ES2907054T3

ES2907054T3 - TriFab-Contorsbody

Info

Publication number: ES2907054T3
Application number: ES18800534T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Brinkmann; Steffen Dickopf; Guy Georges; Irmgard Thorey
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2022-04-21
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: US20210122832A1; EP3704146A1; TWI814749B; JP2021500931A; PL3704146T3; CA3079129A1; WO2019086395A1; BR112020008031A2; MX2020004196A; US20240158533A1; CN111278856A; TW201927818A; KR102559706B1; AU2018358904A1; CA3079129C; KR20200069367A; JP7092881B2; EP3704146B1; IL274118A; AU2022201960A1

Abstract

Un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno y que consiste en dos polipéptidos de fusión circulares, en el que a) el primer polipéptido de fusión circular comprende una primera parte de un primer dominio de unión, una segunda parte de un primer dominio de unión y una primera parte de un tercer dominio de unión, en el que - la primera parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un primer conector peptídico al extremo N de la primera parte del tercer dominio de unión, - la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un segundo conector peptídico al extremo C de la primera parte del tercer dominio de unión, - la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH1-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL1-CL1), con lo que la segunda parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa, y - la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se asocian entre sí y son conjuntamente el primer sitio de unión a antígeno, b) el segundo polipéptido de fusión circular comprende una primera parte de un segundo dominio de unión, una segunda parte de un segundo dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión, en el que - la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un tercer conector peptídico al extremo N de la segunda parte del tercer dominio de unión, - la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un cuarto conector peptídico al extremo C de la segunda parte del tercer dominio de unión, - la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH2-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL2-CL1), con lo que la segunda parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa, - la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se asocian entre sí y son conjuntamente el segundo sitio de unión a antígeno, c) la primera parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión son conjuntamente el tercer sitio de unión a antígeno, en el que - la primera parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 (VH3-CH3) o bien un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3 (VL3-CH3), - la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 si la primera parte del segundo dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3, o viceversa, - la primera parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión se asocian entre sí y forman el tercer sitio de unión a antígeno, en el que los dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3) se alteran para promover la heterodimerización por i) generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3, o sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente, o ii) introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3, o iv) ambas modificaciones de i) y ii), en el que el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2) y de una región bisagra.

Description

DESCRIPCIÓN

T riFab-Contorsbody

La presente invención pertenece al campo de moléculas de unión a diana. En el presente documento se informa de un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno con lo que la molécula es altamente compacta y de peso molecular relativamente bajo.

Antecedentes de la invención

Desde el desarrollo de los primeros anticuerpos monoclonales por Koehler y Milstein en 1974, se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de anticuerpos que sean apropiados para el tratamiento en seres humanos. Los primeros anticuerpos monoclonales que estuvieron disponibles se habían desarrollado en ratones y ratas. Estos anticuerpos, cuando se usaron para tratamiento de un ser humano, provocaron efectos secundarios no deseados debido a los anticuerpos antiroedor. Se han dedicado muchos esfuerzos a la reducción o incluso la eliminación de dichos efectos secundarios no deseados.

En los últimos años, ha llegado al mercado un número cada vez mayor de anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales humanizados. Los ejemplos bien conocidos incluyen, por ejemplo, Herceptin® y MabThera® de Hoffmann-La Roche, Basilea.

Además, se han desarrollado nuevos formatos de anticuerpo derivados del formato de anticuerpo en forma de Y tetracatenario natural. Estos formatos son principalmente formatos bi- y multiespecíficos. Para una revisión, véase, por ejemplo, Kontermann, R., mAbs 4 (2012) 182-197.

En el documento US 2009/0175867 se informa de proteínas de unión multivalentes monocatenarias con función efectora.

En el documento WO 2014/131711 se informa de anticuerpos biespecíficos en los que el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de una región bisagra de inmunoglobulina.

En el documento EP 15176083 se informa de un formato de anticuerpo novedoso que tiene peso molecular reducido en comparación con un anticuerpo de longitud completa y del uso del mismo.

El documento WO 2007/048022 divulga proteínas de fusión anticuerpo-polipéptido y procedimientos para producir y usar las mismas.

El documento WO 2007/146968 divulga proteínas de unión multivalentes monocatenarias con función efectora.

El documento EP 1378520 divulga un anticuerpo triespecífico monocatenario cíclico.

El documento WO 2016/087416 divulga un anticuerpo multiespecífico que comprende al menos tres sitios de unión a antígeno, en el que dos sitios de unión a antígeno se forman por un primer resto de unión a antígeno y un segundo resto de unión a antígeno y el tercer sitio de unión a antígeno se forma por un dominio variable de la cadena pesada (VH3) y un dominio variable de la cadena ligera (VL3).

Klaus Meyer et al., International Jounal of Molecular Sciences, vol. 16, n.°12, (2015-11-17), pp. 27497-27507; divulga TriFab (derivados de anticuerpos biespecíficos con forma de IgG trivalentes).

Sumario de la invención

En el presente documento se informa de una nueva proteína fijadora diana. Esta nueva proteína fijadora diana es un polipéptido bicircular bi- o triespecífico trivalente, en el que cada uno de los polipéptidos circulares comprende tres dímeros dominio variable-dominio constante (V-C). Con más detalle, en el primer polipéptido, el dímero N terminal, V1a-C1a, comprende una primera parte de un primer sitio de unión, el dímero central, V2a-C2a, comprende una primera parte de un segundo sitio de unión, y el dímero C terminal, V1b-C1b, comprende la segunda parte del primer sitio de unión, V1a-C1a y V1b-C1b. El segundo polipéptido comprende como dímero central la segunda parte del segundo sitio de unión, V2b-C2b, y como dímeros N y C terminales la primera y la segunda parte de un tercer sitio de unión. Las respectivas primera y segunda partes del primer, segundo y tercer sitios de unión se asocian entre sí para formar de un primer a tercer sitios de unión completos o funcionales. Por la asociación de la primera y segunda parte del primer y tercer sitio de unión, se circulariza cada uno del primer y segundo polipéptido. Cada una de las asociaciones puede ser independientemente entre sí de forma no covalente o bien covalente. En caso de que la asociación sea covalentemente, no es por un enlace peptídico, sino, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

La invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno, en el que a) el primer sitio de unión a antígeno se forma por un primer polipéptido de fusión circular, que comprende una primera parte de un primer dominio de unión, una segunda parte de un primer dominio de unión y una primera parte de un tercer dominio de unión, en el que

- la primera parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un primer conector peptídico al extremo N de la primera parte del tercer dominio de unión, y

- la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un segundo conector peptídico al extremo C de la primera parte del tercer dominio de unión, y

- la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH1-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL1-CL), con lo que la segunda parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa, y

- la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se asocian entre sí y forman el primer sitio de unión a antígeno,

b) el segundo sitio de unión a antígeno se forma por un segundo polipéptido de fusión circular, que comprende una primera parte de un segundo dominio de unión, una segunda parte de un segundo dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión, en el que

- la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un tercer conector peptídico al extremo N de la segunda parte del tercer dominio de unión, y

- la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un cuarto conector peptídico al extremo C de la segunda parte del tercer dominio de unión, y

- la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH2-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL2-CL), con lo que la segunda parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa (con lo que la primera parte del segundo sitio de unión se selecciona independientemente de la primera parte del primer sitio de unión), y

- la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se asocian entre sí y forman el segundo sitio de unión a antígeno,

c) el tercer sitio de unión a antígeno se forma por la primera parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión, en el que

- la primera parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-conector-CH3 (VH3-L-CH3) o bien un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligeraconector-CH3 (VL3-L-CH3), y

- la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 si la primera parte del tercer dominio de unión en el primer polipéptido de fusión circular es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3, o viceversa, y

- la primera parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión se asocian entre sí y forman el tercer sitio de unión a antígeno,

en el que los dos dominios constantes de la cadena pesada 3 (CH3) se alteran para promover la heterodimerización por

i) generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3, o

sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente, y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente, o

ii) introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3, o

iii) ambas modificaciones de i) y ii), en el que el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2) y una región bisagra.

En un modo de realización, el primer y segundo polipéptido de fusión circular comprende cada uno exactamente una parte de un dominio de unión N terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión a antígeno y exactamente una, pero diferente, parte del dominio de unión C terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión.

En un modo de realización, la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión en el primer polipéptido de fusión circular se asocian covalentemente entre sí y/o la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión en el segundo polipéptido de fusión circular se asocian covalentemente entre sí. En un modo de realización, la asociación covalente es por un enlace distinto de un enlace peptídico. En un modo de realización preferente, la asociación covalente es por un enlace disulfuro.

En un modo de realización

i) el extremo C del dominio CH1 de la primera parte del primer o segundo sitio de unión se conjuga con el extremo N de la parte del tercer dominio de unión, y el extremo N del dominio VL de la segunda parte del primer o segundo sitio de unión se conjuga con el extremo C del tercer dominio de unión, o

ii) el extremo C del dominio VH de la primera parte del primer o segundo sitio de unión se conjuga con el extremo N de la parte del tercer dominio de unión, y el extremo N del dominio CL de la segunda parte del primer o segundo sitio de unión se conjuga con el extremo C del tercer dominio de unión.

En un modo de realización, el primer y/o el segundo y/o el tercer sitio de unión a antígeno se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína independientemente entre sí en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100,

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43, o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización, la primera parte del primer o el segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada de anticuerpo (VH+CH1) y la segunda parte del primer o el segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera de anticuerpo (VL+CL) o viceversa.

En un modo de realización, el polipéptido de fusión de anticuerpo multiespecífico ejerce una función efectora. En un modo de realización, la función efectora es ADCC o/y CDC.

En un modo de realización, la primera parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo C de la parte del tercer dominio de enlace, con lo que el primer y el segundo conector peptídico se seleccionan independientemente entre sí.

En un modo de realización, la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo C de la parte del tercer dominio de enlace, con lo que el primer y el segundo conector peptídico se seleccionan independientemente entre sí.

En un modo de realización preferente, la primera parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de SEQ ID NO: 38 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 al extremo C de la parte del tercer dominio de unión, y la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de ^sE^qID NO: 38 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 al extremo C de la parte del tercer dominio de unión.

En un modo de realización, el tercer sitio de unión se une específicamente a CD3 humano o CD4 humano o CD28 humano.

En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno comprende

un primer polipéptido de fusión circular, que comprende en dirección N a C terminal un fragmento Fab de la cadena pesada (VH-CH1) como primera parte del primer dominio de unión, un conector de SEQ ID NO: 38, un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 como primera parte del tercer dominio de unión, en el que el dominio CH3 comprende la mutación T366W (opcionalmente otra mutación S354C o Y349C), un conector de SEQ ID NO: 16 y un fragmento Fab de la cadena ligera (VL-CL) como segunda parte del primer dominio de unión,

y

un segundo polipéptido de fusión circular, que comprende en dirección N a C terminal un fragmento Fab de la cadena ligera (VL-CL) como primera parte del segundo dominio de unión, un conector de SEQ ID NO: 38, un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3 como segunda parte del tercer dominio de unión, en el que el dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (opcionalmente además la mutación Y349C o S354C), un conector de SEQ ID NO: 16 y un fragmento Fab de la cadena pesada (VH-CH1) como segunda parte del segundo dominio de unión,

(numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat)

y

el tercer sitio de unión se une específicamente a CD3, CD4 o CD28 humano.

En un modo de realización, cada polipéptido de fusión (monocatenario) (circular) comprende en dirección N a C terminal antes de la parte del tercer dominio de unión (es decir, N terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión) exactamente un dominio variable de anticuerpo y después de la parte del tercer dominio de unión (es decir, C terminal con respecto a la parte del tercer dominio) exactamente un dominio variable de anticuerpo.

En un modo de realización, la diana es un antígeno de superficie celular o el ligando soluble de un receptor de superficie celular.

En un modo de realización, el dominio de unión es un Fab, un DAF o un Fab biespecífico.

En un modo de realización, el primer y/o el segundo dominio de unión es un Fab (convencional), en el que la primera parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) primer dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo (CH1) y la respectiva otra parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL), o viceversa. En un modo de realización, la primera parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VH-CH1 y la segunda parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VL-CL, o viceversa.

En un modo de realización, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W, y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización, un dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende una mutación T366W (mutación de botón; lado de botón), y el otro dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (mutaciones de ojal; lado de ojal) (numeraciones de acuerdo con al índice EU de Kabat).

En un modo de realización, un dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones S354C y T366W (mutación botón-cys; lado de botón-cys), y el otro dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V (mutaciones ojal-cys; lado de ojal-cys) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende tres sitios de unión a antígeno, en el que a) el primer sitio de unión a antígeno se forma por un primer dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH1) y un primer par de dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL1) (par VH1/VL1) de un primer polipéptido de fusión circular, en el que

- el VH1 es parte de un primer fragmento Fab de la cadena pesada (VH1-CH1) y el VL1 es parte de un primer fragmento Fab de la cadena ligera (VL1-CL),

- el VH1-CH1 se conjuga por medio de un primer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un primer polipéptido de fusión dominio variable-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-L-CH3) y el VL1-CL se conjuga por medio de un segundo conector peptídico con el respectivo otro extremo del primer V3-L-CH3,

- el VH1-CH1 y el VL1-CL se asocian entre sí y forman el par VH1/VL1,

b) el segundo sitio de unión a antígeno se forma por un segundo dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH2) y un segundo par de dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL2) (par VH2/VL2) de un segundo polipéptido de fusión circular, en el que

- el VH2 es parte de un segundo fragmento Fab de la cadena pesada (VH2-CH1) y el VL2 es parte de un segundo fragmento Fab de la cadena ligera (VL2-CL),

- el VH2-CH1 se conjuga por medio de un tercer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un segundo polipéptido de fusión dominio variable-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-L-CH3) y el VL2-CL se conjuga por medio de un cuarto conector peptídico con el respectivo otro extremo del segundo V3-L-CH3,

- el VH2-CH1 y el VL2-CL se asocian entre sí y forman el par VH2/VL2,

c) el tercer sitio de unión a antígeno se forma por el primer V3-L-CH3 y el segundo V3-L-CH3 , en el que - el primer V3-L-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (VH3-L-CH3) o bien un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (VL3-L-CH3),

- el segundo V3-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-conector-dominio constante de anticuerpo 3 si el primer V3-L-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-conector-dominio constante de anticuerpo 3 o viceversa,

- el VH3-L-CH3 y el VL3-L-CH3 se asocian entre sí y forman el par VH3/VL3,

en el que los dos dominios constantes de anticuerpo 3 (CH3) se alteran para promover la heterodimerización introduciendo la mutación T366W y opcionalmente la mutación S354C en uno de los CH3 y las mutaciones T366S, L368A e Y407V y opcionalmente la mutación Y349C en el respectivo otro CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat),

en el que el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios constantes de anticuerpo 2 (CH2) y una región bisagra.

En un modo de realización, el conector en la primera y/o segunda parte del tercer dominio de unión está ausente (es decir, la primera parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-dominio constante de anticuerpo 3 y la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-dominio constante de anticuerpo 3, o viceversa). En un modo de realización, el primer y el segundo sitio de unión se unen específicamente a la misma o a una diana diferente y el tercer sitio de unión se une específicamente a una diana diferente de la diana del primer y el segundo sitio de unión.

Un aspecto como se informa en el presente documento es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento y un agente citotóxico.

Un aspecto como se informa en el presente documento es una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto como se informa en el presente documento es el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento para su uso como medicamento.

Un aspecto, como se informa en el presente documento, es el uso del anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento en la fabricación de un medicamento.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Los módulos de dimerización de botones en ojales y su uso en la genomanipulación de anticuerpos se describen en Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, volumen 2, número 1, febrero 1996, pp. 73-73(1).

La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660 de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios de la cadena pesada constantes (CH1, bisagra, CH2 y CH3), lo que se aclara además en el presente documento refiriéndose a la "numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat" en este caso). Los procedimientos y técnicas útiles para llevar a cabo la presente invención se describen en, por ejemplo, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I a III (1997); Glover, N.D., y Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, 2.a edición, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, 2.a edición, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, segunda edición, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987).

El uso de tecnología de ADN recombinante permite la generación de derivados de un ácido nucleico. Dichos derivados se pueden modificar, por ejemplo, en posiciones nucleotídicas individuales o varias por sustitución, alteración, intercambio, deleción o inserción. La modificación o derivatización se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida a sitio. Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo fácilmente por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., y Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra).

Cabe destacar que como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc. Además, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento. También se debe destacar que los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" se pueden usar de manera intercambiable.

El término "aproximadamente" indica un intervalo de un /- 20 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 10 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 5 % del siguiente valor numérico posterior.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.

El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" es una función mediada por la unión al receptor de Fc y se refiere a la lisis de células diana mediada por una región Fc de anticuerpo en presencia de células efectoras. La ADCC se mide en un modo de realización por el tratamiento de una preparación de células eritroides que expresan la diana (por ejemplo, células K562 que expresan la diana recombinante) con un polipéptido de fusión multicircular que comprende una región Fc como se informa en el presente documento en presencia de células efectoras tales como PBMC recién aisladas (células mononucleares de sangre periférica) o células efectoras purificadas de capas leucoplaquetarias, como monocitos o linfocitos NK (linfocitos citolíticos naturales). Las células diana se marcan con Cr-51 y posteriormente se incuban con el polipéptido de fusión multicircular. Las células marcadas se incuban con células efectoras y el sobrenadante se analiza para determinar Cr-51 liberado. Los controles incluyen la incubación de las células endoteliales diana con células efectoras pero sin el polipéptido de fusión multicircular. La capacidad del polipéptido de fusión multicircular para inducir las etapas iniciales que median en ADCC se investiga midiendo la unión a células que expresan receptores F^cy, tales como células, que expresan recombinantemente F^cyRI y/o FcyRIIA o linfocitos NK (que expresan esencialmente FcyRIIIA). En un modo de realización preferente, se mide la unión a FcyR en linfocitos NK.

El término "unión a" indica la unión de un sitio de unión a su diana, tal como por ejemplo, un sitio de unión de anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (par VH/VL) al respectivo antígeno. Esta unión se puede determinar usando, por ejemplo, un ensayo BIAcore® (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).

Por ejemplo, en un posible modo de realización del ensayo BIAcore®, el antígeno se une a una superficie y la unión del sitio de unión de anticuerpo se mide por resonancia de plasmón superficial (SPR). La afinidad de la unión se define por los términos ka (constante de asociación: constante de velocidad para que la asociación forme un complejo), kd (constante de disociación; constante de velocidad para la disociación del complejo) y KD (kd/ka). De forma alternativa, la señal de unión de un sensograma SPR se puede comparar directamente con la señal de respuesta de una referencia, con respecto a la altura de señal de resonancia y los comportamientos de disociación.

El término "BiFab" indica una molécula que comprende dos pares de V1-C1/V2-C2 en la que V indica un dominio variable de anticuerpo y C indica un dominio constante de anticuerpo, que se asocian entre sí. Por ejemplo, los pares pueden ser VH1-CH1/VL1-CL y VH2-CH31/VL2-CH32. Asimismo, el término "TriFab" indica una molécula que comprende tres pares de V1-C1/V2-C2 en la que V indica un dominio variable de anticuerpo y C indica un dominio constante de anticuerpo, que se asocian entre sí. Por ejemplo, los pares pueden ser VH1-CH1/VL1-CL, VH2-CH1/VL2-CL y VHa-CH31/VLa-CH32.

El término "dominio CH1" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente de la posición EU 118 a la posición EU 215 (sistema de numeración EU). En un modo de realización, un dominio CH1 comprende la secuencia de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLY SLSSW T VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (SE Q ID NO: 01).

El término "dominio CH2" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente de la posición EU 231 a la posición EU 340 (sistema de numeración EU de acuerdo con Kabat). En un modo de realización, un dominio CH2 comprende la secuencia de aminoácidos de APELLGGPSV FLFPPKPKDT LM ISRTPEV T CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 02). El dominio CH2 es único porque no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una región Fc natural intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio c H2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.

El término "dominio CH3" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente de la posición EU 341 a la posición EU 446. En un modo de realización, el dominio CH3 comprende la secuencia de aminoácidos de GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 03).

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32, Pb-212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

El término "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a la lisis de células inducida por la región Fc de un anticuerpo como se informa en el presente documento en presencia del complemento. La CDC se mide en un modo de realización por el tratamiento de células endoteliales humanas que expresan la diana con un polipéptido de fusión multicircular como se informa en el presente documento en presencia del complemento. En un modo de realización las células se marcan con calceína. Se encuentra CDC si el polipéptido de fusión multicircular induce la lisis de un 20 % o más de las células diana a una concentración de 30 |jg/ml. La unión al factor del complemento C1q se puede medir en un ELISA. En un ensayo de este tipo, en principio se recubre una placa ELISA con intervalos de concentración del polipéptido de fusión multicircular, al que se añade C1q humano purificado o suero humano. La unión de C1q se detecta con un anticuerpo dirigido contra C1q seguido de un conjugado marcado con peroxidasa. La detección de la unión (unión máxima Bmáx) se mide como densidad óptica a 405 nm (DO405) para sustrato de peroxidasa ABTS® (2,2'-acino-di-[3-etilbenctiazolina-6-sulfonato]).

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase de anticuerpo de la que se deriva. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Las funciones efectoras dependientes de la unión al receptor de Fc pueden estar mediadas por la interacción de la región Fc de un anticuerpo con receptores de Fc (FcR), que son receptores especializados de la superficie celular en células hematopoyéticas. Los receptores de Fc pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y se ha demostrado que median tanto en la retirada de patógenos recubiertos de anticuerpo por fagocitosis de complejos inmunitarios, como en la lisis de eritrocitos y diversas otras dianas celulares (por ejemplo, células tumorales) que presentan la región Fc, por medio de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, por ejemplo, Van de Winkel, J.G. y Anderson, C.F., J. Feukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Los FcR se definen por su especificidad por los isotipos de inmunoglobulinas: Los receptores de Fc para regiones Fc de tipo IgG se denominan F^cyR. La unión al receptor de Fc se describe, por ejemplo, en Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Fab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.

La reticulación de receptores para la región Fc de anticuerpos de tipo IgG (F^cyR) desencadena una amplia variedad de funciones efectoras incluyendo fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y liberación de mediadores inflamatorios, así como aclaramiento de complejos inmunitarios y regulación de producción de anticuerpos. En seres humanos se han caracterizado tres clases de F^cyR, que son:

- F^cyRI (CD64) se une a IgG monomérica con alta afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. La modificación en la región Fc de IgG al menos en uno de los residuos aminoacídicos E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) reduce la unión a FcyRI. Los residuos de IgG2 en las posiciones 233-236, sustituidos en IgG1 e IgG4, redujeron la unión a FcyRI 103 veces y eliminaron la respuesta de monocitos humanos a glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

- F^cyRII (CD32) se une a IgG en forma de complejo con una afinidad media a baja y se expresa ampliamente. Este receptor se puede dividir en dos subtipos, FcyRIIA y FcyRIIB. FcyRIIA se encuentra en muchas células implicadas en la destrucción (por ejemplo, macrófagos, monocitos, neutrófilos) y parece que puede activar el proceso de destrucción. FcyRIIB parece desempeñar un papel en procesos inhibidores y se encuentra en linfocitos B, macrófagos y en mastocitos y eosinófilos. En linfocitos B parece funcionar inhibiendo la producción de inmunoglobulina adicional y el cambio de isotipo a, por ejemplo, la clase IgE. En macrófagos, FcyRIIB actúa para inhibir la fagocitosis mediada a través de FcyRIIA. En eosinófilos y mastocitos, la forma B puede ayudar a inhibir la activación de estas células a través de la unión de IgE a su propio receptor. Se encuentra una unión reducida a FcyRIIA, por ejemplo, para los anticuerpos que comprenden una región Fc de IgG con mutaciones al menos en uno de los residuos aminoacídicos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

- FcyRIII (CD16) se une a IgG con afinidad media a baja y existe como dos tipos. FcyRIIIA se encuentra en linfocitos NK, macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y linfocitos T y media en la ADCC. FcyRIIIB se expresa altamente en neutrófilos. Se encuentra una unión reducida a F^cyRIIIA, por ejemplo, para los anticuerpos que comprenden una región Fc de IgG con mutación al menos en uno de los residuos aminoacídicos E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 y D376 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

La cartografía de los sitios de unión en IgG1 humana para receptores de Fc, los sitios de mutación mencionados anteriormente y los procedimientos para medir la unión a FcyRI y FcyRIIA se describen en Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "epítopo" se refiere a esa parte de una diana dada que se requiere para la unión específica entre la diana y un sitio de unión. Un epítopo puede ser continuo, es decir, formado por elementos estructurales adyacentes presentes en la diana, o discontinuo, es decir, formado por elementos estructurales que están en diferentes posiciones en la secuencia primaria de la diana, tal como en la secuencia de aminoácidos de una proteína como diana, pero en estrecha proximidad en la estructura tridimensional, que la diana adopta en un entorno natural, tal como en un líquido corporal.

El término "receptor de Fc" como se usa en el presente documento se refiere a receptores de activación caracterizados por la presencia de una secuencia ITAM citoplásmica asociada con el receptor (véase, por ejemplo, Ravetch, J.V. y Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). Dichos receptores son F^cyRI, F^cyRIIA y F^cyRIIIA. El término "sin unión de F^cyR" indica que, a una concentración de anticuerpo de 10 |jg/ml, la unión de un anticuerpo como se informa en el presente documento a linfocitos NK es de un 10 % o menos de la unión hallada para el anticuerpo anti-OX40L LC.001 como se informa en el documento WO 2006/029879.

Mientras que IgG4 muestra una reducción en la unión a FcR, los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida de carbohidrato de Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que proporcionan si se alteran también reducción en la unión a FcR (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; y el documento EP 0307434).

El término "región bisagra" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que une en una cadena pesada de anticuerpo natural el dominio CH1 y el dominio CH2, por ejemplo, de aproximadamente la posición 216 a aproximadamente la posición 230 de acuerdo con el sistema de numeración EU de Kabat, o de aproximadamente la posición 226 a aproximadamente la posición 230 de acuerdo con el sistema de numeración EU de Kabat. Las regiones bisagra de otras subclases de IgG se pueden determinar alineando con la región bisagra residuos de cisteína de la secuencia de subclase de IgG1. La región bisagra es normalmente una molécula dimérica que consiste en dos polipéptidos con secuencia aminoacídica idéntica. La región bisagra en general comprende aproximadamente 25 residuos aminoacídicos y es flexible permitiendo que los sitios de unión diana asociados se muevan independientemente. La región bisagra se puede subdividir en tres dominios: el dominio bisagra superior, el medio y el inferior (véase, por ejemplo, Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento conjugado con una o más moléculas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

El término "cadena pesada" indica las cadenas polipeptídicas más largas de anticuerpos IgG naturales que comprenden (en dirección N a C terminal) un dominio variable de la cadena pesada (VH), dominio constante de anticuerpo 1 (CH1), una región bisagra, dominio constante de anticuerpo 2 (CH2) y dominio constante de anticuerpo 3 (CH3). La "clase" de un anticuerpo o una región Fc se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por las cadenas pesadas o fragmentos de las mismas. Existen cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, ^yy |J, respectivamente.

El término "cadena ligera" indica las cadenas polipeptídicas más cortas de anticuerpos IgG naturales que comprenden (en dirección N a C terminal) un dominio variable de la cadena ligera (VL) y un dominio constante de la cadena ligera (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (^k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante, véase SEQ ID NO: 04 para un dominio constante de la cadena ligera kappa humana y SEQ ID NO: 05 para un dominio constante de la cadena ligera lambda humana.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "anticuerpo multiespecífico no marcado" se refiere a un anticuerpo multiespecífico que no se conjuga con un resto (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo multiespecífico no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), con lo que entre el primer y el segundo dominio constante se localiza una región bisagra. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (^k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

El término "parátopo" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo dada que se requiere para la unión específica entre una diana y un sitio de unión. Un parátopo puede ser continuo, es decir, formado por residuos aminoacídicos adyacentes presentes en el sitio de unión, o discontinuo, es decir, formado por residuos aminoacídicos que están en diferentes posiciones en la secuencia primaria de los residuos aminoacídicos, tal como en la secuencia de aminoácidos de las CDR de los residuos aminoacídicos, pero en estrecha proximidad en la estructura tridimensional, que el sitio de unión adopta.

El término "conector peptídico" indica un conector de origen natural y/o sintético. Un conector peptídico consiste en una cadena lineal de aminoácidos en la que los 20 aminoácidos naturales son los bloques constitutivos monoméricos que se conectan por enlaces peptídicos. La cadena tiene una longitud de 1 a 50 residuos aminoacídicos, preferente entre 1 y 28 residuos aminoacídicos, especialmente preferente entre 3 y 25 residuos aminoacídicos. El conector peptídico puede contener secuencias de aminoácidos repetitivas o secuencias de polipéptidos naturales. El conector peptídico tiene la función de garantizar que los dominios de un polipéptido de fusión circular puedan realizar su actividad biológica permitiendo que los dominios se plieguen correctamente y estén presentes apropiadamente. Preferentemente, el conector peptídico es un "conector peptídico sintético" que se designa por ser rico en residuos de glicina, glutamina y/o serina. Estos residuos se disponen, por ejemplo, en unidades repetitivas pequeñas de hasta cinco aminoácidos, tales como GGGS (SEQ ID NO: 06), GGGGS (SEQ ID NO: 07), QQQG (SEQ ID NO: 08), QQQQG (SEQ ID NO: 09), SSSG (SEQ ID NO: 10) o SSSSG (SEQ ID NO: 11). Esta unidad repetitiva pequeña se puede repetir de dos para formar a cinco veces para formar una unidad multimérica, tal como, por ejemplo, (GGGS)2 (SEQ ID NO: 12), (GGGS)3 (SEQ ID NO: 13), (GGGS)4 (SEQ ID NO: 14), (GGGS)5 (SEQ ID NO: 15), (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 16), (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 17), (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 18), (GGGGS)4GG (SEQ ID NO: 19), GG(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 20) y (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 21). En los extremos amino y/o carboxiterminales de la unidad multimérica se pueden añadir hasta seis aminoácidos naturales arbitrarios adicionales. Otros conectores peptídicos sintéticos están compuestos por un único aminoácido, que se repite entre 10 y 20 veces y pueden comprender en el extremo amino y/o carboxiterminal hasta seis aminoácidos naturales arbitrarios adicionales, tales como por ejemplo serina en el conector GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 22). Todos los conectores peptídicos se pueden codificar por una molécula de ácido nucleico y por lo tanto se pueden expresar recombinantemente. Como los conectores son en sí mismos péptidos, el péptido antifusogénico se conecta al conector por medio de un enlace peptídico que se forma entre dos aminoácidos.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (véase, por ejemplo, Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, se pueden aislar anticuerpos que se unen a un antígeno particular usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (véanse, por ejemplo, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880 887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

La invención se ejemplifica a continuación usando polipéptidos de diferente estructura y especificidad. Estos se presentan solo para ejemplificar la invención. Esto no se debe interpretar como una limitación. El verdadero alcance se expone en las reivindicaciones.

II. El anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento

En el presente documento se informa de un anticuerpo multiespecífico que comprende dos polipéptidos de fusión circulares, comprendiendo cada uno de ellos un par VH/V^ly, de este modo, un primer y un segundo sitio de unión, con lo que un tercer par VH/VL y de este modo un tercer sitio de unión se forma por el asociado de los dos polipéptidos de fusión circulares.

La invención se basa al menos en parte en el hallazgo de que la fusión del dominio variable de la cadena ligera al extremo C de una cadena pesada (de longitud completa), o del dominio variable de la cadena pesada a una cadena ligera de longitud completa, da como resultado la formación de un sitio de unión funcional que comprende los respectivos dominios VH y VL (par VH/VL) del mismo polipéptido, es decir, el par del dominio variable de la cadena ligera y el dominio variable de la cadena pesada dentro de una única cadena polipeptídica forman un par VH/VL funcional y de este modo un sitio de unión funcional por circularización intracatenaria. En este polipéptido circular, la porción N terminal comprende una primera parte de un dominio de unión y la porción C terminal comprende una segunda parte de un dominio de unión. La primera parte del dominio de unión y la segunda parte del dominio de unión (asociadas entre sí) forman un sitio de unión completo o funcional. De ese modo, el polipéptido se circulariza.

La invención se basa al menos en parte en el hallazgo de que se puede proporcionar un anticuerpo multiespecífico que comprende dos polipéptidos de fusión circulares, en el que cada uno de los polipéptidos de fusión circulares comprende un sitio de unión funcional formado por un par VH/VL, otro sitio de unión se forma por la asociación de los dos polipéptidos de fusión circulares.

La invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que es posible, modificando la longitud de los conectores peptídicos que conectan los dominios variables de anticuerpo individuales a los respectivos extremos N y C de un polipéptido de fusión de una parte del tercer dominio de unión y un dominio de heterodimerización, ajustar la geometría/distancia de los dos sitios de unión formados por los polipéptidos de fusión circulares en el anticuerpo multiespecífico resultante.

La invención se basa al menos en parte en el hallazgo de que la geometría de unión de un polipéptido de fusión dimérico, es decir, dicircular, se puede cambiar dependiendo de las longitudes del primer/tercer conector peptídico y del segundo/cuarto conector peptídico (es decir, proporción de longitud del conector). De este modo es posible fijar la geometría de los dos brazos de unión de tipo Fab entre sí.

En el presente documento se divulga un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno, en el que

a) el primer sitio de unión a antígeno se forma por un primer polipéptido de fusión circular, que comprende una primera parte de un primer dominio de unión, una segunda parte de un primer dominio de unión y una primera parte de un tercer dominio de unión, en el que

- la primera parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un primer conector peptídico al extremo N de la primera parte del tercer dominio de unión,

- la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un segundo conector peptídico al extremo C de la primera parte del tercer dominio de unión,

- la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH1-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL1-CL), con lo que la segunda parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa,

- la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un tercer conector peptídico al extremo N de la segunda parte del tercer dominio de unión,

- la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un cuarto conector peptídico al extremo C de la segunda parte del tercer dominio de unión,

- la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH2-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL2-CL), con lo que la segunda parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa,

- la primera parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 (VH3-CH3) o bien un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3 (VL3-CH3),

- la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 si la primera parte del segundo dominio de unión en el primer polipéptido de fusión circular es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3, o viceversa,

iii) ambas modificaciones de i) y ii),

en el que el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2) y una región bisagra.

- el VHi-CH1 se conjuga por medio de un primer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un primer polipéptido de fusión dominio variable-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-L-CH3) y el VL1-CL se conjuga por medio de un segundo conector peptídico con el respectivo otro extremo del primer V3-CH3,

- el VH1-CH1 y el VL1-CL se asocian entre sí y forman el par VH1/VL1,

- el VH2-CH1 se conjuga por medio de un tercer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un segundo polipéptido de fusión dominio variable-conector-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-L-CH3) y el VL2-CL se conjuga por medio de un cuarto conector peptídico con el respectivo otro extremo del segundo V3-CH3,

- el VH2-CH1 y el VL2-CL se asocian entre sí y forman el par VH2/VL2,

- el segundo V3-L-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-conector-dominio constante de anticuerpo 3 si el primer V3-L-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-conector-dominio constante de anticuerpo 3 o viceversa,

- el VH3-L-CH3 y el VL3-L-CH3 se asocian entre sí y forman el par VH3/VL3,

La primera parte del primer y/o segundo dominio de unión y la respectiva segunda parte del mismo se pueden asociar de forma no covalente o covalente entre sí. Si la asociación es de forma covalente es por un enlace distinto de un enlace peptídico, tal como, por ejemplo, un enlace disulfuro.

Los polipéptidos de fusión circulares contenidos en el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento son cada uno polipéptidos monocatenarios. La estructura general de un polipéptido de fusión circular aislado se muestra en la figura 1.

El anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento se basa en un polipéptido de fusión circular dimérico que comprende un primer polipéptido de fusión circular y un segundo polipéptido de fusión circular, es decir, es dicircular, en el que el primer y el segundo polipéptido de fusión circular son idénticos o diferentes.

Los polipéptidos de fusión circulares del anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento comprenden además de las partes fusionadas en el extremo N y C de los respectivos dominios de unión una región central que comprende una parte del tercer sitio de unión así como un dominio de heterodimerización. En este caso, la propiedad estructural de la región central es la provisión de una funcionalidad de dimerización. El dominio de heterodimerización del primer polipéptido de fusión circular se puede conjugar con el dominio de heterodimerización del segundo polipéptido de fusión circular por al menos un enlace no peptídico, en un modo de realización por al menos un enlace disulfuro.

Los polipéptidos de fusión dicirculares básicos en el presente documento también se denominan Contorsbody. La estructura general del polipéptido de fusión dicircular/Contorsbody se muestra en la figura 2.

En comparación con anticuerpos IgG normales, Contorsbody usa solo una cadena y no una cadena pesada y una ligera para proporcionar un sitio de unión (par VH/VL). La particularidad del anticuerpo multiespecífico basado en Contorsbody como se informa en el presente documento es que se forma un tercer sitio de unión (par VH/VL) por la dimerización de dos polipéptidos de fusión circulares y este tercer sitio de unión/parte del dominio de unión se localiza entre el fragmento Fab de la cadena pesada y el fragmento Fab de la cadena ligera.

El polipéptido de fusión circular dimérico sin tercer sitio de unión se usa a continuación para mostrar las propiedades específicas del polipéptido de fusión dicircular que forma la base del anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento. Además de los fragmentos Fab, también se podrían usar dominios variables aislados como partes de un sitio de unión.

En este ejemplo, los polipéptidos de fusión monocatenarios con un dominio "bisagra-CH2-CH3" como dominio de dimerización entre el fragmento Fab de la cadena pesada y el fragmento Fab de la cadena ligera se dimerizan por medio de sus regiones Fc, en los que los dos Fab se fijan en su orientación entre sí. Por el contrario, en un anticuerpo de tipo IgG normal, los dos Fab son más flexibles y se orientan de manera muy diferente.

La geometría de los dos sitios de unión entre sí se puede modular en un Contorsbody por la longitud de los conectores empleados. La orientación y distancia espacial entre los sitios de unión de un anticuerpo normal del tipo IgG y un polipéptido de fusión dicircular que forma la base del anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento se muestran en la figura 3.

La distancia espacial entre los sitios de unión de un anticuerpo convencional del tipo IgG es de aproximadamente 80 A (angstrom) o más. La distancia espacial entre los sitios de unión de un polipéptido de fusión dicircular como se informa en el presente documento puede ser de entre aproximadamente 20 A y aproximadamente 50 A dependiendo de la longitud y proporción de longitud del conector peptídico en los polipéptidos de fusión circulares individuales que forman el polipéptido de fusión dicircular. Dependiendo de la geometría deseada, se selecciona el conector peptídico. En un modo de realización, el primero a cuarto conector peptídico se selecciona independientemente entre sí del grupo de conector peptídico que consiste en SEQ ID NO: 06 a SEQ ID NO: 22.

II. 1. Anticuerpos bivalentes monoespecíficos comparativos formados a partir de polipéptidos de fusión dicirculares

Un polipéptido de fusión dicircular monoespecífico comprende dos polipéptidos de fusión circulares en los que cada uno de los polipéptidos de fusión circulares se une específicamente al mismo epítopo en la misma diana, es decir, comprende el mismo sitio de unión.

Un polipéptido de fusión dicircular monoespecífico ejemplar es un Contorsbody anti-Her2 (que comprende el polipéptido de fusión circular de SEQ ID NO: 23). Se produjo transfectando células HEK293 con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión circular.

Se ha descubierto que una cromatografía de afinidad de proteína A convencional es adecuada para extraer la parte que contiene la región Fc del sobrenadante de cultivo. De forma alternativa, se puede usar una marca C terminal de hexahistidina (SEQ ID NO: 24) conectada por medio de un conector peptídico GSG con propósitos de purificación.

Se usó cromatografía de exclusión por tamaño preparativa en la segunda etapa de purificación para separar el polipéptido de fusión circular de impurezas relacionadas con el producto, en su mayoría estructuras de orden superior del polipéptido de fusión circular (también se observa una pequeña porción de agregados en el cromatograma como también para un anticuerpo del tipo IgG) (véase, por ejemplo, la figura 4). El rendimiento típico de dichas construcciones es de un promedio de 10 mg/litro. Contorsbody anti-Her2 se ha expresado en varios lotes (escala de matraces de agitación de 0,5 litros a 2 litros). Se ha analizado la calidad del producto por espectrometría de masas (véase la figura 5). Se confirmó la identidad del producto con un grado de pureza por encima de un 95 %.

La unión del Contorsbody anti-Her2 se ha determinado usando resonancia de plasmón superficial (SPR, por ejemplo, BIAcore) en dos configuraciones diferentes para evaluar la afinidad y la avidez de las moléculas en comparación con un anticuerpo anti-Her2 convencional del tipo IgG.

En la primera configuración (1 en la siguiente tabla; para afinidad), se capturó el respectivo Contorsbody anti-Her2 por un anticuerpo anti región Fc humana conjugado a la superficie del chip SPR. Como analito se usó el dominio extracelular Her2 (ECD). En la segunda configuración (2 en la siguiente tabla; para avidez), se inmovilizó el anticuerpo anti-Her2 pertuzumab (comercializado como Perjeta®) en la superficie del chip y de ese modo se capturó el ECD de Her2. Como analito se usó el respectivo Contorsbody. Se midió la avidez del anticuerpo de referencia de tipo IgG trastuzumab, el Contorsbody anti-Her2 bivalente usando series de concentraciones del analito. Como referencia en ambas configuraciones, se ha usado el anticuerpo anti-Her2 trastuzumab (comercializado como Herceptin®).

Contorsbody es mucho más compacto en comparación con un anticuerpo convencional del tipo IgG.

Se han sometido a prueba Contorsbodies anti-Her2 en un ensayo de proliferación. De forma similar, a Scheer et al. (Scheer et al., PLoS One 7 (2012) e51817) que usaron Fab de trastuzumab químicamente reticulados, los Contorsbodies anti-Her2 incluyeron receptores en la superficie celular y promovieron una señal de activación. Trastuzumab, una proteína fijadora para un epítopo de Her2 localizado en el dominio del tallo del receptor, mantiene a los receptores lejos entre sí y, en consecuencia, antagoniza la proliferación. Trastuzumab y Contorsbody anti-Her2 dicircular, respectivamente, son antiproliferativo y proproliferativo. Se ha determinado la capacidad de Contorsbodies anti-Her2 para unirse al receptor FcRn. En comparación con trastuzumab, un anticuerpo del tipo IgG, subclase IgG1, la unión de Contorsbodies anti-Her2 al receptor FcRn humano es sorprendentemente mayor, es decir, alrededor de 10 veces para el Contorsbody bicircular. Contra FcRn de macaco cangrejero, trastuzumab y los Contorsbodies se comportan de forma similar, siendo el Contorsbody dimérico 4,5 veces más afín que trastuzumab.

Usando autofluorescencia de triptófano, la primera temperatura de desnaturalización térmica Tf1 es de aprox.

63 °C para Contorsbody. Usando dispersión de luz estática, se determinó una temperatura de inicio de agregación de aprox. 66 °C para Contorsbody. Usando dispersión de luz dinámica, se determinó una temperatura de inicio de agregación de aprox. 66 °C para Contorsbody. En todos los experimentos, la formulación fue de 1 mg/ml de Contorsbody en His/His*HCl 20 mM, NaCl 140 mM.

Se podría confirmar por espectrometría de masas que no se forman Fab mixtos.

Otros ejemplos de Contorsbodies dicirculares monoespecíficos son Contorsbody anti-cMET (polipéptido de fusión circular de SEQ ID NO: 25) y Contorsbodies anti-CD20 con diferentes dominios variables ((1) polipéptido de fusión circular de SEQ ID NO: 26; (2) polipéptido de fusión circular de SEQ ID NO: 27). En la siguiente tabla se dan la tasa de expresión, el rendimiento y la calidad de estos Contorsbodies.

Todos los Contorsbodies se han expresado de forma transitoria en células HEK-293 con rendimientos que varían de 2 a 15 mg/l. El producto después de la columna de proteína A está por encima de un 85 % y se purifica a partir de productos secundarios por cromatografía en columna SEC hasta una pureza por encima de un 96 % en general.

11.2. Anticuerpos bivalentes biespecíficos comparativos formados a partir de polipéptidos de fusión dicirculares

Un polipéptido de fusión multicircular biespecífico comprende dos polipéptidos de fusión circulares en los que cada uno de los polipéptidos de fusión circulares se une específicamente a una diana diferente y/o a un epítopo diferente en la misma diana, es decir, comprende al menos dos sitios de unión de diferente especificidad.

Sin quedar vinculado a esta teoría, se postula que el autoensamblaje de los correspondientes dominios de los sitios de unión en el polipéptido monocatenario prevalece en la asociación intercatenaria, es decir, en otras palabras, después de la expresión de un único polipéptido de fusión circular los dominios no funcionales individuales del sitio de unión se asocian y forman un sitio de unión funcional. Por ejemplo, si el sitio de unión funcional es un Fab, las porciones Fab, es decir, el fragmento de la cadena pesada (VH-CH1) y el fragmento de la cadena ligera (VL-CL), forman un resto Fab competente de unión constitutivo y el semianticuerpo huérfano de este primer polipéptido de fusión circular ensamblado se asocia consecutivamente con otro polipéptido de fusión circular para formar un polipéptido de fusión bicircular (Contorsbody que comprende un dímero de dos polipéptidos de fusión circulares individuales). Para obtener un polipéptido de fusión multicircular multiespecífico, se debe promover la heterodimerización de los polipéptidos de fusión circulares aislados. Un elemento promotor de heterodimerización ejemplar son las mutaciones de acuerdo con la tecnología de botón en ojal.

Es posible modificar la longitud del conector peptídico para variar la geometría/distancia de los dos sitios de unión del Contorsbody biespecífico resultante; lo mismo también es cierto para Contorsbodies monoespecíficos.

Es posible modificar la geometría/distancia de los sitios de unión cambiando la(s) posición/posiciones relativa(s) del/de los sitio(s) de unión entre sí.

Por ejemplo, en el caso de un Fab como sitio de unión, la secuencia de los dominios del fragmento Fab de la cadena pesada y el fragmento Fab de la cadena ligera se pueden invertir, es decir, por ejemplo, el fragmento Fab de la cadena pesada puede tener la secuencia del dominio VH-CH1, o CH1-VH (de extremo N a C), respectivamente, y asimismo el fragmento Fab de la cadena ligera puede tener la secuencia de dominio VL-CL o CL-VL (de extremo N a C) o mixto. Suponiendo que un conector está presente antes y después del polipéptido de fusión central de la parte del tercer sitio de unión y el dominio central, es decir, antes y después del polipéptido de fusión de la parte del tercer sitio de unión y el dominio constante de anticuerpo 3, el fragmento Fab está limitado en sus orientaciones con respecto al dominio central. En consecuencia, la posición relativa del dominio VH está cerca de la región Fc, denominada aquí "VH-in", o bien más lejos de la región Fc, denominada aquí "VH-out" (véanse las figuras 6 y 7).

También es posible modificar el comportamiento de ensamblaje usando la tecnología CrossMab, es decir, un intercambio de dominio en un brazo. Esto se puede combinar además con variantes de carga en el brazo intercambiado o no intercambiado. Las cadenas ejemplares de polipéptidos de fusión circulares anti-cMET con la respectiva orientación usada para la producción de polipéptidos de fusión bicirculares biespecíficos se muestran en la figura 8 (VH-out, VH-in, y las respectivas tasa de expresión, rendimiento y calidad de estas diferentes combinaciones catenarias se dan en la siguiente tabla.

_________

VH-out-botón = SEQ ID NO: 28,

VH-in-botón = SEQ ID NO: 29,

VH-out-ojal = SEQ ID NO: 30,

VH-out-ojal-CH-CL-cruzado = SEQ ID NO: 31,

VH-in-ojal-VH-VL-cruzado = SEQ ID NO: 32.

Las técnicas en general aplicables para preparar anticuerpos biespecíficos convencionales también se pueden usar y adoptar para preparar polipéptidos de fusión dicirculares biespecíficos.

Por ejemplo, las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véanse Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829 y Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) y genomanipulación "botón en ojal" (véase, por ejemplo, documento US5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993) 6444 6448); y usando dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69.

En general, cada vez que se requiere una restricción geométrica para fijar la orientación de dos sitios de unión, se puede usar un Contorsbody.

II3. Anticuerpos trivalentes bi- y triespecíficos formados a partir de polipéptidos de fusión dicirculares de acuerdo con la presente invención

El diseño y composición de un anticuerpo multiespecífico ejemplar de acuerdo con la presente invención se muestra en la figura 9. Un anticuerpo de este tipo que comprende tres sitios de unión se puede designar como TriFab-Contorsbody.

En la parte inferior de la figura 9 se puede ver que los sitios de unión están dispuestos en posición opuesta en un TriFab-Contorsbody. Por tanto, un TriFab-Contorsbody es una molécula compacta con flexibilidad definida y limitada. Tiene una geometría muy especial y definida. Tras unirse a sus antígenos, conecta dos antígenos (células que presentan dichos antígenos) como un imán con polos.

Un TriFab-Contorsbody ejemplar es un anticuerpo anti-LeY/biotina. Comprende dos polipéptidos de fusión circulares, de los que el primero tiene la secuencia de dominios como sigue:

VH - CH1 anticuerpo anti-LeY - conector peptídico 1 - VL anticuerpo antibiotina - conector - CH3 con mutación en botón - conector peptídico 2 - VL - CL (kappa) anticuerpo anti-LeY

La respectiva secuencia de aminoácidos se enumera en SEQ ID NO: 34.

El segundo polipéptido de fusión circular tiene la secuencia de dominios como sigue:

VH - CH1 anticuerpo anti-LeY - conector peptídico 1 - VL anticuerpo antibiotina - conector - CH3 con mutación en ojal - conector peptídico 2 - VL - C^l(kappa) anticuerpo anti-LeY

La respectiva secuencia de aminoácidos se enumera en SEQ ID NO: 35.

La molécula se expresó y purificó de forma similar al procedimiento descrito en los ejemplos.

La figura 10 muestra la SEC y la SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo purificado KappaSelect.

La identidad de la molécula se confirmó por EM como se muestra en la figura 11 en los datos de la siguiente tabla:

La funcionalidad de la molécula se confirmó por análisis FACS demostrando biespecificidad del TriFab-Contorsbody LeY-Bio. TriFab-Contorsbody se une a la superficie celular por medio de su especificidad de unión anti-LeY. Por la captura del conjugado biotina-Cy5 fluorescente por medio de su sitio de unión antibiotina, el TriFab-Contorsbody unido a la célula se vuelve detectable en el análisis FACS, es decir, las señales Cy5 asociadas a la célula indican la funcionalidad simultánea de ambos sitios de unión, es decir, de los sitios de unión localizados en los polipéptidos de fusión circulares individuales así como el sitio de unión formado por la dimerización de los dos polipéptidos de fusión circulares. Los datos de FACS se muestran en la figura 12.

La invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno y que consiste en dos polipéptidos de fusión circulares, en el que

a) el primer polipéptido de fusión circular comprende una primera parte de un primer dominio de unión, una segunda parte de un primer dominio de unión y una primera parte de un tercer dominio de unión, en el que - la primera parte del primer dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un primer conector peptídico al extremo N de la primera parte del tercer dominio de unión,

- la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se asocian entre sí y son conjuntamente el primer sitio de unión a antígeno,

b) el segundo polipéptido de fusión circular comprende una primera parte de un segundo dominio de unión, una segunda parte de un segundo dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión, en el que - la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona directamente o bien por medio de un tercer conector peptídico al extremo N de la segunda parte del tercer dominio de unión,

- la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se asocian entre sí y son conjuntamente el segundo sitio de unión a antígeno,

c) la primera parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del tercer dominio de unión son conjuntamente el tercer sitio de unión a antígeno, en el que

iii) ambas modificaciones de i) y ii),

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer y segundo polipéptido de fusión circular comprende cada uno exactamente una parte de un dominio de unión N terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión a antígeno y exactamente una, pero diferente, parte del dominio de unión C terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión.

En un modo de realización de todos los aspectos, la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión en el primer polipéptido de fusión circular se asocian covalentemente entre sí y/o la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión en el segundo polipéptido de fusión circular se asocian covalentemente entre sí. En un modo de realización, la asociación covalente es por un enlace distinto de un enlace peptídico. En un modo de realización preferente, la asociación covalente es por un enlace disulfuro.

En un modo de realización de todos los aspectos

En un modo de realización de todos los aspectos, el tercer sitio de unión a antígeno se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína independientemente entre sí en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100,

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43, o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización de todos los aspectos, la primera parte del primer o el segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada de anticuerpo (VH+CH1) y la segunda parte del primer o el segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera de anticuerpo (VL+CL) o viceversa. En un modo de realización de todos los aspectos, el polipéptido de fusión de anticuerpo multiespecífico ejerce una función efectora. En un modo de realización, la función efectora es ADCC o/y CDC.

En un modo de realización de todos los aspectos, la primera parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo C de la parte del tercer dominio de enlace, con lo que el primer y el segundo conector peptídico se seleccionan independientemente entre sí.

En un modo de realización de todos los aspectos, la primera parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un primer conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo N de la parte del tercer dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se fusiona por medio de un segundo conector peptídico de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 17 al extremo C de la parte del tercer dominio de enlace, con lo que el primer y el segundo conector peptídico se seleccionan independientemente entre sí. En un modo de realización de todos los aspectos, cada polipéptido de fusión (monocatenario) (circular) comprende en dirección N a C terminal antes de la parte del tercer dominio de unión (es decir, N terminal con respecto a la parte del tercer dominio de unión) exactamente un dominio variable de anticuerpo y después de la parte del tercer dominio de unión (es decir, C terminal con respecto a la parte del tercer dominio) exactamente un dominio variable de anticuerpo.

En un modo de realización de todos los aspectos, la diana es un antígeno de superficie celular o el ligando soluble de un receptor de superficie celular.

En un modo de realización de todos los aspectos, el dominio de unión es un Fab, un DAF o un Fab biespecífico.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer y/o el segundo dominio de unión es un Fab (convencional), en el que la primera parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) primer dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo (CH1) y la respectiva otra parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL), o viceversa. En un modo de realización, la primera parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VH-CH1 y la segunda parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VL-CL, o viceversa.

En un modo de realización de todos los aspectos, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización de todos los aspectos, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de todos los aspectos, el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W, y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de todos los aspectos, un dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende una mutación T366W (mutación de botón; lado de botón), y el otro dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (mutaciones de ojal; lado de ojal) (numeraciones de acuerdo con al índice EU de Kabat).

En un modo de realización de todos los aspectos, un dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones S354C y T366W (mutación botón-cys; lado de botón-cys), y el otro dominio CH3 del tercer sitio de unión comprende las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407^v(mutaciones ojal-cys; lado de ojal-cys) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno, en el que

a) el primer sitio de unión a antígeno se forma por un primer dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH1) y un primer par de dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL1) (par VH1/VL1) de un primer polipéptido de fusión circular, en el que

- el VH1-CH1 se conjuga por medio de un primer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un primer polipéptido de fusión dominio variable-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-CH3) y el VL1-CL se conjuga por medio de un segundo conector peptídico con el respectivo otro extremo del primer V3-CH3 , - el VH1-CH1 y el VL1-CL se asocian entre sí y forman el par VH1/VL1,

- el VH2-CH1 se conjuga por medio de un tercer conector peptídico con el extremo N o bien el extremo C de un segundo polipéptido de fusión dominio variable-dominio constante de anticuerpo 3 (V3-CH3) y el VL2-CL se conjuga por medio de un cuarto conector peptídico con el respectivo otro extremo del segundo V3-CH3 , - el VH2-CH1 y el VL2-CL se asocian entre sí y forman el par VH2/VL2,

c) el tercer sitio de unión a antígeno se forma por el primer V3-CH3 y el segundo V3-CH3, en el que - el primer V3-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-constante de anticuerpo 3 (VH3-CH3) o bien un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-constante de anticuerpo 3 (VL3-CH3),

- el segundo V3-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-constante de anticuerpo 3 si el primer V3-CH3 es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligeraconstante de anticuerpo 3 o viceversa,

- el VH3-CH3 y el VL3-CH3 se asocian entre sí y forman el par VH3/VL3,

En un modo de realización, el conector en la primera y/o segunda parte del tercer dominio de unión está ausente (es decir, la primera parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-dominio constante de anticuerpo 3 y la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-dominio constante de anticuerpo 3, o viceversa). En un modo de realización, el conector L es un conector peptídico. En un modo de realización, el conector L tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.

Todos los otros modos de realización enumerados no mencionados anteriormente también pertenecen a este aspecto.

Un aspecto como se informa en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico que comprende (al menos) tres pares VH/VL de unión a antígeno,

con lo que el anticuerpo multiespecífico comprende/consiste en

a) un primer polipéptido de fusión circular que comprende en dirección N a C terminal

i) un primer dominio variable de la cadena pesada (VH1),

ii) un dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo 1 (CH1),

iii) un primer conector peptídico,

iv) un segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2),

v) un primer dominio CH3 (CH31),

vi) un segundo conector peptídico,

vii) un primer dominio variable de la cadena ligera (VL1), y

viii) un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL),

en el que los dominios identificados en i) y vii) se asocian entre sí y son un primer par VH/VL que se une específicamente a un primer antígeno,

y

b) un segundo polipéptido de fusión circular que comprende en dirección N a C terminal

i) un tercer dominio variable de la cadena pesada (VH3),

ii) un dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo 1 (CH1),

iii) un tercer conector peptídico,

iv) un segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2),

v) un segundo dominio CH3 (CH32),

vi) un cuarto conector peptídico,

vii) un tercer dominio variable de la cadena ligera (VL3), y

viii) un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL),

en el que los dominios identificados en i) y vii) se asocian entre sí y son un segundo par VH/VL que se une específicamente a un segundo antígeno,

en el que los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en el primer dominio CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, y generación de un cavidad en el segundo dominio CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3,

en el que los dominios identificados en a) v) y b) v) se conjugan entre sí por enlaces disulfuro (para formar un dímero del primer polipéptido de fusión circular y el segundo polipéptido de fusión),

y

en el que los dominios identificados en a) iv) y b) iv) se asocian entre sí y son un tercer par VH/VL que se une específicamente a un tercer antígeno.

En un modo de realización, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo antígeno y el tercer antígeno es un antígeno diferente de estos.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer y el segundo sitio de unión se unen específicamente al mismo (primer) antígeno y el tercer sitio de unión se une específicamente a un diferente (segundo) antígeno.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer sitio de unión se une específicamente a un primer antígeno, el segundo sitio de unión se une específicamente a un segundo antígeno y el tercer sitio de unión se une específicamente a un tercer antígeno, con lo que el primer, el segundo y el tercer antígeno son diferentes antígenos.

111. Sitios de unión

III.I. Sitios de unión derivados de fragmentos de anticuerpo

En determinados modos de realización, los sitios de unión en el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento están compuestos cada uno de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL).

En determinados modos de realización, uno o dos de los sitios de unión del anticuerpo multiespecífico son un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH y Fv. Para un análisis de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; véanse también los documentos WO 93/16185; US 5.571.894 y US 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo véase el documento US 5.869.046.

El fragmento de anticuerpo también puede ser un "Fab de doble acción" o "DAF" (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

Si el sitio de unión es un Fab, entonces el Fab puede ser un Fab convencional, un DAF o un Fab biespecífico. En el caso de un Fab convencional, una parte de un dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) primer dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo (CH1) y la respectiva otra parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL). El orden de estos dominios puede ser cualquiera siempre que la asociación de los mismos y la formación de un sitio de unión (funcional) sea posible (es decir, que no se evite).

En un modo de realización, una parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VH-CH1 y la otra parte del dominio de unión comprende en dirección N a C terminal VL-CL.

En el caso de un Fab biespecífico, una parte del dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) primer dominio constante de la cadena pesada de anticuerpo (CH1) y el respectivo otro dominio de unión comprende un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y al menos un fragmento N terminal de un (o un completo) dominio constante de la cadena ligera de anticuerpo (CL), en el que en el presente documento dicho dominio de unión comprende dos parátopos no superpuestos en el par complementario de un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que el primer parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VL y CDR2 del dominio VH, y el segundo parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VH y CDR2 del dominio VL.

En un modo de realización, el primer parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VL y CDR2 del dominio VH, y el segundo parátopo comprende residuos de CDR1 y CDR3 del dominio VH y ^cDR2 del dominio VL.

En un modo de realización, el dominio variable de la cadena pesada del sitio de unión se basa en una secuencia de la cadena pesada de la familia VH3 humana y el dominio variable de la cadena ligera del sitio de unión se basa en una secuencia de la cadena ligera de la familia Vkappa1 humana.

En un modo de realización, el dominio variable de la cadena pesada del sitio de unión se basa en una secuencia de la cadena pesada de la familia VH3 humana y el dominio variable de la cadena ligera del sitio de unión se basa en una secuencia de la cadena ligera de la familia Vlambda1 humana.

111.2. Sitios de unión derivados de anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, uno o dos o tres de los sitios de unión en el anticuerpo multiespecífico son dominios quiméricos derivados de un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, ^fR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que comprenden los tramos de residuos aminoacídicos que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3).

Las HVR incluyen

(a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(b) las CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), publicación NIH 91-3242.);

(c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos aminoacídicos 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra. En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. En algunos modos de realización, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y refiere a residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; los documentos US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 y US 7.087.409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describen el injerto en la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).

111.3. Sitios de unión derivados de anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, el uno o dos o tres sitio(s) de unión en el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento está(n) compuesto(s) de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL). En determinados modos de realización, los dominios variables son de un anticuerpo humano.

Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 y en Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Véanse también, por ejemplo, los documentos US 6.075.181 y US 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; el documento US 5.770.429 que describe la tecnología H^uM^ab®; el documento US 7.041.870 que describe la tecnología KM MOUSE®; el documento US 2007/0061900, que describe la tecnología V^elociM^ouse® ; el documento WO 2007/131676 que describe un ratón inmunoreconstituido). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano y mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véanse, por ejemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), págs. 51-63; y Boemer, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en el documento US 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 y Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

IM.4. Sitios de unión de anticuerpos derivados de colecciones

En determinados modos de realización, uno o dos o tres del sitio de unión en el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento está(n) compuesto(s) de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL). En determinados modos de realización, los dominios variables se aíslan cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas.

Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 y se describen además, por ejemplo, en McCafferty, J., et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan sitios de unión de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol.

227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: los documentos US 5.750.373 y US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 y US 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

IV. Dominios de heteromulti(di)merización

Para asegurar la asociación correcta de los dos polipéptidos de fusión circulares para formar el anticuerpo multiespecífico como se informa en el presente documento se pueden usar diferentes tecnologías. Una de ellas es la denominada genomanipulación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, el documento US 5.731.168). Los polipéptidos de fusión multicirculares también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más polipéptidos de fusión circulares (véanse, por ejemplo, el documento US 4.676.980 y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir polipéptidos de fusión bicirculares (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547 1553).

El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). Dentro de un anticuerpo de acuerdo con la invención, un dominio CH3 respectivo está dispuesto en el extremo C del dominio VH3 y VL3 del tercer sitio de unión. Los "dominios CH3" en el presente documento son dominios CH3 variantes, en los que la secuencia de aminoácidos del dominio CH3 natural se sometió a al menos una sustitución aminoacídica distinta (es decir, modificación de la secuencia de aminoácidos del dominio CH3) para promover la dimerización de los dos dominios CH3 enfrentados entre sí dentro del anticuerpo multiespecífico.

Se han descrito diversos enfoques para modificaciones de CH3 para soportar la heterodimerización, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

Típicamente, en los enfoques de heterodimerización conocidos en la técnica, el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado ya no se puede homodimerizar con otra cadena pesada de la misma estructura. De este modo, la cadena pesada que comprende un dominio CH3 genomanipulado se fuerza a heterodimerizarse con la otra cadena pesada que comprende el dominio CH3, que se genomanipula de manera complementaria.

Un enfoque de heterodimerización conocido en la técnica es el denominado tecnología de "botones en ojales", que se describe en detalle proporcionando varios ejemplos, por ejemplo, en el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; y documento WO 98/ 050431. En la tecnología de "botones en ojales", dentro de la interfase formada entre dos dominios CH3 en la estructura terciaria del anticuerpo, se genomanipulan aminoácidos particulares en cada dominio CH3 para producir una protuberancia ("botón") en uno de los dominios CH3 y una cavidad ("ojal") en el otro de los dominios CH3, respectivamente. En la estructura terciaria del anticuerpo multiespecífico, la protuberancia introducida en un dominio CH3 es posicionable en la cavidad introducida en el otro dominio CH3.

En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se alteran de acuerdo con la tecnología de botones en ojales. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH)" (en el que la abreviatura "KiH" quiere decir "tecnología de botón en ojal"). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original; y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención que comprende un primer polipéptido que comprende un dominio constante de anticuerpo 3 y un segundo polipéptido que comprende un dominio constante de anticuerpo 3, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido forman una interfaz que se localiza entre los respectivos dominios CH3, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase, en el que la protuberancia se localiza en el dominio CH3 de un polipéptido, y en el que la protuberancia es posicionable en una cavidad localizada en el dominio CH3 del otro polipéptido dentro de la interfase; y

- en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase, en el que la cavidad se localiza en el dominio CH3 del otro polipéptido, y en el que en la cavidad la protuberancia dentro de la interfase localizada en el dominio CH3 del polipéptido es posicionable.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, uno de los dominios CH3 comprende una mutación T366W, y el respectivo otro dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, uno de los dominios CH3 comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el respectivo otro dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, uno de los dominios CH3 comprende las mutaciones T366W, R409D y K370E, y el respectivo otro dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V, D399K y E357K (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

De forma alternativa a o en combinación con las modificaciones de acuerdo con la tecnología de botones en ojales como se define anteriormente, los dominios CH3 del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se alteran para promover la heterodimerización basada en otros enfoques de heterodimerización conocidos en la técnica, preferentemente los descritos en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 y WO 2013/096291.

En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, de forma alternativa a o en combinación con las modificaciones de acuerdo con la tecnología de botones en ojales, los dominios CH3 se alteran por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 (por ejemplo, como se describe en el documento EP 1870459). El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)" (en el que la abreviatura "+/-" representa los aminoácidos con carga opuesta que se introdujeron en los respectivos dominios CH3). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente; y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención que comprende un primer polipéptido y un segunda polipéptido, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido forman una interfase que se localiza entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, un primer aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado positivamente y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido, un segundo aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado negativamente.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H; y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K y R; y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, el aminoácido cargado positivamente es K; y el aminoácido cargado negativamente es E. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) de acuerdo con la invención, en uno de los dominios CH3 el aminoácido R en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D y el aminoácido K en la posición 370 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E; y en el respectivo otro dominio CH3, el aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido E en la posición 357 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K.

En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S)" (en el que la abreviatura "S-S" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por introducción de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido forman una interfase que se localiza entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de un polipéptido y el dominio CH3 del otro polipéptido por medio de los residuos de cisteína introducidos.

En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización del anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización preferente del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro y se alteran de acuerdo con la tecnología de botones en ojales. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS)" (en el que la abreviatura "K" representa la tecnología de botones en ojales y "SS" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización, dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS), los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización por generación de una protuberancia en uno de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original; y generación de una cavidad en el otro de los dominios CH3 sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, de modo que la protuberancia generada en uno de los dominios CH3 es posicionable en la cavidad generada en el otro de los dominios CH3; y una introducción adicional de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido forman una interfaz que se localiza entre los respectivos dominios CH3 de anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido al menos un residuo aminoacídico se sustituye con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase, en el que la cavidad se localiza en el dominio CH3 del otro polipéptido, y en el que en la cavidad la protuberancia dentro de la interfase localizada en el dominio CH3 del polipéptido es posicionable; y en el que - del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de un polipéptido y el dominio CH3 del otro polipéptido por medio de los residuos de cisteína introducidos.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, la mutación E356C o S354C se introduce en el dominio CH3 de la cadena con "botón" y las mutaciones Y349C se introducen en el dominio CH3 de la cadena con "ojal".

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V.

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V, y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende una mutación T366W y el dominio CH3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio CH3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención, el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, R409D y K370E, y el dominio CH3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366s , L368A, Y407V, D399K y E357K (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización preferente del anticuerpo multiespecífico, los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro y se alteran por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización también se denomina en el presente documento "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS)" (en el que la abreviatura representa los aminoácidos con carga opuesta y "SS" representa la estabilización con disulfuro). Por lo tanto, de acuerdo con el presente modo de realización, dentro de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) los dominios CH3 se alteran para promover la heterodimerización sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en uno de los dominios CH3 con un aminoácido cargado positivamente; y sustituyendo al menos un residuo aminoacídico original en el otro de los dominios CH3 con un aminoácido cargado negativamente; y una introducción adicional de al menos un residuo de cisteína en cada dominio CH3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios CH3.

En otras palabras, el presente modo de realización se refiere a un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-SS) de acuerdo con la invención que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que en la estructura terciaria del anticuerpo el dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido forman una interfaz que se localiza entre los respectivos dominios CH3 de anticuerpo, en el que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 del primer polipéptido y el dominio CH3 del segundo polipéptido comprenden cada una un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo,

- en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, un primer aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado positivamente; y

- en el que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido, un segundo aminoácido se sustituye con un aminoácido cargado negativamente; y en el que

- del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de un polipéptido, un primer aminoácido se sustituye con cisteína; y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 del otro polipéptido, un segundo aminoácido se sustituye con cisteína, en el que el segundo aminoácido se orienta hacia el primer aminoácido dentro de la interfase; de modo que se puede formar un puente disulfuro entre el dominio CH3 de un polipéptido y el dominio CH3 del otro polipéptido por medio de los residuos de cisteína introducidos.

En un modo de realización de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro. Por lo tanto, los dominios VH3 y VL3 se alteran por introducción de al menos un residuo de cisteína en el dominio VH3 y un residuo de cisteína en el dominio VL3 de modo que se forma un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3. En un modo de realización de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente, el tercer sitio de unión se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico se estabiliza con disulfuro y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro.

Sin quedar vinculado a esta teoría, los al menos dos enlaces disulfuro formados por esta modificación en diferentes dominios de los polipéptidos alterados del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención reemplazan las interacciones disulfuro de bisagra de la IgG natural y, de este modo soportan la heterodimerización mientras que permiten el acceso del antígeno al tercer sitio de unión.

En un modo de realización de la invención, el primer y/o segundo sitio de unión del anticuerpo multiespecífico también se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína independientemente entre sí en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100;

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43; o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (S-S) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100; y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, la heterodimerización se soporta por modificaciones de botones en ojales dentro de los dominios CH3 y, además, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro, respectivamente. En un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización de las cadenas pesadas modificadas con botones en ojales se soporta además por un enlace disulfuro intercatenario artificial, que, en contraste con los enfoques de botones en ojales conocidos, no se localiza dentro del CH3 dominio, sino en un dominio diferente (es decir, entre los dominios VH3 y VL3). Dentro del anticuerpo de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización del tercer módulo de unión (que comprende los polipéptidos VH3-CH3 y VL3-CH3) se promueve por cuatro interacciones distintas: (i) la interacción natural entre VH3 y VL3, (ii) la estabilización con disulfuro en la interfase VH3/VL3, (iii) la estabilización con disulfuro en la interfase CH3/CH3; y (iv) las modificaciones de botones en ojales en la interfase CH3/CH3. Por esto, se promueve la formación de heterodímeros en lugar de la formación de homodímeros y se mejora la estabilidad del anticuerpo.

En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo aminoacídico original se selecciona de R, F, Y y W; y el residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo aminoacídico original se selecciona de A, S, T y V, y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende una mutación T366W, y el dominio CH3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W y G407Y, y el dominio c H3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KSS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44, y en el dominio VL3 en la posición 100; y el dominio CH3 de un polipéptido (el polipéptido que comprende el "botón") comprende las mutaciones T366W, R409D y K370E, y el dominio ^cH3 del otro polipéptido (el polipéptido que comprende el "ojal") comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V, D399^ky E357K (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro por una mutación E356C o una S354C en uno de los dominios CH3 (en un modo de realización, una mutación S354C) y una mutación Y349C en el otro dominio CH3 (numeraciones de acuerdo con índice EU de Kabat).

En otro modo de realización preferente de la invención, la heterodimerización se soporta por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 y, además, el tercer sitio de unión del anticuerpo multiespecífico y los dominios CH3 se estabilizan con disulfuro, respectivamente. En un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con el presente modo de realización, la heterodimerización de los polipéptidos modificados se soporta además por un enlace disulfuro intercatenario artificial, que no se localiza dentro del dominio CH3, sino en un dominio diferente (es decir, entre los dominios VH3 y VL3). En un modo de realización, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH3 y VL3 (numeración de acuerdo con a Kabat):

- VH3 en la posición 44, y VL3 en la posición 100;

- VH3 en la posición 105, y VL3 en la posición 43; o

- VH3 en la posición 101, y VL3 en la posición 100.

En un modo de realización preferente de la invención, el tercer sitio de unión de un anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-/SS) de acuerdo con la invención se estabiliza con disulfuro por introducción de residuos de cisteína en el dominio VH3 en la posición 44 y en el dominio VL3 en la posición 100.

Otras técnicas para modificar los dominios CH3 de las cadenas pesadas de un anticuerpo multiespecífico (aparte de la tecnología de "botones en ojales") para forzar la heterodimerización son conocidas en la técnica. Estas tecnologías, especialmente las descritas en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 and WO 2013/096291 se contemplan en el presente documento como alternativas a la "tecnología de botón en ojal" en combinación con un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. El anticuerpo multiespecífico que incluye una de estas modificaciones para soportar la heterodimerización se denomina además en el presente documento anticuerpo multiespecífico "con CH3 genomanipulado".

De acuerdo con el enfoque descrito en el documento EP 1870459, la heterodimerización de dominios CH3 se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de dominio CH3/CH3 entre ambas, la primera y la segunda cadena pesada (en el presente documento se denomina además "anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)"). En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2013/157953 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D.

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D. Adicionalmente, al menos una de las siguientes sustituciones está comprendida en el dominio CH3 del otro polipéptido: el aminoácido Y en la posición 349 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido Y en la posición 349 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D y el aminoácido L en la posición 368 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E. En un modo de realización, el aminoácido L en la posición 368 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2012/058768 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y y el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 del otro polipéptido al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) y 392 (originalmente K) se sustituye. Las sustituciones preferentes son:

- sustitución del aminoácido T en la posición 411 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de N, R, Q, K, D, E y W;

- sustitución del aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de R, W, Y y K;

- sustitución del aminoácido S en la posición 400 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de E, D, R y K;

- sustitución del aminoácido F en la posición 405 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de I, M, T, S, V y W;

- sustitución del aminoácido N en la posición 390 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de R, K y D; y

- sustitución del aminoácido K en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) con un aminoácido seleccionado de V, M, R, L, F y E.

En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención (genomanipulado de acuerdo con el documento WO 2012/058768), en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido L en la posición 351 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y y el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con V y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A y el aminoácido K en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con F. En dicho último modo de realización mencionado anteriormente, en el dominio CH3 de dicho otro polipéptido, el aminoácido K en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido T en la posición 411 (numeración de acuerdo con EU el índice de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido D en la posición 399 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con R y el aminoácido S en la posición 400 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con R.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2011/143545 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, las modificaciones de aminoácidos en los dominios CH3 de ambos polipéptidos se introducen en las posiciones 368 y/o 409.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. El documento WO 2011/090762 se refiere a modificaciones de aminoácidos de acuerdo con la tecnología de "botón en ojal". En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con W; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con A. En otro modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado (KiH) de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido T en la posición 366 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con Y; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido Y en la posición 407 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con T.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, que es de isotipo IgG2, se usa el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2009/089004 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido K o N en la posición 392 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado negativamente ( en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D); y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido D en la posición 399, el aminoácido E o D en la posición 356 o el aminoácido E en la posición 357 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado positivamente (en un modo de realización preferente K o R, en un modo de realización preferente con K, en un modo de realización preferente los aminoácidos en las posiciones 399 o 356 se sustituyen con K). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido K o R en la posición 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D). Aún en otro modo de realización, además de o de forma alternativa a las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido K en la posición 439 y/o el aminoácido K en la posición 370 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye independientemente entre sí con un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización preferente con E o D, en un modo de realización preferente con D).

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2007/147901 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización de dicho anticuerpo multiespecífico con CH3 genomanipulado de acuerdo con la invención, en el dominio CH3 de un polipéptido, el aminoácido K en la posición 253 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con E, el aminoácido D en la posición 282 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido K en la posición 322 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D; y en el dominio CH3 del otro polipéptido, el aminoácido D en la posición 239 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K, el aminoácido E en la posición 240 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con K y el aminoácido K en la posición 292 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye con D.

En un modo de realización de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el enfoque descrito en el documento WO 2007/110205 se usa para soportar la heterodimerización del primer polipéptido y el segundo polipéptido del anticuerpo multiespecífico.

Además o de forma alternativa a la genomanipulación de los dominios CH3 por estrategias de heterodimerización identificadas anteriormente, la introducción de un puente disulfuro intercatenario adicional estabiliza los heterodímeros (Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35; Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). Esto también se denomina en el presente documento "estabilización con disulfuro de los dominios CH3".

V. Procedimientos y composiciones recombinantes

El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención se puede producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. En un modo de realización, se proporcionan uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican el anticuerpo multiespecífico descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende un polipéptido de fusión circular y opcionalmente también una secuencia de aminoácidos que comprende un segundo polipéptido de fusión circular (por ejemplo, un primer polipéptido de fusión circular y un segundo polipéptido de fusión circular de un polipéptido de fusión dicircular). En otro modo de realización, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con) en el caso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el primer polipéptido de fusión circular y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo polipéptido de fusión circular o un único vector que comprende estos dos ácidos nucleicos. En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp2/0). En un modo de realización, se proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo multiespecífico, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo multiespecífico, y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo multiespecífico de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos de fusión circulares, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede producir fácilmente usando procedimientos convencionales.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo multiespecífico incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523 (véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo multiespecífico de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar además.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos de fusión circulares, incluyendo hongos y cepas de levadura con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano (véase Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos multiespecíficos glucosilados de acuerdo con la invención también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas)).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol.

36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MM T060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

VI. Ensayos

El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se puede identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica para determinar la unión de un polipéptido a su diana.

VII. Inmunoconjugados

La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal) o fragmentos de las mismas), o isótopos radioactivos.

En un modo de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención-fármaco en el que un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse los documentos US 5.208.020, US 5.416.064 y EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MmAF) (véanse los documentos US 5.635.483, US 5.780.588 y US 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivado de la misma (véanse los documentos US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 y US 5.877.296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; y Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); una antraciclina tal como una daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717 721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg.& Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; y el documento US 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), inhibidor de Momordica charanda, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-acido (tales como bis-(p-acidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104.

1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriamina del ácido pentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el polipéptido de fusión circular (véase el documento WO 94/11026). El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; documento US 5.208.020).

Los inmunoconjugados en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.). VIII. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

En determinados modos de realización, cualquiera del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención es útil para detectar la presencia de su(s) diana(s) en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende sangre, suero, plasma, célula o tejido.

En un modo de realización, se proporciona un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de la(s) diana(s) del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en una muestra biológica. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo multiespecífico a su diana y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo multiespecífico y su diana. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En un modo de realización, se usa un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con dicho anticuerpo multiespecífico.

En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos multiespecíficos marcados de acuerdo con la invención. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares. IX. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se preparan mezclando dicho anticuerpo multiespecífico que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido de fusión circular, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

X. Procedimientos y composiciones terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención se puede usar en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporciona un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo multiespecífico para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es preferentemente un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad. En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad eficaz del medicamento. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad. En un modo de realización, el procedimiento comprende administrar a un individuo que tiene dicha enfermedad una cantidad eficaz de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. En un modo de realización de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención y al menos un agente terapéutico adicional.

Un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se puede usar solo o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En un modo de realización, la administración del anticuerpo multiespecífico y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. El anticuerpo multiespecífico adecuado de acuerdo con la invención también se puede usar en combinación con radioterapia.

Un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

Los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo multiespecífico no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo multiespecífico presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo multiespecífico, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra anticuerpo multiespecífico con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo multiespecífico y el criterio del médico especialista. El anticuerpo multiespecífico se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo multiespecífico puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una inhibición deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo multiespecífico estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo multiespecífico). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención.

XI. Artículos de fabricación

En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de un trastorno. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección.

Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

Figura 1 Esquema de la estructura general del polipéptido de fusión circular como se informa en el presente documento.

Figura 2 Esquemas de la estructura general de polipéptidos de fusión dicirculares como se informa en el presente documento.

Figura 3 Orientación y distancia espacial entre los sitios de unión de un anticuerpo normal del tipo IgG y un polipéptido de fusión dicircular ejemplar como se informa en el presente documento.

Figura 4 Cromatograma de extinción UV (280 nm) de las diferentes formas de Contorsbody. Figura 5 Análisis de calidad de producto del polipéptido de fusión circular como se informa en el presente documento por espectrometría de masas.

Figuras 6+7 Esquema de las posiciones y orientaciones relativas del dominio VH en la orientación "VH-in" (cerca de la región Fc) y la orientación "VH-out" (más lejos de la región Fc). Figura 8 Cadenas ejemplares de polipéptidos de fusión circulares anti-cMET con la respectiva orientación usada para la producción de polipéptidos de fusión bicirculares biespecíficos como se informa en el presente documento.

Figura 9 El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención que comprende dos polipéptidos de fusión circulares y un tercer par VH/VL; figura superior: esbozo, figura inferior: modelo tridimensional.

Figura 10 Cromatograma SEC (parte superior) y SDS-PAGE (parte inferior) del sobrenadante de cultivo purificado KappaSelect del TriFab-Contorsbody LeY/biotina.

Figura 11 espectros m/z de TriFab-Contorsbody LeY/biotina.

Figura 12 Análisis FACS de TriFab-Contorsbody LeY/biotina.

Figura 13 Esquema de TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 biespecífico.

Figura 14 Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3; kDa = kilodalton (marcador de peso molecular); nr = no reducido; r = reducido.

Figura 15 Esquema de TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 biespecífico y TriFabs biespecíficos usados para la incubación con células MCF7.

Figura 16 Destrucción celular dependiente de la dosis de células MCF7 de un TriFab anti-LeY (control positivo), ii) TriFab anti-LeY/X (X no está presente en MCF7; control negativo), Ni) TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 de acuerdo con la presente invención.

XII. Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden practicar otros diversos modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente. Materiales y procedimientos

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis de genes y oligonucleótidos

Se prepararon los segmentos génicos deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos génicos sintetizados se clonaron en un plásmido de E. coli para su propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de fragmentos génicos subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, se ensamblaron fragmentos cortos de ADN sintético hibridando oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Los oligonucleótidos respectivos se prepararon por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).

Reactivos

Todos los productos químicos, anticuerpos y kits comerciales se usaron como se proporcionaron de acuerdo con el protocolo del fabricante, si no se establece de otro modo.

Ejemplo 1

Construcción de los plásmidos de expresión para los polipéptidos de fusión circulares

Para la expresión de un polipéptido de fusión circular como se informa en el presente documento se usó una unidad de transcripción que comprende los siguientes elementos funcionales:

- el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A, - una región no traducida 5' de inmunoglobulina de la cadena pesada humana (5'UTR),

- una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

- un ácido nucleico que codifica el respectivo polipéptido de fusión circular, y

- la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

Además del casete/unidad de expresión que incluye el gen deseado que se va a expresar, el plásmido de expresión de mamífero estándar/básico contiene

- un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli y

- un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.

Ejemplo 2

Expresión de los polipéptidos de fusión circulares

Se realizó la expresión transitoria de polipéptidos de fusión circulares en células HEK293F (células FreeStyle 293-F; Invitrogen) adaptadas a la suspensión con el reactivo de transfección sin 293 (Novagen).

Las células se han pasado, por dilución, al menos cuatro veces (volumen 30 ml) después de descongelarlas en un matraz de agitación de 125 ml (incubar/agitar a 37 °C, CO2 al 7 %, humedad al 85 %, 135 rpm).

Las células se expandieron a 3x105 células/ml en 250 ml de volumen. Tres días después, las células se han dividido y sembrado de nuevo con una densidad de 7* 105 células/ml en un 250 ml de volumen en un matraz de agitación de 1 litro. La transfección se realizará 24 horas después a una densidad celular de alrededor de 1,4 - 2,0 x 106 células/ml.

Antes de la transfección, se diluyeron 250 |jg de ADN-plásmido en un volumen final de 10 ml con Opti-MEM (Gibco) precalentado (baño de agua; 37 °C). La solución se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante no más de 5 min. A continuación, se añadieron 333,3 j l de reactivo de transfección sin 293 a la solución de ADN-OptiMEM. Después de eso, la solución se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Se añadió todo el volumen de la mezcla a un matraz de agitación de 1 l con 250 ml de volumen de cultivo celular HEK.

Incubar/agitar a 37 °C, CO2 al 7 %, humedad al 85 %, 135 rpm durante 6 o 7 días.

El sobrenadante se recogió por una primera etapa de centrifugación a 2.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfirió a un nuevo matraz de centrifugación para una segunda centrifugación a 4.000 rpm, 4 °C, durante 20 minutos. Después de esto, el sobrenadante sin células se filtró a través de un filtro de tapa de frasco de 0,22 jm y se almacenó en un congelador (-20 °C).

Ejemplo 3

Purificación de los polipéptidos de fusión circulares

Los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos se filtraron y se purificaron por dos etapas cromatográficas. Los anticuerpos se capturaron por cromatografía de afinidad usando HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) equilibrada con PBS (KH2PO41 mM, Na2HPO410 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM), pH 7,4. Las proteínas no unidas se retiraron lavando con tampón de equilibrio y el anticuerpo se recuperó con tampón citrato 50 mM, pH 2,8, y de inmediato después de la elución se neutralizó hasta pH 6,0 con Tris-base 1 M, pH 9,0. Se usó cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 200™ (GE Healthcare) como segunda etapa de purificación. La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en tampón histidina 20 mM, NaCl 0,14 M, pH 6,0. Las soluciones que contenían anticuerpos se concentraron con una unidad de filtro centrífugo Ultrafree-CL equipada con una membrana Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA) y se almacenaron a -80 °C. Ejemplo 4

Unión del polipéptido de fusión circular anti-Her2

Unión al receptor de Her2 de resonancia de plasmón superficial

Superficie de chip: CM5-Chip

T: 37 °C y 25 °C, respectivamente para la configuración de ensayo 1 y 2

tampón de PBS Tween 20 al 0,05 % (v/v)

migración:

tampón de dilución: tampón de migración BSA al 0,1 %

analitos: c(ECD HER2) = 0,41-900 nM para la configuración de ensayo 1;

c(Contorsbodies anti-Her2 diméricos) = 3,7-300 nM,

c(trastuzumab) = 3,7-300 nM para la configuración de ensayo 2 Ligando: Contorsbody anti-Her2 dimérico, trastuzumab unido por medio de un anticuerpo anti región Fc humana para la configuración de ensayo 1; Her2-ECD unido por medio de pertuzumab para la configuración del ensayo 2.

Las unidades de respuesta son directamente proporcionales al peso molecular. El máximo teórico de unión a analito se basa en el nivel de unión conocido de ECD Her2. 100 % = 1 molécula de Contorsbodies anti-Her2 diméricos o trastuzumab se une a 2 moléculas de ECD HER2, respectivamente.

Ejemplo 5

Ensayo ADCC-ACEA

Las células BT-474 se "solubilizaron" con Accutase, se contaron en el medio y se llevaron hasta una densidad celular de 2x10E5 células/ml. Se pipetearon 50 j l de medio en cada pocillo en placas de 96 pocillos, se midió el efecto de fondo en ACEA y, finalmente, se añadieron 50 j l de suspensión de células/pocillo (= 10.000 células/pocillo). Las placas se dispusieron en ACEA para medir el índice celular después de 15 minutos. A continuación, el medio se retiró pipeteando, se realizó una etapa de lavado con medio AIM-V y se añadieron 50 j l de anticuerpo en tres concentraciones diferentes. Se contaron los linfocitos citolíticos naturales y se dispusieron en AIM-V hasta una densidad celular de 6x10E5. Se añadieron 50 jl (30.000 células/pocillo y E/T 3:1 en ACEA y se midió el índice celular cada 5 minutos. Después de 24 horas, se detuvo el experimento y se calculó la ADCC después de 2 y 4 horas.

Ejemplo 6

Análisis de espectrometría de masas

Se obtuvo PNGasa F de Roche Diagnostics GmbH (14,3 U/|jl; solución en fosfato de sodio, EDTA y glicerol). Una proteasa que se escinde específicamente en la región bisagra de un anticuerpo IgG se reconstituyó recientemente a partir de un liofilizado antes de la digestión.

Desglucosilación enzimática con PNGasa F

Se diluyeron 50 jg de Contorsbody hasta una concentración final de 0,6 mg/ml con tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,1, y se desglucosiló con 1 j l de PNGasa F a 37 °C durante 16 horas.

Escisión enzimática

La muestra desglucosilada se diluyó hasta una concentración final de 0,5 mg/ml con tampón Tris 200 mM, pH 8.0, y posteriormente se digirió con la proteasa específica de IgG a 37 °C durante 1 hora.

Espectrometría de masas ESI-QTOF

La muestra se desaló por HPLC en una columna Sephadex G25 (Kronlab, 5x250 mm, TAC05/250G0-SR) usando acetonitrilo al 40 % con ácido fórmico al 2 % (v/v). Se determinó la masa total por medio de EM ESI-QTOF en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion). La calibración se realizó con yoduro de sodio (Waters ToF G2-Sample Kit 2 Part: 700008892-1). Para el Contorsbody digerido, la adquisición de datos se realizó a 1000-4000 m/z (ISCID: 30 eV). Los espectros de masas brutos se evaluaron y se transformaron en masas molares relativas individuales. Para la visualización de los resultados, se usó un programa informático comercial para generar espectros de masas desconvolucionados.

Ejemplo 7

Purificación del TriFab-Contorsbody

Los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos se filtraron y se purificaron por dos etapas cromatográficas. Debido a la ausencia de una región Fc funcional ya que las moléculas carecen de dominios CH2, los TriFab-Contorsbodies se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína L estándar (KappaSelect). Se capturaron los anticuerpos por cromatografía de afinidad usando KappaSelect (GE Healthcare) equilibrada con PBS (KH2PO41 mM, Na2HPO410 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM), pH 7,4. Las proteínas no unidas se retiraron lavando con tampón de equilibrio y el anticuerpo se recuperó con tampón citrato 50 mM, pH 2,8, y de inmediato después de la elución se neutralizó hasta pH 6,0 con Tris-base 1 M, pH 9.0. Se usó cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 200™ (GE Healthcare) como segunda etapa de purificación. La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en tampón histidina 20 mM, NaCl 0,14 M, pH 6,0. Las soluciones que contenían anticuerpos se concentraron con una unidad de filtro centrífugo Ultrafree-CL equipada con una membrana Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA) y se almacenaron a -80 °C. Ejemplo 8

Análisis FACS de TriFab-Contorsbody

Se aplicaron análisis FACS para evaluar la funcionalidad de unión del TriFab-Contorsbody generado. Por lo tanto, se expusieron células MCF7 que expresan antígeno LeY al conjugado biotina-Cy5 (control negativo), un TriFab-Contorsbody sin unión como controles negativos seguidos después del lavado de las células por el conjugado biotina-Cy5 (control negativo II), o bien al TriFab-Contorsbody añadiéndose posteriormente biotina-Cy5 y se evaluó la fluorescencia de las células. La figura 12 muestra los resultados.

Ejemplo 9

TriFab Contorsbody media eficazmente en la destrucción de células tumorales inducida por linfocitos T

Para evaluar la idoneidad del formato TriFab-Contorsbody en la destrucción de células tumorales inducida por linfocitos T, se usó como tercera entidad de unión una entidad de unión anti-CD3 (figura 13). Las secuencias de VH y VF son secuencias ejemplares de la proteína fijadora de CD3 como se describe en el documento US 2015/0166661 A1. En el presente documento se puede sustituir cualquier Fv anti-CD3. Esto simplemente se ha elegido como ejemplo. Este TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 comprende los polipéptidos de SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

La expresión y purificación (realizada como se explica en los ejemplos anteriores) del TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 se logró con un rendimiento de 8 mg/l de volumen de expresión. En el análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie, están presentes bandas claras con el peso esperado (figura 14).

Se sembraron células MCF7 positivas para LeY en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche, seguido de exposición a diferentes concentraciones de i) un TriFab anti-LeY como control positivo, ii) un TriFab anti-LeY/X con X no presente en células MCF7 como control negativo, y iii) el TriFab-Contorsbody anti-LeY/CD3 (véase la figura 15). Para evaluar la destrucción mediada por linfocitos T, se añadieron PBMC de sangre completa de donantes sanos (aisladas por medio de purificación Ficoll® Paque Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) en una proporción 5:1. Después de esto los cultivos se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 5 % durante 48 horas, seguido de la evaluación del grado de lisis de células tumorales (aplicando ensayos de liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de detección de citotoxicidad (LDH), Roche). Se confirmó que TriFab-Contorsbody induce destrucción dependiente de la dosis incluso a intervalo picomolar bajo. En comparación con el control positivo TriFab anti-LEY/CD3 (~ 120 pM) TriFab-Contorsbody mostró un valor CI50 significativamente menor (~2,4 pM) (figura 16). Rendimientos de expresión de diferentes TriFab-Contorsbodies LeY/CD3:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo multiespecífico que comprende tres sitios de unión a antígeno y que consiste en dos polipéptidos de fusión circulares, en el que

- la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH1-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL1-CL1), con lo que la segunda parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del primer dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa, y

- la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada (VH2-CH1) o un fragmento Fab de la cadena ligera (VL2-CL1), con lo que la segunda parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena ligera si la primera parte del segundo dominio de unión es un fragmento Fab de la cadena pesada o viceversa,

- la segunda parte del tercer dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena pesada-CH3 si la primera parte del segundo dominio de unión es un polipéptido de fusión de dominio variable de la cadena ligera-CH3, o viceversa,

iv) ambas modificaciones de i) y ii),

en el que el anticuerpo multiespecífico está desprovisto de dominios constantes de la cadena pesada 2 (CH2) y de una región bisagra.

2. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer y/o el segundo y/o el tercer sitio de unión a antígeno se estabiliza por disulfuro independientemente entre sí por introducción de residuos de cisteína en las siguientes posiciones para formar un enlace disulfuro entre los dominios VH y VL (numeración de acuerdo con Kabat):

- VH en la posición 44 y VL en la posición 100,

- VH en la posición 105 y VL en la posición 43, o

- VH en la posición 101 y VL en la posición 100.

3. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el primer, segundo, tercer y cuarto conector peptídico son péptidos de al menos 5 aminoácidos.

4. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer y tercer conector peptídico tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y el segundo y cuarto conector peptídico tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

5. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el extremo C del dominio VH3 se conecta directamente al extremo N de uno de los dominios CH3, y el extremo C del dominio VL3 se conecta directamente al extremo N del otro de los dominios CH3.

6. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo es trivalente.

7. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es biespecífico (el primer sitio de unión se une a un primer antígeno, el segundo sitio de unión se une a un segundo antígeno y el tercer sitio de unión se une a un tercer antígeno, con lo que dos del primer, el segundo y el tercer antígeno son el mismo antígeno y el otro es un antígeno diferente); o triespecífico (el primer sitio de unión se une a un primer antígeno, el segundo sitio de unión se une a un segundo antígeno y el tercer sitio de unión se une a un tercer antígeno, con lo que el primer, el segundo y el tercer antígeno son antígenos diferentes).

8. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la primera parte del primer dominio de unión y la segunda parte del primer dominio de unión se asocian covalentemente por un enlace disulfuro entre sí, y/o en el que la primera parte del segundo dominio de unión y la segunda parte del segundo dominio de unión se asocian covalentemente por un enlace disulfuro entre sí.

9. El anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tercer sitio de unión se une específicamente a CD3 humano.

10. Un procedimiento para la preparación del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas de

- transformar una célula huésped con vectores de expresión que comprenden ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo multiespecífico,

- cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo multiespecífico, y - recuperar dicho anticuerpo multiespecífico de dicho cultivo de células huésped.

11. Un anticuerpo multiespecífico producido por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un conjunto de ácido nucleico que codifica los polipéptidos del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12 o un conjunto de vectores de expresión que comprende cada uno uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Una célula huésped que comprende los ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 12.

15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, opcionalmente en combinación con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.