DLL3抗體之結合。結果論述於以下實例6中且展示於圖4中。

其他相容抗原決定基定位技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點法(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(本文中特定地以全文引用的方式併入)或肽裂解分析。此外，可使用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及抗原之化學修飾之方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)(本文中特定地以全文引用的方式併入)。在其他 實施例中，修飾輔助探測(Modification-Assisted Profiling；MAP)，亦稱為基於抗原結構之抗體探測(Antigen Structure-based Antibody Profiling；ASAP)提供根據各抗體與經化學或酶促修飾之抗原表面之結合概況之相似性來將大量針對相同抗原之單株抗體(mAb)歸類的方法(U.S.P.N.2004/0101920，其特定地以全文引用的方式併入本文中)。各類別可反映獨特抗原決定基，其與由另一類別表示之抗原決定基明顯不同或部分重疊。此技術允許快速過濾遺傳一致抗體，使得表徵可集中於遺傳相異抗體。應瞭解，MAP可用於將本發明之hDLL3抗體調節子分類為結合不同抗原決定基之抗體群。

適用於改變固定之抗原之結構的試劑包括酶，諸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胞內蛋白酶Glu-C、胞內蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。適用於改變固定之抗原之結構的試劑亦可為化學試劑，諸如丁二醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及碳肼、游離胺基酸等。

抗原蛋白質可固定在生物感測器晶片表面或聚苯乙烯珠粒上。後者可經例如分析法處理，該分析法為諸如多工LUMINEX^TM 偵測分析法(Luminex Corp.)。由於LUMINEX用至多100種不同類型之珠粒操作多工分析之能力，LUMINEX提供幾乎無限的具有各種修飾之抗原表面，引起生物感測器分析法中抗體抗原決定基探測之改良之解析。

e. 結合親和力

除抗原決定基特異性以外，所揭示之抗體可使用物理特徵(諸如結合親和力)表徵。在此方面，本發明進一步涵蓋抗體之用途，該等抗體對一或多種DLL3同功異型物或在泛抗體情況下，對DLL家族中一個以上成員具有高結合親和力。如本文中所用，術語IgG抗體之「高親和力」係指抗體對目標抗原之K_D 為10^-8 M或低於10^-8 M，更佳為10^-9 M或低於10^-9 M，且甚至更佳為10^-10 M或低於10^-10 M。然而， 「高親和力」結合可針對其他抗體同型而變化。舉例而言，IgM同型之「高親和力」結合係指抗體之K_D 為10^-7 M或低於10^-7 M，更佳為10^-8 M或低於10^-8 M，甚至更佳為10^-9 M或低於10^-9 M。

如本文中所用，術語「K_D 」意指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。據稱本發明之抗體在解離常數K_D (k_off /k_on )10^-7 M時免疫特異性結合其目標抗原。當K_D 5×10^-9 M時，抗體以高親和力特異性結合抗原，且當K_D 5×10^-10 M時，以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體之K_D 10^-9 M為且解離速率為約1×10^-4 /秒。在本發明之一個實施例中，解離速率<1×10^-5 /秒。在本發明之其他實施例中，抗體將以介於約10^-7 M與10^-10 M之間的K_D 結合於DLL3，且在另一實施例中，其將以K_D 2×10^-10 M結合。本發明之其他所選實施例包含解離常數或K_D (k_off /k_on )滿足以下條件之抗體：小於10^-2 M、小於5×10^-2 M、小於10^-3 M、小於5×10^-3 M、小於10^-4 M、小於5×10^-4 M、小於10^-5 M、小於5×10^-5 M、小於10^-6 M、小於5×10^-6 M、小於10^-7 M、小於5×10^-7 M、小於10^-8 M、小於5×10^-8 M、小於10^-9 M、小於5×10^-9 M、小於10^-10 M、小於5×10^-10 M、小於10^-11 M、小於5×10^-11 M、小於10^-12 M、小於5×10^-12 M、小於10^-13 M、小於5×10^-13 M、小於10^-14 M、小於5×10^-14 M、小於10^-15 M或小於5×10^-15 M。

在特定實施例中，免疫特異性結合於DLL3之本發明之抗體之締合速率常數或k _on (或k _a )速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)^k _on ←Ab-Ag)為至少10⁵ M^-1 s^-1 、至少2×10⁵ M^-1 s^-1 、至少5×10⁵ M^-1 s^-1 、至少10⁶ M^-1 s^-1 、至少5×10⁶ M^-1 s^-1 、至少10⁷ M^-1 s^-1 、至少5×10⁷ M^-1 s^-1 或至少10⁸ M^-1 s^-1 。

在另一實施例中，免疫特異性結合於DLL3之本發明之抗體之解離速率常數或k _off (或k _d )速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)^k _off ←Ab-Ag)小於10^-1 s^-1 、小於5×10^-1 s^-1 、小於10^-2 s^-1 、小於5×10^-2 s^-1 、小於10^-3 s^-1 、小於5×10^-3 s^-1 、小於10^-4 s^-1 、小於5×10^-4 s^-1 、小於10^-5 s^-1 、小於5×10^-5 s^-1 、小於10^-6 s^-1 、小於5×10^-6 s^-1 、小於10^-7 s^-1 、小於5×10^-7 s^-1 、小於10^-8 s^-1 、小於5×10^-8 s^-1 、小於10^-9 s^-1 、小於5×10^-9 s^-1 或小於10^-10 s^-1 。

在本發明之其他所選實施例中，抗DLL3抗體之親合力常數或K_a (k_on /k_off )為至少10² M^-1 、至少5×10² M^-1 、至少10³ M^-1 、至少5×10³ M^-1 、至少10⁴ M^-1 、至少5×10⁴ M^-1 、至少10⁵ M^-1 、至少5×10⁵ M^-1 、至少10⁶ M^-1 、至少5×10⁶ M^-1 、至少10⁷ M^-1 、至少5×10⁷ M^-1 、至少10⁸ M^-1 、至少5×10⁸ M^-1 、至少10⁹ M^-1 、至少5×10⁹ M^-1 、至少10¹⁰ M^-1 、至少5×10¹⁰ M^-1 、至少10¹¹ M^-1 、至少5×10¹¹ M^-1 、至少10¹² M^-1 、至少5×10¹² M^-1 、至少10¹³ M^-1 、至少5×10¹³ M^-1 、至少10¹⁴ M^-1 、至少5×10¹⁴ M^-1 、至少10¹⁵ M^-1 或至少5×10¹⁵ M^-1 。

除上述調節子特徵以外，本發明之抗體可使用其他物理特徵進一步表徵，包括例如熱穩定性(亦即熔融溫度；Tm)及等電點(參見例如Bjellqvist等人，1993,Electrophoresis 14：1023；Vermeer等人，2000,Biophys.J.78：394-404；Vermeer等人，2000,Biophys.J.79：2150-2154，其均以引用的方式併入本文中)。

V. 抗體藥物結合物及藥物連接子部分

應瞭解，本發明之DLL3結合物包含經由連接子部分與PBD藥物有效負載共價連接之DLL3細胞結合劑。如本文中論述，本發明之DLL3結合物可用於在目標位置(例如致瘤細胞)處提供PBD 1、PBD 2、PBD 3、PBD 4或PBD 5中之任一者。此宜由所揭示之ADC實現，該等ADC在釋放及活化藥物有效負載之前將結合之藥物有效負載以相對未反應、無毒狀態引導至目標位點。此毒性有效負載之靶向釋放係主要由併入藥物連接子化合物DL 1-5中之連接子實現，製造該等藥物連接子化合物DL 1-5使得直至ADC到達致瘤細胞方才裂解及釋放細胞毒性二聚型PBD。此有利地在腫瘤位點處提供活性PBD藥物之相對高含量，同時最小化非靶向細胞及組織之暴露。

1.連接子化合物

更特定言之，併入所揭示之ADC中的連接子較佳在細胞外穩定、防止ADC分子聚集及保持ADC可自由地溶於水性介質中且處於單體狀態。在傳送或遞送至細胞中之前，抗體-藥物結合物(ADC)較佳為穩定的且保持完整，亦即抗體保持連接至藥物部分。儘管連接子在目標細胞外部穩定，但其經設計以在細胞內以某一有效速率裂解。因此，有效連接子將：(i)保持抗體之特異性結合性質；(ii)允許結合物或藥物部分之細胞內遞送；(iii)保持穩定及完整，亦即不裂解，直至結合物遞送或傳送至其目標位點；及(iv)保持PBD藥物部分之細胞毒性、細胞殺死作用或細胞抑制作用。ADC之穩定性可由標準分析技術量測，諸如質譜分析、HPLC及分離/分析技術LC/MS。抗體與藥物部分之共價連接需要連接子具有兩個反應性官能基，亦即在反應性含義上為二價。已知適用於連接兩個或多於兩個功能性或生物學活性部分(諸如肽、核酸、藥物、毒素、抗體、半抗原及報道基團)之二價連接子，且以描述其方法及所得結合物(Hermanson,G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，第234-242頁)。

為此，本發明之DLL3 ADC包含可由存在於細胞內環境(例如溶酶體或內體或小窩內)之裂解劑裂解的連接子。在ADC1-5之情況下，連接子包含肽基連接子，其由細胞內肽酶或蛋白酶酶(包括(但不限於)溶酶體或內體蛋白酶)裂解。在某些實施例中，肽基連接子之長度較佳為至少兩個胺基酸或在其他實施例中為至少三個胺基酸。裂解劑可包括組織蛋白酶B及組織蛋白酶D以及纖維蛋白溶酶，已知其中各者均可使二肽藥物衍生物水解，引起目標細胞內活性藥物之釋放。在所揭示之藥物-連接子部分DL1-DL5中，可由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接子為纈胺酸-丙胺酸二肽部分。使用治療劑之細胞內蛋白水解釋放之一個優點為試劑通常在結合時滅毒且結合物之血清穩定性通常較 高。

除可由酶裂解之二肽單元外，在ADC 1-5(或DL1-DL5)中發現之所揭示之連接子各包括間隔基單元、用於將藥物-連接子連接至細胞結合劑的結合部分及(至少在DL4及DL5情況下)在連接子裂解時提供PBD藥物之完全斷開的自我分解部分。關於自我分解基團，DL4及DL5均併入相同部分。為此，自我分解連接子及二肽共同形成基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其說明如下：

其中星號指示與所選PBD細胞毒性部分之連接位點，且波形線表示與連接子之其餘部分(例如間隔基-抗體結合區段)之連接位點，該連接子可與抗體結合。在二肽之酶促裂解時，自我分解型連接子在遠端位點活化時將允許受保護化合物(亦即毒性PBD二聚體)之完全釋放，其沿以下展示之流程進行：

其中L*為包含現在裂解之肽基單元之連接子之其餘部分的活化形式。PBD 4及PBD 5之完全釋放確保其將保持所需毒性活性。

如下文將更詳細論述及實例7中闡述，本發明之藥物連接子將連接至反應性硫醇親核試劑。可藉由用還原劑(諸如DTT(二硫蘇糖醇))處理使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。理論上，各半胱胺酸橋將因此形成兩種反應性硫醇親核試劑。U.S.P.N.7,521,541教示藉由引入反應性半胱胺酸胺基酸而經工程改造之抗體。

在DL 1、DL 2、DL 3及DL 5中，細胞結合劑與藥物-連接子部分之間的連接係經由細胞結合劑之硫醇殘基及連接子上之末端順丁烯二醯亞胺基團實現。在該等實施例中，細胞結合劑與藥物-連接子之間的連接為：

其中星號表示與藥物-連接子之其餘部分之連接位點且波形線表示與細胞結合劑之其餘部分之連接位點。在此實施例中，S原子典型地來源於DLL3抗體。

關於DL4，結合部分包含末端碘乙醯胺，其可與活化之硫醇反應以提供所需ADC 4。如以下實例7中所闡述，DL4之較佳結合程序與在其他實施例中發現之順丁烯二醯亞胺結合基團之較佳結合程序略微不同。在任何情況下，在本發明中，熟習此項技術者可容易地使每一種所揭示之藥物-連接子化合物與相容DLL3調節子結合。

2.PBD化合物

如上文所論述及以下實例中呈現，每一種所揭示之PBD化合物(即將在下文中描繪)均呈現細胞毒性，使其成為待併入本發明之ADC中的潛在候選物。作為DL 1-5中之每一者之組分的PBD 1-5中之每一者之合成十分詳細地呈現於以下實例1中。在本發明中，可容易地產生包含本發明之ADC之有效負載的毒性化合物及如本文中所闡述來使用。在連接子裂解時自ADC 1-5釋放之PBD化合物即將描述於下文中：

根據本發明，該等化合物在腫瘤位點處之遞送及釋放可顯示治療或管理增生性病症之臨床有效性。關於化合物，應瞭解，每一種所揭示之PBD均在各C環中具有兩個sp² 中心，與在各C環具有僅一個sp² 中心之化合物相比，其可允許DNA之小溝中更強的結合(且因此具有更大毒性)。因此，當如本文中所闡述使用DLL3 ADC中時，所揭示之PBD可證明對治療增生性病症尤其有效。

3.藥物-連接子部分

根據本文中之教示，所揭示之PBD將與如上文闡述之連接子組合以提供如下文即將闡述之藥物-連接子化合物DL1-DL5。每一種所揭示之藥物-連接子之合成之詳細方案闡述於以下實例1中。

及

關於藥物-連接子DL 1-5，應瞭解，DL 1、DL 2、DL 3及DL 5各包含末端順丁烯二醯亞胺基團，其可用於使化合物與所選DLL3抗體 結合。相反，DL 4包含末端碘乙醯胺基團，其係用於使PBD有效負載與目標抗體結合。在某些條件下，使用碘乙醯胺部分可避免某些非吾人所樂見之副反應及提供增強之ADC穩定性。此外，應瞭解，DL 4及DL 5包含PBD，其經由B環上之N10位置連接至DLL3調節子，而DL1、DL2及DL3係經由C環上之C2位置連接至所選抗體。關於經由N10位置連接之化合物，應進一步注意，連接子包含PABC自我分解型部分以確保有效負載之完全分離。在本發明中，熟習此項技術者可容易地確定哪種DL(及相關ADC)將對治療所選增生性病症顯示有效性。

4.化合物特徵

以下實施例及下文即將闡述之變化適用於所揭示之ADC、藥物連接子及/或PBD且明確地涵蓋於本發明之範疇內。

a. 溶劑合物

可能適宜或需要製備、純化及/或操作藥物連接子、ADC或PBD之相應溶劑合物。術語「溶劑合物」在本文中係以習知含義使用以指代溶質(例如活性化合物、活性化合物之鹽)與溶劑之複合物。若溶劑為水，則溶劑合物可便利地稱為水合物，例如單水合物、二水合物、三水合物等。

本發明包括其中溶劑添加跨越PBD部分之亞胺鍵的化合物，其說明與下文中，其中溶劑為水或醇(R^A OH，其中R^A 為C_1-4 烷基)：

此等形式可稱為PBD之甲醇胺及甲醇胺醚形式(如以上關於R¹⁰ 之部分中所描述)。此等平衡態之平衡視發現化合物之條件以及部分本身之性質而定。

b. 異構體

某些化合物可以一或多種特定幾何異構、光學異構、對映異構、非對映異構、差向異構、立體異構、互變異構、構形異構或變旋異構形式存在，包括(但不限於)順式-及反式-形式；E-及Z-形式；c-、t-及r-形式；內-及外-形式；R-、S-及內消旋-形式；D-及L-形式；d-及l-形式；(+)及(-)形式；酮-、烯醇-及烯醇化物-形式；同-及逆-形式；順錯-及反錯-形式；α-及β-形式；直立及平伏形式；舟型-、椅型-、扭曲型-、信封型-及半椅型-形式；及其組合，下文中總稱為「異構體」(「異構形式」)。

術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之不可重疊性之性質的分子，而術語「非對掌性」係指可重疊於其鏡像搭配物上之分子。

術語「立體異構體」係指具有相同化學組成，但原子或基團之空間排列不同的化合物。

「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且分子不互為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體混合物可在高解析度分析程序(諸如電泳及層析)下分離。

「對映異構體」係指化合物之互為不可重疊鏡像的兩種立體異構體。

本文中所用立體化學定義及慣例通常係根據S.P.Parker遍，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,「Stereochemistry of Organic Compounds」,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1994。本發明之化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。意欲本發明化合物之所有立體異構形式(包括(但不限於)非對映異構體、對映異構體及滯轉異構體以及其混合物，諸如外消旋混合 物)形成本發明之一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠使平面偏光之平面旋轉。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R 及S 用於表示分子關於其對掌性中心之絕對構型。前綴d及l或(+)及(-)用以表示化合物使平面偏振光旋轉之符號，其中(-)或l意謂化合物為左旋。具有前綴(+)或d之化合物為右旋。對於指定化學結構，此等立體異構體除互為鏡像外均相同。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且該等異構體之混合物通常稱為對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或化學製程中未進行立體選擇或無立體專一性的情況下出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指缺乏光學活性之兩種對映異構體物質的等莫耳混合物。

應注意，除如下文對互變異構形式所論述以外，自如本文所用之術語「異構體」明確排除結構(或構造)異構體(亦即原子之間的連接不同而非僅原子空間位置不同的異構體)。舉例而言，提及甲氧基(-OCH₃ )時不應視為提及其結構異構體羥基甲基(-CH₂ OH)。類似地，提及鄰氯苯基時不應視為提及其結構異構體間氯苯基。然而，提及一類結構時可充分包括屬於該種類之結構異構形式(例如C_1-7 烷基包括正丙基及異丙基；丁基包括正丁基、異丁基、第二丁基及第三丁基；甲氧基苯基包括鄰甲氧基苯基、間甲氧基苯基及對甲氧基苯基)。

上述排除不適於互變異構形式，例如酮、烯醇及烯醇化物形式，如(例如)以下互變異構對中之互變異構形式：酮/烯醇(說明於下文中)、亞胺/烯胺、醯胺/亞胺基醇、脒/脒、亞硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亞硝基/羥基偶氮基及硝基/酸式硝基(aci-nitro)。

術語「互變異構體」或「互變異構形式」係指可經由低能量障壁相互轉化之具有不同能量之結構異構體。舉例而言，質子互變異構體(亦稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移而相互轉化，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構化。價鍵互變異構體包括藉由一些鍵結電子重組而相互轉化。

應注意，術語「異構體」尤其包括具有一或多個同位素取代之化合物。舉例而言，H可為包括¹ H、² H(D)及³ H(T)之任何同位素形式；C可為包括¹² C、¹³ C及¹⁴ C之任何同位素形式；O可為包括¹⁶ O及¹⁸ O之任何同位素形式；及其類似物。

可併入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟及氯之同位素，諸如(但不限於)分別為² H(氘，D)、³ H(氚)、¹¹ C、¹³ C、¹⁴ C、¹⁵ N、¹⁸ F、³¹ P、³² P、³⁵ S、³⁶ Cl及¹²⁵ I。本發明之各種同位素標記之化合物，例如其中合併有放射性同位素(諸如³ H、¹³ C及¹⁴ C)之化合物。該等同位素標記之化合物可用於代謝研究、反應動力學研究、偵測或成像技術(諸如正電子發射斷層攝影法(PET)或單光子發射電腦斷層攝影法(SPECT)，包括藥物或受質組織分佈分析法)或患者之放射性治療中。經氘標記或取代之本發明之治療化合物可具有改良的DMPK(藥物代謝及藥物動力學)性質，該等性質與分佈、代謝及排泄(ADME)有關。經諸如氘之重同位素取代由於代謝穩定性更大而可產生某些治療優點，例如活體內半衰期增加或劑量需求降低。經¹⁸ F標記之化合物可用於PET或SPECT研究。經同位素標記之本發明化合物及其前藥一般可藉由進行流程或下文所述之實例及製備方法中所揭示之程序，藉由以容易獲得之同位素標記試劑代替非同位素標記試劑而製備。此外，以較重同位素，尤其用氘(亦即² H或D)進行之取代可得到由較大代謝穩定性產生之某些治療優勢，例如活體內半衰期增加或劑量需求減小或治療指數改良。應理解，在此情形下，氘視為取 代基。此類重同位素，尤其氘之濃度可由同位素增濃因子定義。在本發明之化合物中，未特定指定為特定同位素之任何原子意欲代表該原子之任何穩定同位素。

除非另外說明，否則提及特定化合物時包括所有該等異構形式，包括其(完全或部分)外消旋混合物及其他混合物。該等異構形式之製備(例如不對稱合成)及分離(例如分步結晶及層析)方法為此項技術中已知的或可藉由以已知方式修改本文所教示之方法或已知方法容易地獲得。

5.結合物及藥物負載

如上文所論述，以下抗體藥物結合物係由本發明提供： 及

一旦產生及/或製造本發明之調節子及藥物-連接子及根據本文中之教示選擇，則其可連接或結合以提供所揭示之ADC。如本文中所用，術語「結合物」或「調節子結合物」或「抗體結合物」或「DLL3結合物」或「ADC」可互換地使用且始終意謂ADC 1、ADC 2、ADC 3、ADC 4或ADC 5中之任一者。可使用此項技術中認可的技術使所選抗體與藥物-連接子結合以提供所需ADC。較佳結合方法闡述於以下實例7中。此外，藉由改變如此項技術中已知的結合條件或選擇特定抗體構築體，可產生呈現各種藥物與抗體之化學計量莫耳比率之ADC且明確地屬於本發明之範疇內。

更一般而言，熟習此項技術者應瞭解，多種不同反應可用於所揭示之藥物-連接子與DLL3結合劑之連接或締合。作為實例，抗體上之親核基團包括(但不限於)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸。硫醇基為親 核性且能夠與連接子部分(諸如本發明之連接子部分)上之親電子基團反應以形成共價鍵。本發明之較佳抗體將具有可還原的鏈間二硫化物，亦即提供該等親核基團之半胱胺酸橋。因此，在某些實施例中，調節子半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示之藥物-連接子之末端馬來醯亞胺或碘乙醯胺基團之反應將提供所需結合。在該等情況下，可藉由用還原劑(諸如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧乙基)膦(TCEP))處理使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。理論上，各半胱胺酸二硫鍵將因此形成兩種反應性硫醇親核試劑。在其他實施例中，可經由離胺酸與試劑(包括(但不限於)2-亞胺基硫雜環戊烷(特勞特試劑(Traut's reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)之反應將其他親核基團引入抗體中，引起胺轉化為硫醇。儘管該等試劑為較佳，但應瞭解，所揭示之藥物-連接子與DLL3調節子之結合可使用熟習此項技術者已知的提供抗體或細胞結合劑之親核基團與藥物-連接子試劑之共價鍵結的各種反應、條件及試劑實現。如所指示，尤其較佳方法更詳細地闡述於以下實例7中。

至少部分視用於實現結合之方法而定，本發明之ADC及ADC組合物可包含各種化學計量莫耳比率之藥物及抗體部分。如本文中所用，化學計量莫耳比率係根據「藥物與抗體比率」、「DAR」或「藥物負載」定義。另一方面，藥物負載或DAR為每細胞結合劑(例如組合物中之抗體)中PBD藥物之加權平均數。當本發明之PBD化合物與IgG1中之天然存在之半胱胺酸結合時，藥物負載可在每細胞結合劑1至8份藥物範圍內，亦即其中1、2、3、4、5、6、7或8份藥物部分共價連接至各細胞結合劑。本發明之組合物之DAR較佳為約2、4或6且在尤其較佳實施例中，DAR將包含約2。

更特定言之，本發明之結合物組合物包含與一定範圍之PBD化合物(1至8份(在IgG1情況下))結合之細胞結合劑，例如抗體。因此，所 揭示之抗體藥物結合物組合物包括抗體藥物結合物化合物之混合物，其中大部分成分抗體共價連接至一或多個PBD藥物部分，且其中藥物部分可在各種胺基酸殘基處連接至抗體。亦即，在結合後，本發明之ADC組合物將包含DLL3結合物與各種濃度之不同藥物負載(例如每IgG1抗體1至8份藥物)之混合物。使用選擇性結合條件及純化方法，可使結合物組合物達到其主要含有單一主要所需ADC物質(例如藥物負載為2)及相對低含量之其他ADC物質(例如藥物負載為1、4、6等)之程度。DAR值表示完整組合物(亦即所有ADC物種合起來)之藥物負載之加權平均值。由於所用定量方法之固有不確定性及在商業環境中完全移除非主要ADC物質的困難，可接受之DAR值或說明通常呈現為某一範圍或分佈(亦即DAR為2 +/- 0.5)。醫藥環境中較佳使用包含屬於該範圍(亦即1.5至2.5)內之所量測之DAR的組合物。

因此，在某些較佳實施例中，本發明將包含DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/- 0.4)的組合物。在其他較佳實施例中，本發明將包含DAR為2、4、6或8 +/- 0.4。最終，在所選較佳實施例中，本發明將包含DAR為2 +/- 0.4。應瞭解，在某些較佳實施例中，範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物之DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(+/- 0.3)；DAR為2、4、6或8 +/- 0.3或甚至更佳DAR為2 +/- 0.3。在其他實施例中，IgG1結合物組合物將較佳包含DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/- 0.4)之組合物及相對低含量(亦即小於30%)之非主要ADC物質。在其他較佳實施例中，ADC組合物將包含DAR為2、4、6或8(各+/- 0.4)及相對低含量(<30%)之非主要ADC物質。在尤其較佳實施例中，ADC組合物將包含DAR為2 +/- 0.4及相對低含量(<30%)之非主要ADC物質。

來自結合反應之ADC製劑中每抗體中之藥物分佈可藉由習知方法表徵，諸如UV、逆相HPLC、HIC、質譜分析、ELISA分析法及電 泳。亦可確定根據每抗體中之藥物之ADC之定量分佈。藉由ELISA，可確定特定ADC製劑中每抗體中藥物之平均值(Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.11：843-852)。然而，每抗體中之藥物分佈值不可由抗體-抗原結合及ELISA之探測限制辨別。又，用於偵測抗體-藥物結合物之ELISA分析法不確定藥物部分在何處連接至抗體(諸如重鏈或輕鏈片段)或特定胺基酸殘基。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方法實現均質ADC(其中DAR包含來自具有其他藥物負載之ADC之某一良好定義之值)之分離、純化及表徵。該等技術亦適用於其他類型之結合物。

當抗體中一個以上親核或親電子基團與藥物-連接子中間物反應或相繼與連接子試劑及藥物部分試劑反應時，則所得產物為ADC化合物(具有連接抗體之藥物部分之分佈，例如1、2、3等)之混合物。液相層析方法(諸如聚合逆相(PLRP)及疏水性相互作用(HIC))可藉由藥物負載值分離混合物中之化合物。然而，可分離具有單一藥物負載值之ADC製劑，此等單一負載值ADC仍可包含非均質混合物，因為藥物部分可經由連接子在抗體上之不同位點處連接。

對於一些抗體-藥物結合物，藥物負載之數目可受抗體上之連接位點數目限制。舉例而言，抗體可具有僅一個或若干個半胱胺酸硫醇基，或可具有僅一個或若干個具有足夠反應性之硫醇基，連接子可經由該等硫醇基連接。較高藥物負載(例如>5)可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不可溶、毒性或細胞滲透性損失。

典型地，低於理論最大值之藥物部分在結合反應期間與抗體結合。抗體可含有例如多個不與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基。僅反應性最高的離胺酸基團可與胺反應性連接子試劑反應。又，僅反應性最高的半胱胺酸硫醇基可與硫醇反應性連接子試 劑反應。通常，抗體不含有許多(若存在)可連接至藥物部分的游離及反應性半胱胺酸硫醇基。化合物之抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫鍵形式存在且必須用還原劑(諸如二硫蘇糖醇(DTT)或TCEP)在部分或完全還原條件下還原。可以若干種不同方式控制ADC之負載(藥物/抗體比率)，包括：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，及(iii)部分化或限制半胱胺酸硫醇修飾之還原條件。

應進一步瞭解，可藉由工程改造一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基將反應性硫醇基引入抗體(或其片段)中(例如製備包含一或多個非原生半胱胺酸胺基酸殘基之突變型抗體)。亦即，半胱胺酸胺基酸可在抗體中且不形成鏈內或分子間二硫鍵的活性部位處經工程改造(Junutula等人，2008b Nature Biotech.,26(8)：925-932；Dornan等人(2009)Blood 114(13)：2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。經工程改造之半胱胺酸硫醇可與本發明之連接子試劑或藥物-連接子試劑(其具有硫醇反應性、親電子基團，諸如順丁烯二醯亞胺或α-鹵醯胺)反應以形成具有經工程改造之抗體及PBD藥物部分之ADC。因此可設計、控制及知曉藥物部分之位置。可控制藥物負載，因為經工程改造之半胱胺酸硫醇基典型地以高產率與硫醇反應性的連接子試劑或藥物-連接子試劑反應。藉由重鏈或輕鏈上單一位點處之取代來工程改造IgG抗體以引入半胱胺酸胺基酸可在對稱抗體上產生兩個新的半胱胺酸。可藉由結合產物ADC之近似均質性實現藥物負載為約2。

VI.醫藥製劑及治療性用途

1.調配物及投與途徑

視所選結合物之形式、所欲遞送模式、所治療或監測之疾病及多種其他變數而定，可視需要使用此項技術中認可的技術調配本發明 之組合物。在一些實施例中，本發明之治療性組合物可以純投與或以含有最少量其他組分之形式投與，而其他組合物可視情況經調配以含有合適的在此項技術中熟知的醫藥學上可接受之載劑，包含賦形劑及助劑(參見例如Gennaro,Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus ，第20版(2003)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems ，第7版，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients ，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。各種醫藥學上可接受之載劑(包括媒劑、佐劑及稀釋劑)容易購自多種商業來源。此外，多種醫藥學上可接受之輔助物質(諸如pH值調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、濕潤劑及其類似物)亦可購得。某些非限制性例示性載劑包括生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。

更特定言之，應瞭解，在一些實施例中，本發明之治療組合物可以純形式投與或以含有最少量其他組分之形式投與。相反，本發明之DLL3 ADC可視情況經調配以含有合適的醫藥學上可接受之載劑(包含賦形劑及助劑)，該等載劑為此項技術中熟知且為相對惰性物質，其有助於結合物之投與或幫助將活性化合物加工成經醫藥學上最佳化以遞送至作用位點的製劑。舉例而言，賦形劑可提供形成或一致性或充當稀釋劑以改良ADC之藥物動力學或穩定性。合適賦形劑或添加劑包括(但不限於)穩定劑、濕潤劑及乳化劑、用於改變容積莫耳滲透濃度之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚滲透增強劑。在某些較佳實施例中，醫藥組合物可以凍乾形式提供及在投與之前在例如緩衝鹽水中復原。該等復原組合物較佳靜脈內投與。

所揭示之用於全身投與之ADC可經調配以用於經腸、非經腸或局部投與。實情為，所有三種類型之調配物可同時使用以實現活性成 分之全身投與。用於非經腸及非注射藥物遞送之賦形劑以及調配物闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)中。適用於非經腸投與之調配物包括呈水可溶形式之活性化合物(例如水可溶鹽)之水溶液。此外，可投與活性化合物之懸浮液，如適用於油性注射懸浮液。合適親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，例如經己基取代之聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或三酸甘油酯。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液之黏度的物質且該等物質包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可視情況含有穩定劑。脂質體亦可用於封裝用於遞送至細胞中之試劑。

適用於經腸投與之調配物包括硬明膠膠囊或軟明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。

適用於非經腸投與(例如藉由注射)之調配物包括水性或非水性、等張、無熱原質、無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中活性成分係以溶解、懸浮或以其他方式提供(例如於脂質體或其他微粒中)。該等液體可額外含有其他醫藥學上可接受之成分，諸如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑，及使調配物與所欲受體之血液(或其他相關體液)等張的溶質。賦形劑之實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及其類似物。適用於該等調配物中之等張載劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸鹽林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)。

用於非經腸投與(例如靜脈內注射)之相容調配物將包含約10μg/ml至約100μg/ml之ADC濃度。在某些所選實施例中，ADC濃度將包含20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、 800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他較佳實施例中，ADC濃度將包含2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。

通常，本發明之化合物及組合物(包含DLL3 ADC)可藉由各種途徑活體內投與有需要之個體，包括(但不限於)經口、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌肉內、顱內、心內、心室內、氣管內、經頰、經直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮及鞘內腔投與，或藉由植入或吸入以其他方式投與。標的組合物可調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑；包括(但不限於)錠劑、膠囊、散劑、粒劑、軟膏劑、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及噴霧劑。適當調配物及投與途徑可根據所欲應用及治療方案來選擇。在尤其較佳實施例中，將靜脈內遞送本發明之化合物。

2.劑量

類似地，特定給藥方案(亦即劑量、時序及重複)將視特定個體及個體之病史以及經驗上的考慮因素(諸如藥物動力學(例如半衰期、清除率等))而定。投與頻率可根據療程確定及調節，且係基於降低增生性或致瘤細胞之數目、保持該等贅生性細胞減少、降低贅生性細胞之增殖或延緩轉移發生。在其他實施例中，可調節或降低所投與之劑量以管理潛在副作用及/或毒性。或者，標的治療性組合物之持續連續釋放調配物可適用。

熟習此項技術者將瞭解，結合物化合物及包含結合物化合物之組合物之合適劑量可視患者而不同。確定最佳劑量將通常涉及治療利益程度與任何風險或有害副作用之間的平衡。所選劑量將視多種因素而定，包括(但不限於)特定化合物之活性、投與途徑、投與時間、化 合物之排泄速率、治療持續時間、其他組合使用之藥物、化合物及/或材料、病狀之嚴重性以及患者之物種、性別、年齡、體重、條件、一般健康狀況及先前病史。化合物量及投與途徑將最終由醫師、獸醫或臨床醫師決定，但通常將選擇劑量以實現可在作用位點處實現所需作用而不引起顯著不良或有害副作用的局部濃度。

通常，本發明之ADC可以各種範圍投與。此等範圍包括每劑量每公斤體重約5微克至每劑量每公斤體重約100毫克；每劑量每公斤體重約50微克至每劑量每公斤體重約約5毫克；每劑量每公斤體重約100微克至每劑量每公斤體重約約10毫克。其他範圍包括每劑量每公斤體重約100微克至每劑量每公斤體重約20毫克及每劑量每公斤體重約0.5毫克至每劑量每公斤體重約20毫克。在某些實施例中，劑量為每公斤體重至少約100微克、每公斤體重至少約至少約250微克、每公斤體重至少約750微克、每公斤體重至少約3毫克、每公斤體重至少約5毫克、每公斤體重至少約10毫克。

在所選實施例中，ADC將以每劑量每公斤體重約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微克投與(較佳靜脈內)。其他實施例將包含ADC以每劑量每公斤體重約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000微克投與。在其他較佳實施例中，所揭示之結合物將以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.58、9或10mg/kg投與。在其他實施例中，結合物可以每劑量每公斤體重12、14、16、18或20毫克投與。在其他實施例中，結合物可以每劑量每公斤體重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100毫克投與。藉由本文中之教示，熟習此項技術者可基於臨床前動物研究、臨床觀測以及標準醫藥及生物化學技術及量測容易地確定各種ADC之合適劑量。在尤其較佳實施例中，該等DLL3結合物劑量將在一段時間 內靜脈內投與。此外，該等劑量可在預定療程內分多次投與。

其他給藥方案可基於體表面積(Body Surface Area；BSA)計算，如U.S.P.N.7,744,877中所揭示。如所熟知，BSA係使用患者身高及體重計算且提供個體尺寸之量測，如由其身體之表面積表示。在某些實施例中，結合物可以1mg/m² 至800mg/m² 、50mg/m² 至500mg/m² 之劑量及以100mg/m² 、150mg/m² 、200mg/m² 、250mg/m² 、300mg/m² 、350mg/m² 、400mg/m² 或450mg/m² 之劑量投與。亦應瞭解，可使用此項技術中認可及經驗上的技術確定合適劑量。

在任何情況下，DLL3 ADC較佳視需要投與有需要之個體。投與頻率可由熟習此項技術者(諸如主治醫師)基於所治療之病狀、所治療之個體之年齡、所治療之病狀之嚴重性、所治療之個體之一般健康狀況及其類似因素等考慮因素決定。通常，DLL3結合物之有效劑量係以一或多次投與個體。更特定言之，ADC之有效劑量係以每月一次、每月一次以上或小於每月一次投與個體。在某些實施例中，DLL3 ADC之有效劑量可分多次投與，包括歷時至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年或若干年。在其他實施例中，所揭示之調節子之投與可歷時若干天(2、3、4、5、6或7)、若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干個月(1、2、3、4、5、6、7或8))或甚至一年或若干年。

在某些較佳實施例中，涉及結合之調節子之療程將包含所選藥物產品在數週或數月時間內的多次給藥。更特定言之，本發明之結合之調節子可以每天一次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每十天一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每十週一次或每三個月一次投與。在此方面，應瞭解，可基於患者反應及臨床實踐改變劑量或調節時間間隔。

亦可憑經驗確定已接受一或多次投與之個體中所揭示之治療性組合物之劑量及方案。舉例而言，可向個體投與增加之劑量之如本文 中所描述製備之治療性組合物。在所選實施例中，劑量可分別基於憑經驗確定或觀測之副作用或毒性而逐漸增加或降低或減少。為評估所選組合物之功效，可如先前描述使用特定疾病、病症或病狀之標記。對於癌症，此等標記包括經由觸診或目測直接量測腫瘤尺寸、藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤尺寸；如由直接腫瘤活組織檢驗及腫瘤樣品之顯微鏡檢驗評估之改良；根據本文中所描述之方法鑑別之間接腫瘤標記(例如PSA(對於前列腺癌))或致瘤抗原之量測、疼痛或麻痹降低；語言、視覺、呼吸或其他與腫瘤相關之失能得到改良；食慾增加；或生活品質提高，如由經認可之測試或存活期延長量測。熟習此項技術者將顯而易見，劑量將視個體、贅生性病狀之類型、贅生性病狀之階段、贅生性病狀是否開始轉移至個體中之其他位置以及曾經使用之治療及並行治療而定。

3.組合療法

根據本發明，組合療法可尤其有效地降低或抑制非吾人所樂見之贅生性細胞增殖、降低癌症發生、降低或預防癌症復發或降低或預防癌症之擴散或轉移。在該等情況下，本發明之ADC藉由移除CSC(否則CSC將支援腫瘤塊及使腫瘤塊永續)及藉此實現現有護理減積或抗癌劑標準之更有效使用而可充當敏化劑或化學敏化劑。亦即，在某些實施例中，所揭示之ADC可提供增強之作用(例如性質上相加或協同)，其增強另一種所投與之治療劑之作用模式。在本發明之情形中，「組合療法」應廣泛加以解釋且僅係指DLL3 ADC及一或多種抗癌劑之投與，該等抗癌劑包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射線療法及放射治療劑、靶向抗癌劑(包括單株抗體及小分子實體)、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、輻射療法以及抗轉移劑及免疫治療劑，包括特異性及非特異性方法。

組合結果無需為當各治療(例如ADC及抗癌劑)獨立進行時所觀測到的作用之累加和。儘管一般需要至少累加作用，但超過單一療法之一的任何抗腫瘤作用增加亦為有益的。此外，本發明無需組合治療呈現協同作用。然而，熟習此項技術者應瞭解，在構成較佳實施例之某些所選組合下可觀測到協同作用。

在實踐組合療法時，DLL3結合物及抗癌劑可以單一組合物形式或以兩種或兩種以上使用相同或不同投與途經之不同組合物形式同時投與個體。或者，ADC可在抗癌劑治療之前或之後例如數分鐘至數週範圍內之時間間隔投與。各次遞送之間的時間週期使抗癌劑及結合物能夠對腫瘤發揮組合作用。在至少一個實施例中，抗癌劑及ADC係彼此在約5分鐘至約兩週內投與。在其他實施例中，投與DLL3 ADC與抗癌劑之間可間隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干個月(1、2、3、4、5、6、7或8)。

組合療法可投與一次、兩次或至少一段時間直至病狀得到治療、減輕或治癒。在一些實施例中，組合療法係分多次投與，例如每天三次至每六個月一次。可根據諸如每天三次、每天兩次、每天一次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次之時程進行投與，或可經由微型真空泵連續投與。如上文說明，組合療法可經由任何途徑投與。組合療法可投與遠離腫瘤位點之位點。

在一個實施例中，ADC係與一或多種用於短治療週期之抗癌劑組合投與有需要之個體。本發明亦涵蓋不連續投與或分成若干次部分投與之每日給藥。結合物及抗癌劑可在交替的天或週交替投與；或可進行一系列抗體治療，接著進行抗癌劑療法之一或多種治療。在任何情況下，如一般熟習此項技術者將理解，化學治療劑及所揭示之結合物之合適劑量將通常與臨床療法(其中化學療法係單獨或與其他化學 療法組合投與)中已使用之劑量類似。

在另一較佳實施例中，本發明之DLL3結合物可用於維持療法中以降低或消除疾病初始呈現後腫瘤復發概率。較佳地，病症將得到治療且初始腫瘤塊得以消除、減小或以其他方式改善，因此患者無症狀或得到緩解。此時可向個體投與醫藥學上有效量之所揭示之DLL3結合物一或多次，儘管使用標準診斷程序發現存在極少或不存在疾病之適應症。在一些實施例中，ADC將在一段時間內按規則時程投與，諸如每週一次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次或每年一次。根據本文中之教示，熟習此項技術者可容易地確定有利於降低疾病復發可能性之劑量及給藥方案。此外，視患者反應及臨床與診斷參數而定，該等治療可持續數週、數月、數年之時段或甚至無限期地持續。

在另一較佳實施例中，本發明之ADC可預防性使用或作為佐劑療法使用以預防或降低減積程序後腫瘤轉移之可能性。如本發明中所使用，減積程序廣泛定義且應意謂消除、減少、治療或改善腫瘤或腫瘤增生之任何程序、技術或方法。例示性減積程序包括(但不限於)手術、輻射治療(亦即束輻射)、化學療法、免疫療法或切除術。在本發明中，在熟習此項技術者可容易確定的合適時間，可如臨床、診斷或治療診斷程序所提示投與所揭示之ADC以降低腫瘤轉移。結合物可以醫藥學上有效劑量(如使用標準技術確定)投與一或多次。較佳給藥方案將由可對其進行改良之合適診斷或監測技術實現。

本發明之其他實施例包含向無症狀但具有發展增生性病症之風險的個體投與所揭示之DLL3結合物。亦即，本發明之結合物可以實際上預防意義使用且投與經檢驗或測試且具有一或多種所述風險因素(例如基因組適應症、家族史、活體內或活體外測試結果等)但未發展贅瘤形成之患者。在該等情況下，熟習此項技術者將能夠經由經驗觀 測或經由經認可的臨床實踐確定有效給藥方案。

4.抗癌劑

如本申請案中所論述，本發明之DLL3結合物可與抗癌劑組合使用。術語「抗癌劑」或「抗增生劑」意謂任何可用於治療細胞增生性病症(諸如癌症)之試劑，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射線療法及放射治療劑、靶向抗癌劑、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、輻射療法以及抗轉移劑及免疫治療劑。

如本文中所用，術語「細胞毒性劑」意謂對細胞具有毒性且可降低或抑制細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。在某些實施例中，該物質為來源於活生物體之天然存在之分子。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)細菌(例如白喉毒素(Diptheria toxin)、假單胞菌(Pseudomonas)內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A))、真菌(例如α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限麴菌素(restrictocin))、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒素、莫迪素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陸抗病毒蛋白質(pokeweed anti-viral protein)、沙泊寧(saporin)、gelonin(gelonin)、地膚子皂苷(momoridin)、栝蔞素(trichosanthin)、大麥毒素、油桐蛋白質(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白質(dianthin protein)、美洲大蠊蛋白質(Phytolacca mericana protein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑(Momordica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑(saponaria officinalis inhibitor)、白樹素(gelonin)、絲林黴素(mitegellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、新黴素(neomycin)及黴菌毒素(tricothecene))或動物(例如細胞毒性RNase，諸如細胞外胰臟RNase；DNase I，包括其片段及/或變異體)之小分子毒素或酶促活性毒素。

為達成本發明之目的，「化學治療劑」包含非特異性降低或抑制癌細胞之生長、增殖及/或存活的化合物(例如細胞毒性劑或細胞生長抑制劑)。該等化學試劑通常針對細胞生長或分裂所必需的細胞內過程，且因此對癌性細胞(其通常快速生長及分裂)尤其有效。舉例而言，長春新鹼(vincristine)使微管脫聚合，且因此抑制細胞進入有絲分裂。通常，化學治療劑可包括任何抑制或經設計以抑制癌性細胞或可能變為癌性或產生致瘤後代之細胞(例如TIC)的化學試劑。該等試劑通常組合投與且通常在以組合形式時最有效，例如在諸如CHOP或FOLFIRI之方案中。

可與本發明之DLL3 ADC組合使用之抗癌劑之實例包括(但不限於)烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、伸乙基亞胺及甲基阿美胺(methylamelamine)、多聚乙醯、喜樹鹼(camptothecin)、苔蘚抑素(bryostatin)、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、海兔毒素(dolastatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、伊留塞羅賓(eleutherobin)、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、斯邦士他汀(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、迪米星(dynemicin)、雙膦酸鹽、埃斯培拉黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克那黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C、卡拉賓辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN^® 阿黴素(ADRIAMYCIN^® doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycins)、派來黴素(peplomycin)、博地黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、克拉黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、百士欣(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、柔紅黴素(zorubicin)；抗代謝物、埃羅替尼(erlotinib)、威羅菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、索拉菲尼(sorafenib)、依魯替尼(ibrutinib)、恩雜魯胺(enzalutamide)、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺素、葉酸補充劑(諸如弗林酸(frolinic acid))、乙醯格雷酮(aceglatone)、醛磷醯胺醣苷、胺基乙醯丙酸、因尼拉爾(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、貝斯布希(bestrabucil)、比山群(bisantrene)、艾達西特(edatraxate)、迪夫法明(defofamine)、秋水仙鹼(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、艾普塞隆(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多醣(lentinan)、洛達尼(lonidainine)、類美登素(maytansinoids)、丙脒腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫丹莫耳(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、噴司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、足葉草酸(podophyllinic acid)、2-乙基肼、甲基苯甲肼、PSK^® 多醣複合物(PSK^® polysaccharide complex)(JHS Natural Products,Eugene,OR)、丙亞胺；根黴素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙基胺；新月毒素(trichothecenes)(尤其T-2毒素、維拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安歸定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖 (arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；紫杉毒素(taxoids)、瘤可寧(chloranbucil)；GEMZAR^® 吉姆他濱(GEMZAR^® gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物、長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE^® 長春瑞濱(NAVELBINE^® vinorelbine)；小藍莓(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視黃素；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；草酸鉑；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A之抑制劑(其降低細胞增殖)及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑、抑制調節腎上腺中之雌激素產生的芳香酶之芳香酶抑制劑及抗雄激素；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸；核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑；疫苗、PROLEUKIN^® rIL-2；LURTOTECAN^® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX^® rmRH；長春瑞賓及埃斯波黴素(Esperamicin)，及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。

尤其較佳抗癌劑包含市售或臨床可用化合物，諸如埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA®，Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(docetaxel)、(TAXOTERE®，Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS號51-21-8)、吉姆他濱(gemcitabine)(GEMZAR®，Lilly)、PD-0325901(CAS號391210-10-9，Pfizer)、順鉑(順二胺，二氯鉑(II)，CAS號15663-27-1)、卡鉑(CAS號41575-94-4)、太平洋紫杉 醇(paclitaxel)(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®，Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS號85622-93-1，TEMODAR®，TEMODAL®，Schering Plough)、塔莫昔酚(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N -二甲基乙胺，NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)及阿黴素(doxorubicin)(ADRIAMYCIN®)。其他市售或臨床可用抗癌劑包含草酸鉑(ELOXATIN®，Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®，Millennium Pharm.)、索坦(sutent)(SUNITINIB®，SU11248，Pfizer)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®，Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC®，Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®，AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(leucovorin/folinic acid)、雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE®，Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB®，GSK572016，Glaxo Smith Kline)、諾拉法尼(lonafarnib)(SARASAR^TM ，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR®，BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(gefitinib)(IRESSA®，AstraZeneca)、伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR®，CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(ZARNESTRA^TM ，Johnson & Johnson)、ABRAXANE^TM (無十六醇聚氧乙烯醚)、太平洋紫杉醇之經白蛋白工程改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg,I1)、範德替尼(vandetanib)(rINN，ZD6474，ZACTIMA®，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、坦羅莫司(temsirolimus)(TORISEL®，Wyeth)、帕佐潘尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、堪佛司非米德(canfosfamide)(TELCYTA®，Telik)、噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN®，NEOSAR®)；長春瑞濱(NAVELBINE®)；卡培他濱(capecitabine)(XELODA®，Roche)、塔莫昔酚(包括NOLVADEX®；檸檬酸塔莫昔酚、FARESTON®(檸檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))、MEGASE®(乙酸甲地孕酮)、AROMASIN®(西美斯坦(exemestane)；Pfizer)、服美斯坦(formestanie))、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏羅唑(vorozole))、FEMARA®(來曲唑(letrozole)；Novartis)及ARIMIDEX®(安那唑(anastrozole)；AstraZeneca)。

在其他實施例中，本發明之DLL3結合物可與當前處於臨床試驗或市售之多種抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。為此，所揭示之DLL3結合物可與選自由以下組成之群之抗體組合使用：阿巴沃單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿夫土珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿瑪圖單抗(amatuximab)、阿納圖單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、巴韋圖單抗(bavituximab)、貝托莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、比瓦珠單抗(bivatuzumab)、布里納單抗(blinatumomab)、貝土西單抗(brentuximab)、坎土珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、西瓦圖單抗(clivatuzumab)、康納單抗(conatumumab)、達雷木單抗(daratumumab)、多茲圖單抗(drozitumab)、杜利圖單抗(duligotumab)、杜斯圖單抗(dusigitumab)、 地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、埃克昔單抗(ecromeximab)、埃洛珠單抗(elotuzumab)、恩斯圖單抗(ensituximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、法樂珠單抗(farletuzumab)、非拉珠單抗(ficlatuzumab)、非圖木單抗(figitumumab)、福沃圖單抗(flanvotumab)、福圖西單抗(futuximab)、蓋尼圖單抗(ganitumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、吉樂木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、伊加圖單抗(imgatuzumab)、因達西單抗(indatuximab)、依諾珠單抗(inotuzumab)、因特圖單抗(intetumumab)、伊派利單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛沃圖單抗(lorvotuzumab)、盧卡圖單抗(lucatumumab)、瑪帕單抗(mapatumumab)、馬圖珠單抗(matuzumab)、米拉圖單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米圖單抗(mitumomab)、莫西圖單抗(moxetumomab)、拉納圖單抗(narnatumab)、那圖莫單抗(naptumomab)、尼西圖單抗(necitumumab)、尼莫珠單抗(nimotuzumab)、諾非圖單抗(nofetumomabn)、奧卡拉單抗(ocaratuzumab)、奧法圖單抗(ofatumumab)、奧拉珠單抗(olaratumab)、奧納珠單抗(onartuzumab)、奧珀珠單抗(oportuzumab)、奧瑞沃單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕撒圖單抗(parsatuzumab)、帕瑞圖單抗(patritumab)、派圖單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥單抗(pintumomab)、普瑞木單抗(pritumumab)、拉克圖單抗(racotumomab)、拉木西單抗(ramucirumab)、拉德瑞單抗(radretumab)、瑞洛圖單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅 妥木單抗(robatumumab)、薩土莫單抗(satumomab)、西博珠單抗(sibrotuzumab)、西圖昔單抗(siltuximab)、斯圖珠單抗(simtuzumab)、索利托單抗(solitomab)、塔卡珠單抗(tacatuzumab)、他普莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替妥木單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、圖土珠單抗(tucotuzumab)、烏利昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃瑟珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮圖木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8及其組合。

其他尤其較佳實施例將包含抗體在測試中或認可用於癌症療法之用途，包括(但不限於)利妥昔單抗、曲妥珠單抗、奧吉妥單抗(gemtuzumab ozogamcin)、阿侖單抗、替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、拉木西單抗、奧法圖單抗、伊派利單抗及維汀貝土西單抗(brentuximab vedotin)。熟習此項技術者將能夠容易地鑑別其他與本文中之教示相容的抗癌劑。

5.放射線療法

本發明亦提供DLL3結合物與放射線療法(亦即任何用於誘導腫瘤細胞內局部DNA損害之機制，諸如γ輻射、X射線、UV輻射、微波、電子發射及其類似物)之組合。亦涵蓋使用放射性同位素至腫瘤細胞之直接遞送之組合療法，且所揭示之結合物可與靶向抗癌劑或其他靶向手段結合使用。通常，放射線療法經約1週至約2週之時段以脈衝形式投與。放射線療法可投與患有頭頸癌之個體持續約6週至7週。視情況，放射線療法可以單次劑量或以多次連續劑量投與。

VII. 適應症

應瞭解，本發明之ADC可用於治療、預防、管理或抑制任何 DLL3相關病症之發生或復發。因此，無論單獨投與或與抗癌劑或放射線療法以組合形式投與，本發明之ADC尤其適用於通常治療患者或個體中之贅生性病狀，其包括良性或惡性腫瘤(例如腎上腺、肝臟、腎、膀胱、乳房、胃、卵巢、結腸直腸的、前列腺、胰臟、肺、甲狀腺、肝、子宮頸、子宮內膜、食道及子宮癌瘤；肉瘤；神經膠母細胞瘤；及各種頭頸腫瘤)；白血病及淋巴惡性腫瘤；其他病症，諸如神經元、神經膠質、星形細胞、下丘腦及其他腺、巨噬細胞、上皮、基質及囊胚腔病症；以及發炎性、血管生成、免疫病症及由病原體引起之病症。特定言之，關鍵治療目標為贅生性病狀，包含實體腫瘤，但本發明之範疇涵蓋血液惡性腫瘤。

如本文中所用之術語「治療」在治療病狀之情形中通常係關於治療及療法(無論人類或動物(例如在獸醫應用中))，其中實現一些所需治療作用，例如抑制病狀發展，且包括發展速率降低、發展速率停止、病狀消退、病狀之改善及病狀之治癒。亦包括作為預防措施(亦即防範、預防)之治療。

如本文中所用之術語「治療有效量」係關於活性化合物或包含活性化合物之物質、組合物或劑量的量，其在根據所需治療方案投與時可有效產生一些所需治療作用，與合理的效益/風險比率相稱。

類似地，如本文中所用之術語「預防有效量」係關於活性化合物或包含活性化合物之物質、組合物或劑量的量，其在根據所需治療方案投與時可有效產生一些所需預防作用，與合理的效益/風險比率相稱。

更特定言之，根據本發明經受治療之贅生性病狀可選自包括(但不限於)以下之群：腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、骨癌(釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦癌及脊髓癌、轉移性 腦腫瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞型腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細胞瘤、促結締組織增生小圓形細胞腫瘤、室管膜瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維性結構不良、膽囊癌及膽管癌、妊娠期滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、胰島細胞瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎母細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、神經管母細胞瘤、黑素瘤、脊膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經母細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒童癌症、周邊神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕見血液病症、轉移性腎癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、轉移性甲狀腺癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。

在某些較佳實施例中，增生性病症將包含實體腫瘤，包括(但不限於)腎上腺、肝臟、腎、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宮頸、子宮、食道、結腸直腸、前列腺、胰臟、肺(小細胞及非小細胞)、甲狀腺、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他較佳實施例中，且如以下實例中所示，所揭示之ADC可尤其有效治療小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在一個實施例中，肺癌為頑抗性、復發性或對以鉑為主之藥劑(例如卡鉑、順鉑、草酸鉑、拓撲替康(topotecan))及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉若他賽(larotaxel)或卡巴他 賽(cabazitaxel))具有抗性。

在尤其較佳實施例中，所揭示之ADC可用於治療小細胞肺癌。關於該等實施例，結合之調節子可投與呈現侷限期(limited stage)疾病之患者。在其他實施例中，所揭示之ADC將投與呈現擴散期(extensive stage)疾病之患者。在其他較佳實施例中，所揭示之ADC將投與頑抗性患者(亦即在初始療程期間或在初始療程完成之後不久復發之患者)或復發性小細胞肺癌患者。其他實施例包含向敏感患者(亦即在基本療法後超過2-3個月復發之患者)投與所揭示之ADC。在各種情況下，應瞭解，視所選給藥方案及臨床診斷而定，相容ADC可與其他抗癌劑組合使用。

如上文所論述，所揭示之ADC可進一步用於預防、治療或診斷具有神經內分泌特徵之腫瘤或包括神經內分泌腫瘤之表現型。由擴散之內分泌系統引起之真性或正則神經內分泌腫瘤(NET)相對罕見，其發病率為每100,000人中2-5名，但具有高侵襲性。神經內分泌腫瘤在腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(骨髓甲狀腺癌)及肺(小細胞肺癌瘤及大細胞神經內分泌癌瘤)中發生。此等腫瘤可分泌若干種激素，包括血清素及/或嗜鉻粒蛋白A，其可引起衰竭性症狀，稱為類癌瘤症候群。該等腫瘤可由陽性免疫組織化學標記(諸如神經元特異性烯醇酶(NSE，亦稱為γ烯醇酶，基因符號=ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜鉻粒蛋白A(CHGA)及突觸素(SYP))或已知呈現升高之表現的基因(諸如ASCL1)表示。不幸的是，傳統化學療法通常無法尤其有效地治療NET及肝臟轉移。

儘管所揭示之ADC可有利地用於治療神經內分泌腫瘤，但其亦可用於治療、預防或診斷偽神經內分泌腫瘤(pNET)，該等偽神經內分泌腫瘤以基因型方式或以表現型方式模仿、類似或呈現與正則神經內 分泌腫瘤之共有特性。偽神經內分泌腫瘤或具有神經內分泌特徵之腫瘤為由彌漫性神經內分泌系統之細胞或其中神經內分泌分化級聯在致癌過程期間異常再活化之細胞引起之腫瘤。該等pNET通常與傳統定義之神經內分泌腫瘤共有某些表現型或生物化學特徵，包括產生生物學活性胺、神經傳遞素及肽激素之子集的能力。組織學上，該等腫瘤(NET及pNET)共有共同外觀，其通常展示密集連接之具有最小細胞質(無刺激細胞病理學)及圓形至橢圓形點狀細胞核之小細胞。為達成本發明之目的，可用於定義神經內分泌及偽神經內分泌腫瘤之通常表現之組織學標記或遺傳標記包括(但不限於)嗜鉻粒蛋白A、CD56、突觸素、PGP9.5、ASCL1及神經元特異性烯醇酶(NSE)。

因此，本發明之ADC可有利地用於治療偽神經內分泌腫瘤及正則神經內分泌腫瘤。在此方面，ADC可如本文中所描述用於治療腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(骨髓甲狀腺癌)及肺(小細胞肺癌瘤及大細胞神經內分泌癌瘤)中產生之神經內分泌腫瘤(NET及pNET)。此外，本發明之ADC可用於治療表現一或多種選自由NSE、CD56、突觸素、嗜鉻粒蛋白A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)組成之群之標記的腫瘤。亦即，本發明可用於治療罹患腫瘤(其為NSE⁺ 或CD56⁺ 或PGP9.5⁺ 或ASCL1⁺ 或SYP⁺ 或CHGA⁺ 或其一些組合)之個體。

關於血液科惡性疾病，應進一步瞭解，本發明之化合物及方法可尤其有效治療各種B細胞淋巴瘤，包括低度/NHL濾泡性細胞淋巴瘤(FCC)、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL、高度免疫母細胞性NHL、高度淋巴母細胞性NHL、高度小無核裂細胞NHL、巨瘤性NHL、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、彌漫 性大細胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma；BL)、AIDS相關淋巴瘤、單核細胞性B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴腺病、小淋巴細胞性、濾泡性、彌漫性大細胞、彌漫性小核裂細胞、大細胞免疫母細胞性淋巴母細胞瘤、小無核裂性伯基特與非伯基特濾泡性、主要大細胞淋巴瘤；濾泡性、主要小核裂細胞淋巴瘤；及濾泡性、混合小核裂細胞與大細胞淋巴瘤。參見Gaidono等人，「Lymphomas」,IN CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY，第2卷：2131-2145(DeVita等人編，第5期增刊1997)。熟習此項技術者應瞭解，由於改變分類系統，故此等淋巴瘤通常將具有不同名稱，且具有歸類為不同名稱之淋巴瘤的患者亦可受益於本發明之組合治療方案。

本發明亦提供呈現良性或癌前腫瘤之個體之預防性或防範性治療。除DLL3相關病症外，咸信使用本發明之治療亦不應排除任何特定類型之腫瘤或增生性病症。然而，腫瘤細胞之類型可與本發明與第二治療劑、尤其化學治療劑及靶向抗癌劑之組合之使用有關。

所治療之「個體」或「患者」較佳為人類，但如本文中所用，該等術語明確地始終包含任何物種，包括所有哺乳動物。因此個體/患者可為動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋動物(例如袋鼠、袋熊)、單孔科動物(例如鴨嘴獸(duckbilled platypus))、嚙齒動物(例如天竺鼠、倉鼠、大鼠、小鼠)、鼠類(例如小鼠)、兔類動物(例如兔)、鳥類動物(例如鳥)、犬科動物(例如狗)、貓科動物(例如貓)、馬科動物(例如馬)、豬科動物(例如豬)、羊(例如綿羊)、牛(例如母牛)、靈長類動物、猿類(例如猴子或猿)、猴子(例如狨猿、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、長臂猿)或人類。

VIII. 製品

亦提供包含一或多個容器之醫藥封裝及套組，該一或多個容器 包含一或多種劑量之DLL3 ADC。在某些實施例中。提供單位劑量，其中單位劑量含有預定量之包含例如抗DLL3結合物之組合物(具有或不具有一或多種其他試劑)。對於其他實施例，該單位劑量供應於用於注射之單一用途預填充注射器中。在其他實施例中，單位劑量中所含之組合物可包含生理食鹽水、蔗糖或其類似物；緩衝液，諸如磷酸鹽或其類似物；及/或調配在穩定且有效的pH值範圍內。或者，在某些實施例中，結合物組合物可以凍乾粉末形式提供，其可在添加合適液體(例如無菌水或生理食鹽水溶液)時復原。在某些較佳實施例中，組合物包含一或多種抑制蛋白質聚集之物質，其包括(但不限於)蔗糖及精胺酸。容器上或與容器相關之任何標記均指示密封之結合物組合物係用於治療所選贅生性疾病病狀。

本發明亦提供用於產生DLL3結合物及視情況選用之一或多種抗癌劑之單劑量或多劑量投與單元之套組。套組包含容器及容器上或與容器相關之標記或藥品說明書。合適容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成且含有醫藥學上有效量之呈結合或未結合形式之所揭示之DLL3結合物。在其他較佳實施例中，容器包含無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之阻塞物的小瓶)。該等套組將通常在合適容器中含有DLL3結合物之醫藥學上可接受之調配物及相同或不同容器中之視情況選用之一或多種抗癌劑。套組亦可含有用於診斷或組合療法之其他醫藥學上可接受之調配物。舉例而言，除本發明之DLL3結合物外，該等套組可含有多種抗癌劑中之任一或多者，諸如化學療法或放射治療藥物；抗血管生成劑；抗轉移劑；靶向抗癌劑；細胞毒性劑；及/或其他抗癌劑。

更特定言之，套組可具有單一容器，該單一容器含有DLL3 ADC且具有或不具有其他組分，或其可具有用於各種所需試劑之不同容 器。當提供組合治療劑進行結合時，可將單一溶液以莫耳當量組合形式或以一種組分超過其他組分形式預混合。或者，套組中之DLL3結合物及任何視情況選用之抗癌劑可在投與患者之前在不同容器內單獨保存。套組亦可包含用於含有醫藥學上可接受之無菌緩衝液或其他稀釋劑的第二/第三容器構件，該緩衝液或稀釋劑為諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。

當套組之組分係以一或多種液體溶液形式提供時，液體溶液較佳為水溶液，其中尤其較佳為無菌水溶液或生理食鹽水溶液。然而，套組之組分可以乾粉形式提供。當試劑或組分以乾粉形式提供時，該粉末可藉由添加合適溶劑來復原。預想該溶劑亦可提供於另一容器中。

如上文簡要說明，套組亦可含有用於投與動物或患者抗體結合物及任何視情況選用之組分的構件，例如一或多種針、靜脈內袋或注射器或甚至滴管、吸管或其他該類設備，該等設備可用於將調配物注入或引入動物中或施用於身體之患病區域。本發明之套組亦通常包括用於含有小瓶或諸如此類之構件，及市售之其他密閉組件，例如置放及保存所需小瓶及其他設備之射出成形或吹塑成形塑膠容器。任何標記或藥品說明書均指示DLL3結合物組合物係用於治療癌症，例如小細胞肺癌。

在其他較佳實施例中，本發明之結合物可與適用於預防或治療增生性病症之診斷或治療性裝置結合使用或包含該等裝置。舉例而言，在一個較佳實施例中，本發明之化合物及組合物可與某些診斷裝置或器具組合，該等診斷裝置或器具可用於偵測、監測、定量或探測與增生性病症之病源學或表現有關的細胞或標記化合物。對於所選實施例，標記化合物可包含NSE、CD56、突觸素、嗜鉻粒蛋白A及PGP9.5。

在尤其較佳實施例中，裝置可用於活體內或活體外偵測、監測及/或定量循環腫瘤細胞(參見例如WO 2012/0128801，其以引用的方式併入本文中)。在其他較佳實施例中且如上文所論述，循環腫瘤細胞可包含癌症幹細胞。

[此頁剩餘部分係故意空白] IX.序列表概述

本申請案附有包含多種核酸及胺基酸序列之序列表。以下表2提供所包括之序列之概述。

X. 其他內容

除非本文另有定義，否則與本發明結合使用之科學及技術術語應具有由普通熟習此項技術者所通常理解之含義。此外，除非上下文 另有所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。更特定言之，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「蛋白質」包括複數個蛋白質；提及「細胞」包括細胞混合物及其類似物。此外，說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包括端點及端點之間的所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及2.0與3.0之間的所有點。

通常，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交結合使用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用之命名法及技術。除非另有指示，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書中通篇引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所述來進行。參見例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第6版，W.B.Saunders Company(2010)；Sambrook J.及Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology ,Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane,Using Antibodies：A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science ,Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書，如此項技術中通常所實現或如本文中所述執行。關於本文中所描述之分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學使用之命名法及該等學科之實驗方法及技術為此項技術中熟知及常用的。此外，本文中所使用之任何章節標題係僅用於組織目的且不應視為限制所描述之標的物。

本文中使用之某些縮寫：

實例

參考以下實例將更容易瞭解上文由此大體上描述之本發明，該等實例係以說明之方式提供且不欲限制本發明。該等實例不欲表示以下實驗為所進行之全部或唯一實驗。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或近大氣壓。

實例1

製造PBD藥物-連接子化合物

PBD藥物-連接子化合物DL1-DL5係合成如下：

A. 一般實驗方法

旋光度係用ADP 220偏光計(Bellingham Stanley Ltd.)量測且濃度(c )以g/100mL給出。熔點係使用數位熔點設備(Electrothermal)量測。IR光譜係用Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR光譜儀記錄。¹ H及¹³ C NMR光譜係分別在400MHz及100MHz下使用Bruker Avance NMR光譜儀在300K下獲得。化學位移係相對於TMS(δ=0.0ppm)報導，且信號指定為s(單峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、dt(雙三重峰)、dd(雙二重峰)、ddd(雙重雙二重峰)或m(多重峰)，其中偶合常數以赫茲(Hz)給出。質譜分析(MS)資料係使用耦接至具有Waters 2996 PDA之Waters 2695 HPLC之Waters Micromass ZQ器具收集。所用Waters Micromass ZQ參數為：毛細管(kV)，3.38；錐體(V)，35；提取器(V)，3.0；源溫度(℃)，100；去溶劑化溫度(℃)，200；錐體流動速率 (L/h)，50；去溶劑化流動速率(L/h)，250。高解析度質譜分析(HRMS)資料係在Waters Micromass QTOF Global上在陽性W模式下使用經金屬塗佈之硼矽玻璃尖端將樣品引入器具中來記錄。薄層層析(TLC)係在矽膠鋁板(Merck 60，F₂₅₄ )上進行，且急驟層析利用矽膠(Merck 60，230-400目ASTM)。除HOBt(NovaBiochem)及固體負載試劑(Argonaut)外，所有其他化學品及溶劑均係購自Sigma-Aldrich且未經進一步純化即按原樣使用。無水溶劑係藉由在乾燥氮氣氛圍下在合適乾燥劑存在下蒸餾而製備，且經由4Å分子篩或鈉線儲存。石油醚係指在40℃-60℃沸騰之部分。

在產生所揭示之化合物時，LC/MS係使用兩種略微不同的程序進行。預設程序為所描述之第一種方法，除非另有說明，否則使用第一種方法。

方法1(預設方法，除非另有說明，否則使用該方法) -HPLC(Waters Alliance 2695)係使用水(A)(甲酸0.1%)及乙腈(B)(甲酸0.1%)之移動相進行。梯度：初始組成5% B保持1.0分鐘，接著經3分鐘週期自5% B增加至95% B。該組成在95% B下保持0.1分鐘，接著在0.03分鐘內返回至5% B且保持0.87分鐘。總梯度運行時間等於5分鐘。

方法2 -HPLC(Waters Alliance 2695)係使用水(A)(甲酸0.1%)及乙腈(B)(甲酸0.1%)之移動相進行。梯度：初始組成5% B保持1.0分鐘，接著經2.5分鐘週期自5% B增加至95% B。該組成在95% B下保持0.5分鐘，接著在0.1分鐘內返回至5% B且保持0.9分鐘。總梯度運行時間等於5分鐘。

在兩種方法中流動速率均為3.0mL/min，經由進入質譜儀中之零怠體積T形連接件分離400μL。波長偵測範圍：220nm至400nm。功能類型：二極體陣列(535次掃描)。管柱：Phenomenex Onyx Monolithic C18 50×4.60mm。

逆相急驟純化條件如下：Flash純化系統(Varian 971-Fp)係使用水(A)及乙腈(B)之移動相進行。梯度：初始組成5% B歷經20C.V.(管柱體積)接著在60C.V內自5% B達到70% B。該組成在95% B下保持15C.V.，且接著在5C.V.內返回至5% B且在5% B下保持10C.V.。總梯度運行時間等於120C.V.。流動速率6.0mL/min。波長偵測範圍：254nm。管柱：Agilent AX1372-1 SF10-5.5g C8。

製備型HPLC係進行如下：逆相超高效能液相層析(UPLC)係在以下尺寸之Phenomenex Gemini NX 5μ C-18管柱上進行：150×4.6mm(用於分析)，及150×21.20mm(用於製備工作)。所有UPLC實驗均在梯度條件下進行。所用溶離劑為溶劑A(具有0.1%甲酸之H₂ O)及溶劑B(具有0.1%甲酸之CH₃ CN)。所用流動速率為1.0ml/min(用於分析)及20.0ml/min(用於製備型HPLC)。偵測係在254nm及280nm下進行。

B. 合成藥物-連接子DL1(途徑1)

(a)1',3'-雙[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)苯氧基]丙烷(3)

偶氮二甲酸二異丙酯(71.3mL，73.2g，362mmol)在0℃-5℃(冰/丙酮)下在氮氣氛圍下經60分鐘時間逐滴添加至經頂置式攪拌之香子 蘭酸甲酯2 (60.0g，329mmol)及Ph₃ P(129.4g，494mmol)於無水THF(800mL)中之溶液中。反應混合物在0℃-5℃下再攪拌1小時，隨後經20分鐘時間逐滴添加1,3-丙二醇(11.4mL，12.0g，158mmol)於THF(12mL)中之溶液。使反應混合物升溫至室溫且攪拌5天。藉由真空過濾收集所得白色沈澱物3 ，用THF洗滌且在真空乾燥器中乾燥至恆重。產量=54.7g(84%(基於1,3-丙二醇))。由LC/MS發現純度令人滿意(3.20min(ES+)m/z (相對強度)427([M +Na]⁺ ,10)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.64(dd,2H,J =1.8,8.3Hz),7.54(d,2H,J =1.8Hz),6.93(d,2H,J =8.5Hz),4.30(t,4H,J =6.1Hz),3.90(s,6H),3.89(s,6H),2.40(p,2H,J =6.0Hz)。

(b)1',3'-雙[2-甲氧基-4-(甲氧基羰基)-5-硝基苯氧基]丙烷(4)

固體Cu(NO₃ )₂ .3H₂ O(81.5g，337.5mmol)在0℃-5℃(冰/丙酮)下緩慢添加至經頂置式攪拌之雙-酯3 (54.7g，135mmol)於乙酸酐(650mL)中之漿料中。反應混合物在0℃-5℃下攪拌1小時且接著升溫至室溫。發生輕度放熱(約40℃-50℃)，伴隨混合物變稠且在此階段觀測到NO₂ 逸出。再添加乙酸酐(300mL)且反應混合物在室溫下攪拌16小時。將反應混合物澆注至冰(約1.5L)上，攪拌且返回至室溫。藉由真空過濾收集所得黃色沈澱物且在乾燥器中乾燥得到呈黃色固體狀之所需雙-硝基化合物4 。產量=66.7g(100%)。由LC/MS發現純度令人滿意(3.25min(ES+)m/z (相對強度)517([M +Na]⁺ ,40)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.49(s,2H),7.06(s,2H),4.32(t,4H,J =6.0Hz),3.95(s,6H),3.90(s,6H),2.45-2.40(m,2H)。

(c)1',3'-雙(4-羧基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丙烷(5 )

甲酯4 (66.7g，135mmol)於THF(700mL)中之漿料用1N NaOH(700mL)處理且反應混合物在室溫下劇烈攪拌。攪拌4天後，漿料變為黑色溶液，其在減壓下經歷旋轉蒸發以移除THF。所得水性殘餘物 用濃鹽酸酸化至pH 1且收集無色沈澱物5且在真空烘箱中充分乾燥(50℃)。產量=54.5g(87%)。由LC/MS發現純度令人滿意(2.65min(ES+)m/z (相對強度)489([M +Na]⁺ ,30))；¹ H NMR(400MHz,DMSO-d ₆ )δ 7.62(s,2H),7.30(s,2H),4.29(t,4H,J =6.0Hz),3.85(s,6H),2.30-2.26(m,2H)。

(d)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙[(5-甲氧基-2-硝基-1,4-伸苯基)羰基]]雙[(2S,4R)-甲基-4-羥基吡咯啶-2-甲酸酯](6)

乙二醯氯(24.5mL，35.6g，281mmol)添加至經攪拌之硝基苯甲酸5 (43g，92.3mmol)及DMF(6mL)於無水DCM(600mL)中之懸浮液中。在初始起泡後，反應懸浮液變為溶液且混合物在室溫下攪拌16小時。藉由用MeOH處理反應混合物之樣品確認轉化成酸氯化物且藉由LC/MS觀測到所得雙-甲酯。藉由在減壓下蒸發移除大部分溶劑；所得濃縮溶液再溶解於最少量無水DCM中且用乙醚濕磨。藉由過濾收集所得黃色沈澱物，用冷的乙醚洗滌且在真空烘箱中在40℃下乾燥1小時。固體酸氯化物在-40℃(乾冰/CH₃ CN)下經25分鐘時間分批添加至經攪拌之(2S ,4R )-甲基-4-羥基吡咯啶-2-甲酸酯鹽酸鹽(38.1g，210mmol)及TEA(64.5mL，g，463mmol)於DCM(400mL)中之懸浮液中。反應立即完成，如由LC/MS(2.47min(ES+)m/z (相對強度)721([M +H]⁺ ,100)判斷。混合物用DCM(200mL)稀釋且用1N HCl(300mL)、飽和NaHCO₃ (300mL)、鹽水(400mL)洗滌，乾燥(MgSO₄ )，過濾且在真空中蒸發溶劑得到呈橙色固體狀之純的產物6 (66.7g，100%)。[α]²² _D =-46.1°(c =0.47,CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )(旋轉異構體)δ 7.63(s,2H),6.82(s,2H),4.79-4.72(m,2H),4.49-4.28(m,6H),3.96(s,6H),3.79(s,6H),3.46-3.38(m,2H),3.02(d,2H,J =11.1Hz),2.48-2.30(m,4H),2.29-2.04(m,4H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )(旋轉異構體)δ 172.4,166.7,154.6,148.4,137.2,127.0,109.7, 108.2,69.7,65.1,57.4,57.0,56.7,52.4,37.8,29.0；IR(ATR,CHCl₃ )3410(br),3010,2953,1741,1622,1577,1519,1455,1429,1334,1274,1211,1177,1072,1050,1008,871cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)721([M +H]⁺ ,47),388(80)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₃₁ H₃₆ N₄ O₁₆ m/z 721.2199，實驗值(ES⁺ )m/z 721.2227。

(e)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS,2R)-2-(羥基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](7)

方法A： 硝基-酯6 (44g，61.1mmol)於MeOH(2.8L)中之溶液添加至5L 3頸圓底燒瓶中之新近購買之Raney^® 鎳(約50g於H₂ O中之約50%漿料)及抗撞擊顆粒中。混合物在回流下加熱且接著用水合肼(21.6mL，22.2g，693mmol)於MeOH(200mL)中之溶液逐滴處理，此時觀測到劇烈起泡。當添加完成(約45分鐘)時，再小心添加Raney^® 鎳直至起泡停止且反應混合物之初始黃色褪色。混合物在回流下再加熱5分鐘，此時藉由TLC(90：10 v/v CHCl₃ /MeOH)及LC/MS(2.12min(ES+)m/z (相對強度)597([M +H]⁺ ,100))認為反應完成。反應混合物立即藉由真空抽吸經由含有矽藻土之燒結漏斗熱過濾。藉由在真空中蒸發使濾液體積降低，此時形成無色沈澱物，藉由過濾收集且在真空乾燥器中乾燥得到7 (31g，85%)。[α]²⁷ _D =+404°(c =0.10,DMF)；¹ H NMR(400MHz,DMSO-d ₆ )δ 10.2(s,2H,NH ),7.26(s,2H),6.73(s,2H),5.11(d,2H,J =3.98Hz,OH ),4.32-4.27(m,2H),4.19-4.07(m,6H),3.78(s,6H),3.62(dd,2H,J =12.1,3.60Hz),3.43(dd,2H,J =12.0,4.72Hz),2.67-2.57(m,2H),2.26(p,2H,J =5.90Hz),1.99-1.89(m,2H)；¹³ C NMR(100MHz,DMSO-d ₆ )δ 169.1,164.0,149.9,144.5,129.8,117.1,111.3,104.5,54.8,54.4,53.1,33.5,27.5；IR(ATR，純)3438,1680,1654,1610,1605,1516,1490,1434,1379,1263,1234, 1216,1177,1156,1115,1089,1038,1018,952,870cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)619([M +Na]⁺ ,10),597([M +H]⁺ ,52),445(12),326(11)；HRMS[M +H]⁺ 理論值C₂₉ H₃₂ N₄ O₁₀ m/z 597.2191，實驗值(ES⁺ )m/z 597.2205。

方法B： 10% Pd/C(7.5g，10% w/w)於DMF(40mL)中之懸浮液添加至硝基-酯6 (75g，104mmol)於DMF(360mL)中之溶液中。懸浮液在Parr氫化設備中氫化8小時。在氫攝取停止後，藉由LC/MS監測反應進展。藉由過濾移除固體Pd/C且濾液在真空(低於10mbar)中在40℃下藉由旋轉蒸發而濃縮，得到含有微量DMF及殘餘木炭之黑色油。殘餘物在水浴(旋轉蒸發器浴)上在40℃下於EtOH(500mL)中消化且所得懸浮液經矽藻土過濾且用乙醇(500mL)洗滌得到透明濾液。水合肼(10mL，321mmol)添加至溶液中且反應混合物在回流下加熱。20分鐘後，觀測到形成白色沈澱物且再繼續回流30分鐘。將混合物冷卻至室溫且藉由過濾擷取沈澱物，用乙醚(沈澱物之2：1體積)洗滌且在真空乾燥器中乾燥得到7 (50g，81%)。方法B之分析資料：與所得方法A之資料相同(旋光度、¹ H NMR、LC/MS及TLC)。

(f)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS,2R)-2-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-1,2,3,10,11,11a-六氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](8)

TBSCl(27.6g，182.9mmol)及咪唑(29.9g，438.8mmol)在0℃(冰/丙酮)下添加至渾濁的四內醯胺7 (21.8g，36.6mmol)於無水DMF(400mL)中之溶液中。混合物在氮氣氛圍下攪拌3小時，隨後認為反應完成，如藉由LC/MS(3.90min(ES+)m/z (相對強度)825([M +H]⁺ ,100)判斷。將反應混合物澆注至冰(約1.75L)上且在攪拌下升溫至室溫。藉由真空過濾收集所得白色沈澱物，用H₂ O、乙醚洗滌且在真空乾燥器中乾燥得到純的8 (30.1g，99%)。[α]²³ _D =+234°(c =0.41, CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.65(s,2H,NH ),7.44(s,2H),6.54(s,2H),4.50(p,2H,J =5.38Hz),4.21-4.10(m,6H),3.87(s,6H),3.73-3.63(m,4H),2.85-2.79(m,2H),2.36-2.29(m,2H),2.07-1.99(m,2H),0.86(s,18H),0.08(s,12H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )δ 170.4,165.7,151.4,146.6,129.7,118.9,112.8,105.3,69.2,65.4,56.3,55.7,54.2,35.2,28.7,25.7,18.0,-4.82及-4.86；IR(ATR,CHCl₃ )3235,2955,2926,2855,1698,1695,1603,1518,1491,1446,1380,1356,1251,1220,1120,1099,1033cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)825([M +H]⁺ ,62),721(14),440(38)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₄₁ H₆₀ N₄ O₁₀ Si₂ m/z 825.3921，實驗值(ES⁺ )m/z 825.3948。

(g)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS,2R)-2-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](9)

n-BuLi(68.3mL於己烷中之1.6M溶液，109mmol)在氮氣氛圍下於-30℃(乾冰/乙二醇)下逐滴添加至經攪拌之四內醯胺8 (30.08g，36.4mmol)於無水THF(600mL)中之懸浮液中。反應混合物在此溫度下攪拌1小時(現為紅橙色)，此時逐滴添加SEMCl(19.3mL，18.2g，109mmol)於無水THF(120mL)中之溶液。反應混合物緩慢升溫至室溫且在氮氣氛圍下攪拌16小時。認為反應完成，如藉由TLC(EtOAc)及LC/MS(4.77min(ES+)m/z (相對強度)1085([M +H]⁺ ,100)判斷。藉由在真空中蒸發移除THF且所得殘餘物溶解於EtOAc(750mL)中，用H₂ O(250mL)、鹽水(250mL)洗滌，乾燥(MgSO₄ )，過濾且在真空中蒸發得到粗的呈油狀之經N10-SEM保護之四內醯胺9(最大39.5g，100%)。產物未經純化即用於下一步驟中。[α]²³ _D =+163°(c =0.41,CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.33(s,2H),7.22(s,2H),5.47(d,2H,J =9.98Hz),4.68(d,2H,J =9.99Hz),4.57(p,2H,J =5.77 Hz),4.29-4.19(m,6H),3.89(s,6H),3.79-3.51(m,8H),2.87-2.81(m,2H),2.41(p,2H,J =5.81Hz),2.03-1.90(m,2H),1.02-0.81(m,22H),0.09(s,12H),0.01(s,18H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )δ 170.0,165.7,151.2,147.5,133.8,121.8,111.6,106.9,78.1,69.6,67.1,65.5,56.6,56.3,53.7,35.6,30.0,25.8,18.4,18.1,-1.24,-4.73；IR(ATR,CHCl₃ )2951,1685,1640,1606,1517,1462,1433,1360,1247,1127,1065cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)1113([M +Na]⁺ ,48),1085([M +H]⁺ ,100),1009(5),813(6)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₅₃ H₈₈ N₄ O₁₂ Si₄ m/z 1085.5548，實驗值(ES⁺ )m/z 1085.5542。

(h)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS,2R)-2-羥基-7-甲氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](10)

TBAF之溶液(150mL於THF中之1.0M溶液，150mmol)在室溫下添加至經攪拌之粗雙-矽烷基醚9 [84.0g(最大56.8g)，52.4mmol]於THF(800mL)中之溶液中。在攪拌1小時後，藉由TLC(95：5 v/v CHCl₃ /MeOH)分析反應混合物顯示反應完成。藉由在室溫下在減壓下蒸發移除THF且所得殘餘物溶解於EtOAc(500mL)中且用NH₄ Cl(300mL)洗滌。合併之有機層用鹽水(60mL)洗滌，乾燥(MgSO₄ )，過濾且在減壓下蒸發得到粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：100% CHCl₃ 至96：4 v/v CHCl₃ /MeOH)純化得到呈白色泡沫狀之純的四內醯胺10 (36.0g，79%)。LC/MS 3.33min(ES+)m/z (相對強度)879([M +Na]⁺ ,100),857([M +H]⁺ ,40)；[α]²³ _D =+202°(c =0.34,CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.28(s,2H),7.20(s,2H),5.44(d,2H,J =10.0Hz),4.72(d,2H,J =10.0Hz),4.61-4.58(m,2H),4.25(t,4H,J =5.83Hz),4.20-4.16(m,2H),3.91-3.85(m,8H),3.77-3.54(m,6H),3.01(寬單峰，2H,OH ),2.96-2.90(m,2H),2.38(p,2H,J =5.77Hz),2.11-2.05(m, 2H),1.00-0.91(m,4H),0.00(s,18H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )δ 169.5,165.9,151.3,147.4,133.7,121.5,111.6,106.9,79.4,69.3,67.2,65.2,56.5,56.2,54.1,35.2,29.1,18.4,-1.23；IR(ATR,CHCl₃ )2956,1684,1625,1604,1518,1464,1434,1361,1238,1058,1021cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)885([M +29]^+. ,70),857([M +H]⁺ ,100),711(8),448(17)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₄₁ H₆₀ N₄ O₁₂ Si₂ m/z 857.3819，實驗值(ES⁺ )m/z 857.3826。

(i)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS)-7-甲氧基-2-側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1,2,3,10,11,11a-六氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](11)

二醇10 (25.6g，30mmol，1當量)、NaOAc(6.9g，84mmol，2.8當量)及TEMPO(188mg，1.2mmol，0.04當量)在Ar下溶解於DCM(326mL)中。冷卻至-8℃(內部溫度)且經15分鐘分批添加TCCA(9.7g，42mmol，1.4當量)。30分鐘後TLC(EtOAc)及LC/MS[3.60min.(ES+)m/z (相對強度)854.21([M +H]⁺ ,40),(ES-)m/z (相對強度)887.07([M-H+Cl]^-. ,10)]指示反應完成。添加冷的DCM(200mL)且混合物經矽藻土墊過濾，隨後用飽和碳酸氫鈉/硫代硫酸鈉(1：1 v/v；200mL×2)之溶液洗滌。有機層藉由MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑得到黃色/橙色海綿狀物(25.4g，99%)。LC/MS[3.60min.(ES+)m/z (相對強度)854.21([M +H]⁺ ,40)；[α]²⁰ _D =+291°(c =0.26,CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.32(s,2H),7.25(s,2H),5.50(d,2H,J =10.1Hz),4.75(d,2H,J =10.1Hz),4.60(dd,2H,J =9.85,3.07Hz),4.31-4.18(m,6H),3.89-3.84(m,8H),3.78-3.62(m,4H),3.55(dd,2H,J =19.2,2.85Hz),2.76(dd,2H,J =19.2,9.90Hz),2.42(p,2H,J =5.77Hz),0.98-0.91(m,4H),0.00(s,18H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )δ 206.8,168.8,165.9,151.8,148.0,133.9,120.9,111.6,107.2, 78.2,67.3,65.6,56.3,54.9,52.4,37.4,29.0,18.4,-1.24；IR(ATR,CHCl₃ )2957,1763,1685,1644,1606,1516,1457,1434,1360,1247,1209,1098,1066,1023cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)881([M +29]^+. ,38),853([M +H]⁺ ,100),707(8),542(12)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₄₁ H₅₆ N₄ O₁₂ Si₂ m/z 853.3506，實驗值(ES⁺ )m/z 853.3502。

(j)1,1'-[[(丙-1,3-二基)二氧基]雙(11aS)-7-甲氧基-2-[[(三氟甲基)磺醯基]氧基]-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮呯-5,11-二酮](12)

無水2,6-二甲基吡啶(5.15mL，4.74g，44.2mmol)在氮氣氛圍下在-45℃(乾冰/乙腈)下一次性注射至經劇烈攪拌之雙-酮11 (6.08g，7.1mmol)於無水DCM(180mL)中之溶液中。快速地逐滴注射自新近打開之安瓿獲得之無水三氟甲磺酸酐(7.2mL，12.08g，42.8mmol)，同時保持溫度為-40℃或低於-40℃。反應混合物在-45℃下攪拌1小時，此時TLC(50/50 v/v正己烷/EtOAc)顯示起始物質完全耗盡。冷的反應混合物立即用DCM(200mL)稀釋且在劇烈搖動下用水(1×100mL)、5%棕檬酸溶液(1×200mL)、飽和NaHCO₃ (200mL)、鹽水(100mL)洗滌且乾燥(MgSO₄ )。過濾且在減壓下蒸發溶劑得到粗產物，其藉由急驟管柱層析(梯度溶離：90：10 v/v正己烷/EtOAc至70：30 v/v正己烷/EtOAc)純化得到呈黃色泡沫狀之雙-烯醇三氟甲磺酸酯12 (5.5g，70%)。LC/MS 4.32min(ES+)m/z (相對強度)1139([M +Na]⁺ ,20)；[α]²⁴ _D =+271°(c =0.18,CHCl₃ )；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.33(s,2H),7.26(s,2H),7.14(t,2H,J =1.97Hz),5.51(d,2H,J =10.1Hz),4.76(d,2H,J =10.1Hz),4.62(dd,2H,J =11.0,3.69Hz),4.32-4.23(m,4H),3.94-3.90(m,8H),3.81-3.64(m,4H),3.16(ddd,2H,J =16.3,11.0,2.36Hz),2.43(p,2H,J =5.85Hz),1.23-0.92(m,4H),0.02(s,18H)；¹³ C NMR(100MHz,CDCl₃ )δ 167.1,162.7,151.9,148.0,138.4, 133.6,120.2,118.8,111.9,107.4,78.6,67.5,65.6,56.7,56.3,30.8,29.0,18.4,-1.25；IR(ATR,CHCl₃ )2958,1690,1646,1605,1517,1456,1428,1360,1327,1207,1136,1096,1060,1022,938,913cm^-1 ；MS(ES⁺ )m/z (相對強度)1144([M +28]^+. ,100),1117([M +H]⁺ ,48),1041(40),578(8)；HRMS[M +H]^+. 理論值C₄₃ H₅₄ N₄ O₁₆ Si₂ S₂ F₆ m/z 1117.2491，實驗值(ES⁺ )m/z 1117.2465。

(a)(S)-三氟甲烷磺酸8-(3-(((S)-2-(4-胺基苯基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基酯(13 )

將Pd(PPh₃ )₄ (116.9mg，0.101mmol)添加至經攪拌之三氟甲磺酸雙-烯醇酯12 (5.65g，5.06mmol)、4-胺基苯基酸四甲基乙二醇酯(1 g，4.56mmol)、Na₂ CO₃ (2.46g，23.2mmol)、MeOH(37mL)、甲苯(74mL)及水(37mL)之混合物中。將反應混合物在氮氣氛圍下在30℃下攪拌24小時，此時所有酸酯耗盡。接著將反應混合物蒸發至乾燥，隨後殘餘物溶解於EtOAc(150mL)中且用H₂ O(2×100mL)、鹽水(150mL)洗滌，乾燥(MgSO₄ )，過濾且在減壓下蒸發得到粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：80：20 v/v己烷/EtOAc至60：40 v/v己烷/EtOAc)純化得到呈淺黃色泡沫狀之產物13 (2.4g，45%)。LC/MS 4.02min(ES+)m/z (相對強度)1060.21([M +H]⁺ ,100)；¹ H-NMR：(CDCl₃ ,400MHz)δ 7.40(s,1H),7.33(s,1H),7.27(bs,3H),7.24(d，2H,J =8.5Hz),7.15(t,1H,J =2.0Hz),6.66(d,2H,J =8.5Hz),5.52(d,2H,J =10.0Hz),4.77(d,1H,J =10.0Hz),4.76(d,1H,J =10.0Hz),4.62(dd,1H,J =3.7,11.0Hz),4.58(dd,1H,J =3.4,10.6Hz),4.29(t,4H,J =5.6Hz),4.00-3.85(m,8H),3.80-3.60(m,4H),3.16(ddd,1H,J =2.4,11.0,16.3Hz),3.11(ddd,1H,J =2.2,10.5,16.1Hz),2.43(p,2H,J =5.9Hz),1.1-0.9(m,4H),0.2(s,18H)。¹³ C-NMR：(CDCl₃ ,100MHz)δ 169.8,168.3,164.0,162.7,153.3,152.6,149.28,149.0,147.6,139.6,134.8,134.5,127.9,127.5,125.1,123.21,121.5,120.5,120.1,116.4,113.2,108.7,79.8,79.6,68.7,68.5,67.0,66.8,58.8,58.0,57.6,32.8,32.0,30.3,19.7,0.25。

(b)(S)-2-(4-胺基苯基)-8-(3-(((S)-2-環丙基-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(14 )

三苯胂(0.24g，0.8mmol)、氧化銀(I)(1.02g，4.4mmol)、環丙基酸(0.47g，5.5mmol)及起始物質13 (1.15g，1.1mmol)在氬氣氛 圍下溶解於二噁烷(30mL)中。磷酸三鉀(2.8g，13.2mmol)用杵棒及研缽研磨且快速添加至反應混合物中。將反應混合物抽成真空且用氬氣沖洗3次且加熱至71℃。添加鈀(II)雙(氯化苯甲腈)(84mg，0.22mmol)且將反應容器抽成真空且用氬氣沖洗3次。10分鐘後，獲取小樣本以藉由TLC(80：20 v/v乙酸乙酯/己烷)及LC/MS進行分析。30分鐘後，反應完成(LC/MS分析指示起始物質完全耗盡)且反應物經矽藻土過濾且濾板用乙酸乙酯(400mL)洗滌。濾液用水(2×200mL)及鹽水(2×200mL)洗滌。有機層用MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(30：70 v/v己烷/乙酸乙酯)純化得到呈橙色/黃色固體狀之產物14 (0.66g，63%)。方法1,LC/MS(3.85min(ES⁺ )m/z (相對強度)952.17([M +H]⁺ ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.36(d,2H,J =8.4Hz),7.30(s,1H),7.25-7.19(m,4H),6.68(s,1H),6.62(d,2H,J =8.4Hz),5.49(dd,2H,J =5.6,10.0Hz),4.73(明顯三重峰，2H,J =10.8Hz),4.54(dd,1H,J =3.2,10.4Hz),4.40(dd,1H,J =3.2,10.4Hz),4.29-4.23(m,4H),3.91-3.85(m,7H),3.80-3.71(m,2H),3.70-3.61(m,2H),3.38-3.32(m,1H),3.12-3.01(m,1H),2.50-2.69(m,1H),2.40(q,2H,J =5.6Hz),1.50-1.43(m,1H),0.99-0.71(m,6H),0.54-0.59(m,2H),0.00(s,18H)ppm。

(c)(S)-2-(4-胺基苯基)-8-(3-(((S)-2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-5(11aH)-酮(15 )

SEM二內醯胺14 (0.66g，0.69mmol)溶解於THF(23mL)中且在氬氣氛圍下冷卻至-78℃。經5分鐘逐滴添加Super-Hydride®溶液(1.7mL，1M於THF中)，同時監測溫度。20分鐘後，獲取小樣本且用水洗滌以用於LC/MS分析。添加水(50mL)且移除冷浴。萃取有機層且用鹽水(60mL)洗滌。合併之水層用CH₂ Cl₂ /MeOH(90/10 v/v)(2×50 mL)洗滌。合併之有機層用MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。粗產物溶解於MeOH(48mL)、CH₂ Cl₂ (18mL)及水(6mL)中，且添加足夠矽膠以得到黏稠的懸浮液。攪拌5天後，懸浮液經燒結漏斗過濾且用CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1)(約200mL)洗滌直至產物不再溶離。有機層用鹽水(2×70mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(100% CHCl₃ 至96/4 v/v CHCl₃ /MeOH)純化得到呈黃色固體狀之產物15 (302mg，66%)。方法1,LC/MS(2.42min(ES⁺ )m/z (相對強度)660.74([M +H]⁺ ,30)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.86(d,1H,J =3.6Hz),7.78(d,1H,J =3.6Hz),7.58-7.44(m,3H),7.34-7.20(m,3H),6.88-6.66(m,4H),4.35-4.15(m,6H),3.95-3.75(m,7H),3.39-3.22(m,1H),3.14-3.04(m,1H),2.93-2.85(m,1H),2.46-2.36(m,2H),1.49-1.41(m,1H),0.80-0.72(m,2H),0.58-0.51(明顯單峰，2H)ppm。

(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸烯丙酯(16 )

在用氬氣填充之經脫氣之圓底燒瓶中，HO-Ala-Val-alloc(149.6mg，0.549mmol)及EEDQ(135.8mg，0.549mmol)溶解於無水CH₂ Cl₂ /MeOH之9：1混合物(5mL)中。燒瓶包裹在鋁箔中且反應混合物在室溫下攪拌1小時，隨後添加起始物質15 (302mg，0.457mmol)。反應混合物在室溫下再攪拌40小時，隨後藉由在減壓下旋轉蒸發來移除揮發性物質(在反應後進行LC/MS,RT起始物質2.32分鐘，(ES⁺ 660.29([M +H]⁺ ,100))。粗產物藉由矽膠管柱層析(100% CHCl₃ 至90/10 v/v CHCl₃ /MeOH)直接純化得到純的產物(16 )，42%產率(174mg)。 方法2 LC/MS(2.70min(ES+)m/z (相對強度)914.73([M +H]^+. ,60),660.43(60),184.31(100))。

(e)(2S)-2-胺基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺(17 )

起始物質16 (170mg，0.185mmol)在填充有氬氣之圓底燒瓶中溶解於無水CH₂ Cl₂ (5mL)中，隨後添加吡咯啶(41μL，0.21mmol)。燒瓶用氬氣吹掃/再填充三次，隨後添加Pd(PPh₃ )₄ (14mg，0.084mmol)且重複沖洗操作。1小時後，觀測到起始物質完全耗盡(在反應後進行LC/MS)且將Et₂ O(50mL)添加至反應混合物中，攪拌反應混合物直至所有產物溶解於溶液中。固體經燒結漏斗過濾且用Et₂ O(2×25mL)洗滌兩次。更換收集燒瓶且分離之固體溶解於CHCl₃ (100mL或直至所有產物通過燒結漏斗)中。接著藉由在減壓下旋轉蒸發來移除揮發性物質，得到粗產物17 (168mg)，其直接用於下一步驟中。LC/MS方法2(2.70min(ES+)m/z (相對強度)830.27([M +H]^+. ,50),660.13(80),171.15(100))。

(f)N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(18 或DL1 )

在用氬氣吹掃及填充之圓底燒瓶中，起始物質17 (154mg，0.185mmol)及EDCI.HCl(110mg，0.185mmol)溶解於無水CH₂ Cl₂ (5mL)中。混合物在室溫下攪拌1小時，隨後添加PEG₈ -順丁烯二醯亞胺 (35.6mg，0.185mmol)且反應混合物再攪拌16小時(或直至反應完成，藉由LC/MS監測)。反應溶液用CH₂ Cl₂ (50mL)稀釋且有機物用H₂ O(50mL)及鹽水(50mL)洗滌，隨後經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發來移除溶劑，得到粗產物。藉由矽膠管柱層析(100% CHCl₃ 至85/15 v/v CHCl₃ /MeOH)純化得到所需產物(135mg)，然而觀測到殘餘微量的未反應之PEG₈ -順丁烯二醯亞胺(藉由LC/MS,2.21分鐘，方法2)。藉由自動逆相矽膠層析(H₂ O/CH₃ CN)(參見一般條件資訊)成功移除雜質，得到純的最終產物(18 ，37mg純產物，自110mg開始，33%)。總產率=17%。方法2 LC/MS(2.58min(ES+)m/z (相對強度)1404.03([M +H]⁺ ,20),702.63(100))。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.91(t,J =3.5Hz,1H),7.80(d,J =4.0Hz,1H),7.75(d,J =8.8Hz,1H),7.69(d,J =8.7Hz,1H),7.54-7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39-7.31(m,2H),6.87(d,J =10.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.72-6.68(m,2H),4.74-4.62(m,1H),4.45-4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67-3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J =10.2,5.2Hz,2H),3.16-3.07(m,1H),2.92(dd,J =16.1,4.1Hz,1H),2.62-2.49(m,4H),2.48-2.39(m,2H),2.37-2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52-1.44(m,3H),1.10-0.93(m,6H),0.79(dd,J =9.2,5.3Hz,2H),0.57(dd,J =9.2,5.3Hz,2H)，未觀測到NH。

C. 合成藥物-連接子DL1(途徑2)

(a)(R)-2-((R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙酸( 20b )

HO-Ala-Val-H20a (350mg，1.86mmol)及Na₂ CO₃ (493mg，4.65mmol)溶解於經蒸餾之H₂ O(15mL)中且混合物冷卻至0℃，隨後添加二噁烷(15mL)(發生胺基酸鹽之部分沈澱)。在劇烈攪拌下經10分鐘逐滴添加Fmoc-Cl(504mg，1.95mmol)於二噁烷(15mL)中之溶液。所得混合物在0℃下攪拌2小時，隨後移除冰浴且保持攪拌16小時。藉 由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑且殘餘物溶解於水(150mL)中。用1N HCl將pH值自9調節至2且接著水層用EtOAc(3×100mL)萃取。合併之有機物用鹽水(100mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除揮發性物質，得到純的HO-Ala-Val-Fmoc20b (746mg，97%產率)。LC/MS 2.85min(ES+)m/z (相對強度)410.60；¹ H-NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.79(d,J =7.77Hz,2H),7.60(d,J =7.77Hz,2H),7.43(d,J =7.5Hz,2H),7.34(d,J =7.5Hz,2H),6.30(bs,1H),5.30(bs,1H),4.71-7.56(m,1H),4.54-4.36(m,2H),4.08-3.91(m,1H),2.21-2.07(m,1H),1.50(d,J =7.1Hz,3H),1.06-0.90(m,6H)。

(b)((S)-3-甲基-1-側氧基-1-(((S)-1-側氧基-1-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼 -2-基)苯基)胺基)丙-2-基)胺基)丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(20 )

在經氬氣沖洗之燒瓶中，4-胺基苯基酸四甲基乙二醇酯(146.9mg，0.67mmol)添加至預先在室溫下攪拌30分鐘之HO-Ala-Val-Fmoc20b (330mg，0.8mmol)、DCC(166mg，0.8mmol)及DMAP(5mg，飽和)於無水DCM(8mL)中之溶液中。接著將反應混合物在室溫下攪拌隔夜。在反應後進行LCMS及TLC。反應混合物用CH₂ Cl₂ 稀釋且有機物用H₂ O及鹽水洗滌，接著經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑。將粗產物乾燥裝載至矽膠層析管柱(己烷/EtOAc，6：4)上且分離呈白色固體狀之純產物20 ，88%產率(360mg)。

(c)三氟甲烷磺酸8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基酯(21 )

雙-三氟甲磺酸酯12 (2.03g，1.81mmol)、酸四甲基乙二醇酯(1g，1.63mmol)及Na₂ CO₃ (881mg，8.31mmol)溶解於甲苯/MeOH/H₂ O之2：1：1混合物(40mL)中。反應燒瓶用氬氣吹掃及填充三次，隨後添加肆(三苯基膦)鈀(0)(41mg，0.035mmol)且將反應混合物加熱至30℃隔夜。在減壓下移除溶劑且殘餘物溶解於H₂ O(100mL)中且用EtOAc(3×100mL)萃取。合併之有機層用鹽水(100mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除揮發性物質。藉由矽膠管柱層析(己烷/EtOAc，8：2至25：75)純化粗產物得到純的21 ，33%產率(885mg)。LC/MS 3.85min(ES+)m/z (相對強度)1452.90；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.78-7.16(m,17H),7.13(s,1H),6.51-6.24(m,1H),5.51(dd,J =10.0,5.1Hz,2H),5.36-5.11(m,1H),4.74(dd,J =10.1,4.4Hz,2H),4.70-4.53(m,2H),4.47(d,J =6.4Hz,1H),4.37(d,J =7.2Hz,1H),4.27(m,4H),4.20-4.14(m,1H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.77(ddd,J =16.7,9.0,6.4Hz,3H),3.71-3.61(m,2H),3.24-2.91(m,3H),2.55-2.33(m,2H),2.22-2.07(m,1H),1.52-1.37(m,3H),1.04-0.86(m,10H),0.00(s,18H)。

(d)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(22 )

在氬氣氛圍下，將三苯胂(42mg，0.137mmol)添加至PBD-三氟甲磺酸酯21 (250mg，0.172mmol)、環丙基酸(73.9mg，0.86mmol)、氧化銀(159mg，0.688mmol)及磷酸三鉀(438mg，2.06mmol)於無水二噁烷(10mL)之混合物中。反應物用氬氣沖洗3次且添 加雙(苯甲腈)氯化鈀(II)(13.2mg，0.034mmol)。反應物再用氬氣沖洗3次，隨後溫至75℃且攪拌10分鐘。反應混合物經矽藻土墊過濾，接著用乙酸乙酯沖洗。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；1%甲醇/氯仿)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物22 (132mg，50%產率)。LC/MS 3.83min(ES+)m/z (相對強度)1345.91；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.88-7.14(m,17H),6.69(s,1H),6.45-6.25(m,1H),5.57-5.41(m,2H),5.34-5.14(m,1H),4.78-4.67(m,2H),4.62-4.55(m,1H),4.50-4.45(m,2H),4.51-4.44(m,1H),4.31-4.21(m，4H),4.16(m,1H),3.92(s,3H),3.86(s,3H),3.82-3.71(m,2H),3.66(m,3H),3.40-3.28(m,1H),3.07(m,1H),2.70-2.57(m,1H),2.47-2.36(m,2H),2.15(m,1H),1.51-1.40(m,3H),1.03-0.87(m,11H),0.77-0.71(m,2H),0.60-0.54(m,2H),0.00(t,J =3.0Hz,18H)。

(e)((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(23 )

Super-Hydride®之溶液(0.5mL，1M於THF中)在氬氣氛圍下在-78℃下逐滴添加至SEM二內醯胺22 (265mg，0.19mmol)於THF(10mL)之溶液中。添加係經5分鐘完成以便保持反應混合物之內部溫度恆定。20分鐘後，等分試樣用水淬滅以進行LC/MS分析，LC/MS分析表明反應完成。將水(20mL)添加至反應混合物中且移除冷浴。有機層用EtOAc(3×30mL)萃取且合併之有機物用鹽水(50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發來移除溶劑。粗產物溶解於MeOH(12mL)、CH₂ Cl₂ (6mL)、水(2mL)及足夠的矽膠中以形成 黏稠攪拌懸浮液。5天後，懸浮液經燒結漏斗過濾且用CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1)(200mL)洗滌直至產物溶離完成。有機層用鹽水(2×70mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(100% CHCl₃ 至96% CHCl₃ /4% MeOH)純化得到呈黃色固體狀之產物23 (162mg，78%)。LC/MS 3.02min(ES+)m/z (相對強度)1052.37。

(f)(2S)-2-胺基-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺(17 )

向SEM-二內醯胺23 (76mg，0.073mmol)於DMF(1mL)中之溶液中添加過量哌啶(0.2mL，2mmol)。混合物在室溫下攪拌20分鐘，此時反應完成(如由LC/MS監測)。反應混合物用CH₂ Cl₂ (75mL)稀釋且有機相用H₂ O(3×75mL)洗滌直至完全移除哌啶。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑，得到粗產物17 ，其按原樣用於下一步驟中。LC/MS 2.32min(ES+)m/z (相對強度)830.00。

(g)N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-環丙基-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(18 或DL1 )

EDCI鹽酸鹽(14mg，0.0732mmol)在氬氣氛圍下添加至順丁烯二醯亞胺-PEG₈ -酸(43.4mg，0.0732mmol)於無水CH₂ Cl₂ (5mL)中之懸浮液中。混合物在室溫下攪拌1小時，隨後添加PBD17 (60.7mg， 0.0732mmol)。保持攪拌直至反應完成(通常5小時)。反應物用CH₂ Cl₂ 稀釋且有機相用H₂ O及鹽水洗滌，接著經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。相繼藉由小心矽膠層析(以100% CHCl₃ 為起始物質至9：1 CHCl₃ /MeOH緩慢溶離)及逆相層析純化產物以移除未反應之順丁烯二醯亞胺-PEG₈ -酸。分離產物18 (DL1)(17.6%，21.8mg)。LC/MS 2.57min(ES+)m/z (相對強度)1405.30；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.91(t,J =3.5Hz,1H),7.80(d,J =4.0Hz,1H),7.75(d,J =8.8Hz,1H),7.69(d,J =8.7Hz,1H),7.54-7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39-7.31(m,2H),6.87(d,J =10.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.72-6.68(m,2H),4.74-4.62(m,1H),4.45-4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67-3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J =10.2,5.2Hz,2H),3.16-3.07(m,1H),2.92(dd,J =16.1,4.1Hz,1H),2.62-2.49(m,4H),2.48-2.39(m,2H),2.37-2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52-1.44(m,3H),1.10-0.93(m,6H),0.79(dd,J =9.2,5.3Hz,2H),0.57(dd,J =9.2,5.3Hz,2H)，未觀測到NH。

D. 合成藥物-連接子DL2(途徑1)

(a)(S )-三氟甲烷磺酸7-甲氧基-8-(3-(((S )-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基酯(24 )

Pd(PPh₃ )₄ (20.6mg，0.018mmol)添加至經攪拌之三氟甲磺酸雙-烯醇酯12 (500mg，0.44mmol)、N-甲基哌嗪酸酯(100mg，0.4mmol)、Na₂ CO₃ (218mg，2.05mmol)、MeOH(2.5mL)、甲苯(5mL)及水(2.5mL)之混合物中。將反應混合物在氮氣氛圍下在30℃下攪拌24小時，此時所有酸酯耗盡。接著將反應混合物蒸發至乾燥，隨後殘餘物溶解於EtOAc(100mL)中且用H₂ O(2×50mL)、鹽水(50mL)洗滌，乾燥(MgSO₄ )，過濾且在減壓下蒸發得到粗產物。藉由急驟層析(梯度溶離：80：20 v/v己烷/EtOAc至60：40 v/v己烷/EtOAc)純化得 到呈淺黃色泡沫狀之產物24 (122.6mg，25%)。

LC/MS 3.15min(ES+)m/z (相對強度)1144([M +H]⁺ ,20%)。

(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(25 )

PBD-三氟甲磺酸酯24 (359mg，0.314mmol)、酸四甲基乙二醇酯20 (250mg，0.408mmol)及三乙胺(0.35mL，2.51mmol)溶解於甲苯/MeOH/H₂ O之2：1：1混合物(3mL)中。微波容器用氬氣吹掃及填充三次，隨後添加肆(三苯基膦)鈀(0)(21.7mg，0.018mmol)且將反應混合物置放於微波中在80℃下保持10分鐘。接著，添加CH₂ Cl₂ (100mL)且有機物用水(2×50mL)及鹽水(50mL)洗滌，接著經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除揮發性物質。藉由矽膠管柱層析(CHCl₃ /EtOAc，100%至9：1)純化粗產物得到純的25 (200mg，43%產率)。LC/MS 3.27min(ES+)m/z (相對強度)1478([M +H]⁺ ,100%)。

(c)((S )-1-(((S )-1-((4-((S )-7-甲氧基-8-(3-(((S )-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(26 )

Super-Hydride®之溶液(0.34mL，1M於THF中)在氬氣氛圍下在-78℃下逐滴添加至SEM二內醯胺25 (200mg，0.135mmol)於THF(5mL)中之溶液中。添加係經5分鐘完成以便保持反應混合物之內部溫度恆定。20分鐘後，等分試樣用水淬滅以進行LC/MS分析，LC/MS分 析表明反應完成。將水(20mL)添加至反應混合物中且移除冷浴。有機層用EtOAc(3×30mL)萃取且合併之有機物用鹽水(50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發來移除溶劑。粗產物溶解於MeOH(6mL)、CH₂ Cl₂ (3mL)、水(1mL)及足夠的矽膠中以形成黏稠攪拌懸浮液。5天後，懸浮液經燒結漏斗過濾且用CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1)(100mL)洗滌直至產物溶離完成。有機層用鹽水(2×50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(100% CHCl₃ 至96% CHCl₃ /4% MeOH)純化得到呈黃色固體狀之產物26 (100mg，63%)。LC/MS 2.67min(ES+)m/z (相對強度)1186([M +H]⁺ ,5%)。

(d)(S )-2-胺基-N-((S )-1-((4-((R )-7-甲氧基-8-(3-(((R )-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺(27 )

向PBD26 (36.4mg，0.03mmol)於DMF(0.9mL)中之溶液中添加過量哌啶(0.1mL，1mmol)。混合物在室溫下攪拌20分鐘，此時反應完成(如由LC/MS監測)。反應混合物用CH₂ Cl₂ (50mL)稀釋且有機相用H₂ O(3×50mL)洗滌直至完全移除哌啶。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑，得到粗產物27 ，其按原樣用於下一步驟中。LC/MS 2.20min(ES+)m/z (相對強度)964([M +H]⁺ ,5%)。

(e)6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S )-1-(((S )-1-((4-((S )-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)- 1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)己醯胺(28或DL 2) 。

EDCI鹽酸鹽(4.7mg，0.03mmol)在氬氣氛圍下添加至6-馬來醯亞胺己酸(6.5mg，0.03mmol)於無水CH₂ Cl₂ (3mL)中之懸浮液中。混合物在室溫下攪拌1小時，隨後添加PBD27 (34mg，粗物質)。保持攪拌直至反應完成(6小時)。反應物用CH₂ Cl₂ 稀釋且有機相用H₂ O及鹽水洗滌，接著經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。相繼藉由小心矽膠層析(以100% CHCl₃ 為起始物質至9：1 CHCl₃ /MeOH緩慢溶離)及逆相層析純化產物以移除未反應之順丁烯二醯亞胺-PEG₈ -酸。經2個步驟分離產物28 (41%，14.6mg)。LC/MS 2.40min(ES+)m/z (相對強度)1157([M +H]⁺ ,5%)

E. 合成藥物-連接子DL2(途徑2)

PBD-三氟甲磺酸酯21 (469mg，0.323mmol)、酸四甲基乙二醇酯(146.5mg，0.484mmol)及Na₂ CO₃ (157mg，1.48mmol)溶解於甲苯/MeOH/H₂ O之2：1：1混合物(10mL)中。反應燒瓶用氬氣吹掃三次，隨後添加肆(三苯基膦)鈀(0)(7.41mg，0.0064mmol)且將反應混合物加熱至30℃隔夜。在減壓下移除溶劑且殘餘物溶解於H₂ O(50mL)中且用EtOAc(3×50mL)萃取。合併之有機層用鹽水(100mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除揮發性物質。藉由矽膠管柱層析(CHCl₃ 100%至CHCl₃ /MeOH 95%：5%)純化粗產物得到純的25 ，33%產率(885mg)。LC/MS 3.27min(ES+)m/z (相對強度)1478 ([M +H]⁺ ,100%)。

F. 合成藥物-連接子DL3(途徑1)

(a)(S)-2-(4-胺基苯基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(29 )

3,4-(亞甲二氧基)苯基酸(356mg，2.1mmol，1.3當量)、TEA(1.8mL，12.9mmol，8當量)及三氟甲磺酸酯/苯胺13 (1.75g，1.7mmol，1當量)在Ar氛圍下溶解於乙醇(7mL)、甲苯(13mL)及水(2 mL)之混合物中。將反應混合物抽成真空且用Ar沖洗3次，隨後添加肆(三苯基膦)鈀(0)(114mg，0.1mmol，0.06當量)。再次將燒瓶抽成真空且用Ar沖洗3次，且在微波中在80℃下加熱8分鐘，其中預先攪拌時間為30秒。TLC(80：20 v/v乙酸乙酯/己烷)分析指示起始物質完成耗盡。反應混合物用二氯甲烷(50mL)稀釋且用水(50mL)洗滌。有機層用MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(60：40至20：80 v/v己烷/乙酸乙酯)純化得到呈黃色固體狀之產物29 (1.21g，71%)。LC/MS(3.92min(ES⁺ )m/z (相對強度)1032.44([M +H]⁺ ,100)。

(b)(S)-2-(4-胺基苯基)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5(11aH)-酮(30 )

SEM二內醯胺29 (0.25g，0.24mmol，1當量)溶解於THF(8mL)中且在Ar氛圍下冷卻至-78℃。經5分鐘逐滴添加Super-Hydride®(0.6mL，1M於THF中，2.5當量)，同時監測溫度。20分鐘後，獲取小樣本且處理以用於LCMS分析。添加水(50mL)，移除冷浴且溶液用乙酸乙酯(50mL)洗滌。萃取有機層且用鹽水(60mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。粗產物溶解於EtOH(15mL)中，添加CH₂ Cl₂ (7.5mL)及水(2.5mL)以及足夠的矽膠直至其為黏稠懸浮液。攪拌5天後，經燒結漏斗過濾且用CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1)(100mL)洗滌直至產物不再溶離。有機層用鹽水(2×50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(具有1%至4% MeOH之CHCl₃ 梯度)純化得到呈黃色固體狀之產物30 (94mg，53%)。LC/MS(2.53min(ES⁺ )m/z (相對強度)739.64([M ]^+. ,70)。

(c)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5- 基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸烯丙酯(31 )

在Ar氛圍下，丙胺酸-纈胺酸-Alloc(180mg，0.66mmol，1.2當量)與EEDQ(163mg，0.66mmol，1.2當量)一起於無水CH₂ Cl₂ (21mL)及甲醇(1mL)中攪拌1小時。PBD30 (407mg，0.55mmol，1當量)溶解於無水CH₂ Cl₂ (21mL)及甲醇(1mL)中且添加至反應物中。在室溫下攪拌5天後，LC/MS證實大部分產物形成。在真空中移除溶劑，隨後藉由管柱層析(具有1%至6% MeOH之CH₂ Cl₂ 梯度)純化，得到呈黃色固體狀之產物31 (184mg，34%)。LC/MS(2.95min(ES⁺ )m/z (相對強度)994.95([M +H]⁺ ,60)。

(d)(S)-2-胺基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺(32 )

亞胺31 (100mg，0.1mmol，1當量)在Ar氛圍下溶解於無水DCM(10mL)中(借助於一滴甲醇幫助溶解)。逐滴添加吡咯啶(30μL，0.15mmol，1.5當量)，隨後將燒瓶抽成真空且用Ar沖洗三次。添加Pd(PPh₃ )₄ (7mg，6μmol，0.06當量)且將燒瓶抽成真空且用Ar沖洗三次。1小時後，LC/MS分析指示產物形成及起始物質完全耗盡。Et₂ O(60mL)添加至反應混合物中且攪拌直至所有產物溶解於溶液中。沈澱物經燒結漏斗過濾且用Et₂ O(2×20mL)洗滌兩次。更換收集燒瓶且使分離之固體溶解且與CHCl₃ (100mL)一起經燒結物洗滌。在真空中移除溶劑得到呈黃色固體狀之粗產物32 ，其直接用於下一步驟中。 LC/MS(1.14min(ES⁺ )m/z (相對強度)910.40([M +H]⁺ ,67)。

(e)N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)-1-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-醯胺(33 或DL 3 )

亞胺32 (92mg，0.1mmol，1.1當量)溶解於CHCl₃ (6mL)中，用一滴無水MeOH幫助溶解。相繼添加順丁烯二醯亞胺-PEG₈ -酸(53mg，0.09mmol，1當量)及EEDQ(33mg，0.14mmol，1.5當量)。在室溫下在Ar下劇烈攪拌4天直至LC/MS分析證實大部分產物形成。在真空中移除溶劑且藉由矽膠管柱層析(具有1%至10% MeOH之CHCl₃ 梯度)部分純化粗產物得到33 (81mg)。藉由製備型HPLC進一步純化物質得到呈黃色固體狀之33 (26.3mg，18%)。快速甲酸運行：LC/MS(1.39min(ES+)m/z(相對強度)1485.00([M +H]⁺ ,64)。

G.合成藥物-連接子DL3(途徑2)

(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-((2-(三甲基矽烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸9H-茀-9-基)甲酯(34 )

三氟甲磺酸酯21 (0.5g，0.35mmol，1當量)、3,4-(亞甲二氧基)苯基酸(75mg，0.45mmol，1.3當量)及Na₂ CO₃ (0.17g，1.6mmol，4.5當量)在Ar氛圍下溶解於甲苯(11mL)、EtOH(5.5mL)及水(5.5mL)中。將燒瓶抽成真空且用Ar沖洗三次。添加Pd(PPh₃ )₄ (24mg，0.02mmol，0.06當量)且再將燒瓶抽成真空且用Ar沖洗三次。加熱至30℃且攪拌隔夜。LC/MS分析證實起始物質完全耗盡。在真空中移除溶劑且殘餘物溶解於水(60mL)中，隨後用乙酸乙酯(60mL×3)洗滌。合併之有機層用鹽水(50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由管柱層析(50：50至25：75 v/v己烷/乙酸乙酯)純化得到呈 黃色固體狀之產物34 (310mg，64%)。LC/MS(1.44min(ES^- )m/z (相對強度)1423.35([M -H]^-. ,79)。

(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(35 )

SEM二內醯胺34 (0.31g，0.22mmol，1當量)溶解於THF(10mL)中且在Ar氛圍下冷卻至-78℃。經5分鐘逐滴添加Super-Hydride®(0.5mL，1M於THF中，2.5當量)，同時監測溫度。30分鐘後，獲取小樣本且處理以用於LC/MS分析。添加水(50mL)，移除冷浴且溶液用乙酸乙酯(50mL)洗滌。萃取有機層且用鹽水(60mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。粗產物溶解於EtOH(13.2mL)中，添加CH₂ Cl₂ (6.6mL)及水(2.2mL)以及足夠的矽膠直至其為黏稠懸浮液。攪拌5天後，經燒結漏斗過濾且用CH₂ Cl₂ /MeOH(9：1)(100mL)洗滌直至產物不再溶離。有機層用鹽水(2×50mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。藉由矽膠管柱層析(具有1%至4% MeOH之CHCl₃ 梯度)純化得到呈黃色固體狀之產物35 (185mg，75%)。LC/MS(1.70min(ES⁺ )m/z (相對強度)1132.85([M +H]⁺ ,60)。

(c)(S)-2-胺基-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(苯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-2-基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-3-甲基丁醯胺(32 )

亞胺35 (82mg，0.07mmol，1當量)溶解於DMF(1mL)中，隨後 緩慢添加(0.2mL，2mmol，過量)。此溶液在室溫下攪拌20分鐘直至LC/MS分析證實起始物質完全消耗。反應混合物用CH₂ Cl₂ (50mL)稀釋，用水(50mL×4)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空中移除溶劑。產物33 未經進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(1.15min(ES⁺ )m/z (相對強度)910.60([M +H]⁺ ,58)。

H. 合成藥物-連接子DL5

(i)(S)-(2-胺基-5-甲氧基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)(2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)甲酮(49)

(a)5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯甲醛(42 )

純三異丙基矽烷基氯(56.4mL，262mmol)添加至咪唑(48.7g，715.23mmol)與4-羥基-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛41 (47g，238mmol)之混合物中(在一起研磨)。加熱混合物直至酚及咪唑熔融及溶解於溶液中(100℃)。攪拌反應混合物15分鐘且接著使其冷卻，因此觀測到燒瓶底部形成固體(咪唑氯化物)。反應混合物用5% EtOAc/己烷稀釋且直接裝載於矽膠上，且襯墊相繼用5% EtOAc/己烷及10% EtOAc/己烷溶離(由於少量過量，因此在產物中發現極少量未反應之TIPSCl)。所需產物用含5%乙酸乙酯之己烷溶離。藉由在減壓下旋轉蒸發移除過 量溶離劑，接著在高真空下乾燥得到結晶感光固體(74.4g，88%)。由LC/MS發現純度令人滿意(4.22min(ES+)m/z (相對強度)353.88([M +H]⁺ ,100))；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 10.43(s,1H),7.60(s,1H),7.40(s,1H),3.96(s,3H),1.35-1.24(m,3H),1.10(m,18H)。

(b)5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)benzoic acid(43 )

亞氯酸鈉(47.3g，523mmol，80%工業級)及磷酸二氫鈉(35.2g，293mmol)(NaH₂ PO₄ )於水(800mL)中之溶液在室溫下添加至化合物2 (74g，209mmol)於四氫呋喃(500mL)中之溶液中。過氧化氫(60% w/w，140mL，2.93mol)立即添加至經劇烈攪拌之雙相混合物中。反應混合物逸出氣體(氧)，起始物質溶解且反應混合物之溫度上升至45℃。30分鐘後，LC/MS表明反應完成。反應混合物在冰浴中冷卻且添加鹽酸(1M)以將pH值降低至3(發現在許多實例中無需此步驟，因為pH值在反應結束時已為酸性；請檢查萃取之前的pH值)。接著反應混合物用乙酸乙酯(1L)萃取且有機相用鹽水(2×100mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。過濾有機相且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑，得到定量產率的呈黃色固體狀之產物43 。LC/MS(3.93min(ES-)m/z (相對強度)367.74([M -H]^- ,100))；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.36(s,1H),7.24(s,1H),3.93(s,3H),1.34-1.22(m,3H),1.10(m,18H)。

(c)((2S,4R)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-羥基吡咯啶-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)甲酮(45 )

DCC(29.2g，141mmol，1.2當量)在0℃下添加至酸3 (43.5g，117.8mmol，1當量)及羥基苯并三唑水合物(19.8g，129.6mmol，1.1當量)於二氯甲烷(200mL)中之溶液中。移除冷浴且反應在室溫下進行30分鐘，此時在氬氣下在-10℃下快速添加(2S,4R)-2-第三丁基二甲基矽烷氧基甲基-4-羥基吡咯啶44 (30g，129.6mmol，1.1當量)及三乙 胺(24.66mL，176mmol，1.5當量)於二氯甲烷(100mL)中之溶液(大規模，添加時間可藉由進一步冷卻反應混合物來縮短)。反應混合物在室溫下攪拌40分鐘至1小時且藉由LC/MS及TLC(EtOAc)監測。藉由經矽藻土過濾移除固體且有機相用冷的0.1M鹽酸水溶液洗滌直至量測到pH值為4或5。接著有機相用水洗滌，接著用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；梯度40/60乙酸乙酯/己烷至80/20乙酸乙酯/己烷)。藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑得到純的產物45 (45.5g純產物(66%)，且17g稍微不純的產物(共90%))。LC/MS 4.43min(ES+)m/z (相對強度)582.92([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.66(s,1H),6.74(s,1H),4.54(s,1H),4.40(s,1H),4.13(s,1H),3.86(s,3H),3.77(d,J =9.2Hz,1H),3.36(dd,J =11.3,4.5Hz,1H),3.14-3.02(m,1H),2.38-2.28(m,1H),2.10(ddd,J =13.3,8.4,2.2Hz,1H),1.36-1.19(m,3H),1.15-1.05(m,18H),0.91(s,9H),0.17-0.05(m,6H)，(存在旋轉異構體)。

(d)(S)-5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯甲醯基)吡咯啶-3-酮(46 )

在0℃下將TCCA(8.82g，40mmol，0.7當量)添加至經攪拌之45 (31.7g，54mmol，1當量)及TEMPO(0.85g，5.4mmol，0.1當量)於無水二氯甲烷(250mL)中之溶液中。反應混合物劇烈攪拌20分鐘，此時TLC(50/50乙酸乙酯/己烷)顯示起始物質完全耗盡。反應混合物經矽藻土過濾且濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)、硫代硫酸鈉(9g於300mL中)、鹽水(100mL)洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下旋轉蒸發得到定量產率的產物46。LC/MS 4.52min(ES+)m/z (相對強度)581.08([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.78-7.60(m,1H),6.85-6.62(m,1H),4.94(dd,J =30.8,7.8Hz,1H),4.50-4.16(m, 1H),3.99-3.82(m,3H),3.80-3.34(m,3H),2.92-2.17(m,2H),1.40-1.18(m,3H),1.11(t,J =6.2Hz,18H),0.97-0.75(m,9H),0.15- -0.06(m,6H)，(存在旋轉異構體)。

(e)(S)-三氟甲烷磺酸5-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯甲醯基)-4,5-二氫-1H-吡咯-3-基酯(47 )

在-50℃(丙酮/乾冰浴)下在2,6-二甲基吡啶(25.6mL，23.5g，220mmol，4當量，經篩網乾燥)存在下將三氟甲磺酸酐(27.7mL，46.4g，165mmol，3當量)注射(溫度控制)至經劇烈攪拌之酮46 (31.9g，55mmol，1當量)於無水二氯甲烷(900mL)中之懸浮液中。攪拌反應混合物1.5小時，在進行微處理(水/二氯甲烷)後進行LC/MS，顯示反應完成。將水添加至仍然冷的反應混合物中且分離有機層且用飽和碳酸氫鈉、鹽水及硫酸鎂洗滌。過濾有機相且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；10/90 v/v乙酸乙酯/己烷)，移除過量溶離劑得到產物47 (37.6g，96%)。LC/MS，方法2,4.32min(ES+)m/z (相對強度)712.89([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.71(s,1H),6.75(s,1H),6.05(d,J =1.8Hz,1H),4.78(dd,J =9.8,5.5Hz,1H),4.15-3.75(m,5H),3.17(ddd,J =16.2,10.4,2.3Hz,1H),2.99(ddd,J =16.3,4.0,1.6Hz,1H),1.45-1.19(m,3H),1.15-1.08(m,18H),1.05(s,6H),0.95-0.87(m,9H),0.15-0.08(m,6H)。

(f)(S)-(2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)甲酮(48 )

在氬氣氛圍下將三苯胂(1.71g，5.60mmol，0.4當量)添加至三氟甲磺酸鹽47 (10.00g，14mmol，1當量)、甲基酸(2.94g，49.1 mmol，3.5當量)、氧化銀(13g，56mmol，4當量)及磷酸三鉀(17.8g，84mmol，6當量)於無水二噁烷(80mL)中之混合物中。反應物用氬氣沖洗3次且添加雙(苯甲腈)氯化鈀(II)(540mg，1.40mmol，0.1當量)。反應物再用氬氣沖洗3次，隨後瞬時溫熱至110℃(在添加燒瓶之前將乾式加熱設備(drysyn)加熱塊預先溫熱至110℃)。10分鐘後，反應物冷卻至室溫且經矽藻土墊過濾。藉由在減壓下旋轉蒸發移除溶劑。所得殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；10%乙酸乙酯/己烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物48 (4.5g，55%)。LC/MS,4.27min(ES+)m/z (相對強度)579.18([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.70(s,1H),6.77(s,1H),5.51(d,J =1.7Hz,1H),4.77-4.59(m,1H),3.89(s,3H),2.92-2.65(m,1H),2.55(d,J =14.8Hz,1H),1.62(d,J =1.1Hz,3H),1.40-1.18(m,3H),1.11(s,9H),1.10(s,9H),0.90(s,9H),0.11(d,J =2.3Hz,6H)。

(g)(S)-(2-胺基-5-甲氧基-4-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)(2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)甲酮(49 )

在約15℃下將鋅粉(28g，430mmol，37當量)添加至化合物48 (6.7g，11.58mmol)於含5%甲酸之乙醇v/v(70mL)中之溶液中。使用冰浴控制所引起之防熱以保持反應混合物之溫度低於30℃。30分鐘後，反應混合物經矽藻土墊過濾。濾液用乙酸乙酯稀釋且有機相用水、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；含10%乙酸乙酯之己烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑，得到產物49 (5.1g，80%)。LC/MS,4.23min(ES+)m/z (相對強度)550.21([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.28(s,1H),6.67(s,1H),6.19(s,1H),4.64-4.53(m,J =4.1Hz,1H),4.17(s,1H),3.87(s,1H),3.77-3.69(m,1H),3.66(s,3H),2.71-2.60(m,1H),2.53-2.43(m,1H),2.04-1.97(m,J =11.9Hz,1H),1.62(s,3H),1.26-1.13(m,3H),1.08-0.99(m,18H),0.82(s,9H),0.03- -0.03(m,J =6.2Hz,6H)。

(ii)(11S,11aS)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-8-((5-碘基戊基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯

(a)(S)-(2-(2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)胺基甲酸烯丙酯(50 )

在-78℃(丙酮/乾冰浴)下在無水吡啶(0.48mL，6.00mmol，2.2當量)存在下將氯甲酸烯丙酯(0.30mL，3.00mmol，1.1當量)添加至胺49 (1.5g，2.73mmol)於無水二氯甲烷(20mL)中之溶液中。30分鐘後，移除浴槽且使反應混合物升溫至室溫。反應混合物用二氯甲烷稀釋且添加飽和硫酸銅水溶液。接著有機層相繼用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過 量溶劑，得到粗產物50 ，其按原樣用於下一反應中。LC/MS,4.45min(ES+)m/z (相對強度)632.91([M +H]⁺ ,100)

(b)(S)-(2-(2-(羥基甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)胺基甲酸烯丙酯(51 )

粗物質50 溶解於乙酸/甲醇/四氫呋喃/水(28：4：4：8mL)之7：1：1：2混合物中且在室溫下攪拌。3小時後，藉由LC/MS觀測到起始物質完全消失。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且相繼用水(2×500mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(200mL)及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量乙酸乙酯。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；含25%乙酸乙酯之己烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物51 (1g，71%)。LC/MS,3.70min(ES+)m/z (相對強度)519.13([M +H]⁺ ,95)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.34(s,1H),7.69(s,1H),6.78(s,1H),6.15(s,1H),5.95(ddt,J =17.2,10.5,5.7Hz,1H),5.33(dq,J =17.2,1.5Hz,1H),5.23(ddd,J =10.4,2.6,1.3Hz,1H),4.73(tt,J =7.8,4.8Hz,1H),4.63(dt,J =5.7,1.4Hz,2H),4.54(s,1H),3.89-3.70(m,5H),2.87(dd,J =16.5,10.5Hz,1H),2.19(dd,J =16.8,4.6Hz,1H),1.70(d,J =1.3Hz,3H),1.38-1.23(m,3H),1.12(s,10H),1.10(s,8H)。

(c)11-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-8-((三異丙基矽烷基)氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,]1aS)-烯丙基(52 )

二甲基亞碸(0.35mL，4.83mmol，2.5當量)在氬氣氛圍下在-78℃(乾冰/丙酮浴)下逐滴添加至乙二醯氯(0.2mL，2.32mmol，1.2當量)於無水二氯甲烷(10mL)中之溶液中。10分鐘後，緩慢添加51 (1g，1.93mmol)於無水二氯甲烷(8mL)中之溶液，同時保持溫度仍為-78℃。15分鐘後，逐滴添加三乙胺(1.35mL，經由4Å分子篩乾燥，9.65 mmol，5當量)且移除乾冰/丙酮浴。使反應混合物達到室溫且用冷的鹽酸(0.1M)、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水萃取。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷得到產物52 (658mg，66%)。LC/MS,3.52min(ES+)m/z (相對強度)517.14([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.20(s,1H),6.75-6.63(m,J =8.8,4.0Hz,2H),5.89-5.64(m,J =9.6,4.1Hz,2H),5.23-5.03(m,2H),4.68-4.38(m,2H),3.84(s,3H),3.83-3.77(m,1H),3.40(s,1H),3.05-2.83(m,1H),2.59(d,J =17.1Hz,1H),1.78(d,J =1.3Hz,3H),1.33-1.16(m,3H),1.09(d,J =2.2Hz,9H),1.07(d,J =2.1Hz,9H)。

(d)(11S,11aS)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-8-((三異丙基矽烷基)氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(53 )

在0℃下在氬氣下將三氟甲磺酸第三丁基二甲基矽烷基酯(0.70mL，3.00mmol，3當量)添加至化合物52 (520mg，1.00mmol)及2,6-二甲基吡啶(0.46mL，4.00mmol，4當量)於無水二氯甲烷(40mL)中之溶液中。10分鐘後，移除冷浴且反應混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物用水、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水萃取。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量物質。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；梯度，含10%乙酸乙酯之己烷至含20%乙酸乙酯之己烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物53 (540mg，85%)。LC/MS,4.42min(ES+)m/z (相對強度)653.14([M +Na]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.20(s,1H),6.71-6.64(m,J =5.5Hz,2H),5.83(d,J =9.0Hz,1H),5.80-5.68(m,J =5.9Hz,1H),5.14-5.06(m,2H),4.58(dd,J =13.2,5.2Hz,1H),4.36(dd,J =13.3,5.5Hz,1H),3.84(s,3H),3.71(td,J =10.1,3.8Hz,1H),2.91(dd,J =16.9,10.3Hz,1H),2.36(d,J =16.8Hz, 1H),1.75(s,3H),1.31-1.16(m,3H),1.12-1.01(m,J =7.4,2.1Hz,18H),0.89-0.81(m,9H),0.25(s,3H),0.19(s,3H)。

(e)(11S,11aS)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-8-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(54 )

將乙酸鋰(87mg，0.85mmol)添加至化合物53 (540mg，0.85mmol)於濕潤的二甲基甲醯胺(6mL，50：1 DMF/水)中之溶液中。4小時後，反應完成且反應混合物用乙酸乙酯(25mL)稀釋且用棕檬酸水容液(約pH 3)、水及鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量乙酸乙酯。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；梯度，含25%乙酸乙酯之己烷至含75%乙酸乙酯之己烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物54 (400mg，定量)。LC/MS,(3.33min(ES+)m/z (相對強度)475.26([M+H]⁺ ,100)。

(f)(11S,11aS)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-8-((5-碘基戊基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(55 )

將二碘基戊烷(0.63mL，4.21mmol，5當量)及碳酸鉀(116mg，0.84mmol，1當量)添加至酚54 (400mg，0.84mmol)於丙酮(4mL，經分子篩乾燥)中之溶液中。接著將反應混合物溫至60℃且攪拌6小時。藉由在減壓下旋轉蒸發移除丙酮。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；50/50，v/v，己烷/乙酸乙酯)。收集且合併純的部分，且移除過量溶離劑以得到55 ，90%產率。LC/MS,3.90min(ES+)m/z (相對強度)670.91([M]⁺ ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.23(s,1H),6.69(s,1H),6.60(s,1H),5.87(d,J =8.8Hz,1H),5.83-5.68(m,J =5.6Hz,1H),5.15-5.01(m,2H),4.67-4.58(m,1H),4.45-4.35(m,1H), 4.04-3.93(m,2H),3.91(s,3H),3.73(td,J =10.0,3.8Hz,1H),3.25-3.14(m,J =8.5,7.0Hz,2H),2.92(dd,J =16.8,10.3Hz,1H),2.38(d,J =16.8Hz,1H),1.95-1.81(m,4H),1.77(s,3H),1.64-1.49(m,2H),0.88(s,9H),0.25(s,3H),0.23(s,3H)。

(iii)11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-8-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲酯(70)

(a)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯 基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)肼基)丙醯胺基)-4-甲基-2-側氧基戊酸烯丙酯(56 )

在5℃(冰浴)下將三乙胺(2.23mL，18.04mmol，2.2當量)添加至經攪拌之胺49 (4g，8.20mmol)及三光氣(778mg，2.95mmol，0.36當量)於無水四氫呋喃(40mL)中之溶液中。監測週期性地自反應混合物移出等分試樣且用甲醇淬滅且進行LC/MS分析來監測異氰酸酯反應之進行。一旦異氰酸酯形成完成，藉由注射將alloc-Val-Ala-PABOH(4.12g，12.30mmol，1.5當量)及三乙胺(1.52mL，12.30mmol，1.5當量)於無水四氫呋喃(40mL)中之溶液快速添加至新近製備之異氰酸酯中。反應混合物在40℃下攪拌4小時。藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；梯度，含1%甲醇之二氯甲烷至含5%甲醇之二氯甲烷)。(使用EtOAc及己烷之替代性層析條件亦成功)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到產物56 (3.9g，50%)。LC/MS,4.23min(ES+)m/z (相對強度)952.36([M +H]⁺ ,100)；¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.62(br s,1H),8.46(s,1H),7.77(br s,1H),7.53(d,J =8.4Hz,2H),7.32(d,J =8.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.57(d,J =7.6Hz,1H),6.17(s,1H),6.03-5.83(m,1H),5.26(dd,J =33.8,13.5Hz,3H),5.10(s,2H),4.70-4.60(m,2H),4.58(dd,J =5.7,1.3Hz,2H),4.06-3.99(m,1H),3.92(s,1H),3.82-3.71(m,1H),3.75(s,3H),2.79-2.64(m,1H),2.54(d,J =12.9Hz,1H),2.16(dq,J =13.5,6.7Hz,1H),1.67(s,3H),1.46(d,J =7.0Hz,3H),1.35-1.24(m,3H),1.12(s,9H),1.10(s,9H),0.97(d,J =6.8Hz,3H),0.94(d,J =6.8Hz,3H),0.87(s,9H),0.07- -0.02(m,6H)。

(b)3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(羥基甲基)-4-甲基-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯 基)肼基)丙醯胺基)-4-甲基-2-側氧基戊酸烯丙酯(57 )

TBS醚56 (1.32g，1.38mmol)溶解於乙酸/甲醇/四氫呋喃/水(14：2：2：4mL)之7：1：1：2混合物中且在室溫下攪拌。3小時後，藉由LC/MS未觀測到起始物質。反應混合物用乙酸乙酯(25mL)稀釋且相繼用水、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量乙酸乙酯。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；含2%甲醇之二氯甲烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物57 (920mg，80%)。LC/MS,3.60min(ES+)m/z (相對強度)838.18([M+H]^+. ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.55(s,1H),8.35(s,1H),7.68(s,1H),7.52(d,J =8.1Hz,2H),7.31(d,J =8.4Hz,2H),6.77(s,1H),6.71(d,J =7.5Hz,1H),6.13(s,1H),5.97-5.82(m,J =5.7Hz,1H),5.41-5.15(m,3H),5.10(d,J =3.5Hz,2H),4.76-4.42(m,5H),4.03(t,J =6.6Hz,1H),3.77(s,5H),2.84(dd,J =16.7,10.4Hz,1H),2.26-2.08(m,2H),1.68(s,3H),1.44(d,J =7.0Hz,3H),1.30(dt,J =14.7,7.4Hz,3H),1.12(s,9H),1.10(s,9H),0.96(d,J =6.8Hz,3H),0.93(d,J =6.8Hz,3H)。

(c)11-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-8-((三異丙基矽烷基)氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲酯(58 )

二甲基亞碸(0.2mL，2.75mmol，2.5當量)在氬氣氛圍下在-78℃(乾冰/丙酮浴)下逐滴添加至乙二醯氯(0.11mL，1.32mmol，1.2當量)於無水二氯甲烷(7mL)中之溶液中。10分鐘後，緩慢添加57 (920mg，1.10mmol)於無水二氯甲烷(5mL)中之溶液，同時保持溫度仍為-78℃。15分鐘後，逐滴添加三乙胺(0.77mL，經由4Å分子篩乾燥，5.50 mmol，5當量)且移除乾冰/丙酮浴。使反應混合物達到室溫且用冷的鹽酸(0.1M)、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水萃取。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷。所得殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；梯度，含2%甲醇之二氯甲烷至含5%甲醇之二氯甲烷)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物58 (550mg，60%)。LC/MS,3.43min(ES+)m/z (相對強度)836.01([M]^+. ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.39(s,1H),7.52-7.40(m,2H),7.21-7.08(m,J =11.5Hz,2H),6.67(s,1H),6.60-6.47(m,J =7.4Hz,1H),5.97-5.83(m,1H),5.79-5.66(m,1H),5.38-4.90(m,6H),4.68-4.52(m,J =18.4,5.5Hz,4H),4.04-3.94(m,J =6.5Hz,1H),3.87-3.76(m,5H),3.00-2.88(m,1H),2.66-2.49(m,2H),2.21-2.08(m,2H),1.76(s,3H),1.45(d,J =7.0Hz,3H),1.09-0.98(m,J =8.9Hz,18H),0.96(d,J =6.7Hz,3H),0.93(d,J =6.9Hz,3H)。

(d)11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-8-((三異丙基矽烷基)氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲酯(59 )

在0℃下在氬氣下將三氟甲磺酸第三丁基二甲基矽烷基酯(0.38mL，1.62mmol，3當量)添加至化合物58 (450mg，0.54mmol)及2,6-二甲基吡啶(0.25mL，2.16mmol，4當量)於無水二氯甲烷(5mL)中之溶液中。10分鐘後，移除冷浴且反應混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物用水、飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水萃取。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶劑。所得殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；50/50 v/v己烷/乙酸乙酯)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物59 (334mg，65%)。LC/MS,4.18min(ES+)m/z (相對強度)950.50([M]^+. ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J =7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J =8.2Hz,2H),6.72-6.61(m,J =8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97-5.79(m,J =24.4,7.5Hz,2H),5.41-5.08(m,5H),4.86(d,J =12.5Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J =6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J =9.6,3.6Hz,1H),2.43-2.09(m,J =34.8,19.4,11.7Hz,3H),1,76(s,3H),1.43(d,J =6.9Hz,3H),1.30-1.21(m,3H),0.97(d,J =6.7Hz,3H),0.92(t,J =8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。

(e)11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-8-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲酯(60 )

將乙酸鋰(50mg，0.49mmol)添加至化合物59 (470mg，0.49mmol)於濕潤的二甲基甲醯胺(4mL，50：1 DMF/水)中之溶液中。4小時後，反應完成且反應混合物用乙酸乙酯稀釋且用棕檬酸(約pH 3)、水及鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量乙酸乙酯。所得殘餘物經歷管柱急驟層析(矽膠；梯度，50/50至25/75 v/v己烷/乙酸乙酯)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到所需產物60 (400mg，定量)。LC/MS,3.32min(ES+)m/z (相對強度)794.18([M+H]^+. ,100)。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J =7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J =8.2Hz,2H),6.72-6.61(m,J =8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97-5.79(m,J =24.4,7.5Hz,2H),5.41-5.08(m,5H),4.86(d,J =12.5Hz,1H),4.69-4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J =6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J =9.6,3.6Hz,1H),2.43 -2.09(m,J =34.8,19.4,11.7Hz,3H),1.76(s,3H),1.43(d,J =6.9Hz,3H),1.30-1.21(m,3H),0.97(d,J =6.7Hz,3H),0.92(t,J =8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。

(iv)11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,35-三側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧-3,6,34-三氮雜三十七烷醯胺基)苯甲酯(64)

(a)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲基)氧基)羰基)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(61 )

將碳酸鉀(70mg，0.504mmol，1當量)添加至55 (370mg，0.552mmol，1.2當量)及酚60 (400mg，0.504mmol)於無水丙酮(25mL)中之溶液中。反應物在70℃下攪拌8小時。LC/MS證實所有起始物質未耗盡，因此將反應物在室溫下攪拌隔夜且第二天再攪拌2小時。藉由在減壓下旋轉蒸發移除丙酮。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；含80%乙酸乙酯之己烷至100%乙酸乙酯)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到產物61 (385mg，57%)。LC/MS,4.07min(ES+)m/z (相對強度)1336.55([M+H]^+. ,50)。

(b)(11S)-8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(烯丙氧基)-4-甲基-1,2-二側氧基戊-3-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲基)氧基)羰基)-11-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-11-羥基-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(62 )

將四-正丁基氟化銨(1M，0.34mL，0.34mmol，2當量)添加至61 (230mg，0.172mmol)於無水四氫呋喃(3mL)中之溶液中。起始物質在10分鐘後全部耗盡。反應混合物用乙酸乙酯(30mL)稀釋且相繼用水及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量乙酸乙酯。所得殘餘物62 以粗混合物形式用於下一反應中。LC/MS,2.87min(ES+)m/z (相對強度)1108.11([M+H]^+. ,100)。

(c)11-羥基-7-甲氧基-8-((5-((7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S)-4-(2-(1-((1-胺基-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)肼基)苯甲酯(63 )

肆(三苯基膦)鈀(0)(12mg，0.01mmol，0.06當量)添加至粗物質62 (0.172mmol)及吡咯啶(36μL，0.43mmol，2.5當量)於無水二氯甲烷(10mL)中之溶液中。攪拌反應混合物20分鐘且用二氯甲烷稀釋且相繼用飽和氯化銨水溶液及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷。所得殘餘物63 以粗混合物形式用於下一反應中。LC/MS,2.38min(ES+)m/z (相對強度)922.16([M+H]^+. ,40)。

(d)11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-側氧基-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-甲基-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5-異丙基-2-甲基-4,7,35-三側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧-3,6,34-三氮雜三十七烷醯胺基)苯甲酯(64 或DL5 )

將1-乙基-3-(3'-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDCI，33mg，0.172mmol)添加至粗63 (0.172mmol)及Mal-(PEG)₈ -酸(100mg，0.172mmol)於無水二氯甲烷(10mL)中之溶液中。攪拌反應物2小時且藉由LC/MS觀測到不再存在起始物質。反應物用二氯甲烷稀釋且相繼用水及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量二氯甲烷。所得殘餘物經歷急驟管柱層析(矽膠；100%氯仿至含10%甲醇之氯仿)。收集且合併純的部分，且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到64 或DL5 (60mg，25%(經3個步驟))。

I. 合成藥物-連接子DL4(途徑1)

化合物65為WO 2011/130598之化合物79

11-羥基-7-甲氧基-8-(3-((7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(11S)-4-(1-碘基-20-異丙基-23-甲基-2,18,21-三側氧基-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮雜二十四醯胺基)苯甲酯(66 或DL4 )

將N,N' -二異丙基碳化二亞胺(DIC，4.71μL，0.0304mmol)添加至胺65 (0.0276mmol)及碘基-(PEG)₄ -酸(13.1mg，0.0304mmol)於無水二氯甲烷(0.8mL)中之溶液中。攪拌反應物3小時且藉由LC/MS觀測到不再存在起始物質。反應混合物直接裝載至薄層層析(TLC)板上且藉由製備型TLC(含10%甲醇之氯仿)純化。將純的材料帶自TLC板刮去，溶解於含10%甲醇之氯仿中，過濾且藉由在減壓下旋轉蒸發移除過量溶離劑，得到66(D) (20.9mg，56%)。LC/MS，方法2,3.08min(ES+)m/z (相對強度)1361.16([M+H]⁺ ,100)。

J. 合成藥物-連接子DL4(途徑2)

此實例J中使用以下方法。

LCMS資料係使用具有Agilent 6110四極聚焦器MS之Agilent 1200系列LC/MS在電噴電離作用下獲得。移動相A-含0.1%乙酸之水。移動相B-0.1%於乙腈中。流動速率為1.00ml/min。梯度自5% B經3分鐘上升至95% B，在95% B保持1分鐘且接著經6秒下降至5% B。總運行時間為5分鐘。管柱：Phenomenex Gemini-NX 3μm C18，30×2.00mm。層析係基於254nm下之UV偵測。質譜係使用MS以陽性模式獲得。質子NMR化學位移值係使用Bruker AV400在400MHz下以δ標度量測。已使用以下縮寫：s，單峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬峰。偶合常數係以Hz報導。除非另有說明，否則管柱層析(藉由急驟程序)係用Merck Kieselgel二氧化矽(Art. 9385)進行。質譜分析(MS)資料係使用耦接至Waters 2795 HPLC分離模組之Waters Micromass LCT器具收集。薄層層析法(TLC)係用矽膠鋁板(Merck 60，F₂₅₄ )進行。所有其他化學品及溶劑均購自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific且未經進一步純化即按原樣使用。

旋光度係用ADP 220偏光計(Bellingham Stanley Ltd.)量測且濃度(c )以g/100mL給出。熔點係使用數位熔點設備(Electrothermal)量測。IR光譜係用Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR光譜儀記錄。¹ H及¹³ C NMR光譜係分別在400MHz及100MHz下使用Bruker Avance NMR光譜儀在300K下獲得。化學位移係相對於TMS(δ=0.0ppm)報導，且信號指定為s(單峰)、d(雙重線)、t(三重峰)、dt(雙三重峰)、dd(雙二重峰)、ddd(雙重雙二重峰)或m(多重峰)，其中偶合常數以赫茲(Hz)給出。質譜分析(MS)資料係使用耦接至具有Waters 2996 PDA之Waters 2695 HPLC之Waters Micromass ZQ器具收集。所用Waters Micromass ZQ參數為：毛細管(kV)，3.38；錐體(V)，35；提取器(V)，3.0；源溫度(℃)，100；去溶劑化溫度(℃)，200；錐體流動速率(L/h)，50；去溶劑化流動速率(L/h)，250。高解析度質譜分析(HRMS)資料係在Waters Micromass QTOF Global上在陽性W模式下使用經金屬塗佈之硼矽玻璃尖端將樣品引入器具中來記錄。薄層層析(TLC)係在矽膠鋁板(Merck 60，F₂₅₄ )上進行，且急驟層析利用矽膠(Merck 60，230-400目ASTM)。除HOBt(NovaBiochem)及固體負載試劑(Argonaut)外，所有其他化學品及溶劑均係購自Sigma-Aldrich且未經進一步純化即按原樣使用。無水溶劑係藉由在乾燥氮氣氛圍下在合適乾燥劑存在下蒸餾而製備，且經由4Å分子篩或鈉線儲存。石油醚係指在40℃-60℃沸騰之部分。

一般LC/MS條件：HPLC(Waters Alliance 2695)係使用水(A)(甲酸0.1%)及乙腈(B)(甲酸0.1%)之移動相進行。梯度：初始組成5% B保 持1.0分鐘，接著在3分鐘內自5% B達到95% B。組成在95% B下保持0.5分鐘，且接著在0.3分鐘內返回至5% B。總梯度運行時間等於5分鐘。流動速率3.0mL/min，經由進入質譜儀之零怠體積T形連接件分離400μL。波長偵測範圍：220nm至400nm。功能類型：二極體陣列(535次掃描)。管柱：Phenomenex^® Onyx Monolithic C18 50×4.60mm

最初製備以下中間物。

(a-i)(S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁酸(I2 )

氯甲酸烯丙酯(36.2ml，340.59mmol，1.2當量)逐滴添加至經攪拌之L-纈胺酸(I1 )(33.25g，283.82mmol，1.0當量)及碳酸鉀(59.27g，425.74mmol，1.5當量)於水(650mL)及THF(650mL)中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌18小時，接著溶劑在減壓下濃縮且剩餘溶液用乙醚(3×100mL)萃取。水性部分用濃鹽酸酸化至pH 2且用DCM(3×100mL)萃取。合併之有機物用鹽水洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈無色油狀之產物(57.1g，假設100%產率)。LC/MS(1.966min(ES⁺ )),m/z ：202.1[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,DMSO-d₆ )δ 12.57(br s,1H),7.43(d,1H,J =8.6Hz),5.96-5.86(m,1H),5.30(ddd,1H,J =17.2,3.4,1.7Hz),5.18(ddd,1H,J =10.4,2.9,1.6Hz),4.48(dt,2H,J =5.3,1.5Hz),3.85(dd,1H,J =8.6,6.0Hz),2.03(oct,1H,J =6.6Hz),0.89(d,3H,J =6.4Hz),0.87(d,3H,J =6.5Hz)。

(a-ii)(S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(I3 )

向經攪拌之受保護的酸I2 (60.6g，301.16mmol，1.0當量)及N-羥基醯亞胺(34.66g，301.16mmol，1.0當量)於無水THF(800mL)中之溶液中添加二環己基碳化二亞胺(62.14g，301.16mmol，1當量)。反應物在室溫下攪拌18小時。接著過濾反應混合物，固體用THF洗滌且合併之濾液在減壓下濃縮。殘餘物再溶解於DCM中且在0℃下靜置30分鐘。過濾懸浮液且用冷的DCM洗滌。在減壓下濃縮濾液，得到呈黏性無色油狀之產物(84.7g，假設100%產率)，其未經進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS(2.194min(ES⁺ )),m/z ：321.0[M+Na]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,DMSO-d₆ )δ 8.0(d,1H,J =8.3Hz),5.97-5.87(m,1H),5.30(ddd,1H,J =17.2,3.0,1.7Hz),5.19(ddd,1H,J =10.4,2.7,1.4Hz),4.52(dt,2H,J =5.3,1.4Hz),4.32(dd,1H,J =8.3,6.6Hz),2.81(m,4H),2.18(oct,1H,J =6.7Hz),1.00(d,6H,J =6.8Hz)。

(a-iii)(S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙酸(I4 )

將丁二醯亞胺酯I3 (12.99g，43.55mmol，1.0當量)於THF(50mL)中之溶液添加至L-丙胺酸(4.07g，45.73mmol，1.05當量)及NaHCO₃ (4.02g，47.90mmol，1.1當量)於THF(100mL)及H₂ O(100mL)中之溶液中。混合物在室溫下攪拌72小時，此時在減壓下移除THF。用檸檬酸將pH值調節至3-4以使白色膠狀物沈澱。在用乙酸乙酯(6×150mL)萃取後，合併之有機物用H₂ O(200mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。用乙醚濕磨得到呈白色粉末狀之產物，藉由過濾收集且用乙醚(5.78g，49%)洗滌。

LC/MS(1.925min(ES⁺ )),m/z ：273.1[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,DMSO-d₆ )δ 12.47(br s,1H),8.17(d,1H,J =6.8Hz),7.16(d,1H,J =9.0Hz),5.95-5.85(m,1H),5.29(dd,1H,J =17.2,1.7Hz), 5.17(dd,1H,J =10.4,1.5Hz),4.46(m,2H),4.18(quin,1H,J =7.2Hz),3.87(dd,1H,J =9.0,7.1Hz),1.95(oct,1H,J =6.8Hz),1.26(d,3H,J =7.3Hz),0.88(d,3H,J =6.8Hz),0.83(d,3H,J =6.8Hz)。

(a-iv)(S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基胺基)-1-側氧基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸烯丙酯(I5 )

EEDQ(5.51g，22.29mmol，1.05當量)添加至對胺基苯甲醇(2.74g，22.29mmol，1.05當量)及酸I4 (5.78g，21.23mmol，1當量)於無水THF(100mL)中之溶液中且在室溫下攪拌72小時。接著在減壓下濃縮反應混合物且所得褐色固體用乙醚濕磨且過濾，接著用過量乙醚洗滌，得到呈灰白色固體狀之產物(7.1g，88%)。LC/MS(1.980min(ES⁺ )),m/z ：378.0[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,DMSO-d₆ )δ 9.89(br s,1H),8.13(d,1H,J =7.0Hz),7.52(d,2H,J =8.5Hz),7.26(m,1H),7.23(d,2H,J =8.5Hz),5.91(m,1H),5.30(m,1H),5.17(m,1H),4.46(m,2H),5.09(t,1H,J =5.6Hz),4.48(m,2H),4.42(m,3H),3.89(dd,1H,J =8.6,6.8Hz),1.97(m,1H),1.30(d,3H,J =7.1Hz),0.88(d,3H,J =6.8Hz),0.83(d,3H,J =6.7Hz)。

1-碘基-2-側氧基-6,9,12,15-四氧-3-氮雜十八-18-酸(I7 )

碘基乙酸酐(0.250g，0.706mmol，1.1當量)於無水DCM(1mL)中之溶液添加至含胺基-PEG₍₄₎ -酸I6 (0.170g，0.642mmol，1.0當量)之DCM(1mL)中。混合物在黑暗中在室溫下攪拌隔夜。反應混合物用0.1M HCl洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠，含3% MeOH及0.1%甲酸之氯仿至含10% MeOH及0.1%甲酸之氯仿)純化殘餘物，得到呈橙色油狀之產物(0.118g，42%)。LC/MS(1.623min(ES⁺ )),m/z ：433..98[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz, CDCl₃ )δ 8.069(s,1H),7.22(br s,1H),3.79(t,2H,J =5.8Hz),3.74(s,2H),3.72-3.58(m,14H),3.50-3.46(m,2H),2.62(t,2H,J =5.8Hz)。

(ii)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-8-(3-碘基丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(74)

(a)三氟甲烷磺酸(S)-5-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-(三異丙基矽烷氧基)苯甲醯基)-4,5-二氫-1H-吡咯-3-基酯(47 )

在-50℃下，三氟甲磺酸酐(28.4g，100.0mmol，3.0當量)經25分鐘逐滴添加至經劇烈攪拌之酮46 (19.5g，30.0mmol，1.0當量)於含有2,6-二甲基吡啶(14.4g，130.0mmol，4.0當量)之DCM(550mL)中之溶液中。攪拌反應混合物1.5小時，此時LC/MS指示完成反應。有機相相繼用水(100mL)、飽和碳酸氫鈉(150mL)、鹽水(50mL)洗滌， 且有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，90/10 v/v正己烷/EtOAc)純化，得到呈淡黃色油狀之產物(19.5g，82%)。LC/MS(4.391min(ES⁺ )),m/z ：713.25[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.68(s,1H),6.72(s,1H),6.02(t,1H,J =1.9Hz),4.75(m,1H),4.05(m,2H),3.87(s,3H),3.15(ddd,1H,J =16.2,10.3,2.3Hz),2.96(ddd,1H,J =16.2,4.0,1.6Hz),1.28-1.21(m,3H),1.07(d,18H,J =7.2Hz),0.88(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,3H)。

(b)(S,E)-(2-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-(三異丙基矽烷氧基)苯基)甲酮(67 )

肆(三苯基膦)鈀(0)(0.41g，0.35mmol，0.03當量)在氮氣氛圍下添加至三氟甲磺酸酯47 (8.4g，11.8mmol，1.0當量)、E -1-丙烯-1-基酸(1.42g，16.5mmol，1.4當量)及磷酸鉀(5.0g，23.6mmol，2.0當量)於無水二噁烷(60mL)中之混合物中。混合物在25℃下攪拌120分鐘，此時LC/MS指示完成反應。添加乙酸乙酯(120mL)及水(120mL)，移除有機相，用鹽水(20mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠，95/5 v/v正己烷/EtOAc至90/10 v/v正己烷/EtOAc)純化殘餘物得到呈黃色泡沫狀之產物(4.96g，70%)。LC/MS(4.477min(ES⁺ )),m/z ：605.0[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.67(s,1H),6.74(s,1H),5.93(d,1H,J =15.4Hz),5.67(s,1H),4.65(m,1H),4.04(m,2H),3.86(s,3H),2.85(m,1H),2.71(m,1H),1.72(dd,3H,J =6.8,1.0Hz),1.30-1.22(m,3H),1.07(d,18H,J =7.2Hz),0.87(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。

(c)(S,E)-(2-胺基-5-甲氧基-4-(三異丙基矽烷氧基)苯基)(2-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-基)甲酮(68 )

經20分鐘向丙烯基中間物67 (5.5g，9.1mmol，1.0當量)於5% v/v甲酸/乙醇(55mL)中之溶液中逐份添加鋅粉(22.0g，0.33mol，37當量)，使用冰浴保持溫度在25℃-30℃之間。30分鐘後，反應混合物經短的celite®床過濾。celite®用乙酸乙酯(65mL)洗滌且合併之有機物相繼用水(35mL)、飽和碳酸氫鈉(35mL)及鹽水(10mL)洗滌。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，90/10 v/v正己烷/EtOAc)純化，得到呈淡黃色油狀之產物(3.6g，69.0%)。LC/MS(4.439min(ES⁺ )),m/z ：575.2[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 6.75(m,1H),6.40(br s,1H),6.28(m,1H),6.11(d,1H,J =15.4Hz),5.53(m,1H),4.67(m,1H),4.36(m,2H),3.93(br s,1H),3.84(br s,1H),3.73(s,3H),2.86(dd,1H,J =15.7,10.4Hz),2.73(dd,1H,J =15.9,4.5Hz),1.80(dd,3H,J =6.8,1.3Hz),1.35-1.23(m,3H),1.12(d,18H,J =7.3Hz),0.89(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。

(d)(S,E)-2-(2-((第三丁基二甲基矽烷氧基)甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三異丙基矽烷氧基)苯基胺基甲酸烯丙酯(69 )

在-78℃下，氯甲酸烯丙酯(0.83g，6.88mmol，1.1當量)添加至胺68 (3.6g，6.26mmol，1.0當量)於含有無水吡啶(1.09g，13.77mmol，2.2當量)之無水DCM(80mL)中之溶液中。移除乾冰且使反應混合物升溫至室溫。再攪拌15分鐘後，LC/MS指示完成反應。有機相相繼用0.01N HCl(50mL)、飽和碳酸氫鈉(50mL)、鹽水(10mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到淡黃色油，其未經進一步純化即用於下一步驟中(4.12g，假設100%產率)。LC/MS(4.862min(ES⁺ )),m/z ：659.2[M+H]⁺ 。

(e)(S,E)-2-(2-(羥基甲基)-4-(丙-1-烯基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-(三異丙基矽烷氧基)苯基胺基甲酸烯丙酯(70 )

粗中間物69 (假設100%產率，4.12g，6.25mmol，1.0當量)溶解於乙酸(70mL)、甲醇(10mL)、THF(10mL)及水(20mL)之混合物中且在室溫下攪拌。6小時後，反應混合物用乙酸乙酯(500mL)稀釋且相繼用水(2×500mL)、飽和碳酸氫鈉(300mL)及鹽水(50mL)洗滌。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，1/99 v/v甲醇/DCM to 5/95 v/v甲醇/DCM)純化，得到呈黃色油狀之產物且回收另外1g未反應之起始物質。此物質經歷如上相同的反應條件，但攪拌16小時。在處理及純化後，分離出副產物(2.7g，79%，2個步驟)。LC/MS(3.742min(ES⁺ )),m/z ：545.2[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.38(m,1H),7.72(m,1H),6.81(s,1H),6.37(m,1H),6.10(d,1H,J =15.8Hz),5.97(m,1H),5.53(m,1H),5.36(ddd,1H,J =17.2,3.1,1.5Hz),5.25(ddd,1H,J =10.4,2.5,1.3Hz),4.78(m,1H),4.65(dt,2H,J =5.7,1.3Hz),3.84(m,3H),3.79(s,3H),3.04(dd,1H,J =16.7,10.5Hz),2.40(dd,1H,J =16.0,4.5Hz),1.82(dd,3H,J =6.8,1.0Hz),1.36-1.26(m,3H),1.14(d,18H,J =7.3Hz)。

(f)(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三異丙基矽烷氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(71 )

在-78℃下，在氮氣氛圍下，將無水二甲亞碸(1.16g，14.87mmol，3.0當量)逐滴添加至乙二醯氯(0.94g，7.43mmol，1.5當量)於DCM(25mL)中之溶液中。保持溫度為-78℃，10分鐘後，逐滴添加一級醇70 (2.7g，4.96mmol，1.0當量)於DCM(20mL)中之溶液。再過15分鐘後，添加無水三乙胺(2.5g，24.78mmol，5.0當量)，且使反應混合物升溫至室溫。反應混合物相繼用冷的0.1N HCl(50mL)、飽和碳酸氫鈉(50mL)及鹽水(10mL)洗滌，且有機層經MgSO₄ 乾燥，過 濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之產物，其未經進一步純化即用於下一步驟中(2.68g，假設100%產率)。LC/MS(3.548min(ES⁺ )),m/z ：543.2[M+H]⁺ 。

(g)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三異丙基矽烷氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(72 )

在0℃下，在氮氣氛圍下，將三氟甲烷磺酸第三丁基二甲基矽烷基酯(3.93g，14.87mmol，3.0當量)添加至甲醇胺71 (假設100%產率，2.68g，4.96mmol，1.0當量)及2,6-二甲基吡啶(2.12g，19.83mmol，4.0當量)於無水DCM(40mL)中之溶液中。10分鐘後，使反應混合物升溫至室溫且再攪拌60分鐘。有機相相繼用水(10mL)、飽和碳酸氫鈉(10mL)及鹽水(5mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，氯仿至2/98 v/v甲醇/氯仿)純化，得到呈黃色油狀之產物(2.0g，63%，2個步驟)。LC/MS(4.748min(ES⁺ )),m/z ：657.2[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.19(s,1H),6.86(m,1H),6.66(s,1H),6.22(d,1H,J =15.4Hz),5.81(d,1H,J =8.8Hz),5.78(m,1H),5.48(m,1H),5.11(d,1H,J =5.0Hz),5.08(m,1H),4.58(dd,1H,J =13.4,5.4Hz),4.35(dd,1H,J =13.2,5.7Hz),3.83(s,3H),3.76(s,1H),3.00(dd,1H,J =15.6,11.0Hz),2.53(m,1H),1.81(dd,3H,J =6.8,0.9Hz),1.30-1.18(m,3H),1.08(d,9H,J =2.3Hz),1.06(d,9H,J =2.3Hz),0.86(s,9H),0.25(s,3H),0.18(s,3H)。

(h)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-8-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(73 )

乙酸鋰二水合物(0.31g，3.04mmol，1.0當量)在25℃下添加至二 氮呯72 (2.0g，3.04mmol，1.0當量)於濕潤的DMF(20mL)中之溶液中且攪拌4小時。反應混合物用乙酸乙酯(200mL)稀釋且相繼用0.1M檸檬酸(50mL，pH 3)、水(50mL)及鹽水(10mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由急驟層析(矽膠，50/50 v/v正己烷/EtOAc至25/75 v/v正己烷/EtOAc)純化殘餘物得到呈淡黃色固體狀之產物(0.68g，45%)。LC/MS(3.352min(ES⁺ )),m/z ：501.1[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.02(s,1H),6.66(m,1H),6.53(s,1H),6.03(d,1H,J =15.5Hz),5.80(s,1H),5.63(d,1H,J =8.9Hz),5.55(m,1H),5.29(m,1H),4.87(m,2H),4.39(dd,1H,J =13.5,4.2Hz),4.20(dd,1H,J =13.2,5.7Hz),3.73(s,3H),3.59(m,1H),2.81(dd,1H,J =16.1,10.5Hz),2.35(d,1H,J =15.7Hz),1.61(d,3H,J =6.4Hz),0.67(s,9H),0.05(s,3H),0.00(s,3H)。

(i)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-8-(3-碘基丙氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(74 )

將二碘基丙烷(0.295g，1.00mmol，5.0當量)及碳酸鉀(0.028g，0.20mmol，1.0當量)添加至酚33 (0.100g，0.020mmol，1.0當量)於無水丙酮(5mL)中之溶液中。反應混合物在60℃下加熱6小時，此時LC/MS證實完成反應。反應混合物在減壓下濃縮至乾燥且藉由急驟層析(矽膠，75/25 v/v正己烷/EtOAc至50/50 v/v正己烷/EtOAc)純化殘餘物，得到呈無色油狀之產物(0.074g，56%)。LC/MS(3.853min(ES⁺ )),m/z ：669.0[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 7.26(s,1H),6.90(s,1H),6.68(s,1H),6.24(d,1H,J =15.3Hz),5.87(d,1H,J =8.9Hz),5.78(m,1H),5.53(m,1H),5.12(m,2H),4.65(m,2H),4.41(m,1H),4.11(m,1H),3.93(s,3H),3.81(m,1H),3.40(t,2H,J =6.7Hz),3.05(dd,1H,J =16.3,10.1Hz),2.57(m,1H),2.34(m,2H),1.84(d, 3H,J =6.6Hz),0.92(s,9H),0.28(s,3H),0.26(s,3H)。

(iii)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-8-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯(79)

(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸烯丙酯(75 )

在5℃(冰浴)下，三乙胺(0.256mL，1.84mmol，2.2當量)添加至經攪拌之胺68 (0.480g，0.835mmol，1.0當量)及三光氣(0.089g，0.301mmol，0.36當量)於無水THF(15mL)中之溶液中。藉由週期性地自反應混合物移出等分試樣且用甲醇淬滅且進行LCMS分析來監測異氰酸酯反應之進行。一旦異氰酸酯反應完成，藉由注射將Alloc-Val-Ala-PABOHI5 (0.473g，1.25mmol，1.5當量)及三乙胺(0.174 mL，1.25mmol，1.5當量)於無水THF(10mL)中之溶液快速添加至新近製備之異氰酸酯中。反應物在40℃下攪拌4小時，接著在室溫下攪拌隔夜。在減壓下濃縮混合物，且藉由急驟層析(矽膠，20/80 v/v正己烷/EtOAc至50/50 v/v正己烷/EtOAc，接著1/99 v/v DCM/MeOH至5/95 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈黃色固體狀之產物(0.579g，71%)。LC/MS(4.468min(ES⁺ )),m/z ：978.55[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.63(br s,1H),8.42(s,1H),7.78(br s,1H),7.53(d,2H,J =8.1Hz),7.31(d,2H,J =8.6Hz),6.76(s,1H),6.59(d,1H,J =7.6Hz),6.36(br s,1H),6.04(d,1H,J =15.9Hz),5.90(m,1H),5.55(m,1H),5.33-5.21(m,3H),5.10(s,2H),4.66(m,2H),4.57(dd,2H,J =5.6,1.0Hz),3.98(dd,1H,J =7.3,6.8Hz),3.90(m,1H),3.81(m,1H),3.78(s,3H),2.82(dd,1H,J =15.4,9.6Hz),2.72(dd,1H,J =15.9,3.5Hz),2.17(m,1H),1.78(dd,3H,J =6.5,0.8Hz),1.46(d,3H,J =7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J =7.1Hz),0.97(d,3H,J =6.8Hz),0.92(d,3H,J =6.8Hz),0.83(s,9H),0.04(s,3H),0.01(s,3H)。

(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(羥基甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氫-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三異丙基矽烷基)氧基)苯基)胺甲醯基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸烯丙酯(76 )

矽烷基醚75 (1.49g，1.52mmol，1.0當量)溶解於乙酸/甲醇/四氫呋喃/水(14：2：2：4mL)之7：1：1：2混合物中且在室溫下攪拌。2小時後，反應物用EtOAc(100mL)稀釋，相繼用水、碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌。接著有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，100/0接著99/1至92/8 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈橙色固體狀之產物(1.2g，92%)。LC/MS(3.649min(ES⁺ )),m/z ：865.44[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.44(s,1H),8.35(s,1H),7.69 (br s,1H),7.53(d,2H,J =8.7Hz),7.32(d,2H,J =8.3Hz),6.78(s,1H),6.56(m,2H),6.32(br s,1H),6.05(d,1H,J =14.9Hz),5.90(m,1H),5.56(m,1H),5.30(m,2H),5.22(m,1H),5.10(d,2H,J =3.1Hz),4.73(m,1H),4.64(m,1H),4.57(d,2H,J =5.8Hz),4.01(m,1H),3.79(m,2H),3.76(s,3H),2.98(dd,1H,J =16.3,10.2Hz),2.38(dd,1H,J =16.6,4.1Hz),2.16(m,1H),1.78(dd,3H,J =6.8,0.9Hz),1.46(d,3H,J =7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J =7.4Hz),0.97(d,3H,J =6.7Hz),0.92(d,3H,J =6.8Hz)。

(c)(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三異丙基矽烷氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯(77 )

在-78℃下，在氮氣氛圍下，無水二甲亞碸(0.180g，2.3mmol，3.0當量)逐滴添加至乙二醯氯(0.147g，1.1mmol，1.5當量)於DCM(10mL)中之溶液中。保持溫度為-78℃，20分鐘後，逐滴添加一級醇76 (0.666g，0.77mmol，1.0當量)於DCM(10mL)中之溶液。15分鐘後，添加無水三乙胺(0.390g，3.85mmol，5.0當量)，且使反應混合物升溫至室溫。反應混合物相繼用冷的0.1N HCl(10mL)、飽和碳酸氫鈉(10mL)及鹽水(5mL)洗滌。接著有機層經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。接著藉由急驟層析(矽膠，50/50 v/v正己烷/EtOAc至25/75 v/v正己烷/EtOAc)純化殘餘物得到呈白色固體狀之產物(0.356g，54%)。LC/MS(3.487min(ES⁺ )),m/z ：862.2[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.34(br s,1H),7.47(d,2H,J =7.6Hz),7.17(s,1H),7.14(d,2H,J =7.5Hz),6.86(br s,1H),6.65(br s,1H),6.42(d,1H,J =7.6Hz),6.22(d,1H,J =14.4Hz),5.80(m,1H),5.40(m,1H),5.53(m,1H),5.32(m,1H),5.21(d,2H,J =9.6Hz),5.06(d,1H,J = 12.3Hz),4.90(m,1H),4.58(m,3H),3.98(m,1H),3.84(m,1H),3.81(s,3H),3.50(m,1H),3.05(dd,1H,J =16.0,10.3Hz),2.76(m,1H),2.15(m,1H),1.80(dd,3H,J =6.7,0.8Hz),1.44(d,3H,J =7.1Hz),1.16(m,3H),1.01(d,18H,J =6.6Hz),0.96(d,3H,J =6.8Hz),0.92(d,3H,J =6.8Hz)。

(d)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-8-(三異丙基矽烷氧基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯(78 )

在0℃下，在氮氣氛圍下，三氟甲烷磺酸第三丁基二甲基矽烷基酯(0.46g，1.74mmol，3.0當量)添加至二級醇77 (0.5g，0.58mmol，1.0當量)及2,6-二甲基吡啶(0.25g，2.32mmol，4.0當量)於無水DCM(10mL)中之溶液中。10分鐘後，使反應混合物升溫至室溫且再攪拌120分鐘。接著有機相相繼用水(10mL)、飽和碳酸氫鈉(10mL)及鹽水(5mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，50/50 v/v正己烷/EtOAc)純化，得到呈白色固體狀之產物(0.320g，57%)。LC/MS(4.415min(ES⁺ )),m/z ：976.52[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.31(br s,1H),7.48(d,2H,J =8.0Hz),7.21(s,1H),7.14(d,2H,J =8.3Hz),6.89(s,1H),6.65(s,1H),6.38(d,1H,J =7.3Hz),6.25(d,1H,J =14.6Hz),5.93(m,1H),5.85(d,1H,J =8.8Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.24(m,2H),5.15(d,1H,J =12.5Hz),4.86(d,1H,J =12.2Hz),4.62(m,3H),4.01(m,1H),3.86(s,3H),3.78(m,1H),3.04(m,1H),2.56(m,1H),2.20(m,1H),1.84(dd,3H,J =6.6,0.7Hz),1.48(d,3H,J =6.8Hz),1.20(m,3H),1.05(d,9H,J =2.9Hz),1.03(d,9H,J =2.9Hz),0.99(d,3H,J =6.8Hz),0.95(d,3H,J =6.8Hz),0.88(s,9H),0.27(s,3H),0.14(s,3H)。

(e)(11S,11aS)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-8-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯(79 )

乙酸鋰二水合物(0.010g，0.10mmol，1.0當量)在25℃下經3小時添加至矽烷基醚78 (0.100g，0.10mmol，1.0當量)於濕潤的DMF(2mL)中之溶液中。接著反應混合物用乙酸乙酯(20mL)稀釋且相繼用0.1M檸檬酸(20mL，pH 3)、水(20mL)及鹽水(5mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由急驟層析(矽膠，5/95 v/v甲醇/DCM)純化，得到呈淡黃色油狀之產物(0.070g，83%)。LC/MS(3.362min(ES⁺ )),m/z ：820.2[M+H]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.39(s,1H),7.48(d,2H,J =8.2Hz),7.25(s,1H),7.12(d,2H,J =8.1Hz),6.88(s,1H),6.68(s,1H),6.47(d,1H,J =7.6Hz),6.24(d,1H,J =15.2Hz),6.03(s,1H),5.92(m,1H),5.84(d,1H,J =8.9Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.26(m,2H),5.18(d,1H,J =12.3Hz),4.80(d,1H,J =12.4Hz),4.66-4.60(m,3H),4.02(m,1H),3.95(s,3H),3.81(m,1H),3.03(m,1H),2.57(m,1H),2.19(m,1H),1.84(dd,3H,J =6.8,0.8Hz),1.48(d,3H,J =7.1Hz),1.00(d,3H,J =6.8Hz),0.95(d,3H,J =6.8Hz),0.87(s,9H),0.26(s,3H),0.12(s,3H)。

(iv)(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((20S,23S)-1-碘基-20-異丙基-23-甲基-2,18,21-三側氧基-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮雜二十四醯胺基)苯甲酯(66或DL4)

(a)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲氧基)羰基)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)丙氧基)-11-(第三丁基二甲基矽烷氧基)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(80 )

碳酸鉀(0.030g，0.21mmol，1.0當量)添加至酚79 (0.175g，0.21 mmol，1.0當量)及碘連接子74 (0.214g，0.32mmol，1.5當量)於丙酮(10mL)中之溶液中。反應混合物在密封燒瓶中、在75℃下、在氮氣氛圍下加熱17小時。反應混合物在減壓下濃縮至乾燥且藉由急驟層析(矽膠，2/98 v/v甲醇/DCM至5/95 v/v甲醇/DCM)純化，得到呈淡黃色固體狀之產物(0.100g，35%)。LC/MS(4.293min(ES⁺ )),m/z ：1359.13[M]⁺ 。

(b)(11S,11aS)-8-(3-((11S,11aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2-(烯丙氧基羰基胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲氧基)羰基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-5,10,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)丙氧基)-11-羥基-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸烯丙酯(81 )

四-正丁基氟化銨(1M，0.22mL，0.22mmol，2.0當量)添加至矽烷基醚80 (0.150g，0.11mmol，1.0當量)於無水THF(2mL)中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，隨後LC/MS指示完成反應。反應混合物用乙酸乙酯(10mL)稀釋且相繼用水(5mL)及鹽水(5mL)洗滌。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到黃色固體。藉由急驟層析(矽膠，6/94 v/v甲醇/DCM至10/90 v/v甲醇/DCM)純化，得到呈淡黃色固體狀之產物(0.090g，73%)。LC/MS(2.947min(ES⁺ )),m/z ：1154.0[M+Na]⁺ 。¹ H NMR(400MHz,CDCl₃ )δ 8.39(br s,1H),7.39(d,2H,J =7.6Hz),7.18(d,2H,J =10.6Hz),7.10(m,3H),6.86(d,2H,J =10.0Hz),6.74(s,1H),6.55(s,1H),6.22(dd,2H,J =15.3,6.6Hz),5.85(m,2H),5.74(m,3H),5.52(m,2H),5.22(m,1H),5.00(m,2H),4.57(m,6H),4.41(m,2H),4.09(m,4H),3.85(m,11H),3.06(m,2H),2.76(m,2H),2.20(m,2H),2.08(m,1H),1.79(d,6H,J =6.4Hz),1.40(d,3H,J =6.1Hz),0.90(m,6H)。

(c)(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((R)-2-((R)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苯甲酯(65 )

肆(三苯基膦)鈀(0)(0.005g，0.005mmol，0.06當量)添加至雙-甲醇胺81 (0.090g，0.08mmol，1.0當量)及吡咯啶(16μL，0.20mmol，2.5當量)於無水DCM(5mL)中之溶液中。20分鐘後，反應混合物用DCM(10mL)稀釋且相繼用飽和氯化銨(5mL)及鹽水(5mL)洗滌，經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下移除溶劑，得到呈淡黃色固體狀之粗產物，其未經進一步純化即用於下一步驟中(0.075g，假設100%產率)。LC/MS(2.060min(ES⁺ )),m/z ：947.2[M+H]⁺ 。

(d)(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-5,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基氧基)丙氧基)-5-側氧基-2-((E)-丙-1-烯基)-11,11a-二氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸4-((20S,23S)-1-碘基-20-異丙基-23-甲基-2,18,21-三側氧基-6,9,12,15-四氧-3,19,22-三氮雜二十四醯胺基)苯甲酯(66 或DL4 )

EDCI(0.015g，0.08mmol，1.0當量)添加至胺65 (假設100%產率，0.075g，0.08mmol，1.0當量)及碘乙醯胺-PEG₄ -酸I7 (0.034g，0.08mmol，1.0當量)於無水二氯甲烷(5mL)中之溶液中且反應物在黑暗中攪拌。50分鐘後，再添加一定量的碘乙醯胺-PEG₄ -酸I7 (0.007g，0.016mmol，0.2當量)以及一定量的EDCI(0.003g，0.016mmol，0.2當量)。在總共2.5小時後，反應混合物用二氯甲烷(15mL)稀釋且相繼用水(10mL)及鹽水(10mL)洗滌。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在減壓下濃縮。所得殘餘物藉由急驟層析(矽膠，氯仿100%至90：10 v/v氯仿：甲醇)純化。合併純的部分得到產物(0.0254g，23%，2個步驟)。收集粗物質部分且藉由製備型TLC(矽膠，90：10 v/v氯仿：甲醇)純化，得到第二批產物(0.0036g，3%，2個步驟)。LC/MS(2.689min(ES⁺ )),m/z ：681.0 1/2[M+2H]⁺ 。

應瞭解，此實例1中合成之化合物可與如本文中揭示之抗DLL3抗體結合以提供所揭示之ADC 1-5。

實例2

產生抗DLL3抗體

抗DLL3鼠類抗體是按如下方式製造。在第一免疫操作中，三隻小鼠(以下品系每種一隻：Balb/c、CD-1、FVB)用經等體積TiterMax^® 或明礬佐劑乳化之人類DLL3-fc蛋白質(hDLL3-Fc)接種。hDLL3-Fc融合構築體自Adipogen International購得(目錄號AG-40A-0113)。每隻小鼠用10μg hDLL3-Fc於TiterMax中之乳液進行初始免疫。接著每兩週一次每隻小鼠用含5μg hDLL3-Fc之明礬佐劑對小鼠進行增強免疫。在融合之前，最終注射為每隻小鼠含5μg hDLL3-Fc之PBS。

在第二免疫操作中，六隻小鼠(以下品系每種兩隻：Balb/c、CD-1、FVB)用經等體積TiterMax^® 或明礬佐劑乳化之人類DLL3-His蛋白質(hDLL3-His)接種。重組型hDLL3-His蛋白質自經工程改造以過表現hDLL3-His之CHO-S細胞之上清液純化。每隻小鼠用10μg hDLL3-His於TiterMax中之乳液進行初始免疫。接著每兩週一次每隻小鼠用含5μg hDLL3-His之明礬佐劑對小鼠進行增強免疫。最終注射為2×10⁵ 個經工程改造以過表現hDLL3之HEK-293T細胞。

使用固相ELISA分析法關於對人類DLL3具有特異性之小鼠IgG抗體篩檢小鼠血清。高於背景之陽性信號指示對DLL3具有特異性之抗體。簡言之，用重組型DLL3-His(0.5μg/ml於ELISA塗佈緩衝劑中)塗佈96孔板(VWR International，目錄號610744)隔夜。用含有0.02% (v/v)Tween 20之PBS洗滌後，各孔在室溫(RT)下用含3%(w/v)BSA之PBS(200微升/孔)阻斷1小時。將小鼠血清滴定(1：100、1：200、1：400及1：800)且以50微升/孔添加至經DLL3塗佈之板中且在室溫下培育1小時。洗滌板且接著與50微升/孔經HRP標記之山羊抗小鼠IgG(在3% BSA-PBS或含2% FCS之PBS中1：10,000倍稀釋)一起在室溫下培育1小時。再洗滌板且在室溫下經15分鐘添加40微升/孔TMB受質溶液(Thermo Scientific 34028)。在顯色後，添加等體積2N H₂ SO₄ 以停止受質顯色且藉由分光光度計在OD 450下分析各板。

將血清陽性免疫之小鼠處死且解剖引流淋巴結(腿彎部、腹股溝及髂骨肌)且用作抗體產生細胞之來源。使用BTX型Hybrimmune系統(BTX Harvard Apparatus)，藉由電細胞融合，將B細胞(約229×10⁶ 個細胞來自經hDLL3-Fc免疫之小鼠，且510×10⁶ 個細胞來自經hDLL3-His免疫之小鼠)之細胞懸浮液與非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞以1：1之比率融合。將細胞再懸浮於由補充有以下物質之DMEM培養基組成的融合瘤選擇培養基中：偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清、10% BM Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM非必需胺基酸、1mM HEPES、100 IU青黴素-鏈黴素及50μM 2-巰基乙醇，且在四個T225燒瓶中於每燒瓶100mL選擇培養基中培養。燒瓶置於含有5% CO₂ 及95%空氣37℃含濕氣培育箱中六至七天。

在融合後第六天或第七天，自燒瓶收集融合瘤文庫細胞且在200μL補充型融合瘤選擇介質(如上文所描述)中以一個細胞/孔(使用FACSAria I細胞分類器)塗於64個Falcon 96孔板中，且48個96孔板用於hDLL3-His免疫操作。其餘文庫儲存於液氮中。

培養融合瘤10天且使用如下進行之流動式細胞測量術關於對hDLL3具有特異性之抗體篩檢上清液。每孔1×10⁵ 個經工程改造以過表現人類DLL3、小鼠DLL3(用染料預先染色)或食蟹獼猴DLL3(用 Dylight800預先染色)之HEK-293T細胞與25μL融合瘤上清液一起培育30分鐘。細胞用PBS/2% FCS洗滌且接著每份樣品與25μL經DyeLight 649標記之山羊抗小鼠IgG一起培育，二級特異性Fc片段在PBS/2% FCS中1：300倍稀釋。培育15分鐘後，細胞用PBS/2% FCS洗滌兩次且與DAPI一起再懸浮於PBS/2% FCS中，且藉由流動式細胞測量術分析超過用同型對照抗體染色之細胞的螢光。其餘未使用的融合瘤文庫細胞在液氮中冷凍以用於未來文庫測試及篩檢。

hDLL3-His免疫操作產生約50種抗hDLL3抗體且hDLL3-Fc免疫操作產生約90種鼠類抗hDLL3抗體。

實例3

抗DLL3抗體之定序

基於上述內容，選擇多種以顯著高親和力結合固定之人類DLL3或h293-hDLL3細胞的例示性相異單株抗體用於定序及進一步分析。如圖3A及圖3B中以表格方式所示，來自實例2中產生之所選單株抗體之輕鏈可變區(圖3A)及重鏈可變區(圖3B)之序列分析證實許多序列具有新的互補決定區且通常顯示新的VDJ配置。應注意，圖3A及圖3B中闡述之互補決定區及構架區係使用Abysis資料庫之專屬版本根據Kabat等人(見上文)定義。

最初將表現所需抗體之所選融合瘤細胞溶解於Trizol^® 試劑(Trizol^® Plus RNA Purification System,Life Technologies)中以製備編碼抗體之RNA。10⁴ 個至10⁵ 個細胞再懸浮於1mL Trizol中且在添加200μL氯仿後劇烈搖動。樣品接著在4℃下離心10分鐘且水相轉移至新的微量離心管中且添加等體積的70%乙醇。將樣品裝載於RNeasy Mini旋轉管柱上，置放於2mL收集管中且根據製造商說明進行處理。藉由溶離提取全部RNA，與100μL不含RNase之水一起引導至旋轉管柱膜。藉由在1%瓊脂糖凝膠中部分分離3μL來測定RNA製劑之品質， 隨後在-80℃下儲存直至使用。

使用5'引子混合物將各融合瘤之Ig重鏈之可變區擴增，該5'引子混合物包含32個小鼠特異性前導序列引子(經設計以靶向完全小鼠V_H 譜系)與3'小鼠Cγ引子(對所有小鼠Ig同型具有特異性)之組合。類似地，含有三十二個5' Vκ前導序列之引子混合物(經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者)與單一反轉引子(對小鼠κ恆定區具有特異性)組合使用以對κ輕鏈進行擴增及定序。對於含有λ輕鏈之抗體，擴增係進行三個5' V_L 前導序列與一個對小鼠λ恆定區具有特異性之反向引子之組合進行。V_H 及V_L 轉錄物係使用Qiagen One Step RT-PCR套組按如下方式自100ng完全RNA擴增。對各融合瘤進行總共八次RT-PCR反應，四次反應針對Vκ輕鏈且四次反應針對Vγ重鏈。PCR反應混合物包括3μL RNA、0.5μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated Data Technologies定製合成)、5μL 5×RT-PCR緩衝劑、1μL dNTPs、1μL酶混合物(含有反轉錄酶及DNA聚合酶)以及0.4μL核糖核酸酶抑制劑RNasin(1單位)。熱循環程式為室溫步驟50℃歷時30分鐘，95℃歷時15分鐘，接著30次(95℃歷時30秒，48℃歷時30秒，72℃歷時1分鐘)之循環。接著在72℃下最終培育10分鐘。

所提取之PCR產物使用與上文關於可變區之擴增所描述相同的特異性可變區引子定序。為製備用於直接DNA定序之PCR產物，其使用QIAquick^TM PCR純化套組(QIAquick^TM PCR Purification Kit；Qiagen)根據製造商方案純化。DNA使用50μL無菌水自旋轉管柱溶離且接著直接自兩個股定序。使用IMGT序列分析工具(http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html )分析核苷酸序列以鑑別具有最高序列同源性之生殖系V、D及J基因成員。藉由使用專屬抗體序列資料庫將V_H 及V_L 基因與小鼠生殖系資料庫比對來比較衍生之序列與Ig V區及Ig J區之已知生殖系DNA序列。

更特定言之，圖3A描繪來自抗DLL3抗體之許多新穎鼠類輕鏈可變區之鄰接胺基酸序列及來源於代表性鼠類輕鏈之例示性人類化輕鏈可變區。類似地，圖3B描繪來自相同抗DLL3抗體之許多新穎鼠類重鏈可變區之鄰接胺基酸序列及來源於相同的提供人類化輕鏈之鼠類抗體之例示性人類化重鏈可變區。鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：21-387(單號)中，而人類化輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：389-407(單號)中。

因此，圖3A及圖3B共同提供多種可操作鼠類抗DLL3抗體(稱為SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150)及例示性人類化抗體(稱為hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56)之註釋序列。應注意，此等相同名稱可指產生標的抗體之純系，且因此任何特定名稱之使用應在周圍揭 示內容之情形下加以解釋。

為達成本申請案之目的，各特定抗體之SEQ ID編號為連續單號。因此，mAb SC16.3包含分別用於輕鏈及重鏈可變區之胺基酸SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23。在此方面，SC16.4包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：27，SC16.5包含SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31等。各抗體胺基酸序列之相應核酸序列包括於隨附序列表中且具有相應胺基酸SEQ ID NO前緊接的SEQ ID NO。因此，舉例而言，SC16.3抗體之V_L 及V_H 之SEQ ID NO分別為21及23，且SC16.3抗體之V_L 及V_H 之核酸序列之SEQ ID NO分別為SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：22。

關於所報導之序列，應注意，由於定序不規則性，某些重鏈及輕鏈可變區序列在程序期間過早地截短。此引起所報導中構架4序列中遺漏一或多個胺基酸。在該等情況下，已供應相容胺基酸(藉由來自其他純系之相應序列之評述確定)以本質上完成標的可變區序列。舉例而言，將殘基「IK」添加至圖3A中SC16.22輕鏈序列(SEQ ID NO：73)之終端以提供具有完全構架4之可操作的輕鏈可變區。將編碼所添加之胺基酸的鹼基類似地添加至相應核酸序列(SEQ ID NO：72)中以確保一致性。在圖3A及圖3B中(但非隨附序列表中)之各種該類情況下，所添加之胺基酸標有下劃線及黑體以便易於識別。

實例4

產生嵌合及人類化抗DLL3抗體

如上文所提及，使用來自實例2之某些鼠類抗體(SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56)衍生包含人類恆定區及鼠類可變區之嵌合抗體以及包含接枝於人類受體抗體中之鼠類CDR的人類化抗體。在較佳實施例中，可將該等衍生之抗體(嵌合或人類化)併入所揭示之DLL3結合物中。

更特定言之，嵌合抗DLL3抗體係使用此項技術中認可的如下技 術產生。自融合瘤提取完全RNA且如實例3中所闡述擴增。自衍生之核酸序列獲得與鼠類抗體之V_H 及V_L 鏈之V、D及J基因區段有關的資料。對抗體之V_H 及V_L 鏈之前導序列具有特異性的引子集合係使用以下限制位點設計：AgeI及XhoI(用於V_H 片段)，以及XmaI及DraIII(用於V_L 片段)。PCR產物用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)純化，接著用限制酶AgeI及XhoI(用於V_H 片段)以及XmaI及DraIII(用於V_L 片段)消化。V_H 及V_L 消化之PCR產物分別純化及接合至人類IgG1(SEQ ID NO：6)重鏈恆定區表現載體或κC_L (SEQ ID NO：5)人類輕鏈恆定區表現載體中。

接合反應係使用200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL消化及純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA以10μL總體積進行。勝任型大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)經由在42℃下與3μL接合產物一起熱休克來轉型，且以100μg/mL之濃度塗於安比西林(ampicillin)板上。在擴增之接合產物之純化及消化後，將V_H 片段選殖至pEE6.4HuIgG1表現載體(Lonza)之AgeI-XhoI限制位點中且將V_L 片段選殖至pEE12.4Hu-κ表現載體(Lonza)之XmaI-DraIII限制位點中。

嵌合抗體係藉由HEK-293T細胞與pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體之共轉染表現。在轉染之前，HEK-293T細胞在標準條件下在150mm板中於補充有10%熱滅活FCS、100μg/mL鏈黴素及100U/mL青黴素G之杜貝克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)中培養。細胞生長至80%融合度以用於短暫轉染。將12.5μg pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA中之每一者添加至含50μL HEK-293T轉染試劑之1.5mL Opti-MEM中。混合物在室溫下培育30分鐘且塗佈。在轉染後三至六天收集上清液。藉由在800×g下離心10分鐘自細胞碎片清理含有重組型嵌合抗體之培養物上清液且在 4℃下儲存。藉由蛋白質A親和層析純化重組型嵌合抗體。

亦使用相同鼠類抗DLL3抗體(例如SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56)衍生CDR接枝或人類化抗體。在此態樣中，鼠類抗體係使用專屬電腦輔助CDR接枝方法(Abysis Database,UCL Business)及標準分子工程技術按如下方式人類化。可變區之人類構架區係基於人類生殖系抗體序列之構架序列及CDR正則結構與相關小鼠抗體之構架序列及CDR之間的最高同源性設計。為達成分析目的，各CDR結構域之胺基酸分配係根據Kabat等人編號法進行。一旦選擇可變區，則其係由合成基因區段(Integrated DNA Technologies)產生。人類化抗體係使用上文關於嵌合抗體描述之分子方法選殖及表現。

所選人類受體可變區之遺傳組成展示於表3中各人類化抗體下方。表3中描繪之序列與圖3A及圖3B中關於標的純系闡述之註釋重鏈及輕鏈序列對應。更特定言之，以下表3中之條目對應於闡述SEQ ID NO：389及391(hSC16.13)、SEQ ID NO：393及395(hSC16.15)、SEQ ID NO：397及399(hSC16.25)、SEQ ID NO：401及403(hSC16.34)以及SEQ ID NO：405及407(hSC16.56)之鄰接可變區序列。除遺傳組成外，表3展示在此等所選實施例中，無需構架變化或回復突變便可保持所選抗體之良好結合性質。當然，在其他CDR接枝構築體中，應瞭解，該等構架變化或回復突變可合乎需要且因此明確涵蓋於本發明之範疇內。

儘管構架區域中無殘基改變，但在一個人類化純系(hSC16.13) 中，將突變引入重鏈CDR2中以解決穩定性問題。檢驗抗體與經修飾之CDR之結合親和力以確保其等效於相應嵌合或鼠類抗體。

在所有所選抗體藉由CDR接枝而人類化後，分析所得輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列以確定其關於鼠類供體及人類受體輕鏈及重鏈可變區之同源性。以下表4中展示之結果表明人類化構築體與具有鼠類供體序列之構築體相比一致地呈現較高的關於人類受體序列之同源性。更特定言之，與人類化抗體及供體融合瘤蛋白質序列之同源性(74%-83%)相比，鼠類重鏈及輕鏈可變區展示與人類生殖系基因之最接近匹配類似的整體百分比同源性(85%-93%)。

在測試時，且如下文將更詳細論述，各種衍生之人類化構築體呈現大致與由鼠類親本抗體所展示相當的良好的結合特徵。

實例5

抗DLL3抗體之特徵

使用各種方法分析如上文所闡述產生之所選DLL3抗體調節子之結合及免疫化學特徵。特定地，藉由此項技術中認可的方法(包括流動式細胞測量術)根據關於人類、食蟹獼猴、大鼠及小鼠抗原識別(亦即使用細胞及DLL3蛋白質構築體)之親和力、動力學、分級結合位置及交叉反應性來表徵多種抗體調節子。所選調節子之親和力及動力學常數k_on 及k_off 係在ForteBio RED(ForteBio,Inc.)上使用生物層干涉測量 分析或使用Biacore 2000之表面電漿子共振(各根據製造商說明)量測。

表徵結果闡述於圖5中之表格中，其中可發現所選調節子通常呈現奈莫耳範圍內之相對高親和力且在許多情況下，具有交叉反應性。圖5進一步列舉憑經驗確定之抗體區間以及由標的抗體結合之DLL3結構域，如使用酵母介導之抗原片段表現確定，諸如以下實例6中更詳細地描述。

對於抗體分級，根據製造商說明使用ForteBio RED鑑別結合於相同或不同區間之競爭抗體。簡言之，參考抗體(Ab1)捕獲於抗小鼠捕獲晶片上，接著使用高濃度非結合抗體阻斷晶片且收集基線。接著藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體型、重組型人類DLL3旗標(Adipogen International)，且將尖端浸人具有作為對照之相同抗體(Ab1)之孔或具有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若觀測到與新抗體之其他結合，則確定Ab1及Ab2處於不同區間。若未發生其他結合，如藉由與對照Ab1比較結合程度確定，則確定Ab2處於相同區間。如此項技術中已知，此過程可放大以使用表示96孔板中之唯一區間之一整列抗體篩檢獨特抗體之大型文庫。在本發明中，此分級過程展示結合於DLL3蛋白質上至少九種不同區間(圖5中指定為區間A至I)之經篩檢抗體。基於DLL3抗原之表觀尺寸(其中ECD為約56kD)及所用分級方法之解析度，咸信九種鑑別之區間表示DLL3細胞外抗原上呈現之大部分區間。

除如上文所闡述評估例示性調節子外，進行流動式細胞測量術以確認所選SC16抗體調節子可與人類DLL3免疫特異性締合及確定相同抗體是否與食蟹獼猴、大鼠及/或鼠類DLL3交叉反應。更特定言之，使用FACSCanto II及過表現鼠類、大鼠、食蟹獼猴或人類DLL3之293細胞藉由流動式細胞測量術分析例示性鼠類抗體。在一些情況下，使用由Cochran等人(J Immunol Methods.287(1-2)：147-158 (2004))描述之方法，使用FACSCanto II及呈現食蟹獼猴DLL3之酵母細胞藉由流動式細胞測量術分析例示性鼠類調節子。

基於流動式細胞測量術，發現所有所選抗體調節子均結合於過表現於293細胞上之人類DLL3(資料未圖示)，同時發現多種測試抗體與食蟹獼猴及/或鼠類DLL3交叉反應(所有與小鼠反應之抗體亦與大鼠反應)。在此方面，且如圖5中列舉，已發現與人類DLL3免疫特異性反應之十三種調節子中的八種調節子亦與鼠類(或大鼠)DLL3反應。特定地，發現mAb SC16.4、SC16.8、SC16.15、SC16.34、SC16.39、SC16.46、SC16.51及SC16.56以較高或較低程度與鼠類DLL3交叉反應，而mAb SC16.7、SC16.10、SC16.13、SC16.25及SC16.65不與鼠類DLL3顯著締合。鑒於鼠類DLL3與人類DLL3之同功異型物2約83%同源，該等結果並不意外。應瞭解，此交叉反應性可經由在藥物發現及發展中使用動物模型而在本發明之情形中有利地開發。

除上述分析法外，分析來自實例4之人類化構築體hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56以確定CDR接枝過程是否顯著地改變其結合特徵。在此態樣中，比較人類化構築體(CDR接枝)與「傳統」嵌合抗體，該等"傳統"嵌合抗體包含鼠類親本(或供體)重鏈及輕鏈可變域以及實質上等效於人類化構築體中所使用之恆定區的人類恆定區。藉由此等構築體，使用Biacore 2000(GE Healthcare)進行表面電漿子共振(SPR)以鑑別由人類化過程引起之速率常數之任何微小變化。

基於人類DLL3抗原之25nM及12.5nM之濃度級數及使用1：1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)，估算結合於人類DLL3抗原之SC16.15抗體之K_D 為0.2nM。接著用其他人類化構築體及嵌合構築體進行類似實驗以證明其保留治療性親和力值(資料未圖示)。該等結果證明人類化過程未本質上影響調節子之親和力且表明其為用於所揭示 之DLL3 ADC之有效候選物。

實例6

抗DLL3抗體之結構域及抗原決定基定位

為了對與所揭示之DLL3抗體藥物結合物締合或結合之抗原決定基進行表徵及定位，使用由Cochran等人，2004(見上文)描述之方案之改進版本對許多例示性抗體進行結構域級抗原決定基定位。簡言之，DLL3中包含特定胺基酸序列之個別結構域表現於酵母表面上，且經由流動式細胞測量術測定與所選DLL3抗體之結合。

更特定言之，產生酵母呈現質體構築體以用於以下構築體之表現：DLL3細胞外結構域(胺基酸27-466)；DLL1-DLL3嵌合體，其由與DLL3(胺基酸220-466)之EGF樣結構域1至6融合之DLL1(胺基酸22-225)之N端區域及DSL結構域組成；DLL3-DLL1嵌合體，其由與DLL1(胺基酸222-518)之EGF樣結構域1至8融合之DLL3(胺基酸27-214)之N端區域及DSL結構域組成；EGF樣結構域#1(胺基酸215-249)；EGF樣結構域#2(胺基酸274-310)；EGF樣結構域#1及#2(胺基酸215-310)；EGF樣結構域#3(胺基酸312-351)；EGF樣結構域#4(胺基酸353-389)；EGF樣結構域#5(胺基酸391-427)；及EGF樣結構域#6(胺基酸429-465)。(關於結構域資訊，通常參見UniProtKB/Swiss-Prot資料庫條目Q9NYJ7，其以引用的方式併入本文中。應注意，胺基酸編號係參考具有諸如SEQ ID NO：1中闡述之前導序列的未經加工的DLL3蛋白質)。對於N端區域或EGF結構域之總體分析，與片段相反，使用具有家族成員DLL1(DLL1-DLL3及DLL3-DLL1)之嵌合體以最小化與蛋白質摺疊有關的潛在問題。先前已證實結構域定位抗體不與DLL1交叉反應，表明與此等構築體之任何結合均係經由與構築體之DLL3部分之締合發生。此等質體轉型成酵母，其接著如Cochran等人所描述生長及誘導。

為了測試與特定構築體之結合，200,000個表現所需構築體之經誘導之酵母細胞在PBS+1mg/mL BSA(PBSA)中洗滌兩次，且在50μL PBSA中與生物素化抗HA純系3F10(Roche Diagnostics)(0.1μg/mL)及50nM經純化之抗體或來自培養7天之融合瘤之未經純化之上清液之1：2稀釋物一起培育。細胞在冰上培育90分鐘，接著在PBSA中洗滌2次。細胞接著在具有適當二級抗體(對於鼠類抗體)之50μL PBSA中培育。Alexa 488結合之抗生蛋白鏈菌素及Alexa 647結合之山羊抗小鼠(均來自Life Technologies)各以1μg/mL添加，且對於人類化或嵌合抗體，Alexa 647結合之抗生蛋白鏈菌素(Life Technologies)及R-藻紅素結合之山羊抗人類(Jackson Immunoresearch)各以1μg/mL添加。在冰上培育二十分鐘後，細胞用PBSA洗滌兩次且在FACS Canto II上分析。結合於DLL3-DLL1嵌合體之抗體指定為與N端區域+DSL結合。特異性結合於特定EGF樣結構域上之抗原決定基的抗體指定為與其各別結構域結合。

為了將抗原決定基分類為構形(例如非連續)或線型，呈現DLL3細胞外結構域之酵母在80℃下熱處理30分鐘，接著在冰冷的PBSA中洗滌兩次。呈現變性抗原之酵母(變性酵母)接著經受與如上文所描述相同的染色方案及流動式細胞測量術分析。結合於變性及原生酵母之抗體歸類為結合於線型抗原決定基，而結合原生酵母但不結合變性酵母之抗體歸類為構形特異性。

測試抗體之結構域級抗原決定基定位資料之示意性概述呈現於圖4中，其中結合線型抗原決定基之抗體標有下劃線且相應區間(若確定)標註於括號中。圖4之評述表明大部分調節子傾向於定位在DLL3之N端/DSL區域中發現之抗原決定基或第二EGF樣結構域中之抗原決定基。如先前提及，圖5以表格形式呈現與多種所選調節子之區間確定及結構域定位有關的類似資料。

進一步使用兩種方法中之一種對所選抗體進行精細抗原決定基定位。第一種方法使用Ph.D.-12噬菌體呈現肽文庫套組(New England Biolabs E8110S)，其係根據製造商說明使用。簡言之，用於抗原決定基定位之抗體以50μg/mL在3mL 0.1M碳酸氫鈉溶液(pH 8)中塗於Nunc MaxiSorp管(Nunc)上隔夜。該管用含3% BSA溶液之碳酸氫鹽溶液阻斷。接著，使含10¹¹ 個輸入噬菌體之PBS+0.1% Tween-20結合，接著在0.1% Tween-20下進行十次連續洗滌以沖去未結合之噬菌體。剩餘噬菌體在室溫下隨溫和攪拌用1mL 0.2M甘胺酸溶離10分鐘，接著用150μL 1M Tris-HCl(pH 9)中和。溶離之噬菌體再次與10¹¹ 個輸入噬菌體一起擴增及塗佈，在洗滌步驟期間使用0.5% Tween-20以增加選擇嚴格度。來自第二輪之溶離噬菌體之24個斑塊之DNA使用Qiaprep M13 Spin套組(Qiagen)分離及定序。使用ELISA分析法確認純系噬菌體之結合，其中將經定位之抗體或對照抗體塗於ELISA板上，阻斷且暴露於各噬菌體純系。使用辣根過氧化酶結合之抗M13抗體(GE Healthcare)及1步驟型Turbo TMB ELISA溶液(Pierce)偵測噬菌體結合。使用Vector NTI(Life Technologies)將來自特異性結合噬菌體之噬菌體肽序列與抗原ECD肽序列比對以確定結合之抗原決定基。

或者，使用酵母呈現方法(Chao等人，Nat Protoc.1(2)：755-768,2007))對選擇抗體進行抗原決定基定位。簡言之，DLL3 ECD突變體之文庫係藉由易出錯的PCR產生，該PCR使用用於各純系之一種胺基酸突變之目標突變誘發速率之核苷酸類似物8-側氧基-2'-脫氧鳥苷-5'-三磷酸鹽及2'-去氧-p-核苷-5'-三磷酸鹽(均來自TriLink Bio)。此等文庫轉型呈酵母呈現格式。使用上文關於結構域級定位描述之技術，文庫針對HA及50nM下之抗體結合進行染色。使用FACS Aria(BD)，將與野生型DLL3 ECD相比呈現結合損失的純系分類。此等純系重新生長，且經受另一輪針對與目標抗體之結合損失之FACS分類。使用 Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep套組(Zymo Research)對個別ECD純系進行分離及定序。必要時，使用Quikchange定點突變套組(Agilent)將突變體重新格式化成單一突變型ECD純系。

接著篩檢個別ECD純系以確定結合損失是否由抗原決定基之突變或引起錯誤摺疊之突變引起。涉及半胱胺酸、脯胺酸及終止密碼子之突變由於高度的錯誤摺疊突變可能性而自動廢除。接著篩檢剩餘ECD純系與非競爭性、構形特異性抗體之結合。推斷出損失與非競爭性、構形特異性抗體之結合的ECD純系含有錯誤摺疊突變，而推斷出保留等效的與野生型DLL3 ECD之結合的ECD純系經適當摺疊。推斷出後一群組中ECD純系中之突變發生於抗原決定基中。結果列舉於以下表5中。

更特定言之，所選抗體(具有其衍生之抗原決定基沒，該等抗原決定基包含與抗體結合有關的胺基酸殘基)之概述列舉於表5中。在此態樣中，抗體SC16.34及SC16.56顯然與共同胺基酸殘基相互作用，與圖4中展示之分級資訊及結構域定位結果一致。此外，發現SC16.23與相異鄰接抗原決定基相互作用且發現不與SC16.34或SC16.56處於同一區間。

實例7

DLL3抗體藥物結合物之製備

為了進一步證明本發明之多功能性，藉由使DL1-DL5之化合物與DLL3抗體(諸如本文中揭示之DLL3抗體)結合來製備實質上如ADC 1-5中闡述之抗DLL3抗體藥物結合物。在此態樣中，應瞭解，由於選擇 用於DL4之連接子，使用兩種稍微不同的結合程序提供所揭示之結合物。更特定言之，ADC 1-3及5係較佳使用以下第一結合程序製備且ADC 4係較佳使用以下第二程序製備。

(a)馬來醯亞胺結合

更特定言之，製備DLL3抗體藥物結合物，其包含共價連接至所揭示之抗體之DL1-DL3及DL5中闡述之連接子及吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體(通常參見U.S.P.N 2011/0256157及2012/0078028以及U.S.P.N 6,214,345，其均以全文引用的方式併入本文中)。

DL1-DL3及DL5之藥物-連接子組合係實質上如以上實例1中所描述且使用此項技術中認可的技術合成及純化。在製備後，包含末端馬來醯亞胺部分之藥物-連接子單元與所選DLL3抗體上之游離巰基結合。在此方面，DLL3結合物係經由用參(2-羧乙基)膦(TCEP)部分還原所選DLL3抗體，接著進行經還原之Cys殘基與馬來醯亞胺-連接子有效負載之反應來製備。

更特定言之，在20℃下於200mM Tris(pH 7.5)及32mM EDTA緩衝劑中，每莫耳mAb用1.3莫耳參(2-羧乙基)膦(TCEP)還原所選DLL3抗體調節子90分鐘。使反應物冷卻至15℃且連接子有效負載溶解於DMA中，接著以3.2mol/mol mAb之比率添加，隨後添加額外量的DMA使最終濃度達到6%(v/v)。反應進行30分鐘。藉由添加等莫耳過量之N-乙醯基半胱胺酸來將未反應之藥物-連接子加蓋。接著使用AKTA Explorer FPLC系統(G.E.Healthcare)藉由離子交換管柱純化實質上如ADC 1-3及5中闡述之結合物以移除聚集之高分子量抗體、共溶劑及小分子。接著溶離之結合物藉由切向流動過濾(TFF)至調配物中、接著進行濃度調節及添加清潔劑來更換緩衝液。分析最終結合物之蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物與抗體比率(DAR)(藉由逆相(RP)HPLC)、是否存在未結合之抗體(藉由疏水性相互作用層 析(HIC)HPLC)、非蛋白質物質(藉由RP HPLC)及活體外細胞毒性(使用DLL3表現細胞株)。

(b)碘乙醯胺結合

實質上按如下方式製備ADC 4。DL4係如實例1中闡述合成及提供。在製備後，包含末端碘乙醯胺部分之細胞毒素-連接子單元與所選DLL3抗體上之游離巰基結合。在此方面，DLL3結合物係經由用參(2-羧乙基)膦(TCEP)部分還原所選DLL3抗體，接著進行經還原之Cys殘基與碘乙醯胺-連接子有效負載之反應來製備。

更特定言之，在20℃下於PBS(pH 7.2)及5mM EDTA緩衝劑中，每莫耳mAb用1.8莫耳TCEP還原所選DLL3抗體調節子90分鐘。接著用100mM硼酸鈉將經還原之抗體溶液調節至pH 8.5且含連接子有效負載之DMSO以至少5mol/mol mAb之比率添加，隨後添加額外量的DMSO使最終濃度達到6%(v/v)。接著反應在20℃下進行隔夜。接著結合物藉由切向流動過濾(TFF)至滲濾緩衝液中、接著進行濃度調節及添加清潔劑來更換緩衝液。接著分析最終結合物之蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物與抗體比率(DAR)(藉由逆相(RP)HPLC)及活體外細胞毒性(使用DLL3表現細胞株)。

使用上述程序或此項技術中已知的實質上類似的方法，如本文中所描述產生及表徵多種包含各種DLL3抗體調節子與DL部分之組合的結合物。在此方面，圖6提供可根據本發明藉由使特異性抗體(例如SC16.3)與所選藥物-連接子(例如DL1)結合以提供相應ADC(亦即SC16.3-DL1或SC16.3-ADC1)而產生的ADC之概述。熟習此項技術者應瞭解，除鑑別為人類化(例如hSC16.34-DL4)以外，例示性構築體中之抗體名稱中之每一者均可表示任何類型之抗體(嵌合、人類化、人類、IgG1、IgG3等)或其免疫反應性片段。此外，應瞭解，例示性ADC 1、ADC 2、ADC 3及ADC 5化合物係使用實例7(a)中闡述之方案 結合，而例示性ADC 4化合物係使用實例7(b)中闡述之方案結合。應瞭解，在所選態樣中，本發明包含如圖6中闡述之結合物。

實例8

DLL3抗體藥物結合物活體外消除腫瘤細胞

為了證明本發明之DLL3 ADC能夠介導細胞毒性劑遞送至活細胞，使用根據先前實例製備之所選DLL3結合物進行活體外細胞殺死分析法。

活體外評估具有若干種PBD有效負載(亦即PBD1-PBD5)中之一種的DLL3靶向ADC且以奈莫耳親和力與經工程改造以過表現人類DLL3之人類293細胞(而非原生親本293細胞)上之DLL3特異性結合。為了探測活體外所選ADC 1-5之潛在細胞毒性，評估其殺死過表現人類DLL3之293細胞的能力。特定地，親本293T細胞或經工程改造以表現DLL3之293T細胞與所選ADC 1-5之稀釋物一起培育48-72小時，隨後使用Cell Titer Glo^® (Promega)根據製造商說明評估細胞活力。選擇以0.1-100pM之IC₅₀ 殺死過表現DLL3之293細胞，但顯示極小的殺死原生親本293細胞之能力的ADC作為臨床前候選物。

基於293細胞毒性分析法，選擇結合物以用於進一步腫瘤細胞檢驗。最初將2,500個細胞/孔的人類KDY66(表現內源DLL3之腎NET NTX)解離至單一細胞懸浮液中且在如此項技術中已知補充有無血清培養基之生長因子中塗於BD Primaria^TM 板(BD Biosciences)上。24小時後，將各種濃度(0.1-100pM)之經純化之DLL3抗體結合物(例如SC16.26-DL1、SC16.81-DL2、SC16.118-DL4及SC16.67-DL5)以及合適對照物(例如未結合之IgG1-DL結合物)添加至培養物中。七天後，檢驗板以確定DLL3抗體結合物對細胞活力之影響。藉由使用Cell Titer Glo^® 根據製造商說明計算活細胞數目來確定抗體藥物結合物內化及殺死腫瘤細胞之能力。將使用含有暴露於同型抗體結合物對照物 之細胞的培養物之原始螢光計數設定為100%參考值且相應地計算所有其他計數。預期一些或所有DLL3結合物以介於0.1pM與100pM之間的IC₅₀ 殺死KDY66腫瘤細胞，且同型結合物對照物呈現極高IC₅₀ 值。

在稀釋分析法中測試活性DLL3抗體結合物以確定活性之EC₅₀ 值。使用與上文所描述相同的分析法，所選抗體結合物及合適結合物對照物與經塗佈之卵巢腫瘤細胞(例如OV26，卵巢NET NTX腫瘤)一起培育。預期所有結合物中之一些結合物展示卵巢腫瘤細胞之有效殺死，其中EC₅₀ 量測值在微莫耳或次微莫耳範圍內。相反，預期對照性ADC呈現相對高EC值，表明其未有效內化且結合之藥物保持惰性狀態。

為了進一步證明所揭示之本發明之多功能性，將來源於大細胞神經內分泌肺癌瘤(LU37)之腫瘤細胞暴露於根據本文中之教示之所選結合物(例如SC16.26-DL1、SC16.81-DL2及SC16.67-DL5)。更特定言之，在補充有無血清培養基之生長因子中以每孔2,500個LU37 NTX細胞塗佈(BD Primaria^TM 板)，一天後添加結合之DLL3抗體及結合之同型對照物。經塗佈之細胞暴露於各種濃度之DLL3結合物及對照性結合物七天。暴露後，藉由如上文所描述使用Cell Titer Glo^® 計算活細胞數目來確定細胞活力。預期DLL3結合物可以臨床相關濃度消除腫瘤細胞。舉例而言，預期DLL3結合物在小於約100pM之濃度下具有活體外殺死50% LU37細胞之能力，而同型對照性結合物需要>1nM之濃度方可殺死50%腫瘤細胞。

該等結果表明所揭示之結合物適用於治療多種贅生性病症。

實例9

DLL3抗體藥物結合物活體內抑制腫瘤生長

鑒於上述活體外結果，進行實驗以評估所揭示之DLL3 ADC活體 內縮減及抑制表現DLL3之人類腫瘤之生長的能力。更特定言之，測試包含鼠類及人類化調節子之所選DLL3結合物以證明其抑制免疫缺乏小鼠中人類NTX腫瘤生長之能力。

為了準備進行實驗，使用此項技術中認可的技術使患者衍生之NTX腫瘤(LU37、LU73及OV26)在雌性NOD/SCID受體小鼠之側腹中皮下生長。每週兩次監測腫瘤體積及小鼠體重。當腫瘤體積達到150-250mm³ 時，將小鼠隨機分配至處理組且經由腹膜內注射來注射各種劑量之DLL3結合物(例如SC16.21-DL2、SC16.144-DL4、hSC16.34-DL5、hSC16.56-DL1)或包含相同DL之同型對照物(各實質上如以上實例7中所描述產生)。小鼠在七天內接受三次相同ADC注射(0.1-1mg/kg)，每次注射之間的間隔時間相同。在處理後，監測腫瘤體積及小鼠體重直至腫瘤超過800mm³ 或小鼠變衰弱。

預期所選DLL3結合物可或多或少地展示降低腫瘤體積或抑制腫瘤生長之能力。在一些情況下，對於三種不同腫瘤細胞株中之每一者，預期預期腫瘤生長抑制為持久性，例如持續長達30天、40天、50天、60天或更長時間。多種結合之調節子(包括人類化結合物)活體內長期延緩或抑制生長之能力將進一步證實所揭示之DLL3結合物作為用於治療增生性病症之治療劑的用途。

實例10

DLL3抗體藥物結合物降低癌症幹細胞出現率

如先前實例中闡述，預期所揭示之DLL3結合物可有效抑制腫瘤生長。此外，如上文所論述，DLL3表現與通常已知為抗藥性及促使腫瘤復發及轉移之癌症幹細胞相關聯。因此，為了證明用DLL3-ADC治療可降低NTX細胞株之復發潛力，進行活體內限制稀釋分析法(LDA)以確定在用DLL3結合物(例如hSC16.13-DL2或hSC16.34-DL5)治療後，小細胞肺癌腫瘤中癌症幹細胞之出現率。

患者衍生之小細胞肺癌異種移植腫瘤(LU95)及來自乳頭狀腎細胞癌瘤(KDY66)之患者衍生之異種移植物在免疫缺乏宿主小鼠中皮下生長。當腫瘤平均體積達到150mm³ -250mm³ 時，將小鼠隨機分配至兩個組中，其中每組七隻小鼠。經由腹膜內注射，在第0天、第4天及第7天向小鼠注射作為陰性對照之人類IgG1-DL2或人類IgG1-DL5(1mg/kg；各組n=7隻小鼠)或DLL3結合物，例如hSC16.13-DL2或hSC16.34-DL5(1mg/kg；各組n=7隻小鼠)。在第8天，使各組中之兩隻代表性小鼠(共四隻)安樂死且收集其腫瘤且分散於單細胞懸浮液中。預期剩餘五隻小鼠中經同型對照結合物處理之腫瘤繼續生長，而剩餘五隻小鼠中經DLL3結合物處理之腫瘤之體積降低至零或接近零。

使用標準流動式細胞測量技術及經標記之抗DLL3抗體，評估自四個處理組中之每一組收集之腫瘤以確認陽性DLL3表現。接著收集來自每一各別處理組之腫瘤細胞且經由FACS使用FACSAria III(Becton Dickinson)根據製造商說明及此項技術中認可的技術分離活的人類細胞。簡言之，細胞用FITC結合之抗鼠類H2Kd及抗鼠類CD45抗體(均來自BioLegend,Inc.)標記且接著以1μg/ml再懸浮於DAPI中。接著在標準條件下藉由收集之DAPI^- 、mH2Kd^- 及mCD45^- 人類細胞及廢棄之鼠類細胞將所得懸浮液分類。

接著五隻受體小鼠之群組用2000、500、120或30個來自經DLL3結合物處理之腫瘤之經分類的活的人類細胞移植。作為比較，五隻受體小鼠之群組用來1000、250、60或15個自經各別同型結合物對照物處理之腫瘤之經分類的活的人類細胞移植。每週一次量測受體小鼠中之腫瘤，且在腫瘤達到1500mm³ 前使個別小鼠安樂死。在腫瘤生長開始後，研究在連續四週任何其他小鼠中未出現新穎腫瘤後結束。此時，針對腫瘤生長將受體小鼠分成陽性或陰性，其中陽性生長具有超 過100mm³ 之體積。預期經DLL3結合物處理之LU95或KDY66細胞之受體與經DL2同型對照物處理之LU95或KDY66細胞之受體相比產生較少腫瘤。

使用泊松分佈統計(L-Calc軟體，Stemcell Technologies)，使用移植後18週具有及不具有腫瘤之受體之注射細胞劑量計算各群體中腫瘤引發細胞之出現率。預期在經DLL3結合物處理之動物中，LU95或KDY66樣品中以每10,000個活的人類細胞計之TIC數目顯著降低，例如降低至少約10倍，或降低20倍，或降低50倍，或降低100倍。癌症幹細胞出現率之顯著降低表明本發明之調節子可顯著及特定地降低癌症幹細胞群體及(作為擴展)腫瘤復發、轉移或重新生長潛力。

所有專利、專利申請案及公開案以及可用電子檔材料(包括例如核苷酸序列提交(例如GenBank及RefSeq中)及胺基酸序列提交(例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中)，以及來自GenBank及RefSeq中之經註釋之編碼區之翻譯文件)均以引用的方式併入本文中。上文詳細描述及實例僅出於清楚理解之目的給出。不應將其理解為不必要的限制。本發明不受限於所展示及所描述之精確細節，此由於對熟悉此項技術者明顯之變體將包含在藉由申請專利範圍來定義之本發明中。

<110> 美商史坦森特瑞斯公司 瑞士商思必螺基有限公司

<120> 新穎抗體結合物及其用途

<130> S69697 1110WO/sc1602.pct

<150> 61/768368

<151> 2013-02-22

<160> 437

<170> PatentIn version 3.5

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<223> 合成構築體

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<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(372)

<223> HSC16.25 VH

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(372)

<400> 398

<210> 399

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 399

<210> 400

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> HSC16.34 VL

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 400

<210> 401

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 401

<210> 402

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(354)

<223> HSC16.34 VH

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(354)

<400> 402

<210> 403

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 403

<210> 404

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> HSC16.56 VL

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 404

<210> 405

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 405

<210> 406

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(354)

<223> HSC16.56 VH

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(354)

<400> 406

<210> 407

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 407

<210> 408

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRL1

<400> 408

<210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRL2

<400> 409

<210> 410

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRL3

<400> 410

<210> 411

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRL1

<400> 411

<210> 412

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRL2

<400> 412

<210> 413

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRL3

<400> 413

<210> 414

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRL1

<400> 414

<210> 415

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRL2

<400> 415

<210> 416

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRL3

<400> 416

<210> 417

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRL1

<400> 417

<210> 418

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRL2

<400> 418

<210> 419

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRL3

<400> 419

<210> 420

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRL1

<400> 420

<210> 421

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRL2

<400> 421

<210> 422

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRL3

<400> 422

<210> 423

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRH1

<400> 423

<210> 424

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRH2

<400> 424

<210> 425

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.13 CDRH3

<400> 425

<210> 426

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRH1

<400> 426

<210> 427

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRH2

<400> 427

<210> 428

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.15 CDRH3

<400> 428

<210> 429

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRH1

<400> 429

<210> 430

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRH2

<400> 430

<210> 431

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.25 CDRH3

<400> 431

<210> 432

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRH1

<400> 432

<210> 433

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRH2

<400> 433

<210> 434

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.34 CDRH3

<400> 434

<210> 435

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRH1

<400> 435

<210> 436

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRH2

<400> 436

<210> 437

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC16.56 CDRH3

<400> 437

Claims (37)

1. 一種抗體藥物結合物(ADC)，其包含經由連接子與吡咯并苯并二氮呯(PBD)共價連接之抗DLL3抗體，其中該抗DLL3抗體結合於如SEQ ID NO：1或2所示的DLL3蛋白質之DSL結構域中之抗原決定基，且其中該PBD係

   
2. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該連接子包含可裂解連接子。
3. 如請求項2之抗體藥物結合物，其中該可裂解連接子包含肽基連接子，該肽基連接子包含至少兩個胺基酸。
4. 如請求項3之抗體藥物結合物，其中該肽基連接子包含纈胺酸-丙胺酸二肽。
5. 如請求項2之抗體藥物結合物，其包含結構：

   

   其中星號指示與PBD之連接位點，且其中波形線表示與連接子之其餘部分之連接位點。
6. 如請求項5之抗體藥物結合物，其中該連接子包含馬來醯亞胺基團。
7. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體係共價連接至多於一個PBD。
8. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該ADC之藥物負載為2。
9. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中1至8個PBD共價連接至該抗DLL3抗體。
10. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物包含

    

    其中Ab包含該抗DLL3抗體。
11. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該ADC係ADC 5且其中Ab係共價連接至多於一個PBD。
12. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該ADC係ADC 5且其中該ADC之藥物負載為2。
13. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該ADC係ADC 5且其中1至8個PBD共價連接至Ab。
14. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體係選自由單株抗體、嵌合抗體、CDR接枝抗體、人類化抗體、人類抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、Fab片段、F(ab')₂片段、Fv片段及ScFv片段；或其免疫反應性片段。
15. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體特異性結合於包含胺基酸G203、R205及P206之抗原決定基。
16. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體包含輕鏈可變區之三個CDR及重鏈可變區之三個CDR，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：405所示的胺基酸序列且該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：407所示的胺基酸序列。
17. 如請求項16之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體包含SEQ ID NO：405之殘基24-34做為CDR-L1、SEQ ID NO：405之殘基50-56做為CDR-L2、SEQ ID NO：405之殘基89-97做為CDR-L3、SEQ ID NO：407之殘基31-35做為CDR-H1、SEQ ID NO：407之殘基50-65做為CDR-H2及SEQ ID NO：407之殘基95-102做為CDR-H3，其中該等殘基係根據Kabat編號。
18. 如請求項16之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體包含SEQ ID NO：405之殘基24-34做為CDR-L1、SEQ ID NO：405之殘基50-56做為CDR-L2、SEQ ID NO：405之殘基89-97做為CDR-L3、SEQ ID NO：407之殘基26-32做為CDR-H1、SEQ ID NO：407之殘基52-56做為CDR-H2及SEQ ID NO：407之殘基95-102做為CDR-H3，其中該等殘基係根據Chothia編號。
19. 如請求項16之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體包含SEQ ID NO：405之殘基30-36做為CDR-L1、SEQ ID NO：405之殘基46-55做為CDR-L2、SEQ ID NO：405之殘基89-96做為CDR-L3、SEQ ID NO：407之殘基30-35做為CDR-H1、SEQ ID NO：407之殘基47-58做為CDR-H2及SEQ ID NO：407之殘基93-101做為CDR-H3，其中該等殘基係根據MacCallum編號。
20. 如請求項16之抗體藥物結合物，其中該抗DLL3抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：405所示之胺基酸序列，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：407所示之胺基酸序列。
21. 如請求項20之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物係ADC 5。
22. 一種抗體藥物結合物(ADC)，其包含經由連接子與一或多個吡咯并苯并二氮呯(PBD)共價連接之抗DLL3抗體，其中該抗DLL3抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：405所示的胺基酸序列且該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：407所示的胺基酸序列；其中該一或多個PBD係：

    

    其中該ADC之藥物負載為2。
23. 一種抗體藥物結合物(ADC)，其包含：

    

    其中Ab包含抗DLL3抗體，該抗DLL3抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：405所示的胺基酸序列且該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：407所示的胺基酸序列；及其中該ADC之藥物負載為2。
24. 一種醫藥組合物，其包含(a)如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物及(b)醫藥學上可接受之載劑。
25. 如請求項24之醫藥組合物，其包含1、2、3、4、5、6、7或8，各+/- 0.4之藥物與抗體比率(DAR)。
26. 如請求項25之醫藥組合物，其包含2 +/- 0.4之DAR。
27. 如請求項25之醫藥組合物，其包含少於30%之非主要ADC物質。
28. 如請求項26之醫藥組合物，其包含少於30%之非主要ADC物質。
29. 一種套組，其包含(a)一或多個容器，其含有如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物；及(b)與該一或多個容器關聯之標記或包裝說明書，其中該標記或包裝說明書指示該抗體藥物結合物係用於治療癌症。
30. 一種套組，其包含(a)一或多個容器，其含有如請求項24至28中任一項之醫藥組合物；及(b)與該一或多個容器關聯之標記或包裝說明書，其中該標記或包裝說明書指示該抗體藥物結合物係用於治療癌症。
31. 一種如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物或如請求項24至28中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療癌症的藥劑。
32. 如請求項31之用途，其中該癌症係小細胞肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌或大細胞神經內分泌癌瘤。
33. 如請求項31之用途，其中該癌症係小細胞肺癌。
34. 一種如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物或如請求項24至28中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製備降低個體中腫瘤引發細胞之出現率的藥劑。
35. 如請求項34之用途，其中該癌症係小細胞肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌或大細胞神經內分泌癌瘤。
36. 如請求項34之用途，其中該癌症係小細胞肺癌。
37. 一種如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物或如請求項24至28中任一項之醫藥組合物之用途，其係用於製備遞送PBD至癌細胞的藥劑。