ES2830385T3 - Anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2 - Google Patents

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cancer
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Mark Dennis
Jagath Reddy Junutula
Gail Lewis Phillips
Thomas Harden Pillow
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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a HER2, en donde el anticuerpo comprende: (i) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H 2 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 14, en donde el anticuerpo se une a HER2 con una constante de disociacion (KD) de <= 5 nM como se determina mediante resonancia de plasmon superficial; y/o (ii) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 11 y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2
Campo
La presente invención se refiere a anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2 y a los métodos de utilizar los mismos.
Antecedentes
El cáncer de mama es una causa muy significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Existen aproximadamente 1,3 millones de casos de cáncer de mama diagnosticados globalmente cada año con más de 450.000 muertes relacionadas con la enfermedad (Jemal A, Bray F, Center M, etal. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011; 61(2):69-90).
El receptor de la tirosina quinasa HER2 (ErbB2) es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de los receptores transmembrana. La expresión en exceso de HER2 se ha observado en aproximadamente un 20 % de cánceres de mama humanos y está implicada en el crecimiento agresivo y los malos resultados clínicos asociados con estos tumores (Slamon et al (1987) Science 235:177-182). La expresión en exceso de la proteína HER2 se ha observado en cánceres de mama primarios, y se puede determinar usando una evaluación inmunohistoquímica de bloques de tumores fijados (Press m F, et al. (1993) Cancer Res 53:4960-70).
Trastuzumab (CAS 180288-69-1, HERCEPTIN®, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Genentech) es un anticuerpo monoclonal recombinante derivado de ADN de la lgG1 kappa, que es una versión humanizada de un anticuerpo anti-HER2 de murino (4D5) que se une selectivamente con alta afinidad en un ensayo con células (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de HER2 (documentos US 5677171; US 5821337; US 6054297; US 6165464; US 6339142; US 6407213; US 6639055; US 6719971; US 6800738; US 7074404; Coussens et al (1985) Science 230:1132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792). Trastuzumab ha demostrado, tanto en ensayos realizados in vitro como en animales, inhibir la proliferación de células tumorales humanas que expresan HER2 en exceso (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831). Trastuzumab es un mediador de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, ADCC (Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother 37(4):255-263; Hotaling et al (1996) [resumen]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [resumen]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Supl 12:60-70; Yarden Y. y Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137).
HERCEPTIN® fue homologado en 1998 para el tratamiento de pacientes con cánceres de mama metastásicos que expresaban HER2 en exceso (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744) que han recibido una extensa terapia previa contra el cáncer y, desde entonces, se ha utilizado en más de 300.000 pacientes (Slamon DJ, et al. N Engl J Med 2001;344:783-92; Vogel CL, et al. J Clin Oncol 2002;20:719-26; Marty M, et al. J Clin Oncol 2005;23:4265-74; Romond EH, et al. TN Engl J Med 2005;353:1673-84; Piccart-Gebhart MJ, et al. N Engl J Med 2005;353:1659-72; Slamon D, et al. [resumen]. Breast Cancer Res Treat 2006, 100 (Supl 1): 52). En 2006, la FDA homologó HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech Inc.) como parte de un régimen de tratamiento que contenía doxorrubicina, ciclofosfamida y paclitaxel para el tratamiento adyuvante de pacientes positivos para HER2, cáncer de mama positivo para ganglios.
Trastuzumab-MCC-DMl (T-DM1, trastuzumab emtansina, adotrastuzumab emtansina, KADCYLA®), un novedoso conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) para el tratamiento del cáncer de mama positivo para HDER2, está compuesto del agente citotóxico DM1 (un agente maitansinoide antimicrotúbulos que contiene tiol) conjugado a trastuzumab en las cadenas laterales de lisina mediante un enlazador MCC, con una carga promedio de fármaco (relación fármaco a anticuerpo) de aproximadamente 3,5. Tras la unión con HER2 expresada en células tumorales, T-DM1 experimenta una internalización mediada por receptor, dando como resultado una liberación intracelular de catabolitos citotóxicos que contienen DM1 y la posterior muerte celular.
La U.S. Food and Drug Administration homologó adotrastuzumab emtansina, comercializada con el nombre comercial KADCYLA®, el 22 de febrero de 2013 para el tratamiento de pacientes de cáncer de mama metastásico positivo para HER2, que previamente había recibido tratamiento con trastuzumab y un taxano.
Pertuzumab (conocido también como anticuerpo 2C4 monoclonal humanizado recombinante, rhuMAb 2C4, PERJETA®, Genentech, Inc, South San Francisco) representa el primero de una nueva clase de agentes conocidos como inhibidores de la dimerización de HER (HDI) y funciona inhibiendo la capacidad de HER2 para formar heterodímeros u homodímeros activos con otros receptores de HER (tales como EGFR/HER1, HER2, HER3 y HER4). Véanse, por ejemplo, Harari y Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden y Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003); y Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)
Se ha comprobado que el bloqueo que realiza pertuzumab sobre la formación de heterodímeros HER2-HER 3 en células tumorales inhibe la señalización celular crítica, lo que da como resultado una proliferación y supervivencia tumorales reducidas (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)).
Se ha evaluado Pertuzumab en estudios en Fase II junto con trastuzumab en pacientes con cáncer de mama metastásico positivo para HER2 que habían recibido previamente trastuzumab para la enfermedad metastásica. Un estudio, realizado por el National cancer Institute (NC1), alistó 11 pacientes con cáncer de mama metastásico positivo para HER2 previamente tratados. Dos de los 11 pacientes presentaron una respuesta parcial (RP) (Baselga et al., J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings; 25:18 S (suplemento 20 de junio): 1004. Los resultados de un estudio en Fase II con neoadyuvantes que evaluó el efecto de un novedoso régimen combinado de pertuzumab y trastuzumab más quimioterapia (Docetaxel) en mujeres con cáncer de mama positivo para HER-2 en etapa temprana, presentado en el CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium (SABCS), 8-12 de diciembre de 2010, mostraron que los dos anticuerpos de HER2 más docetaxel administrados en el escenario neoadyuvante antes de la cirugía mejoraron significativamente la tasa de desaparición completa del tumor (tasa de respuesta patológica completa, pCR, del 45,8 por ciento) en la mama en más de la mitad en comparación con trastuzumab más Docetaxel (pCR de 29, 0 por ciento), p = 0,014.
Pertuzumab, comercializado con el nombre comercial PERJETA®, fue homologado en 2012 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama positivo para HER2 en etapa avanzada o tardía (metastásico). Los cánceres de mama positivos para HER2 tienen cantidades mayores de proteína HER2 que contribuyen al crecimiento y supervivencia de células cancerosas.
El 30 de septiembre de 2013, la U.S. Food and Drug Administration concedió la homologación acelerada a PERJETA® (pertuzumab) como parte de un régimen de tratamiento completo para pacientes con cáncer de mama en etapa temprana (EBC) antes de la cirugía (escenario neoadyuvante). PERJETA® es el primer fármaco homologado por la FDA para el tratamiento neoadyuvante del cáncer de mama.
Existe una necesidad en la técnica de agentes adicionales seguros y eficaces dirigidos contra HER2 para el tratamiento de dolencias asociadas a HER2, tales como cáncer de mama, para usar en monoterapia y terapia combinada. La invención cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.
Los documentos US 2013/0195845; WO 98/17797, US 2005/0208043 y EP2540745 divulgan anticuerpos anti-HER2.
Sumario
La invención proporciona anticuerpos anti-HER2, ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos, células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos, métodos para producir los anticuerpos, inmunoconjugados y métodos para utilizar los anticuerpos, tal como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado que se une a HER2, en donde el anticuerpo comprende (i) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:15; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14, en donde el anticuerpo se une a HER2 con una constante de disociación (KD) de < 5 nM como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; y/o (ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a HER2.
En algunas realizaciones, HER2 es un HER2 humano que comprende los aminoácidos 23 a 1255 del SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al dominio extracelular I de HER2. En algunas realizaciones, el dominio extracelular I de HER2 tiene la secuencia del SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al bucle 163-189 y al bucle 185-189 del dominio extracelular I (por ejemplo, un primer bucle definido por los aminoácidos 163­ 189 y un segundo bucle definido por los aminoácidos 185-189 del dominio extracelular I). En algunas realizaciones, el anticuerpo entra en contacto con His171, Ser186, Ser187 y Glu188 del dominio extracelular I.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG1, IgG2a o IgG2b. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende al menos una mutación en la región constante de la cadena pesada seleccionada entre A118C y S400C. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende al menos una mutación en la región constante de la cadena ligera seleccionada entre K149C y V205C, en donde los restos se han numerado según el sistema de numeración UE.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende:
a) una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende una secuencia del Se Q ID NO: 18; o
b) una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende una secuencia del SEQ ID NO: 23; o
c) una cadena pesada que comprende una secuencia del SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera que comprende una secuencia del Se Q ID NO: 18.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la región constante de la cadena pesada del SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende la región constante de la cadena ligera del SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado que se une a HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado que se une a HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico aislado, que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico. En algunas realizaciones, se proporciona un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula hospedadora de tal manera que se produzca el anticuerpo.
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento y un agente citotóxico. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab-(L-D)p, en donde:
a) Ab es el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16;
b) L es un enlazador;
c) D es un agente citotóxico; y
d) p está comprendido entre 1-8.
En algunas realizaciones, p varía de 1,3-2 o de 2-5. En algunas realizaciones, p es aproximadamente 2.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico se selecciona entre una auristatina, un maitansinoide, una calicheamicina, una pirrolobenzodiazepina, un derivado de nemorubicina y un 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI).
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde D es una pirrolobenzodiazepina de Fórmula A:
Figure imgf000004_0001
en donde la línea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3;
R2 se selecciona independientemente entre H, Oh , =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-Rd, =C(Rd)2, O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente además seleccionados entre halo o dihalo, en donde RD se selecciona independientemente entre R, CO2R, COR, CHO, CO2H y halo;
R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo;
Q se selecciona independientemente entre O, S y NH;
R11 es H o R; o Q es O y R11 es SO3M, en donde M es un catión metálico;
R y R' se selecciona cada uno independientemente entre grupos alquilo C1-8, heterociclilo C3-8 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y opcionalmente en relación con el grupo NRR', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido;
R12, R16, R19 y R17 son como se define para R2, R6, R9 y R7 respectivamente;
R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y
X y X' se seleccionan independientemente entre O, S y N(H).
En algunas realizaciones, D tiene la estructura:
en donde
Figure imgf000005_0001
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde D es un derivado de nemorubicina. En algunas realizaciones, D tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000005_0002
y
Figure imgf000005_0003
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde D comprende un 1-(dorometil)-2,3-dihidro en donde
R1 se selecciona entre H, P(O)3H2, C(O)NRaRb o un enlace a L;
R2 se selecciona entre H, p (o )3H2, c(o)N R aRb o un enlace a L;
Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F, o Ra y Rb forman un grupo heterociclilo de cinco o seis miembros;
T es un grupo de unión seleccionado entre alquileno C3-C12, Y, (alquilen Ci -C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquilen Ci -C6)-Y-(alquilen Ci -C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6) y (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6);
en donde Y se selecciona independientemente entre O, S, NR1, arilo y heteroarilo;
en donde alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con F, OH, O(alquilo C1-C6), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2 y alquilo C1-C6, en donde alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más F; o alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con un enlace a L;
D' es un resto fármaco seleccionado entre:
Figure imgf000006_0001
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a T ;
X1 y X2 se seleccionan independientemente entre O y NR3, en donde R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F;
R4 es H, CO2R o un enlace a un enlazador (L), en donde R es alquilo C1-C6 o bencilo; y
R5 es H o alquilo C1-C6.
En algunas realizaciones, D tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000007_0001
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde el enlazador se puede escindir mediante una proteasa. En algunas realizaciones, el enlazador es lábil a los ácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende hidrazona. En algunas realizaciones, el enlazador comprende un disulfuro.
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado comprende una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000008_0001
en donde Ab es un anticuerpo descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado comprende una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000009_0001
en donde Ab es un anticuerpo descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado comprende una estructura seleccionada entre:
Ċ
Figure imgf000010_0001
y
Figure imgf000011_0001
en donde Ab es un anticuerpo descrito en el presente documento.
En cualquiera de los inmunoconjugados descritos en el presente documento, p puede estar comprendido entre 1,3-2, 1,4-2, 1,5-2 o 2-5.
Se describe una formulación farmacéutica, que comprende un inmunoconjugado descrito en el presente documento y un transportador farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica puede comprender además un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo o inmunoconjugado que se une a HER2. El agente terapéutico adicional puede ser (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio II de HER2, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio IV de HER2. El agente terapéutico adicional puede ser (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 2C4, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 4D5. El agente terapéutico adicional puede seleccionarse entre trastuzumab, trastuzumab-MCC-DMl (T-DM1) y pertuzumab. La formulación farmacéutica puede comprender además (1) trastuzumab o T-DM1, y (2) pertuzumab.
En algunas realizaciones, se proporcionan inmunoconjugados para usar en métodos para tratar un individuo que tiene un cáncer positivo para HER2. En algunas realizaciones, un inmunoconjugado para usar en un método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama o cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer de mama positivo para HER2 es cáncer de mama en etapa temprana. En algunas realizaciones, el cáncer de mama positivo para HER2 es cáncer de mama metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer recurrente. En algunas realizaciones, el cáncer recurrente es cáncer localmente recurrente. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer avanzado. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer no resecable. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar un agente terapéutico adicional al individuo.
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado para usar en un método para tratar un individuo que tiene un cáncer positivo para HER2 comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado descrito en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional al individuo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo o inmunoconjugado que se une a HER2. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio II de HER2, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio IV de HER2. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 2C4, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 4D5. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional se selecciona entre trastuzumab, trastuzumab-MCC-DMl (T-DM1) y pertuzumab. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos adicionales son (1) trastuzumab o T-DM1, y (2) pertuzumab. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama o cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer de mama positivo para HER2 es cáncer de mama en etapa temprana. En algunas realizaciones, el cáncer de mama positivo para h ER2 es cáncer de mama metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer recurrente. En algunas realizaciones, el cáncer recurrente es cáncer localmente recurrente. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer avanzado. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer no resecable.
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado para usar en un método para tratar un individuo que tiene un cáncer positivo para HER2 comprende:
a) someter al individuo a tratamiento neoadyuvante con un inmunoconjugado descrito en el presente documento o una formulación farmacéutica descrita en el presente documento,
b) eliminar el cáncer mediante cirugía definitiva, y
c) someter al individuo a tratamiento adyuvante con un inmunoconjugado descrito en el presente documento o una formulación farmacéutica descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama o cáncer gástrico.
Se describen en el presente documento métodos para inhibir la proliferación de una célula positiva para HER2. Un método puede comprender exponer la célula a un inmunoconjugado descrito en el presente documento en condiciones que permiten la unión del inmunoconjugado a HER2 sobre la superficie de la célula, inhibiendo de esta forma la proliferación de la célula. La célula puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer gástrico.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo descrito en el presente documento conjugado a un marcador. En algunas realizaciones, el marcador es un emisor de positrones. En algunas realizaciones, el emisor de positrones es 89Zr.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para detectar HER2 humano en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-HER2 descrito en el presente documento en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-HER2 a un HER2 humano de origen natural, y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo anti-HER2 y un HER2 humano de origen natural en la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de cáncer de mama o una muestra de cáncer gástrico.
En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo conjugado a un marcador para usar en métodos para detectar un cáncer positivo para HER2 en un sujeto. El método comprende (i) administrar un anticuerpo anti-HER2 marcado a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cáncer positivo para HER2, en donde el anticuerpo anti-HER2 marcado comprende un anticuerpo anti-HER2 descrito en el presente documento, y (ii) detectar el anticuerpo anti-HER2 marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo anti-HER2 marcado indica un cáncer positivo para HER2 en el sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-HER2 marcado comprende un anticuerpo anti-HER2 conjugado a un emisor de positrones. En algunas realizaciones, el emisor de positrones es 89Zr.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una alineación de la secuencia consenso del subgrupo I de VH humano (VHi) y las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada de 7C2.B9 de murino ("7C2") y 7C2.v2.2.LA humanizado, como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra una alineación de la secuencia consenso de VL kappa IV humana (VLkiv) y las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera de 7C2.B9 de murino ("7C2") y 7C2.v2.2.LA humanizado, como se describe en el Ejemplo 1.
La Figura 3 muestra la estructura del dominio extracelular de Her2, con los dominios I a IV indicados, y los dominios a los cuales se unen los anticuerpos anti-HER2 trastuzumab, pertuzumab y 7C2.
La Figura 4 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 5 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 4.
La Figura 6 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 5.
La Figura 7 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 6.
La Figura 8 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 7.
Las Figuras 9 y 10 muestran un método de síntesis ilustrativo para preparar determinados intermedios del fármaco enlazador CB-PBD, como se describe en el Ejemplo 3.
La Figura 11 muestra un método de síntesis ilustrativo para preparar determinados intermedios del fármaco enlazador CBI-CBI, como se describe en el Ejemplo 3.
Las Figuras 12A-F muestran las estructuras de determinados conjugados de anticuerpo-fármaco usados en los ejemplos del presente documento.
Las Figuras 13A-B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) del anticuerpo de la especie principal pertuzumab.
Las Figuras 14A-B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) de la especie variante de pertuzumab ilustrativa.
Las Figuras 15A-B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (A) y la cadena pesada (B) del anticuerpo trastuzumab.
La Figura 16 muestra un esquema del receptor Her2 y las secuencias de los dominios I a IV.
La Figura 17 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 8.
La Figura 18 muestra el cambio en el volumen tumoral (mm3) con el tiempo después del tratamiento con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) hu7C2.v2.2.LA, como se describe en el Ejemplo 9.
La Figura 19A-D muestra (A) la estructura cristalina del complejo entre HER2 e Cd (superficie sombreada por dominio y muestra un modelo de relleno de espacio) y Fab 7C2. El Fab 7C2 se une al dominio I de HER2, que es diferente de los epítopos de unión del Fab de trastuzumab (Tmab, código PDB: 1N8Z) y del Fab de pertuzumab Fab (Pmab, código PDB: 1S78). (B) Superposición de las estructuras de HER2 ECD en el complejo trastuzumab/HER2, complejo pertuzumab/HER2 y complejo 7C2/HER2. (C) La interfase del complejo 7C2/HER2. Las cadenas laterales de los restos implicados en la interacción 7C2/HER2 se muestran como palos. Algunos de los enlaces de hidrógeno intermoleculares potenciales se muestran como líneas discontinuas. (D) El epítopo de unión 7C2 está parcialmente solapado con el Fv monocatenario (ScFV), chA21. Superposición de la estructura del complejo scFv/HER2 de chA21 (código PDB: 3H3B) con el complejo 7C2/HER2.
Descripción detallada
I. Se hará referencia ahora en detalle a determinadas realizaciones de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas adjuntas. Aunque la invención se describirá junto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que no está previsto que la invención se limite a dichas realizaciones.
Definiciones
Los términos "comprenden", "que comprende", "incluye", "que incluye/n", e "incluye", cuando se usan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, pretenden especificar la presencia de las características, números enteros, componentes o etapas establecidas, pero no excluyen la presencia o adición de una o más características, números enteros, componentes o etapas adicionales o grupos de los mismos.
Un "marco aceptor humano", a efectos del presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de la cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de la cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define más adelante. Un marco aceptor humano "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas realizaciones, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia del marco de VL de inmunoglobulina humana o a la secuencia de marco consenso humana.
"Afinidad " se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su ligando de unión (por ejemplo, un antígeno). Salvo que se indique lo contrario, como se utiliza en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones específicas ilustrativas y de ejemplo para medir la afinidad de unión.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de las regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo precursor que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Las expresiones “anticuerpo anti-HER2” y “un anticuerpo que se une a HER2” se refieren a un anticuerpo que puede unirse a HER2 con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para direccionamiento a HER2. En una realización, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-HER2 a una proteína no HER2 no relacionada es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a HER2 según se mide, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a HER2 tiene una constante de disociación (Kd) de <1 |jM, < 1o0 nM, < 10 nM, < 5 nm, < 4 nM, < 3 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 1o-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10­ 13 M). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-HER2 se une a un epítopo de HER2 que está conservado entre HER2 de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, que incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre tanto que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto y que se une al antígeno con el que interactúa el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque no de forma limitativa, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50 % o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un 50 % o más en un ensayo de competición. Se proporciona en el presente documento un ensayo de competición ilustrativo.
Los términos “cáncer" y “canceroso” se refieren o describen la dolencia fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento/proliferación celular no regulados. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama o cáncer gástrico. En algunas realizaciones, un cáncer es cualquier cáncer positivo para HER2.
Un cáncer "positivo para HER2" comprende células cancerosas que tienen niveles de HER2 mayores que los normales. Los ejemplos de cáncer positivo para HER2 incluyen cáncer de mama positivo para HER2 y cáncer gástrico positivo para h ER2. Opcionalmente, el cáncer positivo para HER2tiene una puntuación inmunohistoquímica (IHC) de 2+ o 3+ y/o una relación de amplificación de la hibridación in situ (ISH) >2,0.
La expresión "cáncer de mama de etapa temprana (EBC)" o "cáncer de mama temprano" se utiliza en el presente documento para referirse a un cáncer de mama que no se ha diseminado más allá de la mama o de los ganglios linfáticos axilares. Esto incluye el carcinoma ductal in situ y los cánceres de mama en etapa I, etapa IIA, etapa IIB, y etapa NIA.
La referencia a un tumor o cáncer como en "Estadio 0", "Estadio I", "Estadio II", "Estadio III", o "Estadio IV", y diversas subetapas dentro de esta clasificación, indica la clasificación del tumor o el cáncer mediante los métodos de agrupación general de etapas o representación de números romanos conocidos en la técnica. Aunque la etapa real del cáncer es dependiente del tipo de cáncer, en general, un cáncer en Estadio 0 es una lesión in situ, un cáncer en Estadio I es un tumor pequeño localizado, un cáncer en Estadio II y III es un tumor local avanzado que presenta implicación de los ganglios linfáticos locales, y un cáncer en Estadio IV representa cáncer metastásico. El médico experto conoce los estadios específicos de cada tipo de tumor.
La expresión "cáncer de mama metastásico" significa el estado del cáncer de mama en que las células cancerosas se transmiten desde el sitio original a uno o más sitios en otra parte en el cuerpo, mediante los vasos sanguíneos o linfáticos, para formar uno o más tumores secundarios en uno o más órganos además de la mama.
Un cáncer "avanzado" es uno que se ha diseminado fuera del sitio u órgano de origen, ya sea mediante invasión local o metástasis. Por consiguiente, el término cáncer "avanzado" incluye tanto la enfermedad localmente avanzada como la metastásica.
Un cáncer "recurrente" es uno que tiene recrecimiento, ya sea en el sitio inicial o en un sitio distante, tras una respuesta a la terapia inicial, tal como cirugía.
Un cáncer "localmente recurrente" es un cáncer que vuelve después del tratamiento al mismo lugar que el cáncer tratado anteriormente.
Un cáncer "operable" o "resecable" es un cáncer que está confinado al órgano primario y es adecuado para cirugía (resección).
Un cáncer "no resecable" o "irresecable" no se puede eliminar (resecar) mediante cirugía.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena ligera y/o pesada procede de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden subdividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2 , IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, s, y y M, respectivamente.
La expresión "agente citotóxico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o enzimas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados más adelante.
"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (CCDA); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. La cantidad eficaz del fármaco para tratar el cáncer puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad eficaz puede extender la supervivencia exenta de progresión (por ejemplo, según se mide con los criterios de Evaluación de la respuesta para tumores sólidos, RECIST o cambios en c A-125), y da como resultado una respuesta objetiva (que incluye una respuesta parcial, RP, o una respuesta completa, RC), un aumento del tiempo de supervivencia global, y/o una mejora en uno o más síntomas del cáncer (por ejemplo, según se evalúa mediante FOSI).
El término "epítopo" se refiere al sitio concreto sobre una molécula de antígeno al que se une un anticuerpo.
El "epítopo 4D5" o "epítopo 4D5" o "4D5" es la región del dominio extracelular de HER2 a la que se unen el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y trastuzumab. Este epítopo está cerca del dominio transmembrana de HER2, y dentro del dominio IV de HER2. Para detectar anticuerpos que se unen con el epítopo 4D5, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, se puede llevar a cabo el cartografiado del epítopo para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 4D5 de HER2 (por ejemplo, uno cualquiera o más restos en la región desde aproximadamente el resto 550 hasta aproximadamente el resto 610, inclusive, de HER2 (SEQ ID NO: 39).
El "epítopo 2C4" o "epítopo 2C4" es la región del dominio extracelular de HER2 a la que se une el anticuerpo 2C4. Para cribar anticuerpos que se unen al epítopo 2C4, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, se puede llevar a cabo el cartografiado del epítopo para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 2C4 de HER2. El epítopo 2C4 comprende restos del dominio II en el dominio extracelular de HER2. El anticuerpo 2C4 y pertuzumab se unen al dominio extracelular de HER2 en la unión de los dominios I, II y III (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
En el presente documento, la expresión "región Fc" se usa para definir una región en el extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina del extremo C (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. Salvo que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración UE, también llamado índice UE, tal como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a restos de dominio variable distintos de restos de la región hipervariable (HVR). La región FR de un dominio variable consiste generalmente de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto", y "anticuerpo completo" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
La expresión "formas glucosiladas de HER2" se refiere a formas de HER2 de origen natural que se han modificados después de la traducción mediante la adición de restos de carbohidrato.
Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora", y "cultivo de células hospedadoras" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y la descendencia procedente de esta, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula precursora, sino que puede contener mutaciones. Se incluye en el presente documento la descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha cribado o selecciono en la célula transformada originalmente.
Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o que procede de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de unión a antígeno no humanos.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos que se encuentran con más frecuencia en una selección de secuencias marco de la VL o la VH de una inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de la VL o la VH de una inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publicación 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una realización, para la VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I según Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realización, para la VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat et al., mencionado anteriormente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácido procedentes de HVR no humanas y restos de aminoácidos procedentes de FR humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que la totalidad o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y la totalidad o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo procedente de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
La expresión "región hipervariable" o "HVR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos naturales de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (LI, L2, L3). Las HVR comprenden generalmente restos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o forman las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo estas últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o que están implicadas en el reconocimiento de antígenos. Los bucles hipervariables ilustrativos se producen en los restos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91­ 96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ilustrativas (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los restos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden generalmente los restos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "restos determinantes de la especificidad", o "Sd R", que son restos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de las regiones de las CDR denominadas CDR-abreviadas o CDR-a. Las CDR-a ilustrativas (CDR-a-L1, CDR-a-L2, CDR-a-L3, CDR-a-H1, CDR-a-H2 y CDR-a-H3) se producen en los restos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95­ 102 de H3. (Véase Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Salvo que se indique lo contrario, los restos de HVR y otros restos del dominio variable (por ejemplo, restos de f R) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., mencionado anteriormente.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un agente citotóxico.
Un "paciente" o "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales domesticados (por ejemplo, vacas, oveja, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el paciente, individuo o sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el paciente puede ser un "paciente con cáncer", es decir, uno que padece o está en riesgo de padecer uno o más síntomas de cáncer, en particular cáncer gástrico o cáncer de mama.
Una "población de pacientes" se refiere a un grupo de pacientes con cáncer. Dichas poblaciones se pueden usar para demostrar la eficacia estadísticamente significativa y/o la seguridad de un fármaco.
Un paciente "recidivante" es uno que tiene signos o síntomas de cáncer tras la remisión. Opcionalmente, el paciente ha "recidivado" tras terapia adyuvante o neoadyuvante.
Un cáncer o muestra biológica que "muestra la expresión, ampliación o activación de HER" es una que, en un ensayo diagnóstico, expresa (incluso sobreexpresa) un receptor HER, tiene el gen HER amplificado y/o demuestra de otra manera la activación o la fosforilación de un receptor HER.
En el presente documento, "terapia neoadyuvante" o "terapia preoperatoria" se refieren a una terapia administrada antes de la cirugía. El objetivo de la terapia neoadyuvante es proporcionar tratamiento sistémico inmediato, erradicando potencialmente las micrometástasis que de otra forma proliferarían si se siguiera la secuencia convencional de cirugía seguida por la terapia sistémica. La terapia neoadyuvante puede también ayudar a reducir el tamaño del tumor permitiendo de este modo una resección completa de tumores inicialmente irresecables o preservando porciones del órgano y sus funciones. Adicionalmente, la terapia neoadyuvante permite una evaluación in vivo de la eficacia del fármaco, que puede guiar la elección de tratamientos posteriores.
En el presente documento, "terapia adyuvante" se refiere a la terapia administrada tras la cirugía definitiva, donde no se pueden detectar evidencias residuales de enfermedad, de tal manera que reduce el riesgo de recidiva de la enfermedad. El objetivo de la terapia adyuvante es evitar la recidiva del cáncer y, por tanto, reducir la posibilidad de muerte relacionada con el cáncer. La terapia adyuvante en el presente documento excluye específicamente la terapia neoadyuvante.
"Cirugía definitiva" se usa según se usa este término en la comunidad médica. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, procedimientos, quirúrgicos o de otro tipo, que dan como resultado la eliminación o la resección del tumor, incluyendo los que dan como resultado la eliminación o la resección de todo tumor visible a simple vista. La cirugía definitiva incluye, por ejemplo, la resección completa o curativa o la resección macroscópica completa del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos que se realizan en una o más etapas, e incluye, por ejemplo, procedimientos quirúrgicos multietapa donde se llevan a cabo uno o más procedimientos quirúrgicos o de otro tipo antes de la resección del tumor. La cirugía definitiva incluye procedimientos para eliminar o resecar el tumor incluyendo los órganos implicados, partes de órganos y tejidos, así como los órganos circundantes, tales como los ganglios linfáticos, partes de órganos o tejidos. La eliminación puede ser incompleta de tal manera que las células tumorales pueden permanecer incluso aunque no se detecten.
"Supervivencia" se refiere al paciente que permanece vivo, e incluye la supervivencia exenta de enfermedad (DFS), la supervivencia exenta de progresión (PFS) y la supervivencia global (OS). La supervivencia se puede estimar por el método de Kaplan-Meier, y cualesquiera diferencias en la supervivencia se calculan usando la prueba de rango logarítmico estratificado.
"Supervivencia exenta de progresión" (PFS) es el tiempo a partir del primer día de tratamiento hasta la progresión de una enfermedad documentada (Incluyendo la progresión aislada en el SNC) o de muerte a partir de cualquier causa en el estudio, lo que se produzca en primer lugar.
"Supervivencia exenta de enfermedad (DFS)" se refiere al paciente que sigue vivo, sin reaparición del cáncer, durante un periodo definido de tiempo tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde el diagnóstico inicial. En un aspecto de la invención, la DFS se analiza de acuerdo con el principio de intención de tratar, es decir, los pacientes se evaluaron sobre la base de su terapia asignada. Los eventos utilizados en el análisis de la DFS pueden incluir la recidiva local, regional y distante del cáncer, la aparición de cáncer secundario, y el fallecimiento por cualquier causa en pacientes sin un evento anterior (por ejemplo, recidiva de cáncer de mama o segundo cáncer primario).
"Supervivencia global" se refiere al paciente que sigue vivo durante un periodo definido de tiempo, tal como aproximadamente 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 10 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde el diagnóstico inicial. En los estudios subyacentes a la invención, el evento utilizado para el análisis de supervivencia fue la muerte producida por cualquier causa.
Por "supervivencia ampliada" se entiende el aumento en la DFS y/u OS en un paciente tratado con respecto a un paciente sin tratar, o con respecto a un protocolo de tratamiento del control. La supervivencia se controla durante al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente 1 año, o al menos aproximadamente 2 años, o al menos aproximadamente 3 años, o al menos aproximadamente 4 años, o al menos aproximadamente 5 años, o al menos aproximadamente 10 años, etc., tras el inicio del tratamiento o tras el diagnóstico inicial.
Por "monoterapia" se entiende un régimen terapéutico que incluye solo un único agente terapéutico para el tratamiento del cáncer o el tumor durante el curso del periodo de tratamiento.
Por "terapia de mantenimiento" se entiende un régimen terapéutico que se proporciona para reducir la probabilidad de recidiva o progresión de la enfermedad. Se puede proporcionar terapia de mantenimiento durante cualquier lapso de tiempo, incluyendo periodos de tiempo prolongados durante la vida del sujeto. Se puede proporcionar terapia de mantenimiento tras la terapia inicial o junto con terapias iniciales o adicionales. Las dosificaciones utilizadas para la terapia de mantenimiento pueden variar y pueden incluir dosificaciones disminuidas en comparación con las dosificaciones utilizadas para otros tipos de terapias.
Como se define en el presente documento, los términos "trastuzumab", "HERCEPTIN®" y "huMAb4D5-8" se usan indistintamente. Dicho anticuerpo comprende preferentemente las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y cadena pesada que se muestran en el SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 29, respectivamente.
Para los fines del presente documento, "pertuzumab", "PERJETA®" y "rhuMAb 2C4", se usan indistintamente. Dicho anticuerpo comprende un anticuerpo de una especie principal que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y cadena pesada según los SEQ ID NOS: 32 y 31, respectivamente (Figura 13A y B). En algunas realizaciones, pertuzumab comprende un anticuerpo de especie variante con una extensión líder en el extremo amino, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del SEQ ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del SEQ ID NO: 33. El anticuerpo se produce opcionalmente por células de ovario de hámster chino (CHO) recombinantes.
Como se define en el presente documento, las expresiones "T-DM1", "trastuzumab-MCC-DMl", "ado-trastuzumab emtansina", "trastuzumab emtansina", y "KADCYLA®" se usan indistintamente, y se refieren a trastuzumab unido a través del resto enlazador MCC al resto DM1 del fármaco maitansinoide, incluyendo todas las mezclas de conjugados de anticuerpo-fármaco cargadas y unidas de forma diversa donde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 restos de fármaco están covalentemente unidos al anticuerpo trastuzumab (documentos US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza mayor del 95 % o 99 % tal como se determina mediante, por ejemplo, medios electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGe , isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC en fase invertida). Para una revisión de los métodos de evaluar la pureza de anticuerpos, véanse, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico incluido en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente a su ubicación cromosómica natural.
“Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-HER2" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera (o fragmentos de las mismas) de un anticuerpo, incluyendo dichas una o más moléculas de ácido nucleico en un solo vector o vectores individuales y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones de una célula hospedadora.
El término "HER2", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier HER2 maduro natural que el resultado de procesar una proteína precursora de HER2 en una célula. El término incluye HER2 procedente de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos y macacos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), salvo que se indique lo contrario. La expresión también abarca variantes de HER2 de origen natural, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de HER2 humana ilustrativa, con secuencia de señalización (con secuencia de señalización, aminoácidos 1-22) se muestra en el SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de un HER2 humano maduro ilustrativo es la de los aminoácidos 23-1255 del SEQ ID NO: 1.
La expresión "célula positiva para HER2" se refiere a una célula que expresa HER2 en su superficie.
En el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, salvo por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes generalmente en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un solo determinante de un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante diversas técnicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de expresión en fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los loci de la inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos métodos y otros ejemplos de métodos para producir anticuerpos monoclonales.
Un "anticuerpo puro" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo puro puede estar presente en una formulación farmacéutica.
Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con diversas estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Del extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Análogamente, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio variable ligero o dominio variable de la cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Un "vial" es un envase adecuado para mantener una preparación líquida o liofilizada. En una realización, el vial es un vial de uso individual, por ejemplo un vial de uso individual de 20 cc con tapón.
El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, la terapia combinada, las contraindicaciones y/o las advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" respecto de la secuencia de un polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia del polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades del experto en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros necesarios para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr un alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. Para los fines del presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de la secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue programado por Genentech, Inc. y el código fuente, junto con las documentación para usuarios, se han depositado en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, donde está registrada con el n.° de Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir de su código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
Cuando se utiliza ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto de, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede, como alternativa, citarse como una secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un % determinado de identidad de secuencia respecto de, con o frente a una secuencia de aminoácidos B) se calcula del modo siguiente:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de A respecto de B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto de A. Salvo que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un transportador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque no de forma limitativa, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "tratando") se refiere a la intervención clínica con el objetivo de alterar la evolución natural del individuo que está siendo tratado, y puede efectuarse tanto para profilaxis como durante la evolución de la patología. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, prevenir la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la patología y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para frenar la progresión de una enfermedad.
Por "coadministrar" se entiende administrar por vía intravenosa dos (o más) fármacos durante la misma administración, en lugar de infusiones secuenciales de los dos o más fármacos. En general, esto implicará combinar los dos (o más) fármacos en la misma bolsa IV antes de la coadministración de los mismos.
Un fármaco que se administra de forma "simultánea" con uno o más fármacos diferentes se administra durante el mismo ciclo de tratamiento, el mismo día de tratamiento que el uno o más fármacos diferentes, opcionalmente, al mismo tiempo que el uno o más fármacos diferentes. Por ejemplo, para terapias contra el cáncer que se administran cada 3 semanas, los fármacos administrados simultáneamente se administran cada uno en el día 1 de un ciclo de 3 semanas.
Una "quimioterapia" es el uso de un agente quimioterapéutico útil en el tratamiento del cáncer.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetales que son venenos del huso, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizantes e inhibidores de cinasas. Algunos ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen: antraciclinas, tales como epirrubicina o doxorrubicina (ADRIAMYClN®), ciclofosfamida (CYTOXAN®, NEOSAr ®), antraciclina y ciclofosfamida combinadas ("AC"); un taxano, por ejemplo, docetaxel (TAXOTERE®), o paclitaxel (TAXOL®), 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, n.° CAS 51-21-8), lapatinib (TYKERB®), capecitabina (Xe l OdA®), gemcitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (n.° CAS 391210-10-9, Pfizer), cisplatino (cisdiamina, dicloroplatino(II), n.° CAS 15663-27-1), carboplatino (n.° Ca S 41575-94-4), temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4.3.0] nona-2,7,9-trieno-9-carboxamida, n.° CAS 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoxi]-W,W-dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®).
Más ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen: oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), Sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Inhibidor de MEK, Exelixis, documento WO 2007/044515, A r RY-886 (inhibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inhibidor de la PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inhibidor de la PI3K, Novartis), XL-147 (inhibidor de la PI3K r, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®), Wyeth), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®), BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (iRESSA®), AstraZeneca), irinotecán (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (sin Cremophor), formulaciones de nanopartículas de paclitaxel modificadas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORiSe L®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEo Sa R®); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gamma1I, caliqueamicina omegaI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina relacionados con cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos y derivados de cualquiera de los anteriores.
En el presente documento, una dosis "fija" o "uniforme" de un agente terapéutico se refiere a una dosis que se administra a un paciente humano sin tener en cuenta el peso (WT) o el área de la superficie corporal (ASC) del paciente. La dosis fija o uniforme no se proporciona por tanto como una dosis en mg/kg o una dosis en mg/m2, sino más bien como una cantidad absoluta del agente terapéutico.
En el presente documento, una dosis de "carga" comprende generalmente una dosis inicial de un agente terapéutico administrada a un paciente y va seguida por una o más dosis de mantenimiento de la misma. En general, se administra una única dosis de carga, pero en el presente documento se contemplan múltiples dosis de carga. Normalmente, la cantidad de dosis de carga administrada(s) excede la cantidad de la(s) dosis de mantenimiento administrada(s) y/o la(s) dosis de carga se administra(n) con mayor frecuencia que la(s) dosis de mantenimiento, para conseguir la concentración en estado estacionario deseada del agente terapéutico antes de la que se puede conseguir con la(s) dosis de mantenimiento.
En el presente documento, una dosis de "mantenimiento" se refiere a una o más dosis de un agente terapéutico administrada(s) al paciente durante un periodo de tratamiento. Normalmente, las dosis de mantenimiento se administran a intervalos de tratamiento separados, tales como aproximadamente cada semana, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas o aproximadamente cada 4 semanas, preferentemente cada 3 semanas.
"Infusión" o "infundir" se refiere a la introducción de una solución que contiene un fármaco en el cuerpo a través de una vena para fines terapéuticos. En general, esto se consigue mediante una bolsa intravenosa (IV).
Una "bolsa intravenosa" o "bolsa IV" es una bolsa que puede mantener una solución que se puede administrar a través de la vena de un paciente. En una realización, la solución es una solución salina (por ejemplo, NaCl aproximadamente al 0,9 % o aproximadamente al 0,45 %). Opcionalmente, la bolsa IV se forma a partir de poliolefina o cloruro de polivinal.
La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés) y tres regiones hipervariables (HVR, por sus siglas en inglés). (Véanse, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para transmitir especificidad de unión a antígeno. Adicionalmente, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular se pueden aislar utilizando un dominio VH o VL procedente de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector en forma de una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión".
"Alquilo" es un hidrocarburo C1-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Son ejemplos metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3^), 1 -pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(Ch 3)2), 2-metil-1-butilo (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
La expresión "alquilo C1-C8," como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C8" representativos incluyen, aunque sin limitación, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen, aunque sin limitación, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, los alquilos C1-C8 insaturados incluyen, aunque sin limitación, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-1 butinilo. Un grupo "alquilo C1-C8" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(o ) n (R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
La expresión "alquilo C1-C12," como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Un grupo "alquilo C1-C12" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo Ci -C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
La expresión "alquilo C1-C6," como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C6" representativos incluyen, aunque sin limitación, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, y -n-hexilo; mientras que los alquilos Ci -C6 ramificados incluyen, aunque sin limitación, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo y 2-metilbutilo; alquilos C1-C6 insaturados incluyen, aunque sin limitación, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo e -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo y 3-hexilo. Un grupo "alquilo C1-C6" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos, como se ha descrito anteriormente para un grupo alquilo C1-C8.
La expresión "alquilo C1-C4," como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C4" representativos incluyen, aunque sin limitación, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo; mientras que los alquilos C1-C4 ramificados incluyen, aunque sin limitación, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo; alquilos C1-C4 insaturados incluyen, aunque sin limitación, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo e -isobutilenilo. Un grupo "alquilo C1-C4" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos, como se ha descrito anteriormente para un grupo alquilo C1-C8.
"Alcoxi" es un grupo alquilo unido de forma sencilla a un oxígeno. Los grupos alcoxi a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, metoxi (-OCH3) y etoxi (-OCH2CH3). Un "alcoxi C1-C5" es un grupo alcoxi con 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos alcoxi pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más grupos, como se ha descrito anteriormente para grupos alquilo.
"Alquenilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir un carbono-carbono, doble enlace sp2. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7) y 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2). Un "alquenilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir un carbono-carbono, doble enlace sp2.
"Alquinilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir un carbono-carbono, triple enlace sp. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: acetilénico (-C=CH) y propargilo (-CH2CECH). Un "alquinilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir un carbono-carbono, triple enlace sp.
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo saturado,de cadena lineal o ramificada o cíclico de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alcano precursor. Los radicales alquileno típicos incluyen, pero sin limitación: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) y similares.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno precursor. Los radicales alquenileno típicos incluyen, pero sin limitación: 1,2-etileno (-CH=CH-).
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado,de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino precursor. Los radicales alquinileno típicos incluyen, pero sin limitación: acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2CEC-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CEC-).
"Arilo" se refiere a un grupo aromático carbocíclico. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, aunque sin limitación, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo carbocíclico aromático o un grupo heterocíclico aromático puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos entre los que se incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "arilo C5-C20" es un grupo arilo con 5 a 20 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo C5-C20 incluyen, aunque sin limitación, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C20 puede estar sustituido o sin sustituir como se ha descrito anteriormente para los grupos arilo. Un "arilo C5-C14" es un grupo arilo con 5 a 14 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo C5-C14 incluyen, aunque sin limitación, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C14 puede estar sustituido o sin sustituir como se ha descrito anteriormente para los grupos arilo.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras:
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en las cuales el grupo fenilo puede estar sustituido o no sustituido o sustituido con hasta cuatro grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)Nh R', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en donde uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está sustituido por un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, aunque sin limitación, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del resto arilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo tiene de 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en donde uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está sustituido por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, aunque sin limitación, 2-benzoimidazolilmetilo, 2-fu riletilo, y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene 1 a 6 átomos de carbono, y el resto heteroarilo tiene de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros del anillo (4 a 9 átomos de carbono) y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo, respectivamente, en donde uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen, cada uno independientemente, con un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, aunque sin limitación, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=s )s r , -C(=o )Nr 2, -C(=S)n R2, -C(=NR)NR2, en donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-C18, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14, un grupo protector o resto profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno tal como se han descrito anteriormente también se pueden sustituir de forma similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refieren a un sistema de anillo en el que uno o más átomos del anillo es un heteroátomo, por ejemplo nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende 3 a 20 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S) o un biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
Se describen heterociclos a modo de ejemplo, por ejemplo, en Paquette, Leo A., "Principles of Modern Heterociclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), en particular los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la actualidad), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Los ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y no de limitación, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzoimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bistetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzoisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo y isatinoílo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una aziridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina. De forma aún más típica, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol o p-carbolina. De forma aún más típica, los heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1 -piperidinilo.
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el que uno a cuatro de los átomos de carbono del anillo están sustituidos de forma independiente con un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, aunque sin limitación, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede estar sustituido o no sustituido con hasta siete grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -0 -(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está sustituido con un enlace. Un heterociclo -C3-C8 puede estar sustituido o no sustituido con hasta seis grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "heterociclo C3-C20" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el que uno a cuatro de los átomos de carbono del anillo están sustituidos de forma independiente con un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Un heterociclo C3-C20 puede estar sustituido o no sustituido con hasta siete grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C20" se refiere a un grupo heterociclo C3-C20 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está sustituido con un enlace.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos en el anillo, aún más normalmente 5 o 6 átomos en el anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos del anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1- enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros, saturado o insaturado, no aromático. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, aunque sin limitación, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-cidohexadienilo, -1,4-cidohexadienilo, -cicloheptilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5-cidoheptatrienilo, -ciclooctilo y -ddoodadienilo. Un grupo "carbociclo C3-C8" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos que incluyen, pero sin limitación, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está sustituido con un enlace.
"Enlazador" se refiere a un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que unen covalentemente un anticuerpo a un resto de fármaco. En diversas realizaciones, los enlazadores incluyen una radical divalente tal como un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, restos tales como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetición de alquiloxi (por ejemplo, polietilenoxi, PEG, polimetilenooxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenoamino, Jeffamina™); y éster diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida. En diversas realizaciones, los enlazadores pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos, tales como valina, fenilalanina, lisina y homolisina.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre sus compañeros de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero difieren con respecto a la disposición de los átomos o de los grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares superponibles entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en el presente documento siguen de forma general el S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en un plano. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el sentido de rotación del plano de luz polarizada por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo por que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico puede denominarse también enantiómero, y una mezcla de dichos isómeros se denomina con frecuencia mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede producirse cuando no ha habido estereoselección ni estereoespecificidad en un proceso o reacción química. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede estar sustituido por otro grupo funcional. Determinados grupos salientes son bien conocidos en la técnica y los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluensulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato.
La expresión "grupo protector" se refiere a un sustituyente que se emplea habitualmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras que reaccionan otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo protector de amino" es un sustituyente fijado a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen, aunque sin limitación, acetilo, trifluoroacetilo, tbutoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para una descripción general de grupos protectores y su uso, véase T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991, o una edición posterior.
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS
En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que se unen a HER2 e inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos. Los anticuerpos e inmunoconjugados de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o el tratamiento de cánceres positivos para HER2.
A. Anticuerpos anti-HER2 ilustrativos
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos aislados que se unen al dominio I de HER2. En algunas realizaciones, los anticuerpos no interfieren con la unión de trastuzumab y/o pertuzumab a HER2. En algunas realizaciones, los anticuerpos no interfieren con la unión de trastuzumab a HER2 y no interfieren con la unión de pertuzumab a HER2. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
Una secuencia de proteína precursora de HER2 humana de origen natural ilustrativa, con secuencia de señalización (aminoácidos 1-22) se proporciona en el SEQ ID NO:1, y la correspondiente secuencia de proteína HER2 madura corresponde a los aminoácidos 23-1255 del SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el dominio I de HER2 tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 35, el dominio II tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, el dominio III tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, y el dominio IV tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (véase la Figura 16).
Anticuerpo hu7C2 y otras realizaciones
En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-HER2 que comprende (i) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del Se Q ID NO: 16; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del Se Q ID NO: 13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14, en donde el anticuerpo se une a HER2 con una constante de disociación (KD) de < 5 nM como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; y/o (ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-HER2 está humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-HER2 comprende las HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además un marco aceptor humano, por ejemplo un marco de la inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. En ciertas realizaciones, el marco aceptor humano es el marco de consenso VL kappa IV humano (VLkiv) y/o el marco de VH VHi. En ciertas realizaciones, el marco aceptor humano es el marco de consenso VL kappa IV humano (VLkiv) y/o el marco de VH VHi que comprende una cualquiera de las mutaciones descritas en el presente documento.
Un anticuerpo anti-HER2 puede comprender una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11. Una secuencia VH que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 puede contener sustituciones (por ejemplo sustituciones conservativas, inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-HER2 que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a HER2. Un total de 1 a 10 aminoácidos pueden haberse sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 11. Un total de 1 a 5 aminoácidos pueden haberse sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, sustituciones, inserciones o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-HER2 comprende la secuencia VH de SEQ ID NO: 11, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia. La VH comprende las HVR: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2 que comprende la del SEQ ID NO: 16 y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17.
Un anticuerpo anti-HER2 puede comprender un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10. Una secuencia VL que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10 puede contener sustituciones (por ejemplo sustituciones conservativas, inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-HER2 que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a HER2. Un total de 1 a 10 aminoácidos pueden haberse sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 10. Un total de 1 a 5 aminoácidos pueden haberse sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-HER2 comprende la secuencia VL de SEQ ID NO: 10, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dicha secuencia. La VL comprende las HVR (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-HER2 , en donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente.
En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL del SEQ ID NO: 11 y el SEQ ID NO: 10, respectivamente, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias.
Se describen en el presente documento anticuerpos que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo anti-HER2 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, se describe un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-HER2 que comprende una secuencia VH del SEQ ID NO: 11 y una secuencia VH del SEQ ID NO: 10, respectivamente.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-HER2 comprende una secuencia de cadena pesada que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, una secuencia de cadena pesada tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:19 contiene sustituciones (por ejemplo sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-HER2 que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a HER2. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, sustituciones, inserciones o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-HER2 comprende la secuencia de cadena pesada del SEQ ID NO: 19, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, una secuencia de cadena ligera que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:18 contiene sustituciones (por ejemplo sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-HER2 que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a HER2. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 5 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado del SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen fuera de las HVR (es decir, en los FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-HER2 comprende la secuencia de cadena ligera del SEQ ID NO: 18, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de esta secuencia.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-HER2, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una cadena ligera como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente.
En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada y cadena ligera del SEQ ID NO: 19 y el SEQ ID NO: 18, respectivamente, incluyendo modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias.
En un aspecto adicional, se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo anti-HER2 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-HER2 que comprende una secuencia de cadena pesada del SEQ ID NO: 19 y una secuencia de cadena ligera del SEQ ID NO: 18, respectivamente.
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que comprenden un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC de acuerdo con la numeración de Kabat como se representa en la Figura 1 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-h C y HVR3-HC según la numeración de Kabat como se representa en la Figura 2. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y/o HVR3-LC, y las secuencias FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y/o FR4-LC como se representa en la Figura 1. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-HC y/o HVR3-HC, y las secuencias FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y/o FR4-HC como se representa en la Figura 2.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-HER2 de acuerdo con cualquiera de las anteriores realizaciones es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo humano. En una realización, un anticuerpo anti-HER2 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o un fragmento F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es sustancialmente un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de IgG2a u otra clase de anticuerpo o isotipo tal como se ha definido en el presente documento.
En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-HER2 de acuerdo con cualquiera de las anteriores realizaciones puede incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, como se describe a continuación.
1. Afinidad del anticuerpo
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 50 nM, < 10 nM, < 5 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM, y opcionalmente > 1o-13 M (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
Kd se puede medir mediante un ensayo de unión con antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión a la solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con 125I en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y a continuación se captura el antígeno unido con una placa revestida de anticuerpo contra Fab (véase, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren durante una noche placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) con 5 jg/m l de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Número de cat. 269620), se mezclan antígeno [125I] 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después, la solución se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionaron valores inferiores o iguales al 20 % de la unión máxima se seleccionaron para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con una realización, la Kd se midió utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE ®-3000 (Bl Acore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~ 10 unidades de respuesta (UR). En resumen, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activaron con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluyó con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 jg/m l (~0,2 jM ) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyectó etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones de cinética, se inyectaron diluciones seriadas de factor dos de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Las velocidades de asociación (kasociación) y las velocidades de disociación (kdisociación) se calcularon usando un modelo de unión de Langmuir simple uno a uno (programa informático de evaluación BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdisociación/kasociación. Véanse, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de asociación supera 106 M-1 s-1 en el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, puede determinarse la velocidad de asociación usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la reducción en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno determinadas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con retención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y fragmentos scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de algunos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véanse, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs. 269­ 315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de los Estados Unidos números 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden restos de epítopo de unión a receptor de rescate y que tienen semivida in vivo aumentada, véase la patente de los Estados Unidos n.° 5.869.046.
Los "diacuerpos" son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véanse, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.248.516 B1).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción mediante células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "de clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo precursor. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, reteniendo al mismo tiempo la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y los FR (o porciones de los mismos) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos restos de FR de un anticuerpo humanizado se sustituyen por restos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que proceden los restos de la HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE.UU. N.° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen un injerto de SDR (CDR-a)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe la "modificación de la superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43­ 60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen la estrategia de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones marco humanas que pueden usarse para humanización incluyen, pero sin limitación: regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco procedentes de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadenas ligeras o pesadas (véase, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones marco de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco procedentes del cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Anticuerpos humanos
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando varias técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos, de manera general, en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a un estímulo antigénico. Dichos animales normalmente contienen la totalidad o una parte de los loci de inmunoglobulina humanos, que sustituyen los loci endógenos de la inmunoglobulina, o que están presentes extracromosómicamente o integrados de forma aleatoria en los cromosomas de los animales. En dichos ratones transgénicos, por lo general se han inactivado los loci endógenos de la inmunoglobulina. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos procedentes de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.
23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de Estados Unidos n.° 5.770.429, que describe la tecnología Hu MAB®; la patente de Estados Unidos n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de patente de Estados Unidos n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUs E®). Las regiones variables humanas procedentes de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También pueden prepararse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados mediante tecnología del hibridoma de linfocitos B también se describen Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos monoclonales de IgM humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas de humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
También pueden generarse anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas entre bibliotecas de presentación en fago de origen humano. Posteriormente, pueden combinarse dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación.
5. Anticuerpos procedentes de bibliotecas
Los anticuerpos de la invención se pueden aislar mediante cribado de bibliotecas combinatorias para detectar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica varios métodos para generar bibliotecas de expresión en fago y para cribar dichas bibliotecas para seleccionar anticuerpos que tengan las características de enlace deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En determinados métodos de expresión en fago, los repertorios de genes VH y VL se clonan de forma independiente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan de forma aleatoria en fagotecas, que a continuación se pueden cribar para seleccionar fagos que se unen al antígeno tal como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos expresan de forma típica fragmentos de anticuerpo, ya sea en forma de fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o en forma de fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Como alternativa, el repertorio sin tratar se puede clonar (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, también pueden producirse sintéticamente bibliotecas sin exposición previa clonando segmentos de gen V no reorganizados de células madre y usando cebadores para la PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reorganización in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen fagotecas de anticuerpo humano incluyen, por ejemplo: la patente de Estados Unidos N.° 5.750.373, y las publicaciones de patente de Estados Unidos números 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran en el presente documento como anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de unión es por HER2 y la otra es por cualquier otro antígeno. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de unión es por HER2 y la otra es por CD3. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.821.337. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de HER2. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan HER2. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, la expresión simultánea recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina con diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la tecnología de "botón en el ojal" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.731.168). La expresión "botón en ojal" o tecnología "KnH" como se utiliza en el presente documento se refiere a la tecnología que se dirige al emparejamiento de dos polipéptidos entre sí in vitro o in vivo introduciendo una protuberancia (botón) en un polipéptido y una cavidad (ojal) en el otro polipéptido en una interfase en la que interactúan. Por ejemplo, Los KnH se han introducido en las interfases de unión Fc:Fc, las interfases CL:CH1 o las interfases VH/VL de anticuerpos (véanse, por ejemplo, los documentos US 2011/0287009; US2007/0178552, WO 96/027011; WO 98/050431, Zhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788, y el documento WO2012/106587). En algunas realizaciones, Los KnH dirigen el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí durante la producción de anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fc pueden comprender además dominios variables únicos unidos a cada región Fc, o comprender además diferentes dominios variables de cadena pesada que se emparejan con dominios variables de cadena ligera similares o diferentes. La tecnología KnH también se puede usar para emparejar dos dominios extracelulares del receptor diferentes entre sí o cualquier otra secuencia polipeptídica que comprenda secuencias de reconocimiento de diana diferentes (por ejemplo, incluyendo aficuerpos, pepticuerpos y otras fusiones Fc).
La expresión "mutación de botón", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mutación que introduce una protuberancia (botón) en un polipéptido en una interfase en la que el polipéptido interactúa con otro polipéptido. En algunas realizaciones, el otro polipéptido tiene una mutación de ojal.
La expresión "mutación de ojal", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mutación que introduce una cavidad (ojal) en un polipéptido en una interfase en la que el polipéptido interactúa con otro polipéptido. En algunas realizaciones, el otro polipéptido tiene una mutación de botón.
Se proporciona a continuación una descripción breve no limitante.
Una "protuberancia" se refiere a al menos una cadena lateral de un aminoácido que se proyecta desde la interfase de un primer polipéptido y que por tanto se puede introducir en una cavidad de compensación en la interfase adyacente (es decir, la interfase de un segundo polipéptido de manera que se estabiliza el heteromultímero y, de este modo, se favorece la formación del heteromultímero sobre la formación del homomultímero, por ejemplo. La protuberancia puede existir en la interfase original o puede introducirse sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la interfase del primer polipéptido está alterado para codificar la protuberancia. Para conseguir esto, el ácido nucleico que codifica al menos un resto de aminoácido "original" en la interfase del primer polipéptido se sustituye por un ácido nucleico que codifica al menos un resto de aminoácido importado que tiene un volumen de la cadena lateral más grande que el resto de aminoácido original. Se apreciará que puede haber más de un resto original y un resto importado correspondiente. Se muestran los volúmenes de las cadenas laterales de los diversos restos amino, por ejemplo, en la Tabla 1 del documento US2011/0287009. Una mutación para introducir "protuberancia" puede denominarse una "mutación de botón".
En algunas realizaciones, los restos importados para la formación de una protuberancia son restos de aminoácidos de origen natural seleccionados entre arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). En algunas realizaciones, un resto importado es triptófano o tirosina. En alguna realización, el resto original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.
Una "cavidad" se refiere a al menos una cadena lateral de un aminoácido que se proyecta desde la interfase de un segundo polipéptido y por tanto acomoda una protuberancia correspondiente sobre la interfase adyacente de un primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfase original o puede introducirse sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la interfase del primer polipéptido está alterado para codificar la cavidad. Para conseguir esto, el ácido nucleico que codifica al menos un resto de aminoácido "original" en la interfase del segundo polipéptido se sustituye por ADN que codifica al menos un resto de aminoácido importado que tiene un volumen de la cadena lateral más pequeño que el resto de aminoácido original. Se apreciará que puede haber más de un resto original y un resto importado correspondiente. En algunas realizaciones, los restos importados para la formación de una cavidad son restos de aminoácidos de origen natural seleccionados entre alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). En algunas realizaciones, un resto importado es serina, alanina o treonina. En algunas realizaciones, el resto original para la formación de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano. Una mutación para introducir una "cavidad" puede denominarse una "mutación de ojal".
La protuberancia se "puede introducir" en la cavidad, lo que significa que la localización espacial de la protuberancia y la cavidad sobre la interfase de un primer polipéptido y un segundo polipéptido respectivamente y los tamaños de la protuberancia y la cavidad son tales que la protuberancia puede introducirse en la cavidad sin perturbar significativamente la asociación normal del primer y el segundo polipéptidos en la interfase. Debido a que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp no se extienden normalmente de forma perpendicular desde el eje de la interfase y tienen conformaciones preferidas, el alineamiento de una protuberancia con una cavidad correspondiente puede, en algunos casos, basarse en modelizar el par de protuberancia/cavidad basándose en una estructura tridimensional tal como la obtenida mediante cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto se puede conseguir utilizando técnicas ampliamente aceptadas en la materia.
En algunas realizaciones, una mutación de botón en una región constante de IgG1 es T366W (numeración UE). En algunas realizaciones, una mutación de ojal en una región constante de IgG1 comprende una o más mutaciones seleccionadas entre T366S, L368A e Y407V (numeración UE). En algunas realizaciones, una mutación de ojal en una región constante de IgG1 comprende T366S, L368A e Y407V (numeración UE).
En algunas realizaciones, una mutación de botón en una región constante de IgG4 es T366W (numeración UE). En algunas realizaciones, una mutación de ojal en una región constante de IgG4 comprende una o más mutaciones seleccionadas entre T366S, L368A e Y407V (numeración UE). En algunas realizaciones, una mutación de ojal en una región constante de IgG4 comprende T366S, L368A e Y407V (numeración UE).
También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de anticuerpo Fc (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); mediante el uso de tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenario (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos, como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos diseñados que incluyen tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, que incluyen los "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento del presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a HER2 así como a otro antígeno diferente (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).
7. Variantes de anticuerpos
En ciertas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede efectuarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a) Variantes de sustitución, inserción y eliminación
En ciertas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. En la Tabla 1 se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones de ejemplo", y como se describen más adelante en referencia a las clases de las cadenas laterales de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés, y los productos se pueden cribar para seleccionar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad reducida o ADCC o CDC mejoradas.
TABLA 1
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continuación
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Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). En general, las variantes resultantes seleccionadas para su estudio posterior tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, mayor afinidad, menor inmunogenicidad) respecto del anticuerpo precursor y/o tendrán determinadas propiedades biológicas conservadas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ilustrativa es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse de manera cómoda, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en expresión en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más restos de HVR y los anticuerpos variantes se expresan en fagos y se criban para seleccionar una actividad biológica en particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Pueden efectuarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden efectuarse en "puntos calientes" de la HVR, es decir, restos codificados por codones que experimentan mutaciones con frecuencia elevada durante el proceso de maduración somática (véase, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o en los SDR (CDR-a), evaluándose la afinidad de unión de la VH o VL variante resultante. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas realizaciones de la maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para su maduración mediante cualquiera de diversos métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Después, se crea una biblioteca secundaria. A continuación, la biblioteca se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica estrategias dirigidas a las HVR, en las que se aleatorizan varios restos de HVR (por ejemplo, 4-6 restos a la vez). Los restos de HVR implicados en la unión al antígeno se pueden identificar de manera específica, por ejemplo, utilizando mutagénesis con barrido de alanina o modelización. En particular, CDR-H3 y CDR-L3 suelen ser dianas habituales.
En ciertas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones en una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden efectuarse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas, tal como se proporcionan en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden realizarse fuera de los "puntos calientes" de las HVR o SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias variantes de VH y VL proporcionadas anteriormente, cada HVR bien está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para identificar los restos o regiones de un anticuerpo que pueden ser objeto de mutagénesis es el denominado "mutagénesis con barrido de alanina", como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa o adicional, se una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos pueden usarse como diana o eliminarse como candidatos para sustitución. Las variantes se pueden cribar para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo con un intervalo de longitudes de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones en los extremos incluyen un anticuerpo con un resto metionilo en el extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, ADEPT) o con un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
b) Variantes de glucosilación
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir la extensión en la que el anticuerpo está glucosilado. La adición o eliminación de sitios de glucosilación a un anticuerpo puede lograrse cómodamente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que se crea o elimina más de un sitio de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, puede alterarse el carbohidrato unido a esta. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido ramificado biantenario que está unido generalmente mediante un enlace N al Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas realizaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.
En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidratos que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de 1 % al 80 %, de 1 % al 65 %, de 5 % al 65 % o de 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) según se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al resto de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 de la región Fc (numeración UE de los restos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede situar a aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de menor importancia en la secuencia de los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener mejorada la función ADCC. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes de Estados Unidos números US 2003/0157108 (Presta, L.); el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen los documentos: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos defucosilados incluyen células CHO Lec13 con deficiencia en la fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la publicación de patente de Estados Unidos n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11) y líneas celulares con supresión génica, tal como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con supresión génica (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).
Las variantes de anticuerpo se proporcionan adicionalmente con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido bicatenario unido a la región Fc del anticuerpo está bisecado por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una fucosilación reducida y/o una función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de Estados Unidos N.° 6.602.684 (Umana et al.); y en el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un resto de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener mejorada la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel et al.); el documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y el documento WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Variantes de la región Fc
En ciertas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que tiene algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por tanto, carece probablemente de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan Fc (RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de Estados Unidos n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); el documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayos no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa o adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como se divulga en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden realizar ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véanse, por ejemplo, los ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos Wo 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn y de aclaramiento/semivida in vivo usando métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
En algunas realizaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la porción Fc del anticuerpo proporcionado en el presente documento para aumentar la unión de la IgG al receptor Fc neonatal. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende las tres siguientes mutaciones de acuerdo con la numeración UE: M252Y, S254T y T256E (la "mutación YTE") (patente de EE.UU n.° 8.697.650; véase también Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281 (33):23514-23524 (2006). En ciertas realizaciones, la mutación YTE no afecta la capacidad del anticuerpo para unirse a su antígeno análogo. En ciertas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). En algunas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en 3 veces en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). En algunas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en 2 veces en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). En algunas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en 4 veces en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). En algunas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en al menos 5 veces en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). En algunas realizaciones, la mutación YTE aumenta la semivida en suero del anticuerpo en al menos 10 veces en comparación con el anticuerpo natural (es decir, sin mutante YTE). Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.697.650; véase también Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
En ciertas realizaciones, el mutante YTE proporciona un medio para modular la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En ciertas realizaciones, el mutante YTEO proporciona un medio para modular la actividad ADCC de un anticuerpo de IgG humanizado dirigido contra un antígeno humano. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.697.650; véase también Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281 (33):23514-23524 (2006).
En ciertas realizaciones, el mutante YTE permite la modulación simultánea de la semivida en suero, distribución en el tejido y la actividad del anticuerpo (por ejemplo, la actividad ADCC de un anticuerpo IgG). Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.697.650; véase también Dall'Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281 (33):23514-23524 (2006).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los restos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de Estados Unidos n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc llamado "DANA" con sustitución de los restos 265 y 297 por alanina (patente de Estados Unidos n.° 7.332.581).
En ciertas realizaciones, la prolina en posición 329 (numeración UE) (P329) de una región Fc humana natural está sustituida por glicina o arginina o por un resto de aminoácido suficientemente grande para destruir el sándwich de prolina en la interfase del receptor Fc/Fra, que se forma entre la P329 de Fc y los restos de triptófano W87 y W110 de FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 de julio de 2000)). En una realización adicional, al menos una sustitución de aminoácido adicional en la variante Fc es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S y, en otra realización más, dicha al menos una sustitución de aminoácidos adicional es L234A y L235A de la región Fc de la IgG 1 humana o S228P y L235E de la región Fc de la IgG4 humana, todo ello según la numeración UE (patente de Estados Unidos n.° 8.969.526).
En ciertas realizaciones, un polipéptido comprende la Fc variante de una región Fc de la IgG natural en donde el polipéptido tiene la P329 de la región Fc de la IgG sustituida por glicina y en donde la Fc variante comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales en L234A y L235A de la región Fc de la IgG 1 humana o S228P y L235E de la región Fc de la IgG4 humana, y en donde los restos están numerados según la numeración UE (patente de Estados Unidos n.° 8.969.526). En ciertas realizaciones, el polipéptido que comprende las sustituciones P329G, L234A y L235A (numeración UE) presenta una afinidad reducida con FcyRIIIA y FcyRIIA humanas, para la modulación defectiva de ADCC hasta al menos un 20 % de la ADCC inducida por el polipéptido que comprende la región Fc de la IgG humana natural, y/o para la modulación defectiva de ADCP (patente de Estados Unidos n.° 8.969.526).
En una realización específica el polipéptido comprende un Fc variante de un polipéptido Fc humano natural que comprende una mutación triple: una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329, una mutación L234A y una mutación L235A según la numeración UE P329 / LALA) (patente de Estados Unidos n.° 8.969.526). En realizaciones específicas, el polipéptido comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: P329G, L234A y L235A según la numeración UE.
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o reducida a las FcR. (Véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración UE de los restos).
En algunas realizaciones, se han realizado alteraciones en la región Fc que dieron como resultado una unión alterada (es decir, tanto aumentada como disminuida) a C1q y/o en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642, y en idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los siguientes restos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del resto 434 de la región Fc (patente de Estados Unidos n.° 7.371.826).
Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de los Estados Unidos n.° 5.648.260; la patente de los Estados Unidos n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 en referencia a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
d) Variantes de anticuerpo modificadas con cisteína
En ciertas realizaciones, puede ser deseable crear mediante ingeniería genética anticuerpos modificados con cisteína, por ejemplo, un "THIOMAB™", donde uno o más restos de anticuerpo se han sustituido por restos de cisteína. En realizaciones particulares, los restos sustituidos se producen en sitios del anticuerpo que están disponibles para la conjugación. Mediante la sustitución de esos restos con cisteína, se colocan de este modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármacos o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, puede sustituirse uno cualquiera o más de los siguientes restos por cisteína: K149 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración UE) de la cadena pesada; A140 (numeración UE) de la cadena pesada; L174 (numeración UE) de la cadena pesada; Y373 (numeración UE) de la cadena pesada; y S400 (numeración UE) de la región Fc de la cadena pesada. En realizaciones específicas, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden la sustitución de la cisteína de HC-A140C (numeración UE). En realizaciones específicas, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden la sustitución de la cisteína de LC-K149C (numeración de Kabat). En realizaciones específicas, los anticuerpos descritos en el presente documento comprenden la sustitución de la cisteína de HC-A118C (numeración UE). Pueden generarse anticuerpos modificados con cisteína mediante ingeniería genética como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7.521.541.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una de las siguientes sustituciones de cisteína de la cadena pesada:
Figure imgf000036_0001
continuación
Figure imgf000037_0001
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una de las siguientes sustituciones de cisteína de la cadena ligera:
Figure imgf000037_0002
Una cadena ligera (LC) de hu7C2.v2.2.LA ilustrativa de THIOMAB™ K149C no limitante tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de los SEQ ID NOS: 19 y 23, respectivamente. Una cadena pesada (HC) de hu7C2.v2.2.LA de THIOMAB™ A118C tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de los SEQ ID NOS: 24 y 18, respectivamente.
Una región constante de cadena pesada modificada mediante ingeniería genética con cisteína S400 C ilustrativa se muestra en el SEQ ID NO: 28. La región constante de cadena pesada modificada mediante ingeniería genética con cisteína S400C puede fusionarse al extremo C de la región variable de cadena pesada hu7C2.v2.2.LA que se muestra en el SEQ ID NO: 11. La cadena pesada hu7C2.v2.2.LA HC S400C resultante puede emparejarse con una cadena ligera kappa hu7C2.v2.2.LA, tal como la cadena ligera que se muestra en el SEQ ID NO: 18.
La región constante de la cadena ligera modificada mediante ingeniería genética con una cisteína V205C ilustrativa se muestra en el SEQ ID NO: 25. La región constante de cadena pesada modificada mediante ingeniería genética con cisteína V205C puede fusionarse al extremo C de la región variable de cadena pesada hu7C2.v2.2.LA que se muestra en el SEQ ID NO: 10. La cadena ligera hu7C2.v2.2.LA V205C resultante puede emparejarse con una cadena pesada de IgG hu7C2.v2.2.LA, tal como la cadena pesada que se muestra en el SEQ ID NO: 19.
e) Derivados de anticuerpos
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede estar modificado adicionalmente para contener restos adicionales no proteicos que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero sin limitación, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitativos de polímeros hidrosolubles incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación por su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, aunque no de forma limitativa, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteico que pueden calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede tener cualquier longitud de onda e incluye, aunque no de forma limitativa, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteico a una temperatura a la que las mueren células cercanas al anticuerpo-resto no proteico.
B. Métodos y composiciones recombinantes
Los anticuerpos se pueden producir mediante el uso de métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567. En una realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-HER2 descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). Se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una realización, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, células Y0, NS0, Sp20). En una realización, se proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-HER2, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-HER2, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar rápidamente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo).
Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión de los vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando las funciones de glucosilación y efectora de Fc no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado también proceden de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden usarse junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como hospedadores. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
Las células de vertebrados también pueden usarse como hospedadores. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de células de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono trasformada mediante SV40 (COS-7); la línea de riñón de embrión humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod.
23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); los linfocitos t Ri, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MCR 5; y células FS4. Otras líneas celulares de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véanse, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.
248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).
C. Ensayos
Los anticuerpos anti-HER2 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizarse según sus propiedades físico/químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica.
Se puede someter a ensayo un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tales como ELISA, BIACore®, FACS o transferencia Western.
Se pueden usar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento por la unión a HER2. Dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) al que se une un anticuerpo descrito en el presente documento. Se proporcionan métodos detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
En un ensayo de competición de ejemplo, HER2 inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a HER2 (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento) y un segundo anticuerpo sin marcar del que se está evaluando su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a HER2. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, HER2 inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo marcado. Después de la incubación en condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a HER2, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con h ER2 inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado a HER2 inmovilizado se encuentra sustancialmente reducida en la muestra de ensayo comparada con la muestra del control, entonces, esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a HER2. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
D. Inmunoconjugados
La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden cualquier anticuerpo anti-HER2 proporcionado en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o isótopos radiactivos (es decir, un radioconjugado).
Los inmunoconjugados permiten la administración dirigida de un resto de fármaco a un tumor y, en algunas realizaciones, la acumulación intracelular de los anteriores, donde la administración sistémica de fármacos sin conjugar puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad en células normales (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan propiedades tanto de los anticuerpos como de los fármacos citotóxicos para dirigir potentes fármacos citotóxicos a células tumorales que expresan antígenos (Teicher, B.A. (2009) Cancer Drug Targets 9:982-1004) potenciando, de este modo, el índice terapéutico al maximizar la eficacia y minimizar la toxicidad inespecífica (Carter, PJ y Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
Los compuestos ADC de la invención incluyen aquellos con actividad antineoplásica. En algunas realizaciones, los compuestos ADC incluyen un anticuerpo conjugado, es decir, unido covalentemente, al resto del fármaco. En algunas realizaciones, el anticuerpo está unido covalentemente al resto del fármaco mediante un enlazador. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención administran selectivamente una dosis eficaz de un fármaco a un tejido tumoral de modo que se puede conseguir mayor selectividad, es decir, una dosis eficaz más baja aumentando a la vez el índice terapéutico ("ventana terapéutica").
El resto de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) puede incluir cualquier compuesto, resto o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático. Los restos de fármaco pueden transmitir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen, aunque no de forma limitativa, la unión a tubulina, la unión o intercalado de ADN, y la inhibición de la ARN polimerasa, la síntesis de proteínas y/o la topoisomerasa. Los restos de fármacos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, un maitansinoide, dolastatina, auristatina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepina (PBD), nemorrubicina y sus derivados, PNU-159682, antraciclina, duocarmicina, alcaloide de la vinca, taxano, tricoteceno, CC1065, camptotecina, elinafida y estereoisómeros, isósteros, y derivados de los mismos que tienen actividad citotóxica. Se describen con mayor detalle a continuación los ejemplos no limitantes de dichos inmunoconjugados.
1. Conjugados de anticuerpo-fármaco ilustrativos
Una realización ilustrativa de un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que se dirige a una célula tumoral, un resto de fármaco (D) y un resto enlazador (L) que une Ab a D. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al resto enlazador (L) mediante uno o más restos de aminoácidos, tales como lisina y/o cisteína.
Un ADC ilustrativo tiene la Fórmula I:
Ab-(L-D)p I
donde p es 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, el número de restos de fármaco que se pueden conjugar a un anticuerpo está limitado por el número de restos de cisteína libres. En algunas realizaciones, los restos de cisteína libres se introducen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo con los métodos descritos en el presente documento. El ADC ilustrativo de Fórmula I incluye, pero sin limitación, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína modificados por ingeniería genética (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). En algunas realizaciones, uno o más restos de cisteína libre están ya presentes en un anticuerpo, sin el uso de ingeniería genética, en cuyo caso, los restos de cisteína libre existentes pueden usarse para conjugar el anticuerpo a un fármaco. En algunas realizaciones, un anticuerpo se expone a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo a fin de generar uno o más restos de cisteína libres.
a) Enlazadores ilustrativos
Un "enlazador" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que puede usarse para unir uno o más restos de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I. En algunas realizaciones, los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar usando un enlazador que tiene funcionalidades reactivas para unirse covalentemente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un tiol de cisteína de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un enlazador o un fármacoenlazador intermedio para formar un ADC.
En un aspecto, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. Ejemplos no limitativos de tales funcionalidades reactivas incluyen maleimida, haloacetamidas, a-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Véase, por ejemplo, el método de conjugación de la página 766 de Klussman et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, y los Ejemplos en el presente documento.
En algunas realizaciones, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con un grupo electrofílico presente en un anticuerpo. Ejemplos de tales grupos electrofílicos incluyen, aunque sin limitación, grupos carbonilo aldehído y cetona. En algunas realizaciones, un heteroátomo de la funcionalidad reactiva del enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad de anticuerpo. Ejemplos no limitativos de tales funcionalidades reactivas incluyen, aunque sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida.
Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Ejemplos de componentes enlazadores incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" o "vc"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB"), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo ("SPP") y ciclohexano-1 carboxilato de 4-(N-maleimidometilo) ("MCC"). Se conocen diferentes componentes enlazadores en la técnica, algunos de los cuales se describen a continuación.
Un enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco. Los enlazadores escindibles a modo de ejemplo no limitantes incluyen enlazadores lábiles al ácido (por ejemplo, que comprenden hidrazona), enlazadores sensibles a proteasas (por ejemplo, sensibles a peptidasas), enlazadores fotolábiles o enlazadores que contienen disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); u S 5208020).
En ciertas realizaciones, un enlazador tiene la siguiente Fórmula II:
-Aa-Ww-Yy- II
en donde A es una "unidad de estiramiento" y a es un número entero de 0 a 1; W es una "unidad de aminoácidos" y w es un número entero de 0 a 12; Y es una "unidad separadora", e y es 0, 1 o 2; y Ab, D y p se definen como anteriormente para la Fórmula I. Las realizaciones a modo de ejemplo de tales enlazadores se describen en la Patente de Estados Unidos n.° 7.498.298.
En algunas realizaciones, un componente enlazador comprende una "unidad de extensión" que enlaza un anticuerpo a otro componente enlazador o al resto de un fármaco. A continuación se muestran unidades de estiramiento a modo de ejemplo no limitantes (en donde la línea ondulada indica sitios de unión covalente a un anticuerpo, fármaco o componentes enlazadores adicionales):
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En algunas realizaciones, un componente enlazador comprende una "unidad de aminoácidos". En algunas de tales realizaciones, la unidad de aminoácidos permite la escisión del enlazador por una proteasa, facilitando así la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosómicas (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Las unidades de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Dipéptidos a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalaninalisina (fk o phe-lys); fenilalanina-homolisina (phe-homolys); y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Tripéptidos a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicinaglicina-glicina (gly-gly-gly). Una unidad de aminoácidos puede comprender residuos de aminoácidos que se encuentran de forma natural y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como citrulina. Las unidades de aminoácidos se pueden diseñar y optimizar para la escisión enzimática por una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
En algunas realizaciones, un componente enlazador comprende una unidad "espadadora" que enlaza el anticuerpo a un grupo farmacológico, ya sea directamente o mediante una unidad extensora y/o una unidad de aminoácidos. Una unidad espaciadora puede ser "autoinmolativa" o "no autoinmolativa". Una unidad espaciadora "no autoinmolativa" es aquella en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al resto del fármaco tras la escisión del ADC. Ejemplos de unidades espaciadoras no autoinmolativas incluyen, aunque sin limitación, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. En algunas realizaciones, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina por una proteasa asociada a células tumorales da como resultado la liberación de un resto glicina-glicina-fármaco del resto del ADC. En algunas de tales realizaciones, el resto glicina-glicina-fármaco se somete después a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora de glicina-glicina del resto fármaco.
Una unidad espaciadora "autoinmolativa" permite la liberación del resto del fármaco. En ciertas realizaciones, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad p-aminobencilo. En algunas de tales realizaciones, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido a través de un enlace amida y un carbamato, metilcarbamato o carbonato se produce entre el alcohol bencílico y el fármaco (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En algunas realizaciones, la unidad espaciadora es p-aminobenciloxicarbonilo (PAB). En algunas realizaciones, un ADC que comprende un enlazador autoinmolativo tiene la estructura:
Figure imgf000042_0001
en donde Q es -alquilo C1-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero que varía de 0 a 4; y p varía de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, 1 a 7, 1 a 5 o 1 a 4.
Otros ejemplos de espaciadores autoinmolantes incluyen, aunque sin limitación, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Patente de los Estados Unidos n.° 7.375.078; Hay etal. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o paraaminobencilacetales. En algunas realizaciones, pueden usarse separadores que experimenten una ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituido y no sustituido (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2: 223), sistemas anulares biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc.
94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). La unión de un fármaco al carbono a de un residuo de glicina es otro ejemplo de un espaciador autoinmolativo que puede ser útil en ADC (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
En algunas realizaciones, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco a un anticuerpo a través de una ramificación, resto enlazador multifuncional (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los conectores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia de los ADC. Por lo tanto, donde un anticuerpo modificado porta únicamente un grupo tiol de la cisteína reactivo, gran cantidad de restos de fármaco se pueden unir mediante un enlazador dendrítico.
Los enlazadores a modo de ejemplo no limitantes se muestran a continuación en el contexto de un ADC de Fórmula I:
Otros ADC a modo de ejemplo no limitativos incluyen las estructuras:
Figure imgf000043_0001
en donde X es:
Figure imgf000043_0002
Y es:
Figure imgf000043_0003
cada R es independientemente H o alquilo C1-C6 ; y n es de 1 a 12.
Normalmente, los enlazadores de tipo péptido se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Tales enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis en fase líquida (por ejemplo, E. Schroder y K. Lubke (1965) "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, Academic Press).
En algunas realizaciones, un enlazador está sustituido con grupos que modulan la solubilidad y/o reactividad. Como ejemplo no limitante, un sustituyente cargado como sulfonato (-SO3-) o amonio puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo enlazador y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo enlazador con el anticuerpo y/o el resto del fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermedio anticuerpo-enlazador) con D o DL (intermedio fármaco-enlazador) con Ab, dependiendo de la vía de síntesis empleada para preparar los ADC. En algunas realizaciones, una porción del enlazador se acopla al anticuerpo y una porción del enlazador se acopla al fármaco, y después el Ab-(porción del enlazador) 3 se acopla al fármaco-(porción del enlazador)b para formar el ADC de Fórmula I. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo comprende más de un sustituyente (porción enlazadora)®, de manera que más de un fármaco se acople al anticuerpo en el ADC de Fórmula I.
Los compuestos de la invención contemplan expresamente, aunque sin limitación, ADC preparado con los siguientes reactivos enlazadores: bis-maleimido-trioxietilenglicol (BMPEO), éster de N-(p-maleimidopropiloxi)-N-hidroxisuccinimida (BMPS), éster de N-(s-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS), éster de N-[ymaleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), 1,6-hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de succinimidilo (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de succinimidilo (SBAP), yodoacetato de succinimidilo (SIA), (4-yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (SIAB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), 6-[(betamaleimidopropionamido)hexanoato] de succinimidilo (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPBv y succinimidil-(4-vinilsulfone)benzoato (SVSB) e incluyendo reactivos de bis-maleimida: ditiobismaleimidoetano (DTME), 1,4-Bismaleimidobutano (BMB), 1,4 Bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE), BM(PEG)2 (mostrado a continuación) y BM(PEG)3 (mostrado a continuación); derivados bifuncionales de imidioésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-fluorina activa (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). En algunas realizaciones, los reactivos de bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a un resto de fármaco que contiene tiol, enlazador o intermedio enlazador-fármaco. Otros grupos funcionales que son reactivos con grupos tiol incluyen, aunque sin limitación, yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
Figure imgf000044_0001
Determinados reactivos enlazadores útiles pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, tales como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o sintetizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en la técnica; por ejemplo, in Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO94/11026.
b) Ejemplos de restos de fármacos
(1) Maitansina y maitansinoides
En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de maitansinoide. Los maitansinoides son derivados de la maitansina y son inhibidores mitotóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente de los Estados Unidos n.° 3896111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como el maitansinol y los ésteres de C-3 maitansinol (Patente de los Estados Unidos n.° 4.151.042). Se desvelan maitansinoides sintéticos, por ejemplo, en las Patente de los Estados Unidos n.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
Los restos de fármaco de maitansinoide son restos de fármacos atractivos en los conjugados de anticuerpo-fármaco ya que son: (i) relativamente fáciles de preparar por fermentación o modificación o derivatización química de los productos de fermentación, (ii) susceptibles a la derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de enlaces no de disulfuro a los anticuerpos, (iii) estables en plasma y (iv) eficaces contra varias líneas de células tumorales.
Determinados maitansinoides adecuados para su uso como restos de fármacos maitansinoides son conocidos en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o producirse usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973). Los maitansinoides también se pueden preparar sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
Ejemplos de restos de fármacos maitansinoides incluyen, aunque sin limitación, aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-descloro (Pat, de los Estados Unidos n.° 4256746) (preparado, por ejemplo, por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) /-C-19-decloro (Pat de los Estados Unidos n.° 4361650 y 4307016) (preparados, por ejemplo, por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-descloro (Pat. de los Estados Unidos n.° 4.294.757) (preparado, por ejemplo, por acilación usando cloruros de acilo), y los que tienen modificaciones en otras posiciones del anillo aromático.
Los restos de fármacos maitansinoides a modo de ejemplo también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (PAt. de los Estados Unidos n.° 4424219) (preparado, por ejemplo, por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR)(US 4331598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (Pat. de los Estados Unidos n.° 4450254) (preparado, por ejemplo, de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (US 4364866) (preparado, por ejemplo, por la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Pat. de los Estados Unidos n.° 4313946 y 4315929) (por ejemplo, aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-desmetilo (Pat. de los Estados Unidos n.° 4362663 y 4322348) (preparadp, por ejemplo, por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-deoxi (US 4371533) (preparado, por ejemplo, por la reducción de tricloruro de titanio/LAH de maitansinol).
Muchas posiciones de los compuestos maitansinoides son útiles como posición de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. En algunas realizaciones, la reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En algunas realizaciones, el enlaczador se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol.
Los restos de fármacos maitansinoides incluyen los que tienen la estructura:
Figure imgf000045_0001
en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre del resto del fármaco maitansinoide a un enlazador de un ADC. Cada R puede ser independientemente H o un alquilo C1-C6. La cadena de alquileno que une el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2 o 3 (US 633410; US 5208020; Chari et al (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
Todos los estereoisómeros del resto de fármaco maitansinoide se contemplan para el ADC de la invención, es decir, cualquier combinación de configuraciones R y S en los carbonos quirales (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (documento RE39151); US 5208020; Widdison et al (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408). En algunas realizaciones, el resto del fármaco maitansinoide tiene la siguiente estereoquímica:
Figure imgf000046_0001
Las realizaciones a modo de ejemplo de restos de fármacos maitansinoides incluyen, aunque sin limitación, DM1; DM3; y DM4, que tienen las estructuras:
Figure imgf000047_0001
en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre del fármaco a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco.
Otros conjugados de anticuerpo-fármaco maitansinoide a modo de ejemplo tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en las que Ab es anticuerpo y p es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4):
Figure imgf000047_0002
Los ejemplos de conjugados anticuerpo-fármaco en los que DM1 se une a través de un enlazador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y abreviatura:
Figure imgf000048_0001
en donde Ab es anticuerpo; n es 0, 1 o 2; y p es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, p es de 1 a 10, p es de 1 a 7, p es de 1 a 5 o p es de 1 a 4.
Se desvelan los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para hacer los mismos y su uso terapéutico, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos N.° 5.208.020 y 5.416.064; US 2005/0276812 A1; y Patente Europea EP 0425 235 B1. Véase también Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996); y Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992).
En algunas realizaciones, los conjugados de anticuerpo-maitansinoide pueden prepararse uniendo químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n.° 5.208.020 (). En algunas realizaciones, el ADC con un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para aumentar la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo. En algunos casos, se espera que incluso una molécula de toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo.
Los ejemplos de grupos de unión para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en el presente documento y aquellos desvelados en la Patente de los Estados Unidos n.° 5208020; Patente EP 0425 235 B1; Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; y en el documento US 2005/016993 A1.
(2) Auristatinas y dolastatinas
Los restos de fármacos incluyen dolastatinas, auristatinas y análogos y derivados de las mismas (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431). Las auristatinas son derivados del compuesto de moluscos marinos dolastatina-10. Sin pretender ceñirse a ninguna teoría en particular, se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división celular y nuclear (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticáncer (US 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). El resto de fármaco de dolastatin/auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N-terminal (amino) o el extremo C-terminal (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (documento WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465).
Las realizaciones a modo de ejemplo de auristatina incluyen los restos de fármaco monometilauristatina unidos en el extremo N terminal, De y Df, desvelado en los documentos US 7498298 y US 7659241:
Figure imgf000049_0001
en donde la línea ondulada de De y Df indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o componente enlazador de anticuerpo, e independientemente en cada ubicación:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8 ;
R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8 , carbociclo C3-C8 , arilo, alquilarilo C1-C8 , alquil Ci-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil Ci-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8 , carbociclo C3-C8 , arilo, alquilarilo C1-C8 , alquil Ci-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil Ci-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en donde Ra y Rb se seleccionan de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8 ;
R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8 , carbociclo C3-C8 , arilo, alquilarilo C1-C8 , alquil Ci-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil Ci-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8 , carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8 ;
R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8 ;
Z es O, S, NH, o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8 , -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2 ; m es un número entero que varía de 1-1000;
R13 es alquilo C2-C8 ;
R14 es H o alquilo C1-C8 ;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2 , -(CH2V S O 3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8 , o -(CH2)n-COOH;
R18 se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y-C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y
n es un número entero que varía de 0 a 6.
En una realización, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H o metilo. En una realización ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
Incluso en otra realización más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
Aún en otra realización más, cada aparición de R8 es -OCH3.
En una realización ejemplar, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es secbutilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En una realización, Z es -O- o -NH-.
En una realización, R10 es arilo.
En una realización ejemplar, R10 es fenilo.
En una realización ejemplar, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En una realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2 , en donde R15 es -(CH2)n-N(R16)2 , y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otra realización, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en donde R15 es -(CH2V S O 3H.
Una realización ejemplar de auristatina de fórmula De es MMAE, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco:
Figure imgf000050_0001
Una realización ejemplar de auristatina de fórmula DF es MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco:
Figure imgf000050_0002
Otras realizaciones a modo de ejemplo incluyen compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de carboxi fenilalanina en el extremo C terminal del resto de fármaco pentapéptido auristatina (documento WO 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C del resto de fármaco pentapéptido auristatina (documento WO 2007/008603 ).
Las realizaciones a modo de ejemplo no limitantes de ADC de Fórmula I que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde "Ab" es un anticuerpo; p es de 1 a aproximadamente 8, "Val-Cit" es un dipéptido de a valinea-citrulina; y "S" es un átomo de azufre:
Figure imgf000050_0003
Realizaciones a modo de ejemplo no limitantes de ADC de Fórmula I que comprenden MMAF y varios componentes enlazadores incluyen además Ab-MC-PAB-MMAF y Ab-PAB-MMAF. Se ha demostrado que los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo mediante un enlazador que no es escindible proteolíticamente poseen una actividad comparable a los inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo mediante un enlazador proteolíticamente escindible (Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124). En algunas de tales realizaciones, se cree que la liberación del fármaco se efectúa mediante la degradación del anticuerpo en la célula. Normalmente, los restos de fármaco basados en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis en fase líquida (véase, por ejemplo, E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, págs. 76-136, 1965, Academic Press). Los restos de fármaco auristatina/dolastatina pueden, en algunas realizaciones, prepararse de acuerdo con los métodos de: US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719­ 725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; y Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784. En algunas realizaciones, restos de fármacos de auristatina/dolastatina de fórmulas De, tal como MMAE y Df, tal como MMAF e intermedios de enlazadores de fármacos y derivados de los mismos, tales como MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF y MC-vc-PAB-MMAE, pueden prepararse usando los métodos descritos en el documento US 7498298; Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; y Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784 y después conjugado con un anticuerpo de interés.
(3) Caliqueamicina
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos caliqueamicina y sus análogos, son capaces de producir roturas de ADN de doble hebra a concentraciones subpicomolares (Hinman et al., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). La caliqueamicina tiene sitios de acción intracelulares pero, en ciertos casos, no atraviesa fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos puede, en algunas realizaciones, potenciar en gran medida sus efectos citotóxicos. Se describen métodos a modo de ejemplo no limitativos de preparación de conjugados anticuerpo-fármaco con un resto de fármaco caliqueamicina, por ejemplo, en US 5712374; u S 5714586; US 5739116; y US 5767285. En algunas realizaciones, el resto del fármaco caliqueamicina conjugado con el anticuerpo es un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000051_0001
en donde X es Br o I;
L es un enlazador; R es hidrógeno, alquilo Ci-6 o -C(=O)alquilo Ci-6; y Ra es hidrógeno o alquilo Ci-6.
En algunas realizaciones, X es Br, Ra es hidrógeno y R es isopropilo.
En otras realizaciones, X es Br, Ra es hidrógeno y R es etilo.
En otras realizaciones, X es I, Ra es hidrógeno y R es isopropilo.
En otras realizaciones, X es I, Ra es hidrógeno y R es etilo.
En algunas realizaciones, X es Br, Ra es hidrógeno y R -C(=O)CH3.
En otras realizaciones, X es I, Ra es hidrógeno y R es -C(=O)CH3.
En otras realizaciones, X es I, Ra es etilo y R es -C(=O)CH3.
En otras realizaciones, X es Br, Ra es etilo y R es -C(=O)CH3.
(4) Pirrolobenzodiazepinas
En algunas realizaciones, un ADC comprende una pirrolobenzodiazepina (PBD). En algunas realizaciones, los dímeros de PBD reconocen y se unen a secuencias de ADN específicas. El producto natural antramicina, un PBD, se indicó primero en 1965 (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). Desde entonces, se han indicado varios PBD, tanto de origen natural como análogos (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465 que incluyen dímeros del armazón tricíclico de PBD (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). Sin pretender ceñirse a ninguna teoría en particular, se cree que la estructura del dímero imparte la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN en forma B, lo que lleva a un ajuste perfecto en el sitio de unión (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). Se ha demostrado que los compuestos de PBD diméricos que llevan sustituyentes arilo C2 son útiles como agentes citotóxicos (Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
En algunas realizaciones, Los compuestos PBD se pueden emplear como profármacos protegiéndolos en la posición N10 con un grupo protector de nitrógeno que se puede retirar in vivo (WO 00/12507; WO 2005/023814).
Los dímeros de PBD se han conjugado con anticuerpos y se ha demostrado que el ADC resultante tiene propiedades anticancerígenas (US 2010/0203007). Los sitios de enlace a modo de ejemplo no limitantes en el dímero de PBD incluyen el anillo pirrolo de cinco miembros, la unión entre las unidades de PBD y el grupo imina N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
Los componentes dímeros de PBD a modo de ejemplo no limitantes de los ADC son de Fórmula A: y sales y solvatos de los mismos,
Figure imgf000052_0001
en donde:
la línea ondulada indica el sitio de unión covalente al enlazador;
las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3;
R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =O, =CH2 , CN, R, OR, =c H-RD, =C(Rd)2 , O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente además seleccionados entre halo o dihalo, en donde RD se selecciona independientemente entre R, CO2R, COR, CHO, CO2H y halo;
R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', NO2 , Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', NO2 , Me3Sn y halo;
Q se selecciona independientemente entre O, S y NH;
R11 es H o R o, en donde Q es O, SO3M, en donde M es un catión metálico;
R y R' se selecciona cada uno independientemente entre grupos alquilo C1-8, alquilo C1-12, heterociclilo C3-8, heterociclo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y opcionalmente en relación con el grupo NRR', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido;
R12, R16, R19 y R17 son como se define para R2, R6, R9 y R7 respectivamente;
R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos; y
X y X' se seleccionan independientemente entre O, S y N(H).
En algunas realizaciones, R y R' se selecciona cada uno independientemente entre grupos alquilo C1-12, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y opcionalmente en relación con el grupo n Rr ', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, R9 y R19 son H.
En algunas realizaciones, R6 y R16 son H.
En algunas realizaciones, R7 y R17 son ambos OR7A, en donde R7A es alquilo C1-4 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R7A es Me. En algunas realizaciones, R7A es es Ch2Ph, en donde Ph es un grupo fenilo.
En algunas realizaciones, X es O.
En algunas realizaciones, R11 es H.
En algunas realizaciones, hay un doble enlace entre C2 y C3 en cada unidad de monómero.
En algunas realizaciones, R2 y R12 se seleccionan independientemente entre H y R. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente R. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente arilo C5-20 o arilo C5-7 o arilo C8-10 opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, R2 y R12 son independientemente fenilo, tienilo, naftilo, piridilo, quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, R2 y R12 se seleccionan independientemente entre =O, =CH2 , =CHRD y =C(RD)2. En algunas realizaciones, R2 y R12 son cada uno =CH2. En algunas realizaciones, R2 y R12 son cada uno H. En algunas realizaciones, R2 y R12 son cada uno =O. En algunas realizaciones, R2 y R12 son cada uno =CF2. En algunas realizaciones, R2 y/o R12 son independientemente =C(RD)2. En algunas realizaciones, R2 y/o R12 son independientemente =CH-RD.
En algunas realizaciones, cuando R2 y/o R12 es =CH-RD, cada grupo puede tener independientemente cualquiera de las configuraciones que se muestran a continuación:
Figure imgf000053_0001
En algunas realizaciones, R" ess un grupo alquileno C3 o un grupo alquileno C5.
En algunas realizaciones, un componente dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(I):
Figure imgf000053_0002
en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, un componente dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(II):
Figure imgf000053_0003
en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, un componente dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(III):
Figure imgf000054_0001
en donde RE y RE" se seleccionan cada uno independientemente entre H o RD, en donde RD es como se ha definido anteriormente; y en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, n es 0. En algunas realizaciones, n es 1. En algunas realizaciones, RE y/o RE es H. En algunas realizaciones, RE y RE" son H. En algunas realizaciones, RE y/o RE" es RD, en donde RD es alquilo C1-12 opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, RE y/o RE" es RD, en donde RD es metilo.
En algunas realizaciones, un componente dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(IV):
Figure imgf000054_0002
en donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido; en donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, un componente dímero de PBD ejemplar de un ADC tiene la estructura de Fórmula A(V):
Figure imgf000054_0003
en donde Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido; en donde Ar1 y Ar2 pueden ser iguales o diferentes; y
en donde n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 se seleccionan cada uno independientemente entre fenilo, furanilo, tiofenilo y piridilo opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente fenilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente tien-2-ilo o tien-3-ilo opcionalmente sustituidos. En algunas realizaciones, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituidos. El grupo quinolinilo o isoquinolinilo puede estar unido al núcleo de PBD a través de cualquier posición disponible en el anillo. Por ejemplo, el quinolinilo puede ser quinolin-2-ilo, quinolin-3-ilo, quinolin-4-ilo, quinolin-5-ilo, quinolin-6-ilo, quinolin-7-ilo y quinolin-8-ilo. En algunas realizaciones, el quinolinilo se selecciona entre quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo. El isoquinolinilo puede ser isoquinolin-1-ilo, isoquinolin-3-ilo, isoquinolin-4-ilo, isoquinolin-5-ilo, isoquinolin-6-ilo, isoquinolin-7-ilo e isoquinolin-8-ilo. En algunas realizaciones, el isoquinolinilo se selecciona entre isoquinolin-3-ilo e isoquinolin-6-ilo.
Otros componentes dímeros de PBD a modo de ejemplo no limitantes de los ADC son de Fórmula B:
Figure imgf000055_0001
y sales y solvatos del mismo, en donde:
la línea ondulada indica el sitio de unión covalente al enlazador;
la línea ondulada conectada al OH indica la configuración S o R;
RV1 y rV2 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo y fenilo (fenilo el cual puede estar opcionalmente sustituido con flúor, particularmente en la posición 4) y heterociclilo C5-6 ; en donde RV1 y RV2 pueden ser iguales o diferentes; y
n es 0 o 1.
En algunas realizaciones, RV1 y RV2 se seleccionan independientemente de H, fenilo y 4-fluorofenilo.
En algunas realizaciones, se puede unir un enlazador en uno de varios sitios del resto de fármaco dímero de PBD, incluyendo la imina N10 del anillo B, la posición endo/exo C-2 del anillo C, o la unidad de sujeción que une los anillos A (véase estructuras C(I) y C(II) a continuación).
Los componentes dímeros de PBD a modo de ejemplo no limitantes de los ADC incluyen las fórmulas C(I) y C(II):
Figure imgf000055_0002
Las fórmulas C(I) y C(II) se muestran en su forma de imina N10-C11. Los restos de fármacos de PBD a modo de ejemplo también incluyen las formas carbinolamina y carbinolamina protegida, como se muestra en la siguiente tabla:
Figure imgf000055_0003
en donde:
X es CH2 (n = 1 a 5), N u O;
Z y Z' se seleccionan independientemente entre OR y NR2 , en donde R es una cadena de alquilo primaria, secundaria o terciaria que contiene de 1 a 5 átomos de carbono;
Ri, R'i, R2 y R'2 cada uno de se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8 , alquinilo C2-C8 , arilo C5-20 (incluyendo arilos sustituidos), grupos heteroarilo C5-20, -NH2 , -NHMe, -OH y -SH, en donde, en algunas realizaciones, las cadenas de alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono; R3 y R'3 se seleccionan independientemente entre H, Or , NHR y NR2 , en donde R es una cadena de alquilo primaria, secundaria o terciaria que contiene de 1 a 5 átomos de carbono;
R4 y R'4 se seleccionan independientemente entre H, Me y OMe;
R5 se selecciona entre alquilo C1-C8 , alquenilo C2-C8 , alquinilo C2-C8 , arilo C5-20 (incluyendo arilos sustituidos por halo, nitro, ciano, alcoxi, alquilo, heterociclilo) y grupos heteroarilo C5-20, en donde, en algunas realizaciones, las cadenas de alquilo, alquenilo y alquinilo comprenden hasta 5 átomos de carbono;
R11 es H, alquilo C1-C8 o un grupo protector (tal como acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ), 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc) o un resto que comprende una unidad autoinmolante como valina-citrulina-PAB);
R12 es H, alquilo C1-C8 o un grupo protector;
en donde un hidrógeno de uno de Ri, R'i, R2 , R'2 , R5 o R12 o un hidrógeno del -OCH2CH2 (X)nCH2CH2O-espaciador entre los anillos A se reemplaza por un enlace conectado al enlazador del ADC.
Las porciones de dímero de PBD a modo de ejemplo de ADC incluyen, pero no se limitan a (la línea ondulada indica el sitio de unión covalente al enlazador):
Figure imgf000056_0001
Las realizaciones a modo de ejemplo no limitantes de ADC que comprenden dímeros PBD tienen las siguientes estructuras:
dímero-Phe-Lys-PAB-Ab de PBD, en donde:
n es de 0 a 12. En algunas realizaciones, n es de 2 a 10. En algunas realizaciones, n es de 4 a 8. En algunas realizaciones, n se selecciona entre 4, 5, 6, 7 y 8.
Se puede preparar otro ADC ejemplar no limitativo que comprende un dímero de PBD conjugando un PBD unido con monometil disulfuro N10 (mostrado a continuación) con un anticuerpo: para producir un conjugado de anticuerpofármaco de PBD unido con monometil disulfuro N10:
Figure imgf000057_0001
Véase, por ejemplo, Publicación PCT n.° WO 2013/055987.
Los enlazadores de dímero-val-cit-PAB-Ab de PBD y el dímero de PBD-Phe-Lys-PAB-Ab son escindibles con proteasa, mientras que el enlazador de dímero-maleimida-acetal de PBD es lábil en ácido.
Los dímeros de PBD y los ADC que comprenden dímeros de PBD se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, WO 2009/016516; US 2009/304710; Us 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598; WO 2013/055987.
(5) Antraciclinas
En algunas realizaciones, un ADC comprende una antraciclina. Las antraciclinas son compuestos antibióticos que muestran actividad citotóxica. Si bien no pretenden ceñirse a ninguna teoría en particular, los estudios han indicado que las antraciclinas pueden funcionar eliminando células mediante diversos mecanismos diferentes, incluyendo: 1) intercalación de las moléculas de fármaco en el ADN de la célula, inhibiendo de este modo la síntesis de ácidos nucleicos dependiente de ADN; 2) producción por el fármaco de radicales libres que después reaccionan con macromoléculas celulares para provocar daño a las células y/o 3) interacciones de las moléculas de fármaco con la membrana celular [véase, por ejemplo, C. Peterson et al., "Transport And Storage Of Anthracicline In Experimental Systems And Human Leukemia" en Anthracicline Antibiotics In Cancer TherapyA N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. en pág. 97-102). Debido a su potencial citotóxico, las antraciclinas se han usado en el tratamiento de numerosos cánceres, tales como leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de ovario y sarcomas (véase, por ejemplo, P.H-Wiernik, en Anthracicline: Current Status And New Developments pág. 11).
Las antraciclinas a modo de ejemplo no limitantes incluyen doxorrubicina, epirubicina, idarrubicina, daunomicina, nemorubicina y derivados de los mismos. Se han preparado y estudiado inmunoconjugados y profármacos de daunorrubicina y doxorrubicina (Kratz et al (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834; Dubowchik et al (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; u S 6630579). El conjugado anticuerpo-fármaco BR96-doxorrubicina reacciona específicamente con el antígeno Lewis-Y asociado al tumor y se ha evaluado en estudios de fase I y II (Saleh et al (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher et al (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
PNU-159682 es un potente metabolito (o derivado) de nemorubicina (Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11 (4): 1608-1617). La nemorubicina es un análogo semisintético de la doxorrubicina con un grupo 2-metoximorfolino en el glucósido amino de la doxorrubicina y ha estado bajo evaluación clínica (Grandi et al (1990) Cancer Treat. Rev.
17:133; Ripamonti et al (1992) Brit. J. Cancer 65:703;), incluidos los ensayos de fase M/MI para el carcinoma hepatocelular (Sun et al (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1a Ed, Abs 4649; Pacciarini et al (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116).
En la Fórmula Ia se muestra un ADC ejemplar no limitativo que comprende nemorubicina o derivados de nemorubicina:
Figure imgf000058_0001
en donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
Li y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en el presente documento;
T es un anticuerpo (Ab) como se describe en el presente documento; y
m es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, m es de 1 a 10, de 1 a 7, de 1 a 5 o de 1 a 4.
En algunas realizaciones, Ri y R2 son ambos metoxi (-OMe).
En la fórmula Ib se muestra otro ADC ejemplar no limitativo que comprende nemorubicina o derivados de nemorubicina:
Figure imgf000058_0002
en donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi C1-C5 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
L2 y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en el presente documento;
T es un anticuerpo (Ab) como se describe en el presente documento; y
m es de 1 a aproximadamente 20. En algunas realizaciones, m es de 1 a 10, de 1 a 7, de 1 a 5 o de 1 a 4. En algunas realizaciones, Ri y R2 son ambos metoxi (-OMe).
En algunas realizaciones, el componente nemorubicina de un ADC que contiene nemorubicina es PNU-159682. En algunas de tales realizaciones, la porción de fármaco del ADC uede tener una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000059_0001
o
Figure imgf000059_0002
en donde la línea ondulada indica la unión al enlazador (L).
Las antraciclinas, incluido PNU-159682, pueden conjugarse con anticuerpos a través de varios sitios de enlace y varios enlazadores (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124), incluyendo los enlazadores descritos en el presente documento.
Los ADC a modo de ejemplo que comprenden una nemorubicina y un enlazador incluyen, pero sin limitación:
Figure imgf000060_0001
PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador-Ab;
Figure imgf000061_0001
PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador(R1 R2)-Ab,
en donde:
Ri y R2 se seleccionan independientemente entre H y alquilo C1-C6 ; y
Figure imgf000061_0002
PNU-159682-maleimida-Ab.
Se puede preparar un ADC ejemplar no limitante adicional que comprende un dímero de PBD conjugando una amida PNU de disulfuro de piridilo (que se muestra a continuación) con un anticuerpo: para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco p Nu -159682 unido por disulfuro:
Figure imgf000062_0001
El enlazador de PNU-159682 maleimida acetal-Ab es ácido lábil, mientras que los enlazadores de PNU-159682-valcit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-Ab y PNU-159682- val-cit-PAB-espaciador(R1R2)-Ab son escindibles con proteasa.
(6) Restos de fármaco dímero de 1-(dorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI)
En algunas realizaciones, un ADC comprende 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI). La clase 5-amino-1-(clorometil)-1,2-dihidro-3H-benz[e]indol (amino CBI) de alquilantes de surcos menores de ADN son citotoxinas potentes (Atwell, et al (1999) J. Med. Chem., 42:3400), y se han utilizado como unidades efectoras en varias clases de profármacos diseñados para la terapia del cáncer. Estos han incluido conjugados de anticuerpos, (Jeffrey, et al. (2005) J. Med. Chem., 48:1344), profármacos para terapia génica basados en carbamatos de nitrobencilo (Hay, et al (2003) J. Med. Chem. 46:2456) y los correspondientes derivados nitro-CBI como profármacos activados por hipoxia (Tercel, et al (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609). Los farmacóforos de CBI y pirrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepina (PBD) se han unido mediante una cadena de alquilo (Tercel et al (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151).
En algunas realizaciones, un ADC comprende dímero de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1 H-benzo[e]indol (CBI). En algunas de tales realizaciones, el dímero es un heterodímero en el que la mitad del dímero es un resto CBI y la otra mitad del dímero es un resto PBD.
En algunas realizaciones, un dímero CBI comprende la fórmula:
Figure imgf000063_0001
en donde
R1 se selecciona entre H, P(O)3H2, C(O)NRaRb o un enlace al enlazador (L);
R2 se selecciona entre H, P(O)3H2, C(O)NRaRb o un enlace al enlazador (L);
Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F, o Ra y Rb forman un grupo heterociclilo de cinco o seis miembros;
T es un grupo de unión seleccionado entre alquileno C3-C12, Y, (alquilen Ci-C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquilen Ci-C6)-Y-(alquilen Ci-C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6) y (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6);
en donde Y se selecciona independientemente entre O, S, NR1, arilo y heteroarilo;
en donde alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con F, OH, O(alquilo C1-C6), NH2 , NHCH3 , N(CH3)2, OP(O)3H2 y alquilo C1-C6 , en donde alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más F;
o alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con un enlace a L; D' es un resto fármaco seleccionado entre:
Figure imgf000063_0002
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a T ;
X1 y X2 se seleccionan independientemente entre O y NR3, en donde R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F;
R4 es H, CO2R o un enlace a un enlazador (L), en donde R es alquilo C1-C6 o bencilo; y R5 es H o alquilo C1-C6. Los intermedios de fármaco enlazador 51-86 de la Tabla A se prepararon acoplando un dímero CBI o un resto de fármaco heterodímero CBI / PBD con un reactivo enlazador, de acuerdo con los procedimientos del documento WO 2015/023355.
- ^ -
Figure imgf000064_0001
(continuación)
Figure imgf000065_0001
(continuación)
etil)-
etil)-[e]
Figure imgf000066_0001
(continuación)
Figure imgf000067_0001
(continuación)
Figure imgf000068_0001
(continuación)
Figure imgf000069_0001
(continuación)
l]-
Figure imgf000070_0001
(continuación)
Figure imgf000071_0001
Los intermedios de enlazador-fármaco 87 y 88 de la Tabla B se prepararon acoplando un resto de fármaco dímero de PBD con un reactivo de enlazador de acuerdo con los procedimientos de WO 2013/055987.
T l B In rm i - f rm ím r PBD
Figure imgf000071_0002
Los intermedios de enlazador-fármaco 89 y 90 de la Tabla C se prepararon acoplando un resto de fármaco dímero de CBI con un reactivo de enlazador peptidomimético de acuerdo con los procedimientos de WO 2015/095227.
Tabla C intermedios 89-90 del fármaco enlazador peptidomimético del dímero CBI
Figure imgf000072_0001
Ejemplos de porciones de dímeros CBI de ADC incluyen, pero no se limitan a, los siguientes dímeros CBI-PBD (la línea ondulada indica el sitio de unión covalente al enlazador):
Figure imgf000073_0001
y el siguiente dímero CBI-CBI:
Figure imgf000073_0002
Las realizaciones a modo de ejemplo no limitantes de ADC que comprenden dímeros CBI tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000073_0003
CBI-PBD (profármaco de piperazin-profármaco)-disulfuro-Ab;
Figure imgf000074_0001
CBI-PBD (fosfato)-disulfuro-Ab;
y
Figure imgf000074_0002
Los intermediarios de fármaco-enlazador de heterodímero CBI-PBD a modo de ejemplo no limitantes que pueden conjugarse con anticuerpos para formar ADC incluyen, pero sin limitación:
Figure imgf000075_0001
CBI-PBD (profármaco de piperazin-profármaco)-2-propil piridil disulfuro 81;
Figure imgf000075_0002
y
Figure imgf000076_0001
CBI-PBD-(fosfato)-enlazador peptidomimético 86.
Los intermedios de fármaco-enlazador de homodímero CBI-CBI a modo de ejemplo no limitantes que se pueden conjugar con anticuerpos para formar ADC incluyen, pero sin limitación:
Figure imgf000076_0002
CBI-CBI (fosfato)-acetal-maleimida 78;
Figure imgf000076_0003
y
Figure imgf000077_0001
CBI-CBI (fosfato)-enlazador peptidomimético EDA 90.
(7) Amatoxina
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de amatoxina. Las amatoxinas son péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos. Se pueden aislar de la seta Amanita phalloides o prepararse sintéticamente. Las amatoxinas inhiben específicamente la ARN polimerasa II dependiente de ADN de células de mamífero y, de este modo, también la transcripción y la biosíntesis de proteínas de las células afectadas. La inhibición de la transcripción en una célula produce la detención del crecimiento y la proliferación. Véanse, por ejemplo, Moldenhauer et al. JNCI 104:1-13 (2012), los documentos WO2010115629, WO2012041504, WO2012119787, WO2014043403, WO2014135282 y WO2012119787. En algunas realizaciones, la una o más moléculas de amatoxina son una o más moléculas de a-amanitina.
(8) Otros restos de fármacos
Los restos de fármacos incluyen también geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem.
13:786-791); y toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la cadena de difteria A, fragmentos activos no de unión de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232.
Los restos de fármacos también incluyen compuestos con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa).
En ciertas realizaciones, un inmunoconjugado puede comprender un átomo radioactivo. Están disponibles diversos isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. En algunas realizaciones, cuando se usa un inmunoconjugado para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios de centellografía, por ejemplo, Tc99 o I123 o un marcador de espín para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (r Mn) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, IRM), tales como circonio-89, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El circonio-89 puede complejarse a diversos agentes quelantes metálicos y conjugarse a anticuerpos, por ejemplo, para la adquisición de imágenes PET (documento WO 2011/056983).
Los marcadores radioactivos u otros marcadores pueden incorporarse al conjugado según modos conocidos. Por ejemplo, se puede biosintetizar o sintetizar químicamente un péptido usando precursores de aminoácidos adecuados que comprenden, por ejemplo, uno o más átomos de flúor-19 en lugar de uno o más hidrógenos. En algunas realizaciones, marcadores tales como Tc99, I123, Re186, 188Re y 111In pueden unirse mediante un resto de cisteína del anticuerpo. En algunas realizaciones, el itrio-90 puede unirse mediante un resto de lisina del anticuerpo. En algunas realizaciones, el método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57) puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe algunos otros métodos.
Un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo conjugado a una enzima activadora de profármaco. Una enzima activadora de profármaco puede convertir un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO 81/01145) en un fármaco activo, tal como un fármaco antineoplásico. Dichos inmunoconjugados son útiles, por ejemplo, en terapia con profármacos mediada por enzima dependiente de anticuerpo ("ADEPT"). Las enzimas que se pueden conjugar a un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, fosfatasas alcalinas, que son útiles para convertir profármacos que contienen fosfatasa en fármacos libres; arilsulfatasas, que son útiles para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, que es útil para convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L), que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, que son útiles para convertir los profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que escinden carbohidratos tales como pgalactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; plactamasa, que es útil para convertir fármacos derivatizados con p-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas pueden unirse covalentemente a anticuerpos por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Neuberger etal., Nature 312:604-608 (1984).
c) Carga de fármaco
La carga de fármaco se representa por p, el número promedio de restos de fármaco por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 restos de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una gama de restos de fármaco, de 1 a 20. El número promedio de restos de fármaco por anticuerpo en preparaciones de ADC procedentes de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en función de p. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de los ADC homogéneos donde p es un determinado valor de ADC con otras cargas de fármaco puede lograrse por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis.
Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión del anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión se realiza en un tiol de la cisteína, como en determinados ejemplos de realización anteriores, un anticuerpo puede tener únicamente uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede unirse un enlazador. En ciertas realizaciones, una mayor carga de fármaco, por ejemplo, p > 5, puede provocar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados de anticuerpo-fármaco. En ciertas realizaciones, la carga de fármaco promedio de un ADC varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. De hecho, se ha comprobado que, para determinados ADC, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor de 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 (documento US 7498298).
En ciertas realizaciones, se conjugan menos del máximo teórico de restos de fármaco con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con el intermedio de fármaco-enlazador o el reactivo enlazador, como se analiza a continuación. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que se puedan unir a un resto de fármaco; de hecho, la mayoría de los restos tiol de las cisteínas en los anticuerpos se encuentran en forma de puentes disulfuro. En ciertas realizaciones, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones reductoras parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteínas reactivos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de varias maneras diferentes, y por ejemplo, mediante: (i) limitar el exceso molar del intermedio fármaco-enlazador o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación, y (iii) limitar o reducir parcialmente las condiciones reductoras para la modificación del tiol de la cisteína.
Debe entenderse que cuando más de un grupo nucleofílico reacciona con un intermedio de fármaco-enlazador o un reactivo enlazador, a continuación, el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA doble, que es específico del anticuerpo y específico del fármaco. Las moléculas ADC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante espectroscopía de masas y separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba (véanse, por ejemplo, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Resumen N.° 624, American Association for Cancer Research, Reunión Anual de 2004, 27­ 31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Resumen N.° 627, American Association for Cáncer Research, Reunión Anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004). En ciertas realizaciones, se puede aislar un ADC homogéneo con un único valor de carga de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
d) Algunos métodos para preparar inmunoconjugados
Se puede preparar un ADC de Fórmula I mediante varias rutas usando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en la materia, que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente para formar Ab-L a través de un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguida de la reacción con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. Se describen ejemplos de métodos para preparar un ADC de Fórmula I según la última ruta en el documento US 7498298.
Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitación: (i) grupos amino en el extremo N, (ii) grupos amino en la cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol en la cadena lateral, por ejemplo cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en los que el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos de restos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, esteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; y (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden volverse reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP), de tal manera que el anticuerpo está completa o parcialmente reducido. Por tanto, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos mediante la modificación de restos de lisina, por ejemplo, haciendo reaccionar restos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos también se pueden introducir en un anticuerpo introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más restos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos variantes que comprenden uno o más restos de aminoácido de cisteína no naturales).
Los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse mediante reacción entre un grupo electrófilo de un anticuerpo, tal como un grupo carbonilo de aldehído o cetona, con un grupo nucleófilo de un reactivo o fármaco enlazador. Los grupos nucleófilos útiles de un reactivo enlazador incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida. Se puede modificar un anticuerpo para introducir restos electrófilos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos del reactivo o fármaco enlazador. Los azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o restos de fármacos. Las iminas resultantes, como bases de Schiff, pueden formar un enlace estable, o se pueden reducir, por ejemplo, mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. La reacción entre la porción de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado tanto con galactosa oxidasa como con meta-peryodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en el anticuerpo que pueden reaccionar con los grupos adecuados del fármaco drug (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Los anticuerpos que contienen restos serina o treonina en el extremo N pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; documento US 5362852). Dicho aldehído puede hacer reaccionar con un resto de fármaco o enlazador nucleófilo.
Los grupos nucleófilos ilustrativos de un resto de fármaco incluyen, pero sin limitación: amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y grupos arilhidrazida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, esteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida.
Los reactivos reticulantes ilustrativos no limitantes que se pueden usar para preparar ADC se describen en el presente documento en la sección titulada "Enlazadores ilustrativos". Se conocen en la técnica los métodos para utilizar reactivos reticulantes para enlazar dos restos, incluyendo un resto proteico y un resto químico. Se puede preparar una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y un agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis peptídica. Una molécula de ADN recombinante puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y porciones citotóxicas del conjugado tanto adyacentes entre sí como separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
Un anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su uso en el predireccionamiento de tumores en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente clarificador y después la administración de un “ligando" (por ejemplo avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).
E. Trastuzumab-MCC-DMI y Pertuzumab
Trastuzumab-MCC-DMl (T-DM1)
La presente invención incluye inmunoconjugados para usar en tratamientos terapéuticos con trastuzumab-MCC-DMI (T-DM1, denominado también trastuzumab emtansina), un conjugado de anticuerpo fármaco (N.° de Registro CAS 139504-50-0), que tiene la estructura:
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donde Tr es trastuzumab unido a través del resto enlazador MCC al resto DM1 del fármaco maitansinoide (documentos US 5208020; US 6441163). La relación fármaco a anticuerpo o la carga del fármaco se representa por p en la anterior estructura de trastuzumab-MCC-DM1, y está comprendida en valores enteros de 1 a aproximadamente 8. Trastuzumab-MCC-DM1 incluye todas las mezclas de conjugados de anticuerpo-fármaco de diversas cargas y conjugados de anticuerpo-fármaco unidos donde 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 restos de fármaco están covalentemente unidos al anticuerpo trastuzumab (documentos US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
Trastuzumab se puede producir mediante un cultivo en suspensión de células de mamífero (ovario de hámster chino, CHO). El protooncogén HER2 (o c-erbB2) codifica una proteína de un receptor transmembrana de 185 kDa, que está estructuralmente relacionada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Trastuzumab es un anticuerpo que tiene restos de unión a antígeno de, o derivados de, el anticuerpo 4D5 de murino (ATCC CRL 10463, depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 según el Tratado de Budapest, el 24 de mayo de 1990). Los anticuerpos 4D5 humanizados ilustrativos incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (trastuzumab, HERCEPTIN®) como en el documento US 5821337. En algunas realizaciones, la porción de anticuerpo de T-DM1 comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y cadena pesada que se muestran en el SEQ ID NO: 30 y el SEQ ID NO: 29, respectivamente.
Se puede preparar trastuzumab-MCC-DM de acuerdo con el Ejemplo 1 de la solicitud de Estados Unidos con n.° de publicación 20110165155, por ejemplo.
Como regla general, la cantidad farmacéuticamente eficaz inicial de trastuzumab-MCC-DM1 administrada por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0,3 a 15 mg/kg/día de peso corporal del paciente.
Una formulación comercial de T-DM1 (KADCYLA®, es un polvo liofilizado estéril de color blanquecino a blanco exento de conservantes en viales de un solo uso. Cada vial contiene 100 mg o 160 mg de adotrastuzumab emtansina. Tras la reconstitución, cada vial de un solo uso contiene adotrastuzumab emtansina (20 mg/ml), polisorbato 20 [0,02 % (p/v)], succinato de sodio (10 mM) y sacarosa [6 % (p/v)] con un pH de 5,0 y una densidad de 1,026 g/ml. La solución resultante que contiene 20 mg/ml de adotrastuzumab emtansina se administra mediante infusión intravenosa tras dilución. En algunas realizaciones, adotrastuzumab emtansina se administra a una dosis de 3,6 mg/kg cada tres semanas. En algunas realizaciones, adotrastuzumab emtansina se administra a una dosis de 2,4 mg/kg cada semana. Composiciones de pertuzumab
La composición de pertuzumab comprende una mezcla de una especie principal del anticuerpo pertuzumab, como se ha definido anteriormente en el presente documento, y una o más variantes del mismo. La realización preferida del presente documento de un anticuerpo de una especie principal de pertuzumab es una que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del SEQ ID NO:32, y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del SEQ ID NO: 31 (incluyendo variantes desamidadas y/u oxidadas de dichas secuencias). La composición puede comprender una mezcla del anticuerpo de la especie principal de pertuzumab y una secuencia de aminoácidos variante del mismo que comprende una extensión líder en el extremo amino, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del SEQ ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del SEQ ID NO: 33. Preferentemente, la extensión líder del extremo amino está en una cadena ligera de la variante de anticuerpo (por ejemplo, en una o dos cadenas ligeras de la variante de anticuerpo). El anticuerpo HER2 de la especie principal o la variante del anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos Fab de F(ab')2, pero preferentemente ambos son anticuerpos de longitud completa. La variante de anticuerpo del presente documento puede comprender una extensión líder en el extremo amino en una cualquiera o más de las cadenas pesadas o ligeras de la misma. Preferentemente, la extensión líder del extremo amino se encuentra en una o dos cadenas ligeras del anticuerpo. La extensión líder del extremo amino comprende o consiste preferentemente en VHS. La presencia de la extensión líder del extremo amino en la composición puede detectarse mediante diversas técnicas analíticas que incluyen, aunque no de forma limitativa, el análisis de la secuencia del extremo N, ensayo para heterogeneidad de carga (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o electroforesis de zona capilar), espectrometría de masas, etc. La cantidad de la variante de anticuerpo en la composición varía generalmente entre una cantidad que constituye el límite de detección de cualquier ensayo (preferentemente el análisis de la secuencia del extremo amino) usado para detectar la variante hasta una cantidad menor que la cantidad del anticuerpo de la especie principal. En general, aproximadamente 20 % o menos (por ejemplo de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, por ejemplo, de 5 % a aproximadamente 15 %) de las moléculas de anticuerpo en la composición comprende una extensión líder en el extremo amino. Dichas cantidades porcentuales se determinan preferentemente usando el análisis cuantitativo de la secuencia del extremo N o el análisis del intercambio de cationes (usando preferentemente una columna de intercambio de cationes débiles de alta resolución, tal como una columna de intercambio catiónico PROPAC WCX-10™). Aparte de la variante de extensión del extremo amino, se contemplan otras alteraciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo y/o variante de la especie principal, incluyendo, aunque no de forma limitativa un anticuerpo que comprende un resto de lisina en el extremo C en una o ambas cadenas del mismo, una variante de anticuerpo desamidado, etc.
Además, el anticuerpo de la especie principal o variante puede comprender además variaciones de glucosilación, cuyos ejemplos no limitativos incluyen anticuerpo que comprende una estructura de oligosacárido G1 o G2 unida con la región Fc del mismo, un anticuerpo que comprende un resto carbohidrato unido a la cadena ligera del mismo (por ejemplo uno o dos restos de carbohidrato, tales como glucosa o galactosa, unidos a una o dos cadenas ligeras del anticuerpo, por ejemplo unidos a uno o más restos de lisina), un anticuerpo que comprende una o dos cadenas pesadas no glucosiladas, o un anticuerpo que comprende un oligosacárido sialidado unido a una o dos cadenas pesadas del mismo, etc.
La composición puede recuperarse de una línea celular modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresa el anticuerpo HER2, o puede prepararse mediante síntesis peptídica.
Para más información con respecto a las composiciones de pertuzumab ilustrativas, véanse las patentes de Estados Unidos números 7.560.111 y 7.879.325 así como el documento US 2009/0202546A1.
Una formulación comercial de pertuzumab (PERJETA®) contiene pertuzumab 420 mg/14 ml (30 mg/ml) en forma de una solución exenta de conservante para infusión IV. En algunas realizaciones, la terapia con pertuzumab comprende la administración de una dosis inicial de carga de 840 mg, seguido por la administración de una dosis de mantenimiento uniforme de 420 mg cada tres semanas.
F. Métodos y composiciones para diagnósticos y detección
En ciertas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-HER2 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de HER2 en una muestra biológica. El término "detectar", como se utiliza en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Una "muestra biológica" comprende, por ejemplo, una célula o tejido (por ejemplo, material de biopsia, incluyendo tejido de mama canceroso o potencialmente canceroso).
Se proporciona un anticuerpo anti-HER2 para usar en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de HER2 humano en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-HER2 como se describe en el presente documento en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-HER2 a un HER2 humano de origen natural, y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo anti-HER2 y un HER2 humano de origen natural en la muestra biológica. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se usa un anticuerpo anti-HER2 para seleccionar sujetos candidatos para terapia con un anticuerpo anti-HER2, por ejemplo, donde HER2 es un biomarcador para la selección de pacientes. En una realización adicional, la muestra biológica es una célula o tejido.
En una realización adicional, se usa un anticuerpo anti-HER2 in vivo para detectar, por ejemplo, mediante obtención de imágenes in vivo, un cáncer positivo para HER2 en un sujeto, por ejemplo, con fines de diagnóstico, pronóstico o estadificación del cáncer, para determinar el curso apropiado de la terapia, o seguir la respuesta del cáncer a la terapia. Un método conocido en la técnica para la detección in vivo es la tomografía por emisión de inmunopositrones (inmuno-PET), como se describe, por ejemplo, en van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) y en Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003). En dichas realizaciones, se proporciona un método para detectar un cáncer positivo para HER2 en un sujeto, comprendiendo el método administrar un anticuerpo anti-HER2 marcado a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cáncer positivo para HER2, y detectar el anticuerpo anti-HER2 marcado en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo anti-HER2 marcado indica un cáncer positivo para HER2 en el sujeto. En determinadas de estas realizaciones, el anticuerpo anti-HER2 marcado comprende un anticuerpo anti-HER2 conjugado con un emisor de positrones, tal como 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr e 124I. En una realización particular, el emisor de positrones es 89Zr.
Un método de diagnóstico o detección puede comprender poner en contacto un primer anticuerpo anti-HER2 inmovilizado a un sustrato con una muestra biológica a ensayar para determinar la presencia de HER2, exponer el sustrato a un segundo anticuerpo anti-HER2, y detectar si el segundo anti-HER2 se ha unido a un complejo entre el primer anticuerpo anti-HER2 y HER2 en la muestra biológica. Un sustrato puede ser cualquier medio de soporte, por ejemplo, vidrio, metal, cerámica, perlas poliméricas, portaobjetos, chips, y otros sustrato. Una muestra biológica puede comprender una célula o un tejido. El primer o segundo anticuerpo anti-HER2 puede ser cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.
Los trastornos ilustrativos que se pueden diagnosticar o detectar de acuerdo con cualquiera de las anteriores realizaciones incluyen cánceres positivos para HER2, tales como cáncer de mama positivo para HER2 y cáncer gástrico positivo para HER2. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2tiene una puntuación inmunohistoquímica (IHC) de 2+ o 3+ y/o una relación de amplificación de la hibridación in situ (ISH) >2,0.
En ciertas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-HER2 marcados. Los marcadores incluyen, pero sin limitación, las marcas o restos que se detectan directamente (tal como marcas fluorescentes, cromofóricas, densas en electrones, quimioluminiscentes y radioactivas), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de los Estados Unidos n.° 4.737.456), 2,3-dihidroftalacinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares. En otra realización, un marcador es un emisor de positrones. Los emisores de positrones incluyen, entre otros, 68G, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr e 124I. En una realización particular, un emisor de positrones es 89Zr.
G. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables normalmente son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación: tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas;
polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como polietilenglicol (PEG). Los transportadores farmacéuticamente aceptables de ejemplo en el presente documento incluyen además agentes para la dispersión intersticial de fármacos tales como las glucoproteínas de hialuronidasa neutras-activas (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertos sHASEGP de ejemplo y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las patentes de Estados Unidos con n.° de publicación 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.
Las formulaciones de anticuerpos o inmunoconjugados liofilizados ilustrativas se describen en la patente de Estados Unidos n.° 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpos o inmunoconjugados incluyen las descritas en la patente de los Estados Unidos n.° 6.171.586 y el documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.
La formulación del presente documento puede contener también más de un principio activo necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí.
Los principios activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se han descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo o el inmunoconjugado, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, generalmente, estériles. Puede lograrse fácilmente la esterilidad, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
H. Métodos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-HER2 proporcionados en el presente documento se pueden usar en los métodos, por ejemplo, métodos terapéuticos.
Se describe en el presente documento un anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 proporcionado en el presente documento que se usa en un método para inhibir la proliferación de una célula positiva para HER2, comprendiendo el método exponer la célula al anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 en condiciones que permiten la unión del anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 a HER2 sobre la superficie de la célula, inhibiendo de esta forma la proliferación de la célula. El método puede ser un método in vitro o un método in vivo. La célula puede ser una célula de cáncer de mama o una célula de cáncer gástrico.
Se puede evaluar la inhibición de la proliferación celular in vitro usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, que está comercializado por Promega (Madison, WI). Este ensayo determina el número de células viables en un cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, que es un indicador de células metabólicamente activas. Véase Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, patente de Estados Unidos n.° 6602677. El ensayo puede llevarse a cabo en un formato de 96 o 384 pocillos, haciéndolo apto para un cribado automatizado de alto rendimiento (HTS). Véase Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo implica añadir un único reactivo (CellTiter-Glo® Reagent) directamente a células cultivadas. Esto da como resultado la lisis celular y la generación de una señal luminiscente producida por la reacción de la luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Se pueden registrar los datos mediante un luminómetro o un dispositivo de formación de imágenes de una cámara CCD. La salida de la luminiscencia se expresa como unidades de luz relativa (ULR).
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 para usar como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2 para usar en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, se proporciona un inmunoconjugado, como se define en las reivindicaciones, para usar en el tratamiento del cáncer positivo para HER2. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un inmunoconjugado, como se define en las reivindicaciones, para usar en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer positivo para HER2, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado anti-HER2. En una de dichas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Un cáncer positivo para HER2 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser, por ejemplo, cáncer de mama positivo para HER2 o cáncer gástrico positivo para HER2. En algunas realizaciones, el cáncer positivo para HER2tiene una puntuación inmunohistoquímica (IHC) de 2+ o 3+ y/o una relación de amplificación de la hibridación in situ (ISH) >2,0.
Un "individuo", "paciente", o "sujeto" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
También se proporcionan formulaciones que comprenden cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-HER2 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para usar en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. Una formulación farmacéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-HER2 proporcionados en el presente documento y un transportador farmacéuticamente aceptable. Una formulación farmacéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o inmunoconjugados anti-HER2 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se pueden utilizar tanto solos como combinados con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC)) puede administrarse simultáneamente con al menos un agente terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es también un anticuerpo o inmunoconjugado que se une a HER2. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio II de HER2, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al dominio IV de HER2. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es (i) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 2C4, y/o (ii) un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al epítopo 4D5.
En algunas realizaciones, un conjugado de anticuerpo-fármaco hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC) se administra simultáneamente con uno o más agentes terapéuticos adicionales seleccionados entre trastuzumab (Herceptin®), T-DM1 (Kadcyla®) y pertuzumab (Perjeta®). En algunas realizaciones, un hu7C2 ADC se administra simultáneamente con trastuzumab. En algunas realizaciones, un hu7C2 ADC se administra simultáneamente con T-DM1. En algunas realizaciones, un hu7C2 ADC se administra simultáneamente con pertuzumab. En algunas realizaciones, un hu7C2 ADC se administra simultáneamente con trastuzumab y pertuzumab. En algunas realizaciones, un hu7C2 ADC se administra simultáneamente con T-DM1 y pertuzumab.
Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede producirse antes de, de manera simultánea y/o después de, la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional. Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención también se pueden utilizar combinados con radioterapia.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para un tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es corta o crónica. Se contemplan en el presente documento diversas pautas de dosificación que incluyen, aunque de forma no limitativa, administraciones individuales o múltiples en diferentes momentos puntuales, administración en bolo, e infusión pulsada.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención podrían formularse, dosificarse y administrarse de una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el mamífero particular que se va a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio donde se suministra el agente, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios. No es necesario formular el anticuerpo o inmunoconjugado con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, sino que esto es opcional. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconjugado presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan generalmente con las mismas dosis y vías de administración como las descritas en el presente documento o aproximadamente de 1 al 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente como adecuada.
Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (cuando se utiliza solo o combinado con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, del tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo o inmunoconjugado se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y el criterio del médico responsable del tratamiento. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra de manera adecuada al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo o inmunoconjugado puede ser una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica estará en el intervalo de aproximadamente 1 jg /g a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la dolencia, el tratamiento será generalmente sostenido hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ilustrativa del anticuerpo o inmunoconjugado estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al paciente. Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga inicial superior, seguida de una o más dosis inferiores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las anteriores formulaciones o métodos terapéuticos puede llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención y un anticuerpo anti-HER2.
I. A rtícu los de fabricación
Se describen en el presente documento artículos de fabricación, o "kits", que contienen un conjugado de anticuerpofármaco hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC) y trastuzumab-MCC-DMI y/o pertuzumab útiles para los métodos de tratamiento. El kit puede comprender un envase que comprende un hu7C2 ADC. El kit puede comprender además un envase que comprende trastuzumab-MCC-DM1. El kit puede comprender además un envase que comprende pertuzumab. Un kit puede comprender además un envase que comprende trastuzumab-MCC-DMI y un envase que comprende pertuzumab. El kit puede comprender dos o más de hu7C2 ADC, trastuzumab-MCC-DMl y pertuzumab en el mismo envase. El kit puede comprender además una etiqueta o prospecto, en o asociado con el envase. El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, envases blíster, etc. Los envases pueden conformarse a partir de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase puede contener hu7C2 ADC y, opcionalmente, trastuzumab-MCC-DMl y/o pertuzumab o una formulación de los mismos que sea eficaz para usar en un método de tratamiento del presente documento, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa o de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa en un método de tratamiento como se describe y reivindica en el presente documento. El artículo de fabricación puede también contener un envase adicional que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
El kit puede comprender además directrices para administrar hu7C2 ADC y, opcionalmente, trastuzumab-MCC-DMI y/o pertuzumab. Por ejemplo, si el kit comprende una primera composición que comprende hu7C2 ADC y una segunda formulación farmacéutica, el kit puede comprender además directrices para la administración simultánea, secuencial o separada de la primera y segunda composiciones farmacéuticas a un paciente que lo necesita.
Los kits pueden ser adecuados para la administración de formas orales sólidas de hu7C2 ADC y, opcionalmente, trastuzumab-MCC-DMI y/o pertuzumab, tales como comprimidos o cápsulas. Dicho kit incluye preferentemente varias dosificaciones unitarias. Dichos kits pueden incluir una ficha que tiene las dosificaciones orientadas en el orden de su uso previsto. Un ejemplo de dicho kit es un "envase de tipo blíster". Los envases de tipo blíster son bien conocidos en la industria del envasado y se usan ampliamente para el envasado de formas farmacéuticas unitarias. Si se desea, se puede proporcionar un recordatorio, por ejemplo, en la forma de números, letras u otros marcadores o con un calendario inserto, que designa los días del calendario de tratamiento en los que se han de administrar las dosis.
Un kit puede comprender (a) un primer envase con hu7C2 ADC y, opcionalmente, (b) un segundo envase con trastuzumab-MCC-DMI contenido en su interior y/o con pertuzumab contenido en su interior. En algunas realizaciones, un kit puede comprender (a) un primer envase con hu7C2 ADC, (b) un segundo envase con trastuzumab-MCC-DM1 contenido en su interior, y(c) un tercer envase con pertuzumab contenido en su interior. El kit puede comprender además un envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Cuando el kit comprende una composición de hu7C2 ADC y trastuzumab-MCC-DMI y/o pertuzumab, el kit puede comprender un envase para contener las composiciones separadas tales como un frasco dividido o un envase con láminas de aluminio dividido, sin embargo, las composiciones separadas también pueden estar contenidas en un único envase sin dividir. Normalmente, el kit comprende directrices para administrar los componentes separados. La forma de kit es especialmente ventajosa cuando se administran preferentemente los componentes separados en formas farmacéuticas diferentes (por ejemplo, oral y parenteral), se administran en diferentes intervalos de dosificación, o cuando se desea la valoración de los componentes individuales de la combinación por el médico a cargo del tratamiento.
Un artículo de fabricación del presente documento puede comprender una bolsa intravenosa (IV) que contiene una mezcla estable de un hu7C2 ADC y pertuzumab y/o T-DM1 adecuados para la administración a un paciente con cáncer. Opcionalmente, la mezcla está en suero salino; comprendiendo por ejemplo NaCI aproximadamente al 0,9 % o NaCI aproximadamente al 0,45 %. Una bolsa IV ilustrativa es una bolsa de infusión de poliolefina o cloruro de polivinilo, por ejemplo una bolsa IV de 250 ml. La mezcla puede incluir aproximadamente 420 mg o aproximadamente 840 mg de pertuzumab y de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 160 mg de T-DM1.
Opcionalmente, la mezcla en la bolsa IV es estable durante hasta 24 horas a 5 °C o 30 °C. Se puede evaluar la estabilidad de la mezcla mediante uno o más ensayos seleccionados entre el grupo que consiste en: color, aspecto y transparencia (CAC), análisis de concentración y turbidez, análisis de partículas, cromatografía de exclusión molecular (SEC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), electroforesis en zona capilar (CZE), isoelectroenfoque capilar fotografiado (iCIEF) y ensayo de potencia.
III. Ejemplos
A continuación se encuentran ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica varias realizaciones diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1: Humanización de anticuerpo de murino 7C2
El anticuerpo de murino 7C2 anti-HER2 se une a un epítopo en el dominio I de HER2. Véase, por ejemplo, Publicación PCT n.° WO 98/17797. Este epítopo es distinto de epítopo al que se une trastuzumab, que se une al dominio IV de HER2, y el epítopo al que se une pertuzumab, que se une al dominio II de HER2. Véanse las Figuras 3, 16 y 18. Mediante la unión del dominio IV, trastuzumab altera los complejos HER2-HER3 independientes de ligando, inhibiendo de este modo la señalización en la dirección 3' (por ejemplo, PI3K/AKT). Por el contrario, la unión de pertuzumab al dominio II evita la interacción de HER2 activada por ligando con otros miembros de la familia HER (por ejemplo, HER3, HERI o HER4), evitando también por tanto la transducción de la señal en la dirección 3'. La unión del MAb 7C2 al dominio I no da como resultado la interferencia de la unión de trastuzumab o pertuzumab a los dominios IV y II, respectivamente, ofreciendo por tanto el potencial de combinar un MAb 7C2 ADC con trastuzumab, trastuzumab emtansina (T-DM-1) y/o pertuzumab.
El anticuerpo de murino 7C2 (7C2.B9, véase la publicación PCT n.° WO 98/17797) se humanizó de la siguiente manera.
A. Materiales y métodos
La numeración de los restos es según Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Injertos directos de la región hipervariable sobre el marco de consenso humano aceptor. Se evaluaron las variantes construidas durante la humanización de 7C2 en la forma de una IgG. Los dominios VL y VH de 7C2 de murino se alinearon con la VL humana kappa IV (VLkiv) y las secuencias de consenso del subgrupo I de VH humano (VHi). Se diseñaron mediante ingeniería genética las regiones hipervariables (HVR) del 7C2 del anticuerpo murino (7C2.B9) en los marcos aceptores de VLkiv y VHi para generar variantes de injertos de CDR. A partir del dominio mu7C2 VL, las posiciones 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) se injertaron en v Lki. A partir del dominio mu7C2 VH, las posiciones 26-35 (HI), 50-65 (H2) y 95-102 (h 3) se injertaron en VH i (Figuras 1 y 2). Las definiciones de las HVR se han definido por su hipervariabilidad de secuencia (Wu, T. T. y Kabat, E. A. (1970)), su localización estructural (Chothia, C. y Lesk, A. M. (1987)) y su implicación en los contactos antígeno-anticuerpo (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). Para evaluar las posiciones del nonio del marco que pudieran ser importantes, las posiciones del nonio seleccionadas se retromutaron a la secuencia de murino. Las posiciones del nonio incluyen las posiciones 4 y 49 en VL y las posiciones 37, 67, 69, 71 y 73 en VH. Se sintetizaron tres versiones diferentes de secuencias VL y secuencias VH (Blue Heron, Bothell, WA) y posteriormente se subclonaron en vectores de expresión mamíferos. Combinando las versiones diferentes de LC con HC, se generaron un total un total nueve variantes de injerto hu7C2 diferentes (v1.1, v1.2, v1.3, v2.1, v2.2, v2.3, v3.1, v3.2 y v3.3).
Biblioteca de maduración por afinidad. Se usó un vector de expresión fagémido Fab-g3 monovalente con 2 marcos de lectura abiertos bajo el control de un único promotor de phoA. El primer marco de lectura abierto consiste en una secuencia de señalización stII fusionada a los dominios VL y CH1 de la cadena ligera del aceptor y el segundo consiste en la secuencia de señalización stII fusionada a los dominios VH y CH1 de la cadena pesada del aceptor seguido por la proteína de revestimiento P3 del fago menor. Se generó la variante de injerto de HVR (7C2.v2.1) mediante mutagénesis de Kunkel usando oligonucleótidos diferentes para cada región hipervariable y se expresó en fago como un Fab.
Para mejorar la afinidad, se generaron bibliotecas de fagos que contenían cambios en cada región hipervariable. Se introdujo diversidad de secuencias por separado en cada posición en las regiones hipervariables de 7C2.v2.1 usando mutagénesis de Kunkel. Se aleatorizaron completamente cada una de las posiciones en la región hipervariable de 7C2.v2.1 una de cada vez momento a la totalidad de los posibles 20 aminoácidos usando oligonucleótidos que codificaban NNS. Se prepararon un total de 6 8 bibliotecas, consistiendo cada una en 20 miembros, que tenían una única posición localizada en una de las regiones hipervariables de 7C2 completamente aleatorizada. Las bibliotecas con posiciones en la misma región hipervariable se combinaron para generar un total de seis bibliotecas.
Generación de bibliotecas de fagos. Los oligonucleótidos diseñados para introducir diversidad en cada región hipervariable como se ha reseñado anteriormente se fosforilaron por separado en reacciones de 2 0 |jl que contenían 6 6 0 ng de oligonucleótidos, Tris 50 mM pH 7,5, MgCl210 mM, At P 1 mM, DTT 20 mM, y 5 U de polinucleótido quinasa durante 1 h a 37°C.
Para generar la biblioteca de maduración por afinidad, se llevaron a cabo 68 reacciones de mutagénesis de Kunkel individuales en una placa de PCR de 96 pocillos. A partir de las reacciones de oligonucleótidos fosforilados (arriba), se añadieron 2 j l a 500 ng de molde de Kunkel en Tris 50 mM pH 7,5, MgCh 10 mM en un volumen final de 25 |jl. La mezcla se hibridó a 90°C durante 1 min, 50 °C durante 3 min y a continuación se enfrió en hielo. El molde hibridado se rellenó a continuación añadiendo 0,5 j l de ATP 10 mM, 0,5 j l de dNTP 10 mM (10 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 j l de DTT 100 mM, 1 j l de tampón TM 10X (Tris 0,5 M pH 7,5, MgCh 0,1 M), 80 U de ligasa T4, y 4 U de polimerasa T7 en un volumen total de 30 j l durante 2 h a temperatura ambiente. Cada uno de estos productos rellenados y ligados se transformaron a continuación en células XL1-blue. Las bibliotecas que contenían posiciones en la misma región CDR se combinaron y recuperaron en 10 ml de medio SOC durante 1 hora a 37 °C. Se añadieron carbenacilina (50 jg/m l) y fago auxiliar M13/KO7 (MOI 10). Los cultivos se incubaron los cultivos durante otros 30 min a 37 °C y se transfirieron a 500 ml de 2YT que contenía 50 jg/m l de carbenacilina y 50 jg/m l de kanamicina y se hicieron crecer 20 h a 37 °C.
Selecciones de fagos. Se biotiniló el dominio extracelular de Her2 (Her2 ECD) mediante las aminas libres usando NHS-PEG4-Biotina (Pierce). Para las reacciones de biotinilación, se usó un exceso molar de 4 veces de reactivo de biotina en PBS. Se continuaron las reacciones mediante diálisis en PBS.
Se recogieron los fagos del sobrenadante del cultivo celular y se suspendieron en Pbs que contenía BSA al 1 %. Las bibliotecas de fagos se incubaron con Her2 ECD biotinilado a temperatura ambiente y a continuación se capturó el fago unido a biotina-Her2 durante 5 min en neutrAvidin (10 jg/m l) que se había inmovilizado en PBS en placas de microvaloración MaxiSorp (Nunc) durante la noche a 4 °C. Los pocillos de microvaloración se lavaron ampliamente con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBST) y los fagos unidos se eluyeron incubando los pocillos con HCl 20 mM, KCl 500 mM durante 30 min. Los fagos eluidos se neutralizaron con Tris 1 M, pH 7,5 y se amplificaron usando células XL1-Blue y el fago auxiliar M13/KO7 y se hicieron crecer durante la noche a 37 °C en 2YT, 50 jg/m l de carbenacilina y 50 jg/m l de kanamicina. Los títulos del fago eluido a partir de un pocillo que contenía la diana se compararon con los títulos del fago recuperado a partir de un pocillo que no contenía diana para evaluar el enriquecimiento. Se aumento la rigurosidad de la selección disminuyendo la concentración de1Her2 ECD biotinilado (desde 5 nM a 0,2 nM) durante la unión y aumentando el tiempo de competición (de 0 a 60 min a temperatura ambiente) con 1 jM de Her2 ECD sin marcar en solución.
Evaluación de variantes mediante resonancia de plasmón superficial. Se expresaron variantes 7C2 como IgG mediante 293 transfecciones transitorias. Se purificó IgG con cromatografía de afinidad de proteína G. Se determinó la afinidad de cada variante de IgG 7C2 para Her2 mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcoreT100. Se inmovilizaron chips detectores CM5 de la serie Biacore con anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IgG humana (Fc) (kit de captura de anticuerpo humano, GE Healthcare). Se inyectaron diluciones seriadas de factor 3 de cada variante 7C2 a un caudal de 30 jl/min. Se analizó cada muestra con una asociación de 3 minutos y una disociación de 10 minutos. Después de cada inyección, el chip se regeneró con MgCI2 3 M. Se corrigió la respuesta de unión sustrayendo las UR de una celda de flujo capturando una IgG irrelevante a una densidad similar. Se usó un modelo de Languir 1:1 con ajuste simultáneo de kon y koff para el análisis de la cinética.
B. Resultados y discusión
Humanización de 7C2. Los marcos aceptores humanos usados para la humanización de 7C2 se basan en el consenso de VL kappa IV humano (VLkiv) y el consenso de VH i humano. Los dominios VL y VH de 7C2 murino se alinearon con los dominios VLkiv y VH i humanos; se identificaron las regiones hipervariables y se injertaron en el marco aceptor humano para generar 7C2.v1.1. Se disminuyó la afinidad monovalente de 7C2.v1.1 2,5 veces con respecto a mu7C2.B9 como se evaluó mediante SPR (véase la Tabla 2).
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Para mejorar la afinidad de unión de 7C2.v1.1, las posiciones 4 y 49 de la cadena ligera y las posiciones 37, 67, 69, 71 y 73 de la cadena pesada se cambiaron por los restos que se encuentran en estas posiciones en mu7C2.B9. Las combinaciones de estas cadenas ligera y pesada alteradas con las cadenas de 7C2.v1.1 se transfectaron a células 293, se expresaron como IgG y se purificaron, y se evaluaron según la unión a Her2 ECD mediante SPR (véase la Tabla 2). La variante 7C2.v3.3, que contiene 2 posiciones alteradas en la cadena ligera y 5 posiciones alteradas en la cadena pesada, tenía una afinidad monovalente comparable a mu7C2.B9 quimérica (véase la Tabla 2).
Se exploraron las bibliotecas de maduración por afinidad en un intento para conseguir mejoras adicionales usando el marco de 7C2.v2.1, que contiene una posición nonio con una mínima alteración (Y49K) en la cadena ligera. Para cada región hipervariable, los 20 aminoácidos se introdujeron por separado en una posición individual usando mutagénesis de Kunkel (un total de 68 bibliotecas, conteniendo cada una 20 miembros, combinados en seis bibliotecas de maduración por afinidad). Las seis bibliotecas de maduración por afinidad se seleccionaron mediante desplazamiento lateral durante 4 ciclos en solución con Her2 ECD biotinilado. Se aumento gradualmente la rigurosidad de la selección disminuyendo la concentración de biotina-Her2 ECD (desde 5 a 0,2 nM) y aumentando el tiempo de competición (de 0 a 1 hora a temperatura ambiente) con una cantidad saturada de Her2 ECD sin marcar. Se observó un enriquecimiento del fago de dos mil veces para la biblioteca H2.
Se repicaron un total de 588 clones procedentes de la última ronda para el análisis de la secuencia de ADN. Se identificaron los cambios individuales en la secuencia para cada HVR (véase la Tabla 3). Los clones más abundantes tuvieron cambios en VH en la posición 53to a Met o Leu. Las variantes S53M y S53L se expresaron como IgG y el análisis SPR indica que S53M y S53L tienen una afinidad comparable a Her2. La variante S53l se seleccionó porque la metionina es propensa a la oxidación durante el proceso de fabricación. Se eliminó un potencial sitio formador de ácido isoaspártico en HVR-H2 con una mutación S55A (véase la Tabla 4).
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Tabla 4: Resumen de afinidades de la variante hu7C2
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En las Figuras 1 y 2 se muestra un alineamiento entre los dominios VLkiv y VH i y las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de mu7C2.B9 ("7C2") y hu7C2.v2.2.LA (denominados en los siguientes ejemplos como "hu7C2").
Ejemplo 2: Producción de conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2
Para la producción de anticuerpos a mayor escala, los anticuerpos se produjeron en células CHO. Los vectores que codificaban la cadena pesada y la cadena ligera se transfectaron en células CHO y la IgG se purificó a partir del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
A. Síntesis del intermedio del fármaco enlazador amida PNU de disulfuro de piridilo
El intermedio de fármaco enlazador de amida de disulfuro de piridilo PNU ((2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metil-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-octahidro-1H-pirano[1,2]oxazolo[3,4-b][1,4]oxazin-3-il]oxi]-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-6,11-dioxo-N-[2-(2-piridildisulfanil)etil]-3,4-dihidro-1H-tetracen-2-carboxamida; "LD-51") que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000089_0001
se sintetizó como sigue a continuación. Siguiendo el ejemplo 3 del documento US 8389697, a una solución de PNU-159682 (15,3 mg, 0,02038 mmol), preparada como se indica en el documento WO 1998/02446 y el ejemplo 1 del documento US 8470984, en 3 ml de metanol y 2 ml de H2O, se añadió una solución de NaIO4 (5,1 mg, 0,0238 mmol) en 1 ml de H2O. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, hasta que no se detectó material de partida (análisis por TLC y HPLC). Los disolventes se retiraron a presión reducida y el sólido de color rojo en bruto, ácido (2S,4S)-2,5,12-trihidroxi-7-metoxi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoxi-1-metiloctahidro-1H-pirano[4',3':4,5][1,3]oxazolo[2,3-c][1,4]oxazin-3-il]oxi}-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-2-carboxílico 51a se usó sin purificaciones adicionales en la siguiente etapa. EM (IEN): 628 [M+H]+.
Figure imgf000089_0002
A una solución del intermedio 51a en bruto en diclorometano anhidro en una atmósfera de argón, se le añadieron trietilamina anhidro, TBTU (tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N-tetrametiluronio, también denominado: tetrafluoroborato de N,N,N,N’-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio, n° de CAS 125700-67-6, Sigma-Aldrich B-2903), y N-hidroxisuccinimida para formar el intermedio NHS éster de 51a. Como alternativa, pueden usarse otros reactivos de acoplamiento, tales como DCC o EDC. Después de una hora, se añadió clorhidrato de 2-(piridin-2-ildisulfanil)etanamina (n.° CAS 106139-15-5). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min, hasta la desaparición del material de partida (análisis HPLC-EM). El disolvente se evaporó al vacío y después el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice, proporcionando LD-51. EM (IEN): 796,88 [M+H]+.
B. Síntesis de intermediarios de fármacos enlazadores CBI-PBD
El dímero CBI-PBD (profármaco de piperazin-carbamato)-2-propil piridil disulfuro enlazador-fármaco intermedio (3-[6-[1-(clorometil)-5-(4-metilpiperazin-1-carbonil)oxi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-oxo-hexoxi]-6-hidroxi-2-metoxi-11-oxo-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-carboxilato de 2-(2-piridildisulfanil)propilo; compuesto 81 de la Tabla A) que tiene la fórmula:
Figure imgf000090_0001
y el dímero CBI-PBD (fosfato)-2-propil piridil disulfuro enlazador-fármaco intermedio (3-[6-[1-(clorometil)-5-fosfonooxi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-oxo-hexoxi]-6-hidroxi-2-metoxi-11-oxo-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-carboxilato de 2-(2-piridildisulfanil)propilo; compuesto 82 de la Tabla A) que tiene la fórmula:
Figure imgf000090_0002
se sintetizaron como sigue a continuación. Para el esquema de reacción, incluidas las fórmulas de reactivos e intermedios, véase las figuras 9 y 10. Esta síntesis también es adecuada para producir 3-[6-[1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-oxo-hexoxi]-6-hidroxi-2-metoxi-11-oxo-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-carboxilato de 2-(2-piridildisulfanil)propilo ("CBI-PBD-2-propil piridil disulfuro").
Una mezcla de 1 (1,40 g, 4,00 mmol, preparado siguiendo el procedimiento bibliográfico: J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151), 2 (1,31 g, 5,22 mmol, preparado siguiendo el procedimiento bibliográfico: WO2004065491 A1) y K2CO3 (829 mg, 6,00 mmol) en DMA seca (15 ml) se agitó a t.a. durante 43 h. Después, la mezcla se diluyó con EtOAc y H2O, se mezcló bien y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con H2O (3 x) y salmuera (1 x) y se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc:Hex 50:50 a 67:33 a 100:0 para dar el compuesto 3 (1,74 g, 84 %) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H 5 (400 MHz, CDCb) 8,77 (s a, 1H), 7,79 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,02-5,92 (m, 1H), 5,36 (dc, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,26 (dc, J = 10,4, 1,2 Hz, 1H), 4,69-4,60 (m, 2H), 4,47-4,39 (m, 1h), 4,28 (s a, 1H), 4,09-4,05 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,90-3,80 (m, 1H), 3,74-3,70 (m, 1H), 3,65-3,59 (m, 1H), 3,54-3,47 (m, 1H), 2,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,20­ 2,15 (m, 1H), 1,93-1,84 (m, 3H), 1,81-1,72 (m, 1H), 1,70-1,63 (m, 3h ), 1,53-1,47 (m, 2H), 1,44 (s, 9H). HRMS m/z 543,2666 [(M+Na)+ calc. para C27H4oN2NaO8543,2677].
Figure imgf000090_0003
Se añadió Et3N (1,32 ml, 9,47 mmol) a una solución de 3 (821 mg, 1,58 mmol) en DCM seco (6 ml) a t.a. Después, se añadió anhídrido acético (0,75 ml, 7,93 mmol) y la mezcla se agitó a t.a. durante 4,5 h. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió MeOH seco (1 ml) y la mezcla se agitó a 0 °C durante 15 min. Después se añadió EtOAc (120 ml) y la mezcla se lavó con H2O (2 x) y salmuera (1 x), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío para dar el compuesto 4 (891 mg, cuantitativo) el cual se usó en la siguiente etapa sin purificación. RMN 1H 5 (400 MHz, CDCb) 8,88 (s a, 1H), 7,82 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,01-5,91 (m, 1H), 5,36 (dc, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,25 (dc, J = 10,4, 1,3 Hz, 1H), 4,65-4,62 (m, 2h ), 4,61-4,54 (m, 1H), 4,32-4,22 (m, 2H), 4,09-4,06 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,55-3,47 (m, 2H), 2,26­ 2,23 (m, 2H), 2,18-2,12 (m, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,97-1,77 (m, 5H), 1,70-1,63 (m, 2H), 1,54-1,47 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).
HRMS m/z 585,2774 [(M+Na)+ calc. para C2gH42N2NaOg 585,2783].
Figure imgf000091_0001
Se añadió pirrolidona (1,6 ml, 19,2 mmol) a una solución de 4 (1,06 g, 1,88 mmol) en DCM seco (20 ml) a t.a. Después se añadió Pd(PPh3)4 (109 mg, 0,0943 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 40 min. La mezcla de reacción se lavó con una solución 0,25 M de HCl (2 x 75 ml), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc:Hex 50:50 a 100:0 para dar el compuesto 5 (726 mg, 81 %) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-cfe) 6,67 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,35-4,30 (m, 1H), 4,13-4,06 (m, 2H), 3,87 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,63 (s, 3H), 3,50-3,44 (m, 1H), 3,42-3,35 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,07-2,00 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,77-1,67 (m, 4H), 1,59-1,51 (m, 2H), 1,44-1,36 (m, 2H), 1,39 (s, 9H). HRMS m/z 501,2573 [(M+Na)+ calc. para C25H38N2NaOz 501,2571].
Figure imgf000091_0002
Se añadió difosgeno (0,22 ml, 1,82 mmol) a una mezcla de 5 (726 mg, 1,52 mmol) y DMAP (557 mg, 4,56 mmol) en DCM seco (25 ml) a t.a. en una atmósfera de nitrógeno. Después de 30 min se añadió una solución de 6 (2,60 g, 12,9 mmol; preparada recientemente mediante el procedimiento mencionado anteriormente - sin número asignado previamente al alcohol) en DCM seco (25 ml) y la mezcla se agitó a t.a. durante una noche. Después de 18 h la mezcla de reacción se lavó con H2O (1 x), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando DCM:EtOAc 100:0 a 95:5 a 94:6 hasta que el exceso de 6 eluyó y después, EtOAc:Hex 70:30 para dar el compuesto 7 (920 mg, 86 %) en forma de un aceite de color amarillo pálido. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-ds) 9,16 (s a, 1H), 8,45-8,43 (m, 1H), 7,83-7,78 (m, 2H), 7,25-7,21 (m, 1H), 7,15 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 6,87 (s, 1H), 4,29 (s a, 1h), 4,17-3,99 (m, 4H), 3,92 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,42-3,30 (m, 3H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,06-1,95 (m, 4H), 1,83 (s a, 1H), 1,77-1,68 (m, 4H), 1,58-1,49 (m, 2H), 1,43-1,36 (m, 2H), 1,39 (s, 9h), 1,29 (d, J = 6,8 Hz, 3H). HRMS m/z 706,2832 [(M+H)+ calc. para C34H48N3O9S2706,2826].
Figure imgf000091_0003
Una mezcla de 7 (949 mg, 1,34 mmol) y K2CO3 (1,85 g, 13,4 mmol) en DCM-MeOH (34 ml/17 ml) se agitó a t.a. durante 45 min. La mezcla se diluyó con DCM, se vertió en H2O con hielo (200 ml), se mezcló bien y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con DCM (1 x), las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando DCM:EtOAc 100:0 a 50:50 para dar el compuesto 8 (808 mg, 91 %) en forma de un aceite de color amarillo pálido. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-ds) 9,20 (s a, 1H), 8,44 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 7,81-7,80 (m, 2H), 7,25-7,20 (m, 2H), 6,94 (s, 1H), 4,75 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,17-3,99 (m, 3h), 3,92 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,60-3,46 (m, 2H), 3,37-3,20 (m, 3h), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2h), 1,93-1,76 (m, 3h), 1,75-1,68 (m, 3H), 1,58-1,51 (m, 2h), 1,44-1,36 (m, 2h), 1,39 (s, 9H), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 3H). HRMS m/z 664,2721 [(M+H)+ calc. para C32H46N3O8S2664,2724].
Figure imgf000092_0001
Se añadió (diacetoxiiodo)benceno (259 mg, 0,804 mmol) a una mezcla de 8 (349 mg, 0,526 mmol) y TEMPO (82,2 mg, 0,526 mmol) en DCM seco (10 ml) a t.a. y la mezcla de reacción se agitó durante una noche. Después de 24 h la mezcla se diluyó con DCM y Na2S2O3 acuoso saturado y se mezcló bien. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con Na2S2O3 acuoso saturado (1 x), NaHCO3 acuoso saturado (1 x), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc:Hex 70:30 a 100:0 para dar el compuesto 9 (248 mg, 71 %) en forma de una espuma de color blanco. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-cfe) 8,45-8,43 (m, 1H), 7,79-7,69 (m, 1h ), 7,51-7,48 (m, 1H), 7,24-7,20 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,96 y 6,91 (2s, 1H), 6,55 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 8,9; 6,1 Hz, 1H), 4,31-4,21 (m, 1H), 4,02-3,84 (m, 3H), 3,80 y 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,46 (m, 1H), 3,40-3,18 (m, 3H), 2,19-2,13 (m, 2H), 2,09-2,00 (m, 1H), 1,96-1,85 (m, 3H), 1,70-1,67 (m, 2h), 1,56-1,45 (m, 2H), 1,40-1,34 (m, 2h), 1,38 y 1,37 (2s, 9H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 662,2592 [(M+H)+ calc. para C32H44N3O8S2 662,2564].
Figure imgf000092_0002
Una mezcla de 9 (254 mg, 0,384 mmol) y HCl 4 M en dioxano (11 ml) se agitó a t.a. durante 1 h 15 min. El disolvente se retiró al vacío a 25-30 °C para dar el compuesto 10 (162 mg, 70 %) el cual se usó en la siguiente etapa sin purificación.
Figure imgf000092_0003
Una mezcla de 10 (161 mg, 0,266 mmol), 58b (195 mg, 0,542 mmol, recientemente preparado mediante el procedimiento mencionado anteriormente), EDCI.HCl (253 mg, 1,32 mmol) y TsOH (19,5 mg, 0,113 mmol) en DMA seca (5 ml) se agitó a t.a. durante una noche, en una atmósfera de nitrógeno. Después de 23 h la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y NaHCO3 acuoso saturado y se mezcló bien. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (1 x). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con H2O (1 x) y salmuera (1 x), se secaron (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando DCM:MeOH 100:0 a 93:7 y el material se recolumnó usando DCM:MeOH 99:1 a 94:6 para dar 11 (compuesto n.° 81, 118 mg, 47 %, pureza por HPLC: 98,0 %) en forma de una espuma de color amarillo pálida. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-cfe) 8,43-8,41 (m, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73-7,66 (m, 1H), 7,61­ 7,56 (m, 1H), 7,51-7,45 (m, 2H), 7,22-7,17 (m, 1H), 7,10 (s, 1h ), 6,97 y 6,92 (2s, 1H), 6,56 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 9,1,6,2 Hz, 1H), 4,42-4,20 (m, 4H), 4,05-3,76 (m, 7H), 3,80 y 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1H), 3,38-3,11 (m, 4H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,94-1,88 (m, 3H), 1,77-1,74 (m, 2H), 1,65-1,62 (m, 2H), 1,48-1,42 (m, 2H), 1,35-1,23 (m, 1H), 1,15­ 1,10 (m, 3H), 9H parcialmente oscurecido por DMSO. HRMS m/z 969,3070 [(M+Na)+ calc. para C47H55ClNeNaOgS2 969,3053].
Se preparó el compuesto 82 como sigue a continuación:
Figure imgf000093_0001
Una mezcla de 10 (162 mg, 0,267 mmol), 66d (178 mg, 0,418 mmol, recientemente preparado mediante el procedimiento mencionado anteriormente), EDCI.HCl (184 mg, 0,960 mmol) y TsOH (11 mg, 0,0639 mmol) en DMA seca (5 ml) se agitó a t.a. durante una noche, en una atmósfera de nitrógeno. Después de 18,5 h la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y H2O y se mezcló bien. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (1 x), H2O (1 x) y salmuera (1 x), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc:MeOH 100:0 a 95:5 para dar un residuo de color amarillo. Este se purificó adicionalmente por HPLC preparativa (columna: Synergi-MAX RP 4 |j, 21,20 x 250 mm; caudal: 12 ml/min; fase móvil: disolvente A: H2O/tampón de formiato amónico pH 3,45, disolvente B: MeCN/H2O 90:10; método: gradiente, disolvente A:disolvente B 90:10 a 10:90 a 0:100 durante 30 min) para dar el compuesto 12 (89,3 mg, 33 %, pureza por HPLC: 99,5 %) en forma de una espuma de color blanco. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-cfe) 8,56 (s, 1H), 8,43-8,41 (m, 1H), 8,04 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73-7,67 (m, 1H), 7,60-7,56 (m, 1H), 7,51­ 7,45 (m, 2H), 7,22-7,17 (m, 1h), 7,10 (s, 1H), 6,98 y 6,92 (2s, 1H), 6,55 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 5,47-5,44 (m, 1h), 4,40­ 4,36 (m, 1 h), 4,30-4,19 (m, 3h ), 4,04-3,86 (m, 4H), 3,86-3,75 (m, 1h), 3,80 y 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,46 (m, 1h), 3,38­ 3,22 (m, 3H), 3,21-3,15 (m, 1H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,94-1,85 (m, 3H), 1,78-1,74 (m, 2H), 1,69-1,60 (m, 2H), 1,55-1,40 (m, 2H), 1,47 y 1,47 (2s, 18H), 1,28-1,23 (m, 1H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 1035,3162 [(M+Na)+ calc. para C4gH62ClN4NaOiiPS21035,3175].
Figure imgf000093_0002
Una mezcla de 12 (84,0 mg, 0,0829 mmol) y TFA (1 ml) en DCM seco (2 ml) se agitó a t.a. durante 40 min. Después, el disolvente se retiró al vacío a 25 °C para dar un residuo de color verde. El residuo se disolvió en DCM, la solución se diluyó con EtOAc y el DCM se retiró al vacío para dar un sólido de color blanco y el disolvente restante se decantó. Este proceso se repitió y el sólido resultante se trituró con EtOAc y se secó para dar 13 (compuesto 82 de la Tabla A, 43,8 mg, 59 %, pureza por HPLC: 93,8 %) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-cfe) 8,47 (s, 1H), 8,44-8,42 (m, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,74-7,68 (m, 1H), 7,58-7,54 (m, 1H), 7,51­ 7,48 (m, 1H), 7,47-7,43 (m, 1H), 7,22-7,18 (m, 1H), 7,10 (s, 1h ), 6,98 y 6,93 (2s, 1h), 5,46 (d, J = 9,5 Hz, 1h), 4,39­ 4,18 (m, 4 h), 4,04-3,95 (m, 3h ), 3,90-3,85 (m, 1h), 3,84-3,76 (m, 1H), 3,80 y 3,80 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1h), 3,40­ 3,27 (m, 3H), 3,21-3,15 (m, 1H), 2,10-2,02 (m, 1H), 1,94-1,88 (m, 3H), 1,78-1,74 (m, 2H), 1,69-1,60 (m, 2h), 1,48-1,42 (m, 2h), 1,35-1,23 (m, 1H), 1,16-1,10 (m, 3H), 3H no observado. HRMS m/z 923,1938 [(M+Na)+ calc. para C4iH4sClN4NaOiiPS2923,1923].
Se preparó el compuesto 83 como sigue a continuación:
Figure imgf000093_0003
Una mezcla de 10 (45,0 mg, 0,0743 mmol), 67d (24,3 mg, 0,0899 mmol, recientemente preparado mediante el procedimiento mencionado anteriormente), EDCI.HCl (42,7 mg, 0,223 mmol) y TsOH (3 mg, 0,0174 mmol) en DMA seca (3 ml) se agitó a t.a. en una atmósfera de nitrógeno durante 5 h. Se añadieron porciones adicionales de 67d (24,3 mg, 0,0899 mmol) y EDCI.HCl (16,0 mg, 0,0835 mmol) a la mezcla y la reacción se agitó a t.a. durante una noche. Después de 22 h la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con H2O (2 x) y salmuera (1 x), se secó (Na2SO4) y el disolvente se retiró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc para dar un polvo de color verde. Este se purificó adicionalmente llevando a cabo cromatografía en columna sobre gel de sílice usando EtOAc una segunda vez para dar 14 (compuesto 83 de la Tabla A, 8,3 mg, 13,5 %, pureza por HPLC: 81,2 %) en forma de un sólido de color beis. RMN 1H 5 (400 MHz, DMSO-de) 10,33 (s, 1H), 8,43­ 8,42 (m, 1H), 8,07 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,77 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,74-7,67 (m, 1H), 7,50-7,46 (m, 2H), 7,33­ 7,29 (m, 1H), 7,24-7,18 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,98 y 6,92 (2s, 1H), 6,56 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,47-5,44 (m, 1H), 4,33­ 4,21 (m, 2H), 4,15-4,13 (m, 2H), 4,05-3,93 (m, 3H), 3,90-3,75 (m, 2H), 3,80 y 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1H), 3,38­ 3,13 (m, 4H), 2,10-1,99 (m, 1H), 1,94-1,89 (m, 3H), 1,77-1,74 (m, 2H), 1,66-1,62 (m, 2H), 1,52-1,41 (m, 2H), 1,32-1,24 (m, 1H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 843,2258 [(M+Na)+ calc. para C4iH45ClN4NaO8S2843,2260].
Se preparó el compuesto 85 como sigue a continuación:
A una solución de 82 (15 mg, 16,64 umol) en DMF (1,0 ml) se le añadió una solución de 5-nitropiridin-2-tiol (25,99 mg, 166,41 umol) a 20 °C. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se filtró y se purificó por HPLC prep. (FA) para dar (11 aS)-8-((6-((S)-1-(clorometil)-5-(fosfonooxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11a-tetrahidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de 2-((5-nitropiridin-2-il)disulfanil)propilo 85 (7,5 mg, 47,62 %) en forma de un sólido de color gris. CLEM: (10-80, CD_NEG, 3,0 min), 1,161 min, EM = 944,2 [M-1]-; RMN 1H (400 MHz, CDCh) 59,18 (s, 1H), 8,41 (a, 1H, J = 7,6 Hz), 8,11 (a, 1H), 7,80 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,67 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,30 (s, 1H), 7,07 (s, 1H), 6,99-6,93 (m, 1H), 5,52 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 4,26-4,14 (m, 4H), 3,98-3,80 (m, 4H), 3,76 (s, 3H), 3,40-3,26 (m, 5H), 2,40-2,28 (m, 2H), 2,10-1,80 (m, 5H), 1,79-1,55 (m, 5H), 1,40 (a, 1H), 1,19 (s, 1H), 1,12 (d, 3H, J = 8,8 Hz).
Se preparó el compuesto 86 como sigue a continuación:
Etapa A: Síntesis de (1-(clorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il)fosfato de (S)-di-tercbutilo 1u
Figure imgf000094_0001
A una solución homogénea en agitación de (S)-1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indolo-3-carboxilato de terc-butilo (3,34 g, 10,0 mmol) en DCM seco (25 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió HCl 4 M en dioxano (12,5 ml, 50,0 mmol). Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante un adicional de 20 h. La mezcla se diluyó con éter de petróleo (250 ml) y se agitó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 20 min. Los disolventes se decantaron y el procedimiento se repitió una vez más con éter de petróleo (250 ml). El sólido resultante se secó al vacío a 25 °C durante 1 h para dar clorhidrato de (S)-1-(clorometil)-2,3-dihidro-1 H-benzo[e]indol-5-ol (2,7 g, 100 %); RMN 1H [(CD3)2SO] 5 10,80 (s, 1 H), 8,15 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,87 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,58 (t a, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,43 (t a, J = 7,4 Hz, 1 H), 6,81 (s, 1 H), 4,27-4,17 (m, 1 H), 4,01 (dd, J = 11,0, 3,2 Hz, 1 H), 3,93-3,74 (m, 3 H), 2 protones no observados. El producto en bruto se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una mezcla heterogénea en agitación de clorhidrato de (S)-1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-ol (2,7 g, 10,0 mmol) en DCM seco (10 ml) y dioxano (30 ml) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió anhídrido trifluoroacético (TFAA) (3,4 ml, 24,0 mmol), seguido de diisopropiletilamina (DIPEA) (8,71 ml, 50,0 mmol). Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno durante un adicional de 50 min. Se añadieron acetato de etilo (400 ml) y HCl 1 N (200 ml) a 0 °C y la mezcla se agitó durante 20 min en una atmósfera de nitrógeno. La capa de acetato de etilo se separó, se lavó sucesivamente con HCl 1 N (200 ml) y agua (2x200 ml), y después se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida a una temperatura de baño de 25 °C para dar (S)-1-(1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-2,2,2-trifluoroetan-1-ona (3,3 g, 100 %) en forma de un sólido de color verde-gris. Este material se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una solución homogénea en agitación de (S)-1-(1-(clorometil)-5-hidroxi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-2,2,2-trifluoroetan-1-ona (3,3 g, 10,0 mmol) en THF seco (40 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió di-tercbutil-N,N-diisopropilfosforamidita (4,31 ml, 13,0 mmol). Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 5-10 min y después, se añadió gota a gota tetrazol (solución al 3 % en CH3CN, 38,0 ml, 13,0 mmol) durante 17 min. La mezcla de reacción final se agitó además a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 19 h. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió H2O2 al 30 % (11,3 ml, 100,0 mmol). Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante un adicional de 1 h 30 min. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (300 ml) y Na2S2O3 acuoso al 10 % (500 ml) en agitación a 0 °C durante 20 min. La capa de acetato de etilo se separó y se lavó sucesivamente con agua (200 ml), NaHCO3 saturado (200 ml), y agua (200 ml) y después se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida a una temperatura de baño de 25 °C para dar un aceite de color ámbar. La purificación por cromatografía sobre a gel de sílice (eluyendo con acetato de etilo:éter de petróleo 1:3) dio 1u (4,7 g, 90 %) en forma de un sólido espumoso incoloro, pf 39-42 °C; [a]D-61,8°(c 1,02, CHCh). Anal. (C23H28C F 3NO5P) Calc: C, 52,93; H, 5,41; N, 2,68. Encontrado: C, 53,05; H, 5,43; N, 2,80.
Etapa B: Síntesis de ((S)-1 -(2-((((4-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-6-((tercbutoxicarbonil)amino)hexanamido)bencil)oxi)carbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-terc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-5-metoxibenzoil)pirrolidin-2-il)macetato de etilo 3 g
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
A una solución en agitación de (S)-6-(5-(((aliloxi)carbonil)amino)-4-(2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carbonil)-2-metoxifenoxi)hexanoato de 2,2,2-tricloroetilo 3a (4,14 g, 6,95 mmol) (J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151) en DCM seco (25 ml) se le añadieron anhídrido acético (3,30 ml, 34,8 mmol) y trietilamina (5,81 ml, 41,7 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 3 h 30 min. Se añadió MeOH seco (4,0 ml) y la mezcla se agitó durante 30 min. La mezcla se repartió entre EtOAc (400 ml) y agua (400 ml). La capa de EtOAc se separó, se lavó con agua (2x200 ml) y después se secó (MgSO4) y se evaporó para dar (S)-6-(4-(2-(acetoximetil)pirrolidin-1-carbonil)-5-(((aliloxi)carbonil)amino)-2-metoxifenoxi)hexanoato de 2,2,2-tricloroetilo 3b (4,28 g, 96 %) en forma de un aceite; [a]D-57,4° (c 0,21, CHCh); RMN 1H [(CD3)2SO] 59,10 (s, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 6,87 (s, 1 H), 6,01-5,87 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,5 Hz, 1 H), 5,21 (dd, J = 10,4, 1,4 Hz, 1 H), 4,89 (s, 2 H), 4,54 (d, J = 5,4 Hz, 2 H), 4,39-4,20 (m, 3 H), 3,93 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 3,46-3,27 (m, 2 H), 2,13-1,90 (m, 4 H), 1,89-1,60 (m, 7 H), 1,54-1,40 (m, 2 H), 2 protones oscurecidos por pico de DMSO. HRMS (IEN) m/z calc. para C27H36 ChN2O9 : 637,1481, encontrado: 637,1475 [MH+]; calc. para C27H35ChN2 NaO9 : 659,1300, encontrado: 659,1303 [MNa+]; calc. para C27H35ChKN2O9 : 675,1040, encontrado: 675,1035 [MK+].
A una solución en agitación de 3b (4,27 g, 6,69 mmol) en acetona (75 ml), agua (50 ml) y THF (30 ml) se le añadieron polvo de cinc (17,5 g, 268 mmol) y NH4Cl (28,6 g, 535 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 42 h. Se añadió acetona (100 ml), la mezcla se agitó durante 10 min y el sobrenadante se decantó. El procedimiento se repitió dos veces y los sobrenadantes combinados se evaporaron a presión reducida para retirar acetona y THF. El residuo se diluyó con agua (50 ml) y se acidificó con HCl acuoso 1 N a pH aprox. 1. La mezcla ácida se lavó con éter de petróleo (2x200 ml) y se extrajo con EtOAc (400 ml). El extracto de EtOAc se lavó con agua (200 ml) y se secó (MgSO4) y el disolvente se evaporó para dar ácido (S)-6-(4-(2-(acetoximetil)pirrolidin-1-carbonil)-5-(((aliloxi)carbonil)amino)-2-metoxifenoxi)hexanoico 3c (2,72 g, 80 %) en forma de un aceite; [a]D-73,5° (c 1,12, CHCh); RMN 1H [(CD3)2So ] 5 11,99 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 9,10 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 7,17 (s, 1 h ), 6,87 (s, 1 H), 6,00-5,86 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,5 Hz, 1 H), 5,20 (dd, J = 10,4, 1,5 Hz, 1 H), 4,57-4,52 (m, 2 H), 4,37-4,03 (m, 3 H), 3,93 (t, J = 6,5 Hz, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 3,40-3,10 (m, 2 H), 2,23 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,07-1,93 (m, 4 H), 1,89-1,66 (m, 5 H), 1,62-1,49 (m, 2 H), 1,47-1,34 (m, 2 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C25H35N2O9 : 507,2337, encontrado: 507,2340 [MH+]; calc. para C25H34KN2O9 : 545,1896, encontrado: 545,1906 [MK+]; calc. para C25H34N2 NaO9 : 529,2157, encontrado: 529,2169 [MNa+].
A una solución en agitación de (1-(clorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il)fosfato de (S)-di-terc-butilo 1u (1,38 g, 2,64 mmol) en MeOH (10 ml) a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió Cs2CO3 (1,03 g, 3,17 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 h 30 min y después se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (150 ml). La capa de EtOAc se separó y se lavó de nuevo con agua (100 ml) y después se secó (MgSO4) y se evaporó a presión reducida en una temperatura de baño de 25 °C para dar el (1-(dorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il) fosfato de (S)-di-íerc-butilo 1v (1,17 g) en forma de un sólido espumoso de color amarillo pálido, el cual se trató con 3c (1,24 g, 2,45 mmol), EDCI.Hcl (1,41 g, 7,35 mmol) y ácido p-toluenosulfónico (84 mg, 0,49 mmol) en DMA seca (14 ml) a 0-20 °C durante 22 h. La mezcla se repartió entre EtOAc (400 ml) y agua (300 ml). La capa de EtOAc se separó y se lavó de nuevo con agua (100 ml) y después se secó (MgsO4) y se evaporó. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc:éter de petróleo 2:1) dio ((S)-1-(2-(((aliloxi)carbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-íerc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-5-metoxibenzoil)pirrolidin-2-il)macetato de etilo 3d (1,49 g, 66 %) en forma de un sólido espumoso de color amarillo pálido, pf 55-59 °C; [a]D-68,0° (c 1,00, CHCb); RMN 1H [(CD3)2SO] 59,10 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,47 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 6,86 (s, 1 H), 5,99-5,86 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, 1 H), 5,20 (dd, J = 10,4, 1,5 Hz, 1 H), 4,53 (d, J = 5,4 Hz, 2 H), 4,45-3,84 (m, 10 H), 3,74 (s, 3 H), 3,44-3,26 (m, 2 H), 2,68-2,47 (m, 2 H), 2,02 (s a, 3 H), 1,93-1,43 (m, 10 H), 1,474 y 1,469 (2 s, 18 h ). HRm S (IEN) m/z calc. para C46H62ClN3Oi2P: 914,3754, encontrado: 914,3749 [calc. para: C46H6iClKN3Oi2P: 952,3313, encontrado: 952,3381 [MK+]; calc. para C46H6iClN3NaOi2P: 936,3574, encontrado: 936,3589 [MNa+].
A una solución en agitación de 3d (548 mg, 0,60 mmol) en DCM (8 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadieron Pd(Ph3P)4 (17,1 mg; Pd al 9,8 %) y pirrolidina (0,49 ml, 6,00 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 30 min y después se repartió entre EtOAc (200 ml) y agua (150 ml). La capa de EtOAc se separó y se lavó de nuevo con agua (50 ml) y después se secó (MgsO4) y se evaporó a presión reducida a una temperatura de baño de 25 °C. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc:MeOH 50:1) para dar ((S)-1-(2-amino-4-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-íerc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-5-metoxibenzoil)pirrolidin-2-il)macetato de etilo 3e (323 mg, 65 %) en forma de un sólido espumoso de color amarillo pálido, pf 46-49 °C; [a]D-85,2° (c 0,36, CHCb); RMN 1H [(CD3)2SO] 58,56 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,93 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,58 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,47 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 6,67 (s, 1 H), 6,37 (s, 1 H), 5,09 (s, intercambiable con D2O, 2 H), 4,46-3,85 (m, 10 H), 3,63 (s, 3 H), 3,52-3,34 (m, 2 H), 2,69-2,50 (m, 2 H), 2,08-1,94 (m, 1 H), 2,01 (s, 3 H), 1,91-1,61 (m, 7 H), 1,58-1,44 (m, 2 H), 1,476 y 1,470 (2 s, 18 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C42H58ClN3OioP: 830,3522, encontrado: 830,3543 [MH+].
A una solución en agitación de 3e (293 mg, 0,35 mmol) y DMAP (202 mg, 1,65 mmol) en DCM seco (7 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió una solución de difosgeno en DCM seco (0,05 M, 6,7 ml, 0,33 mmol). La mezcla se agitó durante 25 min y después se añadió una solución de alil íerc-butil (6-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-6-oxohexano-1,5-diil)(S)-dicarbamato 3f (1,54 g, 3,54 mmol) en DCM seco (20 ml). La mezcla se agitó a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 68 h y después se repartió entre EtOAc (300 ml) y agua (200 ml). La capa de EtOAc se separó, se lavó de nuevo con agua (100 ml) y después se secó (MgsO4) y se evaporó a una temperatura de baño de 30 °C. El aceite de color naranja resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con EtOAc:MeOH:éter de petróleo 30:0,5:10) para proporcionar ((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-6-((tercbutoxicarbonil)amino)hexanamido)bencil)oxi)carbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-íerc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-5-metoxibenzoil)pirrolidin-2-il)macetato de etilo 3 g (385 mg, 84 %) en forma de un sólido espumoso, pf 72-75 °C; [a]D -55,2° (c 0,53, CHCb); RMN 1H [(CD3)2SO] 5 10,04 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 9,12 (s a, intercambiable con D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,52 (m, 3 H, reducido a 2 H después de D2O), 7,46 (t, J = 7,8 Hz, 2 H), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,20 (s a, 1 H), 6,86 (s, 1 H), 6,75 (t mal resuelta, intercambiable con D2O, 1 H), 5,97-5,83 (m, 1 H), 5,30 (d a, J= 17,3 Hz, 1 H), 5,17 (d a, J = 10,6 Hz, 1 H), 5,18-4,97 (m, 2 H), 4,51-3,85 (m, 13 H), 3,74 (s, 3 H), 3,43-3,23 (m, 2 H, parcialmente oscurecido mediante pico de agua), 2,94-2,83 (m, 2 H), 2,65-2,50 (m, 2 H, parcialmente oscurecido por pico de DMSO), 2,07-1,91 (m, 1 H), 2,01 (s a, 3 H), 1,88-1,43 (m, 11 H), 1,473-1,468 (2 s, 18 H), 1,43-1,20 (m, 4 H), 1,35 (s, 9 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C65H89GN 6O17P: 1291,5665, encontrado: 1291,5705 [MH+]; calc. para C65H88ClKN6Oi7P: 1329,5262, encontrado: 1329,5264 [MK+]; calc. para C65H88ClN6NaOi7P: 1313,5554, encontrado: 1313,5524 [MNa+].
Etapa C: Síntesis de 86
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Una mezcla de 3 g (366 mg, 0,28 mmol) y K2CO3 (1,14 g, 8,24 mmol) en DCM (9 ml) y MeOH (9 ml) se agitó a 0 °C durante 3 h 30 min. La mezcla se agitó con EtOAc frío (200 ml) y hielo-agua (150 ml) durante 10 min. La capa de EtOAc se separó, se lavó de nuevo con agua (100 ml), y después se secó (MgSO4) y se evaporó a una temperatura de baño de 25 °C para dar alil terc-butil ((S)-6-((4-((((5-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-ferc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-2-((S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-carbonil)-4-metoxifenil)carbamoil)oxi)metil)fenil)amino)-6-oxohexano-1,5-diil)dicarbamato 3h (343 mg, 97 %) en forma de un sólido espumoso incoloro, pf 71-75 °C; [a]D-58,2° (c 0,57, CHCb); RMN 1H [(CD3)2So ] 5 10,04 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 9,11 (s a, intercambiable con D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,53 (m, 3 H, reducido a 2 H después de D2O), 7,46 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 7,32 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 7,27 (s a, 1 H), 6,93 (s, 1 H), 6,75 (t mal resuelta, intercambiable con D2O, 1 H), 5,97-5,82 (m, 1 H), 5,29 (d a, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,17 (d a, J = 10,5 Hz, 1 H), 5,03 (s a, 2 H), 4,73 (t, J = 5,8 Hz, intercambiable con D2O, 1 H), 4,50-3,82 (m, 11 H), 3,74 (s, 3 H), 3,62-3,44 (m, 2 H), 3,40-3,21 (m, 2 H, parcialmente oscurecido mediante pico de agua), 2,95-2,80 (m, 2 H), 2,65­ 2,50 (m, 2 H, parcialmente oscurecido por pico de DMSO), 1,93-1,21 (m, 16 h ), 1,473-1,468 (2 s, 18 H), 1,35 (s, 9 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C63H86ClKN6Oi6P: 1287,5158, encontrado: 1287,5113 [MK+]; calc. para C63H86ClN6NaOi6P: 1271,5419, encontrado: 1271,5381 [MNa+].
A una solución en agitación de 3h (322 mg, 0,26 mmol) en DCM seco (14 ml) a 0 °C se le añadió en porciones peryodinano de Dess-Martin (DMP) (131 mg, 0,31 mmol) durante 3 min. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante un adicional de 2 h, después a 20 °C durante 50 h. La mezcla se diluyó con DCM (40 ml) y Na2S2O3 al 10 % (40 ml), se agitó a 20 °C durante 10 min y después se repartió entre DCM (200 ml) y una solución saturada de NaHCO3 (150 ml). La capa de DCM se separó y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (2x50 ml). Los extractos de DCM combinados se lavaron con una solución saturada de NaHCO3 (2x100 ml) y agua (2x100 ml), y después se secó (MgSO4) y se evaporó a una temperatura de baño de 25 °C. El aceite de color naranja resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con CHCh:MeOH 40:1) para dar (11aS)-8-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((diterc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-11 -hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11atetrahidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de 4-((S)-2-(((aliloxi)carbonil)amino)-6-((tercbutoxicarbonil)amino)hexanamido)bencilo 3i (228 mg, 71 %) en forma de un sólido espumoso de color pardo pálido, pf 98 °C (decomp); [a]D 74,5° (c 0,26, CHCh); RMN 1H [(CD3)2SO] 510,02 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,47 (m, 5 H, reducido a 4 H después de D2O), 7,25-7,12 (m, 2 H, s a y 1 H en intercambio D2O), 7,03 (s, 1 H), 6,83-6,64 (m, 2 H), 6,48 (s a, intercambiable con D2O, 1 H), 5,96­ 5,80 (m, 1 H), 5,52-5,39 (m, d en intercambio D2O, J = 9,6 Hz, 1 H), 5,27 (d a, J = 16,8 Hz, 1 H), 5,21-5,10 (m, 2 H), 4,81 (d a, J = 12,3 Hz, 1 H), 4,54-3,85 (m, 8 H), 3,83-3,70 (m, 5 H), 3,53-3,21 (m, 3 H, parcialmente oscurecido mediante pico de agua), 2,93-2,82 (m, 2 H), 2,64-2,47 (m, 2 H, parcialmente oscurecido por pico de DMSO), 2,10-1,20 (m, 16 H), 1,470 y 1,464 (2 s, 18 H), 1,34 (s, 9 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C63H84ClKN6Oi6P: 1285,5002, encontrado: 1285,4938 [MK+]; calc. para C63H84ClN6NaOi6P: 1269,5262, encontrado: 1269,5220 [MNa+].
A una solución en agitación de 3i (125 mg, 0,10 mmol) en DCM (2 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadieron Pd(Ph3P)4 (2,9 mg; Pd al 9,8 %) y pirrolidina (0,08 ml, 1,00 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C y se controló por TLC (EtOAc:MeOH 20:1). Después de 40 min se añadieron más Pd(Ph3P)4 (5,8 mg; Pd al 9,8 %) y pirrolidina (0,16 ml, 2,00 mmol) y la mezcla se agitó durante otras 3 h. La mezcla se repartió entre EtOAc (100 ml) y agua (100 ml). La capa de EtOAc se separó y se lavó de nuevo con agua (50 ml), y después se secó (MgSO4) y se evaporó a una temperatura de baño de 25 °C. El (11aS)-8-((6-((S)-1-(clorometil)-5-((di-terc-butoxifosforil)oxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-11 -hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11 a-tetrahidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de 4-((S)-2-amino-6-((terc-butoxicarbonil)amino)hexanamido)bencilo en bruto 3j (94 mg, 81 %) se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional. HRMS (IEN) m/z calc. para C59H8iClN6Oi4P: 1163,5231, encontrado: 1163,5188 [MH+].
Una solución de 3j (91 mg, 0,078 mmol) en DMA seca (1,0 ml) se trató con un preformado (a 20 °C durante 10 min) mezcla de ácido 1-((5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil)carbamoil)ciclobutanocarboxílico 1p (36 mg, 0,12 mmol), EDCI.HCl (34 mg, 0,18 mmol) y TsOH (4,0 mg, 0,023 mmol) en DMA seca (0,5 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno. Después de 10 min, se añadió DIPEA (0,016 ml, 0,078 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 23 h. La mezcla se repartió entre EtOAc (100 ml) y agua (100 ml). La capa de EtOAc se separó y se lavó además con NaHCO3 saturado (50 ml), agua (50 ml) y después se secó (MgSO4). La evaporación del disolvente a una temperatura de baño de 25 °C dio un producto en bruto que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con CHCta:EtOAc:MeOH 30:10:2) para dar (11 aS)-8-((6-((S)-1-(clorometil)-5-(fosfonooxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oxohexil)oxi)-11 -hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2,3,11,11 a-tetrahidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de 4-((S)-6-((íerc-butoxicarbonil)amino)-2-(1-((5-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)pentil)carbamoil)ciclobutano-1-carboxamido)hexanamido)bencilo 3k (63 mg, 56 %) en forma de un sólido espumoso de color pardo pálido; pf 67-70 °C; [a]D 23,9° (c 2,09, CHCh); RMN 1H [(CD3)2SO] 610,05 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,84-7,71 (m, 2 H, intercambiable con D2O), 7,62-7,52 (m, 3 H), 7,46 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 7,22-7,13 (m, 2 H), 7,03 (s a, 1 H), 6,96 (s, 2 H), 6,71 (s a, 2 H, reducido a 1 H después de D2O), 6,49 (s a, intercambiable con D2O, 1 H), 5,51-5,41 (m, pero d en intercambio D2O con J = 9,5 Hz, 1 H), 5,15 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 4,82 (d a, J = 12,4 Hz, 1 H), 4,47-3,85 (m, 8 H), 3,77 (s a, 3 H), 3,52-3,20 (m, 3 H, parcialmente oscurecido mediante pico de agua), 3,12-3,20 (m, pero t en intercambio D2O J = 6,7 Hz, 2 H), 2,92­ 2,80 (m, 2 H), 2,65-2,50 (m, 2 H, parcialmente oscurecido por pico de DMSO), 2,39 (t, J = 7,9 Hz, 2 H), 2,07-1,24 (m, 28 H), 1,469 y 1,463 (2 s, 18 H), 1,33 (s, 9 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C/4H98ClN8NaOi8P: 1475,6317, encontrado: 1475,6267 [MNa+].
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A una solución en agitación de 3k (45 mg, 0,031 mmol) en DCM (1,0 ml) a 20 °C en una atmósfera de nitrógeno se le añadió TFA (1,0 ml) y la mezcla se agitó durante 15 min. Se añadió éter de petróleo (20 ml) y la mezcla se agitó durante 30 min. El sobrenadante se decantó y el procedimiento se repitió usando EtOAc:éter de petróleo (1:5) (2x20 ml). El sólido resultante se recogió y se purificó por HPLC preparativa [columna Synergi PolarRP; TFA acuoso (pH = 2,56; 90 % a 2 %)/agua al 10 % en CH3CN (10 % a 98 %); elución de gradiente durante 23 min con un caudal de 12 ml/min] para dar 86 puro (17,5 mg, 38 %) en forma de un sólido de color beis, pureza (HPLC): 99,1 %; [a]D 54,9° (c 0,18, MeOH); RMN 1H [(CD3)2SO] 510,20 (s, intercambiable con D2O, 1 H), 8,50 (s, 1 H), 8,20-7,78 (m, 7 H, reducido a 1H después de D2O), 8,12 (d, J = 9,1 Hz, 1 H), 7,72-7,47 (m, 4 H, reducido a 3H después de D2O), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,17 (d a, J = 7,3 Hz, 2 H), 7,03 (s a, 1 h), 6,97 (s, 2 H), 6,66 (s a, intercambiable con D2O, 1 h), 5,51 (s a, 1 H), 5,48 (d a, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,32-5,18 (m, pero d después de D2O, J = 12,6 Hz, 1 H), 4,75 (d a, J = 12,4 Hz, 1 H), 4,44­ 3,81 (m, 8 H), 3,77 (s, 3 H), 3,52-3,21 (m, 5 H, parcialmente oscurecido mediante pico de agua), 3,04 (c, pero t después de D2O con J = 6,8 Hz, 2 H), 2,80-2,68 (m, 2 H), 2,39 (t, J = 7,7 Hz, 2 H), 2,12-1,08 (m, 28 H). HRMS (IEN) m/z calc. para C6iH75ClN8Oi6P: 1241,4722, encontrado: 1241,4700 [MH+]; calc. para C6iH74ClN8NaOi6P: 1263,4541, encontrado: 1263,4531 [MNa+].
C. Síntesis de intermedios de fármacos enlazadores de dímeros CBI
El dímero CBI-CBI dihidrogenofosfato de ([(1S)-1-(clorometil)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(clorometil)-5-fosfonooxi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-3-oxo-prop-1-enil]-2-[2-[2-(2,5-dioxopirrol-1-il)etoxi]etoxi]fenil]prop-2-enoil]-1,2-dihidrobenzo[e]indol-5-ilo]; compuesto 78 de la Tabla A) que tiene la fórmula:
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se sintetizó como sigue a continuación. Para ver el esquema de reacción, incluidas las fórmulas de reactivos e intermedios, véase la figura 11.
A temperatura ambiente a una solución de 1-(clorometil)-5-hidroxi-1H-benzo[e]indolo-3(2H)-carboxilato de (S)-terc-butilo 51a (2,00 g, 5,99 mmol) en DMF (5 ml) se le añadieron bromuro de bencilo (7,13 ml, 59,90 mmol), yoduro potásico KI (50 mg, 0,30 mmol) y carbonato potásico K2CO3 (4,14 g, 30,00 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h y después se diluyó con acetato de etilo. El precipitado se separó por filtración. El filtrado se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se filtraron a través de celite. El disolvente se retiró mediante un evaporador rotatorio y el exceso de bromuro de bencilo se retiró mediante bombeo. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna usando una mezcla de acetato de etilo y éter de petróleo (v/v 1:10) como eluyente para dar (5-(benciloxi)-1-(clorometil)-1H-benzo[e]indolo-3(2H)-carboxilato de S)-terc-butilo 57a en forma de un sólido de color blanco (1,97 g, 78 %); pf 186-188 °C. RMN 1H (CDCb) 58,29 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (s a, 1H), 7,65 (d, J = 8,29 Hz, 1H), 7,55-7,49 (m, 3H), 7,45-7,41 (m, 2H), 7,38-7,31 (m, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,26 (s a, 1H), 4,13 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 4,00-3,92 (m, 2H), 3,44 (t, J = 10,5 Hz, 1H), 1,61 (s, 9H) ppm. LRMS (APCI) encontrado m/z 424,8 (M H). C25H27ClNO3 requiere 424,2. (Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. y Suntornwat O., (1990) J. Org. Chem., 55, 5823-5832.)
A una solución de 5-(benciloxi)-1-(clorometil)-1H-benzo[e]indolo-3(2H)-carboxilato de (S)-terc-butilo 57a, preparado a partir de 1-(clorometil)-5-hidroxi-1H-benzo[e]indolo-3(2H)-carboxilato (S)-terc-butilo 51a (1,595 g, 3,76 mmol) en DCM (15 ml) enfriado en un baño de hielo se le añadió HCl 4 N en dioxano (40 ml). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 h. Se bombearon todos los componentes volátiles. El residuo resultante se redistribuyó entre acetato de etilo y amoniaco acuoso frío al 5 %. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua seguido de salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró a través de celite. El disolvente se retiró para dar (S)-5-(benciloxi)-1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol 57b en forma de una goma de color pardo, el cual se usó directamente; RMN 1H (DMSO) 58,04 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,45-7,34 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,24 (s, 2h ), 3,96-3,92 (m, 1H), 3,84 (dd, J = 3,4; 10,7 Hz, 1H), 3,70 (t, J = 9,3 Hz, 1H), 3,60 (dd, J = 2,4; 10,0 Hz, 1H), 3,55 (t, J = 10,3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) encontrado m/z 324,1150 (M H). C20H19CINO requiere 324,1150.
Se enfrió el Intermedio 57b en un baño de hielo y se añadió piridina (15 ml), seguido de anhídrido trifluoroacético (3,14 ml, 22,57 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 10 min y se añadió hielo. La mezcla se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua seguido de salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró a través de celite. El disolvente se retiró y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna usando una mezcla de acetato de etilo y éter de petróleo (v/v 1:10) como eluyente para dar (S)-1-(5-(benciloxi)-1-(clorometil)-1H-benzo[e]indol-3(2H)-il)-2,2,2-trifluoroetanona 66a en forma de un sólido de color blanco (1,11 g, 70 %); pf 167-170 °C. RMN 1H (CDCb) 58,37 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,61-7,54 (m, 3H), 7,49-7,42 (m, 3H), 7,39-7,35 (m, 1h), 5,30 (AB c, J = 11,7, 15,7 Hz, 2H), 4,63-4,59 (m, 1H), 4,43-4,38 (m, 1H), 4,15-4,09 (m, 1H), 3,97-3,93 (m, 1H), 3,49 (dd, J = 9,9, 11,3 Hz, 1H) ppm. HRMS (IEN) encontrado m/z 442,0799 (M Na). C22HizClF3NNaO2 requiere 442,0795.
A -10 °C, a una solución de 66a (1,10 g, 2,62 mmol) en THF (20 ml) se le añadió formiato amónico acuoso al 25 % a(20 ml) seguido de catalizador de Pd-C (10 %, húmedo, 550 mg) y la mezcla se agitó durante 2 h antes de añadirse más catalizador de Pd-C (550 mg). La mezcla resultante se agitó a -10 °C durante una noche y el catalizador se retiró por filtración a través de celite. El THF se retiró del el filtrado y el residuo se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua seguido de salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró a través de celite. El disolvente se retiró y el residuo resultante se purificaron por cromatografía en columna usando una mezcla de acetato de etilo y éter de petróleo (v/v 1:5) como eluyente para dar (S)-1-(1-(clorometil)-5-hidroxi-1H-benzo[e]indol-3(2H)-il)-2,2,2-trifluoroetanona 66b en forma de un sólido de color blanquecino (758 mg, 88 %); pf 209-212 °C. RMN 1H (CDCb) 58,33 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,64 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,60-7,56 (m, 1H), 7,51-7,47 (m, 1H), 4,60-4,56 (m, 1H), 4,41-4,36 (m, 1 h), 4,00-3,95 (m, 1H), 3,93-3,90 (m, 1H), 3,44 (dd, J = 9,8, 11,3 Hz, 1h) ppm. HRMS (IEN) encontrado m/z 352,0331 (M Na). Ci5HiiClF3NNaO2 requiere 352,0323.
A una solución de 66b (250 mg, 0,76 mmol) en THF (15 ml) se le añadió tetrazol (3 % en acetonitrilo, 13,5 ml, 4,55 mmol) seguido de fosforamidita de di-ferc-butil-N,N-di-isopropilo (1,51 ml, 4,55 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche, después se enfrió en un baño de hielo y H2O2 (solución acuosa al 30 %, 0,78 ml, 7,58 mmol). La mezcla resultante se dejó calentar hasta una temperatura ambiente y se agitó durante 5 h. La reacción se interrumpió mediante la adición de sulfito sódico acuoso al 10 % con refrigeración en un baño de hielo. Los volátiles orgánicos se retiraron mediante un evaporador rotatorio. La mezcla resultante se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua seguido de salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró a través de celite. El disolvente se retiró y el residuo resultante se purificaron por cromatografía en columna Florisil® (US Silica) usando mezclas de gradiente de acetato de etilo y éter de petróleo (v/v 1:6 a 1:3) como eluyente para dar 1-(clorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dihidro-1 H-benzo[e]indol-5-il fosfato de (S)-di-ferc-butilo 66c en forma de un aceite incoloro (367 mg, 93 %); RMN 1H (DMSO) 58,44 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,69-7,65 (m, 1H), 7,63-7,59 (m, 1H), 4,61-4,56 (m, 1H), 4,46-4,41 (m, 1H), 4,15-4,12 (m, 1H), 4,06-4,00 (m, 1H), 1,50 (s, 9H), 1,48 (s, 9h) ppm. RMN 31P (DMSO) 5 -15,54 ppm. HRMS (IEN) encontrado m/z 544,1236 (M Na). C23H28ClF3NNaO5P requiere 544,1238.
A una solución de 66c (239 mg, 0,46 mmol) en MeOH (2 ml) enfriada en un baño de hielo se le añadieron CsCO3 (298 mg, 0,92 mmol) y varias gotas de agua. La mezcla se agitó en el baño de hielo durante 1 h y después se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron a través de celite y el disolvente se retiró. El residuo resultante se disolvió en acetato de etilo y se filtró a través de una capa de cromatografía en columna Florisil® (US Silica) para dar 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il fosfato de (S)-di-terc-butilo 66d en forma de una goma de color blanquecino (183 mg, 94 %) la cual se usó directamente sin purificación adicional; RMN 1H (DMSO) 58,08 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,46-7,42 (m, 1H), 7,25­ 7,21 (m, 1H), 7,13 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 4,00-3,93 (m, 1h), 3,87-3,78 (m, 2H), 3,54-3,42 (m, 2H), 1,50 (s, 9H), 1,49 (s, 9H) ppm. RMN 31P (DMSO) 5 -15,58 ppm. HRMS (ESI) encontrado m/z 426,1587 (M H). C2iH3oClNO4P requiere 426,1595.
A 76 mg (0,18 mmol) de 1 (66d, recientemente preparado mediante el procedimiento mencionado anteriormente) se le añadieron 2 (18 mg, 0,045 mmol), clorhidrato de EDCI (69 mg, 0,36 mmol), ácido toluenosulfónico (0,8 mg, 0,005 mmol) y d Ma (0,25 ml). Después de que la mezcla se agitara durante una noche, la mayor parte del DMA se eliminó al vacío y el residuo se redistribuyó entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo tres veces. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua seguido de salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se filtraron a través de una capa de Celite. El disolvente se retiró y el residuo resultante se disolvió en el DCM mínimo y precipitó añadiendo heptano para dar el producto en bruto (54 mg), el cual se purificó adicionalmente por HpLC preparativa (Columna: Synergi-Max RP 4 |j, 250 x 21,20 mm; Fase móvil: A/B = de 20 % a 1 % (A: formiato amónico pH 3,45, B: acetonitrilo al 90 % en agua); caudal 12 ml/min, método de gradiente; longitud de onda: 254 nm, 325 nm) para dar 3 (17 mg, 30 %) en forma de un sólido de color amarillo. RMN 1H (CDCb) 58,72 (s a, 2H), 8,23 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,96 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 15,3 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,547,50 (m, 3H), 7,42-7,39 (m, 2H), 7,26-7,12 (m, 3H), 6,95-6,88 (m, 1H), 6,67 (s, 2H), 4,57-4,52 (m, 2H), 4,47-4,38 (m, 2H), 4,28-4,24 (m, 2H), 4,16-4,09 (m, 2H), 4,00-3,94 (m, 4H), 3,78 (s aparente, 4H), 3,55-3,48 (m, 2H), 1,57 (s, 36H) ppm. RMN 31P (CDCla) 5 - 15,64 (s) ppm. HRMS (IEn) encontrado m/z 1238,3862 (M Na). C62H73ChN3NaOi4P2 requiere 1238,3837.
A una solución de 3 (16 mg, 0,013 mmol) en DCM (1 ml) enfriada en un baño de hielo se le añadió TFA (0,5 ml, 3,24 mmol). La mezcla se dejó calentar hasta una temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. Se bombearon todos los componentes volátiles y el residuo resultante se trituró con acetato de etilo para dar el compuesto 78 en forma de un sólido de color amarillo (13 mg, 100 %, pureza HPLC del 100 %). RMN 1H (DMSO) 5 8,60 (s, 2H), 8,12 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,95-7,87 (m, 4H), 7,72 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 7,61-7,57 (m, 2H), 7,53-7,45 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 2H), 6,97 (s, 2H), 4,60-4,48 (m, 4H), 4,30-4,28 (m, 4H), 4,08-3,88 (m, 6H), 3,68-3,58 (m, 4H). RMN 31P (DMSO) 5 -5,94 (s) ppm. HRMS (IEN) encontrado m/z 1014,1301 (M Na). C46H4iChN3NaOi4P2 requiere 1014,1333.
D. Conjugación de restos de enlazador-fármaco con anticuerpos
Se produjeron conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) conjugando hu7C2.v.2.2.LA con una mutación A118C de la cadena pesada (tio-hu7C2-HC A118C) o una mutación K149C de la cadena ligera (tio-hu7C2-LC-K149C) en el resto de fármaco-enlazador seleccionado. Según fueron inicialmente aislados, los restos de cisteína genomanipulados de los anticuerpos existen como disulfuros mixtos con tioles celulares (por ejemplo, glutatión) y no por tanto no están disponibles para la conjugación. La reducción parcial de estos anticuerpos (por ejemplo, DTT), la purificación y la reoxidación con ácido deshidroascórbico (DHAA) proporciona anticuerpos con grupos sulfhidrilo libres en la cisteína disponibles para la conjugación, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, en Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:925-932 y documento US 2011/0301334. En resumen, los anticuerpos se combinan con el resto de fármaco-enlazador para permitir la conjugación del resto de fármaco-enlazador a los restos de cisteína libre del anticuerpo. Tras varias horas, los ADC se purifican. Se determinó la carga del fármaco (número promedio de restos de fármaco por anticuerpo) para cada ADC y estaba en el intervalo de 1,4-2,0.
En la Figura 12 se muestran las estructuras de ADC resultantes y los términos usados para las mismas a continuación.
Ejemplo 3: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en modelos de xenoinjerto de trasplante de tum or de mama transgénico MMTV-Her2 Fo5
Se implantaron fragmentos de ~2x2 mm de tumores de mama transgénicos MMTV-Her2 Fo5 en ratones CRL nu/nu (Charles River Laboratory). Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 7 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 1 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-HC-A118C-disulfuro-pBD, 0,3 mg/kg; (3) tiohu7C2-HC-A118C-disulfuro-PBD, 1 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PBD, 0,3 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PBD, 1 mg/kg; (6) tio-Abcontrol-HC-A118C-disulfuro-PBD, 1 mg/kg; o (7) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PBD, 1 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000-2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 5 y en la Figura 4 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 5 son del día 21, salvo ara el grupo de control con vehículo, que son del día 10. Cada grupo contenía 8 ratones al comienzo del estudio y 8 ratones en el día 21 (u 8 ratones en el día 10 para el grupo control con vehículo). Se calculó la ABC/día % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral) se calculó usando la siguiente fórmula: % de TGI = 100 x (1-ABC tratamiento/Día 4 ABC vehículo/Día). RP = respuesta parcial, que se define como más del 50 % pero menos del 100 % de reducción en el volumen tumoral, en comparación con el volumen tumoral de partida, en cualquier día durante el estudio. Ningún animal mostró una respuesta completa en este experimento.
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continuación
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Como se muestra en la Tabla 5, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PBD mostró 8 respuestas parciales a 1 mg/kg y 1 respuesta parcial a 0,3 mg/kg. Tio-hu7C2-HC-A118C-disulfuro-PBD mostró 2 respuestas parciales a 1 mg/kg y no mostró respuestas parciales a 0,3 mg/kg.
Ejemplo 4: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en modelos de xenoinjerto de trasplante de tum or de mama transgénico MMTV-Her2 Fo5
Se implantaron fragmentos de ~2x2 mm de tumores de mama transgénicos MMTV-Her2 Fo5 en ratones CRL nu/nu (Charles River Laboratory). Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 9 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 1 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) dímero de tio-hu7C2-LC-K149C-CBI, 1 mg/kg; (3) dímero de tio-hu7C2-LC-K149C-CBI, 3 mg/kg; (4) dímero de tio-hu7C2-LC-K149C-CBI, 6 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 1 mg/kg; (6) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 3 mg/kg; (7) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 6 mg/kg; (8) dímero de tio-Abcontrol-LC-K149C-CBI, 6 mg/kg; o (9) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 6 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000-2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 6 y en la Figura 5 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 6 son del día 21, salvo ara el grupo de control con vehículo, que son del día 14. Cada grupo contenía 8 ratone al comienzo del estudio y 8 ratones en el día 21, salvo para el grupo de control con vehículo, que tenía 8 ratones el comienzo del estudio y 7 ratones en el día 14. Se determinaron ABC/día % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral) y RP como se describe en el ejemplo anterior. RC = respuesta completa, que se definió como una reducción del 100 % en el volumen tumoral (tumor no mensurable), en cualquier día durante el estudio. La relación fármaco: anticuerpo (DAR) para cada conjugado anticuerpo-fármaco usado en el experimento se muestra en la segunda columna.
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Como se muestra en la Tabla 6, El dímero tio-hu7C2-LC-K149C-CBI mostró 1 respuesta parcial a 1 mg/kg, 6 respuestas parciales a 3 mg/kg, y 5 respuestas parciales y 2 respuestas completas a 6 mg/kg. Tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD mostró 1 respuesta parcial a 6 mg/kg. En un segundo estudio en el que las dosis se redujeron a 1 mg/kg, el dímero tio-hu7C2-LC-K149C-CBI a 1 mg/kg produjo regresiones del tumor mientras que el dímero tio-Abcontrol-LC-K149C-CBI a 1 mg/kg produjo un % de TGI del 60 %. Sin pretender quedar ligados a teoría concreta alguna, se cree que la actividad del control refleja la actividad no dirigida.
Ejemplo 5: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en modelos de xenoinjerto de trasplante de tum or de mama transgénico MMTV-Her2 Fo5
Se implantaron fragmentos de ~2x2 mm de tumores de mama transgénicos MMTV-Her2 Fo5 en ratones CRL nu/nu (Charles River Laboratory). Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 7 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 1 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU, 1 mg/kg; (3) tiohu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU, 3 mg/kg; (4) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PNU, 1 mg/kg; (5) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PNU, 3 mg/kg; (6) trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumab emtansina, adotrastuzumab emtansina), 3 mg/kg; o (7) T-DM1, 10 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000­ 2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 7 y en la Figura 6 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 7 son del día 20, salvo ara el grupo de control con vehículo, 1 mg/kg del grupo tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PNU, y el grupo T-DM1 3 mg/kg, que son del día 14. Cada grupo contenía 8 ratones al comienzo del estudio y 8 ratones al final, salvo para el grupo de control con vehículo, que tenía 8 ratones al comienzo del estudio y 7 ratones al final. ABC/día % de TGI (la inhibición del crecimiento tumoral se determinó como se describe en los ejemplos anteriores). En este experimento, no hubo respuestas parciales ni completas. La relación fármaco: anticuerpo (DAR) para cada conjugado anticuerpo-fármaco usado en el experimento se muestra en la segunda columna.
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Estos datos sugieren que tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU (3 mg/kg) tiene mayor eficacia que T-DM1 o el inmunoconjugado del control en este modelo.
Ejemplo 6: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en modelos de xenoinjerto de trasplante de tum or de mama transgénico MMTV-Her2 Fo5
Se implantaron fragmentos de ~2x2 mm de tumores de mama transgénicos MMTV-Her2 Fo5 en ratones CRL nu/nu (Charles River Laboratory). Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 9 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 1 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-HC-A1 18C-maleimida-PNU, ~1 mg/kg (la dosis de fármaco correspondió al grupo IV); (3) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 0,3 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 1 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 3 mg/kg; (6) tio-Abcontrol-LC-K149C-maleimida-PNU, 3 mg/kg; (7) dímero de tio-hu7C2-LC-K149C-CBI, 0,3 mg/kg; (8) dímero de tio-hu7C2-LC-K149C-CBI, 1 mg/kg; o (9) dímero de tio-Abcontrol-LC-K149C-CBI, 1 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000-2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 8 y en la Figura 7 se muestran los resultados de este experimento. Los datos en la Tabla 8 son del último día del estudio de cada grupo, indicado en la segunda columna de la tabla. Cada grupo contenía 8 ratones al comienzo del estudio y 8 ratones al final, excepto el grupo (9), que tenía 7 ratones al final del estudio. ABC/día % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral), RP y RC se determinaron como se describe en los ejemplos anteriores. La relación fármaco: anticuerpo (DAR) para cada conjugado anticuerpo-fármaco usado en el experimento se muestra en la segunda columna.
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Como se muestra en la Tabla 8, tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU mostró 3 respuestas parciales a 1 mg/kg y 8 respuestas completas a 3 mg/kg. El dímero tio-hu7C2-LC-K149C-CBI mostró 5 respuestas parciales a 1 mg/kg.
Ejemplo 7: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en el modelo de xenoinjerto de la línea de células de cáncer de mama KPL4
Ratones SCID de color beige (C.B-17 SCID.bg, Charles River Laboratories) se inocularon con 3 millones de células por ratón suspendidas en HBSS/matrigel en la almohadilla grasa de la mama torácica en un volumen de 0,2 ml. Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 9 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 1 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 0,3 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 1 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU, 3 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU, 0,3 mg/kg; (6) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU, 1 mg/kg; (7) tio-hu7C2-LC-K149C--disulfuro-PNU, 3 mg/kg; (8) tio-Abcontrol-LC-K149C-maleimida-PNU, 3 mg/kg; (9) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PNU, 3 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000-2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 9 y en la Figura 8 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 9 son del día 22 para todos los grupos excepto el grupo de control del vehículo y el grupo tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-PNU, que son del día 18. Cada grupo contenía 8 ratones al comienzo del estudio y 8 ratones al final, excepto el grupo (6), que tenía 7 ratones al final del estudio. ABC/día % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral), RP y RC se determinaron como se describe en los ejemplos anteriores. La relación fármaco: anticuerpo (DAR) para cada conjugado anticuerpofármaco usado en el experimento se muestra en la segunda columna.
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Como se muestra en la Tabla 9, tio-hu7C2-LC-K149C-maleimida-PNU mostró 7 respuestas parciales y 1 respuesta completa a 3 mg/kg. Tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-PNU mostró 7 respuestas parciales a 3 mg/kg.
Ejemplo 8: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en modelos de xenoinjerto de trasplante de tum or de mama transgénico MMTV-Her2 Fo5
Se implantaron fragmentos de ~2x2 mm de tumores de mama transgénicos MMTV-Her2 Fo5 en ratones CRL nu/nu (Charles River Laboratory). Cuando los tumores alcanzaron un volumen tumoral medio de 100-250 mm3, los animales se agruparon en 7 grupos de 8-10 ratones cada uno. Los ratones recibieron una única administración en el día 0 de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 2 mg/kg; (3) tiohu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 5 mg/kg; (4) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 5 mg/kg; (5) tiohu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD (fosfato), 2 mg/kg; (6) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD (fosfato), 5 mg/kg; o (7) tio-Abcontrol-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD (fosfato), 5 mg/kg. Se tomaron medidas del tumor y del peso corporal al menos una vez por semana durante la duración del estudio. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1000-2000 mm3 o si el ratón perdía 20 % o más de su peso corporal. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 10 y en la Figura 17 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 10 son del día 21. Cada grupo contenía 7 ratones al comienzo del estudio y 7 ratones al final, excepto el grupo (1), que tenía 5 ratones al final del estudio, y el grupo (4), que tenía 6 ratones al final del estudio. Se determinaron ABC/día % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral) y RP como se describe en los ejemplos anteriores. Ningún ratón mostró una respuesta completa en este experimento. La relación fármaco: anticuerpo (DAR) para cada conjugado anticuerpo-fármaco usado en el experimento se muestra en la segunda columna.
T abla 10: Eficacia de hu7C2 ADC en un modelo de xenoin erto de tumor de mama trans énico MMTV-Her2 Fo5
Figure imgf000107_0001
Como se muestra en la Tabla 10, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD mostró 2 respuestas parciales a 2 mg/kg y 4 respuestas parcial a 5 mg/kg. Tio-hu7C2-LC-K149C--disulfuro-CBI-PBD (fosfato) mostró 1 respuesta parcial a 2 mg/kg y 7 respuestas parciales a 5 mg/kg.
Ejemplo 9: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en el modelo de xenoinjerto de trasplante HCC1569X2
Se obtuvo a línea de células HCC1569 de cáncer de mama humano de la ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA) y se generó una sublínea HCC1569X2 en Genentech para el crecimiento óptimo en ratones.
Ratones C.B-17 SCID hembra de color beige (Charles River Laboratory) se inocularon cada uno en la zona de la almohadilla de grasa de mama torácica con 5 millones de células HCC1569X2 suspendidas en HBSS/matrigel (relación 1:1). Cuando los tumores de los xenoinjertos alcanzaron un volumen tumoral promedio de 100-300 mm3 (Día 0), los animales se aleatorizaron entre 7 grupos con 7 ratones por grupo y recibieron una única administración de uno de los siguientes tratamientos, mediante inyección intravenosa en la vena de la cola: (1) vehículo (L-histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, Tween-20 al 0,02 %, pH 5,5), (2) trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumab emtansina, adotrastuzumab emtansina). 3 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 0,5 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 1 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 2 mg/kg; (6) T-d M1, 3 mg/kg tiohu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 0,5 mg/kg; o (7) T-DM1, 3 mg/kg tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD, 1 mg/kg. Se midieron los tumores y los pesos corporales de los ratones 1-2 veces una semana a lo largo del estudio. Se sometieron a eutanasia los ratones cuando la pérdida de peso corporal fue > 20 % de su peso de partida. Se sometieron a eutanasia todos los animales antes de que los tumores alcanzaran 3000 mm3 o mostraran signos de ulceración inminente. Se midió el volumen tumoral en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibres y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula: Tamaño tumoral (mm3) = (medición más larga x medición más corta2) x 0,5.
En la Tabla 11 y en la Figura 18 se muestran los resultados de este experimento. Los datos de la Tabla 11 son del día 14 teniendo todos los grupos 7 ratones.
Tabla 11: Eficacia de los conjugados de anticuerpo fármaco hu7C2 en el modelo de xenoinjerto de trasplante
HCC1569X2.
Figure imgf000107_0002
(continuación)
Figure imgf000108_0001
En este estudio, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD demostró inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral, observándose la regresión del tumor a una dosis de 2 mg/kg. La combinación de tio-hu7C2-LC-K149C-disulfuro-CBI-PBD y T-DM1 dio como resultado una mayor eficacia que cualquier agente solo y fue bien tolerada basándose en los cambios mínimos en los pesos corporales animales en comparación con el grupo del vehículo.
Ejemplo 10: Estructura cristalina de Fab 7C2 unido a HER2
Métodos
Expresión, purificación y cristalización del complejo 7C2/HER2 - Fab 7C2 se expresó en E. coli y se purificó usando resina de afinidad de sefarosa con proteína G (GE), cromatografía de intercambio catiónico con sefarosa SP, y cromatografía de exclusión molecular (SEC). Se expresó el dominio extracelular HER2 (ECD) en células CHO y se purificó mediante cromatografía de afinidad usando el anticuerpo trastuzumab usando perlas de vidrio de poro controlado, seguido por intercambio aniónico DEAE y cromatografía de exclusión molecular.
El complejo entre Fab 7C2 y HER2 ECD se purificó mediante SEC. El complejo se desglucosiló usando una combinación de enzimas (Endo F1, F2, F3, Endo H y PNGasa), seguido de purificación por SEC en NaCl 0,1 M, HEPES 20 mM pH 7,2 y glicerol al 2 %. Se cristalizó el complejo dando como resultado placas gruesas después de una semana en gotas colgantes usando partes iguales de proteína a 10 mg/ml y un depósito (30 % v/v de PEG 550 monometiléter, citrato de sodio tribásico dihidratado 0,1 M pH 5,0) y se trató brevemente con depósito antes de la inmersión en nitrógeno líquido.
Los datos de difracción para el complejo extendidos a una resolución de 2,7 A se recogieron a ~110 K con un haz de línea 11-1. Se integraron las imágenes de difracción y se escalaron usando el programa HKL2000 y los elementos de la suite CCP4. Véase Winn et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 67: 235-42.
La estructura se resolvió mediante sustitución molecular (MR) usando el programa Phaser. Véase McCoy et al., 2005, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 61: 458-64. Los modelos de búsqueda MR incluyen el dominio ECD de HER2 derivado de una estructura cristalina del complejo HER2/Herceptina Fab (código PDB: 1N8Z), dominio constante Fab (código PDB: 1N8Z) y un modelo previsto para el dominio variable generado por el programa Modeller. Véase Fiser et al., 2003, Methods Enzymol., 374: 461-91. La estructura se refinó con programas REFMAC5 (Marshudov et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 67: 355-67) y PHENIX.refine (Adams et al., 2010, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 66 (pt.2): 213-21) usando las funciones diana de máxima probabilidad, factores B individuales anisótropos y el refino TLS. En la Tabla 12 se resumen los datos y la estadística de refino.
Tabla 12: Estadística de recogida de datos de difracción de rayos x y refino de la estructura (los valores entre paréntesis son para la última envoltura de resolución)
Recogida de datos SSRL 11-1
Grupo espacial C222i
Parámetros de la celdilla (A) a =136,8, b = 171,9, c = 162,5
Resolución (A) 50-2,75 (2,85-2,75)
Rsym 0,112 (0,689)
Número de observaciones 319169
Reflexiones únicas 49078
(continuación)
Redundancia 6,5 (5,5)
Completitud (%) 98,8 (92,2)
<|>/<a|> 20 (2,2)
Vm(A3/Da) 4,2
Refinado
Resolución (A) 48,33-2,75
Número de reflexiones 49053
R, Rlibre 0,23, 0,25
Número de restos 1047
Número de aguas 109
Número de átomos 8039
Enlaces RMSD (A) 0,007
ángulos RMSD (°) 1,2
Unión media A B (A2) 5,5
Análisis de Ramachandran (%) 93/6/1
Número de grupos TLS 3
<B>e (A2) 7C2/HER2 88
Resultados
Se determinó la estructura cristalina del complejo Fab 7C2/HER2 a una resolución de 2,75 A. Cada celda unitaria asimétrica contiene un complejo Fab/HER2. La estructura desveló que el Fab 7C2 se une al dominio I de HER2 ECD (Figura 19A). El epítopo de unión es distinto de los encontrados en los complejos caracterizados anteriormente de HER2 ECD con fragmentos Fab de anticuerpos terapéuticos trastuzumab (Tmab) o pertuzumab (Pmab), que se localizan en los dominios IV y II, respectivamente. Véase, por ejemplo, Cho etal., 2003, Nature, 421: 756-60; Figenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; y Franklin et al., 2004, Cancer Cell, 5: 17-28. De hecho, una superposición de la estructura del complejo 7C2 Fab/HER2 ECD con las estructuras del complejo Tmab/HER2 ECD y el complejo Pmab/HER2 ECD muestra que los tres Fab tienen epítopos no solapantes independientes y no interferirían espacialmente entre sí con la unión a HER2 (Figura 19A). Una superposición de las estructuras HER2 ECD en el complejo Tmab/HER2 ECD, el complejo Pmab/HER2 ECD y el complejo Fab 7C2/HER2 ECD mostró diferencias estructurales mínimas (Figura 19B). Esta observación sugirió que el HER2 ECD es relativamente rígido, lo que es consistente con los informes anteriores en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-60; Figenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; y Franklin et al., 2004, Cancer Cell, 5: 17-28.
El Fab 7C2 se une al bucle 163-175 y al bucle 185-189 en el dominio I de HER2 (es decir, los aminoácidos 163-175 y 185-189 de HER2 maduro, por ejemplo, SEQ ID NO: 39; el dominio I se muestra en el SEQ ID NO: 35). La unión entierra ~1160A2 de área de la superficie accesible al disolvente a cada lado de la interfase. Existe una red intrincada de interacciones hidrófobas, de unión a hidrógeno e iónicas. Determinados restos que están implicados en la unión están marcados en la Figura 19C. La cadena lateral de His171 hace contacto con los restos de la cadena pesada His52 y Asp55. Los restos de HER2 Ser186, Ser187 y Glu188 forman un enlace de hidrógeno con el D102 de la cadena pesada y los dos restos Tyr (Tyr36 y Tyr54) de la cadena ligera.
El epítopo de unión a 7C2 se solapa parcialmente con el de un anticuerpo anti-HER2 notificado anteriormente, chA21 (Figura 19D). Véase Zhou et al., 2011, JBC, 286: 31676-83. Ambos epítopos incluyen un bucle en el dominio I (restos 163-187). Curiosamente, el resto His171 juega un papel en la interacción con anticuerpos. Sin embargo, el epítopo de unión a chA21 abarca ~1820A2 de área de la superficie accesible al disolvente, que es ~660A2 más grande que el epítopo 7C2 e incluye dos bucles en el extremo N adicionales, los restos 100-105 y los restos 135-144.
T l n i
Figure imgf000110_0001
(continuación)
Figure imgf000111_0001

Claims (51)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une a HER2, en donde el anticuerpo comprende:
(i) (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14, en donde el anticuerpo se une a HER2 con una constante de disociación (KD) de < 5 nM como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; y/o
(ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 11 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 10.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 11 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 10.
3. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo monoclonal.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo humanizado o quimérico.
5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo IgG1, IgG2a o IgG2b.
6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un fragmento de anticuerpo que se une a HER2.
7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo se une al dominio extracelular I de HER2, en donde el dominio extracelular I de HER2 tiene la secuencia del SEQ ID NO: 35.
8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo comprende al menos una mutación en la región constante de la cadena pesada seleccionada entre A118C y S400C y/o comprende al menos una mutación en la región constante de la cadena ligera seleccionada entre K149C y V205C, en donde los restos se han numerado según el sistema de numeración UE.
9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo comprende:
a) una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 18; o
b) una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 23; o
c) una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 24 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 18.
10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 23.
11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo comprende la región constante de la cadena pesada del SEQ ID NO:28 o en donde el anticuerpo comprende la región constante de la cadena ligera del SEQ ID NO: 25.
12. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 13 de tal manera que se produzca el anticuerpo.
15. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un agente citotóxico.
16. El inmunoconjugado de la reivindicación 15 que comprende el anticuerpo de la reivindicación 2 o la reivindicación 10 y un agente citotóxico.17
17. El inmunoconjugado de la reivindicación 15 o de la reivindicación 16, en donde el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab-(L-D)p, en donde:
(a) Ab es el anticuerpo;
(b) L es un enlazador;
(c) D es un agente citotóxico; y
(d) p está comprendido entre 1-8.
18. El inmunoconjugado de la reivindicación 17, en donde p varía entre 1,3-2 o entre 2-5.
19. El inmunoconjugado de la reivindicación 17, en donde p es aproximadamente 2.
20. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el agente citotóxico se selecciona entre una auristatina, un maitansinoide, una caliqueamicina, una pirrolobenzodiazepina, un derivado de nemorrubicina y un 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI).
21. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el agente citotóxico es una pirrolobenzodiazepina de Fórmula A:
Figure imgf000155_0001
en donde la línea de puntos indica la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3;
R2 se selecciona independientemente entre H, OH, =O, =CH2 , CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2 , O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente además seleccionados entre halo o dihalo, en donde
RD se selecciona independientemente entre R, CO2R, COR, CHO, CO2H y halo;
R6 y R9 se seleccionan independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', NO2 , Me3Sn y halo; R7 se selecciona independientemente entre H, R, OH, OR, SH, SR, NH2 , NHR, NRR', NO2 , Me3Sn y halo;
Q se selecciona independientemente entre O, S y NH;
R11 es H o R; o Q es O y R11 es SO3M, en donde M es un catión metálico;
R y R' se selecciona cada uno independientemente entre grupos alquilo C1-8, heterociclilo C3-8 y arilo C5-20 opcionalmente sustituidos y opcionalmente en relación con el grupo NRR', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido;
R12, R16, R19 y R17 son como se define para R2, R6, R9 y R7 respectivamente;
R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos que están opcionalmente sustituidos; y
X y X' se seleccionan independientemente entre O, S y N(H).
22. El inmunoconjugado de la reivindicación 21, en donde D tiene la estructura:
Figure imgf000155_0002
en donde n es 0 o 1.
23. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el agente citotóxico es un derivado de nemorubicina.
24. El inmunoconjugado de la reivindicación 23, en donde el agente citotóxico tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000156_0001
25. El inmunoconjugado de una de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el agente citotóxico comprende un 1­ (clorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI).
26. El inmunoconjugado de la reivindicación 25, en donde el agente citotóxico tiene la fórmula:
Figure imgf000156_0002
en donde
R1 se selecciona entre H, P(O)3H2, C(O)NRaRb o un enlace a L;
R2 se selecciona entre H, p (o )3H2, C(O)NRaRb o un enlace a L;
Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F, o Ra y Rb forman un grupo heterociclilo de cinco o seis miembros;
T es un grupo de unión seleccionado entre alquileno C3-C12, Y, (alquilen Ci-C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquilen Ci-C6)-Y-(alquilen Ci-C6)-Y-(alquileno C1-C6), (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6) y (alquinilen C2-C6)-Y-(alquinileno C2-C6);
en donde Y se selecciona independientemente entre O, S, NR1, arilo y heteroarilo;
en donde alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con F, OH, O(alquilo Ci-Cs), NH2 , NHCH3 , N(CH3)2 , OP(O)3H2 y alquilo C1-C6 , en donde alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más F;
o alquileno, alquenileno, arilo y heteroarilo están independiente y opcionalmente sustituidos con un enlace a L; D' es un resto fármaco seleccionado entre:
Figure imgf000157_0001
en donde la línea ondulada indica el sitio de unión a T ;
X1 y X2 se seleccionan independientemente entre O y NR3, en donde R3 se selecciona entre H y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más F;
R4 es H, CO2R o un enlace a un enlazador (L), en donde R es alquilo C1-C6 o bencilo; y R5 es H o alquilo C1-C6.
27. El inmunoconjugado de la reivindicación 26, en donde el agente citotóxico tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000158_0001
28. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, en donde el enlazador se puede escindir mediante una proteasa.
29. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, en donde el enlazador es lábil a ácido.
30. El inmunoconjugado de la reivindicación 29, en donde el enlazador comprende hidrazina.
31. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 29, en donde el enlazador comprende un disulfuro.
32. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 que tiene una estructura selecciona entre:
Figure imgf000159_0001
Figure imgf000160_0001
Figure imgf000161_0001
33. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde el agente citotóxico comprende la estructura:
Figure imgf000162_0001
34. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 33 para usar en el tratamiento de un individuo que tiene un cáncer positivo para HER2.
35. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 34, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama o cáncer gástrico.
36. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 35, en donde el cáncer de mama positivo para HER2 es cáncer de mama en etapa temprana.
37. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 35, en donde el cáncer de mama positivo para HER2 es cáncer de mama metastásico.
38. El inmunoconjugado para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, en donde el inmunoconjugado es para usar junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
39. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 38, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales son un anticuerpo o un inmunoconjugado que se unen a HER2.
40. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 39, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales son (i) un anticuerpo o un inmunoconjugado que se unen al dominio II de HER2, y/o (ii) un anticuerpo o un inmunoconjugado que se unen al dominio IV de HER2.
41. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 39, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales son
(1) seleccionados entre trastuzumab, trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1) y pertuzumab;
(2) trastuzumab;
(3) T-DM1;
(4) pertuzumab; o
(5) trastuzumab y pertuzumab.
42. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 41, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama metastásico, y en donde el agente terapéutico adicional es T-DM1.
43. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 41, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer de mama metastásico, y en donde el agente terapéutico adicional es trastuzumab, pertuzumab y un agente quimioterapéutico.
44. El inmunoconjugado para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 43, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer recurrente.
45. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 44, en donde el cáncer recurrente es cáncer localmente recurrente.
46. El inmunoconjugado para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 43, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer avanzado.
47. El inmunoconjugado para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 46, en donde el cáncer positivo para HER2 es cáncer no resecable.
48. El inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 34 o de la reivindicación 35, en donde el tratamiento comprende:
a) someter al individuo a un tratamiento neoadyuvante con el inmunoconjugado,
b) eliminar el cáncer mediante cirugía definitiva, y
c) someter al individuo a tratamiento adyuvante con el inmunoconjugado.
49. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 conjugado a una marca, en donde la marca es opcionalmente un emisor de positrones, en donde el emisor de positrones es opcionalmente 89Zr.
50. Un método para detectar HER2 humano en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-HER2 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 49 en condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-HER2 a un HER2 humano de origen natural, y detectar si se ha formado un complejo entre el anticuerpo anti-HER2 y un HER2 humano de origen natural en la muestra biológica, en donde la muestra biológica es opcionalmente una muestra de cáncer de mama o una muestra de cáncer gástrico.
51. El anticuerpo de la reivindicación 49 para usar en la detección de un cáncer positivo para HER2, en donde la detección comprende (i) administrar un anticuerpo a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cáncer positivo para HER2, y (ii) detectar el anticuerpo en el sujeto, en donde la detección del anticuerpo indica un cáncer positivo para HER2 en el sujeto.
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