KR20170057280A - 항-her2 항체 및 면역콘주게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-HER2 항체 및 면역콘주게이트, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-HER2 항체 및 면역콘주게이트{ANTI-HER2 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은, 이의 전문이 임의의 목적을 위하여 본원에 참고로 포함된, 2014년 9월 12일 출원된 미국 가특허원 제62/049,594호에 대한 우선권의 이점을 청구한다.
서열 목록
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본 발명은 항-HER2 항체 및 면역콘주게이트 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
유방암은 전세계적으로 이환율 및 사망률의 크게 유의미한 원인이다. 상기 질환에 관련된 매년 450,000 초과 사망과 함께 전면적으로 진단된 유방암의 1.3 백만 사례 초과가 있다 (Jemal A, Bray F, Center M, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011; 61(2):69-90).
HER2 (ErbB2) 수용체 티로신 키나아제는 막통과 수용체의 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리의 구성원이다. HER2의 과발현은 인간 유방암의 대략 20%에서 관측되고 이들 종양과 관련된 공격성 성장 및 좋지 못한 임상 결과에 연루된다 (Slamon et al (1987) Science 235:177-182). HER2 단백질 과발현은 고정된 종양 블록의 면역조직화학 기반 평가를 이용하여 결정될 수 있다 (Press MF, et al (1993) Cancer Res 53:4960-70).
트라스트주맙 (CAS 180288-69-1, HERCEPTIN®, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Genentech)은 HER2의 세포외 도메인에 세포-기반 검정 (Kd = 5 nM)에서 높은 친화도로 선택적으로 결합하는 뮤린 항-HER2 항체 (4D5)의 인간화된 버전인 재조합 DNA-유도된, IgG1 카파, 단클론성 항체이다 (US 5677171; US 5821337; US 6054297; US 6165464; US 6339142; US 6407213; US 6639055; US 6719971; US 6800738; US 7074404; Coussens et al (1985) Science 230:1132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792). 트라스트주맙은, 모든 시험관내 검정 및 동물에서, HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제하기 위해 보여지고 있다 (Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831). 트라스트주맙은 항체-의존적 세포성 세포독성의 매개체, ADCC이다 (Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother 37(4):255-263; Hotaling et al (1996) [요약]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [요약]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137).
HERCEPTIN®은 광범위한 선행 항-암 요법을 받아 온 HER2-과발현 전이성 유방암 (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744) 을 갖는 환자의 치료에 대하여 1998년 승인되었고, 그 이후 300,000 초과 환자에서 사용되어 왔다 (Slamon DJ, et al. N Engl J Med 2001;344:783-92; Vogel CL, et al. J Clin Oncol 2002;20:719-26; Marty M, et al. J Clin Oncol 2005;23:4265-74; Romond EH, et al. T N Engl J Med 2005;353:1673-84; Piccart-Gebhart MJ, et　al. N Engl J Med 2005;353:1659-72; Slamon D, et al. [요약]. Breast Cancer Res Treat 2006, 100 (Suppl　1): 52). 2006년에, FDA는 HER2-양성, 노드-양성 유방암을 갖는 환자의 보조제 치료를 위하여 독소루비신, 사이클로포스파마이드 및 파클리탁셀을 함유한 치료 레지멘의 일부로서 HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech Inc.)을 승인하였다.
트라스트주맙-MCC-DM1 (T-DM1, 트라스트주맙 엠탄신, 아도-트라스트주맙 엠탄신, KADCYLA®), HER2-양성 유방암의 치료용 신규 항체-약물 콘주게이트 (ADC)는, 약 3.5의 평균 약물 부하 (약물 대 항체 비)를 갖는, MCC 링커를 통해 리신 측쇄에서 트라스트주맙에 콘주게이트된 세포독성제 DM1 (티올-함유 메이탄시노이드 항-미세소관 제제)로 구성된다. 종양 세포 상에서 발현된 HER2에 결합 이후, T-DM1은 수용체-매개된 내재화를 경험하여, DM1을 함유한 세포독성 분해대사물의 세포내 방출 및 후속의 세포 사망을 초래한다.
미국 식품의약국은, 트라스트주맙 및 탁산을 이용한 치료를 앞서 받았던 HER2-양성, 전이성 유방암을 갖는 환자의 치료를 위하여, 2013년 2월 22일에, 상표명 KADCYLA®로 시판되는, 아도-트라스트주맙 엠탄신을 승인하였다.
(재조합 인간화된 단클론성 항체 2C4, rhuMAb 2C4, PERJETA®, Genentech, Inc, South San Francisco 로서 또한 공지된) 퍼투주맙은 HER 이량체화 억제제 (HDI)로서 공지된 신규 부류의 제제에서 제1로 나타내고 HER2의 능력을 억제하는 기능을 하여 다른 HER 수용체 (예컨대 EGFR/HER1, HER2, HER3 및 HER4)와 활성 이종이량체 또는 동형이량체를 형성한다. 참고, 예를 들어, Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003); 및 Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)
종양 세포에서 HER2-HER 3 이종이량체의 형성의 퍼투주맙 봉쇄는 결정적 세포 신호전달을 억제하기 위해 입증하여 왔고, 이는 감소된 종양 증식 및 생존을 초래한다 (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)).
퍼투주맙은 전이성 질환에 대하여 트라스트주맙을 앞서 받았던 HER2-양성 전이성 유방암을 갖는 환자에 있에서 트라스트주맙과 조합으로 상 II 연구에서 평가되어 왔다. 국립 암 연구소 (NCI)에 의해 수행된 한 연구는 앞서 치료된 HER2-양성 전이성 유방암을 갖는 11 환자를 등록하였다. 11 환자 중 둘은 부분 반응 (PR)을 나타내었다 (Baselga et al., J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings; 25:18 S (June 20 Supplement): 1004. 2010년 12월 8일 - 12일, CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium (SABCS)에서 발표된, 초기-단계 HER2-양성 유방암을 갖는 여성에 있어서 퍼투주맙 및 트라스트주맙 플러스 화학요법 (도세탁셀)의 신규 조합 레지멘의 효과를 평가하는 상 II 선행보조제 연구의 결과는, 수술에 앞서 선행보조제 셋팅에서 주어진 2개의 HER2 항체 플러스 도세탁셀이 트라스트주맙 플러스 도세탁셀 (pCR 29.0 퍼센트), p = 0.014 과 비교로 절반 초과만큼 유방에서 완벽한 종양 소멸 (병리적 완벽한 반응 속도, pCR, 45.8 퍼센트)의 속도를 유의미하게 개선하였음을 보여주었다.
상표명 PERJETA®으로 시판되는, 퍼투주맙은 진전된 또는 말기-단계 (전이성) HER2-양성 유방암을 갖는 환자의 치료를 위하여 2012년에 승인되었다. HER2-양성 유방암은 암 세포 성장 및 생존에 기여하는 HER2 단백질의 증가된 양을 갖는다.
2013년 9월 30일, 미국 식품의약국은 수술 (선행보조제 셋팅) 이전 초기 단계 유방암 (EBC)을 갖는 환자에 대하여 완벽한 치료 레지멘의 일부로서 PERJETA® (퍼투주맙)에 대해 가속화된 승인을 부여하였다. PERJETA®은 유방암의 선행보조제 치료에 대하여 제1 FDA-승인된 약물이다.
단일요법 및 조합 요법에서 사용하기 위해, HER2-관련된 질환, 예컨대 유방암의 치료용 HER2를 표적하는 추가의 안전한 및 유효한 제제가 당해 기술에서 필요하다. 본 발명은 그러한 요구를 충적하고 기타 이점을 제공한다.
요약
본 발명은 항-HER2 항체 및 면역콘주게이트, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, HER2에 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열 번호: 11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 10의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 HER2에 결합하는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, HER2는 서열 번호: 1의 아미노산 23 내지 1255을 포함하는 인간 HER2이다. 일부 구현예에서, 항체는 HER2의 세포외 도메인 I에 결합한다. 일부 구현예에서, HER2의 세포외 도메인 I은 서열 번호: 35의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 세포외 도메인 I의 루프 163-189 및 루프 185-189 (예컨대 세포외 도메인 I의, 아미노산 163-189로 정의된 제1 루프 및 아미노산 185-189로 정의된 제2 루프)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 세포외 도메인 I의 His171, Ser186, Ser187 및 Glu188에 접촉한다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 A118C 및 S400C로부터 선택된 중쇄 불변 영역 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 K149C 및 V205C로부터 선택된 경쇄 불변 영역 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다:
a)서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 18의 서열을 포함하는 경쇄; 또는
b)서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 23의 서열을 포함하는 경쇄; 또는
c)서열 번호: 24의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 18의 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 상기 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 28의 중쇄 불변 영역. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하기를 포함한다: 서열 번호: 25의 경쇄 불변 영역.
일부 구현예에서, HER2에 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 상기 항체는 서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 23의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, HER2에 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 상기 항체는 서열 번호: 24의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 18의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산이 제공되며, 이는 본원에 기술된 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 이는 숙주 세포를 배양시켜 상기 항체가 생산되도록 하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 이는 본원에 기술된 항체 및 세포독성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 화학식 Ab-(L-D)p를 갖고, 여기서:
a) Ab는 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체이고;
b) L은 링커이며;
c) D 는 세포독성제이며; 그리고
d) p는 1 내지 8의 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 세포독성제는 하기로부터 선택된다: 오리스타틴, 메이탄시노이드, 칼리키아마이신, 피롤로벤조다이아제핀, 네모루비신 유도체, 및 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI).
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 D는 하기 화학식 A의 피롤로벤조다이아제핀이다:
Figure pct00001
식 중, 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의의 존재를 나타내고;
R2 는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 그리고 임의로 추가로 할로 또는 디할로로부터 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되며;
R6 및 R9 는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
R7 은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
Q 는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되며;
R11 은 H 또는 R이거나, Q 는 O, SO3M이고, M 은 금속 양이온이며;
R 및 R’는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C3-8 헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 그리고 임의로 NRR’ 기와 연관되고, R 및 R’ 은 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로환식 환을 형성하며;
R12, R16, R19 및 R17 은 각각, R2, R6, R9 및 R7 에 대해 정의된 바와 같으며;
R″ 는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 임의로 치환된 하나 이상의 헤테로원자 및/또는 방향족 환에 의해 저해될 수 있으며; 그리고
X 및 X’ 는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, D는 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
이며;
식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 D는 네모루비신 유도체이다. 일부 구현예에서, D는 하기로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00003
및
Figure pct00004
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 D는 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI)을 포함한다. 일부 구현예에서, D는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00005
식 중,
R1 은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 L에 대한 결합이며;
R2 은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 L에 대한 결합이며;
Ra 및 Rb 는 독립적으로 하나 이상의 F로 임의로 치환된, H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
또는 Ra 및 Rb 는 5 또는 6 원 헤테로사이클릴 기를 형성하며;
T는 하기로부터 선택된 연결기이며: C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌);
여기서 Y 는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로, F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 치환되며, 여기서 알킬은 하나 이상의 F로 임의로 치환되며;
또는 알킬렌, 알키닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로 L에 대한 결합으로 치환되며;
D' 는 하기로부터 선택되는 약물 모이어티이며:
Figure pct00006
Figure pct00007
및
Figure pct00008
여기서 물결선은 T에 대한 부착 부위를 표지하며;
X1 및 X2 는 독립적으로 O 및 NR3 로부터 선택되며, 여기서 R3 은 하나 이상의 F로 임의로 치환된 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
R4 는 H, CO2R, 또는 링커 (L)에 대한 결합이며, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이며; 그리고
R5 는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
일부 구현예에서, D는 하기로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00009
Figure pct00010
및
Figure pct00011
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 링커는 프로테아제에 의하여 절단가능하다. 일부 구현예에서, 링커는 산-불안정하다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라존을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 디설파이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 면역콘주게이트는 하기로부터 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
; 및
Figure pct00014
여기서 Ab는 본원에 기술된 항체이다.
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 면역콘주게이트는 하기로부터 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00015
Figure pct00016
및
Figure pct00017
여기서 Ab는 본원에 기술된 항체이다.
일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 제공되며, 여기서 면역콘주게이트는 하기로부터 선택된 구조를 포함한다:
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
및
Figure pct00021
여기서 Ab는 본원에 기술된 항체이다.
본원에 기술된 면역콘주게이트 중 임의의 것에서, p는 하기 범위일 수 있다: 1.3-2, 1.4-2, 1.5-2, 또는 2-5.
일부 구현예에서, 약제학적 제형이 제공되며, 이는 본원에 기술된 면역콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 제형은 추가 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) HER2의 도메인 II에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 도메인 IV 또는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) 에피토프 2C4에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 에피토프 4D5에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 트라스투주맙, 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1), 및 퍼투주맙. 일부 구현예에서, 약제학적 제형은 하기를 추가로 포함한다: (1) 트라스투주맙 또는 T-DM1, 및 (2) 퍼투주맙.
일부 구현예에서, HER2-양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은, 본원에 기술된 유효량의 면역콘주게이트 , 또는 본원에 기술된 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 유방암 또는 위암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 초기-단계 유방암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 전이성 유방암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 재발성 암이다. 일부 구현예에서, 상기 재발성 암은 국소적 재발성 암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 진행성 암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 절제가능하지 않다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로, 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 함한다.
일부 구현예에서, HER2-양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법은, 본원에 기술된 유효량의 면역콘주게이트, 및 적어도 하나의 추가 치료제를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) HER2의 도메인 II에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 도메인 IV 또는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) 에피토프 2C4에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 에피토프 4D5에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로부터 선택된다: 트라스투주맙, 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1), 및 퍼투주맙. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (1) 트라스투주맙 또는 T-DM1, 및 (2) 퍼투주맙. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 유방암 또는 위암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 초기-단계 유방암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 전이성 유방암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 재발성 암이다. 일부 구현예에서, 상기 재발성 암은 국소적 재발성 암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 진행성 암이다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 절제가능하지 않다.
일부 구현예에서, HER2-양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법은 하기를 포함한다:
a)본원에 기술된 면역콘주게이트, 또는 본원에 기술된 약제학적 제형으로의 선행보조 치료를 상기 개체에게 적용시키는 단계,
b)확정적 수술에 의하여 상기 암을 제거하는 단계, 및
c)본원에 기술된 면역콘주게이트, 또는 본원에 기술된 약제학적 제형으로의 보조 치료를 상기 개체에게 적용시키는 단계.
일부 구현예에서, HER2-양성 암은 유방암 또는 위암이다.
일부 구현예에서, HER2-양성 세포의 증식을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 표면 상에서의 HER2에 대한 면역콘주게이트의 결합을 허용하는 조건 하에서, 본원에 기술된 면역콘주게이트를 상기 세포에 노출시켜 이로써 상기 세포의 증식을 억제하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유방암 세포, 또는(of) 위암 세포이다.
일부 구현예에서, 표지에 콘주게이트된, 본원에 기술된 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 표지는 양전자 방출핵(positron emitter)이다. 일부 구현예에서, 양전자 방출핵은 89Zr이다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플 중의 인간 HER2를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항-HER2 항체의 HER2로의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 천연 발생 항-HER2 항체와 접촉시키는 단계, 및 복합체가 생물학적 샘플 내에서의 항-HER2 항체와 천연 발생 인간 HER2 간에 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 유방암 또는 위암 샘플이다.
일부 구현예에서, 대상체에서 HER2-양성 암을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 하기를 포함한다: (i) HER2-양성 암을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 표지된 항-HER2를 투여하는 단계로서, 상기 표지된 항-HER2 항체는 본원에 기술된 항-HER2 항체를 포함하는, 상기 투여 단계, 및 (ii) 상기 대상체에서 상기 표지된 항-HER2 항체를 검출하는 단계로서, 상기 표지된 항-HER2 항체의 검출은 상기 대상체에서의 HER2-양성 암을 표지하는, 상기 검출 단계. 일부 구현예에서, 표지된 항-HER2 항체는 양전자 방출핵에 콘주게이트된 항-HER2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 양전자 방출핵은 89Zr이다.
도 1은, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 뮤린 7C2.B9 ("7C2") 및 인간화된 7C2.v2.2.LA의 인간 VH 하위그룹 I (VHI) 공통 서열 및 중쇄 가변 영역 서열의 정렬을 보여준다.
도 2는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 뮤린 7C2.B9 ("7C2") 및 인간화된 7C2.v2.2.LA의 인간 VL 카파 IV (VLKIV) 공통 서열 및 경쇄 가변 영역 서열의 정렬을 보여준다.
도 3은 항-Her2 항체 트라스트주맙, 퍼투주맙, 및 7C2가 결합하는 도메인, 및 지적된 도메인 I 내지 IV를 갖는 Her2 세포외 도메인 구조를 보여준다.
도 4는, 실시예 3에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 5는, 실시예 4에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 6은, 실시예 5에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 7은, 실시예 6에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 8은, 실시예 7에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 9 및 10은, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 특정 CB-PBD 링커 약물 중간체 제조용 예시적 합성 방법을 보여준다.
도 11은, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 특정 CBI-CBI 링커 약물 중간체 제조용 예시적 합성 방법을 보여준다.
도 12A-F는 본원에서 실시예에 사용된 특정 항체-약물 콘주게이트용 구조를 보여준다.
도 13A-B는 퍼투주맙 주요 종 항체 경쇄 (A) 및 중쇄 (B) 아미노산 서열을 보여준다.
도 14A-B는 예시적 퍼투주맙 변이체 종 항체 경쇄 (A) 및 중쇄 (B) 아미노산 서열을 보여준다.
도 15A-B는 트라스트주맙 항체 경쇄 (A) 및 중쇄 (B) 아미노산 서열을 보여준다.
도 16은 도메인 I 내지 IV에 대하여 Her2 수용체 및 서열의 도식을 보여준다.
도 17은, 실시예 8에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 18은, 실시예 9에 기재된 바와 같이, hu7C2.v2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)로 치료시 경시적으로 종양 용적 (mm3)의 변화를 보여준다.
도 19A-D는 HER2 ECD (도메인에 의해 그늘진 및 공간-충전 모델로서 보여진 표면)과 7C2 Fab 사이에서 복합체의 (A) 결정 구조를 보여준다. 7C2 Fab는, 트라스트주맙 Fab (Tmab, PDB 코드: 1N8Z) 및 퍼투주맙 Fab (Pmab, PDB 코드: 1S78)의 결합 에피토프와 상이한, HER2의 도메인 I에 결합한다. 트라스트주맙/HER2 복합체, 퍼투주맙/HER2 복합체, 및 7C2/HER2 복합체 내에서 HER2 ECD의 구조의 (B) 중첩. (C) 7C2/HER2 복합체 인터페이스. 7C2/HER2 상호작용에서 관여된 잔기의 측쇄는 스틱으로서 보여진다. 잠재적 분자간 수소 결합의 일부는 점선으로서 보여진다. (D) 7C2 결합 에피토프는 chA21 단일-사슬 Fv (scFv)로 부분적으로 겹쳐진다. 7C2/HER2 복합체와 chA21 scFv/HER2 복합체 (PDB 코드: 3H3B)의 구조의 중첩.
이제 본 발명의 특정한 구현예를 더 자세히 설명하게 될 것이며, 본 발명의 실례가 첨부된 구조 및 식으로 예시된다. 본 발명은 열거된 구현예와 함께 기술될 것이지만, 이것이 이들 구현예에 본 발명을 제한하도록 의도되지 않음이 이해될 것이다. 그와 반대로, 본 발명은 청구범위에서 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 균등물을 포괄하는 것으로 의도된다. 당업자는 본원에서 설명된 것들과 유사한 또는 동등한 많은 방법과 물질을 인식할 것이고, 이들은 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 본 발명은 비제한적으로 기재된 방법 및 물질이다.
모든 인용된 참고문헌은 개시내용에 걸쳐 전체적으로 본원에 명시적으로 참조로서 편입된다. 만일 하나 이상의 포함된 문헌, 특허 및 유사한 자료가 정의된 용어, 용어 사용, 서술된 기술, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않고 본 명세서와 다르거나 본 명세서를 부정하는 경우, 본 명세서에 우선한다.
I. 정의
단어 “포함한다(comprise),” “포함하는(comprising),” “포함한다(include),” 및 “포함하는(including),”은, 본 명세서 및 청구항에서 사용될 때, 지칭된 특징, 정수, 성분, 또는 단계가 존재함을 명시하고자 하지만, 하나 이상의 그것의 다른 특징, 정수, 성분, 단계, 또는 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다.
본원의 목적을 위해 "수용체 인간 프레임워크"는 아래에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 동일하다.
"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 다르게 명시되지 않으면, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍 (예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 그 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에서 기재된 것을 포함하여 당해분야에서 공지된 공통의 방법으로 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 특정의 구체적이고 예시적인 구현예들이 아래에 기재되어 있다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서의 개선을 야기하는 변형을 갖지 않는 모 항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 나타내며, 이러한 변형은 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서의 개선을 야기한다.
용어 "항-HER2 항체" 및 “HER2에 결합하는 항체"는 항체가 HER2를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 하기에 충분한 친화도로 HER2에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 구현예에서, 비관련, 비-HER2 단백질에 대한 항-HER2 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정법(RIA)으로 측정 시, 약 10% 미만의 HER2에 대한 항체의 결합이다. 특정 구현예에서, HER2에 결합하는 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, , ≤　5 nm, ≤　4 nM, ≤　3 nM, , ≤　2 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-HER2 항체는 상이한 종 유래의 HER2 중 보존되어 있는 HER2의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 동안, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체)를 포함하여, 다양한 항체 구조, 및 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원을 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편들의 예시들은 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다가특이적 항체를 포함한다.
표준 항체와 “동일한 에피토프에 결합하는 항체”는 경쟁 검정에서 표준 항체의 이의 항원으로의결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로, 표준 항체는 경쟁 검정에서 50% 이상으로 항체의 이의 항원으로의 결합을 차단한다. 예시적 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어들 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예에는 비제한적으로, 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병이 포함된다. 일부 구현예에서, 암은 유방암 또는 위암이다. 일부 구현예에서, 암은 임의의 HER2-양성 암이다.
"HER2-양성" 암은 HER2의 정상 수준 보다 더 많이 갖는 암 세포를 포함한다. HER2-양성 암의 예는 HER2-양성 유방암 및 HER2-양성 위암을 포함한다. 임의로, HER2-양성 암은 면역조직화학 (IHC) 스코어 2+ 또는 3+ 및/또는 원위치 하이브리드화 (ISH) 증폭 비 ≥2.0을 갖는다.
용어 "초기 단계 유방암 (EBC)" 또는 "초기 유방암"은 유방 또는 겨드랑이 림프절을 넘어서 확산되지 않은 유방암을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이는 도관 제자리 암종 및 단계 I, 단계 IIA, 단계 IIB, 및 단계 IIIA 유방암을 포함한다.
상기 분류 내에서 "단계 0," "단계 I," "단계 II," "단계 III," 또는 "단계 IV", 및 다양한 하위-단계로서 종양 또는 암에 대한 지칭은 당해 기술에서 공지된 전체 단계 그룹화 또는 로마식 숫자 단계부여 방법을 이용한 종양 또는 암의 분류를 나타낸다. 비록 암의 실제 단계가 암의 유형에 의존하여도, 일반적으로, 단계 0 암은 원위치 병변이고, 단계 I 암은 작은 국소적 종양이고, 단계 II 및 III 암은 국부 림프절의 관여를 나타내는 국부 진전된 종양이고, 단계 IV 암은 전이성 암을 나타낸다. 각 유형의 종양에 대하여 특이적 단계는 숙련된 임상의에 공지된다.
용어 "전이성 유방암"은, 혈관 또는 림프에 의해, 신체에 있어서 최초 부위에서 다른 곳에 하나 이상의 부위로 암 세포가 전염되어, 유방 주위의 하나 이상의 기관에서 하나 이상의 2차 종양을 형성하는 유방암의 상태를 의미한다.
"진전된" 암은, 국부 침습 또는 전이에 의해, 태생의 부위 또는 장기 외부로 확산하는 것이다. 따라서, 용어 "진전된" 암은 국소로 진전된 및 전이성 질환 모두를 포함한다.
"재발성" 암은, 초기 요법, 예컨대 수술에 대한 반응 이후, 초기 부위 또는 먼 부위에서, 재성장한 것이다.
"국소로 재발성" 암은 앞서 치료된 암으로서 동일한 부위에서 치료 이후 되돌아가는 암이다.
"작동가능한" 또는 "절제가능한" 암은 1차 장기에 국한된 및 수술 (절제)에 적합한 암이다.
"비-절제가능한" 또는 "절제 불가능한" 암은 수술에 의해 제거 (절제)될 수 없다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 소스 또는 종으로부터 유도되는 반면 나머지 중쇄 및/또는 경쇄는 상이한 소스 또는 종으로부터 유도되는 항체를 나타낸다.
항체의 “부류”는 이의 중쇄가 소유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개 주요 부류의 항체가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포성 기능을 억제 또는 예방하고/하거나 세포사 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제는, 비제한적으로, 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 약물); 성장 억제성 제제; 효소 및 그 단편 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소 예컨대 작은 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 단편 및/또는 그 변이체 포함; 및 아래 개시된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 나타내며, 이것은 항체 동형에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예를 들면, B 세포 수용체); 및 B 세포 활성화.
제제, 예를 들면, 약제학적 제형의 "효과적인 양"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 복용량에서 시간의 기간동안 효과적인 양을 지칭한다. 암을 치료하기 위한 유효량의 약물은 암 세포수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 말초 장기로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 느리게 하거나 바람직하게는 정지)하고/하거나; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 느리게 하거나 바람직하게는 정지)하고/하거나; 종양 성장을 어느 정도로 억제하고/하거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도로 완화시킬 수 있다. 상기 약물이 성장을 방지하거나 및/또는 기존 암 세포를 사멸시킬 정도이면, 상기 약물은 세포증식 억제제 및/또는 세포독성일 수 있다. 유효한 양은 (예를 들면 고형 종양, RECIST, 또는 CA-125 변화에 대하여 반응 평가 기준에 의해 측정된 바와 같이) 무진행 생존을 연장할 수 있고, (부분 반응, PR, 또는 완벽한 반응, CR을 포함하여) 객관적 반응을 초래할 수 있고, 전체 생존율 시간을 증가시킬 수 있고/있거나 (예를 들면 FOSI에 의해 평가된 바와 같이) 암의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다.
"에피토프 4D5" 또는 "4D5 에피토프" 또는 "4D5"는 항체 4D5 (ATCC CRL 10463) 및 트라스트주맙이 결합하는 HER2의 세포외 도메인에서의 영역이다. 상기 에피토프는 HER2의 막통과 도메인에 밀접하고, HER2의 도메인 IV 내이다. 4D5 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝을 위하여, 일상적 교차-차단 검정, 예컨대 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기술된 것이 수행될 수 있다. 대안적으로, 에피토프 맵핑은 항체가 HER2의 4D5 에피토프 (예를 들면 HER2 (서열 번호: 39)의, 약 잔기 550 내지 약 잔기 610, (포함) 영역에서 임의의 하나 이상의 잔기)에 결합하는지를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 39).
"에피토프 2C4" 또는 "2C4 에피토프"는 항체 2C4가 결합하는 HER2의 세포외 도메인에서의 영역이다. 2C4 에피토프에 결합하는 항체에 대한 스크리닝을 위하여, 일상적 교차-차단 검정, 예컨대 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기술된 것이 수행될 수 있다. 대안적으로, 에피토프 맵핑은 항체가 HER2의 2C4 에피토프에 결합하는지를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 에피토프 2C4는 HER2의 세포외 도메인에서 도메인 II로부터 잔기를 포함한다. 2C4 항체 및 퍼투주맙은 도메인 I, II 및 III의 콘주게이트에서 HER2의 세포외 도메인에 결합한다 (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
본원에서 용어 "Fc 영역"은 적어도 불변 영역의 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 원상태 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226 또는 Pro230으로부터 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내에 아미노산 잔기의 넘버링은 하기에서 설명된 바와 같이, EU 인덱스로 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서 HVR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 출현한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내기 위해 상호교환 가능하게 본원에서 사용된다.
용어 "HER2의 글리코실화된 형태"는, 탄수화물 잔기의 부가에 의하여 후-번역 변형된 HER2의 천연 발생 형태를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환 가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입되는 세포를 이러한 세포의 자손을 포함하여 나타낸다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 상관없이 이로부터 유래된 후손을 포함하는 ”형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 기타의 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유도되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특이적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 하기에서의 것과 같다: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. 일 구현예에서, VL에 대해, 하위그룹은 Kabat et al, 상기에서와 같이 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH에 대해, 하위그룹은 Kabat et al., 상기에서와 같이 하위그룹 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 HVR (예를 들면, CDR)의 실질적으로 모두는 비인간 항체의 것에 일치하고, 그리고 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 일치한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화처리되는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역", "HVR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6 개의 HVR; VH에 3 개(H1, H2, H3), 및 VL에 3 개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 중 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식을 수반한다. 예시적인 초가변성 루프는 하기에서 발생한다: 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 하기 아미노산 잔기에서 발생한다: L1의 24-34 , L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102 . (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH 내의 CDR1을 예외로 하여, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 “특이성 결정 잔기” 또는 “SDR”을 포함하며, 이는 항원에 접촉하는 잔기이다. SDR은, 소위 간략화된-CDR 또는 CDR이라고 불리는 CDR의 영역 내 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 하기 아미노산 잔기에서 발생한다: L1의 31-34 , L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102. (참고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008).) 다르게 명시되지 않으면, 가변 도메인 (예를 들면, FR 잔기)에서 HVR 잔기 및 다른 잔기는 Kabat et al., 상기에 따라 본원에서 넘버링된다.
"면역콘주게이트"는 세포독성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 콘주게이트된 항체이다.
"환자" 또는 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은, 비제한적으로, 사육된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 랫트)를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자, 개체, 또는 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 환자는 "암 환자" 즉, 암, 특히 위 또는 유방암의 하나 또는 그 이상의 증상을 앓거나 또는 앓을 위험이 있는 사람일 수 있다.
"환자 집단"은 암 환자의 그룹을 지칭한다. 상기 집단은 약물의 유의미한 효능 및/또는 안전성을 통계적으로 입증하기 위해 사용될 수 있다.
"재발한" 환자는 차도 이후 암의 징후 또는 증상을 갖는 환자이다. 임의로, 환자는 보조제 또는 선행보조제 요법 이후 재발하였다.
"HER 발현, 증폭, 또는 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, HER 수용체를 발현하는 (과발현하는 포함), HER 유전자를 증폭한, 및/또는 다르게는 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 입증한 것이다.
본원에서 "선행보조제 요법" 또는 "수술전 요법"은 수술에 앞서 주어진 요법을 지칭한다. 선행보조제 요법의 목표는, 수술 그 다음 전신 요법의 표준 차례를 따르면 다르게는 증식하는 미세전이를 잠재적으로 근절하는, 즉각적인 전신 치료를 제공하는 것이다. 선행보조제 요법은 또한 종양 크기를 감소시키는데 도움을 줄 수 있어 그렇게 함으로써 초기에 절제 불가능한 종양의 완벽한 절제를 허용하거나 또는 장기의 일부 및 그의 기능을 보존한다. 더욱이, 선행보조제 요법은 약물 효능의 생체내 평가를 허용하고, 이는 후속의 치료의 선택을 인도할 수 있다.
본원에서 "보조제 요법"은, 질환 재발의 위험을 감소시키기 위해, 잔류 질환의 증거가 검출될 수 없는, 최종적인 수술 이후 주어진 요법을 지칭한다. 보조제 요법의 목표는 암의 재발을 예방하는 것이고, 따라서 암-관련된 사망의 기회를 감소시키는 것이다. 보조제 요법은 본원에서 특이적으로 선행보조제 요법을 배제한다.
"최종적인 수술"은 용어가 의료 사회 내에서 사용됨에 따라 사용된다. 최종적인 수술은, 예를 들어, 절차, 수술 또는 다르게는, 모든 지나치게 가시적인 종양의 제거 또는 절제를 초래하는 것을 포함하여, 종양의 제거 또는 절제를 초래하는 것을 포함한다. 최종적인 수술은, 예를 들어, 종양의 완벽한 또는 치유적인 절제 또는 완벽한 전체 절제를 포함한다. 최종적인 수술은 하나 이상의 단계에서 발생하는 절차를 포함하고, 예를 들어, 하나 이상의 수술 또는 다른 절차가 종양의 절제에 앞서 수행되는 다중-단계 수술 과정을 포함한다. 최종적인 수술은 관여된 기관, 기관 및 조직의 일부, 뿐만 아니라 주위의 기관, 예컨대 림프절, 기관의 일부, 또는 조직을 포함하여 종양을 제거 또는 절제하기 위한 절차를 포함한다. 제거는 불완전할 수 있어서 이로써 종양 세포가 심지어 미검출된 채로 남아 있을 수 있다.
"생존"은 살아남은 상기 환자를 나타내며, 무질환 생존 (DFS), 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존률(OS)이 포함된다. 생존은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 추정될 수 있으며, 생존에 있어서의 임의의 편차는 층화 로그순위 검정(stratified log-rank test)을 사용하여 계산된다.
"무진행 생존" (PFS)은 치료의 제1 일로부터, 어느 것이 먼저 발생하든, (단리된 CNS 진행을 포함하여) 문서로 기록된 질환 진행까지 또는 연구 상으로 임의의 원인으로 사망까지 시간이다.
“무질환 생존 (DFS)”는 규정된 시기, 예컨대 치료 개시로부터 또는 최초 진단으로부터 약 1 년, 약 2 년, 약 3 년, 약 4 년, 약 5 년, 약 10 년 등 동안 암의 재발 없이 살아남은 환자를 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, DFS는 치료 목적 원리에 따라 검정된다, 즉, 환자는 그의 배정된 요법에 기초하여 평가된다. DFS의 검정에서 사용된 사례는 선행 이벤트 (예를 들면, 유방암 재발 또는 제2 1차 암) 없이 환자에 있어서 암의 국부적, 영역적 및 먼 재발, 2차 암의 발생, 및 임의의 원인으로부터 사망을 포함할 수 있다.
"전체 생존률"은 규정된 시기, 예컨대 치료 개시로부터 또는 최초 진단으로부터 약 1 년, 약 2 년, 약 3 년, 약 4 년, 약 5 년, 약 10 년 등 동안 살아남은 환자를 지칭한다. 본 발명의 근간이 되는 연구에서, 생존율 검정을 위해 사용되는 사건은 모든 원인의 사망이었다.
"연장 생존"은 비치료 환자에 비해, 또는 대조 치료 프로토콜에 비해 치료 환자에서 DFS 및/또는 OS의 증가를 의미한다. 생존은 치료 개시 후 또는 최초 진단 후 적어도 약 6 개월, 또는 적어도 약 1 년, 또는 적어도 약 2 년, 또는 적어도 약 3 년, 또는 적어도 약 4 년, 또는 적어도 약 5 년, 또는 적어도 약 10 년 등 동안 모니터링된다.
"단일요법"이란 치료 기간의 경과 동안 암 또는 종양의 치료를 위한 단일 치료제만을 포함하는 치료 레지멘을 의미한다.
"유지 요법"란 질병의 재발 또는 진행의 가능성을 감소시키기 위해 주어지는 치료 요법을 의미한다. 유지 치료법은, 대상체의 수명까지의 연장된 기간을 포함하여, 임의의 길이의 시간 동안 제공될 수 있다. 유지 치료법은 초기 치료 후 또는 치료 또는 추가적인 치료와 함께 제공될 수 있다. 유지 요법을 위해 사용되는 용량은 다양할 수 있고, 다른 유형의 요법에 사용되는 복용량과 비교하여 점차 줄여나가는 복용량을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 “트라스투주맙”, “HERCEPTIN(헤르셉틴)®” 및 “huMAb4D5-8”은 상호교환가능하게 사용된다. 상기 항체는 바람직하게는 하기를 포함한다: 서열 번호: 30 및 서열 번호: 29, 각각에 나타난 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열.
본원에서 목적을 위하여, "퍼투주맙", "PERJETA®" 및 "rhuMAb 2C4"는 상호교환적으로 사용된다. 상기 항체는 서열 번호: 32 및 31, 각각에서 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 주요 종 항체를 포함한다 (도 13A 및 B). 일부 구현예에서, 퍼투주맙은, 예를 들면, 하기를 포함하는 아미노-말단 리더 연장을 갖는 변이체 종 항체를 포함한다: 서열 번호: 34의 경쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호: 33의 중쇄 아미노산 서열. 상기 항체는 재조합 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 임의로 생산된다.
본원에서 정의된 바와 같이, 용어들 "T-DM1," "트라스트주맙-MCC-DM1," "아도-트라스트주맙 엠탄신," "트라스트주맙 엠탄신," 및 "KADCYLA®"는 상호교환적으로 사용되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 약물 모이어티가 항체 트라스트주맙에 공유결합된 다양하게 부하된 및 부착된 항체-약물 콘주게이트의 모든 혼합물을 포함하여, 링커 모이어티 MCC를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 트라스트주맙을 지칭한다 (US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
"단리된" 항체는 그 자연 환경의 성분으로부터 분리되는 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 다음 기술에 의한 측정시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다: 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC). 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 참고, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr . B 848:79-87 (2007).
“단리된” 핵산은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 원래 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 이의 자연 염색체 위치와는 다른 염색체 위치에 존재한다.
"항-HER2 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 이러한 핵산 분자(들)를 단일 벡터 또는 별도의 벡터로 포함하여 나타내며, 이러한 핵산 분자(들)는 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "HER2"는, 세포 내 HER2 전구체 단백질의 처리로 유발된 임의의 천연, 성숙 HER2를 지칭한다. 상기 용어는, 달리 표지되지 않는다면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한 척추동물 공급원 유래의 HER2를 포함한다. 상기 용어는 또한 HER2의 천연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 신호 서열을 갖는 예시적인 인간 HER2 전구체 단백질의 아미노산 서열 (신호 서열, 아미노산 1-22를 가짐)은 서열 번호: 1에 나타난다. 예시적인 성숙 인간 HER2의 아미노산 서열은 서열 번호: 의 아미노산 23-1255에 제공된다.
용어 "HER2-양성 암 세포"는 이들 표면 상에 HER2를 발현하는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들면, 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 단클론성 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프를 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대해서 유도된다. 따라서, 형용사 "단클론"은 항체가 실질적으로 균일한 항체 집단에서 수득된 것이라는 속성을 명시하고, 어떤 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생산을 요구하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 혼성세포 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 기술들에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론성 항체를 제조하기 위한 기타의 예시적인 방법들이 본원에 기재되어 있다.
"네이키드 항체(naked antibody)"는 이종 잔기(예컨대, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약제학적 제형에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 디설파이드 결합된 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이질사량체성 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어 세 개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어 불변(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 두 가지 타입 중의 하나에 할당될 수 있다.
"바이알"은 액체 또는 동결건조된 제제를 유지하는데 적합한 용기이다. 한 구현예에서, 바이알은 단일-용도 바이알, 예를 들면 스토퍼가 있는 20-cc 단일-용도 바이알이다.
용어 "팩키지 삽입물"은 치료학적 제품의 상업 팩키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용되고 이는 상기 치료학적 제품의 사용에 관한 지적사항, 용도, 투여량, 투여, 조합 치료요법, 사용금지 사항 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.
기준 폴리펩티드 서열에 관한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 기준 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적으로의 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 재량 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제조사 (Genentech, Inc.)에 의해 개발되었고, 소스 코드는 사용자 기록문서와 함께 하기와 같이 제출되었다: 미국 저작권 청, 워싱턴 D.C., 20559, 하기 하에서 등록됨: 미국 저작권 등록 번호 TXU510087. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코에 소재하는 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 이용 가능하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 바뀌지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 A 내지, 및, 또는 소정의 아미노산 서열 B(이것은 소정의 아미노산 서열 B에 대해 특정의 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)의 아미노산 서열 동일성 %는 다음과 같이 계산된다:
분수 X/Y의 100배
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 스코어링되는 아미노산 잔기의 수이고 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 % 아미노산서열 동일성은 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성은 동일하지 않음을 인식할 것이다. 달리 구체적으로 기재하지 않은 경우, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전의 문단에 기재된 바와 같이 수득한다.
용어 "약제학적 제형"은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하기 위한 형태인, 그리고 제형이 투여되는 대상체에 허용불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분을 제외한, 개체에 비독성인, 약제학적 제형 중 성분을 가리킨다. 약제학적으로 허용가능한 담체에는 비제한적으로, 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제가 포함된다.
본원에서 사용되는 "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적인 과정을 변경하려는 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발병 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 사용된다.
"공-투여"는, 2 이상의 약물의 순차적인 주입 보다는, 동일한 투여 동안 2 (또는 초과) 약물의 정맥내로 투여를 의미한다. 일반적으로, 이의 공-투여에 앞서 동일한 IV 백속에 2개 (또는 초과) 약물의 조합을 포함할 것이다.
하나 이상의 다른 약물과 "동반하여" 투여된 약물은, 하나 이상의 다른 약물과 동일한 치료 일에, 및, 임의로, 하나 이상의 다른 약물과 동시에, 동일한 치료 주기 동안 투여된다. 예를 들면, 매 3 주 주어진 암 요법에 대하여, 동반하여 투여된 약물은 각각 3-주 주기의 제1일에 투여된다.
“화학요법”은 암의 치료에 유용한 화학치료제를 지칭한다.
"화학치료제"는 작용 기전과 무관하게, 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 부류는 알킬화제, 대사길항물질, 방추체 억제제 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 항체, 광감작제 및 키나제 억제제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 화학치료제의 예는 하기를 포함한다: 안트라사이클린, 예컨대 에피루비신 또는 독소루비신 (ADRIAMYCIN®), 사이클로포스파마이드 (CYTOXAN®, NEOSAR®), 조합으로 안트라사이클린 및 사이클로포스파마이드 ("AC"); 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 (TAXOTERE®,) 또는 파클리탁셀 (TAXOL®), 5-FU (플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS 번호 51-21-8), 라파티닙 (TYKERB®), 카페시타빈 (XELODA®), 젬시타빈 (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS 번호 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴 (시스-디아민,디클로로백금(II), CAS 번호 15663-27-1), 카보플라틴 (CAS 번호 41575-94-4), 테모졸로마이드 (4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜타자바이사이클로[4.3.0]노나-2,7,9-트리엔-9-카복사마이드, CAS 번호 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), 타목시펜 ((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸-에탄아민, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®).
화학치료제의 더 많은 예는 옥살리플라틴(엘록사틴(ELOXATIN)®, 사노피(Sanofi)), 보르테조밉(벨로케이드(VELCADE)®, 밀레니움 팜(Millennium Pharm.)), 수텐트(수니티닙(SUNITINIB)®, SU11248, 화이자), 레트로졸(페마라(FEMARA)®, 노바티스(Novartis)), 이마티닙 메실레이트(글리벡(GLEEVEC)®, 노바티스), XL-518 (MEK 억제제, 엑셀릭시스(Exelixis), WO 2007/044515), ARRY-886(Mek 억제제, AZD6244, 어레이 바이오파마(Array BioPharma), 아스트라 제네카(Astra Zeneca)), SF-1126(PI3K 억제제, 세마포어 파마슈티칼스(Semafore Pharmaceuticals)), BEZ-235(PI3K 억제제, 노바티스), XL-147(PI3K 억제제, 엑셀릭시스), PTK787/ZK 222584(노바티스), 플루베스트란트(파스로덱스(FASLODEX)®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 류코보린(폴린산), 라파마이신(리롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®, 와이어스(Wyeth), 로나파르닙(SARASARTM, SCH 66336, 셰링 플라우), 소라페닙(넥사바르(NEXAVAR)®, BAY43-9006, 바이엘 랩스(Bayer Labs)), 게피티닙(이레사(IRESSA)®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 이리노테칸(캄프토사르(CAMPTOSAR)®, CPT-11, 화이자), 티피파르닙(자르네스트라(ZARNESTRA)TM, 존슨 앤드 존슨(Johnson & Johnson), 아브락산(ABRAXANE)TM (크레모포-프리(Cremophor-free)), 파클리탁셀의 알부민-공학처리된 나노입자 제형(일리노이주 샤움베르크에 소재한 아메리칸 파마슈티칼 파트너즈(American Pharmaceutical Partners)), 반데타닙(rINN, ZD6474, ZACTIMA®, 아스트라제네카(AstraZeneca)), 클로람뷰실, AG1478, AG1571 (SU 5271; 수겐(Sugen)), 템시롤리무스(토리셀(TORISEL)®, 와이어스), 파조파닙(글락소스미스클린(GlaxoSmithKline)), 칸포스파마이드(텔시타(TELCYTA)®, 텔리크(Telik)), 티오네파 및 사이클로스포노스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)®, 네오사르(NEOSAR)®); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설폰 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민(알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌 포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스포르아마이드 및 트라이메틸로멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논)을 포함); 캄토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 예컨대 클로람뷰실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로소유레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 엔다인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 칼리케아마이신 감마1I, 칼리케아마이신 오메가I1(Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33:183-186); 다이네마이신, 다이네마이신 A; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피머, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피담놀; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS 다당류 복합체 (JHS 천연 생성물, Eugene, OR); 라족산; 라이족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("아라(Ara)-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 테니포시드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 및 유도체.
본원에서 치료제의 "고정된" 또는 "변동없는" 용량은 환자의 중량 (WT) 또는 체표면적 (BSA)을 고려하지 않고 인간 환자에 투여된 용량을 지칭한다. 고정된 또는 변동없는 용량은 따라서 mg/kg 용량 또는 mg/m2 용량으로서 제공되지 않지만, 오히려 치료제의 절대적인 양으로서 제공된다.
"부하" 용량은 본원에서 일반적으로 환자에 투여된 치료제의 초기 용량을 포함하고, 그 다음 그의 하나 이상의 유지 용량(들)이다. 일반적으로, 단일 부하 용량이 투여되지만, 다중 부하 용량이 본원에서 고려된다. 보통, 투여된 부하 용량(들)의 양은 투여된 유지 용량(들)의 양을 초과하고/하거나 부하 용량(들)은 유지 용량(들) 보다 더 자주 투여되어, 유지 용량(들)로 달성될 수 있는 것보다 더 초기에 치료제의 원하는 정상상태 농도를 달성한다.
본원에서의 "유지" 투여는 치료 시기에 걸쳐 환자에 투여되는 치료 제제의 하나 이상의 투여를 지칭한다. 보통, 상기 유지 용량은 치료 간격을 두고, 예컨대 대략 1주, 대략 2주, 대략 3주, 또는 대략 4주 간격, 바람직하게는 3주 간격으로 투여된다.
"주입" 또는 "주입하는"은 치료적 목적을 위하여 정맥을 통해 신체속에 약물-함유 용액의 도입을 지칭한다. 일반적으로, 이는 정맥내 (IV) 백을 통해 달성된다.
"정맥내 백" 또는 "IV 백"은 환자의 정맥을 통해 투여될 수 있는 용액을 유지할 수 있는 백이다. 한 구현예에서, 용액은 염수 용액 (예를 들면 약 0.9% 또는 약 0.45% NaCl)이다. 임의로, IV 백은 폴리올레핀 또는 폴리비날 클로라이드로부터 형성된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. (참고: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원을 결합하는 항체는 항원을 결합하여 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 참고: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol . 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “벡터”는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 증가시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 삽입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
“알킬” 은 노르말, 2차, 3차 또는 환형 탄소 원자를 함유하는 C1-C18 탄화수소이다. 예시는 하기이다: 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3.
본원에 사용된 용어 “C1-C8 알킬”은, 1 내지 8개 탄소 원자을 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소이다. 대표적인 “C1-C8 알킬” 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실; 한편, 분지형 C1-C8 알킬은 비제한적으로 하기를 포함하며: -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸, 불포화된 C1-C8 알킬은 비제한적으로 하기를 포함한다: -비닐, -알릴, -1부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실,-아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1 부티닐. C1-C8 알킬 기는 하기를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 “C1-C12 알킬”은, 1 내지 12개 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소이다. C1-C12 알킬 기는 하기를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 “C1-C6 알킬”은, 1 내지 6개 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소이다. 대표적인 “C1-C6 알킬” 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, 및 -n-헥실; 한편, 분지형 C1-C6 알킬 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 및 2-메틸부틸; 불포화된 C1-C6 알킬 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 및 3-헥실. C1-C6 알킬 기는 C1-C8 알킬 기에 대하여 상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “C1-C4 알킬”은, 1 내지 4개 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소이다. 대표적인 “C1-C4 알킬” 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸; 한편, 분지형 C1-C4 알킬 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸; 불포화된 C1-C4 알킬 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐. C1-C4 알킬 기는 C1-C8 알킬 기에 대하여 상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다.
“알콕시”는 산소에 단일 결합된 알킬 기이다. 예시적인 알콕시 기는, 비제한적으로 메톡시 (-OCH3) 및 에톡시 (-OCH2CH3)를 포함한다. “C1-C5 알콕시”는 1 내지 5개 탄소 원자를 갖는 알콕시 기이다. 알콕시 기는, 알킬 기에 대해 상기 기술된 바와 같이, 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다.
“알케닐”은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 2 이중 결합을 갖는 노르말, 2차, 3차, 또는 환형 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 사이클로펜틸 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2). “C2-C8 알케닐”은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 노르말, 2차, 3차, 또는 환형 탄소 원자를 함유하는 탄화수소이다.
“알키닐”은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 노르말, 2차, 3차, 또는 환형 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예시는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아세틸렌 (-C≡CH) 및 프로파르길 (-CH2C≡CH). “C2-C8 알키닐”은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 노르말, 2차, 3차, 또는 환형 탄소 원자를 함유하는 탄화수소이다.
"알킬렌"은, 모 알칸의 동일한 또는 1개의 상이한 탄소 원자로부터 2개 수소 원자의 제거에 의해 유도된 2개의 1가 라디칼 센터를 갖고, 2-18 탄소 원자의 포화된, 분지형 또는 직쇄형 또는 환식 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌 라디칼은 비제한적으로 하기를 포함한다: 메틸렌 (-CH2-), 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2-) 등.
"알케닐렌"은, 모 알켄의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개 수소 원자의 제거에 의해 유도된 2개의 1가 라디칼 센터를 갖고, 2-18 탄소 원자의 불포화된, 분지형 또는 직쇄형 또는 환식 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알케닐렌 라디칼은 비제한적으로 하기를 포함한다: 1,2-에틸렌 (-CH=CH-).
"알키닐렌"은, 모 알킨의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개 수소 원자의 제거에 의해 유도된 2개의 1가 라디칼 센터를 갖고, 2-18 탄소 원자의 불포화된, 분지형 또는 직쇄형 또는 환식 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적 알키닐렌 라디칼은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파르길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-).
“아릴”은 탄소환식 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 예시는 하기를 비제한적으로 포함한다: 페닐, 나프틸 및 안트라세닐. 탄소환식 방향족 기 또는 헤테로환식 방향족 기는 하기를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
“C5-C20 아릴”은 탄소환식 방향족 환에서 5 내지 20개 탄소 원자를 갖는 아릴 기이다. C5-C20 아릴 기의 예시는 하기를 비제한적으로 포함한다: 페닐, 나프틸 및 안트라세닐. C5-C20 아릴 기는 아릴 기에 대하여 상기 기술된 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있다. “C5-C14 아릴”은 탄소환식 방향족 환에서 5 내지 14개 탄소 원자를 갖는 아릴 기이다. C5-C14 아릴 기의 예시는 하기를 비제한적으로 포함한다: 페닐, 나프틸 및 안트라세닐. C5-C14 아릴 기는 아릴 기에 대하여 상기 기술된 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있다.
“아릴렌”은 2개의 공유 결합을 갖고, 하기 구조에서 나타난 바와 같이 오르쏘, 메타, 또는 파라 입체배치에 있을 수 있는 아릴 기이다:
Figure pct00022
여기서 페닐 기는 하기를 비제한적으로 포함하는 4개 이하의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
“아릴알킬”은, 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 아릴 라디칼로 교체되는 아크릴 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 아릴알킬 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등. 아릴알킬 기는 6 내지 20개 탄소 원자를 포함하며, 예컨대 아릴알킬 기의 알킬 모이어티 (알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기 포함)는 1 내지 6개 탄소 원자이고, 아릴 모이어티는 5 내지 14개 탄소 원자이다.
“헤테로아릴알킬”은, 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 헤테로아릴 라디칼로 교체되는 아크릴 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 헤테로아릴알킬 기는, 비제한적으로, 2-벤즈이미다졸일메틸, 2-푸르일에틸 등을 포함한다. 헤테로아릴알킬 기는 6 내지 20개 탄소 원자를 포함하며, 예컨대 헤테로아릴알킬 기의 알킬 모이어티 (알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기 포함)는 1 내지 6개 탄소 원자이고, 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개 탄소 원자이고, 그리고 1 내지 3개의 헤테로원자는 N, O, P, 및 S로부터 선택된다. 헤테로아릴알킬 기의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7 환 구성원 (2 내지 6개 탄소 원자)을 갖는 단환, 또는 7 내지 10 환 구성원 (N, O, P, 및 S로부터 선택된 4 내지 9개 탄소 원자 및 1 내지 3개 헤테로원자)를 갖는 이환, 예를 들어: 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 계일 수 있다.
“치환 알킬,” “치환 아릴,” 및 “치환 아릴알킬”은 각각, 하나 이상의 수소 원자가 치환체로 각각 독립적으로 대체되는, 알킬, 아릴, 및 아릴알킬을 의미한다. 전형적인 치환체는 비제한적으로 하기를 포함한다: -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO- 3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2 (여기서 각 X 는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br, 또는 I이며; 그리고 각 R은 독립적으로 -H, C2-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로환, 보호기 또는 전구약물 모이어티임). 상기 기술된 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 기 또한 유사하게 치환될 수 있다.
“헤테로아릴” 및 “헤테로환”은, 하나 이상의 환 원자가 예컨대 질소, 산소, 및 황인, 환계를 지칭한다. 헤테로환 라디칼은 3 내지 20개 탄소 원자를 포함하며, 그리고 1 내지 3개의 헤테로원자는 N, O, P, 및 S로부터 선택된다. 헤테로환은 3 내지 7 환 구성원 (2 내지 6개 탄소 원자)을 갖는 단환, 또는 7 내지 10 환 구성원 (N, O, P, 및 S로부터 선택된 4 내지 9개 탄소 원자 및 1 내지 3개 헤테로원자)를 갖는 이환, 예를 들어: 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 계일 수 있다.
예시적 헤테로환은 하기에 기술된다: 예컨대, Paquette, Leo A., “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularly Chapters 1, 3, 4, 6, 7, and 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), in particular Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; 및 J. Am. Chem. Soc . (1960) 82:5566.
헤테로환의 예는 예로써 및 비제한적으로 하기를 포함한다: 피리딜, 디하이드로이피리딜, 테트라하이드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 테트라하이드로티오페닐, 황 산화된 테트라하이드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라하이드로푸라닐, 비스-테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 비스-테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카바졸릴, 카바졸릴, β-카볼리닐, 펜안트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 펜안트롤리닐, 펜아지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 펜옥사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥신돌릴, 벤즈옥사졸리닐, 및 이사티노일.
예로써 및 비제한적으로, 탄소 결합된 헤테로환은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 결합된다. 더욱더 전형적으로, 탄소 결합된 헤테로환은 하기를 포함한다: 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴.
예로써 및 비제한적으로, 질소 결합된 헤테로환은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모폴린의 위치 4, 및 카바졸, 또는 β-카볼린의 위치 9에서 결합된다. 더욱더 전형적으로, 질소 결합된 헤테로환은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 및 1-피페리디닐을 포함한다.
"C3-C8 헤테로환"은 고리 탄소 원자의 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 헤테로원자로 대체되는 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 탄소환을 지칭한다. C3-C8 헤테로환의 대표적인 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴. C3-C8 헤테로환은 하기를 비제한적으로 포함하는 7개 이하의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C8 헤테로사이클로"는 헤테로환 기의 수소 원자 중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의된 C3-C8 헤테로환 기를 지칭한다. C3-C8 헤테로사이클로는 하기를 비제한적으로 포함하는 6개 이하의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
“C3-C20 헤테로환”은 환 탄소 원자 중 1 내지 4개가 O, S 및 N으로 구성된 군 유래의 헤테로원자로 독립적으로 대체되는 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 탄소환을 지칭한다. C3-C20 헤테로환은 하기를 비제한적으로 포함하는 7개 이하의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C20 헤테로사이클로"는 헤테로환 기의 수소 원자 중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의된 C3-C20 헤테로환 기를 지칭한다.
"탄소환"은 단환으로서 3 내지 7 탄소 원자 또는 이환으로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 포화된 또는 불포화된 고리를 의미한다. 단환식 탄소환은 3 내지 6 고리 원자, 더욱더 전형적으로 5 또는 6 고리 원자를 갖는다. 이환식 탄소환은, 예를 들면 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열된 7 내지 12 고리 원자, 또는 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열된 9 또는 10 고리 원자를 갖는다. 단환식 탄소환의 예는 하기를 포함한다: 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸.
"C3-C8 탄소환"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 포화된 또는 불포화된 비-방향족 탄소환식 환이다. 대표적인 C3-C8 탄소환은, 비제한적으로, -사이클로프로필, -사이클로부틸, -사이클로펜틸, -사이클로펜타디에닐, -사이클로헥실, -사이클로헥세닐, -1,3-사이클로헥사디에닐, -1,4-사이클로헥사디에닐, -사이클로헵틸, -1,3-사이클로헵타디에닐, -1,3,5-사이클로헵타트리에닐, -사이클로옥틸, 및 -사이클로옥타디에닐을 포함한다. C3-C8 탄소환 기는 하기를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 기로 비치환 또는 치환될 수 있다: -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2 -NHC(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 및 -CN; 여기서 각 R’ 는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C8 카보사이클로"는 탄소환 기의 수소 원자 중 하나가 결합으로 대체되는 상기 정의된 C3-C8 탄소환 기를 지칭한다.
"링커"는 약물 모이어티에 항체를 공유적으로 부착하는 원자의 사슬 또는 공유 결합을 포함한 화학 모이어티를 지칭한다. 각종 구현예에서, 링커는 하기를 포함한다: 2가 라디칼 예컨대 알킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일, 모이어티 예컨대: (CR2)nO(CR2)n, 알킬옥시 (예를 들면 폴리에틸엔옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예를 들면 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM)의 반복 단위; 및 석시네이트, 석신아미드, 디글라이콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함한 이산 에스테르 및 아미드. 각종 구현예에서, 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 발린, 페닐알라닌, 리신, 및 호모리신을 포함할 수 있다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비-중첩성 (non-superimposability)의 특성을 갖는 분자를 나타내는 반면에, 용어 "아키랄 (achiral)"은 그들의 거울상 파트너 상에 중첩할 수 있는 분자를 나타낸다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간에서 원자 또는 그룹의 배열에 관해서는 상이한 화합물을 나타낸다.
"부분입체이성체"는 2 개 또는 그 이상의 키랄 중심을 가지며, 이의 분자가 서로의 거울상이 아닌 입체이성체를 나타낸다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예컨대 녹는점, 끓는점, 스펙트럼 특성, 및 반응성을 가진다. 부분입체이성체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분할 검정절차에 따라 분리시킬 수 있다.
"에난티오머"는 서로의 비-중첩성 거울상인 화합물의 2 개의 입체이성체를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 입체화학적 정의 및 관용어는 일반적으로 하기에 따른다: S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. 여러 유기 화합물이 광학적으로 활성인 형태로 존재한다. 즉, 평면-편광의 평면을 회전시키는 능력을 가진다. 광학적으로 활성인 화합물의 기재에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 분자의 부제성 중심(들)에 대하여 분자의 절대 입체배치를 표시하기 위하여 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광의 회전의 부호를 나타내기 위하여 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. (+) 또는 d가 접두사인 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에 있어서, 이들 입체이성질체는 이들이 서로 거울상임을 제외하고 동일하다. 특정의 입체이성체는 또한 에난티오머로 불릴 수 있으며, 이러한 이성체의 혼합물은 종종 에난티오머 혼합물로 칭할 수 있다. 에난티오머의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세메이트로 불리며, 이것은 화학적 반응 또는 과정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 나타날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세메이트"는 광학적 활성이 없는 2 개의 에난티오머 종의 동몰성 혼합물을 나타낸다.
"이탈 기"는 또 다른 작용기에 의해 치환될 수 있는 작용기를 지칭한다. 특정 이탈 기는 당해 기술에서 잘 알려지고, 예는, 비제한적으로, 할라이드 (예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 메탄설포닐 (메실), p-톨루엔설포닐 (토실), 트리플루오로메틸설포닐 (트리플레이트), 및 트리플루오로메틸설포네이트를 포함한다.
용어 "보호기"는 화합물 상의 특정 작용기를 차단 또는 보호하는 한편 다른 작용기와 반응하기 위하여 통상적으로 사용되는 치환기를 지칭한다. 예를 들어, "아미노-보호기"는 화합물 중의 아미노 작용기를 차단 또는 보호하는, 아미노 기에 부착된 치환기이다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카보닐(BOC), 벤질옥시카보닐 (CBZ) 및 9-플루오렌일메틸렌옥시카보닐(Fmoc)을 비제한적으로 포함한다. 보호기 및 이들의 사용에 대한 일반적인 기술에 대하여, 하기를 참고한다: T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, or a later edition.
II.조성물 및 방법
일 양태에서, 본 발명은 부분적으로, HER2에 결합하는 항체 및 그러한 항체를 포함하는 면역콘주게이트를 기반으로 한다. 본 발명의 항체 및 면역콘주게이트는, 예를 들어, HER2-양성 암의 진단 또는 기반에 유용하다.
A. 예시적인 항- HER2 항체
HER2의 도메인 I에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체는 트라스투주맙 및/또는 퍼투주맙의 HER2로의 결합을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 트라스투주맙의 HER2로의 결합을 저해하지 않고, 퍼투주맙의 HER2로의 결합을 저해하지 않는다. 본원에 기술된 구현예 중 임의의 것에서, 항체는 단클론성 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
신호 서열을 갖는 예시적인 천연 발생 인간 HER2 전구체 단백질 서열 (아미노산 1-22)은 서열 번호: 1에 제공되고, 상응 성숙 HER2 단백질 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 23-1255에 상응한다. 일부 구현예에서, HER2의 도메인 I은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 갖고, 도메인 II는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 갖고, 도메인 III는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 갖고, 그리고 도메인 IV는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 갖는다 (도 16 참조).
항체 hu7C2 및 기타 구현예
일부 구현예에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-HER2 항체를 제공한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및, (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일부 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항-HER2 항체를 제공한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개 HVR: (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (c) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (d) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및, (e) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
일 양태에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 일 구현예에서, 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호: 17 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다. 추가 구현예에서, 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 구현예에서, 항체는 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3. 일 구현예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1 (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 하기를 포함한다: (a) 하기로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인: (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및, (iii) 서열 번호: 17의 아미노산 서열로부터 선택된 HVR-H3, 및 (b) 하기로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인: (i) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및, (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
임의의 상기 구현예에서, 항-HER2 항체는 인간화된 것이다. 한 구현예에서, 항-HER2 항체는 임의의 상기 구현예에서와 같이 HVR를 포함하고, 그리고 추가로, 인간 수용체 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1 이다. 특정 구현예에서, 인간 수용체 프레임워크는 본원에 기술된 돌연변이 중 임의의 하나를 포함하는, 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1 이다.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HER2 항체는 HER2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호: 11에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산은 서열 번호: 11에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR 에서)에서 발생한다. 임의로, 항-HER2 항체는 서열 번호: 11의 VH 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, VH 는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체가 제공되고, 여기서, 상기 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HER2 항체는 HER2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호: 10에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산은 서열 번호: 10에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 구현예에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-HER2 항체는 서열 번호: 10의 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, VL 은 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체가 제공되고, 여기서, 상기 항체는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열 번호: 11 및 서열 번호: 10 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
추가의 측면에서, 본원에 제공된 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 서열 번호: 11의 VH 서열 및 서열 번호: 10의 VL 서열을 각각 포함하는, 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체는 서열 번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 19의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 중쇄 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HER2 항체는 HER2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호: 19에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산은 서열 번호: 19에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR 에서)에서 발생한다. 임의로, 항-HER2 항체는 서열 번호: 19의 중쇄 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체가 제공되고, 여기서, 상기 항체는 서열 번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 서열 번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 경쇄 서열은 참조 서열에 관하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-HER2 항체는 HER2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호: 18에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산은 서열 번호: 18에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 구현예에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 이외의 영역(즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-HER2 항체는 서열 번호: 18의 경쇄 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄는 하기로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR을 포함한다: (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 측면에서, 항-HER2 항체가 제공되고, 여기서, 상기 항체는 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 중쇄 및 상기 제공된 임의의 양태에서와 같은 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열 번호: 19 및 서열 번호: 18 각각의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하며, 이는 각각, 상기 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
추가의 측면에서, 본원에 제공된 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 각각 서열 번호: 19의 중쇄 서열 및 서열 번호: 18의 경쇄 서열을 포함하는, 항-HER2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
하기를 포함하는 항체가 본원에 제공된다: 경쇄 가변 도메인 (도 1에 도시된 카밧 넘버링에 따른 HVR1-LC, HVR2-LC 및 HVR3-LC 서열 포함) 및 중쇄 가변 도메인 (도 2에 도시된 카밧 넘버링에 따른 HVR1-HC, HVR2-HC 및 HVR3-HC 서열 포함). 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: 도 1에 도시된 바와 같은, HVR1-LC, HVR2-LC 및/또는 HVR3-LC 서열, 및 FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC 및/또는 FR4-LC 서열. 일부 구현예에서, 항체는 하기를 포함한다: 중쇄 가변 도메인 (HVR1-HC, HVR2-HC 및 HVR3-HC 서열 포함) 및/또는 중쇄 가변 도메인 (FR1-HC, FR2-HC 및 FR3-HC 및/또는 FR4-HC 서열 포함).
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 구현예에 따른 항-HER2 항체는, 인간 항체를 포함하는, 단클론성 항체이다. 일 구현예에서, 항-HER2 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 2중체, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 실질적 전장 항체, 예를 들면, IgG1 항체, IgG2a 항체, 또는 본원에서 정의된 바와 같이 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가의 측면에서, 상기 임의의 양태에 따른 항-HER2 항체는 하기에 기재된 바와 같이단독으로 또는 조합적으로 임의의 특징을 혼입할 수 있다.
1.항체 친화도
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　50 nM, ≤　10 nM, ≤　5 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM, 및 임의로 ≥　10-13 M. (예를 들어, 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
하나의 양태에서, Kd는 하기의 검정에 의해 기재된 바와 같은 목적하는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원과 함께 수행된 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 일련의 적정된 비표지된 항원의 존재하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체 코팅된 플레이트로 포획함에 의해 측정된다 (예를 들어, 참고: Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999)). 검정용 조건을 수립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml로 밤새 코팅되고, 그리고 그 뒤에 2 내지 5 시간동안 실온 (대략 23℃)에서 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 해당 Fab의 연속 희석으로 혼합된다 (예를 들면, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). 그 다음 해당 Fab는 밤새 항온처리되지만; 그러나, 항온처리는 평형이 달성됨을 확인하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들면, 약 65 시간)동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 (예를 들면, 1 시간 동안) 항온처리를 위해 포착 플레이트로 이동된다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시키는 경우, 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20 TM; Packard)를 첨가하고 플레이트는 10분 동안 TOPCOUNT TM 감마 카운터 (Packard) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 구현예에 따라서, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정은 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 수행된다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 이의 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 아세트산나트륨으로 5 μg/ml (0.2 μΜ) 까지 희석되고, 그 다음 5 μl/분의 유속으로 주입되어 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성한다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석된 Fab (0.78 nM 내지 500 nM)를 대략 25 μl/min의 유속으로 25°C 에서 PBS 중에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)와 함께 사용한다. 결합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델 (BIACORE® Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 참고, 예를 들면, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). 만일 가역속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1 를 초과하면, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 항원의 증가 농도의 존재하에 25 ℃에서 pH 7.2, PBS내 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 가역 속도는 측정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기된 다른 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 참고 Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). scFv 단편의 검토를 위하여, 예를 들면, 다음을 참고하며: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 또한 다음을 참고한다: WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458. 셀비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 검토를 위해서는, U.S. 특허 제5,869,046호를 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참고: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디가 또한 하기에 기술된다: Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003).
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,248,516 B1)이다.
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 무손상 항체의 단백질 가수분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예컨대, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술들로 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들면 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). 일 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유도된 가변 영역)과 인간 불변영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류로부터 변화된 “부류 스위칭된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되어 있고 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는, HVR, 예를 들면, CDR, (또는 그 일부)가 비인간 항체로부터 유도되고, FR (또는 그 일부)가 인간 항체 서열로부터 유도되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들면, 하기에 고찰되고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008), 그리고 추가로 하기에 기재된다: 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (하기를 기술: SDR (a-CDR) 그래프팅); Padlan, Mol . Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기재함).
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역에는 비제한적으로 하기: "최적-피팅" 방법을 이용해서 선택된 프레임워크 영역(예를 들면, 참고: Sims et al. J. Immunol . 151:2296 (1993)); 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Carter et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol ., 151:2623 (1993)); 인간 성숙(체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, 참고: Almagro and Fransson, Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고: 예를 들어, Baca et al., J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)).
4. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 다음 문헌에 기재되어 있다: van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin . Immunol . 20:450-459 (2008).
인간 항체는 항원 시험(antigenic challenge)에 응답하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 제조하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자좌 모두 또는 일부를 함유한다. 상기 유전자전이 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되어 있다. 형질전환 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 하기를 참조한다: Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). 참고 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 VelociMouse® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900). 이와 같은 동물에 의해 생성된 무손상 항체의 인간 가변 영역은, 예컨대 상이한 인간 불변영역과 조합함으로써, 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 혼성세포 기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다. (참고: 예를 들어, Kozbor J. Immunol ., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B 세포 혼성세포 기술을 통해 제조된 인간 항체가 또한 다음 문헌에 기재되어 있다: Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006). 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,189,826 (혼성세포 세포주로부터 단클론성 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 혼성세포 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 혼성세포 기술 (Trioma technology)은 또한 다음 문헌에 기재되어 있다: Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
인간 항체는 또한 인간 유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인서열을 단리시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재되어 있다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하고 목적하는 결합 특징을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 각종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 하기에 검토되며: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 추가로 하기에 검토된다: 예를 들어, the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004).
일부 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 파아지는 전형적으로 단일쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 혼성세포를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 단순 레퍼토리는 (예를 들면, 인간으로부터) 클로닝되어 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 725-734 (1993). 최종적으로, 순수 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 분절을 클로닝하고 고도의 가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있고, 이는 다음 문헌에 기재된 바와 같다: Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992). 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어, 다음의 문헌을 포함한다: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360.
인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체이다. 다중특이성 항체는 최소한 두 개의 상이한 자리에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성들 중 하나는 HER2에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성들 중 하나는 HER2에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 CD3에 대한 것이다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,821,337. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 HER2 의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 HER2 를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시 발현 (참고: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 및 "크놉-인-홀" 가공 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "크놉-인투-홀(knob-into-hole)" 또는 "KnH"는, 돌출부 (크놉)을 일 폴리펩티드에, 공동(홀)을 다른 폴리펩티드에 그들이 상호작용하는 계면에 도입함으로써 시험관내 또는 생체내 2개으 폴리펩티드를 함께 짝짓기하도록 지시하는 기술을 지칭한다. 예를 들어, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 계면, CL:CH1 계면 또는 VH/VL 계면 내에 도입된다 (예를 들어, US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, Zhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788, 및 WO2012/106587). 일부 구현예에서, 이는 특히 다중특이적 항체의 제조 동안 2개의 상이한 중쇄를 함께 짝짓기하는 것을 촉진하는데 유용하다. 예를 들어, 이들의 Fc 영역 내 KnH를 갖는 다중특지적 항체는 추가로, 각 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 포함하거나, 또는 추가로, 유사하거나 상이한 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루는 상이한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. KnH 기술은 또한, 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인을 함께, 또는 상이한 표적 인식 서열 (예컨대, 아피바디, 펩티바디, 및 기타 Fc 융합)을 포함하는 임의의 기타 폴리펩티드를 짝짓기하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “크놉(knob) 돌연변이”는, 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 상호작용하는, 계면에서 폴리펩티드로 돌출부 (크놉)을 도입시키는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 기타 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 갖는다.
본원에 사용된 용어 “홀(hole) 돌연변이”는, 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 상호작용하는, 계면에서 폴리펩티드로 공동 (홀)을 도입시키는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 기타 폴리펩티드는 크놉 돌연변이를 갖는다.
간단한 고찰이 하기에 제공된다.
"돌출부"는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출되고, 따라서 이종이량체를 안정화시키기 위하여, 인접 계면 (즉, 제2 폴리펩티드의 계면) 내의 보충적 공동 내에 위치가능하고, 그리고 이로써 이종이량체 형성을, 예를 들어 동종다량체의 형성보다 용이하게 하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 본래의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로(예를 들어, 계면을 암호화하는 핵산을 변화시킴에 의해) 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 계면을 암호화하는 핵산은 돌출부(protuberance)을 암호화하도록 변형된다. 이를 성취하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 "본래의" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산은 본래의 아미노산 잔기보다 큰 측쇄 용적을 갖는 적어도 하나의 "유입(import) 아미노산 잔기"를 암호화하는 핵산으로 대체된다. 하나 초과의 원래의 및 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 용적은 예를 들어, US2011/0287009의 표 1에 나타난다. “돌출부”를 도입시키는 돌연변이는 “크놉 돌연변이”로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 돌출부를 형성하기 위한 유입 잔기는 천연 발생 아미노산 잔기이고 아르기닌(R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유입 잔기는 트립토판 또는 티로신이다. 일부 구현예에서, 돌출부의 형성에 대한 원 잔기는 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같이 작은 측쇄 용적을 갖는다.
"공동(cavity)"은 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 오목하고, 따라서 제1 폴리펩티드의 인접한 계면 상에 상응하는 돌출부 ("크놉")을 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 공동은 본래의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로(예를 들어, 계면을 암호화하는 핵산을 변화시킴에 의해) 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 계면을 암호화하는 핵산은 공동(cavity)을 암호화하도록 변형된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 인터페이스에서의 적어도 하나의 "원래의" 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산이 원래의 아미노산 잔기보다 작은 부사슬 용적을 가지는 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기를 암호화하는 DNA에 의해 대체된다. 하나 초과의 원래의 및 상응하는 유입 잔기가 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 공동을 형성하기 위한 유입 잔기는 천연 아미노산 잔기이고 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유입 잔기는 세린, 알라닌 또는 트레오닌이다. 일부 구현예에서, 공동의 형성에 대한 원 잔기는 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판과 같이 큰 측쇄 용적을 갖는다. “공동”을 도입시키는 돌연변이는 “홀 돌연변이”로 지칭될 수 있다.
돌출부는 공동에서 "배치 가능"하고, 이것은 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 인터페이스 상의 돌출부 및 공동의 공간 위치 및 돌출부 및 공동의 크기가, 돌출부가 인터페이스에서의 제1 및 제2 폴리펩티드의 일반 회합을 상당히 방해하지 않으면서 공동에 배치될 수 있게 한다는 것을 의미한다. 돌출부, 예컨대 Tyr, Phe 및 Trp가 통상적으로 인터페이스의 축으로부터 직각으로 연장되지 않고 바람직한 입체형태를 가지지 않으므로, 상응하는 공동에 의한 돌출부의 정렬은 예컨대 X선 결정학 또는 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance: NMR)에 의해 얻은 3차원 구조에 기초하여, 일부 경우에, 돌출부/공동 쌍을 모델링하는 것에 의존할 수 있다. 이는 본 분야에서 널리 수용된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 내 크놉 돌연변이는 T366W (EU 넘버링)이다. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 내 홀 돌연변이는 하기를 포함한다: T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링)로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, IgG1 불변 영역 내 홀 돌연변이는 하기를 포함한다: T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링).
일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 내 크놉 돌연변이는 T366W (EU 넘버링)이다. 일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 내 홀 돌연변이는 하기를 포함한다: T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링)로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이. 일부 구현예에서, IgG4 불변 영역 내 홀 돌연변이는 하기를 포함한다: T366S, L368A 및 Y407V (EU 넘버링).
다중 특이적 항체는 또한 다음과 같이 제조될 수 있다: 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공함에 의해 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합시킴에 의해 (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 제조하디 위한 "디아바디" 기술을 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); 및 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함에 의해(문헌참조: 예를 들어, Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)); 및 다음 문헌에 기재된 바와 같이 3특이적 항체를 제조함에 의해, 예를 들어, Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991).
"옥토퍼스 항체"를 포함하는, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체는 또한 본원에 포함된다(문헌참조: 예를 들어 US 2006/0025576A1).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 HER2 및 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이원 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(문헌참조: 예를 들어 US 2008/0069820).
7. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 향상시키는 것이 바람직한 일일 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 적당한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기들로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결손, 삽입 및 치환의 어떠한 조합이 이루어져서 최종 구조체에 도달할 수 있는데, 단, 상기 최종 구조체는 바람직한 특징, 예컨대, 항원-결합을 갖는다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이 유발을 위한 목적하는 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환."의 제목하에 표 1에서 보여준다. 보다 실질적 변화는 "예시적 치환"의 표제하에 표 1에 제공되고, 추가로 아미노산 측쇄 부류를 참조로 하기에 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 목적하는 활성, 예컨대, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 선별된 제품 및 관심 항체에 도입될 수 있다.
표 1
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아미노산은 통상의 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 다른 부류로 교체함을 수반할 것이다.
치환 변이체의 일 유형은 친계 항체 (예컨대, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 생성된 변이체(들)는 친계 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 변형(예컨대, 개선)을 갖고/갖거나 친계 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 통상적으로 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기를 성숙시키고, 변이체 항체를 파지 상에 디스플레이시키고, 특정 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다.
변형(예컨대, 치환)은 HVR에서, 예컨대, 항체 친화도를 개선시키기 위해 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟," 즉, 체세포 성숙 공정 동안 높은 빈도로 돌연변이하는 코돈에 의해 암호화된 잔기 (참고, 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기에 의해 실시될 수 있고, 수득한 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) 친화성 성숙화의 일부 양태에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 발생 경향 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙화를 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이후 2차 라이브러리가 형성된다. 이후 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기(예컨대, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 특히, 예컨대, 알라닌 주사 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링을 사용하여 식별할 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 흔히 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변형이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변형(예컨대, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변형은 HVR “핫스팟” 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR는 변형되지 않거나, 또는 하나 이상, 두 개 또는 세 개의 아미노산 치환을 함유하지 않는다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기들 또는 영역들의 동정을 위해 유용한 방법은다음 문헌에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. 이 방법에서는, 표적 잔기들(예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 그룹을 동정하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지를 측정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감도를 입증하는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 접촉을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 동정하기 위하여 사용된다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기가 치환을 위한 후보물질로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1 잔기 내지 100 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 또 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예컨대, ADEPT에 대한)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변형된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있어서 하나 이상의 글리코실화 부위는 제조 또는 제거된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 원상태 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결부에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 2분지 올리고당을 포함한다. 참고: 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2분지 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 실시될 수 있다.
한 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 부족한 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 상기 항체에서 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광계에 의하여 측정 시, Asn 297에 부착된 모든 당구조(glycostructure) (예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 총합과 비교하여, Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코오스의 평균 양을 산출함으로써 측정될 수 있다. Asn297은 Fc 영역에서의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 배치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 그러나, Asn297은, 항체내 작은 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294 와 300 사이에 또한 배치될 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변종은 ADCC 작용을 향상시킬 가능성이 있다. 예컨대, 미국 특허 공보 번호 US 2003/0157108(Presta, L.); US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. “탈푸코실화된” 또는 “푸코스-결핍” 항체 변이체와 관련된 공보의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참고, 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107).
항체 변이체는 이등분한 올리고당으로 추가 제공되고, 예를 들면, 여기에서 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 상기 항체 변이체는 푸코실화를 감소시킬 수 있고/있거나 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체의 예는, 예를 들면, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재된다. Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기 항체 변이체는 CDC 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재된다.
c) Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역속에 도입될 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 발생시킨다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 모든 반응기 작용은 아니지만 일부 반응기 작용을 지니는 항체 변종을 고려하며, 이 기능은 상기 항체 변종을 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 반응기 기능(예컨대 보완 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 용도에 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 경감/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족하지만 (따라서 유사하게 ADCC 활성 부족), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 확보하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포 매개용 1차 세포는 Fc(RIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 하기에 기재된다: 미국 특허 번호 5,500,362 (참고, 예를 들면 Hellstrom, I. et al. Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I et al., Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참고 Bruggemann, M. et al., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)). 대안적으로, 하기와 같은 비-방사능활성 검정 방법이 사용될 수 있다: 예를 들어, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비 방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 그와 같은 검정을 위해 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al. Proc . Nat’l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998). C1q 결합 검정은 또한 항체가 C1q를 결합할 수 없음에 따라서 CDC 활성이 부재임을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 참고, 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참고, 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 또한 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참고, 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int ’l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어, 이에 의해 신생아 Fc 수용체에 대한 IgG 결합을 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따라 하기 3개의 돌연변이를 포함한다: M252Y, S254T, 및 T256E (“YTE 돌연변이”) (미국 특허 번호: 8,697,650; 또한 참고: Dall’Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006)). 특정 구현예에서, YTE 돌연변이는 이의 동원 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향을 미치지 않는다. 특정 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다. 일부 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 3 배 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 2 배 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 4 배 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 적어도 5 배 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, YTE 돌연변이는, 천연 (즉 비-YTE 돌연변이체) 항체와 비교하여, 항체의 혈청 반감기를 적어도 10 배 만큼 증가시킨다. 참고: 예컨대 US 특허 번호: 8,697,650; 또한 참고: Dall’Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
특정 구현예에서, YTE 돌연변이체는 항체의 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 조절하는 수단을 제공한다. 특정 구현예에서, YTEO 돌연변이체는 인간 항원에 대해 지시된 인간화 IgG 항체의 ADCC 활성을 조절하는 수단을 제공한다. 참고: 예컨대 US 특허 번호: 8,697,650; 또한 참고: Dall’Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
특정 구현예에서, YTE 돌연변이는, 혈청 반감기, 조직 분포, 및 항체 활성 (예컨대 IgG 항체의 ADCC 활성)의 동시 조절을 가능케한다. 참고: 예컨대 US 특허 번호: 8,697,650; 또한 참고: Dall’Acqua et al., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
감소된 효과기 기능을 가진 항체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 제6,737,056호). 상기 Fc 돌연변이체는, 알라닌에 대해 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 2 또는 그 초과의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
특정 구현예에서, 야생형 인간 Fc 영역의 위치 329 (EU 넘버링) (P329)에서 프롤린은, Fc의 P329와 FcgRIII의 트립토판 잔기 W87 및 W110 사이에서 형성된, Fc/Fc□ 수용체 인터페이스 내에서 프롤린 샌드위치(proline sandwich)를 파괴하기에 충분히 큰 글리신 또는 아르기닌 또는 아미노산 잔기로 치환된다 (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 July 2000)). 추가 구현예에서, Fc 변이체에서 적어도 1종의 추가 아미노산 치환은 S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, 또는 P331S이고 또한 또 다른 구현예에서 상기 적어도 1종의 추가 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E이고, 모두 EU 넘버링 (그 전체가 참고로 편입된 미국 특허 번호 8,969,526)에 따른다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역의 Fc 변이체를 포함하고 여기에서 폴리펩티드는 글리신으로 치환된 인간 IgG Fc 영역의 P329를 갖고 Fc 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A에서 적어도 2종의 추가 아미노산 치환 또는 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E를 포함하고, 잔기는 EU 넘버링 (그 전체가 참고로 편입된 미국 특허 번호 8,969,526)에 따라 넘버링된다. 특정 구현예에서, P329G, L234A 및 L235A (EU 넘버링) 치환을 포함한 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 포함한 폴리펩티드에 의해 유도된 ADCC의 적어도 20%까지 ADCC의 다운-조절을 위하여, 및/또는 ADCP의 다운-조절 (그 전체가 참고로 편입된 미국 특허 번호 8,969,526)을 위하여, 인간 FcγRIIIA 및 FcγRIIA에 대해 감소된 친화도를 나타낸다.
특이적 구현예에서 야생형 인간 Fc 폴리펩티드의 Fc 변이체를 포함한 폴리펩티드는 삼중 돌연변이: EU 넘버링 (P329 / LALA) (그 전체가 참고로 편입된 미국 특허 번호 8,969,526)에 따른 위치 Pro329, L234A 및 L235A 돌연변이에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 하기 아미노산 치환을 포함한다: EU 넘버링에 따른 P329G, L234A, 및 L235A.
FcRs로의 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 하기 참고: 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001).)
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다 (잔기의 EU 넘버링).
일부 구현예에서, 변경은 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역 내에서 제조된다: 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000).
증가된 반감기 및 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용하는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재된다. 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 그안에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 하기 참고: Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351.
d) 시스테인 가공된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 "THIOMAB™"을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 콘주게이션에 대해 이용가능한 항체의 부위에서 발생한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기는 그렇게 함으로써 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항체를 콘주게이트하는데 사용되어, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, 면역콘주게이트를 제조할 수 있다. 특정 양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 K149 (카밧 넘버링); 경쇄의 V205 (카밧 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 중쇄의 A140 (EU 넘버링); 중쇄의 L174 (EU 넘버링); 중쇄의 Y373 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 하기를 포함한다: HC-A140C (EU 넘버링) 시스테인 치환. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 하기를 포함한다: LC-K149C (카밧 넘버링) 시스테인 치환. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 하기를 포함한다: HC-A118C (EU 넘버링) 시스테인 치환. 시스테인이 조작된 항체는 예컨대, 미국 특허 제7,521,541호에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 하기 중쇄 시스테인 치환 중 하나를 포함한다:
Figure pct00024
특정 구현예에서, 항체는 하기 경쇄 시스테인 치환 중 하나를 포함한다:
Figure pct00025
비제한적 예시적 hu7C2.v2.2.LA 경쇄 (LC) K149C THIOMAB™ 는, 하기를 갖는다: 서열 번호: 19 및 23, 각각의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열. 비제한적 예시적 hu7C2.v2.2.LA 중쇄 (HC) A118C THIOMAB™ 는, 하기를 갖는다: 서열 번호: 24 및 18, 각각의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열.
예시적 S400C 시스테인 가공된 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 28에 나타난다. 28. S400C 시스테인 가공 중쇄 불변 영역은 하기에 결합될 수 있다: hu7C2.v2.2.LA 중쇄 가변 영역 (서열 번호: 11에 나타남). 생성된 v2.2.LA HC S400C 중쇄는 하기와 쌍형성할 수 있다: v2.2.LA 카파 경쇄, 예컨대 경쇄 (서열 번호: 18에 나타남).
예시적 V205C 시스테인 가공된 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 25에 나타난다. V205C 시스테인 가공 경쇄 불변 영역은 하기에 결합될 수 있다: hu7C2.v2.2.LA 경쇄 가변 영역 (서열 번호: 10에 나타남). 생성된 hu7C2.v2.2.LA LC V205C 경쇄는 하기와 쌍형성할 수 있다: hu7C2.v2.2.LA IgG 중쇄, 예컨대 중쇄 (서열 번호: 19에 나타남).
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되어 있고 쉽게 이용 가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적 예에는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-l,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서 그 안정성 때문에 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 만일 1 초과 폴리머가 부착되면, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은, 만일 항체 유도체가 한정된 조건하에서의 요법 등에서 사용된다면, 비제한적으로, 개선되는 항체의 특정한 특성 또는 기능을 포함하는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티 및 항체의 복합체가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (참고: Kam et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있으며, 보통의 세포에는 유해하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸하는 온도로 가열시키는 파장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 구현예에서, 본원에서 기재된 항-HER2 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 암호화할 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 일 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들면, 하기로 변형된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프모양 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-HER2 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 방법은 항체의 발현을 위해 적합한 조건 하에서 상기 제공된 바와 같이 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-HER2 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 단리 및 삽입된다. 이러한 핵산은 통상의 과정들(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 쉽게 단리하고 서열검정할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 및 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523. (또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술)). 발현 이후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
발현 후, 항체를 가용성 단편의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 일부 또는 전부 인간 글리코실화된 패턴을 갖는 항체를 생성할 수 있는 진균 및 효모 균주를 포함한 사상균 또는 효모균과 같은 진핵 미생물이 항체-암호화 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인된다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체 생산용 PLANTIBODIESTM 기술 기재).
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁제에서 성장하도록 적응되는 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)에 기재된 바와 같이 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같이 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)에 기재된 바와 같이 TRI 세포); MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하고, 이는 DHFR- CHO 세포 (참고: Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 참고, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
C. 검정
본원에서 제공된 항-HER2 항체는 당해기술에서 공지된 다양한 검정에 의해 그 물리적/화학 특성 및/또는 생물학적 활성으로 확인, 스크리닝, 또는 특징화될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 공지된 방법 예컨대 ELISA, BIACore®, FACS, 또는 웨스턴 블랏에 의해 그 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 검정은 본원에서 기재된 HER2로의 결합을 위해 본원에 기술된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 항체는 크레네주맙 또는 본원에 기술된 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 세부적인 예시적 방법은 다음 문헌에 제공되어 있다: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 HER2는 HER2 (예를 들면, 본원에 기술된 임의의 항체)에 결합하는 제1 표지된 항체 및 HER2에의 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 그 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 혼성세포 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 HER2는 제2 비표지된 항체가 아닌 제1 표지된 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. HER2로의 제1 항체의 결합에 허용된 조건 하에서 항온처리 이후, 과잉의 미결합된 항체는 제거되고, 고정된 HER2에 관련된 표지의 양이 측정된다. 만일 고정된 HER2에 관련된 표지의 양이 대조군 샘플에 비하여 시험 샘플에서 실질적으로 감소되면, 그러면 그것은 제2 항체가 HER2에 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 것을 나타낸다. 참고: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
D. 면역콘주게이트
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제성 제제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사콘주게이트)에 콘주게이트되는 본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체를 포함하는 면역콘주게이트를 제공한다.
면역콘주게이트는 약물 모이어티의 종양으로의 표적화된 전달, 및, 일부 구현예에서 그 안의 세포내 누적을 가능케 하고, 여기서 비콘주게이트된 약물의 전신성 투여가 정상 세포로의 허용불가능한 독성 수준을 유발할 수 있다 (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-약물 콘주게이트 (ADC)는 표적화된 화학치료적 분자이며, 이는 항원-발현 종양 세포로 강력한 세포독성제을 표적화함으로써 항체 및 세포독성제 둘 다의 특성을 조합하며 (Teicher, B.A. 2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), 이로써 효능을 최대화하고 오프-타겟 독성을 최소화함으로써 치료학적 지수를 증진시킨다 (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc . Chem . Res. 41:98-107 .
본 발명의 ADC 화합물은 항암 활성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, ADC 화합물은 약물 모이어티에 콘주게이트된, 즉 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체를 통하여 약물 모이어티에 공유적으로 부착된다. 본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 유효량의 약물을 종양 조직에 선택적으로 송달함으로써 더 큰 선택성, 즉 더 작은 유효량이 달성되는 한편, 치료 지수 ("치료적 윈도우(therapeutic window)")를 증가시킬 수 있다.
항체-약물 콘주게이트 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는, 세포독성 또는 세포휴지 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티, 또는 기를 포함할 수 있다. 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 상호작용, 및 RNA 폴리머라아제, 단백질 합성, 및/또는 토포이소머라아제 억제를 비제한적으로 포함하는 기전에 의한 이들의 세포독성 및 세포정지 효과에 영향을 줄 수 있다. 예시적 약물 모이어티는 비제한적으로 하기를 포함한다: 메이탄시노이드, 돌라스태틴, 오리스타틴, 칼리키아마이신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 네모루비신 및 이의 유도체, PNU-159682, 안트라사이클린, 듀오카르마이신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 캄프토테신, 엘리나피드, 및 입체이성질체, 동배체, 유사체 및 이의 유도체 (세포 독성을 가짐). 상기 면역콘주게이트의 비제한적 예시는 하기에 추가로 자세히 논의된다.
1. 예시적 항체-약물 콘주게이트
항체-약물 콘주게이트 (ADC) 화합물의 예시적 구현예는 종양 세포를 표적하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및/또는 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 부착된다.
예시적 ADC는 하기 화학식 I을 갖는다:
Ab-(L-D)p I
여기에서 p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, 항체에 콘주게이트될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 구현예에서, 유리 시스테인 잔기는 본원에서 기재된 방법에 의해 항체 아미노산 서열 속에 도입된다. 화학식 I의 예시적 ADC는, 비제한적으로, 1, 2, 3, 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다 (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 구현예에서, 하나 이상의 유리 시스테인 잔기는, 조작의 사용 없이, 항체에 이미 존재하고, 이 경우에 현존하는 유리 시스테인 잔기는 항체를 약물에 콘주게이트하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 유리 시스테인 잔기를 생성하기 위해 항체의 콘주게이션에 앞서 환원 조건에 노출된다.
a) 예시적 링커
"링커" (L)는 하나 이상의 약물 모이어티 (D)를 항체 (Ab)에 연결하여 화학식 I의 항체-약물 콘주게이트 (ADC)를 형성하기 위해 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 모이어티이다. 일부 구현예에서, 항체-약물 콘주게이트 (ADC)는 약물 및 항체에 공유 부착을 위하여 반응성 작용기를 갖는 링커를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커의 반응성 작용기 또는 약물-링커 중간체와 결합을 형성하여 ADC를 만들 수 있다.
한 측면에서, 링커는 공유 결합을 형성하기 위해 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응할 수 있는 작용성을 갖는다. 비제한적 예시적 상기 반응성 작용기는 하기를 포함한다: 말레이미드, 할로아세트아미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르 예컨대 석신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 설포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트. 참고: 예를 들면, Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773의 766쪽의 콘주게이션 방법, 및 본원의 실시예.
일부 구현예에서, 링커는 항체 상에 존재한 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용성을 갖는다. 예시적 상기 친전자성 기는, 비제한적으로, 알데하이드 및 케톤 카보닐 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커의 반응성 작용성의 헤테로원자는 항체 상에서 친전자성 기와 반응할 수 있고 항체 단위에 공유 결합을 형성할 수 있다. 비제한적 예시적 상기 반응성 작용기는, 비제한적으로, 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드를 포함한다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적 링커 성분은 하기를 포함한다: 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카보닐 ("PAB"), N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트 ("MCC"). 다양한 링커 성분은 당해 기술에 공지되어 있고, 이의 일부는 아래에 기재되어 있다.
링커는 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 비제한적 예시적 절단가능 링커는 산-불안정한 링커 (예를 들면, 하이드라존 포함), 프로테아제-민감성 (예를 들면, 펩티다아제-민감성) 링커, 광불안정한 링커, 또는 디설파이드-함유 링커를 포함한다 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).
특정 구현예에서, 링커는 하기 화학식 II를 갖는다:
Figure pct00026
여기에서 A는 "스트레처 단위"이고, a는 정수 0 내지 1이고; W는 "아미노산 단위"이고, w는 정수 0 내지 12이고; Y는 "스페이서 단위"이고, y는 0, 1, 또는 2이고; Ab, D, 및 p는 화학식 I에 대하여 상기와 같이 정의된다. 상기 링커의 예시적 구현예는 미국 특허 번호 7,498,298에 기재되고, 이는 본원에서 참고로 명확히 편입된다.
일부 구현예에서, 링커 성분은 항체를 또 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결하는 "스트레처 단위"를 포함한다. 비제한적 예시적 스트레처 단위는 아래 보여진다 (여기에서 물결선은 항체, 약물, 또는 추가의 링커 성분에 공유 결합의 부위를 나타낸다):
Figure pct00027
일부 구현예에서, 링커 성분은 "아미노산 단위"를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의해 링커의 절단을 허용하고, 그렇게 함으로써 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀 효소에 노출시 면역콘주게이트로부터 약물의 방출을 용이하게 한다 (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol . 21:778-784). 예시적 아미노산 단위는, 비제한적으로, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 및 펜타펩티드를 포함한다. 예시적 디펩티드는, 비제한적으로, 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모리신 (phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함한다. 예시적 트리펩티드는, 비제한적으로, 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 단위는 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기 및/또는 적은 아미노산 및/또는 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정한 효소, 예를 들어, 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위하여 설계 및 최적화될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 성분은, 직접적으로 또는 스트레처 단위 및/또는 아미노산 단위를 통해, 항체를 약물 모이어티에 연결하는 "스페이서" 단위를 포함한다. 스페이서 단위는 "자기-희생성" 또는 "비-자기-희생성"일 수 있다. "비-자기-희생성" 스페이서 단위는 일부 또는 모든 스페이서 단위가 ADC의 절단시 약물 모이어티에 결합된 채 남은 것이다. 비-자기-희생 스페이서 단위의 예는, 비제한적으로, 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양-세포 관련된 프로테아제에 의해 글리신-글리신 스페이서 단위를 함유한 ADC의 효소 절단은 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티의 방출을 초래한다. 일부 상기 구현예에서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포에서 가수분해 단계 처리되고, 따라서 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이서 단위를 쪼갠다.
"자기-희생" 스페이서 단위는 약물 모이어티의 방출을 허용한다. 특정 구현예에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, p-아미노벤질 알코올은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 카바메이트, 메틸카바메이트, 또는 카보네이트는 벤질 알코올과 약물 사이에서 제조된다 (Hamann et al. (2005) Expert Opin . Ther . Patents (2005) 15:1087-1103). 일부 구현예에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카보닐 (PAB)이다. 일부 구현예에서, 자기-희생 링커를 포함한 ADC는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00028
여기에서 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로, 또는 -사이아노이고; m은 0 내지 4 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 20 범위이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4 범위이다.
자기-희생 스페이서의 다른 예는, 비제한적으로, PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (미국 특허 번호 7,375,078; Hay et al. (1999) Bioorg . Med . Chem . Lett. 9:2237) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미드 결합 가수분해시 고리화를 경험하는 스페이서, 예컨대 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), 적절하게 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 고리계 (Storm et al (1972) J. Amer . Chem . Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867)가 사용될 수 있다. 글리신 잔기의 α-탄소에 약물의 연결은 ADC에서 유용할 수 있는 자기-희생 스페이서의 또 다른 예이다 (Kingsbury et al (1984) J. Med . Chem. 27:1447)가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 L은 분지형, 다작용성 링커 모이어티를 통해 항체에 1 초과 약물 모이어티의 공유 결합용 수지상 유형 링커일 수 있다 (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). 수지상 링커는 약물 대 항체의 몰비, 즉 부하를 증가시킬 수 있고, 이는 ADC의 효력에 관련된다. 따라서, 항체가 단 하나의 반응성 시스테인 티올 기를 보유한 경우, 다수의 약물 모이어티는 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
비제한적 예시적 링커는 화학식 I의 ADC의 맥락에서 아래 보여진다:
Figure pct00029
추가의 비제한적 예시적 ADC는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00030
여기에서 X는 하기이고:
Figure pct00031
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
Y는 하기이고:
Figure pct00034
또는
Figure pct00035
각 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
전형적으로, 펩티드-유형 링커는 2 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에서 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드 결합은, 예를 들어, 액체상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (참고, 예를 들면, E.
Figure pct00036
and K.
Figure pct00037
(1965) “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, Academic Press).
일부 구현예에서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조절하는 기로 치환된다. 비제한적인 예로서, 하전된 치환체 예컨대 설포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 링커 시약의 수용해도를 증가시킬 수 있고 항체 및/또는 약물 모이어티와 링커 시약의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있거나, 또는 ADC를 제조하기 위해 이용된 합성 경로에 따라, D와 Ab-L (항체-링커 중간체), 또는 Ab와 D-L (약물-링커 중간체)의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커의 부분은 항체에 커플링되고 링커의 부분은 약물에 커플링되고, 그 다음 Ab-(링커 부분)a 은 약물-(링커 부분)b 에 커플링되어 화학식 I의 ADC를 형성한다. 일부 상기 구현예에서, 항체는 1 초과 (링커 부분)a 치환체를 포함하고, 이로써 1 초과 약물은 화학식 I의 ADC에서 항체에 커플링된다.
본 발명의 화합물은, 비제한적으로, 하기 링커 시약으로 제조된 ADC를 명확히 고려한다: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-하이드록시 석신이미드 에스테르 (BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 석신이미드 에스테르 (EMCS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐설폰 (HBVS), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라자이드 (MPBH), 석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 석신이미딜 아이오도아세테이트 (SIA), 석신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 석신이미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란 (IT), 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트 (SVSB), 및 하기 비스-말레이미드 시약 포함: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-디하이드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (아래 보여짐), 및 BM(PEG)3 (아래 보여짐); 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠). 일부 구현예에서, 비스-말레이미드 시약은 티올-함유 약물 모이어티, 링커, 또는 링커-약물 중간체에 항체내 시스테인의 티올 기의 부착을 허용한다. 티올 기와 반응성인 다른 작용기는, 비제한적으로, 아이오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
Figure pct00038
특정 유용한 링커 시약은 다양한 상업적 공급원, 예컨대 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)로부터 수득될 수 있거나, 또는 당해 기술; 예를 들어, 하기에 기재된 절차에 따라 합성될 수 있다: Toki et al (2002) J. Org . Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org . Chem. 60:5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828.
탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사선뉴클레오티드의 콘주게이션용 예시적 킬레이트제이다. 참고, 예를 들면, WO94/11026.
b) 예시적 약물 모이어티
(1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 콘주게이트된 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 메이탄신의 유도체이고, 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타로부터 먼저 단리되었다 (미국 특허 번호 3896111). 그 뒤에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시노이드는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티가 항체-약물 콘주게이트에서 매력적인 약물 모이어티인 것은, 이들이 하기 때문이다: (i) 발효 생성물의 발효 또는 화학 변형 또는 유도체화에 의해 제조하기 위해 상대적으로 접근가능한, (ii) 항체에 비-디설파이드 링커를 통해 콘주게이션에 적합한 작용기와 유도체화하기 위해 잘 받아들이는, (iii) 플라즈마에서 안정한, 및 (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 유효한.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용에 적합한 특정 메이탄시노이드는 당해 기술에 공지되어 있고 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 또는 유전적 공학 기술을 이용하여 생산될 수 있다 (참고, 예를 들면, Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973). 메이탄시노이드는 또한 공지된 방법에 따라 합성으로 제조될 수 있다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는, 비제한적으로, 변형된 방향족 고리를 갖는 것, 예컨대 하기: C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4256746) (예를 들어, 안사마이토신 P2의 리튬 수소화알루미늄 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4361650 및 4307016) (예를 들어, 스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스 를 이용한 탈메틸화에 의해 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 번호 4,294,757) (예를 들어, 아실 클로라이드를 이용한 아실화에 의해 제조됨), 및 방향족 고리의 다른 위치에서 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시적 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 변형을 갖는 것 예컨대 하기를 포함한다: C-9-SH (미국 특허 번호 4424219) (예를 들어, H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2 OR)(US 4331598); C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 번호 4450254) (예를 들어, Nocardia로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시 (US 4364866) (예를 들어, 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환으로 제조됨); C-15-메톡시 (미국 특허 번호 4313946 및 4315929) (예를 들어, Trewia nudlflora로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (미국 특허 번호 4362663 및 4322348) (예를 들어, 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화로 제조됨); 및 4,5-데옥시 (US 4371533) (예를 들어, 메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원으로 제조됨).
메이탄시노이드 화합물 상에서 많은 위치는 연결 위치로서 유용하다. 예를 들어, 에스테르 연결은 종래의 커플링 기술을 이용하여 하이드록실 기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응은 하이드록실 기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 구조를 갖는 것을 포함한다:
Figure pct00039
여기에서 물결선은 ADC의 링커에 메이탄시노이드 약물 모이어티의 황 원자의 공유 결합을 나타낸다. 각 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 황 원자에 아미드 기를 부착한 알킬렌 사슬은 메타닐, 에타닐, 또는 프로필일 수 있다, 즉, m은 1, 2, 또는 3이다 (US 633410; US 5208020; Chari et al (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc . Natl . Acad . Sci USA 93:8618-8623).
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성질체는 본 발명의 ADC, 즉 키랄 탄소에서 R 및 S 입체배치의 임의의 조합으로 고려된다 (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (RE39151); US 5208020; Widdison et al (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). Med. Chem. 49:4392-4408, 그 전체가 참고로 편입됨).
일부 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 입체화학을 갖는다:
Figure pct00040
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적 구현예는, 비제한적으로, 하기 구조를 갖는, DM1; DM3; 및 DM4를 포함한다:
Figure pct00041
Figure pct00042
여기에서 물결선은 항체-약물 콘주게이트의 링커 (L)에 약물의 황 원자의 공유 결합을 나타낸다.
다른 예시적 메이탄시노이드 항체-약물 콘주게이트는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기에서 Ab는 항체이고 p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다):
Figure pct00043
DM1이 항체의 티올 기에 BMPEO 링커를 통해 연결된 예시적 항체-약물 콘주게이트는 하기 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pct00044
여기에서 Ab는 항체이고; n은 0, 1, 또는 2이고; p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다.
메이탄시노이드를 함유한 면역콘주게이트, 이의 제조 방법, 및 이의 치료 용도는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020 및 5,416,064; US 2005/0276812 A1; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되고, 그의 개시내용은 이로써 참고로 명확히 편입된다. 또한, 참고: Liu et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8618-8623 (1996); 및 Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992).
일부 구현예에서, 항체-메이탄시노이드 콘주게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성의 유의미한 약화 없이 메이탄시노이드 분자에 항체의 화학적으로 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,208,020 (그의 개시내용은 이로써 참고로 명확히 편입된다). 일부 구현예에서, 항체 분자 당 콘주게이트된 평균 3-4 메이탄시노이드 분자를 갖는 ADC는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적 영향 없이 표적 세포의 세포독성 향상에서 효능을 보여주었다. 일부 사례에서, 심지어 독소/항체의 1 분자는 노출 항체의 사용에 대해 세포독성을 향상시키는 것으로 예상된다.
항체-메이탄시노이드 콘주게이트 제조를 위한 예시적 연결 기는, 예를 들어, 본원에서 기재된 것 및 미국 특허 번호 5208020; EP 특허 0 425 235 B1; Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; 및 US 2005/016993 A1 (그의 개시내용은 이로써 참고로 명확히 편입된다)에 개시된 것을 포함한다.
(2) 아우리스타틴 및 돌라스타틴
약물 모이어티는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 및 유사체 및 그의 유도체를 포함한다 (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431). 아우리스타틴은 해양 연체동물 화합물 돌라스타틴-10의 유도체이다. 임의의 특정한 이론에 의해 제한되지 않는 동안, 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동력학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포성 분할을 방해하는 것으로 보여지고 있고 (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) 항암 (US 5663149) 및 항진균 활성을 갖는다 (Pettit et al (1998) Antimicrob . Agents Chemother. 42:2961-2965). 돌라스타틴/아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465).
예시적 아우리스타틴 구현예는, 그의 개시내용은 그 전체가 참고로 명확히 편입된, US 7498298 및 US 7659241에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다:
Figure pct00045
여기서 DE 및 DF 의 물결선은, 항체 또는 항체-링커 성분으로의 공유 부착 부위를 표지하고, 각 위치에 독립적으로 존재한다.
R2 는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3 는 하기로부터 선택되거나: H, C1-C8 알킬, C3-C8 탄소환, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 탄소환), C3-C8 헤테로환 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로환);
R4 는 하기로부터 선택되거나: H, C1-C8 알킬, C3-C8 탄소환, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 탄소환), C3-C8 헤테로환 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로환);
R5는 H 및 메틸로부터 선택되고;
또는 R4 및 R5 는 공동으로 탄소환식 환을 형성하고 화학식 -(CRaRb)n- 을 갖고, 여기서 Ra 및 Rb 는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 탄소환으로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되며;
R6 는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7 는 하기로부터 선택되거나: H, C1-C8 알킬, C3-C8 탄소환, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 탄소환), C3-C8 헤테로환 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로환);
각 R8 은 독립적으로 하기로부터 선택되며: H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 탄소환 및 O-(C1-C8 알킬);
R9 는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10 는 아릴 또는 C3-C8 헤테로환으로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 이며, 여기서 R12 는 C1-C8 알킬이고;
각 R11 은 독립적으로 하기로부터 선택되며: H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로환, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13 은 C2 - C8 알킬이고;
R14 는 H 또는 C1-C8 알킬이며;
각 경우에, R15 는 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이며;
각 경우에, R16 은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이며,
R18 는 하기로부터 선택되며: -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로환), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 탄소환); 그리고
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
일 구현예에서, R3, R4 및 R7 은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, 그리고 R5 는 -H 또는 메틸이다. 예시적인 구현예에서, R3, 및 R4 는 각각 이소프로필이고, 그리고 R5 는 -H이며, 그리고 R7 은 sec-부틸이다.
일 구현예에서, R2 및 R6 은 각각 메틸이고, 그리고 R9 는 -H이다.
또 다른 구현예에서, 각 경우에, R8 은 -OCH3 이다.
예시적 구현예에서, R3 및 R4 는 각각 이소프로필이고, R2 및 R6 은 각각 메틸이고, R5 는 -H이고, R7 은 sec-부틸이고, R8 은, 각 경우에, -OCH3 이고, 그리고 R9 는 -H이다.
일 구현예에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
일 구현예에서, R10 은 아릴이다.
예시적인 구현예에서, R10 은 -페닐이다.
예시적인 구현예에서, Z 가 -O-일 경우, R11 은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
일 구현예에서, Z 가 -NH 일 경우, R11 은 -CH(R15)2 이며, 여기서 R15 는 -(CH2)n-N(R16)2 이고, R16 은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
또 다른 구현예에서, Z 가 -NH 일 경우, R11 은 -CH(R15)2 이며, 여기서 R15 는 -(CH2)n-SO3H 이다.
화학식 DE 의 예시적 오리스타틴 구현예는, MMAE이며, 여기서 물결선은 항체-약물 콘주게이트에 대한 링커 (L)의 공유 결합을 나타낸다:
Figure pct00046
화학식 DF 의 예시적 오리스타틴 구현예는, MMAF이며, 여기서 물결선은 항체-약물 콘주게이트에 대한 링커 (L)의 공유 결합을 나타낸다:
Figure pct00047
다른 예시적 구현예는 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 카복시 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008848) 및 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 측쇄 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008603)을 포함한다.
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함한 화학식 I의 ADC의 비제한적 예시적 구현예는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기에서 "Ab"는 항체이고; p는 1 내지 약 8이고, "Val-Cit"는 발린-시트룰린 디펩티드이고; "S"는 황 원자이다:
Figure pct00048
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함한 화학식 I의 ADCs의 비제한적 예시적 구현예는 추가로 Ab-MC-PAB-MMAF 및 Ab-PAB-MMAF를 포함한다. 단백분해적으로 절단가능하지 않은 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함한 면역콘주게이트는 단백분해적으로 절단가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함한 면역콘주게이트와 비교할만한 활성을 갖는 것으로 보여지고 있다 (Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem . 17:114-124). 일부 상기 구현예에서, 약물 방출은 세포에서 항체 분해에 의해 영향받은 것으로 여겨진다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에서 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드 결합은, 예를 들어, 액체상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (참고, 예를 들면, E.
Figure pct00049
및 K.
Figure pct00050
, "The Peptide", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는, 일부 구현예에서, 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다: US 7498298; US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem . Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem . Soc . Perkin Trans. 1 5:859-863; 및 Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
일부 구현예에서, 식 DE 예컨대 MMAE, 및 DF, 예컨대 MMAF, 및 약물-링커 중간체 및 그의 유도체, 예컨대 MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 7498298; Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; 및 Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있고 그 다음 당해 항체에 콘주게이트될 수 있다.
(3) 칼리키아마이신
일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 하나 이상의 칼리키아마이신 분자에 콘주게이트된 항체를 포함한다. 항생제의 칼리키아마이신 패밀리, 및 이의 유사체는 하위-피코몰 농도에서 이중-가닥 DNA 절단을 생성할 수 있다 (Hinman et al., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). 칼리키아마이신은 작용의 세포내 부위를 갖지만, 특정 사례에서, 원형질막을 쉽게 교차시키지 않는다. 따라서, 항체-매개된 내재화를 통해 이들 제제들의 세포성 흡수는, 일부 구현예에서, 그의 세포독성 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 칼리키아마이신 약물 모이어티를 이용한 항체-약물 콘주게이트 제조의 비제한적 예시적 방법은, 예를 들어, US 5712374; US 5714586; US 5739116; 및 US 5767285에 기재된다.
일부 구현예에서, 항체에 콘주게이트된 칼리키아마이신 약물 모이어티는 하기 화학식을 갖는 화합물이다:
Figure pct00051
여기서 X 는 Br 또는 I이며;
L 은 링커이며; R 은 수소, C1-6 알킬, 또는 -C(=O) C1-6 알킬; 그리고 Ra 는 수소 또는 C1-6 알킬이다.
일부 구현예에서, X 는 Br이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 이소프로필이다.
기타 구현예에서, X 는 Br이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 에틸이다.
기타 구현예에서, X 는 I이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 이소프로필이다.
기타 구현예에서, X 는 I이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 에틸이다.
일부 구현예에서, X 는 Br이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 -C(=O)CH3 이다.
기타 구현예에서, X 는 I이고, Ra 는 수소이며, 그리고 R 은 -C(=O)CH3 이다.
기타 구현예에서, X 는 I이고, Ra 는 에틸이며, 그리고 R 은 -C(=O)CH3 이다.
기타 구현예에서, X 는 Br이고, Ra 는 에틸이며, 그리고 R 은 -C(=O)CH3 이다.
(4) 피롤로벤조다이아제핀
일부 구현예에서, ADC는 피롤로벤조다이아제핀 (PBD)을 포함한다. 일부 구현예에서, PBD 이량체는 특정 DNA 서열을 인식하고 이에 결합한다. 천연 생성물 안트라마이신, PBD는, 1965 년에 최초 발견되었다 (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem . Soc., 87:5791-5793). 그때 이후, 다수의 천연적으로 존재하는 PBD 및 유사체가 보고되었다 (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465 (삼환식 PBD 스캐폴드의 이량체 포함) (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099). 임이의 특정 이론에 구속됨이 없이, 이량체 구조는 이들에게, 결합부위에서 적합한 스너그 (sug)를 유도하도록 B-형태 DNA의 작은 그루브 (minor groove)를 갖는 이소헬리시티 (isohelicity)를 위해서 적절한 삼차원 형상을 제공한다 (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc . Chem . Res., 19:230-237). C2 아릴 치환체를 갖는 이량체 PBD 화합물은 세포독성제로 유용하다는 것이 나타났다 (Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med . Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med . Chem . Letters 19(22):6463-6466).
일부 구현예에서, PBD 화합물은 생체내 제거가능한 질소 보호기로 N10 위치에서 이들을 보호함에 의하여 프로드러그로서 사용될 수 있다 (WO 00/12507; WO 2005/023814).
PBD 이량체는 항체에 콘주게이트되고, 생성된 ADC는 항암 특성을 갖는 것으로 나타났다 (US 2010/0203007). PBD 이량체 상에서의 비제한적 예시적 연결 부위는 5-원 피롤로 환, PBD 단위 간의 연결기, 및 N10-C11 이민 기를 포함한다 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
ADC의 비제한적 예시적 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A의 것:
Figure pct00052
및 이의 염 및 용매화물이며, 여기서:
물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 표지하며;
식 중, 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 선택적 존재를 나타내고;
R2 는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 그리고 임의로 추가로 할로 또는 디할로로부터 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되며;
R6 및 R9 는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
R7 은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
Q 는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되며;
R11 은 H 또는 R이거나, Q 는 O, SO3M이고, M 은 금속 양이온이며;
R 및 R’ 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C1-12 알킬, C3-8　헤테로사이클릴, C3-20 헤테로환, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 그리고 임의로 NRR’ 기와 연관되고, R 및 R’ 은 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로환식 환을 형성하며;
R12, R16, R19 및 R17 은 각각, R2, R6, R9 및 R7 에 대해 정의된 바와 같으며;
R″ 는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 임의로 치환된 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대 O, S, N(H), NMe 및/또는 방향족 환, 예컨대 벤젠 또는 피리딘에 의해 저해될 수 있으며; 그리고
X 및 X’ 는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R 및 R’ 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로환, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 그리고 임의로 NRR’ 기와 연관되고, R 및 R’ 은 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로환식 환을 형성한다.
일부 구현예에서, R9 및 R19 는 H이다.
일부 구현예에서, R6 및 R16 는 H이다.
일부 구현예에서, R7 및 R17 는 둘 모두 OR7A 이며, 여기서 OR7A 는 임의로 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R7A 는 Me이다. 일부 구현예에서, R7A 는 Ch2Ph 이며, 여기서 Ph는 페닐 기이다.
일부 구현예에서, X는 O이다.
일부 구현예에서, R11 은 H이다.
일부 구현예에서, 각 모노머 단위체 내 C2 및 C3 사이에 이중 결합이 존재한다.
일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 H 및 R로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 R이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴 또는 C5-7 아릴 또는 C8-10 아릴이다. 일 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐이다. 일 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 =O, =CH2, =CH-RD, 및 =C(RD)2 로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 각각 =CH2 이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 각각 H이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 각각 =O이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 각각 =CF2 이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 =C(RD)2 이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12 는 독립적으로 =CH-RD 이다.
일부 구현예에서, R2 및 R12 가 =CH-RD 일 경우, 각 기는 독립적으로 하기에 나타난 입체배치를 가질 수 있다:
Figure pct00053
일부 구현예에서, =CH-RD 는 입체배치 (I) 내에 있다.
일부 구현예에서, R″ 는 C3 알킬렌 기 또는 C5 알킬렌 기이다.
일부 구현예에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(I)의 구조를 갖는다:
Figure pct00054
식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(II)의 구조를 갖는다:
Figure pct00055
식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00056
여기서 RE 및 RE” 는 각각 독립적으로 H 또는 RD 부터 선택되며, 여기서 RD 는 상기와 같이 정의되며; 그리고 식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, RE 및 RE” 는 H이다. 일부 구현예에서, RE 및/또는 RE” 는 RD 이며, 여기서 RD 는 임의로 치환된 C1-12 알킬이다. 일부 구현예에서, RE 및/또는 RE” 는 RD 이며, 여기서 RD 는 메틸이다.
일부 구현예에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00057
여기서 Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이며; 여기서 Ar1 및 Ar2 는 상동 또는 상이할 수 있으며; 그리고
식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, ADC의 예시적 PBD 이량체 성분은 화학식 A(V)의 구조를 갖는다:
Figure pct00058
여기서 Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이며; 여기서 Ar1 및 Ar2 는 상동 또는 상이할 수 있으며; 그리고
식 중, n은 0 또는 1이다.
일부 구현예에서, Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜이다. 일부 구현예에서, Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 일부 구현예에서, Ar1 및 Ar2 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는, 임의의 이용가능한 환 위치를 통하여 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예를 들어, 퀴놀리닐은 하기일 수 있다: 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일. 일부 구현예에서, 퀴놀리닐은 각각 독립적으로 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일로부터 선택된다. 예를 들어, 이소퀴놀리닐은 하기일 수 있다: 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일. 일부 구현예에서, 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-3-일, 및 이소퀴놀린-6-일로부터 선택된다.
추가 비제한적 예시적 ADC의 PBD 이량체 성분은 화학식 B의 구조의 것이다:
Figure pct00059
및 이의 염 및 용매화물, 여기서:
물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 표지하며;
OH에 연결된 물결선은 S 또는 R 입체배치를 표지하며;
RV1 및 RV2 는 독립적으로 하기로부터 선택되며: H, 메틸, 에틸 및 페닐 (상기 페닐은 특히 4 위치에서 플루오로로 임의로 치환될 수 있음) 및 C5-6 헤테로사이클릴; (여기서 RV1 및 RV2 는 상동 또는 상이할 수 있음); 그리고
n은 0 또는 1이다.
일 구현예에서, RV1 및 RV2 는 H, 페닐, 및 4-플루오로페닐로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 링커는 PBD 이량체 약물 모이어티의 다양한 부위 중 하나에 부착될 수 있고, 이는 하기를 포함한다: B 환의 N10 이민, C-2 환의 내부/외부 위치, 또는 A 환을 연결하는 연결기 단위체 (참고: 하기 구조 C(I) 및 C(II)).
ADC의 비제한적 예시적 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 C(I) 및 C(II)를 포함한다:
Figure pct00060
화학식 C(I) 및 C(II) 는, 이들의 N10-C11 이민 형태로 나타난다. 예시적 PBD 약물 모이어티는 또한 하기 표에서 나타내는 바와 같이 카르비놀아민 및 보호된 카르비놀아민을 포함한다:
Figure pct00061
상기 식에서:
X 는 CH2 (n = 1 내지 5), N, 또는 O이며;
Z 및 Z’ 는 독립적으로 OR 및NR2 로부터 선택되며, 여기서 R은 1 내지 5개 탄소 원자를 함유하는 1차, 2차 또는 3차 알킬 쇄이며;
R1, R’1, R2 및 R’2 는 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (치환된 아릴 포함), C5-20 헤테로아릴 기, -NH2, -NHMe, -OH, 및 -SH로부터 선택되며 (여기서, 일부 구현예에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐 쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함함);
R3 및 R’3 은 독립적으로 H, OR, NHR, 및 NR2 로부터 선택되며, 여기서 R은 1 내지 5개 탄소 원자를 함유하는 1차, 2차 또는 3차 알킬 쇄이며;
R4 및 R’4 는 독립적으로 H, Me, 및 OMe로부터 선택되며;
R5 는 하기로부터 선택되며: C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (하기를 포함: 할로, 니트로, 시아노, 알콕시, 알킬, 헤테로사이클릴로 치환된 아릴) 및 C5-20 헤테로아릴 기 (여기서, 일부 구현예에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐 쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함함);
R11 은 H, C1-C8 알킬, 또는 보호기 (예컨대 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카보닐 (BOC), 벤질옥시카보닐 (CBZ), 9-플루오렌일메틸렌옥시카보닐 (Fmoc), 또는 자가-희생적 단위체 예컨대 발린-시트룰린-PAB)를 포함하는 모이어티이며;
R12 는 H, C1-C8 알킬, 또는 보호기이며;
여기서 A 환 간의 R1, R’1, R2, R’2, R5, 또는 R12 중 하나의 수소 및 -OCH2CH2(X)nCH2CH2O-의 수소 스페이서는 ADC의 링커에 연결된 결합으로 대체된다.
ADC의 예시적 PBD 이량체 부분은 비제한적으로 하기를 포함한다: (물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 표지함):
Figure pct00062
PBD 이량체;
PBD 이량체를 포함하는 ADC의 비제한적 예시적 구현예는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00063
PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab;
Figure pct00064
PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab, 여기서:
n은 0 내지 12이다. 일부 구현예에서, n은 2 내지 10이다. 일부 구현예에서, n은 4 내지 8이다. 일부 구현예에서, n은 4, 5, 6, 7, 및 8로부터 선택된다.
PBD 이량체를 포함한 추가 비제한적인 예시적 ADC는 항체에 모노메틸 디설파이드 N10-연결된 PBD (아래 보여짐)를 콘주게이트시켜:
Figure pct00065
모노메틸 디설파이드-연결된N10-연결된 PBD 항체-약물 콘주게이트를 생성함으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00066
참고, 예를 들면, PCT 공개 번호 WO 2013/055987.
PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab 및 PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab의 링커는 프로테아제 절단가능성이고, 반면에 PBD 이량체-말레이미드-아세탈의 링커는 산-불안정성이다.
PBD 이량체 및 PBD 이량체를 포함한 ADC는 당해 기술에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 참고, 예를 들면, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598; WO 2013/055987.
(5) 안트라사이클린
일부 구현예에서, ADC는 안트라사이클린을 포함한다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 임의의 특정한 이론에 의해 제한될 의도가 없는 동안, 연구는 안트라사이클린이, 하기를 포함하여, 수많은 상이한 기전에 의해 세포를 사멸하기 위해 작동할 수 있음을 지적하였다: 1) 세포의 DNA 속으로 약물 분자의 삽입 그렇게 함으로써 DNA-의존적 핵산 합성의 억제; 2) 세포에 손상을 유발시키는 세포성 거대분자와 그 다음 반응하는 유리 라디칼의 약물에 의한 생산, 및/또는 3) 세포 막과 약물 분자의 상호작용 (참고, 예를 들면, C. Peterson et al., “Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia” in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, “Free Radical Damage” id. at pp.97-102). 그의 세포독성 포텐셜 때문에 안트라사이클린은 수많은 암 예컨대 백혈병, 유방암종, 폐 암종, 난소 선암종 및 육종의 치료에서 사용되어 왔다 (참고 예를 들면, P.H- Wiernik, in Anthracycline : Current Status And New Developments p 11).
비제한적 예시적 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노마이신, 네모루비신, 및 그들의 유도체를 포함한다. 다우노루비신 및 독소루비신의 면역콘주게이트 및 전구약물은 제조 및 연구되었다 (Kratz et al (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al (2006) Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362; Torgov et al (2005) Bioconj . Chem. 16:717-721; Nagy et al (2000) Proc. Natl . Acad . Sci. USA 97:829-834; Dubowchik et al (2002) Bioorg . & Med . Chem. Letters 12:1529-1532; King et al (2002) J. Med . Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). 항체-약물 콘주게이트 BR96-독소루비신은 종양-관련된 항원 루이스-Y와 특이적으로 반응하고 상 I 및 II 연구에서 평가되었다 (Saleh et al (2000) J. Clin . Oncology 18:2282-2292; Ajani et al (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher et al (1999) J. Clin . Oncology 17:478-484).
PNU-159682는 네모루비신의 강력한 대사물 (또는 유도체)이다 (Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). 네모루비신은 독소루비신의 글리코사이드 아미노 상에서 2-메톡시모폴리노 기를 갖는 독소루비신의 반합성 유사체이고, 간세포 암종에 대하여 상 II/III 시험을 포함하여 Rev. (Sun et al (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1st Ed, Abs 4649; Pacciarini et al (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116), 임상 평가되고 있다 (Grandi et al (1990) Cancer Treat. Clin . Oncology 24:14116).
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 비제한적 예시적 ADC는 화학식 Ia에 나타난다:
Figure pct00067
상기 식 중, R1은 수소 원자, 하이드록시 또는 메톡시기이고, R2 는 C1-C5 알콕시 기, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이며;
L1 및 Z는 함께 본원에 기술된 링커 (L)이며;
T는 본원에 기술된 항체 (Ab)이며; 그리고
m 은 1 내지 약 20이며; 일부 구현예에서, m 은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4 이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2 는 둘 모두 메톡시 (-OMe)이다.
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 추가의 비제한적 예시적 ADC는 화학식 Ib에 나타난다:
Figure pct00068
상기 식 중, R1은 수소 원자, 하이드록시 또는 메톡시기이고, R2 는 C1-C5 알콕시 기, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이며;
L2 및 Z는 함께 본원에 기술된 링커 (L)이며;
T는 본원에 기술된 항체 (Ab)이며; 그리고
m 은 1 내지 약 20이며; 일부 구현예에서, m 은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4 이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2 는 둘 모두 메톡시 (-OMe)이다.
일부 구현예에서, 네모루비신-함유 ADC의 네모루비신 성분은 PNU-159682이다. 상기 일부 구현예에서, ADC의 약물 부분은 다음의 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00069
또는
Figure pct00070
여기서 물결선은 링커 (L)에 대한 부착을 표지한다.
PNU-159682를 포함하여, 안트라사이클린은, 본원에서 기재된 링커를 포함하여, 몇 개의 연결 부위 및 다양한 링커를 통해 항체에 콘주게이트될 수 있다 (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124).
네모루비신 및 링커를 포함한 예시적 ADC는, 비제한적으로, 하기를 포함한다:
Figure pct00071
PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab;
Figure pct00072
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab;
Figure pct00073
PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab;
Figure pct00074
PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab, (여기에서: R1 및 R2는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택됨); 및
Figure pct00075
PNU-159682-말레이미드-Ab.
PBD 이량체를 포함한 추가 비제한적인 예시적 ADC는 항체에 피리딜 디설파이드 PNU 아미드 (아래 보여짐)를 콘주게이트시켜:
Figure pct00076
디설파이드-연결된 PNU-159682 항체-약물 콘주게이트를 생성함으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00077
PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab의 링커는 산-불안정성이고, 반면에 PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab, 및 PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab의 링커는 프로테아제 절단가능성이다.
(6) 1-( 클로로메틸 )-2,3- 디하이드로 -1H- 벤조[e]인돌 ( CBI ) 이량체 약물 모이어티
일부 구현예에서, ADC는 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI)을 포함한다. DNA 좁은 홈 알킬화제의 5-아미노-1-(클로로메틸)-1,2-디하이드로-3H-벤즈[e]인돌 (아미노 CBI) 부류는 강력한 세포독소 (Atwell, et al (1999) J. Med. Chem., 42:3400)이고, 암 요법을 위하여 설계된 전구약물의 수많은 부류에서 효과기 단위로서 이용되어 왔다. 이들은 항체 콘주게이트, (Jeffrey, et al. (2005) J. Med. Chem., 48:1344), 니트로벤질 카바메이트에 기반된 유전자 요법을 위한 전구약물 (Hay, et al (2003) J. Med. Chem. 46:2456) 및 저산소증-활성화된 전구약물로서 상응하는 니트로-CBI 유도체 (Tercel, et al (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609). CBI 및 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 (PBD) 약물분자구조는 알킬 사슬에 의해 함께 연결되었다 (Tercel et al (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151)를 포함하였다.
일부 구현예에서, ADC는 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI) 이량체를 포함한다. 상기 일부 구현예에서, 이량체는 이종이량체이며, 여기서 상기 이량체의 절반은 CBI 모이어티이며, 그리고 상기 이량체의 나머지 절반은 PBD 모이어티이다.
일부 구현예에서, CBI 이량체는 하기의 화학식을 포함한다:
Figure pct00078
식 중,
R1 은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 링커(L)에 대한 결합이며;
R2 는 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 링커(L)에 대한 결합이며;
Ra 및 Rb 는 독립적으로 하나 이상의 F로 임의로 치환된, H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되거나, Ra 및 Rb 는 5원 또는 6원 헤테로사이클릴 기를 형성하며;
T는 하기로부터 선택된 연결기이며: C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌);
여기서 Y 는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
여기서 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로, F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 치환되며, 여기서 알킬은 하나 이상의 F로 임의로 치환되며;
또는 알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로 L에 대한 결합으로 치환되며;
D' 는 하기로부터 선택되는 약물 모이어티이며:
Figure pct00079
Figure pct00080
및
Figure pct00081
여기서 물결선은 T에 대한 부착 부위를 표지하며;
X1 및 X2 는 독립적으로 O 및 NR3 로부터 선택되며, 여기서 R3 은 하나 이상의 F로 임의로 치환된 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
R4 는 H, CO2R, 또는 링커 (L)에 대한 결합이며, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이며; 그리고
R5 는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
표 A의 링커-약물 중간체 51-86은, 본원에서 그 전체가 참조로 편입된, WO 2015/023355의 절차에 따라, 링커 시약으로 CBI 이량체 또는 CBI/PBD 이종이량체 약물 모이어티를 커플링함으로써 제조하였다.
표 A 링커-CBI 이량체 및 CBI/PBD 이종이량체 약물 중간체 51-86
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
표 B의 링커-약물 중간체 87 및 88은, 본원에서 그 전체가 참조로 편입된, WO 2013/055987의 절차에 따라, 링커 시약으로 PBD 이량체 약물 모이어티를 커플링함으로써 제조하였다.
표 B PBD 이량체 약물 중간체 87-88
Figure pct00091
표 C의 링커-약물 중간체 89 및 90은, 본원에서 그 전체가 참조로 편입된, WO 2015/095227의 절차에 따라, 펩티도미메틱 링커 시약으로 CBI 이량체 약물 모이어티를 커플링함으로써 제조하였다.
표 C CBI 이량체 펩티도미메틱 링커 약물 중간체 89-90
Figure pct00092
ADC의 예시적 CBI 이량체 부분은 비제한적으로 하기를 포함한다: 하기 CBI-PBD 이량체 (물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 표지함):
Figure pct00093
Figure pct00094
및
하기 CBI-CBI 이량체:
Figure pct00095
CBI 이량체를 포함하는 ADC의 비제한적 예시적 구현예는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00096
CBI-PBD-디설파이드-Ab; 또는
Figure pct00097
CBI-PBD (피페라진-카바메이트 전구약물)-디설파이드-Ab;
Figure pct00098
CBI-PBD (포스페이트)-디설파이드-Ab; 및
Figure pct00099
CBI-CBI (포스페이트)-아세탈-말레이미드-Ab.
ADC를 형성하기 위하여 항체에 콘주게이트될 수 있는 비제한적 예시적 CBI-PBD 이종이량체 링커-약물 중간체는 하기를 포함한다:
Figure pct00100
CBI-PBD-2-프로필 피리딜 디설파이드 83;
Figure pct00101
CBI-PBD (피페라진-카바메이트 전구약물)- 2-프로필 피리딜 디설파이드 81;
Figure pct00102
CBI-PBD-(포스페이트)-2-프로필 피리딜 디설파이드 82;
Figure pct00103
CBI-PBD-(포스페이트)-2-프로필, 니트로피리딜 디설파이드 85; 및
Figure pct00104
CBI-PBD-(포스페이트)-펩티도미메틱 링커 86.
ADC를 형성하기 위하여 항체에 콘주게이트될 수 있는 비제한적 예시적 CBI-CBI 동종이량체 링커-약물 중간체는 하기를 포함한다:
Figure pct00105
CBI-CBI (포스페이트)-아세탈-말레이미드 78;
Figure pct00106
CBI-CBI (포스페이트)-펩티도미메틱 PAB 링커 89; 및
Figure pct00107
CBI-CBI (포스페이트)-펩티도미메틱 EDA 링커 90.
(7) 아마톡신
일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 하나 이상의 아마톡신 분자에 콘주게이트된 항체를 포함한다. 아마톡신은 8개 아미노산으로 이루어진 환형 펩티드이다. 이들은 알광대버섯(Amanita phalloides mushrooms)으로부터 단리되거나 합성 제조될 수 있다. 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존적 RNA 폴리머라아제 II를 억제하여, 이로써 또한 영향받은 세포의 전사 및 단백질 생합성을 억제한다. 세포 내 전사 억제는 성장 및 증식의 정지를 야기한다. 예를 들어, 참고: Moldenhauer et al. JNCI 104:1-13 (2012), WO2010115629, WO2012041504, WO2012119787, WO2014043403, WO2014135282, 및 WO2012119787 (본원에서 이의 전체 내용이 참조로 편입됨). 일부 구현예에서, 하나 이상의 아마톡신 분자는 하나 이상의 α-아마톡신 분자이다.
(8) 기타 약물 모이어티
약물 모이어티 또한 하기를 포함한다: 겔다나마이신 (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst . 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med . Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem . 13:786-791); 및 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편 (비제한적으로 하기를 포함: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센). 참고, 예를 들어, WO 93/21232.
약물 모이어티는 또한 하기를 포함한다: 핵산분해 활성 (예컨대 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 갖는 화합물.
특정 구현예에서, 면역콘주게이트는 방사성 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소가 방사콘주게이트된 항체의 생산을 위해 이용 가능하다. 예시는 하기를 포함한다: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소. 일부 구현예에서, 면역콘주게이트가 검출을 위해 사용되는 경우, 이것은 섬광조영 구를 위한 방사선 활성 원자, 예를 들어 Tc99 또는 I123를, 또는 핵자기공명(NMR) 영상(자기공명영상(MRI)로도 알려짐)을 위한 스핀 레이블, 예컨대 다시 한 번 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트제에 착화될 수 있고, 예를 들면, PET 영상화를 위하여 항체에 콘주게이트될 수 있다 (WO 2011/056983).
방사선- 또는 다른 라벨은 면역콘주게이트에서 공지된 방식으로 편입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 수소 대신 하나 이상의 불소-19 원자를 포함한 적합한 아미노산 전구체를 이용하여 생합성 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 라벨 예컨대 Tc99, I123, Re186, Re188 및 In111은 항체에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 이트륨-90은 항체의 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem . Biophys . Res. Commun . 80: 49-57 은 요오드-123을 편입시키기 위해 사용될 수 있다. "면역섬광조영술에서 단클론성 항체" (Chatal, CRC Press 1989)는 특정 다른 방법을 기재한다.
특정 구현예에서, 면역콘주게이트는 프로드러그-활성화 효소에 콘주게이트된 항체를 포함할 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 프로드러그-활성화 효소는 프로드러그 (예를 들면, 펩티딜 화학치료제, 참고 WO 81/01145)를 활성 약물, 예컨대 항-암 약물로 전환시킨다. 상기 면역콘주게이트는, 일부 구현예에서, 항체-의존적 효소-매개된 프로드러그 요법 ("ADEPT")에 유용하다. 항체에 콘주게이트될 수 있는 효소는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항-암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키기에 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다아제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키기에 유용한 D-알라닐카복시펩티다아제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 탄수화물-절단 효소 예컨대 β-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제; β-락탐으로 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 β-락타마아제; 및 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기, 각각을 갖는 그의 아민 질소에서 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 페니실린 아미다아제, 예컨대 페니실린 V 아미다아제 및 페니실린 G 아미다아제. 일부 구현예에서, 효소는 당해 기술에서 잘 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 참고, 예를 들면, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
c) 약물 부하
약물 부하는 p, 화학식 I의 분자 내 항체 당 약물 모이어티의 평균 수로 표시된다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D) 범위일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 하기를 포함한다: 1 내지 20개 범위의 약물 모이어티와 콘주게이트된 항체의 집합체. 컨주게이션 반응으로부터의 ADC의 제조에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 개수는 질량 분광검정법, ELISA 검정 및 HPLC과 같은 통상의 수단에 의해 특성화될 수 있다. 또한 p의 관점에서 ADC의 정량 분포가 결정될 수 있다. 일부 예에서, p가 다른 약물 부하의 ADC로부터의 특정 값인 경우, 동종 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 성취될 수 있다.
일부 항체-약물 컨주게이트에서, p는 항체 상의 부착 위치의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 특정 예시적 구현예에서와 같이 부착이 시스테인 티올일 경우, 항체는 단지 하나의 또는 수 개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있고, 링커가 부착될 수 있는 하나의 또는 수 개의 충분한 반응성의 티올 기를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 고 약물 부하, 예를 들어 p >5는 특정 항체-약물 컨주게이트의 세포 투과성의 손실, 응집, 불용성 또는 독성을 야기할 수 있다. 특정 구현예에서, ADC에 대한 평균 약물 부하는 약 1 내지 약 8, 약 2 내지 약 6, 또는 약 3 내지 약 5의 범위일 수 있다. 정말로, 특정 ADC에 대하여, 항체 당 약물 모이어티의 최적 비율은 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것이 나타났다 (US 7498298).
특정 구현예에서, 이론적 최대치 보다 적은 수의 약물 모이어티가 컨주게이션 반응 동안 항체에 컨주게이트된다. 항체는, 예를 들어 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 다수의 유리 및 반응성 시스테인 티올을 포함하지 않으며; 정말로, 항체 내 모스트 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 가교로서 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는, 반응성 시스테인 티올 기를 생성하기 위하여 부분적 또는 전체적 환원 조건하에서 환원제 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원될 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 반응성 친핵성 기 예컨대 리신 또는 시스테인을 노출시키는 변성 조건으로 처리된다.
ADC의 부하 (약물/항체 비율)는 하기의 방법을 포함하는 다수의 상이한 방법으로 조절될 수 있다: (i) 항체와 관련된 링커 시약 또는 몰 과량의 약물-링커 중간체의 제한, (ii) 컨주게이션 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건의 부분적 또는 제한.
하기가 이해될 것이다: 1 초과의 친핵성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 이후 생성된 생성물은 항체에 부착된 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물이다. 항체 당 약물의 평균 수는 항체에 대해 특이적이고 약물에 태해 특이적인, 이중 ELISA 항체 검정에 의하여 혼합물로부터 산출될 수 있다. 개별 ADC 분자는 질량 분광측정에 의하여 혼합물 내에서 식별될 수 있고, HPLC, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 분리될 수 있으며, 예를 들어, 하기를 참고한다: McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). 특정 구현예에서, 단일 부하 값을 갖는 동종성 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의하여 콘주게이션 혼합물로부터 단리될 수 있다.
d) 면역콘주게이트를 제조하는 특정 방법
화학식 I의 ADC는, 당업자에 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여, 다양한 경로에 의해 제조될 수 있다. (1) 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성하기 위하여, 2가 링커 시약과 항체의 친핵성 기와의 반응, 이후 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통하여 D-L을 형성하기 위하여, 2가 링커 시약과 약물 모이어티의 친핵성 기와의 반응, 이후 항체와의 반응. 후자의 경로를 통한 화학식 I의 ADC를 제조하기 위한 예시적 방법은 US 7498298에 기술되며, 이는 본원에서 참고로 명확히 편입된다.
항체 상의 친핵성 기는 비제한적으로 하기를 포함한다: (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예컨대 리신, (iii) 측쇄 티올 기, 예컨대 시스테인, 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노 기 (여기서 항체는 글리코실화됨). 아민, 티올, 및 하이드록실 기는 친핵성이며, 본 발명의 경우와 같은 링커 모이어티 상의 친전자성 그룹들과의 공유결합을 형성하도록 반응할 수 있고, 링커 시약은 하기를 포함한다: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산성 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기. 특정의 항체는 환원가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 가교를 갖는다. 항체는 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제를 이용한 처리에 의한 링커 시약과의 컨주게이션을 위해 반응하여 상기 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원될 수 있도록 제조될 수 있다. 각각의 시스테인 가교는 따라서 이론적으로 2 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는, 리신 잔기의 변형, 예컨대, 아민을 티올로 전환시키는, 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)과 리신 잔기의 반응에 의하여 항체 내에 도입될 수 있다. 반응성 티올 기는 또한 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조)함으로써, 항체로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘주게이트는 또한 항체 상에서 친전자성 기, 예컨대 알데하이드 또는 케톤 카보닐 기와 링커 시약 또는 약물 상에서 친핵성 기 사이의 반응에 의해 생산될 수 있다. 링커 시약 상에서 유용한 친핵성 기는, 비제한적으로, 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드를 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 링커 시약 또는 약물 상에서 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 글리코실화된 항체의 당류는, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 기를 형성하기 위해, 예를 들면 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화될 수 있다. 수득한 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는, 예를 들면 안정한 아민 연결기를 형성하기 위해 보로하이드라이드 시약에 의해 감소될 수 있다. 한 구현예에서, 갈락토오스 옥시다아제 또는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분의 반응은 약물 상에서 적절한 기와 반응할 수 있는 항체에서 카보닐 (알데하이드 및 케톤) 기를 수득할 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유한 항체는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응할 수 있어서, 제1 아미노산 대신 알데하이드의 생산을 초래한다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem . 3:138-146, 5362852)에서 찾을 수 있다. 그와 같은 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
약물 모이어티 상에서 예시적 친핵성 기는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상에서 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드 기: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기.
ADC를 제조하기 위해 사용될 수 있는 비제한적 예시적 교차-링커 시약은 본원에서 "예시적 링커" 명칭의 섹션에 기재된다. 단백질성 모이어티 및 화학 모이어티를 포함하여, 2개 모이어티를 연결하기 위한 상기 교차-링커 시약의 이용 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 항체 및 세포독성제를 포함한 융합 단백질은, 예를 들면, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는 콘주게이트의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 암호화한 영역에 의해 분리된 또는 서로 인접한 콘주게이트의 세포독성 부분 및 항체를 암호화한 영역을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체는 항체-수용체 콘주게이트가 환자에 투여되는 종양 사전-표적화에서 이용하기 위해, 이어서 투명제를 이용하여 순환으로부터 미결합된 콘주게이트의 제거 및 그 다음 세포독성제 (예를 들면, 약물 또는 방사선뉴클레오티드)에 콘주게이트된 "리간드" (예를 들면, 아비딘)의 투여를 위하여 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 콘주게이트될 수 있다.
E. 트라스트주맙 - MCC -DM1 및 퍼투주맙
트라스트주맙-MCC-DM1 (T-DM1)
본 발명은, 하기 구조를 갖는, 트라스트주맙-MCC-DM1 (T-DM1, 또한 일명 트라스트주맙 엠탄신), 항체-약물 콘주게이트 (CAS 등록 번호 139504-50-0)를 이용한 치료법을 포함한다:
Figure pct00108
여기에서 Tr은 링커 모이어티 MCC를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 트라스트주맙이다 (US 5208020; US 6441163). 약물 대 항체 비 또는 약물 부하는 트라스트주맙-MCC-DM1의 상기 구조에서 p로 나타내고, 1 내지 약 8의 정수 값 범위이다. 트라스트주맙-MCC-DM1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 약물 모이어티가 항체 트라스트주맙에 공유결합되는 다양하게 부하된 및 부착된 항체-약물 콘주게이트의 모든 혼합물을 포함한다 (US 7097840; US 8337856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
트라스트주맙은 포유동물 세포 (차이니즈 햄스터 난소, CHO) 현탁 배양에 의해 생산될 수 있다. HER2 (또는 c-erbB2) 원종양유전자는, 표피 성장 인자 수용체에 구조적으로 관련된, 185kDa의 막통과 수용체 단백질을 암호화한다. 트라스트주맙은 뮤린 4D5 항체의 항원 결합 잔기를 갖는, 또는 이로부터 유도된 항체이다 (ATCC CRL 10463, 미국 종균 협회 기탁, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 under the Budapest Treaty on May 24, 1990). 예시적 인간화된 4D5 항체는 US 5821337에서와 같이 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (트라스트주맙, HERCEPTIN®)을 포함한다. 일부 구현예에서, T-DM1의 항체 부분은 서열 번호: 30 및 서열 번호 29, 각각에서 보여진 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
트라스트주맙-MCC-DM1은 예를 들어 미국 출원 공개 번호 20110165155의 실시예 1에 따라 제조될 수 있다.
일반적인 제의로서, 용량 당 투여된 초기 약제학적 유효량의 트라스트주맙-MCC-DM1은 환자 체중의 약 0.3 내지 15 mg/kg/일의 범위일 것이다.
상업적 T-DM1 제형 (fomulation) (KADCYLA®, 아도-트라스트주맙 엠탄신)은 단일-용도 바이알에서 멸균된, 백색 내지 황백색 보존제 없는 동결건조된 분말이다. 각 바이알은 100 mg 또는 160 mg 아도-트라스트주맙 엠탄신을 함유한다. 재구성 이후, 각 단일-용도 바이알은 pH 5.0 및 밀도 1.026 g/mL를 갖는 아도-트라스트주맙 엠탄신 (20 mg/mL), 폴리소르베이트 20 [0.02% (w/v)], 나트륨 석시네이트 (10 mM), 및 수크로오스 [6% (w/v)]를 함유한다. 20 mg/mL 아도-트라스트주맙 엠탄신을 함유한 수득한 용액은 정맥내 주입 이후 희석에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 아도-트라스트주맙 엠탄신은 매 3 주 3.6 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 아도-트라스트주맙 엠탄신은 매주 2.4 mg/kg의 용량으로 투여된다.
퍼투주맙 조성물
퍼투주맙 조성물은, 위에서 정의된 바와 같이, 주요 종 퍼투주맙 항체, 및 하나 이상의 이의 변이체의 혼합물을 포함한다. 본원에서 퍼투주맙 주요 종 항체의 바람직한 구현예는 (상기 서열의 탈아미드화된 및/또는 산화된 변이체를 포함한) 서열 번호: 32의 경쇄 아미노산 서열, 및 서열 번호: 31의 중쇄 아미노산 서열을 포함한 것이다. 및 서열 번호: 의 중쇄 아미노산 서열 (상기 서열의 탈아미드화되고/되거나 산화된 변이체 포함). 일부 구현예에서, 본 조성물은 아미노-말단 리더 확대를 포함한, 예를 들면, 서열 번호: 34의 경쇄 아미노산 서열 및 및 서열 번호: 33의 중쇄 아미노산 서열을 포함한 그의 아미노산 서열 변이체 및 주요 종 퍼투주맙 항체의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 아미노-말단 리더 확대는 항체 변이체의 경쇄 상에서 (예를 들면 항체 변이체의 1개 또는 2개 경쇄 상에서)이다. 주요 종 HER2 항체 또는 항체 변이체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면 F(ab')2 단편의 Fab)일 수 있지만, 바람직하게는 둘 모두는 전장 항체이다. 본원에서 항체 변이체는 이의 중쇄 또는 경쇄의 임의의 하나 이상에서 아미노-말단 리더 확대를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노-말단 리더 확대는 항체의 1개 또는 2개 경쇄이다. 아미노-말단 리더 확대는 바람직하게는 VHS--를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 본 조성물에서 아미노-말단 리더 확대의 존재는, 비제한적으로, N-말단 서열 검정, 전하 이종성용 검정 (예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 구역 전기영동), 질량 분광검정법, 등을 포함하여 다양한 검정적 기술로 검출될 수 있다. 조성물에서 항체 변이체의 양은 일반적으로 변이체를 검출하기 위해 사용된 임의의 검정 (바람직하게는 N-말단 서열 검정)의 검출 한계를 구성하는 양 내지 주요 종 항체의 양 미만 양 범위이다. 일반적으로, 본 조성물에서 항체 분자의 약 20% 이하 (예를 들면 약 1% 내지 약 15%, 예를 들면 5% 내지 약 15%)는 아미노-말단 리더 확대를 포함한다. 상기 백분율 양은 바람직하게는 정량적 N-말단 서열 검정 또는 양이온 교환 검정을 이용하여 (바람직하게는 고-해상도, 약 양이온교환 칼럼, 예컨대 PROPAC WCX-10™ 양이온 교환 칼럼을 이용하여) 결정된다. 아미노-말단 리더 확대 변이체를 제외하고, 비제한적으로 이의 한쪽 또는 양쪽 중쇄 상에서 C-말단 리신 잔기를 포함한 항체, 탈아미드화된 항체 변이체, 등을 포함하여, 주요 종 항체 및/또는 변이체의 추가 아미노산 서열 변경이 고려된다.
게다가, 주요 종 항체 또는 변이체는 글리코실화 변화를 추가로 포함할 수 있고, 이의 비제한적인 예는 이의 Fc 영역에 부착된 G1 또는 G2 올리고당 구조를 포함한 항체, 이의 경쇄에 부착된 탄수화물 모이어티 (예를 들면 항체의 1개 또는 2개 경쇄에 부착된, 예를 들면 하나 이상의 리신 잔기에 부착된, 1개 또는 2개 탄수화물 모이어티, 예컨대 글루코오스 또는 갈락토오스)를 포함한 항체, 1개 또는 2개 비-글리코실화된 중쇄를 포함한 항체, 또는 이의 1개 또는 2개 중쇄에 부착된 시알리데이티드 올리고당을 포함한 항체 등을 포함한다.
본 조성물은 유전자 상으로 조작된 세포주, 예를 들면 HER2 항체를 발현한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주로부터 회수될 수 있거나, 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다.
예시적 퍼투주맙 조성물에 관한 더 많은 정보에 대하여, 참고: 미국 특허 번호 7,560,111 및 7,879,325 또한 US 2009/0202546A1.
퍼투주맙 (PERJETA®)의 상업적 제형은 IV 주입용 보존제-없는 용액의 형태로 퍼투주맙 420mg/14mL (30mg/mL)를 함유한다. 일부 구현예에서, 퍼투주맙 요법은 840 mg의 초기 부하 용량의 투여, 이후 매 3 주 420 mg의 변동없는 유지 용량의 투여를 포함한다.
F. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체는 생물학적 샘플에서 HER2의 존재 검출에 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. "생물학적 샘플"은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성, 또는 잠재적 암성 유방 조직을 포함하는 생검 재료)을 포함한다.
일 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-HER2 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 생물학적 샘플 중의 HER2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 항-HER2 항체의 HER2로의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항-HER2 항체와 접촉시키는 단계, 및 복합체가 생물학적 샘플 내에서의 항-HER2 항체와 HER2 간에 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들면, HER2가 환자의 선택용 바이오마커인 경우, 항-HER2 항체가 사용되어 항-HER2 항체를 이용한 요법에 자격있는 대상체를 선택하는데 사용된다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직이다.
추가 구현예에서, 항-HER2 항체는 하기에 의하여 생체내 검출하기 위하여 사용된다: 예를 들어, 암의 진단, 예측, 또는 분류 목적을 위하여 대상체에서의 HER2-양성 암의 예를 들어, 생체내 이미지화에 의하여, 요법의 적절한 코스를 결정함에 의하여, 또는 요법에 대한 암의 반응을 모니터링함에 의하여. 생체내 검출을 위한 본 분야에 알려진 일 방법은 면역-양전자 방출 단층촬영 (면역-PET)이며, 이는 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같다: van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) 및 Verel et al., J. Nucl . Med . 44:1271-1281 (2003). 그러한 구현예에서, HER2-양성 암을 검출하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법이 개시된다: HER2-양성 암을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 표지된 항-HER2 항체를 투여하는 단계; 및 상기 대상체에서 상기 표지된 항-HER2 항체를 검출하는 단계로서, 상기 표지된 항-HER2 항체의 검출은 상기 대상체에서의 HER2-양성 암을 표지하는, 상기 검출 단계. 그러한 특정 구현예에서, 상기 표지된 항-HER2 항체는 양전자 방출핵에 콘주게이트된 항-HER2 항체, 예컨대 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I를 포함한다. 특정 구현예에서, 양전자 방출핵은 89Zr이다.
추가 구현예에서, 진단 또는 검출 방법은 하기를 포함한다: HER2의 존재에 대하여 시험될 생물학적 샘플과, 기질에 고정화된 제1 항-HER2 항체를 접촉시키는 단계, 제2 항-HER2 항체를 상기 기질에 노출시키는 단계, 및 상기 제2 항-HER2가 상기 생물학적 샘플 내 상기 제1 항-HER2 항체 및 HER2 사이의 복합체에 결합되는지 여부를 검출하는 단계. 기질은 임의의 지지 매질, 예컨대 유리, 금속, 세라믹, 폴리머 비드, 슬라이드, 칩, 및 기타 기질일 수 있다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 또는 제2 항-HER2 항체는 본원에 기술된 임의의 항체이다.
상기 구현예 중 임의의 것에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시적 장애는 하기를 포함한다: HER2-양성 암, 예컨대 HER2-양성 유방암 및 HER2-양성 위암. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 면역조직화학 (IHC) 스코어 2+ 또는 3+ 및/또는 원위치 하이브리드화 (ISH) 증폭 비 ≥2.0을 갖는다.
특정 구현예에서, 표지된 항-HER2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들면, 형광성, 발색성, 전자-밀도, 화학발광성, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레신 및 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 엄벨리페론, 루세리페라제, 예를 들면, 개똥벌레 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 염료 전구체 예컨대 HRP를 산화하기 위해 과산화수소를 사용하는 효소로 커플링된, 헤테로사이클릭 옥시다제 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토페록시다아제, 또는 마이크로페록시다아제, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼, 등. 또 다른 구현예에서, 표지는 양전자 방출핵(positron emitter)이다. 양전자 방출핵은 하기를 비제한적으로 포함한다: 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I. 특정 구현예에서, 양전자 방출핵은 89Zr이다.
G. 약제학적 제형
본원에 기재된 바와 같은 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트의 약제학적 제형은 상기 항체 또는 목적하는 정도의 순도를 갖는 면역콘주게이트를 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함에 의해 제조되고 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액 형태이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 이용된 복용량 및 농도에서 수령체에 일반적으로 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적 약제학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재된다. 일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 또는 면역콘주게이트 제형이 미국 특허 번호 6,267,958에 기재된다. 수성 항체 제형은 다음 문헌에 기재된 것들을 포함하고 [문헌참조: 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908], 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서의 상기 제형은 또한 시험된 특정 징후에 필요한 만큼 하나 이상의 활성 성분들을 함유할 수 있고, 바람직하게는 서로 안좋은 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 포함한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 매크로에멀젼에서 각각, 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 상기 기술은 하기에서 개시되어 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
지속-방출 제제는 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는, 매트릭스가 형상화된 물품, 예를 들면 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태인, 항체 또는 면역콘주게이트를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함한다.
생체내 투여용으로 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
H. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트는 방법, 예컨대 치료 방법에서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본원에서 제공된 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트는 HER2-양성 세포의 증식을 억제하는 방법에서 사용되고, 상기 방법은 상기 세포의 표면 상에서 HER2에 대한 항-HER2 항체의 결합을 위하여 허용된 조건 하에서, 상기 세포를 상기 항-HER2 항체에 노출시켜, 이로서 상기 세포의 증식을 억제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법이다. 추가 구현예에서, 세포는 유방암 세포, 또는 위암 세포이다.
시험관내 세포 증식 억제는 Promega (Madison, WI)에서 상업적으로 이용가능한 CellTiter-GloTM 발광 세포 생존력 검정을 사용하여 검정될 수 있다. 상기 검정은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량화에 근거한 배양물 내의 생존 세포의 수를 결정한다. 참고: Crouch et al. (1993) J. Immunol . Meth . 160:81-88, 미국 특허 번호 6602677. 상기 검정은 자동화된 초고속 스크리닝 (HTS)에 따라서 96 또는 384 웰 포맷 (format)으로 수행될 수 있다. 참고: Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. 상기 검정은 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 결과는 루시퍼라아제 반응에 의하여 생산된 발광 신호의 세포 용해 및 생성을 초래한다. 이러한 발광 신호는 ATP의 양에 비례하며, 여기서 상기 양은 배양물 내에 존재하는 생세포의 수에 정비례한다. 데이터는 루미노미터 또는 CCD 카메라 이미지화 장치에 의하여 기록될 수 있다. 발광 산출량은 상대적 밝기 단위 (RLU)로서 표시된다.
또 다른 측면에서, 약제로서 사용되기 위한 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트가 제공된다. 추가 측면에서, 치료 방법에서 사용되기 위한 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트가 제공된다. 특정 구현예에서, HER2-양성 암을 치료하는데 사용되기 위한 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은, 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, HER2-양성 암을 갖는 개체의 치료 방법에서 사용을 위한 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트를 제공한다. 상기 일 구현예에서, 방법은, 예를 들면, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제를 개체에게 투여함을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트의 사용를 위해 제공된다. 일 구현예에서, 약제는 HER2-양성 암의 치료를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 상기 약제는 HER2-양성 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 방법은 HER2-양성 암을 갖는 개체에게 상기 약제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 일 구현예에서, 방법은, 예를 들면, 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제를 개체에게 투여함을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 HER2-양성 암의 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 HER2-양성 암을 갖는 개체에게 유효량의 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 일 구현예에서, 방법은 아래에 기재된 바와 같은 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제를 개체에게 투여함을 추가로 포함한다.
상기 구현예 중 임의의 것에 따른 HER2-양성 암은 예컨대, HER2-양성 유방암 및 HER2-양성 위암일 수 있다. 일부 구현예에서, HER2-양성 암은 면역조직화학 (IHC) 스코어 2+ 또는 3+ 및/또는 원위치 하이브리드화 (ISH) 증폭 비 ≥2.0을 갖는다.
상기 구현예 중의 임의의 것에 따른 “개별,” “환자,” 또는 “대상체”는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에서 사용을 위해, 본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 한 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 본원에서 제공된 임의의 항-HER2 항체 또는 면역콘주게이트 및, 예를 들면, 아래에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트는 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트 (예컨대 hu7C2.v.2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (hu7C2 ADC))는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동-투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 또한 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) HER2의 도메인 II에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 도메인 IV 또는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 하기이다: (i) 에피토프 2C4에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 에피토프 4D5에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트.
일부 구현예에서, hu7C2.v.2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (hu7C2 ADC)는 하기로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료제로 공-투여된다: 트라스투주맙 (Herceptin®), T-DM1 (Kadcyla®) 및 퍼투주맙 (Perjeta®). 일부 구현예에서, hu7C2 ADC는 트라스투주맙과 공-투여된다. 일부 구현예에서, hu7C2 ADC는 T-DM1와 공-투여된다. 일부 구현예에서, hu7C2 ADC는 퍼투주맙과 공-투여된다. 일부 구현예에서, hu7C2 ADC는 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 공-투여된다. 일부 구현예에서, hu7C2 ADC는 T-DM1 및 퍼투주맙과 공-투여된다.
상기 지칭된 상기 병용 요법은 병용 투여 (2 또는 그 초과 치료제가 동일 또는 개별의 제형에 포함되는 경우), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에, 본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전, 동시, 및/또는 이후 발생할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트는 또한, 방사선 요법과 합동으로 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트 (및 임의의 추가의 치료학적 제제)는 비경구, 폐내 및 비강내 및 경우에 따라 국소 치료를 위해, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 모든 적합한 경로, 예컨대 부분적으로 상기 투여가 간단한 것이냐 또는 만성적인 것이냐에 따라, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어진다. 다양한 시점 상에서 단일 또는 다중 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 투여 스케줄, 볼러스 투여 및 펄스 주입이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트는 양호한 의료 실시와 일치된 방식으로 제형화, 복용, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개체 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타의 인자들을 포함한다. 항체 또는 면역콘주게이트는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 임의로 제형화될 필요는 없지만, 제형화된다. 상기 다른 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 항체 또는 면역콘주게이트의 양, 장애의 유형 또는 치료 및 상기 논의된 다른 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로 동일한 투여량으로 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 적당한 것으로 실험적/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 병용하여 사용될 때) 본 발명의 항체 또는 면역콘주게이트의 적절한 복용량은 치료받는 질환의 유형, 항체 또는 면역콘주게이트의 유형, 중증도 및 질환의 추이, 항체 또는 면역콘주게이트가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 항체 또는 면역콘주게이트에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체 또는 면역콘주게이트는 환자에게 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 또는 면역콘주게이트의 약 1 mg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.1mg/kg-10mg/kg)은 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의한 것이든 상관 없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 전형적인 1일 투여량 중의 하나는 상기 지칭된 인자들에 따라 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상에 이른다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 면역콘주게이트의 하나의 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위에 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 또는 10 mg/kg 중 하나 이상의 용량(또는 이들의 임의의 조합)이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예컨대, 따라서 환자가 약 2 회 내지 약 20 회, 또는 예컨대 약 6 회 용량의 항체를 투여받는다). 초기 보다 높은 부하량에 이르는 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약량 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 본 발명의 면역콘주게이트 및 항-HER2 항체 둘 모두를 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.
I. 제품
본원에서 치료 방법에 유용한 hu7C2.v.2.2.LA 항체-약물 콘주게이트 (hu7C2 ADC) 및 트라스트주맙-MCC-DM1 및/또는 퍼투주맙을 함유한 제조 물품, 또는 "키트"가 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 hu7C2 ADC를 포함한 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 추가로 트라스트주맙-MCC-DM1을 포함한 용기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 추가로 퍼투주맙을 포함한 용기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 트라스트주맙-MCC-DM1을 포함한 용기 및 퍼투주맙을 포함한 용기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 동일한 용기에서 2 이상의 hu7C2 ADC, 트라스트주맙-MCC-DM1, 및 퍼투주맙을 포함한다. 키트는 추가로 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 용어 "팩키지 삽입물"은 치료학적 제품의 상업 팩키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용되고 이는 상기 치료학적 제품의 사용에 관한 지적사항, 용도, 투여량, 투여, 사용금지 사항 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 상기 용기는, 본원에서의 치료 방법에 사용되기에 유효한, hu7C2 ADC 및, 임의로, 트라스투주맙-MCC-DM1 및/또는 퍼투주맙 또는 이의 제형을 보유할 수 있으며, 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 본원에서 기술되고 청구되는 치료 방법에서 사용됨을 표지한다. 상기 제조물품은 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 정균처리한 주사용수(BWFI), 인산-완충제 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 추가적인 용기를 또한 함유할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트는 hu7C2 ADC 및, 임의로, 트라스트주맙-MCC-DM1 및/또는 퍼투주맙의 투여용 사용서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트가 hu7C2 ADC 및 제2 약제학적 제형을 포함한 제1 조성물을 포함하면, 키트는 필요한 환자에 제1 및 제2 약제학적 조성물의 동시, 순차적 또는 개별 투여용 사용서를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 키트는 고체 경구 형태의 hu7C2 ADC 및, 임의로, 트라스트주맙-MCC-DM1 및/또는 퍼투주맙, 예컨대 정제 또는 캡슐의 전달에 적합하다. 상기 키트는 바람직하게는 수많은 단위 복용량을 포함한다. 상기 키트는 그의 의도한 용도의 순서로 배향된 복용량을 갖는 카드를 포함할 수 있다. 상기 키트의 예는 "수포 팩"이다. 수포 팩은 패키징 산업에서 잘 알려지고 약제학적 단위 복용 형태의 패키징에 널리 사용된다. 원한다면, 메모리 지원은, 예를 들어 복용량이 투여될 수 있는 치료 계획에서 일을 지정하는, 숫자, 글자, 또는 다른 표시물의 형태로 또는 캘린더 삽입물과 함께 제공될 수 있다.
일 구현예에 따라, 키트는 (a) hu7C2 ADC를 갖는 제1 용기, 및 임의로, (b) 그안에 함유된 트라스트주맙-MCC-DM1 및/또는 그안에 함유된 퍼투주맙을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 (a) hu7C2 ADC를 갖는 제1 용기, (b) 그안에 함유된 트라스트주맙-MCC-DM1을 갖는 제2 용기, 및 (c) 그안에 함유된 퍼투주맙을 갖는 제3 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 정균처리한 주사용수(BWFI), 인산-완충제 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트가 hu7C2 ADC 및 트라스트주맙-MCC-DM1 및/또는 퍼투주맙의 조성물을 포함한 경우, 키트는 별도 조성물을 함유하기 위한 용기 예컨대 분할된 병 또는 분할된 포일 패킷을 포함할 수 있지만, 그러나, 별도 조성물은 또한 단일, 미분할된 용기 내에 함유될 수 있다. 전형적으로, 본 키트는 별개의 성분을 투여하기 위한 지시서를 포함한다. 상기 키트 형태는, 별개의 성분이 바람직하게는 상이한 투여 형태 (예를 들면, 경구 및 비경구)로 투여되는 경우에, 상이한 투여 간격에서 투여되는 경우에, 또는 본 조합물의 별개 성분의 역가측정(titration)이 처방의에 의해 요구되는 경우에, 특히 유리하다.
본원에서 제조 물품의 한 구현예는 암 환자에 대한 투여에 적합한 hu7C2 ADC 및 퍼투주맙 및/또는 T-DM1의 안정한 혼합물을 함유한 정맥내 (IV) 백을 포함한다. 임의로, 혼합물은 염수 용액내이고; 예를 들어 약 0.9% NaCl 또는 약 0.45% NaCl을 포함한다. 예시적 IV 백은 폴리올레핀 또는 폴리비닐 클로라이드 주입 백, 예를 들면 250mL IV 백이다. 본 발명의 일부 구현예에 있어서, 혼합물은 약 420mg 또는 약 840mg의 퍼투주맙 및 약 100 mg 내지 약 160 mg T-DM1을 포함한다.
임의로, IV 백에서 혼합물은 5℃ 또는 30℃에서 최대 24 시간 동안 안정하다. 합물의 안정성은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 검정으로 평가될 수 있다: 색상, 외관 및 선명성 (CAC), 농도 및 탁도 검정, 미립자 검정, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 이온교환 크로마토그래피 (IEC), 모세관 구역 전기영동 (CZE), 이미지 모세관 등전점 전기영동 (iCIEF), 및 효력 검정.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있다.
실시예 1: 뮤린 항체 7C2의 인간화
항-HER2 뮤린 항체 7C2는 HER2의 도메인 I에서 에피토프에 결합한다. 참고, 예를 들면, PCT 공개 번호 WO 98/17797. 상기 에피토프는, HER2의 도메인 IV에 결합하는 트라스트주맙에 의해 결합된 에피토프, 및 HER2의 도메인 II에 결합하는 퍼투주맙에 의해 결합된 에피토프와 상이하다. 참고 도 3, 16, 및 18. 도메인 IV를 결합시킴으로써, 트라스트주맙은 리간드-독립적인 HER2-HER3 복합체를 방해하고, 그렇게 함으로써 다운스트림 신호전달 (예를 들면 PI3K/AKT)를 억제한다. 그에 반해서, 도메인 II에 결합한 퍼투주맙은 다른 HER 패밀리 구성원 (예를 들면 HER3, HER1 또는 HER4)와 리간드-유도된 HER2 상호작용을 예방하고, 따라서 또한 다운스트림 신호 전달을 예방한다. 도메인 I에 MAb 7C2의 결합은 도메인 IV 및 II, 각각에 트라스트주맙 또는 퍼투주맙 결합의 간섭을 초래하지 않고, 그렇게 함으로써 트라스트주맙, 트라스트주맙 엠탄신 (T-DM-1), 및/또는 퍼투주맙과 MAb 7C2 ADC 조합의 포텐셜을 제공한다.
뮤린 항체 7C2 (7C2.B9, 참고 PCT 공개 번호 WO 98/17797)는 아래와 같이 인간화된다.
A. 물질 및 방법
잔기 숫자는 카밧에 따른다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
수용체 인간 공통 프레임워크 상에서 직접적인 초가변 영역 그라프트 7C2의 인간화 동안 작제된 변이체는 IgG의 형태로 평가되었다. 뮤린 7C2로부터 VL 및 VH 도메인은 인간 VL 카파 IV (VLKIV) 및 인간 VH 하위그룹 I (VHI) 공통 서열로 정렬되었다. 뮤린 7C2 (7C2.B9) 항체로부터 초가변 영역 (HVR)은 CDR-그라프트 변이체를 생성하기 위해 VLKIV 및 VHI 수용체 프레임워크로 조작되었다. mu7C2 VL 도메인으로부터, 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3)은 VLKI 속으로 그라프팅된다. mu7C2 VH 도메인으로부터, 위치 26-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)은 VHI 속으로 그라프팅된다 (도 1 및 2). HVR 정의는 그의 서열 초가변성 (Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)), 항원-항체 접촉에서 그의 구조적 위치 (Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)) 및 그의 관여 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))에 의해 정의된다. 중요할 수 있는 프레임워크 버니어 위치를 평가하기 위해, 선택된 버니어 위치는 뮤린 서열로 역으로 돌연변이되었다. 버니어 위치는 VL에서 위치 4 및 49 및 VH에서 위치 37, 67, 69, 71 및 73을 포함한다. VL 서열 및 VH 서열의 3개 상이한 버전은 합성되었고 (Blue Heron, Bothell, WA) 그 뒤에 포유동물 발현 벡터 속으로 서브클로닝되었다. LC의 상이한 버전을 HC와 조합시킴으로써, 총 9개 상이한 hu7C2 그라프트 변이체 (v1.1, v1.2, v1.3, v2.1, v2.2, v2.3, v3.1, v3.2 및 v3.3)는 생성되었다.
친화도 성숙 라이브러리. 단일 phoA 프로모터의 제어 하에서 2 열린 해독틀을 갖는 1가 Fab-g3 디스플레이 파아지미드 벡터가 사용되었다. 제1 열린 해독틀은 수용체 경쇄의 VL 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어지고 제2는 수용체 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열 그 다음 마이너 파아지 외피 단백질 P3으로 이루어진다. HVR 그라프트 변이체 (7C2.v2.1)는 각 초가변 영역에 대하여 별도 올리고뉴클레오티드를 이용한 Kunkel 돌연변이유발에 의해 생성되었고, Fab로서 파아지 상에서 표현되었다.
친화도를 개선하기 위해, 각 초가변 영역에서 변화를 함유한 파아지 라이브러리가 생성되었다. 서열 다양성은 Kunkel 돌연변이유발을 이용하여 7C2.v2.1의 초가변 영역내에 각 위치에서 별도로 도입되었다. 7C2.v2.1 각각의 초가변 영역내에 위치는 올리고뉴클레오티드 암호화 NNS를 이용하여 모든 가능한 20 아미노산에 한번에 한가지 각각 완전히 무작위되었다. 각각 20 구성원으로 이루어진, 총 68 라이브러리는 완전히 무작위된 7C2의 초가변 영역 중 하나 내에 위치한 단일 위치를 갖는 것으로 제조되었다. 동일한 초가변 영역내에 위치를 갖는 라이브러리는 총 6개 라이브러리를 생성하기 위해 풀링되었다.
파아지 라이브러리의 생성. 상기 개괄된 바와 같이 각 초가변 영역으로 다양성을 도입하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드는 37℃에서 1시간 동안 660 ng의 올리고뉴클레오티드, 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT, 및 5 U 폴리뉴클레오티드 키나아제를 함유한 20 μl 반응에서 별도로 인산화되었다.
친화도 성숙 라이브러리를 생성하기 위해, 68 개별적인 Kunkel 돌연변이유발 반응은 96-웰 PCR 플레이트에서 수행되었다. 인산화된 올리고뉴클레오티드 반응 (상기)으로부터, 2 μl는 25 μl의 최종 용적내에 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2의 500 ng Kunkel 템플레이트에 부가되었다. 혼합물은 1 분 동안 90℃에서, 3 분 동안 50℃에서 어닐링되었고 그 다음 얼음 상에서 냉각되었다. 어닐링된 템플레이트는 그 다음 실온에서 2시간 동안 30 μl의 총 용적 내에 0.5 μl 10 mM ATP, 0.5 μl 10 mM dNTPs (10 mM 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 1 μl 100 mM DTT, 1 μl 10X TM 완충제 (0.5 M Tris pH 7.5, 0.1 M MgCl2), 80 U T4 리가아제, 및 4 U T7 폴리머라아제를 부가시킴으로써 내부 충전되었다. 이들 내부 충전된 및 결찰된 생성물은 그 다음 XL1-청색 세포 속으로 각각 형질전환되었다. 동일한 CDR 영역에서 위치를 함유한 라이브러리는 풀링되었고 37℃에서 1시간 동안 10ml SOC 배지에서 회수되었다. 카르베나실린 (50μg/ml) 및 M13/KO7 헬퍼 파아지 (MOI 10)는 부가되었다. 배양물은 37℃에서 또 다른 30분 동안 항온처리되었고 50 μg/ml 카르베나실린 및 50 μg/ml 카나마이신을 함유한 500 ml 2YT로 이동되었고 37℃에서 20시간 성장되었다.
파아지 선택. Her2 세포외 도메인 (Her2 ECD)은 NHS-PEG4-바이오틴 (Pierce)을 이용하여 유리 아민을 통해 비오티닐화되었다. 비오티닐화 반응을 위하여, 4-배 몰 과잉의 바이오틴 시약은 PBS에서 사용되었다. 반응은 그 다음 PBS에서 투석되었다.
파아지는 세포 배양 상청액으로부터 수확되었고 1% BSA를 함유한 PBS에서 현탁되었다. 파아지 라이브러리는 실온에서 비오티닐화된 Her2 ECD로 항온처리되었고 바이오틴-Her2에 결합된 파아지는 그 다음 4℃에서 밤새 MaxiSorp 미세적정 플레이트 (Nunc) 상에서 PBS에 고정된 neutrAvidin (10 μg/ml) 상에서 5분 동안 포착되었다. 미세적정 웰들은 0.05% Tween 20 (PBST)을 함유한 PBS로 광범위하게 세정되었고 결합된 파아지는 웰들을 20 mM HCl, 500 mM KCl로 30분 동안 항온처리시킴으로써 용출되었다. 용출된 파아지는 1 M Tris, pH 7.5로 중화되었고 XL1-청색 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파아지를 이용하여 증폭되었고 37℃에서 밤새 2YT, 50 μg/ml 카르베나실린 및 50 μg/ml 카나마이신내에 성장되었다. 표적 함유 웰로부터 용출된 파아지의 역가는 농축을 평가하기 위해 비-표적 함유 웰로부터 회수된 파아지의 역가와 비교되었다. 선택 엄격성은 결합 동안 비오티닐화된 Her2 ECD의 농도 감소 (5 nM에서 0.2 nM로) 및 용액내 비표지된 Her2 ECD의 1μM로 경쟁 시간 (실온에서 0에서 60분) 증가 모두에 의해 증가되었다.
변이체의 표면 플라즈몬 공명 평가. 7C2 변이체는 293 일시적 형질감염에 의해 IgG로서 표현되었다. IgG는 단백질 G 친화성 크로마토그래피로 정제되었다. Her2용 각 7C2 IgG 변이체의 친화도는 BIAcoreT100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되었다. Biacore 시리즈 S CM5 센서 칩은 단클론성 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체 (인간 항체 포착 키트, GE Healthcare)로 고정되었다. 각 7C2 변이체의 시리즈 3-배 희석은 30 μl/분의 유속으로 주사되었다. 각 샘플은 3-분 회합 및 10-분 해리로 검정되었다. 각 주사 이후 칩은 3 M MgCl2를 이용하여 재생되었다. 결합 반응은 유사한 밀도에서 무관한 IgG를 포착한 유동 세포로부터 RU를 제함으로써 정정되었다. kon 및 koff의 동시 적합화의 1:1 랭기어 모델은 동력학 검정을 위하여 사용되었다.
A. 결과 및 논의
7C2의 인간화. 7C2의 인간화를 위하여 사용된 인간 수용체 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 공통 (VLKIV) 및 인간 VHI 공통에 기반된다. 뮤린 7C2의 VL 및 VH 도메인은 인간 VLKIV 및 VHI 도메인으로 정렬되었고; 초가변 영역은 확인되었고 7C2.v1.1을 생성하기 위해 인간 수용체 프레임워크 속으로 그라프팅되었다. 7C2.v1.1의 1가 친화도는 SPR에 의해 평가된 바와 같이 mu7C2.B9에 비해 2.5-배 감소된다 (참고 표 2).
표 2: 7C2 CDR 그라프팅된 항체의 친화도
Figure pct00109
7C2.v1.1의 결합 친화도를 개선하기 위해, 경쇄내 위치 4 및 49 및 중쇄내 위치 37, 67, 69, 71 및 73은 mu7C2.B9내 이들 위치에서 발견된 잔기로 변화되었다. 7C2.v1.1로부터 사슬을 갖는 이들 변경된 경쇄 및 중쇄의 조합은 293 세포로 형질감염되었고, IgG로서 표현되었고 정제되었고, SPR에 의해 Her2 ECD에 대한 결합에 대하여 평가되었다 (참고 표 2). 경쇄에서 2 변경된 위치 및 중쇄에서 5 변경된 위치를 함유하는 변이체 7C2.v3.3은 키메라성 mu7C2.B9에 비교할만한 1가 친화도를 가졌다 (참고 표 2).
친화도 성숙 라이브러리는, 경쇄에서 최소 변경된 버니어 위치 (Y49K)를 함유하는, 7C2.v2.1의 프레임워크를 이용하여 추가 개선을 되찾기 위한 노력으로 탐구되었다. 각 초가변 영역에 대하여, 모든 20 아미노산은 Kunkle 돌연변이유발 (총 68 라이브러리, 각 20 구성원 함유, 6 친화도 성숙 라이브러리로 풀링됨)을 이용하여 개별적인 위치에서 별도로 도입되었다. 6 친화도 성숙 라이브러리는 비오티닐화된 Her2 ECD를 갖는 용액에서 4 회 세정되었다. 선택 엄격성은 비표지된 Her2 ECD의 포화된 양으로 바이오틴-Her2 ECD의 농도 감소 (5에서 0.2 nM로) 및 경쟁 시간 (실온에서 0에서 1 시간으로) 증가에 의해 서서히 증가되었다. 파아지 강화의 2천배는 H2 라이브러리에 대하여 관측되었다.
최종 회 유래의 총 588 클론이 DNA 서열 검정을 위하여 선택되었다. 개별적인 서열 변화는 각 HVR에서 확인되었다 (참고 표 3). 가장 풍부한 클론은 Met 또는 Leu에 대한 위치 S53에서 VH내에 변화를 가졌다. S53M 및 S53L 변이체는 IgG로서 표현되었고 SPR 검정은 S53M 및 S53L이 Her2에 비교할만한 친화도를 가짐을 나타낸다. 메티오닌이 제조 공정 동안 산화되기 쉽기 때문에 S53L 변이체는 선택되었다. HVR-H2에서 잠재적 이소-아스파르트산 형성 부위는 S55A 돌연변이로 제거되었다 (참고 표 4).
표 3: 친화도-개선된 변이체의 동력학
Figure pct00110
표 4: hu7C2 변이체 친화도의 요약
Figure pct00111
(하기 실시예에서 "hu7C2"로서 지칭된) hu7C2.v2.2.LA 및 mu7C2.B9 ("7C2")의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 인간 VLKIV 및 VHI 도메인의 정렬은 도 1 및 2에서 보여진다.
실시예 2: hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 생산
더 큰 규모 항체 생산을 위하여, 항체는 CHO 세포에서 생산되었다. 중쇄 및 경쇄를 위한 벡터 암호화는 CHO 세포로 형질감염되었고 IgG는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제되었다.
A. 피리딜 디설파이드 PNU 아미드 링커 약물 중간체의 합성
하기 화학식을 갖는 피리딜 디설파이드 PNU 아미드 링커 약물 중간체 ((2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-옥타하이드로-1H-피라노[1,2]옥사졸로[3,4-b][1,4]옥사진-3-일]옥시]-2,5,12-트리하이드록시-7-메톡시-6,11-디옥소-N-[2-(2-피리딜디설파닐)에틸]-3,4-디하이드로-1H-테트라센-2-카복사마이드; "LD-51"):
Figure pct00112
를 아래와 같이 합성하였다. US 8389697의 실시예 3 이후, 3 ml의 메탄올 및 2 ml의 H2O내, WO 1998/02446 및 US 8470984의 실시예 1에 보고된 대로 제조된, PNU-159682 (15.3 mg, 0.02038 mmol)의 용액에, 1 ml의 H2O내 NaIO4 (5.1 mg, 0.0238 mmol)의 용액을 부가하였다. 출발 물질이 검출가능하지 않을 때까지 (TLC 및 HPLC 검정), 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하였고 미정제 적색 고형물 (2S,4S)-2,5,12-트리하이드록시-7-메톡시-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타하이드로-1H-피라노[4',3':4,5][1,3]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일]옥시}-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사하이드로테트라센-2-카복실산 51a를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. MS (ESI): 628 [M+H]+.
Figure pct00113
아르곤 대기 하에서 무수 디클로로메탄내 미정제 중간체 51a의 용액에 무수 트리에틸아민, TBTU (O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, 또한 소위: N,N,N ',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트, CAS 번호 125700-67-6, Sigma-Aldrich B-2903), 및 N-하이드록시석신이미드를 부가하여 51a의 중간체 NHS 에스테르를 형성하였다. 대안적으로, 다른 커플링 시약 예컨대 DCC 또는 EDC를 사용할 수 있다. 1 시간 후, 2-(피리딘-2-일디설파닐)에탄아민 하이드로클로라이드 (CAS 번호 106139-15-5)을 부가하였다. 출발 물질이 사라질 때까지 (HPLC-MS 검정), 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시켰고 잔류물을 그 다음 실리카 겔상의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제시켜, LD-51을 제공하였다. MS (ESI): 796.88 [M+H]+.
B. CBI - PBD 링커 약물 중간체의 합성
하기 화학식을 갖는 CBI-PBD 이량체 (피페라진-카바메이트 프로드러그)-2-프로필 피리딜 디설파이드 링커-약물 중간체 (2-(2-피리딜디설파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-(4-메틸피페라진-1-카보닐)옥시-1,2-디하이드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥스옥시]-6-하이드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라하이드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카복실레이트; 표 A로부터 화합물 81):
Figure pct00114
및 하기 화학식을 갖는 CBI-PBD 이량체 (포스페이트)-2-프로필 피리딜 디설파이드 링커-약물 중간체 (2-(2-피리딜디설파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디하이드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥스옥시]-6-하이드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라하이드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카복실레이트; 표 A로부터 화합물 82):
Figure pct00115
를 아래와 같이 합성하였다. 시약 및 중간체 화학식을 포함하여, 반응 스킴에 대하여, 참고 도 9 및 10. 상기 합성은 2-(2-피리딜디설파닐)프로필 3-[6-[1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1,2-디하이드로벤조[e]인돌-3-일]-6-옥소-헥스옥시]-6-하이드록시-2-메톡시-11-옥소-6a,7,8,9-테트라하이드로-6H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-카복실레이트 ("CBI-PBD-2-프로필 피리딜 디설파이드")의 생산에 또한 적합하다.
건조 DMA (15 mL)내 1 (1.40 g, 4.00 mmol, 하기 문헌 절차에 따라 제조됨: J. Med . Chem . 2003, 46, 2132-2151), 2 (1.31 g, 5.22 mmol, 하기 문헌 절차에 따라 제조됨: WO2004065491 A1) 및 K2CO3 (829 mg, 6.00 mmol)의 혼합물을 실온에서 43시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 그 다음 EtOAc 및 H2O로 희석하고, 양호하게 혼합하고 층 분리시켰다. 유기층을 H2O (3 x), 염수 (1 x)로 세정하고 건조시키고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거하였다. EtOAc:Hex 50:50 내지 67:33 내지 100:0을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 화합물 3 (1.74 g, 84%)을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.77 (br s, 1H), 7.79 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.02-5.92 (m, 1H), 5.36 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.26 (dq, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 4.69-4.60 (m, 2H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.28 (br s, 1H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.90-3.80 (m, 1H), 3.74-3.70 (m, 1H), 3.65-3.59 (m, 1H), 3.54-3.47 (m, 1H), 2.25 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.20-2.15 (m, 1H), 1.93-1.84 (m, 3H), 1.81-1.72 (m, 1H), 1.70-1.63 (m, 3H), 1.53-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). HRMS m/z 543.2666 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C27H40N2NaO8 543.2677)].
Figure pct00116
Et3N (1.32 mL, 9.47 mmol)을 실온에서 건조 DCM (6 mL)내 3 (821 mg, 1.58 mmol)의 용액에 부가하였다. 아세트산 무수물 (0.75 mL, 7.93 mmol)을 그 다음 부가하였고 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하였고 건조 MeOH (1 mL)를 부가하였고 혼합물을 0 ℃에서 15분 동안 교반시켰다. EtOAc (120 mL)를 그 다음 부가하였고 혼합물을 H2O (2 x), 염수 (1 x)로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켜 다음 단계에서 정제 없이 사용된 화합물 4 (891 mg, 정량적)를 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8.88 (br s, 1H), 7.82 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.01-5.91 (m, 1H), 5.36 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.25 (dq, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.61-4.54 (m, 1H), 4.32-4.22 (m, 2H), 4.09-4.06 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.55-3.47 (m, 2H), 2.26-2.23 (m, 2H), 2.18-2.12 (m, 1H), 2.07 (s, 3H), 1.97-1.77 (m, 5H), 1.70-1.63 (m, 2H), 1.54-1.47 (m, 2H), 1.44 (s, 9H). HRMS m/z 585.2774 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C29H42N2NaO9 585.2783)].
Figure pct00117
피롤리딘 (1.6 mL, 19.2 mmol)을 실온에서 건조 DCM (20 mL)내 4 (1.06 g, 1.88 mmol)의 용액에 부가하였다. Pd(PPh3)4 (109 mg, 0.0943 mmol)을 그 다음 부가하였고 반응 혼합물을 실온에서 40 분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 0.25 M HCl 용액 (2 x 75 mL)으로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거하였다. EtOAc:Hex 50:50 내지 100:0을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 화합물 5 (726 mg, 81%)를 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 6.67 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.35-4.30 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 2H), 3.87 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.50-3.44 (m, 1H), 3.42-3.35 (m, 1H), 2.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.07-2.00 (m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.77-1.67 (m, 4H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H). HRMS m/z 501.2573 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C25H38N2NaO7 501.2571)].
Figure pct00118
디포스겐 (0.22 mL, 1.82 mmol)을 실온에서 질소 하에 건조 DCM (25 mL)내 5 (726 mg, 1.52 mmol) 및 DMAP (557 mg, 4.56 mmol)의 혼합물에 부가하였다. 30 분 이후 건조 DCM (25 mL)내 6 (2.60 g, 12.9 mmol; 상기 지칭된 절차에 의해 새롭게 제조됨 - 알코올에 앞서 배정된 숫자 없음)의 용액을 부가하였고 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 18시간 후 반응 혼합물을 H2O (1 x)로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. 과잉의 6을 용출할 때까지 DCM:EtOAc 100:0 내지 95:5 내지 94:6 및 그 다음 EtOAc:Hex 70:30을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 화합물 7 (920 mg, 86%)을 담황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 9.16 (br s, 1H), 8.45-8.43 (m, 1H), 7.83-7.78 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.15 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 4.29 (br s, 1H), 4.17-3.99 (m, 4H), 3.92 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.42-3.30 (m, 3H), 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.06-1.95 (m, 4H), 1.83 (br s, 1H), 1.77-1.68 (m, 4H), 1.58-1.49 (m, 2H), 1.43-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d, J = 6.8 Hz, 3H). HRMS m/z 706.2832 [(M+H)+ (하기에 대해 산출됨: C34H48N3O9S2 706.2826)].
Figure pct00119
DCM-MeOH (34 mL/17 mL)내 7 (949 mg, 1.34 mmol) 및 K2CO3 (1.85 g, 13.4 mmol)의 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반시켰다. 혼합물을 DCM으로 희석하였고, 얼음 H2O (200 mL)에 부었고, 양호하게 혼합시켰고 층 분리시켰다. 수층을 DCM (1 x)으로 추출하였고, 조합된 유기층을 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. DCM:EtOAc 100:0 내지 50:50을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 화합물 8 (808 mg, 91%)을 담황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 9.20 (br s, 1H), 8.44 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 7.81-7.80 (m, 2H), 7.25-7.20 (m, 2H), 6.94 (s, 1H), 4.75 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.17-3.99 (m, 3H), 3.92 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.37-3.20 (m, 3H), 2.20 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.93-1.76 (m, 3H), 1.75-1.68 (m, 3H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.29 (d, J = 6.9 Hz, 3H). HRMS m/z 664.2721 [(M+H)+ (하기에 대해 산출됨: C32H46N3O8S2 664.2724)].
Figure pct00120
(디아세톡시아이오도)벤젠 (259 mg, 0.804 mmol)을 실온에서 건조 DCM (10 mL)내 8 (349 mg, 0.526 mmol) 및 TEMPO (82.2 mg, 0.526 mmol)의 혼합물에 부가하였고 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 24시간 후 혼합물을 DCM 및 포화 수성 Na2S2O3으로 희석하였고 양호하게 혼합시켰다. 층을 분리시켰고 유기층을 포화 수성 Na2S2O3 (1 x), 포화 수성 NaHCO3 (1 x)으로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. EtOAc:Hex 70:30 내지 100:0을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 화합물 9 (248 mg, 71%)를 백색 포말로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 8.45-8.43 (m, 1H), 7.79-7.69 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.24-7.20 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.96 및 6.91 (2s, 1H), 6.55 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 8.9, 6.1 Hz, 1H), 4.31-4.21 (m, 1H), 4.02-3.84 (m, 3H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.40-3.18 (m, 3H), 2.19-2.13 (m, 2H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.96-1.85 (m, 3H), 1.70-1.67 (m, 2H), 1.56-1.45 (m, 2H), 1.40-1.34 (m, 2H), 1.38 및 1.37 (2s, 9H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 662.2592 [(M+H)+ (하기에 대해 산출됨: C32H44N3O8S2 662.2564)].
Figure pct00121
디옥산 (11 mL)내 9 (254 mg, 0.384 mmol) 및 4 M HCl의 혼합물을 1시간 15 분 동안 실온에서 교반시켰다. 용매를 25-30 ℃에서 진공 하에 제거시켜 다음 단계에서 정제 없이 사용된 화합물 10 (162 mg, 70%)을 제공하였다.
Figure pct00122
건조 DMA (5 mL)내 10 (161 mg, 0.266 mmol), 58b (195 mg, 0.542 mmol, 상기 지칭된 절차에 의해 새롭게 제조됨), EDCI.HCl (253 mg, 1.32 mmol) 및 TsOH (19.5 mg, 0.113 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반시켰다. 23시간 후 반응 혼합물을 EtOAc 및 포화 수성 NaHCO3으로 희석하였고 양호하게 혼합시켰다. 층을 분리시켰고 수층을 EtOAc (1 x)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (1 x), 염수 (1 x)로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. DCM:MeOH 100:0 내지 93:7을 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켰고 DCM:MeOH 99:1 내지 94:6을 이용하여 물질을 재칼럼시켜 11 (화합물 번호 81, 118 mg, 47%, HPLC 순도: 98.0%)을 담황색 포말로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 8.43-8.41 (m, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.66 (m, 1H), 7.61-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.97 및 6.92 (2s, 1H), 6.56 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 9.1, 6.2 Hz, 1H), 4.42-4.20 (m, 4H), 4.05-3.76 (m, 7H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.11 (m, 4H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.65-1.62 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H), 9H (DMSO에 의하여 부분적으로 모호함). HRMS m/z 969.3070 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C47H55ClN6NaO9S2 969.3053)].
화합물 82를 아래와 같이 제조하였다:
Figure pct00123
건조 DMA (5 mL)내 10 (162 mg, 0.267 mmol), 66d (178 mg, 0.418 mmol, 상기 지칭된 절차에 의해 새롭게 제조됨), EDCI.HCl (184 mg, 0.960 mmol) 및 TsOH (11 mg, 0.0639 mmol)의 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반시켰다. 18.5시간 후 반응 혼합물을 EtOAc 및 H2O로 희석하였고 양호하게 혼합시켰다. 층을 분리시켰고 유기층을 포화 수성 NaHCO3 (1 x), H2O (1 x), 염수 (1 x)로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. EtOAc:MeOH 100:0 내지 95:5를 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 황색 잔류물을 제공하였다. 이것을 분취형 HPLC (칼럼: Synergi-MAX RP 4 μ, 21.20 x 250 mm; 유속: 12 mL/분; 이동상: 용매 A: H2O/암모늄 포르메이트 완충제 pH 3.45, 용매 B: MeCN/H2O 90:10; 방법: 구배, 30분에 걸쳐 용매 A:용매 B 90:10 내지 10:90 내지 0:100)로 추가 정제하여 화합물 12 (89.3 mg, 33%, HPLC 순도: 99.5%)를 백색 포말로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 8.56 (s, 1H), 8.43-8.41 (m, 1H), 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73-7.67 (m, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.92 (2s, 1H), 6.55 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.40-4.36 (m, 1H), 4.30-4.19 (m, 3H), 4.04-3.86 (m, 4H), 3.86-3.75 (m, 1H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.46 (m, 1H), 3.38-3.22 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.94-1.85 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.55-1.40 (m, 2H), 1.47 및 1.47 (2s, 18H), 1.28-1.23 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 1035.3162 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C49H62ClN4NaO11PS2 1035.3175)].
Figure pct00124
건조 DCM (2 mL)내 12 (84.0 mg, 0.0829 mmol) 및 TFA (1 mL)의 혼합물을 실온에서 40 분 동안 교반시켰다. 용매를 그 다음 25 ℃에서 진공 하에 제거시켜 녹색 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 DCM에서 용해시켰고, 용액을 EtOAc로 희석하였고 DCM을 진공 하에서 제거시켜 경사분리된 백색 고형물 및 잔여 용매를 제공하였다. 본 공정을 반복하였고 수득한 고형물을 EtOAc로 분쇄하였고 건조시켜 13 (표 A의 화합물 82, 43.8 mg, 59%, HPLC 순도: 93.8%)을 백색 고형물로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 8.47 (s, 1H), 8.44-8.42 (m, 1H), 8.08 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.58-7.54 (m, 1H), 7.51-7.48 (m, 1H), 7.47-7.43 (m, 1H), 7.22-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.93 (2s, 1H), 5.46 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.39-4.18 (m, 4H), 4.04-3.95 (m, 3H), 3.90-3.85 (m, 1H), 3.84-3.76 (m, 1H), 3.80 및 3.80 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.40-3.27 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 1H), 2.10-2.02 (m, 1H), 1.94-1.88 (m, 3H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.69-1.60 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 1H), 1.16-1.10 (m, 3H), 3H (관찰되지 않음). HRMS m/z 923.1938 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C41H46ClN4NaO11PS2 923.1923)].
화합물 83을 아래와 같이 제조하였다:
Figure pct00125
건조 DMA (3 mL)내 10 (45.0 mg, 0.0743 mmol), 67d (24.3 mg, 0.0899 mmol, 상기 지칭된 절차에 의해 새롭게 제조됨), EDCI.HCl (42.7 mg, 0.223 mmol) 및 TsOH (3 mg, 0.0174 mmol)의 혼합물을 질소 하에 5시간 동안 실온에서 교반시켰다. 67d (24.3 mg, 0.0899 mmol)의 추가 부분 및 EDCI.HCl (16.0 mg, 0.0835 mmol)을 혼합물에 부가하였고 반응을 실온에서 밤새 교반시켰다. 22시간 후 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하였고 H2O (2 x), 염수 (1 x)로 세정하였고, 건조시켰고 (Na2SO4) 진공 하에서 용매 제거시켰다. EtOAc를 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피로 미정제 생성물을 정제시켜 녹색 분말을 제공하였다. 재차 EtOAc를 이용하여 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피를 실시함으로써 이것을 추가로 정제시켜 14 (표 A의 화합물 83, 8.3 mg, 13.5%, HPLC 순도: 81.2%)를 베이지색 고형물로서 제공하였다. 1H NMR δ (400 MHz, DMSO-d 6) 10.33 (s, 1H), 8.43-8.42 (m, 1H), 8.07 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.74-7.67 (m, 1H), 7.50-7.46 (m, 2H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.24-7.18 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.98 및 6.92 (2s, 1H), 6.56 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 5.47-5.44 (m, 1H), 4.33-4.21 (m, 2H), 4.15-4.13 (m, 2H), 4.05-3.93 (m, 3H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.80 및 3.79 (2s, 3H), 3.52-3.47 (m, 1H), 3.38-3.13 (m, 4H), 2.10-1.99 (m, 1H), 1.94-1.89 (m, 3H), 1.77-1.74 (m, 2H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.52-1.41 (m, 2H), 1.32-1.24 (m, 1H), 1.15-1.10 (m, 3H). HRMS m/z 843.2258 [(M+Na)+ (하기에 대해 산출됨: C41H45ClN4NaO8S2 843.2260)].
화합물 85를 아래와 같이 제조하였다:
DMF (1.0 mL)내 82 (15 mg, 16.64 umol)의 용액에 20 ℃에서 5-니트로피리딘-2-티올 (25.99 mg, 166.41 umol)의 용액을 부가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시켰고 분취-HPLC (FA)로 정제하여 2-((5-니트로피리딘-2-일)디설파닐)프로필 (11aS)-8-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트 85 (7.5 mg, 47.62%)를 회색 고형물로서 제공하였다. LCMS: (10-80, CD_NEG, 3.0 min), 1.161 min, MS = 944.2 [M-1]-；1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 9.18 (s, 1H), 8.41 (br, 1H, J = 7.6 Hz), 8.11 (br, 1H), 7.80 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.67 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.46 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.30 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.99-6.93 (m, 1H), 5.52 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.26-4.14 (m, 4H), 3.98-3.80 (m, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.40-3.26 (m, 5H), 2.40-2.28 (m, 2H), 2.10-1.80 (m, 5H), 1.79-1.55 (m, 5H), 1.40 (br, 1H), 1.19 (s, 1H), 1.12 (d, 3H, J = 8.8 Hz).
화합물 86을 아래와 같이 제조하였다:
단계 A: (S)-디-tert-부틸 (1-(클로로메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-일) 포스페이트 1u의 합성
Figure pct00126
질소 대기하에 20 ℃에서 건조 DCM (25 mL)내 tert-부틸 (S)-1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-카복실레이트 (3.34 g, 10.0 mmol)의 교반된 균질한 용액에 디옥산 (12.5 mL, 50.0 mmol)내 4M HCl을 부가하였다. 부가 이후 반응 혼합물을 20 ℃에서 질소 하에 추가 20시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 석유 에테르 (250 mL)로 희석하였고 20 ℃에서 질소 하에 20분 동안 교반시켰다. 용매를 경사분리시켰고 절차를 석유 에테르 (250 mL)로 한번 더 반복하였다. 수득한 고형물을 25 ℃에서 1시간 동안 진공하에서 건조시켜 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-올 하이드로클로라이드 (2.7 g, 100%)를 제공하였다; 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.80 (s, 1 H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.87 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.58 (br t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.43 (br t, J = 7.4 Hz, 1 H), 6.81 (s, 1 H), 4.27-4.17 (m, 1 H), 4.01 (dd, J = 11.0, 3.2 Hz, 1 H), 3.93-3.74 (m, 3 H), 2 양성자는 관측되지 않음. 미정제 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다.
질소 대기하에 0 ℃에서 건조 DCM (10 mL)내 (S)-1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-올 하이드로클로라이드 (2.7 g, 10.0 mmol) 및 디옥산 (30 mL)의 교반된 이종 혼합물에 트리플루오로아세트산 무수물 (TFAA) (3.4 mL, 24.0 mmol), 그 다음 디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (8.71 mL, 50.0 mmol)을 부가하였다. 부가 이후 반응 혼합물을 0 ℃에서 질소 하에 추가 50 분 동안 교반시켰다. 에틸 아세테이트 (400 mL)을 부가하였고 1N HCl (200 mL)을 0 ℃에서 부가하였고 혼합물을 20분 동안 질소 하에서 교반시켰다. 에틸 아세테이트 층을 분리시켰고, 연속하여 1N HCl (200 mL) 및 물 (2x200 mL)로 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 감압 하에 25 ℃의 배쓰 온도에서 증발시켜 (S)-1-(1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-2,2,2-트리플루오로에탄-1-온 (3.3 g, 100%)을 녹색-회색 고형물로서 제공하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다.
질소 대기하에 20 ℃에서 건조 THF (40 mL)내 (S)-1-(1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-2,2,2-트리플루오로에탄-1-온 (3.3 g, 10.0 mmol)의 교반된 균질한 용액에 디-tert-부틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (4.31 mL, 13.0 mmol)를 부가하였다. 부가 이후 반응 혼합물을 20 ℃에서 질소 하에 5-10 분 동안 교반시켰고 그 다음 테트라졸 (CH3CN내 3% 용액, 38.0 mL, 13.0 mmol)을 17 분에 걸쳐 적가하였다. 최종 반응 혼합물을 20 ℃에서 질소 하에 19시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 빙욕에서 냉각하였고 30% H2O2 (11.3 mL, 100.0 mmol)을 부가하였다. 부가 이후 반응 혼합물을 20 ℃에서 추가 1시간 30분 동안 교반시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (300 mL) 및 10% 수성 Na2S2O3 (500 mL)으로 희석하였고 0 ℃에서 20분 동안 교반시켰다. 에틸 아세테이트 층을 분리시켰고 연속하여 물 (200 mL), 포화된 NaHCO3 (200 mL), 및 물 (200 mL)로 세정하였고 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 감압 하에 25 ℃의 배쓰 온도에서 증발시켜 호박색 오일을 제공하였다. 실리카 겔상의 크로마토그래피 (에틸 아세테이트:석유 에테르 1:3으로 용출)에 의한 정제는 1u (4.7 g, 90%)를 무색 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 39-42 ℃; [α]D -61.8° (c 1.02, CHCl3). 검정 (C23H28ClF3NO5P) 계산치: C, 52.93; H, 5.41; N, 2.68. 실측치; C, 53.05; H, 5.43; N, 2.80.
단계 B: ((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)벤질)옥시)카보닐)아미노)-4-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-5-메톡시벤조일)피롤리딘-2-일)메틸 아세테이트 3g의 합성
Figure pct00127
Figure pct00128
건조 DCM (25 mL)내 2,2,2-트리클로로에틸 (S)-6-(5-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-4-(2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-카보닐)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 3a (4.14 g, 6.95 mmol) (J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151)의 교반된 용액에 아세트산 무수물 (3.30 mL, 34.8 mmol) 및 트리에틸아민 (5.81 mL, 41.7 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 20 ℃에서 3시간 30분 동안 교반시켰다. 건조 MeOH (4.0 mL)을 부가시켰고 혼합물을 30분 동안 교반시켰다. 혼합물을 EtOAc (400 mL)와 물 (400 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고, 물 (2x200mL)로 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 증발시켜 2,2,2-트리클로로에틸 (S)-6-(4-(2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카보닐)-5-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-2-메톡시페녹시)헥사노에이트 3b (4.28 g, 96%)을 오일로서 제공하였다; [α]D -57.4° (c 0.21, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.10 (s, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 6.87 (s, 1 H), 6.01-5.87 (m, 1 H), 5.32 (dd, J = 17.2, 1.5 Hz, 1 H), 5.21 (dd, J = 10.4, 1.4 Hz, 1 H), 4.89 (s, 2 H), 4.54 (d, J = 5.4 Hz, 2 H), 4.39-4.20 (m, 3 H), 3.93 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.75 (s, 3 H), 3.46-3.27 (m, 2 H), 2.13-1.90 (m, 4 H), 1.89-1.60 (m, 7 H), 1.54-1.40 (m, 2 H), 2 양성자는 DMSO 피크에 의해 모호함. HRMS (ESI) m/z C27H36 Cl3N2O9에 대한 계산치: 637.1481, 실측치; 637.1475 [MH+]; C27H35Cl3N2NaO9에 대한 계산치: 659.1300, 실측치; 659.1303 [MNa+]; C27H35Cl3KN2O9에 대한 계산치: 675.1040, 실측치; 675.1035 [MK+].
아세톤 (75 mL), 물 (50 mL), 및 THF (30 mL)내 3b (4.27 g, 6.69 mmol)의 교반된 용액에, 아연 분말 (17.5 g, 268 mmol) 및 NH4Cl (28.6 g, 535 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 20℃에서 질소 대기하에 42시간 동안 교반시켰다. 아세톤 (100 mL)을 부가하였고, 혼합물을 10분 동안 교반시켰고, 상청액을 경사분리시켰다. 절차를 2회 반복하고 조합된 상청액을 감압 하에서 증발시켜 아세톤 및 THF를 제거하였다. 잔류물을 물 (50 mL)로 희석하였고 pH 약 1까지 수성 1N HCl로 산성화하였다. 산성 혼합물을 석유 에테르 (2x200 mL)로 세정하였고 EtOAc (400 mL)로 추출하였다. EtOAc 추출물을 물 (200 mL)로 세정하였고 건조시켰고 (MgSO4) 용매를 증발시켜 (S)-6-(4-(2-(아세톡시메틸)피롤리딘-1-카보닐)-5-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-2-메톡시페녹시)헥산산 3c (2.72 g, 80%)을 오일로서 제공하였다; [α]D -73.5° (c 1.12, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 11.99 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 9.10 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 6.87 (s, 1 H), 6.00-5.86 (m, 1 H), 5.32 (dd, J = 17.2, 1.5 Hz, 1 H), 5.20 (dd, J = 10.4, 1.5 Hz, 1 H), 4.57-4.52 (m, 2 H), 4.37-4.03 (m, 3 H), 3.93 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 3.75 (s, 3 H), 3.40-3.10 (m, 2 H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 2.07-1.93 (m, 4 H), 1.89-1.66 (m, 5 H), 1.62-1.49 (m, 2 H), 1.47-1.34 (m, 2 H). HRMS (ESI) m/z C25H35N2O9에 대한 계산치: 507.2337, 실측치; 507.2340 [MH+]; C25H34KN2O9에 대한 계산치: 545.1896, 실측치; 545.1906 [MK+]; C25H34N2NaO9에 대한 계산치: 529.2157, 실측치; 529.2169 [MNa+].
0℃에서 질소 대기 하에 MeOH (10 mL)내 (S)-디-tert-부틸 (1-(클로로메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-일) 포스페이트 1u (1.38 g, 2.64 mmol)의 교반된 용액에 Cs2CO3 (1.03 g, 3.17 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 30분 동안 교반시켰고 그 다음 EtOAc (200 mL)와 물 (150 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고 물 (100 mL)로 재차 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 감압 하에서 25℃의 배쓰( bathe ) 온도에서 증발시켜 0-20℃에서 22시간 동안 건조 DMA (14 mL)내 3c (1.24 g, 2.45 mmol), EDCI.HCl (1.41 g, 7.35 mmol) 및 p-톨루엔설폰산 (84 mg, 0.49 mmol)으로 처리된 담황색 포말성 고형물로서 (S)-디-tert-부틸 (1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-일) 포스페이트 1v (1.17 g)를 제공하였다. 혼합물을 EtOAc (400 mL)와 물 (300 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고 물 (100 mL)로 재차 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 및 증발시켰다. 실리카 겔상의 크로마토그래피 (EtOAc:석유 에테르 2:1로 용출)에 의한 정제는 ((S)-1-(2-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-4-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-5-메톡시벤조일)피롤리딘-2-일)메틸 아세테이트 3d (1.49 g, 66%)를 담황색 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 55-59℃; [α]D -68.0° (c 1.00, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 9.10 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.57 (t, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.47 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.19 (s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 5.99-5.86 (m, 1 H), 5.32 (dd, J = 17.2, 1.6 Hz, 1 H), 5.20 (dd, J = 10.4, 1.5 Hz, 1 H), 4.53 (d, J = 5.4 Hz, 2 H), 4.45-3.84 (m, 10 H), 3.74 (s, 3 H), 3.44-3.26 (m, 2 H), 2.68-2.47 (m, 2 H), 2.02 (br s, 3 H), 1.93-1.43 (m, 10 H), 1.474 및 1.469 (2 s, 18 H). HRMS (ESI) m/z C46H62ClN3O12P에 대한 계산치: 914.3754, 실측치; 914.3749 [MH+]; C46H61ClKN3O12P에 대한 계산치: 952.3313, 실측치; 952.3381 [MK+]; C46H61ClN3NaO12P에 대한 계산치: 936.3574, 실측치; 936.3589 [MNa+].
20℃에서 질소 대기 하에 DCM (8 mL)내 3d (548 mg, 0.60 mmol)의 교반된 용액에 Pd(Ph3P)4 (17.1 mg; 9.8% Pd) 및 피롤리딘 (0.49 mL, 6.00 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 20℃에서 30분 동안 교반시켰고 그 다음 EtOAc (200 mL)와 물 (150 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고 물 (50 mL)로 재차 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 감압 하에 25℃의 배쓰 온도에서 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔상의 크로마토그래피 (EtOAc:MeOH 50:1로 용출)로 정제하여 ((S)-1-(2-아미노-4-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-5-메톡시벤조일)피롤리딘-2-일)메틸 아세테이트 3e (323 mg, 65%)를 담황색 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 46-49℃; [α]D -85.2° (c 0.36, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 8.56 (s, 1 H), 8.04 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.58 (t, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.47 (t, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 6.37 (s, 1 H), 5.09 (s, D2O와 교환가능, 2 H), 4.46-3.85 (m, 10 H), 3.63 (s, 3 H), 3.52-3.34 (m, 2 H), 2.69-2.50 (m, 2 H), 2.08-1.94 (m, 1 H), 2.01 (s, 3 H), 1.91-1.61 (m, 7 H), 1.58-1.44 (m, 2 H), 1.476 및 1.470 (2 s, 18 H). HRMS (ESI) m/z C42H58ClN3O10P에 대한 계산치: 830.3522, 실측치; 830.3543 [MH+].
질소 대기 하에 20℃에서 건조 DCM (7 mL)내 3e (293 mg, 0.35 mmol) 및 DMAP (202 mg, 1.65 mmol)의 교반된 용액에 건조 DCM (0.05 M, 6.7 mL, 0.33 mmol)내 디포스겐의 용액을 부가하였다. 혼합물을 25분 동안 교반시켰고 그 다음 건조 DCM (20 mL)내 알릴 tert-부틸 (6-((4-(하이드록시메틸)페닐)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디일)(S)-디카바메이트 3f (1.54 g, 3.54 mmol)의 용액을 부가하였다. 혼합물을 20℃에서 질소 대기 하에 68시간 동안 교반시켰고 그 다음 EtOAc (300 mL)와 물 (200 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고, 물 (100 mL)로 재차 세정하였고 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 30℃의 배쓰 온도에서 증발시켰다. 수득한 오렌지색 오일을 실리카 겔상의 크로마토그래피 (EtOAc:MeOH:석유 에테르 30:0.5:10으로 용출)로 정제하여 ((S)-1-(2-((((4-((S)-2-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)벤질)옥시)카보닐)아미노)-4-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-5-메톡시벤조일)피롤리딘-2-일)메틸 아세테이트 3g (385 mg, 84%)를 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 72-75℃; [α]D -55.2° (c 0.53, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.04 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 9.12 (br s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.52 (m, 3 H, D2O 이후 2 H까지 감소됨), 7.46 (t, J = 7.8 Hz, 2 H), 7.31 (d, J = 8.5 Hz, 2 H), 7.20 (br s, 1 H), 6.86 (s, 1 H), 6.75 (저조하게 분할된 t, D2O와 교환가능, 1 H), 5.97-5.83 (m, 1 H), 5.30 (br d, J = 17.3 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 10.6 Hz, 1 H), 5.18-4.97 (m, 2 H), 4.51-3.85 (m, 13 H), 3.74 (s, 3 H), 3.43-3.23 (m, 2 H, 물 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.94-2.83 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.07-1.91 (m, 1 H), 2.01 (br s, 3 H), 1.88-1.43 (m, 11 H), 1.473-1.468 (2 s, 18 H), 1.43-1.20 (m, 4 H), 1.35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z C65H89ClN6O17P에 대한 계산치: 1291.5665, 실측치; 1291.5705 [MH+]; C65H88ClKN6O17P에 대한 계산치: 1329.5262, 실측치; 1329.5264 [MK+]; C65H88ClN6NaO17P에 대한 계산치: 1313.5554, 실측치; 1313.5524 [MNa+].
단계 C: 86의 합성
Figure pct00129
DCM (9 mL) 및 MeOH (9 mL)내 3g (366 mg, 0.28 mmol) 및 K2CO3 (1.14 g, 8.24 mmol)의 혼합물을 0℃에서 3시간 30분 동안 교반시켰다. 혼합물을 10분 동안 차가운 EtOAc (200 mL) 및 빙수 (150 mL)로 교반시켰다. EtOAc 층을 분리시켰고, 물 (100 mL)로 재차 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 25℃의 배쓰 온도에서 증발시켜 알릴 tert-부틸 ((S)-6-((4-((((5-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-2-((S)-2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-카보닐)-4-메톡시페닐)카바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-6-옥소헥산-1,5-디일)디카바메이트 3h (343 mg, 97%)을 무색 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 71-75℃; [α]D -58.2° (c 0.57, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.04 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 9.11 (br s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.53 (m, 3 H, D2O 이후 2 H까지 감소됨), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.32 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.27 (br s, 1 H), 6.93 (s, 1 H), 6.75 (저조하게 분할된 t, D2O와 교환가능, 1 H), 5.97-5.82 (m, 1 H), 5.29 (br d, J = 17.2 Hz, 1 H), 5.17 (br d, J = 10.5 Hz, 1 H), 5.03 (br s, 2 H), 4.73 (t, J = 5.8 Hz, D2O와 교환가능, 1 H), 4.50-3.82 (m, 11 H), 3.74 (s, 3 H), 3.62-3.44 (m, 2 H), 3.40-3.21 (m, 2 H, 물 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.95-2.80 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 모호함), 1.93-1.21 (m, 16 H), 1.473-1.468 (2 s, 18 H), 1.35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z C63H86ClKN6O16P에 대한 계산치: 1287.5158, 실측치; 1287.5113 [MK+]; C63H86ClN6NaO16P에 대한 계산치: 1271.5419, 실측치; 1271.5381 [MNa+].
0℃에서 건조 DCM (14 mL)내 3h (322 mg, 0.26 mmol)의 교반된 용액에 3분에 걸쳐 나누어서 데스-마틴 페리오디난 (DMP) (131 mg, 0.31 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가 2시간 동안, 그 다음 20℃에서 50시간 동안 교반사켰다. 혼합물을 DCM (40 mL) 및 10% Na2S2O3 (40 mL)으로 희석하였고, 20℃에서 10분 동안 교반시켰고, 그 다음 DCM (200 mL)과 포화된 NaHCO3 용액 (150 mL) 사이에서 분할하였다. DCM 층을 분리시켰고 수층을 추가로 DCM (2x50 mL)로 추출하였다. 조합된 DCM 추출물을 포화된 NaHCO3 용액 (2x100 mL) 및 물 (2x100 mL)로 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 25℃의 배쓰 온도에서 증발시켰다. 수득한 오렌지색 오일을 실리카 겔상의 크로마토그래피 (CHCl3:MeOH 40:1로 용출)로 정제하여 4-((S)-2-(((알릴옥시)카보닐)아미노)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)벤질 (11aS)-8-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트 3i (228 mg, 71%)를 담갈색 포말성 고형물로서 제공하였다, mp 98℃ (분해); [α]D +74.5° (c 0.26, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.02 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.04 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.65-7.47 (m, 5 H, D2O 이후 4 H까지 감소됨), 7.25-7.12 (m, 2 H, D2O 교환 상에서 br s 및 1 H), 7.03 (s, 1 H), 6.83-6.64 (m, 2 H), 6.48 (br s, D2O와 교환가능, 1 H), 5.96-5.80 (m, 1 H), 5.52-5.39 (m, D2O 교환 상에서 d, J = 9.6 Hz, 1 H), 5.27 (br d, J = 16.8 Hz, 1 H), 5.21-5.10 (m, 2 H), 4.81 (br d, J = 12.3 Hz, 1 H), 4.54-3.85 (m, 8 H), 3.83-3.70 (m, 5 H), 3.53-3.21 (m, 3 H, 물 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.93-2.82 (m, 2 H), 2.64-2.47 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.10-1.20 (m, 16 H), 1.470 및 1.464 (2 s, 18 H), 1.34 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z C63H84ClKN6O16P에 대한 계산치: 1285.5002, 실측치; 1285.4938 [MK+]; C63H84ClN6NaO16P에 대한 계산치: 1269.5262, 실측치; 1269.5220 [MNa+].
20℃에서 질소 대기 하에 DCM (2 mL)내 3i (125 mg, 0.10 mmol)의 교반된 용액에 Pd(Ph3P)4 (2.9 mg; 9.8% Pd) 및 피롤리딘 (0.08 mL, 1.00 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 20℃에서 교반시켰고 TLC (EtOAc:MeOH 20:1)로 모니터링하였다. 40분 후 더 많은 Pd(Ph3P)4 (5.8 mg; 9.8% Pd) 및 피롤리딘 (0.16 mL, 2.00 mmol)을 부가하였고 혼합물을 또 다른 3시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 EtOAc (100 mL)와 물 (100 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고 물 (50 mL)로 재차 세정하였고, 그 다음 건조시켰고 (MgSO4) 25℃의 배쓰 온도에서 증발시켰다. 미정제 4-((S)-2-아미노-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)헥산아미도)벤질 (11aS)-8-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-((디-tert-부톡시포스포릴)옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트 3j (94 mg, 81%)을 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다. HRMS (ESI) m/z C59H81ClN6O14P에 대한 계산치: 1163.5231, 실측치; 1163.5188 [MH+].
건조 DMA (1.0 mL)내 3j (91 mg, 0.078 mmol)의 용액을 20℃에서 질소 대기 하에 건조 DMA (0.5 mL)내 1-((5-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)펜틸)카바모일)사이클로부탄카복실산 1p (36 mg, 0.12 mmol), EDCI.HCl (34 mg, 0.18 mmol), 및 TsOH (4.0 mg, 0.023 mmol)의 전-형성된 (20℃에서 10분 동안) 혼합물로 처리하였다. 10분 후 DIPEA (0.016 mL, 0.078 mmol)을 부가하였고 반응 혼합물을 23시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 EtOAc (100 mL)와 물 (100 mL) 사이에서 분할하였다. EtOAc 층을 분리시켰고 추가로 포화된 NaHCO3 (50 mL), 물 (50 mL)로 세정하였고, 그 다음 건조시켰다 (MgSO4). 25℃의 배쓰 온도에서 용매의 증발은 실리카 겔상의 크로마토그래피 (CHCl3:EtOAc:MeOH 30:10:2로 용출)로 정제된 미정제 생성물을 제공하여 4-((S)-6-((tert-부톡시카보닐)아미노)-2-(1-((5-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)펜틸)카바모일)사이클로부탄-1-카복사미도)헥산아미도)벤질 (11aS)-8-((6-((S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1,2-디하이드로-3H-벤조[e]인돌-3-일)-6-옥소헥실)옥시)-11-하이드록시-7-메톡시-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카복실레이트 3k (63 mg, 56%)를 담갈색 포말성 고형물로서 제공하였다; mp 67-70℃; [α]D +23.9° (c 2.09, CHCl3); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.05 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.84-7.71 (m, 2 H, D2O와 교환가능), 7.62-7.52 (m, 3 H), 7.46 (t, J = 7.7 Hz, 1 H), 7.22-7.13 (m, 2 H), 7.03 (br s, 1 H), 6.96 (s, 2 H), 6.71 (br s, 2 H, D2O 이후 1 H까지 감소됨), 6.49 (br s, D2O와 교환가능, 1 H), 5.51-5.41 (m, 그러나 J = 9.5 Hz로 D2O 교환 상에서 d, 1 H), 5.15 (d, J = 12.2 Hz, 1 H), 4.82 (br d, J = 12.4 Hz, 1 H), 4.47-3.85 (m, 8 H), 3.77 (br s, 3 H), 3.52-3.20 (m, 3 H, 물 피크에 의해 부분적으로 모호함), 3.12-3.20 (m, 그러나 J = 6.7 Hz로 D2O 교환 상에서 t, 2 H), 2.92-2.80 (m, 2 H), 2.65-2.50 (m, 2 H, DMSO 피크에 의해 부분적으로 모호함), 2.39 (t, J = 7.9 Hz, 2 H), 2.07-1.24 (m, 28 H), 1.469 및 1.463 (2 s, 18 H), 1.33 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z C74H98ClN8NaO18P에 대한 계산치: 1475.6317, 실측치; 1475.6267 [MNa+].
Figure pct00130
20℃에서 질소 하에 DCM (1.0 mL)내 3k (45 mg, 0.031 mmol)의 교반된 용액에 TFA (1.0 mL)를 부가하였고 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 석유 에테르 (20 mL)를 부가하였고 혼합물을 30분 동안 교반시켰다. 상청액을 경사분리시켰고 EtOAc:석유 에테르 (1:5) (2×20 mL)를 이용하여 상기 절차를 반복하였다. 수득한 고형물을 수집하였고 분취형 HPLC [Synergi 극성RP 칼럼; 수성 TFA (pH = 2.56; 90%에서 2%)/CH3CN내 10% 물 (10%에서 98%); 12 mL/분의 유속으로 23분에 걸쳐 구배 용출]로 정제시켜 순수한 86 (17.5 mg, 38%)을 베이지색 고형물로서 제공하였다, 순도 (HPLC): 99.1%; [α]D +54.9° (c 0.18, MeOH); 1H NMR [(CD3)2SO] δ 10.20 (s, D2O와 교환가능, 1 H), 8.50 (s, 1 H), 8.20-7.78 (m, 7 H, D2O 이후 1 H까지 감소됨), 8.12 (d, J = 9.1 Hz, 1 H), 7.72-7.47 (m, 4 H, D2O 이후 3 H까지 감소됨), 7.40 (t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.17 (br d, J = 7.3 Hz, 2 H), 7.03 (br s, 1 H), 6.97 (s, 2 H), 6.66 (br s, D2O와 교환가능, 1 H), 5.51 (br s, 1 H), 5.48 (br d, J = 9.7 Hz, 1 H), 5.32-5.18 (m, 그러나 D2O 이후 d, J = 12.6 Hz, 1 H), 4.75 (br d, J = 12.4 Hz, 1 H), 4.44-3.81 (m, 8 H), 3.77 (s, 3 H), 3.52-3.21 (m, 5 H, 물 피크에 의해 부분적으로 모호함), 3.04 (q, 그러나 J = 6.8 Hz으로 D2O 이후 t, 2 H), 2.80-2.68 (m, 2 H), 2.39 (t, J = 7.7 Hz, 2 H), 2.12-1.08 (m, 28 H). HRMS (ESI) m/z C61H75ClN8O16P에 대한 계산치: 1241.4722, 실측치; 1241.4700 [MH+]; C61H74ClN8NaO16P에 대한 계산치: 1263.4541, 실측치; 1263.4531 [MNa+].
C. CBI 이량체 링커 약물 중간체의 합성
하기 화학식을 갖는 CBI-CBI 이량체 ([(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(클로로메틸)-5-포스포노옥시-1,2-디하이드로벤조[e]인돌-3-일]-3-옥소-프로프-1-에닐]-2-[2-[2-(2,5-디옥소피롤-1-일)에톡시]에톡시]페닐]프로프-2-에노일]-1,2-디하이드로벤조[e]인돌-5-일] 2수소 포스페이트; 표 A의 화합물 78):
Figure pct00131
를 아래와 같이 합성하였다. 시약 및 중간체 화학식을 포함하여, 반응 스킴에 대하여, 참고 도 11.
실온에서 DMF (5 mL)내 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카복실레이트 51a (2.00 g, 5.99 mmol)의 용액에 벤질 브로마이드 (7.13 mL, 59.90 mmol), 요오드화칼륨 KI (50 mg, 0.30 mmol) 및 탄산칼륨 K2CO3 (4.14 g, 30.00 mmol)을 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반시켰고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 침전물을 여과 제거하였다. 여과물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 및 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 회전식 증발기로 제거하였고 과잉의 벤질 브로마이드를 폄핑 제거하였다. 용출물로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:10)의 혼합물을 이용하여 수득한 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (S)-tert-부틸 5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카복실레이트 57a을 백색 고형물로서 제공하였다 (1.97 g, 78%); mp 186-188℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.29 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.86 (br s, 1H), 7.65 (d, J = 8.29 Hz, 1H), 7.55-7.49 (m, 3H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.38-7.31 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.26 (br s, 1H), 4.13 (t, J = 10.8 Hz, 1H), 4.00-3.92 (m, 2H), 3.44 (t, J = 10.5 Hz, 1H), 1.61 (s, 9H) ppm. LRMS (APCI) 실측된 m/z 424.8 (M + H). C25H27ClNO3은 424.2가 필요하다. (Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. and Suntornwat O., (1990) J. Org . Chem ., 55, 5823-5832.)
빙욕에서 냉각된 DCM (15 mL)내 (S)-tert-부틸 1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카복실레이트 51a (1.595 g, 3.76 mmol)로부터 제조된, (S)-tert-부틸 5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-카복실레이트 57a의 용액에, 디옥산 (40 mL)내 4N HCl을 부가하였다. 혼합물을 최대 실온까지 가온시켰고 2시간 동안 교반시켰다. 모든 휘발성 성분을 펌핑 제거하였다. 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트와 차가운 수성 5% 암모니아 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 그 다음 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하여 (S)-5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 57b를 갈색 검으로서 제공하였고, 이것을 직접적으로 사용하였다; 1H NMR (DMSO) δ 8.04 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.45-7.34 (m, 4H), 7.14 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.84 (dd, J = 3.4, 10.7 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 2.4, 10.0 Hz, 1H), 3.55 (t, J = 10.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 324.1150 (M + H). C20H19ClNO는 324.1150이 필요하다.
중간체 57b를 빙욕에서 냉각하였고 피리딘 (15 mL), 그 다음 트리플루오로아세트산 무수물 (3.14 mL, 22.57 mmol)을 부가하였다. 수득한 혼합물을 10분 동안 교반하였고 얼음을 부가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 그 다음 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하였고 용출물로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:10)의 혼합물을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 수득한 잔류물을 정제하여 (S)-1-(5-(벤질옥시)-1-(클로로메틸)-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-2,2,2-트리플루오로에타논 66a을 백색 고형물로서 제공하였다 (1.11 g, 70%); mp 167-170℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.37 (d, J = 8.3Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61-7.54 (m, 3H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.39-7.35 (m, 1H), 5.30 (AB q, J = 11.7, 15.7 Hz, 2H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.9, 11.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 442.0799 (M + Na). C22H17ClF3NNaO2는 442.0795가 필요하다.
-10℃에서, THF (20 mL)내 66a (1.10 g, 2.62 mmol)의 용액에 25% 수성 암모늄 포르메이트 (20 mL) 그 다음 Pd-C 촉매 (10%, 습성, 550 mg)를 부가하였고 혼합물을 2시간 동안 교반한 후에 더 많은 Pd-C 촉매 (550 mg)를 부가하였다. 수득한 혼합물을 -10℃에서 밤새 교반시켰고 셀라이트를 통해 촉매를 여과 제거하였다. THF를 여과물로부터 제거하였고 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 그 다음 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하였고 용출물로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:5)의 혼합물을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 수득한 잔류물을 정제하여 (S)-1-(1-(클로로메틸)-5-하이드록시-1H-벤조[e]인돌-3(2H)-일)-2,2,2-트리플루오로에타논 66b를 황백색 고형물로서 제공하였다 (758 mg, 88%); mp 209-212 ℃. 1H NMR (CDCl3) δ 8.33 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.51-7.47 (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.00-3.95 (m, 1H), 3.93-3.90 (m, 1H), 3.44 (dd, J = 9.8, 11.3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 352.0331 (M + Na). C15H11ClF3NNaO2는 352.0323이 필요하다.
THF (15 mL)내 66b (250 mg, 0.76 mmol)의 용액에 테트라졸 (아세토니트릴내 3%, 13.5 mL, 4.55 mmol) 그 다음 디-tert-부틸-N,N-디-이소프로필 포스포르아미다이트 (1.51 mL, 4.55 mmol)를 부가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰고 빙욕에서 냉각하였고 H2O2 (30% 수용액, 0.78 mL, 7.58 mmol)를 적가하였다. 수득한 혼합물을 최대 실온까지 가온시켰고 5시간 동안 교반시켰다. 빙욕에서 냉각하면서 반응을 10% 수성 나트륨 설파이트의 부가로 켄칭하였다. 유기 휘발성물질을 회전식 증발기로 제거하였다. 수득한 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 그 다음 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 용매를 제거하였고 용출물로서 에틸 아세테이트 및 석유 에테르 (v/v 1:6 내지 1:3)의 구배 혼합물을 이용하여 Florisil® (US Silica) 칼럼 크로마토그래피로 수득한 잔류물을 정제하여 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로아세틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66c를 무색 오일로서 제공하였다 (367 mg, 93%); 1H NMR (DMSO) δ 8.44 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.63-7.59 (m, 1H), 4.61-4.56 (m, 1H), 4.46-4.41 (m, 1H), 4.15-4.12 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 1H), 1.50 (s, 9H), 1.48 (s, 9H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.54 ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 544.1236 (M + Na). C23H28ClF3NNaO5P는 544.1238이 필요하다.
빙욕에서 냉각된 MeOH (2 mL)내 66c (239 mg, 0.46 mmol)의 용액에 CsCO3 (298 mg, 0.92 mmol) 및 몇 방울의 물을 부가하였다. 혼합물을 빙욕에서 1시간 동안 교반하였고 그 다음 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 및 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트를 통해 여과하였고, 용매를 제거하였다. 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트에서 용해시켰고 Florisil® (US Silica) 칼럼 크로마토그래피의 패드를 통해 여과하여 추가 정제 없이 직접적으로 사용된 (S)-디-tert-부틸 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌-5-일 포스페이트 66d를 황백색 검으로서 제공하였다 (183 mg, 94%); 1H NMR (DMSO) δ 8.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.46-7.42 (m, 1H), 7.25-7.21 (m, 1H), 7.13 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.87-3.78 (m, 2H), 3.54-3.42 (m, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.49 (s, 9H) ppm. 31P NMR (DMSO) δ -15.58 ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 426.1587 (M + H). C21H30ClNO4P는 426.1595가 필요하다.
76 mg (0.18 mmol)의 1 (66d, 상기 절차 지칭에 의해 새롭게 제조됨)에 2 (18 mg, 0.045 mmol), EDCI 하이드로클로라이드 (69 mg, 0.36 mmol), 톨루엔설폰산 (0.8 mg, 0.005 mmol) 및 DMA (0.25 mL)를 부가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 이후, 대부분의 DMA를 진공 하에서 제거하였고 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 재분배하였다. 수성 상을 3회 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물 그 다음 염수로 세정하였고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 용매를 제거하였고 수득한 잔류물을 최소 DCM에서 용해시켰고 헵탄의 부가에 의해 침전시켜 미정제 생성물 (54 mg)을 제공하였고, 이것을 추가로 분취형 HPLC (칼럼: Synergi-Max RP 4 μ, 250 × 21.20 mm; 이동상: A/B = 20%에서 1%로 (A: 암모늄 포르메이트 pH 3.45, B: 물내 90% 아세토니트릴); 유속 12 mL/분, 구배 방법; 파장: 254 nm, 325 nm)로 정제하여 3 (17 mg, 30%)을 황색 고형물로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) δ 8.72 (br s, 2H), 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54-7.50 (m, 3H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.26-7.12 (m, 3H), 6.95-6.88 (m, 1H), 6.67 (s, 2H), 4.57-4.52 (m, 2H), 4.47-4.38 (m, 2H), 4.28-4.24 (m, 2H), 4.16-4.09 (m, 2H), 4.00-3.94 (m, 4H), 3.78 (명백한 s, 4H), 3.55-.348 (m, 2H), 1.57 (s, 36H) ppm. 31P NMR (CDCl3) δ -15.64 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 1238.3862 (M + Na). C62H73Cl2N3NaO14P2는 1238.3837이 필요하다.
빙욕에서 냉각된 DCM (1 mL)내 3 (16 mg, 0.013 mmol)의 용액에 TFA (0.5 mL, 3.24 mmol)를 부가하였다. 혼합물을 최대 실온까지 가온시켰고 3시간 동안 교반시켰다. 모든 휘발성 성분을 펌핑 제거하였고 수득한 잔류물을 에틸 아세테이트로 분쇄하여 화합물 78을 황색 고형물로서 제공하였다 (13 mg, 100%, HPLC 순도 100%). 1H NMR (DMSO) δ 8.60 (s, 2H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.95-7.87 (m, 4H), 7.72 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.53-7.45 (m, 4H), 7.38-7.32 (m, 2H), 6.97 (s, 2H), 4.60-4.48 (m, 4H), 4.30-4.28 (m, 4H), 4.08-3.88 (m, 6H), 3.68-3.58 (m, 4H). 31P NMR (DMSO) δ -5.94 (s) ppm. HRMS (ESI) 실측된 m/z 1014.1301 (M + Na). C46H41Cl2N3NaO14P2는 1014.1333이 필요하다.
D. 항체에 링커-약물 모이어티의 콘주게이션
선택된 약물-링커 모이어티에 중쇄 A118C 돌연변이 (티오-hu7C2-HC A118C) 또는 경쇄 K149C 돌연변이 (티오-hu7C2-LC-K149C)를 갖는 hu7C2.v.2.2.LA를 콘주게이트시킴으로써 Hu7C2 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)를 생산한다. 초기에 단리됨에 따라, 항체내 조작된 시스테인 잔기는 세포성 티올 (예를 들면, 글루타티온)을 갖는 혼합된 디설파이드로서 존재하고 따라서 콘주게이션으로 이용할 수 없다. (예를 들면, DTT를 갖는) 이들 항체의 부분적 환원, 정제, 및 데하이드로아스코르브산 (DHAA)과 재산화는, 앞서 기재된 바와 같이, 예를 들면, Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:925-932 및 US 2011/0301334에서, 콘주게이션으로 이용가능한 유리 시스테인 설프하이드릴 기를 갖는 항체를 제공한다. 간단히, 항체는 약물-링커 모이어티와 조합되어 항체의 유리 시스테인 잔기에 약물-링커 모이어티의 콘주게이션을 허용한다. 몇 시간 후, ADCs는 정제된다. 각 ADC에 대하여 약물 부하 (항체 당 약물 모이어티의 평균 수)는 결정되었고 1.4-2.0의 범위이었다.
아래 이들을 위하여 사용된 수득한 ADC 구조 및 용어들은 도 12에서 보여진다.
실시예 3: MMTV - Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
CRL nu/nu 마우스 (Charles River Laboratory)는 MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양의 ~2x2 mm 단편으로 이식되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 7 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 일 1에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-HC-A118C-디설파이드-PBD, 0.3 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-HC-A118C-디설파이드-PBD, 1 mg/kg; (4) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PBD, 0.3 mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PBD, 1 mg/kg; (6) 티오-대조군Ab-HC-A118C-디설파이드-PBD, 1 mg/kg; 또는 (7) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PBD, 1 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시하였다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 5 및 도 4에서 보여진다. 표 5에서 데이터는 일 21부터이고, 일 10부터인 비히클 대조군 그룹은 제외한다. 각 그룹은 연구의 초기에 8 마우스 및 일 21에 8 마우스 (또는 비히클 대조군 그룹에 대하여 일 10에 8 마우스)를 함유하였다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제)는 하기 식을 이용하여 계산된다: %TGI = 100 x (1 - AUC치료/일 ÷ AUC비히클/일). 종양 용적에서 50% 초과 100% 미만 감소로서 정의된 PR = 부분 반응은 연구 동안 임의의 일에 개시 종양 용적과 비교하였다. 동물은 상기 실험에서 완벽한 반응을 보여주지 않았다.
표 5: MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00132
표 5에서 보여진 바와 같이, 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PBD는 1 mg/kg에서 8 부분 반응 및 0.3 mg/kg에서 1 부분 반응을 보여주었다. 티오-hu7C2-HC-A118C-디설파이드-PBD는 1 mg/kg에서 2 부분 반응 및 0.3 mg/kg에서 무 부분 반응을 보여주었다.
실시예 4: MMTV - Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
CRL nu/nu 마우스 (Charles River Laboratory)는 MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양의 ~2x2 mm 단편으로 이식되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 9 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 일 1에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체, 1 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체, 3 mg/kg; (4) 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체, 6 mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 1 mg/kg; (6) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 3 mg/kg; (7) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 6 mg/kg; (8) 티오-대조군Ab-LC-K149C-CBI 이량체, 6 mg/kg; 또는 (9) 티오-대조군Ab-LC-K149C- 디설파이드-CBI-PBD, 6 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시되었다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 6 및 도 5에서 보여진다. 표 6에서 데이터는 일 21부터이고, 일 14부터인 비히클 대조군 그룹은 제외한다. 각 그룹은 연구의 초기에 8 마우스 및 일 21에 8 마우스를 함유하였고, 연구의 초기에 8 마우스 및 일 14에 7 마우스를 가진 비히클 대조군 그룹은 제외한다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제) 및 PR은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 결정되었다. CR = 완벽한 반응은 연구 동안 임의의 일에 종양 용적에서 100% 감소 (측정가능한 종양 없음)로서 정의된다. 실험에서 사용된 각 항체-약물 콘주게이트에 대한 약물:항체 비 (DAR)는 제2 칼럼에서 보여진다.
표 6: MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00133
표 6에서 보이는 바와 같이, 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체는 1 mg/kg에서 1 부분 반응, 3 mg/kg에서 6 부분 반응, 및 6 mg/kg에서 5 부분 반응 및 2 완벽한 반응을 보여주었다. 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD는 6 mg/kg에서 1 부분 반응을 보여주었다. 용량이 1 mg/kg까지 감소된 제2 연구에서, 1 mg/kg에서 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체가 종양 퇴화를 야기하였고 반면에 1 mg/kg에서 티오-대조군Ab-LC-K149C-CBI 이량체는 60%의 % TGI를 야기하였다. 임의의 특정한 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 대조군의 활성은 비-표적화된 활성을 반영한 것으로 여겨진다.
실시예 5: MMTV - Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
CRL nu/nu 마우스 (Charles River Laboratory)는 MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양의 ~2x2 mm 단편으로 이식되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 7 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 일 1에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU, 1 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU, 3 mg/kg; (4) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PNU, 1 mg/kg; (5) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PNU, 3 mg/kg; (6) 트라스트주맙-MCC-DM1 (T-DM1, 트라스트주맙 엠탄신, 아도-트라스트주맙 엠탄신), 3 mg/kg; 또는 (7) T-DM1, 10 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시되었다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 7 및 도 6에서 보여진다. 표 7에서 데이터는 일 20부터이고, 일 14부터인 비히클 대조군 그룹, 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PNU 1 mg/kg 그룹, 및 T-DM1 3 mg/kg 그룹은 제외한다. 각 그룹은 연구의 초기에 8 마우스 및 말기에 8 마우스를 함유하였고, 연구의 초기에 8 마우스 및 말기에 7 마우스를 가진 비히클 대조군 그룹은 제외한다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제는 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 결정되었다. 상기 실험에서, 부분 또는 완벽한 반응은 없었다. 실험에서 사용된 각 항체-약물 콘주게이트에 대한 약물:항체 비 (DAR)는 제2 칼럼에서 보여진다.
표 7: MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00134
이들 데이터는 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU (3 mg/kg)가 상기 모델에서 T-DM1 또는 대조군 면역콘주게이트 보다 더 큰 효능을 가짐을 제안한다.
실시예 6: MMTV - Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
CRL nu/nu 마우스 (Charles River Laboratory)는 MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양의 ~2x2 mm 단편으로 이식되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 9 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 일 1에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-HC-A118C-말레이미드-PNU, ~1 mg/kg (그룹 IV에 매칭된 약물 용량); (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU, 0.3 mg/kg; (4) 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU, 1 mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C- 말레이미드-PNU, 3 mg/kg; (6) 티오-대조군Ab-LC-K149C-말레이미드-PNU, 3 mg/kg; (7) 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체, 0.3 mg/kg; (8) 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체, 1 mg/kg; 또는 (9) 티오-대조군Ab-LC-K149C-CBI 이량체, 1 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시되었다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 8 및 도 7에서 보여진다. 표 8에서 데이터는, 표의 제2 칼럼에서 지적된, 각 그룹에 대하여 연구의 마지막 일로부터이다. 각 그룹은 연구의 초기에 8 마우스 및 말기에 8 마우스를 함유하였고, 연구의 말기에 7 마우스를 가진 그룹 (9)은 제외한다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제), PR, 및 CR은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 결정되었다. 실험에서 사용된 각 항체-약물 콘주게이트에 대한 약물:항체 비 (DAR)는 제2 칼럼에서 보여진다.
표 8: MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00135
표 8에서 보이는 바와 같이, 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU는 1 mg/kg에서 3 부분 반응 및 3 mg/kg에서 8 완벽한 반응을 보여주었다. 티오-hu7C2-LC-K149C-CBI 이량체는 1 mg/kg에서 5 부분 반응을 보여주었다.
실시예 7: KPL4 유방암 세포주 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
SCID 베이지 마우스 (C.B-17 SCID.bg, Charles River Laboratories)는 0.2 ml의 용적으로 흉부 유선 지방 패드 속에 HBSS/매트리겔에서 현탁된 마우스 당 3 백만 세포로 예방접종되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 9 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 일 1에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU, 0.3 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU, 1 mg/kg; (4) 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU, 3 mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU, 0.3 mg/kg; (6) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU, 1 mg/kg; (7) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU, 3 mg/kg; (8) 티오-대조군Ab-LC-K149C-말레이미드-PNU, 3 mg/kg; (9) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PNU, 3 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시되었다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 9 및 도 8에서 보여진다. 표 9에서 데이터는, 일 18로부터인 비히클 대조군 그룹 및 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-PNU 그룹을 제외하고, 모든 그룹에 대하여 일 22로부터이다. 각 그룹은 연구의 초기에 8 마우스 및 말기에 8 마우스를 함유하였고, 연구의 말기에 7 마우스를 가진 그룹 (6)은 제외한다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제), PR, 및 CR은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 결정되었다. 실험에서 사용된 각 항체-약물 콘주게이트에 대한 약물:항체 비 (DAR)는 제2 칼럼에서 보여진다.
표 9: KPL4 유방암 세포주 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00136
표 9에서 보이는 바와 같이, 티오-hu7C2-LC-K149C-말레이미드-PNU는 3 mg/kg에서 7 부분 반응 및 1 완벽한 반응을 보여주었다. 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-PNU는 3 mg/kg에서 7 부분 반응을 보여주었다.
실시예 8: MMTV - Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
CRL nu/nu 마우스 (Charles River Laboratory)는 MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유방 종양의 ~2x2 mm 단편으로 이식되었다. 종양이 100-250 mm3의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 8-10 마우스 각각의 7 그룹으로 그룹화되었다. 마우스는 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 0 일째에 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 2 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 5 mg/kg; (4) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 5 mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD (포스페이트), 2 mg/kg; (6) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD (포스페이트), 5 mg/kg; 또는 (7) 티오-대조군Ab-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD (포스페이트), 5 mg/kg. 종양 및 체중 측정은 연구의 지속시간 동안 주 당 적어도 1회 실시되었다. 종양이 1000-2000 mm3를 도달한 경우 또는 마우스가 그의 체중의 20% 이상을 손실하면 마우스는 안락사되었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 10 및 도 17에서 보여진다. 표 10에서 데이터는, 일 21로부터이다. 각 그룹은 연구의 초기에 7 마우스 및 말기에 7 마우스를 함유하였고, 연구의 말기에 5 마우스를 가진 그룹 (1), 및 연구의 말기에 6 마우스를 가진 그룹 (4)은 제외한다. AUC/일 % TGI (종양 성장 억제) 및 PR은 이전의 실시예에서 기재된 바와 같이 결정되었다. 마우스는 상기 실험에서 완벽한 반응을 보여주지 않았다. 실험에서 사용된 각 항체-약물 콘주게이트에 대한 약물:항체 비 (DAR)는 제2 칼럼에서 보여진다.
표 10: MMTV-Her2 Fo5 트랜스제닉 유선 종양 이종이식 모델에서 hu7C2 ADCs의 효능
Figure pct00137
표 10에서 보이는 바와 같이, 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD는 2 mg/kg에서 2 부분 반응 및 5 mg/kg에서 4 부분 반응을 보여주었다. 티오-hu7C2-LC-K149C--디설파이드-CBI-PBD (포스페이트)는 2 mg/kg에서 1 부분 반응 및 5 mg/kg에서 7 부분 반응을 보여주었다.
실시예 9: HCC1569X2 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능
HCC1569 인간 유방암 세포주는 ATCC (미국 종균 협회; Manassas, VA)로부터 수득되었고 하위-라인 HCC1569X2는 마우스에서 최적의 성장을 위하여 Genentech에서 생성되었다.
암컷 C.B-17 SCID-베이지 마우스 (Charles River Laboratory)는 각각 HBSS/매트리겔 (1:1 비)에서 현탁된 5 백만 HCC1569X2 세포로 흉부 유선 지방 패드 영역에서 예방접종되었다. 이종이식 종양이 100-300 mm3 (일 0)의 평균 종양 용적을 도달한 경우, 동물은 그룹 당 7 마우스를 갖는 7 그룹으로 무작위되었고 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 치료 중 하나의 단일 투여를 수용하였다: (1) 비히클 (20 mM L-히스티딘, 240 mM 수크로오스, 0.02% Tween-20, pH 5.5), (2) 트라스트주맙-MCC-DM1 (T-DM1, 트라스트주맙 엠탄신, 아도-트라스트주맙 엠탄신). 3 mg/kg; (3) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 0.5mg/kg; (4) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 1mg/kg; (5) 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 2mg/kg; (6) T-DM1, 3mg/kg + 티오-hu7C2- LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 0.5mg/kg; 또는 (7) T-DM1, 3mg/kg + 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD, 1mg/kg. 마우스의 종양 및 체중은 연구 전반에 걸쳐 1 주에 1-2 회 측정되었다. 체중 감소가 그의 출발 중량의 >20%인 경우 마우스는 안락사되었다. 모든 동물이 안락사된 후 종양은 3000 mm3를 도달하였거나 또는 임박한 궤양화의 징후를 보여주었다. 종양 용적은 캘리퍼스를 이용하여 2개의 치수 (길이 및 폭)로 측정되었고 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 크기 (mm3)　=　(더 긴 측정　x 더 짧은 측정2) x 0.5.
그 실험의 결과는 표 11 및 도 18에서 보여진다. 표 11에서 데이터는 7 마우스를 가진 모든 그룹을 이용하여 일 14부터이다.
표 11: HCC1569X2 이식 이종이식 모델에서 hu7C2 항체 약물 콘주게이트의 효능.
Figure pct00138
상기 연구에서, 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD는, 2 mg/kg 용량에서 관측된 종양 퇴화와 함께, 종양 성장의 용량-의존적 억제를 입증하였다. 티오-hu7C2-LC-K149C-디설파이드-CBI-PBD 및 T-DM1의 조합은 제제 단독 보다 더 큰 효능을 초래하였고 비히클 그룹과 비교된 동물 체중에서 최소 변화에 기반하여 양호하게 용인되었다.
실시예 10: HER2에 결합된 7C2 Fab의 결정 구조
방법
7C2 / HER2 복합체의 발현, 정제, 및 결정화 - 7C2 Fab는 E. 콜리에서 발현되었고 단백질 G 세파로오스 친화도 수지 (GE), SP 세파로오스 양이온 교환 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 정제되었다. HER2 세포외 도메인 (ECD)은 CHO 세포에서 발현되었고 제어된 기공 유리 구슬에 연결된 트라스트주맙 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피, 그 다음 DEAE 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피로 정제되었다.
Fab 7C2와 HER2 ECD 사이의 복합체는 SEC로 정제되었다. 복합체는 효소 (Endo F1, F2, F3, Endo H 및 PNGase)의 조합을 이용하여 탈글리코실화되었고, 그 다음 0.1M NaCl, 20mM HEPES pH 7.2 및 2% 글리세롤 속에 SEC로 정제되었다. 복합체는 10 mg/mL에서 단백질의 동등 부분 및 저장기 (30% v/v PEG 550 모노메틸에테르, 0.1M 나트륨 시트레이트 3염기성 디히드레이트 pH 5.0)를 이용한 현적 배양에서 1 주 후 두꺼운 플레이트에서 수득하여 결정화되었고 액체 질소에서 액침에 앞서 저장기로 간단히 처리되었다.
2.7 Å 해상도까지 확대한 복합체에 대한 회절 데이터는 SSRL 빔 라인 11-1의 ~110 K에서 수집되었다. 회절 이미지는 통합되었고 CCP4 묶음의 요소 및 프로그램 HKL2000을 이용하여 규모화되었다. 참고 Winn et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol . Crystallogr. 67: 235-42.
구조는 프로그램 페이저를 이용하여 분자 대체 (MR)로 해결되었다. 참고 McCoy et al., 2005, Acta Crystallogr D. Biol . Crystallogr. 61: 458-64. MR 조사 모델은 HER2/HERCEPTIN Fab 복합체 (PDB 코드: 1N8Z)의 결정 구조로부터 유도된 HER2 ECD 도메인, Fab 불변 도메인 (PDB 코드: 1N8Z) 및 프로그램 모델러에 의해 생성된 가변형 도메인용 예상된 모델을 포함한다. 참고 Fiser et al., 2003, Methods Enzymol ., 374: 461-91. 구조는 최대 가능성 표적 기능, 비등방성 개별적인 B-인자, 및 TLS 개량을 이용하여 프로그램 REFMAC5 (Marshudov et al., 2011, Acta Crystallogr D. Biol . Crystallogr. 67: 355-67) 및 PHENIX.refine (Adams et al., 2010, Acta Crystallogr D. Biol . Crystallogr. 66 (pt. 2): 213-21)으로 정제되었다. 데이터 및 개량 통계는 표 12에서 요약된다.
표 12: x-선 회절 데이터 수집 및 구조 개량의 통계 (소괄호내 값은 최후 해상도 쉘에 대한 것이다)
Figure pct00139
결과
7C2 Fab/HER2 복합체의 결정 구조는 2.75 Å 해상도에서 결정되었다. 각 비대칭 단위 세포는 하나의 Fab/HER2 복합체를 함유한다. 구조는 7C2 Fab가 HER2 ECD의 도메인 I에 결합하는 것을 드러냈다 (도 19A). 결합 에피토프는, 도메인 IV 및 II, 각각에 위치한, 치료적 항체 트라스트주맙 (Tmab) 또는 퍼투주맙 (Pmab)의 Fab 단편과 HER2 ECD의 앞서 특성화된 복합체의 것과 상이하다. 참고, 예를 들면, Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; 및 Franklin et al., 2004, Caner Cell, 5: 17-28. 사실상, Tmab/HER2 ECD 복합체 및 Pmab/HER2 ECD 복합체의 구조와 7C2 Fab/HER2 ECD 복합체 구조의 오버레이는 3개의 Fabs가 독립적인, 비-겹쳐진 에피토프를 갖고 HER2에 대한 결합을 서로 공간적으로 방해하지 않음을 보여준다 (도 19A). Tmab/HER2 ECD 복합체, Pmab/HER2 ECD 복합체 및 7C2 Fab/HER2 ECD 복합체 내의 HER2 ECD 구조의 중첩은 최소 구조적 차이를 보여주었다 (도 19B). 상기 관찰은 HER2 ECD가, 문헌에서 이전의 보고서와 일치된, 상대적으로 강직성임을 제시하였다. 참고, 예를 들면, Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot et al., 2010, PNAS, 107: 15039-44; 및 Franklin et al., 2004, Caner Cell, 5: 17-28.
7C2 Fab는 HER2 도메인 I 내의 루프 163-175 및 루프 185-189 (즉, 성숙한 HER2의 아미노산 163-175 및 185-189, 예를 들면, 서열 번호: 39; 도메인 I은 서열 번호: 35에서 보여진다)에 결합한다. 결합은 인터페이스의 각 면 상에서 용매 접근가능한 표면적의 ~1160Å2를 감춘다. 소수성, 수소 결합 및 이온성 상호작용의 복잡한 네트워크가 있다. 결합에 관여된 특정 잔기는 도 19C에 표지된다. His171의 측쇄는 중쇄 잔기 His52 및 Asp55와 접촉한다. HER2 잔기 Ser186, Ser187 및 Glu188은 중쇄로부터 D102와 그리고 경쇄로부터 2개의 Tyr 잔기 (Tyr36 및 Tyr54)와 수소 결합을 형성한다.
7C2 결합 에피토프는 부분적으로 앞서 보고된 항-HER2 항체, chA21로부터의 것으로 겹친다 (도 19D). 참고 Zhou et al., 2011, JBC, 286: 31676-83. 모든 에피토프는 도메인 I (잔기 163-187)에서 루프를 포함한다. 흥미롭게도, 잔기 His171은 모든 항체와 상호작용에서 역할을 한다. 그러나, chA21 결합 에피토프는 7C2 에피토프 보다 더 큰 ~660Å2인 용매 접근가능한 표면적의 ~1820Å2에 이르고 2개의 추가 N-말단 루프, 잔기 100-105 및 잔기 135-144를 포함한다.
이전의 발명이 이해를 명백히 할 목적으로 설명 및 실시예를 통해 일부 상세하게 기재되었지만, 기재 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
서열 표
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Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
<110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-HER2 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES <130> 01146-0037-00PCT <150> US 62/049,594 <151> 2014-09-12 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu 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Leu Pro Asp Leu 385 390 395 400 Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn 405 410 415 Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly 420 425 430 Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His 435 440 445 Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe 450 455 460 Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly 485 490 495 His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe 500 505 510 Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu 515 520 525 Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu 530 535 540 Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp 545 550 555 560 Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala 565 570 575 Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp 580 585 590 Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys 595 600 605 Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln 610 615 620 Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 625 630 635 640 Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg 645 650 655 Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr 660 665 670 Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala 675 680 685 Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu 690 695 700 Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp 705 710 715 720 Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn 725 730 735 Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met 740 745 750 Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu 755 760 765 Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu 770 775 780 Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu 785 790 795 800 Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp 805 810 815 Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys 820 825 830 Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu 835 840 845 Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile 850 855 860 Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln 865 870 875 880 Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe 885 890 895 Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu 900 905 910 Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp 915 920 925 Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg 930 935 940 Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp 945 950 955 960 Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser 965 970 975 Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met 980 985 990 Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe 995 1000 1005 Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg 1010 1015 1020 His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly 1025 1030 1035 1040 Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser 1045 1050 1055 Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala 1060 1065 1070 Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln 1075 1080 1085 Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly 1090 1095 1100 Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln 1105 1110 1115 1120 Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro 1125 1130 1135 Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser 1140 1145 1150 Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala 1155 1160 1165 Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln 1170 1175 1180 Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr 1185 1190 1195 1200 Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys 1205 1210 1215 Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro 1220 1225 1230 Val <210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 43 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Phe Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg

Claims (76)

  1. HER2에 결합하는 단리된 항체로서,
    (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및
    (f) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    를 포함하는, 단리된 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 11의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 및 서열 번호: 10의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 단클론성 항체인, 단리된 항체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 또는 키메라 항체인, 단리된 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, HER2에 결합하는 항체 단편인, 단리된 항체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, HER2는 서열 번호: 1의 아미노산 23 내지 1255를 포함하는 인간 HER2인, 단리된 항체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 HER2의 세포외 도메인 I에 결합하는, 단리된 항체.
  8. 청구항 7에 있어서, HER2의 세포외 도메인 I은 서열 번호: 35의 서열을 갖는, 단리된 항체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 항체인, 단리된 항체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 A118C 및 S400C로부터 선택된 상기 중쇄 불변 영역 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단리된 항체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 K149C 및 V205C로부터 선택된 상기 경쇄 불변 영역 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단리된 항체.
  12. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기를 포함하는, 단리된 항체:
    a) 서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:18의 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    b) 서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 23의 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    c) 서열 번호: 24의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 18의 서열을 포함하는 경쇄.
  13. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 28의 상기 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  14. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 25의 상기 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  15. HER2에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열 번호: 19의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 23의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  16. HER2에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열 번호: 24의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 18의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는, 단리된 핵산.
  18. 청구항 17의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  19. 청구항 18의 숙주 세포를 배양시켜 상기 항체가 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  20. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는, 면역콘주게이트.
  21. 청구항 20에 있어서, 화학식 Ab-(L-D)p를 갖고,
    (a) Ab는 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체이고;
    (b) L은 링커이며;
    (c) D 는 세포독성제이며; 그리고
    (d) p는 1 내지 8의 범위인, 면역콘주게이트.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 세포독성제는 하기로부터 선택되는, 면역콘주게이트: 오리스타틴, 메이탄시노이드, 칼리키아마이신, 피롤로벤조다이아제핀, 네모루비신 유도체, 및 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI).
  23. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 화학식 A의 피롤로벤조다이아제핀인, 면역콘주게이트:
    Figure pct00144

    식 중, 상기 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의의 존재를 나타내고;
    R2 는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 그리고 임의로 추가로 할로 또는 디할로로부터 선택되고, 여기서 RD 는 독립적으로 CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되며;
    R6 및 R9 는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
    R7 은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되며;
    Q 는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되며;
    R11 은 H 또는 R이거나, Q 는 O, SO3M이고, M 은 금속 양이온이며;
    R 및 R’ 는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C3-8 헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 그리고 임의로 NRR’ 기와 연관되고, R 및 R’ 은 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로환식 환을 형성하며;
    R12, R16, R19 및 R17 은 각각, R2, R6, R9 및 R7 에 대해 정의된 바와 같으며;
    R″ 는 C3-12 알킬렌 기이며, 이의 쇄는 임의로 치환된 하나 이상의 헤테로원자 및/또는 방향족 환에 의해 저해될 수 있으며; 그리고
    X 및 X’ 는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다.
  24. 청구항 23에 있어서, D는 하기의 구조를 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00145

    식 중, n은 0 또는 1이다.
  25. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 세포독성제는 네모루비신 유도체인, 면역콘주게이트.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 세포독성제는 하기로부터 선택된 구조를 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00146
    및
    Figure pct00147
  27. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 세포독성제는 1-(클로로메틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]인돌 (CBI)를 포함하는, 면역콘주게이트.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 화학식을 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00148

    식 중,
    R1 은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 L에 대한 결합이며;
    R2 은 H, P(O)3H2, C(O)NRaRb 로부터 선택되거나, 또는 L에 대한 결합이며;
    Ra 및 Rb 는 독립적으로 하나 이상의 F로 임의로 치환된, H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되거나,
    또는 Ra 및 Rb 는 5 또는 6 원 헤테로사이클릴 기를 형성하며;
    T는 하기로부터 선택된 연결기이며: C3-C12 알킬렌, Y, (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌)-Y-(C1-C6 알킬렌), (C2-C6 알케닐렌)-Y-(C2-C6 알케닐렌), 및 (C2-C6 알키닐렌)-Y-(C2-C6 알키닐렌);
    Y 는 독립적으로 O, S, NR1, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택되며;
    알킬렌, 알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로, F, OH, O(C1-C6 알킬), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, 및 C1-C6 알킬로 치환되며, 여기서 알킬은 하나 이상의 F로 임의로 치환되며;
    또는 알킬렌, 알키닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 독립적으로, 그리고 임의로 L에 대한 결합으로 치환되며;
    D' 는 하기로부터 선택되는 약물 모이어티이며:
    Figure pct00149
    및
    Figure pct00150

    여기서 물결선은 T에 대한 부착 부위를 표지하며;
    X1 및 X2 는 독립적으로 O 및 NR3 로부터 선택되며, 여기서 R3 은 하나 이상의 F로 임의로 치환된 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R4 는 H, CO2R, 또는 링커 (L)에 대한 결합이며, 여기서 R은 C1-C6 알킬 또는 벤질이며; 그리고
    R5 는 H 또는 C1-C6 알킬이다.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 세포독성제는 하기로부터 선택된 구조를 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00151

    Figure pct00152

    Figure pct00153
    및
    Figure pct00154
  30. 청구항 21 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 프로테아제에 의하여 절단가능한, 면역콘주게이트.
  31. 청구항 21 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 산-불안정한, 면역콘주게이트.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 링커는 하이드라존인, 면역콘주게이트.
  33. 청구항 21 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 디설파이드인, 면역콘주게이트.
  34. 청구항 21 또는 24에 있어서, 하기로부터 선택된 구조를 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00155
    및
    Figure pct00156
  35. 청구항 21 또는 26에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식을 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00157

    Figure pct00158
    및
    Figure pct00159
  36. 청구항 21 또는 29에 있어서, 하기로부터 선택된 구조를 갖는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00160

    Figure pct00161
    및
    Figure pct00162
  37. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 구조를 포함하는, 면역콘주게이트:
    Figure pct00163
  38. 청구항 21 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, p는 1.3 내지 2 또는 2 내지 5의 범위인, 면역콘주게이트.
  39. 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 제형.
  40. 청구항 39에 있어서, 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 제형.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 추가 치료제는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트인, 약제학적 제형.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기인, 약제학적 제형: (i) HER2의 도메인 II에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 도메인 IV 또는 HER2(domain IV or HER2)에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트.
  43. 청구항 41에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기인, 약제학적 제형: (i) 에피토프 2C4에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 에피토프 4D5에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트.
  44. 청구항 40에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기로부터 선택되는, 약제학적 제형: 트라스투주맙, 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1), 및 퍼투주맙.
  45. 청구항 40에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, 약제학적 제형: (1) 트라스투주맙 또는 T-DM1, 및 (2) 퍼투주맙.
  46. HER2-양성 암을 갖는 개체의 치료방법으로서, 유효량의 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트 또는 청구항 39 내지 45 중 어느 한 항의 약제학적 제형을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 유방암 또는 위암인, 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 초기-단계 유방암인, 방법.
  49. 청구항 47에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 전이성 유방암인, 방법.
  50. 청구항 46 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. HER2-양성 암을 갖는 개체의 치료방법으로서, 유효량의 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트 및 적어도 하나의 추가 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 추가 치료제는 HER2에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트인, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기인, 방법: (i) HER2의 도메인 II에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 도메인 IV 또는 HER2(domain IV or HER2)에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트.
  54. 청구항 52에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기인, 방법: (i) 에피토프 2C4에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트, 및/또는 (ii) 에피토프 4D5에 결합하는 항체 또는 면역콘주게이트.
  55. 청구항 51에 있어서, 상기 추가 치료제는 하기로부터 선택되는, 방법: 트라스투주맙, 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1), 및 퍼투주맙.
  56. 청구항 51에 있어서, 상기 추가 치료제는 (1) 트라스투주맙 또는 T-DM1, 및 (2) 퍼투주맙인, 방법.
  57. 청구항 51 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 유방암 또는 위암인, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 전이성 유방암인, 방법.
  59. 청구항 57에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 초기-단계 유방암인, 방법.
  60. 청구항 46 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 재발성 암인, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 재발성 암은 국소적 재발성 암인, 방법.
  62. 청구항 46 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 진행성 암인, 방법.
  63. 청구항 46 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 절제가능하지 않은, 방법.
  64. HER2-양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서,
    a) 유효량의 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트 또는 청구항 39 내지 45 중 어느 한 항의 약제학적 제형으로의 선행보조치료를 상기 개체에게 적용시키는 단계,
    b) 확정적 수술에 의하여 상기 암을 제거하는 단계, 및
    c) 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트 또는 청구항 39 내지 45 중 어느 한 항의 약제학적 제형으로의 보조치료를 상기 개체에게 적용시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 유방암 또는 위암인, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 HER2-양성 암은 유방암인, 방법.
  67. HER2-양성 세포의 증식을 억제하는 방법으로서,
    상기 세포를, 상기 세포의 표면 상에서 HER2에 대한 면역콘주게이트의 결합에 대해 허용된 조건 하에서 청구항 20 내지 38 중 어느 한 항의 면역콘주게이트에 노출시켜, 이로써 상기 세포의 증식을 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 세포는 유방암 세포 또는 위암 세포(breast cancer cell of a gastric cancer cell)인, 방법.
  69. 표지에 콘주게이트되는, 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항체.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 표지는 양전자 방출핵인, 항체.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 양전자 방출핵은 89Zr인, 항체.
  72. 생물학적 샘플 내 인간 HER2를 검출하는 방법으로서,
    상기 생물학적 샘플을, 천연 발생 인간 HER2로의 항-HER2 항체의 결합에 대해 허용된 조건하에서, 청구항 1 내지 16 및 청구항 69 중 어느 한 항의 항-HER2 항체와 접촉시키는 단계; 및
    복합체가 상기 생물학적 샘플 내 상기 항-HER2 항체와 천연 발생 인간 HER2 사이에서 형성되는지를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 유방암 샘플 또는 위암 샘플인, 방법.
  74. HER2-양성 암을 검출하는 방법으로서,
    (i) HER2-양성 암을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 표지된 항-HER2를 투여하는 단계로서, 상기 표지된 항-HER2 항체는 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항의 항-HER2 항체를 포함하는, 상기 투여 단계, 및
    (ii) 상기 대상체에서 상기 표지된 항-HER2 항체를 검출하는 단계로서, 상기 표지된 항-HER2 항체의 검출은 상기 대상체에서의 HER2-양성 암을 표지하는, 상기 검출 단계
    를 포함하는, 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 표지된 항-HER2 항체는 양전자 방출핵에 콘주게이트된 항-HER2 항체를 포함하는, 방법.
  76. 청구항 75에 있어서, 상기 양전자 방출핵은 89Zr인, 방법.
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