JP2024503658A - 抗ｄｌｌ３抗体－薬物コンジュゲート - Google Patents

抗ｄｌｌ３抗体－薬物コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、ＤＬＬ３に結合する抗体と抗腫瘍活性を有する薬物との抗体－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲートを含み、腫瘍に対する治療作用を有する医薬組成物、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物を使用して腫瘍を処置するための方法などを提供することである。本発明は、ＤＬＬ３に結合する抗体と抗腫瘍活性を有する薬物との抗体－薬物コンジュゲート、抗体又は抗体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、及び腫瘍を処置するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月１３日に出願された米国仮出願第６３／１３６，９３８号の優先権を主張し、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２２年１月１２日に作成され、０９８０６５－０３０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１５０，７６２バイトのサイズである。
技術分野
本発明の技術は、一般的に、デルタ様タンパク質３（ＤＬＬ３）に特異的に結合する免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体又はその抗原結合断片）の調製及びその使用に関し、加えて、抗ＤＬＬ３抗体を作製するための方法、抗ＤＬＬ３抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体－薬物コンジュゲートを含む抗癌剤などに関する。本発明の開示はさらに、開示された抗ＤＬＬ３抗体、ＡＤＣ、及び抗癌剤を、必要とする対象に投与することを含む、使用及び処置の方法を提供する。
本技術の背景の以下の説明は、単に本発明の技術の理解の補助に役立つものとして提供され、本発明の技術に対する先行技術を記載又は構成するものとして認められない。
がんは、死因の上位にランク付けされている。がん患者の数は人口の老化に伴い増加すると予測されるが、処置の必要性はまだ十分に満たされていない。従来の化学療法剤の問題は、これらの化学療法剤は、その低い選択性のために、腫瘍細胞に対してだけでなく正常細胞にも毒性であり、それにより有害反応があること；及び化学療法剤は、十分な量で投与できないため、その効果を十分にもたらすことができないことである。したがって、近年、がん細胞において突然変異又は高い発現特徴を呈する分子、又は細胞の悪性転換に関与する特異的な分子を標的化する、より高度に選択的な分子標的薬物又は抗体薬物が開発されてきた。
抗体は、血液中で高度に安定であり、その標的抗原に特異的に結合する。これらの理由のために、有害反応の低減が期待され、がん細胞の表面上で高度に発現された分子に対する多数の抗体薬物が開発されてきた。抗体の抗原特異的な結合能力に頼る技術の１つは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用することである。ＡＤＣは、がん細胞の表面上で発現された抗原に結合し、結合を介して細胞に抗原を内在化させることができる抗体が、細胞傷害性活性を有する薬物にコンジュゲートされているコンジュゲートである。ＡＤＣは、薬物をがん細胞に効率的に送達でき、それによりがん細胞に薬物を蓄積させてがん細胞を殺滅することが期待される（Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016；ＷＯ２０１４／０５７６８７；ＵＳ２０１６／０２９７８９０）。ＡＤＣに関して、例えば、モノメチルオーリスタチンＥにコンジュゲートした抗ＣＤ３０モノクローナル抗体を含むＡｄｃｅｔｒｉｓ（商標）（ブレンツキシマブベドチン）が、ホジキンリンパ腫及び未分化大細胞型リンパ腫のための治療薬物として承認されている。またエムタンシンにコンジュゲートした抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を含むＫａｄｃｙｌａ（商標）（トラスツズマブエムタンシン）も、ＨＥＲ２陽性進行性又は再発性乳がんの処置に使用される。
抗腫瘍薬としてＡＤＣに好適な標的抗原の特徴は、抗原が、がん細胞の表面上で特異的に高度に発現されるが、正常細胞では低い発現であるか又は発現されないこと；抗原が、細胞に内在化されうること；抗原が、細胞表面から分泌されないことなどである。抗体の内在化能力は、標的抗原と抗体の両方の特性に依存する。標的の分子構造から内在化に好適な抗原結合部位を予測したり、又は抗体の結合強度、物理的特性などから高い内在化能力を有する抗体を予測したりすることは難しい。したがって、高い効能を有するＡＤＣを開発することにおける重要な課題は、標的抗原に対する高い内在化能力を有する抗体を得ることである（Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015）。
ＤＬＬ３（すなわち、デルタ様リガンド３又はデルタ様タンパク質３）は、ＡＤＣの公知の標的抗原の１つである。ＤＬＬ３は、シングルパスＩ型膜貫通タンパク質であり、Ｎｏｔｃｈリガンドの１つである（Owen et al. J Hematol Oncol 12, 61 (2019)を参照）。ＤＬＬ３は、ＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣを含む高悪性度肺神経内分泌腫瘍において選択的に発現される。ＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣ患者由来の異種移植片腫瘍においてＤＬＬ３の発現増加が観察され、原発性腫瘍も確認された。Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302):302ra136 (2015)を参照されたい。ＤＬＬ３の発現増加はまた、前立腺の神経内分泌癌を含む肺外神経内分泌がんでも観察された（Puca et al., Sci Transl Med 11(484): pii: eaav0891 (2019)）。ＤＬＬ３はこのような腫瘍細胞の表面上で発現されるが、その成人における正常な組織での発現は限定される。
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）にコンジュゲートした抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を含むＡＤＣが報告されている（ＷＯ２０１３／１２６７４６及びSaunders et al., Sci Translational Medicine 7(302): 302ra136 (2015)を参照）。加えて、活性成分として抗ＤＬＬ３抗体を含有する様々な医薬組成物が公知である。Giffin et al., Clin Cancer Res 2021;27:1526-37、及びＷＯ２０１１／０９３０９７を参照されたい。ただしこれまで、医薬物質としての使用について承認されたＤＬＬ３を標的化する薬物はない。
様々な種類のがんを処置するためのＡＤＣなどの効率的で有効な標的化治療剤が当業界で求められている。本出願はこの必要性を満たす。
本発明の目的は、このような抗デルタ様リガンド３（すなわち、「デルタ様タンパク質３」又は「ＤＬＬ３」）抗体を含み、高い抗腫瘍活性を有する抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体－薬物コンジュゲートを含み、腫瘍への治療作用を有する医薬化合物、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬化合物を使用して腫瘍を処置するための方法などを提供することである。
本発明者らは、上述の目的を達成することに向けられた集中的な研究を実行し、驚くべきことに、開示された抗ＤＬＬ３抗体を含むＡＤＣは、特に小細胞肺がんにおいて、意外にも高い抗腫瘍活性を有することを見出した。
本発明は、以下の本発明の態様及び実施形態を含む：
［１］一態様において、本発明の開示は、リンカーを介して薬物にコンジュゲートされている、ＤＬＬ－３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、抗体又は当該抗体の機能的な断片は、ＤＬＬ３に結合することが可能であり、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶHは、
（ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５；並びに
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５
からなる群から選択されるＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含み；及び／又は（ｂ）ＶLは、
（ｉ）それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
からなる群から選択されるＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含む、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。
［２］［１］の一部の実施形態において、抗体は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含むＶH及び（ｂ）ＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含むＶLの組合せは、
（ｉ）それぞれ、（ａ）配列番号３、配列番号４、及び配列番号５並びに（ｂ）配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
（ｉｉ）それぞれ、（ａ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５並びに（ｂ）配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
（ｉｉｉ）それぞれ、（ａ）配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５並びに（ｂ）配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
（ｉｖ）それぞれ、（ａ）配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５並びに（ｂ）配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
からなる群から選択される。
［３］［１］又は［２］の一部の実施形態において、抗体は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶHは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；及び／又は（ｂ）ＶLは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
［４］［１］～［３］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶHは、配列番号１２、配列番号２２又は配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶLは、配列番号１７、配列番号２７又は配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含む。
［５］［１］～［４］のいずれか１つの一部の実施態様において、ＶHアミノ酸配列及びＶLアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号７（７－Ｉ１－Ｂ）；それぞれ配列番号１２及び配列番号１７（２－Ｃ８－Ａ）；それぞれ配列番号２２及び配列番号２７（１０－Ｏ１８－Ａ）；及びそれぞれ配列番号３２及び配列番号３７（６－Ｇ２３－Ｆ）からなる群から選択されるか、又は抗ＤＬＬ３抗体は、それぞれ配列番号５９及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ）；それぞれ配列番号６０及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２）；それぞれ配列番号６１及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３）；それぞれ配列番号６７及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ）；それぞれ配列番号６８及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２）；それぞれ配列番号６９及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３）；それぞれ配列番号６３及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ）；それぞれ配列番号６４及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２）；並びにそれぞれ配列番号６５及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３）からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む。
［６］［１］～［５］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号７、１７、２７、若しくは３７のいずれか１つの軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に少なくとも９５％同一な軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列、又は配列番号６２、６６、若しくは７０のいずれか１つの配列に少なくとも９５％同一な軽鎖配列；及び／又は（ｂ）配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に少なくとも９５％同一な重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列、又は配列番号５９、６０、６１、６３、６４、６５、６７、６８、又は６９のいずれか１つの配列に少なくとも９５％同一な重鎖配列を含む。
［７］［１］～［８］のいずれか１つの一部の実施態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプのＦｃドメインをさらに含む。
［８］［１］～［７］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３は、配列番号４２、５７又は５８の重鎖定常領域を含む。
［９］［１］～［８］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦv、及びＦvからなる群から選択される。
［１０］［１］～［９］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は二重特異性抗体である。
［１１］［１］～［１０］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号５９～６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖；及び／又は
（ｃ）配列番号６７～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
［１２］［１］～［１１］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、
（ａ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む。
［１３］別の態様において、本発明の開示は、リンカーを介して薬物にコンジュゲートされている、ＤＬＬ－３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、抗ＤＬＬ－３抗体は、ＤＬＬ－３への結合に関して、［１］～［１２］のいずれか１つによる抗体と競合する、抗体－薬物コンジュゲートを提供する。
［１４］［１］～［１３］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体は、哺乳類ＤＬＬ３ポリペプチドに存在するエピトープに結合する。
［１５］［１４］の一部の実施態様において、エピトープは、コンフォメーショナルエピトープ又は非コンフォメーショナルエピトープである。
［１６］［１４］又は［１５］の一部の実施形態において、哺乳類ＤＬＬ３ポリペプチドは、配列番号５０又は配列番号５１のアミノ酸残基２７～４９２を含むアミノ酸配列を有する。
［１７］［１］～［１６］のいずれか１つの一部の実施態様において、重鎖又は軽鎖は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵインデックスに従って）における２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への置換（ＬＡＬＡ）、重鎖のアミノ酸残基３５６位におけるＧｌｕ（Ｅ）及び３５８位におけるＭｅｔ（Ｍ）（ＥＵインデックスに従って）のセット、重鎖の３５６位におけるＡｓｐ（Ｄ）及び３５８位におけるロイシン（Ｌ）（ＥＵインデックスに従って）のセット又はそれらのあらゆる組合せ、Ｎ末端グルタミン又はＮ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、並びにカルボキシル末端からの１又は２つのアミノ酸の欠失からなる群から選択されるアミノ酸残基の１若しくは２つ又はそれより多くの改変又はセットを有する。
［１８］［１７］の一部の実施形態において、１又は２つのアミノ酸が、その重鎖のカルボキシル末端から欠失している。
［１９］［１８］の一部の実施形態において、１つのアミノ酸が、その重鎖の両方のカルボキシル末端のそれぞれから欠失している。
［２０］［１７］～［１９］のいずれか１つの一部の実施形態において、その重鎖のカルボキシル末端におけるプロリン残基は、さらにアミド化されている。
［２１］［１］～［２０］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞傷害活性を強化するために調節されている糖鎖改変を含む。
［２２］［１］～［２１］のいずれか１つの一部の実施態様において、薬物は、以下の式によって表される抗腫瘍化合物である：
Figure 2024503658000001
［２３］［１］～［２２］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体は、以下の式（ａ）～（ｆ）：
（ａ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
（ｂ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
（ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
（ｄ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
（ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
（ｆ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
からなる群から選択されるいずれかの構造を有するリンカーを介して薬物にコンジュゲートされており、
式中、抗体は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）の末端に接続されており、抗腫瘍化合物は、１位におけるアミノ基の窒素原子を接続位置として（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分のカルボニル基、（ｃ）のＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分又は（ｄ）のＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分に接続されおり、ＧＧＦＧ（配列番号８５）は、ペプチド結合を介して連結されたグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（配列番号８５）からなるアミノ酸配列を表し、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－は、以下の式によって表される構造：
Figure 2024503658000002
 を有し、この構造は、その３位で抗体に接続されており、１位における窒素原子で、この構造を含有するリンカー構造中のメチレン基に接続されている。
［２４］［１］～［２３］のいずれか１つの一部の実施態様において、リンカーは、以下の式（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）：
（ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
（ｄ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
（ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
からなる群から選択されるいずれかの式によって表される。
［２５］［１］～［２４］のいずれか１つの一部の実施態様において、リンカーは、以下の式（ｃ）又は（ｅ）：
（ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
（ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
によって表される。
［２６］［１］～［２５］のいずれか１つの一部の実施態様において、ＡＤＣは、以下の式によって表される構造：
Figure 2024503658000003
 を有し、式中、ＡＢは、抗体を表し、ｎは、抗体１個当たりの抗体にコンジュゲートした薬物－リンカー構造の単位の平均数を表し、抗体は、抗体由来のスルフヒドリル基を介してリンカーに接続されている。
［２７］［１］～［２５］のいずれか１つの一部の実施態様において、ＡＤＣは、以下の式によって表される構造：
Figure 2024503658000004
 を有し、式中、ＡＢは、抗体を表し、ｎは、抗体１個当たりの抗体にコンジュゲートした薬物－リンカー構造の単位の平均数を表し、抗体は、抗体由来のスルフヒドリル基を介してリンカーに接続されている。
［２８］［１］～［２７］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、配列番号１７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号１２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である。
［２９］［１］～［２７］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、配列番号２７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である。
［３０］［１］～［２７］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、配列番号３７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号３２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である。
［３１］［１］～［２７］のいずれか１つの一部の実施形態において、抗体は、配列番号７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である。
［３２］［１］～［３１］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数は、１～１０の範囲内である。
［３３］［１］～［３２］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数は、２～８の範囲内である。
［３４］［１］～［３３］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数は、５～８の範囲内である。
［３５］［１］～［３４］のいずれか１つの一部の実施態様において、抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数は、７～８の範囲内である。
［３６］別の態様において、本発明の開示は、［１］～［３５］のいずれか１つに記載の抗体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、その塩、又は当該コンジュゲート若しくは塩の水和物を提供する。
［３７］抗腫瘍薬である、［３６］の一部の実施態様において。
［３８］一部の実施形態において、［３６］又は［３７］の医薬組成物は、腫瘍を処置することにおける使用のためのものであり、腫瘍は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍である。
［３９］［３８］の一部の実施形態において、腫瘍は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）；大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）；腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍；神経膠腫；又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐｓｅｕｄｏ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ；ｐＮＥＴ）である。
［４０］別の態様において、本発明の開示は、腫瘍を処置するための方法であって、［１］～［３５］のいずれか１つによる抗体－薬物コンジュゲート、その塩、及びコンジュゲート又は塩の水和物を、腫瘍を有する個体に投与することを含む方法を提供する。
［４１］別の態様において、本発明の開示は、腫瘍を処置するための方法であって、［１］～［３５］のいずれか１つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、及びコンジュゲート又は塩の水和物、並びに少なくとも１つの抗腫瘍薬を含む医薬組成物を、同時に、別々に、又は連続的に腫瘍を有する個体に投与することを含む方法を提供する。
［４２］［４０］又は［４１］の一部の実施形態において、腫瘍は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍である。
［４３］［４０］～［４２］のいずれか１つの一部の実施形態において、腫瘍は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）；大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）；腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍；神経膠腫；又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）である。
［４４］別の態様において、本発明の開示は、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを作製するための方法であって、抗ＤＬＬ３抗体又は当該抗体の機能的な断片を、薬物－リンカー中間体化合物と反応させる工程を含み、抗体又は当該抗体の機能的な断片は、ＤＬＬ３に結合することが可能であり、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶHは、
（ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５；並びに
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５
からなる群から選択されるＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含み；及び／又は（ｂ）ＶLは、
（ｉ）それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
（ｉｖ）それぞれ、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
からなる群から選択されるＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含む、方法を提供する。
発明の有利な作用：特異的な構造を有するリンカーを介して、細胞において毒性を発揮する薬物にコンジュゲートした本発明の抗ＤＬＬ３抗体を含む抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートの特徴は、ＤＬＬ３を発現するがん細胞を有する患者への投与によって優れた抗腫瘍作用及び安全性を達成することと予測することができる。具体的には、本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、抗癌剤として有用である。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的及び説明的なものであり、特許請求されたものの開示のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、及び新規の特徴は、以下の図面の簡単な説明及び開示の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。
３種のヒト抗ＤＬＬ３抗体－薬物－コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートのインビボの抗腫瘍作用を示す図である。評価は、ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ２０９を免疫不全マウスに接種した動物モデルを使用して実行された。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、標準誤差（ＳＥ）値を示す。矢印は、投与の日付を示す。 ３種のヒト抗ＤＬＬ３抗体－薬物－コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートのインビボの抗腫瘍作用を示す図である。評価は、ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２４を免疫不全マウスに接種した動物モデルを使用して実行された。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、標準誤差（ＳＥ）値を示す。矢印は、投与の日付を示す。 ３種のヒト抗ＤＬＬ３抗体－薬物－コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲート若しくは抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）のインビボの抗腫瘍作用を示す図である。評価は、ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａを免疫不全マウスに接種した動物モデルを使用して実行された。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、標準誤差（ＳＥ）値を示す。矢印は、投与の日付を示す。 それぞれ配列番号５５及び配列番号５０として表されたヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）デルタ様の正規のＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）アイソフォーム１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ配列番号５６及び配列番号５１として表されたヒトデルタ様の正規のＮｏｔｃｈリガンド３（ＤＬＬ３）アイソフォーム２のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ配列番号１及び配列番号２として表された抗体７－Ｉ１－ＢのＶHドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶH ＣＤＲ１（配列番号３）は、ボールド体のフォントで示され、ＶH ＣＤＲ２（配列番号４）は、下線で示され、ＶH ＣＤＲ３（配列番号５）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号６及び配列番号７として表された抗体７－Ｉ１－ＢのＶLドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶL ＣＤＲ１（配列番号８）は、ボールド体のフォントで示され、ＶL ＣＤＲ２（配列番号９）は、下線で示され、ＶL ＣＤＲ３（配列番号１０）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号１１及び配列番号１２として表された抗体２－Ｃ８－ＡのＶHドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶH ＣＤＲ１（配列番号１３）は、ボールド体のフォントで示され、ＶH ＣＤＲ２（配列番号１４）は、下線で示され、ＶH ＣＤＲ３（配列番号１５）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号１６及び配列番号１７として表された抗体２－Ｃ８－ＡのＶLドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶL ＣＤＲ１（配列番号１８）は、ボールド体のフォントで示され、ＶL ＣＤＲ２（配列番号１９）は、下線で示され、ＶL ＣＤＲ３（配列番号２０）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号２１及び配列番号２２として表された抗体１０－Ｏ１８－ＡのＶHドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶH ＣＤＲ１（配列番号２３）は、ボールド体のフォントで示され、ＶH ＣＤＲ２（配列番号２４）は、下線で示され、ＶH ＣＤＲ３（配列番号２５）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号２６及び配列番号２７として表された抗体１０－Ｏ１８－ＡのＶLドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶL ＣＤＲ１（配列番号２８）は、ボールド体のフォントで示され、ＶL ＣＤＲ２（配列番号２９）は、下線で示され、ＶL ＣＤＲ３（配列番号３０）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号３１及び配列番号３２として表された抗体６－Ｇ２３－ＦのＶHドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶH ＣＤＲ１（配列番号３３）は、ボールド体のフォントで示され、ＶH ＣＤＲ２（配列番号３４）は、下線で示され、ＶH ＣＤＲ３（配列番号３５）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 それぞれ配列番号３６及び配列番号３７として表された抗体６－Ｇ２３－ＦのＶLドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＶL ＣＤＲ１（配列番号３８）は、ボールド体のフォントで示され、ＶL ＣＤＲ２（配列番号３９）は、下線で示され、ＶL ＣＤＲ３（配列番号４０）は、イタリックの下線付きのフォントで示される。 指定された抗体によるＤＬＬ３の内在化をアッセイするために実行された細胞傷害性ベースの内在化アッセイであるＦａｂ ＺＡＰアッセイの結果を示す図である。参照ＤＬＬ３モノクローナル抗体ＳＣ１６を、陽性対照として使用した。ＷＯ２０１５１２７４０７を参照されたい。全ての試験した抗ＤＬＬ３抗体は、参照モノクローナル抗体に匹敵する殺滅活性を呈した。遊離の抗ＤＬＬ３がＦａｂ ＺＡＰに関して細胞に結合した抗ＤＬＬ３と競合したため、より高い濃度の抗ＤＬＬ３抗体でフック効果が観察された。 図１０Ａ～１０Ｄは、結合緩衝剤としてＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び再生緩衝剤として１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を使用して、２５℃でＯｃｔｅｔ ＨＴＸを介して測定した場合の、抗体７－Ｉ１－Ｂ（図１０Ａ）、６－Ｇ２３－Ｆ（図１０Ｂ）、１０－Ｏ１８－Ａ（図１０Ｃ）、及び２－Ｃ８－Ａ（図１０Ｄ）の結合曲線を示す図である。モノクローナル抗体（各５μｇ／ｍＬ）を、抗マウスＦｃセンサー上にローディングし、ローディングされたセンサーを、７回の連続する１：３希釈での２００ｎＭの開始濃度の組換えヒトＤＬＬ３タンパク質（アミノ酸Ａｌａ２７～Ａｌａ４７９、カタログ番号９７４９－ＤＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の指定された希釈物に浸漬した。各ＤＬＬ３希釈物につき、実際の測定及び曲線のフィットが示される。図１０Ｅは、本明細書に記載される４つのモノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａ）の解離定数（ＫD）の値を示し、これらは、図１０Ａ～１０Ｄに示される結合曲線を使用し、１価（１：１）結合モデルを適用して計算された。 ６－Ｇ２３－Ｆ、１０－Ｏ１８－Ａ、及び２－Ｃ８－Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＤＬＬ３と選択的に結合するが、ＤＬＬ１又はＤＬＬ４と選択的に結合しないことを示す図である。７－Ｉ１－ＢｍＡｂは、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４の両方と結合するが、ＤＬＬ１と結合しない。 ２種のヒト抗ＤＬＬ３抗体－薬物－コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲート、又は抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）のインビボの抗腫瘍作用を示す図である。評価は、ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａを免疫不全マウスに接種した動物モデルを使用して実行された。横座標は、投与後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、標準誤差（ＳＥ）値を示す。 ２種のヒト抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）のインビボの抗腫瘍作用を示す図である。評価は、ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ２０９を免疫不全マウスに接種した動物モデルを使用して実行された。横座標は、投与後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、標準誤差（ＳＥ）値を示す。
本発明の技術の実質的な理解を提供するために、本発明の技術の特定の態様、様式、実施形態、バリエーション及び特徴が様々な詳細のレベルで後述されることが理解されるものとする。
本発明の技術を実施することにおいて、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学及び組換えＤＮＡにおける多くの従来の技術が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis;米国特許第４，６８３，１９５号; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London);及びHerzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。ポリペプチド遺伝子発現生成物のレベル（すなわち、遺伝子翻訳レベル）を検出及び測定する方法は、当業界において周知であり、抗体検出及び定量化技術などのポリペプチド検出方法の使用を含む。（Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)も参照）。
以下、図面を参照しながら本発明を行うための好ましい実施形態を記載する。後述される実施形態は単に本発明の代表的な実施形態を例示したにすぎず、本発明の範囲は、これらの例によって狭義に解釈されないものとすることに留意されたい。
Ｉ．定義
本発明の説明において、用語「がん」は、用語「腫瘍」の意味と同じ意味を有するものとして使用される。
本発明の説明において、用語「遺伝子」は、ＤＮＡだけでなくそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ、並びにそれらのｃＲＮＡを含むものとして使用される。
本発明の説明において、用語「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」は、核酸の意味と同じ意味を有するものとして使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含む。本発明の説明において、用語「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド」は、別段の規定がない限り、互いに同義的に使用することができる。
本発明の説明において、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互いに同義的に使用することができる。
本発明の説明において、用語「細胞」は、個々の動物の細胞、及び培養細胞を含む。
本発明の説明において、用語「ＤＬＬ３」は、ＤＬＬ３タンパク質の意味と同じ意味を有するものとして使用することができる。本発明の説明において、ヒトＤＬＬ３はまた、「ｈＤＬＬ３」とも称される。
本発明の説明において、用語「細胞傷害活性」は、何らかの所与の方法で細胞に病理学的な変化がもたらされることを意味するものとして使用される。この用語は、直接の外傷を意味するだけでなく、細胞にもたらされる全てのタイプの構造的又は機能的なダメージも意味し、例えばＤＮＡ切断、塩基二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置へのダメージ、及び様々な種類の酵素の活性の低減が挙げられる。
本発明の説明において、語句「細胞において毒性を発揮すること」は、毒性が何らかの所与の方法で細胞において呈されることを意味するものとして使用される。この用語は、直接の外傷を意味するだけでなく、細胞にもたらされる全てのタイプの構造的、機能的、又は代謝的な影響も意味し、例えばＤＮＡ切断、塩基二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置へのダメージ、様々な種類の酵素の活性の低減、及び細胞増殖因子の作用の抑制も意味する。
本発明の説明において、用語「抗体の機能的な断片」は、「抗体の抗原結合断片」とも呼ばれ、これは、抗原に対する結合活性を有する抗体の部分的な断片を意味するのに使用され、抗体断片から形成された、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体及び多重特異性抗体などを含む。Ｆａｂ’は、還元条件下でＦ（ａｂ’）２を処理することにより得られた抗体可変領域の１価断片であり、これも抗体の抗原結合断片に含まれる。しかしながら、抗体の抗原結合断片は、抗原結合断片が抗原と結合する能力を有する限り、これらの分子に限定されない。これらの抗原結合断片としては、抗体タンパク質の全長分子を適切な酵素で処理することにより得られるものだけでなく、遺伝子操作された抗体遺伝子を使用して適切な宿主細胞で作製されたタンパク質も挙げられる。
本発明の説明において、用語「エピトープ」は、特異的な抗ＤＬＬ３抗体が結合するＤＬＬ３の部分的なペプチド又は部分的な３次元構造を意味するのに使用される。このようなエピトープは、上述したＤＬＬ３の部分的なペプチドであり、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイによって決定することができる。最初に、抗原の様々な部分的な構造が作製される。このような部分的な構造の作製に関して、公知のオリゴペプチド合成技術を適用することができる。例えば、ＤＬＬ３がそのＣ末端又はＮ末端から適切な長さで連続的に短縮化された一連のポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって作製される。その後、このようなポリペプチドに対する抗体の反応性を研究して、認識部位がおおまかに決定される。その後、さらにより短いペプチドを合成し、次いでこれらのペプチドに対するそれらの反応性を、エピトープが決定されるように研究することができる。複数の細胞外ドメインを有する膜タンパク質に結合する抗体が、エピトープとして複数のドメインで構成される３次元構造に対するものである場合、抗体が結合するドメインは、特異的な細胞外ドメインのアミノ酸配列を改変し、それによって３次元構造を改変することによって決定することができる。エピトープは、特異的な抗体に結合する抗原の部分的な３次元構造であり、これもまた、Ｘ線構造分析によって抗体に隣接する抗原のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。
本発明の説明において、「ヒト化抗体」は、ヒト抗体鎖からの可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖及び非ヒト抗体（例えば、マウス）からの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を指す。
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフト化された抗体を含むことは意図されない。
本発明の説明において、語句「同じエピトープに結合する抗体」は、共通のエピトープに結合する抗体を意味するのに使用される。第２の抗体が、第１の抗体が結合する部分的なペプチド又は部分的な３次元構造に結合する場合、第１の抗体及び第２の抗体は同じエピトープに結合すると決定することができる。代替として、第２の抗体が、第１の抗体の抗原への結合に関して第１の抗体と競合すること（すなわち、第２の抗体が第１の抗体の抗原への結合に干渉する）を確認することによって、エピトープの特異的な配列又は構造が決定されていないとしても、第１の抗体及び第２の抗体は同じエピトープと結合すると決定することができる。本発明の説明において、語句「同じエピトープに結合する」は、これらの決定方法のどちらか一方又は両方によって第１の抗体及び第２の抗体が共通のエピトープに結合すると決定されるケースを指す。第１の抗体及び第２の抗体が同じエピトープに結合し、さらに第１の抗体が、抗腫瘍活性又は内在化活性などの特殊な作用を有する場合、第２の抗体は、第１の抗体の活性と同じ活性を有することを期待することができる。
本発明の説明において、用語「ＣＤＲ」は、相補性決定領域を意味するのに使用される。抗体分子の重鎖及び軽鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを有することが公知である。このようなＣＤＲは高度可変領域とも称され、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に配置される。これらの領域は、特に高度に可変性の一次構造を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれにおいて、ポリペプチド鎖の一次構造で３つの部位に分かれている。本発明の説明において、抗体のＣＤＲに関して、重鎖のＣＤＲは、重鎖のアミノ酸配列のアミノ末端側から、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と称され、それに対して軽鎖のＣＤＲは、軽鎖のアミノ酸配列のアミノ末端側から、それぞれＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と称される。これらの部位は、３次元構造において互いに近接して配置され、抗体が結合する抗原への抗体の特異性を決定する。
用語「ＣＤＲグラフト化抗体」は、本明細書で使用される場合、「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、所望の抗原特異性を有する「ドナー」抗体からのＣＤＲ「グラフト」で置き換えられた抗体を意味する。
本発明において、語句「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションが、６８℃で、商業的に入手可能なハイブリダイゼーション溶液であるＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって製造された）中で行われること、又は６８℃で、０．７～１．０ＭのＮａＣｌの存在下で、ＤＮＡが固定されたフィルターを使用してハイブリダイゼーションを行い、次いで結果物を、６８℃で、同定のための０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（この場合、１倍濃度のＳＳＣは、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムからなる）で洗浄する条件、又はそれに同等な条件下でハイブリダイゼーションが行われることを意味するのに使用される。
用語「個体」、「患者」、又は「対象」は、本明細書で使用される場合、個体生物、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであり得る。一部の実施形態において、個体、患者又は対象は、ヒトである。
用語「医薬的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、医薬投与に適合性を有する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌化合物、等張性の、及び吸収を遅延させる化合物などを含むことが意図される。医薬的に許容される担体及びそれらの配合物は当業者公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.)に記載される。
「処置すること」又は「処置」は、本明細書で使用される場合、対象、例えばヒトにおける本明細書に記載される疾患又は障害の処置を網羅し、その例としては、（ｉ）疾患又は障害を阻害すること、すなわちその発生を停止させること；（ｉｉ）疾患又は障害を緩和すること、すなわち障害の退行をもたらすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を減速させること；及び／又は（ｉｖ）疾患又は障害の１つ又は複数の症状を阻害すること、緩和すること、若しくはその進行を減速させることが挙げられる。一部の実施形態において、処置は、疾患に関連する症状が、例えば軽減される、低減される、治癒する、又は寛解の状態に置かれることを意味する。
「と特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、一方の分子（例えば、抗原）を認識し、それと結合するが、他方の分子を実質的に認識し、それと結合しない分子（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を指す。特定の分子（例えば、ポリペプチド、又はポリペプチド上のエピトープ）への「特異的な結合」、それに「特異的に結合する」、又はそれに「特異的な」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、分子が、それが結合する分子に対して、約１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、又は１０-12ＭのＫDを有することによって呈される場合がある。用語「と特異的に結合する」はまた、分子（例えば、抗体又はその抗原結合断片）が、特定のポリペプチド（例えば、ＤＬＬ３ポリペプチド）、又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するが、他のいずれのポリペプチド、又はポリペプチドエピトープとも実質的に結合しないような結合を指す場合もある。
本発明の説明において、用語「１～複数」は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１若しくは２を意味するのに使用される。
ＩＩ．デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）
ＤＬＬ３（すなわち、デルタ様リガンド３又はデルタ様タンパク質３）は、ＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣなどの高悪性度肺神経内分泌腫瘍で選択的に発現される。ＤＬＬ３の発現の増加は、ＳＣＬＣ及びＬＣＮＥＣ患者由来の異種移植片腫瘍で観察され、原発性腫瘍でも確認された。Saunders et al., Sci Translational Medicine 7(302): 302ra136 (2015)を参照されたい。またＤＬＬ３の発現の増加は、前立腺神経内分泌癌などの肺外神経内分泌がんでも観察された（Puca et al., Sci Transl Med 11(484): pii: eaav0891 (2019)。ＤＬＬ３は、このような腫瘍細胞の表面で発現されるが、正常な組織では発現されない。本発明の開示は、免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を提供し、これは、腫瘍細胞上のＤＬＬ３に結合すると内在化することから、これらの腫瘍細胞に毒性ペイロードを送達するのに有用である。本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、それを必要とする対象において、ＤＬＬ３関連がんを検出又は処置するための方法において有用である。したがって、本発明の方法の様々な態様は、抗ＤＬＬ３抗体の調製、特徴付け、及び操作に関する。本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、単独でも、又はがんを処置するための追加の治療剤と組み合わせても有用である。一部の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は二重特異性抗体である。
キイロショウジョウバエ属において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、主としてＮｏｔｃｈ受容体により媒介される。デルタは、隣接する細胞でシグナル伝達を活性化するＮｏｔｃｈのキイロショウジョウバエ属のリガンドの１つである。ヒトは、４つの公知のＮｏｔｃｈ受容体（ＮＯＴＣＨ１～ＮＯＴＣＨ４）、並びにデルタ様リガンド：ＤＬＬ１、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４と呼ばれるデルタの３つのホモログを有する。ＤＬＬ３は、ＤＬＬ１及びＤＬＬ４とは異なり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するのではなくむしろ阻害することが報告されている。
ＤＬＬ３（デルタ様３又はＳＣＤＯ１としても公知）は、Ｎｏｔｃｈ ＤＳＬリガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オーソログとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
ヒト（受託番号ＮＰ＿０５８６３７：
ＭＶＳＰＲＭＳＧＬＬＳＱＴＶＩＬＡＬＩＦＬＰＱＴＲＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＰＧＡＰＲＳＰＣＳＡＲＬＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＬＳＥＥＡＡＥＳＰＣＡＬＧＡＡＬＳＡＲＧＰＶＹＴＥＱＰＧＡＰＡＰＤＬＰＬＰＤＧＬＬＱＶＰＦＲＤＡＷＰＧＴＦＳＦＩＩＥＴＷＲＥＥＬＧＤＱＩＧＧＰＡＷＳＬＬＡＲＶＡＧＲＲＲＬＡＡＧＧＰＷＡＲＤＩＱＲＡＧＡＷＥＬＲＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＴＡＣＴＲＬＣＲＰＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＡＰＬＥＤＥＣＥＡＰＬＶＣＲＡＧＣＳＰＥＨＧＦＣＥＱＰＧＥＣＲＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＳＰＲＧＰＳＳＡＴＴＧＣＬＶＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＰＲＳＦＥＣＴＣＰＲＧＦＹＧＬＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＡＤＰＤＳＡＹＩＣＨＣＰＰＧＦＱＧＳＮＣＥＫＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＲＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＡＨＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＡＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＡＲＣＥＦＰＶＨＰＤＧＡＳＡＬＰＡＡＰＰＧＬＲＰＧＤＰＱＲＹＬＬＰＰＡＬＧＬＬＶＡＡＧＶＡＧＡＡＬＬＬＶＨＶＲＲＲＧＨＳＱＤＡＧＳＲＬＬＡＧＴＰＥＰＳＶＨＡＬＰＤＡＬＮＮＬＲＴＱＥＧＳＧＤＧＰＳＳＳＶＤＷＮＲＰＥＤＶＤＰＱＧＩＹＶＩＳＡＰＳＩＹＡＲＥＶＡＴＰＬＦＰＰＬＨＴＧＲＡＧＱＲＱＨＬＬＦＰＹＰＳＳＩＬＳＶＫ（配列番号５０）
及びＮＰ＿９８２３５３：
ＭＶＳＰＲＭＳＧＬＬＳＱＴＶＩＬＡＬＩＦＬＰＱＴＲＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＰＧＡＰＲＳＰＣＳＡＲＬＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＬＳＥＥＡＡＥＳＰＣＡＬＧＡＡＬＳＡＲＧＰＶＹＴＥＱＰＧＡＰＡＰＤＬＰＬＰＤＧＬＬＱＶＰＦＲＤＡＷＰＧＴＦＳＦＩＩＥＴＷＲＥＥＬＧＤＱＩＧＧＰＡＷＳＬＬＡＲＶＡＧＲＲＲＬＡＡＧＧＰＷＡＲＤＩＱＲＡＧＡＷＥＬＲＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＴＡＣＴＲＬＣＲＰＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＡＰＬＥＤＥＣＥＡＰＬＶＣＲＡＧＣＳＰＥＨＧＦＣＥＱＰＧＥＣＲＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＳＰＲＧＰＳＳＡＴＴＧＣＬＶＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＰＲＳＦＥＣＴＣＰＲＧＦＹＧＬＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＡＤＰＤＳＡＹＩＣＨＣＰＰＧＦＱＧＳＮＣＥＫＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＲＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＡＨＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＡＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＡＲＣＥＦＰＶＨＰＤＧＡＳＡＬＰＡＡＰＰＧＬＲＰＧＤＰＱＲＹＬＬＰＰＡＬＧＬＬＶＡＡＧＶＡＧＡＡＬＬＬＶＨＶＲＲＲＧＨＳＱＤＡＧＳＲＬＬＡＧＴＰＥＰＳＶＨＡＬＰＤＡＬＮＮＬＲＴＱＥＧＳＧＤＧＰＳＳＳＶＤＷＮＲＰＥＤＶＤＰＱＧＩＹＶＩＳＡＰＳＩＹＡＲＥＡ（配列番号５１））；
チンパンジー（受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５：
ＭＶＳＰＲＭＳＲＬＬＳＱＴＶＩＬＡＬＩＦＬＰＱＴＲＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＰＧＡＰＲＳＰＣＳＡＲＶＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＬＳＥＥＡＡＥＳＰＣＡＬＧＡＡＬＳＡＲＧＰＶＹＴＥＱＰＧＡＰＡＰＤＬＰＬＰＤＧＬＬＱＶＰＦＲＤＡＷＰＧＴＦＳＦＩＩＥＴＷＲＥＥＬＧＤＱＩＧＧＰＡＷＳＬＬＡＲＶＡＧＲＲＲＬＡＡＧＧＴＷＡＲＤＩＱＲＡＧＡＷＥＬＲＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＴＡＣＴＲＬＣＲＰＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＡＰＬＥＤＥＣＥＡＰＰＶＣＲＡＧＣＳＰＥＨＧＦＣＥＱＰＧＥＣＲＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＳＰＲＧＰＳＳＡＴＴＧＣＬＶＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＰＧＳＦＥＣＡＣＰＲＧＦＹＧＬＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＡＤＰＤＳＡＹＩＣＨＣＰＰＧＦＱＧＳＮＣＥＫＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＲＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＡＨＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＡＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＡＲＣＥＦＰＶＨＰＤＧＡＳＡＬＰＡＡＰＰＧＬＲＰＧＤＰＱＲＹＬＬＰＰＡＬＧＬＬＶＡＡＧＶＡＧＡＡＬＬＬＶＨＶＲＲＲＧＨＡＱＤＡＧＡＲＬＬＡＧＴＰＥＰＳＶＨＡＬＰＤＡＬＮＮＬＲＴＱＥＧＡＧＤＧＰＳＳＳＶＤＷＮＲＰＥＤＶＤＰＲＧＩＹＶＩＳＡＰＳＩＹＡＲＥＡ（配列番号５２））；
マウス（受託番号ＮＰ＿０３１８９２：
ＭＶＳＬＱＶＳＰＬＳＱＴＬＩＬＡＦＬＬＰＱＡＬＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＬＧＴＰＲＳＰＣＮＡＲＧＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＶＳＱＥＡＴＥＳＬＣＡＬＧＡＡＬＳＴＳＶＰＶＹＴＥＨＰＧＥＳＡＡＡＬＰＬＰＤＧＬＶＲＶＰＦＲＤＡＷＰＧＴＦＳＬＶＩＥＴＷＲＥＱＬＧＥＨＡＧＧＰＡＷＮＬＬＡＲＶＶＧＲＲＲＬＡＡＧＧＰＷＡＲＤＶＱＲＴＧＴＷＥＬＨＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＡＡＣＡＲＬＣＲＳＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＴＰＦＰＤＥＣＥＡＰＳＶＣＲＰＧＣＳＰＥＨＧＹＣＥＥＰＤＥＣＲＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＮＳＲＶＰＧＰＡＳＴＧＣＬＬＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＳＧＳＦＥＣＡＣＰＲＧＦＹＧＬＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＥＤＰＤＳＡＹＶＣＨＣＰＰＧＦＱＧＳＮＣＥＫＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＱＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＳＲＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＳＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＶＲＣＥＦＡＶＲＰＤＧＡＤＡＶＰＡＡＰＲＧＬＲＱＡＤＰＱＲＦＬＬＰＰＡＬＧＬＬＶＡＡＧＬＡＧＡＡＬＬＶＩＨＶＲＲＲＧＰＧＱＤＴＧＴＲＬＬＳＧＴＲＥＰＳＶＨＴＬＰＤＡＬＮＮＬＲＬＱＤＧＡＧＤＧＰＳＳＳＡＤＷＮＨＰＥＤＧＤＳＲＳＩＹＶＩＰＡＰＳＩＹＡＲＥＡ（配列番号５３））、
及びラット（受託番号ＮＰ＿４４６１１８：
ＭＶＳＬＱＶＳＳＬＰＱＴＬＩＬＡＦＬＬＰＱＡＬＰＡＧＶＦＥＬＱＩＨＳＦＧＰＧＰＧＰＧＴＰＲＳＰＣＮＡＲＧＰＣＲＬＦＦＲＶＣＬＫＰＧＶＳＱＥＡＡＥＳＬＣＡＬＧＡＡＬＳＴＳＧＰＶＹＴＥＱＰＧＶＰＡＡＡＬＳＬＰＤＧＬＶＲＶＰＦＬＤＡＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＴＷＲＥＱＬＧＥＲＡＡＧＰＡＷＮＬＬＡＲＶＡＧＲＲＲＬＡＡＧＡＰＷＡＲＤＶＱＲＴＧＡＷＥＬＨＦＳＹＲＡＲＣＥＰＰＡＶＧＡＡＣＡＲＬＣＲＳＲＳＡＰＳＲＣＧＰＧＬＲＰＣＴＰＦＰＤＥＣＥＡＰＲＥＳＬＴＶＣＲＡＧＣＳＰＥＨＧＹＣＥＥＰＤＥＣＨＣＬＥＧＷＴＧＰＬＣＴＶＰＶＳＴＳＳＣＬＮＳＲＶＳＧＰＡＧＴＧＣＬＬＰＧＰＧＰＣＤＧＮＰＣＡＮＧＧＳＣＳＥＴＰＧＳＦＥＣＡＣＰＲＧＦＹＧＰＲＣＥＶＳＧＶＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＬＣＶＧＧＥＤＰＤＳＡＹＶＣＨＣＰＰＡＦＱＧＳＮＣＥＲＲＶＤＲＣＳＬＱＰＣＱＮＧＧＬＣＬＤＬＧＨＡＬＲＣＲＣＲＡＧＦＡＧＰＲＣＥＨＤＬＤＤＣＡＧＲＡＣＡＮＧＧＴＣＶＥＧＧＧＡＲＲＣＳＣＡＬＧＦＧＧＲＤＣＲＥＲＡＤＰＣＡＳＲＰＣＡＨＧＧＲＣＹＡＨＦＳＧＬＶＣＡＣＡＰＧＹＭＧＶＲＣＥＦＡＶＲＰＤＧＡＤＡＶＰＡＡＰＲＧＬＲＱＡＤＳＱＲＦＬＬＰＰＡＬＧＬＬＡＡＡＡＬＡＧＡＡＬＬＬＩＨＶＲＲＲＧＰＧＲＤＴＧＴＲＬＬＳＧＴＲＥＰＳＶＨＴＬＰＤＡＬＮＮＬＲＬＱＤＧＡＧＤＧＰＴＳＳＡＤＷＮＨＰＥＤＧＤＳＲＳＩＹＶＩＰＡＰＳＩＹＡＲＥＡ（配列番号５４））
ヒトにおいて、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３に配置された９．５ｋＢｐにわたる８つのエクソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングは、２３８９ｂｐの転写物（受託番号ＮＭ＿０１６９４１（配列番号５５））及び２０５２ｂｐの転写物（受託番号ＮＭ＿２０３４８６（配列番号５６））を生じる。前者の転写物は、６１８アミノ酸の長さであるタンパク質（受託番号ＮＰ＿０５８６３７（配列番号５０））をコードし、それに対して後者の転写物は、５８７アミノ酸の長さであるタンパク質（受託番号ＮＰ＿９８２３５３（配列番号５１））をコードする。図４Ａ～４Ｂを参照されたい。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメイン及びそれらの膜貫通ドメインにわたり全体的な１００％の同一性を有し、より長いアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端に３２個の追加の残基を含有する伸長した細胞質内のテールを含有する点でのみ異なっている。
両方のアイソフォームは、腫瘍細胞で検出することができる。実際には、異常なＤＬＬ３発現（遺伝子型及び／又は表現型の）は、様々な腫瘍形成性細胞部分集団、例えばがん幹細胞及び腫瘍始原細胞（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）に関連する。したがって、本発明の開示は、このような細胞（例えば、がん幹細胞、腫瘍原始細胞、及びがん、例えば、小細胞肺がん、大細胞神経内分泌癌、肺神経内分泌がん、肺外神経内分泌がん、及び黒色腫）を標的化することに特に有用である可能性があり、それによって新生物形成性の障害の処置、管理又は防止を容易にするＤＬＬ３抗体を提供する。
本発明で使用されるＤＬＬ３タンパク質は、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス又はサル）のＤＬＬ３を発現する細胞から直接的に精製でき、次いで使用してもよいし、又は前述の細胞の細胞膜画分を調製して、ＤＬＬ３タンパク質として使用してもよい。代替として、ＤＬＬ３はまた、インビトロでそれを合成することによって、又は遺伝子操作によって宿主細胞にＤＬＬ３を作製させることによって得てもよい。このような遺伝子操作によって、ＤＬＬ３タンパク質は、具体的には、ＤＬＬ３ ｃＤＮＡを発現することが可能なベクターにＤＬＬ３ ｃＤＮＡを取り込むこと、次いで、転写及び翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー材料を含有する溶液中でＤＬＬ３を合成することによって、又は他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を、それらがＤＬＬ３を発現できるように形質転換することによって得ることができる。また、上述した遺伝子操作に基づくＤＬＬ３を発現する細胞、又はＤＬＬ３を発現する細胞株も、ＤＬＬ３タンパク質を提示させるために使用することができる。代替として、ＤＬＬ３ ｃＤＮＡが取り込まれた発現ベクターは、免疫化しようとする動物に直接投与してもよく、ＤＬＬ３は、このようにして免疫化された動物の体内で発現させてもよい。
さらに、上述したＤＬＬ３のアミノ酸配列における１つ又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を含み、ＤＬＬ３タンパク質の生物学的活性と同等の生物学的活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、用語「ＤＬＬ３」に含まれる。
ＩＩＩ．抗ＤＬＬ３抗体
本発明の技術は、抗ＤＬＬ３免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ＤＬＬ３抗体又はその抗原結合断片）の生成及び使用のための方法及び組成物を記載する。本発明の開示の抗ＤＬＬ３免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３関連がん（例えば、小細胞肺がん、大細胞神経内分泌癌、肺神経内分泌がん、肺外神経内分泌がん、及び黒色腫）の診断、又は処置において有用であり得る。本発明の技術の範囲内の抗ＤＬＬ３免疫グロブリン関連組成物としては、例えば、これらに限定されないが、標的ポリペプチド、そのホモログ、誘導体又は断片と特異的に結合する、モノクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性、ヒト抗体、及びダイアボディが挙げられる。本発明の開示はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、及びＦｖからなる群から選択される、本明細書で開示される抗ＤＬＬ３抗体のいずれかの抗原結合断片も提供する。
本発明の技術は、ＤＬＬ３－抗体複合体の内在化を促進することができ、したがって腫瘍細胞に毒性ペイロードを送達するのに有用な抗ＤＬＬ３抗体を開示する。
図５～８は、ＶＨ及びＶＬのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供し、加えて抗体のＣＤＲ配列は、本明細書で開示される（配列番号１～４０）。以下の表はまた、ＶH及びＶLのアミノ酸配列も提供し、加えて抗体のＣＤＲ配列は、本明細書で開示される。
Figure 2024503658000005
Figure 2024503658000006

Figure 2024503658000007

Figure 2024503658000008
一態様において、本発明の開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ＶＨは、（ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；（ｉｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５；並びに（ｉｖ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５からなる群から選択されるＶＨ－ＣＤＲ１配列、ＶＨ－ＣＤＲ２配列、及びＶＨ－ＣＤＲ３配列を含み；及び／又は（ｂ）ＶＬは、（ｉ）それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；（ｉｉ）それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに（ｉｖ）それぞれ、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択されるＶＬ－ＣＤＲ１配列、ＶＬ－ＣＤＲ２配列、及びＶＬ－ＣＤＲ３配列を含む、抗体又はその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態において、本発明の開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含むＶH及び（ｂ）ＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含むＶLの組合せは、（ｉ）（ａ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５並びに（ｂ）配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；（ｉｉ）（ａ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５並びに（ｂ）配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；（ｉｉｉ）（ａ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５並びに（ｂ）配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに（ｉｖ）（ａ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５並びに（ｂ）配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０からなる群から選択される、抗体又はその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態において、抗体は、あらゆるアイソタイプ、例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ１並びにバリアント（配列番号４２、５７、及び５８）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、及びＩｇＹのＦｃドメインをさらに含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号４２、５７、又は５８、好ましくは配列番号５７、又は５８、より好ましくは配列番号５８の重鎖定常領域を含む。定常領域配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０（配列番号４１）
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ
ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７（配列番号４２）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ１バリアント定常領域（配列番号５７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ１バリアント定常領域（配列番号５８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９（配列番号４３）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０（配列番号４４）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１（配列番号４５）
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１（配列番号４６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６（配列番号４７）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７（配列番号４８）
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４（配列番号４９）
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号４１－４８、５７、５８に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一な重鎖定常領域を含む。加えて、又は代替として、一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号４９に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％同一な軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３の細胞外ドメインに結合する。一部の実施形態において、エピトープは、コンフォメーショナルエピトープである。
別の態様において、本発明の開示は、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２を含む重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列、若しくは１つ若しくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそれらのバリアント、又は配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９を含む重鎖アミノ酸配列若しくは１つ若しくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそれらのバリアントを含む、単離された免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体又はその抗原結合断片）を提供する。
加えて、又は代替として、一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７を含む軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列、若しくは１つ若しくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそれらのバリアント又は配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０を含む軽鎖アミノ酸配列若しくは１つ若しくは複数の保存的アミノ酸置換を有するそれらのバリアントを含む。
一部の実施態様において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、それぞれ配列番号２及び配列番号７（７－Ｉ１－Ｂ）；それぞれ配列番号１２及び配列番号１７（２－Ｃ８－Ａ）；それぞれ配列番号５９及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ）；それぞれ配列番号６０及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２）；それぞれ配列番号６１及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３）；それぞれ配列番号２２及び配列番号２７（１０－Ｏ１８－Ａ）；それぞれ配列番号６７及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ）；それぞれ配列番号６８及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２）；それぞれ配列番号６９及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３）；それぞれ配列番号３２及び配列番号３７（６－Ｇ２３－Ｆ）；それぞれ配列番号６３及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ）；それぞれ配列番号６４及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２）；並びにそれぞれ配列番号６５及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３）からなる群から選択される、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ）又は重鎖アミノ酸配列及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＬ）又は軽鎖アミノ酸配列を含む。
免疫グロブリン関連組成物の上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣ及びＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＤＬＬ３の細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を構成する。免疫グロブリン関連組成物の上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣ及びＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＤＬＬ３に結合し、免疫グロブリン関連組成物の内在化を促進する抗原結合部位を構成する。一部の実施形態において、エピトープは、コンフォメーショナルエピトープである。
一部の実施形態において、ＨＣ及びＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。他の実施形態において、ＨＣ及びＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。特定の実施形態において、抗体は、全長抗体である。
一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、少なくとも１つのＤＬＬ３ポリペプチドに特異的に結合する。一部の実施形態において、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、少なくとも１つのＤＬＬ３ポリペプチドと、約１０-3Ｍ、１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、又は１０-12Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合する。特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又は二重特異性抗体である。一部の実施形態において、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
特定の実施態様において、免疫グロブリン関連組成物は、以下の特徴のうちの１つ又は複数を含む：（ａ）配列番号７、１７、２７、３７、６２、６６、又は７０のいずれか１つに存在する軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列又は軽鎖配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一な軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列；及び／又は（ｂ）配列番号２、１２、２２、３２、５９、６０、６１、６３、６４、６５、６７、６８、又は６９のいずれか１つに存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列又は重鎖配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一な重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列。別の態様において、本明細書で提供される免疫グロブリン関連組成物における１つ又は複数のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換される。置換は、本明細書において定義されるような「保存的置換」であってもよい。
特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、Ｎ２９７Ａ及びＫ３２２Ａからなる群から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸置換若しくはアミノ酸残基のセット、重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵインデックスに従って）における２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への２つのアミノ酸置換（ＬＡＬＡ）、重鎖のアミノ酸残基３５６位のＧｌｕ（Ｅ）及び３５８位（ＥＵインデックスに従って）のＭｅｔ（Ｍ）のセット、又は重鎖の３５６位のＡｓｐ（Ｄ）及び３５８位（ＥＵインデックスに従って）のロイシン（Ｌ）のセット若しくはそれらのあらゆる組合せを含むＩｇＧ１定常領域を含有する。加えて、又は代替として、一部の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含むＩｇＧ４定常領域を含有する。上記のＬＡＬＡ置換を含む操作された抗体は、Ｆｃ媒介エフェクター免疫機能によって引き起こされる毒性、ＰＫプロファイル及び安定性の損失のいかなる望ましくない作用もなく、抗腫瘍作用を示す（Pharmacol Ther. 2019; 200: 110-125）。
一部の態様において、本明細書に記載される抗ＤＬＬ３免疫グロブリン関連組成物は、迅速な結合及び細胞の取り込み並びに／又は遅延放出を容易にするために構造改変を含有する。一部の態様において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体）は、迅速な結合及び細胞の取り込み並びに／又は遅延放出を容易にするために、ＣＨ２定常重鎖領域に欠失を含有していてもよい。一部の態様において、Ｆａｂ断片は、迅速な結合及び細胞の取り込み並びに／又は遅延放出を容易にするために使用される。一部の態様において、Ｆ（ａｂ）’２断片は、迅速な結合及び細胞の取り込み並びに／又は遅延放出を容易にするために使用される。
本明細書に記載される抗ＤＬＬ３抗体のアミノ酸配列改変が予期される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的な特性を改善することが望ましい場合がある。抗ＤＬＬ３抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又はそれへの挿入及び／又はその置換が挙げられる。得られた抗体が所望の特性を有する限りは、目的の抗体を得るために欠失、挿入、及び置換のあらゆる組合せがなされる。改変はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化も含む。変異誘発のための最も興味のある部位としては、高度可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更も予期される。「保存的置換」は、以下の表に示される。
Figure 2024503658000009
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体の１つ又は複数の高度可変領域の残基の置換を含む。このような置換バリアントを生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。具体的には、いくつかの高度可変領域部位（例えば、６～７つの部位）を突然変異させて、各部位でいずれかの可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして生成した抗体バリアントは、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合体として１価の様式で提示される。次いでファージディスプレイされたバリアントは、本明細書において開示されたように、その生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。改変のための候補高度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異は、抗原結合に著しく関与する高度可変領域残基を同定するために実行してもよい。代替として、又は加えて、抗体と抗原との間の接触ポイントを同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書で詳述される技術による置換のための候補である。このようなバリアントが生成されたら、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、類似の、又は優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために１つ又は複数の関連アッセイで選択することができる。
一態様において、本発明の技術は、本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物のいずれかをコードする核酸配列を提供する。本明細書に記載される抗体のいずれかをコードする組換え核酸配列も本明細書で開示される。一部の実施形態において、核酸配列は、配列番号１、６、１１、１６、２１、２６、３１、及び３６からなる群から選択される。
別の態様において、本発明の技術は、本明細書に記載される免疫グロブリン関連組成物のいずれかをコードするいずれかの核酸配列を発現する宿主細胞又は発現ベクターを提供する。
本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗ＤＬＬ３抗体）は、単一特異性、二重特異性、三重特異性であってもよいし、又はそれより高次の多重特性であってもよい。多重特異性抗体は、１つ又は複数のＤＬＬ３ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよいし、又はＤＬＬ３ポリペプチドに加えて、異種組成物、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体材料の両方に対して特異的であってもよい。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991)； 米国特許第５，５７３，９２０号、４，４７４，８９３号、５，６０１，８１９号、４，７１４，６８１号、４，９２５，６４８号；６，１０６，８３５号；Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照されたい。一部の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、キメラである。特定の実施形態において、免疫グロブリン関連組成物は、ヒト化されている。
本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物はさらに、Ｎ又はＣ末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合していてもよいし、又はポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲートされていてもよい（共有結合及び非共有結合によるコンジュゲーションを含む）。例えば、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、及び異種ポリペプチド、薬物、又は毒素などのエフェクター分子に、組換えによって融合又はコンジュゲートしていてもよい。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及びＥＰ０３９６３８７を参照されたい。
本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物の上記実施形態のいずれかにおいて、抗体又は抗原結合断片は、任意選択で、同位体、色素、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）、造影剤、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種、金属、リポソーム、ナノ粒子、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態において、本発明の技術の抗体又は抗原結合断片は、医薬的に許容される担体と組み合わせてもよい。化学結合又は物理的な結合の場合、免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、典型的には、薬剤上の官能基と会合する。代替として、薬剤上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基と会合する。
薬剤及び免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、直接会合していてもよい。例えば、薬剤上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基（例えば、スルフヒドリル基）と会合して、ジスルフィドを形成してもよい。代替として、官能基は、架橋剤（すなわち、リンカー）を介して会合していてもよい。架橋剤の一部の例は、後述される。架橋剤は、薬剤又は免疫グロブリン関連組成物のいずれかに付着していてもよい。コンジュゲート中の薬剤又は免疫グロブリン関連組成物の数はまた、他方に存在する官能基の数によっても限定される。例えば、コンジュゲートと会合した薬剤の最大数は、免疫グロブリン関連組成物上に存在する官能基の数によって決まる。代替として、薬剤と会合した免疫グロブリン関連組成物の最大数は、薬剤上に存在する官能基の数によって決まる。
さらに別の実施形態において、コンジュゲートは、１つの薬剤に会合した１つの免疫グロブリン関連組成物を含む。一実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物に化学結合した（例えば、コンジュゲートした）少なくとも１つの薬剤を含む。薬剤は、当業者公知のあらゆる方法によって免疫グロブリン関連組成物に化学結合していてもよい。例えば、薬剤上の官能基は、免疫グロブリン関連組成物上の官能基に直接付着されていてもよい。好適な官能基の一部の例としては、例えば、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアナト、イソチオシアネート及びヒドロキシルが挙げられる。
薬剤はまた、架橋剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどによって免疫グロブリン関連組成物に化学結合していてもよい。架橋剤は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから得ることができる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のウェブサイトは、補助を提供することができる。追加の架橋剤としては、オランダ、アムステルダムのＫｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｖ．の米国特許第５，５８０，９９０号；５，９８５，５６６号；及び６，１３３，０３８号に記載される白金架橋剤が挙げられる。
代替として、薬剤及び免疫グロブリン関連組成物上の官能基は、同じであってもよい。同一な官能基を架橋するために、典型的には、ホモ二官能性架橋剤が使用される。ホモ二官能性架橋剤の例としては、ＥＧＳ（すなわち、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］）、ＤＳＳ（すなわち、スベリン酸ジスクシンイミジル）、ＤＭＡ（すなわち、アジプイミド酸ジメチル．２ＨＣｌ）、ＤＴＳＳＰ（すなわち、３，３’－ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］））、ＤＰＤＰＢ（すなわち、１，４－ジ－［３’－（２’－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ブタン）、及びＢＭＨ（すなわち、ビスマレイミドヘキサン）が挙げられる。このようなホモ二官能性架橋剤も、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃより入手可能である。
他の例において、免疫グロブリン関連組成物から薬剤を切断することが有益な場合がある。上述したＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のウェブサイトはまた、細胞中で例えば酵素によって切断可能な好適な架橋剤を選ぶことにおける補助も当業者に提供することができる。したがって、薬剤は、免疫グロブリン関連組成物から分離されていてもよい。切断可能なリンカーの例としては、ＳＭＰＴ（すなわち、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－ａ－［２－ピリジルジチオ］トルエン）、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（すなわち、スルホスクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＰＤＰ（すなわち、Ｎ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミドヘキサノエート）、及びＡＥＤＰ（すなわち、３－［（２－アミノエチル）ジチオ］プロピオン酸ＨＣｌ）が挙げられる。
別の実施形態において、コンジュゲートは、少なくとも１つの免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合した少なくとも１つの薬剤を含む。薬剤を免疫グロブリン関連組成物と物理的に結合させるために、当業者公知のあらゆる方法が採用できる。例えば、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤は、当業者公知のあらゆる方法によって一緒に混合することができる。混合の順番は重要ではない。例えば、薬剤は、当業者公知のあらゆる方法によって免疫グロブリン関連組成物と物理的に混合することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤を容器に入れ、例えば容器を振盪することによってかき混ぜて、免疫グロブリン関連組成物及び薬剤を混合することができる。
免疫グロブリン関連組成物は、当業者公知のあらゆる方法によって改変することができる。例えば、免疫グロブリン関連組成物は、上述したように架橋剤又は官能基によって改変することができる。
本発明の抗体はまた、抗体の改変も含む。改変は、本発明の抗体を化学的又は生物学的に改変することを意味するのに使用される。このような化学的改変の例としては、アミノ酸骨格への化学部分の結合、及びＮ結合型又はＯ結合型炭水化物鎖の化学的改変が挙げられる。このような生物学的な改変の例としては、翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合型又はＯ結合型グリコシル化、Ｎ末端又はＣ末端プロセシング、脱アミド、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、及びＮ末端グルタミン又はＮ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換）を受けた抗体、及び原核生物の宿主細胞を使用して発現させた結果として、そのＮ末端にメチオニン残基が付加された抗体が挙げられる。加えて、このような改変はまた、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするための標識された抗体、例えば、酵素標識された抗体、蛍光標識された抗体、及び親和性標識された抗体を含むことも意味する。このような本発明の抗体の改変は、抗体の血中での安定性及び保持の改善；抗原性の低減；抗体又は抗原の検出又は単離などのために有用である。
さらに、本発明の抗体に結合する糖鎖改変を調節すること（グリコシル化、脱フコシル化など）によって、抗体依存性細胞傷害活性を強化することができる。抗体の糖鎖改変を調節する技術として、国際公報ＷＯ１９９９／５４３４２号、ＷＯ２０００／６１７３９号、及びＷＯ２００２／３１１４０号、ＷＯ２００７／１３３８５５号などに記載されるものが公知であるが、技術は、それらに限定されない。本発明の抗体はまた、抗体に関する前述の糖鎖改変が調節された抗体も含む。
抗体遺伝子が単離されたら、遺伝子を適切な宿主に導入して、宿主及び発現ベクターの適切な組合せを使用して抗体を作製することができる。抗体遺伝子の具体的な例は、本発明の説明に記載される抗体の重鎖配列をコードする遺伝子及びそこに記載された抗体の軽鎖配列をコードする遺伝子の組合せであり得る。宿主細胞の形質転換のとき、このような重鎖配列遺伝子及び軽鎖配列遺伝子は、単一の発現ベクターに挿入されてもよいし、又はその代わりに、これらの遺伝子は、それぞれ異なる発現ベクターに挿入されてもよい。
真核細胞が宿主として使用される場合、動物細胞、植物細胞又は真核微生物が使用されてもよい。特に、動物細胞の例としては、哺乳類細胞、例えばサル細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、チャイニーズハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損細胞株（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）（Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220）、及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を挙げることができる。
原核細胞が宿主として使用される場合、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用してもよい。
目的の抗体遺伝子は、形質転換のためにこれらの細胞に導入され、次いで形質転換した細胞はインビトロで培養されて、抗体が得られる。前述の培養において、抗体の配列に応じて収量が異なる場合があることから、インジケーターとして収量を使用して、等価な結合活性を有する抗体から、医薬として容易に作製される抗体を選択することが可能である。したがって、本発明の抗体はまた、形質転換宿主細胞を培養する工程、及び前述の工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能的な断片を収集する工程を含む、上述した抗体を作製するための方法により得られた抗体も含む。
培養された哺乳類細胞で作製された抗体の重鎖のカルボキシル末端におけるリジン残基は欠失していることが公知であり（Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)）、重鎖カルボキシル末端における２つのアミノ酸残基、グリシン及びリジンが欠失していること、及びカルボキシル末端に新たに配置されたプロリン残基はアミド化されていることも公知である（Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)）。しかしながら、これらの重鎖配列のこのような欠失及び改変は、抗体の抗原結合活性及びエフェクター機能（補体の活性化、抗体依存性細胞傷害など）への影響を有さない。したがって、本発明による抗体はまた、前述の改変を受けた抗体、及びその抗体の機能的な断片も含み、このような抗体の具体的な例としては、重鎖カルボキシル末端に１又は２アミノ酸の欠失を含む欠失突然変異体、及び前述の欠失突然変異体をアミド化することによって形成された欠失突然変異体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）が挙げられる。しかしながら、本発明による抗体の重鎖のカルボキシル末端に欠失を含む欠失突然変異体は、それらが抗原結合活性及びエフェクター機能を保持する限り、上述した欠失突然変異体に限定されない。本発明による抗体を構成する２つの重鎖は、全長抗体からなる群から選択される重鎖及び上述した欠失突然変異体のいずれか一方のタイプであってもよいし、又は前述の群から選択されるいずれか２つのタイプの組合せであってもよい。個々の欠失突然変異体の比率は、本発明による抗体を作製する培養された哺乳類細胞のタイプや培養条件によって影響を受ける可能性がある。本発明による抗体の主要な成分の例としては、２つの重鎖のカルボキシル末端のそれぞれにおいて１つのアミノ酸残基が欠失した抗体を挙げることができる。
抗体の生物学的活性の例としては、一般的に、抗原結合活性、抗原に結合することによって抗原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を強化する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を挙げることができる。本発明による抗体の機能は、ＤＬＬ３に対する結合活性であり、好ましくは、ＤＬＬ３に結合することによってＤＬＬ３を発現する細胞に内在化する活性である。さらに、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性、加えて、細胞内在化活性を有していてもよい。
ＩＶ．抗ＤＬＬ３抗体の作製
本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、あらゆる種由来であってもよい。種の好ましい例としては、ヒト、サル、ラット、マウス及びウサギを挙げることができる。本発明の抗ＤＬＬ３抗体がヒト以外の種から誘導される場合、周知の技術によって抗ＤＬＬ３抗体をキメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体が好ましい。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、腫瘍細胞を標的化することができる抗体である。具体的には、本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、腫瘍細胞の認識が可能な特性、腫瘍細胞への結合が可能な特性、及び／又は細胞内取り込みによって腫瘍細胞に内在化される特性などを有する。したがって、本発明の抗ＤＬＬ３抗体は、抗体－薬物コンジュゲートを調製するために、リンカーを介して抗腫瘍活性を有する化合物にコンジュゲートしていてもよい。
腫瘍細胞に対する抗体の結合活性は、フローサイトメトリーによって確認することができる。腫瘍細胞への抗体の取り込みは、（１）抗体に結合する二次抗体（蛍光標識した）を使用して蛍光顕微鏡下で細胞に取り込まれた抗体を可視化するアッセイ（Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761）（２）抗体に結合する二次抗体（蛍光標識した）を使用して細胞に取り込まれた蛍光の量を測定するアッセイ（Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004）又は（３）抗体に結合する免疫毒素を使用するＭａｂ－ＺＡＰアッセイであって、毒素は、細胞成長を抑制するように細胞内取り込みのときに放出される、アッセイ（Bio Techniques 28: 162-165, January 2000）によって確認することができる。ジフテリア毒素の触媒領域及びプロテインＧの組換えコンジュゲートタンパク質が、免疫毒素として使用される可能性がある。
本発明の説明において、用語「高い内在化能力」は、前述の抗体及びサポリン標識された抗ラットＩｇＧ抗体が投与されたＤＬＬ３を発現する細胞の生存率（これは、１００％と定義される抗体添加なしの場合の細胞生存率に対する比率によって示される）が、好ましくは７０％又はそれ未満であり、より好ましくは６０％又はそれ未満であることを意味するものとして使用される。
本発明の抗腫瘍抗体－薬物コンジュゲートは、抗腫瘍作用を発揮するコンジュゲート化合物を含む。それゆえに、必ずしもそうとは限らないが、抗体それ自体が抗腫瘍作用を有することが好ましい。腫瘍細胞において抗腫瘍化合物の細胞傷害性を特異的及び／又は選択的に発揮する目的のために、抗体が、腫瘍細胞に内在化され移行される特性を有することが重要であり好ましい。
抗ＤＬＬ３抗体は、この分野で通常実行される方法によって、抗原として作用するポリペプチドで動物を免疫化すること、次いで、その生体内で作製された抗体を収集及び精製することによって得ることができる。抗原としての３次元構造を保持するＤＬＬ３を使用することが好ましい。このような方法の例としては、ＤＮＡ免疫化方法を挙げることができる。
抗原の起源は、ヒトに限定されず、したがって、動物はまた、マウス又はラットなどの非ヒト動物由来の抗原で免疫化することもできる。この場合、ヒトの疾患に適用可能な抗体は、異種抗原に結合する得られた抗体の、ヒト抗原との交差反応性を検査することによって選択することができる。
さらに、抗原に対する抗体を作製する抗体産生細胞は、モノクローナル抗体が得られるようにハイブリドーマを確立するために、公知の方法により骨髄腫細胞と融合させてもよい（例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497；及びKennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)）。
以下、ＤＬＬ３に対する抗体を得るための方法を具体的に記載する。
一般的な概要。最初に、本発明の技術の抗体を生じさせる可能性がある標的ポリペプチドを選択する。例えば、抗体は、全長ＤＬＬ３タンパク質に対して、又はＤＬＬ３タンパク質の細胞外ドメインの一部に対して生じ得る。このような標的ポリペプチドに対する抗体を生成するための技術は、当業者周知である。このような技術の例としては、例えば、これらに限定されないが、ディスプレイライブラリー、ゼノマウス又はヒトマウス、ハイブリドーマを含むものなどが挙げられる。本発明の技術の範囲内の標的ポリペプチドとしては、免疫応答を惹起することが可能な、細胞外ドメインを含有するＤＬＬ３タンパク質由来のあらゆるポリペプチドが挙げられる。
ＤＬＬ３タンパク質に対する、組換え操作された抗体及び抗体断片、例えば抗体関連のポリペプチド及びそれらの断片は、本発明の開示に従った使用に好適であることが理解されるものとする。
本明細書に記載の技術に供することができる抗ＤＬＬ３抗体としては、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は抗体断片が挙げられる。抗体Ｆｖ含有ポリペプチド、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2抗体断片の高収量生成に有用な方法がすでに記載されている。米国特許第５，６４８，２３７号を参照されたい。
一般的に、抗体は、起源となる種から得られる。さらにとりわけ、標的ポリペプチド抗原への特異性を有する起源となる種の抗体の、軽鎖、重鎖又はその両方の可変部分の核酸又はアミノ酸配列が得られる。起源となる種は、本発明の技術の抗体又は抗体のライブラリーを生成するのに有用であったあらゆる種であり、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
ファージ又はファージミドディスプレイ技術は、本発明の技術の抗体を得るのに有用な技術である。モノクローナル抗体を生成及びクローニングするための技術は、当業者周知である。本発明の技術の抗体をコードする配列の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で行うことができる。
核酸コード配列の縮重により、本発明の技術の実施において、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列を使用してもよいその例としては、これに限定されないが、上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全部又は一部を含む核酸配列が挙げられ、このような核酸配列は、配列内の機能的に同等なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更されており、したがってサイレントな変化を引き起こす。本発明の技術による免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、標準的な方法（Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.）によって計算した場合、このようなバリアントがＤＬＬ３タンパク質を認識する有効な抗体を形成する限り、２５％までの配列相同性のバリエーションを許容することが理解される。例えば、ポリペプチド配列内の１つ又は複数のアミノ酸残基は、機能的な等価体として作用する類似の極性を有する別のアミノ酸によって置換されていてもよく、結果としてサイレントな変更が生じる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。また、例えば、グリコシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子又は他の細胞性リガンドへの連結などによって、翻訳中又はその後に差次的に改変されたタンパク質又はその断片若しくは誘導体も、本発明の技術の範囲内に含まれる。加えて、免疫グロブリンをコードする核酸配列は、翻訳、開始、及び／又は終結配列を作り出したり及び／若しくは破壊したりするために、又はコード領域中にバリエーションを作り出すために、及び／又は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成したり若しくは既存のそのような部位を破壊したりするために、さらにインビトロでの改変を容易にするために、インビトロ又はインビボで突然変異させてもよい。当業界において公知の変異誘発のためのあらゆる技術を使用でき、その例としては、これらに限定されないが、インビトロの部位特異的変異誘発、J. Biol. Chem. 253:6551、Ｔａｂリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが挙げられる。
ポリクローナル抗血清及び免疫原の調製。本発明の技術の抗体又は当該抗体断片を生成する方法は、典型的には、精製したＤＬＬ３タンパク質若しくはその断片又はＤＬＬ３タンパク質又はその断片を発現する細胞で対象（一般的に非ヒト対象、例えばマウス又はウサギ）を免疫化することを含む。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたＤＬＬ３タンパク質又は化学的に合成されたＤＬＬ３ペプチドを含有していてもよい。ＤＬＬ３タンパク質の細胞外ドメイン、又はその一部若しくは断片は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、ＤＬＬ３タンパク質、又はその一部若しくは断片に結合する抗ＤＬＬ３抗体を生成するための免疫原として使用することができる。
全長ＤＬＬ３タンパク質又はその断片は、免疫原としての断片として有用である。一部の実施形態において、ペプチドに対して生じた抗体がＤＬＬ３タンパク質との特異的な免疫複合体を形成するように、ＤＬＬ３断片は、ＤＬＬ３の細胞外ドメインを含む。
ＤＬＬ３の細胞外ドメインは、全長ＤＬＬ３タンパク質のアミノ酸２７～４９２にわたる４６６アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態において、抗原性ＤＬＬ３ペプチドは、少なくとも５、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０アミノ酸残基を含む。使用に応じて、当業者周知の方法によっては、より長い抗原性ペプチドが、より短い抗原性ペプチドより時には望ましい。所与のエピトープの多量体は、時には単量体より有効である。
必要な場合、ＤＬＬ３タンパク質（又はその断片）の免疫原性は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）又はオボアルブミン（卵子）などの担体タンパク質への融合又はコンジュゲーションによって増加させることができる。多くのこのような担体タンパク質は、当業界において公知である。またＤＬＬ３タンパク質を、従来のアジュバント、例えばフロイント完全又は不完全アジュバントと組み合わせて、ポリペプチドに対する対象の免疫反応を増加させることもできる。免疫応答を増加させるのに使用される様々なアジュバントとしては、これらに限定されないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバント、例えばカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、又は類似の免疫刺激性化合物が挙げられる。これらの技術は、当業界において標準的である。
本発明の技術を記載することにおいて、免疫応答は、「一次」又は「二次」免疫応答のいずれかとして記載することができる。一次免疫応答は、「防御的」免疫応答とも記載され、これは、特定の抗原、例えばＤＬＬ３タンパク質へのいくらかの最初の曝露（例えば、最初の「免疫化」）の結果として個体で生じた免疫応答を指す。一部の実施形態において、免疫化は、個体に抗原を含有するワクチンを接種した結果として起こり得る。例えば、ワクチンは、１種又は複数のＤＬＬ３タンパク質由来の抗原を含むＤＬＬ３ワクチンであり得る。一次免疫応答は、経時的に弱化又は減衰する可能性があり、さらには消失し、又は少なくとも検出できない程度に弱毒化することさえもあり得る。したがって、本発明の技術はまた、ここでは「メモリー免疫応答」とも記載される「二次」免疫応答にも関する。二次免疫応答という用語は、一次免疫応答がすでに生じた後に個体において惹起された免疫応答を指す。
したがって、二次免疫応答を惹起することで、例えば、弱化又は減衰した状態になった既存の免疫応答を強化したり、又は消失したか又はもはや検出できなくなったかのいずれかの以前の免疫応答を再び生じさせたりすることができる。二次又はメモリー免疫応答は、体液性（抗体）応答又は細胞の応答のいずれかであり得る。二次又はメモリー体液性応答は、最初の抗原提示で生成したメモリーＢ細胞の刺激で起こる。遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって媒介される細胞性二次又はメモリー免疫応答の一種である。最初の抗原曝露は免疫系を刺激し、追加の曝露はＤＴＨを引き起こす。
適切な免疫化の後、抗ＤＬＬ３抗体は、対象の血清から調製することができる。必要に応じて、ＤＬＬ３タンパク質に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することができ、さらにポリペプチドＡクロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。
モノクローナル抗体。本発明の技術の一実施形態において、抗体は、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体である。例えば、一部の実施形態において、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体は、ヒト又はマウス抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体であり得る。ＤＬＬ３タンパク質、又はその誘導体、断片、アナログ又はホモログに対するモノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養によって抗体分子の作製を提供するあらゆる技術を利用することができる。このような技術としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497を参照）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72を参照）及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の技術の実施で利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030を参照）、又はインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン－バーウイルスで形質転換することによって（例えば、Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照）作製することができる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団は、単離されてもよい。抗体の保存された領域をコードする配列由来のプライマーを利用するＰＣＲを使用して、集団から抗体の一部をコードする配列を増幅し、次いで抗体又はその断片、例えば可変ドメインをコードするＤＮＡが、増幅した配列から再構成される。このような増幅した配列はまた、ファージ又は細菌での融合ポリペプチドの発現及び提示のために、他のタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、バクテリオファージコート、又は細菌細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡに融合されていてもよい。次いで増幅した配列は、発現させることができ、さらに、例えば、ＤＬＬ３タンパク質上に存在する抗原又はエピトープに関する発現した抗体又はその断片の親和性に基づいて選択又は単離することができる。代替として、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫化し、次いで慣例的な方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製することができる。例えば、Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46）を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることは、多様な特異性（すなわち、異なるエピトープに対する）及び親和性を有するモノクローナル抗体を作製すると予想される。所望の特性、例えばＤＬＬ３結合を示す選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現された状態で使用してもよいし、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させてその特性を変更してもよいし、又はそれをコードするｃＤＮＡを単離し、シーケンシングし、様々な方法で操作してもよい。合成のデンドリマー状のツリー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒｉｃ ｔｒｅｅ）を反応性アミノ酸側鎖、例えばリジンに付加して、ＤＬＬ３タンパク質の免疫原性特性を強化することができる。またＣＰＧ－ジヌクレオチド技術を使用しても、ＤＬＬ３タンパク質の免疫原性特性を強化することができる。他の操作としては、貯蔵中又は対象への投与後の抗体の不安定さに寄与する特定のアミノアシル残基を置換するか又は欠失させること、及びＤＬＬ３タンパク質の抗体の親和性を改善するための親和性成熟技術が挙げられる。
ハイブリドーマ技術。一部の実施形態において、本発明の技術の抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって作製された抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術としては、当業界において公知のもの、及びHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)で教示されたものが挙げられる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を作製するための他の方法は、当業者周知である。
ファージディスプレイ技術。上述したように、本発明の技術の抗体は、組換えＤＮＡ及びファージディスプレイ技術の適用を介して作製することができる。例えば、抗ＤＬＬ３抗体は、当業界において公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、典型的には固体表面又はビーズに結合又は捕捉された抗原を用いて直接選択することによって、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウスの）から選択される。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィドで安定化されたＦｖ抗体ドメインを有するｆｄ及びＭ１３などの繊維状ファージである。加えて、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合させることができ（例えば、Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989を参照）、それにより、ＤＬＬ３ポリペプチド、例えば、そのポリペプチド又は誘導体、断片、アナログ又はホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で有効な同定を可能にする。本発明の技術の抗体の作製に使用できるファージディスプレイ方法の他の例としては、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ＷＯ９６／０６２１３；ＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）；ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）；並びに米国特許第５，６９８，４２６号、５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、５，５８０，７１７号、５，４２７，９０８号、５，７５０，７５３号、５，８２１，０４７号、５，５７１，６９８号、５，４２７，９０８号、５，５１６，６３７号、５，７８０，２２５号、５，６５８，７２７号及び５，７３３，７４３号で開示されたものが挙げられる。ジスルフィド結合を介してポリペプチドを付着させることによってバクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドを提示させるのに有用な方法は、Ｌｏｈｎｉｎｇによって、米国特許第６，７５３，１３６号に記載されている。上記の参考文献に記載されたように、ファージ選択の後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを使用して、ヒト抗体を含む全抗体、又は他のあらゆる所望の抗原結合断片を生成し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌などのいずれかの所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2断片を組換えによって作製する技術はまた、当業界において公知の方法例えば、ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992;及びSawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995;及びBetter et al., Science 240: 1041-1043, 1988で開示されたものを使用しても採用することができる。
一般的に、抗体又は当該抗体断片は、ファージ又はファージミド粒子の表面上に存在すると予想されることから、提示ベクターにクローニングされるハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体断片は、優れた結合活性を維持するバリアントを同定するために、適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)を参照されたい。しかしながら、他のベクター様式は、このプロセスに使用でき、例えば、選択及び／又はスクリーニングのための溶菌性ファージベクター（改変されたＴ７又はラムダＺａｐ系）に抗体断片ライブラリーをクローニングすることに使用できる。
組換え抗ＤＬＬ３抗体の発現。上述したように、本発明の技術の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製することができる。本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的には、天然に関連する又は異種プロモーター領域などの、抗ＤＬＬ３抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。したがって、本技術の別の態様は、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体をコードする１つ又は複数の核酸配列を含有するベクターを含む。本発明の技術のポリペプチドのうちの１つ又は複数の組換え発現のために、抗ＤＬＬ３抗体をコードするヌクレオチド配列の全部又は一部を含有する核酸は、当業界において周知の組換えＤＮＡ技術によって、さらに以下で詳述されるように、適切なクローニングベクター、又は発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクター）に挿入される。ベクターの多様な集団を作製するための方法は、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．によって米国特許第６，２９１，１６０号及び６，６８０，１９２号に記載される。
一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本発明の開示において、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は、同義的に使用することができる。しかしながら、本発明の技術は、このような技術的にはプラスミドではない発現ベクターの他の形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含むことが意図され、これらは、同等の機能を提供する。このようなウイルスベクターは、対象の感染及びその対象における構築物の発現を許容する。一部の実施形態において、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることが可能なベクターにおいて、真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、宿主は、抗ＤＬＬ３抗体をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現、並びに抗ＤＬＬ３抗体、例えば交差反応性抗ＤＬＬ３抗体の収集及び精製に好適な条件下で維持される。一般的に、Ｕ．Ｓ．２００２／０１９９２１３を参照されたい。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体のＤＮＡの構成部分としてのいずれかで、宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞を検出できるように、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性又はハイグロマイシン耐性選択マーカーを含有する。ベクターはまた、シグナルペプチドをコードしていてもよく、例えば、細胞外抗体断片の分泌を指示するのに有用なペクチン酸リアーゼをコードしていてもよい。米国特許第５，５７６，１９５号を参照されたい。
本発明の技術の組換え発現ベクターは、ＤＬＬ３結合特性を有するタンパク質をコードする核酸を、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づき選択された１つ又は複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載される。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどのような要因に依存する可能性があると理解されると予想される。組換えポリペプチド発現（例えば、抗ＤＬＬ３抗体）のプロモーターとして有用な典型的な調節配列としては、例えば、これらに限定されないが、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖分解酵素のプロモーターが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、なかでも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロムＣ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが挙げられる。一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体をコードするポリヌクレオチドは、ａｒａ Ｂプロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞において発現可能である。米国特許第５，０２８，５３０号を参照されたい。本発明の技術の発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、本明細書に記載される核酸によってコードされた融合ポリペプチドを含むポリペプチド又はペプチド（例えば、抗ＤＬＬ３抗体など）を作製することができる。
本発明の技術の別の態様は、１つ又は複数の抗ＤＬＬ３抗体をコードする核酸を含有する、抗ＤＬＬ３抗体を発現する宿主細胞に関する。本発明の技術の組換え発現ベクターは、原核又は真核細胞における抗ＤＬＬ３抗体の発現のために設計することができる。例えば、抗ＤＬＬ３抗体は、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、真菌細胞、例えば酵母、酵母細胞又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)でさらに論じられる。代替として、組換え発現ベクターは、インビトロで、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、転写及び翻訳させることができる。これまでに、確率論的に生成したポリヌクレオチド配列の発現を介した、予め決定された特性を有するポリペプチド、例えば抗ＤＬＬ３抗体の調製及びスクリーニングに有用な方法が記載されている。米国特許第５，７６３，１９２号；５，７２３，３２３号；５，８１４，４７６号；５，８１７，４８３号；５，８２４，５１４号；５，９７６，８６２号；６，４９２，１０７号；６，５６９，６４１号を参照されたい。
原核生物におけるポリペプチドの発現は、ほとんどの場合、融合又は非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指示する構成的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌で行われる。融合ベクターは、そこにコードされたポリペプチドに、通常、組換えポリペプチドのアミノ末端に、所定数のアミノ酸を追加する。このような融合ベクターは、典型的には、３つの目的：（ｉ）組換えポリペプチドの発現を増加させること；（ｉｉ）組換えポリペプチドの溶解性を増加させること；及び（ｉｉｉ）組換えポリペプチドの精製において、親和性精製におけるリガンドとして作用することによって補助することに役立つ。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合部分と組換えポリペプチドとのジャンクションにタンパク質分解による切断部位が導入されることで、融合ポリペプチドの精製の後、融合部分からの組換えポリペプチドの分離が可能になる。このような酵素、及びその同族認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチド、又はポリペプチドＡを標的組換えポリペプチドに融合させる、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc;Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315）及びｐＥＴ １１ｄ（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。ポリペプチド融合を介して多官能性ポリペプチドを得るための別個の活性なペプチド又はタンパク質ドメインの標的化されたアセンブリのための方法は、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．によって、米国特許第６，２９４，３５３号；６，６９２，９３５号に記載されている。大腸菌における組換えポリペプチド発現、例えば、抗ＤＬＬ３抗体を最大化する１つの戦略は、タンパク質分解によって組換えポリペプチドを切断する機能が損なわれた宿主細菌中でポリペプチドを発現させることである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、発現宿主、例えば大腸菌で優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照）。このような本発明の技術の核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
別の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。代替として、抗ＤＬＬ３抗体は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞で発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）において、ポリペプチド、例えば抗ＤＬＬ３抗体の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983）及びｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が挙げられる。
さらに別の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体をコードする核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、例えば、これらに限定されないが、ｐＣＤＭ８（Nature 329: 840, 1987を参照）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０から誘導される。本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体の発現に有用な、原核及び真核細胞の両方のための他の好適な発現系に関して、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
別の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において核酸の発現を指示することが可能である（例えば、組織特異的調節エレメント）。組織特異的調節エレメントは、当業界において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987）、リンパ球特異的プロモーター（Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988）、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989）及び免疫グロブリン（Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）、並びに乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターも包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990）及びα－フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989）である。
本発明の方法の別の態様は、本発明の技術の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の後代又は発生し得る後代も指すことが理解される。突然変異又は環境の影響のいずれかによって後の世代で特定の改変が起こる可能性があるため、このような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、いずれの原核又は真核細胞であってもよい。例えば、抗ＤＬＬ３抗体は、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、酵母又は哺乳類細胞で発現させることができる。哺乳類細胞は、免疫グロブリン又はその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現させるための好適な宿主である。Winnacker、From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)を参照されたい。無傷の異種タンパク質を分泌することが可能な多数の好適な宿主細胞株が当業界で開発されており、その例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞及び骨髄腫細胞株が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー、及び必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986。例示的な発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のプロモーターなどである。Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992。他の好適な宿主細胞は当業者公知である。
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞に導入することができる。用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための様々な当業界で認識されている技術を指すことが意図され、その例としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃又はウイルスベースのトランスフェクションが挙げられる。哺乳類細胞を形質転換するのに使用される他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションの使用が挙げられる（一般的に、Sambrook et al., Molecular Cloningを参照）。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、及び他の実験室マニュアルに見出すことができる。目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて、周知の方法によって宿主細胞に移行させることができる。
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、ことが公知である使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、ごくわずかな細胞だけが、外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことができる。これらの組み込み体を同定及び選択するために、一般的に、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。様々な選択可能マーカーとしては、薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートに対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、抗ＤＬＬ３抗体をコードするものと同じベクターで宿主細胞に導入してもよいし、又は別々のベクターで導入してもよい。導入された核酸が安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は、生存すると予想され、一方で他の細胞は死滅する）。
培養物中の本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体を含む宿主細胞、例えば原核又は真核宿主細胞は、組換え抗ＤＬＬ３抗体を作製する（すなわち、発現させる）のに使用することができる。一実施形態において、本方法は、抗ＤＬＬ３抗体が作製されるように、好適な培地中で宿主細胞（抗ＤＬＬ３抗体をコードする組換え発現ベクターが導入された）を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、培地又は宿主細胞から抗ＤＬＬ３抗体を単離する工程をさらに含む。一旦発現されたら、抗ＤＬＬ３抗体、例えば、抗ＤＬＬ３抗体又は抗ＤＬＬ３抗体関連のポリペプチドの収集は、培養培地及び宿主細胞から精製される。抗ＤＬＬ３抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当分野の標準的手順に従って、精製することができる。一実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号の方法によって宿主生物で作製される。通常、抗ＤＬＬ３抗体鎖は、シグナル配列と共に発現され、したがって、培養培地に放出される。しかしながら、抗ＤＬＬ３抗体鎖が宿主細胞によって天然に分泌されない場合、抗ＤＬＬ３抗体鎖は、穏やかな界面活性剤での処理によって放出させることができる。組換えポリペプチドの精製は当業界において周知であり、その例としては、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照）。
抗ＤＬＬ３抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗ＤＬＬ３抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入及びそれに続くトランスジェニック動物の乳での発現のために、導入遺伝子に取り込まれていてもよい。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、５，３０４，４８９号、及び５，８４９，９９２号を参照されたい。好適な導入遺伝子としては、カゼイン又はβ－ラクトグロブリンなどの乳腺特異的な遺伝子からのプロモーター及びエンハンサーと作動可能に連結された軽鎖及び／又は重鎖のコード配列が挙げられる。トランスジェニック動物の作製のために、導入遺伝子は、受精した卵母細胞にマイクロインジェクションされてもよいし、又は胚性幹細胞のゲノムに取り込ませてもよく、このような細胞の核が、除核した卵母細胞に移行される。
単鎖抗体。一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、単鎖抗ＤＬＬ３抗体である。本発明の技術に従って、ＤＬＬ３タンパク質に特異的な単鎖抗体の作製に技術を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。単鎖Ｆｖｓ及び本発明の技術の抗体を作製するのに使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び５，２５８，４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993;並びにSkerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988に記載されるものが挙げられる。
キメラ及びヒト化抗体。一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ抗ＤＬＬ３抗体である。一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、ヒト化抗ＤＬＬ３抗体である。本発明の技術の一実施形態において、ドナー及びアクセプター抗体は、異なる種からのモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおいてその抗原性を最小化するために）、この場合、得られたＣＤＲグラフト化抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。
組換え抗ＤＬＬ３抗体、例えばヒト及び非ヒト部分の両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製でき、本発明の技術の範囲内である。インビボでのヒトにおける本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体の使用、加えて、インビトロでの検出アッセイにおけるこれらの薬剤の使用などの一部の使用に関して、キメラ又はヒト化抗ＤＬＬ３抗体を使用することが可能である。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当業界において公知の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。このような有用な方法としては、例えば、これらに限定されないが、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許第１８４１８７号；欧州特許第１７１４９６号；欧州特許第１７３４９４号；ＰＣＴ国際公報ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；５，２２５，５３９号；欧州特許第１２５０２３号；Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988. Science 239: 1534; Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989;米国特許第５，８０７，７１５号；及びBeidler, et al., 1988. J. Immunol. 141: 4053-4060に記載される方法が挙げられる。例えば、抗体は、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，８５９，２０５号；６，２４８，５１６号；ＥＰ４６０１６７）、ベニアリング又はリサーフェイシング（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991；Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994）、及びチェーンシャッフリング（米国特許第５,５６５,３３２号）などの様々な技術を使用してヒト化することができる。一実施形態において、マウス抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡが、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するように特異的に選択された制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの等価な部分が置換される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１７３，４９４号;Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１２５，０２３号; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449；及びShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第６，３００，０６４号；６，６９６，２４８号；６，７０６，４８４号；６，８２８，４２２号を参照。
一実施形態において、本発明の技術は、ヒト抗マウス抗体（以下「ＨＡＭＡ」と称する）応答を誘導する可能性が低いが、それでもなお有効な抗体エフェクター機能を有するヒト化抗ＤＬＬ３抗体の構築を提供する。用語「ヒト」及び「ヒト化」は、抗体に関して、本明細書で使用される場合、ヒト対象において治療上許容できる弱い免疫原性応答を惹起すると予測されるあらゆる抗体に関する。一実施形態において、本発明の技術は、ヒト化抗ＤＬＬ３抗体、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンを提供する。
ＣＤＲグラフト化抗体。一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、抗ＤＬＬ３ ＣＤＲグラフト化抗体である。一般的に、抗ＤＬＬ３ ＣＤＲ抗体を生成するのに使用されるドナー及びアクセプター抗体は、異なる種からのモノクローナル抗体である；典型的には、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおけるその抗原性を最小化するために）、この場合、得られたＣＤＲグラフト化抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。詳細には、「ヒト化抗体」は、ヒト抗体鎖からの可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖及び非ヒト抗体（例えば、マウス）からの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を指す。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフト化された抗体を含むことは意図されない。グラフトは、アクセプター抗体の単一のＶH又はＶL以内の単一のＣＤＲのグラフトであってもよいし（又は単一のＣＤＲの一部であってもよい）、又はＶH及びＶLの一方又は両方以内の複数のＣＤＲ（又はそれらの一部）のグラフトであってもよい。多くの場合、アクセプター抗体の全ての可変ドメイン中の全ての３つのＣＤＲが、対応するドナーＣＤＲで置き換えられることになるが、得られたＣＤＲグラフト化抗体のＤＬＬ３タンパク質への十分な結合を許容するのに必要な程度分だけ置き換える必要がある。ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体を生成するための方法は、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；並びにＷｉｎｔｅｒのＵ．Ｓ．５，２２５，５３９；及びＥＰ０６８２０４０によって教示される。ＶH及びＶLポリペプチドを調製するのに有用な方法は、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，８１６，３９７号；６，２９１，１５８号；６，２９１，１５９号；６，２９１，１６１号；６，５４５，１４２号；ＥＰ０３６８６８４；ＥＰ０４５１２１６；及びＥＰ０１２０６９４によって教示される。
同じファミリー及び／又は同じファミリーメンバーから好適なフレームワーク領域候補を選択した後、重鎖及び軽鎖可変領域のいずれか又は両方は、起源となる種からのＣＤＲをハイブリッドフレームワーク領域にグラフト化することによって作製される。上記の態様のいずれかに関するハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体又はハイブリッド抗体断片のアセンブリは、当業者公知の従来の方法を使用して達成することができる。例えば、本明細書に記載されるハイブリッド可変ドメイン（すなわち、標的種に基づくフレームワーク及び起源となる種からのＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成及び／又はＰＣＲによって作製することができる。ＣＤＲ領域をコードする核酸はまた、好適な制限酵素を使用して起源となる種の抗体から単離し、好適なライゲーション酵素でライゲートすることによって、標的種のフレームワークにライゲートすることもできる。代替として、起源となる種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的変異誘発によって変更してもよい。
ハイブリッドは、各フレームワーク領域に対応する複数の候補から選択されたもので構成されているため、本明細書に記載される原理に従って構築するのに適した配列の多くの組合せが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の異なる組合せを有するメンバーを有するハイブリッドのライブラリーをアセンブリすることができる。このようなライブラリーは、配列の電子データベースコレクション又はハイブリッドの物理的なコレクションであってもよい。
このプロセスは、典型的には、グラフト化されたＣＤＲに隣接するアクセプター抗体のＦＲを変更しない。しかしながら、当業者は、時には、ドナー抗体の対応するＦＲにより類似したＦＲを作製するために所与のＦＲの特定の残基を置き換えることによって、得られた抗ＤＬＬ３ ＣＤＲグラフト化抗体の抗原結合親和性を改善してもよい。置換の好適な位置としては、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基、又はＣＤＲと相互作用することが可能なアミノ酸残基が挙げられる（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９、特に１２～１６列を参照）。又は当業者は、ドナーＦＲから開始して、アクセプターＦＲ又はヒトコンセンサスＦＲにより類似したものにそれを改変してもよい。これらの改変を作製するための技術は、当業界において公知である。とりわけ、得られたＦＲが、その位置に関してヒトコンセンサスＦＲに適合するか、又はこのようなコンセンサスＦＲに少なくとも９０％又はそれより高度に同一である場合、そのようにすることは、完全ヒトＦＲを有する同じ抗体と比較して、得られた改変された抗ＤＬＬ３ ＣＤＲグラフト化抗体の抗原性を著しく増加させない可能性がある。
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）。二重特異性抗体は、別個の構造を有する２つの標的、例えば２つの異なる標的抗原、同じ標的抗原上の２つの異なるエピトープと同時に結合できる抗体である。ＢｓＡｂは、例えば、同一又は異なる抗原の異なるエピトープを認識する重鎖及び／又は軽鎖を組み合わせることによって作製することができる。一部の実施形態において、分子機能によって、二重特異性の結合剤は、その２つの結合アームの一方の上の１つの抗原（又はエピトープ）と結合し（１つのＶＨ／ＶＬ対）、その第２のアーム上の異なる抗原（又はエピトープ）と結合する（異なるＶＨ／ＶＬ対）。この定義によれば、二重特異性結合剤は、２つの別個の抗原結合アーム（特異性及びＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合する各抗原に対して１価である。
本発明の技術の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）及び二重特異性抗体断片（ＢｓＦａｂ）は、例えばＤＬＬ３に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び第２の標的抗原に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有する。特定の実施形態において、ＢｓＡｂは、細胞表面上にＤＬＬ３抗原を発現する腫瘍細胞に結合することが可能である。
様々な二重特異性融合タンパク質は、分子工学を使用して作製することができる。例えば、完全免疫グロブリンフレームワーク（例えば、ＩｇＧ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はそれらの組合せのいずれかを利用するＢｓＡｂが構築されている。一部の実施形態において、二重特異性融合タンパク質は、２価であり、例えば、１つの抗原につき単一の結合部位を有するｓｃＦｖ及び第２の抗原のための単一の結合部位を有するＦａｂ断片を含む。一部の実施形態において、二重特異性融合タンパク質は、２価であり、例えば、１つの抗原につき単一の結合部位を有するｓｃＦｖ及び第２の抗原のための単一の結合部位を有する別のｓｃＦｖ断片を含む。他の実施形態において、二重特異性融合タンパク質は、４価であり、例えば、１つの抗原につき２つの結合部位を有する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）及び第２の抗原のための２つの同一なｓｃＦｖを含む。タンデム状の２つのｓｃＦｖ単位で構成されるＢｓＡｂは、臨床的に成功した二重特異性抗体様式であることが示されている。一部の実施形態において、ＢｓＡｂは、タンデム状の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）を含み、腫瘍抗原（例えば、ＤＬＬ３）と結合するｓｃＦｖが、異なる標的抗原に結合するｓｃＦｖと連結されるように設計されている。
近年のＢｓＡｂを作製するための方法としては、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプより強くそれらが架橋するように、追加のシステイン残基を有する操作された組換えモノクローナル抗体が挙げられる。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225 (1997)を参照されたい。別のアプローチは、必要な二重特異性を有する、２つ又はそれより多くの異なる単鎖抗体又は抗体断片セグメントを連結する組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163 (1997)を参照されたい。様々な二重特異性融合タンパク質が、分子工学を使用して作製することができる。
２つ又はそれより多くの異なる単鎖抗体又は抗体断片を連結する二重特異性融合タンパク質は、類似の方式で作製される。組換え方法は、様々な融合タンパク質を作製するのに使用することができる。一部の特定の実施形態において、本発明の技術によるＢｓＡｂは、免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖、並びにｓｃＦｖを含む。一部の特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書で開示されるいずれかのＤＬＬ３免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている。一部の特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書で開示されたいずれかのＤＬＬ３免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結されている。様々な実施形態において、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して重鎖又は軽鎖に連結されている。重鎖ＦｄのｓｃＦｖへのフレーム内接続に必要な適切なリンカー配列は、ＰＣＲ反応を介してＶL及びＶkappaドメインに導入される。次いでｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片は、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するステージングベクター（ｓｔａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）にライゲートされる。得られたｓｃＦｖ－ＣＨ１構築物は切り出され、ＤＬＬ３抗体のＶH領域をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターにライゲートされる。得られたベクターは、二重特異性融合タンパク質の発現のために適切な宿主細胞、例えば哺乳類細胞をトランスフェクトするのに使用することができる。
一部の実施形態において、リンカーは、長さが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれより多くのアミノ酸である。一部の実施形態において、リンカーは、硬い３次元構造をとらずに、むしろポリペプチド（例えば、第１及び／又は第２の抗原結合部位）にフレキシビリティーを提供する傾向があることを特徴とする。一部の実施形態において、リンカーは、例えば安定性の増加などのＢｓＡｂに付与された具体的な特性に基づいて、本明細書に記載されるＢｓＡｂで採用される。一部の実施形態において、本発明の技術のＢｓＡｂは、Ｇ4Ｓリンカー（配列番号８２）を含む。一部の特定の実施形態において、本発明の技術のＢｓＡｂは、（Ｇ4Ｓ）nリンカーを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５であるか、又はそれより大きい（配列番号８３）。
Ｆｃ改変。一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、バリアントＦｃ領域を含み、前記バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域（又は親のＦｃ領域）と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を含むことによって、前記分子は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に対して変更された親和性を有し、ただし、前記バリアントＦｃ領域は、Sondermann et al., Nature, 406:267-273 (2000)によって開示されたものなどのＦｃ－Ｆｃ受容体相互作用の結晶学的及び構造的な分析に基づいて、Ｆｃ受容体との直接の接触をもたらす位置に置換を有さない。ＦｃγＲなどのＦｃ受容体との直接の接触をもたらすＦｃ領域内の位置の例としては、アミノ酸２３４～２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５～２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７～２９９（Ｃ７Ｅループ）、及びアミノ酸３２７～３３２（Ｆ／Ｇ）ループが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、活性化及び／又は阻害性受容体に対する変更された親和性を有し、１つ又は複数のアミノ酸改変を有するバリアントＦｃ領域を有し、前記１つ又は複数のアミノ酸改変は、アラニンでのＮ２９７置換、又はアラニンでのＫ３２２置換である。
グリコシル化改変。一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、親Ｆｃ領域と比較して、バリアントグリコシル化を有するＦｃ領域を有する。一部の実施形態において、バリアントグリコシル化は、フコースの非存在を含み；一部の実施形態において、バリアントグリコシル化は、ＧｎＴ１欠乏ＣＨＯ細胞における発現に起因する。
一部の実施形態において、本発明の技術の抗体は、抗体の機能性、例えば抗原への結合活性を変更することなく、目的の抗原（例えば、ＤＬＬ３）に結合する適切な参照抗体と比べて改変されたグリコシル化部位を有していてもよい。「グリコシル化部位」は、本明細書で使用される場合、オリゴ糖（すなわち、互いに連結された２個又はそれより多くの単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合で付着すると予想される抗体中のあらゆる特異的なアミノ酸配列を含む。
オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ又はＯ結合のいずれかを介して抗体の主鎖に連結される。Ｎ結合型グリコシル化は、オリゴ糖部分のアスパラギン残基の側鎖への付着を指す。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、スレオニンへのオリゴ糖部分の付着を指す。例えば、フコース及び末端Ｎ－アセチルグルコサミンなどの特定のオリゴ糖が欠如したＦｃ－グリコフォーム（ｈＤＬＬ３－ＩｇＧｌｎ）は、特殊なＣＨＯ細胞中で作製でき、強化されたＡＤＣＣエフェクター機能を呈することができる。
一部の実施形態において、本明細書で開示される免疫グロブリン関連組成物の炭水化物含量は、グリコシル化部位を付加したり又は欠失させたりすることによって改変される。抗体の炭水化物含量を改変するための方法は当業界において周知であり、本発明の技術内に含まれ、例えば、米国特許第６，２１８，１４９号；ＥＰ０３５９０９６Ｂ１；米国特許公開ＵＳ２００２／００２８４８６号；国際特許出願公開ＷＯ０３／０３５８３５；米国特許公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号を参照されたい；これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、抗体（又はその関連する部分又は成分）の炭水化物含量は、抗体の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失させることによって改変される。一部の特定の実施形態において、本発明の技術は、２９７位をアスパラギンからアラニンに改変することによって、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失させることを含む。
操作されたグリコフォームは、これらに限定されないが、エフェクター機能を強化すること又は低減させることなどの様々な目的のために有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者公知のあらゆる方法によって生成することができ、例えば、操作された又はバリアント発現株を使用することによって、１つ又は複数の酵素、例えばＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現によって、様々な生物又は様々な生物からの細胞株においてＦｃ領域を含む分子を発現することによって、又はＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を改変することによって生成することができる。操作されたグリコフォームを生成するための方法は当業界において公知であり、その例としては、これらに限定されないが、それらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473；米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際特許出願公開ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；ＰＯＴＩＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるものが挙げられる。例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／０６１７３９；米国特許公開公報第２００３／０１１５６１４号；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49を参照されたい。
融合タンパク質。一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、融合タンパク質である。本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、第２のタンパク質に融合する場合、抗原性タグとして使用することができる。ポリペプチドに融合できるドメインの例としては、異種シグナル配列だけでなく、他の異種の機能的な領域も挙げられる。融合は、必ずしも直接的な融合でなくてもよいが、リンカー配列を介して生じるものでもよい。さらに、本発明の技術の融合タンパク質はまた、抗ＤＬＬ３抗体の特徴を改善するように操作することもできる。例えば、追加のアミノ酸、とりわけ荷電アミノ酸の領域を抗ＤＬＬ３抗体のＮ末端に付加して、宿主細胞からの精製又はそれに続く取り扱い及び貯蔵中の安定性及び持続性を改善することができる。またペプチド部分を抗ＤＬＬ３抗体に付加して、精製を容易にすることもできる。このような領域は、抗ＤＬＬ３抗体の最終的な調製の前に除去することができる。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当業界においてよく知られた慣例的な技術である。本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、マーカー配列、例えば融合したポリペプチドの精製を容易にするペプチドに融合していてもよい。選択された実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、なかでもｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ）に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号８４）であり、これらの多くは商業的に入手可能である。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989に記載されたように、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号８４）は、融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製に有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する。Wilson et al., Cell 37: 767, 1984。
したがって、これらの上記の融合タンパク質はいずれも、本発明の技術のポリヌクレオチド又はポリペプチドを使用して操作することができる。また一部の実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、インビボにおける半減期の増加も示す。
ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質（ＩｇＧによる）は、単量体の分泌されたタンパク質又はタンパク質断片単独と比較して、他の分子と結合すること及びそれを中和することにおいてより効率的であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
同様に、ＥＰ－Ａ－Ｏ４６４５３３（カナダの対応出願２０４５８６９）は、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を別のヒトタンパク質又はその断片と共に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、療法及び診断において有益であり、したがって、例えば改善した薬物動態学的特性をもたらすことができる。ＥＰ－Ａ０２３２２６２を参照されたい。代替として、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後にＦｃ部分を欠失させること又は改変することが望ましい場合がある。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、療法及び診断を妨害する可能性がある。創薬において、例えば、ヒトタンパク質、例えばｈＩＬ－５は、ｈＩＬ－５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995。
抗原の調製：ＤＬＬ３抗原は、宿主細胞が遺伝子操作に従って抗原タンパク質をコードする遺伝子を作製できるようにすることにより得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現することが可能なベクターが作製され、次いでベクターは、遺伝子がそこで発現されるように宿主細胞に導入され、その後、発現された抗原を精製することができる。抗体はまた、上述した遺伝子操作に基づき抗原を発現する細胞で、又は抗原を発現する細胞株で動物を免疫化する方法によっても得ることができる。
代替として、抗体はまた、抗原タンパク質を使用せずに、抗原タンパク質のｃＤＮＡを発現ベクターに取り込み、次いで免疫化される動物に発現ベクターを投与し、抗原タンパク質に対する抗体がそこで作製されるように、そのようにして免疫化された動物の体内で抗原タンパク質を発現させることによって得ることもできる。
本発明で使用される抗ＤＬＬ３抗体は、特に限定されない。例えば、本出願の配列表に示されるアミノ酸配列によって特定された抗体が、好適に使用することができる。本発明で使用される抗ＤＬＬ３抗体は、望ましくは、以下の特性を有する抗体である：
（１）以下の特性を有する抗体：
（ａ）ＤＬＬ３に特異的に結合すること、及び
（ｂ）ＤＬＬ３に結合することによってＤＬＬ３を発現する細胞に内在化される活性を有すること；又は
（２）上記の（１）に記載の抗体であって、ＤＬＬ３は、ヒトＤＬＬ３である、抗体。
本発明のＤＬＬ３に対する抗体を得るための方法は、抗ＤＬＬ３抗体を得ることができる限りは、特に限定されない。抗原として、そのコンフォメーションを保持するＤＬＬ３を使用することが好ましい。
抗体を得るための方法の一例としては、ＤＮＡ免疫化方法を挙げることができる。ＤＮＡ免疫化方法は、動物（例えば、マウス又はラット）個体を抗原発現プラスミドでトランスフェクトすること、次いで個体中で抗原を発現させて、抗原に対する免疫性を誘導することを含むアプローチである。トランスフェクションアプローチとしては、プラスミドを筋肉に直接注射する方法、トランスフェクション試薬、例えばリポソーム又はポリエチレンイミンを静脈に注射する方法、ウイルスベクターを使用するアプローチ、ジーンガンを使用してプラスミドを付着させた金粒子を注射するアプローチ、静脈にプラスミド溶液を大量に急速に注射する流体力学的方法などが挙げられる。発現プラスミドを筋肉注射するトランスフェクション方法に関して、インビボのエレクトロポレーションと呼ばれる技術は、プラスミドの筋肉内注射部位へのエレクトロポレーションを適用することを含み、これは、発現レベルを改善するためのアプローチとして公知である（Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70又はMir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7。このアプローチは、プラスミドの筋肉内注射の前に筋肉をヒアルロニダーゼで処置することによって発現レベルをさらに改善する（McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70）。さらに、ハイブリドーマ作製は、公知の方法によって実行してもよいし、また例えばＨｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実行してもよい。
モノクローナル抗体を得る具体的な例は、以下の手順を含んでいてもよい：
（ａ）免疫応答は、発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）にＤＬＬ３ ｃＤＮＡを取り込むこと、及び動物の体内でＤＬＬ３を発現するように、エレクトロポレーション又はジーンガンなどの方法によって、免疫化される動物（例えば、ラット又はマウス）にベクターを直接投与することにより誘導することができる。エレクトロポレーションなどによるベクターの投与は、抗体力価を強化するために必要に応じて、１回又はそれより多く、好ましくは複数回、実行してもよい；
（ｂ）免疫応答が誘導された前述の動物からの抗体産生細胞を含有する組織（例えば、リンパ節）の収集；
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「骨髄腫」と称する）（例えば、マウス骨髄腫ＳＰ２／０－ａｇ１４細胞）の調製；
（ｄ）抗体産生細胞と骨髄腫との細胞融合；
（ｅ）目的の抗体を作製するハイブリドーマ群の選択；
（ｆ）単一細胞クローンへの分裂（クローニング）；
（ｇ）任意選択で、モノクローナル抗体の大量作製のためのハイブリドーマの培養、若しくはハイブリドーマを接種する動物の繁殖；並びに／又は
（ｈ）このようにして作製されたモノクローナル抗体の生理学的活性（内在化活性）及び結合特異性の研究、若しくは標識試薬としての抗体の特性の検査。
本明細書において使用される抗体力価を測定するための方法の例としては、これらに限定されないが、フローサイトメトリー及びＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡを挙げることができる。
本発明の抗体はまた、ヒトに対する異種遺伝子型の抗原性を低減させる目的のために人工的に改変された、遺伝学的に組換えられた抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体、加えてＤＬＬ３に対する上述したモノクローナル抗体も含む。これらの抗体は、公知の方法によって作製することができる。
キメラ抗体の例としては、可変領域及び定常領域が互いに異種である抗体、例えば、マウス又はラット由来の抗体の可変領域をヒト由来の定常領域にコンジュゲートすることによって形成されたキメラ抗体を挙げることができる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)を参照）。
ヒト化抗体の例としては、ヒト由来の抗体に相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを取り込むことによって形成された抗体（Nature (1986) 321, p. 522-525を参照）、ＣＤＲグラフティング方法に従ってヒト抗体に一部のフレームワーク、加えてＣＤＲ配列からのアミノ酸残基を取り込むことによって形成された抗体（国際公開ＷＯ９０／０７８６１号）、及び抗原と結合する能力を維持しながら一部のＣＤＲのアミノ酸配列を改変することによって形成された抗体を挙げることができる。
本発明の抗体のさらなる例としては、ＤＬＬ３に結合するヒト抗体を挙げることができる。抗ＤＬＬ３ヒト抗体は、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＤＬＬ３ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを使用する方法により得ることができる（Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727などを参照）。
このようなヒト抗体産生マウスは、その内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座を破壊し、次いで、その代わりに酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターなどを使用して、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子改変動物を使用し、次いでこのような遺伝子改変された動物からノックアウト動物及びトランスジェニック動物を作製し、次いでこのような動物を互いに繁殖させることによって、特異的に作製してもよい。
それ以外の方法で、抗ＤＬＬ３ヒト抗体はまた、遺伝学的組換え技術に従って、このようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれをコードするｃＤＮＡで、又は好ましくは、ｃＤＮＡを含むベクターで真核細胞を形質転換すること、次いで、培養上清から抗体が得られるように、遺伝子改変されたヒトモノクローナル抗体を作製する形質転換した細胞を培養することによっても得ることもできる。
この状況において、真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、リンパ球又は骨髄腫は、例えば、宿主として使用することができる。
さらに、ヒト抗体ライブラリーから選択されたファージディスプレイ由来のヒト抗体を得る方法（Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431などを参照）もまた公知である。
例えば、ヒト抗体の可変領域を単鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージの表面上に発現させ、次いで抗原に結合するファージを選択することを含むファージディスプレイ方法を適用することができる（Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116）。
抗原へのその結合能力のために選択されたファージ遺伝子を分析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が決定されたら、前述の配列を有する発現ベクターが作製され、作製された発現ベクターは次いで適切な宿主に導入され、そこで発現させることができ、それによってヒト抗体が得られる（国際公報ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／２０７９１号、ＷＯ９３／０６２１３号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９３／１９１７２号、ＷＯ９５／０１４３８号、及びＷＯ９５／１５３８８号、Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116）。
本発明の説明におけるアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、特定のアミノ酸側鎖に関連するアミノ酸グループ内で起こる置換である。好ましいアミノ酸グループは、以下の通りである：酸性グループ＝アスパラギン酸及びグルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、及びヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン；及び非荷電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、及びチロシン。他の好ましいアミノ酸グループは、以下の通りである：脂肪族ヒドロキシ基＝セリン及びスレオニン；アミドを含有するグループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；及び芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。このようなアミノ酸置換は、好ましくは、元のアミノ酸配列を有する物質の特性を損なうことなく行われる。
Ｖ．抗ＤＬＬ３抗体の同定及び特徴付け
本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体を同定及び／又はスクリーニングするための方法。ＤＬＬ３タンパク質に対する所望の特異性を有するもの（例えば、ＤＬＬ３の細胞外ドメインに結合するもの）に関してＤＬＬ３ポリペプチドに対する抗体を同定及びスクリーニングするのに有用な方法は、当業界公知のあらゆる免疫学的に媒介される技術を含む。免疫応答の成分は、当業者周知の様々な方法によって、インビトロで検出することができる。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球を、放射標識された標的細胞と共にインキュベートし、これらの標的細胞の溶解物は、放射活性の放出によって検出することができる；（２）ヘルパーＴリンパ球を、抗原及び抗原提示細胞と共にインキュベートし、サイトカインの合成及び分泌を標準的な方法によって測定することができる（Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995）；（３）抗原提示細胞をタンパク質抗原全体と共にインキュベートし、ＭＨＣ上におけるその抗原の提示を、Ｔリンパ球活性化アッセイ又は生物物理学的な方法のいずれかによって検出することができる（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989）；（４）肥満細胞を、そのＦｃ－イプシロン受容体を架橋する試薬と共にインキュベートし、ヒスタミン放出を酵素免疫検査法によって測定することができる（Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983）；及び（５）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
同様に、モデル生物（例えば、マウス）又はヒト対象のいずれかにおける免疫応答の生成物も、当業者周知の様々な方法によって検出することができる。例えば、（１）ワクチン接種に応答する抗体の作製は、臨床実験室で現在使用されている標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡによって容易に検出することができる；（２）免疫細胞の炎症部位への移動は、皮膚表面を引っ掻き、滅菌容器に入れて、引っ掻いた部位にわたり移動する細胞を捕獲することによって検出することができる（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）；（３）マイトジェン又は混合リンパ球反応に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖は、３Ｈ－チミジンを使用して測定することができる；（４）顆粒球、マクロファージ、及びＰＢＭＣ中の他の食細胞の食細胞能力は、ウェル中にＰＢＭＣを標識された粒子と共に入れることによって測定することができる（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）；及び（５）免疫系細胞の分化は、ＣＤ分子、例えばＣＤ４及びＣＤ８に対する抗体でＰＢＭＣを標識付け、これらのマーカーを発現するＰＢＭＣの割合を測定することによって測定することができる。
一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、複製可能な遺伝学的パッケージの表面上へのＤＬＬ３ペプチドの提示を使用して選択される。例えば、米国特許第５，５１４，５４８号；５，８３７，５００号；５，８７１，９０７号；５，８８５，７９３号；５，９６９，１０８号；６，２２５，４４７号；６，２９１，６５０号；６，４９２，１６０号；ＥＰ５８５２８７；ＥＰ６０５５２２；ＥＰ６１６６４０；ＥＰ１０２４１９１；ＥＰ５８９８７７；ＥＰ７７４５１１；ＥＰ８４４３０６を参照されたい。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する糸状バクテリオファージ粒子を作製／選択するのに有用な方法が記載されている。例えば、ＥＰ７７４５１１；ＵＳ５８７１９０７；ＵＳ５９６９１０８；ＵＳ６２２５４４７；ＵＳ６２９１６５０；ＵＳ６４９２１６０を参照されたい。
一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、酵母宿主細胞の表面上へのＤＬＬ３ペプチドの提示を使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるｓｃＦｖポリペプチドの単離に有用な方法が、Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10によって記載されている。
一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリーにおいてリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994;及びHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997によって記載されている。
特定の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、ＤＬＬ３ペプチドのｔＲＮＡディスプレイを使用して選択される。インビトロにおけるｔＲＮＡディスプレイを使用するリガンドの選択に有用な方法は、Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002によって記載されている。
一実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、ＲＮＡディスプレイを使用して選択される。ＲＮＡディスプレイライブラリーを使用してペプチド及びタンパク質を選択するのに有用な方法は、Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997; and Nemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997によって記載されている。非天然ＲＮＡディスプレイライブラリーを使用してペプチド及びタンパク質を選択することに有用な方法は、Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003によって記載されている。
一部の実施形態において、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体は、グラム陰性細菌のペリプラズムで発現され、標識されたＤＬＬ３タンパク質と混合される。ＷＯ０２／３４８８６を参照されたい。ＤＬＬ３タンパク質に親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンにおいて、Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004及び米国特許公開第２００４／００５８４０３号に記載されたように、抗ＤＬＬ３抗体に結合した標識されたＤＬＬ３タンパク質の濃度は増加し、細胞をライブラリーの残りから単離することが可能になる。
所望の抗ＤＬＬ３抗体の選択の後、前記抗体は、当業者公知のあらゆる技術によって、例えば原核又は真核細胞発現などによって大量に作製できることが予期される。抗ＤＬＬ３抗体は、例えば、これらに限定されないが、抗ＤＬＬ３ハイブリッド抗体又は断片であり、これは、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来の技術を使用することによって作製することができ、それにおいて、元の種抗体結合特異性を保持するのに必要なＣＤＲ、及び必要に応じて可変領域フレームワークの最小部分（本明細書に記載される技術によって操作されたものなど）が、起源となる種抗体から誘導され、抗体の残部が、本明細書に記載される通りに操作することができる標的種の免疫グロブリンから誘導され、それによって、ハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターが作製される。
ＤＬＬ３結合の測定。一部の実施形態において、ＤＬＬ３結合アッセイは、ＤＬＬ３タンパク質及び抗ＤＬＬ３抗体を、ＤＬＬ３タンパク質と抗ＤＬＬ３抗体との結合に好適な条件下で混合し、ＤＬＬ３タンパク質と抗ＤＬＬ３抗体との結合の量を評価するアッセイ様式を指す。結合の量は、好適な対照と比較され、対照は、ＤＬＬ３タンパク質の非存在下における結合の量、非特異的な免疫グロブリン組成物の存在下における結合の量、又はその両方であり得る。結合の量は、あらゆる好適な方法によって評価することができる。結合アッセイ方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜ろ過アッセイなどが挙げられる。抗ＤＬＬ３抗体に結合するＤＬＬ３タンパク質の直接的な測定のための生物物理学的なアッセイは、例えば、核磁気共鳴、蛍光、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥチップ）、バイオレイヤー干渉法などである。特異的な結合は、当業界において公知の標準的なアッセイによって、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＲＥＴ、免疫沈降、ＳＰＲ、ＮＭＲ（２Ｄ－ＮＭＲ）、質量分析法などによって決定される。候補抗ＤＬＬ３抗体の特異的な結合が、候補抗ＤＬＬ３抗体の非存在下で観察される結合より少なくとも１パーセント大きい場合、候補抗ＤＬＬ３抗体は、本発明の技術の抗ＤＬＬ３抗体として有用である。
上述した重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列に高い同一性を示す配列を一緒に組み合わせることによって、上述した抗体のそれぞれの生物学的活性と同等の生物学的活性を有する抗体を選択することが可能になる。このような同一性は、一般的に８０％又はそれより高い、好ましくは９０％又はそれより高い、より好ましくは９５％又はそれより高い、最も好ましくは９９％又はそれより高い同一性である。さらに、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列と比べて、それらの１つの又はいくつかのアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を含む重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上述した抗体のそれぞれの生物学的活性と同等な生物学的活性を有する抗体を選択することが可能になる。
２つのタイプのアミノ酸配列間の同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗバージョン２のデフォルトパラメーターを使用して配列をアライメントすることによって決定することができる（Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007),“Clustal W and Clustal X version 2.0”, Bioinformatics. 23 (21): 2947-2948）。
新たに作製されたヒト抗体が、いずれか１つの本発明の説明に記載されるラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体が結合する部分的なペプチド又は部分的な３次元構造に結合する場合、ヒト抗体が、ラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体が結合するのと同じエピトープに結合することを決定できる。代替として、ヒト抗体が、抗体のＤＬＬ３への結合において本発明の説明に記載されるラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体と競合することを確認することによって、エピトープの特異的な配列又は構造が決定されていない場合であっても、ヒト抗体が、本発明の説明に記載されるラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体が結合するのと同じエピトープに結合することを決定できる。本発明の説明において、これらの決定方法のうちの少なくとも１つによって、ヒト抗体が「同じエピトープに結合する」ことが決定される場合、本発明の説明に記載されるラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体に関するものと同様に、新たに調製されたヒト抗体は、「同じエピトープに結合する」と結論付けられる。ヒト抗体が同じエピトープに結合することが確認される場合、ヒト抗体は、ラット抗ヒトＤＬＬ３抗体、キメラ抗ヒトＤＬＬ３抗体又はヒト化抗ヒトＤＬＬ３抗体の生物学的活性と同等の生物学的活性を有することが予測される。
上述した方法により得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体は、好ましい抗体が選択できるように、公知の方法などにより、抗原に対するそれらの結合活性に関して評価される。
抗体の特性の比較のための別のインジケーターの一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査熱量計（ＤＳＣ）は、タンパク質の相対的な構造的安定性のための優れたインジケーターとして役立つ熱変性中点（Ｔｍ）を敏速及び正確に測定することが可能な装置である。ＤＳＣを使用してＴｍ値を測定し、得られた値に関する比較を行うことによって、熱安定性の差を比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性と特定の相関を有することが公知であり（Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273）、したがって、好ましい抗体は、インジケーターとして熱安定性を使用して選択することができる。抗体の選択のためのインジケーターの他の例としては、好適な宿主細胞における高い収量、及び水溶液中での低い凝集を挙げることができる。例えば、収量が最大の抗体が、必ずしも最大の熱安定性を呈するとは限らないため、前述のインジケーターに基づいてそれを包括的に決定することによって、ヒトへの投与に最も好適な抗体を選択することが必要である。
得られた抗体は、同質の状態になるまで精製してもよい。抗体の分離及び精製のために、通常のタンパク質のために使用される分離及び精製方法を使用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び等電点分画法が適切に選択され、抗体を分離及び精製できるように互いに組み合わされるが（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); and Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）、分離及び精製方法の例は、それらに限定されない。
クロマトグラフィーの例としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び吸収クロマトグラフィーを挙げることができる。
これらのクロマトグラフ技術は、液体クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ又はＦＰＬＣを使用して行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに使用されるカラムの例としては、プロテインＡカラム及びプロテインＧカラムを挙げることができる。プロテインＡの使用を含むカラムの例としては、ハイパーＤ（Ｈｙｐｅｒ Ｄ）、ＰＯＲＯＳ、及びセファロースＦ．Ｆ．（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ． Ｆ．）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を挙げることができる。
また抗原が固定された担体を使用して、抗原への抗体の結合活性を利用することによって、抗体を精製することもできる。
ＶＩ．抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
Ａ．薬物
本明細書に記載される抗ＤＬＬ３抗体（例えば、２－Ｃ８－Ａ、６－Ｇ２３－Ｆ、及び１０－Ｏ１８－Ａ又はヒト抗体：Ｈ２－Ｃ８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２、及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３）を、薬物にリンカー構造部分を介してコンジュゲートして、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製することができる。薬物は、それがリンカー構造に接続できる置換基又は部分構造を有する限り、特に限定されない。抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、コンジュゲートした薬物に応じて様々な目的のために使用することができる。このような薬物の例としては、抗腫瘍活性を有する物質、血液疾患に有効な物質、自己免疫疾患に有効な物質、抗炎症性物質、抗微生物物質、抗真菌物質、抗寄生虫物質、抗ウイルス物質、及び抗麻痺物質（ａｎｔｉ－ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を挙げることができる。
ｉ．抗腫瘍化合物
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート中のコンジュゲートさせる化合物として抗腫瘍化合物を使用する実施例は、後述される。抗腫瘍化合物は、化合物が抗腫瘍作用を有し、リンカー構造に接続できる置換基又は部分構造を有する限り、特に限定されない。腫瘍細胞においてリンカーの一部又は全部が切断されると、抗腫瘍化合物が抗腫瘍作用を呈するように、抗腫瘍化合物部分が放出される。リンカーが薬物との接続位置で切断される場合、抗腫瘍化合物は、その元の構造で放出されて、その元の抗腫瘍作用を発揮する。
本明細書で開示される抗ＤＬＬ３抗体（例えば、２－Ｃ８－Ａ、６－Ｇ２３－Ｆ、及び１０－Ｏ１８－Ａ又はヒト抗体：Ｈ２－Ｃ８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２、及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３）、例えばセクションＩＶ．「抗ＤＬＬ３抗体の作製」に記載されたようにして得られたものを、リンカー構造部分を介して抗腫瘍化合物にコンジュゲートして、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを調製することができる。
本発明で使用される抗腫瘍化合物の一例として、エキサテカン、カンプトテシン誘導体（以下の式によって表される（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－２，３－ジヒドロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）－ジオン）が、好ましく使用することができる。
Figure 2024503658000010
化合物は、例えば、米国特許公開ＵＳ２０１６／０２９７８９０号に記載される方法又は他の公知の方法によって得ることができ、１位におけるアミノ基は、好ましくはリンカー構造への接続位置として使用することができる。さらに、エキサテカンは、リンカーの一部がまだそれに付着したままで腫瘍細胞中で放出される場合がある。しかしながら、この化合物は、このような状況であっても優れた抗腫瘍作用を発揮する。
エキサテカンはカンプトテシン構造を有するため、酸性水性媒体（例えば、およそｐＨ３）中では、形成されたラクトン環（閉環）を有する構造に平衡がシフトし、それに対して塩基性水性媒体（例えば、およそｐＨ１０）中では、開環したラクトン環（開環）を有する構造に平衡がシフトすることが公知である。このような閉環構造及び開環構造に対応するエキサテカン残基が導入された薬物コンジュゲートも、同等の抗腫瘍作用を有すると予測され、言うまでもないが、このような薬物コンジュゲートはいずれも本発明の範囲内に含まれる。
抗腫瘍化合物の他の例としては、文献（Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016）に記載される抗腫瘍化合物を挙げることができる。その具体的な例としては、ドキソルビシン、カリケアマイシン、ドラスタチン１０、オーリスタチン、例えばモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシノイド、例えばＤＭ１及びＤＭ４、ピロロベンゾジアゼピン二量体ＳＧ２０００（ＳＪＧ－１３６）、カンプトテシン誘導体ＳＮ－３８、デュオカルマイシン、例えばＣＣ－１０６５、アマニチン、ダウノルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、シクロシチジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、白金ベースの抗癌剤（シスプラチン及びその誘導体）、並びにタキソール及びその誘導体を挙げることができる。
抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の数は、その効能及び安全性に影響を有する主要な要素である。抗体－薬物コンジュゲートの作製は、一定数のコンジュゲートした薬物分子が達成されるように、反応に使用される出発材料や試薬の量などの反応条件を特定することによって行われる。低分子量化合物の化学反応とは異なり、通常、異なる数のコンジュゲートした薬物分子を含有する混合物が得られる。抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の数は、平均値として、すなわちコンジュゲートした薬物分子の平均数として定義され、示される。別段の規定がない限り、すなわち、異なる数のコンジュゲートした薬物分子を有する抗体－薬物コンジュゲート混合物中に含まれる、特定の数のコンジュゲートした薬物分子を有する抗体－薬物コンジュゲートを表す場合を除いて、本発明によるコンジュゲートした薬物分子の数も、原則的に平均値を意味する。抗体分子にコンジュゲートしたエキサテカン分子の数は制御可能であり、抗体１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数として、およそ１～１０個のエキサテカン分子がコンジュゲートすることができる（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）。エキサテカン分子の数は、好ましくは２～８、３～８、４～８、５～８、６～８、又は７～８であり、より好ましくは５～８、さらに好ましくは７～８、依然としてさらに好ましくは８である。当業者であれば、本出願の実施例の記載に基づいて必要な数の薬物分子を抗体分子にコンジュゲートさせるための反応を設計でき、制御された数のコンジュゲートしたエキサテカン分子を有する抗体－薬物コンジュゲートを得ることができることに留意されたい。
Ｂ．リンカー構造
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物を抗ＤＬＬ３抗体にコンジュゲートするリンカー構造を説明する。
本出願の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗ＤＬＬ３抗体を薬物にコンジュゲートするリンカー構造は、得られた抗体－薬物コンジュゲートが使用可能な限り、特に限定されない。リンカー構造は、使用目的に従って適切に選択し、使用することができる。リンカー構造の一例としては、公知の文献（Pharmacol Rev 68: 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0など）に記載されるリンカーを挙げることができる。そのさらなる具体的な例としては、ＶＣ（バリン－シトルリン）、ＭＣ（マレイミドカプロイル）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート、ＳＳ（ジスルフィド）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート、ＳＳ／ヒドラゾン、ヒドラゾン及びカーボネートを挙げることができる。
別の例としては、米国特許公開ＵＳ２０１６／０２９７８９０号に記載されるリンカー構造（一例として、その段落［０２６０］～［０２８９］に記載されるもの）を挙げることができる。以下に示すあらゆるリンカー構造が好ましく使用することができる。構造の左の末端が抗体への接続位置であり、その右の末端が薬物への接続位置であることに留意されたい。さらに、以下に示されるリンカー構造中のＧＧＦＧ（配列番号８５）は、ペプチド結合を介して連結されたグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンからなるアミノ酸配列（ＧＧＦＧ；配列番号８５）を表す。
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
より好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
より一層好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
抗体は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）の末端（例えば、「－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－」において－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－が接続されている末端と逆の末端（左の末端））に接続されており、抗腫瘍化合物は、抗体が－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）に接続されている末端と逆の末端（上述した例における右の末端のＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－のカルボニル基）に接続されている。「－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－」は、以下の式によって表される構造を有する：
Figure 2024503658000011
 この部分構造の３位は、抗ＤＬＬ３抗体への接続位置である。この３位における抗体への接続は、チオエーテル結合を形成することを特徴とする。この構造部分の１位における窒素原子は、その構造を含むリンカー内に存在するメチレンの炭素原子に接続されている。
薬物としてエキサテカンを有する本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、以下に示すいずれかの構造を有する薬物－リンカー構造部分が、抗体へのコンジュゲーションのために好ましい。これらの薬物－リンカー構造部分について、抗体１個当たりのコンジュゲートしたものの平均数は、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）であってもよく、好ましくは２～８、より好ましくは５～８、さらに好ましくは７～８、依然としてさらに好ましくは８である。
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
より好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
より一層好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（ＮＨ－ＤＸ）（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
－（ＮＨ－ＤＸ）は、以下の式によって表される構造：
Figure 2024503658000012
 を有し、これは、エキサテカンの１位におけるアミノ基から１個の水素原子を除去することによって得られた基を表す。
Ｃ．抗体－薬物コンジュゲートを作製するための方法
本発明の抗体－薬物コンジュゲートで使用できる抗体は、それが、上記のセクションＩＶ．「抗ＤＬＬ３抗体の作製」及び実施例に記載されたような内在化活性を有する抗ＤＬＬ３抗体又はその抗体の機能的な断片である限り、特に限定されない。一部の実施態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、２－Ｃ８－Ａ、６－Ｇ２３－Ｆ、１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２、又はＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３である。
次に、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを作製するための典型的な方法を説明する。以下の説明において、各反応スキームに示される「化合物番号」は、化合物を表すのに使用されることに留意されたい。具体的には、各化合物は、「式（１）の化合物」、「化合物（１）」などと称される。同じことが、他の化合物番号にも当てはまる。
Ｄ．作製方法１
抗ＤＬＬ３抗体がチオエーテルを介してリンカー構造に接続されている以下で示される式（１）によって表される抗体－薬物コンジュゲートは、抗ＤＬＬ３抗体の還元によってジスルフィド結合から変換されたスルフヒドリル基を有する抗体を、化合物（２）と反応させることによって作製することができ、化合物（２）は、公知の方法によって入手可能である（例えば、特許公報文献ＵＳ２０１６／２９７８９０に記載される方法（例えば、段落［０３３６］～［０３７４］に記載される方法）によって入手可能である）。この抗体－薬物コンジュゲートは、例えば以下の方法によって作製することができる。
Figure 2024503658000013
 式中、ＡＢは、スルフヒドリル基を有する抗体を表し、
Ｌ1は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－によって表される構造を有し、
Ｌ1’は、以下の式によって表されるマレイミジル基を表す。
Figure 2024503658000014
 －Ｌ1－ＬXは、以下の式のいずれかによって表される構造を有する：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
それらのなかでも、より好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
さらに好ましくは、以下のものである：
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）。
上述した反応スキームにおいて、抗体－薬物コンジュゲート（１）は、薬物からリンカー末端までの１つの構造部分が１つの抗体に接続されている構造を有すると理解することができる。しかしながら、この説明は便宜的に示されたものであり、実際には、複数の前述の構造部分が１つの抗体分子に接続されている多くのケースがある。同じことが、後述される作製方法の説明にも当てはまる。
具体的には、抗体－薬物コンジュゲート（１）は、公知の方法によって入手可能な（例えば、特許公報文献ＵＳ２０１６／２９７８９０に記載される方法によって入手可能な（例えば、段落［０３３６］～［０３７４］に記載される方法によって入手可能な））化合物（２）を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）と反応させることによって作製することができる。
スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、当業者に周知の方法により得ることができる（Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)）。方法の例としては、これらに限定されないが、トラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬を抗体のアミノ基と反応させること；Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアルカノエートを抗体のアミノ基と反応させ、続いてヒドロキシルアミンと反応させること；Ｎ－スクシンイミジル３－（ピリジルジチオ）プロピオネートを抗体と反応させ、続いて還元剤と反応させること；抗体を、ジチオスレイトール、２－メルカプトエタノール、又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤と反応させて、スルフヒドリル基が形成されるように抗体中の鎖間のジスルフィド結合を還元することを挙げることができる。
具体的には、鎖間のジスルフィド結合が部分的又は完全に還元された抗体は、還元剤として、抗体中の鎖間のジスルフィド結合１つ当たり０．３～３モル当量のＴＣＥＰを使用すること、及びキレート剤を含有する緩衝溶液中で還元剤を抗体と反応させることによって得ることができる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を挙げることができる。キレート剤は、１ｍＭ～２０ｍＭの濃度で使用することができる。リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの溶液は、緩衝溶液として使用することができる。具体的な例として、部分的又は完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、抗体をＴＣＥＰと４℃～３７℃で１～４時間反応させることによって得ることができる。
薬物－リンカー部分へのスルフヒドリル基の付加反応を行うことによって、薬物－リンカー部分は、チオエーテル結合によってコンジュゲートできることに留意されたい。
次いで、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）１個当たり２～２０モル当量の化合物（２）を使用して、抗体１個当たり２～８個の薬物分子がコンジュゲートされている抗体－薬物コンジュゲート（１）を作製することができる。具体的には、そこに溶解させた化合物（２）を含有する溶液は、反応のためのスルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含有する緩衝溶液に添加されてもよい。この状況において、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムなどは、緩衝溶液として使用することができる。反応のｐＨは、５～９であり、より好ましくは、反応は、ｐＨ７付近で実行してもよい。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、又はＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）などの有機溶媒が、化合物（２）を溶解させるための溶媒として使用することができる。反応は、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含有する緩衝溶液に、有機溶媒中に溶解させた化合物（２）を含有する溶液を１～２０％ｖ／ｖで添加することによって実行してもよい。反応温度は、０～３７℃であり、より好ましくは１０～２５℃であり、反応時間は、０．５～２時間である。反応は、未反応の化合物（２）のチオールを含有する試薬との反応性を不活性化することによって終結させることができる。チオールを含有する試薬は、例えば、システイン又はＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、反応は、１～２０モル当量のＮＡＣを使用される化合物（２）に添加し、得られた混合物を室温で１０～３０分インキュベートすることによって終結させることができる。
抗体－薬物コンジュゲートの同定：作製された抗体－薬物コンジュゲート（１）を、後述される一般的な手順に従って、濃縮、緩衝剤交換、精製、並びに抗体濃度及び抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数の測定に供して、抗体－薬物コンジュゲート（１）を同定してもよい。
ｉ．一般的な手順Ａ：抗体又は抗体－薬物コンジュゲートの水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）容器に、抗体又は抗体－薬物コンジュゲートの溶液を添加し、抗体又は抗体－薬物コンジュゲートの溶液を、遠心分離機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．）を使用した遠心分離（２０００Ｇ～４０００Ｇで５～２０分間の遠心分離）によって濃縮した。
ｉｉ．一般的な手順Ｂ：抗体濃度の測定
ＵＶ検出器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、製造元によって規定された方法に従って抗体濃度の測定を行った。この点において、抗体間で異なる２８０ｎｍの吸収係数（１．３ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1～１．８ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1）を使用した。
ｉｉｉ．一般的な手順Ｃ：抗体ごとの緩衝剤交換
ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを抗体の水溶液に添加し、これを一般的な手順Ａに従って濃縮した。このオペレーションを数回行い、次いで抗体濃度を一般的な手順Ｂを使用することによって測定し、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡで５～２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
ｉｖ．一般的な手順Ｄ：抗体－薬物コンジュゲートの精製
ＮＡＰ－２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、いずれかの商業的に入手可能な緩衝溶液、例えばソルビトール（５％）を含有する酢酸緩衝剤（１０ｍＭ、ｐＨ５．５；本発明の説明ではＡＢＳと称する）で平衡化した。抗体－薬物コンジュゲートの水性反応溶液（およそ２．５ｍＬ）をＮＡＰ－２５カラムに適用し、その後、抗体画分が収集されるように、製造元によって規定された量で緩衝溶液を用いて溶出を行った。収集された画分を再びＮＡＰ－２５カラムに適用し、緩衝溶液を用いて溶出を行うゲルろ過精製プロセスを合計２又は３回繰り返して、コンジュゲートしていない薬物リンカー及び低分子量化合物（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、及びジメチルスルホキシド）を排除した抗体－薬物コンジュゲートを得た。
ｖ．一般的な手順Ｅ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度の測定及び抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数
抗体－薬物コンジュゲート中のコンジュゲートした薬物濃度は、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの２つの波長で抗体－薬物コンジュゲートの水溶液のＵＶ吸光度を測定すること、及びその後以下に示す計算を実行することによって計算することができる。
いずれか所与の波長での総吸光度は、系中に存在する全ての光を吸収する化学種の吸光度の合計に等しい［吸光度の加算性］。それゆえに、抗体及び薬物のモル吸収係数は抗体と薬物との間のコンジュゲーションの前と後で変化しないという仮説に基づいて、抗体－薬物コンジュゲート中の抗体濃度及び薬物濃度は、以下の方程式によって表される。
Ａ280＝ＡD,280＋ＡA,280＝εD,280ＣD＋εA,280ＣA 方程式（１）
Ａ370＝ＡD,370＋ＡA,370＝εD,370ＣD＋εA,370ＣA 方程式（２）
この状況において、Ａ280は、２８０ｎｍでの抗体－薬物コンジュゲートの水溶液の吸光度を表し、Ａ370は、３７０ｎｍでの抗体－薬物コンジュゲートの水溶液の吸光度を表し、ＡA,280は、２８０ｎｍでの抗体の吸光度を表し、ＡA,370は、３７０ｎｍでの抗体の吸光度を表し、ＡD,280は、２８０ｎｍでのコンジュゲート前駆体の吸光度を表し、ＡD,370は、３７０ｎｍでのコンジュゲート前駆体の吸光度を表し、εA,280は、２８０ｎｍでの抗体のモル吸収係数を表し、εA,370は、３７０ｎｍでの抗体のモル吸収係数を表し、εD,280は、２８０ｎｍでのコンジュゲート前駆体のモル吸収係数を表し、εD,370は、３７０ｎｍでのコンジュゲート前駆体のモル吸収係数を表し、ＣAは抗体－薬物コンジュゲート中の抗体濃度を表し、ＣDは、抗体－薬物コンジュゲート中の薬物濃度を表す。
この状況において、εA,280、εA,370、εD,280、及びεD,370に関し、事前に用意された値（計算に基づいて推測された値又は化合物のＵＶ測定により得られた測定値）が使用される。例えば、εA,280は、公知の計算方法によって抗体のアミノ酸配列から推測することができる（Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423）。εA,370は、一般的にゼロである。εD,280及びεD,370は、ランベルト・ベールの法則（吸光度＝モル濃度×モル吸収係数×セルのパス長）に従って、使用されるコンジュゲート前駆体が特定のモル濃度で溶解している溶液の吸光度を測定することによって得ることができる。ＣA及びＣDは、抗体－薬物コンジュゲートの水溶液のＡ280及びＡ370を測定し、次いでこれらの値の代入によって連立方程式（１）及び（２）を解くことによって決定することができる。さらに、ＣDをＣAで割ることによって、抗体１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数を決定することができる。
ｖｉ．一般的な手順Ｆ：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数の測定－（２）
抗体－薬物コンジュゲート中の抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数は、上記のサブセクションｖ「一般的な手順Ｅ」に加えて、以下の方法を使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によっても決定できる。以下、抗体がジスルフィド結合によって薬物リンカーにコンジュゲートされる場合の、ＨＰＬＣによるコンジュゲートした薬物分子の平均数を測定するための方法を説明する。当業者は、この方法を参照して、抗体と薬物リンカーとの間の接続方式に応じて、ＨＰＬＣによってコンジュゲートした薬物分子の平均数を適切に測定することが可能である。
ＨＰＬＣ分析のためのサンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）
抗体－薬物コンジュゲート溶液（およそ１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合される。混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることによって、抗体－薬物コンジュゲートの軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合が切断される。得られたサンプルはＨＰＬＣ分析に使用される。
ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析は、以下の測定条件下で行われる。
ＨＰＬＣシステム：アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１２９０ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）
検出器：紫外線吸収分光計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０オングストローム；ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．、Ｐ／Ｎ１８６００２８８４）
カラム温度：７５℃
移動相Ａ：０．１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び１５％２－プロパノールを含有する水溶液
移動相Ｂ：０．０７５％ＴＦＡ及び１５％２－プロパノールを含有するアセトニトリル溶液
勾配プログラム１：１４％～３６％（０分～１５分）、３６％～８０％（１５分～１７分）、８０％～１４％（１７分～１７．０１分）、及び１４％（１７．０１分～２５分）
勾配プログラム２：１４％～８０％（０分～１５分）、８０％（１５分～１７分）、８０％～１４％（１７分～１７．０１分）、及び１４％（１７．０１分～２５分）
サンプル注入：１０μＬ
データ分析
コンジュゲートしていない抗体軽（Ｌ０）及び重（Ｈ０）鎖と比較して、薬物分子に結合した軽鎖（ｉ薬物分子に結合した軽鎖：Ｌi）及び薬物分子に結合した重鎖（ｉ薬物分子に結合した重鎖：Ｈi）は、コンジュゲートした薬物分子の数に比例してより高い疎水性を呈することから、より大きい保持時間を有する。したがってこれらの鎖は、例えば、Ｌ０及びＬ１、又はＨ０、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３の順番で溶出される。検出ピークは、Ｌ０及びＨ０との保持時間の比較によってＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３のいずれかに割り当てることができる。コンジュゲートした薬物分子の数は当業者によって定義できるが、好ましくはＬ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３である。
薬物リンカーはＵＶ吸収を有するため、ピーク面積値は、軽鎖又は重鎖及び薬物リンカーのモル吸収係数を使用した以下の式に従って、コンジュゲートした薬物リンカー分子の数に応じて補正される。
Figure 2024503658000015
この状況において、公知の計算方法（Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423）による各抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列から推測された値は、抗体の軽鎖又は重鎖のモル吸収係数（２８０ｎｍ）として使用することができる。－Ｈ２－Ｃ８－Ａにおいて、軽鎖及び重鎖について、それぞれ、２６１２３のモル吸収係数及び８４１５０のモル吸収係数を、抗体のアミノ酸配列に従って、推測された値として使用した。Ｈ６－Ｇ２３－Ｆのケースにおいて、軽鎖及び重鎖について、それぞれ、３０１０５のモル吸収係数及び７７４２３のモル吸収係数を、抗体のアミノ酸配列に従って、推測された値として使用した。Ｈ１０－Ｏ１８－Ａのケースにおいて、軽鎖及び重鎖について、それぞれ、２６１６６のモル吸収係数及び８１３４０のモル吸収係数を、抗体のアミノ酸配列に従って、推測された値として使用した。各薬物リンカーのメルカプトエタノール又はＮ－アセチルシステインとの反応によってマレイミド基がスクシンイミドチオエーテルに変換された化合物の実際に測定されたモル吸収係数（２８０ｎｍ）を、薬物リンカーのモル吸収係数（２８０ｎｍ）として使用した。吸光度測定のための波長は、当業者により適切に設定することができるが、好ましくは抗体のピークを測定できる波長であり、より好ましくは２８０ｎｍである。Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２のケースにおいて、軽鎖及び重鎖について、それぞれ、２６２１２のモル吸収係数及び８３９９８のモル吸収係数を、抗体のアミノ酸配列に従って、推測された値として使用した。Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２のケースにおいて、軽鎖及び重鎖について、それぞれ、２６２１２のモル吸収係数及び８１４７８のモル吸収係数を、抗体のアミノ酸配列に従って、推測された値として使用した。
各鎖のピーク面積比（％）は、以下の式に従ってピーク面積の補正された値の合計に対して計算される。
Figure 2024503658000016
抗体－薬物コンジュゲート中の抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数は、以下の式に従って計算される。
コンジュゲートした薬物分子の平均数＝（Ｌ0ピーク面積比×０＋Ｌ1ピーク面積比×１＋Ｈ0ピーク面積比×０＋Ｈ1ピーク面積比×１＋Ｈ2ピーク面積比×２＋Ｈ3ピーク面積比×３）／１００×２。
抗体－薬物コンジュゲートの量を確保するために、類似の条件下で作製された、ほぼ同じコンジュゲートした薬物分子の平均数（例えば、±１程度で）を有する複数の抗体－薬物コンジュゲートを混合して、新しいロットを調製できることに留意されたい。このケースにおいて、新しいロットの薬物分子の平均数は、混合前の薬物分子の平均数の間に収まる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートの１つの具体的な例としては、以下の式：
Figure 2024503658000017
 又は以下の式：
Figure 2024503658000018
 によって表される構造を有する抗体－薬物コンジュゲートを挙げることができる。
この状況において、ＡＢは、本発明の説明で開示された抗ＤＬＬ３抗体を表し、抗体は、抗体由来のスルフヒドリル基を介して薬物リンカーにコンジュゲートされている。この状況において、ｎは、いわゆるＤＡＲ（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ；薬物対抗体比）の意味と同じ意味を有し、抗体１個当たりの薬物対抗体比を表す。具体的には、ｎは、抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の数を表し、これは、平均値として、すなわち、コンジュゲートした薬物分子の平均数として定義され示される数値である。本発明の［式９］又は［式１０］によって表される抗体－薬物コンジュゲートのケースにおいて、ｎは、上記のサブセクションｖｉの一般的な手順Ｆによる測定で、２～８であってもよく、好ましくは５～８、より好ましくは７～８、さらにより好ましくは８である。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートの一例としては、上述した式［式９］又は［式１０］によって表される構造を有する抗体－薬物コンジュゲートを挙げることができ、式中、ＡＢによって表される抗体は、以下の抗体（ａ）～（ｅ）：
（ａ）配列番号７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２の可変ドメイン配列を含む重鎖；
（ｂ）配列番号１７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号１２の可変ドメイン配列を含む重鎖；
（ｃ）配列番号２７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２２の可変ドメイン配列を含む重鎖；
（ｄ）配列番号３７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号３２の可変ドメイン配列を含む重鎖；並びに
（ｅ）抗体（ａ）～（ｆ）からなる群から選択されるいずれか１つの抗体
からなる群から選択されるいずれか１つの抗体、又は当該抗体の機能的な断片、又は抗体－薬物コンジュゲートの薬理学的に許容できる塩を含み、ここで重鎖又は軽鎖は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及びＮ末端グルタミン又はＮ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換を特徴とする翻訳後修飾、並びにカルボキシル末端における１又は２つのアミノ酸の欠失からなる群から選択される１若しくは２つ又はそれより多くの改変を含む。
ＶＩＩ．医薬
本明細書で開示される（例えば、２－Ｃ８－Ａ、６－Ｇ２３－Ｆ、１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２、又はＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３）、並びに上記のセクションＩＶ「抗ＤＬＬ３抗体の作製」及び実施例に記載される本発明の抗ＤＬＬ３抗体又は当該抗体の機能的な断片は、腫瘍細胞の表面上でＤＬＬ３に結合し、内在化活性を有するため、これは、医薬として、特に、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む 様々な組織の神経内分泌腫瘍、神経膠腫又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐｓｅｕｄｏ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ；ｐＮＥＴ）などのがんのための治療剤として、単独で、又はと追加の薬物を組み合わせてのいずれかで使用することができる。
さらに、本発明の抗ＤＬＬ３抗体又は当該抗体の機能的な断片は、ＤＬＬ３を発現する細胞の検出において使用することができる。
さらに、本発明の抗ＤＬＬ３抗体又は当該抗体の機能的な断片は、内在化活性を有するため、抗体－薬物コンジュゲート中の抗体として適用することができる。
細胞傷害性活性などの抗腫瘍活性を有する薬物が薬物として使用される場合、上記のセクションＶＩ「抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート」及び実施例に記載される本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、抗ＤＬＬ３抗体及び／又は内在化活性を有する抗体の機能的な断片、並びに細胞傷害性活性などの抗腫瘍活性を有する薬物のコンジュゲートである。この抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、ＤＬＬ３を発現するがん細胞に対して抗腫瘍活性を呈するため、医薬として、特に、がんの治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、例えば、それが空気中に置かれたり又は再結晶又は精製手順に供されたりすると水和物に変わるように、水分を吸収することができるか、又は吸着水を含んでいてもよい。このような水を含有する化合物又は薬理学的に許容できる塩も本発明に含まれる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、アミノ基などの塩基性基を有する場合、必要に応じて、薬理学的に許容できる酸付加塩を形成することができる。このような酸付加塩の例としては、ハロゲン化水素（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｄｅ）、例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩；無機酸塩、例えば硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩；低級アルカンスルホン酸塩、例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、及びエタンスルホン酸塩；アリールスルホン酸塩、例えばベンゼンスルホン酸塩及びｐ－トルエンスルホン酸塩；有機酸塩、例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、及びマレイン酸塩；並びにアミノ酸性塩、例えばオルニチン塩、グルタミン酸塩、及びアスパラギン酸塩を挙げることができる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、カルボキシ基などの酸性基を有する場合、必要に応じて、薬理学的に許容できる塩基付加塩を形成することができる。このような塩基付加塩の例としては、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、及びリチウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩及びマグネシウム塩；無機塩、例えばアンモニウム塩；並びに有機アミン塩、例えばジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－Ｎ－（２－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を挙げることができる。
本発明は、抗体－薬物コンジュゲートを構成する１つ又は複数の原子が原子の同位体で置き換えられた抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを含み得る。２つのタイプの同位体：放射性同位体及び安定同位体がある。同位体の例としては、水素の同位体（２Ｈ及び３Ｈ）、炭素の同位体（１１Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ）、窒素の同位体（１３Ｎ及び１５Ｎ）、酸素の同位体（１５０、１７０及び１８０）、及びフッ素の同位体（１８）を挙げることができる。このような同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートを含む組成物は、例えば、治療剤、予防剤、調査用の試薬、アッセイ用の試薬、診断剤、及びインビボでの画像診断剤として有用である。同位体で標識された様々な抗体－薬物コンジュゲート、及び同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートのあらゆる所与の比率での混合物が本発明に含まれる。同位体で標識された抗体－薬物コンジュゲートは、例えば、当業界において公知の方法に従って、後述される本発明の作製方法のための出発材料の代わりに同位体で標識された出発材料を使用することによって作製することができる。
インビトロの細胞傷害性は、例えば細胞の増殖応答を抑制する活性に基づいて測定することができる。例えば、ＤＬＬ３を過剰発現するがん細胞株を培養し、培養系に、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを様々な濃度で添加する。その後、細胞増殖、病巣形成、コロニー形成及びスフェロイド増殖に対するその抑制活性を測定することができる。この状況において、例えば、小細胞肺がん又は大細胞神経内分泌癌由来のがん細胞株を使用することによって、小細胞肺がん又は大細胞神経内分泌癌に対する細胞増殖阻害活性を検査できる。
インビボの実験動物におけるがんに対する治療作用は、例えば、ＤＬＬ３を高度に発現する腫瘍細胞株を接種したヌードマウスに、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを投与すること、次いで、がん細胞における変化を測定することによって測定することができる。この状況において、例えば、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍、神経膠腫又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）の接種によって免疫不全マウスから得られた動物モデルを使用することによって、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍、神経膠腫又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）に対する治療作用を測定することができる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートが適用されるがんのタイプは、処置しようとするがん細胞においてがんがＤＬＬ３を発現する限りは特に限定されない。その例としては、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍を挙げることができる。それらの他の実施例としては、神経膠腫及び偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）を挙げることができる。しかしながら、がんは、がんがＤＬＬ３を発現する限りは限定されない。がんのより好ましい例としては、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、及び様々な組織の神経内分泌腫瘍を挙げることができる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、好ましくは哺乳動物に投与でき、より好ましくはヒトに投与できる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物で使用される物質は、適用される用量又は適用される濃度に関して、この分野で通常使用される医薬用添加剤などから適切に選択して、次いで使用することができる。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートは、１つ又は複数の医薬的に適合性の成分を含む医薬組成物として投与することができる。例えば、医薬組成物は、典型的には、１種又は複数の製剤用担体（例えば、滅菌した液体（例えば、水及び油（石油及び動物性、植物性、又は合成の油（例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、及びゴマ油）を含む））を含む。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合、より典型的な担体である。食塩水溶液、デキストロース水溶液、及びグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射溶液のために使用することができる。好適な医薬用ビヒクルは当業界において公知である。必要に応じて、組成物はまた、微量の保湿剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。好適な製剤用担体の例は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に開示されている。処方は、投与様式に対応する。
様々な送達系が公知であり、それらは、本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを投与するために使用することができる。投与経路の例としては、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、及び皮下経路を挙げることができる。投与は、例えば注射又はボーラス注射によってなされることができる。具体的な好ましい実施態様によれば、上述した抗体－薬物コンジュゲートの投与は、注射によって実行される。好ましい投与経路は、非経口投与である。
代表的な実施形態によれば、医薬組成物は、従来の手順に従って、ヒトへの静脈内投与に好適な医薬組成物として処方される。静脈内投与のための組成物は、典型的には、滅菌及び等張水性緩衝溶液中の溶液である。必要に応じて、医薬はまた、注射部位における痛みを軽減するための可溶化剤及び局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含有していてもよい。一般的に、上述した成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又は小容器中に密封することにより得られる、容器に入れられたフリーズドライさせた粉末又は無水濃縮物として、別々に、又は単位剤形での混合物中に一緒のいずれかで提供される。医薬は、注射によって投与される場合、例えば、滅菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注射ボトルを使用して投与されてもよい。医薬は、注射によって投与される場合、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルは、上述した成分が投与の前に互いに混合されるように提供されてもよい。
本発明の医薬組成物は、本出願の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物であってもよいし、又は抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲート及び少なくとも１種の他のがんの治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートはまた、追加のがんの治療剤と共に投与されてもよく、それによって抗がん作用を強化することができる。このような目的に使用される追加の抗がん剤は、抗体－薬物コンジュゲートと、同時に、別々に、又は連続的に、個体に投与してもよい。それ以外にも、追加の抗がん剤及び抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートはそれぞれ、異なる投与間隔で対象に投与してもよい。このようながんの治療剤の例としては、細胞傷害性の化学療法剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、ロバプラチン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、及びアムルビシンなど、ＲＮＡ転写阻害剤、例えば、ルルビネクテジンなど、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びイピリムマブなど、並びにチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、アンロチニブなどを挙げることができるが、がんの治療剤は、薬物が抗腫瘍活性を有する限りこれらに限定されない。
このような医薬組成物は、フリーズドライ配合物又は液体配合物の形態で、選択された組成物及び必要な純度を有する配合物として調製することができる。フリーズドライ配合物として調製された医薬組成物は、この分野で使用される適切な医薬用添加剤を含有する配合物であってもよい。
同様に、液体配合物は、液体配合物がこの分野で使用される様々な医薬用添加剤を含有するように、調製することができる。
医薬組成物の組成及び濃度も、投与方法に応じて変更することができる。本発明の医薬組成物に含まれる抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）に関して、親和性が増加する場合（すなわち、Ｋｄ値は低い）、その適用される用量を減少させたとしても、医薬組成物は、医薬作用を発揮することができる。
したがって、抗体－薬物コンジュゲートの適用される用量は、抗原に対する抗体－薬物コンジュゲートの親和性の状態に基づいて適用される用量を設定することによって決定することもできる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、ヒトに投与される場合、例えば、およそ０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの用量で、１回又は１～１８０日の間隔で複数回で投与してもよい。これは、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１５ｍｇ／ｋｇ、２～５０ｍｇ／ｋｇ、２～３０ｍｇ／ｋｇ、２～２０ｍｇ／ｋｇ又は２～１５ｍｇ／ｋｇの用量で、１～４週間、好ましくは２～３週間の間隔で複数回で投与してもよい。
要するに、開示された免疫グロブリン関連組成物（例えば、抗体又はその抗原結合断片、例えば２－Ｃ８－Ａ、６－Ｇ２３－Ｆ、１０－Ｏ１８－Ａ、及びそれらのヒト化バージョン）及びその抗体－薬物コンジュゲートは、ＤＬＬ３関連がんの処置に有用である。このような処置は、病理学的に高いレベルのＤＬＬ３を有するとして同定された患者（例えば、本明細書に記載される方法によって診断された者）又はこのような病理学的レベルに関連することが公知の疾患と診断されている患者において使用することができる。一態様において、本発明の開示は、ＤＬＬ３関連がんを、それを必要とする対象において処置するための方法であって、有効量の本発明の技術の抗体（又はその抗原結合断片）を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明の技術の抗体によって処置することができるがんの例としては、これらに限定されないが、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍、神経膠腫又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）が挙げられる。本発明の技術の組成物は、任意選択で、単一のボーラス剤としてそれを必要とする対象に投与することができる。代替として、用量レジメンは、腫瘍の出現後に様々な回数で実行される複数回の投与を含んでいてもよい。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、頭蓋内、腫瘍内、クモ膜下、又は局所などのあらゆる好適な経路によって行うことができる。投与としては、自己投与及び他者による投与が挙げられる。また、記載される医学的状態の様々な処置様式は、「実質的」であることを意味することが意図されることも理解されるものとし、実質的とは、全ての処置を含むが、全てに満たない処置も含み、ある程度の生物学的又は医学的に関連する結果が達成されることを含む。
本発明の技術は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらはいかなる意味においても限定として解釈されるべきではない。以下の実施例は、本発明の技術の例示的な抗ＤＬＬ３抗体及び抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製、特徴付け、及び使用を実証する。しかしながら、これらの実施例は、発明の範囲を限定することは意図されない。さらに、これらの実施例は、いずれの手段によっても限定された方式で解釈されるべきではない。以下の実施例において、別段の規定がない限り、遺伝子操作に関する個々のオペレーションは、“Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989)に記載される方法、又は当業者によって使用される実験マニュアルに記載される他の方法に従って行われ、又は商業的に入手可能な試薬又はキットが使用されている場合、その実施例は、商業的に入手可能である製品に含まれる説明書に従って行われたことに留意されたい。本発明の説明において、試薬、溶媒及び出発材料は、商業的に入手可能な供給源、別段の規定がない限りから容易に入手可能である。
（実施例１）
モノクローナル抗体の生成
全長ＤＬＬ３を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で作製されたＣ末端の６×Ｈｉｓタグ（配列番号８４）を有するアミノ酸Ａｌａ２７－Ａｌａ４７９に対応するＤＬＬ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＹ Ｊ７－１）を、免疫原として使用した。ヒト免疫グロブリンレパートリーを内包するＡｂｌｅｘｉｓ ＡｌｉｖａＭＡｂ Ｋａｐｐａ Ｍｉｃｅ（Ａｂｌｅｘｉｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、標準的な免疫化技術に従って、３週間の期間にわたり、可溶性ＤＬＬ３－ＥＣＤ又は安定な細胞のいずれかで免疫化した。ＤＬＬ３に特異的な高い血清力価を有するマウスからの脾細胞及び流入領域リンパ節細胞を回収し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、電気融合を使用してハイブリドーマを生成した。次いでこれらのハイブリドーマをスクリーニングして、ＥＬＩＳＡによって可溶性ＤＬＬ３－ＥＣＤに特異的に結合した抗体の存在を同定し、親の２９３細胞に対するフローサイトメトリーによって安定して発現する２９３細胞における全長ＤＬＬ３タンパク質の存在を同定した。さらなる調査のために、後述するように４℃／３７℃の染色と共に２９３ＤＬＬ３形質転換体における染色強度に関するフローサイトメトリーでのランク付けによってハイブリドーマを選択した。
（実施例２）
モノクローナル抗体６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａを用いた４／３７内在化アッセイ
４種のモノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａ）を、４℃での染色を３７℃での染色と比較することによって、ＤＬＬ３を内在化するそれらの能力に関して比較した。参照モノクローナル抗体ＳＣ１６は、ＤＬＬ３を介して内在化し、ＡＤＣ活性を有することが公知であり、文献でこれまでに報告されており、これを、内在化の陽性対照として使用した。指数増殖中のＮＣＩ－Ｈ８２細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ中で１回洗浄し、１０％ＦＣＳが補充されたＤＭＥＭに細胞２×１０7個／ｍｌで再懸濁した。１００μｌ（細胞２×１０6個）を、Ｕ底９６ウェルプレートに添加した。試験モノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ又は１０－Ｏ１８－Ａ）又は参照モノクローナル抗体を別々のウェルに添加して、２連のプレートで１０μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。両方のプレートを４℃で３０分保持したその後、両方のプレートを、１０％ＦＣＳが補充された冷ＲＰＭＩで２回洗浄し、１０％ＦＣＳが補充されたＲＰＭＩに再懸濁した。一方のプレートを４℃で保持し（対照プレート）、他方のプレートを、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした（実験プレート）。ＣＯ２インキュベーター中、実験プレートでは３７℃、対照プレートでは４℃で、４時間インキュベーションの後、細胞を、冷洗浄緩衝剤（０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で、４℃で３回洗浄した。次いでサンプルを、洗浄緩衝剤中７μｇ／ｍｌの最終濃度での冷洗浄緩衝剤＋Ｒ－フィコエリトリン－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－１１６－０７１）に再懸濁した。４℃で３０分のインキュベーション後、細胞を冷洗浄緩衝剤で３回洗浄し、どちらもＰＢＳ０．５％パラホルムアルデヒド中で固定し、４８時間以内にフローサイトメトリーによって分析した。対照プレート（４℃で抗体と共にインキュベートした）から得られたＭＦＩを、実験プレート（３７℃で抗体と共にインキュベートした）から得られた対応するＭＦＩで割ることによって計算した平均蛍光強度（ＭＦＩ）比を、内在化の相対的な尺度として採用した。高い値は、より大きい内在化を示した。以下の表で示されるように、モノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａ）の全てが、結合するＤＬＬ３で内在化することができたが、参照モノクローナル抗体の程度までは内在化できなかった。
Figure 2024503658000019

これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、ＤＬＬ３に結合することを介して内在化を受けることを実証する。したがって、本明細書で開示された免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３陽性がん細胞に治療剤を送達することに有用である。
（実施例３）
モノクローナル抗体６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａのためのクエンチング内在化アッセイ
内在化に関してモノクローナル抗体をランク付けするために、クエンチング内在化アッセイを使用した。この方法は、エンドソーム／リソソーム経路への内在化及び侵入を反映する。ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｆ（ａｂ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １１５－００７－１８５）を、Ｄｙ ｌｉｇｈｔ Ｄｙ６５０ ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ０２２０６）及びＬＩＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ＱＣ１ ＮＨＳエステル（ＬＩＣＯＲ９２９－７０３０）で二重標識した（二重に標識された抗体は、本明細書において「Ｆ（ａｂ）Ｄｙ６５０－ＱＣ１」と称される）。このアッセイの原理は、以下の通りである：Ｄｙ ｌｉｇｈｔ Ｄｙ６５０蛍光はＩＲＤｙｅ ＱＣ１によって消光されるため、Ｆ（ａｂ）Ｄｙ６５０－ＱＣ１は蛍光を発しない。しかしながら、内在化されると、Ｆ（ａｂ）Ｄｙ６５０－ＱＣ１はエンドソーム／リソソーム経路を介して分解され、その結果起こるＩＲＤｙｅ ＱＣ１の放出が、Ｄｙ ｌｉｇｈｔ Ｄｙ６５０の蛍光を観察可能にする。したがって、Ｄｙ ｌｉｇｈｔ Ｄｙ６５０蛍光シグナルを、リソソームを介した内在化の尺度として採用した。簡単に言えば、指数増殖中のＮＣＩ－Ｈ８２細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、１０％ＦＣＳが補充された増殖培地ＲＰＭＩ中で１回洗浄し、増殖培地に再懸濁し、ウェル当たり細胞１．２５×１０6個（８０μｌ）を添加した。２００μｇ／ｍｌ濃度でのモノクローナルＤＬＬ３抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｄｙ６５０ ＱＣ１と、２００μｇ／ｍｌで、室温で２０分混合し、混合物の２０μｌを細胞に添加した。４℃で３０分のインキュベーションの後、細胞を増殖培地で２回洗浄し、増殖培地に再懸濁し、ＣＯ2インキュベーター中で４時間にわたり３７℃に移行させ、内在化させた。次いで細胞を、０．５％ＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析し、平均蛍光強度を決定した。対照参照モノクローナルの平均蛍光強度を、１００％内在化に設定した。以下の表で示されるように、４種の全てのモノクローナル抗体が、エンドソーム／リソソーム経路への内在化及び侵入を実証した。
Figure 2024503658000020
これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、ＤＬＬ３に結合することを介して内在化を受け、細胞のファゴソーム／リソソーム区画に侵入することを実証する。したがって、本明細書で開示された免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３陽性がん細胞に治療剤を送達することに有用である。
（実施例４）
抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体のためのＦａｂ ＺＡＰアッセイ
Ｆａｂ ＺＡＰアッセイを、内在化を測定する別の方法として使用した。Ｆａｂ ＺＡＰアッセイは、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体の内在化を介した細胞への毒素の送達を測定する。Ｆａｂ ＺＡＰアッセイは、毒素でモノクローナル抗体をタグ付けするのにサポリン毒素コンジュゲートＦ（ａｂ）抗マウス重鎖及び軽鎖を使用する。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓからのキットを使用し、Ｆａｂ ＺＡＰアッセイプロトコールに従って、抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体のパネルを特徴付けた。簡単に言えば、指数増殖中のＮＣＩ－Ｈ８２細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、１０％ＦＣＳが補充されたＲＭＰＩ中で１回洗浄し、１００μｌの１０％ＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ中の、９６ウェル白色固体プレートに細胞５０００個／ウェルでプレーティングする。次の日、２５μｌの精製されたモノクローナル抗体（Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ又は１０－Ｏ１８－Ａ）又は参照モノクローナル抗体を、１０μｇ／ｍｌの開始濃度で添加し、連続する３倍希釈を実行した。サポニンコンジュゲートＦ（ａｂ）抗マウスＩｇ ＨＬ（Ｆａｂ ＺＡＰ）を２５μｌに添加して、４．４ｎＭの最終濃度を得た。３～４日後、等しい体積のＣｅｌｌ Ｔｉｔｒｅ Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１）をプレートに添加し、これをオービタルシェーカーで２分振盪し、さらに室温で１０分後、発光を、プレートリーダーを使用して読んだ。プロゾーン作用を打ち消すために、モノクローナル抗体の全てを完全な滴定として試験した。図９及び以下の表で示されるように、モノクローナル抗体の全てが、参照モノクローナル抗体に匹敵する細胞傷害活性を呈した。これらのモノクローナル抗体を用いた他の実験において、マウスＩｇＧ１対照モノクローナル抗体は、細胞傷害活性を呈しなかった。したがって、これらの結果は、細胞傷害活性が、ＤＬＬ３の認識を介して媒介され、ＦｃＲｓを介して媒介されないことを実証する。
Figure 2024503658000021

これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、その細胞表面上にＤＬＬ３を発現する腫瘍に治療剤を送達できることを実証する。したがって、本明細書で開示された免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３陽性がん細胞に治療剤を送達することに有用である。
（実施例５）
抗ＤＬＬ３抗体のエピトープ結合
精製された抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体及び参照モノクローナル抗体のパネルを、Ｃａｒｔｅｒｒａ（登録商標）アレイ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイプラットフォーム（Ｃａｒｔｅｒｒａ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ ＵＴ）でのペアになったエピトープビニングに供し、そこで、ヒスチジンタグを有するＤＬＬ３抗原（ＤＬＬ３－Ｈｉｓ）の捕捉に関して、さらに、ＤＬＬ３－Ｈｉｓへの結合のためのパネル中の他の全ての抗体との競合に関しても、各モノクローナル抗体を試験した。抗体を、プリントアレイ方法による標準的なアミンカップリング技術を介してＨＣ２００Ｍチップ（リガンド）に固定した。次いで各サイクルにおいて、アレイ全体にわたり抗原を注入し、続いて単一抗体（分析物）を注入した。各サイクルの最後に、新しいサイクルが始まる前に、表面を再生して、抗原及び分析物を除去した。以下の表で示されるように、パネルを用いて３つの異なるビンを同定したところ、７－Ｉ１－Ｂ及び２－Ｃ８－Ａはビン２にマッピングされ、一方で６－Ｇ２３－Ｆはビン３に、１０－Ｏ１８－Ａはビン１にマッピングされた。
Figure 2024503658000022

これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、ＤＬＬ３タンパク質に存在する３つの別個のエピトープに結合することを実証する。したがって、本明細書で開示された免疫グロブリン関連組成物は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍細胞に複数の治療剤を送達するために、互いに組み合わせて使用することができる。
（実施例６）
親和性測定。
４種のモノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａ）の結合親和性を、結合緩衝剤としてＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び再生緩衝剤として１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用した、２５℃でのＯｃｔｅｔ ＨＴＸ装置を使用したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定した。４種の精製されたモノクローナル抗体（各５μｇ／ｍＬ）を、抗マウスＦｃセンサー上にローディングした。ローディング済みのセンサーを、７回の連続する１：３希釈での２００ｎＭの開始濃度での組換えヒトＤＬＬ３タンパク質（アミノ酸Ａｌａ２７～Ａｌａ４７９、カタログ番号９７４９－ＤＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈物に浸漬した。図１０Ａ～１０Ｄで示されるように、結合は濃度依存性であった。解離定数（ＫＤ）を、１価（１：１）結合モデルを使用して計算した。図１０Ｅで示されるように、全てのモノクローナル抗体が、ナノモル濃度未満の範囲で親和性を有していた。図１１は、６－Ｇ２３－Ｆ、１０－Ｏ１８－Ａ、及び２－Ｃ８－Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＤＬＬ３と選択的に結合するが、ＤＬＬ１又はＤＬＬ４と結合しないことを示す。７－Ｉ１－ＢｍＡｂは、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４の両方と結合するが、ＤＬＬ１と結合しない。
これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、高親和性でＤＬＬ３と特異的に結合することを実証する。したがって、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物は、生物学的サンプルにおいてＤＬＬ３タンパク質を検出するための方法において有用である。
（実施例７）
トランスフェクトされた及び初代細胞へのモノクローナル抗体の結合。
４種のモノクローナル抗体（６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ、７－Ｉ１－Ｂ及び１０－Ｏ１８－Ａ）を、フローサイトメトリーによって、マウス及びカニクイザルＤＬＬ３に加えて内因性ヒトＤＬＬ３に結合するそれらの能力に関して試験した。この目的のために、ＨＥＫ２９３細胞を、全長ヒト、マウス又はカニクイザルＤＬＬ３をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、これを実験で使用した。簡単に言えば、１０6個のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞又はＮＣＩ－Ｈ８２初代細胞を、ＦＡＣＳ緩衝剤ＰＢＳ ０．５％ＢＳＡ中で、９６ウェルＵ底プレートのウェルに添加し、精製されたモノクローナルを１０μｇ／ｍｌまで添加した。４℃で３０分のインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤で３回洗浄し、ＰＥ標識Ｆ（ａｂ）２抗マウスＩｇＧ Ｈ及びＬ第２ステージと共にインキュベートした。さらに４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤中で３回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。データは、第２ステージを用いたバックグラウンド染色で割ったモノクローナル抗体の平均蛍光強度比で提示される。以下の表で示されるように、モノクローナル抗体の全てがカニクイザルＤＬＬ３と交差反応し、ＮＣＩ Ｈ８２細胞において内因性ＤＬＬ３を検出したが、マウスＤＬＬ３に結合した６－Ｇ２３－Ｆ及び７－Ｉ１－Ｂのみであった。
Figure 2024503658000023

これらの結果は、本発明の技術の免疫グロブリン関連組成物が、生物学的サンプルにおいてＤＬＬ３タンパク質を検出するための方法において有用であることを実証する。
（実施例８）
－シーケンシング
４種のモノクローナル抗体の可変重鎖及び可変軽鎖を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）によって、７－Ｉ１－Ｂ、６－Ｇ２３－Ｆ、２－Ｃ８－Ａ及び１０－Ｏ１８－Ａの対応するハイブリドーマから単離した。ＲＮＡを、ＲＮＡＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解したハイブリドーマから単離した。ｃＤＮＡ合成のためにｍＲＮＡを単離し、ＲＡＣＥキットを使用してＰＣＲ産物を生成した。次いでＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングし、ＰＣＲ増幅し、その後シーケンシングのためにゲルで分離した。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、以下の表及び図５Ａ～５Ｂ（７－Ｉ１－Ｂ）、図６Ａ～６Ｂ（２－Ｃ８－Ａ）、図７Ａ～７Ｂ（１０－Ｏ１８－Ａ）、及び図８Ａ～８Ｂ（６－Ｇ２３－Ｆ）に示される。
Figure 2024503658000024
Figure 2024503658000025

Figure 2024503658000026
以下の「組換え抗ＤＬＬ３抗体の作製」に関する実施例８－１～８－３において、アルギニン残基を、ＩＭＧＴ ＩＤ Ｊ００２４１による軽鎖定常領域の第１のアミノ酸位置に挿入した。
（実施例８－１）
組換え抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２、及びＨ２－Ｃ８－Ａ－３の作製
重鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ（配列番号５９）の重鎖を、実施例８で得られた可変領域（配列番号１２）をＩｇＧ１のヒトガンマ鎖定常領域（配列番号４２）と接続することによって構築した。抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２の重鎖（配列番号６０）及びＨ２－Ｃ８－Ａ－３の重鎖（配列番号６１）も、実施例８で得られた可変領域（配列番号１２）をＩｇＧ１又はバリアントのヒトガンマ鎖定常領域（配列番号５７及び５８）と接続することによって構築された。
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ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＱＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＥＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＷＡＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６０）
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軽鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａの軽鎖を構築し、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２及びＨ２－Ｃ８－Ａ－３の軽鎖は、実施例８で得られた可変領域を、ＩｇＧ１のヒトカッパ鎖定常領域（配列番号１７及び４９）と接続することによって構築した（配列番号６２）。
ＤＩＱＭＳＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＡＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＴＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６２）
発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトガンマ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築物は、特許出願ＷＯ２０１７／０５１８８８号に記載されたものであった。
発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトカッパ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築物は、特許出願ＷＯ２０１７／０５１８８８号に記載されたものであった。
発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１－１の構築：ＤＮＡ断片（配列番号７５）を合成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、人工遺伝子合成サービス）。ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ及びＰｍｅＩの制限酵素で消化した。得られた１．１ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。ｐＣＭＡ－Ｇ１の発現ベクターものＸｂａＩ及びＰｍｅＩ制限酵素で消化して、アガロースゲル電気泳動によってヒト重鎖シグナル配列及びヒトガンマ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を除去した。得られたｐＣＭＡ－Ｇ１の３．４ｋｂのＸｂａＩ／ＰｍｅＩ断片も、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。精製した１．１ｋｂ及び３．４ｋｂのＸｂａＩ／ＰｍｅＩ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡株式会社）を用いてライゲートして、発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１－１を構築した。
ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＴＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧ（配列番号７５）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２重鎖の発現ベクターの構築：５’－部位（ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣ；配列番号７６のヌクレオチド３６～５７）及び３’－部位（ＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ；配列番号７６のヌクレオチド４０６～４２８）の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置５８～４０５（配列番号７６中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して、合成したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢＩｐＩで切断されたｐＣＭＡ－Ｇ１－１の部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２重鎖の発現ベクターが構築された。
ＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号７６）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３重鎖の発現ベクターの構築：配列番号７７（ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ；配列番号８６）の外側の５’－部位及び配列番号７７（ＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＴ；配列番号８７）の外側の３’－部位の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置１～１４０１（配列番号７７中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキットを使用して、増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩ／ＰｍｅＩで切断されたｐＣＭＡ－ＬＫの部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３重鎖の発現ベクターが構築された。
ＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号７７）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２及びＨ２－Ｃ８－Ａ－３軽鎖の発現ベクターの構築：５’－部位（ＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣ；配列番号８０のヌクレオチド３７～６０）及び３’－部位（ＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣ；配列番号８０のヌクレオチド３８２～４０２）の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置６１～３８１（配列番号８０中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して、合成したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｉＷＩで切断されたｐＣＭＡ－ＬＫの部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２及びＨ２－Ｃ８－Ａ－３軽鎖の発現ベクターが構築された。
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発現及び精製：Ｈ２－Ｃ８－Ａの重鎖及び軽鎖の対応するＤＮＡ配列をコードする発現ベクターを構築し（トランスフェクショングレードのプラスミド、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＤ２９３Ｆ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）にトランスフェクトした。それに続いて培養及び回収し、得られた上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。
代替として、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３に関して、マニュアルに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、継代させた。対数増殖期のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を、３Ｌのエルレンマイヤーフラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）上に植え付け、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、細胞２．０～２．４×１０6個／ｍＬで総体積５８０ｍＬまで希釈した。その間に、３００μｇのＨ２－Ｃ８－Ａ－３の重鎖発現ベクター、３００μｇのＨ２－Ｃ８－Ａ－３の軽鎖発現ベクター及び１．８ｍｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、得られた混合物を穏やかに撹拌した。５分間のインキュベーションの後、混合物を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で、９５ｒｐｍで振盪しながら４時間インキュベートし、その後、４８０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１２０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３フィード（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、培養物に添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で、９５ｒｐｍで振盪しながら６日間さらにインキュベートした。培養上清を回収し、５００ｍＬフィルターシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でろ過した。
一方で、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２に関して、マニュアルに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を培養し、ミドルスケールバイオリアクターＢＣＰ（Ｂｉｏｔｔ）を備えたスピナーフラスコで、３７℃で、８％ＣＯ2で継代させた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞のトランスフェクション及び培養を、ＷＡＶＥ ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。２．５Ｌの、対数増殖期の細胞２．０～２．４×１０6個／ｍＬでのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（Ｃｙｔｉｖａ）上に植え付けた。その間に、１．２５ｍｇのＨ２－Ｃ８－Ａ－２の重鎖発現ベクター、１．２５ｍｇのＨ２－Ｃ８－Ａ－２の軽鎖発現ベクター及び７．５ｍｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、１６０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、得られた混合物を穏やかに撹拌した。５分間のインキュベーションの後、混合物を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。細胞を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（３７℃、８％ＣＯ2）中で、４時間振盪しながら培養し、その後、１．９２Ｌの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３及び４８０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３フィードを、培養物に添加した。細胞をさらにＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（３７℃、８％ＣＯ2）中で６日間振盪しながら培養した。培養上清を回収し、遠心分離し、カプセルカートリッジフィルター（細孔サイズ：０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過した。
抗ＤＬＬ３抗体の精製：ろ過した培養上清を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー及びセラミックヒドロキシアパタイトの２工程プロセスによって精製した。精製方法の詳細は、特許出願ＷＯ２０２０／０１３１７０号に記載されたものであった。
（実施例８－２）
組換え抗ＤＬＬ３抗体Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２、及びＨ６－Ｇ２３－Ｆ－３の作製
重鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ６－Ｇ２３－Ｆの重鎖（配列番号６３）を、実施例８で得られた可変領域（配列番号３２）をＩｇＧ１のヒトガンマ鎖定常領域（配列番号４２）と接続することによって構築した。また抗ＤＬＬ３抗体Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２及びＨ６－Ｇ２３－Ｆ－３の重鎖（それぞれ配列番号６４及び６５）も、実施例８で得られた可変領域（配列番号３２）をＩｇＧ１のヒトガンマ鎖定常領域バリアント（配列番号５７及び５８）と接続することによって構築した。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＧＳＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＥＹＮＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＧＳＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＥＹＮＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＤＰＳＤＧＳＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＥＹＮＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６５）
軽鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ６－Ｇ２３－Ｆの軽鎖を構築した。抗ＤＬＬ３抗体Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２及びＨ６－Ｇ２３－Ｆ－３の軽鎖は、実施例８で得られた可変領域を、ＩｇＧ１のヒトカッパ鎖定常領域（配列番号３７及び４９）と接続することによって構築することができる（配列番号６６）。
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＹＲＤＧＮＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＮＲＤＳＧＶＰＤＲＦＲＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６６）
発現及び精製：上述したＨ６－Ｇ２３－Ｆの重鎖及び軽鎖の対応するＤＮＡ配列をコードする発現ベクターを調製し（トランスフェクショングレードのプラスミド、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＤ２９３Ｆ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）にトランスフェクトした。それに続いて培養及び回収し、得られた上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。
（実施例８－３）
組換え抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２、及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３の作製
重鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａの重鎖（配列番号６７）を、実施例８で得られた可変領域（配列番号２２）をＩｇＧ１のヒトガンマ鎖定常領域（配列番号４２）と接続することによって構築した。抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３の重鎖（それぞれ配列番号６８及び６９）は、実施例８で得られた可変領域（配列番号２２）をＩｇＧ１のヒトガンマ鎖定常領域バリアント（配列番号５７及び５８）と接続することによって構築することができる。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＦＹＳＧＩＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＧＶＡＧＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６７）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＦＹＳＧＩＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＧＶＡＧＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６８）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＮＳＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＦＹＳＧＩＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＬＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＧＶＡＧＦＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６９）
軽鎖の構築：抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａの軽鎖を構築した。抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３の軽鎖は、実施例８で得られた可変領域を、ＩｇＧ１のヒトカッパ鎖定常領域（配列番号２７及び４９）と接続することによって構築することができる（配列番号７０）。
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＴＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２重鎖の発現ベクターの構築：５’－部位（ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣ；配列番号７８のヌクレオチド３６～５７）及び３’－部位（ＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ；配列番号７８のヌクレオチド４０６～４２８）の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置５８～４０５（配列番号７８中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して、合成したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢＩｐＩで切断されたｐＣＭＡ－Ｇ１－１の部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２重鎖の発現ベクターが構築された。
ＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号７８）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３重鎖の発現ベクターの構築：配列番号７９（ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ；配列番号８６）の外側の５’－部位及び配列番号７９（ＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＴ；配列番号８７）の外側の３’－部位の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置１～１４０１（配列番号７９中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキットを使用して、増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＰｍｅＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＣＭＡ－ＬＫの部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３重鎖の発現ベクターが構築された。
ＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号７９）
抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３軽鎖の発現ベクターの構築：５’－部位（ＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣ；配列番号８１のヌクレオチド３７～６０）及び３’－部位（ＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣ；配列番号８１のヌクレオチド３８５～４０５）の両方におけるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応のための隣接する組換え部位を有するヌクレオチド位置６１～３８４（配列番号８１中）におけるヌクレオチドからなるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、人工遺伝子合成サービス）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を使用して、合成したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｉＷＩで切断されたｐＣＭＡ－ＬＫの部位に挿入することで、抗ＤＬＬ３抗体Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３軽鎖の発現ベクターが構築された。
ＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＴＧＴ（配列番号８１）
発現及び精製：Ｈ１０－Ｏ１８－Ａの重鎖及び軽鎖の対応するＤＮＡ配列をコードする発現ベクターを構築し（トランスフェクショングレードのプラスミド、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＤ２９３Ｆ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）にトランスフェクトした。それに続いて培養及び回収し、得られた上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。
代替として、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３に関して、マニュアルに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、継代させた。対数増殖期のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を、３Ｌのエルレンマイヤーフラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ）上に植え付け、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、細胞２．０～２．４×１０6個／ｍＬで総体積５８０ｍＬまで希釈した。その間に、３００μｇのＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３の重鎖発現ベクター、３００μｇのＨ１０－Ｏ１８－Ａ－３の軽鎖発現ベクター及び１．８ｍｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、得られた混合物を穏やかに撹拌した。５分間のインキュベーションの後、混合物を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で、９５ｒｐｍで振盪しながら４時間インキュベートし、その後、４８０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１２０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３フィード（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、培養物に添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ2）中で、９５ｒｐｍで振盪しながら６日間さらにインキュベートした。培養上清を回収し、５００ｍＬフィルターシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でろ過した。一方で、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２に関して、マニュアルに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を培養し、ミドルスケールバイオリアクターＢＣＰ（Ｂｉｏｔｔ）を備えたスピナーフラスコで、３７℃で、８％ＣＯ2で継代させた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞のトランスフェクション及び培養を、ＷＡＶＥ ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。２．５Ｌの、対数増殖期の細胞２．０～２．４×１０6個／ｍＬでのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（Ｃｙｔｉｖａ）上に植え付けた。その間に、１．２５ｍｇのＨ１０－Ｏ１８－Ａ－２の重鎖発現ベクター、１．２５ｍｇのＨ１０－Ｏ１８－Ａ－２の軽鎖発現ベクター及び７．５ｍｇのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を、１６０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、得られた混合物を穏やかに撹拌した。５分間のインキュベーションの後、混合物を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。細胞を、ＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（３７℃、８％ＣＯ2）中で、４時間振盪しながら培養し、その後、１．９２Ｌの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３及び４８０ｍＬの、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸサプリメントＩを含むＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）ＨＥＫ２９３フィードを、培養物に添加した。細胞をさらにＷＡＶＥ ＣＥＬＬＢＡＧ１０Ｌ（３７℃、８％ＣＯ2）中で６日間振盪しながら培養した。培養上清を回収し、遠心分離し、カプセルカートリッジフィルター（細孔サイズ：０．４５μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過した。
抗ＤＬＬ３抗体の精製：ろ過した培養上清を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー及びセラミックヒドロキシアパタイトの２工程プロセスによって精製した。精製方法の詳細は、特許出願ＷＯ２０２０／０１３１７０号に記載されたものであった。
（実施例９）
抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６の作製
抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６を、国際公報ＷＯ２０１７／０３１４５８号に記載されるｈＳＣ１６．５６の以下の配列番号７１及び７２（これは、国際公報ＷＯ２０１７／０３１４５８号の配列番号７及び８に対応する）の重鎖全長及び軽鎖全長アミノ酸配列を参照しながら作製した：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＩＧＤＳＳＰＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ （配列番号７１）、または
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＶＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＮＲＹＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥ ＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ （配列番号７２）
（実施例１０）
Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲートの作製
工程１：抗体－薬物コンジュゲート（１）
Figure 2024503658000027
抗体の還元：実施例８－１で作製されたＨ２－Ｃ８－Ａを、作製方法１に記載される一般的な手順Ｂ（２８０ｎｍの吸収係数として１．５２ｍＬｍｇ-1ｃｍ-1を使用して）及びＣを使用することによって、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡで１０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。この溶液（２．０ｍＬ）に、１０ｍＭのＴＣＥＰ（東京化成工業株式会社）の水溶液（０．０８６８ｍＬ；抗体分子１個当たり６．０当量）及び１Ｍのリン酸水素二カリウム水溶液（ナカライテスク株式会社；０．０３００ｍＬ）を添加した。溶液がｐＨ７．０を有することを確認した後に、溶液を３７℃で２時間インキュベートすることによって、抗体中の鎖間のジスルフィド結合を還元した。
抗体と薬物リンカーとのコンジュゲーション：ジメチルスルホキシド中のＮ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－ｌＨ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－ｌＨ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）（ＵＳ２０１６／０２９７８９０の実施例１４、プロセス８）の１０ｍＭ溶液（０．１４５ｍＬ；抗体分子１個当たり１０当量）をそこに添加し、得られた混合物を１５℃で１時間インキュベートして、薬物リンカーを抗体にコンジュゲートさせた。その後、１００ｍＭのＮＡＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ）の水溶液（０．０１４５ｍＬ；抗体分子１個当たり１０当量）をそこに添加し、得られた混合物を室温で２０分間さらに撹拌して、薬物リンカーの反応を終わらせた。
精製：上述した溶液を、作製方法１に記載される一般的な手順Ｄによって精製して、９．０ｍＬの表題の抗体－薬物コンジュゲート「Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート」を含有する溶液を得た。
特徴付け：作製方法１に記載される一般的な手順Ｅを使用して（εA,280＝２２０３７８及びεA,370＝０、εD,280＝５４４０及びεD,370＝２１８００を使用して）、以下の特徴的な値を得た。抗体濃度：１．９６ｍｇ／ｍＬ、抗体収量：１７．６ｍｇ（８４％）、一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：５．０、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム１）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．５。
（実施例１１）
Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲートの作製
実施例１０と同じオペレーションを、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ溶液（ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ中の１０．１ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍＬ）（２８０ｎｍの吸収係数として１．４６ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用して）を使用して実行した。結果として、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート溶液（１８ｍＬ）を得た。
特徴付け：作製方法１に記載される一般的な手順Ｅを使用して（εA,280＝２１５３５３及びεA,370＝０、εD,280＝５４４０及びεD,370＝２１８００を使用して）、以下の特徴的な値を得た。抗体濃度：１．７４ｍｇ／ｍＬ、抗体収量：３１．４ｍｇ（７８％）、一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：５．３、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム１）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．７。
（実施例１２）
Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲートの作製
実施例１０と同じオペレーションを、Ｈ１０－Ｏ１８Ａ溶液（ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ中の１０．５ｍｇ／ｍＬ、３．８ｍＬ）（２８０ｎｍの吸収係数として１．４９ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用して）を使用して実行した。結果として、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａコンジュゲート溶液（１８ｍＬ）を得た。
特徴付け：作製方法１に記載される一般的な手順Ｅを使用して（εA,280＝２１５４２４及びεA,370＝０、εD,280＝５４４０及びεD,370＝２１８００を使用して）、以下の特徴的な値を得た。抗体濃度：１．８０ｍｇ／ｍＬ、抗体収量：３２．５ｍｇ（８１％）、一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：５．１、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム２）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．８。
（実施例１３）
抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ、ＳＣ１６ＬＤ６．５の作製
抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ、ＳＣ１６ＬＤ６．５を、以下の工程によって調製した；抗ＤＬＬ３抗体、ｈＳＣ１６．５６を、ＷＯ２０１７／０３１４５８Ａ２を参照して作製した。ｈＳＣ１６．５６の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１及び配列番号７２によって表される。薬物リンカーであるＳＧ３２４９を、以前の報告に従って合成した（Med. Chem. Lett. 2016, 7, 983-987）。ｈＳＣ１６．５６を、ＷＯ２０１４／１３０８７９Ａ２に記載される手順に従って、ＳＧ３２４９とコンジュゲートして、ＳＣ１６ＬＤ６．５を得た。
（実施例１４）
抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートの作製
抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートは、ＤＬＬ３と関係のない抗原を認識するヒトＩｇＧから作製された抗体－薬物コンジュゲートであり、これを、陰性対照として使用した。
国際公開ＷＯ２０１５／０４６５０５号に記載されるｈ＃１Ｇ５－Ｈ１Ｌ１の以下で配列番号７３及び７４で示される重鎖全長及び軽鎖全長アミノ酸配列（国際公開ＷＯ２０１５／０４６５０５号の配列番号５７及び６７に相当する）を参照しながら、抗ＬＰＳ抗体を作製した。
実施例１０の類似の方式で、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートを、抗ＬＰＳ抗体及びＮ－［６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－ｌＨ－ピロール－１－イル）ヘキサノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－（２－｛［（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－ｌＨ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル］アミノ｝－２－オキソエトキシ）メチル］グリシンアミド（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）を使用して調製した。
特徴付け：抗体濃度：１０．７４ｍｇ／ｍＬ一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：５．８、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム１）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＹＰＧＳＳＳＩＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＹＮＹＧＳＳＧＹＮＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（ＬＰＳ＿重鎖；配列番号７３）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＥＮＶＧＮＳＶＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ＬＰＳ＿軽鎖；配列番号７４）
（実施例１５）
インビボにおける抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍作用
抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍作用を、免疫不全マウス由来の動物モデルを使用して、ＤＬＬ３陽性ヒト腫瘍細胞株の細胞を接種させることによって評価した。４～５週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌ［ｎｕ］／ＣｒｌＣｒｌｊ［Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｆｏｘｎｌｎｕ］、日本チャールス・リバー株式会社）を、実験で使用する前に、ＳＰＦ条件下で、３日間又はそれより長く順化させた。マウスに、滅菌した固体食物（ＦＲ－２、株式会社フナバシファーム）及び所与の滅菌した水道水（これは、５～１５ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム溶液を水道水に添加することによって調製された）を給餌した。接種を受けた腫瘍の長径と短径を、電子デジタルノギス（ＣＤ－１５ＣＸ、株式会社ミツトヨ）を使用して週２回測定し、次いで腫瘍の体積を、以下の式に従って計算した。
腫瘍体積（ｍｍ3＝１／２×長径（ｍｍ）×［短径（ｍｍ）］2
各抗体－薬物コンジュゲートを、ＡＢＳ緩衝剤（１０ｍＭの酢酸緩衝剤、５％のソルビトール、ｐＨ５．５）（ナカライテスク株式会社）で希釈し、各マウスの尾部に、希釈物を、各実施例に示される用量で静脈内投与した。対照グループ（ビヒクルグループ）に、上記と同じ方式でＡＢＳ緩衝剤を投与した。グループ１つ当たり６匹のマウスを実験に使用した。
１５）－１抗腫瘍作用－（１）
ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ２０９（ＡＴＣＣ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に懸濁し、細胞懸濁液を、各雌ヌードマウスの右脇腹の領域に細胞４×１０6個の用量で皮下接種させた（０日目）。１１日目に、マウスをランダムにグループ分けした。グループ分けの日に、３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートのそれぞれを、３ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスの尾部に静脈内投与した。図１に結果を示す。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、ＳＥ値を示す。矢印は、投与の日付を示す。
この腫瘍モデルにおいて、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートは、有意義な抗腫瘍作用を呈しなかった。３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）の全てが、投与後に腫瘍体積を減少させ、有意な腫瘍退縮を引き起こし、投与後の２８日間にわたり腫瘍退縮作用を持続させた（図１）。加えて、各抗体－薬物コンジュゲートで処置したマウスは、体重の減少の有意な兆候を示さなかったことから、３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）は、低い毒性であり、安全であることが示唆される。各グループのマウスのうち少なくとも１匹の推測された腫瘍体積が３０００ｍｍ3を超えた場合、ビヒクル及び抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートグループを安楽死させた。
１５）－２抗腫瘍作用－（２）
ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２４（ＡＴＣＣ）をＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に懸濁し、細胞懸濁液を、各雌ヌードマウスの右わき腹の領域の皮下に、細胞２．５×１０6個の用量で接種した（０日目）。１３日目に、マウスをランダムにグループ分けした。グループ分けの日に、３種抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートのそれぞれを、３ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスの尾部に静脈内投与した。図２に結果を示す。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、ＳＥ値を示す。矢印は、投与の日付を示す。
この腫瘍モデルにおいて、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートは、有意義な抗腫瘍作用を呈しなかった。全ての３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）が、投与後に腫瘍体積を減少させ、有意な腫瘍退縮を引き起こし、投与後の２９日間にわたり腫瘍退縮作用を持続させた（図２）。加えて、各抗体－薬物コンジュゲートで処置したマウスは、体重の減少の有意な兆候を示さなかったことから、３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）は、毒性が低く安全であることが示唆される。グループのマウスのうちの少なくとも１匹の推測された腫瘍体積が３０００ｍｍ3を超えた場合、ビヒクル及び抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートグループを安楽死させた。
１５）－３抗腫瘍作用－（３）
ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１０Ａ（ＡＴＣＣ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に懸濁し、細胞懸濁液を、各雌ヌードマウスの右脇腹の領域に細胞２．５×１０6個の用量で皮下接種させた（０日目）。１５日目に、マウスをランダムにグループ分けした。グループ分けの日に、３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）のそれぞれ、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートを、各マウスの尾部に３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。参照抗ＤＬＬ３－抗体－薬物コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）を、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスの尾部に静脈内投与した。図３に結果を示す。横座標は、接種後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、ＳＥ値を示す。矢印は、投与の日付を示す。
この腫瘍モデルにおいて、抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲート３ｍｇ／ｋｇは、有意義な抗腫瘍作用を呈しなかった。この腫瘍モデルにおいて、参照抗ＤＬＬ３－薬物コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）０．２ｍｇ／ｋｇは、ある程度の腫瘍増殖阻害を呈し、腫瘍退縮作用は呈しなかった。一方で、全ての３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）３ｍｇ／ｋｇは、投与後に腫瘍体積を減少させ、有意な腫瘍退縮を引き起こし、投与後の２７日間にわたり腫瘍退縮作用を持続させた。全ての３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）は、ＳＣ１６ＬＤ６．５より腫瘍体積をさらに減少させた。したがって、本発明の３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）３ｍｇ／ｋｇは、ＳＣ１６ＬＤ６．５と比較して、抗癌剤として作用する抗体－薬物コンジュゲートとして優れている。（図３）。加えて、各抗体－薬物コンジュゲートで処置したマウスは、体重の減少の有意な兆候を示さなかったことから、３種の抗体－薬物コンジュゲート（クローン名称：Ｈ２－Ｃ８－Ａ－コンジュゲート、Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－コンジュゲート）は、毒性が低く安全であることが示唆される。
（実施例１６）
Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２コンジュゲートの作製
実施例１０と同じオペレーションを、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２溶液（ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ中の１０．１ｍｇ／ｍＬ、１８．０ｍＬ）（２８０ｎｍの吸収係数として１．５３ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用して）を使用して実行した。結果として、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２コンジュゲート溶液（５９．５ｍＬ）を得た。
特徴付け：作製方法１に記載される一般的な手順Ｅを使用して（εA,280＝２２０４２０及びεA,370＝０、εD,280＝５４４０及びεD,370＝２１８００を使用して）、以下の特徴的な値を得た。抗体濃度：２．８０ｍｇ／ｍＬ、抗体収量：１６６ｍｇ（９２％）、一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：６．１、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム１）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．８。
（実施例１７）
Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートの作製
実施例１０と同じオペレーションを、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２溶液（ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡ中の１０．３ｍｇ／ｍＬ、１８．３ｍＬ）（２８０ｎｍの吸収係数として１．４９ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１を使用して）を使用して実行した。結果として、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２コンジュゲート溶液（５９．５ｍＬ）を得た。
特徴付け：作製方法１に記載される一般的な手順Ｅを使用して（εA,280＝２１５３８０及びεA,370＝０、εD,280＝５４４０及びεD,370＝２１８００を使用して）、以下の特徴的な値を得た。抗体濃度：２．８５ｍｇ／ｍＬ、抗体収量：１６９．８ｍｇ（９０％）、一般的な手順Ｅによって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：６．０、及び一般的な手順Ｆ（勾配プログラム２）によって測定された抗体分子１個当たりのコンジュゲートした薬物分子の平均数（ｎ）：７．９。
（実施例１８）
インビボにおける抗体－薬物コンジュゲートの抗腫瘍作用
１８）－１抗腫瘍作用－（４）
ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ（ＡＴＣＣ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に懸濁し、細胞懸濁液を、各雌ヌードマウスの右脇腹の領域に細胞２．３×１０6個の用量で皮下接種させた。腫瘍が定着した後、マウスをランダムにグループ分けした（グループ１つ当たり６匹のマウス）。グループ分けの日に、２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）、又は抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートのそれぞれを、３ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスの尾部に静脈内投与した。参照抗ＤＬＬ３抗体－コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）を、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスの尾部に静脈内投与した。図１２に結果を示す。横座標は、投与後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、ＳＥ値を示す。
この腫瘍モデルにおいて、３ｍｇ／ｋｇの抗ＬＰＳ抗体－コンジュゲートは、有意義な抗腫瘍作用を呈しなかった。この腫瘍モデルにおいて、０．２ｍｇ／ｋｇの参照抗ＤＬＬ３－薬物コンジュゲート（ＳＣ１６ＬＤ６．５）は、ある程度の腫瘍増殖阻害を呈し、腫瘍退縮作用を生じなかった。一方で、これらのグループにおいて、３ｍｇ／ｋｇの２種の両方の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）が、腫瘍体積を減少させ、腫瘍の全てが、投与後の２８日に、それらの最初の体積より小さくなった。Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート及びＨ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートはさらに、ＳＣ１６ＬＤ６．５より腫瘍体積を減少させた。したがって、本発明の２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）は、ＳＣ１６ＬＤ６．５抗体－薬物コンジュゲートと比較して、抗腫瘍剤として作用する抗体－薬物コンジュゲートとして優れている（図１２）。加えて、各抗体－薬物コンジュゲートで処置したマウスは、体重の減少を示さなかったか、又はわずかな体重の減少しか示さなかったことから、これらの抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）は、低い毒性であり、安全であることが示唆される。グループのマウスのうちの少なくとも１匹の腫瘍の長径が２０ｍｍを超えた場合、ビヒクルグループを安楽死させた。
１８）－２抗腫瘍作用－（５）
ＤＬＬ３陽性ヒト小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ２０９（ＡＴＣＣ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に懸濁し、細胞懸濁液を、各雌ヌードマウスの右脇腹の領域に細胞４×１０6個の用量で皮下接種させた。腫瘍が定着した後、マウスをランダムにグループ分けした（グループ１つ当たり５匹のマウス）。グループ分けの日に、２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）のそれぞれを、各マウスの尾部に３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。図１３に結果を示す。横座標は、投与後の日数を示し、縦座標は、推測された腫瘍体積を示す。誤差範囲は、ＳＥ値を示す。
これらのグループにおいて、２種の両方の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）が、腫瘍体積を減少させ、腫瘍の全てが、投与後の２８日に、それらの最初の体積より小さくなった。加えて、各抗体－薬物コンジュゲートで処置したマウスは、体重の減少の有意義な兆候を示さなかったことから、２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）は両方とも、低い毒性であり、安全であることが示唆される。
（実施例１９）
ＩＣＲマウスにおける抗体－薬物コンジュゲートの毒性又は許容できる用量
１９）－１ ＩＣＲマウスにおける許容できる用量－（１）
対照：５週齢のＣＤ１（ＩＣＲ）雄マウス（日本チャールス・リバー株式会社）をランダムにグループ分けした（グループ１つ当たり５匹のマウス）。グループ分けの日に、２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、又はＨ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）のそれぞれを、４５又は９０ｍｇ／ｋｇの用量で、各マウスの尾部に静脈内投与した。マウスを、死亡率に関して週数回観察し、投与後の４１日間、体重を測定した。
この実験中、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは全て生存した。この実験中、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは、いずれの試験された用量（４５、９０ｍｇ／ｋｇ）でも、わずかな体重の減少しか示さないか、又は体重の減少を示さなかった。この実験中、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは全て生存した。この実験中、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは、いずれの試験された用量（４５、９０ｍｇ／ｋｇ）でも、わずかな体重の減少しか示さないか、又は体重の減少を示さなかった。
１９）－２ ＩＣＲマウスにおいて許容できる用量－（２）
対照：５週齢のＣＤ１（ＩＣＲ）雌マウス（日本チャールス・リバー株式会社）をランダムにグループ分けした（グループ１つ当たり５匹のマウス）。グループ分けの日に、２種の抗体－薬物コンジュゲート（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲート、又はＨ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲート）のそれぞれを、各マウスの尾部に、４５、又は９０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。マウスを、死亡率に関して週数回観察し、投与後の４１日間、体重を測定した。
この実験の間、Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは全て生存した。Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは、この実験の間、試験されたどの用量でも（４５、９０ｍｇ／ｋｇ）、わずかな体重の減少を示すか又は体重の減少を示さなかった。この実験の間、Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは全て生存した。Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２－コンジュゲートで処置したマウスは、この実験の間、試験されたどの用量でも（４５、９０ｍｇ／ｋｇ）、わずかな体重の減少を示すか又は体重の減少を示さなかった。
産業上の利用可能性：本発明は、内在化活性を有する抗ＤＬＬ３抗体及びその抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートを提供する。抗体－薬物コンジュゲートは、がんなどのための治療薬物として使用することができる。実際に、前述の実施例及び開示は、本発明の技術のＡＤＣ組成物が、ＤＬＬ３関連がん（例えば、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍、神経膠腫又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ））に罹っている対象を処置するための方法において有用であることを実証する。

Claims (44)

  1. リンカーを介して薬物にコンジュゲートされている、ＤＬＬ－３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲートであって、抗体又は当該抗体の機能的な断片は、ＤＬＬ３に結合することが可能であり、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、
    （ａ）ＶHは、
    （ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５；並びに
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５
    からなる群から選択されるＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含み；及び／又は
    （ｂ）ＶLは、
    （ｉ）それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
    からなる群から選択されるＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含む、抗体－薬物コンジュゲート。
  2. 抗体が、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、
    （ａ）ＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含むＶH及び（ｂ）ＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含むＶLの組合せは、
    （ｉ）それぞれ、（ａ）配列番号３、配列番号４、及び配列番号５並びに（ｂ）配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
    （ｉｉ）それぞれ、（ａ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５並びに（ｂ）配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
    （ｉｉｉ）それぞれ、（ａ）配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５並びに（ｂ）配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
    （ｉｖ）それぞれ、（ａ）配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５並びに（ｂ）配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
    からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  3. 抗体が、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、
    （ａ）ＶHは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；及び／又は
    （ｂ）ＶLは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、及び配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  4. 抗ＤＬＬ３抗体が、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、（ａ）ＶHは、配列番号１２、配列番号２２又は配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶLは、配列番号１７、配列番号２７又は配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  5. ＶHアミノ酸配列及びＶLアミノ酸配列が、
    それぞれ配列番号２及び配列番号７（７－Ｉ１－Ｂ）；
    それぞれ配列番号１２及び配列番号１７（２－Ｃ８－Ａ）；
    それぞれ配列番号２２及び配列番号２７（１０－Ｏ１８－Ａ）；及び
    それぞれ配列番号３２及び配列番号３７（６－Ｇ２３－Ｆ）
    からなる群から選択されるか；又は
    抗ＤＬＬ３抗体が、
    それぞれ配列番号５９及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ）；
    それぞれ配列番号６０及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－２）；
    それぞれ配列番号６１及び配列番号６２（Ｈ２－Ｃ８－Ａ－３）；
    それぞれ配列番号６７及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ）；
    それぞれ配列番号６８及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－２）；
    それぞれ配列番号６９及び配列番号７０（Ｈ１０－Ｏ１８－Ａ－３）；
    それぞれ配列番号６３及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ）；
    それぞれ配列番号６４及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－２）；並びに
    それぞれ配列番号６５及び配列番号６６（Ｈ６－Ｇ２３－Ｆ－３）
    からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  6. 抗体が、
    （ａ）配列番号７、１７、２７、若しくは３７のいずれか１つの軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に少なくとも９５％同一な軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列、又は配列番号６２、６６、若しくは７０のいずれか１つの配列に少なくとも９５％同一な軽鎖配列；及び／又は
    （ｂ）配列番号２、１２、２２、又は３２のいずれか１つに存在する重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に少なくとも９５％同一な重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列、又は配列番号５９、６０、６１、６３、６４、６５、６７、６８、又は６９のいずれか１つの配列に少なくとも９５％同一な重鎖配列
    を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  7. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプのＦｃドメインをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  8. 抗ＤＬＬ３が、配列番号４２、５７又は５８の重鎖定常領域を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  9. 抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦv、及びＦvからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  10. 抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は二重特異性抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  11. 抗体が、
    （ａ）配列番号５９～６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｂ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖；及び／又は
    （ｃ）配列番号６７～６９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  12. 抗体が、
    （ａ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖；
    （ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖
    を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  13. 抗ＤＬＬ－３抗体が、ＤＬＬ－３への結合に関して請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体と競合する、請求項１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  14. 抗体が、哺乳類ＤＬＬ３ポリペプチドに存在するエピトープに結合する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  15. エピトープが、コンフォメーショナルエピトープ又は非コンフォメーショナルエピトープである、請求項１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  16. 哺乳類ＤＬＬ３ポリペプチドが、配列番号５０又は配列番号５１のアミノ酸残基２７～４９２を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  17. 重鎖又は軽鎖が、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、重鎖の２３４位及び２３５位における２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への置換（ＥＵの番号付け）（ＬＡＬＡ）、重鎖のアミノ酸残基３５６位のＧｌｕ（Ｅ）及び３５８位のＭｅｔ（Ｍ）のセット（ＥＵの番号付け）、重鎖の３５６位のＡｓｐ（Ｄ）及び３５８位のロイシン（Ｌ）のセット（ＥＵの番号付け）又はそれらのあらゆる組合せ、Ｎ末端グルタミン又はＮ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、並びにカルボキシル末端からの１又は２つのアミノ酸の欠失からなる群から選択されるアミノ酸残基の１若しくは２つ又はそれより多くの改変又はセットを有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  18. １又は２アミノ酸が、重鎖のカルボキシル末端から欠失している、請求項１７に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  19. １つのアミノ酸が、重鎖の両方のカルボキシル末端のそれぞれから欠失している、請求項１８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  20. 重鎖のカルボキシル末端におけるプロリン残基が、さらにアミド化されている、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  21. 抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を強化するために調節されている糖鎖改変を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  22. 薬物が、以下の式：
    Figure 2024503658000028
     によって表される抗腫瘍化合物である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  23. 抗体が、以下の式（ａ）～（ｆ）：
    （ａ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
    （ｂ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
    （ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
    （ｄ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
    （ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
    （ｆ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
    からなる群から選択されるいずれかの構造を有するリンカーを介して薬物にコンジュゲートされており、
    抗体は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）の末端に接続されており、抗腫瘍化合物は、１位におけるアミノ基の窒素原子を接続位置として（ａ）、（ｂ）、（ｅ）又は（ｆ）の－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分のカルボニル基、（ｃ）のＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分又は（ｄ）のＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－部分に接続されおり、ＧＧＦＧ（配列番号８４）は、ペプチド結合を介して連結されたグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（配列番号８５）からなるアミノ酸配列を表し、
    －（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－は、以下の式によって表される構造：
    Figure 2024503658000029
     を有し、この構造は、その３位で抗体に接続されており、１位における窒素原子で、この構造を含有するリンカー構造中のメチレン基に接続されている、請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  24. リンカーが、以下の式（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）：
    （ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、
    （ｄ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
    （ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
    からなる群から選択されるいずれかの式によって表される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  25. リンカーが、以下の式（ｃ）又は（ｅ）：
    （ｃ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）、及び
    （ｅ）－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－Ｃ（＝Ｏ）－（配列番号８５として開示される「ＧＧＦＧ」）
    によって表される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  26. 以下の式によって表される構造：
    Figure 2024503658000030
     を有し、式中、ＡＢは、抗体を表し、ｎは、抗体１個当たりの抗体にコンジュゲートした薬物－リンカー構造の単位の平均数を表し、抗体は、抗体由来のスルフヒドリル基を介してリンカーに接続されている、請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  27. 以下の式によって表される構造：
    Figure 2024503658000031
     を有し、式中、ＡＢは、抗体を表し、ｎは、抗体１個当たりの抗体にコンジュゲートした薬物－リンカー構造の単位の平均数を表し、抗体は、抗体由来のスルフヒドリル基を介してリンカーに接続されている、請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  28. 抗体が、配列番号１７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号１２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  29. 抗体が、配列番号２７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  30. 抗体が、配列番号３７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号３２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  31. 抗体が、配列番号７の可変ドメイン配列を含む軽鎖及び配列番号２の可変ドメイン配列を含む重鎖を含む抗体である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  32. 抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数が、１～１０の範囲内である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  33. 抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数が、２～８の範囲内である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  34. 抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数が、５～８の範囲内である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  35. 抗体１個当たりのコンジュゲートした選択された薬物－リンカー構造の単位の平均数が、７～８の範囲内である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
  36. 請求項１～３５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、又は当該コンジュゲート若しくは塩の水和物を含む医薬組成物。
  37. 抗腫瘍薬である、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 腫瘍を処置することにおける使用のためのものであり、腫瘍は、ＤＬＬ３を発現する腫瘍である、請求項３６又は３７に記載の医薬組成物。
  39. 腫瘍が、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）；大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）；腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍；神経膠腫；又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）である、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 腫瘍を処置するための方法であって、請求項１～３５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、及びコンジュゲート又は塩の水和物を、腫瘍を有する個体に投与することを含む方法。
  41. 腫瘍を処置するための方法であって、請求項１～３５のいずれか１項に記載の抗体－薬物コンジュゲート、その塩、及びコンジュゲート又は塩の水和物を含む医薬組成物、及び少なくとも１つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に、又は連続的に、腫瘍を有する個体に投与することを含む方法。
  42. 腫瘍が、ＤＬＬ３を発現する腫瘍である、請求項４０又は４１に記載の処置するための方法。
  43. 腫瘍が、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）；大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）；腎臓、尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頸、及び子宮内膜）、消化管（胃、結腸）、甲状腺（甲状腺髄様がん）、膵臓及び肺を含む様々な組織の神経内分泌腫瘍；神経膠腫；又は偽性神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）である、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の処置するための方法。
  44. 抗ＤＬＬ３抗体－薬物コンジュゲートを作製するための方法であって、抗ＤＬＬ３抗体又は当該抗体の機能的な断片を、薬物－リンカー中間体化合物と反応させる工程を含み、抗体又は当該抗体の機能的な断片は、ＤＬＬ３に結合することが可能であり、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン（ＶL）を含み、
    （ａ）ＶHは、
    （ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５；
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５；並びに
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５
    からなる群から選択されるＶH－ＣＤＲ１配列、ＶH－ＣＤＲ２配列、及びＶH－ＣＤＲ３配列を含み；及び／又は
    （ｂ）ＶLは、
    （ｉ）それぞれ、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０；
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０；
    （ｉｉｉ）それぞれ、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０；並びに
    （ｉｖ）それぞれ、配列番号３８、配列番号３９、及び配列番号４０
    からなる群から選択されるＶL－ＣＤＲ１配列、ＶL－ＣＤＲ２配列、及びＶL－ＣＤＲ３配列を含む、方法。
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