BR112013024574B1 - Anticorpo e uso do anticorpo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, USOS DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO E MÉTODO DE TRATAMENTO COM UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção refere-se a polipeptídeos elaborados que compreendem variantes Fc e seus usos. Mais especificamente, são descritas variantes de Fc que exibem função efetora reduzida. Essas variantes causam benefício para pacientes que sofrem de doenças que poderiam ser tratadas com um anticorpo para o qual é desejável reduzir a função efetora oferecida por anticorpos.

Description

VARIANTES FC DE ANTICORPOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos que compreendem variantes de uma região Fc. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a polipeptídeos que contêm região Fc que alteraram a função efetora em consequência de uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc do polipeptídeo.

RESUMO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se ao campo de variantes de anticorpos e fornece polipeptídeos que compreendem variantes de Fc com função efetora reduzida, como menor ligação de C1q e/ou ADCC.

[003] Particularmente, a presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma variante Fc de uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem, em que a mencionada variante Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição Pro329 e pelo menos uma substituição de aminoácidos adicional, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat e o mencionado polipeptídeo exibe afinidade reduzida ao FCYRIIIA e/ou FCYRIIA e/ou FCYRI humano em comparação com um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG do tipo selvagem e em que o ADCC induzida pelo mencionado polipeptídeo é reduzido a pelo menos 20% do ADCC induzida pelo polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem.

[004] Em uma realização específica, Pro329 de uma região Fc humano do tipo selvagem no polipeptídeo descrito acima é substituída com glicina, arginina ou um resíduo de aminoácido suficientemente grande para destruir o sanduíche de prolina na interface de receptor FC/FCY, que é formada entre a linha pró 329 do Fc e resíduos de triptofano Trp 87 e Trp 110 de FcgRIII (Sondermann et al., Nature 406, 267-273 (20 de julho de 2000)). Em ainda outro aspecto da presente invenção, a pelo menos uma substituição de aminoácido adicional na variante Fc é S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S e, em ainda outra realização, a mencionada pelo menos uma substituição de aminoácido adicional é L234A e L235A da região Fc de IgG1 humano ou S228P e L235E da região Fc de IgG4 humano.

[005] Em outro aspecto da presente invenção, o polipeptídeo fornecido exibe afinidade reduzida a pelo menos um receptor adicional do grupo que compreende os receptores humanos FCYI, FCYIIA e C1q em comparação com o polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem. Em ainda outro aspecto da presente invenção, o polipeptídeo compreende uma região Fc de IgG1 ou IgG4 humano. Em ainda outro aspecto da presente invenção, o polipeptídeo é um anticorpo ou uma proteína de fusão Fc.

[006] Em uma realização adicional, a agregação de trombócitos induzida pelo polipeptídeo que compreende a variante Fc é reduzida em comparação com a agregação de trombócitos induzida por um polipeptídeo que compreende uma região Fc humana do tipo selvagem. Em ainda outra realização, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção exibe CDC fortemente reduzida em comparação com a CDC induzida por um polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem.

[007] Em outra realização da presente invenção, são fornecidos polipeptídeos que compreendem uma variante de Fc, conforme descrito acima, para uso como medicamento. Em uma realização específica, o polipeptídeo é um anticorpo anti-CD9, que é caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que compreende a região Fc do tipo selvagem compreende, como região variável de cadeia pesada, SEQ ID N° 9 e, como região de cadeia leve variável, SEQ ID N° 8.

[008] Em outro aspecto da presente invenção, os polipeptídeos descritos acima são fornecidos para uso no tratamento de doenças, em que é favorável que uma função efetora do polipeptídeo que compreende a variante Fc seja fortemente reduzido em comparação com a função efetora induzida por um polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem.

[009] Em outra realização, o uso dos polipeptídeos descritos acima é fornecido para fabricação de medicamentos para o tratamento de doenças, em que é favorável que a função efetora do polipeptídeo que compreende a variante Fc de uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem seja fortemente reduzido em comparação com a função efetora induzida por um polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem.

[010] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de indivíduo que possui uma doença, em que é favorável que a função efetora do polipeptídeo que compreende uma variante Fc de uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem seja fortemente reduzido em comparação com a função efetora induzida por um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo Fc humano do tipo selvagem, que compreende a administração a indivíduos de uma quantidade eficaz do polipeptídeo descrito acima.

[011] Um aspecto da presente invenção é o uso de um polipeptídeo que compreende uma variante Fc de uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem, em que o mencionado polipeptídeo contém Pro329 da região Fc de IgG humano substituída com glicina, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat e o mencionado polipeptídeo exibe afinidade reduzida ao FCYRIIIA e FCYRIIA humano para inframodulação (downmodulation) de ADCC até pelo menos 20% do ADCC induzida pelo polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG humano do tipo selvagem e/ou para inframodulação de ADCP.

[012] Outro aspecto da presente invenção é o uso de um polipeptídeo que compreende uma variante Fc de uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem, em que o mencionado polipeptídeo contém Pro329 da região Fc de IgG humano substituída com glicina, em que a variante Fc compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos adicionais em L234A e L235A da região Fc de IgG1 humano ou S228P e L235E da região Fc de IgG4 humano, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat e o mencionado polipeptídeo exibe afinidade reduzida ao FCYRIIIA e FCYRIIA humano para inframodulação de ADCC até pelo menos 20% do ADCC induzida pelo polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG humano do tipo selvagem e/ou para inframodulação de ADCP.

[013] Outro aspecto da presente invenção é o uso do polipeptídeo descrito acima, em que a agregação de trombócitos induzida pelo polipeptídeo descrito acima é reduzida em comparação com a agregação de trombócitos induzida por um polipeptídeo que compreende uma região Fc humana do tipo selvagem, em que o polipeptídeo é um anticorpo ativador de plaquetas.

[014] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de tratamento a um indivíduo que possui uma doença, em que o mencionado indivíduo é tratado com polipeptídeos, em que o mencionado polipeptídeo possui Pro329 da região Fc de IgG humano substituída com glicina, os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat e o mencionado polipeptídeo é caracterizado por forte redução da ligação de FCYRIIIA e/ou FCYRIIA em comparação com um polipeptídeo que compreende uma região Fc de IgG humano do tipo selvagem, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do mencionado polipeptídeo.

[015] Em ainda outro aspecto da presente invenção, o polipeptídeo utilizado no mencionado método compreende pelo menos duas substituições de aminoácidos adicionais em L234A e L235A da região Fc de IgG1 humano ou S228P e L235E da região Fc de IgG4 humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[016] Anticorpos monoclonais possuem grande potencial terapêutico e desempenham um papel importante no portfólio médico atual. Durante a última década, uma tendência significativa na indústria farmacêutica foi o desenvolvimento de anticorpos monoclonais (mAbs) como agentes terapêuticos para o tratamento de uma série de doenças, tais como cânceres, asma, artrite, esclerose múltipla etc. Os anticorpos monoclonais são predominantemente fabricados na forma de proteínas recombinantes no cultivo de células de mamíferos elaboradas geneticamente.

[017] A região Fc de um anticorpo, ou seja, as extremidades terminais das cadeias pesadas de anticorpo que cobrem os domínios CH2, CH3 e uma parte da região de articulação, possui variabilidade limitada e está envolvida no desempenho dos papéis fisiológicos pelo anticorpo. As funções efetoras que podem ser atribuídas à região Fc de um anticorpo variam com a classe e a subclasse de anticorpos e incluem a ligação do anticorpo por meio da região Fc a um receptor Fc específico (“FcR”) sobre uma célula que aciona várias respostas biológicas.

[018] Estes receptores possuem tipicamente um domínio extracelular que media ligação a Fc, uma região que varre a membrana e um domínio intracelular que pode mediar algum evento de sinalização no interior da célula. Estes receptores são expressos em uma série de células imunológicas que incluem monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, células mastro, plaquetas, células B, linfócitos granulares grandes, células de Langerhans, células matadoras naturais (NK) e células T. A formação do complexo FC/FCYR recruta estas células efetoras para locais de antígeno ligado, o que tipicamente resulta em eventos de sinalização no interior das células e importantes respostas imunológicas subsequentes, tais como a liberação de mediadores de inflamações, ativação de células B, endocitose, fagocitose e ataque citotóxico. A capacidade de mediação de funções efetoras citotóxicas e fagocíticas é um mecanismo potencial por meio do qual anticorpos destroem células alvo. A reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam FCYRS reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e causam em seguida lise da célula alvo é denominada citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). A reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam FCYRS reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e causam em seguida fagocitose da célula alvo é denominada fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP). Além disso, um local de sobreposição sobre a região Fc da molécula também controla a ativação de uma função citotóxica independente de células mediada por complemento, conhecida de outra forma como citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[019] Para a classe IgG de Abs, ADCC e ADCP são regidos pelo encaixe da região Fc com uma família de receptores denominados receptores Fcy (FcyRs). Em seres humanos, essa família de proteínas compreende FcyRI (CD64); FcyRII (CD32), incluindo as isoformas FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIC; e FcyRIII (CD16), incluindo as isoformas FcyRIIIA e FcyRIIIB (Raghavan e Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes et al., Expert Reviews Vol. 5 (6) (2009), 735-747). FcyRs são expressos sobre uma série de células imunológicas e a formação do complexo Fc/FcyR recruta estas células para locais de antígeno ligado, o que tipicamente resulta em sinalização e respostas imunológicas subsequentes, tais como a liberação de mediadores de inflamações, ativação de células B, endocitose, fagocitose e ataque citotóxico. Além disso, embora FcyRI, FcyRIIA/c e FcyRIIIA sejam receptores ativadores caracterizados por um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora intracelular (ITAM), FCYRIIB possui um motivo de inibição (ITIM) e, portanto, é inibidor. Além disso, de Reys et al., Blood, 81 (1993), 1792-1800 concluíram que a ativação e agregação de plaquetas induzida por anticorpos monoclonais, tais como CD9, é iniciada por reconhecimento de antígenos seguido por uma etapa dependente de domínios Fc, que envolve o receptor de FCYRII (vide também Taylor et al., Blood 96 (2000) 4254-4260). Embora FCYRI ligue IgG monomérico com alta afinidade, FCYRIII e FCYRII são receptores de baixa afinidade, em interação com IgG em complexo ou agregado.

[020] A cascata inflamatória complementar é uma parte da resposta imunológica inata e é fundamental para a capacidade do indivíduo de evitar infecções. Outro ligante Fc importante é a proteína complementar C1q. A ligação de Fc a C1q media um processo denominado citotoxicidade dependente de complemento (CDC). C1q é capaz de ligar seis anticorpos, embora a ligação a dois IgGs seja suficiente para ativar a cascata de complementos. C1q forma um complexo com as proteases de serina C1r e C1s para formar o complexo C1 do processo de complemento.

[021] Em muitas circunstâncias, a ligação e o estímulo de funções efetoras mediadas pela região Fc de imunoglobulinas é altamente benéfica, por exemplo, para um anticorpo CD20, mas em certos casos pode ser mais vantajoso reduzir ou até eliminar a função efetora. Isso é particularmente verdadeiro para os anticorpos projetados para fornecer drogas (tais como toxinas e isótopos) para a célula alvo na qual as funções efetoras mediadas por Fc/FcyR trazem células imunológicas saudáveis para perto da compensação mortal, o que resulta em esgotamento de tecido linfoide normal junto com as células alvo (Hutchins et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White et al., Annu. Rev. Med. 52 (2001) 125-145). Nestes casos, o uso de anticorpos que mal necessitam de células efetoras ou de complemento seria de enorme benefício (vide também Wu et al., Cell Immunol. 200 (2000) 16-26; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9) (2001) 6591-6604; US 6.194.551; US 5.885.573 e publicação PCT WO 04/029207).

[022] Em outros casos, por exemplo, quando o objetivo for bloquear a interação de um receptor amplamente expresso com o seu ligante cognato, seria vantajoso reduzir ou eliminar toda a função efetora de anticorpos para reduzir a toxicidade indesejada. Além disso, caso um anticorpo terapêutico exibisse ligação promíscua ao longo de uma série de tecidos humanos, seria prudente limitar o direcionamento da função efetora a um conjunto diverso de tecidos para limitar a toxicidade. Por fim, mas não menos importante, a redução da afinidade de anticorpos ao receptor FCYRII em particular seria vantajosa para anticorpos que induzem a ativação e agregação de plaquetas por meio de ligação de receptores FCYRII, o que seria um sério efeito colateral desses anticorpos.

[023] Embora haja certas subclasses de imunoglobulinas humanas que não possuem funções efetoras específicas, não há imunoglobulinas de ocorrência natural conhecidas que não possuam todas as funções efetoras. Uma abordagem alternativa seria a elaboração ou mutação dos resíduos críticos na região Fc que são responsáveis pela função efetora. Para exemplos, vide as publicações PCT WO 2009/100309 (Medimmune), WO 2006/076594 (Xencor), WO 1999/58572 (Univ. Cambridge), US 2006/0134709 (Macrogenics), WO 2006/047350 (Xencor), WO 2006/053301 (Xencor), US 6.737.056 (Genentech), US 5.624.821 (Scotgen Pharmaceuticals) e US 2010/0166740 (Roche).

[024] A ligação de IgG a receptores de Fcy ativadores e inibidores ou o primeiro componente de complemento (C1q) depende de resíduos localizados na região de articulação e no domínio CH2. Duas regiões do domínio CH2 são críticas para FcyR2 e ligação de C1q de complemento e possuem sequências exclusivas. A substituição de resíduos IgG1 e IgG2 humanos nas posições 233-236 e resíduos IgG4 nas posições 327, 330 e 331 reduziram em muito ADCC e CDC (Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (8) (1999) 2613-2624; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9) (2001) 6591-6604). Idusogie et al., J. Immunol. 166 (2000) 2571-2575) mapearam o local de ligação de C1q para rituxan e demonstraram que Pro329Ala reduziu a capacidade de Rituximab de igar C1q e ativar complemento. Relatou-se que a substituição de Pro329 por Ala gerou redução da ligação aos receptores FcyRI, FCYRII e FCYRIIIA (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9) (2001) 6591-6604), mas essa mutação também foi descrita como exibindo ligação similar a tipo selvagem ao FcyRI e FcyRII e apenas redução muito pequena da ligação ao receptor FcyRIIIA (Tabela 1 e Tabela 2 de EP 1.068.241, Genentech).

[025] Oganesyan et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704, introduziram a mutação tripla L234F/L235E/P331S no domínio C2H e articulação inferior e exibiram redução da atividade de ligação a moléculas IgG1 humanas de receptor de C1q humano, FcyRI, FcyRII e FcyRIIIA.

[026] Existe ainda a necessidade não atendida de anticorpos com forte redução de ADCC e/ou ADCP e/ou CDC. O objeto da presente invenção foi, portanto, o de identificar esses anticorpos. Descobriu-se, surpreendentemente, que a mutação do resíduo de prolina em Pro329 em glicina resultou em forte inibição inesperada do receptor FcyRIIIA e FcyRIIA e em forte inibição de ADCC e CDC. Além disso, a mutação combinada de Pro329 e, por exemplo, L234A e L235A (LALA) gera forte inibição inesperada de C1q, FcyRI, FcyRII e FcyRIIIA. Desta forma, um resíduo de glicina aparentemente é inesperadamente superior às outras substituições de aminoácidos, como alanina, tal como na posição 329, na destruição do sanduíche de prolina na interface entre receptor Fc e Fcy.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1

[027] As afinidades de ligação de diferentes FcyRs para imunoglobulinas foram medidas por meio de Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) utilizando um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25 °C. a. A afinidade de ligação de FCYRI foi testada para variantes de anticorpo GA101 (GA) (mutação de IgG1-P329G, IgG4-SPLE e IgG1-LALA) e para variantes de anticorpos P-selectina (PS) (IgG1-P329G, IgG1-LALA e IgG4- SPLE), bem como para os anticorpos do tipo selvagem. b. A afinidade de ligação de FCYRI foi testada para variantes de anticorpo CD9 (IgG1-tipo selvagem, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G/LALA, IgG4-SPLE/P329G), bem como para os anticorpos do tipo selvagem. c. A afinidade de ligação de FcyRIIA (R131) foi testada para variantes de anticorpo CD9 (IgG1-tipo selvagem, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG4-SPLE, IgG1-P329G/LALA, IgG4-SPLE/P329G), bem como para os anticorpos do tipo selvagem. A resposta normalizada é exibida em função da concentração do receptor. d. A afinidade de ligação de FcyRIIB foi testada para variantes de anticorpos CD9 (denominado no presente “TA”) (IgG1-tipo selvagem, IgG4- SPLE/P329G, IgG1-LALA, IgG1-LALA/P329G) e variantes de anticorpos P- selectina (pSel) (IgG1-tipo selvagem e IgG4-SPLE), bem como para os anticorpos do tipo selvagem. e. A afinidade de ligação de FcyRIIIA-V158 foi testada para variantes de anticorpo CD9 (IgG1-tipo selvagem, IgG1-SPLE, IgG1-LALA, IgG4- SPLE/P329G, IgG1-P329G, IgG1-LALA, IgG1-LALA/P329G), bem como para os anticorpos do tipo selvagem. A resposta normalizada é exibida em função da concentração do receptor.

FIGURA 2

[028] A ligação de C1q foi testada para variantes de anticorpos de P-selectina (PS) (IgG1 do tipo selvagem, P329G, IgG4-SPLE) e variantes de anticorpos CD20 (GA) (IgG1-tipo selvagem, P329G e IgG4-SPLE).

FIGURA 3

[029] A potência para recrutar células efetoras imunes depende do tipo de variante de Fc. Variantes de Fc foram revestidas sobre uma placa ELISA e foram adicionadas células eftoras de NK92 humanas transfectadas com FCYRIIIA humano. A indução da atividade citolítica de células NK ativadas foi medida utilizando um teste de esterase. a. Foram analisadas variantes de anticorpos CD20 (GA101) (tipo selvagem, LALA, P329G, P329G/LALA). b. Foram analisadas variantes de anticorpos CD20 (GA101) (mutações P329R ou P329G introduzidas. c. Todas as variantes foram produzidas na versão glicoelaborada, a fim de ter sinal mais forte para qualquer função de recrutamento de células efetoras.

FIGURA 4

[030] A potência para recrutar células efetoras imunes depende do tipo de variante de Fc, conforme medido por meio de teste ADCC clássico. Linhagem de células NK92 humanas transfectada com FYCRIIIA foi utilizada como efetora e células Raji positivas para CD20 foram utilizadas como células alvo. Foram testadas variantes de anticorpos CD20 glicoelaborados (GA101 G(2)) e anticorpos CD20 não glicoelaborados (GA101) (mutações P329G, P329A ou LALA introduzidas). a. anticorpo CD20 não glicoelaborado: mutações P329G, LALA e P329G/LALA, respectivamente, foram introduzidas no anticorpo. b. anticorpo CD20 glicoelaborado: mutações P329G, P329A e LALA, respectivamente, foram introduzidas no anticorpo.

FIGURA 5

[031] Teste de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). As diferentes variantes Fc de um anticorpo CD20 não glicoelaborado e glicoelaborado (GA101) foram analisadas para determinar a sua eficácia de mediação de CDC sobre células alvo SUDH-L4. a. CD20 não glicoelaborado: mutações P329G, LALA e P329G/LALA, respectivamente, foram introduzidas no anticorpo. b. CD20 glicoelaborado: mutações P329G, P329A e LALA, respectivamente, foram introduzidas no anticorpo. FIGURA 6 a. Perfil de carboidratos de glicanos associados a Fc de variantes IgG1 humanas. O percentual de glicosilação sobre oligossacarídeos associados a Fc de hIgG1 contendo as mutações LALA, P329G, P329A ou P329G/LALA difere apenas minimamente do anticorpo do tipo selvagem. b. Galactosilação relativa: Quatro IgGs diferentes com mutações P329G/LALA de IgG1 introduzidas. Quatro domínios V diferentes foram comparados pela sua quantidade de galactosilação quando expressos em células Hek293 EBNA.

FIGURA 7

[032] Agregação de plaquetas induzida por anticorpos em exame de sangue integral. Agregação de plaquetas induzida por IgG1 murino, conforme determinado para dois doadores com resposta diferente dependendo da concentração de anticorpo. a. Doador A; b. Doador B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[033] No presente relatório descritivo e nas reivindicações, a numeração dos resíduos em cadeias pesadas de imunoglobulina é a do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), expressamente incorporado ao presente como referência. O “índice EU como em Kabat” designa a numeração de resíduos do anticorpo IgG1 EU humano.

[034] “Afinidade” designa a resistência da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (tal como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como um antígeno ou um receptor Fc). A menos que indicado em contrário, da forma utilizada no presente, “afinidade de ligação” designa afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (tal como anticorpo/receptor de Fc ou anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, que incluem os descritos no presente. Exemplos e ilustrações específicas de realizações de medição da afinidade de ligação encontram-se descritos a seguir.

[035] Anticorpo “amadurecido por afinidade” designa um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui essas alterações, em que essas alterações resultam em aumento da afinidade do anticorpo para antígeno.

[036] “Modificação de aminoácidos” designa mudança na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos previamente determinada. Exemplos de modificações incluem uma substituição, inserção e/ou exclusão de aminoácidos. A modificação de aminoácido preferida no presente é uma substituição. “Modificação de aminoácido em” uma posição especificada, por exemplo, da região Fc designa a substituição ou exclusão do resíduo especificado ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido ao lado do resíduo especificado. Por inserção “ao lado de” um resíduo especificado, indica-se inserção em um a dois dos seus resíduos. A inserção pode ser N- terminal ou C-terminal para o resíduo especificado.

[037] “Substituição de aminoácido” indica a substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácidos previamente detreminada com outro resíduo de aminoácido de “substituição” diferente. O(s) resíduo(s) de substituição pode(m) ser “resíduo(s) de aminoácidos de ocorrência natural” (ou seja, codificado(s) pelo código genético) e selecionado(s) a partir do grupo que consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Val). Preferencialmente, o resíduo de substituição não é cisteína. A substituição com um ou mais resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural também é englobada pela definição de substituição de aminoácido no presente. “Resíduo de aminoácido não de ocorrência natural” designa um resíduo diferente dos resíduos de aminoácidos de ocorrência natural relacionados acima, que é capaz de ligar covalentemente resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) em uma cadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de aminoácidos não de ocorrência não natural incluem norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ellman et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Para gerar esses resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural, podem ser utilizados os procedimentos de Noren et al., Science 244 (1989) 182 e Ellman et al., acima. Resumidamente, estes procedimentos envolvem a ativação química de um tRNA supressor com resíduo de aminoácido não de ocorrência natural seguido por transcrição e tradução do RNA in vitro.

[038] “Inserção de aminoácido” indica a incorporação de pelo menos um aminoácido em uma sequência de aminoácidos previamente determinada. Embora a inserção normalmente consista na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, o presente pedido contempla “inserções de peptídeos” maiores, tais como a inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até cerca de dez resíduos de aminoácidos. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode(m) ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, conforme descrito acima.

[039] “Exclusão de aminoácido” indica a remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência de aminoácidos previamente determinada.

[040] O termo “anticorpo” no presente é utilizado no sentido mais amplo e engloba diversas estruturas de anticorpos, incluindo, mas sem limitações, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de ligação de antígenos desejada.

[041] A expressão “variante de anticorpos”, da forma utilizada no presente, designa uma variante de um anticorpo do tipo selvagem, carcterizada pelo fato de que uma alteração da sequência de aminoácidos com relação ao anticorpo do tipo selvagem ocorre na variante de anticorpo, introduzida, por exemplo, por mutações de um resíduo de aminoácido específico no anticorpo do tipo selvagem.

[042] A expressão “função(ões) efetora(s) de anticorpos” ou “função efetora”, da forma utilizada no presente, designa uma função contribuída por um ou mais domínios efetores de Fc de um IgG (tal como a região Fc de uma imunoglobulina). Essa função pode ser efetuada, por exemplo, por meio de ligação de um ou mais domínios efetores de Fc a um receptor Fc sobre uma célula imunológica com atividade fagocítica ou lítica ou por meio de ligação de um ou mais domínios efetores de Fc a componentes do sistema de complemento. Funções efetoras típicas são ADCC, ADCP e CDC.

[043] “Fragmento de anticorpo” designa uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma parte de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas sem limitações, fragmentos de Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH e F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de fita simples (tais como scFv); e anticorpos multiespecíficos formados com fragmentos de anticorpos.

[044] “Anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como anticorpo de referência, designa um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais e, por outro lado, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais. É fornecido no presente um exemplo de teste de competição.

[045] “Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” e “ADCC” designam reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam FcRs (tais como células Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula alvo e, em seguida, causam lise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9 (1991) 457-492.

[046] As expressões “fagocitose celular dependente de anticorpos” e “ADCP” designam um processo por meio do qual células revestidas com anticorpos são internalizadas, no todo ou em parte, por células imunológicas fagocíticas (tais como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas) que se ligam a uma região Fc de imunoglobulina.

[047] A expressão “domínio de ligação” designa a região de um polipeptídeo que se liga a outra molécula. No caso de um FcR, o domínio de ligação pode compreender uma parte de uma de suas cadeias de polipeptídeo (tal como a sua cadeia α) que é responsável pela ligação de uma região Fc. Um domínio de ligação útil é o domínio extracelular de uma cadeia α de FcR.

[048] O termo “ligação” a um receptor Fc utilizado no presente indica a ligação do anticorpo a um receptor Fc em um teste BIAcore®, por exemplo (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia).

[049] No teste BIAcore®, o receptor Fc é ligado a uma superfície e a ligação da variante, tal como da variante de anticorpo à qual a foram introduzidas mutações, é medida por meio de Ressonância de Plasma da Superfície (SPR). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de velocidade para associação do anticorpo a partir do complexo de anticorpo e receptor Fc), kd (constante de dissociação) e KD (kd/ka). Alternativamente, o sinal de ligação de um sensograma de SPR pode ser comparado diretamente com o sinal de resposta de uma referência, com respeito à altura do sinal de ressonância e aos comportamentos de dissociação.

[050] “C1q” é um polipeptídeo que inclui um local de ligação para a região Fc de uma imunoglobulina. C1q, juntamente com duas serino proteases, C1r e C1s, formam o complexo C1, o primeiro componente do processo de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). C1q humano pode ser adquirido comercialmente, por exemplo, por meio da Quidel, San Diego, CA.

[051] O “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio “CY2”) normalmente se estende de cerca do aminoácido 231 até cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é exclusivo pelo fato de que não é emparelhado de perto com outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Especulou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o emparelhamento entre domínios e ajudar a estabilizar o domínio CH2 (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206).

[052] O “domínio CH3” compreende o estiramento de resíduos C- terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, de cerca do resíduo de aminoácido 341 até cerca do resíduo de aminoácido 447 de um IgG).

[053] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitações, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem carcinoma de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer da cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorretal, carcinoma endométrico ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer dos rins, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e do pescoço.

[054] Da forma utilizada no presente, as expressões “célula”, “linhagem celular” e “cultivo celular” são utilizadas de forma intercambiável e todas essas designações incluem a descendência. Desta forma, as palavras “transformadores” e “células transformadas” incluem a célula objeto primário e os cultivos dela derivados, sem considerar a quantidade de transferências. Também se compreende que nem todos os descendentes podem ser precisamente idênticos em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Inclui-se prole mutante que possui a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado na célula transformada originalmente. Ficará claro a partir do contexto quando se desejarem designações distintas.

[055] A expressão anticorpo “quimérico” designa um anticorpo no qual uma parte da cadeia leve e/ou pesada é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia leve e/ou pesada é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[056] A “classe” de um anticorpo designa o tipo de domínio constante ou região constante da sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, ye μ, respectivamente.

[057] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita uma função celular e/ou causa destruição ou morte das células. Os agentes citotóxicos incluem, mas sem limitações, isótopos radioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu), drogas ou agentes quimioterapêuticos (tais como metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, incluindo seus fragmentos e/ou variantes; e os diversos agentes antitumores ou anticancerígenos descritos abaixo.

[058] A expressão “citotoxicidade dependente de complemento” ou CDC designa um mecanismo de indução da morte celular no qual um ou mais domínios efetores de Fc de um anticorpo ligado a alvo ativam uma série de reações enzimáticas que culminam na formação de orifícios na membrana da célula alvo. Tipicamente, complexos de antígeno e anticorpo tais como aqueles sobre células alvo revestidas por anticorpos ligam e ativam o componente de complemento C1q que, por sua vez, ativa a cascata de complemento que gera a morte das células alvo. A ativação de complemento pode também resultar na deposição de componentes de complementos sobre a superfície das células alvo que facilitam ADCC por meio da ligação de receptores de complementos (tais como CR3) sobre leucócitos.

[059] “Distúrbio” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com polipeptídeos, como anticorpos que compreendem uma variante de Fc. Isso inclui doenças ou distúrbios agudos e crônicos que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Em uma realização, o distúrbio é câncer.

[060] As “funções efetoras” designam as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e ligação de C1q; ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose (ADCP); regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptores de células B); e ativação de células B.

[061] “Função efetora reduzida”, da forma utilizada no presente, designa a redução de uma função efetora específica, tal como ADCC ou CDC, em comparação com controle (tal como um polipeptídeo com região Fc do tipo selvagem), em pelo menos 20% e “função efetora fortemente reduzida”, da forma utilizada no presente, designa redução de uma função efetora específica, tal como ADCC ou CDC, em comparação com controle, em pelo menos 50%.

[062] “Quantidade eficaz” de um agente, tal como formulação farmacêutica, designa uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[063] A expressão “região Fc” no presente é utilizada para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina que contém pelo menos uma parte da região constante. A expressão inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana estende-se de Cys226 ou de Pro230 até o terminal carboxila da cadeia pesada. A lisina C terminal (Lys447) da região Fc pode, entretanto, ou não estar presente. A menos que especificado em contrário no presente, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991).

[064] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência “nativa” ou “do tipo selvagem” em virtude de pelo menos uma “modificação de aminoácido”, conforme definido no presente. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante do presente possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, de maior preferência, pelo menos cerca de 90% de homologia com ele, de maior preferência pelo menos cerca de 95% de homologia.

[065] A expressão “variante de Fc”, da forma utilizada no presente, designa um polipeptídeo que compreende uma modificação em um domínio Fc. As variantes de Fc de acordo com a presente invenção são definidas de acordo com as modificações de aminoácidos que as compõem. Desta forma, por exemplo, P329G é uma variante de Fc com a substituição da linhagem pró por glicina na posição 329 com relação ao polipeptídeo Fc parental, em que a numeração está de acordo com o índice EU. A identidade do aminoácido do tipo selvagem pode ser não especificada e, neste caso, a variante mencionada acima é denominada P329G. Para todas as posiçoões discutidas na presente invenção, a numeração está de acordo com o índice EU. O índice EU, índice EU como em Kabat ou esquema de numeração EU designa a numeração do anticorpo EU (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 63 (1969) 78-85, integralmente incorporado ao presente como referência). A modificação pode ser uma adição, exclusão ou substituição. As substituições podem incluir aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos sem ocorrência natural. As variantes podem compreender aminoácidos não naturais. Exemplos incluem a Patente Norte- Americana n° 6.586.207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004/0214988 A1; WO 05/35727 A2; WO 05/74524 A2; Chin, J. W. et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin, J. W. e Schultz, P. G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J. W. et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; e Wang, L. e Schultz, P. G., Chem. (2002) 110, todos integralmente incorporados como referência.

[066] A expressão “polipeptídeo que contém uma região Fc” designa um polipeptídeo, tal como um anticorpo ou imunoadesina (vide definições abaixo), que compreende uma região Fc.

[067] As expressões “receptor de Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, FcR preferido é aquele que liga um anticorpo IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FCYRI, FCYRII e FCYRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (“receptor de ativação”) e FcyRIIB (“receptor de inibição”), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FCYRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FCYRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise em Daêron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-41. Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; e Kim et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

[068] Por “ligante Fc de IgG”, da forma utilizada no presente, designa-se uma molécula, preferencialmente um polipeptídeo, de qualquer organismo que se liga à região Fc de um anticorpo IgG para formar um complexo ligante de Fc/Fc. Os ligantes Fc incluem, mas sem limitações, FCYRS, FCYRS, FCYRS, FcRN, C1q, C3, lectina de ligação manana, receptor de manose, proteína A de estafilococos, proteína G de estreptococos e FcyR viral. Os ligantes Fc também incluem homólogos de receptores Fc (FcRH), que são uma família de receptores Fc que são homólogos aos FcyRs (Davis et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, integralmente incorporado como referência). Os ligantes Fc podem incluir moléculas não descobertas que ligam Fc. Ligantes Fc de IgG específicos são receptores FcRn e Fc gama. Por “ligante Fc”, da forma utilizada no presente, designa-se uma molécula, preferencialmente um polipeptídeo, de qualquer organismo que se liga à região Fc de um anticorpo para formar um complexo ligante de Fc/Fc.

[069] Por “receptor Fc gama”, “FcyR” ou “Fc gama R”, da forma utilizada no presente, designa-se qualquer membro da família de proteínas que liga a região Fc de anticorpo IgG e é codificado por um gene FCYR. Em seres humanos, esta família inclui, mas sem limitações, FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FCYRIA, FCYRIB e FCYRIC; FCYRII (CD32), incluindo as isoformas FCYRIIA (incluindo os alotipos H131 e R131), FCYRIIB (incluindo FCYRIIB-1 e FcyRIIB-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16), incluindo as isoformas FcyRIIIA (incluindo os alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo os alotipos FcyRIIB- NA1 e FcyRIIB-NA2) (Jefferis et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65, integralmente incorporados como referência), bem como quaisquer isoformas ou alotipos FcyRs ou FcyR humanos não descobertos. FcyR pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas sem limitações, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. FcyRs de camundongos incluem, mas sem limitações, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIII-2 (CD16-2), bem como quaisquer isoformas ou alotipos FcyRs ou FcyR de camundongo não descobertos.

[070] Por “FcRn” ou “receptor Fc neonatal”, da forma utilizada no presente, designa-se uma proteína que liga a região Fc do anticorpo IgG e é codificada, ao menos em parte, por um gene FcRn. O FcRn pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas sem limitações, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Como se sabe na técnica, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, frequentemente denominados cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é beta-2-microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. A menos que indicado em contrário no presente, FcRn ou proteína FcRn designa o complexo de cadeia pesada de FcRn com beta-2-microglobulina.

[071] Por “polipeptídeo parental ou do tipo selvagem”, da forma utilizada no presente, indica-se um polipeptídeo não modificado que é modificado em seguida para gerar uma variante. O polipeptídeo do tipo selvagem pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou uma variante ou versão elaborada de um polipeptídeo de ocorrência natural. Polipeptídeo do tipo selvagem pode designar o próprio polipeptídeo, composições que compreendem o polipeptídeo parental ou a sequência de aminoácidos que o codifica. Consequentemente, por “imunoglobulina do tipo selvagem” da forma utilizada no presente, indica-se um polipeptídeo de imunoglobulina não modificado que é modificado para gerar uma variante e por “anticorpo do tipo selvagem”, da forma utilizada no presente, indica-se um anticorpo não modificado que é modificado para gerar um anticorpo variante. Dever-se-á observar que “anticorpo do tipo selvagem” indica anticorpos comerciais produzidos de forma recombinante conforme indicado abaixo.

[072] A expressão “polipeptídeo cristalizável por fragmento (Fc)” é a parte de uma molécula de anticorpo que interage com células e moléculas efetoras. Ela compreende as partes C-terminais das cadeias pesadas de imunoglobulina.

[073] O termo “estrutura” ou “FR” designa resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste de quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de FR e HVR geralmente aparecem na sequência a seguir em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)- FR4.

[074] As expressões “anticorpo com comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são utilizadas no presente de forma intercambiável para designar um anticorpo que possui uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que possui cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente.

[075] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de “funções efetoras” incluem ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (tal como um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando vários testes conforme descrito no presente, por exemplo.

[076] “Região de articulação” é geralmente definida como estendendo-se de Glu216 a Pro230 de IgG1 humano (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 por meio da colocação dos primeiro e último resíduos de cisteína, formando ligações S-S intercadeias pesadas nas mesmas posições.

[077] A “região de articulação inferior” de uma região Fc é normalmente definida como o estiramento de resíduos imediatamente C- terminais até a região de articulação, ou seja, os resíduos 233 a 239 da região Fc.

[078] “Homologia” é definida como o percentual de resíduos na variante de sequência de aminoácidos que são idênticos após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir o percentual máximo de homologia. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um desses programas de computador é “Align 2”, de autoria da Genentech, Inc., que foi depositado com a documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos Estados Unidos, Washington DC 20559, Estados Unidos, em dez de dezembro de 1991.

[079] As expressões “célula hospedeira”, “linhagem de células hospedeiras” e “cultivo de células hospedeiras” são utilizadas de forma intercambiável e designam células nas quais o ácido nucleico exógeno tenha sido introduzido, incluindo a prole dessas células. As células hospedeiras incluem “transformadores” e “células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a prole delas derivada sem considerar o número de passagens. A prole pode não ter teor de ácido nucleico completamente idêntico a uma célula parental, mas pode conter mutações. Inclui-se no presente, prole mutante que possui a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado na célula transformada originalmente.

[080] “Anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano, célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências de codificação de anticorpos humanos. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

[081] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FCYRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal como sangue ou PMBCs, conforme descrito no presente.

[082] Anticorpo “humanizado” designa um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (tais como CDRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem às de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma parte de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. “Forma humanizada” de um anticorpo, tal como um anticorpo não humano, designa um anticorpo que tenha sofrido humanização.

[083] A expressão “região hipervariável” ou “HVR”, da forma utilizada no presente, indica cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável e/ou formam circuitos definidos estruturalmente (“circuitos hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos com quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs compreendem geralmente resíduos de aminoácidos dos circuitos hipervariáveis e/ou das “regiões de determinação de complementaridade” (CDRs), em que estas últimas possuem variabilidade de sequências mais alta e/ou estão envolvidas no reconhecimento de antígenos. Exemplos de circuitos hipervariáveis ocorrem nos resíduos de aminoácidos 2632 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Exemplos de CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 e 95-102 de H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Com exceção de CDR1 em VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam os circuitos hipervariáveis. CDRs também compreendem “resíduos de determinação da especificidade” ou “SDRs”, que são resíduos que entram em contato com antígeno. SDRs estão contidas em regiões das CDRs denominadas CDRs abreviadas ou a-CDRs. Exemplos de a-CDRs (a- CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3 (vide Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que indicado em contrário, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (tais como resíduos de FR) são numerados no presente de acordo com Kabat et al., acima.

[084] “Complexo imunológico” designa a estrutura relativamente estável que se forma quando pelo menos uma molécula alvo e pelo menos um polipeptídeo que contém região Fc heteróloga ligam-se entre si, formando um complexo com peso molecular maior. Exemplos de complexos imunológicos são agregados de antígenos e anticorpos e agregados de imunoadesina de moléculas alvo. A expressão “complexo imunológico”, da forma utilizada no presente, a menos que indicado em contrário, designa um complexo ex vivo (ou seja, diferente da forma ou ambiente no qual pode ser encontrado na natureza). O complexo imunológico pode, entretanto, ser administrado a mamíferos, por exemplo, para avaliar a liberação do complexo imunológico no mamífero.

[085] “Imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, mas sem limitações, um agente citotóxico.

[086] “Indivíduo” ou “paciente” é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas sem limitações, animais domesticados (tais como vacas, carneiros, gatos, cães e cavalos), primatas (tais como seres humanos e primatas não humanos como macacos), coelhos e roedores (tais como ratos e camundongos). Em certas realizações, o indivíduo ou paciente é um ser humano.

[087] Polipeptídeo “isolado” é aquele que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado até pureza de mais de 95% ou 99%, conforme determinado, por exemplo, por meio de eletroforese (tal como SDS-PAGE, concentração isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (tal como HPLC de fase reversa ou troca de íons). Para análise dos métodos de determinação da pureza de anticorpos, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 7987.

[088] Polipeptídeo “isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até mais de 95% em peso de polipeptídeo, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando um sequenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Um polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.

[089] Ácido nucleico “isolado” designa uma molécula de ácido nucleico que tenha sido separada de um componente do seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em um local cromossômico que é diferente do seu local cromossômico natural.

[090] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo” designa uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos que codificam cadeias leve e pesada de anticorpos (ou seus fragmentos), incluindo a(s) molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados e a(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[091] A palavra “marca”, da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente ao polipeptídeo. A marca pode ser detectável por si própria (tais como marcas de radioisótopos ou marcas fluorescentes) ou, no caso de marca enzimática, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável.

[092] A expressão “domínio de ligação de ligante”, da forma utilizada no presente, designa qualquer receptor de superfície celular nativo ou qualquer região ou seu derivado que retenha pelo menos a capacidade de ligação de ligante qualitativo de um receptor nativo correspondente. Em realização específica, o receptor é de um polipeptídeo da superfície celular que contém domínio extracelular que é homólogo a um membro da superfamília genética da imunoglobulina. Outros receptores que não são membros da superfamília genética da imunoglobulina, mas que, mesmo assim, são especificamente cobertos pela presente definição, são receptores para citoquinas, particularmente receptores com atividade de tirosino quinase (tirosino quinases receptoras), membros das superfamílias de receptores de fator de crescimento dos nervos e hematopoietina e moléculas de adesão celular, tais como selectinas (E, L e P).

[093] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, em que essas variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpos monoclonais é dirigido a um único determinante sobre um antígeno. Desta forma, o adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de nenhum método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser elaborados, por exemplo, por meio de uma série de métodos, incluindo, mas sem limitações, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, em que esses métodos e outros exemplos de métodos de elaboração de anticorpos monoclonais são descritos no presente.

[094] “Anticorpo bruto” designa um anticorpo que não é conjugado a uma porção heteróloga (tal como uma porção citotóxica) ou rádio marca. O anticorpo bruto pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[095] “Anticorpos nativos” designam moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Anticorpos de IgG nativos, por exemplo, são glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. Do terminal N ao C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De forma similar, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos, denominados capa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante e variável.

[096] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humano de sequência nativa (alotipos A e não A); região Fc de IgG2 humano de sequência nativa; região Fc de IgG3 humano de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humano de sequência nativa, bem como suas variantes de ocorrência natural.

[097] Ácido nucleico é “ligado operativamente” quando é colocado em relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. DNA para uma sequência prévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador é ligado operativamente a uma sequência de codificação caso afete a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossomos é ligado operativamente a uma sequência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, “ligado operativamente” indica que as sequências de DNA que são ligadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Os aprimoradores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é realizada por meio de ligação em locais de restrição convenientes. Caso esses locais não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

[098] O termo “bula” é utilizado para designar instruções costumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.

[099] Por “posição”, da forma utilizada no presente, indica-se um local na sequência da proteína. As posições podem ser numeradas em sequência ou de acordo com um formato estabelecido, tal como o índice EU para numeração de anticorpos.

[100] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável para designar um polímero de resíduos de aminoácidos, que compreende resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais, e não são limitados a um comprimento mínimo.

[101] Desta forma, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, multímeros e similares são incluídos na definição. As proteínas com comprimento total e seus fragmentos são englobados pela definição. Os termos também incluem modificações pós-tradução do polipeptídeo, incluindo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação e fosforilação.

[102] Além disso, “polipeptídeo” no presente também indica uma proteína modificada tal como uma ou mais exclusões, adições e substituições de resíduos de aminoácidos para a sequência nativa, desde que a proteína mantenha atividade desejada. Um resíduo de serina pode ser substituído, por exemplo, para eliminar uma cisteína reativa isolada ou para remover a ligação de dissulfeto ou uma substituição de aminoácidos conservadora pode ser realizada para eliminar um local de divisão. Essas modificações podem ser deliberadas, tal como por meio de mutagênese dirigida a local, ou podem ser acidentais, tal como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR).

[103] As expressões “polipeptídeo do tipo selvagem” e “região Fc do tipo selvagem (humana)”, da forma utilizada no presente, designam um polipeptídeo e região Fc, respectivamente, que compreende uma sequência de aminoácidos que não possui uma ou mais das modificações de região Fc descritas no presente, pois elas não foram introduzidas, e servem, por exemplo, de controle. O polipeptídeo do tipo selvagem pode compreender uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc com modificações de sequência de aminoácidos previamente existentes (tais como adições, exclusões e/ou substituições).

[104] A expressão “formulação farmacêutica” designa uma preparação que se encontra em uma forma que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo nela contido seja efetiva e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um paciente a quem a formulação seria administrada.

[105] “Veículo farmaceuticamente aceitável” designa um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente do ingrediente ativo, que é atóxico para o paciente. Veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas sem limitações, tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[106] Um polipeptídeo com afinidade de ligação de FcR “alterada” ou atividade de ADCC é aquele que possui atividade de ligação de FcR e/ou atividade de ADCC aumentada ou reduzida em comparação com um polipeptídeo parental ou um polipeptídeo que compreende uma região Fc de sequência nativa. A variante de polipeptídeo que “exibe maior ligação” para um FcR liga pelo menos um FcR com melhor afinidade que o polipeptídeo parental. A variante de polipeptídeo que “exibe menor ligação” para um FcR liga pelo menos um FcR com pior afinidade que o polipeptídeo parental. Essas variantes que exibem menor ligação a FcR podem possuir pouca ou nenhuma ligação a FcR, tal como 0 a 20% de ligação a FcR em comparação com uma região Fc de IgG de sequência nativa, conforme determinado, por exemplo, nos Exemplos do presente.

[107] O polipeptídeo que liga FcR com “afinidade reduzida” com relação a um polipeptídeo parental é aquele que liga qualquer um ou mais dos FcRs identificados acima com afinidade de ligação substancialmente reduzida com relação ao anticorpo parental, quando as quantidades de variantes de polipeptídeos e polipeptídeo parental no teste de ligação forem essencialmente as mesmas. A variante de polipeptídeo com afinidade de ligação de FcR reduzida, por exemplo, pode exibir cerca de 1,15 vezes a cerca de cem vezes, tal como de cerca de 1,2 vezes a cerca de cinquenta vezes, a redução na afinidade de ligação de FcR em comparação com o polipeptídeo parental, na qual é determinada a afinidade de ligação de FcR, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos do presente.

[108] O polipeptídeo que compreende uma variante Fc que “media a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) na presença de células efetoras humanas menos efetivamente” que um polipeptídeo parental ou do tipo selvagem é aquele que in vitro ou in vivo é substancialmente menos eficaz na mediação de ADCC, quando as quantidades de variante de polipeptídeo e anticorpo parental utilizadas no teste forem essencialmente as mesmas. Geralmente, essas variantes serão identificadas utilizando o teste de ADCC in vitro, conforme descrito no presente, mas são contemplados outros testes ou métodos de determinação da atividade de ADCC, por exemplo em um modelo animal etc. A variante preferida é de cerca de 1,5 vezes a cerca de cem vezes, por exemplo cerca de duas vezes a cerca de cinquenta vezes menos eficaz na mediação de ADCC que a progenitora, por exemplo, no teste in vitro descrito no presente.

[109] “Receptor” é um polipeptídeo capaz de ligar pelo menos um ligante. O receptor preferido é um receptor da superfície celular que possui um domínio de ligação de ligante extracelular e, opcionalmente, outros domínios (tais como domínio transmembrana, domínio intracelular e/ou âncora de membrana). O receptor a ser avaliado no teste descrito no presente pode ser um receptor intacto ou um de seus fragmentos ou derivados (tal como uma proteína de fusão que compreende o domínio de ligação do receptor fundido a um ou mais polipeptídeos heterólogos). Além disso, o receptor a ser avaliado para determinar suas propriedades de ligação pode estar presente em uma célula ou ser isolado e opcionalmente revestido sobre uma placa de teste ou alguma outra fase sólida.

[110] A expressão “domínio de ligação de receptor” é utilizada para designar qualquer ligante nativo para um receptor, incluindo moléculas de adesão celular, ou qualquer região ou derivado desse ligante nativo que retenha pelo menos a capacidade de ligação de receptor qualitativo de um ligante nativo correspondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente sequências de ligação de ligantes para os receptores mencionados acima.

[111] Da forma utilizada no presente, “tratamento” (e suas variações gramaticais tais como “tratar” ou “tratando”) indica intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas sem limitações, a prevenção da ocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a velocidade do progresso de uma doença.

[112] Por “proteína variante” ou “variante de proteína”, ou “variante”, da forma utilizada no presente, designa-se uma proteína que difere de uma proteína parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Variante de proteína pode designar a própria proteína, uma composição que compreende a proteína ou a sequência amino que a codifica. Preferencialmente, a variante de proteína contém pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a proteína parental, tal como cerca de uma a cerca de setenta modificações de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco modificações de aminoácidos em comparação com o pai. A sequência de variante de proteína de acordo com o presente possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma sequência de proteína parental; de maior preferência, pelo menos cerca de 90% de homologia e, de maior preferência pelo menos cerca de 95% de homologia. Variante de proteína pode designar a própria proteína variante, composições que compreendem a variante de proteína ou a sequência de DNA que a codifica. Consequentemente, por “variante de anticorpo” ou “anticorpo variante”, da forma utilizada no presente, designa-se um anticorpo que difere de um anticorpo parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, “variante de IgG” ou “IgG variante”, da forma utilizada no presente, indica um anticorpo que difere de um IgG parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido e “variante de imunoglobulina” ou “imunoglobulina variante”, da forma utilizada no presente, indica uma sequência de imunoglobulina que difere de uma sequência de imunoglobulina parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido.

[113] A expressão “região variável” ou “domínio variável” designa o domínio de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo que está envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente possuem estruturas similares, em que cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FRs) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVRs) (vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, sexta edição, W. H. Freeman & Co. (2007), pág. 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígenos. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clarkson et al., Nature 352 (1991) 624-628.

[114] O termo “vetor”, da forma utilizada no presente, designa uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual é ligado. O termo inclui o vetor como estrutura de ácido nucleico autorreprodutora, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual tenha sido introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos aos quais são ligados operativamente. Esses vetores são denominados no presente “vetores de expressão”.

[115] O presente pedido refere-se a polipeptídeos que incluem modificações de aminoácidos que modulam a ligação a receptores Fc, particularmente a receptores FCY.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[116] A presente invenção refere-se no presente a um método de elaboração de polipeptídeos que compreendem variantes Fc. Polipeptídeo “parental”, “de partida”, “não variante” ou do tipo selvagem é preparado utilizando métodos disponíveis na técnica para gerar polipeptídeos ou anticorpos que compreendem uma região Fc. Na realização preferida da presente invenção, o polipeptídeo parental é um anticorpo e exemplos de métodos de geração de anticorpos são descritos com mais detalhes nas seções a seguir. O polipeptídeo parental pode, entretanto, ser qualquer outro polipeptídeo que compreende uma região Fc, tal como uma imunoadesina. Os métodos de elaboração de imunoadesinas são elaborados com mais detalhes abaixo.

[117] Em uma realização alternativa, uma região Fc variante (variante Fc) pode ser gerada de acordo com os métodos descritos no presente e essa variante Fc pode ser fundida a um polipeptídeo heterólogo selecionado, tal como um domínio variável de anticorpo ou domínio de ligação de um receptor ou ligante.

[118] O polipeptídeo do tipo selvagem compreende uma região Fc. Geralmente, a região Fc do polipeptídeo do tipo selvagem compreenderá uma região Fc de sequência nativa ou do tipo selvagem e, preferencialmente, uma região Fc de sequência nativa humana (região Fc humana). A região Fc do polipeptídeo do tipo selvagem pode, entretanto, ter uma ou mais modificações ou alterações de sequências de aminoácidos previamente existentes de uma região Fc de sequência nativa. A atividade de ligação C1q ou FCY da região Fc, por exemplo, pode haver sido alterada anteriormente (outros tipos de modificações da região Fc são descritos com mais detalhes abaixo). Em uma realização adicional, a região Fc de polipeptídeo parental é “conceitual” e, embora não exista fisicamente, o engenheiro de anticorpos pode decidir por uma sequência de aminoácidos de região Fc variante desejada e gerar um polipeptídeo que compreende aquela sequência ou um DNA que codifica a sequência de aminoácidos da região Fc variante desejada.

[119] Na realização preferida da presente invenção, entretanto, é disponível um ácido nucleico que codifica uma região Fc de um polipeptídeo do tipo selvagem e essa sequência de ácidos nucleicos é alterada para gerar uma sequência de ácidos nucleicos variante que codifica a variante de região Fc.

[120] DNA que codifica uma variante da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida é preparado por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas sem limitações, preparação por meio de mutagênese dirigida a local (ou mediada por oligonucleotídeos), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de um DNA preparado anteriormente que codifica o polipeptídeo.

[121] Mutagênese dirigida a local é um método preferido de preparação de variantes de substituição. Este método é bem conhecido na técnica (vide, por exemplo, Carter et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 4431-4443 e Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 (1985) 488). Resumidamente, ao conduzir-se mutagênese de DNA dirigida a local, o DNA de partida é alterado por meio da hibridização, em primeiro lugar, de um oligonucleotídeo que codifica a mutação desejada em uma fita simples desse DNA de partida. Após a hibridização, é utilizada uma polimerase de DNA para sintetizar uma segunda fita completa, empregando o oligonucleotídeo hibridizado como primer e utilizando a fita simples do DNA de partida como modelo. Desta forma, o oligonucleotídeo que codifica a mutação desejada é incorporado ao DNA de fita dupla resultante.

[122] Mutagênese de PCR também é apropriada para elaborar variantes de sequências de aminoácidos do polipeptídeo de partida. Vide Higuchi, PCR Protocols, Academic Press (1990), págs. 177-183; e Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17 (1989) 723-733. Resumidamente, ao utilizar-se pequenas quantidades de DNA modelo como material de partida em PCR, primers que diferem levemente de sequência da região correspondente em um DNA modelo podem ser utilizados para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmento de DNA específico que difere da sequência de modelo apenas nas posições em que os primers diferem do modelo.

[123] Outro método de preparação de variantes, mutagênese de conjunto, é baseada no método descrito por Wells et al., Gene 34 (1985) 315323.

[124] Uma realização da presente invenção engloba polipeptídeos que compreendem uma região Fc de um anticorpo, que compreende a adição, substituição ou exclusão de pelo menos um resíduo de aminoácido na região Fc, o que resulta em redução ou remoção da afinidade para pelo menos um receptor Fc. A região Fc interage com uma série de receptores ou ligantes, incluindo, mas sem limitações, receptores Fc (tais como FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIIA), a proteína de complemento CIq e outras moléculas tais como proteínas A e G. Essas interações são essenciais para uma série de funções efetoras e eventos de sinalização abaixo no fluxo, que incluem, mas sem limitações, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Consequentemente, em certas realizações, as variantes de acordo com a presente invenção possuem redução ou remoção da afinidade para um receptor Fc responsável por uma função efetora em comparação com um polipeptídeo que possui a mesma sequência de aminoácidos do polipeptídeo que compreende uma variante Fc de acordo com a presente invenção, mas sem compreender a adição, substituição ou exclusão de pelo menos um resíduo de aminoácidos para a região Fc (também denominada no presente “polipeptídeo do tipo selvagem”). Em certas realizações, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos uma ou mais das propriedades a seguir: redução ou remoção da função efetora (ADCC e/ou CDC e/ou ADCP), redução ou remoção da ligação a receptores Fc, redução ou remoção da ligação a C1q ou redução ou remoção da toxicidade. Mais especificamente, realizações da presente invenção fornecem anticorpos anti-CD20 (idênticos a GA101 ou GA), anti-CD9 (idênticos a TA) e anti-Selectina (pSel) com afinidade reduzida para receptores Fc (tais como FCYRI, FCYRII, FCYRIIIA) e/ou a proteína complementar C1q.

[125] Em uma realização, os anticorpos de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc que compreende pelo menos uma adição, substituição ou exclusão de um resíduo de aminoácido na posição P329, em que o sistema de numeração da região constante é o do índice EU conforme definido em Kabat et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, Serviço Nacional de Informações Técnicas, Springfield VA.

[126] Em uma realização específica, os polipeptídeos de acordo com a presente invenção compreendem uma variante Fc de um polipeptídeo Fc humano do tipo selvagem, em que a mencionada variante compreende uma substituição de aminoácidos na posição Pro329, em que a numeração dos resíduos na região Fc de IgG é a do índice EU como em Kabat. Em ainda outra realização, a mencionada variante compreende pelo menos uma substituição de aminoácido adicional.

[127] Em ainda outra realização, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc de um polipeptídeo Fc humano do tipo selvagem possui uma substituição, exclusão ou adição de aminoácido que destrói ou reduz a função do sanduíche de prolina na região e/ou serve de interface entre o polipeptídeo Fc e o receptor Fc gama.

[128] Em outra realização, Pro329 é substituída com um aminoácido que é maior ou menor que prolina. Em ainda outra realização, o aminoácido substituído é Gly, Ala ou Arg. Em um aspecto adicional da presente invenção, Pro329 do polipeptídeo Fc é substituída com glicina.

[129] Em ainda outra realização, o mencionado polipeptídeo compreende uma variante Fc que possui pelo menos uma substituição, adição ou exclusão de aminoácido adicional. Em ainda outra realização, as mencionadas variantes exibem afinidade reduzida para receptor Fc humano (FCYR) e/ou um receptor de complemento humano em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[130] Em ainda outra realização, o mencionado polipeptídeo que compreende uma variante Fc exibe afinidade reduzida para receptor Fc humano (FCYR) e/ou um receptor de complemento humano em comparação com o polipeptídeo que compreende a região Fc humana do tipo selvagem. Em uma realização adicional, a afinidade para pelo menos um dentre FcyRI, FcyRII e FcyRIIIA é reduzida, em ainda outra realização a afinidade para FcyRI e FcyRIIIA é reduzida e, em ainda outra realização, a afinidade para FcyRI, FcyRII e FcyRIIIA é reduzida, em ainda outro aspecto da presente invenção a afinidade para o receptor FCYRI, receptor FCYRIIIA e C1q é reduzida e, em ainda outro aspecto da presente invenção, a afinidade para receptor FCYRI, FCYRII, FCYRIIIA e C1q é reduzida.

[131] Em ainda outra realização, o ADCC induzida pelo mencionado polipeptídeo que compreende uma variante Fc é reduzido e, em uma realização preferida, o ADCC é reduzido para pelo menos 20% do ADCC induzida pelo polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em ainda outro aspecto da presente invenção, ADCC e CDC induzidos pelo polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem são reduzidos ou removidos e, em ainda outro aspecto, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc descrita acima exibe ADCC, CDC e ADCP reduzidos em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[132] Em uma realização, a pelo menos uma substituição de aminoácidos adicional no polipeptídeo que compreende a variante Fc é selecionada a partir do grupo: S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S.

[133] Em um certo aspecto da presente invenção, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc compreende um anticorpo. Em ainda outro aspecto da presente invenção, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc compreende uma região Fc de IgG1 ou IgG4 humano. Em ainda outro aspecto da presente invenção, as variantes são anticorpos IgG1 ou IgG4.

[134] Em outra realização da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc Pro329. As variantes compreendem ainda pelo menos uma adição, substituição ou exclusão de um resíduo de aminoácidos na região Fc que é correlacionada com estabilidade mais alta do anticorpo. Em ainda outro aspecto da presente invenção, a afinidade do polipeptídeo que compreende uma variante Fc descrita acima para o receptor Fcn é apenas levemente e, por exemplo, não mais de 10 a 20% da afinidade de polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem alterado.

[135] Em uma realização, a adição, substituição ou exclusão de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo que compreende uma variante Fc encontra-se na posição 228 e/ou 235 da região Fc, em que o sistema de numeração da região constante é o do índice EU conforme definido em Kabat et al.

[136] Em uma realização específica, serina na posição 228 e/ou leucina na posição 235 no mencionado polipeptídeo que compreende uma variante Fc é substituída por outro aminoácido.

[137] Em uma realização específica, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 228, em que o resíduo de serina é substituído com prolina.

[138] Em uma realização específica, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 235, em que o resíduo de leucina é substituído com ácido glutâmico.

[139] Em uma realização específica, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc compreende uma mutação tripla: uma substituição de aminoácidos na posição P329, S228P e uma mutação L235E (P329/SPLE).

[140] Em uma realização específica adicional, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc compreende uma região IgG4 humana.

[141] Em uma realização, a adição, substituição ou exclusão de resíduos de aminoácidos encontra-se na posição 234 e/ou 235 da região Fc, em que o sistema de numeração da região constante é o do índice EU conforme definido em Kabat et al.

[142] Em uma realização específica, leucina na posição 234 e/ou leucina na posição 235 no polipeptídeo que compreende uma variante Fc é substituída por outro aminoácido.

[143] Em uma realização específica, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 234, em que o resíduo de leucina é substituído com alanina.

[144] Em uma realização específica, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc que compreende uma substituição de aminoácidos na posição 235, em que o resíduo de leucina é substituído com serina.

[145] Em uma realização específica, o polipeptídeo que compreende uma variante Fc de um polipeptídeo Fc humano compreende uma mutação tripla: uma substituição de aminoácidos na posição Pro329, L234A e uma mutação L235A (P329/LALA).

[146] Em uma realização específica adicional, os polipeptídeos mencionados acima compreendem uma região IgG1 humana.

[147] Embora se prefira alterar a ligação a uma FCYR, variantes de região Fc com afinidade de ligação alterada para o receptor neonatal (FcRn) também são contempladas no presente. Antecipa-se que variantes de região Fc com afinidade aprimorada para FcRn possuem meias vidas em soro mais longas e essas moléculas possuirão aplicações úteis em métodos de tratamento de mamíferos, em que se deseja meia vida longa do polipeptídeo administrado, por exemplo, para tratar uma doença ou distúrbio crônico. Espera-se que variantes de região Fc com afinidade reduzida de ligação de FcRn, pelo contrário, possuam meias vidas mais curtas e essas moléculas podem ser administradas, por exemplo, a mamíferos em que o tempo de circulação reduzido pode ser vantajoso, por exemplo, para formação de imagens de diagnóstico in vivo ou para polipeptídeos que possuem efeitos colaterais tóxicos quando mantidos em circulação no fluxo sanguíneo por períodos mais extensos etc. Antecipa-se que variantes de região Fc com afinidade de ligação de FcRn reduzida são menos propensas a cruzar a placenta e, desta forma, podem ser utilizadas no tratamento de doenças ou distúrbios em mulheres grávidas.

[148] Variantes de região Fc com afinidade de ligação alterada para FcRn incluem as que compreendem uma modificação de aminoácido de região Fc em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 ou 447. As que exibem redução da ligação para FcRn geralmente compreenderão uma modificação de aminoácido de região Fc em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 ou 447; e as com ligação aprimorada a FcRn normalmente compreenderão modificação de aminoácidos de região Fc em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434.

[149] Em outra realização, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer classe (tal como, mas sem limitações, IgG, IgM e IgE). Em certas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são membros da classe IgG de anticorpos. Em uma realização específica, anticorpos de acordo com a presente invenção são da subclasse IgG1, IgG2 ou IgG4. Em outra realização específica, os anticorpos de acordo com a presente invenção são da subclasse IgG1 e compreendem as substituições de aminoácidos a seguir: P329G e/ou L234A e L235A da região Fc. Em realizações alternativas, os anticorpos de acordo com a presente invenção são da subclasse IgG4. Em uma realização específica, os anticorpos de acordo com a presente invenção são da subclasse IgG4 e compreendem as substituições de aminoácidos a seguir: P329G e/ou S228P e L235E da região Fc. Em certas realizações, os anticorpos modificados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por meio da combinação de um domínio variável ou seu fragmento com um domínio Fc que compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos descritas no presente. Em outras realizações, anticorpos modificados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por meio da modificação de um anticorpo que contém domínio Fc pela introdução de um ou mais dos resíduos de substituições de aminoácidos no domínio Fc.

LIGAÇÃO REDUZIDA A LIGANTES FC

[150] Os técnicos no assunto compreenderão que os anticorpos de acordo com a presente invenção podem possuir propriedades de ligação de FCYR e/ou C1q alteradas (com relação a anticorpos não modificados) (exemplos de propriedades de ligação incluem, mas sem limitações, especificidade de ligação, constante de dissociação de equilíbrio (KD), taxas de dissociação e associação (koff e kon, respectivamente), avidez e/ou afinidade de ligação) e que certas alterações são mais ou menos desejáveis. Sabe-se na técnica que a constante de dissociação de equilíbrio (KD) é definida como koff/kon. Os técnicos no assunto podem determinar qual parâmetro cinético é o mais importante para uma dada aplicação de anticorpo. Uma modificação que reduz a ligação a um ou mais reguladores positivos (tal como FCYRIIIA) e/ou aumenta a ligação a um receptor Fc inibidor (tal como FCYRIIB), por exemplo, seria apropriada para reduzir a atividade de ADCC. Consequentemente, a razão de afinidades de ligação (tais como constantes de dissociação de equilíbrio (KD)) pode indicar se a atividade de ADCC de um anticorpo de acordo com a presente invenção é maior ou menor. Além disso, uma modificação que reduz a ligação a C1q seria apropriada para reduzir ou eliminar a atividade de CDC. As afinidades e propriedades de ligação de um receptor Fc para o seu ligante podem ser determinadas por uma série de métodos de teste in vitro (testes com base bioquímica ou imunológica) conhecidos na técnica para determinar interações entre Fc e FCYR, ou seja, ligação específica de uma região Fc a um FCYR, incluindo, mas sem limitações, métodos de equilíbrio (tais como teste imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA) ou radioimunoteste (RIA)) ou cinéticos (tais como análise BIACORE®) e outros métodos tais como testes de ligação indireta, testes de inibição competitiva, transferência de energia por ressonância de fluroescência (FRET), eletroforese de gel e cromatografia (tal como filtragem de gel). Estes e outros métodos podem utilizar uma marca sobre um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou empregar uma série de métodos de detecção, incluindo, mas sem limitações, marcas cromogênicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas. Descrição detalhada das afinidades de ligação e cinéticas pode ser encontrada em Paul, W. E., Ed., Fundamental Immunology, quarta edição, Lippincott-Raven, Filadélfia (1999).

[151] Em um aspecto da presente invenção, um polipeptídeo que compreende uma variante Fc de uma região Fc humana do tipo selvagem, em que a mencionada variante compreende uma substituição de aminoácidos na posição Pro329 e pelo menos uma substituição de aminoácidos adicional, exibe afinidade reduzida a um receptor Fc humano (FcyR) e/ou um receptor de complemento humano em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para receptor Fc que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menores que um polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[152] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade de ligação para um ou mais receptores Fc, incluindo, mas sem limitações, FCYRI (CD64) que inclui isoformas FCYRIA, FCYRII e FCYRIII (CD 16, incluindo isoformas FcyRIIIA) em comparação com um anticorpo não modificado.

[153] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade de ligação para FcyRI (CD64), FcyRIIA e FcyRIIIA em comparação com um anticorpo não modificado.

[154] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade de ligação para FcyRIIA e FcyRIIIA em comparação com um anticorpo não modificado.

[155] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade de ligação para FcyRI (CD64) e FcyRIIIA em comparação com um anticorpo não modificado.

[156] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção que exibe afinidade de ligação reduzida para os receptores Fc também exibem afinidade reduzida para o receptor C1q.

[157] Em um certo aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção não compreendem aumento simultâneo da ligação ao receptor FcyRIIB em comparação com um polipeptídeo do tipo selvagem. Em certos aspectos da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc possuem afinidade reduzida para o receptor FcyIIIA humano e para pelo menos um receptor adicional do grupo que compreende os receptores FcyIIA, FcyIIIB e C1q humanos em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em aspectos adicionais da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc possuem afinidade reduzida para o receptor FCYIIIA humano e para dois receptores adicionais do grupo que compreende os receptores FCYIIA, FCYIIIB e C1q humanos em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em um aspecto adicional da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc possuem afinidade reduzida para FCYRIA, FCYIIIA, FCYIIA, FCYIIIB e C1q humanos em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em ainda outro aspecto da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc possuem afinidade reduzida para os receptores FcyRIA, FcyIIIA, FcyIIA, FcyIIIB e C1q humanos em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[158] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução das afinidades para FcyRI ou FcyRIIA com relação a anticorpo não modificado. Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc exibem afinidades para FcyRI ou FcyRIIA que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menos que um polipeptídeo do tipo selvagem. Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc exibem afinidades para FcyRI ou FcyRIIA que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[159] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade para FCYRIIIA com relação a anticorpo não modificado. Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para FcyRIIIA que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[160] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para FcyRIIIA que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[161] Compreende-se na técnica que a variante alélica F1-58V de FcyRIIIA possui características de ligação alteradas para anticorpos. Em uma realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção ligam-se com afinidades reduzidas a receptores FcyRIIIA com relação a um polipeptídeo do tipo selvagem. Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para FcyRIIIA (Fl 58 V) que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menos que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[162] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da afinidade para o receptor C1q com relação a anticorpo não modificado. Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para receptor C1q que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[163] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para C1q que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[164] Em um aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para os receptores FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIIA (Fl 58V) ou C1q que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% menores que um polipeptídeo do tipo selvagem.

[165] Em outro aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para os receptores FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIIA, FCYRIIIA (Fl 58V) e/ou C1q, respectivamente, que são de cerca de 10 nM a 100 nM, 10 nM a 1 μM, 100 nM a cerca de 100 μM, cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, cerca de 1 μM a cerca de 100 μM ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas realizações, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para os receptores FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcyRIIIA (Fl-58V) ou C1q que são de mais de 100 nM, 500 nM, 1 μM, mais de 5 μM, mais de 10 μM, mais de 25 μM, mais de 50 μM ou mais de 100 μM.

[166] Em outro aspecto da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem aumento de afinidade para FcyRIIB em comparação com um polipeptídeo do tipo selvagem. Em outro aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para FcyRIIB que são inalteradas ou aumentadas em pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes a de anticorpo não modificado. Em um outro aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para o receptor FcyRIIB que são aumentadas em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% sobre um polipeptídeo do tipo selvagem.

[167] Em outro aspecto da presente invenção, variantes da presente invenção exibem afinidades para os receptores FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIIA ou FCYRIIIA (Fl 58V) ou C1q que são de menos de 100 μM, menos de 50 μM, menos de 10 μM, menos de 5 μM, menos de 2,5 μM, menos de 1 μM, menos de 100 nM ou menos de 10 nM.

FUNÇÃO EFETORA REDUZIDA

[168] Em certos aspectos da presente invenção, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção modulam uma função efetora em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[169] Em ainda outro aspecto da presente invenção, essa modulação é uma modulação de ADCC e/ou ADCP e/ou CDC. Em um aspecto adicional da presente invenção, essa modulação é inframodulação ou redução do efeito. Em ainda outro aspecto da presente invenção, esta é uma modulação de ADCC e, em ainda outro aspecto da presente invenção, essa modulação é uma inframodulação de ADCC. Em ainda outro aspecto, essa modulação é inframodulação de ADCC e CDC, em ainda outra realização é uma inframodulação apenas de ADCC e, em ainda outra realização, esta é uma inframodulação de ADCC e CDC e/ou ADCP. Em ainda outro aspecto da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção modulam para baixo ou reduzem ADCC/CDC e ADCP.

[170] Em um aspecto adicional da presente invenção, a redução ou inframodulação de ADCC, CDC ou ADCP induzida pelo polipeptídeo que compreende a variante Fc é uma redução para 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 ou 75% do valor observado para indução de ADCC, CDC ou ADCP, respectivamente, pelo polipeptídeo que compreende a região Fc do tipo selvagem.

[171] Em ainda outros aspectos da presente invenção, a modulação de ADCC induzida pelos polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção é uma redução da potência, de tal forma que a EC50 da mencionada variante Fc seja reduzida em mais de cerca de dez vezes em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[172] Em ainda outro aspecto, a variante de acordo com a presente invenção é isenta de qualquer ADCC e/ou CDC e/ou ADCP substancial na presença de células efetoras humanas em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[173] Em ainda outro aspecto da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução, tal como redução em pelo menos 20%, ou redução forte, tal como redução em pelo menos 50%, da função efetora, que poderá ser uma redução de ADCC (inframodulação), CDC e/ou ADCP.

REDUÇÃO DA ATIVIDADE DE ADCC

[174] Testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de ligação de receptores Fc (FcR), por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não apresente ligação de FcyR (portanto, propenso a não apresentar atividade de ADCC), mas retenha a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FCYRIII, enquanto monócitos expressam FCYRI, RII e RIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitadores de testes in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente Norte- Americana n° 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (1986) 7059-7063) e Hellstsrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 (1985) 1499-1502; US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, podem ser empregados métodos de teste não radioativos (vide, por exemplo, teste de citotoxicidade não radioativo ACTI® para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View CA; e teste de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison WI). Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em um modelo animal como o descrito em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95 (1998) 652-656). Testes de ligação de C1q podem também ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e, desta forma, não apresenta atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação de C1q e C3c em WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163; Cragg, M. S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M. S. e Glennie, M. J., Blood 103 (2004) 2738-2743). Determinações de meia vida/liberação in vivo e ligação de FcRn podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, S. B. et al., Intl. Immunol. 18 (12) (2006) 1759-1769).

[175] Contempla-se que polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção são caracterizados por testes funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções de células efetoras mediadas por FCYR. Em certas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção possuem propriedades de ligação similares e funções de células efetoras em modelos in vivo (tais como descrito e revelado no presente) às de testes com base in vitro. A presente invenção não exclui, entretanto, variantes da presente invenção que não exibem o fenótipo desejado em testes com base in vitro, mas não exibem o fenótipo desejado in vivo. Em uma realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem atividades de ADCC reduzidas em comparação com polipeptídeos Fc do tipo selvagem não modificados. Em outro aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades de ADCC que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos cinquenta vezes ou pelo menos cem vezes a de anticorpo não modificado. Em ainda outra realização, anticorpos de acordo com a presente invenção exibem atividades de ADCC que são reduzidas em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% com relação a anticorpo não modificado. Em um aspecto adicional da presente invenção, a redução ou inframodulação de ADCC induzida pelo polipeptídeo que compreende a variante Fc é uma redução para 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 ou 75% do valor observado para indução de ADCC, CDC ou ADCP, respectivamente, pelo polipeptídeo que compreende a região Fc do tipo selvagem. Em certas realizações, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção não possuem atividade de ADCC detectável. Em realizações específicas, a redução e/ou a remoção da atividade de ADCC podem ser atribuídas à afinidade reduzida dos polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção para ligantes e/ou receptores de Fc. Em uma realização específica da presente invenção, a inframodulação de ADCC é a redução da potência de tal forma que a EC50 do mencionado polipeptídeo que compreende uma variante Fc é reduzida em cerca de dez vezes ou mais em comparação com o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[176] Em ainda outro aspecto da presente invenção, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção modulam ADCC e/ou CDC e/ou ADCP. Em um aspecto específico, as variantes de acordo com a presente invenção exibem atividade de CDC e ADCC e/ou ADCP reduzida.

ATIVIDADE DE CDC REDUZIDA

[177] O processo de ativação de complementos é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula, tal como um anticorpo, em complexo com um antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163.

[178] As propriedades de ligação das diferentes variantes a C1q podem ser analisadas por meio de imunoteste do tipo sanduíche ELISA. A concentração de anticorpos na metade da resposta máxima determina o valor EC50. Esta leitura é relatada como a diferença relativa com o padrão de referência medido sobre a mesma placa em conjunto com o coeficiente de variação de amostra e referência.

[179] Em uma realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades reduzidas para C1q com relação a um polipeptídeo do tipo selvagem. Em outra realização, dos polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para receptor C1q que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menores que o polipeptídeo do tipo selvagem.

[180] Em outra realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para C1q que são pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% menores que um polipeptídeo do tipo selvagem. Em outra realização, variantes de acordo com a presente invenção exibem afinidades para C1q que são de cerca de 100 nM a 100 μM, cerca de 100 nM a cerca de 10 μM, cerca de 100 nM a cerca de 1 μM, cerca de 1 nM a cerca de 100 μM, cerca de 10 nM a cerca de 100 μM, cerca de 1 μM a cerca de 100 μM ou cerca de 10 μM a cerca de 100 μM. Em certas realizações, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem afinidades para C1q que são de mais de 1 μM, mais de 5 μM, mais de 10 μM, mais de 25 μM, mais de 50 μM ou mais de 100 μM.

[181] Em uma realização, polipeptídeo que compreende uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibe redução das atividades de CDC em comparação com o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em outra realização, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem atividades de CDC que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos cinquenta vezes ou pelo menos cem vezes menores que o polipeptídeo do tipo selvagem.

[182] Em ainda outra realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem atividades de CDC que são reduzidas em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% com relação ao polipeptídeo do tipo selvagem. Em certos aspectos, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção não exibem atividades de CDC detectáveis. Em realizações específicas, a redução e/ou a remoção da atividade de CDC podem ser atribuídas à afinidade reduzida dos polipeptídeos que compreendem uma variante Fc para ligantes e/ou receptores de Fc.

REDUÇÃO DA TOXICIDADE RELATIVA A ANTICORPOS

[183] Compreende-se na técnica que terapias biológicas podem possuir questões de toxicidade adversas associadas à natureza complexa de direção do sistema imunológico para reconhecer e atacar células e/ou alvos indesejados. Quando o reconhecimento e/ou o direcionamento para ataque não tiverem lugar quando for necessário tratamento, podem ocorrer consequências tais como toxicidade adversa. Manchas de anticorpos de tecidos não desejados, por exemplo, podem indicar potenciais questões de toxicidade.

[184] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução das manchas de tecidos não desejados em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Em outro aspecto, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução de manchas para tecidos não desejados que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menos que um polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em outra realização, variantes da presente invenção exibem redução das manchas de tecidos não desejados de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% com relação ao polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[185] Em uma realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da toxicidade relativa ao anticorpo em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Em outra realização, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem toxicidades que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menores que o polipeptídeo do tipo selvagem. Em outro aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem toxicidades que são reduzidas em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% com relação ao polipeptídeo do tipo selvagem.

AGREGAÇÃO DE TROMBÓCITOS

[186] Em um aspecto da presente invneção, o polipeptídeo do tipo selvagem induz ativação de plaquetas e/ou agregação de plaquetas e suas variantes, ou seja, polipeptídeos, que compreendem variantes de Fc, exibem redução ou até eliminação da ativação e/ou agregação de trombócitos. Em ainda outro aspecto da presente invneção, esses polipeptídeos do tipo selvagem são anticorpos dirigidos a proteínas de plaquetas. Em ainda outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo CD9. Em ainda outra realização, esse anticorpo CD9 possui mutação na posição P329G e/ou na posição L234A/L235A ou S228P/L235E (P329G/LALA, P329G/SPLE). Em uma realização específica adicional, o anticorpo é caracterizado por SEQ ID N° 8-14.

[187] Compreende-se na técnica que terapias biológicas podem possuir o efeito prejudicial de agregação de trombócitos. Testes in vitro e in vivo poderão ser utilizados para medir a agregação de trombócitos. Considera-se que o teste in vitro reflete a situação in vivo.

[188] Em um aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da agregação de trombócitos em testes in vitro em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Em outro aspecto, os polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da agregação de trombócitos em testes in vitro que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menos que um polipeptídeo do tipo selvagem. Em outra realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem agregação de trombócitos em teste in vitro que é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% com relação ao polipeptídeo do tipo selvagem.

[189] Em ainda outro aspecto, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem redução da agregação de trombócitos in vivo em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem. Em outro aspecto, variantes da presente invenção exibem redução da agregação de trombócitos em testes in vivo que são pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos trinta vezes, pelo menos quarenta vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos sessenta vezes, pelo menos setenta vezes, pelo menos oitenta vezes, pelo menos noventa vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos duzentas vezes menos que o polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em outra realização, polipeptídeos que compreendem uma variante Fc de acordo com a presente invenção exibem agregação de trombócitos em teste in vivo que é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% com relação ao polipeptídeo do tipo selvagem.

INTERNALIZAÇÃO DE ANTICORPOS

[190] Variantes da presente invenção podem ligar-se a antígenos da superfície celular que podem internalizar-se, conduzindo adicionalmente os anticorpos para o interior da célula. Uma vez no interior da célula, as variantes podem ser liberadas para o citoplasma, dirigidas a um compartimento específico ou recicladas para a superfície celular. Em algumas realizações, as variantes da presente invenção ligam-se a um antígeno da superfície celular que se internaliza. Em outras realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser dirigidos a organelas específicas ou compartimentos da célula. Em ainda outras realizações, as variantes da presente invenção podem ser recicladas par a superfície ou periferia celular após a internalização.

[191] Em uma realização específica, o anticorpo de acordo com a presente invenção é específico para p-selectina, CD9, CD19, CD81, CCR5 ou CXCR5, IL17a ou IL-33.

PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS

[192] Na realização preferida da presente invenção, o polipeptídeo que contém região Fc que é modificado de acordo com os ensinamentos do presente é um anticorpo. Seguem-se as técnicas de produção de anticorpos:

SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS

[193] Quando o polipeptídeo for um anticorpo, ele é dirigido contra um antígeno de interesse. Preferencialmente, o antígeno é um polipeptídeo biologicamente importante e a administração do anticorpo a mamíferos que sofram de doença ou distúrbio pode resultar em benefício terapêutico naquele mamífero. Entretanto, os anticorpos dirigidos contra antígenos não de polipeptídeo (tais como antígenos de glicolipídios associados a tumores; vide a Patente Norte-Americana n° 5.091.178) também são contemplados.

[194] Quando o antígeno for um polipeptídeo, ele pode ser uma molécula transmembranosa (tal como receptor) ou ligante, tal como fator de crescimento. Exemplos de antígenos incluem moléculas tais como renina; hormônio do crescimento, incluindo hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação de hormônio do crescimento; hormônio paratireoide; hormônio estimulante da tireoide; lipoproteínas; alfa-1- antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormônio estimulante das folículas; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido (TF) e fator von Willebrands; fatores anticoagulantes tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo dos pulmões; ativador plasminogênio, tal como uroquinase, urina humana ou ativador plasminogênio do tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; fator de necrose tumorosa alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulada mediante ativação de células T normalmente expressas e secretadas); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); albumina de soro tal como albumina de soro humano; substância inibidora Muelleriana; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró- relaxina; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; proteína microbiana, tal como betalactamase; DNase, IgE; antígeno associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; fator neurotrófico, tal como fator neurotrófico derivado de ossos (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT- 4, NT-5 ou NT-6) ou fator de crescimento dos nervos, tal como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastas, tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF), tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 ou TGF-β5; fator de crescimento similar a insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação de fator de crescimento similar a insulina; proteínas CD, tais como CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; proteína morfogenética óssea (BMP); interferona, tal como interferona-alfa, beta e gama; fatores estimulantes de colônias (CSFs), tais como M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), tais como IL-1 a IL-10; dismutase de superóxido; proteínas de membrana da superfície; fator de aceleração do envelhecimento; antígeno viral, tal como uma parte do envelope contra a AIDS; proteínas de transporte; receptores de abrigo; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas, tais como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 e VCAM; antígeno associado a tumores tal como receptor de HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de quaisquer dos polipeptídeos relacionados acima.

[195] Alvos moleculares preferidos para anticorpos de acordo com a presente invenção incluem proteínas CD tais como CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptores ErbB tais como o receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina α4/β7 e integrina αv/β3, que inclui suas subunidades α ou β (tais como anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como VEGF; fator de tecido (TF); alfa interferona (α-IFN); e interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C etc.

[196] Antígenos solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser utilizados como imunogenes para a geração de anticorpos. Para moléculas transmembranosas, tais como receptores e seus fragmentos (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser utilizados como imunogene. Alternativamente, células que expressam a molécula transmembranosa podem ser utilizadas como imunogene. Essas células podem ser derivadas de fonte natural (tal como linhagens de células cancerosas) ou podem ser células que foram transformadas por meio de técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranosa. Outros antígenos e suas formas úteis de preparo de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

ANTICORPOS POLICLONAIS

[197] Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados em animais por meio de diversas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada tal como hemocianina de conchas, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, tal como éster maleimidobenzoil sufossuccinimida (conjugação por meio de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2 ou carbodi-imida, em que R e R1 são grupos alquila diferentes.

[198] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados por meio da combinação, por exemplo, de 100 μg ou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução de forma intradérmica em diversos locais. Um mês mais tarde, os animais são incentivados com, por exemplo, 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injeção subcutânea em diversos locais. Sete a quatorze dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para determinar a titulagem de anticorpos. Os animais são incentivados até a estabilização do título. Preferencialmente, o animal é incentivado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a proteína diferente e/ou por meio de reagente reticulante diferente. Os conjugados podem também ser elaborados em cultivo celular recombinante, na forma de fusões de proteínas. Além disso, agentes agregantes tais como alúmen são adequadamente utilizados para aumentar a resposta imunológica.

ANTICORPOS MONOCLONAIS

[199] Anticorpos monoclonais podem ser elaborados utilizando o método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature, 256 (1975) 495, ou podem ser elaborados por meio de métodos de DNA recombinante (Patente Norte-Americana n° 4.816.567).

[200] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou macaco, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se liguem especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fundidos em seguida a células de mieloma, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs. 59-103).

[201] As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultivo apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

[202] Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a meio tal como meio HAT. Dentre estas, as linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Rockville MD, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J., Immunol. 133, (1984) 3001 e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1987), págs. 51-63).

[203] O meio de cultivo no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou de teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).

[204] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados por meio de limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs. 59-103). Meios de cultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI- 1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em animais.

[205] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultivo, fluido de ascite ou soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como proteína A Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[206] O DNA codificador dos anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado por meio da utilização de procedimentos convencionais (empregando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos será descrita com mais detalhes abaixo.

[207] Em realização adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty, J. et al., Nature, 348 (1990) 552-554. Clackson et al., Nature, 352 (1991) 624-628 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597 descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology 10 (1992) 779-783), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia de construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21 (1993) 2265-2266). Desta forma, estas técnicas são alternativas viáveis para as técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

[208] O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio de substituição da sequência de codificação por domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das sequências murinas homólogas (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 (1984) 6851-6855, ou por meio de ligação covalente da sequência de codificação de imunoglobulina com a sequência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte.

[209] Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de um local de combinação de antígenos de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antígenos que possui especificidade para um antígeno e outro local de combinação de antígenos que possui especificidade para um antígeno diferente.

AFINIDADE DE ANTICORPOS

[210] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente possui uma constante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (tal como 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, tal como de 10-9 M a 10-13 M).

[211] Em uma realização, Kd é medido por meio de um teste de ligação de antígenos radiomarcados ou receptor Fc (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno conforme descrito pelo teste a seguir. A afinidade de ligação de soluções de Fabs para antígeno é medida por meio de equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas com múltiplas cavidades MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno [125I] são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (tal como consistente com a determinação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por uma noite; entretanto, a incubação pode prosseguir por um período mais longo (tal como cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (tal como por uma hora). A solução é removida em seguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% polissorbato 20 (TWEEN 20®) em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μl/cavidade de cintilante (MICROSCINT 20®; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT® (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva.

[212] De acordo com uma outra realização, Kd é medido utilizando testes de ressonância de plasma de superfície empregando BIACORE® 2000 ou BIACORE® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno imobilizado ou receptor Fc CM5 a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)- carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, até 5 μg/ml (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de tensoativo polissorbato 20 (TWEEN 20®) (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIACORE® versão 3.2) por meio de configuração simultânea dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 s-1 por meio do teste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada em seguida utilizando um método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo antiantígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-AMINCO® série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

[213] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas sem limitações, fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, bem como outros fragmentos descritos abaixo. Para análise de certos fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para análise de fragmentos de scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore Eds. (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185; e Patentes Norte-Americanas n° 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos de Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopos de ligação de receptores salvos e possuem maior meia vida in vivo, vide a Patente Norte-Americana n° 5.869.046.

[214] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígenos que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 0.404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129134; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (1993) 6444-6448. Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.

[215] Anticorpos com domínio simples são fragmentos de anticorpos que compreendem, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia pesada ou, no todo ou em parte, o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio simples é um anticorpo com domínio simples humano (Domantis, Inc., Waltham MA; vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.248.516 B1).

[216] Podem ser elaborados fragmentos de anticorpos por meio de diversos métodos, incluindo, mas sem limitações, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (tais como E. coli ou fago), conforme descrito no presente.

ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[217] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81 (1984) 6851-6855. Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (tal como uma região variável derivada de camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “classe trocada” no qual a classe ou subclasse foi alterada com relação ao anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem seus fragmentos de ligação de antígenos.

[218] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para seres humanos, mantendo ao mesmo tempo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, tais como CDRs (ou suas partes), são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou suas partes) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos com resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (tal como o anticorpo do qual são derivados os resíduos de HVR), por exemplo, para restaurar ou aumentar a especificidade ou afinidade de anticorpos.

[219] Anticorpos humanizados e os métodos de sua elaboração são analisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 e são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (1989) 10029-10033; e Patentes Norte-Americanas n° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que descreve enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que descreve “nova formação de superfície”); Dall’Acqua et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que descreve “mudança de FR”); e Osbourn et al., Methods 36 (2005) 61-68 e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260 (que descreve a abordagem de “seleção orientada” para troca de FR).

[220] As regiões de estrutura humana que podem ser utilizadas para humanização incluem, mas sem limitações: regiões de estrutura selecionadas utilizando o método de “melhor adequação” (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296); regiões de estrutura derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89 (1992) 4285; e Presta et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623); regiões de cadeia principal maduras humanas (que sofreram mutação somática) ou regiões de cadeia principal de linhagem de germens humanos (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de cadeia principal derivadas de bibliotecas de FR de seleção (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

ANTICORPOS HUMANOS

[221] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Anticorpos humanos são descritos de forma geral em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 36874 e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

[222] Podem ser preparados anticorpos humanos por meio da administração de imunogenes a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a desafio antigênico. Esses animais contêm tipicamente, no todo ou em parte, os locais de imunoglobulina humana, que substituem os locais de imunoglobulina endógena ou que estão presentes de forma extracromossômica ou são integrados aleatoriamente aos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os locais de imunoglobulina endógena foram, de forma geral, desativados. Para análise de métodos de obtenção de anticorpos humanos de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Vide também, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem tecnologia XENOMOUSE®; Patente Norte-Americana n° 5.770.429, que descreve a tecnologia HuMab®; Patente Norte-Americana n° 7.041.870, que descreve tecnologia K-M MOUSE®; e o Pedido de Patente Norte-Americano publicado n° US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, por meio de combinação com uma região constante humana diferente.

[223] Podem também ser elaborados anticorpos humanos por meio de métodos com base em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (vide, por exemplo, Kozbor, J. Immunol., 133 (1984) 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., Nova Iorque (1987), págs. 51-63; e Boerner et al., J. Immunol., 147 (1991) 86). Os anticorpos humanos gerados por meio da tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103 (2006) 3557-3562). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais de linhagens de células de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) (2006) 265-268 (que descreve hibridomas humanos). Tecnologia de hibridomas humanos (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) (2005) 927-937 e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) (2005) 185-91.

[224] Anticorpos humanos podem também ser gerados por meio do isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de seres humanos. Essas sequências de domínios variáveis podem ser combinadas em seguida com um domínio constante humano desejado. Métodos de seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritos abaixo.

ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS

[225] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser isolados por meio da seleção de bibliotecas combinatórias em busca de anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Diversos métodos são conhecidos na técnica, por exemplo, para gerar bibliotecas de exibição de fagos e selecionar essas bibliotecas em busca de anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Esses métodos são analisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e adicionalmente descritos, por exemplo, em McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks e Bradbury em Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) (2004) 299-310; Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) (2004) 1073-1093; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (34) (2004) 12467-12472; e Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2) (2004) 119-132.

[226] Em certos métodos de exibição de fagos, repertórios de genes VH e VL são clonados separadamente por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) e novamente combinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem ser pesquisadas em seguida em busca de fago de ligação de antígenos conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455. Fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, seja na forma de fragmentos de Fv de fita simples (scFv) ou de fragmentos de Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunogene sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado (por exemplo, de seres humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla variedade de antígenos próprios e não próprios sem nenhuma imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J., 12: 1993 (725-734). Por fim, bibliotecas nativas podem também ser elaboradas sinteticamente por meio de clonagem dos segmentos de genes V não redispostos de células haste, utilizando primers de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e realizar redisposição in vitro conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 1992 (381-388). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente Norte- Americana n° 5.750.373 e Patentes Norte-Americanas publicadas n° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.

[227] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos no presente.

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[228] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para um antígeno específico e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes do antígeno. Podem também ser utilizados anticorpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expressem o antígeno ao qual se liga o anticorpo. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos.

[229] Os métodos de elaboração de anticorpos multiespecíficos incluem, mas sem limitações, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina que possuem especificidades diferentes (vide Milstein e Cuello, Nature 305 (1983) 537, WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10 (1991) 3655) e engenharia de “botão no orifício” (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos podem também ser preparados por meio da realização de efeitos de direcionamento eletrostático para elaborar moléculas heterodiméricas de Fc de anticorpos (WO 2009/089004 A1); retícula de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente Norte-Americana n° 4.676.980 e Brennan et al., Science, 229 (1985) 81); utilizando fechos de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5) (1992) 1547-1553); utilizando tecnologia de “diacorpos” para elaborar fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90 (1993) 6444-6448); e utilizando dímeros Fv de fita simples (sFv) (vide, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152 (1994) 5368); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al., J. Immunol. 147 (1991) 60.

[230] São também incluídos no presente anticorpos elaborados com três ou mais locais de ligação de antígenos funcionais, incluindo “anticorpos Octopus” (vide, por exemplo, US 2006/0025576A1).

[231] O anticorpo ou fragmento do presente também inclui um “FAb de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um local de ligação de antígenos que se liga a um antígeno específico, bem como um outro antígeno diferente (vide, por exemplo, US 2008/0069820).

VARIANTES DE ANTICORPOS COM AFINIDADE DE LIGAÇÃO ALTERADA AO ANTÍGENO

[232] Em certas realizações, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação ao antígeno e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas por meio da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, tais como ligação de antígenos.

VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E EXCLUSÃO

[233] Em certas realizações, são fornecidos polipeptídeos que compreendem variantes Fc e possuem adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos em partes diferentes da parte Fc. Locais de interesse para mutagênese de substituição incluem HVRs e FRs. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título “substituições conservadoras”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 com o título “exemplos de substituições” e conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de cadeias laterais de aminoácidos. Substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos são selecionados para determinar uma atividade desejada, tal como ligação de antígenos retida/aprimorada ou redução da imunogenicidade. TABELA 1

[234] Agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: Ile, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[235] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[236] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional conterá(ão) modificações (tais como melhorias) em certas propriedades biológicas (tais como aumento da afinidade e redução da imunogenicidade) com relação ao anticorpo parental e/ou possuirão certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Um exemplo de variante de substituição é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, utilizando, por exemplo, métodos de amadurecimento por afinidade com base em exibição de fagos, tais como os descritos no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR sofreram mutação e os anticorpos variantes são exibidos sobre fago e selecionados em busca de atividade biológica específica (tal como afinidade de ligação).

[237] Podem ser elaboradas alterações (tais como substituições) em HVRs, por exemplo, para aumentar a afinidade de anticorpo. Essas alterações podem ser feitas em “pontos quentes” de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação sob alta frequência durante o processo de amadurecimento somático (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) e/ou SDRs (a-CDRs), em que a variante resultante VH ou VL é testada para determinar a afinidade de ligação. O amadurecimento por afinidade por meio da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrito, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O’Brien et al., Ed., Human Press, Totowa NJ (2001)). Em algumas realizações de amadurecimento por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis selecionados para determinar o amadurecimento por qualquer um dentre uma série de métodos (tais como PCR à prova de erros, alteração de cadeias ou mutagênese dirigida a oligonucleotídeos). É criada em seguida uma biblioteca secundária. A biblioteca é selecionada em seguida para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Um outro método de introdução da diversidade envolve abordagens dirigidas a HVR, em que diversos resíduos de HVR (tais como quatro a seis resíduos de cada vez) são aleatorizados. Resíduos de HVR envolvidos na ligação de antígenos podem ser especificamente identificados, utilizando, por exemplo, modelagem ou mutagênese de varrimento de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 são particularmente dirigidos frequentemente.

[238] Em certas realizações, substituições, inserções ou exclusões podem ocorrer em até um ou mais HVRs, desde que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de ligar antígeno. Alterações conservadoras, por exemplo (tais como substituições conservadoras conforme fornecido no presente), que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser elaboradas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de “pontos quentes” de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR é inalterado ou contém não mais de uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[239] Um método útil de identificação de resíduos ou regiões de anticorpo que podem ser dirigidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varrimento de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells (244), Science (1989) 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) é identificado e substituído com um aminoácido neutro ou com carga negativa (tal como alanina ou polialanina) para determinar se é afetada a interação do anticorpo com o antígeno. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativa ou adicionalmente, uma estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo identifica pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser dirigidos ou eliminados para possível substituição. Variantes podem ser selecionadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[240] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.

VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[241] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente é alterado para aumentar ou reduzir a extensão de glicosilação do anticorpo. A adição ou exclusão de locais de glicosilação para um anticorpo pode ser convenientemente realizada por meio da alteração da sequência de aminoácidos, de tal forma que sejam criados ou removidos um ou mais locais de glicosilação.

[242] Quando o anticorpo compreender uma região Fc, o carboidrato a ele ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, tais como manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na “haste” da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas realizações, podem ser elaboradas modificações do oligossacarídeo em um anticorpo de acordo com a presente invenção, a fim de criar variantes de anticorpos com certas propriedades aprimoradas.

[243] Polipeptídeos que compreendem variantes Fc são adicionalmente equipados com oligossacarídeos sialilados, por exemplo, nos quais é fornecida sialilação diferencial do oligossacarídeo central de Fc ligado à região Fc do anticorpo. Esses polipeptídeos podem ter função de sialilação aumentada e/ou de ADCC reduzida. Exemplos dessas variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, por Kaneko et al., Science 313 (2006) 670-673.

VARIANTES DE ANTICORPOS ELABORADOS COM CISTEÍNAS

[244] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados com cisteína, tais como “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos com resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são posicionados, portanto, em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de drogas ou porções de droga e ligante, para criar um imunoconjugado, conforme descrito adicionalmente no presente. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir podem ser substituídos com cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos elaborados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 7.521.541.

DERIVADOS DE ANTICORPOS

[245] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pode ser adicionalmente modificado para que contenha porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. As porções apropriadas para derivação do anticorpo incluem, mas sem limitações, polímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeros hidrossolúveis incluem, mas sem limitações, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, póli-1,3-dioxolano, póli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextran ou póli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno e óxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens de fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. A quantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de um polímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes. Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas sem limitações, as propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condições definidas etc.

[246] Em uma outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por meio de exposição à radiação. Em uma realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas sem limitações, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas que aquecem a porção não proteinácea até uma temperatura na qual células próximas da porção não proteinácea de anticorpos são mortas.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RECOMBINANTES

[247] Anticorpos podem ser produzidos utilizando composições e métodos recombinantes, tal como conforme descrito na Patente Norte- Americana n° 4.816.567. Em uma realização, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica uma variante de anticorpo descrita no presente. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência VL e/ou de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo (tais como as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (tais como vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Em uma dessas realizações, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo; ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende o VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucariótica, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (tal como célula Y0, NS0, Sp20). Em uma realização, é fornecido um método de elaboração de uma variante de anticorpo, em que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições apropriadas para a expressão do anticorpo, e recuperação opcional do anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultivo de células hospedeiras).

[248] Para produção recombinante de uma variante de anticorpo, ácido nucleico que codifica um anticorpo, tal como conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo).

[249] Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células eucarióticas ou procarióticas descritas no presente. Anticorpos podem ser produzidos, por exemplo, em bactérias, particularmente quando não forem necessárias glicosilação e função efetora de Fc. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes Norte- Americanas n° 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523 (vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, 248 (2003) 245-254 (B. K. C. Lo, Ed., Humana Press, Totowa NJ), que descreve a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[250] Além de procariotes, micróbios eucarióticos tais como leveduras ou fungos filamentosos são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores codificadores de anticorpos, incluindo linhagens de fungos e leveduras cujos processos de glicosilação tenham sido “humanizados”, o que resulta na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação total ou parcialmente humano. Vide Gerngross, Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 e Li et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

[251] As células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (vertebrados e invertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[252] Cultivos de células vegetais podem também ser utilizados como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIES® para a produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[253] Células de vertebrados podem também ser utilizadas como hospedeiros. Linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescimento em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou de rim (BHK)); células Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23: 1980 (243-251); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma da cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células do fígado de ratos búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongos (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77 (1980) 4216); e linhagens de células de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para análise de certas linhagens de células de hospedeiros mamíferos apropriadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, 248 (2003) 255-268 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa NJ).

TESTES

[254] Os anticorpos fornecidos no presente podem ser identificados, selecionados ou caracterizados pelas suas propriedades físico- químicas e/ou atividades biológicas por meio de vários testes conhecidos na técnica.

TESTES DE LIGAÇÃO E OUTROS TESTES

[255] Em um aspecto, um anticorpo de acordo com a presente invenção é testado para determinar a sua atividade de ligação de antígenos, por exemplo, por meio de métodos conhecidos tais como ELISA, Western Blot etc.

[256] Em um exemplo de teste de competição, antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga ao antígeno (por exemplo) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado para determinar a sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, antígeno imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições que permitam a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido e é medida a quantidade de marca associada ao antígeno imobilizado. Se a quantidade de marca associada a antígeno imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste com relação à amostra controle, isso indica que o segundo anticorpo está concorrendo com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno (vide Harlow e Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

IMUNOCONJUGADOS

[257] A presente invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo no presente conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores do crescimento, toxinas (tais como toxinas de proteínas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou isótopos radioativos.

[258] Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado de droga e anticorpo (ADC) no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas, que incluem, mas sem limitações, um maitansinoide (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e a Patente Europeia n° EP 0.425.235 B1); uma auristatina tal como as porções de droga monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (vide as Patentes Norte- Americanas n° 5.635.483, 5.780.588 e 7.498.298); dolastatina; uma caliqueamicina ou seu derivado (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; e Lode et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (vide Kratz et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 2006 (358-362); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (2000) 829-834); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 15291532; King et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; e Patente Norte- Americana n° 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; tricoteceno; e CC1065.

[259] Em uma outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou seu fragmento, incluindo, mas sem limitações, cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia modeccina A, alfassarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[260] Em uma outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou I123, ou uma marca de centrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[261] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bisazido (tais como bis(p- azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos de flúor bisativo (tais como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al., Science 238 (1987) 1098. Ácido 1-isotiocianatobenzil- 3-metildietileno triaminopenta-acético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. A ligação pode ser “ligação divisível” que possibilita a liberação de droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52 (1992) 127131; Patente Norte-Americana n° 5.208.020).

[262] Os imunoconjugados ou ADCs contemplam expressamente no presente, mas sem limitações, os conjugados preparados com reagentes reticulantes, que incluem, mas sem limitações, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES DE DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO

[263] Em certas realizações, qualquer uma das varantes de anticorpos fornecidas no presente é útil para detectar a presença do antígeno que se liga àquele anticorpo em amostras biológicas. O termo “detecção”, da forma utilizada no presente, engloba detecção qualitativa ou quantitativa. Em certas realizações, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido.

[264] Em uma realização, é fornecida uma variante de anticorpo para uso em um método de detecção ou diagnósico. Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detecção da presença do antígeno ao qual se liga a mencionada variante de anticorpo em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método compreende o contato da amostra biológica com um anticorpo conforme descrito no presente sob condições permissivas para ligação do anticorpo ao antígeno e detecção se é formado um complexo entre o anticorpo e o antígeno. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma realização, uma variante de anticorpo é utilizada para selecionar pacientes propensos a terapia com anticorpo, tal como em que o antígeno ao qual se liga o mencionado anticorpo é um biomarcador para seleção de pacientes.

[265] Exemplos de distúrbios que podem ser diagnosticados utilizando um anticorpo de acordo com a presente invenção incluem câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neuronais e diabete.

[266] Em certas realizações, são fornecidas variantes de anticorpos marcados. As marcas incluem, mas sem limitações, marcas ou porções que são detectadas diretamente (tais como marcas fluorescentes, cromofóricas, densas em elétrons, quimioluminescentes e radioativas), bem como porções, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, tal como por meio de reação enzimática ou interação molecular. Exemplos dessas marcas incluem, mas sem limitações, os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoroforos tais como quelatos de terra rara ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, tais como luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente Norte-Americana n° 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, peroxidase de rabanete silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases, tais como glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6- fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantino oxidase, acopladas a uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar precursor de tintura tal como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcas de centrifugação, marcas de bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[267] Formulações farmacêuticas de uma variante de anticorpo conforme descrito no presente são preparadas por meio da mistura desse anticorpo ou molécula que possui o grau desejado de pureza com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A., Ed.: (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são atóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas sem limitações: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis no presente incluem ainda agentes de dispersão de drogas intersticiais tais como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), como glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) Certos exemplos de sHASEGPs e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas Patentes Norte-Americanas publicadas n° 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, um sHASEGP é combinado com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[268] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizadas encontram-se descritos na Patente Norte-Americana n° 6.267.958. Formulações de anticorpos aquosas incluem as descritas na Patente Norte-Americana n° 6.171.586 e em WO 2006/044908, em que estas últimas formulações incluem um tampão de acetato de histidina.

[269] A formulação do presente pode também conter mais de um ingrediente ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Esses ingredientes ativos encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[270] Os ingredientes ativos podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Esses métodos são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A., Ed. (1980).

[271] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, em que as matrizes se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.

[272] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[273] Qualquer um dos polipeptídeos fornecidos no presente pode ser utilizado em métodos terapêuticos.

[274] Em um aspecto específico da presente invenção, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é utilizado para o tratamento de doenças. Em um aspecto mais específico, a doença é tal que é favorável a forte redução, pelo menos em 50%, da função efetora da variante em comparação com o polipeptídeo que compreende o polipeptídeo Fc do tipo selvagem.

[275] Em um aspecto específico, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é utilizado na fabricação de medicamento para o tratamento de doenças, em que é favorável que a função efetora do polipeptídeo seja fortemente reduzida em comparação com um polipeptídeo Fc do tipo selvagem. Em um aspecto específico adicional, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é utilizado na fabricação de medicamento para o tratamento de doenças, em que é favorável que a função efetora do polipeptídeo seja reduzida em comparação com um polipeptídeo Fc do tipo selvagem, em pelo menos 20%.

[276] Um aspecto adicional é um método de tratamento de um indivíduo que possui uma doença, em que é favorável que a função efetora da variante sej fortemente reduzido em comparação com um polipeptídeo Fc do tipo selvagem, que compreende a administração ao indivíduo de quantidade eficaz do polipeptídeo de acordo com a presente invenção.

[277] Forte redução da função efetora é uma redução da função efetora em pelo menos 50% da função efetora induzida pelo polipeptídeo do tipo selvagem.

[278] Essas doenças são, por exemplo, todas as doenças nas quais a célula alvo não deverá ser destruída, por exemplo, por meio de ADCC, ADCP ou CDC. Isso é particularmente verdadeiro para os anticorpos projetados para fornecer drogas (tais como toxinas e isótopos) para a célula alvo na qual as funções efetoras mediadas por FC/FCYR trazem células imunológicas saudáveis para perto da compensação mortal, o que resulta em esgotamento de tecido linfoide normal junto com as células alvo (Hutchins et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White et al., Annu. Rev. Med. 52 (2001) 125-145). Nestes casos, o uso de anticorpos que mal necessitam de células efetoras ou de complemento seria de enorme benefício (vide também Wu et al., Cell Immunol. 200 (2000) 1626; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9) (2001) 6591-6604; US 6.194.551; US 5.885.573 e publicação PCT WO 04/029207).

[279] Em outros casos, por exemplo, quando o objetivo for bloquear a interação de um receptor amplamente expresso com o seu ligante cognato, seria vantajoso reduzir ou eliminar toda a função efetora de anticorpos para reduzir a toxicidade indesejada. Além disso, caso um anticorpo terapêutico exibisse ligação promíscua ao longo de uma série de tecidos humanos, seria prudente limitar o direcionamento da função efetora a um conjunto diverso de tecidos para limitar a toxicidade.

[280] Para anticorpos agonistas, também seria muito útil se esses anticorpos exibissem função efetora reduzida.

[281] As condições que podem ser tratadas com a variante de polipeptídeo são muitas e incluem câncer (em que, por exemplo, a variante de anticorpo liga o receptor HER2, o receptor de angiopoietina ou fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)); condições alérgicas, tais como asma (com um anticorpo anti-IgE); e distúrbios mediados por LFA-1 (em que, por exemplo, a variante de polipeptídeo é um anticorpo anti-LFA-1 ou anti-ICAM-1), distúrbios neurológicos e metabólicos.

[282] Quando o anticorpo ligar o receptor de HER2, o distúrbio é preferencialmente câncer que expressa HER2, tal como tumor benigno ou maligno caracterizado pela sobre-expressão do receptor de HER2. Esses cânceres incluem, mas sem limitações, câncer de mama, câncer de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de células pequenas, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer da cervical, câncer do ovário, câncer da bexiga, hepatoma, câncer do cólon, câncer colorretal, carcinoma endométrico, carcinoma das glândulas salivares, câncer do rim, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e do pescoço.

[283] A variante de anticorpo ou polipeptídeo é administrada por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento imunossupressivo local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, a variante de anticorpo é administrada adequadamente por meio de infusão de pulsos, particularmente com doses decrescentes da variante de polipeptídeo. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, de maior preferência injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, de se a administração é rápida ou crônica.

[284] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de variante de anticorpo ou polipeptídeo dependerá do tipo de doença a ser tratado, conforme definido acima, da severidade e do curso da doença, se a variante de polipeptídeo é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta à variante de polipeptídeo e do critério do médico atendente. A variante de polipeptídeo é administrada adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

[285] Dependendo do tipo e da severidade da doença, por exemplo, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1 a 20 mg/kg) de variante de anticorpo ou polipeptídeo é uma possível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Podem, entretanto, ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.

[286] Em certas realizações, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo ou polipeptídeo para uso em um método de tratamento de um indivíduo que possui câncer que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da variante de anticorpo. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como conforme descrito abaixo. Em realizações adicionais, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo para uso na inibição da angiogênese, inibição da proliferação celular ou esgotamento de células B em indivíduos, que compreende a administração ao indivíduo de uma variante de anticorpo eficaz para inibir a angiogênese, inibição da proliferação celular ou esgotamento de células B em um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima, preferencialmente um ser humano.

[287] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma variante de anticorpo ou polipeptídeo na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento destina-se ao tratamento de câncer ou distúrbios inflamatórios. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de tratamento de câncer, diabete, distúrbios neuronais ou inflamatórios que compreende a administração a um indivíduo que possui câncer, diabete, distúrbios neuronais ou inflamatórios de uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma dessas realizações, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como conforme descrito abaixo. Em uma realização adicional, o medicamento destina-se à inibição da angiogênese, inibição da proliferação celular ou esgotamento de células B.

[288] Em uma realização adicional, o medicamento destina-se a uso em um método de inibição da angiogênese, inibição da proliferação celular ou esgotamento de células B em indivíduos que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade efica do medicamento para inibir a angiogênese, inibir a proliferação celular ou esgotar células B. Um “indivíduo” de acordo com qualquer das realizações acima pode ser um ser humano.

[289] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer uma das variantes de anticorpos fornecidas no presente, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer uma das variantes de anticorpos fornecidas no presente e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer uma das variantes de anticorpos fornecidas no presente e pelo menos um agente terapêutico adicional, tal como conforme descrito abaixo.

[290] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes em terapia. Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.

[291] Essas terapias de combinação indicadas acima incluem administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas) e administração separada, caso em que a administração do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou depois da administração do agente terapêutico e/ou adjuvante adicional. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados em combinação com terapia de radiação.

[292] Um anticorpo de acordo com a presente invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, que inclui administração parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser fornecida por qualquer via apropriada, tal como por meio de injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, de se a administração é rápida ou crônica. São contemplados no presente diversos cronogramas de dosagem, que incluem, mas sem limitações, administrações isoladas ou múltiplas ao longo de diversos momentos, administração de mistura e infusão de pulso.

[293] Os anticorpos de acordo com a presente invenção seriam formulados, dosados e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina. O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para evitar ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descrito no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente ou em qualquer dosagem e por meio de qualquer processo que seja determinado empírica ou clinicamente como sendo apropriado.

[294] Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente, resposta ao anticorpo e do critério do médico atendente. O anticorpo é administrado adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem inicial possível para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até que ocorra uma supressão desejada de sintomas da doença. Um exemplo de dosagem do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode-se administrar uma dose de carregamento mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Podem, entretanto, ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.

[295] Compreende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima pode ser conduzida utilizando um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de um anticorpo de acordo com a presente invenção.

ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS

[296] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas, sacos de solução intravenosa etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que, por si própria ou quando combinada com outra composição, é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um anticorpo de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição específica. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo de acordo com a presente invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico ou terapêutico de outra forma adicional. O artigo industrializado desta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indica que as composições podem ser utilizadas para o tratamento de uma condição específica. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[297] Compreende-se que qualquer um dos artigos industrializados acima pode incluir um imunoconjugado de acordo com a presente invenção no lugar ou além de uma variante de anticorpo.

USOS NÃO TERAPÊUTICOS DO POLIPEPTÍDEO

[298] A variante de anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como agente de purificação de afinidade. Neste processo, a variante de anticorpo é imobilizada sobre uma fase sólida, tal como resina Sephadex ou papel filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. A variante de polipeptídeo imobilizada é colocada em contato com uma amostra que contém o antígeno a ser purificado e, em seguida, o suporte é lavado com solvente apropriado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto pelo antígeno a ser purificado, que é ligado à variante de anticorpo imobilizada. Por fim, o suporte é lavado com outro solvente apropriado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que liberará o antígeno da variante de polipeptídeo.

[299] A variante de anticorpo pode também ser útil em testes de diagnóstico, por exemplo, para detectar a expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos específicos ou soro.

[300] Para aplicações em diagnóstico, a variante de anticorpo será tipicamente marcada com uma porção detectável. São disponíveis numerosas marcas que podem ser agrupadas de forma geral nas categorias a seguir: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. A variante de polipeptídeo pode ser marcada com o radioisótopo, utilizando as técnicas descritas em Coligen et al., Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Ed. Wiley-Interscience, Nova Iorque NY, Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida utilizando contagem de cintilação. (b) Marcas fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e Vermelho do Texas são disponíveis. As marcas fluorescentes podem ser conjugadas à variante de polipeptídeo, utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, acima, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (c) Várias marcas de substratos de enzima são disponíveis e a Patente Norte-Americana n° 4.275.149 fornece análise de alguns destes. A enzima geralmente catalisa alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida utilizando várias técnicas. A enzima pode catalisar, por exemplo, mudança de cor em substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. São descritas acima técnicas de quantifiicação da mudança de fluorescência. O substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por meio de reação química e pode emitir em seguida luz que pode ser medida (utilizando um quimioiluminômetro, por exemplo) ou doar energia para um receptor fluorescente. Exemplos de marcas enzimáticas incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana; Patente Norte- Americana n° 4.737.456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rabanete silvestre (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (tais como glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantino oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas de conjugação de enzimas a anticorpos são descritas em O’Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay em Methods in Enzym. (Ed. J. Langone e H. Van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, 73: 147-166 (1981).

[301] Exemplos de combinações de substrato e enzima incluem, por exemplo: (i) peroxidase de rabanete silvestre (HRPO) com peroxidase de hidrogênio como substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de tintura (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de paranitrofenila como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (tal como p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4- metilumbeliferil-β-D-galactosidase.

[302] Numerosas outras combinações de enzima e substrato são disponíveis para os técnicos no assunto. Para análise geral destes, vide as Patentes Norte-Americanas n° 4.275.149 e 4.318.980.

[303] Às vezes, a marca é conjugada indiretamente à variante de polipeptídeo. Os técnicos no assunto conhecerão vários métodos para atingir isso. A variante de polipeptídeo pode ser conjugada, por exemplo, com biotina e qualquer uma das três categorias amplas de marcas mencionadas acima pode ser conjugada com avidina ou vice-versa. Biotina liga-se seletivamente a avidina e, desta forma, a marca pode ser conjugada à variante de polipeptídeo dessa forma indireta. Alternativamente, para atingir conjugação indireta da marca com a variante de polipeptídeo, a variante de polipeptídeo é conjugada a um hapteno pequeno (tal como digoxin) e um dos tipos diferentes de marcas mencionados acima é conjugado a uma variante de polipeptídeo anti-hapteno (tal como anticorpo antidigoxin). Desta forma, pode ser atingida a conjugação indireta da marca com a variante de polipeptídeo.

[304] Em outra realização da presente invenção, a variante de anticorpo não necessita ser marcada e a sua presença pode ser detectada utilizando um anticorpo marcado que se liga à variante de polipeptídeo.

[305] A variante de polipeptídeo de acordo com a presente invenção pode ser empregada em qualquer método de teste conhecido, tal como testes de ligação competitiva, testes de sanduíche direto e indireto e testes de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987), págs. 147-158, CRC Press, Inc.

[306] A variante de anticorpo pode também ser utilizada para testes de diagnóstico in vivo. Geralmente, a variante de polipeptídeo é marcada com um radionucleto (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S), de tal forma que o antígeno ou as células que o expressam possam ser localizados utilizando imunocintiografia. Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e os exemplos não deverão ser interpretados como limitadores do escopo da presente invenção. DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID N° 1: cadeia leve capa humana. SEQ ID N° 2: cadeia leve lambda humana. SEQ ID N° 3: IgG1 humano (alótipo caucasiano). SEQ ID N° 4: IgG1 humano (alótipo afro-americano). SEQ ID N° 5: mutante LALA de IgG1 humano (alótipo caucasiano). SEQ ID N° 6: IgG4 humano. SEQ ID N° 7: mutante SPLE de IgG4 humano que representa exemplos de sequências humanas para a cadeia leve capa, cadeia leve lambda, IgG1 e IgG4, que poderão servir de base para gerar as variantes de acordo com a presente invenção.

[307] Em SEQ ID N° 3-5, a sequência de alótipos de IgG1 humanos, a região P329 de acordo com o índice EU de Kabat está localizada na posição 212, enquanto a mencionada região P329 em SEQ ID N° 6 e 7 pode ser encontrada na posição 209. SEQ ID N° 8: cadeia leve capa de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 9: cadeia pesada de IgG1 do tipo selvagem de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 10: cadeia pesada de IgG1 P329G de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 11: cadeia pesada de IgG1 LALA/P329G de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 12: cadeia pesada de IgG4 SPLE de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 13: cadeia pesada de IgG4 SPLE/P329G de mAb 40A746.2.3. SEQ ID N° 14: cadeia pesada de IgG1 LALA de mAb 40A746.2.3.

EXEMPLOS

[308] Os sete exemplos a seguir são exemplos de métodos e composições de acordo com a presente invenção. Compreende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, considerando o relatório descritivo geral fornecido acima.

[309] Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes como forma de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, as descrições e os exemplos não deverão ser interpretados como limitadores do escopo da presente invenção. As descrições de todas as literaturas científicas e patentes mencionadas no presente são expressamente incorporadas integralmente como referência.

EXEMPLO 1 ANTICORPOS

[310] Para os experimentos descritos abaixo, foram utilizados anticorpos contra CD9 (vide SEQ ID N° 8-14), P-selectina (sequências descritas em WO 2005/100402) e CD20 (sinônimo: GA101, sequências descritas em EP 1.692.182).

[311] Todas as variantes descritas no presente, tais como anticorpo de ligação glicoelaborado por P329G, P329A, P329R SPLE, LALA, P329G/LALA, variantes P329G/SPLE da selectina, CD9, CD20 (GA101) e CD20 (GA101) (numeração de acordo com a nomenclatura EU) foram geradas utilizando mutagênese com base em PCR. Moléculas de IgG foram expressas no sistema HEK-EBNA ou HEK293 (variantes Fc de CD9) e purificadas utilizando cromatografia de exclusão de tamanhos e proteína A.

EXEMPLO 2 DETERMINAÇÃO DAS AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE DIFERENTES RECEPTORES Fcr A IMUNOGLOBULINAS

[312] As afinidades de ligação de diferentes FCYR2 para imunoglobulinas foram medidas por meio de Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) utilizando um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

[313] O sistema BIAcore® é bem estabelecido para estudo das interações moleculares. Ele permite monitoramento em tempo real contínuo de ligações entre ligantes e analíticos e, portanto, a determinação de constantes da velocidade de associação (ka), constantes da velocidade de dissociação (kd) e constantes de equilíbrio (KD). Alterações do índice de refração indicam alterações de massa sobre a superfície causadas pela interação de ligante imobilizado com analítico injetado em solução. Caso as moléculas liguem ligantes imobilizados sobre a superfície, a massa aumenta; em caso de dissociação, a massa diminui.

[314] Para interação 1:1, não deverá ser observada nenhuma diferença nos resultados se uma molécula de ligação for injetada sobre a superfície ou imobilizada sobre uma superfície. Foram utilizadas, portanto, configurações diferentes (com receptor FCY como ligante ou analítico, respectivamente), dependendo da solubilidade e da disponibilidade de ligante ou analítico correspondente.

[315] Para FCYRI, dez mil unidades de ressonância (RU) de um sistema de captura que reconhece uma sequência de póli-histidina (anticorpo monoclonal pentaHis, Qiagen Hilden, cat. n° 34660) foram imobilizadas pelo uso de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare e um chip CM5 sob pH 4,5. FCYRI foi capturado sob concentração de 5 μg/ml com pulso de sessenta segundos em fluxo de 5 μl/min. Diferentes concentrações de anticorpos que variam de 0 a 100 nM foram passadas com velocidade de fluxo de 30 μl/min através das células de fluxo a 298 K por 120 segundos para registrar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada por até 240 segundos e acionada por meio de comutação da solução de amostra para tampão corrente. A superfície foi regenerada por meio de lavagem por dois minutos com uma solução de glicina sob pH 2 em velocidade de fluxo de 30 ml/min. Para todos os experimentos, foi selecionado tampão HBS-P+ fornecido pela GE Healthcare (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) de Tensoativo P20). Grandes diferenças do índice de refração foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida de uma superfície sem FcyRI capturado. Injeções de placebo também são subtraídas (= referência dupla).

[316] A constante de dissociação de equilírio (KD), definida como ka/kd, foi determinada por meio de análise das curvas de sensograma obtidas com diversas concentrações diferentes, utilizando pacote de software de avaliação BIA. A adequação dos dados seguiu um modelo de ligação apropriado.

[317] Para FcyRIIA e FcyRIIIAV158, dez mil unidades de ressonância (RU) de um anticorpo monoclonal a ser testado foram imobilizadas sobre uma placa CM5 utilizando um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE (pH 4,5 sob concentração de 10 μg/ml).

[318] Diferentes concentrações de FcyRIIA e IIIA que variam de 0 a 12800 nM foram passadas com velocidade de fluxo de 5 μl/min através das células de fluxo a 298 K por 120 segundos para registrar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada por até 240 segundos e acionada por meio de comutação da solução de amostra para tampão corrente. A superfície foi regenerada por meio de lavagem por meio minuto com uma solução de 3 mM de NaOH e 1 M de NaCl em velocidade de fluxo de 30 ml/min. Para todos os experimentos, foi selecionado tampão HBS-P+ fornecido pela GE Healthcare (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) de Tensoativo P20).

[319] Grandes diferenças do índice de refração foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida de uma superfície sem anticorpo capturado. Injeções de placebo também são subtraídas (= referência dupla).

[320] A constante de dissociação de equilírio (KD) foi determinada por meio de análise das curvas de sensograma obtidas com diversas concentrações diferentes, utilizando pacote de software de avaliação BIA. A adequação dos dados seguiu um modelo de ligação apropriado utilizando adequação em estado estável.

[321] Para FCYRIIB, dez mil unidades de ressonância (RU) de um sistema de captura que reconhece uma sequência de póli-histidina (anticorpo monoclonal pentaHis, Qiagen Hilden, cat. n° 34660) foram imobilizadas pelo uso de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare e um chip CM5 sob pH 4,5. FCYRIIB foi capturado sob concentração de 5 μg/ml com pulso de 120 segundos em fluxo de 5 μl/min. Diferentes anticorpos foram passados em concentração de 1340 nM com velocidade de fluxo de 5 μl/min através das células de fluxo a 298 K por sessenta segundos para registrar a fase de associação. A fase de dissociação foi monitorada por até 120 segundos e acionada por meio de comutação da solução de amostra para tampão corrente. A superfície foi regenerada por meio de lavagem por meio minuto com uma solução de glicina sob pH 2,5 em velocidade de fluxo de 30 ml/min. Para todos os experimentos, foi selecionado tampão HBS-P+ fornecido pela GE Healthcare (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) de Tensoativo P20).

[322] Grandes diferenças do índice de refração foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida de uma superfície sem FcyRIIB capturado. Injeções de placebo também são subtraídas (= referência dupla).

[323] Devido à afinidade intrínseca muito baixa de FCYRIIB a IgG1 do tipo selvagem, nenhuma afinidade foi calculada, mas foi determinada ligação qualitativa.

[324] As tabelas a seguir resumem os efeitos da introdução de mutação na parte Fc sobre a ligação a FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB e FCYRIIIAV1-58 (A), bem como o efeito sobre ADCC (medido sem (BLT) e com células alvo (ADCC)) e sobre a ligação de C1q (B). TABELA 2A

TABELA 2B

-fortemente reduzido/inativo em comparação com wt; - reduzido em comparação com wt; + comparável com a interação com wt; n. d. não determinado; / sem resultado

[325] Foram obtidos, com mais detalhes, os resultados a seguir:

AFINIDADE PARA O RECEPTOR FcrRI

[326] Mutações P329G, P329A, SPLE e LALA foram introduzidas no polipeptídeo Fc de uma P-selectina, anticorpo CD20 e CD9 e a afinidade de ligação para FCYRI foi medida com o sistema Biacore. Embora o anticorpo com a mutação P329G ainda se ligue a FCYRI (Fig. 1a e 1b), a introdução de mutações triplas P329G/LALA e P329G/SPLE, respectivamente, resultou em anticorpos para os quais quase nenhuma ligação pôde ser detectada (Fig. 1b). As mutações LALA ou SPLE reduziram mais a ligação ao receptor que P329G isolado, mas menos que em combinação com P329G (Figs. 1a e 1b). Desta forma, a combinação de P329G com mutações LALA ou SPLE é muito mais eficaz que a mutação P329G das mutações duplas LALA ou SPLE isoladas. O valor kd para o anticorpo do tipo selvagem IgG1 CD20 foi de 4,6 nM e, para o mutante P329G do mesmo anticorpo, 5,7 nM, mas, para o mutante triplo P329G/LALA, nenhum valor kd pôde ser determinado devido à ligação quase indetectável do anticorpo ao receptor FcyRI. O próprio anticorpo, ou seja, se CD9, CD20 ou P-selectina foi testado, possui efeito menor sobre as afinidades de ligação.

AFINIDADE PARA O RECEPTOR FcrRIlA

[327] Mutações P329G, SPLE e LALA, respectivamente, foram introduzidas no polipeptídeo Fc do anticorpo CD9 e a afinidade de ligação para o receptor FcyRIIA-R131 foi medida com o sistema Biacore. O nível de ligação é normalizado; mAb capturado, por exemplo, representa 100 RU. Desta forma, não mais de cerca de 20 RU são esperadas para estequiometria 1:1. A Fig. 1c demonstra que a ligação ao receptor FcyRIIA é fortemente reduzida por meio da introdução da mutação LALA, SPLE/P329G, P329G e LALA/P329G na variante Fc. Ao contrário da ligação ao receptor FCYRI , a introdução da mutação P329G isolada pode bloquear muito fortemente a ligação ao mencionado receptor, mais ou menos até um ponto similar à mutação tripla P329G/LALA (Fig. 1c).

AFINIDADE PARA O RECEPTOR FcrRIIB

[328] Mutações SPLE, LALA, SPLE/P329G e LALA/P329G, respectivamente, foram introduzidas no polipeptídeo Fc do anticorpo CD9 e P- selectina e a afinidade de ligação para o receptor FcyRIIB foi medida com o sistema Biacore. A Fig. 1d demonstra que a ligação ao receptor FcyRIIB é fortemente reduzida em LALA e mutantes triplos P329G/LALA, P329G/SPLE.

AFINIDADE PARA O RECEPTOR FcrRIIIA

[329] Mutações P329G, LALA, SPLE, P329G/LALA e SPLE/P329G foram introduzidas no polipeptídeo Fc do CD9 e a afinidade de ligação para o receptor FcyRIIA-V158 foi medida com o sistema Biacore. A mutação P329G e a mutação tripla P329G/LALA reduziram a ligação ao receptor FcyRIIIA mais fortemente até níveis quase indetectáveis. P329G/SPLE também geram afinidade de ligação fortemente reduzida, as mutações SPLE e LALA, respectivamente, reduziram apenas fortemente a afinidade de ligação ao receptor de FcyRIIIA (Fig. 1e).

EXEMPLO 3 ELISA C1Q

[330] As propriedades de ligação dos diferentes polipeptídeos que compreendem variantes de Fc para C1q foram analisadas por meio de imunoteste do tipo sanduíche ELISA. Cada variante é acoplada a uma placa com 96 cavidades Maxisorp hidrofóbica em oito concentrações de 10 μg/ml a 0 μg/ml. Este acoplamento simula complexos de anticorpos, o que é um requisito prévio para ligação de alta afinidade da molécula C1q. Após lavagem, as amostras são incubadas para permitir a ligação de C1q. Após lavagem adicional, a molécula de C1q ligada é detectada por um anticorpo anti-hC1q de coelho policlonal. Após a etapa de lavagem seguinte, adiciona-se um anticorpo específico anti-FcY de coelho marcado com enzimas. A resposta imunológica torna-se visível por meio da adição de um substrato que é convertido em um produto colorido pela enzima. A absorção resultante, medida fotometricamente, é proporcional à quantidade de C1q ligada ao anticorpo a ser pesquisado. Foram calculados valores EC50 da interação entre variante e C1q. As unidades de absorção resultantes da reação corante são plotadas contra a concentração do anticorpo. A concentração de anticorpos na metade da resposta máxima determina o valor EC50. Esta leitura é relatada como a diferença relativa com o padrão de referência medido sobre a mesma placa em conjunto com o coeficiente de variação de amostra e referência.

[331] A mutação P329G introduzida na P-selectina ou anticorpo CD20 reduziu fortemente a ligação a C1q, similar à mutação SPLE (Fig. 2). A Tabela 3 resume os valores EC50 calculados para ligação das variantes ao receptor C1q. C1q pertence às proteínas de ativação de complemento e desempenha papel importante na ativação do processo clássico do complemento, que gera a formação do complexo de ataque de membrana. C1q também está envolvido em outros processos imunológicos tais como o aumento da fagocitose, liberação de células apoptóticas ou neutralização de vírus. Pode- se, portanto, esperar que os mutantes exibidos no presente reduzam a ligação a C1q, tais como P329G e SPLE, e também é muito provável que as mutações triplas que compreendem as mutações isoladas mencionadas acima reduzam fortemente as funções de C1q mencionadas acima. TABELA 3

EXEMPLO 4 ADCC SEM CÉLULAS ALVO, TESTE BLT

[332] Os anticorpos a serem testados (CD20 (GA101) e CD9) foram revestidos em PBS por uma noite a 4 °C em placas com 96 cavidades com fundo plano. Após lavagem da placa com PBS, os locais de ligação restantes foram bloqueados com PBS/solução de BSA a 1% por uma hora à temperatura ambiente. Enquanto isso, foram colhidas células efetoras (linhagem de células NK-92 transfectada para expresar FCYRIII humano com alta ou baixa afinidade) e 200.000 células vivas/cavidade foram semeadas em 100 μl/cavidade de meio AIM V nas cavidades após o descarte do tampão de bloqueio. 100 μl/cavidade de tampão saponina (0,5% de saponina + 1% BSA em PBS) foram utilizados para determinar a liberação máxima de esterase pelas células efetoras. As células foram incubadas por três horas a 37 °C em 5% de CO2 em um incubador. Após três horas, 20 μl/cavidade dos sobrenadantes foram misturados com 180 μl/cavidade de substrato BLT (0,2 mM de BLT + 0,11 mM de DTNB em 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0) e incubados por trinta minutos a 37 °C antes da leitura da placa a 405 nm em um leitor de microplacas. O percentual de liberação de esterase foi determinado definindo-se a liberação máxima (células tratadas com saponina) a 100% e as células não estimuladas (sem revestimento de ab) em liberação de 0%.

[333] O anticorpo CD20 do tipo selvagem (GA101 wt (1)) exibe forte indução da atividade citolítica. A variante LALA exibe notável redução da liberação de esterase, enquanto P329G e a variante P329G/LALA não exibem nenhuma atividade de ADCC (Fig. 3a). A Fig. 3b demonstra que não apenas uma troca de G na posição P329 gera atividade citosólica notadamente reduzida, mas também troca de P329 por R329 (anticorpo CD20). Desta forma, arginina aparentemente destrói a função do sanduíche de prolina no anticorpo, de forma similar a glicina. O ADCC fortemente reduzido observado no presente para o mutante P329G mais provavelmente resultou da ligação fortemente reduzida ao receptor de FCYRIIA e FCYRIIIA (vide a Fig. 1c e a Fig. 1e).

EXEMPLO 5 ADCC COM CÉLULAS ALVO

[334] Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram utilizadas como células efetoras e preparadas utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis MO 63178, Estados Unidos), seguindo essencialmente as instruções do fabricante. Resumidamente, sangue venoso foi retirado com seringas heparinizadas de voluntários. O sangue foi diluído a 1:0,75-1,3 com PBS (sem conter Ca++ ou Mg++) e depositado em camadas sobre Histopaque-1077. O gradiente foi centrifugado a 400 x g por trinta minutos à temperatura ambiente (RT) sem interrupções. A interfase contendo PBMC foi coletada, lavada com PBS (50 ml por células de dois gradientes) e colhida por meio de centrifugação a 300 x g por dez minutos à temperatura ambiente. Após nova suspensão da pelota com PBS, as PBMCs foram contadas e lavadas por segunda vez por meio de centrifugação a 200 x g por dez minutos à temperatura ambiente. As células foram novamente suspensas no meio apropriado para os procedimentos subsequentes. A razão entre efetor e alvo utilizada para os testes de ADCC foi de 25:1 e 10:1 para PBMC e células NK, respectivamente. As células efetoras foram preparadas em meio AIM-V na concentração apropriada a fim de adicionar 50 ml por cavidade de placas com 96 cavidades com fundo abaulado. As células alvo foram células de linfoma B humano (tais como células Raji) cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS. Células alvo foram lavadas em PBS, contadas e novamente suspensas em AIM- V a 0,3 milhões por ml, a fim de adicionar 30.000 células em 100 ml por microcavidade. Anticorpos foram diluídos em AIM-V, adicionados em 50 ml às células alvo previamente colocadas em placas e mantidas para ligar-se aos alvos por dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células efetoras foram adicionadas e a placa foi incubada por quatro horas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. A morte de células alvo foi determinada pela medição da liberação de desidrogenase de lactato (LDH) a partir de células danificadas utilizando o kit de Detecção da Citotoxicidade (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça). Após a incubação por quatro horas, as placas foram centrifugadas a 800 x g. 100 ml de sobrenadante de cada cavidade foram transferidos para uma nova placa com 96 cavidades com fundo plano transparente. 100 ml de tampão com substrato colorido do kit foram adicionados por cavidade. Os valores Vmax da reação colorida foram determinados em um leitor ELISA a 490 nm por pelo menos dez minutos utilizando software SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale CA 94089, Estados Unidos). A liberação de LDH espontânea foi medida a partir de cavidades contendo apenas células alvo e efetoras, mas não anticorpos. A liberação máxima foi determinada a partir de cavidades que contêm apenas células alvo e 1% de Triton X-100. O percentual de morte mediada por anticorpo específico foi calculado conforme segue: ((x - SR)/(MR - SR)x100, em que x é a média de Vmax em concentração específica de anticorpo, SR é a média de Vmax da liberação espontânea e MR é a média de Vmax da liberação máxima.

[335] A potência para recrutar células efetoras imunes depende do tipo de variante de Fc, conforme medido por meio de teste ADCC clássico. Neste ponto, linhagem de células NK92 humanas transfectada com FcgRIIIA foi utilizada como efetora e células Raji positivas para CD20 foram utilizadas como células alvo. Como se pode observar na Fig. 4a, o ADCC é fortemente reduzido em variantes Fc GA101 (CD20), em que glicina substitui prolina (P329G) e também, até ponto similar, no mutante duplo P329G/LALA. Por outro lado, a redução de ADCC foi menos forte com a mutação de LALA. A fim de melhor diferenciar entre as diferentes variantes, as variantes também foram produzidas na versão glicoelaborada para aumentar o potencial de ADCC. Pode-se observar que a molécula parental (GA101 (CD20)) exibe forte ADCC, conforme esperado. A versão LALA é fortemente impedida no seu potencial de ADCC. O mutante P329G reduziu muito fortemente ADCC; muito mais que uma variante de P329A do anticorpo GA101 (CD20) (Fig. 4b).

EXEMPLO 6 ATIVIDADE DE COMPLEMENTO

[336] Células alvo foram contadas, lavadas em PBS e novamente suspensas em AIM-V (Invitrogen) a um milhão de células por ml. 50 ml de células foram colocados em placas por cavidade em uma placa com 96 cavidades com fundo plano. Diluições de anticorpos foram preparadas em AIM-V e adicionadas em 50 ml às células. Anticorpos foram mantidos em ligação às células por dez minutos à temperatura ambiente. Complemento de soro humano (Quidel) foi recém descongelado, diluído por três vezes com AIM-V e adicionado em 50 ml às cavidades. Complemento de coelho (Cedarlane Laboratories) foi preparado conforme descrito pelo fabricante, diluído por três vezes com AIM-V e adicionado em 50 ml às cavidades. Como controle, fontes de complemento foram aquecidas por trinta minutos a 56 °C antes da adição ao teste. As placas foram incubadas por duas horas a 37 °C. A morte das células foi determinada por meio de medição da liberação de LDH. Resumidamente, as placas foram centrifugadas a 300 x g por três minutos. 50 ml de sobrenadante por cavidade foram transferidos para uma nova placa com 96 cavidades e foram adicionados 50 ml do reagente de teste do Kit de Citotoxicidade (Roche). Medição cinética com o leitor ELISA determinou o Vmax correspondente com a concentração de LDH no sobrenadante. A liberação máxima foi determinada por meio de incubação das células na presença de Triton X-100 a 1%.

[337] As diferentes variantes Fc foram analisadas para mediar CDC sobre células alvo SUDH-L4. A molécula GA101 não glicoelaborada exibe clara indução de CDC. A variante LALA exibe atividade apenas na concentração mais alta, enquanto as variantes P329G e P329G/LALA não exibem atividade de CDC (Fig. 5a). Além disso, a variante LALA, bem como as variantes P329G e P329A de uma molécula GA101 glicoelaborada, não exibem nenhuma atividade de CDC (Fig. 5b).

EXEMPLO 7 PERFIL DE CARBOIDRATOS DE IGG1 HUMANO

[338] Os perfis de carboidratos de anticorpos IgG1 humanos contendo mutações dentro de Fc, destinados a eliminar a ligação a receptores FCY, foram analisados por meio de MALDI/TOF-MS em modo de íons positivos (oligossacarídeos neutros).

[339] Variantes de IgG1 humanas (h) foram tratadas com sialidase (QA-Bio) seguindo as instruções do fabricante para remover ácido siálico terminal. Os oligossacarídeos neutros de hIgG1 foram liberados em seguida por meio de digestão de PNGase F (QA-Bio) conforme descrito anteriormente (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861). Os perfis de carboidrato foram analisados por meio de espectrometria de massa (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH) em modo de íons positivos conforme descrito anteriormente (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861).

[340] O perfil de carboidratos dos glicanos associados a Fc neutro de IgG1 humano é caracterizado por três picos m/z importantes, que podem ser atribuídos a oligossacarídeo complexo fucosilado com nenhum (G0), um (G1) ou dois (G2) resíduos de galactose terminais.

[341] Os perfis de carboidrato de hIgG1 que contém mutações dentro do Fc, destinadas a eliminar a ligação a receptores Fc, foram analisados e comparados com os obtidos para o anticorpo do tipo selvagem. As variantes de IgG que contêm uma das mutações dentro do Fc (P329G, LALA, P329, P329G/LALA) exibem perfis de carboidrato similares ao anticorpo do tipo selvagem, em que os glicanos associados a Fc são oligossacarídeos complexos fucosilados (dados não exibidos). Mutação dentro do Fc pode afetar o nível de galactosilação terminal e sialilação terminal, conforme observado pela substituição de aminoácidos nas posições 241, 243, 263, 265 ou 301 por alanina (Lund, J. et al., J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969).

[342] A Figura 6a exibe o percentual relativo de galactosilação para as diferentes variantes Fc hIgG1 descritas no presente. Leves variações podem ser observadas quando os anticorpos são expressos em um hospedeiro diferente, mas nenhuma diferença significativa de galactosilação terminal pôde ser observada.

[343] A Figura 6b indica a variabilidade do teor de galactosilação para IgG1-P329G/LALA e tipo selvagem para quatro anticorpos diferentes, em que quatro domínios V diferentes foram comparados para determinar a sua quantidade de galactosilação quando expressa em células EBNA Hek293.

EXEMPLO 8 AGREGAÇÃO DE PLAQUETAS INDUZIDA POR ANTICORPOS EM EXAME DE SANGUE INTEGRAL

[344] Análise da agregação de plaquetas de sangue integral utilizando o instrumento Multiplate da Dynabyte. Em primeiro lugar, 20 ml de sangue de doadores humanos normais são retirados e transferidos para tubos de hiruidina (Dynabyte Medical, n° MP0601). Utilizou-se dispositivo de impedância minicelular de batoques (Dynabead n° MP0021) no intrumento Multiplate para o teste. Em seguida, foram adicionados 175 μl de NaCl a 0,9% à minicélula. Adicionou-se anticorpo à minicélula para obter a concentração final de teste. Em seguida, 175 μl de sangue humano foram adicionados e incubados por três minutos a 37 °C. Início automático da análise de impedância por seis minutos adicionais a 37 °C. Os dados foram analisados por meio da quantificação de área sob a curva como medida da agregação de plaquetas.

[345] Demonstrou-se que o anticorpo CD9 induz a ativação de plaquetas e agregação de plaquetas (Worthington et al., Br. J. Hematol. 74(2) (1990) 216-222). Demonstrou-se anteriormente que a agregação de plaquetas induzida por anticorpos que se ligam a plaquetas envolve a ligação a FCYRIIA (de Reys et al., Blood 81 (1993) 1792-1800). Conforme demonstrado acima, as mutações LALA, P329G, P329G/LALA e P329G/SPLE introduzidas no anticorpo CD9 reduziram fortemente a ligação do anticorpo CD9 ao receptor FCYRIIA (Fig. 1c).

[346] A ativação (medida por efluxo de Ca, dados não exibidos), bem como agregação de plaquetas induzida por um anticorpo CD9, foi eliminada por meio de introdução da mutação tripla P329G e LALA no anticorpo, de tal forma que a ligação de FcyRIIA seja fortemente reduzida em comparação com o anticorpo do tipo selvagem (vide as Figs. 7a e 7b). IgG1 murino induziu a agregação de plaquetas em baixas concentrações de anticorpos (0,1 a 1 μ/ml). Em concentrações mais altas, o estímulo excessivo de plaquetas gera o silenciamento da reação de agregação (3-30 μg/ml). Observou-se variabilidade de doadores com chim-hu-IgG4-SPLE. Na Fig. 6a, são exibidos dados para uma reação de chim-hu-IgG4-SPLE em concentrações de anticorpo mais altas e, na Fig. 6b, dados para um não reagente chim-hu-IgG4-SPLE. Nenhuma das amostras de sangue demonstrou reação de agregação com as variantes de anticorpos chim-hu-IgG1-LALA, chim-hu-IgG-WT-P329G, chim-hu-IgG1-LALA- P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-P329G e chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q. Controles: agregação espontânea em amostra de sangue não tratada (fundo); agregação de plaquetas induzidas por ADP (ADP) e induzidas por análogo de trombina (TRAP6). Controle de isótipos: IgG1 murino (isótipo murino) e IgG4-SPLE humano (isótipo hu-IgG4-SPLE).

[347] Uma interpretação possível desses dados é o fato de que a redução da ligação do anticorpo CD9 com as mutações triplas ao receptor FCYRIIA é a razão da agregação de plaquetas reduzida observada com este tipo de anticorpos mutantes. Em princípio, a prevenção da agregação de trombócitos, como efeito colateral tóxico de um tratamento com anticorpos, poderá, portanto, ser possível por meio da introdução das mutações mencionadas acima, capazes de reduzir a ligação ao receptor de FcyRIIA, na parte Fc de um anticorpo.

Claims (5)

1. ANTICORPO, ou uma proteína de fusão FC, caracterizado por compreender uma variante Fc de uma região Fc de IgG1 humano do tipo selvagem, em que a variante Fc de uma região Fc de IgG1 humano do tipo selvagem contém substituição de aminoácidos P329G, L234A e L235A, em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU de Kabat.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo anti-CD9, em que a região Fc do tipo selvagem compreende como região variável de cadeia pesada SEQ ID N° 9 e como região de cadeia leve variável SEQ ID N° 8.

3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser usado como medicamento.

4. ANTICORPO, de acordo a reivindicação 3, caracterizado por ser usado como um medicamento para o tratamento de uma doença, em que é favorável que a função efetora do anticorpo ou proteína de fusão Fc seja fortemente reduzida em comparação com a função efetora induzida pelo anticorpo ou proteína de fusão Fc compreeedendo a região Fc de IgG humano do tipo selvagem.

5. USO DE UM ANTICORPO, ou proteína de fusão Fc, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo, em que a doença é selecionada de câncer, diabetes e asma.

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