MX2013009981A - Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con polipéptidos genéticamente modificados que comprenden variantes Fc y su uso. Más específicamente, las variantes Fc se describen mostrando una función efectora reducida. Estas variantes dan lugar a un beneficio para un paciente que sufre una enfermedad que puede tratarse con un anticuerpo para el que se desea reducir la función efectora que provocan los anticuerpos.

Description

VARIANTES DE FRAGMENTO CRISTALIZABLE (FC) DE LOS ANTICUERPOS Campo de la Invención La presente invención está relacionada con polipéptidos que comprenden variantes de una región Fe. ,Más en particular, la presente invención está relacionada con polipéptidos que contienen la región Fe que tienen alterada la función efectora como consecuencia de una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fe del polipéptido.

Antecedentes de la Invención Los anticuerpos monoclonales poseen un gran potencial terapéutico y juegan un papel importante én el portafolio médico actual. Durante la última década, una tendencia significativa en la industria farmacéutica h sido el desarrollado de anticuerpos monoclonales (mAbs, por sus siglas eninglés) como agentes terapéuticos para el tratamiento de una serie de enfermedades, como el cáncer, asma, artritis, esclerosis múltiple etc. Los anticuerpos monoclonales se fabrican principalmente como proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos modificados genéticamente.

La región Fe de un anticuerpo, es decir, los extremos terminales de las hejbras pesadas del anticuerpo que abarca los dominios CH2 , CH3 y una porción de la región bisagra, está limitada en la variabilidad y está involucrada en efectuar los roles fisiológicos mostrados por el Ref. 243233 anticuerpo. Las funciones efectoras atribuibles a la región Fe de un anticuerpo varían con la clase y subclase de anticuerpo e incluye la unión del anticuerpo mediante la región Fe a un receptor Fe específico ("FcR", por sus siglas en inglés) en una célula que activa varias respuestas biológicas.

Estos receptores normalmente poseen un dominio extracelular que media la unión a Fe, una región que abarca la membrana, y un dominio intracelular que puede mediar algún evento señalizador dentro de la célula. Estos receptores se expresan en una serie de células inmunitarias que incluye a monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células asesinas (NK) , y linfocitos T. La formación del complejo Fc/Fc R recluta estas células efectoras en los lugares de unión a antígeno, lo que resulta normalmente en eventos de señalización dentro de las células y posteriores respuestas inmunitarias importantes como la liberación de mediadores de la inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis, y ataque citotóxico. La capacidad de médiar funciones efectoras fagocíticas y citotóxicas y es un mecanismo potencial mediante el cual los anticuerpos destruyen a las células objetivo. La reacción mediada por células en donde las células citotóxicas inespecíficas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula objetivo y posteriormente causa la lisis de la célula objetivo se refiere como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) (Ravetch et al., Annu Rev Immunol 19 (2001) 275-290). La reacción mediada por células en donde las células citotóxicas inespecíficas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula objetivo y posteriormente provoca la fagocitosis de la célula objetivo se refiere como fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA) . Además, un sitio solapante en la región Fe de la molécula también controla la activación de una función citotóxica independiente de la célula mediada por el complemento, conocida por otro lado como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

Para los anticuerpos de clase IgG, la CCDA y FCDA están controlados por el acoplamiento de la región Fe con una familia de receptores que se refieren como receptores Fcy (FcyRs) . En humanos, esta familia de proteínas comprende FcyRI (CD64) ; FcyRII (CD32) , que incluye las isoformas FcyRIIA, FcyRIIB, y FcyRIIC; y FcyRIII (CD16), que incluye; las isoformas FCYRIIIA y FcyRIIIB (Raghavan, y Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996), 181-220; Abes, et al., Expert Reviews, Vol . 5(6) (2009) 735-747). Los FcyRs se expresan en una serie de células inmunitarias , y la formación del complejo Fc/FcyR recluta estas células en los lugares de unión a antígeno, que resulta normalmente en la señalización y posterior respuestas inmunitarias como mediadores ¦ de liberación de la inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis, y ataque citotóxico. Además, mientras que FcyRI, FcyRIIA/c, y FcyRIIIA son receptores activadores que se caracterizan por un motivo de activación de inmunoreceptor intracelular basado en la tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) , FcyRIIB posee un motivo de inhibición (ITIM, por sus siglas en inglés) y es por lo tanto inhibidor. Además, de Reys et al. Blood, Vol . 81, (1993) 1792-1800 concluyó que la activación de plaquetas y la agregación inducida por anticuerpos monoclonales , como por ejemplo CD9, está iniciada por el reconocimiento de antígenos seguida por un paso dependiente del dominio Fe, que involucra el receptor FcyRII- (véase también: Taylor, et al., Blood 96 (2000) ,4254-4260). Mientras que FcyRI se une a IgG monomérico con alta afinidad, FcyRIII y FcyRII son receptores de baja afinidad, que interacciona con IgG en complejo o agregado. ¡« 11 La cascada inflamatoria del complemento es una parte de la respuesta inmunitaria innata y es crucial para la capacidad de un individuo para evitar infecciones. Otro ligando importante de Fe es la proteína del complemento! Clq . La unión de Fe a Clq media un proceso denominado citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Clq es capaz de unir seis anticuerpos, aunque la unión de dos IgG es suficiente -para activar la cascada del complemento. Clq forma un complejo con las serina proteasas Clr y Cls para formar el complejo Cl de la ruta del complemento.

En muchas circunstancias, la unión y estimulación de las funciones efectoras mediadas por la región Fe de las inmunoglobulinas es altamente beneficioso, por ejemplo, para un anticuerpo CD20, no obstante, en ciertas ocasiones será más ventajoso disminuir o incluso eliminar la función efectora. Esto es particularmente cierto para aquellos anticuerpos genéticamente modificados para liberar un fármaco (por ejemplo, toxinas e isótopos) a la célula objetivo en donde las funciones efectoras mediadas por FC/FCYR traen células inmunitarias saludables en la proximidad de la carga mortal, que resulta en el agotamiento de tejido linfoide normal junto con las células objetivo (Hutchins, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984; White, et al., Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). En estos casos el uso de anticuerpos que reclutan pobremente células efectoras o del complemento serán de un beneficio tremendo (véase también, Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276(9) (2001) 6591-6604; US 6.194.551; US 5.885.573 y publicación PCT WO 04/029207).

En otros casos, por ejemplo, cuando el objetivo es bloquear la interacción de un receptor ampliamente expresado con su ligando afín, será ventajoso disminuir o eliminar toda función efectora de anticuerpo para reducir la toxicidad no deseada. También, en el caso en que un anticuerpo terapéutico presenta una unión promiscua con una serie de tejidos humanos será prudente limitar el alcance de la función efectora- a un grupo de tejidos para limitar la toxicidad. Por último pero no por ello menos importante, la afinidad reducida de anticuerpos hacia el receptor de FCYRII en particular, será ventajoso para anticuerpos que inducen la activación y agregación de plaquetas mediante la unión del receptor de FCYRII, que podría ser en efecto secundario grave a los anticuerpos.

Aunque existen ciertas subclases de inmunoglobulinas humanas que carecen de funciones efectoras específicas, no existen inmunoglobulinas naturales conocidas que carezcan de todas las funciones efectoras. Una aproximación alternativa será modificar o mutar los residuos críticos en la región Fe que son responsables de la función efectora. Por ejemplo véanse las publicaciones PCT WO 2009/100309 (Medimmune) , i WO 2006/076594 (Xencor) , WO 1999/58572 (Univ. Cambridge) , US 2006/0134709 (Macrogenics) , WO 2006/047350 (Xencor) , WO 2006/053301 (Xencor), US 6.737.056 (Genentéch) , US 5.624.821 (Scotgen Pharmaceuticals) , y US 2010/01:66740 (Roche) . I] La unión de IgG a Tos receptores FCY activadores e inhibidores al primer componente del complemento (Clq) depende de los residuos localizados en la región bisagra y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son críticas para la unión de FcyR y Clq del complemento, y poseen secuencias únicas. La sustitución de los residuos IgGl y IgG2 humanos en las posiciones 233-236 y los residuos IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 reducen enormemente la CCDA y CDC (Armour, efc al., Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604). Idusogie, et al., J. Immunol 166 (2000) 2571-2575 hizo un mapa del sitio de ;unión de Clq a rituxan y mostró que la Pro329Ala redujo la capacidad de Rituximab de unir Clq y activar el complemento. La sustitución de Pro329 con Ala ha demostrado que conduce 'a una reducción de la unión a los receptores FcyRI, FcyRII y FcyRIIIA (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) -6591-6604) pero esta mutación también se ha descrito que presenta una unión similar al tipo silvestre hacia FcyRI y FcyRII y solamente una pequeña disminución en la unión del receptor FcyRIIIA (Tabla 1 y Tabla 2 en PE 1 068 241, Genentech) .

Oganesyan, et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704 introdujo la triple mutación L234F/L235E/P331S ;én la bisagra inferior y el dominio C2H y mostró un descenso 'en la actividad de unión hacia las moléculas IgGl humanas hacia el receptor Clq humano, FcyRI, FcyRII y FcyRIIIA.

- Además, existe una necesidad no satisfecha de anticuerpos con una CCDA y/o FCDA y/o CDC fuertemente disminuida. Por lo tanto, el objeto de la presente invención es identificar los anticuerpos. Sorprendentemente, sé ha encontrado que si se muta el residuo de prolina en Pro329 hacia glicina resulta en una fuerte inhibición inesperada del receptor FCYRIIIA y FcyRIIA y en una fuerte inhibición de CCDA y CDC . Además, la mutación combinada de Pro329 y por ejemplo L234A y L235A (LALA) conduce a una fuerte inhibición inesperada de Clq, FcyRI, FcyRII y FcyRIIIA. Así, un residuo de glicina parece ser inesperadamente superior sobre otras sustituciones de aminoácidos, como alanina, por ejemplo, en la posición 329 para destruir el sándwich de prolina ,en la interfaz del receptor Fc/Fcy. ,: Breve Descripción de la Invención La presente invención está relacionada con el Acampo de las variantes de anticuerpo y proporciona polipéptidos que comprenden variantes Fe con una función efectora disminuida, como CCDA y/o unión a Clq disminuida.

En particular la invención proporciona un polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de tipo silvestre de IgG humana, la variante de Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición É*ro329 y al menos otra sustitución de aminoácidos, en dondé los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, y en donde el polipéptido presenta una afinidad reducida al FcyRIIIA humana y/o FcyRIIA y /o FcyRI en comparación con un polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre de IgG, y en donde la CCDA inducida por el polipéptido;; está reducida en al menos un 20% de la CCDA inducida por el polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG.

En una modalidad específica la Pro329 de una región Fe humana de tipo silvestre en el polipéptido descrito anteriormente está sustituida con glicina o arginina o un residuo de aminoácidos suficientemente grande como para destruir el sándwich de prolina dentro de la interfaz del receptor FC/FCY, que se forma entre la prolina329 del Fe y los residuos de triptófano Trp 87 y Trp 110 de FcgRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 Julio 2000)). En un aspecto adicional de la invención la sustitución adicional de aminoácidos en la variante de Fe es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, o P331S y aún en otra modalidad la sustitución adicional de aminoácidos es L234A y L235A de la región Fe de IgGl humana o S228P y L235E de la región Fe de IgG4 humana.

En otro aspecto de la invención el polipéptido proporcionado presenta una afinidad reducida en al menos» otro receptor del grupo que comprende los receptores humanos Fcyl , FcylIA y Clq en comparación con el polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG humana. En aún ' otro aspecto de la invención el polipéptido comprende una región Fe de IgGl o IgG4 humana. En aún otro aspecto de la invención el polipéptido es un anticuerpo o una proteína de fusión de Fe.

En otra modalidad la agregación de trombocitos inducida por el polipéptido que comprende la variante de Fe está reducida en comparación con la agregación de trombocitos inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG humana. En aún otra modalidad, el polipéptido de acuerdo con la invención presenta una CDC fuertemente reducida en comparación con la CDC inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG humana.

En otra modalidad de la invención se proporcionan polipéptidos que comprenden una variante de Fe, tal como se ha descrito anteriormente, para su uso como medicamentos. En una modalidad específica el polipéptido es un anticuerpo anti-CD9, que se caracteriza en que el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre comprende como región variable de la hebra pesada la SEC ID NO: 9 y como región variable de la hebra ligera la SEC ID NQ:8.

En otro aspecto de la invención se proporcionan los polipéptidos tal como se han descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad en donde es favorable que una función efectora del polipéptido que comprende la variante de Fe esté fuertemente reducida en comparación con la función efectora inducida por un polipéptido que comprend una región Fe de tipo silvestre de IgG humana.

En otra modalidad se proporciona el uso de los polipéptidos tal como se ha descrito anteriormente para la manufactura de un medicamento para el tratamiento dé una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora del polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de tipo silvestre de IgG humana esté fuertemente reducida en comparación con la función efectora inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG humana.

En aún otro aspecto de la invención se proporciona un método para tratar a un individuo con una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora del polipéptido que comprende una variante de Fe dé una región Fe de tipo silvestre de IgG humana esté fuertemente reducida en comparación con la función efectora inducida por un polipéptido que comprende un polipéptido Fe humano de tipo silvestre, que comprende la administración a un individuo una cantidad efectiva del polipéptido descrito anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención es la utilización de un polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de tipo silvestre de IgG humana, el polipéptido posee la Pro329 de la región Fe de la IgG humana sustituida con glicina, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, en donde el polipéptido presenta una afinidad reducida al FCYRIIIA humano y FcyRIIA para la modulación negativa de la CCDA en al menos un 2:6% de la CCDA inducida por el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre de IgG humana, y/o para la modulación negativa de FCDA.

Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de tipo silvestre de IgG humana, el polipéptido posee la Pro329 de la región Fe de la IgG humana sustituida con glicina y en donde la variante de Fe comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales en L234A y L235A de la región Fe de IgGl humana o S228P y L235E de la región, Fe de IgG4 humana, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, en donde el polipéptido presenta una afinidad reducida al FCYRIIIA humano y FcyRIIA, para la modulación negativa de CCDA en al menos un 20% de la, CCDA inducida por el polipéptido que comprende la región Fe dé tipo silvestre de IgG humana, y/o para la modulación negativa de FCDA .

Otro aspecto de la invención es la utilización del polipéptido descrito anteriormente, en donde la agregación de trombocitos inducida por el polipéptido descrito anteriormente está reducida en comparación con la agregación de trombocitos inducida por un polipéptido que comprende una región ,'Fe de tipo silvestre humana, en donde el polipéptido e's un anticuerpo activador de plaquetas.

En otro aspecto de la invención se proporciona un método para tratar a un individuo con una enfermedad, en donde el individuo se trata con un polipéptido, el polipéptido posee la Pro329 de la región Fe de la IgG humana sustituida con glicina, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat , en donde el polipéptido está caracterizado por una unión fuertemente reducida de FcVRIIIA y/o FCYRIIA en comparación con un polipéptido que comprende una región Fe de tipo silvestre de IgG humana, que comprende la administración a un individuo una cantidad efectiva del polipéptido.

En aún otro aspecto de la invención el polipéptido utilizado en el método comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales en L234A y L235A de la región Fe de igGl humana o S228P y L235E de la región Fe de IgG4 humana.

Breve Descripción de las Figuras Figuras la- le Se midieron las afinidades de unión de los diferentes FcyR hacia las inmunoglobulinas mediante Resonancia del plasmón en superficie (RPS) utilizando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) at 25°C.

Fig. la La afinidad de unión de FcyRI se analizó para variantes de anticuerpo GA101 (GA) (mutación IgGl-P329G, IgG4-SPLE y IgGl-LALA) y para variantes del anticuerpo P-selectina (PS) (IgGl-P329G, IgGl-LALA y IgG4-SPLE) así como para los anticuerpos de tipo silvestre.

Fig. Ib La afinidad de unión de FcyRI se analizó : para variantes de anticuerpo CD9 (IgGl- tipo silvestre, IgGl-P329G, IgGl-LALA, IgG4-SPLE, IgGl-P329G / LALA, IgG4-SPLE / P329G) así como para los anticuerpos de tipo silvestre.

Fig. le La afinidad de unión de FCYRIIA (R131)se analizó para variantes de anticuerpo CD9 (IgGl- tipo silvestre, IgGl-P329G, IgGl-LALA, IgG4-SPLE, IgGl-P329G/ LALA, IgG4-SPLE / P329G) así como para los anticuerpos de < tipo silvestre. Una respuesta normalizada se muestra como una función de la concentración del receptor.

Fig. Id La afinidad de unión de FCYRIIB se analizó: para variantes de anticuerpo CD9 (denominada aquí "TA") (IgGl-tipo silvestre, IgG4-SPLE/ P329G, IgGl-LALA, IgGl-LALA/ P329G) y variantes de anticuerpo P-selectina (pSel) (IgG4,-tipo silvestre, IgG4-SPLE) así como para los anticuerpos de' tipo ? silvestre. ? Fig. le La afinidad de unión de FCYRIIIA-V158 se analizó para variantes de anticuerpo CD9 (IgGl-tipo silvestre, IgG4-SPLE, IgGl-LALA, IgG4-SPLE / P329G, IgGl-P329G, IgGl;-LALA / P329G) así como para los anticuerpos de tipo silvestre;. Una respuesta normalizada se muestra como una función de la concentración del receptor.

Figura 2 La unión de Clq se analizó para variantes de anticuerpo P-selectina (PS) (IgGl tipo silvestre, P329G, IgG4-SPLE) y para variantes de anticuerpo CD20 (GA) (IgGl-tipo silvestre, P329G y IgG4-SPLE) .

Figuras 3a- 3b La potencia para reclutar células inmuno-efectoras depende del tipo de variante Fe. Las variantes Fe se recubrieron sobre una placa de ELISA y se añadieron las células efectoras NK92 humanas transfectadas con FCYRIIIA humano. La inducción de la actividad citolítica de células NK activadas se midió utilizando un ensayo esterasa.

Fig. 3a Se analizaron las variantes de anticuerpo CD20 (GA101) (tipo silvestre, LALA, P329G, P329G / LALA) Fig. 3b Se analizaron las variantes de anticuerpo CD20 (GA101) (mutaciones P329R o P329G introducidas) . Todas las variantes se produjeron en la versión glucomodificada para poder una señal más fuerte para cualquier función de reclutamiento de células efectoras.

Figuras 4a-4b La potencia para reclutar células inmuno-efectoras depende del tipo de variante Fe, como se mide mediante el ensayo CCDA clásico. La línea celular NK92 humana transfectada con FYCRIIIA humano se utilizó como efector y las células Raj i CD20 positivas se utilizaron como células objetivo. Se analizaron diferentes anticuerpos CD20 glucomodificados (variantes GA101 G(2) y anticuerpo CD20 no glucomodificados (GA101) (mutaciones P329G, P329A o LALA introducidas) .

Fig. 4a Anticuerpo CD20 no glucomodificado : las mutaciones P329G, LALA y P329G/LALA, respectivamente, se han introducido en el anticuerpo, respectivamente.

Fig. 5b Anticuerpo CD20 glucomodificado : las mutaciones P329G, P329A y LALA, respectivamente, se han introducido en el anticuerpo, respectivamente.

Figuras 5a-5b Ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Las. diferentes variantes de Fe de un anticuerpo CD20 non-glucomodificado y glucomodificado (GA101) se analizaron; para su eficacia para mediar la CDC sobre células objetivo SUDH-L4.

Fig. 5a CD20 no glucomodificado : P329G, las mutaciones LALA y P329G/LALA, respectivamente, se han introducido en el anticuerpo, respectivamente.

Fig. 5b CD20 glucomodificado : las mutaciones P329G, P329A y LALA, respectivamente, se han introducido en el anticuerpo, respectivamente.

Figuras 6a-6b Fig. 6a Perfil de carbohidratos de glicanos asociados a Fe de variantes IgGl humanas. El porcentaje de galactosiláción sobre oligosacáridos asociados a Fe de hlgGl que contiene las mutaciones LALA, P329G, P329A o P329G / LALA solo difiere mínimamente del anticuerpo de tipo silvestre.

Fig. 6b Galactosiláción relativa: Se introdujeron cuatro IgG diferentes con mutaciones P329G / LALA introducidas en IgGl. Se compararon cuatro dominios V diferentes por su cantidad de galactosiláción cuando se expresan en células Hek293 EBNA.

Figuras 7a-7b Ensayo de sangre total en agregación de plaquetas inducida por anticuerpos. Se determinó la agregación de plaquetas inducida por IgGl murino para dos donantes que difieren en su respuesta en la dependencia de la concentración de anticuerpo.

Fig. 7a Donante A, Fig. 7b Donante B.

Breve Descripción del listado de secuencias SEC ID N0:1 hebra ligera kappa humana SEC ID NO: 2 ejra ligera lambda humana SEC ID NO: 3 IgGl humana (alotipo caucásico) SEC ID NO: 4 IgGl humana (alotipo afroamericano) SEC ID NO: 5 Mutante LALA de IgGl humana (alotipo caucásico) SEC ID NO: 6 IgG4 humana SEC ID NO: 7 Mutante SPLE de IgG4 humana que representa ejemplos de secuencias humanas para la hebra ligera kappa, hebra ligera lambda, IgGl y IgG4 que pueden servir como base para generar las variantes de acuerdo con la invención.

En las secuencias Id. No 3-5, la secuencia de los alotipos IgGl humanos, la región P329 de acuerdo con el índice Kabat EU está localizado en la posición 212, mientras que la región P329 en las secuencias Id N° 6 y 7 puede encontrarse en la posición 209. .', SEC ID NO: 8 Hebra ligera Kappa de mAb 40A746.2.3 ;; SEC ID NO: 9 Hebra pesada de IgG de tipo silvestre de mAb 40A746.2.3 SEC ID NO: 10 Hebra pesada de IgGl P329G de mAb 40A746.2.3 SEC ID NO: 11 Hebra pesada de IgGl LALA P329G de mAb 40A746.2.3 SEC ID NO: 12 Hebra pesada de IgG4 SPLE de mAb 40A746.2.3 SEC ID NO: 13 Hebra pesada de IgG4 SPLE P329G de mAb 40A746.2.3 SEC ID NO: 14 Hebra pesada de IgGl LALA de mAb 40A746.2.3 Descripción Detallada de la Invención Definiciones En la presente especificación y reivindicaciones, la numeración de los residuos en una hebra pesada de inmunoglobulina es la del índice EU como en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) , que se incorpora de forma expresa aquí mediante referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de los residuos del anticuerpo IgGl EU humano.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno o un receptor Fe) . A no ser que se indique de otra manera, tal como se utiliza aquí, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo/ receptor Fe o anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede en general estar representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse mediante métodos conocidos en la materia, que incluye aquellos descritos aquí. Se describen a continuación ejemplos de modalidades específicas ilustrativas para medir la afinidad de unión.

Un anticuerpo "madurado para afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (RHV) , en comparación con un anticuerpo parental que no posee las alteraciones, las alteraciones resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo paira el antígeno.

Una "modificación de aminoácidos" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Ejemplos de modificaciones incluye una sustitución, inserción y/o supresión de aminoácidos. La modificación de aminoácidos preferible aquí es . una sustitución. Una "modificación de aminoácidos en" una posición especificada, por ejemplo, de la región Fe, se refiere ja la sustitución o supresión del residuo especificado, p la inserción de al menos un residuo de aminoácidos adyacente al residuo especificado. Se entiende por inserción "adyacente" la inserción de un residuo especificado dentro de uno o dos residuos de los mismos. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal al residuo especificado.

Una "sustitución de aminoácidos" se refiere a la sustitución de al menos un residuo de aminoácidos existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada con otra "sustitución" de residuo de aminoácidos diferente. La sustitución de residuo o residuos puede ser por un "residuo de aminoácido que aparece de forma natural" (es decir codificado por el código genético) y seleccionado de entre el grupo que consiste en: alanina (Ala) ; arginina (Arg) ; asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteína (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleücina (He) : leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) treonina (Thr) ; triptófano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Preferiblemente, el residuo de sustitución no es cisteína. La sustitución con uno o más residuos de aminoácidos que aparecen de forma no natural también está abarcada por la definición de una sustitución de aminoácidos aquí. A "un residuo de aminoácido que no aparece de forma natural" se refiere a un residuo, diferente a aquellos residuos de aminoácidos que aparecen de forma natural que se listan anteriormente, que son capaces de unirse de forma covalente a residuos (s) de aminoácidos adyacentes en una hebra de polipéptido. Ejemplos de residuos de aminoácidos que no aparecen de forma natural incluye norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros residuos de aminoácido análogos a los descritos en Ellman et al. Met. Enzym. 202 (1991) 301-336. Para generar los residuos de aminoácidos que no aparecen de forma natural, .puede utilizarse los procedimiento de Noren, et al. Science 244 (1989)182 y Ellman, et al., supra . En resumen, restos procedimientos implican la activación química de un| tR A supresor con un residuo de aminoácidos que aparece de forma no natural- seguida de una transcripción y traducción in vitro del ARN.

Una inserción de aminoácidos se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Mientras que la inserción consistirá normalmente de la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos, la presente solicitud contempla "inserciones de péptido" más grandes, por ejemplo, la inserción de:;entre alrededor de tres a alrededor de cinco o incluso diez residuos de aminoácidos. El (los) residuo (s) insertados pueden ser naturales o no naturales tal como se ha descrito antes .

Una «supresión de aminoácidos" se refiere a la eliminación de al menos un residuo de aminoácidos a partir de una secuencia de aminoácidos predeterminada.

El término "anticuerpo aquí se utiliza en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, que incluye pero no se limita a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

El término "variante de anticuerpo" tal como se utiliza aquí se refiere a una variante de un anticuerpo de tipo silvestre, que se caracteriza en que una alteración en la secuencia de aminoácidos relativa al anticuerpo de tipo silvestre ocurre en la variante de anticuerpo, por ejemplo, introducida mediante mutaciones un residuo de aminoácido específico en el anticuerpo de tipo silvestre.

El término "función efectora del anticuerpo" o "función efectora" tal como se utiliza aquí se refiere a una función contribuida por un dominio efector de Fe de una IgG (por ejemplo, la región Fe de una inmunoglob li a) . La función puede efectuarse por, por ejemplo, unión de un dominio efector de Fe a un receptor de Fe en una célula inmunitaria con actividad fagocítica o lítica o mediante la unión de un dominio efector de Fe a componentes del sistema del complemento. Las funciones efectoras típicas son CCDA, FCDA y CDC.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que une el antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluye pero no se limita a Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de hebra sencilla (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo .

Un "anticuerpo que se une al mismo epítope" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50% o más, y por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno es un ensayo de competición en un 50% o más. Un ejemplo de ensayo de competición se proporciona aquí.

"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo" y "CCDA" se refiere a una reacción mediada por células en que las células citotóxicas no específicas que expresan FcR (por ejemplo, células Asesinas Naturales (NK, por sus siglas en inglés), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una célula objetivo y posteriormente provoca la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar la CCDA, células NK, expresan tan solo FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FCYRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9 (1991) 457-492.

El término "fagocitosis celular dependiente de anticuerpo" y "FCDA" se refiere a un proceso mediante el cual se internalizan células recubiertas de anticuerpo, ya sea de forma completa o en parte, mediante células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a una región Fe de inmunoglobulina .

El término "dominio de unión" se refiere a la región de un polipéptido que se une a otra molécula. En el caso de un FcR, el dominio de unión puede comprender una porción de una hebra de polipéptido del mismo (por ejemplo, la hebra a del mismo) que es responsable de la unión de una región Fe. Un dominio de unión útil es el dominio extracelular de una hebra a de la FcR.

El término "unión" a un receptor Fe tal como se usa aquí significa la unión de un anticuerpo a un receptor Fe en un ensayo BIAcore (R) , por ejemplo (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) .

En el ensayo BIAcore (R) el receptor Fe está unido a una superficie y la unión de la variante, por ejemplo, la variante de anticuerpo en donde se han introducido las mutaciones, se mide mediante resonancia del plasmón en superficie (RPS) . La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante para la tasa de asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/receptor Fe), kd (constante de disociación) , y KD (kd/ka) . Alternativamente, la señal de unión de un sensograma RPS puede ser en comparación directamente con la señal de respuesta de una referencia, con respecto a la altura de la señal de resonancia y los comportamientos de disociación.

"Clq" es un polipéptido que incluye un lugar de unión para la región Fe de una inmunoglobulina . Clq junto con dos serina proteasas, Clr y Cls, forma el complejo Cl, el primer componente de la ruta de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . El Clq humano puede obtenerse de forma comercial, por ejemplo, en Quidel, San Diego, California.

El "dominio CH2" de una región Fe de IgG humana (también referido como dominio "0?2") normalmente se extiende a partir de los aminoácidos 231 a alrededor de los aminoácidos 340. El dominio CH2 es único en que no está íntimamente emparejado con otro dominio. En su lugar, dos hebras de carbohidratos ramificados N-unidos se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula IgG intacta nativa. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayuda a estabilizar el dominio CH2. (Burton, Molec . Immunol . 22 (1985) 161-206).

El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C-terminal hasta un dominio CH2 en una región Fe (es decir desde alrededor del residuo de aminoácidos 341 hasta alrededor del residuo de aminoácidos 447 de una IgG) .

Los términos "cáncer" y "cancerígeno" se refieren a o describen la condición fisiológica de los mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular desregulado. Ejemplos de cáncer incluye pero no se limita a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Más en particular, ejemplos de los tipos de cáncer incluye cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células peqúeñas, cáncer de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

Tal como se utiliza aquí, las expresiones "célula," "línea celular," y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas las designaciones incluyen la su progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen las células primarias del sujeto y los cultivos derivados de las mismas sin tener en cuenta el húmero de transferencias. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido dé; ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que posee la misma función o actividad biológica que la buscada en la célula originalmente transformada está incluida. Cuando se manejan distintas designaciones, quedará claro según el contexto.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en que una porción de la hebra pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la hebra pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su hebra pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3í IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de hebra pesada que corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, µ, respectivamente.

El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previenen una función celular y/o provoca la muerte celular o destrucción. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristine , vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos del mismo como enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluye fragmentos y/o variantes del mismo; y los diferentes agentes antitumorales o anticancerígenos descritos más adelante.

El término "citotoxicidad dependiente del complemento" o CDC se refiere a un mecanismo para inducir la muerte celular en que un dominio efector Fe de un anticuerpo unido al objetivo activa una serie de reacciones enzimáticas que culminan en la formación de agujeros en la membrana de la célula objetivo. Normalmente, los complejos antígeno-anticuerpo como aquellos de las células objetivo cubiertas de anticuerpo y que activan el componente Clq del complemento que a su vez activa la cascada del complemento que conduce a la muerte de la célula objetivo. La activación del complemento puede también resultar en la deposición de componentes del complemento sobre la superficie de la célula objetivo que facilita la CCDA mediante la unión de receptores, del complemento (por ejemplo, CR3) sobre leucocitos.

Un "trastorno" es cualquier condición qué se beneficiará de un tratamiento con un polipéptido, . como anticuerpos que comprende una variante de Fe. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluye aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión. En una modalidad, el trastorno es cáncer.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varía con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluye: unión de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; unión del receptor Fe; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) ; fagocitosis (FCDA) ; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) ; y activación de células B.

Una "función efectora reducida" tal como se utiliza aquí se refiere a una reducción de una función efectora específica, como por ejemplo CCDA o CDC, en comparación con un control (por ejemplo un polipéptido con una región Fe de tipo silvestre) , en al menos un 20% y una "función efectora fuertemente reducida" tal como se utiliza aquí se refiere a una reducción de una función efectora específica, como por ejemplo CCDA o CDC, en comparación con un control, en al menos un 50%.

Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesario, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado .

El término "región Fe" se utiliza aquí para definir una región C-terminal de una hebra pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones de la secuencia Fe nativa y regiones de Fe variante. En una modalidad, una región Fe de una hebra pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxi-terminal de la hebra pesada. No obstante, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede estar o no presente. A menos que se especifique de otra manera aquí, la numeración de los residuos de aminoácidos en - la región Fe o la región constante está de acuerdo con el sistema e numeración de la UE, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat, et al., Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Una "variante de región Fe" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una secuencia de región Fe "nativa" o "tipo silvestre" en al menos una "modificación de aminoácidos" tal como se define aquí. Preferiblemente, la variante de región Fe posee al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una secuencia nativa de región Fe o a la región Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, desde alrededor de una a alrededor de diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente desde alrededor de una a alrededor de cinco sustituciones de aminoácidos en una secuencia nativa de región Fe o en la región Fe del polipéptido parental. La variante de región Fe aquí poseerá preferiblemente al menos alrededor de un 80% de homología con una secuencia nativa de región Fe y/o con una región Fe de un polipéptido parental, y más preferiblemente al menos alrededor de un 90% de homología con el mismo, más preferiblemente al menos alrededor de un 95% homología con el mismo.

El término "variante de Fe" tal como se utiliza aquí se refiere a un polipéptido que comprende una modificación en un dominio Fe. Las variantes Fe de la presente invención están definidas de acuerdo con las modificaciones de aminoácidos que las componen. Así, por ejemplo, P329G es una variante de Fe con la sustitución de prolina con glicina en la posición '329 en relación al polipéptido Fe parental, en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU. La identidad de los aminoácidos de tipo silvestre puede ser inespecífica , en cuyo caso la variante anteriormente mencionada se refiere como P329G. Para todas las posiciones descritas en la présente invención, la numeración está de acuerdo con el índice EU. El índice EU o índice EU como en el esquema de numeración Kábat o EU se refiere a la numeración del anticuerpo EU (Edelman, et al., Proc Nati Acad Sci USA 63 (1969) 78-85, que se incorpora aquí por referencia) . La modificación puede ser una adición, supresión o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. Las •variantes pueden comprender aminoácidos no naturales:. Los ejemplos incluyen la Pat . Estadounidense N° 6.586.207; WO 98/48032; WO 03/073238; US 2004-0214988 Al; WO 05/35727 A2 ; WO 05/74524A2; Chin, J.W., et al., Journal of the American Chemical Society 124 (2002) 9026-9027; Chin; J.W., y Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et; al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; y Wang, L., y Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10, todos ellos incorporados en su totalidad por referencia. ;; El término "polipéptido que contiene la región Fe" se refiere a un polipéptido, como un anticuerpo o immunoadhesina (véanse las definiciones más adelante),, que comprende una región Fe. .· Los términos "receptor Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fe ,cle un anticuerpo. El FcR preferible es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferible es uno que se une;; a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, que incluye variantes alélicas y alternativamente formas de corte y empalme de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FCYRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que posee secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos del mismo. El receptor FCYRIIA activador contiene un motivo de activación basado en la tirosina del inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático . El receptor FCYRIIB inhibidor contiene un motivo de inhibición basado en la tirosina del inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (véase la revisión en Daéron, M . , Annu. Rev. Immunol . 15 (1997) 203-234). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; y de Haas, et al., J. Lab. Clin. ed. 126 (1995) 330-41. Otros FcR, que incluye aquellos a identificar en el futuro, están comprendidos por el término "FcR" en este documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587 y Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

Por "ligando de Fe de IgG" tal como se utiliza aquí se entiende una molécula, preferiblemente un polipéptidó, de cualquier organismo que se une a la región Fe de un anticuerpo IgG para formar un complejo ligando Fc/Fc. Los ligandos Fe incluyen pero no se limitan a FcyRs, FcyRs, FCYRS, FcRn, Clq, C3 , lectina de unión a mananos , receptor de mañosa, proteína A de estafilococo, proteína G de estreptococo, y FcyR viral. Los ligandos de Fe también incluyen homólogos del receptor Fe (FcRH) , que son una familia de receptores Fe que son homólogos con los FcyR (Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, que se incorporan en su totalidad por referencia). Los ligandos de Fe pueden incluir moléculas aún no descubiertas que se unen a Fe. Los ligandos de Fe de IgG particulares son receptores FcRn y Fe gamma. Por "ligando de Fe" tal como se utiliza aquí se entiende una molécula, preferiblemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fe de un anticuerpo para formar un complejo de ligando Fc/Fc.

Por "receptor gamma de Fe", "FcyR" o "FcgammaR" tal como se utiliza aquí se entiende cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fe del anticuerpo IgG y está codificado por un gen FcyR. En humanos esta familia incluye pero no se limita a FcyRI (CD64) , que incluye las isoformas FcyRIA, FcyRIB, y FCYRIC; FcyRII (CD32) , que incluye las isoformas FcyRIIA (que incluye los alotipos H131 y R131) , FCYRIIB (que incluye FCYRIIB-1 y FCYRIIB-2) , y FcyRIJc; y FCYRIII (CD16) , que incluye las isoformas FCYRIIIA:: (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (que incluye los alotipos FCYRIIB-NAI y FCYRIIB-NA2) (Jefferis et al., Immunol Lett 82 (2002) 57-65, que se incorpora en su totalidad por referencia) , así como cualquier isoformas o alotipos de FcyR o FcyR humanos sin descubrir. Un FcyR puede ser de · cualquier organismo, que incluye pero no se limita a humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. Los FcyR de ratones incluyen pero no se limita a FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) , FCYRIII (CD16) , y FCYRIII-2 (CD16-2) , así como cualquier isoformas o alotipos de FcyR o FcyR de ratón sin descubrir.

Por "FcRn" o "Receptor Fe neonatal" tal como se utiliza aquí se entiende una proteína que.se une a la región Fe del anticuerpo IgG y está codificada al menos en parte por un gen de FcRn. El FcRn puede ser de cualquier organismo, que incluye pero no se limita a humanos, ratones, ratas, conejos, y monos. Tal como se conoce en la materia, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos , a menudo referidos como hebra pesada y hejbra ligera. La hebra ligera es una beta-2-microglobulina y la hejbra pesada está codificada por el gen FcRn. A menos que se indique de otra manera en este documento, un FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de hejbra pesada de FcRn con beta-2-microglobulina.

Por "polipéptido parental o de tipo silvestre" tal como se utiliza aquí se entiende un polipéptido sin modificar que se modifica posteriormente para generar una variante. El polipéptido de tipo silvestre puede ser un polipéptido que aparece de forma natural, o una variante o versión modificada de un polipéptido que aparece de forma natural. Polipéptido de tipo silvestre puede referirse al polipéptido en sí, a composiciones que comprenden el polipéptido parental, o la secuencia de aminoácidos que la codifica. De acuerdo con "esto, por "inmunoglobulina de tipo silvestre" tal como se utiliza aquí se entiende un polipéptido de inmunoglobulina sin modificar que se modifica para generar una variante, y por "anticuerpo de tipo silvestre" tal como se utiliza aquí se entiende un anticuerpo sin modificar que está modificado para generar una variante de anticuerpo. Deberá notarse que el "anticuerpo de tipo silvestre" incluye anticuerpos comerciales conocidos, producidos de forma recombinante tal como se describe más adelante.

El término "polipéptido cristalizable del fragmento (Fe) " es la porción de una molécula de anticuerpo que interacciona con moléculas efectoras y células. Comprende las porciones C-terminal de las hebras pesadas de inmunoglobulina.

El término "marco" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable (HVR) . El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2 , FR3 , y FR4. De este modo, las secuencias HVR y FR generalmente aparecen n la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa" "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se utilizan aquí de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que posee una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativa o que posee hebras pesadas que contienen una región Fe tal como se ha definido aquí.

Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una secuencia nativa de región Fe. Ejemplos de "funciones efectoras" incluye la unión de Clq; citotoxicidad dependiente de complemento; unión al receptor Fe; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) ,-fagocitosis; regulación negativa de receptores de superficie celular ' (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR) , etc. Las funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe esté combinada con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y puede analizarse utilizando por ejemplo varios ensayos tal como se describen aquí.

"Región bisagra" está definida generalmente cómo el tramo desde la Glu216 a la Pro230 de la IgGl humana (Burton, Molec. Immunol . 22 (1985) 161-206). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgGl situando el primer y último residuo de cisteína que forman enlaces S—S interiiejra pesada en la misma posición.

La "región bisagra inferior" de una región Fe- está normalmente definida como el tramo de residuos inmediatamente C-terminal a la región bisagra, es decir los residuos 233 a 239 de la región Fe.

"Homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de aminoácidos que es idéntica tras alinear las' secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas de ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la materia. Uno de estos programas de ordenador es "Align 2", de Genentech, Inc., que se utilizó con documentación de usuario en la oficina de derechos de autor de Estados Unidos, Washington, D.C. 20559, el 10 de Diciembre de 1991.

Los términos "célula huésped" "línea de células huéspedes" y "cultivo de células huéspedes " se utilizan de forma intercambiable y se refieren a células en las que se han introducido ácido nucleico exógeno, que incluye la progenie de las células. Las células huéspedes incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluye la célula primaria transformada y la progenie derivada de esta sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser idéntica por completo en el contenido de ácido nucleico a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie imitante que posee la misma función o actividad biológica que se cribó o seleccionó en las células originalmente transformadas están incluidas aquí.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee* una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana derivada de una fuente no humana que utiliza el repertorio de anticuerpos humanos u otra secuencia que codifica un anticuerpo humano .

Esta definición de un anticuerpo human excluye de forma específica un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FCYRIII y realizan la función efectora de CCDA. Ejemplos de leucocitos humanos mediadores de CCDA incluye células mononucleares de sangre periférica (CMSP) , células Asesinas Naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferibles las CMSP y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa del mismo, por ejemplo, de sangre o CMSP tal como se ha descrito en este documento.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanos y residuos de aminoácidos de FR humanos. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos de HVR (por ejemplo, CDR) corresponden con aquellos de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todos los FR corresponden con aquellos de un anticuerpo humano1. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido una humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR, por sus siglas en inglés" tal como se utiliza aquí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forma un bucle estructuralmente definido ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos nativos de cuatro hebras comprenden seis HVR; tres en el VH (Hl, H2, H3) , y tres en el VL (Ll, L2„ L3) . Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR, por sus siglas en inglés) , siendo estas últimas de mayor variabilidad de secuencia y/o involucradas en el reconocimiento de antígenos. Ejemplos de bucles hipervariables aparecen en los residuos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) , 91-96 (L3), 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) , y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol . 196 (1987) 901-917). Ejemplos de CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-Hl, CDR-H2, y CDR-H3) aparecen en los residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2 , 89-97 de L3 , 31-35B de Hl , 50-65 de H2, y 95-102 de H3 (Kabat, et al., Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) ) . Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad," o "SDR" que son residuos que contactan con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de los CDR denominados de forma abreviada CDR, o a-CDR. Ejemplos de a-CDR (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) aparecen en los residuos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2 , 89-96 de ,L3, 31-35B de Hl, 50-58 de H2 , y 95-102 de H3 (Véase Almagro y Fransson, Front . Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que se indique de otra manera, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) están numerados aquí de acuerdo con Kabat et al . , supra .

"Complejo inmune" se refiere a la estructura relativamente estable que se forma cuando al menos una molécula objetivo y al menos una heteróloga que contiene el polipéptido de la región Fe se unen entre ellas para formar un complejo de peso molecular más grande. Ejemplos de complejos inmunes son los agregados antígeno-anticuerpo y agregados molécula obj etivo- inmunoadhesina . El término "complejo inmune" tal como se utiliza aquí, a no ser que se indique de otra manera, se refiere a un complejo ex vivo (es decir, otro diferente a la forma o ajuste que el que se encuentra de forma natural) . No obstante, el complejo inmune puede administrarse a un mamífero, por ejemplo, para evaluar el aclaramiento del complejo inmune en el mamífero.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, que incluye pero no se limita a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perr s, y caballos) , primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto,, es un humano . t' Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su ambiente natural. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica en más de un 95% o 99% de pureza determinado mediante, por ejemplo, electroforesis :: (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF, por sus siglas en inglés) , electroforesis capilar) o por cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones o HPLC de fase reversa) , Para revisar los métodos de evaluación de la pureza cíe un anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman, et al.,, J. Chromatogr. B 848' (2007) 79-87.

Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con el diagnóstico o uso terapéutico del polipéptido, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferibles, el polipéptido estará purificado (1) en más de un 95% en peso de polipéptido tal como se determina mediante el método Lowry, y más preferiblemente en más de un 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneizar mediante SDS-PAGE hasta condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes siempre que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no esté presente. Habitualmente , no obstante, un polipéptido aislado se preparara mediante al menos un paso de purificación.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contiene la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica qué es diferente de su localización cromosómica natural.

Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifica las hebras pesada y ligera de un anticuerpo (o fragmentos de las mismas) , que incluye la molécula de ácido nucleico en un vector simple o vectores separados, y la molécula de ácido nucleico presente en una o más localizaciones en una célula huésped.

La palabra "etiqueta" cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto detectable o composición que está conjugada directa o indirectamente con el polipéptido. La marca puede ser en sí misma detectable (por ejemplo, etiqueta por radioisótopo o etiqueta fluorescente) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o composición que es detectable.

El término "dominio de unión a ligando" tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier receptor de superficie celular nativo o cualquier región o derivado del mismo que retiene al menos una capacidad de unión a ligando cualitativa correspondiente a un receptor nativo. En una modalidad específica, el receptor es de un polipéptido de superficie celular con un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina . Otros receptores, que no son miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina pero que sin embargo están específicamente cubiertos por esta definición, son receptores para: las citoquinas, y en particular receptores con actividad tirosina cinasa (receptores tirosina cinasas) , miembros de la superfamilia de receptores del factor de crecimiento nervioso y de hematopoyetina, y moléculas de adhesión celular, por ejemplo, selectinas (E-, L- y P-).

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, la población que comprende los anticuerpos individuales son idénticos y/o se unen al mismo epítope, excepto por la posible variante de anticuerpos, por ejemplo, lo que contienen mutaciones naturales o que aparecen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, cuyas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos · policlonales , que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido frente a un determinante único sobre un antígeno. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo de haberse obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe entenderse como producción del anticuerpo necesaria mediante ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse mediante una serie de técnicas, que incluye pero no se limita al método del hibridoma, métodos de ADN recombinante , métodos de exposición en fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los loci de la inmunoglobulina, los métodos y otros ejemplos de métodos para fabricar los anticuerpos monoclonales descritos aquí .

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con una porción heteróloga (por ejemplo, una porción citotóxica) o radioetiqueta . El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos nativos" se refiere a moléculas de inmunoglobulina naturales con variaciones en sus estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150.000 dalton, compuestas de dos hebras ligeras idénticas y dos hebras pesadas idénticas que están unidas por puentes disulfuro. Desde el extremo N- al C-terminal, cada hebra pesada posee una región variable (VH) , también denominada un dominio pesado variable o un dominio de hebra pesada variable, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3) . De forma Similar, desde el extremo N- al C-terminal, cada hebra ligera posee una región variable¦ (VL) , también denominada un dominio ligero variable o un dominio de hebra ligera variable, seguido por un dominio constante ligero (CL) . La hebra ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , basados en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante y variable.

Una "secuencia de región Fe nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada de forma natural. La secuencia nativa de la región Fe humana incluye una secuencia nativa de la región Fe humana de IgGl (alotipos A y no A) ; secuencia nativa de la región Fe humana de IgG2 ; secuencia nativa de la región Fe humana de IgG3 ; y secuencia nativa de la región Fe humana de IgG4 así como variantes naturales de las mismas.

Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción está operativamente unido al ADN para un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido 'a una secuencia codificante si está posicionado de forma que facilita la traducción. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas están contiguas, y, en el caso de un líder de secreción, - están contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no hace falta que estén contiguos. La unión se logra mediante la ligación en lugares de restricción adecuados. Si los sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazantes se utilizan de acuerdo con la práctica habitual.

El término "inserto de empaque" se utiliza para referirse a instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, utilización, dosificaciones, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o avisos relativos al uso de los productos terapéuticos.

Por "posición" tal como se utiliza aquí se entiende una localización en la secuencia de una proteína * Las posiciones pueden estar numeradas de forma secuencial, o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo el índice EU para la numeración de anticuerpos.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos, que comprende residuos de aminoácidos naturales o no naturales, y no están limitados a una longitud mínima.

Así, los péptidos, oligopéptidos , dímeros, multímeros, y similares están incluidos dentro de la definición. Ambas proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas están incluidas en la definición. Los términos también incluyen modificaciones postraduccionales del polipéptido, que incluye, por ejemplo, glucosilación, sialilación, acetilación y fosforilación.

Además, un "polipéptido" aquí también se refiere a una proteína modificada como supresiones, adiciones, y sustituciones únicas o múltiples de residuos de aminoácido en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga una actividad deseada. Por ejemplo, un residuo de serina puede estar sustituido para eliminar una única cisteína reactiva o para eliminar enlaces disulfuro o una sustitución de aminoácidos conservadora puede realizarse para eliminar un lugar de escisión. Estas modificaciones pueden entenderse, como mutagénesis dirigida al sitio deliberadas, o pueden ser accidentales, como mutaciones producidas por los huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación mediante la reacción en hebra de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) .

El término "polipéptido de tipo silvestre" y "región Fe (humana) de tipo silvestre" tal como se utiliza aquí se refiere a un polipéptido y región Fe, respectivamente, que comprende una secuencia de aminoácidos que carece de una o más modificaciones de la región Fe descritas aquí, debido a que no se han introducido, y sirven por ejemplo como controles. El polipéptido de tipo silvestre puede comprender una secuencia nativa de región Fe o una región Fe con modificaciones en la secuencia de aminoácidos preexistentes (como adiciones, supresiones y/o sustituciones) .

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en la forma que permite la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en este para ser efectiva, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le va a administrar la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente del ingrediente activo, que no es tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un amortiguador, excipiente, estabilizador, o conservante .

Un polipéptido con la afinidad de unión a FcR o una actividad CCDA "alterada" es uno que posee tanto la actividad de unión a FcR y/o actividad CCDA amentada o disminuida en comparación con un polipéptido parental o con un polipéptido que comprende una secuencia nativa de la región Fe. La variante de polipéptido que "muestra un aumento de la unión" a un FcR se une al menos a un FcR con mejor afinidad que el polipéptido parental. La variante de polipéptido que "muestra una disminución de la unión" a un FcR, se une al menos a un FcR con peor afinidad que un polipéptido parental. Las variantes que muestran una disminución de la unión a un FcR pueden poseer cierta unión apreciable a un FcR o ninguna, por ejemplo, unión de un 0-20% al FcR en comparación con una secuencia nativa de región Fe de IgG, por ejemplo, como se determina en los Ejemplos en este documento.

El polipéptido que se une a un FcR con "afinidad reducida" que un polipéptido parental, es uno que se une a uno o más de los anteriores FcR identificados con la afinidad de unión sustancialmente reducida comparado con el anticuerpo parental, cuando las cantidades de la variante de polipéptido y el polipéptido parental en el ensayo de unión son esencialmente las mismas. Por ejemplo, la variante de polipéptido con la afinidad de unión a FcR reducida puede mostrar desde alrededor de 1,15 veces hasta alrededor de 100 veces, por ejemplo, desde alrededor de 1,2 veces a alrededor de 50 veces una reducción en la afinidad de unión a FcR en comparación con el polipéptido parental, cuando la afinidad de unión a FcR se determina, por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos en este documento.

El polipéptido que comprende una variante de Fe que "media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) en presencia de células efectoras humanas de forma menos efectiva" que un polipéptido parental o de tipo silvestre es uno que in vitro o in vivo es sustancialmente menos efectivo mediando la CCDA, cuando las cantidades de variante de polipéptido y anticuerpo parental utilizados en el ensayo son esencialmente los mismos. En general, las variantes se identificarán utilizando el ensayo CCDA in vitro tal como se ha descrito aquí, pero se contemplan otros ensayos o métodos para determinar la actividad CCDA, por ejemplo, en un modelo animal, etc. La variante preferible es desde alrededor de 1,5 veces a alrededor de 100 veces, por ejemplo, ;¡ desde alrededor de dos veces a alrededor de cincuenta veces, menos efectiva en mediar la CCDA que el parental, por ejemplo,¦· en el ensayo in vitro descrito aquí. :¡ Un "receptor" es un polipéptido capaz de unirse al menos a un ligando. El receptor preferible es un receptor de superficie celular con al menos un dominio de unión a ligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo, dominio transmembrana, dominio intracelular y/o ancljaje a membrana) . El receptor que se evalúa en el ensayo descrito aquí puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionado con uno o más polipéptidos heterólogos) . Además, el receptor que vana ser evaluado por sus propiedades de unión puede estar presénte en una célula o aislarse y opcionalmente recubrirlo en una, placa de ensayo o alguna otra fase sólida.

El término "dominio de unión al receptor" se Utiliza para designar cualquier ligando nativo para un receptor, que incluye moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado del ligando nativo que retiene al menos una capacidad de unión a receptor cualitativa que corresponde a un ligando nativo. Esta definición, entre otras, incluye de forma específica las secuencias de unión de ligandos para los receptores anteriormente mencionados.

Tal como se utiliza aquí, "tratamiento" (y las variaciones gramaticales del mismo como "tratar" o "tratando") se refiere a una intervención clínica en u intento de alterar el curso natural del ser individual a tratar, y puede realizarse mediante profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluye, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o mejora del pronóstico. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

Por "variante de proteína" o "proteína variante", o "variante" tal como se utiliza aquí se entiende una proteína que difiere de una proteína parental en al menos una modificación de aminoácidos. La variante de proteína puede referirse a la proteína en sí, una composición que comprende la proteína, o la secuencia de aminoácidos que la codifica.

Preferiblemente, la variante de proteína posee al menos una modificación de aminoácidos en comparación con la próteína parental, por ejemplo, desde alrededor de uno a alrededor de setenta modificaciones de aminoácidos, y preferiblemente desde alrededor de uno a alrededor de cinco modificaciones de aminoácidos en comparación con el parental. La secuencia de la variante de proteína aquí poseerá preferiblemente al menos alrededor de un 80% de homología con una secuencia de proteína parental, y más preferiblemente al menos alrededor de un 90% de homología, más preferiblemente al menos alrededor de un 95% de homología. La variante de proteína puede referirse a la variante de proteína en sí, composiciones que comprenden la variante de proteína, o la secuencia de ADN que las codifica. En consecuencia, por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" tal como se utiliza aquí se entiende un anticuerpo que difiere de un anticuerpo parental en al menos una modificación de aminoácidos, "variante de IgG" o "IgG variante" tal como se utiliza aquí se entiende por un anticuerpo que difiere de una IgG parental en al menos una modificación de aminoácidos, y "inmunoglobulina variante" o "variante de inmunoglobulina" tal como se utiliza aquí se entiende por una secuencia de inmunoglobulina que difiere de una secuencia de inmunoglobulina parental en al menos una modificación de aminoácidos.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una hebra ligera o pesada de un anticuerpo que está involucrado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la hebra pesada y de la hebra ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente poseen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés) y tres regiones hipervariables (HVR) . (Véase, por ejemplo, Kindt, et al., Kuby Immunology, 6a ed. , .H. Freeman y Co. (2007) página 91) . Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular puede aislarse utilizando un dominio VH o VL a partir de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar un librería de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano, et al., J. Immunol . 150 (1993) 880-887; Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628.

El término "vector" tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual está unido. El término incluye el vector como una estructura autorreplicante de ácido nucleico así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en donde se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos de forma operativa. Tales vectores se denominan aquí "vectores de expresión" .

La presente solicitud está dirigida a polipéptidos que incluyen modificaciones de aminoácidos que modulan la unión a receptores de Fe, en particular a receptores de FCY.

La presente invención está relacionada con un método para construir un polipéptido que comprende una variante de Fe. El polipéptido "parental", "de inicio", "no variante" o de tipo silvestre se prepara utilizando técnicas disponibles en la materia para generar polipéptidos o anticuerpos que comprenden una región Fe. En la modalidad preferible de la invención, el polipéptido parental es un anticuerpo y ejemplos de métodos para generar anticuerpos se describen en más detalle en las siguientes secciones. El polipéptido parental puede, no obstante, ser cualquier otro polipéptido que comprende una región Fe, por ejemplo, una inmunoadhesina . Los métodos para construir inmunoadhesinas se elaboran en más detalle más adelante en este documento.

En una modalidad alternativa, una variante de región Fe (variante de Fe) puede generarse de acuerdo con los métodos descritos aquí y esta variante de Fe puede fusionarse, a un polipéptido heterólogo de elección, como un dominio variable de un anticuerpo o dominio de unión de un receptor o ligando.

El polipéptido de tipo silvestre comprende una región Fe. Generalmente la región Fe del polipéptido de tipo silvestre comprenderá una secuencia de región Fe nativa o de tipo silvestre, y preferiblemente una secuencia nativa de región Fe humana (región Fe humana) . No obstante, la región Fe del polipéptido de tipo silvestre puede tener una más alteraciones o modificaciones de secuencia de aminoácidos preexistentes a partir de una secuencia nativa de región Fe. Por ejemplo, la actividad de unión de la región Fe a Clq o Fcy puede haberse alterado con anterioridad (otros tipos de modificaciones de región Fe se describen en más detalle más adelante) . En otra modalidad el polipéptido parental de .región Fe es "conceptual" y, mientras no existe físicamente, el ingeniero de anticuerpos puede decidir una secuencia de aminoácidos de variante deseada de región Fe y generar un polipéptido que comprende esta secuencia o un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la variante deseada de región Fe .

En la modalidad de la invención preferible, no obstante, está disponible un ácido nucleico que codifica una región Fe de un polipéptido de tipo silvestre y esta secuencia de ácido nucleico está alterada para generar una variante de secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de región FC. ;; El ADN que codifica una variante de secuencia de aminoácidos del polipéptido de inicio se prepara mediante una serie de métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, preparación mediante mutagénesis dirigida al sitio (o mediada, por oligonucleótidos) , mutagénesis por PCR, y mutagénesis en cásete de una ADN preparado anteriormente que codifica el polipéptido La mutagénesis dirigida al sitio es un método preferible para preparar variantes de sustitución. Esta técnica es bien conocida en la materia (véase, por ejemplo, Cárter, et al., Acid nucleic Res. 13 (1985) 4431-4443 y Kunkel, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488). En resumen, al llevar a cabo una mutagénesis de ADN dirigida al sitio, el ADN inicial se altera hibridando primero un oligonucleótido que codifica la mutación deseada en una hebra sencilla del ADN inicial. Tras la hibridación, se utiliza una polimerasa de ADN para sintetizar una segunda hebra entera, utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador, y utilizando la hebra sencilla del ADN inicial como molde. Así, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN de doble hebra resultante.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para construir variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido inicial. Véase Higuchi, en PCR Protocols, Acádemic Press (1990) pp. 177-183; y Vallette, et al., Nuc . Acids Res. 17 (1989) 723-733. En resumen, cuando pequeñas cantidades de ADN molde se utilizan como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un molde de ADN pueden utilizarse para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia molde solo en las posiciones en las que los cebadores difieren del molde.

Otro método para preparar variantes, la mutagénesis en cásete, está basada en la técnica descrita por Wells, et al., Gene 34 (1985) 315-323.

Una modalidad de la invención abarca polipéptidos que comprenden una región Fe de un anticuerpo, que comprende la adición, sustitución, o supresión de al menos un residuo de aminoácidos con la región Fe que resulta en una afinidad reducida o ausente para al menos un receptor Fe. La región Fe interacciona con una serie de receptores o ligandos que incluyen pero no se limitan a receptores Fe (por ejemplo, FcyRI, FCYRIIA, FCYRIIIA) , la proteína del complemento CIq, y otras moléculas como las proteínas A y G. Estas interacciones son esenciales para una serie de funciones efectoras y eventos de señalización corriente abajo que incluye, pero que no se limita a, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) , fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (FCDA) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . De este modo, en ciertas modalidades las variantes de la invención poseen una afinidad reducida o nula para un receptor Fe responsable de una función efectora en comparación con un polipéptido que posee la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención peo que no comprende la adición, sustitución, o supresión de al menos un residuo de aminoácidos con la región Fe (también referida aquí como "polipéptido de tipo silvestre"). En ciertas modalidades, el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención comprende al menos una o más de las siguientes propiedades: función efectora reducida o nula (CCDA y/o CDC y/o FCDA) , función de unión a los receptores Fe reducida o nula, función de unión a Clq reducida o nula o toxicidades .1 reducidas o nulas. Mas específicamente, las modalidades ;;de la invención proporcionan anticuerpos anti-CD20 (el mismo que GA101 o GA) , anti-CD9 (el mismo que TA) y anti -Seléctina (pSel) con afinidad reducida para los receptores Fe (por ejemplo, FcyRI , FcyRII, FCYRIIIA) y/o la proteína del complemento Clq.

En una modalidad, los anticuerpos de la invención que comprenden una región Fe que comprende al menos una adición, sustitución, o supresión de un residuo de aminoácidos en la posición P329, en donde el sistema de numeración ;de la región constante es el que establece el índice EU en Kabat, et al., NIH Publicación 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, VA.

En una modalidad específica, los polipéptidos de la invención comprenden una variante de Fe de un polipéptido Fe humano de tipo silvestre la variante comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329, en donde la numeración de los residuos en la región Fe de IgG es la del índice EU como en Kabat . En aún otra modalidad, la variante comprende al menos otra sustitución de aminoácidos.

En aún otra modalidad el polipéptido que comprende una variante de Fe de un polipéptido Fe humano de tipo silvestre posee una sustitución, supresión o adición de aminoácidos que destruye o disminuye la función del sándwich de prolina en la región y/o interfaz del polipéptido con el recepto Gamma Fe. !' En otra modalidad la Pro329 está sustituida con un aminoácido que puede ser más pequeño o más grande que la prolina. En aún otra modalidad el aminoácido sustituido es Gly, Ala o Arg. En un aspecto adicional de la invención la Pro329 del polipéptido Fe está sustituida con glicina.

En aún otra modalidad el polipéptido que comprende una variante de Fe posee al menos otra sustitución, adición o supresión de aminoácidos. En aún otra modalidad, las variantes presentan una afinidad reducida a un receptor Fe humano (FcyR) y/o a un receptor del complemento humano en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En otra modalidad el polipéptido que comprende una variante de Fe presenta una afinidad reducida a un receptor Fe humano (FcyR) y/o a un receptor del complemento humano en comparación con el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre humana. En otra modalidad la afinidad a al menos uno de FcyRI, FCYRII, FcyRIIIA está reducida, en aún otra modalidad la afinidad hacia FcyRI y FcyRIIIA está reducida, y en aún otra modalidad la afinidad al FcyRI, FCYRII y FcyRIIIA está reducida, en aún un aspecto adicional de la invención la afinidad al receptor FcyRI, receptor FcyRIIIA y Clq está reducida, y en aún un aspecto adicional de la invención la afinidad al FcyRI, FcyRII, FcyRIIIA y receptor Clq está reducida. ! En aún otra modalidad la CCDA inducida por el polipéptido que comprende una variante de Fe está reducida y en una modalidad preferible la CCDA está reducida en al ; menos un 20% de la CCDA inducida por el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre. En aún un aspecto adicional de la invención, la CCDA y CDC inducida por el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre está disminuida o es nula y en aún otro aspecto el polipéptido que comprende una variante de Fe descrito anteriormente presenta una CCDA, CDC y FCDA disminuida en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En una modalidad la sustitución adicional de aminoácidos en el polipéptido que comprende la variante ¡jde Fe se selecciona entre el grupo: S228P, E233P, L234A, Í.235A, L235E, N297A, N297D, o P331S. :; En cierto aspecto de la invención el polipéptido que comprende una variante de Fe comprende un anticuerpo. En aún otro aspecto de la invención el polipéptido que comprende una variante de Fe comprende una región Fe humana de IgGl o IgG4. En aún un aspecto adicional de la invención las variantes son anticuerpos IgGl o IgG4.

En otra modalidad de la invención, los polipéptidos que comprenden una variante Pro329 de variantes Fe comprenden además al menos una adición, sustitución, o supresión de un residuo de aminoácidos en la región Fe que se correlaciona con un aumento de la estabilidad del anticuerpo. En aún un aspecto adicional de la invención la afinidad del polipéptido que comprende una variante de Fe descrito anteriormente al receptor Fcn es solo ligera, y por ejemplo no más del 10-20% de la afinidad de polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre alterado.

En una modalidad, la adición, sustitución, o supresión de un residuo de aminoácidos en un polipéptido que comprende una variante de Fe está en la posición 228 y/o 235 de la región Fe, en donde el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU tal como se establece en Kabat, et al .

En una modalidad específica la serina en la posición 228 y/o leucina en la posición 235 en el polipéptido que comprende una variante de Fe está sustituida por otro aminoácido.

En una modalidad específica, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención comprenden una región Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 228, en donde el residuo de serina está sustituido con prolina.

En una modalidad específica, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención comprenden una región Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 235, en donde el residuo de leucina está sustituido con ácido glutámico.

En una modalidad específica el polipéptido que comprende una variante de Fe comprende una mutación triple: una sustitución de aminoácidos en la posición P329, una mutación S228P y una mutación L235E (P329/ SPLE) En otra modalidad específica el polipéptido que comprende una variante de Fe comprende una región IgG4 humana.

En una modalidad, la adición, sustitución, o supresión de un residuo de aminoácidos está en la posición 234 y/o 235 de la región Fe, en donde el sistema de numeración de la región constante es el del índice EU tal como se establece en Kabat et al.

En una modalidad específica la leucina en la posición 234 y/o leucina en la posición 235 en el polipéptido que comprende una variante de Fe está sustituida por otro aminoácido .

En una modalidad específica, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención comprenden una región Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 234, en donde el residuo de leucina está sustituido con alanina.

En una modalidad específica, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención comprendén una región Fe que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 235, en donde el residuo de leucina está sustituido con serina.

En una modalidad específica el polipéptidó que comprende una variante de Fe de un polipéptidó Fe humano de tipo silvestre comprende una triple mutación: una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329, una mutación L234A y una mutación L235A (P329/ LALA) .

En otra modalidad específica los polipéptidos anteriormente mencionados comprenden una región IgGl humana.

Mientras que es preferible alterar la unión a un FcyR, las variantes de la región Fe con la afinidad de unión alterada para el receptor neonatal (FcRn) también están contempladas en este documento. Las variantes de la región Fe con afinidad mejorada para FcRn se anticipa que poseen mayor vida media en suero, y las moléculas poseerán aplicaciones útiles en los métodos para tratar mamíferos en los que se desea la administración de polipéptidos de mayor vida media, por ejemplo, para tratar una enfermedad crónica o trastorno.

Las variantes de la región Fe con afinidad de unión por FcRn disminuida, por el contrario, se espera que posean una vida media más corta, y las moléculas pueden, por ejemplo, administrarse a un mamífero en donde un tiempo de circulación más corto puede ser ventajoso, por ejemplo, para un diagnóstico por imagen in vivo o para polipéptidos que poseen efectos secundarios tóxicos cuando se dejan en circulación por el torrente sanguíneo por periodos largos, etc. Las variantes de la región Fe con la afinidad de unión FcRn disminuida se anticipa que serán menos probables de cruzar la placenta, y así pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas.

Las variantes de la región Fe con la afinidad de unión por FcRn alterada i cluye aquellas que comprenden una modificación de aminoácidos en la región Fe en cualquiera de una o más de posiciones de los aminoácidos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311,; 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388/; 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 o 447. Aquellas que muestran una unión reducida a FcRn comprenderá generalmente una modificación de aminoácidos en la región Fe en cualquiera de una o más de posiciones de los aminoácidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 o 447; y aquellas con unión aumentada a FcRn comprenderá generalmente una modificación de aminoácidos en la región Fe en cualquiera de una o más de posiciones de los aminoácidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360|1 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434.

En otra modalidad, los anticuerpos de la invención pueden ser cualquiera de cualquier clase (por ejemplo'/ pero sin limitarse a IgG, IgM, y IgE) . En ciertas los anticuerpos de la invención son miembros de anticuerpos IgG. En una modalidad específica, los anticuerpos de la invención son de la subclase IgGl , IgG2 o IgG4. En otra modalidad especifica, los anticuerpos de la invención siíon de la subclase IgGl y comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: P329G y/o L234A y L235A de la región Ec . En modalidades alternadas, los anticuerpos de la invención :son de la subclase IgG4. En una modalidad específica, los anticjuerpos de la invención son de la subclase IgG4 y comprende las siguientes sustituciones de aminoácidos: P329G y/o S228P y L235E de la región Fe. En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados de la presente invención pueden producirse mediante la combinación de un dominio variable, o un frágmento del mismo, con un dominio Fe que comprende una o más jae las sustituciones de aminoácidos descritas aquí. En '· otras modalidades los anticuerpos modificados de la invención ¡pueden producirse mediante la modificación de un anticuerpo que contiene el dominio Fe mediante la introducción de una'o más de las sustituciones de residuos de aminoácidos en el dominio Fe.

Unión reducida a los ligandos Fe Un experto en la materia entenderá que los anticuerpos de la invención pueden tener propiedades de unión a FcyR y/o Clq alteradas (en relación a un anticuerpo sin modificar) (ejemplos de propiedades de unión incluye pero no se limita a, especificidad de unión, constante de equilibrio de disociación (KD) , tasas de disociación y asociación (koff y kon, respectivamente) la afinidad de unión y/o avidez) y que ciertas alteraciones son más o menos deseables. Es conocido en la materia que la constante de equilibrio de disociación (KD) está definida como koff/kon. Un experto en la materia puede determinar qué parámetro cinético es el más importante para una aplicación de anticuerpo determinada. Por ejemplo, una modificación que reduce la unión a uno o más reguladores positivos (por ejemplo, FCYRIIIA) y/o aumenta la unión a un receptor Fe inhibidor (por ejemplo, FcyRIIB) será adecuado para reducir la actividad CCDA. De este modo, la proporción de unión de las afinidades de unión (por ejemplo, constante de equilibrio de disociación (KD) ) puede indicar si la actividad CCDA de un anticuerpo de la invención está aumentada o disminuida. De forma adicional, una modificación que reduce la unión a Clq será adecuada para reducir o eliminar la actividad CDC. Las afinidades y propiedades de unión de una región Fe para su ligando, puede determinarse mediante una serie de métodos de ensayo in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicas) conocidos en la materia para determinar las interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de una región Fe a un FcyR que incluye pero no se limita a, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) o radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés)), o cinéticas (por ejemplo, análisis BIACORE ), y otros métodos como los ensayos de. nión indirectos, ensayos de inhibición competitivos, transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET, por sus siglas en inglés) , electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel) . Estos y otros métodos pueden utilizar una etiqueta sobre uno o más de los componentes a examinar y/o utilizar una serie de métodos de detección que incluye pero no se limita a etiquetas cromogénicas , fluorescentes, luminiscentes, o isotópicas. Una descripción detallada de las afinidades de unión y cinéticas puede encontrarse en Paul, .E., ed. , Fundamental Immunology, 4" Ed. , Lippincott-Raven, Philadelphia (1999) .

En un aspecto de la invención un polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe humana de, tipo silvestre, la variante que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329 y al menos otra sustitución de aminoácidos, presenta una afinidad reducida para un receptor Fe humano (FcyR) y/o un receptor humano del complemento en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre. En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por un receptor Fe que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que para un polipéptido Fe de tipo silvestre.

En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad de unión reducida para uno o más receptores Fe que incluye, pero no se limita a FCYRI (CD64) que incluye las isoformas FcyRIA, FcyRII y FCYRIII (CD 16, que incluye las isoformas FCYRIIIA) en comparación con un anticuerpo no modificado.

En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad de unión reducida por FcyRI (CD64) FcyRIIA y FcyRIIIA en comparación con un anticuerpo no modificado.

En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad de unión reducida para FcyRIIA y FcyRIIIA en comparación con un anticuerpo no modificado. ü En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad de unión reducida para FCYRI (CD64) y FCYRIIIA en comparación con un anticuerpo no modificado.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención que presentan una afinidad de unión reducida para los receptores Fe que también presentan una afinidad reducida para el receptor Clq.

En cierto aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención no comprenden un aumento concomitante en la unión en el receptor FCYRIIB en comparación con un polipéptido de tipo silvestre. En ciertos aspectos de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe poseen una afinidad reducida al receptor FCYIIIA humano, y al menos otro receptor del grupo que comprende los receptores FCYIIA, FCYIIIB y Clq humanos en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvéstre. En otros aspectos de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe poseen una afinidad reducida hacia el receptor FCYIIIA humano, y hacia dos receptores adicionales del grupo que comprende los receptores FcyIIA, FcyIIIB y Clq humanos en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre. In otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe poseen una afinidad reducida para FcyRIA, FcyIIIA, FcyIIA, FcyIIIB y Clq humanos en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre. En aún otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe poseen una afinidad reducida hacia el receptor FcyRIA, FCYIIIA, FCYIIA, FCYIIIB, y Clq humano en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades disminuidas hacia FCYRI o FCYRIIA en relación a un anticuerpo no modificado. En un aspecto dé la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe presentan afinidades por FcyRI o FCYRIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces', o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre. En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe presentan una afinidad por FCYRI o FcyRIIA que es al menos un 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad disminuida por el FCYRIIIA en relación con un anticuerpo no modificado. En un aspecto los polipéptidps que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por FcyRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por FCYRIIIA que son al menos un 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre.

Se entiende en la materia que la variante alélica F1-58V de FCYRIIIA posee unas características de unión alteradas hacia los anticuerpos. En una modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención se unen con afinidades disminuidas a los receptores FCYRIIIA en relación a un polipéptido de tipo silvestre. En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por FCYRIIIA (Fl 58V) que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces > o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una afinidad disminuida para el receptor Clq en relación a un anticuerpo no modificado. En un aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por el receptor Clq que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces o al menos 200 veces inferior que la de a polipéptido de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por Clq que son al menos un 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10% o al menos 5% inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre.

En un aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por los receptores FcyRI, FcyRIIA, FCYRIIIA, FCYRIIIA (Fl 58V) o Clq humanos que son al menos un 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% inferior que un polipéptido de tipo silvestre.

En otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por los receptores FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcyRIIIA (Fl 58V) y/o Clq, respectivamente, que están ;: entre alrededor de 10 nM a 100 nM, 10 nM a 1 µ?, 100 nM a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 100 nM a alrededor de 10 µ?, o alrededor de 100 nM a alrededor de 1 µ?, o alrededor de 1 nM a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 10 nM a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 1 µ? a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 10 µ? a alrededor de 100 µ?. En ciertas modalidades, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por los receptores FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcyRIIIA (F1-58V) o Clq que es superior a 100 nM, 500 nM, 1 µ?, superior a 5 µ?, superior a 10 µ?, superior a 25 µ?, superior a 50 µ?, o superior a 100 µ?. ;; En otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades aumentadas por FcyRIIB en comparación con un polipéptido de tipo silvestre. En otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por el FCYRIIB que están inalteradas o aumentadas en al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces que la de un anticuerpo no modificado. En otro aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan af nidades por el receptor FCYRIIB que están aumentadas en al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% que un polipéptido de tipo silvestre.

En otro aspecto de la invención las variantes de la invención presentan afinidades por los receptores FCYRI , FCYRIIA FCYRIIIA, O FCYRIIIA (Fl 58V) o Clq que son inferiores a 100 µ?, inferior a 50 µ?, inferior a 10 µ?, inferior a 5 µ?, inferior a 2.5 µ?, inferior a 1 µ?, o inferior a 100 nM o inferior a 10 nM.

Función efectora reducida En ciertos aspectos de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención modulan una función efectora en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En aún otro aspecto de la invención esta modulación es una modulación de CCDA y/o FCDA y/o CDC. En un aspecto adicional de la invención esta modulación es una modulación negativa o reducción del efecto. En aún otro aspecto de la invención esta es una modulación de CCDA y aún en otro aspecto de la invención esta modulación es una modulación negativa de CCDA. En aún otro aspecto esta modulación es una modulación negativa de CCDA y CDC, aún en otra modalidad esta modulación negativa es solo de CCDA, en aún otra modalidad esta ,és una modulación negativa de CCDA y CDC y/o FCDA. En aún otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención modulan negativamente o reducen CCDA/ CDC y FCDA.

En un aspecto adicional de la invención la reducción o modulación negativa de CCDA o CDC o FCDA inducida por el polipéptido que comprende la variante Fe, es una reducción hasta 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 o 75% del valor observado para la inducción de CCDA, o CDC o FCDA, respectivamente, por el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre'.

En aún otros aspectos de la invención la modulación de CCDA inducida por los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención es una disminución de la potencia de forma que la CE50 de la variante de: Fe es aproximadamente >10 veces inferior en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silyestre.

En aún otro aspecto la variante de acuerdo con la invención está desprovista de cualquier CCDA y/o CDC y/o FCDA sustancial en presencia de células efectoras humanas en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En aún otro aspecto de la invención los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una reducción, por ejemplo una reducción en al menos un 20%, o fuertemente reducida, por ejemplo una reducción en al menos un 50%, de la función efectora, que puede ser una reducción en la CCDA (modulación negativa) , CDC y/o FCDA.

Actividad CCDA reducida Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden llevarse a cabo para confirmar la reducción/ disminución de las actividades CDC y/o CCDA. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) pueden llevarse a cabo para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto probable falta de actividad CCDA) , pero retiene capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar la CCDA, las células NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, RII y RUI. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9 (1991) 457-492. Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad CCDA de una molécula de interés n la Patente Estadounidense N° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 83 (1986) 7059-7063) y Hellstrom, I., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502; US 5.821.337 (véase Bruggemann, M. , et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) . Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo para citometría de flujo ACTI™ (Ce11Technology, Inc. Mountain View, CA; y CytoTox 96 ensayo de citotoxicidad no radioactivo (Promega, Madison, WI) . Las células efectoras útiles para los ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células Asesinas Naturales (NK) . Alternativamente o adicionalmente, la actividad CCDA de la molécula de interés puede analizarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clynes, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Los ensayos de unión a Clq pueden también llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para analizar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro, et al., J. Immunol . Methods 202 (1996) 163; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; y Cragg, M.S., y Glennie, M . J . , Blood 103 (2004) 2738-2743) . La unión a FcRn y las determinaciones de aclaramiento/vida media in vivo pueden también realizarse utilizando métodos conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Petkova, S.B., et al., Intl. Immunol . 18 (12) (2006) 1759-1769) .

Se contempla que los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención están caracterizados por ensayos funcionales in vitro para determinar uno o más funciones de células efectoras mediadas por FcyR. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención poseen propiedades de unión similares y funciones celulares efectoras que en los modelos in vivo (como aquellos descritos y descritas aquí) como aquellos ensayos in vitro. No obstante, la presente invención no excluye variantes de la invención que no presenten el fenotipo deseado en los ensayos in vitro pero que presentan el fenotipo deseado in vivo. En una modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan las actividades CCDA disminuidas en comparación con un polipéptido Fe de tipo silvestre sin modificar. En otro aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan las actividades CCDA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces inferior que la de un anticuerpo no modificado. En aún otra modalidad, los anticuerpos de la invención presentan actividades CCDA reducidas en al menos un 10%, o al menos 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100% en relación a un anticuerpo no modificado. En un aspecto adicional de la invención la reducción o modulación negativa de CCDA inducida por el polipéptido que comprende la variante Fe, es una reducción de 0, 2,5, 5, 10, 20, 50 o 75% del valor observado para la inducción de CCDA, o CDC o FCDA, respectivamente, por el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre. En ciertas modalidades, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención poseen una actividad CCDA no detectable. En modalidades específicas, la reducción y/o anulación de la actividad CCDA puede ser atribuible a la afinidad reducida de los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención para los ligandos y/o receptores de Fe. En una modalidad específica de la invención la modulación negativa de CCDA es una disminución de la potencia de forma que el CE50 del polipéptido que comprende una variante de Fe se reduce aproximadamente 10 veces o más en comparación con el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En aún otro aspecto los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención modulan la CCDA y/o CDC y/o FCDA. En un aspecto específico las variantes de acuerdo con las invenciones muestran una actividad CDC y CCDA y/o FCDA reducida.

Actividad CDC reducida La ruta de activación del complemento está iniciada por la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a una molécula, un anticuerpo por ejemplo, acomplejado con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al, 1996, J. Immunol . Methods, 202 (1996) 163.

Las propiedades de unión de las diferentes variantes a Clq pueden analizarse mediante un inraunoensayo de tipo ELISA en sandwich. La concentración de anticuerpo en la respuesta media máxima determina el valor CE50. Esta lectura se registra como la diferencia relativa a la medición de referencia estándar en la misma placa junto con el coeficiente de variación de la muestra y referencia.

En una modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención presentan una disminución de las afinidades a Clq en relación a un polipéptido de tipo silvestre. En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención presentan afinidades por el receptor Clq que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces o al menos 200 : veces inferior que la del polipéptido de tipo silvestre.

En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de acuerdo con la invención presentan afinidades por Clq que son al menos un 90%, al menos 8,0%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 40%, al menos 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% inferior que la del polipéptido de tipo silvestre. En otra modalidad, las variantes de acuerdo con la invención presentan afinidades por Clq que están entre alrededor de 100 nM a alrededor de 1?0 µ?, 0 alrededor de 100 nM a alrededor de 10 µ?, o alrededor de 100 nM a alrededor de 1 µ?, o alrededor de 1 nM a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 10 nM a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 1 µ? a alrededor de 100 µ?, o alrededor de 10 µ? a alrededor de 100 µ?. En ciertas modalidades, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan afinidades por Clq que son superiores a 1 µ?, superiores a 5 µ?, superiores a 10 µ?, superiores a 25 µ?, superiores a 50 µ? o superiores a 100 µ?.

En una modalidad el polipéptido que comprende una variante de Fe de ' la invención presenta actividades CDC reducidas en comparación con el polipéptido Fe de tipo silvestre. En otra modalidad, el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención presenta actividades CDC que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces inferior que la de un polipéptido de tipo silvestre. En aún otra modalidad el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención presenta actividades de CDC reducidas en al menos un 10%, o al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en relación al polipéptido de tipo silvestre. En ciertos aspectos los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención no presentan actividad de CDC detectable. En modalidades específicas, la reducción y/o anulación de la actividad CDC puede ser atribuida a la afinidad reducida de los polipéptidos que comprenden una variante de Fe para los ligandos y/o receptores Fe.

Toxicidad relacionada con el anticuerpo reducida Se entiende en la materia que las terapias biológicas pueden tener aspectos de toxicidad adversa asociados con la naturaleza compleja de dirigir el sistema inmunitario para reconocer y atacar células y/o objetivos no deseados. Cuando el reconocimiento y/o la localización para atacar no tienen lugar cuando el tratamiento es necesario, pueden aparecer consecuencias como toxicidad adversa. Por ejemplo, la tinción con anticuerpos de tejidos no objetivo puede ser indicativo de toxicidad de tejidos potencial. ; En un aspecto, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una tinción reducida de los tejidos no objetivo en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. En otro aspecto, el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención presenta una tinción reducida de los tejidos no objetivo que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la de un polipéptido Fe de tipo silvestre. En otra modalidad, las variantes de la invención presentan una tinción reducida de los tejidos no objetivo que están reducidas en al menos un 10%, o al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en relación :con el polipéptido Fe de tipo silvestre.

En una modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una toxicidad reducida relacionada con el anticuerpo en comparación con un polipéptido de tipo silvestre. En otra modalidad, el polipéptido que comprende una variante de Fe de la invención presenta toxicidades que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferiores que la de un polipéptido de tipo silvestre. En otro aspecto, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan toxicidades que están reducidas en al menos un 10%, o al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en relación al polipéptido de tipo silvestre.

Agregación de trombocitos En un aspecto de la invención el polipéptido de tipo silvestre induce la activación y/o agregación de plaquetas, y las variantes del mismo, es decir los polipéptidos, que comprenden las variantes Fe, muestran una disminución o incluso anulación de la activación y/o agregación de trombocitos. En aún otro aspecto de la invención . estos polipéptidos de tipo silvestre son anticuerpos dirigidos contra una proteína de las plaquetas. En aún otro aspecto el anticuerpo es un anticuerpo CD9. En aún otra modalidad este anticuerpo CD9 posee una mutación en la posición P329G y/o en la posición L234A/ L235A o S228P/ L235E (P329G/ LALA, P329G/ SPLE) . En otra modalidad específica el anticuerpo está caracterizado por las SEC ID NO: 8-14.

Se entiende en la materia que las terapias biológicas pueden tener como efecto adverso la agregación de trombocitos. Los ensayos in vitro e in vivo pueden utilizarse para medir la agregación de trombocitos. Se asume que el ensayo in vitro refleja la situación in vivo.

En un aspecto, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una agregación de trombocitos reducida en un ensayo in vitro en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. En otro aspecto, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una agregación de trombocitos reducida en un ensayo in vitro que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la del polipéptido de tipo silvestre. En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una agregación de trombocitos reducida en un ensayo in vitro que está reducida en al menos un 10%, o al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 401, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en relación al polipéptido de tipo silvestre.

En aún otro aspecto, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de las invenciones presentan una agregación de trombocitos reducida in vivo en comparación con el polipéptido de tipo silvestre. En otro aspecto, las variantes de la invención presentan una agregación de trombocitos reducida en un ensayo in vivo que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces inferior que la del polipéptido Fe de tipo silvestre. En otra modalidad, los polipéptidos que comprenden una variante de Fe de la invención presentan una agregación de trombocitos reducida en un ensayo in vivo que está reducida en al menos un 10%, o al menos un 20%, o en al menos un 30%, o en al menos un 40%, o en al menos un 50%, o en al menos un 60%, o en al menos un 70%, o :en al menos un 80%, o en al menos un 90%, o en al menos un 100%, o en al menos un 200%, o en al menos un 300%, o en al menos un 400%, o en al menos un 500% en relación al polipéptido dé tipo silvestre.

Internalización de anticuerpos Las variantes de la invención pueden unirse a antígenos de superficie celular que pueden internalizar, incluso llevar los anticuerpos dentro de la célula. Una vez dentro de la célula, las variantes pueden liberarse dentro del citoplasma, dirigirse hacia un compartimento específico o reciclarse en la superficie celular. En algunas modalidades, las variantes de la invención se unen a un antígeiio de superficie celular que se internaliza. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención pueden dirigirse a org nulos específicos o compartimentos de la célula. En aún otras modalidades, las variantes de la invención pueden reciclarse en la superficie celular o periferia tras la internalización.

En una modalidad específica, el anticuerpo de la invención es específica para p-Selectina, CD9, CD19, ;¡CD81, CCR5 o CXCR5 , IL17a o 11-33. ' Preparación de anticuerpos En la modalidad preferible de la invención, el polipéptido que contienen la región Fe que está modificada de acuerdo con las enseñanzas aquí descritas es un anticuerpo. A continuación se describen las técnicas para producir 1 anticuerpos: Selección y preparación de antígenos Cuando el polipéptido es un anticuerpo, está dirigido contra un antígeno de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido importante a nivel biológico y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufre una enfermedad o trastorno puede resultar en un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, también están contemplados los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (como los antígenos glucolípidos asociados a un tumor, véase la patente estadounidense N° 5.091.178).

Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembranal (por ejemplo un receptor) o ligando como un factor de crecimiento. Ejemplos de antígenos incluyen moléculas como la renina, una hormona de crecimiento, lo que incluye la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina, factor de liberación de la hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimuladora de la tiroides, lipoproteínas , alfa-l-antitripsina, hebra A de la insulina, hebra B de la insulina, proinsulina, hormona estimuladora de los folículos, calcitonina, hormona luteinizante , glucagón, factores de coagulación como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular (TF, por sus siglas en inglés) y factor de von Willebrand, factores anticoagulantes como la proteína C, factor natriurético atrial, surfactante pulmonar, un activador de plasminogeno, como la urocinasa o activador de plasminogeno de la orina humana o de tipo tisular (t-PA) , bombesina, trombina, factor de crecimiento hemopoyético, factor de necrosis tumoral alfa y beta, encefalinasa, RANTES (regulado en la activación y normalmente expresado y secretado por las células T) , proteína inflamatoria de los macrófagos humana (???-1-alfa) , una albúmina sérica como la albúmina sérica humana, sustancia inhibidora Muelleriana, hejbra A de la relaxina, hebra B de la relaxina, prorrelaxina, péptido asociado a la gonadotropina de ratón, una proteína microbiana, como la beta-lactamasa, ;ADNsa, IgE, un antígeno asociado a linfocito T citotóxico (CTLA, por sus siglas en inglés), como el CTLA-4, inhibina, actiivina, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , receptores de las hormonas o factores de crecimiento, proteína A o D, factores reumatoides, un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF, por sus siglas en inglés), neurotrofina-3 , -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso como el NGF-ß, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés) , factor de crecimiento de los fibroblastos como el aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento transformante' (TGF, por sus siglas en inglés) como el TGF-alfa y TGF-beta, lo que incluye TGF-ß?, TGF- 2, TGF- 3, TGF- o TGF-ßd, factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I y IGF-II) , des (1-3) -IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, proteínas CD como CD4, CD8, CD19 y CD20, eritropoyetina , factores osteoinductivos, inmunotoxinas , una proteína morfogenética ósea (BMP, por sus siglas en inglés) , un interferón como el interferón alfa, beta y gamma, los factores estimuladores de colonias (CSF, por sus siglas en inglés) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF, interleucinas (IL) , por ejemplo, de IL-1 a IL-10, la superóxido dismutasa, proteínas de superficie de membrana, factor acelerador de la caída, antígenos virales como por ejemplo, una porción de la cubierta del .. SIDA, proteínas de transporte, receptores de localización, adresinas, proteínas reguladoras, integrinas como la CDlla, CDllb, CDllc, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM, un antígeno asociado a tumores como los receptores HER2 , HER3 o HER4 , y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos listados anteriormente.

Los objetivos moleculares preferibles para los anticuerpos comprendidos por la presente invención incluyen las proteínas CD como CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34, miembros de la familia de receptores ErbB como el receptor de EGF, los receptores de HER2 , HER3 o HER , moléculas de adhesión celular como la LFA-1 , Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina a4/ß7, e integrina a?/ß3, lo que incluye las subunidades: a o ß de las mismas (por ejemplo los anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) , factores de crecimiento como el VEGF, el factor tisular (TF) , interferón alfa ( -IFN) , una interleucina, como IL-8, IgE, antígenos de grupo sanguíneo, el receptor flk2/flt3, receptor de la obesidad (OB) , receptor mpl, CTLA-4, proteína C, etc.

Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, pueden utilizarse como inmunogenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, como los receptores, pueden utilizarse fragmentos de éstos (por ejemplo el dominio extracelular de un receptor) como inmunogeno. Alternativamente, pueden utilizarse células que expresan la molécula transmembrana como inmunógeno. Tales células pueden derivarse a partir de una fuente natural (por ejemplo líneas celulares cancerosas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para la preparación de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia.

Anticuerpos policlonales Anticuerpos policlonales se generan preferiblemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de la tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, sulfosuccinimidato de maleimidobenzoilo (conjugación a través de residuos cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o carbodiimida, en los que R y R1 son diferentes grupos alquilo.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 g o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples lugares. Un mes después, los animales se estimular de nuevo, por ejemplo, con 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples lugares. Entre 7 y 14 días después, se extrae sangre de los animales y se analiza en el suero el título de anticuerpos. Se estimula de nuevo a los animales hasta que se alcanza una meseta en el título. Preferiblemente, se estimula el animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzado diferente. Los conjugados también pueden obtenerse en cultivos de células recombinantes como proteínas de fusión. Además, los agentes de agregación como el alumbre se utilizan adecuadamente para potenciar la respuesta inmune.

Anticuerpos monoclonales Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales utilizando el método del hibridoma descrito inicialmente por Kohlér, et al., Nature, 256 (1975) 495, o pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante (patente estadounidense N° 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se ha descrito aquí anteriormente para dar lugar a linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente se unirán a la proteína utilizada para su inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Entonces se fusionan los linfocitos con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como el polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press (1986) págs . 59-103).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo paira los hibrídomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , y estas sustancias evitarán el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferibles son aquellas que se fusionan de forma eficiente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo mediante las células productoras del anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre ellas, las líneas celulares de mieloma preferibles son las líneas de mieloma murinas, como las derivadas a partir de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, y las células SP-2 o X63-Ág8-653 disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano, Rockville, Md. USA. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. , Inmunol . 133 (1984) 3001, Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) págs . 51-63).

En el medio de cultivo en donde se encuentran en crecimiento las células de hibridoma se analiza la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente acoplado a enzima (ELISA) .

Tras identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse limitándose a procedimientos de dilución y crecimiento mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic( Press (1986) págs. 59-103) . Los medios de ,cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivó como ascitis tumorales en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados pó'r los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales como, por ejemplo, la proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. .

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las hebras pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente preferible de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede situarse en vectores de expresión, que lue 1 'ígo se transfectan en células huéspedes como las células de E.' coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , o células de mieloma que de otro modo no producen proteínas de las inmunoglobulinas, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos se describirá en más detalle a continuación.

En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas fágicas de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty, J. , et al., Nature 348 (1990) 552-554. Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628 y Marks, et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597 describe el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Subsiguientes publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de n ) mediante cambió de hebras (Marks, et al., Bio/Tecnología 10 (1992) 779-783) , así como la infección combinatoria! y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas fágicas de gran tamaño (Waterhouse, et al., Nuc . Acids. Res. 21 (1993) 2265-2266). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificante de los humano dominios constantes de la hebra pesada y ligera en lugar de las secuencias homologas murinas (Pat. estadounidense N° 4.816.567, Morrison, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855) , o mediante secuencia de la inmunoglobulina la secuencia codificante de un inmunog1obu1ina . ¡ Típicamente tales polipéptidos diferentes de una inmunoglobulina se sustituyen en el lugar de los dotninios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen en el lugar de los dominios variables de un lugar de combinación cpn el antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un lugar de combinación con el ir antígeno con la especificidad de un antígeno y otro lu9ar de combinación con el antígeno con la especificidad déj otro antígeno diferente. i Afinidad de los anticuerpos j- En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que se proporcionan aquí posee una constante de disociación (Kd) de = ! I !) 1 µ?, < 100 n , < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, = 0,01 nM, o = ! ? 0,001 nM (por ejemplo 10"8 M o inferior, por ejemplo de LO"8 M a 10~13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M) . · ;j En una modalidad, la Kd se mide mediante un ensayo de unión a un receptor Fe o antígeno radiomarcado (RIA) que se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interés^ y su antígeno como se describe mediante el siguiente ensayo. La afinidad de unión de Fab de una solución por el antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con 12I en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo artti-Fab (véase, por ejemplo, Chen, et al., J. Mol. Biol . 293 (1999) 865-881) . Para establecer las condiciones de ensayó, se recubren las placas de múltiples cavidades MICROTITER8 (Thermo Scientific) durante toda la noche con 5 g/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9,6), y subsiguientemente se bloquean con albúmina sérica bovina al 2% (p/v) en PBS de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente a 23°C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de antígeno-

[1251] con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la valoración del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta, et al., Cáncer Res. 57 (1997) 4593-4599). El Fab de interés entonces se incuba durante toda la noche, sin embargo la incubación puede continuar durante un periodo de tiempo mayor (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Entonces se elimina la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1% (TWEEN-20 ) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 µ?/cavidad de agente de centelleo (MICROSCINT-20™, Packard) , y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOU T™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que proporcionan una. unión máxima inferior o igual al 20% se escogen para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra modalidad, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia del plasmón en superficie utilizando un BIACORE<S-2000 o a BIACORE "-3000 (BIAcore,;; Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de receptor de Fe o antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU, por sus siglas en inglés) . Brevemente, los chips biosensofes de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de W-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El antígeno se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 4,8, a 5 g/ml (-0,2 µ?) antes de su inyección a una tasa de flujo de 5 µ?/minuto para alcanzar aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las medidas cinéticas, se inyectaron diluciones seriadas al doble de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con el surfactante polisorbato 20 al 0,05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25 °C a una tasa de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y tasas de disociación (kQff) se calculan utilizando un modelo de Langmuir de unión ® simple de uno a uno (BIACORE Software de evaluación versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de equilibrio en la disociación (Kd) se calcula como la proporción entre k0ff/kon> Véase, por ejemplo, Chen, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881; Si la sobretasa supera 106 M-1 s-1 mediante el ensayo de resonancia del plasmón en superficie anterior, entonces 1 puede determinarse la sobretasa utilizando una técnica de bloqueo de la fluorescencia que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm, emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti -antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro de la serie 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta en agitación.

En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan', a los fragmentos Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, et al., Nat . Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore Ed. , (Springer-Verlag, New York), págs . 269-315 (1994), véase también la O 93/16185, y las patentes estadounidenses N" US 5.571.894. y US 5.587.458. Para la discusión de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítope de unión al receptor silvestre y una vida media in vivo aumentada,,, véase la patente estadounidense N° US 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos lugares de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos . Véase, por ejemplo, la PE 0 404 097, WO 1993/01161, Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 y Hollinger, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 90 (1993) 6444-6448. Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson, et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de la hebra pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de la hebra ligera ;de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° US 6.248.516 Bl) .

Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante varias técnicas, lo que incluye pero no se limita a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción mediante células huéspedes recombinantes (por ejemplo un E. coli o fago), como se describe aquí.

Anticuerpos quiméricos y humanizados En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense N° US 4.816.567 y en Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o un primate no humano, como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo con conmutación de clase en donde la clase o subclase se ha cambiado respecto a la del anticuerpo parental . Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no ^humano se humaniza para reducir su inmunogenicidad en los humanos, manteniendo la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, CDR (o porciones de las mismas) se derivan a partir de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de las mismas) se derivan a partir de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente , al menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de la FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo a partir del que se derivan los residuos de la HVR) , por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de un anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los métodos para obtenerlos se revisan, por ejemplo, en Almagro, y Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen en más detalle, por ejemplo, en Riechmann, et al., Nature 332 (1988) 323-329, Queen, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033, las patentes estadounidenses N° 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409, Kashmiri, et al., Métodos 36 (2005) 25-34 (que describe el injerto de SDR (un CDR)), Padlan, Mol. Inmunol . 28 (1991) 489-498 (que describe la "reordenación de superficie"), Dall'Acqua, et al., Métodos 36 (2005) 43-60 (que describe el "intercambio de FR" ) , y Osbourn, et al., Métodos 36 (2005) 61-68 y Klimka, et al., Br. J. Cáncer, 83 (2000) 252-260 (que describe la aproximación de la "selección guiada" al intercambio de FR) .

Las regiones marco humanas que pueden utilizarse para la humanización incluyen pero no se limitan a: regiones marco seleccionadas utilizando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, et al., J. Inmunol . 151 (1993) 2296), regiones marco derivadas de la secuencia consenso de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las regiones variables de la hebra ligera o pesada (véase, por ejemplo, Cárter, et al-, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285, y Presta, et al., J. Inmunol., 151 (1993) 2623), regiones marco maduras humanas (mutadas a nivel somático) o regiones marco de línea germinal humanas (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633), y regiones marco derivadas a partir del cribaje de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca, et al., J. Biol . Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

Anticuerpos humanos En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk, y van de Winkel, Curr . Opin. Pharmacol . 5 (2001) 368-74 y Lonberg, Curr. Opin. Inmunol. 20 (2008) 450-459.

Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición al antígeno. Tales animales normalmente contienen la totalidad o una porción del Itícus de la inmunoglobulina humana, que reemplaza el locus de inmunoglobulina endógena, o que está presente de ' forma extracromosómica o integrada al azar en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, en general el lócus de la inmunoglobulina humana endógena se ha inactivado. Para una revisión de los métodos para la obtención de anticuerpo humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat . Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses N° 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología del XENORATÓN™, la patente estadounidense N° 5.770.429 que describe la tecnología de HUMAB®, La patente estadounidense N° 7.041.870 que describe la tecnología de K-M RATÓN®, y la solicitud de patente estadounidense N° publicación US 2007/0061900, que describen la tecnología de VELoeiRatón®) . Las regiones variables humanas de los anticuerpos intactos generadas por tales animales pueden modificarse posteriormente, por ejemplo, combinándolas con una región constante humana diferente. "> Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse mediante métodos basados en un hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón- humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor, J. Inmunol . , 133 (1984) 3001, Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) págs . 51-63, y Boerner, et al., J. Inmunol., 147 (1991) 86). Los anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562. Otros métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM monoclonales humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4) (2006) 265-268 (que describen los hibridomas humano-humano) . La tecnología de hibridoma humanos (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers, y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3) (2005) 927-937 y Vollmers, y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3) (2005) 185-91.

Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante el aislamiento de secuencias del dominio variable de un clon Fv seleccionadas de entre una biblioteca de presentación de fagos derivada de humano. Tales secuencias del dominio variable pueden combinarse a continuación con el dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar los anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación.

Anticuerpos derivados de una biblioteca Los anticuerpos de la invención pueden aislarse mediante el cribado de bibliotecas combinatoriales en busca de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la materia una variedad de métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y el cribado de tales bibliotecas en busca de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H. ., et al., en Methqds in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., Ed. / Human Press, Totowa, NJ, 2001) y también se describen, por ejemplo, en McCafferty, J. , et al., Nature 348 (1990) 552-554, Clackson, et al., Nature 352 (1991) 624-628, Marks, et al., J. Mol. Biol . 222 (1992) 581-597, Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003), Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2) (2004) 299-310, Lee, et al., J. Mol. Biol. 340(5) (2004) 1073-1093, Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34) (2004) 12467-12472, y Lee, et al., J. Inmunol . Methods 284(1-2) (2004) 119-132. :: En ciertos métodos de presentación en fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan de forma separada mediante la reacción en hebra de la polimerasa (PCR) y se recombinan al azar en bibliotecas fágicas, que entonces pueden cribarse en busca de fagos que se unan al antígeno cómo se describe en inter, et al., Ann. Rev. Inmunol . , 12 (1994) 433-455. Los fagos normalmente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv de hebra sencilla (scFv) o fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas . Alternativamente, el repertorio naive puede clonarse (por ejemplo, a partir de humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a un amplio rango de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths, et al., EMBO J, 12 (1993) 725-734. Finalmente, las bibliotecas naive también pueden obtenerse de forma sintética mediante el clonaje de segmentos del gen V no reordenados de células madre, y utilizando cebadores de PCR que contienen una secuencia al azar para codificar las regiones CDR3 altamente variable y para conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol . , 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen las bibliotecas fágicas de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense N° 5.750.373 y las publicaciones de patente estadounidense N° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos aquí se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos.

Anticuerpos multiespecífieos En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que poseen especificidades de unión por al menos dos lugares diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de unión lo es por un antígeno específico y la otra lo es por cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopes diferentes del antígeno. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar los agentes citotóxicos en las células que expresan el antígeno al que se une el anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para obtener anticuerpos multiespecífieos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de hejbras pesadas-hejbras ligeras de inmunoglobulina con diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305 (1983). 537) , WO 93/08829, y Traunecker, et al., EMBO J. 10 (1991) 3655), y el diseño de botón en ojal (en inglés nknob-in-hole" ) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecífieos también pueden obtenerse mediante el diseño de efectos de direccionamiento electrostático para obtener moléculas de anticuerpo Fc-heterodiméricas (WO ? 2009/ 089004A1) , entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense N° 4.676.980, y Brennan, et al., Science, 229 (1985) 8¡1) , la utilización de cremalleras de anticuerpos biespecífieos (véase , al., J. Inmunol., 148(5) (1992) 1547-1553), utilizar la !) tecnología de los "diacuerpos" para obtener f ragmentaos de anticuerpo biespecífico (véanse, por ejemplo, Hol et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90 (1993) 6444-6448) , y la 'i utilización de dímeros de Fv de hebra sencilla (sFv) (¡véase, por ejemplo Gruber, et al., J. Inmunol., 152 (1994) 5368), y ¦i la preparación de anticuerpos triespecíficos como los ; descritos, por ejemplo, en Tutt, et al., J. Inmunol. 147 Los anticuerpos genéticamente modificados con |¡tres o más puntos de unión a antígeno funcionales, lo que incluye los "anticuerpos Octopus," también están incluidos aquí (Véase, por ejemplo la US 2006/0025576A1) . i; El anticuerpo o fragmento de esta descripción también incluye un "FAb de acción dual" o "DAF, por sus ¡'siglas 1 i en inglés" que comprende un lugar de unión al antígeno ;que se une a un antígeno específico así como a otro antígeno diferente (véase la US 2008/0069820, por ejemplo) . \ i I . ,i Variantes de anticuerpo con afinidad de unión alterada al antígeno En ciertas modalidades, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Pueden obtenerse variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo las modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo, o mediante la síntesis de pépt:idos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, las supresiones y/o inserciones, y/o sustituciones de residuos dé las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, de unión al antígeno.

Variantes de sustitución, inserción y supresión En ciertas modalidades, se proporcionan polipéptidos que comprenden variantes de Fe, y además poseen una ',,'? más sustituciones de aminoácido en otras partes distintas de la parte Fe. Los puntos de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título "sustituciones conservadoras". Se proporcionan otros cambios más sustanciales en la Tabla 1 bajo el título "sustituciones de ejemplo" y como se describe más en detalle a continuación, en referencia a las clases de hejbras laterales de los aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos pueden cribarse para la actividad deseada, por ejemplo, retención o mejora de unión al antígeno o inmunogenicidad reducida .

Tabla 1: agrupados de acuerdo con las propiedades comunes de las hebras hidrofóbicos : He, Met, Ala, Val, Leu, II hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la hebra: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe .

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante sustitucional involucra la sustitución de uno o más residuos de la región hiperváriable de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humano o humanizado). En general, la(s) variante(s) resultantes seleccionadas para su posterior estudio tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) relativas al anticuerpo parental y/o habrán retenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo parental. Un ejemplo de variante sustitucional es un anticuerpo maduro de afinidad, que puede haberse generado convenientemente, por ejemplo, utilizando técnicas de maduración de la afinidad basadas en la exposición en fagos como los descritos aquí. Brevemente, se mutan uno o más residuos de la HVR y los anticuerpos variantes se exponen sobre fagos y se criban en busca de una actividad biológica particular (por ejemplo afinidad de unión) .

Pueden obtenerse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones pueden obtenerse en lugares de hipermutación o "punto activo" de las HVR, es decir, residuos codificados por codones que sufren mutaciones a una elevada frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol . 207 (2008) 179-196) , y/o las SDR (a-CDRs) , y luego se analiza la afinidad de unión de la VH o VL variante resultante.;, Se ha descrito la maduración de la afinidad mediante la construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human, Press, Totowa, NJ, (2001) ) . En algunas modalidades de la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables escogidos para su maduración mediante cualquiera de una serie de métodos (por ejemplo, PCR con tendencia al error, intercambio de hebras o mutagénesis dirigida con oligonucleótidos) . Entonces se crea una biblioteca secundaria. Entonces se criba una biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra aproximaciones dirigidas a las HVR, en las que varios residuos de las HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) se aleatorizan. Los residuos de la HVR involucrados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, utilizando la mutagénesis de escaneo de alanina o el modelaje. En particular, la CDR-H3 y la CDR-L3 a menudo son objetivos.

En ciertas modalidades, las substituciones, inserciones o supresiones pueden ocurrir en una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden obtenerse alteraciones conservadoras en las HVR (por ejemplo, sustituciones conservadoras como las que aquí se proporcionan) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Tales alteraciones pueden estar fuera de los "puntos activos" de la HVR o SDR. En ciertas modalidades de las secuencias VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está, o bien inalterada o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácido.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que puede ser el objetivo de una mutagénesis se denomina "mutagénesis de escanea de alanina" como se describe en Cunningham y Wells, Science 244 (1989) 1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y reemplazan por aminoácidos neutros o cargados nega ivamente (por ejemplo, alanina o polial'anina) para determinar si se ve afectada la interacción del anticuerpo con antígeno. Otras sustituciones adicionales pueden introducirse en localizaciones de aminoácidos que muestren una sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente o adicionalmente, puede realizarse una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos pueden ser los objetivos, o eliminarse como candidatos para su sustitución. Las variantes pueden cribarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones terminales en amino y/o carboxilo con una longitud que oscila entre un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un único o múltiples residuos de aminoácido. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N- o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en el suero del anticuerpo. ! Variantes de glucosilación En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan está alterado para aumentar o reducir la extensión en donde el anticuerpo se glucosila. La adición o supresión de puntos de glucosilación a un anticuerpo' puede conseguirse de forma conveniente alterando la aecueiicia de aminoácidos de forma que se creen o se eliminen uno o más puntos de glucosilación.

Donde el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido a éste puede ser alterado. Los anticuerpos nativos producidos por las células de mamífero normalmente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está unido mediante un N-enlace al Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ejemplo, right, et al., TIBTECH 15 (1997) 26-32. El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en la base de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas modalidades, pueden obtenerse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

Además se proporcionan polipéptidos que comprenden variantes Fe con oligosacáridos sialilados, por ejemplo, en los que una sialilación diferencial del núcleo de oligosacárido del Fe unido a la región Fe del anticuerpo. Tales polipéptidos pueden poseer una sialilación aumentada y/o función de CCDA reducida. Ejemplos de tales variantes de anticuerpo se describen por ejemplo en Kaneko, et al., Science 313 (2006) 670-673.

Variantes de anticuerpo modificadas genéticamente con cisteínas En ciertas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisteínas, por ejemplo, los "tioMAb" , en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos ocurren en lugares accesibles del anticuerpo. Sustituyendo estos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan así en lugares accesible del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo con otras porciones, como porciones fármaco o porciones de unión a fármacos, para crear un inmunoconjugado, como se ha descrito aquí en detalle. En ciertas modalidades, cualquiera de entre uno o más de los siguientes residuos puede estar sustituido con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la hebra ligera, A118 (numeración EU) de la hebra pesada, y S400 (numeración EU) de la región Fe de la hebra pesada. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteínas pueden generarse como se ha descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 7.521.541.

Derivados de anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo de los que aquí se proporcionan puede estar modificado adicionalmente para que contenga porciones adicionales no proteicas que son conocidas en la materia y fácilmente disponibles. Las porciones adecuadas para la derivatización del anticuerpo incluyen pero no se limitan a los polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/ propilenglicol , carboximetilcelulosa , dextrano, polivinilalcohol , polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/ anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) , y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona) olietilenglicol , homopolímeros propropilenglicol , copolímeros de óxido de prolipropileno/ óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , polivinilalcohol, y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la manufactura debido a su estabilidad en agüa. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo pueden variar, y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización puede determinarse en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, de si el derivado de anticuerpo va a utilizarse en una terapia bajo unas condiciones definidas, etc.

En otra modalidad, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y una porción no proteica que pueden calentarse de forma selectiva mediante exposición a radiación. En una modalidad, la porción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605) . La radiación puede ser de cualquier longitud de nda e incluye, pero no se limita, a las longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la porción no proteica hasta una temperatura a la que se destruyen las células proximales a la porción no proteica del anticuerpo. Composiciones y métodos recombinantes Los anticuerpos pueden producirse utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, tal cqmo se describe en la Patente Estadounidense N° 4.816.567. Én una modalidad, se proporciona el ácido nucleico aislaáo que codifica una variante de anticuerpo descrita aquí. El ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las hebras lige!ra y/o pesada del anticuerpo) . En otra modalidad, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden el ácido nucleico. En otra modalidad, se proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico. En la modalidad, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20) . ;En una modalidad, se proporciona un método para construir una variante de anticuerpo, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped) .

Para la producción recombinante de una variante de anticuerpo, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, se aisla y se inserta en uno o más vectores para un posterior clonaje y/o expresión en una célula huésped. El ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las hebras ligera y pesada del anticuerpo) .

Las células huéspedes adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpos incluye células procariotas o eucariotas como se ha descrito en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glucosilación y la función efectora Fe no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, Las patentes Estadounidenses N° 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B. .C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ) , que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Tras la expresión, el anticuerpo puede aislarse a partir de pasta de células bacterianas Sn una fracción soluble y puede purificarse posteriormente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o levaduras son adecuados como huéspedes de clonación o expresión para vectores que codifican anticuerpos, que incluye cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación han sido "humanizadas," lo que resulta en la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcialmente o totalmente humano. ¦ Véase Gerngross, Nat . Biotech. 22 (2004) 1409-1414, y Li, et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huéspedes adecuadas para la expresión de de anticuerpos glucosilados también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células invertebradas incluye células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que pueden utilizarse junto con células de insecto, en particular para la transfeccion de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales también pueden utilizarse como huéspedes. Véase, por ejemplo, Patente Estadounidense N° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describe la tecnología PLA TIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .

Las células de vertebrados también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, las líneas celulares de mamífero que se adaptan al crecimiento en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares de mamífero huéspedes útiles son la línea de riñon de mono CV1 transformada con SV40 (COS-7) ; la línea de riñon embrionario humano (293 o células de riñon (BHK) ; las células de sertoli de ratón (las células TM4 como se describen, por ejemplo, en Mather, Biol. R'eprod. 23 (1980) 243-251) ; células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, por sus siglas en inglés) ; células de riñon de perro (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de pulmón humano (W138) ; células de hígado ; humano (Hep G2) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562) ; células TRI , tal como se describen, por ejemplo, en Mather, et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células RC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huéspedes de mamífero útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) , que incluyen las células CHO DHFR" (Urlaub, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216); y líneas celulares de mieloma como YO, NSO y Sp2/0. Para revisar ciertas líneas celulares huéspedes de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268 (B.K.C. Lo, Ed. , Humana Press, Totowa, NJ) .

Ensayos Los anticuerpos proporcionados aquí pueden identificarse, cribarse para, o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en la materia.

Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se analiza por su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, mediante métodos conocidos como ELISA, Western blot, etc.

En un ejemplo de ensayo de competición, el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al antígeno (por ejemplo) y un segundo anticuerpo no marcado que se está analizando ,,por su capacidad para competir con el primer anticuerpo para la unión al antlgeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, el antígeno inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Tras la incubación bajo condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al antígeno, el exceso de- anticuerpo no unido se elimina, y se mide la cantidad de etiqueta asociada con antígeno inmovilizado. Si la cantidad de etiqueta asociada con antígeno inmovilizado se reduce sustancialmente ;en una muestra de ensayo en relación a la muestra control, lo que indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para la unión al antígeno (véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .

Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado aquí a uno o más agentes citotóxicos, como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes que inhiben el crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteína, toxinas de bacterias enzimáticamente activas, o de origen fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o isótopos radioactivos.

En una modalidad, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo- fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) en dónde un anticuerpo está conjugado a uno o más fármacos, que incluye pero no se limita a un maitansinoide (véanse las patentes estadounidenses N° 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea PE 0 425 235 Bl) ; una auristatina como las porciones de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes estadounidenses N° 5.635.483, 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una caliceamicina o derivado de las mismas (véanse las patentes estadounidenses N° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.7.73.001 y 5.877.296; Hinman, et al., Cáncer Res. 53 (1993) 3336-3342; y Lode, et al., Cáncer Res. 58 (1998) 2925-2928); una antraciclina como daunomicina o doxorubicina (véanse Kratz, et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362; Torgov, et al., Bioconj . Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; y la patente estadounidense N° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano como el docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se ha descrito en este documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, que incluye pero no se limita a hebra de difteria A, fragmentos activos que no se unen de la toxina de difteria, hebra A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , hebra A de la ricina, hebra A de la abrina, hebra A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se ha descrito en este documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado .¦ Están disponibles una serie de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados . Ejemplos incluye At211; I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se utiliza el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios de centelleo, por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta de espín para resonancia magnética nuclear! (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética,! IRM) , como el yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro; Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico pueden realizarse utilizando una serie de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional como el propioriato de N-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (como tolueno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos flúor bis-activos (como 1, 5-difluoro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse tal como se describe en Vitetta, et al., Science 238 (1987) 1098.!] Ácido 1- isotiocianatobenzil-3 -metildietilen-triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo (véase la O 94/11026) . El enlazante puede ser un "enlazante escindible" que' facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante lábil al ácido, enlazante sensible a peptidasa, enlazante fotolábil, enlazante dimetilo o enlazante que contiene disulfuros (Chari, et al., Cáncer Res. 52 (1992) 127-131; Patente Estadounidense N° 5.208.020).

Los inmunuoconjugados o ADC se contemplan de forma expresa en este documento, pero no se limitan a los conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento que incluyen, pero no se limitan a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo- SMPB, y SVSB ( succinimidil - (4 -vinilsulfona) benzoato) que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S. A).

Métodos y composiciones para el diagnóstico y detección En ciertas modalidades, cualquier variante del anticuerpo proporcionada aquí es útil para la detección de la presencia de la unión de antígeno a ese anticuerpo en una muestra biológica. El término "detectar" tal como se utiliza aquí abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido.

En una modalidad, se proporciona una variante de anticuerpo para utilizar en un método de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un método para detectar la presencia del antígeno al que la variante de anticuerpo se une a una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende contactar la muestra biológica con un anticuerpo tal como se ha descrito en este documento bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo al antígeno, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo y el antígeno. El- método puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, una variante de anticuerpo se utiliza para seleccionar sujetos elegibles para la terapia con un anticuerpo, por ejemplo, si el antígeno al que el anticuerpo se une es un biomarcador para la selección de pacientes.

Ejemplos de trastornos que pueden diagnosticarse utilizando un anticuerpo de la invención incluye cáncer, enfermedades cardiovasculares, trastornos neuronales y diabetes.

En ciertas modalidades, se proporcionan variantes de anticuerpos marcados. Las etiquetas incluyen, pero no se limitan a, etiquetas o porciones que se detectan directamente (como etiquetas fluorescentes, cromofóricas , electrodensas , quimioluminiscentes, y radioactivos), así como porciones, como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Ejemplos de etiquetas incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, y 131I, fluoróforos como quelantes térreos raros o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas , por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente Estadounidense N° 4.737.456), luciferina, 2 , 3 -dihidroftalazinadionas , peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina oxidasa, acoplada con una enzima que utiliza el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinción como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/ avidina, etiquetas de espín, etiquetas de bacteriófago, radicales libres estables y similares.

Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de una variante de anticuerpo tal como se ha descrito en este documento se preparan mezclando el anticuerpo con el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluye, pero no se limita a: i, amortiguadores como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluye ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbenzilamonio ; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio ; cloruro de benzetonio; fenol,, butil o bencil alcohol; alquil parabenos como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a alrededor de 10 residuos); proteínas, como albúmina d esuero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona ; aminoácidos' como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluye glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitql; contraiones que forman sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-prot ína) ; y/o tensioactivos no iónicos como polietilenglicol (PEG) . Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables en este documento incluye agentes de dispersión instersticial de fármacos como glucoproteínas hialuronidasa neutral-a tivas solubles (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteínas hialuronidasa humanas solubles PH-20, como rHuPH20 (HYLENEXE, Baxter International, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGP y métodos de utilización, que incluye rHuPH20, se describen en la publicación de patente estadounidense N°' 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglicanasas adicionales como condroitinasas .

Ejemplos de formulaciones de anticuerpo liofil zadas se describen en la Patente Estadounidense N° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuoso incluye aquellas descritas en la Patente Estadounidense N° 6,171,586 y WO 2006/0:44908, estas últimas formulaciones incluyen un amortiguador histidina-acetato .

La formulación aquí puede también contener más de un ingrediente activo como sea necesario para la indicación particular a tratar, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre ellas. Los ingredientes activos están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito que se pretende .

Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial!, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) .

Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluye matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, las matrices están en forma de artículos, por ejemplo, películas, o microcápsulas.

Las formulaciones para utilizar en la administración in vivo son en general estériles. La esterilidad " puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Métodos y composiciones terapéuticas Cualquiera de los polipéptidos proporcionados aquí puede ser utilizado en métodos terapéuticos.

En un aspecto específico de la invención el polipéptido de acuerdo con la invención se utiliza para tratar una enfermedad. En un aspecto más específico, la enfermedad es tal, que favorece que la función efectora de la variante esté fuertemente reducida, en al menos un 50%, en comparación con el polipéptido que comprende el polipéptido Fe dé tipo silvestre.

En un aspecto específico el polipéptido de acuerdo con la invención se utiliza en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora del polipéptido esté fuertemente reducida en comparación con un polipéptido Fe de tipo silvestre. En otro aspecto específico el polipéptido de acuerdo con la invención se utiliza en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora del polipéptido esté reducida en comparación con un polipéptido Fe de tipo silvestre, en al menos un 20%.

Un aspecto adicional es un método para tratar a un individuo con una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora de la variante esté fuertemente reducida en comparación con un polipéptido Fe de tipo silvestre, que comprende la administración a un individuo una cantidad efectiva del polipéptido de acuerdo con la invención.

Una fuerte reducción de la función efectora es una reducción de la función efectora en al menos un 50 ' de la función efectora inducida por el polipéptido de tipo silvestre.

Las enfermedades son por ejemplo todas las enfermedades en las que la célula objetivo no sé verá destruida mediante por ejemplo CCDA, FCDA o CDC. Además, esto es verdad para aquellos anticuerpos que están genéticamente modificados para liberar un fármaco (por ejemplo, toxinas e isótopos) a la célula objetivo en donde las funciones efectoras mediadas por Fc/FcyR proporcionan células inmunitarias sanas en la proximidad de la carga mortal,] lo que j resulta en la disminución de tejido linfoide normal junto con las células objetivo (Hutchins, et al, PNAS USA 92 M (1995) 11980-11984; White, et al, Annu Rev Med 52 (2001) 125-145). En estos casos el uso de anticuerpos que reclutan pobremente al complemento o a células efectoras serán de un beneficio tremendo (véase por ejemplo, Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26; Shields, et al., J. Biol Chem 276 (9) (2001) 6591-6604; US 6.194.551; US 5.885.573 y publicación PCT WO 04/029207) . ;; En otros ejemplos, por ejemplo, en los : que el bloqueo de la interacción de un receptor ampliamente expresado con su ligando afín es el objetivo, será ventajoso disminuir o eliminar toda función efectora del anticuerpo para reducir una toxicidad no deseada. También, en el ejemplo en donde un anticuerpo terapéutico muestre una unión promiscua a lo largo de una serie de tejidos humanos será prudente limitar el alcance de la función efectora hacia un grupo diverso de tejidos para limitar la toxicidad.

También para los anticuerpos agonistas será muy útil si estos anticuerpos presentan función efectora reducida.

Las condiciones que pueden tratarse con la variante de polipéptido son muchas y variadas e incluye el cáncer (por ejemplo, en donde la variante de anticuerpo se une al receptor HER2 , receptor angiopoyetina o factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, por sus siglas en inglés) ) condiciones alérgicas como asma (con un anticuerpo anti-IgE) ; y trastornos mediados por LFA-1 (por ejemplo, en donde la variante de polipéptido es un anticuerpo anti-LFA-1 o anti-ICAM-l) , trastornos neurológicos y metabólicos.

Cuando el anticuerpo se une al receptor HER2 , el trastorno preferiblemente es un cáncer que expresa HER2 , por ejemplo, un tumor benigno o maligno que se caracteriza por la sobreexpresión del receptor HER2. Los cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células grandes, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y. varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El polipéptido o variante de anticuerpo se administra mediante cualquier medio adecuado, que incluye parenteral, subcutáneo, intraperitoneal , intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, o subcutánea. Además, la variante de anticuerpo se administra adecuadamente mediante infusión por pulsos, particularmente con dosis decrecientes de la variante de polipéptido. Preferiblemente la dosificación se proporciona mediante inyecciones, más preferiblemente mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de polipéptido o variante de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y curso de la enfermedad, si la variante de polipép ido se administra con un propósito preventivo o terapéutico, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la variante de polipéptido, y del juicio del médico responsable. La variante de polipéptido se administra de forma adecuada al paciente en una sola toma o durante una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, alrededor de 1 pg/kg hasta 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1-20 mg/kg) de polipéptido o variante de anticuerpo es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, si por ejemplo, se administra mediante una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica está en el rango de alrededor de 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Por administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que aparece una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

En ciertas modalidades, la invención proporciona una variante de anticuerpo o polipéptido para utilizar en un método para tratar a un individuo que posee un cáncer que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de la variante de anticuerpo. En una modalidad, el método comprende además la administración a un individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más adelante. En otras modalidades, la invención proporciona una variante de anticuerpo para utilizar en la inhibición de la angiogénesis, inhibición de la proliferación celular o reducir los linfocitos B en un individuo que comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva de la variante de anticuerpo para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular o reducir los linfocitos B en un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores que se refiere preferiblemente a un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una variante de anticuerpo o polipéptido en la elaboración o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento del cáncer o enfermedades inflamatorias. En otra modalidad, el medicamento es para utilizar en un método para tratar el cáncer, diabetes, trastornos neuronales o inflamatorios que comprenden la administración a un individuo que posee cáncer, diabetes, trastornos neuronales o inflamatorios de una cantidad efectiva del medicamento. En una de las modalidades, el método comprende además la administración a un individuo de una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe más adelante. En otra . modalidad, el medicamento es para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular o reducir los linfocitos B.

En otra modalidad, el medicamento es para utilizar en un método para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular o reducir los linfocitos B.

En un individuo que comprende la administración a un individuo una cantidad efectiva del medicamento para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular o reducir los linfocitos B. un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprende cualquiera de las variantes de anticuerpo proporcionadas aquí, por ejemplo, para utilizar en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquier variante de anticuerpo proporcionada aquí; y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquier variante de anticuerpo proporcionada aquí y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe más adelante. | Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede co-administrarse con al menos un agente terapéutico adicional.

Las terapias de combinación citadas anteriormente abarcan la administración combinada (en la que dos o más agentes terapéuticos están incluidos en la misma formulación o una separada) , y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede realizarse antes, de forma simultánea, y/o tras la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos de la invención pueden también utilizarse en combinación con terapia de radiación.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier "agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, que incluye administración parenteral, intrapulmonar, e intranasal , y si se desea para el tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier ruta adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es puntual o crónica. Se contemplan aquí varios calendarios de dosificación que incluye pero no se limita a administraciones únicas o múltiples a lo largo del tiempo, administración en bolo e infusión en pulsos.

Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán, y administrarán de una forma consistente con las buenas prácticas clínicas. Los factores para considerar en este contexto incluye el trastorno particular a tratar, el mamífero particular a tratar, la condición clínica del paciente, la causa del trastorno, le lugar de liberación del agente, el método de administración, el calendario de administración, y otros factores conocidos para el médico. El anticuerpo no necesita, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados en la actualidad para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva, de los otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosificaciones y con rutas de administración tal como se ha descrito en este documento, o alrededor de 1 al 99% de las dosificaciones descritas aquí, o en cualquier dosificación y mediante cualquier ruta que esté determinada empírica o clínicamente para ser apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapias previas, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el juicio del médico. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una sola vez o durante una serie de tratamientos . Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, alrededor de 1 g/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para la administración al paciente, ya sea por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica estará en el rango de alrededor de 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendrá hasta que aparezca la supresión desead de síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosis del anticuerpo estará en el rango de alrededor de 0,05 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg. Así, una o más dosis de alrededor de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación del mismo) puede administrarse al paciente. Las dosis pueden administrarse de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de forma que el paciente reciba desde alrededor de dos a alrededor de veinte, o por ejemplo, alrededor ,de seis dosis del anticuerpo) . Una carga de dosis inicial superior, seguida por una o más dosis inferiores puede administrarse. No obstante, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se puede monitorizar fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las anteriores formulaciones o métodos terapéuticos puede llevarse a cabo utilizando un inmunoco jugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de empaque dentro o asociado al contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los contenedores pueden estar formados a partir de una serie de materiales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva por sí misma o combinada con otra composición para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y puede poseer un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un obturador perforable para agujas hipodérmicas) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se utiliza para tratar la condición de elección. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer contenedor con una composición contenida en este, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo contenedor con una composición contenida en este, en donde la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede además comprender un inserto de empaque que indica que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente , el artículo de manufactura puede además comprender un segundo (o tercer) contenedor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés) , amortiguador fosfato salino, solución de Ringer y solución dextrosa. Puede también incluir otros materiales deseables a partir de un punto de vista comercial y del usuario, que incluye otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos anteriores de manufactura puede incluir un inmunocon ugado de la invención en lugar de o además de una variante de anticuerpo .

Usos no terapéuticos para el polipéptido La variante de anticuerpo de la invención puede utilizarse como agente de purificación por afinidad. En este proceso, la variante de anticuerpo está inmovilizada en una fase sólida como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos bien conocidos en la materia. La variante de polipéptido inmovilizado está en contacto una muestra que contiene el antígeno a purificar, y posteriormente el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno a purificar, que está unido a la variante de anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, como amortiguador glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno de la variante de polipéptido.

La variante de anticuerpo puede también ser útil en los ensayos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés -en células específicas, tejidos o suero.

Para aplicaciones diagnósticas, la variante de anticuerpo normalmente estará marcada con una porción detectable. Están disponibles numerosas etiquetas que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, como 35S, 14C, 1251 , 3H, y ^31I . La variante de polipéptido puede marcarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas por ejemplo en Coligen, et al., Current Protocole in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs . (1991) y la radioactividad puede medirse utilizando el contaje por centelleo . (b) Las etiquetas fluorescentes como los qúelados térreos raros (quelado de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina y rojo Texas están disponibles. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse a la variante de polipéptido utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro. (c) Varias etiquetas enzima-sustrato están disponibles y la Pat . Estadounidense N° 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de estos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse mediante un espectrofotómetro . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente pasa a estar electrónicamente excitado mediante una reacción química y puede emitir entonces una luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o proporciona energía a una aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluye luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana ,-patente estadounidense N° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas , malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa como peroxidasa de rábano picante (HRPO) , fdsfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan, et al., Method for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) .

Ejemplos de combinaciones enzima sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3 ',5,5'-tetrametil bencidina (TMB) ) ; I (ii) Fosfatsa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil- ß-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4 -metilumbeliferil- ß-D-galactosidasa .

Están disponibles numerosas combinaciones de enzima sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revisión general de estos, véase la patente estadounidense N° 4.275.149 y .318.980.

Algunas veces, la etiqueta está . indirectamente conjugada con la. variante de polipéptido. El experto en la materia estará al caso de diferentes técnicas para lograrlo. Por ejemplo, la variante de polipéptido puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina ie une selectivamente con avidina y así, la etiqueta \: puede conjugarse con la variante de polipéptido de esta forma indirecta. Alternativamente, para lograr una conjugación indirecta de la etiqueta con la variante de polipéptido, la variante de polipéptido está conjugada con un pequeño hapteno (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionadas anteriormente está conjugado con una variante de polipéptido antihapteno (por ejemplo, anticuerpo anti -digoxina) . Así, puede lograrse la conjugación indirecta de la etiqueta con la variante de polipéptido.

En otra modalidad de la invención, la variante de anticuerpo no necesita estar marcada, y la presencia del mismo puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que sé une a la variante de polipéptido.

La variante de anticuerpo de la presente invención puede utilizarse en cualquier método de ensayo conocido, como los ensayos de unión competitivos, ensayos en sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, (1987) págs . 147-158, CRC Press, Inc..

La variante de anticuerpo puede también utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, la variante de polipéptido está marcada con un radionúclido (como1 li:iIn, "Te, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P O 35S) por lo que el antíígeno o células que lo expresan pueden localizarse utilizando inmunoescintografía . Aunque la invención anterior ,jse ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el propósito de clarificar el entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberán entenderse como limitadores del álcance i de la invención.

Ejemplos Los siguientes siete ejemplos son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden realizarse otras modalidades diferentes, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Aunque la invención precedente se ha descrito .en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el propósito de clarificar el entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberán entenderse como limitadores del alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y literatura científica citada en este documento se incorporan de forma expresa en su totalidad por referencia.

Ejemplo 1 Anticuerpos Para los experimentos descritos más adelante se utilizan los anticuerpos dirigidos contra CD9 (véase SEC ID NO 8-14), P-selectina (secuencial como se describe en WO 2005100402) y CD20 (sinónimo: GA101, secuencial como se describe en PE 1 692 182) . :.

Todas las variantes descritas aquí, por ejemplo, P329G, P329A, P329R SPLE, LALA, P329G/LALA, P329G/SPLE de la selectina, CD9, CD20 (GA101) y anticuerpo de unión CD20 (GA101) -glucomodificado (numeración de acuerdo con la nomenclatura EU) se generaron utilizando mutagénesis basada en PCR. Las moléculas de IgG se expresaron en el sistema HEK-EBNA o HEK293 (variantes Fe CD9) , y se purificaron utilizando la proteína A y la cromatografía por exclusión de tamaño.

Ejemplo 2 Determinación de las afinidades de unión de diferentes receptores de Fcy a las inmunoglobulinas Las afinidades de unión de diferentes FcyR hacia las inmunoglobulinas se midieron mediante Resonancia del plasmón en Superficie (SPR) utilizando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25°C.

El sistema BIAcore® está bien establecido para el estudio de interacciones de moléculas. Permite una monitorización continua a tiempo real de la unión ligando/analito y así la determinación de las tasas de las constantes de asociación (ka) , las tasas de las constantes de disociación (ka) , y constantes de equilibrio (KD) . Los cambios en el índice refractivo indica cambios en la masa sobre la superficie provocada por la interacción de ligando inmovilizado con analito inyectado en solución. Si las moléculas se unen a ligandos inmovilizados en la superficie la masa aumenta, en caso de disociación la masa disminuye.

Para una interacción 1:1 no se percibirá diferencia en los resultados si una molécula de unión se inyecta sobre la superficie o se inmoviliza en una superficie. Por lo tanto se utilizaron diferentes jajuste (con receptor Fcy como ligando o analito respectivamente) , dependiendo de la solubilidad y disponibilidad del ligando o analito correspondiente.

Para FcyRI 10000 unidades de resonancia (RU)j de un sistema de captura que reconoce una secuencia de polihistidina (anticuerpo monoclonal pentaHis, ;Qiagen Hilden, n° de cat . 34660) se inmovilizó para utilizar un equipo de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare y un chip CM5 a pH 4 , 5. El FcyRI se capturó a una concentración de 5 µg/ml con un pulso de 60 segundos a un flujo de 5 µ?/min. Se pasaron diferentes concentraciones de anticuerpo en un rango de 0 a 100 nM con una tasa de flujo de 30 µ?/min a través de células en flujo a 298 K durante 120 segundos para registrar la fase de asociación. La fase de disociación se monitorizó durante hasta 240 segundos y se disparó cambiando la solución de muestra a un amortiguador de reacción. La superficie se regeneró mediante un lavado de 2 min. con una solución de glicina a pH 2 a una tasa de flujo de 30 ml/min. Para todos los experimentos se escogió amortiguador ' HBS-P+ suministrado por GE Healthcare (10 m HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl ," 0,05% (v/v) tensioactivo P20) . Las diferencias de índice refractivo se corrigieron al sustraer la respuesta obtenida de una superficie sin FCYRI capturado. Las inyecciones de control de blancos también se sustrajeron (= doble referencia) .

La constante de equilibrio de disociación (KD) , definida como ka/kd, se determinó analizando las curvas de sensograma obtenidas con varias concentraciones diferentes, utilizando el paquete de programas BIAevaluation. El ajuste de los datos siguió un modelo de unión adecuado.

Para FCYRIIA y FCYRIIIAV158 10000 unidades de resonancia (RU) de un anticuerpo monoclonal a analizar se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de un equipo de acoplamiento de amina suministrado por GE (pH 4,5 a una concentración de 10 ug/ml) .

Diferentes concentraciones de FcyRIIA y IIIA en un rango de 0 a 12800 nM se pasaron con una tasa de flujo de 5 µ?/min a través de las células de flujo a 298 K durante 120 segundos para registrar la fase de asociación. La fase de disociación se monitorizó durante hasta 240 segundos y se disparó cambiando la solución de muestra a un amortiguador de reacción. La superficie se regeneró mediante un lavado de 0,5 min. con una solución de NaOH 3 mM/ NaCl 1M a una tasa de flujo de 30 ml/min. Para todos los experimentos se escogió amortiguador HBS-P+ suministrado por GE Healthcare (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05% (v/v) ) .

Las diferencias del índice refractivo bruto se corrigieron al sustraer la respuesta obtenida de una superficie sin anticuerpo capturado. Las inyecciones de control de blancos también se sustrajeron (= doble referencia) .

La constante de equilibrio de disociación (KD) , se determinó analizando las curvas de sensograma obtenidas con varias concentraciones diferentes, utilizando el paquete de programas BIAevaluation . El ajuste de los datos siguió un modelo de unión adecuado, utilizando un ajuste en estado estacionario. ;: Para FCYRIIB 10000 unidades de resonancia (RU) de un sistema de captura que reconoce una secuencia de polihistidina (anticuerpo monoclonal pentaHis, Qiagen Hilden, n° de cat . 34660) se inmovilizó para utilizar un equipo de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare y un chip CM5 a pH 4,5. El FCYRIIB se capturó a una concentración de 5 ug/ml con un pulso de 120 segundos a un flujo de 5 µ?/min. Se pasaron diferentes anticuerpos a una concentración de 1340 nM; a una tasa de flujo de 5 µ?/min. a través de células en flujo a 298 ¦i K durante 60 segundos para registrar la fase de asociación. La fase de disociación se monitorizó durante hasta 120 segundos y se disparó cambiando la solución de muestra a un amortiguador de reacción. La superficie se regeneró mediante un layado de 0,5 min. con una solución de glicina a pH 2,5 a una üasa de flujo de 30 ml/min. Para todos los experimentos se ^escogió amortiguador HBS-P+ suminitrado por GE Healthcare (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05% (v/v) ) · Las diferencias de índice refractivo bruto se corrigieron al sustraer la respuesta obtenida de una superficie sin FCYRIIB capturado. Las inyecciones de control de blancos también se sustrajeron (= doble referencia) .", Debido a la afinidad intrínseca muy baja de FCYRIIB hacia la IgGl de tipo silvestre no se calculó la afinidad pero se analizó la unión cualitativa.

Las siguientes tablas resumen los efectos de introducir una mutación en la parte Fe en la unión a FcyRI , FcyRIIA, FcyRIIB, y FCYRIIIAV1-58 (A) así como el efecto sobre la CCDA (medida sin (BLT) y con células objetivo (CGDA) ) . y sobre la unión a Clq (B) Tabla 2A: Tabla 2B: fuertemente reducida/inactiva frente al reducida frente al wt, comparable a la interacción del wt, d. no determinado / sin resultados En más detalle, se obtuvieron los siguientes resultados: Afinidad al receptor FCYRI Las mutaciones P329G, P329A, SPLE y LALA se introdujeron en el polipéptido Fe de un anticuerpo P-selectina, CD20 y CD9 , y se determinó la afinidad de unión a FcyRI con el sistema de Biacore. Mientras el anticuerpo con la mutación P329G aún se unía a FcyRI (Fig. la y Ib) , la introducción de mutaciones triples P329G/ LALA y P329G/ SPLE, respectivamente, resultó en anticuerpos de los que apenas se pudo detectar unión (Fig. Ib) . Las mutaciones LALA o SPLE disminuyeron la unión al receptor en mayor medida que sólo la P329G pero en menor medida que en combinación con P329G (Fig. la y Ib) . Por lo tanto, la combinación de P329G con las mutaciones LALA o SPLE es mucho más efectiva que sólo la mutación P329G o la mutación doble LALA y SPLE. El valor de kd del anticuerpo IgGl CD20 de tipo silvestre fue de 4,6 nM y para el mutante P329G del mismo anticuerpo 5,7 nM, pero para el triple mutante P329G/LALA no pudo determinarse un valor de kd debido a la unión prácticamente indetectable del anticuerpo al receptor FcyRI. El anticuerpo en sí mismo, es decir si se analizaba un CD9 o CD20 o P-selectina, mostró un efecto menor en las afinidades de unión.

Afinidad al receptor FcyRIIA Las mutaciones P329G, SPLE y LALA, respectivamente, se introdujeron en el polipéptido Fe del anticuerpo CD9 y se determinó la afinidad de unión con el receptor FCYRIIA-R131 con el sistema de Biacore. El nivel de unión se normalizó como cada mAb capturado representa 100 RU. Por lo tanto, no es esperable que resulten más de aproximadamente 20 RU en una estequiometría 1:1. La Fig. le muestra que la unión al receptor FCYRIIA se redujo fuertemente al introducir las mutaciones LALA, SPLE/P329G, P329G y LALA/P329G en la variante Fe. Al contrario que la unión al receptor FCYRI, la introducción sólo de la mutación P329G es capaz de bloquear muy potentemente la unión al receptor, más o menos en una extensión similar a la de la mutación triple P329G/ LALA (Fig. le) .

Afinidad al receptor FcyRIIB Las mutaciones SPLE, LALA, SPLE/P329G y LALA/P329G, respectivamente, se introdujeron en el polipéptido Fe del anticuerpo CD9 y P-selectina, y se determinó la afinidad de unión al receptor FcyRIIB con el sistema de Biacore. La Fig. id muestra que la unión al receptor FcyRIIB se :' reduce fuertemente en los mutantes LALA y triple P329G/ LALA, P329G/ SPLE.

Afinidad al receptor FCYRIIIA Las mutaciones P329G, LALA, SPLE, P329G/ LALA y SPLE/ P329G se introdujeron en el polipéptido Fe del CD9 y se determinó la afinidad de unión al receptor FCYRIIIA-V158 con el sistema de Biacore. La mutación P329G y la triple mutación P329G/ LALA reducían la unión al receptor FCYRIIÍA más fuertemente, hasta niveles casi indetectables . La P329G/ SPLE también dio lugar a una afinidad de unión fuertemente reducida, y las mutaciones SPLE y LALA, respectivamente, sólo redujeron ligeramente la afinidad de unión al receptor FcyRIIIA (Fig. le) .

Ejemplo 3 I ELISA C1Q Las propiedades de unión de los diferentes polipéptidos que comprenden las variantes Fe a Clq se ¦i analizaron mediante un inmunoensayo ELISA de tipo sándwich.

Cada variante se acopló a una placa de 96 cavidades hidrofóbica Maxisorp a 8 concentraciones entre 10 µg ml y 0 ug/ml. Este acoplamiento simula complejos de anticuerpos, que son un prerrequisito para la unión de alta afinidad de ? la molécula Clq. Tras el lavado, las muestras se incubaron para permitir la unión de Clq. Tras un lavado adicional, la molécula Clq unida se detectó mediante un anticuerpo anti-hClq policlonal de conejo. Tras el siguiente paso de lavado, se añadió un anticuerpo específico anti-Fcy de ¡¡conejo marcado con una enzima. La reacción inmunológica se hizo visible al añadir un sustrato que la enzima convierte en un producto coloreado. La absorbancia resultante, medida fotométricamente, es proporcional a la cantidad de Clq unida al anticuerpo que se está investigando. Se calcularon los valores de CE50 de la interacción variante-Clq. Las unidades de absorción resultantes de la reacción de color se representan frente a la concentración del anticuerpo. La concentración de anticuerpo en la mitad de la respuesta máxima determina el valor de CE50. Esta lectura se proporciona como diferencia relativa al estándar de '¡i referencia determinado en la misma placa junto con el coeficiente de variación de muestras y referencia. | La mutación P329G introducida en el anticuerpo P- ¡t selectina o CD20 fuertemente redujo la unión a Clq, de forma similar a la mutación SPLE (Fig. 2). La Tabla 3 resume los valores de CE50 calculados para la unión de las variantes al receptor Clq. Clq pertenece a las proteínas de activación del complemento y juega un papel principal, en la activación de la vía clásica del complemento, que da< lugar a la formación del complejo de ataque a la membrana. Clq también está involucrada en otros procesos inmunologicos como la potenciación de la fagocitosis, eliminación de células apoptóticas o neutralización de virus. Flor lo tanto, es esperable que los mutantes que aquí se muestra que poseen una unión reducida a Clq, por ejemplo, P329G y SPLE, así como también muy probablemente las ¡triple mutaciones que comprenden las mutaciones sencillas anteriormente mencionadas, reduzcan fuertemente; las funciones anteriormente mencionadas de Clq. ' Tabla 3 : Ejemplo 4 CCDA sin células objetivo, ensayo BLT Los anticuerpos a analizar (CD20 (GA101) y CD9) se utilizaron para recubrir placas de fondo plano adecuadas de 96 cavidades, en PBS durante toda la noche a 4°C. Tras el lavado de la placa con PBS, el resto de puntos de unión se bloquearon con una solución de PBS/ BSA al 1 % durante 1 h a TA. Mientras tanto, las células efectoras (línea celular NK-92 transfectada para expresar un FCYRIII humano de baja o alta afinidad) se recogieron y se sembraron 200.000 células vivas/ cavidad en 100 µ?/ cavidad de medio AIM V en las cavidades tras descartar el amortiguador de bloqueo. Se utilizaron 100 µ?/cavidad de amortiguador de saponina (saponina al 0,5% + BSA al 1% en PBS) para determinar la máxima liberación de esterasa por las células efectoras. Las células se incubaron durante 3 h a 37°C, con C02 al 5% en un incubador. Tras 3 h, se mezclaron 20 µ?/cavidad de los sobrenadantes con 180 µ?/cavidad de sustrato BLT (BLT 0,2 mM + DTNB 0,11 mM en Tris-HCL 0,1 M, pH 8,0) y se incubaron durante 30 min. a 37°C antes de leer la placa a 405 nm en un lector de microplacas. El porcentaje de liberación de esterasas se determinó fijando la liberación máxima (células tratadas con saponina) al 100% y las células no estimuladas (no recubiertas de ab) a la liberación del 0%.

El anticuerpo CD20 de tipo silvestre (GA101 wt (1) ) muestra una fuerte inducción de actividad citolítica. La variante LALA muestra una marcada reducción en la liberación de esterasas, mientras la variante P329G y las variantes P329G/ LALA no muestran ninguna actividad de CCDA (Fig. 3a) . La Fig. 3b muestra que no sólo un intercambio de G en la posición P329 da lugar a una actividad citosólica marcadamente reducida sino también un intercambio de P329 a R329 (anticuerpo CD20) . Por lo tanto, la arginina parece destruir la función del sándwich de prolina en el anticuerpo, similar a la glicina. La CCDA fuertemente reducida que aquí se observa para el mutante P329G sea muy probablemente resultado de la unión fuertemente reducida a los receptores FCYRIIA y FcyRIIIA (véanse las Fig. le y Fig. le) .

Ejemplo 5 CCDA con células objetivo Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) como células efectoras y se prepararon utilizando el Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St . Louis, M063178 USA) y siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. Brevemente, se extrajo sangre venosa de voluntarios con jeringas heparinizadas . La sangre se diluyó 1:0,75-1,3 con PBS (que no contenía Ca++ o g++) y se separó en capas con el Histopaque-1077. El gradiente se centrifugó a 400 x g durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) sin freno. La interfaz que contiene las CMSP se recogió y se lavó con PBS (50 mi para las células de dos gradientes) y se recogieron mediante centrifugación a 300 x g durante 10 minutos a TA. Tras la resuspensión del botón con PBS, se contaron las CMSP y se lavaron una segunda vez mediante centrifugación a 200 x g durante .10 minutos a TA. Las células se resuspendieron entonces en el medio apropiado para los subsiguientes procedimientos. La proporción entre efector y objetivo utilizada para los ensayos de CCDA fue de 25:1 y 10:1 para las células CMSP y NK, respectivamente. Las células efectoras se prepararon en medio AIM-V a la concentración apropiada para añadir 50 mi por cavidad de fondo redondeado en placas de 96 cavidades. Las células objetivo eran células humanas de linfoma B (por ejemplo, células aji) que habían crecido en medio DMEM que contenía un 10% de FCS . Las células objetivo se lavaron en PBS, se contaron y se resuspendieron en AIM-V a 0,3 millones por mi para añadir 30,000 células en 100 mi por microcavidad . Los anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se añadieron en 50 mi de las células objetivo previamente colocadas en placas y se permitió que se unieran a los objetivos durante 10 minutos a TA. Entonces se añadieron las células efectoras y la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía C02 al 5%. La muerte de las células objetivo se valoró mediante una determinación de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) a partir de las células dañadas utilizando el equipo Cytotoxicity Detection kit (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) . Tras la incubación de 4 horas de las placas, éstas se centrifugaron a 800 x g. Se transfirieron 100 mi de sobrenadante de cada cavidad a una nueva placa de 96 cavidades de fondo plano transparente. Se añadieron 100 mi por cavidad de amortiguador de sustrato de color del equipo. Los valores de Vmax de la reacción de color se determinaron en un lector de ELISA a 490 nm durante al menos 10 min. utilizando el programa informático SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). La liberación espontánea de LDH se midió a partir de las cavidades que contenían sólo células objetivo y efectoras pero no anticuerpos. La liberación máxima se determinó a partir de cavidades que contenían sólo células objetivo y Tritón X-100 al 1%. El porcentaje de muerte mediada por el anticuerpo específico se calculó como sigue: ( (x-SR) / (MR - SR)*100, en donde x es la media de Vmax a una concentración de anticuerpo específico, SR es la media de Vmax de la liberación espontánea y MR es la media de Vmax de la liberación máxima.

La potencia para reclutar células efectoras inmunes depende del tipo de variante de Fe como se puede medir mediante el ensayo de CCDA clásico. Aquí, la línea celular NK92 humaría transfectada con FcgRIIIA humano se utilizó como efector y las células Raji positivas para CD20 se utilizaron como células objetivo. Como puede verse en la Fig. 4a, la CCDA. está fuertemente reducida en las variantes de Fe GA101 (CD20) en las que la glicina reemplaza la prolina (P329G) y también, en un grado similar, en el doble imitante P329G/ LALA. Por el contrario, la disminución de la CCDA fue menos fuerte con la mutación LALA. Para poder distinguir mejor entre las diferentes variantes, también se obtuvieron las variantes en una versión glucomodificada para potenciar su potencial de CCDAJ Puede observarse que la molécula parental (GA101 (CD20) ) muestra una fuerte CCDA como era esperable. La versión LALA muestra una gran afectación de su potencial de CCDA. El imitante P329G muestra una muy fuerte reducción de la CCDA, mucho más que una variante P329A del anticuerpo GA101 (CD20) (Fig. 4b) .

Ejemplo 6 : Actividad del complemento Se contaron las células objetivo, se lavaron con PBS, se resuspendieron en AIM-V (Invitrogen) a 1 millón de células por mi. Se sembraron 50 mi de células por cavidad en una placa de 96 cavidades de fondo plano. Se prepararon diluciones de anticuerpo en AIM-V y se añadieron en 50 mi a las células. Se dejó que los anticuerpos se unieran a las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se descongeló complemento de suero humano (Quidel) e inmediatamente se diluyó 3 veces con AIM-V y se añadió en 50 mi a las cavidades. Se preparó complemento de conejo (Cedarlane Laboratories) como describe el fabricante, se diluyó 3 veces con AIM-V y se añadió en 50 mi a las cavidades. Como control, las fuentes de complemento se calentaron durante 30 min. a 56 "C antes de su adición al ensayo. Las placas de ensayo se incubaron durante 2 h a 37°C. La destrucción de las células se determinó mediante la medida de liberación de LDH. Brevemente, las placas se centrifugaron a 300 x g durante 3 min. Se transfirieron 50 mi de sobrenadante por cavidad a una nueva placa de 96 cavidades y se añadieron 50 mi del reactivo de ensayo del equipo Cytotoxicity Kit (Roche) . Una medida cinética con el lector de ELISA determinó la Vmax correspondiente a la concentración de LDH en el sobrenadante. La liberación máxima se determinó mediante la incubación de las células en presencia de Tritón X-100 al 1%.

Se analizó si las diferentes variantes Fe mediaban en la CDC en células objetivo SUDH-L4. La molécula no glucomodificada GA101 mostró una clara inducción de la CDC. La variante LALA mostró actividad sólo a la concentración más elevada, mientras las variantes P329G y P329G/LALA no mostraron ninguna actividad de CDC (Fig. 5a) . Además, la variante LALA así como las variantes P329G y P329A de una molécula GA101 glucomodificada no muestran ninguna actividad de CDC (Fig. 5b) .

Ejemplo 7 Perfil de carbohidratos de la IgGl humana Los perfiles de carbohidratos de los anticuerpos de la IgGl humana que contienen mutaciones dentro de Fe, pretenden evitar la unión a los receptores Fcy, se analizaron mediante MALDI/TOF-MS en modo de ion positivo (oligosacáridos neutros) .

Las variantes de IgGl humanas (h) se trataron con sialidasa (QA-Bio) siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar el ácido siálico terminal. Los oligosacáridos neutros de la hlgGl se liberaron posteriormente mediante la digestión con PNGasa F (QA-Bio) como se ha descrito previamente (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93!, (2006) 851-861) . Los perfiles de carbohidratos se analizaron mediante espectrometría de masas (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH) en modo de ion positivo como se ha descrito previamente (Ferrara, C. et al., Biotech. Bioeng. 93 (2006) 851-861).

Los perfiles de carbohidratos de los glucanos asociados a Fe neutros de la IgGl humana se caracterizan por tres picos m/z principales, que pueden asignarse a oligosacáridos complejos fucosilados sin ningún (G0) , con uno (Gl) o dos (G2) residuos galactosa terminales.

Los perfiles de carbohidratos de la hlgGl que contenían mutaciones en el Fe, que pretenden evitar la unión a los receptores de Fe, se analizaron y compararon con los datos obtenidos para el anticuerpo de tipo silvestre. Las variantes de IgG que contenían una de las mutaciones en el Fe (P329G, LALA, P329A, P329G/LALA) mostró un perfil de carbohidratos similar a la del anticuerpo de tipo silvestre, siendo los glucanos asociados a Fe oligosacáridos complejos fucosilados (los datos no se muestran) . La mutación en el Fe puede afectar al nivel de galactosilación y sialilación terminal, como se ?? ¡1 observo al reemplazar los aminoácidos de las posiciones 241, 243, 263, 265, o 301 por alanina (Lund, J. et al., J. Immunol . 157 (1996) 4963-4969) . ; i La Figura 6a muestra el porcentaje relativo de galactosilación de las diferentes variantes Fe de la, hlgGl aquí descritas. Pueden observarse ligeras variaciones cuando los anticuerpos se expresan en un huésped diferente, pero no pudo observarse ninguna diferencia significativa en la galactosilación terminal.

Ejemplo 8 ;¡ Ensayo de agregación de las plaquetas inducido por un anticuerpo en sangre completa.

Análisis de agregación de las plaquetas en ,< sangre completa utilizando el instrumento multiplaca de Dynabyte. En primer lugar, 20 mi de sangre de donantes humanos normales se extraen y se transfieren a tubos con hiruidina (Dynabyte Medical, # MP0601) . Para el ensayo se utilizó un dispositivo de impedancia en miniceldas (Dynabead #MP0021) conectado al instrumento multiplaca. Luego, se añadieron 175 µ? de aCl al 0,9 % a la minicelda. Se añadió anticuerpo a la minicelda para obtener la concentración de ensayo final. Entonces, se añadieron 175 µ? de sangre humana y se incubaron durante 3 min. a 37°C. Se inició el análisis automatizado de la impedancia durante 6 min. adicionales a 37 °C. Los datos se analizaron mediante cuantificación del área bajo la curva como medida de la agregación de las plaquetas.

Se ha demostrado que el anticuerpo CD9 induce la activación de las plaquetas y la agregación de las plaquetas (Worthington, et al., Br. J. Hematol . 74(2) (1990) 216-222). La agregación de las plaquetas inducida por los anticuerpos de unión a las plaquetas se ha descrito anteriormente que involucra la unión a FcyRIIA (de Reys, et al., Blood 81 (1993) 1792-1800). Como se ha mostrado anteriormente, las mutaciones LALA, P329G, P329G/LALA y P329G/SPLE introducidas en el anticuerpo CD9 reducen fuertemente la unión del anticuerpo CD9 al receptor FcyRIIA (Fig. le) .

La activación (medida por flujo de Ca, datos no mostrados) así como la agregación de las plaquetas inducida por un anticuerpo CD9 se eliminó introduciendo la triple mutación P329G y LALA en el anticuerpo de forma que la unión a FCYRIIA se reduce fuertemente comparado con el anticuerpo silvestre (véanse las Fig. 7a y 7b) . La agregación :de las plaquetas inducida por la IgGl murina a bajas concentraciones de anticuerpo (0,1-1 µ/ml) . A concentraciones mayores la sobreestimulación de las- plaquetas da lugar al silenciamiento de la respuesta de agregación (3-30 ug/ml) . Se variabilidad en los donantes con chim-hu- IgG4 -SPLE . En ¡la Fig. 6a se presentan datos de una respuesta a chim-hu- IgG4¡ SPLE a concentraciones elevadas de anticuerpo, y en la Fig. 6Í> datos de una no respuesta a chim-hu- IgG -SPLE. Ninguna de las muestras de sangre mostró respuesta alguna de agregación con las variantes de anticuerpo chim-hu-IgGl-LALA, chim-hu-IgG-WT-P329G, chim-hu- IgGl -LALA-P329G, chim-hu-IgG4 -SPLE-P329G o chim-hu- IgG4-SPLE-N297Q. Controles: agregación espontánea en muestra de sangre no tratada (fondo) , agregación de plaquetas inducida por ADP (ADP) e inducida por un análogo de trombina (TRAP6 ) . Controles de isotipo: IgGl murina (isotipo murino) e IgG4-SPLE humana (isotipo hu- IgG4 -SPLE) .

Una posible interpretación de estos datos es:;que la disminución de la unión del anticuerpo CD9 con la I! triple mutación al receptor FCYRIIA es la razón de la disminución de la agregación de las plaquetas observada con este tipo de anticuerpos mutantes. En principio, la prevención ;;de la agregación de trombocitos, como efecto tóxico colateral de un tratamiento con anticuerpos, por lo tanto puede realizarse introduciendo las mutaciones anteriormente mencionadas, capaces de reducir la unión al receptor FCYRIIA, en la parte Fe de un anticuerpo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido que comprende una variante de Fe de la región Fe de una IgG humana tipo silvestre, caracterizado porque la variante de Fe comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Pro329 y al menos otra sustitución de aminoácidos, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, y en donde el polipéptido muestra una afinidad reducida por la FCYRIÍIA y/o FCYRIIA y/o FcyRI humana en comparación con un polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre de la IgG, y en donde la CCDA inducida por el polipéptido se reduce hasta al menos un 20% de la CCDA inducida por el polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana tipo silvestre,

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la Pro329 de una región Fe humana de tipo silvestre se sustituye con glicina o arginina o un residuo aminoácido lo suficientemente grande para destruir el sándwich de prolina de la interfaz. del receptor de Fc/Fcy.

3. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque al menos una de las sustituciones adicionales de aminoácidos es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S.

4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque al menos una de las sustituciones adicionales de aminoácidos es L234A y L235A de la región Fe de la IgGl humana o S228P y L235E de la región Fe de la IgG4 humana .

5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la afinidad con al menos un receptor adicional del grupo que comprende los receptores humanos Fcyl , FcylIA y Clq se reduce comparada con la del polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana tipo silvestre.

6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque comprende una región Fe IgGl o IgG4 humana.

7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque es un anticuerpo o una proteína de fusión Fe.

8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la agregación trombocitaria inducida por el polipéptido se reduce comparado con la agregación trombocitaria inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana tipo silvestre.

9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la CDC inducida por el polipéptido se reduce de forma importante comparado con la CDC inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana tipo silvestre.

10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado para usarse como un medicamento .

11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo anti-CD9, en donde el polipéptido que comprende la región Fe de tipo silvestre comprende como región variable de la hebra pesada la SEC ID NO: 9 y como región variable de la hebra ligera la SEC ID NO: 8.

12. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para usarse en el tratamiento de una enfermedad en donde es favorable que una función efectora del polipéptido se reduzca fuertemente comparado con la función efectora inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre.

13. Uso del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, en donde es favorable que la función efectora del polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre se reduzca fuertemente comparado con la función efectora inducida por un polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre. ;\

14. Un método para el tratamiento de un individuo con una enfermedad, caracterizado porque es favorable que la función efectora del polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre se reduzca fuertemente comparado con la función efectora inducida por un polipéptido que comprende un polipéptido de la Fe humana tipo silvestre, que comprende la administración de una cantidad efectiva del polipéptido a un individuo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12^

15. Uso del polipéptido que comprende una variante de Fe de una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, el polipéptido tiene la Pro329 de la región Fe de la IgG humana sustituida por glicina, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, en donde el polipéptido muestra una afinidad reducida por la FCYRIIIA y FCYRIIA humanas, para la regulación negativa de la CCDA hasta al menos un 20% de la CCDA inducida por el polipéptidp que comprende la región Fe de la IgG humana tipo silvestre-, y/o para la regulación negativa de la FCDA. '¦

16. Uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, en donde la variante de Fe comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales en L2.34A y L235A de la región Fe de la IgGl humana o S228P y L235E :de la región Fe de la IgG4 humana .

17. El uso de conformidad con las reivindicaciones 15-16, en donde la agregación trombocitaria inducida por el polipéptido se reduce comparado con la agregación trombocitaria inducida por un polipéptido que comprende una región Fe humana de tipo silvestre, en donde el polipéptido es un anticuerpo activador de las plaquetas.

18. Un método para el tratamiento de un individuo con una enfermedad con un polipéptido, el polipéptido:; tiene la Pro329 de la región Fe de la IgG humana sustituida por Gly, en donde los residuos están numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, en donde el polipéptido se caracteriza por una unión fuertemente reducida al FCYRIIIA y FcyRJIA en comparación con un polipéptido que comprende una región Fe de la IgG humana de tipo silvestre, caracterizado porque comprende la administración a un individuo de una cantidad efectiva del polipéptido.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos dos sustituciones adicionales de aminoácidos en L234A y L235A de la región Fe de IgGl humana o S228P y L235E de la región Fe de IgG4 humana.