JP2022508529A - 二重標的抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、二重標的抗原結合分子、二重標的抗原結合分子を含む医薬組成物、および疾患の治療における使用に関する。さらに、本発明は、二重標的抗原結合分子を生成する方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、二重標的抗原結合分子、二重標的抗原結合分子を含む医薬組成物、および疾患の治療における使用に関する。さらに、本発明は、二重標的抗原結合分子を生成する方法にも関する。
二重標的抗原結合分子は、二種類の異なる抗原、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３分子と癌細胞の腫瘍特異的抗原を標的とし、癌治療に大きな期待を寄せている。これらの分子の中には、市場に投入されたものがある。しかし、今まで、これらの二重特異性抗体の治療効果は期待されるほど満足のいくものではない。実例として、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ，ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性抗体、オフターゲットＡＤＣＣ効果に起因する重大な副作用のため、市場から撤回された）が挙げられる。別の例として、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ，ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）は半減期が短く、投与方法も不便であるため、この薬剤を患者に投与することに対する熱意はひどく打撃を受けている。本発明の目的は、このような問題を克服する新世代の二重標的抗原結合分子を開発することである。
本発明は、一方では標的細胞に対する結合および減弱の良好な効果を示し、他方ではＦｃを介した副作用が低減された通常のＩｇＧ薬物動態（例えば、長い血漿半減期）を示す、新世代の二重標的抗原結合分子に関する。本発明により提供されるこのような分子は、二重標的抗原結合分子に対する臨床的ニーズをある程度満たす。
具体的には、一局面において、本発明により提供されるのは、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子であり、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じ標的細胞抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、同じ標的細胞抗原の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、標的細胞抗原の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じ抗体に由来する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、同じ標的細胞抗原に結合する異なる抗体に由来する。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までに重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までに軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。好ましい実施形態では、前記二重標的抗原結合分子は、安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端またはｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に融合した第１のＦａｂを含み、前記ｓｃＦｖのＣ末端は、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのいずれか一つに連結され、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのもう一つのサブユニットに融合した第２のＦａｂを含む。特定の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に融合し、または、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端に融合する。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＣ末端またはｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合する第１のＦａｂを含み、第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端は、Ｆｃの第１及び第２のサブユニットのいずれか一つに連結され、しかも第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのもう一つのサブユニットに融合する第２のＦａｂを含む。特定の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合し、または、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端に融合する。
一部の実施形態では、本発明に係る二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる抗原結合部を一つのみ含む。
上記いずれかの実施形態によって、本発明の二重標的抗原結合分子の成分、例えば、第１の抗原結合部、第２の抗原結合部、ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）、Ｆｃドメインは、直接に融合する（例えば、末端カルボキシル基とアミノ基によって形成されるペプチド結合を介して）か、本分野で既知の様々なリンカー、特に一つまたは複数のアミノ酸、通常は約２～２０のアミノ酸、を含むペプチドリンカーを介して融合することができる。適宜に、非免疫源性ペプチドリンカーは、例えば、（ＧｘＳｙ）ｎを含み、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。具体的な実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖのＣ末端に融合する、あるいはＦａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖのＮ末端に融合する（一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介して）第１のＦａｂを含み、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。具体的な実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）は、一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、前記第１及び／または第２の抗原結合部は、ヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を介してＦｃドメインに連結される。一部の実施形態では、前記第１及び／または第２の抗原結合部は、一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介してＦｃドメインに連結し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記ＦｃドメインはヒトＩｇＧ Ｆｃドメインであり、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインである。一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、前記Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの接合を促進する一つまたは複数の修飾を含む。好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって前記サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて一つの突起が生成され、前記Ｆｃドメインのその他のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて一つの窪みが生成され、前記突起は前記窪みに突出することができる。好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換される。より好ましい実施形態では、Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７から選択される一つまたは複数の残基は、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基により置換される。さらに好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインは一つのサブユニットにおいてＴ３６６Ｗ置換基を含み、Ｆｃドメインのその他のサブユニットにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ置換基を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、（天然のＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して）Ｆｃ受容体への結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある。より好ましくは、各Ｆｃドメインのサブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとの二つの、アミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であり、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子は、ＩｇＧのＳ２２８サイトにあるアミノ酸置換を含み、好ましくは、Ｓ２２８サイトにあるアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂとは、両方とも抗ＣＤ２０Ｆａｂである。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、第１のＦａｂと第２のＦａｂおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦＶを含み、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、両方ともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を含み、もしくは前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一局面において、本発明は、ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端に融合し、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６サイトのより大きい側鎖を有するアミノ酸置換を含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７サイトの、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、二重標的抗原結合分子に係る。
好ましい実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、Ｆｃドメインは第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む。より好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。さらに好ましい実施形態では、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある。最も好ましい実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換、すなわち、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとを含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子はさらに、ＩｇＧ４のＳ２２８、好ましくはＳ２２８Ｐ、のサイトにあるアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎを介してＦａｂ重鎖に融合し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
当業者は、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との間に一つのリンカーがあってもよく、後者は、本発明による二重標的抗原結合分子に含まれることを理解するであろう。前記リンカーはペプチドリンカーであってもよく、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
一局面において、本発明はさらに、ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６サイトのより大きい側鎖を有するアミノ酸置換を含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７サイトの、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは、Ｆｃドメインは第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含み、より好ましくは、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含み、さらに好ましくは、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９基からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにあり、最も好ましくは、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換、すなわち、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとを含む、二重標的抗原結合分子に係る。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、ＩｇＧ４のＳ２２８、好ましくはＳ２２８Ｐ、のサイトにあるアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎを介してＦａｂ重鎖に融合し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、ヘテロ二量体の形成を促進する一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている。好ましくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋのアミノ酸変異を含み、前記第２のサブユニットは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅのアミノ酸変異を含む。より好ましくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄのアミノ酸変異を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）のアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される一つである。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記標的細胞抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。好ましくは、前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択される一つである。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体、またはＴ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる抗体フラグメントである。
一局面において、本開示は、（本発明の二重標的抗原結合分子をコードする）単離されたポリヌクレオチド、（前記単離されたポリヌクレオチドによってコードされた）ポリペプチド、（前記単離されたポリヌクレオチドを含む）ベクター、または（前記単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む）宿主細胞に係る。
一局面において、本開示は、ａ）前記二重標的抗原結合分子の発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、ｂ）前記二重標的抗原結合分子を回収する工程とを含む、本発明による二重標的抗原結合分子を製造する方法に係る。また、本発明は、本発明の方法により生成された二重標的抗原結合分子にも拡張されている。
一局面において、本開示は、本発明による二重標的抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。本発明は、容器内にある前記二重標的抗原結合分子または本発明による医薬組成物、および、前記二重標的抗原結合分子の使用方法に関するプロトコルを含む製品またはキットを包含する。
一局面において、本開示はさらに、本発明による二重標的抗原結合分子または医薬組成物の使用、例えば、異なる種類の癌の治療のための使用を披露する。
一局面において、本発明が対象とする主題は、それを必要とする個体の疾患に対する薬剤の調製における前記二重標的抗原結合分子の使用をさらに含む。
一局面において、本発明は、治療有効量の、本発明による前記二重標的抗原結合分子または前記医薬組成物を前記個体に投与することを含む、個体の疾患（特に癌）を治療する方法に係る。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞の存在下で標的細胞を前記二重標的抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の細胞溶解を誘導する方法に係る。
上記実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は好ましくは、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体またはそのフラグメント（Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる）である。前記細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、およびＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される一つであってもよい。前記標的細胞抗原は、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。好ましくは、前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択される一つである。
図１Ａ－Ｂは、前記二重特異性抗体（ＴＲＡＢ）構造の設計図である。前記二重特異性抗体は、（Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる）第１の抗体結合部と、（標的細胞抗原ＴＳＡまたはＴＡＡに特異的に結合できる）第２の抗体結合部と、第１と第２のサブユニットからなるＦｃドメインとを含み、第１の抗原結合部はｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部は第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。説明のために、前記設計図では、Ｔ細胞活性化抗原の実例としてＣＤ３を使用し、ＴＡＡを標的細胞抗原としている。図示された二重特異性抗体は、ＴＡＡ×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭとＳｏｍＢｏｄｙＴＭと命名されている。 図２Ａ－Ｂは、分子Ａと分子Ｂ ＣＤ２０×ＣＤ３（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ融合タンパク質の構造を示す図である。 図３Ａ－Ｂは、二つのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢの構造を示す図である。 図４Ａ－Ｂは、分子Ｃと分子Ｄ ＣＤ２０×ＣＤ３（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ融合タンパク質の構造を示す図である。 図５Ａ－Ｂは、二つのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢの構造を示す図である。 図６は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢを作成するために構築されたプラスミドの概略図である。 図７Ａ－Ｂは、プロテインＡ精製後のテスト対象のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図８は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図９は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１０は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－ＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１１は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－ＤのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１２Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す図である。 図１３Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ分析を示す図である。 図１４Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＲ－ＣＥ－ＳＤＳ分析を示す図である。 図１５は、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１６は、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１７は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１８は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１９は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭによりリダイレクトされたＴ細胞（ヒトＰＢＭＣ細胞由来）がヒトリンパ系Ｂ細胞株Ｄａｕｌｉを濃度依存的に溶解することを示す図である。 図２０Ａ－Ｄは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭを使用した初期および後期Ｔ細胞活性化を示す図である。 図２１は、ｉｎ ｖｉｖоＢ細胞枯渇試験の投与およびサンプリング収集の概略図である。 図２２は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ１９＋Ｂ細胞枯渇（減弱）率（％）を示す図である。 図２３は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）の変化を示す図である。 図２４は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）の変化を示す図である。 図２５は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａの全分子量の質量分析を示す図である。 図２６は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ軽鎖の分子量の質量分析を示す図である。 図２７Ａ－Ｂは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ重鎖１及び重鎖２の分子量の質量分析を示す図である。
本発明は二重標的抗原結合分子に係り、特に、二つの異なる抗原結合成分を含む二重特異性Ｔ細胞リダイレクト抗体（ＴＲＡＢ）に係り、一つはＴ細胞活性化抗原に特異的に結合するためのものであり、もう一つは、標的細胞抗原、例えば、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するためのものである。Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合することにより、二重特異性分子（抗体）は、癌細胞を含む標的細胞が位置するサイトにＴ細胞をリダイレクトし、標的細胞は、活性化されたＴ細胞及び／またはその他のエフェクター細胞により破壊される（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して）。
定義
本発明で使用されるように、「二重標的抗原結合分子」とは、当該分子がＴ細胞活性化抗原を標的化および結合することができるだけではなく、標的細胞抗原を標的化および結合することもできることをいう。二重標的抗原結合分子は例えば、抗体、抗体フラグメント、およびＣＤ３分子やＴＳＡまたはＴＡＡ抗原などの抗原を二重に標的化して結合するポリペプチドを含む。該分子は、ＣＤＲドメイン、可変領域、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメント及び／またはＦｃドメインなど、組み立てられた抗体または抗体に由来する異なる部分から組み立てられた高分子ポリペプチドとして表すことができる。組み立てられた抗体とポリペプチドは、ＣＤ３分子やＴＳＡまたはＴＡＡ抗原に特異的に結合する。
本発明の用語の「抗体（Ａｂ）または抗体（Ａｂｓ）」は、天然抗体の構造特徴を有する抗体、及び天然抗体とは異なるが一つまたは複数の特異的抗原に対して結合特異性の構造特徴を有する抗体様分子を含む。用語の抗体とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
用語の「重鎖」、「軽鎖」、「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」）、「重鎖可変領域」（「ＶＨ」）、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）、「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ」）、「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）とは、天然に存在する免疫グロブリンにおけるドメイン及び合成した（例えば組み換えた）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体）の対応するドメインをいう。天然に存在する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本構造単位は、二つの軽鎖と二つの重鎖を持つ四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０またはより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常三つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。よって、天然に存在するＩｇＧ分子の軽鎖構造はＮ－ＶＬ－ＣＬ－Ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はＮ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ（Ｈはヒンジ領域である）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、フレームワークセグメントと呼ばれる抗原と非ＣＤＲセグメントと接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する。よって、ＶＬとＶＨドメインは、Ｎ－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－Ｃ構造を有する。
本文で使用される「二重特異性抗体」または「二重特異性抗原結合抗体」とは、二重結合特異性を有する抗体（前文で定義された通り）をいい、結合特異性の中の一つは、例えば、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１またはＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４のようなＴ細胞活性化抗原に特異的に結合するためのものであり、もう一つは、標的細胞抗原に特異的に結合するためのものであり、例えば、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）が挙げられる。
天然抗体は通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖と二つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は共有ジスルフィド結合を介して重鎖に接続され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖または軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋をさらに有する。各重鎖には、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後にいくつかの定常領域がある。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域がある。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と整列する。
天然の抗体において、変異性は抗体の可変領域全体に均等に分布しておらず、軽鎖と重鎖可変領域の中の、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変領域のより保存的な部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、三つのＣＤＲで接続される四つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域の近くで一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合サイトの形成に寄与する［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、免疫学的目的のタンパク質配列国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）参照］。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接に関与しないが、様々なエフェクター機能を示し、例えば、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する。
本文で使用される抗体は、完全な抗体分子または「抗体フラグメント」であってもよい。本文で使用される「抗体フラグメント」は、完全抗体の抗原結合サイトまたは可変領域を含む完全抗体の一部分として定義され、その部分は、定常重鎖ドメイン（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４、完全抗体のＦｃ領域の抗体アイソタイプによる）を含まない。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。
抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合サイトを持つ「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる二つの同一の抗原結合フラグメントと、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残留「Ｆｃ」フラグメントを生成する。「Ｆａｂ」フラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントとＦａｂフラグメントとの違いは、抗体ヒンジ領域からの一つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたことにある。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を指す。ペプシン消化の産物であるＦ（ａｂ’）２のヒンジシステインのジスルフィド結合を切断することにより、Ｆ（ａｂ’）フラグメントが生成される。
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識及び結合サイトを含む抗体フラグメントであり、緊密に非共有結合されている一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域の二量体からなり、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」フラグメントは、一つの単鎖ポリペプチド鎖の柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されている一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域とからなる。この構成では、重鎖と軽鎖の各可変領域の三つのＣＤＲは相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合サイトを規定する。合計六つのＣＤＲが抗体の抗原結合特異性を付与する。
本発明の一部の実施形態では、二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体を含む）は、ｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部を含み、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、後者はｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までであり、もしくは、軽鎖の可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、後者はｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までである。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、任意の抗ＣＤ３抗体、抗４－１ＢＢ抗体または抗ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４抗体に由来する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４ ｓｃＦｖであってもよい。本発明の一部の実施形態では、二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体を含む）は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖに融合する第１のＦａｂを含む第２の抗原結合部を含み、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にＦｃドメインに融合する。好ましい実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＴＳＡとＴＡＡ抗原（抗ＴＳＡ Ｆａｂまたは抗ＴＡＡ Ｆａｂ）に特異的に結合する。Ｆａｂフラグメントは、任意の抗原に対する任意抗体に由来してもよく、前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択されるものである。
本文で使用されるように、用語の「抗原結合部」とは、抗原に特異的に結合するポリペプチドをいう。本発明では、第１の抗原結合部と第２の抗原結合部は、少なくとも二つの異なる抗原に結合する。例えば、第１の抗原結合部は、Ｔ細胞活性化抗原に結合し、第２の抗原結合部は、癌細胞により発現されるタンパク質のような標的細胞抗原に結合する。構造において、抗原結合部は抗体に由来するフラグメントを含み、例えば、ペプチドリンカーを介して接続するＦａｂとｓｃＦｖフラグメントを含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体）は、第１のサブユニットと、安定的に接合できる第２のサブユニットとを含むＦｃドメインを含む。
「Ｆｃドメイン」は「Ｆｃ領域」ともいい、結晶化可能なフラグメントドメインが抗体のテール領域であり、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と補体系のいくつかのタンパク質と相互作用することを意味する。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃドメイン（領域）は二つの同一のサブユニット（第１のサブユニットと第２のサブユニット）からなり、各サブユニットは、抗体重鎖に由来するＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインからなる；ＩｇＭとＩｇＥ Ｆｃドメイン（領域）は二つの同一のサブユニット（第１のサブユニットと第２のサブユニット）からなり、各サブユニットは、抗体重鎖に由来するＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４定常ドメインからなる。Ｆｃドメインは、様々な細胞受容体と補体タンパク質に結合する。このようにして、抗体の異なる生理学的効果を媒介する。
Ｆｃドメイン（領域）は抗体重鎖のＣ末端領域に位置する。境界はわずかに異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６からカルボキシ末端まで伸びていると定義されている。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＣＨ２とＣＨ３との二つの定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインともいう）は、通常アミノ酸２３１からアミノ酸３３８まで伸び、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは通常アミノ酸３４２から４４７まで伸びる。
用語の「ヒンジ領域」は、通常ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びると定義される。最初と最後のシステイン残基を同じ位置における重鎖間ＳＳ結合を形成することにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域をＩｇＧ１配列と整列させることができる。上述のように、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４に由来し、好ましくは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの結合を促進する一つまたは複数の修飾を含み、例えば、ノブイントゥホール構造を形成することで結合を強化する。Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することにより、このようなピンホールに結合した構造を形成することができ、これによってＣＨ３ドメイン内に突起（ノブ）を形成し、さらにより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸を置換して第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞（ホール）を形成し、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの安定した接合を促進するように、突起は空洞に突出可能である。
Ｆｃドメインを変えると重鎖ヘテロ二量体の生成を促進することができ、これによって二つの異なる重鎖と軽鎖のペアを含む二重特異性抗体が生じる。ヘテロ二量体の形成を促進するために、上述のように、一対のＦｃサブユニット間の界面を設計して、例えば、ノブイントゥホール構造を導入してヘテロ二量体の割合を最大にする。これによって、アイソタイプ二量体のようなその他の望ましくない最終生成物に対するヘテロ二量体の収率を高めるためのメカニズムが提供される。ＣＨ３修飾は、例えば、一つの重鎖上のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａともう一つの重鎖上のＴ３６６Ｗ；一つの重鎖上のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗともう一つの重鎖上のＹ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含む。米国特許第７，１８３，０７６号には別の改善が記載されており、その結果、一方の鎖に突起（ノブ）と他方の鎖に空洞（ホール）が形成され、また、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１にも記載されている。ヘテロ二量体を生成するために使用できるその他の修飾は、静電的に整合したＦｃサブユニットの共発現によるヘテロ二量化をもたらすように、Ｆｃ二量体界面を貫通する電荷極性を変更するものを含むが、これらに限られていない。電荷極性を変更する修飾は、以下のものを含むが、それらに限られていない：
Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ４３９Ｄ Ｄ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ４０９Ｄ
Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｅ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｅ Ｄ３９９Ｒ
Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｒ
Ｄ３３９Ｋ Ｅ３５６Ｋ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｄ Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ
Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３６０Ｄ Ｄ３９９Ｋ。
それらはＷＯ２００７／１４７９０１や、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、２０１０、ＪＢＣ ２８５：１９６３７－４６にも開示されている。また、Ｄａｖｉｓら（２０１０、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５－２０２）は、ヒトＩｇＧとＩｇＡ ＣＨ３ドメインの誘導体である鎖交換工程化ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ドメインを使用したヘテロ二量体Ｆｃプラットフォームについて説明している（ＷＯ２００７／１１０２０５も参照）。
Ｆｃドメインのその他の修飾および／または置換および／または付加および／または欠失は、安定した接合を実現するため、および／またはヘテロ二量体の形成を促進するためであることは、当業者にとって自明である。本分野で開示されたこれらのＦｃ変異体は、本発明に開示されたＦｃドメインと組み合わせることができ、Ｆｃ変異体を開示したそれらの文献は、参照としてその全体が本出願に組み込まれる。
本文で使用するＦｃドメインの「サブユニット」とは、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドのうちの一つ、すなわち、安定的に自己接合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドをいう。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２とＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
抗体に言及する場合、各ドメインのアミノ酸の割り当ては、引用により明確に本文に組み込まれたＫａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７と１９９１）に合致する。本明細書において、ＩｇＧ重鎖の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号付けであり、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の番号付けを指す。
本文で使用されるように、用語の「癌」とは、細胞の異常、且つ制御されない成長によって引き起こされる新生物または腫瘍をいう。本文で使用されるように、癌は明確に、白血病とリンパ腫とを含む。一部の実施形態では、癌とは、局部の良性腫瘍をいう。その他の実施形態では、癌とは、隣接する身体構造に侵入して破壊し、遠隔部位に広がった悪性腫瘍をいう。一部の実施形態では、癌は特定の癌抗原に関連している。
以下は、特定の実施例および特定の図面を参照にして本発明について説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書および請求の範囲で使用される「含む」という用語は、その他の要素やステップを除外しない。単数名詞に言及する時に不定冠詞または定冠詞を使用する場合、例えば、「一つ」または「前記」、「上記」を使用する場合、特に説明しない限り、該名詞の複数形をも含む。
本文で特に定義しない限り、用語または定義は、本発明の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。遺伝子工学技術で一般的に使用されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、クローニング、トランスフェクション、形質導入、発現などの用語および方法に関して、当業者は特に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照することができる。
本発明の二重標的抗原結合分子
本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子に係り、第１の抗原結合分子抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。好ましい実施形態では、二重標的抗原結合分子はさらに、安定的に接合できる第１と第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体であり、または、Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原とに特異的に結合できるフラグメントである。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子に係る。一部の実施形態では、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、方向を逆転させることができる。一部の実施形態では、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂは、Ｆｃドメインに融合したｓｃＦｖに融合し、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインに融合する。よって、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドの一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＦｃまたはＮ－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－Ｆｃとして表され得、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドのもう一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第２のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得る。
一部の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合し、第２のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端に融合する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、方向を逆転させることができる。よって、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドの一つの構造は、Ｎ－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＦｃまたはＮ－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（第１のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドのもう一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第２のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得る。
本発明の二重標的抗原結合分子を組み立てるために、抗体に由来するＣＤＲ、ＦＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３などの部分は、リンカーによって互いに融合することができる。好ましくは、本文に記載のペプチドリンカー（ＧｘＳｙ）ｎ、または共有結合、例えば、末端カルボキシおよびアミノ基によって形成されるペプチド結合を介して融合する。
第１の抗原結合部と第２の抗原結合部により、本発明の二重標的抗原結合分子はＴ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、抗原に対して選択的であり、しかも望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できる結合をいう。特異的に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者が熟知している他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃоｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））と従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定できる。一実施形態では、無関係なタンパク質への抗原結合部の結合程度は、例えば、ＳＰＲにより測定された、抗原結合部と抗原との結合の約１０％未満である。
抗原結合分子または同族抗原に結合する抗体の能力は、「親和性」によって決定することができる。「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合サイトとその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本文で使用されるように、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができ、解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と接合速度定数との比率（それぞれｋоｆｆとｋоｎである）である。よって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む、本分野で既知の実証済みの方法によって測定することができる。
さらに好ましい実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域に、少なくとも一部の定常領域を含む「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」を含む。例えば、ＩｇＧ ＣＨ２とＩｇＧ ＣＨ３はサブユニットを形成することができ、しかも本文に記載の抗原結合分子または抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットとの接合を促進しながらＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとを接合してアイソタイプ二量体を形成することを低減または阻止する修飾を含む。本文で使用される接合を促進する修飾は特に、結合することが望まれる二つのＦｃドメインのサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニット）のそれぞれに対して行われる単独の修飾を含み、前記修飾は、二つのＦｃドメインのサブユニットの接合を促進するように相補的である。例えば、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインのサブユニットの一つまたは二つの構造または電荷を変えてそれらの空間上または静電上の結合に寄与する。そのため、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドとの間に発生し、それらは各サブユニット（例えば抗原結合部）に融合するさらなる成分という意味で同一ではないかもしれない。一部の実施形態では、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインにおけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。一つの具体的な実施形態では、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのそれぞれの単独のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの接合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、該方法は、二つのＦｃドメインのサブユニットの界面にある一つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置換することに係り、これによって、アイソタイプ二量体の形成は静電的に不利になるに対して、ヘテロ二量化は静電的に有利になる。
例えば、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基によるＴ３６６の置換を含み、もう一つのサブユニットは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基によるＴ３６６、Ｌ３６８、および／またはＹ４０７の一つまたは複数の置換を含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋを含み、もう一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅを含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄを含み、もう一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）を含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子はさらに、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、例えば、前記一つまたは複数のアミノ酸置換のサイトは、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択されるサイトである。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子はさらに、ＩｇＧ４のＳ２２８（好ましくはＳ２２８Ｐ）サイト上の置換を含む。
本発明の二重標的抗原結合分子の調製
本発明の二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含み、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。
前記ｓｃＦｖとＦａｂ分子は、既存技術のいずれか、または将来のｓｃＦｃとＦａｂ分子であってもよい。それらは、マウス、ヤギ、ウサギ、およびヒトを含むがこれらに限定されない任意の種の天然抗体に由来してもよく、または組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化および／またはインビトロ生成（例えば、ファージディスプレイによりスクリーニングされる）したものであってもよい。例えば、ｓｃＦｖとＦａｂ分子は、目的の抗原を使用して動物を免疫し、続いて目標の抗体フラグメントのｍＲＮＡを単離し、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって獲得することができ、これによって何百万ものクローン化された目標の抗体フラグメントを含む遺伝子ライブラリーを生成する。ファージディスプレイやリボソームディスプレイなどのスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンの特定に役立つ。別の方法では、事前に免疫されていない動物の遺伝子ライブラリーが使用される。このような天然ライブラリーは通常、目的の抗原に対する親和性が低い抗体のみを含み、追加のステップとしてランダム突然変異誘発を使用して親和性の成熟化をすることが必要となる。最も効果的なクローンが特定されると、それらのＤＮＡ配列が最適化され、例えば、それらが酵素に対する安定性を改善する。もう一つの目標は、抗体に対するヒト生物体の免疫応答を防ぐためのヒト化である。最後のステップは、大腸菌、サッカロミセスセレビシエまたはその他の適切な生物体で最適化された抗体フラグメントを翻訳することである。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂはいずれも抗ＣＤ２０ Ｆａｂである。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を含み、もしくは前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
本発明の二重標的抗原結合分子は、異なる抗原結合部を含み、一実施形態では、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方または他方に融合するので、Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、通常、二つの異なるポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え共発現及びその後の二量化により、二つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせがもたらされる。組み換え生産における二重標的抗原結合分子の収率および純度を高めるために、二重標的抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの接合を促進する修飾を導入することが有利である。
よって、特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの二つのサブユニット間の最も広範なタンパク質‐タンパク質間相互作用のサイトは、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施形態では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。一つの具体的な実施形態では、前記修飾はいわゆる「ノブイントゥホール」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方における「ノブ」修飾と、二つのサブユニットの他方における「ホール」修飾とを含む。ノブイントゥホール技術は、例えば、ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）、およびＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。通常、該方法は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入することと、第２のポリペプチドの界面にそれ対応に空洞（「ホール」）を導入することに係り、これによって、ヘテロ二量体の形成を促進しながらアイソタイプ二量体の形成を阻害するように突起が空洞に位置付けられる。突起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより調製できる。例えば、サイト特異的変異誘発またはペプチド合成により調製できる。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの接合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、該方法は、二つのＦｃドメインのサブユニットの界面にある一つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置換することに係り、これによって、アイソタイプ二量体の形成は静電的に不利になるに対して、ヘテロ二量化は静電的に有利になる。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部と、第１と第２のサブユニットからなるＦｃとを含む二重標的抗原結合分子を提供し、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、第１のサブユニットと第２のサブユニットは、ヘテロ二量体の形成に静電的に有利な一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている。
Ｆｃドメインは、長い血漿半減期を含む有利な薬物動態特性を二重標的抗原結合分子に付与するとともに、二重標的抗原結合分子が抗原標的細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞を標的化すること（望ましくない）をもたらし得る。したがって、特定の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施形態では、二重標的抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の結合親和性、および／または５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満のエフェクター機能（天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを含む二重標的抗原結合分子と比べて）を示す。一つの具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびサイトカイン分泌物からなる群より選択される一つまたは複数である。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する実質的に類似した結合親和性を保持することが望まれる。
一実施形態では、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性および／またはエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、例えば、その全体が参照にして本文に組み込まれるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載されるようなアミノ酸置換である。また、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３は、このような突然変異体Ｆｃドメインを調製する方法、およびその特性（例えば、Ｆｃ受容体の結合またはエフェクター機能）を確定する方法を記載している。
本発明の二重標的抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成）または組み換え生産により得ることができる。組み換え生産では、二重標的抗原結合分子（フラグメント）をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニングおよび／または発現のためにそれを一つまたは複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドを従来の方法を使用して容易に単離および配列決定することができる。一実施形態では、本発明の一つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、二重標的抗原結合分子（フラグメント）のコード配列を含む発現ベクター及び適切な転写／翻訳制御シグナルを構築することができる。これらの方法として、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術、およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照できる。
治療的使用
本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍、特にヒト腫瘍を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍細胞の成長を阻害することができる。
疾患の治療のために、本発明の二重標的抗原結合分子の適切な用量（単独でまたは一つまたは複数のその他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療する疾患の種類、投与経路、患者の体重、疾患の重症度および経過、予防または治療目的、以前または同時の治療的介入、患者の臨床病歴および本発明の二重標的抗原結合分子に対する反応、並びに主治医の自由裁量によるものである。いずれにしても、投与を担当する開業医は、組成物における活性成分の濃度および個体被験者の適切な用量を決定する。本文では、様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投与計画が考慮される。
本発明の二重標的抗原結合分子は、一回または一連の治療にわたって患者に投与することに適する。疾患の種類および重症度に応じて、本発明の二重標的抗原結合分子の約１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）は、患者に投与する初期候補用量であり得る。例えば、一回または複数回の単独投与、または持続注入によって投与する。上記の要因に応じて、典型的な１日量は約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇ以上である場合がある。しかし、他の投与計画が利用できる場合もある。
治療の進行は、従来の技術によって容易に監視することができ、治療有効量の決定は、特に本文で提供される詳細な開示内容によって、完全に当業者の能力の範囲内である。投与量および間隔を個別に調整して、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重標的抗原結合分子の血漿レベルを提供することができる。注射による投与のための通常の患者用量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日であり、一般的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日である。
医薬組成物及び製品
本発明はまた、本発明の二重標的抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。用語の「薬学的に許容される担体」とは、使用される投与量および濃度での非毒性レシピエントを指し、動物（例えば、ヒト）に適切に投与される場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不良反応を引き起こさない。薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、接着剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、類似物質およびそれらの組み合わせを含み、当業者に知られているように（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、第１２８９～１３２９頁を参照として本文に組み込む。
本発明の二重標的抗原結合分子は、治療において一つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の二重標的抗原結合分子は、少なくとも一つの追加の治療薬と同時投与することができ、相補的活性を有し、副作用を有さない。追加の治療薬は、癌の化学療法薬、例えば免疫調節薬および細胞抑制薬を含む。本発明の二重標的抗原結合分子および治療における一つまたは複数のその他の薬剤は、製品の異なる容器に入れられることができる。一部の実施形態では、製品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルとを含む。適切な容器は、ボトル、バイアル、注射器、静脈注射溶液バッグなどを含む。ラベルまたはプロトコルは、治療における本発明の二重標的抗原結合分子と一つまたは複数のその他の薬剤と使用、並びに、本発明の二重標的抗原結合分子および一つまたは複数のその他の薬剤を必要とする疾患の治療方法を示す。また、前記製品は、その他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含む、商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質を収容する一つまたは複数の容器を含むことができる。
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の分子構造設計および検証研究
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭの設計
本発明は、改善されたＩｇＧ４構成を使用して新規な二重特異性結合抗体を構築する。以下のように簡単に説明する。ＩｇＧ４のＦａｂアームの交換を防止するようにＩｇＧ４のＳ２２８サイトをＰに変異させ、Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａ変異は、高親和性Ｆｃ受容体への結合を減少させる。一つの側アームのみがＣＤ３に特異的に結合するため、新しいＴＲＡＢｓが低親和性でＴ細胞に一価で結合し、該特異性抗体が標的腫瘍細胞により多共価方式でＴ細胞に提示されない限り、当該親和性は、ＣＤ３を介したＴ細胞活性化を引き起こさない。
上記設計に基づき、新しいＴＲＡＢ二重特異性抗体は次の特徴と成分を有する。すなわち、１）一つのＴ細胞エンゲージメント成分：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨのタンデム型）；２）腫瘍細胞ターゲティング成分：抗腫瘍関連抗原ＴＡＡのＩｇＧ４モノクローナル抗体、一つの重鎖はＴ３６６Ｗ変異を有し、もう一つの重鎖はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を有する；抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを、３）抗ＴＡＡ ＦａｂとＴＲＡＢ分子の重鎖領域のヒンジＦｃ領域との間に挿入し、後者はノブ変異を固定し、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）に基づくリンカーを介して抗ＴＡＡ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端に接続され、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭと命名される；４）あるいは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）に基づくリンカーを介してノブ変異の重鎖上に接続されて固定され、ＳоｍＢｏｄｙＴＭと命名される。それぞれ一つの軽鎖と二つの異なる重鎖をコードするｃＤＮＡを使用したプラスミドをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションしたことにより、安定したノブイントゥホールヘテロ二量体のＩｇＧ４様ＢｓＡｂ（図１Ａと１Ｂ）が形成され、それをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。
図１Ａと１Ｂに示すように、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭとＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢはいずれも下記のものを含む。すなわち、１）Ｔ細胞エンゲージメント成分、すべてのＴＲＡＢで共有されるＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ方向の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ；２）一つの重鎖がノブ（Ｔ３６６Ｗ）変異を有し、もう一つの重鎖がホール（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）変異を有する、ＩｇＧ４ｍＡｂを標的とする腫瘍関連抗原；（Ａ）ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの場合、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを抗ＴＡＡ ＦａｂとＴＲＡＢ分子のＨ鎖上のヒンジＦｃ領域との間に挿入し、該領域はノブ変異を含み、抗ＴＡＡ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端（（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを介して）に共有結合し、ｎ＝１または２である；（Ｂ）ＳоｍＢｏｄｙＴＭの場合、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖをそのＨ鎖上の（Ｇ４Ｓ）ｎに基づくリンカーを介して抗ＴＡＡ ｍＡｂのＮ末端に共有結合し、重鎖はノブ変異を固定し、ｎ＝１または２である。
検証研究
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の構造の実現可能性を検証するために、本発明は、図２～５に示す一連のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体を構築し、発現して精製した後、プロ―サイトメトリーによってヒトＢ細胞およびＴ細胞への結合活性を評価した。本検証研究では、ヒト化ムロモナブ‐ＣＤ３およびＦＤＡ承認のオファツムマブ配列が使用された。
ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（分子Ａと分子Ｂ）は、二つの同一の重鎖（抗ＣＤ２０‐リンカー‐抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４融合タンパク質）を含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨであり、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）である。図２を参照できる。
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は、二つの異なる重鎖を含み、一つの重鎖は、抗ＣＤ２０重鎖可変領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とからなり（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む）、もう一つの重鎖は、抗ＣＤ２０ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）、（Ｇ４Ｓ）２、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ）、および、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ４（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）からなる。図３を参照できる。
追加のＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（分子Ｃと分子Ｄ）は、二つの同一の重鎖（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ‐リンカー‐抗ＣＤ２０－ＩｇＧ４ＰＡＡ融合タンパク質）を含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨであり、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）である。図４を参照できる。
最後に、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は、二つの異なる重鎖を含み、一つの重鎖は、抗ＣＤ２０重鎖可変領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とからなり（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む）、もう一つの重鎖は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ）、（Ｇ４Ｓ）２、抗ＣＤ２０ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）、および、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ４（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）からなる。図５を参照できる。
Figure 2022508529000001
具体的な配列は下記通りである：
SEQ ID NO:1
Gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggcaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttaatgattatgccatgcactgggtccggcaagctccagggaagggcctggagtgggtctcaactattagttggaatagtggttccataggctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtccctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaagatatacagtacggcaactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
SEQ ID NO:2
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:3
GFTFNDYA
SEQ ID NO:4
ISWNSGSI
SEQ ID NO:5
AKDIQYGNYYYGMDV
SEQ ID NO:6
Gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
SEQ ID NO:7
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:8
QSVSSY
SEQ ID NO:9
DAS
SEQ ID NO:10
QQRSNWPIT
SEQ ID NO:11
caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagcaccgacaagagcaagagcaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca
SEQ ID NO:12
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:13
GYTFTRYT
SEQ ID NO:14
INPSRGYT
SEQ ID NO:15
ARYYDDHYSLDY
SEQ ID NO:16
Gacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagacccccggcaaggcccccaagcgctggatctacgacaccagcaagctggccagcggcgtgcccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccttcaccatcagcagcctgcagcccgaggacatcgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccttcaccttcggccagggcaccaagctgcagatcacc
SEQ ID NO:17
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQIT
SEQ ID NO:18
SSVSY
SEQ ID NO:19
DTS
SEQ ID NO:20
QQWSSNPFT
SEQ ID NO:21
caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagccgcgacaatagcaagaacaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccggcgtgtacttctgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の遺伝子合成、プラスミド構築
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体を調製するために、以下に説明するように重鎖および軽鎖プラスミドをそれぞれ構築した。詳細は次の通りである：
まず、抗ＣＤ２０重鎖‐ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）およびホール変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を含むＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、Ｎｏｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクターｐＣＤＮＡ３．３にクローニングして抗ＣＤ２０重鎖ＩｇＧ４ＰＡＡを含むプラスミド＃１２５０９を構築した。次に、抗ＣＤ２０抗体軽鎖のＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、ＮｈｅＩ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクターｐＣＤＮＡ３．３にクローニングして抗ＣＤ２０軽鎖を含むプラスミド＃１２５０１を構築した。Ｑ５(R) Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔｌｏｇ＃Ｅ０５５２Ｓ）を介して、下記のプライマーペアを使用した：
フォワードプライマー１：5’-GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT-3’;
SEQ ID NO:23
リバースプライマー１：5’-TGGTTCTTGGTCATCTCCTCCTGGGATG-3’ ;
SEQ ID NO:24
フォワードプライマー２：5’-CTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCG-3’ ;
SEQ ID NO:25
リバースプライマー２：5’-GAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGC-3’
SEQ ID NO:26。
プラスミド＃１２５０９のＦｃ領域（Ｓ３６６、Ａ３６８、Ｖ４０７）サイトを、ホール変異の抗ＣＤ２０重鎖‐ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）を含まないプラスミド＃１３１６６に変異させた。
そして、ＣＨ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗‐ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含むＤＮＡフラグメント（配列＃３と＃４）を全遺伝子合成し、ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化をしてプラスミド＃１２５０９にクローニングして元の抗体定常領域ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域を置き換えて、プラスミド＃１４６０６と＃１３６７２を生成した。抗‐ＣＤ３（＃１または＃２）ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）－（Ｇ４Ｓ）２－抗‐ＣＤ２０ ＶＨを含むＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、ＮｈｅＩ／Ｎｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクター＃１３１６６にクローニングしてプラスミド＃１３７３５と＃１３７３６を構築した。そして、Ｑ５(R) Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔｌｏｇ＃Ｅ０５５２Ｓ）を介して、下記のプライマーペアを使用した：
（１）フォワードプライマー：
5’-AACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC-3’
SEQ ID NO:27
（２）リバースプライマー：
5’-CTTGGTCATCTCCTCCTGGGATGGGGGCAGGGTGTACA-3’
SEQ ID NO:28
それぞれプラスミド＃１４６０６、＃１３６７８、＃１３７３５、および＃１３７３６からノブ変異（Ｔ３６６Ｗ）を有するプラスミド＃１４６０６、＃１３６７８、＃１３７３７、および＃１３７３８を生成した。構築できたプラスミドはそれぞれ表１に示し、概略図を図６に示す。
Figure 2022508529000002
抗体発現、精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
表２に挙げられた組み合わせに従って、重鎖と軽鎖をコードするプラスミドを混合し、２００ｍｌのＥｘｐｉ－ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２７）に同時トランスフェクションして、対応する二重抗体を発現させた。トランスフェクションしたＥｘｐｉ－ＣＨＯ－Ｓ細胞を３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに置いて８～１０日間培養した後、細胞培養上清を取り、ＧＥ仕入先が推奨した方法に従ってＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃ＧＥ－１７５４３８０４）にロードしてて目標の抗体を溶出して単離し、最終的に目標の抗体を１×ＰＢＳバッファーに置き換えた。
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体について、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後、ＧＥＨＰ－ＳＰ陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃２９０５１３２４）を用いて二番目の精製ステップを行い、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の溶出条件を最適化するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズエクスクルーシブクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、還元および非還元キャピラリー電気泳動（Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）などの分析方法によって異なる溶出画分を収集し評価した。最後に、２８０ｎｍの条件下での吸光係数を利用してＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｉｍｐｌｅｎ，ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(R)ＮＰ８０－Ｔоｕｃｈ）によって検測して抗体総収量を計算した。
Figure 2022508529000003
３μｇの目標抗体タンパク質サンプルを４×タンパク質サンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ＃ＮＰ００７）に置いて６５℃で５～１０分間インキュベーションし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でタンパク質純度を評価し、８％非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して非還元状態の目標被験抗体の分子サイズ、純度、および凝集状況を特定した。
図７は、ワンステッププロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後の非還元条件下での目的の抗体の純度を示す。各被験抗体は、１８０ＫＤａを超える一つのメインバンドを有し、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は９５～１８０ＫＤａの間に低分子量バンドを有する。
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭは陽イオン交換精製を経て、異なる溶出画分を収集し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を図８～図１１に示す。各被験抗体の最適な溶出画分（ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ：ＣＥＸ溶出画分１、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ｂ：ＣＥＸ溶出画分３、ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｃ：ＣＥＸ溶出画分７、ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｄ：ＣＥＸ溶出成分２）を取って更なる質量分析を行った。
被験抗体ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて実施例３の最適な溶出画分に対して質量分析を行った。被験抗体をｄｄＨ２Ｏで１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００）のカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ）に入れた。移動相は５０ｍＭ ＰＢ溶液（ｐＨ７．０）と３００ｍＭ ＮａＣｌであり、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎであり、ＵＶ吸光度は２８０ｎｍである。データ分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアを使用して行った。
図１２に示すように、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＡおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｃのメインピークの割合は９０％を超え、少量の低分子量（ＬＭＷ）フラグメントまたは高分子量（ＨＭＷ）凝集体が伴われる。ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＢおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｄのメインピークの割合は６４％を超え、多い高分子量凝集体（＞２５％）が伴われる。すべての被験抗体のＨＭＷ凝集体、モノマーのメインピーク、およびＬＭＷフラグメントの割合の詳細は表３に示される。
Figure 2022508529000004
非還元および還元ＣＥ－ＳＤＳ分析
キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ，Ｂｅｃｋｍａｎキャピラリー５０ｕｍＩＤ×２０ｃｍ）を使用して実施例３の被験抗体の最適な溶出画分の純度を分析した。ＳＤＳ－ＭＷ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｓｍａｒｔ Ｔｅｃｈ． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｃａｔ＃ＢＳＹＫ０１８）を使用して下記の方法に従って被験抗体に対して還元および非還元処理を行った。非還元：１００μｇの被験抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのヨードアセトアミドを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。還元：１００μｇの被験抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのβ－メルカプトエタノールを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。それぞれキャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、モデル：ＰＡ８００ｐｌｕｓ）を用いて純度分析をした。
その結果、非還元（ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）条件下で、本発明の分子Ａ、分子Ｂ、分子Ｃおよび各ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ／ＳоｍＢｏｄｙＴＭの純度はいずれも９０％以上に達した。分子Ｄのメインピークの純度は低く、より高い割合のフラグメントピークが現れた。還元（Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ）条件下で、本発明の各分子は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに類似した結果を有する。詳細な結果を図１３～１４および表４～５に示す。
Figure 2022508529000005
Figure 2022508529000006
ヒトＢ細胞及びＴ細胞に対する被験抗体のインビトロ結合活性
ヒトＢ細胞（Ｒａｊｉ）またはＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を１×ＰＢＳで一回洗浄した後、１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ溶液に懸濁し、１×１０５／ウェル、５０μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。５０μＬ／ウェルの被験抗体（１０μｇ／ｍＬから３倍勾配希釈）を細胞懸濁液に加え、氷上で６０分間インキュベーションしてから遠心分離し、冷１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を二回濯いだ。そして、各ウェルに１：２００に希釈した１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ標識抗体（Ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ９８５９６）と細胞を加え、氷上で６０分間インキュベーションしてから遠心分離し、冷１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を二回濯いだ後、それを改めて２００μＬ ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに懸濁し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ＨＴフローサイトメトリー（ＭＥＲＣＫ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でＭＦＩ（平均蛍光強度）シグナルを検出して、ヒトＢ細胞及びＴ細胞に対する異なる濃度の被験抗体の結合活性を評価した。Ｇｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアで非線形回帰曲線を作成し、ヒトＢ細胞またはＴ細胞に結合した抗体のＥＣ５０を用量‐反応曲線の関係から計算した。
すべての被験抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ）はヒトＢ細胞（Ｒａｊｉ）で生成した蛍光シグナルが濃度依存性を有し、陽性コントロール（抗‐ＣＤ２０ ＩｇＧ４ＰＡＡ）に類似した結合活性を示した（図１５、図１６、および表６、表７）。陽性コントロール（抗‐ＣＤ２０ ＩｇＧ４ＰＡＡ）と比べて、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭはより高い結合曲線レベルを備えている。
Figure 2022508529000007
Figure 2022508529000008
陽性コントロール（抗‐ＣＤ３ Ｍ１ ＩｇＧ４ＰＡＡ）と比べて、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭは、ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）への結合活性が異なる程度の低下を示し（図１７、図１８）、そのＥＣ５０値の詳細は表８、表９に示される。
Figure 2022508529000009
Figure 2022508529000010
ヒト末梢血Ｔ細胞が指向的にヒトＢリンパ腫細胞を殺傷するインビトロ実験
ＣＤ２０陽性ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞を標的細胞として、ＨＥＰＥＳ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で一回洗浄し、２Ｅ４細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。新たに単離したヒトＰＢＭＣｓをエフェクター細胞とし、ＲＰＭＩ １６４０培地で一回洗浄し、２Ｅ５細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルの密度で対応する９６ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞と標的細胞との比率は１０：１（Ｅ：Ｔ＝１０：１）であった。次に、２０μｌの対応する被験抗体（１００μｇ／ｍｌから１０倍勾配希釈）を加え、３７℃で５％ＣＯ２条件下で１日間インキュベーションした。翌日、プレートを取り出して２２℃に置き、陽性コントロールウェル（Ｄａｕｄｉ細胞のみを含む）内に１５μｌのライセートを加え、３５０×ｇの条件下で３０分間遠心分離した。
実験用９６ウェルプレートから５０μｌの上清を取り、新しい９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ｃａｔｌｏｇ＃３５９９）に入れ、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ９６(R)試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔｌｏｇ＃Ｇ１７８０）を各ウェルに添加した。暗所で室温で３０分間インキュベーションし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して波長４９０ｎｍまたは４９２ｎｍで吸光度を測定し、試験ウェル細胞分裂の割合を計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて非線形回帰曲線に適合させ、半分最大有効濃度（ＥＣ５０）を用量‐反応曲線の関係から計算した。
その結果の詳細は図１９、表１０に示される。
Figure 2022508529000011
Ｔ細胞活性化試験
実施例７の、ヒト末梢血Ｔ細胞が指向的にヒトＢリンパ腫細胞を殺傷するインビトロ実験と同時に、Ｔ細胞活性化の誘発に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの作用を評価した。具体的な実施工程は実施例７に記載されている。実施例７の各ウェルから５０μＬの上清を取って細胞毒性を評価した後、残りの細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで一回洗浄し、下記の抗体で細胞を染色して分析した。
染色の手順は次の通りである。
ＣＤ６９－ＰＥ、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ抗体を１：２５の比率でＰＢＳ＋１５ＦＢＳ溶液に希釈し、５０μＬ／ウェルで試験ウェルに加え、氷上で３０分間インキュベーションした。染色された細胞を遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで二回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ＋１％ＦＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で検測した。その結果をＧｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて非線形回帰曲線に適合させ、半分最大有効濃度（ＥＣ５０）を用量‐反応曲線の関係から計算した。詳細は表１１、表１２、図２０に示される。
Figure 2022508529000012
Figure 2022508529000013
ＨＳＣ－ＮＳＧマウス体内のＢ細胞枯渇（減弱）実験
１２匹のメス重度免疫不全（ＮＳＧ、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスを取り、ｈＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を使用して２０～２４週間にわたってマウス免疫系を再構築し、体内のヒトＢ／Ｔ細胞を安定させた。Ｂ細胞の割合は約４５．８９％であり、ｈＣＤ４＋、ｈＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は平均でそれぞれ３８．２０％と８．６７％であった。
上記ＨＳＣ－ＮＳＧマウスをＡ（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ １μｇ／ｋｇ）、Ｂ（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ １０μｇ／ｋｇ）、Ｃ（抗ＣＤ２０モノクロナール抗体（ＩｇＧ１）１００μｇ／ｋｇ）、Ｄ（抗ＣＤ２０モノクロナール抗体（ＩｇＧ１）５００μｇ／ｋｇ）の四つの群に分け、各群で３匹ずつとし、一回の静脈注射により投与した。詳細は表１３を参照できる。投与前および投与後１日、３日、７日目に眼窩から採血し（図２１）、各回８０μＬを取ってヘパリンナトリウムを含む試験管に入れた。新たに調製したＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ：ｄｄＨ２Ｏ（１：１）の溶液で赤血球を溶解し、残りの細胞を１０００μＬのＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で二回洗浄し、対応する検出インジケーターの抗体と氷上で３０分間インキュベーションした。さらに二回洗って、ＮｏｖｏＣｙｔｅ３１３０フローサイトメトリーでサンプルを分析した。検出指標は、ｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ４＋、ｈＣＤ８＋、ｈＣＤ２であった。
Ｂ細胞インデックスｈＣＤ１９＋／ｈＣＤ２‐の相対百分比を図２２に示し、Ｔ細胞インデックスｈＣＤ４＋／ｈＣＤ８＋／ｈＣＤ２＋の相対百分比を図２３、図２４に示す。
Figure 2022508529000014
質量分析：二重特異性抗体の構造
ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ６５３０Ｑ－ＴＯＦ）を用いて還元または非還元条件下でのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａの完全な分子量を測定した。被験抗体を５０μＬの０．０５Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で最終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸‐アセトニトリル溶液であり、試験サンプルの添加量は１０μｇ／サンプルであった。図２５～図２７に示すように、実際に測定した分子量と理論分子量との差は１．４３Ｄａであり、軽鎖の差は０．１５Ｄａであり、重鎖１の差は０．５３Ｄａであり、重鎖２の差は０．３９Ｄａであった。
本発明は、二重標的抗原結合分子、二重標的抗原結合分子を含む医薬組成物、および疾患の治療における使用に関する。さらに、本発明は、二重標的抗原結合分子を生成する方法にも関する。
二重標的抗原結合分子は、二種類の異なる抗原、例えば、Ｔ細胞のＣＤ３分子と癌細胞の腫瘍特異的抗原を標的とし、癌治療に大きな期待を寄せている。これらの分子の中には、市場に投入されたものがある。しかし、今まで、これらの二重特異性抗体の治療効果は期待されるほど満足のいくものではない。実例として、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ，ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性抗体、オフターゲットＡＤＣＣ効果に起因する重大な副作用のため、市場から撤回された）が挙げられる。別の例として、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ，ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）は半減期が短く、投与方法も不便であるため、この薬剤を患者に投与することに対する熱意はひどく打撃を受けている。本発明の目的は、このような問題を克服する新世代の二重標的抗原結合分子を開発することである。
本発明は、一方では標的細胞に対する結合および減弱の良好な効果を示し、他方ではＦｃを介した副作用が低減された通常のＩｇＧ薬物動態（例えば、長い血漿半減期）を示す、新世代の二重標的抗原結合分子に関する。本発明により提供されるこのような分子は、二重標的抗原結合分子に対する臨床的ニーズをある程度満たす。
具体的には、一局面において、本発明により提供されるのは、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子であり、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じ標的細胞抗原に結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、同じ標的細胞抗原の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、標的細胞抗原の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じ抗体に由来する。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、同じ標的細胞抗原に結合する異なる抗体に由来する。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までに重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までに軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。好ましい実施形態では、前記二重標的抗原結合分子は、安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む。一部の実施形態では、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端またはｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に融合した第１のＦａｂを含み、前記ｓｃＦｖのＣ末端は、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットのいずれか一つに連結され、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのもう一つのサブユニットに融合した第２のＦａｂを含む。特定の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に融合し、または、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端に融合する。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＣ末端またはｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合する第１のＦａｂを含み、第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端は、Ｆｃの第１及び第２のサブユニットのいずれか一つに連結され、しかも第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのもう一つのサブユニットに融合する第２のＦａｂを含む。特定の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合し、または、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端に融合する。
一部の実施形態では、本発明に係る二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる抗原結合部を一つのみ含む。
上記いずれかの実施形態によって、本発明の二重標的抗原結合分子の成分、例えば、第１の抗原結合部、第２の抗原結合部、ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）、Ｆｃドメインは、直接に融合する（例えば、末端カルボキシル基とアミノ基によって形成されるペプチド結合を介して）か、本分野で既知の様々なリンカー、特に一つまたは複数のアミノ酸、通常は約２～２０のアミノ酸、を含むペプチドリンカーを介して融合することができる。適宜に、非免疫源性ペプチドリンカーは、例えば、（ＧｘＳｙ）ｎを含み、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。具体的な実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖのＣ末端に融合する、あるいはＦａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖのＮ末端に融合する（一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介して）第１のＦａｂを含み、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。具体的な実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）は、一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、前記第１及び／または第２の抗原結合部は、ヒンジ領域またはヒンジ領域の一部を介してＦｃドメインに連結される。一部の実施形態では、前記第１及び／または第２の抗原結合部は、一般式（ＧｘＳｙ）ｎを有するペプチドリンカーを介してＦｃドメインに連結し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～１０、好ましくは２～８、２～７、２～６、２～５、２～４から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記ＦｃドメインはヒトＩｇＧ Ｆｃドメインであり、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインである。一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、前記Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの接合を促進する一つまたは複数の修飾を含む。好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって前記サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて一つの突起が生成され、前記Ｆｃドメインのその他のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて一つの窪みが生成され、前記突起は前記窪みに突出することができる。好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換される。より好ましい実施形態では、Ｆｃドメインの一つのサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７から選択される一つまたは複数の残基は、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基により置換される。さらに好ましい実施形態では、前記Ｆｃドメインは一つのサブユニットにおいてＴ３６６Ｗ置換基を含み、Ｆｃドメインのその他のサブユニットにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ置換基を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、（天然のＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して）Ｆｃ受容体への結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある。より好ましくは、各Ｆｃドメインのサブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとの二つの、アミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子において、前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であり、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。
一部の実施形態では、本発明による上記二重標的抗原結合分子は、ＩｇＧのＳ２２８サイトにあるアミノ酸置換を含み、好ましくは、Ｓ２２８サイトにあるアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂとは、両方とも抗ＣＤ２０Ｆａｂである。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、第１のＦａｂと第２のＦａｂおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦＶを含み、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、両方ともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を含み、もしくは前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明の上記二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一局面において、本発明は、ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端に融合し、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６サイトのより大きい側鎖を有するアミノ酸置換を含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７サイトの、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、二重標的抗原結合分子に係る。
好ましい実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、Ｆｃドメインは第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む。より好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。さらに好ましい実施形態では、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある。最も好ましい実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換、すなわち、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとを含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子はさらに、ＩｇＧ４のＳ２２８、好ましくはＳ２２８Ｐ、のサイトにあるアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎを介してＦａｂ重鎖に融合し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
当業者は、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）との間に一つのリンカーがあってもよく、後者は、本発明による二重標的抗原結合分子に含まれることを理解するであろう。前記リンカーはペプチドリンカーであってもよく、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
一局面において、本発明はさらに、ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６サイトのより大きい側鎖を有するアミノ酸置換を含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、後者は、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７サイトの、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは、Ｆｃドメインは第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含み、より好ましくは、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含み、さらに好ましくは、前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９基からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにあり、最も好ましくは、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換、すなわち、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとを含む、二重標的抗原結合分子に係る。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、ＩｇＧ４のＳ２２８、好ましくはＳ２２８Ｐ、のサイトにあるアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは（ＧｘＳｙ）ｎを介してＦａｂ重鎖に融合し、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、ヘテロ二量体の形成を促進する一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている。好ましくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋのアミノ酸変異を含み、前記第２のサブユニットは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅのアミノ酸変異を含む。より好ましくは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄのアミノ酸変異を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）のアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される一つである。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子において、前記標的細胞抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。好ましくは、前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択される一つである。
一部の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体、またはＴ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる抗体フラグメントである。
一局面において、本開示は、（本発明の二重標的抗原結合分子をコードする）単離されたポリヌクレオチド、（前記単離されたポリヌクレオチドによってコードされた）ポリペプチド、（前記単離されたポリヌクレオチドを含む）ベクター、または（前記単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む）宿主細胞に係る。
一局面において、本開示は、ａ）前記二重標的抗原結合分子の発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程と、ｂ）前記二重標的抗原結合分子を回収する工程とを含む、本発明による二重標的抗原結合分子を製造する方法に係る。また、本発明は、本発明の方法により生成された二重標的抗原結合分子にも拡張されている。
一局面において、本開示は、本発明による二重標的抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。本発明は、容器内にある前記二重標的抗原結合分子または本発明による医薬組成物、および、前記二重標的抗原結合分子の使用方法に関するプロトコルを含む製品またはキットを包含する。
一局面において、本開示はさらに、本発明による二重標的抗原結合分子または医薬組成物の使用、例えば、異なる種類の癌の治療のための使用を披露する。
一局面において、本発明が対象とする主題は、それを必要とする個体の疾患に対する薬剤の調製における前記二重標的抗原結合分子の使用をさらに含む。
一局面において、本発明は、治療有効量の、本発明による前記二重標的抗原結合分子または前記医薬組成物を前記個体に投与することを含む、個体の疾患（特に癌）を治療する方法に係る。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞の存在下で標的細胞を前記二重標的抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の細胞溶解を誘導する方法に係る。
上記実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は好ましくは、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体またはそのフラグメント（Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる）である。前記細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、およびＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される一つであってもよい。前記標的細胞抗原は、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。好ましくは、前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択される一つである。
具体的には、本発明は、
１．Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子であって、
第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、二重標的抗原結合分子；
２．前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）と軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）、またはｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までの軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）と重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）を含む、項１に記載の二重標的抗原結合分子；
３．安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む、項１または２に記載の二重標的抗原結合分子；
４．前記第２の抗原結合部は、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖに融合した第１のＦａｂを含み、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合した第２のＦａｂを含む、項３に記載の二重標的抗原結合分子；
５．第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）のＮ末端に融合する、項４に記載の二重標的抗原結合分子；
６．第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）のＮ末端に融合する、項４に記載の二重標的抗原結合分子；
７．前記第２の抗原結合部は、前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖに融合する第１のＦａｂを含み、且つ前記第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合する第２のＦａｂを含む、項３に記載の二重標的抗原結合分子；
８．第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）のＣ末端に融合する、項７に記載の二重標的抗原結合分子；
９．第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）のＣ末端に融合する、項７に記載の二重標的抗原結合分子；
１０．Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる一つ以下の抗原結合部を含む、項１～９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
１１．第１と第２の抗原結合部はリンカーを介して互いに融合する、項１～１０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
１２．前記リンカーがペプチドリンカーである、項１１に記載の二重標的抗原結合分子；
１３．前記リンカーが（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、項１１に記載の二重標的抗原結合分子；
１４．ＦｃドメインがヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、項３～１３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
１５．ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、項１４に記載の二重標的抗原結合分子；
１６．Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットとの接合を促進する一つまたは複数の修飾を含む、項３～１５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
１７．Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて突起が生成され、アミノ酸残基のＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて空洞が生成され、前記突起は前記空洞に突出することができる、項１６に記載の二重標的抗原結合分子；
１８．Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換された、項１７に記載の二重標的抗原結合分子；
１９．Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７から選択される一つまたは複数の残基は、より小さいアミノ酸残基を有する一つまたは複数のアミノ酸残基により置換された、項１７に記載の二重標的抗原結合分子；
２０．前記Ｆｃドメインは第１のサブユニットにおいてＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ置換を含む、項１７～１９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２１．天然のＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す、項３～２０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２２．前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、項３～２１のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２３．前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、項２２に記載の二重標的抗原結合分子；
２４．前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとの二つの、アミノ酸置換を含む、項２３に記載の二重標的抗原結合分子；
２５．前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である、項２１～２４のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２６．前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である、項２１～２５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２７．ＩｇＧ４のＳ２２８サイトにあるアミノ酸置換を含む、項１～２６のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
２８．Ｓ２２８サイトにあるアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである、項２７に記載の二重標的抗原結合分子；
２９．ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）のＮ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）のＮ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端に融合し、または、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）または軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）のＣ末端で、ｓｃＦｖはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基によるＴ３６６の置換を含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７の、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む、二重標的抗原結合分子；
３０．前記Ｆｃドメインは、第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む、項２９に記載の二重標的抗原結合分子；
３１．前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、項２９または３０に記載の二重標的抗原結合分子；
３２．前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、項３１に記載の二重標的抗原結合分子；
３３．前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａである、項３２に記載の二重標的抗原結合分子；
３４．ＩｇＧ４のＳ２２８のサイトにあるアミノ酸置換をさらに含む、項２９～３３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
３５．Ｓ２２８サイトのアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである、項３４に記載の二重標的抗原結合分子；
３６．前記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して前記第１のＦａｂのＦａｂ重鎖に融合している、項２９～３５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
３７．前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、項３６に記載の二重標的抗原結合分子；
３８．ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
１）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）のＣ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）のＣ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第１のＦａｂはＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに融合し、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基でＴ３６６を置換することを含み、
２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７の、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む、二重標的抗原結合分子；
３９．前記Ｆｃドメインは、第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む、項３８に記載の二重標的抗原結合分子；
４０．前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、項３８または３９に記載の二重標的抗原結合分子；
４１．前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、項４０に記載の二重標的抗原結合分子；
４２．前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａである、項４１に記載の二重標的抗原結合分子；
４３．ＩｇＧ４のＳ２２８のサイトにある置換をさらに含む、項３８～４２のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
４４．Ｓ２２８サイトの置換はＳ２２８Ｐである、項４３に記載の二重標的抗原結合分子；
４５．前記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して前記第１のＦａｂのＦａｂ重鎖に融合している、項３６～４４のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
４６．前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、項４５に記載の二重標的抗原結合分子；
４７．前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、静電的にヘテロ二量体の形成を促進する一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている、項３～４６のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
４８．前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋのアミノ酸変異を含み、前記第２のサブユニットは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅのアミノ酸変異を含む、項４７に記載の二重標的抗原結合分子；
４９．前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄのアミノ酸変異を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）のアミノ酸変異を含む、項４７に記載の二重標的抗原結合分子；
５０．前記Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される何れか一つである、項１～４９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
５１．前記標的細胞抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、項１～５０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
５２．前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択されるいずれか一つである、項１～５０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子；
５３．前記二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体または抗体フラグメントである、項１～５２のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
５４．項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド；
５５．項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；
５６．項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター；
５７．項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは項５６に記載のベクターを含む宿主細胞；
５８．ａ）二重標的抗原結合分子の発現に適した条件下で項５７に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）前記二重標的抗原結合分子を回収する工程とを含む、項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子を生成する方法；
５９．項５８に記載の方法により生成された二重標的抗原結合分子；
６０．項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物；
６１．容器内にある項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または項６０に記載の医薬組成物、および、前記二重標的抗原結合分子の使用方法に関するプロトコルを含む製品またはキット；
６２．医薬としての、項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または項６０に記載の医薬組成物の使用；
６３．それを必要とする個体の疾患の治療に使用する、項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または項６０に記載の医薬組成物；
６４．前記疾患は癌である、項６３に記載の二重標的抗原結合分子または医薬組成物；
６５．ニーズがある個体の疾患の治療のための薬剤の調製における項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子の使用；
６６．治療有効量の、項１～５３のいずれか一項に記載の前記二重標的抗原結合分子または項６０に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法；
６７．前記疾患は癌である、項６５に記載の使用または項６６に記載の方法；
６８．Ｔ細胞の存在下で標的細胞を項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の細胞溶解を誘導する方法
に係る。
図１Ａ－Ｂは、前記二重特異性抗体（ＴＲＡＢ）構造の設計図である。前記二重特異性抗体は、（Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる）第１の抗体結合部と、（標的細胞抗原ＴＳＡまたはＴＡＡに特異的に結合できる）第２の抗体結合部と、第１と第２のサブユニットからなるＦｃドメインとを含み、第１の抗原結合部はｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部は第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。説明のために、前記設計図では、Ｔ細胞活性化抗原の実例としてＣＤ３を使用し、ＴＡＡを標的細胞抗原としている。図示された二重特異性抗体は、ＴＡＡ×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭとＳｏｍＢｏｄｙＴＭと命名されている。 図２Ａ－Ｂは、分子Ａと分子Ｂ ＣＤ２０×ＣＤ３（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ融合タンパク質の構造を示す図である。 図３Ａ－Ｂは、二つのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢの構造を示す図である。 図４Ａ－Ｂは、分子Ｃと分子Ｄ ＣＤ２０×ＣＤ３（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ融合タンパク質の構造を示す図である。 図５Ａ－Ｂは、二つのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢの構造を示す図である。 図６は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢを作成するために構築されたプラスミドの概略図である。 図７Ａ－Ｂは、プロテインＡ精製後のテスト対象のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図８は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図９は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１０は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－ＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１１は、陽イオン交換後のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－ＤのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図１２Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す図である。 図１３Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ分析を示す図である。 図１４Ａ－Ｈは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭテスト対象のＲ－ＣＥ－ＳＤＳ分析を示す図である。 図１５は、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１６は、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１７は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１８は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭの結合曲線を示す図である。 図１９は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭによりリダイレクトされたＴ細胞（ヒトＰＢＭＣ細胞由来）がヒトリンパ系Ｂ細胞株Ｄａｕｌｉを濃度依存的に溶解することを示す図である。 図２０Ａ－Ｄは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭを使用した初期および後期Ｔ細胞活性化を示す図である。 図２１は、ｉｎ ｖｉｖоＢ細胞枯渇試験の投与およびサンプリング収集の概略図である。 図２２は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ１９＋Ｂ細胞枯渇（減弱）率（％）を示す図である。 図２３は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（％）の変化を示す図である。 図２４は、ｉｎ ｖｉｖо試験のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）の変化を示す図である。 図２５は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａの全分子量の質量分析を示す図である。 図２６は、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ軽鎖の分子量の質量分析を示す図である。 図２７Ａ－Ｂは、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ重鎖１及び重鎖２の分子量の質量分析を示す図である。
本発明は二重標的抗原結合分子に係り、特に、二つの異なる抗原結合成分を含む二重特異性Ｔ細胞リダイレクト抗体（ＴＲＡＢ）に係り、一つはＴ細胞活性化抗原に特異的に結合するためのものであり、もう一つは、標的細胞抗原、例えば、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合するためのものである。Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合することにより、二重特異性分子（抗体）は、癌細胞を含む標的細胞が位置するサイトにＴ細胞をリダイレクトし、標的細胞は、活性化されたＴ細胞及び／またはその他のエフェクター細胞により破壊される（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して）。
定義
本発明で使用されるように、「二重標的抗原結合分子」とは、当該分子がＴ細胞活性化抗原を標的化および結合することができるだけではなく、標的細胞抗原を標的化および結合することもできることをいう。二重標的抗原結合分子は例えば、抗体、抗体フラグメント、およびＣＤ３分子やＴＳＡまたはＴＡＡ抗原などの抗原を二重に標的化して結合するポリペプチドを含む。該分子は、ＣＤＲドメイン、可変領域、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメント及び／またはＦｃドメインなど、組み立てられた抗体または抗体に由来する異なる部分から組み立てられた高分子ポリペプチドとして表すことができる。組み立てられた抗体とポリペプチドは、ＣＤ３分子やＴＳＡまたはＴＡＡ抗原に特異的に結合する。
本発明の用語の「抗体（Ａｂ）または抗体（Ａｂｓ）」は、天然抗体の構造特徴を有する抗体、及び天然抗体とは異なるが一つまたは複数の特異的抗原に対して結合特異性の構造特徴を有する抗体様分子を含む。用語の抗体とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
用語の「重鎖」、「軽鎖」、「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」）、「重鎖可変領域」（「ＶＨ」）、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）、「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ」）、「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）とは、天然に存在する免疫グロブリンにおけるドメイン及び合成した（例えば組み換えた）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体）の対応するドメインをいう。天然に存在する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本構造単位は、二つの軽鎖と二つの重鎖を持つ四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０またはより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常三つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。よって、天然に存在するＩｇＧ分子の軽鎖構造はＮ－ＶＬ－ＣＬ－Ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はＮ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ（Ｈはヒンジ領域である）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、フレームワークセグメントと呼ばれる抗原と非ＣＤＲセグメントと接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する。よって、ＶＬとＶＨドメインは、Ｎ－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－Ｃ構造を有する。
本文で使用される「二重特異性抗体」または「二重特異性抗原結合抗体」とは、二重結合特異性を有する抗体（前文で定義された通り）をいい、結合特異性の中の一つは、例えば、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１またはＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４のようなＴ細胞活性化抗原に特異的に結合するためのものであり、もう一つは、標的細胞抗原に特異的に結合するためのものであり、例えば、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）が挙げられる。
天然抗体は通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖と二つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は共有ジスルフィド結合を介して重鎖に接続され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖または軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋をさらに有する。各重鎖には、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後にいくつかの定常領域がある。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端には定常領域がある。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と整列する。
天然の抗体において、変異性は抗体の可変領域全体に均等に分布しておらず、軽鎖と重鎖可変領域の中の、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変領域のより保存的な部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、三つのＣＤＲで接続される四つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域の近くで一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合サイトの形成に寄与する［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、免疫学的目的のタンパク質配列国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）参照］。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接に関与しないが、様々なエフェクター機能を示し、例えば、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する。
本文で使用される抗体は、完全な抗体分子または「抗体フラグメント」であってもよい。本文で使用される「抗体フラグメント」は、完全抗体の抗原結合サイトまたは可変領域を含む完全抗体の一部分として定義され、その部分は、定常重鎖ドメイン（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４、完全抗体のＦｃ領域の抗体アイソタイプによる）を含まない。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。
抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合サイトを持つ「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる二つの同一の抗原結合フラグメントと、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残留「Ｆｃ」フラグメントを生成する。「Ｆａｂ」フラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントとＦａｂフラグメントとの違いは、抗体ヒンジ領域からの一つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたことにある。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を指す。ペプシン消化の産物であるＦ（ａｂ’）２のヒンジシステインのジスルフィド結合を切断することにより、Ｆ（ａｂ’）フラグメントが生成される。
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識及び結合サイトを含む抗体フラグメントであり、緊密に非共有結合されている一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域の二量体からなり、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」フラグメントは、一つの単鎖ポリペプチド鎖の柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されている一つの重鎖可変領域と一つの軽鎖可変領域とからなる。この構成では、重鎖と軽鎖の各可変領域の三つのＣＤＲは相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合サイトを規定する。合計六つのＣＤＲが抗体の抗原結合特異性を付与する。
本発明の一部の実施形態では、二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体を含む）は、ｓｃＦｖを含む第１の抗原結合部を含み、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、後者はｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までであり、もしくは、軽鎖の可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを含み、後者はｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までである。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、任意の抗ＣＤ３抗体、抗４－１ＢＢ抗体または抗ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４抗体に由来する抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４ ｓｃＦｖであってもよい。本発明の一部の実施形態では、二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体を含む）は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖに融合する第１のＦａｂを含む第２の抗原結合部を含み、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にＦｃドメインに融合する。好ましい実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＴＳＡとＴＡＡ抗原（抗ＴＳＡ Ｆａｂまたは抗ＴＡＡ Ｆａｂ）に特異的に結合する。Ｆａｂフラグメントは、任意の抗原に対する任意抗体に由来してもよく、前記抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択されるものである。
本文で使用されるように、用語の「抗原結合部」とは、抗原に特異的に結合するポリペプチドをいう。本発明では、第１の抗原結合部と第２の抗原結合部は、少なくとも二つの異なる抗原に結合する。例えば、第１の抗原結合部は、Ｔ細胞活性化抗原に結合し、第２の抗原結合部は、癌細胞により発現されるタンパク質のような標的細胞抗原に結合する。構造において、抗原結合部は抗体に由来するフラグメントを含み、例えば、ペプチドリンカーを介して接続するＦａｂとｓｃＦｖフラグメントを含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子（Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体）は、第１のサブユニットと、安定的に接合できる第２のサブユニットとを含むＦｃドメインを含む。
「Ｆｃドメイン」は「Ｆｃ領域」ともいい、結晶化可能なフラグメントドメインが抗体のテール領域であり、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と補体系のいくつかのタンパク質と相互作用することを意味する。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃドメイン（領域）は二つの同一のサブユニット（第１のサブユニットと第２のサブユニット）からなり、各サブユニットは、抗体重鎖に由来するＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインからなる；ＩｇＭとＩｇＥ Ｆｃドメイン（領域）は二つの同一のサブユニット（第１のサブユニットと第２のサブユニット）からなり、各サブユニットは、抗体重鎖に由来するＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４定常ドメインからなる。Ｆｃドメインは、様々な細胞受容体と補体タンパク質に結合する。このようにして、抗体の異なる生理学的効果を媒介する。
Ｆｃドメイン（領域）は抗体重鎖のＣ末端領域に位置する。境界はわずかに異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６からカルボキシ末端まで伸びていると定義されている。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＣＨ２とＣＨ３との二つの定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインともいう）は、通常アミノ酸２３１からアミノ酸３３８まで伸び、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは通常アミノ酸３４２から４４７まで伸びる。
用語の「ヒンジ領域」は、通常ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びると定義される。最初と最後のシステイン残基を同じ位置における重鎖間ＳＳ結合を形成することにより、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域をＩｇＧ１配列と整列させることができる。上述のように、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４に由来し、好ましくは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの結合を促進する一つまたは複数の修飾を含み、例えば、ノブイントゥホール構造を形成することで結合を強化する。Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸残基を、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することにより、このようなピンホールに結合した構造を形成することができ、これによってＣＨ３ドメイン内に突起（ノブ）を形成し、さらにより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸を置換して第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞（ホール）を形成し、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの安定した接合を促進するように、突起は空洞に突出可能である。
Ｆｃドメインを変えると重鎖ヘテロ二量体の生成を促進することができ、これによって二つの異なる重鎖と軽鎖のペアを含む二重特異性抗体が生じる。ヘテロ二量体の形成を促進するために、上述のように、一対のＦｃサブユニット間の界面を設計して、例えば、ノブイントゥホール構造を導入してヘテロ二量体の割合を最大にする。これによって、アイソタイプ二量体のようなその他の望ましくない最終生成物に対するヘテロ二量体の収率を高めるためのメカニズムが提供される。ＣＨ３修飾は、例えば、一つの重鎖上のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａともう一つの重鎖上のＴ３６６Ｗ；一つの重鎖上のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗともう一つの重鎖上のＹ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含む。米国特許第７，１８３，０７６号には別の改善が記載されており、その結果、一方の鎖に突起（ノブ）と他方の鎖に空洞（ホール）が形成され、また、Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７－６８１にも記載されている。ヘテロ二量体を生成するために使用できるその他の修飾は、静電的に整合したＦｃサブユニットの共発現によるヘテロ二量化をもたらすように、Ｆｃ二量体界面を貫通する電荷極性を変更するものを含むが、これらに限られていない。電荷極性を変更する修飾は、以下のものを含むが、それらに限られていない：
Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ４３９Ｄ Ｄ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ４０９Ｄ
Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｅ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｅ Ｄ３９９Ｒ
Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｒ
Ｄ３３９Ｋ Ｅ３５６Ｋ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ４３９Ｄ Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５６Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ３７０Ｄ
Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３９２Ｄ
Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ Ｄ３９９Ｋ
Ｋ４０９Ｄ／Ｋ３６０Ｄ Ｄ３９９Ｋ。
それらはＷＯ２００７／１４７９０１や、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、２０１０、ＪＢＣ ２８５：１９６３７－４６にも開示されている。また、Ｄａｖｉｓら（２０１０、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５－２０２）は、ヒトＩｇＧとＩｇＡ ＣＨ３ドメインの誘導体である鎖交換工程化ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ドメインを使用したヘテロ二量体Ｆｃプラットフォームについて説明している（ＷＯ２００７／１１０２０５も参照）。
Ｆｃドメインのその他の修飾および／または置換および／または付加および／または欠失は、安定した接合を実現するため、および／またはヘテロ二量体の形成を促進するためであることは、当業者にとって自明である。本分野で開示されたこれらのＦｃ変異体は、本発明に開示されたＦｃドメインと組み合わせることができ、Ｆｃ変異体を開示したそれらの文献は、参照としてその全体が本出願に組み込まれる。
本文で使用するＦｃドメインの「サブユニット」とは、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドのうちの一つ、すなわち、安定的に自己接合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドをいう。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２とＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
抗体に言及する場合、各ドメインのアミノ酸の割り当ては、引用により明確に本文に組み込まれたＫａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７と１９９１）に合致する。本明細書において、ＩｇＧ重鎖の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスの番号付けであり、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の番号付けを指す。
本文で使用されるように、用語の「癌」とは、細胞の異常、且つ制御されない成長によって引き起こされる新生物または腫瘍をいう。本文で使用されるように、癌は明確に、白血病とリンパ腫とを含む。一部の実施形態では、癌とは、局部の良性腫瘍をいう。その他の実施形態では、癌とは、隣接する身体構造に侵入して破壊し、遠隔部位に広がった悪性腫瘍をいう。一部の実施形態では、癌は特定の癌抗原に関連している。
以下は、特定の実施例および特定の図面を参照にして本発明について説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書および請求の範囲で使用される「含む」という用語は、その他の要素やステップを除外しない。単数名詞に言及する時に不定冠詞または定冠詞を使用する場合、例えば、「一つ」または「前記」、「上記」を使用する場合、特に説明しない限り、該名詞の複数形をも含む。
本文で特に定義しない限り、用語または定義は、本発明の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。遺伝子工学技術で一般的に使用されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、クローニング、トランスフェクション、形質導入、発現などの用語および方法に関して、当業者は特に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照することができる。
本発明の二重標的抗原結合分子
本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子に係り、第１の抗原結合分子抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。好ましい実施形態では、二重標的抗原結合分子はさらに、安定的に接合できる第１と第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗原結合抗体であり、または、Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原とに特異的に結合できるフラグメントである。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子に係る。一部の実施形態では、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、方向を逆転させることができる。一部の実施形態では、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１のＦａｂは、Ｆｃドメインに融合したｓｃＦｖに融合し、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインに融合する。よって、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドの一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＦｃまたはＮ－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－Ｆｃとして表され得、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドのもう一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第２のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得る。
一部の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合し、第２のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合する。一部の実施形態では、第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端に融合する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は、方向を逆転させることができる。よって、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドの一つの構造は、Ｎ－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（第１のＦａｂ）－ＦｃまたはＮ－ＶＨ（ｓｃＦｖ）－ＶＬ（ｓｃＦｖ）－ＶＨ（第１のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得、組み立てられた二重標的抗原結合分子のポリペプチドのもう一つの構造は、Ｎ－ＶＨ（第２のＦａｂ）－Ｆｃとして表され得る。
本発明の二重標的抗原結合分子を組み立てるために、抗体に由来するＣＤＲ、ＦＲ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３などの部分は、リンカーによって互いに融合することができる。好ましくは、本文に記載のペプチドリンカー（ＧｘＳｙ）ｎ、または共有結合、例えば、末端カルボキシおよびアミノ基によって形成されるペプチド結合を介して融合する。
第１の抗原結合部と第２の抗原結合部により、本発明の二重標的抗原結合分子はＴ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、抗原に対して選択的であり、しかも望ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できる結合をいう。特異的に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者が熟知している他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃоｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））と従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定できる。一実施形態では、無関係なタンパク質への抗原結合部の結合程度は、例えば、ＳＰＲにより測定された、抗原結合部と抗原との結合の約１０％未満である。
抗原結合分子または同族抗原に結合する抗体の能力は、「親和性」によって決定することができる。「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合サイトとその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本文で使用されるように、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができ、解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と接合速度定数との比率（それぞれｋоｆｆとｋоｎである）である。よって、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む、本分野で既知の実証済みの方法によって測定することができる。
さらに好ましい実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域に、少なくとも一部の定常領域を含む「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」を含む。例えば、ＩｇＧ ＣＨ２とＩｇＧ ＣＨ３はサブユニットを形成することができ、しかも本文に記載の抗原結合分子または抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットを含み、さらに、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットとの接合を促進しながらＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとを接合してアイソタイプ二量体を形成することを低減または阻止する修飾を含む。本文で使用される接合を促進する修飾は特に、結合することが望まれる二つのＦｃドメインのサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニット）のそれぞれに対して行われる単独の修飾を含み、前記修飾は、二つのＦｃドメインのサブユニットの接合を促進するように相補的である。例えば、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインのサブユニットの一つまたは二つの構造または電荷を変えてそれらの空間上または静電上の結合に寄与する。そのため、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドとの間に発生し、それらは各サブユニット（例えば抗原結合部）に融合するさらなる成分という意味で同一ではないかもしれない。一部の実施形態では、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインにおけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。一つの具体的な実施形態では、接合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのそれぞれの単独のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの接合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、該方法は、二つのＦｃドメインのサブユニットの界面にある一つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置換することに係り、これによって、アイソタイプ二量体の形成は静電的に不利になるに対して、ヘテロ二量化は静電的に有利になる。
例えば、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基によるＴ３６６の置換を含み、もう一つのサブユニットは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基によるＴ３６６、Ｌ３６８、および／またはＹ４０７の一つまたは複数の置換を含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋを含み、もう一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅを含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子の一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄを含み、もう一つのサブユニットは、アミノ酸変異Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）を含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子はさらに、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、例えば、前記一つまたは複数のアミノ酸置換のサイトは、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択されるサイトである。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子はさらに、ＩｇＧ４のＳ２２８（好ましくはＳ２２８Ｐ）サイト上の置換を含む。
本発明の二重標的抗原結合分子の調製
本発明の二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含み、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む。
前記ｓｃＦｖとＦａｂ分子は、既存技術のいずれか、または将来のｓｃＦｃとＦａｂ分子であってもよい。それらは、マウス、ヤギ、ウサギ、およびヒトを含むがこれらに限定されない任意の種の天然抗体に由来してもよく、または組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化および／またはインビトロ生成（例えば、ファージディスプレイによりスクリーニングされる）したものであってもよい。例えば、ｓｃＦｖとＦａｂ分子は、目的の抗原を使用して動物を免疫し、続いて目標の抗体フラグメントのｍＲＮＡを単離し、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって獲得することができ、これによって何百万ものクローン化された目標の抗体フラグメントを含む遺伝子ライブラリーを生成する。ファージディスプレイやリボソームディスプレイなどのスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンの特定に役立つ。別の方法では、事前に免疫されていない動物の遺伝子ライブラリーが使用される。このような天然ライブラリーは通常、目的の抗原に対する親和性が低い抗体のみを含み、追加のステップとしてランダム突然変異誘発を使用して親和性の成熟化をすることが必要となる。最も効果的なクローンが特定されると、それらのＤＮＡ配列が最適化され、例えば、それらが酵素に対する安定性を改善する。もう一つの目標は、抗体に対するヒト生物体の免疫応答を防ぐためのヒト化である。最後のステップは、大腸菌、サッカロミセスセレビシエまたはその他の適切な生物体で最適化された抗体フラグメントを翻訳することである。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂはいずれも抗ＣＤ２０ Ｆａｂである。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５、１８、１９、および２０からなる群より選択される一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは同じであり、しかもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、５、８、９、および１０からなる群より選択される六つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、第１のＦａｂと第２のＦａｂは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を含み、もしくは前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ ｓｃＦＶは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７とは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、しかもＣＤ３ ｓｃＦｖは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される重鎖と軽鎖の可変領域を含む。
本発明の二重標的抗原結合分子は、異なる抗原結合部を含み、一実施形態では、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方または他方に融合するので、Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、通常、二つの異なるポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え共発現及びその後の二量化により、二つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせがもたらされる。組み換え生産における二重標的抗原結合分子の収率および純度を高めるために、二重標的抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの接合を促進する修飾を導入することが有利である。
よって、特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの二つのサブユニット間の最も広範なタンパク質‐タンパク質間相互作用のサイトは、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施形態では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。一つの具体的な実施形態では、前記修飾はいわゆる「ノブイントゥホール」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方における「ノブ」修飾と、二つのサブユニットの他方における「ホール」修飾とを含む。ノブイントゥホール技術は、例えば、ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）、およびＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。通常、該方法は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入することと、第２のポリペプチドの界面にそれ対応に空洞（「ホール」）を導入することに係り、これによって、ヘテロ二量体の形成を促進しながらアイソタイプ二量体の形成を阻害するように突起が空洞に位置付けられる。突起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより調製できる。例えば、サイト特異的変異誘発またはペプチド合成により調製できる。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットの接合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されているように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、該方法は、二つのＦｃドメインのサブユニットの界面にある一つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置換することに係り、これによって、アイソタイプ二量体の形成は静電的に不利になるに対して、ヘテロ二量化は静電的に有利になる。
一局面において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部と、第１と第２のサブユニットからなるＦｃとを含む二重標的抗原結合分子を提供し、第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含み、第１のサブユニットと第２のサブユニットは、ヘテロ二量体の形成に静電的に有利な一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている。
Ｆｃドメインは、長い血漿半減期を含む有利な薬物動態特性を二重標的抗原結合分子に付与するとともに、二重標的抗原結合分子が抗原標的細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞を標的化すること（望ましくない）をもたらし得る。したがって、特定の実施形態では、本発明による二重標的抗原結合分子は、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施形態では、二重標的抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満の結合親和性、および／または５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満のエフェクター機能（天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを含む二重標的抗原結合分子と比べて）を示す。一つの具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびサイトカイン分泌物からなる群より選択される一つまたは複数である。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する実質的に類似した結合親和性を保持することが望まれる。
一実施形態では、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性および／またはエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、例えば、その全体が参照にして本文に組み込まれるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載されるようなアミノ酸置換である。また、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３は、このような突然変異体Ｆｃドメインを調製する方法、およびその特性（例えば、Ｆｃ受容体の結合またはエフェクター機能）を確定する方法を記載している。
本発明の二重標的抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成）または組み換え生産により得ることができる。組み換え生産では、二重標的抗原結合分子（フラグメント）をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニングおよび／または発現のためにそれを一つまたは複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドを従来の方法を使用して容易に単離および配列決定することができる。一実施形態では、本発明の一つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、二重標的抗原結合分子（フラグメント）のコード配列を含む発現ベクター及び適切な転写／翻訳制御シグナルを構築することができる。これらの方法として、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組み換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術、およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照できる。
治療的使用
本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍、特にヒト腫瘍を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍細胞の細胞溶解を誘導することができる。特定の実施形態では、本発明の二重標的抗原結合分子は、腫瘍細胞の成長を阻害することができる。
疾患の治療のために、本発明の二重標的抗原結合分子の適切な用量（単独でまたは一つまたは複数のその他の追加の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療する疾患の種類、投与経路、患者の体重、疾患の重症度および経過、予防または治療目的、以前または同時の治療的介入、患者の臨床病歴および本発明の二重標的抗原結合分子に対する反応、並びに主治医の自由裁量によるものである。いずれにしても、投与を担当する開業医は、組成物における活性成分の濃度および個体被験者の適切な用量を決定する。本文では、様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投与計画が考慮される。
本発明の二重標的抗原結合分子は、一回または一連の治療にわたって患者に投与することに適する。疾患の種類および重症度に応じて、本発明の二重標的抗原結合分子の約１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）は、患者に投与する初期候補用量であり得る。例えば、一回または複数回の単独投与、または持続注入によって投与する。上記の要因に応じて、典型的な１日量は約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇ以上である場合がある。しかし、他の投与計画が利用できる場合もある。
治療の進行は、従来の技術によって容易に監視することができ、治療有効量の決定は、特に本文で提供される詳細な開示内容によって、完全に当業者の能力の範囲内である。投与量および間隔を個別に調整して、治療効果を維持するのに十分な本発明の二重標的抗原結合分子の血漿レベルを提供することができる。注射による投与のための通常の患者用量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日であり、一般的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日である。
医薬組成物及び製品
本発明はまた、本発明の二重標的抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。用語の「薬学的に許容される担体」とは、使用される投与量および濃度での非毒性レシピエントを指し、動物（例えば、ヒト）に適切に投与される場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不良反応を引き起こさない。薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、接着剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、類似物質およびそれらの組み合わせを含み、当業者に知られているように（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、第１２８９～１３２９頁を参照として本文に組み込む。
本発明の二重標的抗原結合分子は、治療において一つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の二重標的抗原結合分子は、少なくとも一つの追加の治療薬と同時投与することができ、相補的活性を有し、副作用を有さない。追加の治療薬は、癌の化学療法薬、例えば免疫調節薬および細胞抑制薬を含む。本発明の二重標的抗原結合分子および治療における一つまたは複数のその他の薬剤は、製品の異なる容器に入れられることができる。一部の実施形態では、製品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルとを含む。適切な容器は、ボトル、バイアル、注射器、静脈注射溶液バッグなどを含む。ラベルまたはプロトコルは、治療における本発明の二重標的抗原結合分子と一つまたは複数のその他の薬剤と使用、並びに、本発明の二重標的抗原結合分子および一つまたは複数のその他の薬剤を必要とする疾患の治療方法を示す。また、前記製品は、その他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含む、商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質を収容する一つまたは複数の容器を含むことができる。
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の分子構造設計および検証研究
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭの設計
本発明は、改善されたＩｇＧ４構成を使用して新規な二重特異性結合抗体を構築する。以下のように簡単に説明する。ＩｇＧ４のＦａｂアームの交換を防止するようにＩｇＧ４のＳ２２８サイトをＰに変異させ、Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａ変異は、高親和性Ｆｃ受容体への結合を減少させる。一つの側アームのみがＣＤ３に特異的に結合するため、新しいＴＲＡＢｓが低親和性でＴ細胞に一価で結合し、該特異性抗体が標的腫瘍細胞により多共価方式でＴ細胞に提示されない限り、当該親和性は、ＣＤ３を介したＴ細胞活性化を引き起こさない。
上記設計に基づき、新しいＴＲＡＢ二重特異性抗体は次の特徴と成分を有する。すなわち、１）一つのＴ細胞エンゲージメント成分：抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨのタンデム型）；２）腫瘍細胞ターゲティング成分：抗腫瘍関連抗原ＴＡＡのＩｇＧ４モノクローナル抗体、一つの重鎖はＴ３６６Ｗ変異を有し、もう一つの重鎖はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を有する；抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを、３）抗ＴＡＡ ＦａｂとＴＲＡＢ分子の重鎖領域のヒンジＦｃ領域との間に挿入し、後者はノブ変異を固定し、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）に基づくリンカーを介して抗ＴＡＡ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端に接続され、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭと命名される；４）あるいは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）に基づくリンカーを介してノブ変異の重鎖上に接続されて固定され、ＳоｍＢｏｄｙＴＭと命名される。それぞれ一つの軽鎖と二つの異なる重鎖をコードするｃＤＮＡを使用したプラスミドをＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションしたことにより、安定したノブイントゥホールヘテロ二量体のＩｇＧ４様ＢｓＡｂ（図１Ａと１Ｂ）が形成され、それをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。
図１Ａと１Ｂに示すように、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭとＳоｍＢｏｄｙＴＭＴＲＡＢはいずれも下記のものを含む。すなわち、１）Ｔ細胞エンゲージメント成分、すべてのＴＲＡＢで共有されるＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ方向の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ；２）一つの重鎖がノブ（Ｔ３６６Ｗ）変異を有し、もう一つの重鎖がホール（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）変異を有する、ＩｇＧ４ｍＡｂを標的とする腫瘍関連抗原；（Ａ）ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの場合、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを抗ＴＡＡ ＦａｂとＴＲＡＢ分子のＨ鎖上のヒンジＦｃ領域との間に挿入し、該領域はノブ変異を含み、抗ＴＡＡ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）のＣ末端（（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーを介して）に共有結合し、ｎ＝１または２である；（Ｂ）ＳоｍＢｏｄｙＴＭの場合、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖをそのＨ鎖上の（Ｇ４Ｓ）ｎに基づくリンカーを介して抗ＴＡＡ ｍＡｂのＮ末端に共有結合し、重鎖はノブ変異を固定し、ｎ＝１または２である。
検証研究
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の構造の実現可能性を検証するために、本発明は、図２～５に示す一連のＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体を構築し、発現して精製した後、プロ―サイトメトリーによってヒトＢ細胞およびＴ細胞への結合活性を評価した。本検証研究では、ヒト化ムロモナブ‐ＣＤ３およびＦＤＡ承認のオファツムマブ配列が使用された。
ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（分子Ａと分子Ｂ）は、二つの同一の重鎖（抗ＣＤ２０‐リンカー‐抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４融合タンパク質）を含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨであり、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）である。図２を参照できる。
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は、二つの異なる重鎖を含み、一つの重鎖は、抗ＣＤ２０重鎖可変領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とからなり（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む）、もう一つの重鎖は、抗ＣＤ２０ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）、（Ｇ４Ｓ）２、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ）、および、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ４（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）からなる。図３を参照できる。
追加のＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体（分子Ｃと分子Ｄ）は、二つの同一の重鎖（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ‐リンカー‐抗ＣＤ２０－ＩｇＧ４ＰＡＡ融合タンパク質）を含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ構造は、ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨであり、リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎ＝１または２）である。図４を参照できる。
最後に、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は、二つの異なる重鎖を含み、一つの重鎖は、抗ＣＤ２０重鎖可変領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とからなり（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異を含む）、もう一つの重鎖は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＬまたはＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ）、（Ｇ４Ｓ）２、抗ＣＤ２０ Ｆａｂ（ＶＨ－ＣＨ１）、および、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ４（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）からなる。図５を参照できる。
Figure 2022508529000042
具体的な配列は下記通りである：
SEQ ID NO:1
Gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggcaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttaatgattatgccatgcactgggtccggcaagctccagggaagggcctggagtgggtctcaactattagttggaatagtggttccataggctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtccctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtattactgtgcaaaagatatacagtacggcaactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
SEQ ID NO:2
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:3
GFTFNDYA
SEQ ID NO:4
ISWNSGSI
SEQ ID NO:5
AKDIQYGNYYYGMDV
SEQ ID NO:6
Gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
SEQ ID NO:7
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:8
QSVSSY
SEQ ID NO:9
DAS
SEQ ID NO:10
QQRSNWPIT
SEQ ID NO:11
caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagcaccgacaagagcaagagcaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca
SEQ ID NO:12
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:13
GYTFTRYT
SEQ ID NO:14
INPSRGYT
SEQ ID NO:15
ARYYDDHYSLDY
SEQ ID NO:16
Gacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgcagcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagacccccggcaaggcccccaagcgctggatctacgacaccagcaagctggccagcggcgtgcccagccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccttcaccatcagcagcctgcagcccgaggacatcgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccttcaccttcggccagggcaccaagctgcagatcacc
SEQ ID NO:17
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQIT
SEQ ID NO:18
SSVSY
SEQ ID NO:19
DTS
SEQ ID NO:20
QQWSSNPFT
SEQ ID NO:21
caggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcaaggccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaaggtgaaggaccgcttcaccatcagccgcgacaatagcaagaacaccgccttcctgcagatggacagcctgcgccccgaggacaccggcgtgtacttctgcgcccgctactacgacgaccactactcgctggactactggggccagggcacccccgtgaccgtgtcctca
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳｏｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の遺伝子合成、プラスミド構築
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体を調製するために、以下に説明するように重鎖および軽鎖プラスミドをそれぞれ構築した。詳細は次の通りである：
まず、抗ＣＤ２０重鎖‐ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）およびホール変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を含むＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、Ｎｏｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクターｐＣＤＮＡ３．３にクローニングして抗ＣＤ２０重鎖ＩｇＧ４ＰＡＡを含むプラスミド＃１２５０９を構築した。次に、抗ＣＤ２０抗体軽鎖のＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、ＮｈｅＩ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクターｐＣＤＮＡ３．３にクローニングして抗ＣＤ２０軽鎖を含むプラスミド＃１２５０１を構築した。Ｑ５(R) Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔｌｏｇ＃Ｅ０５５２Ｓ）を介して、下記のプライマーペアを使用した：
フォワードプライマー１：5’-GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT-3’;
SEQ ID NO:23
リバースプライマー１：5’-TGGTTCTTGGTCATCTCCTCCTGGGATG-3’ ;
SEQ ID NO:24
フォワードプライマー２：5’-CTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCG-3’ ;
SEQ ID NO:25
リバースプライマー２：5’-GAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGC-3’
SEQ ID NO:26。
プラスミド＃１２５０９のＦｃ領域（Ｓ３６６、Ａ３６８、Ｖ４０７）サイトを、ホール変異の抗ＣＤ２０重鎖‐ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）を含まないプラスミド＃１３１６６に変異させた。
そして、ＣＨ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗‐ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇＧ４ＰＡＡ（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含むＤＮＡフラグメント（配列＃３と＃４）を全遺伝子合成し、ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化をしてプラスミド＃１２５０９にクローニングして元の抗体定常領域ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３領域を置き換えて、プラスミド＃１４６０６と＃１３６７２を生成した。抗‐ＣＤ３（＃１または＃２）ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）－（Ｇ４Ｓ）２－抗‐ＣＤ２０ ＶＨを含むＤＮＡフラグメントを全遺伝子合成し、ＮｈｅＩ／Ｎｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより二重消化をしてベクター＃１３１６６にクローニングしてプラスミド＃１３７３５と＃１３７３６を構築した。そして、Ｑ５(R) Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔｌｏｇ＃Ｅ０５５２Ｓ）を介して、下記のプライマーペアを使用した：
（１）フォワードプライマー：
5’-AACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC-3’
SEQ ID NO:27
（２）リバースプライマー：
5’-CTTGGTCATCTCCTCCTGGGATGGGGGCAGGGTGTACA-3’
SEQ ID NO:28
それぞれプラスミド＃１４６０６、＃１３６７８、＃１３７３５、および＃１３７３６からノブ変異（Ｔ３６６Ｗ）を有するプラスミド＃１４６０６、＃１３６７８、＃１３７３７、および＃１３７３８を生成した。構築できたプラスミドはそれぞれ表１に示し、概略図を図６に示す。
Figure 2022508529000043
抗体発現、精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
表２に挙げられた組み合わせに従って、重鎖と軽鎖をコードするプラスミドを混合し、２００ｍｌのＥｘｐｉ－ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２７）に同時トランスフェクションして、対応する二重抗体を発現させた。トランスフェクションしたＥｘｐｉ－ＣＨＯ－Ｓ細胞を３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに置いて８～１０日間培養した後、細胞培養上清を取り、ＧＥ仕入先が推奨した方法に従ってＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃ＧＥ－１７５４３８０４）にロードしてて目標の抗体を溶出して単離し、最終的に目標の抗体を１×ＰＢＳバッファーに置き換えた。
ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体について、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後、ＧＥＨＰ－ＳＰ陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃２９０５１３２４）を用いて二番目の精製ステップを行い、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭまたはＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体の溶出条件を最適化するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズエクスクルーシブクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、還元および非還元キャピラリー電気泳動（Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）などの分析方法によって異なる溶出画分を収集し評価した。最後に、２８０ｎｍの条件下での吸光係数を利用してＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｉｍｐｌｅｎ，ＮａｎｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ(R)ＮＰ８０－Ｔоｕｃｈ）によって検測して抗体総収量を計算した。
Figure 2022508529000044
３μｇの目標抗体タンパク質サンプルを４×タンパク質サンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ＃ＮＰ００７）に置いて６５℃で５～１０分間インキュベーションし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でタンパク質純度を評価し、８％非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して非還元状態の目標被験抗体の分子サイズ、純度、および凝集状況を特定した。
図７は、ワンステッププロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後の非還元条件下での目的の抗体の純度を示す。各被験抗体は、１８０ＫＤａを超える一つのメインバンドを有し、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭ二重特異性抗体は９５～１８０ＫＤａの間に低分子量バンドを有する。
ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＣＤ２０×ＣＤ３ ＳоｍＢｏｄｙＴＭは陽イオン交換精製を経て、異なる溶出画分を収集し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を図８～図１１に示す。各被験抗体の最適な溶出画分（ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ：ＣＥＸ溶出画分１、ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ｂ：ＣＥＸ溶出画分３、ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｃ：ＣＥＸ溶出画分７、ＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｄ：ＣＥＸ溶出成分２）を取って更なる質量分析を行った。
被験抗体ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて実施例３の最適な溶出画分に対して質量分析を行った。被験抗体をｄｄＨ２Ｏで１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００）のカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ）に入れた。移動相は５０ｍＭ ＰＢ溶液（ｐＨ７．０）と３００ｍＭ ＮａＣｌであり、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎであり、ＵＶ吸光度は２８０ｎｍである。データ分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアを使用して行った。
図１２に示すように、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＡおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｃのメインピークの割合は９０％を超え、少量の低分子量（ＬＭＷ）フラグメントまたは高分子量（ＨＭＷ）凝集体が伴われる。ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－ＢおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ－Ｄのメインピークの割合は６４％を超え、多い高分子量凝集体（＞２５％）が伴われる。すべての被験抗体のＨＭＷ凝集体、モノマーのメインピーク、およびＬＭＷフラグメントの割合の詳細は表３に示される。
Figure 2022508529000045
非還元および還元ＣＥ－ＳＤＳ分析
キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ，Ｂｅｃｋｍａｎキャピラリー５０ｕｍＩＤ×２０ｃｍ）を使用して実施例３の被験抗体の最適な溶出画分の純度を分析した。ＳＤＳ－ＭＷ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｓｍａｒｔ Ｔｅｃｈ． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｃａｔ＃ＢＳＹＫ０１８）を使用して下記の方法に従って被験抗体に対して還元および非還元処理を行った。非還元：１００μｇの被験抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのヨードアセトアミドを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。還元：１００μｇの被験抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのβ－メルカプトエタノールを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。それぞれキャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、モデル：ＰＡ８００ｐｌｕｓ）を用いて純度分析をした。
その結果、非還元（ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳ）条件下で、本発明の分子Ａ、分子Ｂ、分子Ｃおよび各ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ／ＳоｍＢｏｄｙＴＭの純度はいずれも９０％以上に達した。分子Ｄのメインピークの純度は低く、より高い割合のフラグメントピークが現れた。還元（Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳ）条件下で、本発明の各分子は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに類似した結果を有する。詳細な結果を図１３～１４および表４～５に示す。
Figure 2022508529000046
Figure 2022508529000047
ヒトＢ細胞及びＴ細胞に対する被験抗体のインビトロ結合活性
ヒトＢ細胞（Ｒａｊｉ）またはＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を１×ＰＢＳで一回洗浄した後、１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ溶液に懸濁し、１×１０５／ウェル、５０μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。５０μＬ／ウェルの被験抗体（１０μｇ／ｍＬから３倍勾配希釈）を細胞懸濁液に加え、氷上で６０分間インキュベーションしてから遠心分離し、冷１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を二回濯いだ。そして、各ウェルに１：２００に希釈した１００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ標識抗体（Ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ９８５９６）と細胞を加え、氷上で６０分間インキュベーションしてから遠心分離し、冷１×ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで細胞を二回濯いだ後、それを改めて２００μＬ ＰＢＳ＋１％ＦＢＳに懸濁し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ＨＴフローサイトメトリー（ＭＥＲＣＫ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でＭＦＩ（平均蛍光強度）シグナルを検出して、ヒトＢ細胞及びＴ細胞に対する異なる濃度の被験抗体の結合活性を評価した。Ｇｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアで非線形回帰曲線を作成し、ヒトＢ細胞またはＴ細胞に結合した抗体のＥＣ５０を用量‐反応曲線の関係から計算した。
すべての被験抗体（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭ）はヒトＢ細胞（Ｒａｊｉ）で生成した蛍光シグナルが濃度依存性を有し、陽性コントロール（抗‐ＣＤ２０ ＩｇＧ４ＰＡＡ）に類似した結合活性を示した（図１５、図１６、および表６、表７）。陽性コントロール（抗‐ＣＤ２０ ＩｇＧ４ＰＡＡ）と比べて、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭはより高い結合曲線レベルを備えている。
Figure 2022508529000048
Figure 2022508529000049
陽性コントロール（抗‐ＣＤ３ Ｍ１ ＩｇＧ４ＰＡＡ）と比べて、ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭおよびＳоｍＢｏｄｙＴＭは、ヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）への結合活性が異なる程度の低下を示し（図１７、図１８）、そのＥＣ５０値の詳細は表８、表９に示される。
Figure 2022508529000050
Figure 2022508529000051
ヒト末梢血Ｔ細胞が指向的にヒトＢリンパ腫細胞を殺傷するインビトロ実験
ＣＤ２０陽性ダウディ（Ｄａｕｄｉ）細胞を標的細胞として、ＨＥＰＥＳ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ／１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で一回洗浄し、２Ｅ４細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。新たに単離したヒトＰＢＭＣｓをエフェクター細胞とし、ＲＰＭＩ １６４０培地で一回洗浄し、２Ｅ５細胞／ウェル、５０μｌ／ウェルの密度で対応する９６ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞と標的細胞との比率は１０：１（Ｅ：Ｔ＝１０：１）であった。次に、２０μｌの対応する被験抗体（１００μｇ／ｍｌから１０倍勾配希釈）を加え、３７℃で５％ＣＯ２条件下で１日間インキュベーションした。翌日、プレートを取り出して２２℃に置き、陽性コントロールウェル（Ｄａｕｄｉ細胞のみを含む）内に１５μｌのライセートを加え、３５０×ｇの条件下で３０分間遠心分離した。
実験用９６ウェルプレートから５０μｌの上清を取り、新しい９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ｃａｔｌｏｇ＃３５９９）に入れ、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ９６(R)試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔｌｏｇ＃Ｇ１７８０）を各ウェルに添加した。暗所で室温で３０分間インキュベーションし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して波長４９０ｎｍまたは４９２ｎｍで吸光度を測定し、試験ウェル細胞分裂の割合を計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて非線形回帰曲線に適合させ、半分最大有効濃度（ＥＣ５０）を用量‐反応曲線の関係から計算した。
その結果の詳細は図１９、表１０に示される。
Figure 2022508529000052
Ｔ細胞活性化試験
実施例７の、ヒト末梢血Ｔ細胞が指向的にヒトＢリンパ腫細胞を殺傷するインビトロ実験と同時に、Ｔ細胞活性化の誘発に対するＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭの作用を評価した。具体的な実施工程は実施例７に記載されている。実施例７の各ウェルから５０μＬの上清を取って細胞毒性を評価した後、残りの細胞をＰＢＳ＋１％ＦＢＳで一回洗浄し、下記の抗体で細胞を染色して分析した。
染色の手順は次の通りである。
ＣＤ６９－ＰＥ、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ抗体を１：２５の比率でＰＢＳ＋１５ＦＢＳ溶液に希釈し、５０μＬ／ウェルで試験ウェルに加え、氷上で３０分間インキュベーションした。染色された細胞を遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳで二回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ＋１％ＦＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で検測した。その結果をＧｒａｐｈｐａｄ(R)Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて非線形回帰曲線に適合させ、半分最大有効濃度（ＥＣ５０）を用量‐反応曲線の関係から計算した。詳細は表１１、表１２、図２０に示される。
Figure 2022508529000053
Figure 2022508529000054
ＨＳＣ－ＮＳＧマウス体内のＢ細胞枯渇（減弱）実験
１２匹のメス重度免疫不全（ＮＳＧ、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスを取り、ｈＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を使用して２０～２４週間にわたってマウス免疫系を再構築し、体内のヒトＢ／Ｔ細胞を安定させた。Ｂ細胞の割合は約４５．８９％であり、ｈＣＤ４＋、ｈＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は平均でそれぞれ３８．２０％と８．６７％であった。
上記ＨＳＣ－ＮＳＧマウスをＡ（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ １μｇ／ｋｇ）、Ｂ（ＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａ １０μｇ／ｋｇ）、Ｃ（抗ＣＤ２０モノクロナール抗体（ＩｇＧ１）１００μｇ／ｋｇ）、Ｄ（抗ＣＤ２０モノクロナール抗体（ＩｇＧ１）５００μｇ／ｋｇ）の四つの群に分け、各群で３匹ずつとし、一回の静脈注射により投与した。詳細は表１３を参照できる。投与前および投与後１日、３日、７日目に眼窩から採血し（図２１）、各回８０μＬを取ってヘパリンナトリウムを含む試験管に入れた。新たに調製したＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ：ｄｄＨ２Ｏ（１：１）の溶液で赤血球を溶解し、残りの細胞を１０００μＬのＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で二回洗浄し、対応する検出インジケーターの抗体と氷上で３０分間インキュベーションした。さらに二回洗って、ＮｏｖｏＣｙｔｅ３１３０フローサイトメトリーでサンプルを分析した。検出指標は、ｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ４＋、ｈＣＤ８＋、ｈＣＤ２であった。
Ｂ細胞インデックスｈＣＤ１９＋／ｈＣＤ２‐の相対百分比を図２２に示し、Ｔ細胞インデックスｈＣＤ４＋／ｈＣＤ８＋／ｈＣＤ２＋の相対百分比を図２３、図２４に示す。
Figure 2022508529000055
質量分析：二重特異性抗体の構造
ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ６５３０Ｑ－ＴＯＦ）を用いて還元または非還元条件下でのＣＤ２０×ＣＤ３ ＳｉｍＢｏｄｙＴＭ－Ａの完全な分子量を測定した。被験抗体を５０μＬの０．０５Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で最終濃度１ｍｇ／ｍＬに希釈した。移動相は０．１％ギ酸と０．１％ギ酸‐アセトニトリル溶液であり、試験サンプルの添加量は１０μｇ／サンプルであった。図２５～図２７に示すように、実際に測定した分子量と理論分子量との差は１．４３Ｄａであり、軽鎖の差は０．１５Ｄａであり、重鎖１の差は０．５３Ｄａであり、重鎖２の差は０．３９Ｄａであった。

Claims (68)

  1. Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる第１の抗原結合部と、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２の抗原結合部とを含む二重標的抗原結合分子であって、
    第１の抗原結合部がｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合部が第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、二重標的抗原結合分子。
  2. 前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはｓｃＦｖのＮ末端からＣ末端までの軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１に記載の二重標的抗原結合分子。
  3. 安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む、請求項１または２に記載の二重標的抗原結合分子。
  4. 前記第２の抗原結合部は、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖに融合した第１のＦａｂを含み、第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合した第２のＦａｂを含む、請求項３に記載の二重標的抗原結合分子。
  5. 第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に融合している、請求項４に記載の二重標的抗原結合分子。
  6. 第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端に融合している、請求項４に記載の二重標的抗原結合分子。
  7. 前記第２の抗原結合部は、前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖに融合する第１のＦａｂを含み、且つ前記第２の抗原結合部は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインに融合する第２のＦａｂを含む、請求項３に記載の二重標的抗原結合分子。
  8. 第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端に融合している、請求項７に記載の二重標的抗原結合分子。
  9. 第１のＦａｂは、Ｆａｂ重鎖のＮ末端でｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端に融合している、請求項７に記載の二重標的抗原結合分子。
  10. Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合することができる一つ以下の抗原結合部を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  11. 第１と第２の抗原結合部はリンカーを介して互いに融合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  12. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１１に記載の二重標的抗原結合分子。
  13. 前記リンカーが（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、請求項１１に記載の二重標的抗原結合分子。
  14. ＦｃドメインがヒトＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項３～１３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  15. ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１４に記載の二重標的抗原結合分子。
  16. Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１と第２のサブユニットとの接合を促進する一つまたは複数の修飾を含む、請求項３～１５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  17. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて突起が生成され、アミノ酸残基のＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて空洞が生成され、前記突起は前記空洞に突出することができる、請求項１６に記載の二重標的抗原結合分子。
  18. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換された、請求項１７に記載の二重標的抗原結合分子。
  19. Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７から選択される一つまたは複数の残基は、より小さいアミノ酸残基を有する一つまたは複数のアミノ酸残基により置換された、請求項１７に記載の二重標的抗原結合分子。
  20. 前記Ｆｃドメインは第１のサブユニットにおいてＴ３６６Ｗ置換を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ置換を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  21. 天然のＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下および／またはエフェクター機能の低下を示す、請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  22. 前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項３～２１のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  23. 前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｐ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、請求項２２に記載の二重標的抗原結合分子。
  24. 前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａとの二つの、アミノ酸置換を含む、請求項２３に記載の二重標的抗原結合分子。
  25. 前記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  26. 前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  27. ＩｇＧ４のＳ２２８サイトにあるアミノ酸置換を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  28. Ｓ２２８サイトにあるアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである、項２７に記載の二重標的抗原結合分子。
  29. ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
    １）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＮ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＣ末端に融合し、または、ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖはＦｃドメインの第１のサブユニットに融合し、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基によるＴ３６６の置換を含み、
    ２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７の、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む、二重標的抗原結合分子。
  30. 前記Ｆｃドメインは、第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む、請求項２９に記載の二重標的抗原結合分子。
  31. 前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、項２９または３０に記載の二重標的抗原結合分子。
  32. 前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、請求項３１に記載の二重標的抗原結合分子。
  33. 前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａである、請求項３２に記載の二重標的抗原結合分子。
  34. ＩｇＧ４のＳ２２８のサイトにあるアミノ酸置換をさらに含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  35. Ｓ２２８サイトのアミノ酸置換はＳ２２８Ｐである、請求項３４に記載の二重標的抗原結合分子。
  36. 前記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して前記第１のＦａｂのＦａｂ重鎖に融合している、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  37. 前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、請求項３６に記載の二重標的抗原結合分子。
  38. ａ）安定的に接合できる第１及び第２のサブユニットからなるヒトＩｇＧのＦｃドメイン、ｂ）ｓｃＦｖを含む、Ｔ細胞活性化抗原に特異的に結合できる第１の抗原結合部、およびｃ）第１のＦａｂと第２のＦａｂとを含む、標的細胞抗原に特異的に結合できる第２の抗原結合部を含む二重標的抗原結合分子であって、
    １）ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のＣ末端、またはｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣ末端で、ｓｃＦｖは第１のＦａｂのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第１のＦａｂはＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに融合し、より大きい側鎖を有するアミノ酸残基でＴ３６６を置換することを含み、
    ２）Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２のＦａｂはＦｃドメインの第２のサブユニットに融合し、Ｔ３６６、Ｌ３６８および／またはＹ４０７の、より小さい側鎖体積を有する一つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む、二重標的抗原結合分子。
  39. 前記Ｆｃドメインは、第１のサブユニットでＴ３６６Ｗ置換を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットでＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ置換を含む、請求項３８に記載の二重標的抗原結合分子。
  40. 前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項３８または３９に記載の二重標的抗原結合分子。
  41. 前記一つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、およびＰ３２９からなる群より選択される一つまたは複数のサイトにある、請求項４０に記載の二重標的抗原結合分子。
  42. 前記Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合および／またはエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ／Ｆ２３４ＡとＬ２３５Ａである、請求項４１に記載の二重標的抗原結合分子。
  43. ＩｇＧ４のＳ２２８のサイトにある置換をさらに含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  44. Ｓ２２８サイトの置換はＳ２２８Ｐである、請求項４３に記載の二重標的抗原結合分子。
  45. 前記ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーを介して前記第１のＦａｂのＦａｂ重鎖に融合している、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  46. 前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳｙ）ｎであり、式中、ｘとｙはそれぞれ１～５から選ばれる任意の整数であり、ｎは１～５から選ばれる任意の整数である、請求項４５に記載の二重標的抗原結合分子。
  47. 前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、静電的にヘテロ二量体の形成を促進する一つまたは複数の荷電アミノ酸を含むように修飾されている、請求項３～４６のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  48. 前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｋ、および／またはＤ３９９Ｋのアミノ酸変異を含み、前記第２のサブユニットは、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｅ、および／またはＫ４３９Ｅのアミノ酸変異を含む、請求項４７に記載の二重標的抗原結合分子。
  49. 前記Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、Ｋ３９２ＤとＫ４０９Ｄのアミノ酸変異を含み、前記Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、Ｅ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＤＤＫＫ）のアミノ酸変異を含む、項４７に記載の二重標的抗原結合分子。
  50. 前記Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４からなる群より選択される何れか一つである、請求項１～４９のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  51. 前記標的細胞抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項１～５０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  52. 前記標的細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ホスファチジルイノシトールグリカン－３、メソセリン、栄養膜糖タンパク質（５Ｔ４）、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ１）、および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  53. 前記二重標的抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原と標的細胞抗原に特異的に結合できる、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗原結合抗体または抗体フラグメントである、請求項１～５２のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子。
  54. 請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  55. 請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
  56. 請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  57. 請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは項５６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  58. ａ）二重標的抗原結合分子の発現に適した条件下で項５７に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）前記二重標的抗原結合分子を回収する工程とを含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子を生成する方法。
  59. 請求項５８に記載の方法により生成された二重標的抗原結合分子。
  60. 請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  61. 容器内にある請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または請求項６０に記載の医薬組成物、および、前記二重標的抗原結合分子の使用方法に関するプロトコルを含む製品またはキット。
  62. 医薬としての、請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または請求項６０に記載の医薬組成物の使用。
  63. それを必要とする個体の疾患の治療に使用する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子または請求項６０に記載の医薬組成物。
  64. 前記疾患は癌である、請求項６３に記載の二重標的抗原結合分子または医薬組成物。
  65. ニーズがある個体の疾患の治療のための薬剤の調製における請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子の使用。
  66. 治療有効量の、請求項１～５３のいずれか一項に記載の前記二重標的抗原結合分子または請求項６０に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法。
  67. 前記疾患は癌である、請求項６５に記載の使用または請求項６６に記載の方法。
  68. Ｔ細胞の存在下で標的細胞を請求項１～５３のいずれか一項に記載の二重標的抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の細胞溶解を誘導する方法。
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