JP7092881B2 - ＴｒｉＦａｂコントースボディ - Google Patents

Description

本発明は標的結合分子の分野に属する。本明細書において、分子が高度にコンパクトでありかつ比較的低分子量である、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体を報告する。

発明の背景
1974年にKoehlerとMilsteinが最初のモノクローナル抗体を開発して以来、ヒトの治療に適した抗体の開発には、多くの努力が注がれてきた。利用可能になった最初のモノクローナル抗体は、マウスおよびラットで開発された。人間の治療に使用した場合、これらの抗体は、抗齧歯類抗体ゆえの望ましくない副作用を引き起こした。そのような望ましくない副作用を低減し、さらには排除するために、多くの努力が注がれてきた。

ここ数年、市場に出るヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体の数は増加の一途を辿っている。周知の例として、Hoffmann-La Roche、バーゼルのHerceptin（登録商標）およびMabThera（登録商標）が挙げられる。

その上、野生型四鎖Y字状抗体フォーマットから派生した新しい抗体フォーマットも開発されている。これらのフォーマットは主として二重特異性および多重特異性フォーマットである。総説として、例えばKontermann, R., mAbs 4（2012）182-197（非特許文献1）を参照されたい。

US 2009/0175867（特許文献1）において、エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質が報告されている。

WO 2014/131711（特許文献2）において、第2抗原結合部分および第3結合部分がFcドメインに、直接または免疫グロブリンヒンジ領域を介して、融合されていてもよい、二重特異性抗体が報告されている。

EP 15176083（特許文献3）において、完全長抗体と比較して分子量が低減している新規抗体フォーマットおよびその使用が報告されている。

WO 2007/048022（特許文献4）は、抗体-ポリペプチド融合タンパク質ならびにその産生方法および使用方法を開示している。

WO 2007/146968（特許文献5）は、エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質を開示している。

EP 1 378 520は（特許文献6）、環状単鎖三重特異性抗体を開示している。

WO 2016/087416（特許文献7）は、2つの抗原結合部位が第1抗原結合部分および第2抗原結合部分によって形成され、第3抗原結合部位が可変重鎖ドメイン（VH3）と可変軽鎖ドメイン（VL3）とによって形成される、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体を開示している。

US 2009/0175867 WO 2014/131711 EP 15176083 WO 2007/048022 WO 2007/146968 EP 1 378 520 WO 2016/087416

Kontermann, R., mAbs 4（2012）182-197

本明細書において新しい標的結合物質を報告する。この新しい標的結合物質は、環状ポリペプチドのそれぞれが3つの可変ドメイン-定常ドメイン（V-C）二量体を含む、三価、二重特異性、または三重特異性の二環状ポリペプチドである。より具体的には、第1ポリペプチドでは、N末端二量体V_1a-C_1aが第1結合部位の第1部分を含み、中央の二量体V_2a-C_2aが第2結合部位の第1部分を含み、C末端二量体V_1b-C_1bが第1結合部位V_1a-C_1aおよびV_1b-C_1bの第2部分を含む。第2ポリペプチドは、中央の二量体として第2結合部位の第2部分V_2b-C_2bを含み、N末端およびC末端二量体として第3結合部位の第1部分および第2部分を含む。第1、第2、および第3結合部位のそれぞれの第1部分および第2部分は、互いに連結して、完全なまたは機能的な第1～第3結合部位を形成する。第1結合部位および第3結合部位の第1部分と第2部分とが連結することにより、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドのそれぞれが環化する。連結のそれぞれは互いに独立して、非共有結合的または共有結合的であることができる。連結が共有結合的である場合、それはペプチド結合によるのではなく、例えばジスルフィド結合による。

本明細書において報告する一局面は、3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、
（a）第1抗原結合部位が、第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分と第3結合ドメインの第1部分とを含む第1環状融合ポリペプチドによって形成され、ここで、
- 第1結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第1部分のN末端に直接または第1ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第1部分のC末端に直接または第2ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第1部分が、重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）であり、ここで、第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第1結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、かつ
- 第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第1抗原結合部位を形成し、
（b）第2抗原結合部位が、第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分と第3結合ドメインの第2部分とを含む第2環状融合ポリペプチドによって形成され、ここで、
- 第2結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第2部分のN末端に直接または第3ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第2部分のC末端に直接または第4ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）であり、ここで、第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第2結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、（ここで、第2結合部位の第1部分が第1結合部位の第1部分とは独立して選択され）、
- 第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第2抗原結合部位を形成し、
（c）第3抗原結合部位が、第3結合ドメインの第1部分および第3結合ドメインの第2部分によって形成され、ここで、
- 第3結合ドメインの第1部分が、可変重鎖-リンカー-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VH₃-L-CH3）、または可変軽鎖-リンカー-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VL₃-L-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1環状融合ポリペプチド中の第3結合ドメインの第1部分が可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドである場合には第3結合ドメインの第2部分が可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- 第3結合ドメインの第1部分と第3結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第3抗原結合部位を形成し、
2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
（i）一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、もしくは
一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、または
（ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、または
（iii）（i）および（ii）の改変の両方によって、
ヘテロ二量体化を促進するように変更されている、
多重特異性抗体である。

一態様において、多重特異性抗体は、前記CH3ドメインの各N末端側に定常重鎖ドメイン2（CH2）を含むが、ヒンジ領域は含まない。

一態様において、多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている。

一態様において、第1環状融合ポリペプチドおよび第2環状融合ポリペプチドはそれぞれ、第3抗原結合ドメインの部分のN末端側に、ある結合ドメインの正確に1つの部分を含み、第3抗原結合ドメインの部分のC末端側に、該結合ドメインの正確に1つの、ただし異なる、部分を含む。

一態様では、第1環状融合ポリペプチドにおいて、第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分は互いに共有結合的に連結され、かつ/または第2環状融合ポリペプチドにおいて、第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分は互いに共有結合的に連結される。一態様において、共有結合的連結はペプチド結合以外の結合による。好ましい一態様において、共有結合的連結はジスルフィド結合による。

一態様において、
（i）第1結合部位または第2結合部位の第1部分のCH1ドメインのC末端は第3結合ドメインの部分のN末端にコンジュゲートされ、かつ第1結合部位または第2結合部位の第2部分のVLドメインのN末端は第3結合ドメインのC末端にコンジュゲートされるか、または
（ii）第1結合部位または第2結合部位の第1部分のVHドメインのC末端は第3結合ドメインの部分のN末端にコンジュゲートされ、かつ第1結合部位または第2結合部位の第2部分のCLドメインのN末端は第3結合ドメインのC末端にコンジュゲートされる。

一態様において、第1抗原結合部位および/または第2抗原結合部位および/または第3抗原結合部位は、VHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）に互いに独立してシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VHの44番目およびVLの100番目、
- VHの105番目およびVLの43番目、または
- VHの101番目およびVLの100番目。

一態様において、第1または第2結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fabフラグメント（VH＋CH1）であり、かつ該第1または第2結合ドメインの第2部分は抗体軽鎖Fabフラグメント（VL＋CL）であるか、またはその逆である。

一態様において、多重特異性抗体融合ポリペプチドはエフェクター機能を発揮する。一態様において、エフェクター機能はADCCまたは/およびCDCである。

一態様において、第1結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第1結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合され、ここで、第1ペプチド性リンカーと第2ペプチド性リンカーは互いに独立して選択される。

一態様において、第2結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第2結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合され、ここで、第1ペプチド性リンカーと第2ペプチド性リンカーは互いに独立して選択される。

好ましい一態様において、第1結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:38の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第1結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合され、第2結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:38の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第2結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合される。

一態様において、第3結合部位はヒトCD3またはヒトCD4またはヒトCD28に特異的に結合する。

一態様において、3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体は、
N末端からC末端に向かって、第1結合ドメインの第1部分としての重鎖Fabフラグメント（VH-CH1）、SEQ ID NO:38のリンカー、第3結合ドメインの第1部分としての、CH3ドメインが突然変異T366W（任意でさらなる突然変異S354CまたはY349C）を含む可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド、SEQ ID NO:16のリンカー、および第1結合ドメインの第2部分としての軽鎖Fabフラグメント（VL-CL）を含む、第1環状融合ポリペプチドと、
N末端からC末端に向かって、第2結合ドメインの第1部分としての軽鎖Fabフラグメント（VL-CL）、SEQ ID NO:38のリンカー、第3結合ドメインの第2部分としての、CH3ドメインが突然変異T366S、L368A、およびY407V（任意でさらなる突然変異Y349CまたはS354C）を含む可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド、SEQ ID NO:16のリンカー、および第2結合ドメインの第2部分としての重鎖Fabフラグメント（VH-CH1）を含む、第2環状融合ポリペプチドと
を含み（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、かつ
第3結合部位はヒトCD3またはCD4またはCD28に特異的に結合する。

一態様において、各（環状）（単鎖）融合ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、第3結合ドメインの部分の前（すなわち第3抗原結合ドメインの部分のN末端側）に正確に1つの抗体可変ドメインを含み、第3結合ドメインの部分の後（すなわち第3ドメインの部分のC末端側）に正確に1つの抗体可変ドメインを含む。

一態様において、標的は、細胞表面抗原であるか、または細胞表面受容体の可溶性リガンドである。

一態様において、結合ドメインはFab、DAF、または二重特異性Fabである。

一態様において、第1および/または第2結合ドメインは（通常の）Fabであり、結合ドメインの第1部分が、抗体重鎖可変ドメイン（VH）と第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1）の少なくともN末端フラグメント（または完全な第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1））とを含み、かつ結合ドメインのそれぞれ他方の部分が、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）と抗体軽鎖定常ドメイン（CL）の少なくともN末端フラグメント（または完全な抗体軽鎖定常ドメイン（CL））とを含むか、またはその逆である。一態様において、結合ドメインの第1部分はN末端からC末端に向かってVH-CH1を含み、かつ結合ドメインの第2部分はN末端からC末端に向かってVL-CLを含むか、またはその逆である。

一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。

一態様において、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはT366W突然変異（ノブ突然変異、ノブ側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異T366S、L368A、Y407V（ホール突然変異、ホール側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはT366W突然変異（ノブ突然変異、ノブ側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異T366S、L368A、およびY407V（ホール突然変異、ホール側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはS354CおよびT366W突然変異（ノブ-cys突然変異、ノブ-cys側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V（ホール-cys突然変異、ホール-cys側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

一態様において、多重特異性抗体は3つの抗原結合部位を含み、
（a）第1抗原結合部位は、第1環状融合ポリペプチドの第1抗体重鎖可変ドメイン（VH₁）と第1抗体軽鎖可変ドメイン（VL₁）との対（VH₁/VL₁対）によって形成され、ここで、
- VH₁は第1重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）の一部であり、かつVL₁は第1軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）の一部であり、
- VH₁-CH1は、第1ペプチド性リンカーを介して第1可変ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-L-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₁-CLは第2ペプチド性リンカーを介して第1 V₃-L-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₁-CH1とVL₁-CLは、互いに連結されてVH₁/VL₁対を形成し、
（b）第2抗原結合部位は、第2環状融合ポリペプチドの第2抗体重鎖可変ドメイン（VH₂）と第2抗体軽鎖可変ドメイン（VL₂）との対（VH₂/VL₂対）によって形成され、ここで、
- VH₂は第2重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）の一部であり、かつVL₂は第2軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）の一部であり、
- VH₂-CH1は、第3ペプチド性リンカーを介して第2可変ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-L-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₂-CLは第4ペプチド性リンカーを介して第2 V₃-L-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₂-CH1とVL₂-CLは、互いに連結されてVH₂/VL₂対を形成し、
（c）第3抗原結合部位は第1 V₃-L-CH3および第2 V₃-L-CH3によって形成され、ここで、
- 第1 V₃-L-CH3は、可変重鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VH₃-L-CH3）、または可変軽鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VL₃-L-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1 V₃-L-CH3が可変軽鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドである場合には第2 V₃-CH3は可変重鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであるかまたはその逆であり、
- VH₃-L-CH3とVL₃-L-CH3は、互いに連結されてVH₃/VL₃対を形成し、
2つの抗体定常ドメイン3（CH3）は、一方のCH3に突然変異T366Wと任意で突然変異S354Cとを導入し、かつそれぞれ他方のCH3に突然変異T366S、L368A、およびY407Vと任意で突然変異Y349Cとを導入することによって、ヘテロ二量体化を促進するように変更されており（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、
多重特異性抗体は抗体定常ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている。

一態様において、第3結合ドメインの第1および/または第2部分にはリンカーが存在しない（すなわち第3結合ドメインの第1部分は可変重鎖ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであり、第3結合ドメインの第2部分は可変軽鎖ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであるか、またはその逆である）。

一態様において、第1結合部位および第2結合部位は同じ標的または異なる標的に特異的に結合し、第3結合部位は第1結合部位および第2結合部位の標的とは異なる標的に特異的に結合する。

本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告する多重特異性抗体と細胞障害性作用物質とを含むイムノコンジュゲートである。

本明細書において報告する一局面は、本明細書において報告する多重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤である。

本明細書において報告する一局面は、医薬として使用するための本明細書において報告する多重特異性抗体である。

本明細書において報告する一局面は、医薬の製造における、本明細書において報告する多重特異性抗体の使用である。
[本発明1001]
3つの抗原結合部位を含みかつ2つの環状融合ポリペプチドからなる、多重特異性抗体であって、
（a）第1環状融合ポリペプチドが、第1結合ドメインの第1部分、第1結合ドメインの第2部分、および第3結合ドメインの第1部分を含み、ここで、
- 該第1結合ドメインの第1部分が、該第3結合ドメインの第1部分のN末端に直接または第1ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 該第1結合ドメインの第2部分が、該第3結合ドメインの第1部分のC末端に直接または第2ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 該第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH1-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL1-CL1）であり、ここで、該第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には該第1結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、かつ
- 該第1結合ドメインの第1部分と該第1結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第1抗原結合部位であり、
（b）第2環状融合ポリペプチドが、第2結合ドメインの第1部分、第2結合ドメインの第2部分、および該第3結合ドメインの第2部分を含み、ここで、
- 該第2結合ドメインの第1部分が、該第3結合ドメインの第2部分のN末端に直接または第3ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 該第2結合ドメインの第2部分が、該第3結合ドメインの第2部分のC末端に直接または第4ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 該第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH2-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL2-CL1）であり、ここで、該第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には該第2結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
- 該第2結合ドメインの第1部分と該第2結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第2抗原結合部位であり、
（c）該第3結合ドメインの第1部分と該第3結合ドメインの第2部分が全体として第3抗原結合部位であり、ここで、
- 該第3結合ドメインの第1部分が、可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VH3-CH3）または可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VL3-CH3）のどちらか一方であり、
- 該第2結合ドメインの第1部分が可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドである場合には該第3結合ドメインの第2部分が可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- 該第3結合ドメインの第1部分と該第3結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第3抗原結合部位を形成し、
2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
（i）一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、もしくは
一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、または
（ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、または
（iv）（i）および（ii）の改変の両方によって、
ヘテロ二量体化を促進するように変更されており、
該多重特異性抗体が定常重鎖ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている、
該多重特異性抗体。
[本発明1002]
前記第1抗原結合部位および/または前記第2抗原結合部位および/または前記第3抗原結合部位が互いに独立して、VHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化されている、本発明1001の多重特異性抗体:
- VHの44番目およびVLの100番目、
- VHの105番目およびVLの43番目、または
- VHの101番目およびVLの100番目。
[本発明1003]
前記第1ペプチド性リンカー、第2ペプチド性リンカー、第3ペプチド性リンカー、および第4ペプチド性リンカーが、少なくとも5個のアミノ酸のペプチドである、本発明1001または1002の多重特異性抗体。
[本発明1004]
前記第1ペプチド性リンカーおよび第3ペプチド性リンカーがSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有し、かつ前記第2ペプチド性リンカーおよび第4ペプチド性リンカーがSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する、本発明1001～1003のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1005]
VH3ドメインのC末端が一方のCH3ドメインのN末端に直接接続されており、かつVL3ドメインのC末端が他方のCH3ドメインのN末端に直接接続されている、本発明1001～1004のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1006]
三価である、本発明1001～1005のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1007]
二重特異性である（前記第1結合部位が第1抗原に結合し、前記第2結合部位が第2抗原に結合し、かつ前記第3結合部位が第3抗原に結合し、ここで、第1抗原、第2抗原、および第3抗原のうちの2つが同じ抗原でありかつ残りの抗原が異なる抗原である）か、または、三重特異性である（前記第1結合部位が第1抗原に結合し、前記第2結合部位が第2抗原に結合し、かつ前記第3結合部位が第3抗原に結合し、ここで、第1抗原、第2抗原、および第3抗原が異なる抗原である）、本発明1001～1006のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1008]
前記第1結合ドメインの第1部分と該第1結合ドメインの第2部分が、ジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ/または前記第2結合ドメインの第1部分と該第2結合ドメインの第2部分がジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されている、本発明1001～1007のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1009]
前記第3結合部位がヒトCD3に特異的に結合する、本発明1001～1008のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1010]
以下の工程を含む、本発明1001～1009のいずれかの多重特異性抗体の調製のための方法:
- 該多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
- 該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
- 宿主細胞培養物から該多重特異性抗体を回収する工程。
[本発明1011]
本発明1010の方法によって産生される多重特異性抗体。
[本発明1012]
本発明1001～1009のいずれかの多重特異性抗体のポリペプチドをコードする一組の核酸。
[本発明1013]
本発明1012の核酸を含む発現ベクター、または、それぞれが本発明1012の核酸のうちの1つを含む一組の発現ベクター。
[本発明1014]
本発明1012の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1015]
少なくとも1つの薬学的に許容される担体と任意で組み合わせて本発明1001～1009のいずれかの多重特異性抗体を含む、薬学的組成物。

発明の詳細な説明
I. 定義
ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）二量体化モジュールおよび抗体工学におけるそれらの使用は、Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996 , pp.73-73(1)に記載されている。

ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に与えられている。

本明細書において使用する場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、κアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabatナンバリングシステム（647～660頁参照）が使用され、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661～723頁参照）が使用され、この場合、本明細書では、「ナンバリングはKabat EUインデックスに従う」ということによってさらに明確にされる）。

本発明の実行に有用な方法および手法は、例えばAusubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I～III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IおよびII (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited（1986）; Watson, J.D., et al, Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, EX., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)に記載されている。

組換えDNA技術の使用により、核酸の誘導体の生成が可能になる。そのような誘導体は、例えば、個々のヌクレオチド位置またはいくつかのヌクレオチド位置が、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって改変されることができる。この改変および誘導体化は、例えば部位特異的突然変異誘発法を使って実行することができる。当業者は、そのような改変を容易に実行することができる（例えばSambrook, J., et al, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach（1985）IRL Press, Oxford, England参照）。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「細胞（a cell）」と書いた場合、それは、複数のそのような細胞および当業者に公知のそれらの等価物を包含する、などとなる。同様に、「1つの（a）」（または「1つの（an）」）、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書では、相互可換的に使用されうる。「を含む（comprising）」、「を包含する（including）」および「を有する（having）」という用語が、相互可換的に使用されうることにも留意されたい。

「約」という用語は、その後ろに続く数値の±20％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±10％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±5％の範囲を表す。

「アフィニティー」とは、ある分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の総計の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書において使用する場合、「結合アフィニティー」は、結合対のメンバー（例えば抗体と抗原）間の1:1相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティーは、一般に、解離定数（kd）によって表すことができる。アフィニティーは、本明細書に記載する方法を含む、当技術分野において公知の一般的方法によって測定することができる。

「抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）」という用語はFc受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下で抗体Fc領域によって媒介される標的細胞の溶解を指す。ADCCは、一態様では、新鮮単離PBMC（末梢血単核球）などのエフェクター細胞の存在下または単球もしくはNK（ナチュラルキラー）細胞のようなバフィーコートからの精製エフェクター細胞の存在下で、標的を発現する赤血球系細胞（例えば組換え標的を発現するK562細胞）の調製物を、本明細書において報告するFc領域を含む多環状融合ポリペプチドで処理することによって測定される。標的細胞をCr-51で標識してから、多環状融合ポリペプチドと共にインキュベートする。標識細胞をエフェクター細胞と共にインキュベートし、放出されたCr-51について上清を分析する。対照には、標的内皮細胞を多環状融合ポリペプチドなしでエフェクター細胞と共にインキュベートすることを含める。FcγRIおよび/またはFcγRIIAを組換え発現する細胞または（本質的にFcγRIIIAを発現する）NK細胞などのFcγ受容体発現細胞への結合を測定することによって、ADCCを媒介する初期段階を誘発する多環状融合ポリペプチドの能力を調べる。好ましい一態様では、NK細胞上のFcγRへの結合を測定する。

「に結合する」という用語は、結合部位のその標的への結合、例えば抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（VH/VL対）を含む抗体結合部位のそれぞれの抗原への結合を表す。この結合は、例えばBIAcore（登録商標）アッセイ（GE Healthcare、スウェーデン、ウプサラ）を使って、決定することができる。

例えば、BIAcore（登録商標）アッセイの考えうる一態様では、抗原を表面に結合し、表面プラズモン共鳴（SPR）によって抗体結合部位の結合を測定する。結合のアフィニティーは、ka（会合定数:複合体を形成する会合に関する速度定数）、kd（解離定数:複合体の解離に関する速度定数）およびKD（kd/ka）の各項によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、リファレンスの応答シグナルと直接比較することができる。

「BiFab」という用語は、互いに連結している2対のV₁-C₁/V₂-C₂を含む分子を表し、ここでVは抗体可変ドメインを表し、Cは抗体定常ドメインを表す。例えば、これらの対はVH₁-CH1/VL₁-CLおよびVH₂-CH3₁/VL₂-CH3₂であることができる。同様に、「TriFab」という用語は、互いに連結している3対のV₁-C₁/V₂-C₂を含む分子を表し、ここでVは抗体可変ドメインを表し、Cは抗体定常ドメインを表す。例えば、これらの対はVH₁-CH1/VL₁-CL、VH₂-CH1/VL₂-CL、およびVH₃-CH3₁/VL₃-CH3₂であることができる。

「CH1ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置118からEU位置215まで（EUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH1ドメインは

のアミノ酸配列を含む。

「CH2ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置231からEU位置340まで（KabatによるEUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH2ドメインは

のアミノ酸配列を含む。CH2ドメインは、別のドメインと密接には対を形成していない点でユニークである。むしろ、無傷のネイティブFc領域の2つのCH2ドメインの間には、2つのN結合型分岐糖質鎖が差し挟まれている。この糖質はドメイン-ドメイン対形成の代用となって、CH2ドメインの安定化に役立つことができると推測されている。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。

「CH3ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置341からEU位置446までにわたる部分を表す。一態様において、CH3ドメインは

のアミノ酸配列を含む。

本明細書において使用する「細胞障害性作用物質」という用語は、細胞機能を阻害もしくは妨げ、かつ/または細胞の死または破壊を引き起こす物質を指す。細胞障害性作用物質としては、放射性同位体（例えばAt-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、Pb-212、およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）;成長阻害性作用物質;酵素およびそれらのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物、または動物由来の低分子量毒素または酵素活性毒素（それらのフラグメントおよび/またはバリアントを含む）;ならびに以下に開示するさまざまな抗腫瘍作用物質または抗がん作用物質が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体の存在下で、本明細書において報告する抗体のFc領域によって誘発される細胞の溶解を指す。CDCは、一態様では、標的を発現するヒト内皮細胞を、補体の存在下で、本明細書において報告する多環状融合ポリペプチドで処理することによって測定される。一態様では、細胞をカルセインで標識する。多環状融合ポリペプチドが、30μg/mlの濃度で20％またはそれ以上の標的細胞の溶解を誘発するのであれば、CDCが見いだされる。補体因子C1qへの結合はELISAにおいて測定することができる。そのようなアッセイでは、原則として、ある濃度範囲の多環状融合ポリペプチドでELISAプレートをコーティングし、そこに精製ヒトC1qまたはヒト血清を加える。C1q結合は、C1qに対する抗体とそれに続くペルオキシダーゼ標識コンジュゲートによって検出される。結合の検出（最大結合Bmax）は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート]）に関して、405nmにおける光学密度（OD405）として測定される。

「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指し、それが由来する抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）; Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;貪食;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション;およびB細胞活性化が挙げられる。

Fc受容体結合依存的エフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるFc受容体（FcR）との相互作用によって媒介されうる。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の貪食による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）による赤血球およびFc領域を提示する他のさまざまな細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解とを、どちらも媒介することが示されている（例えばVan de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524参照）。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれぞれの特異性によって規定され、IgGタイプのFc領域に対するFc受容体はFcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えばRavetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al, Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al, J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載されている。

IgGタイプの抗体のFc領域に対する受容体（FcγR）の架橋は、貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害、および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の調節を含む、多種多様なエフェクター機能の引き金を引く。ヒトでは、3つのFcγRクラスが特徴決定されており、それらは以下のとおりである。
- FcγRI（CD64）は、単量体IgGに高いアフィニティーで結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、およびP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つにおけるIgGのFc領域中の改変は、FcγRIへの結合を低減する。IgG1およびIgG4中に置換された233～236番目のIgG2残基は、FcγRIへの結合を10³分の1に低減し、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
- FcγRII（CD32）は、複合体化したIgGに、中～低アフィニティーで結合し、広く発現している。この受容体は2つのサブタイプFcγRIIAおよびFcγRIIBに分けることができる。FcγRIIAは、死滅に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）に見いだされ、死滅プロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、B細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球上に見いだされる。これは、B細胞上では、さらなる免疫グロブリン産生および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制する機能を果たすようである。FcγRIIBは、マクロファージ上では、FcγRIIAによって媒介される貪食を阻害するように作用する。このB型は、好酸球および肥満細胞上では、IgEがその別個の受容体に結合することによるこれらの細胞の活性化を抑制するのに役立ちうる。FcγRIIAに対する結合の低減は、例えばアミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、およびK414（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
- FcγRIII（CD16）は中～低アフィニティーでIgGに結合し、2つのタイプが存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好中球ならびに一部の単球およびT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球に高発現している。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えばアミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、およびD376（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。

Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、上述の突然変異部位ならびにFcγRIおよびFcγRIIAへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載されている。

作用物質、例えば薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療結果または予防結果を達成するのに、必要な投薬量および期間で、有効な量を指す。

「エピトープ」という用語は、所与の標的のうち、その標的と結合部位との間の特異的結合に要求される部分を指す。エピトープは、連続的である場合、すなわち標的中に存在する隣り合った構造要素によって形成される場合もあるか、または、不連続である場合、すなわち標的の一次配列中では、例えば標的としてのタンパク質のアミノ酸配列中では、異なる位置にあるが、体液などの自然環境中で標的がとる三次元構造中では近接している構造要素によって形成される場合もある。

本明細書において使用する「Fc受容体」という用語は、受容体に付随する細胞質ITAM配列の存在を特徴とする活性化受容体を指す（例えばRavetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290参照）。そのような受容体はFcγRI、FcγRIIA、およびFcγRIIIAである。「FcγRの結合がない」という用語は、10μg/mlの抗体濃度において、NK細胞への本明細書において報告する抗体の結合が、WO 2006/029879において報告されている抗OX40L抗体LC.001について見いだされる結合の10％またはそれ未満であることを表す。

IgG4は低減したFcR結合を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。ただし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc糖質の喪失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435は、変更された場合、同様に低減したFcR結合を与える残基である（Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324;およびEP 0 307 434）。

「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖中でCH1ドメインとCH2ドメインとを接合している部分、例えばKabatのEUナンバーシステム（number system）で216番目あたりから230番目あたりまで、またはKabatのEUナンバーシステムで226番目あたりから230番目あたりまでを表す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基との整列によって決定することができる。

ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般的には、約25個のアミノ酸残基を含み、かつ、フレキシブルであり、付随する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、3つのドメイン、すなわち上部（upper）、中央（middle）、および下部（lower）ヒンジドメインに細分することができる（例えばRoux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083参照）。

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書では相互可換的に使用されて、ネイティブ抗体構造と実質的に類似する構造を有する抗体を指す。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は、相互可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、それらには、初代形質転換細胞とそこから派生する子孫とが継代数を問わずに包含される。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異型子孫は、本明細書に包含される。

「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の分子、例えば限定するわけではないが細胞障害性作用物質などにコンジュゲートされた、本明細書において報告する多重特異性抗体である。

「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物として、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の態様において、個体または対象はヒトである。

「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体純度を評価するための方法に関する総説として、例えばFlatman, S. et al, J. Chrom. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸を通常含有する細胞に含まれている核酸分子が包含されるが、この核酸分子は染色体外に存在するか、その天然の染色体位置とは異なる染色体上の位置に存在する。

「重鎖」という用語は、（N末端からC末端に向かって）重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、ヒンジ領域、抗体定常ドメイン2（CH2）および抗体定常ドメイン3（CH3）を含む、ネイティブIgG抗体の長い方のポリペプチド鎖を表す。抗体またはFc領域の「クラス」は、重鎖またはそのフラグメントが保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「軽鎖」という用語は、軽鎖可変ドメイン（VL）および軽鎖定常ドメイン（CL）を（N末端からC末端への方向で）含む、ネイティブIgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を表す。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つのタイプのうちの一方に割り当てることができる。ヒトκ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:04を、またヒトλ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:05を参照されたい。

本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の突然変異を含有しまたはモノクローナル抗体の産生時に生じ、存在量が一般に少量である、バリアント抗体などといった考えうるバリアント抗体を除けば、該集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、何か特定の方法による抗体の産生を必要とするとみなしてはならない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を用いる方法などといったさまざまな手法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法は、本明細書において説明する。

「ネイキッド多重特異性抗体」とは、何らかの部分（例えば細胞障害性部分）または放射性ラベルにコンジュゲートされていない多重特異性抗体を指す。ネイキッド多重特異性抗体は薬学的製剤中に存在しうる。

「ネイティブ抗体」とは、さまざまな構造を有する天然の免疫グロブリン分子を指す。例えばネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう可変領域（VH）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）とを有し、第1定常ドメインと第2定常ドメインとの間にヒンジ領域が位置する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう可変領域（VL）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つのタイプのうちの一方に割り当てることができる。

「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれており、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、および/または当該治療製品の使用上の注意に関する情報を含んでいる、説明書を指すために使用される。

「パラトープ」という用語は、所与の抗体分子のうち、標的と結合部位との間の特異的結合に必要な部分を指す。パラトープは、連続的である場合、すなわち結合部位中に存在する隣り合ったアミノ酸残基によって形成される場合もあるし、不連続である場合、すなわちアミノ酸残基の一次配列中では、例えばアミノ酸残基のCDRのアミノ酸配列中では、異なる位置にあるが、結合部位がとる三次元構造中では近接しているアミノ酸残基によって形成される場合もある。

「ペプチド性リンカー」という用語は、天然起源および/または合成起源のリンカーを表す。ペプチド性リンカーは、20種類の天然アミノ酸を、ペプチド結合によって接続されるモノマービルディングブロックとする、アミノ酸の線状鎖からなる。この鎖は、1～50個のアミノ酸残基、好ましくは1～28個のアミノ酸残基、とりわけ好ましくは3～25個のアミノ酸残基の長さを有する。ペプチド性リンカーは、反復アミノ酸配列または天然ポリペプチドの配列を含有しうる。ペプチド性リンカーは、環状融合ポリペプチドのドメインが正しく折りたたまれることおよびドメインが適正に提示されることを可能にすることによって、それらのドメインがそれぞれの生物学的活性を発揮できることを保証する機能を有する。好ましくは、ペプチド性リンカーは、グリシン、グルタミン、および/またはセリン残基に富むように設計された「合成ペプチド性リンカー」である。これらの残基は、例えば、

などの、5個のアミノ酸までの小さな繰り返し単位で、配置される。この小さな繰り返し単位は、2～5回繰り返して、例えば

などのマルチマー単位を形成することができる。マルチマー単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端には、任意の天然アミノ酸を6個まで追加することができる。他の合成ペプチド性リンカーは、例えば、リンカー

中のセリンなどの、10～20回繰り返される単一アミノ酸で構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に任意の天然アミノ酸をさらに6個まで含みうる。すべてのペプチド性リンカーは核酸分子によってコードすることができるので、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるから、抗融合性ペプチド（antifusogenic peptide）は、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合によって、リンカーに接続される。

「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、かつその製剤を投与されることになる対象にとって許容できないほどに毒性な追加の構成成分を含有しない、調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において使用する場合、「処置（treatment）」（およびその文法上の変形、例えば「処置する（treat）」または「処置すること（treating）」）は、処置される個体の自然の過程を変化させようとする臨床的介入を指し、これは、予防のために行うか、臨床的病変の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度を減じること、疾患状態の改善または一時的軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発達を遅延させるためまたは疾患の進行を遅くするために使用される。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体重鎖または抗体軽鎖のうち、抗原への抗体の結合に関与するドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる（例えばKindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007) 91頁参照）。抗原結合特異性を付与するには単一のVHドメインまたはVLドメインで十分でありうる。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVHドメインまたはVLドメインを使ってそれぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、単離することができる（例えばPortolano, S., et al, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al, Nature 352 (1991) 624-628参照）。

本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも包含する。ある特定のベクターは、それらが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有する。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」という。

以下に、構造と特異性が異なるポリペプチドを使って、本発明を例示する。これらは本発明を例示するために提示されるにすぎない。これを限定と解釈する必要はない。真の範囲は特許請求の範囲に記載される。

II. 本明細書において報告する多重特異性抗体
本明細書において、それぞれがVH/VL対を含む2つの環状融合ポリペプチドを含み、それによって第1結合部位および第2結合部位を含む、多重特異性抗体であって、2つの環状融合ポリペプチドの会合により第3 VH/VL対が形成され、それによって第3結合部位が形成される、多重特異性抗体を報告する。

本発明は、少なくとも部分的には、（完全長）重鎖のC末端への軽鎖可変ドメインの融合、または完全長軽鎖への重鎖可変ドメインの融合が、同じポリペプチドのそれぞれVHドメインおよびVLドメイン（VH/VL対）を含む機能的結合部位の形成をもたらすという発見、すなわち単一ポリペプチド鎖内での可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとの対が、鎖内環化によって、機能的VH/VL対を形成し、そしてそれにより、機能的結合部位を形成するという発見に基づいている。この環状ポリペプチドにおいて、N末端部は結合ドメインの第1部分を含み、C末端部は結合ドメインの第2部分を含む。結合ドメインの第1部分と結合ドメインの第2部分は（互いに連結して）完全なまたは機能的な結合部位を形成する。これにより、ポリペプチドは環化する。

本発明は、少なくとも部分的には、2つの環状融合ポリペプチドを含む多重特異性抗体であって、それら環状融合ポリペプチドのそれぞれがVH/VL対によって形成される機能的結合部位を含み、さらに1つの結合部位が該2つの環状融合ポリペプチドの会合によって形成される、多重特異性抗体を、提供することができるという発見に基づいている。

本発明は、少なくとも部分的には、個々の抗体可変ドメインを第3結合ドメインの部分およびヘテロ二量体化ドメインの融合ポリペプチドのそれぞれN末端およびC末端に接続するペプチド性リンカーの長さを改変することにより、結果として生じる多重特異性抗体において環状融合ポリペプチドによって形成される2つの結合部位のジオメトリ/距離を調節することが可能であるという発見に基づいている。

本発明は、少なくとも部分的には、二量体の、すなわち二環状の融合ポリペプチドの結合ジオメトリが、第1/第3リンカーおよび第2/第4リンカーの長さ（すなわちリンカー長比）に応じて変えられうるという発見に基づいている。これにより、2つのFab様結合アームの相対的なジオメトリを固定することが可能である。

本明細書において、3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、
（a）第1抗原結合部位が、第1結合ドメインの第1部分と、第1結合ドメインの第2部分と第3結合ドメインの第1部分とを含む第1環状融合ポリペプチドによって形成され、ここで、
- 第1結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第1部分のN末端に直接または第1ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第1部分のC末端に直接または第2ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）であり、ここで、第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第1結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
- 第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第1抗原結合部位を形成し、
（b）第2抗原結合部位が、第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分と第3結合ドメインの第2部分とを含む第2環状融合ポリペプチドによって形成され、ここで、
- 第2結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第2部分のN末端に直接または第3ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第2部分のC末端に直接または第4ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）であり、ここで、第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第2結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
- 第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第2抗原結合部位を形成し、
（c）第3抗原結合部位が、第3結合ドメインの第1部分および第3結合ドメインの第2部分によって形成され、ここで、
- 第3結合ドメインの第1部分が、可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VH₃-CH3）、または可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VL₃-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1環状融合ポリペプチド中の第2結合ドメインの第1部分が可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドである場合には第3結合ドメインの第2部分が可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- 第3結合ドメインの第1部分と第3結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第3抗原結合部位を形成し、
2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
（i）一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置され可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、もしくは
一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、または
（ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、または
（iii）（i）および（ii）の改変の両方によって、
ヘテロ二量体化を促進するように変更されており、
多重特異性抗体が定常重鎖ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている、
多重特異性抗体が開示される。

一態様において、多重特異性抗体は3つの抗原結合部位を含み、
（a）第1抗原結合部位は、第1環状融合ポリペプチドの第1抗体重鎖可変ドメイン（VH₁）と第1抗体軽鎖可変ドメイン（VL₁）との対（VH₁/VL₁対）によって形成され、ここで、
- VH₁は第1重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）の一部であり、かつVL₁は第1軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）の一部であり、
- VH₁-CH1は、第1ペプチド性リンカーを介して第1可変ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-L-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₁-CLは第2ペプチド性リンカーを介して第1 V₃-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₁-CH1とVL₁-CLは、互いに連結されてVH₁/VL₁対を形成し、
（b）第2抗原結合部位は、第2環状融合ポリペプチドの第2抗体重鎖可変ドメイン（VH₂）と第2抗体軽鎖可変ドメイン（VL₂）との対（VH₂/VL₂対）によって形成され、ここで、
- VH₂は第2重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）の一部であり、かつVL₂は第2軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）の一部であり、
- VH₂-CH1は、第3ペプチド性リンカーを介して第2可変ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-L-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₂-CLは、第4ペプチド性リンカーを介して第2 V₃-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₂-CH1とVL₂-CLは、互いに連結されてVH₂/VL₂対を形成し、
（c）第3抗原結合部位は第1 V₃-L-CH3および第2 V₃-L-CH3によって形成され、ここで、
- 第1 V₃-L-CH3は、可変重鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VH₃-L-CH3）、または可変軽鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VL₃-L-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1 V₃-L-CH3が可変軽鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドである場合には第2 V₃-L-CH3は可変重鎖ドメイン-リンカー-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- VH₃-L-CH3とVL₃-L-CH3は、互いに連結されてVH₃/VL₃対を形成し、
2つの抗体定常ドメイン3（CH3）は、一方のCH3に突然変異T366Wと任意で突然変異S354Cとを導入し、それぞれ他方のCH3に突然変異T366S、L368A、およびY407Vと任意で突然変異Y349Cとを導入することによって、ヘテロ二量体化を促進するように変更されており（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、
多重特異性抗体は抗体定常ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている。

第1および/または第2結合ドメインの第1部分とそのそれぞれの第2部分は、非共有結合的または共有結合的に、互いに連結されうる。連結が共有結合的である場合、それはペプチド結合以外の結合によるもの、例えばジスルフィド結合によるものである。

本明細書において報告する多重特異性抗体に含有される環状融合ポリペプチドはそれぞれ単鎖ポリペプチドである。単離された環状融合ポリペプチドの一般構造を図1に示す。

本明細書において報告する多重特異性抗体は、第1環状融合ポリペプチドと第2環状融合ポリペプチドとを含む二量体環状融合ポリペプチドに基づく。すなわちこれは二環状であり、第1環状融合ポリペプチドと第2環状融合ポリペプチドは同一であるか、または相違する。

本明細書において報告する多重特異性抗体の環状融合ポリペプチドは、N末端およびC末端に融合されているそれぞれの結合ドメインの部分の他に、第3結合部位の部分とヘテロ二量体化ドメインとを含むコア領域も含む。この場合、コア領域の構造的特性は二量体化機能性の提供である。第1環状融合ポリペプチドのヘテロ二量体化ドメインは、少なくとも1つの非ペプチド結合によって、一態様では少なくとも1つのジスルフィド結合によって、第2環状融合ポリペプチドのヘテロ二量体化ドメインにコンジュゲートされうる。

本明細書における基本的二環状融合ポリペプチドはコントースボディ（Contorsbody）とも呼ばれる。二環状融合ポリペプチド/コントースボディの一般構造を図2に示す。

普通のIgG抗体と比較して、コントースボディは、結合部位（VH/VL対）を提供するのに、重鎖と軽鎖ではなく、鎖を1本しか使用していない。本明細書において報告するコントースボディベースの多重特異性抗体の特殊性は、2つの環状融合ポリペプチドの二量体化によって第3結合部位（VH/VL対）が形成され、この第3結合部位/結合ドメインの部分が重鎖Fabフラグメントと軽鎖Fabフラグメントとの間に位置することである。

以下に、第3結合部位を有さない二量体環状融合ポリペプチドを使って、本明細書において報告する多重特異性抗体の基礎を成す二環状融合ポリペプチドの特別な特性を示す。Fabフラグメントだけでなく、単離された可変ドメインも、結合部位の部分として使用することができるだろう。

この例では、重鎖Fabフラグメントと軽鎖Fabフラグメントの間に二量体化ドメインとして「ヒンジ-CH2-CH3」ドメインを有する単鎖融合ポリペプチドが、それらのFc領域を介して二量体化し、2つのFabは互いに対してそれぞれの配向に固定される。対照的に、普通のIgGタイプ抗体では、2つのFabは、よりフレキシブルであり、かつまったく異なって配向される。

コントースボディでは、使用するリンカーの長さによって、2つの結合部位の互いの相対的ジオメトリを調整することができる。IgGタイプの普通の抗体と、本明細書において報告する多重特異性抗体の基礎を成す二環状融合ポリペプチドの、結合部位間の配向および空間的距離を図3に示す。

IgGタイプの通常の抗体の結合部位間の空間的距離は約80Å（オングストローム）またはそれ以上である。本明細書において報告する二環状融合ポリペプチドの結合部位間の空間的距離は、二環状融合ポリペプチドを形成している個々の環状融合ポリペプチドにおけるペプチド性リンカーの長さおよび長さの比に応じて、約20Å～約50Åの間であることができる。意図したジオメトリに応じてペプチド性リンカーが選択される。一態様において、第1～第4ペプチド性リンカーは、SEQ ID NO:06～SEQ ID NO:22からなるペプチド性リンカーの群から、互いに独立して選択される。

II.1. 二環状融合ポリペプチドから形成される単一特異性二価の比較抗体
単一特異性二環状融合ポリペプチドは、2つの環状融合ポリペプチドを含み、それら環状融合ポリペプチドのそれぞれは、同じ標的上の同じエピトープに特異的に結合する、すなわち同じ結合部位を含む。

例示的な単一特異性二環状融合ポリペプチドは抗Her2コントースボディ（SEQ ID NO:23の環状融合ポリペプチドを含む）である。これは、環状融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを、HEK293細胞にトランスフェクトすることによって産生された。

培養上清のFc領域含有部分を抽出するには、通常のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーが適していることが見いだされた。あるいは、精製用にGSGペプチド性リンカーを介して接続されたヘキサヒスチジンC末端タグ（SEQ ID NO:24）を使用することができる。

第2精製工程では、主として環状融合ポリペプチドの高次構造物である生成物関連不純物（IgGタイプの抗体についても同様であるように、わずかな凝集体もクロマトグラムにみられる）から環状融合ポリペプチドを分離するために、分取用サイズ排除クロマトグラフィーを使用した（例えば図4参照）。このような構築物の典型的な収量は平均すると10mg/リットルである。抗Her2コントースボディをいくつかのバッチで発現させた（0.5リットル～2リットル振とうフラスコ規模）。生成物品質を質量分析によって分析した（図5参照）。生成物の実体は95％超の純度グレードで確認された。

抗Her2コントースボディの結合は、分子のアフィニティーおよびアビディティを通常のIgGタイプの抗Her2抗体と比較して評価するために2つの異なる設定で、表面プラズモン共鳴（SPR、例えばBIAcore）を使って決定した。

第1設定（以下の表の1;アフィニティー用）では、SPRチップ表面にコンジュゲートされた抗ヒトFc領域抗体によって、各抗Her2コントースボディを捕捉した。分析物としてHer2細胞外ドメイン（ECD）を使用した。第2設定（以下の表の2;アビディティ用）では、抗Her2抗体ペルツズマブ（Perjeta（登録商標）として市販されている）をチップ表面に固定化し、Her2のECDをそれによって捕捉した。分析物として各コントースボディを使用した。分析物の濃度系列を使って、IgGタイプリファレンス抗体トラスツズマブ、二価抗Her2コントースボディのアビディティを測定した。どちらの設定でもリファレンスとして抗Her2抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）として市販されている）を使用した。

コントースボディは通常のIgGタイプの抗体と比較してはるかにコンパクトである。

抗Her2コントースボディを増殖アッセイにおいて試験した。化学的に架橋されたトラスツズマブFabを使用したScheerら（Scheer et al, PLoS One 7 (2012) e51817）と同様に、抗Her2コントースボディは、細胞表面の受容体を動員し、活性化シグナルを促進した。トラスツズマブは、受容体ストークドメイン上に位置するHer2エピトープに対する結合物質であり、受容体を互いに離れた状態に保ち、その結果、増殖を拮抗している。トラスツズマブおよび二環状抗Her2コントースボディはそれぞれ抗増殖性および増殖促進性であることを示している。

抗Her2コントースボディのFcRn受容体に結合する能力を決定した。IgGタイプIgG1サブクラスの抗体であるトラスツズマブと比較して、ヒトFcRn受容体に対する抗Her2コントースボディの結合は驚くほど高く、二環状コントースボディではおよそ10倍であった（図8A参照）。カニクイザルFcRnに対して、トラスツズマブおよびコントースボディは、同様に挙動し、二量体コントースボディはトラスツズマブより4.5倍親和性が高い。

トリプトファン自己蛍光によると、第1熱変性温度T_m1は、コントースボディの場合、約63℃である。静的光散乱を使って、約66℃という凝集開始温度が、コントースボディについて決定された。動的光散乱を使って、約66℃という凝集開始温度が、コントースボディについて決定された。どの実験でも、製剤は20mM His/His＊HCl、140mM NaCl中の1mg/mLコントースボディとした。

混合Fabが形成されていないことは質量分析によって確認することができた。

二環状単一特異性コントースボディの他の例は、抗cMETコントースボディ（SEQ ID NO:25の環状融合ポリペプチド）および異なる可変ドメインを有する抗CD20コントースボディ（（1）SEQ ID NO:26の環状融合ポリペプチド;（2）SEQ ID NO:27の環状融合ポリペプチド）である。以下の表に、これらのコントースボディの発現率、収量、および品質を記載する。

コントースボディはいずれも、HEK-293細胞中で一過性に発現させ、収量は2～15mg/Lの範囲であった。プロテインAカラム後の生成物は85％超であり、SECカラムクロマトグラフィーによって副生成物から一般に96％超の純度まで精製される。

II.2. 二環状融合ポリペプチドから形成される二重特異性二価の比較抗体
二重特異性多環状融合ポリペプチドは、2つの環状融合ポリペプチドを含み、環状融合ポリペプチドのそれぞれは、異なる標的および/または同じ標的上の異なるエピトープに特異的に結合する、すなわち特異性が異なる少なくとも2つの結合部位を含む。

この理論に拘束されるわけではないが、単鎖ポリペプチド中の結合部位の対応するドメインの自己集合の方が、鎖間連結より優勢である、すなわち言い換えると、単一環状融合ポリペプチドの発現後は、結合部位の個々の非機能的ドメインが連結して、機能的結合部位を形成すると考えられる。例えば、機能的結合部位がFabである場合、Fab部分、すなわち重鎖フラグメント（VH-CH1）および軽鎖フラグメント（VL-CL）は、結合能を有する構成的なFab部分を形成し、集合したこの第1環状融合ポリペプチドの孤立した半抗体は、別の環状融合ポリペプチドと構成的に連結して、二環状融合ポリペプチド（2つの単一環状融合ポリペプチドの二量体を含むコントースボディ）を形成する。多重特異性多環状融合ポリペプチドを得るには、単離された環状融合ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進する必要がある。例示的なヘテロ二量体化促進要素の一つは、ノブ・イントゥ・ホール技術による突然変異である。

結果として生じる二重特異性コントースボディの2つの結合部位のジオメトリ/距離を変えるために、ペプチドリンカーの長さを改変することが可能であり、同じことは単一特異性コントースボディにもいえる。

結合部位相互の相対的位置を変化させることによって、結合部位のジオメトリ/距離を改変することができる。

例えば、結合部位としてのFabの場合、重鎖Fabフラグメントおよび軽鎖Fabフラグメントのドメインの配列は、逆にすること、すなわち例えば重鎖Fabフラグメントはそれぞれドメイン配列VH-CH1またはCH1-VH（N末端からC末端に向かって）を有すること、同様に軽鎖Fabフラグメントはドメイン配列VL-CLまたはCL-VL（N末端からC末端に向かって）を有すること、または混合状態であることができる。リンカーが、第3結合部位の一部とコアドメインの中央融合ポリペプチドの前後、すなわち、第3結合部位の一部と抗体定常ドメイン3の中央融合ポリペプチドの前後に存在するとすれば、Fabフラグメントは、コアドメインに対するその配向が限定される。結果として、VHドメインの相対的位置は、Fc領域に近いか（本明細書では「VH-in」と呼ぶ）、またはFc領域から離れているか（本明細書では「VH-out」と呼ぶ）になる（図6および図7参照）。

CrossMab技術、すなわち一つのアームにおけるドメイン交換を使って、集合挙動を改変することも可能である。これは、交換アームまたは非交換アームにおける電荷バリアントと、さらに組み合わせることができる。二重特異性二環状融合ポリペプチドの産生のために使用される各配向を有する抗cMET環状融合ポリペプチドの例示的な鎖を、図12に示す（これら異なる鎖の組み合わせのVH-out、VH-in、ならびにそれぞれの発現率、収量および品質を、以下の表に記載する）。

VH-out-ノブ＝SEQ ID NO:28、
VH-in-ノブ＝SEQ ID NO:29、
VH-out-ホール＝SEQ ID NO:30、
VH-out-ホール-CH-CL交差＝SEQ ID NO:31、
VH-in-ホール-VH-VL交差＝SEQ ID NO:32。

一般的に適用可能な、通常の二重特異性抗体を作製するための手法は、二重特異性二環状融合ポリペプチドを作製するためにも使用および採用することができる。

例えば多重特異性抗体を作製するための手法として、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540、WO 93/08829、およびTraunecker, A. et al, EMBO J.10 (1991) 3655-3659参照）、および「ノブ・イン・ホール」工学（例えばUS 5,731,168参照）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果を工作すること（WO 2009/089004）; 2つまたはそれ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えばUS 4,676,980およびBrennan, M. et al, Science 229 (1985) 81-83参照）;ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を産生すること（例えばKostelny, S.A. et al, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）;二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えばHolliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448参照）;および単鎖Fv（sFv）二量体を使用すること（例えばGruber, M et al, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374参照）;および例えばTutt, A. et al, J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように三重特異性抗体を調製することによって作製してもよい。

一般に、2つの結合部位の配向を固定するために幾何学的制約が要求されるたびに、コントースボディを使用することができる。

II.3 本発明に従って二環状融合ポリペプチドから形成される二重特異性および三重特異性の三価抗体
本発明の例示的多重特異性抗体のデザインおよび組成を図9に示す。3つの結合部位を含むそのような抗体はTriFabコントースボディと呼ぶことができる。

図9の下側の図から、TriFabコントースボディでは結合部位が反対の位置に配置されることがわかる。このようにTriFabコントースボディは、明確でかつ限定されたフレキシビリティを有する密に詰まった分子である。これは極めて特殊で明確なジオメトリを有する。これは、その抗原に結合すると、極性を有する磁石のように、2つの抗原（抗原を提示する細胞）を連結する。

例示的なTriFabコントースボディは抗LeY/ビオチン抗体である。これは、2つの環状融合ポリペプチドを含み、そのうちの1つは次のドメイン配列を有する:
抗LeY抗体VH-CH1-ペプチド性リンカー1-抗ビオチン抗体VL-リンカー-ノブ突然変異を有するCH3-ペプチド性リンカー2-抗LeY抗体VL-CL（κ）。

それぞれのアミノ酸配列をSEQ ID NO:34に列挙する。

第2の環状融合ポリペプチドは次のドメイン配列を有する:
抗LeY抗体VH-CH1-ペプチド性リンカー1-抗ビオチン抗体VL-リンカー-ホール突然変異を有するCH3-ペプチド性リンカー2-抗LeY抗体VL-CL（κ）。

それぞれのアミノ酸配列をSEQ ID NO:35に列挙する。

この分子は、実施例に記載の方法と同様にして発現され、精製された。

図10に、KappaSelectで精製した培養上清のSECおよびSDS-pageを示す。

分子の実体は、図11および以下の表のデータに示すように、MSによって確認された。

分子の機能性は、LeY-Bio TriFabコントースボディの二重特異性を実証するFACS分析によって確認された。TriFabコントースボディは、その抗LeY結合特異性によって細胞表面に結合する。細胞に結合したTriFabコントースボディは、その抗ビオチン結合部位による蛍光性ビオチン-Cy5コンジュゲートの捕捉により、FACS分析において検出可能になる。すなわち、細胞に付随するCy5シグナルは、両結合部位の、すなわち個々の環状融合ポリペプチド中に位置する結合部位と2つの環状融合ポリペプチドの二量体化によって形成される結合部位の、同時機能性を示す。FACSデータを図12に示す。

本明細書において、3つの抗原結合部位を含みかつ2つの環状融合ポリペプチドからなる、多重特異性抗体であって、
（a）第1環状融合ポリペプチドが、第1結合ドメインの第1部分、第1結合ドメインの第2部分、および第3結合ドメインの第1部分を含み、ここで、
- 第1結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第1部分のN末端に直接または第1ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第1部分のC末端に直接または第2ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）であり、ここで、第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第1結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
- 第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第1抗原結合部位であり、
（b）第2環状融合ポリペプチドが、第2結合ドメインの第1部分、第2結合ドメインの第2部分、および第3結合ドメインの第2部分を含み、ここで、
- 第2結合ドメインの第1部分が、第3結合ドメインの第2部分のN末端に直接または第3ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第2部分が、第3結合ドメインの第2部分のC末端に直接または第4ペプチド性リンカーを介して融合されており、
- 第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）であり、ここで、第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には第2結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
- 第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第2抗原結合部位であり、
（c）第3結合ドメインの第1部分と第3結合ドメインの第2部分が全体として第3抗原結合部位であり、ここで、
- 第3結合ドメインの第1部分が、可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VH₃-CH3）、または可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VL₃-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1環状融合ポリペプチド中の第2結合ドメインの第1部分が可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドである場合には第3結合ドメインの第2部分が可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- 第3結合ドメインの第1部分と第3結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第3抗原結合部位を形成し、
2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
（i）一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、もしくは
一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、または
（ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、または
（iii）（i）および（ii）の改変の両方によって、
ヘテロ二量体化を促進するように変更されており、
多重特異性抗体が定常重鎖ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている、
多重特異性抗体が開示される。

あらゆる局面の一態様において、第1環状融合ポリペプチドおよび第2環状融合ポリペプチドはそれぞれ、第3抗原結合ドメインの部分のN末端側に、ある結合ドメインの正確に1つの部分を含み、第3抗原結合ドメインの部分のC末端側に、該結合ドメインの正確に1つの、ただし異なる、部分を含む。

あらゆる局面の一態様において、第1環状融合ポリペプチド中の第1結合ドメインの第1部分と第1結合ドメインの第2部分は互いに共有結合的に連結され、かつ/または第2環状融合ポリペプチド中の第2結合ドメインの第1部分と第2結合ドメインの第2部分は互いに共有結合的に連結される。一態様において、共有結合的連結はペプチド結合以外の結合による。好ましい一態様において、共有結合的連結はジスルフィド結合による。

あらゆる局面の一態様において、
（i）第1結合部位または第2結合部位の第1部分のCH1ドメインのC末端は第3結合ドメインの部分のN末端にコンジュゲートされ、かつ第1結合部位または第2結合部位の第2部分のVLドメインのN末端は第3結合ドメインのC末端にコンジュゲートされるか、または
（ii）第1結合部位または第2結合部位の第1部分のVHドメインのC末端は第3結合ドメインの部分のN末端にコンジュゲートされ、かつ第1結合部位または第2結合部位の第2部分のCLドメインのN末端は第3結合ドメインのC末端にコンジュゲートされる。

あらゆる局面の一態様において、第3抗原結合部位は、VHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）に互いに独立してシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VHの44番目およびVLの100番目、
- VHの105番目およびVLの43番目、または
- VHの101番目およびVLの100番目。

あらゆる局面の一態様において、第1または第2結合ドメインの第1部分は抗体重鎖Fabフラグメント（VH＋CH1）であり、かつ該第1または第2結合ドメインの第2部分は抗体軽鎖Fabフラグメント（VL＋CL）であるか、またはその逆である。

あらゆる局面の一態様において、多重特異性抗体融合ポリペプチドはエフェクター機能を発揮する。一態様において、エフェクター機能はADCCまたは/およびCDCである。

あらゆる局面の一態様において、第1結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第1結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合され、ここで、第1ペプチド性リンカーと第2ペプチド性リンカーは互いに独立して選択される。

あらゆる局面の一態様において、第2結合ドメインの第1部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第1ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のN末端に融合され、第2結合ドメインの第2部分は、SEQ ID NO:16またはSEQ ID NO:17の第2ペプチド性リンカーを介して、第3結合ドメインの部分のC末端に融合され、ここで、第1ペプチド性リンカーと第2ペプチド性リンカーは互いに独立して選択される。

あらゆる局面の一態様において、各（環状）（単鎖）融合ポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、第3結合ドメインの部分の前（すなわち第3抗原結合ドメインの部分のN末端側）に正確に1つの抗体可変ドメインを含み、第3結合ドメインの部分の後（すなわち第3ドメインの部分のC末端側）に正確に1つの抗体可変ドメインを含む。

あらゆる局面の一態様において、標的は、細胞表面抗原であるか、または細胞表面受容体の可溶性リガンドである。

あらゆる局面の一態様において、結合ドメインはFab、DAF、または二重特異性Fabである。

あらゆる局面の一態様において、第1および/または第2結合ドメインは（通常の）Fabであり、結合ドメインの第1部分が、抗体重鎖可変ドメイン（VH）と第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1）の少なくともN末端フラグメント（または完全な第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1））とを含み、かつ結合ドメインのそれぞれ他方の部分が、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）と抗体軽鎖定常ドメイン（CL）の少なくともN末端フラグメント（または完全な抗体軽鎖定常ドメイン（CL））とを含むか、またはその逆である。一態様において、結合ドメインの第1部分はN末端からC末端に向かってVH-CH1を含み、かつ結合ドメインの第2部分はN末端からC末端に向かってVL-CLを含むか、またはその逆である。

あらゆる局面の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。

あらゆる局面の一態様において、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

あらゆる局面の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

あらゆる局面の一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはT366W突然変異（ノブ突然変異、ノブ側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異T366S、L368A、およびY407V（ホール突然変異、ホール側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

あらゆる局面の一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはT366W突然変異（ノブ突然変異、ノブ側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異T366S、L368A、およびY407V（ホール突然変異、ホール側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

あらゆる局面の一態様において、第3結合部位の一方のCH3ドメインはS354CおよびT366W突然変異（ノブ-cys突然変異、ノブ-cys側）を含み、第3結合部位の他方のCH3ドメインは突然変異Y349C、T366S、L368A、およびY407V（ホール-cys突然変異、ホール-cys側）を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本明細書において報告する一局面は、3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、
（a）第1抗原結合部位が、第1環状融合ポリペプチドの第1抗体重鎖可変ドメイン（VH₁）と第1抗体軽鎖可変ドメイン（VL₁）との対（VH₁/VL₁対）によって形成され、ここで、
- VH₁が第1重鎖Fabフラグメント（VH₁-CH1）の一部であり、かつVL₁が第1軽鎖Fabフラグメント（VL₁-CL）の一部であり、
- VH₁-CH1が、第1ペプチド性リンカーを介して第1可変ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₁-CLが第2ペプチド性リンカーを介して第1 V₃-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₁-CH1とVL₁-CLが、互いに連結されてVH₁/VL₁対を形成し、
（b）第2抗原結合部位が、第2環状融合ポリペプチドの第2抗体重鎖可変ドメイン（VH₂）と第2抗体軽鎖可変ドメイン（VL₂）との対（VH₂/VL₂対）によって形成され、ここで、
- VH₂が第2重鎖Fabフラグメント（VH₂-CH1）の一部であり、かつVL₂が第2軽鎖Fabフラグメント（VL₂-CL）の一部であり、
- VH₂-CH1が、第3ペプチド性リンカーを介して第2可変ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（V₃-CH3）のN末端またはC末端のどちらか一方にコンジュゲートされており、かつVL₂-CLが第4ペプチド性リンカーを介して第2 V₃-CH3のそれぞれの他端にコンジュゲートされており、
- VH₂-CH1とVL₂-CLが、互いに連結されてVH₂/VL₂対を形成し、
（c）第3抗原結合部位が第1 V₃-CH3および第2 V₃-CH3によって形成され、ここで、
- 第1 V₃-CH3が、可変重鎖-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VH₃-CH3）または可変軽鎖-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチド（VL₃-CH3）のどちらか一方であり、
- 第1 V₃-CH3が可変軽鎖-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドである場合には第2 V₃-CH3が可変重鎖-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
- VH₃-CH3とVL₃-CH3が、互いに連結されてVH₃/VL₃対を形成し、
一方のCH3に突然変異T366Wと任意で突然変異S354Cとを導入し、それぞれ他方のCH3に突然変異T366S、L368A、およびY407Vと任意で突然変異Y349Cとを導入することによって、2つの抗体定常ドメイン3（CH3）がヘテロ二量体化を促進するように変更されており（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、
多重特異性抗体が抗体定常ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている、
多重特異性抗体である。

一態様において、第3結合ドメインの第1および/または第2部分にはリンカーが存在しない（すなわち第3結合ドメインの第1部分は可変重鎖ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであり、第3結合ドメインの第2部分は可変軽鎖ドメイン-抗体定常ドメイン3融合ポリペプチドであるか、またはその逆である）。

一態様において、リンカーLはペプチド性リンカーである。一態様において、リンカーLはSEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する。

上記に列挙されていない他の態様もすべてこの局面に関係する。

本明細書において報告する一局面は、（少なくとも）3つの抗原結合VH/VL対を含む多重特異性抗体であり、
多重特異性抗体は、
（a）N末端からC末端に向かって
（i）第1可変重鎖ドメイン（VH₁）、
（ii）抗体重鎖定常ドメイン1（CH1）、
（iii）第1ペプチド性リンカー、
（iv）第2可変重鎖ドメイン（VH₂）、
（v）第1 CH3ドメイン（CH3₁）、
（vi）第2ペプチド性リンカー、
（vii）第1可変軽鎖ドメイン（VL₁）、および
（viii）抗体軽鎖定常ドメイン（CL）
を含む、第1環状融合ポリペプチドであって、
（i）および（vii）において特定されたドメインが、互いに連結されており、かつ第1抗原に特異的に結合する第1 VH/VL対である、第1環状融合ポリペプチドと、
（b）N末端からC末端に向かって
（i）第3可変重鎖ドメイン（VH₃）、
（ii）抗体重鎖定常ドメイン1（CH1）、
（iii）第3ペプチド性リンカー、
（iv）第2可変軽鎖ドメイン（VL₂）、
（v）第2 CH3ドメイン（CH3₂）、
（vi）第4ペプチド性リンカー、
（vii）第3可変軽鎖ドメイン（VL₃）、および
（viii）抗体軽鎖定常ドメイン（CL）
を含む第2環状融合ポリペプチドであって、
（i）および（vii）において特定されたドメインは互いに連結されており、かつ第2抗原に特異的に結合する第2 VH/VL対である、第2環状融合ポリペプチドと
を含み/それらからなり、
一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる第1 CH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる第2 CH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、CH3ドメインは、ヘテロ二量体化を促進するように変更されており、
（a）の（v）および（b）の（v）において特定されたドメインはジスルフィド結合によって互いにコンジュゲートされ（て、第1環状融合ポリペプチドと第2融合ポリペプチドの二量体を形成し）、かつ
（a）の（iv）および（b）の（iv）において特定されたドメインは、互いにコンジュゲートされており、かつ第3抗原に特異的に結合する第3 VH/VL対である。

一態様において、第1抗原と第2抗原は同じ抗原であり、かつ第3抗原はそれとは異なる抗原である。

上記に列挙されていない他の態様もすべてこの局面に関係する。

あらゆる局面の一態様において、第1結合部位および第2結合部位は同じ（第1）抗原に特異的に結合し、第3結合部位は異なる（第2）抗原に特異的に結合する。

あらゆる局面の一態様において、第1結合部位は第1抗原に特異的に結合し、第2結合部位は第2抗原に特異的に結合し、第3結合部位は第3抗原に特異的に結合し、ここで第1抗原、第2抗原、および第3抗原は異なる抗原である。

III. 結合部位
III.1. 抗体フラグメント由来の結合部位
ある特定の態様において、本明細書において報告する多重特異性抗体中の結合部位はそれぞれ、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体軽鎖可変ドメイン（VL）から構成される。

ある特定の態様において、多重特異性抗体の結合部位のうちの1つまたは2つは抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Fab、Fab'、Fab'-SHおよびFvフラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の抗体フラグメントに関する総説として、Hudson, P.J. et al, Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。scFvフラグメントの総説として、例えばPlueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore（eds.）, Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315を参照されたい。また、WO 93/16185; US 5,571,894およびUS 5,587,458も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、延長したインビボ半減期を有するFabフラグメントに関する議論については、US 5,869,046を参照されたい。

抗体フラグメントは「二重作用性Fab（Dual Acting Fab）」、すなわち「DAF」であることもできる（例えばUS 2008/0069820参照）。

抗体フラグメントは、本明細書に記載するように、さまざまな手法によって、例えば限定するわけではないがインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば大腸菌またはファージ）による産生などによって、作製することができる。

結合部位がFabである場合、Fabは通常のFab、DAF、または二重特異性Fabであることができる。

通常のFabの場合、結合ドメインの一方の部分は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）と第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1）の少なくともN末端フラグメント（または完全な第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1））とを含み、その結合ドメインのそれぞれ他方の部分は、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）と抗体軽鎖定常ドメイン（CL）の少なくともN末端フラグメント（または完全な抗体軽鎖定常ドメイン（CL））とを含む。これらのドメインの順序は、それらの連結および（機能的）結合部位の形成が可能である限り（すなわち妨げられない限り）、どの順序でもよい。

一態様において、結合ドメインの一方の部分は、N末端からC末端に向かって、VH-CH1を含み、かつ結合ドメインの他方の部分は、N末端からC末端に向かって、VL-CLを含む。

通常の二重特異性Fabの場合、結合ドメインの一方の部分は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）と第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1）の少なくともN末端フラグメント（または完全な第1抗体重鎖定常ドメイン（CH1））とを含み、それぞれ他方の結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）と抗体軽鎖定常ドメイン（CL）の少なくともN末端フラグメント（または完全な抗体軽鎖定常ドメイン（CL））とを含み、本明細書において該結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL）との相補的な対の中に2つの非オーバーラップパラトープを含み、第1パラトープは、VLドメインのCDR1およびCDR3ならびにVHドメインのCDR2からの残基を含み、第2パラトープは、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2からの残基を含む。

一態様において、第1パラトープは、VLドメインのCDR1およびCDR3ならびにVHドメインのCDR2からの残基を含み、第2パラトープは、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2からの残基を含む。

一態様において、結合部位の重鎖可変ドメインはヒトVH3ファミリー重鎖配列に基づき、結合部位の軽鎖可変ドメインはヒトVκ1ファミリー軽鎖配列に基づく。

一態様において、結合部位の重鎖可変ドメインはヒトVH3ファミリー重鎖配列に基づき、結合部位の軽鎖可変ドメインはヒトVλ1ファミリー軽鎖配列に基づく。

III.2. キメラ抗体由来およびヒト化抗体由来の結合部位
ある特定の態様において、多重特異性抗体中の結合部位のうちの1つまたは2つは、キメラ抗体、例えばヒト化抗体に由来するキメラドメインである。

「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメインFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、HVR配列とFR配列は一般にVH（またはVL）中に、以下の順序で現れる: FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。

本明細書において使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）、かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原接触残基（「抗原接触部」）を含有する領域のそれぞれを指す。一般に、抗体は6つのHVRを含み、3つはVHに（H1、H2、H3）、そして3つはVL（L1、L2、L3）中にある。

HVRは、
（a） アミノ酸残基26～32（L1）、50～52（L2）、91～96（L3）、26～32（H1）、53～55（H2）および96～101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）;
（b） アミノ酸残基24～34（L1）、50～56（L2）、89～97（L3）、31～35b（H1）、50～65（H2）および95～102（H3）に存在するCDR（Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）;
（c） アミノ酸残基27c～36（L1）、46～55（L2）、89～96（L3）、30～35b（H1）、47～58（H2）および93～101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)）;および
（d） アミノ酸残基46～56（L2）、47～56（L2）、48～56（L2）、49～56（L2）、26～35（H1）、26～35b（H1）、49～65（H2）、93～102（H3）および94～102（H3）を含む（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ
を含む。

別段の表示がある場合を除き、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばFR残基）は、本明細書では、前掲のKabatらに従ってナンバリングされる。

ある特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。通例、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティーを保ちつつヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えばCDR、（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、1つまたは複数の可変ドメインを含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば抗体の特異性またはアフィニティーを回復または改良するために、非ヒト抗体（例えばHVR残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含む抗体を指す。ある特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

ヒト化抗体およびそれらの作製方法については、例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に総説があり、例えばRiechmann, I. et al, Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321およびUS 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al, Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（SDR）移植に関する記載がある）; Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」に関する記載がある）; Dall'Acqua, W.F. et al, Methods 36 (2005) 43-60（「FRシャフリング」に関する記載がある）;ならびにOsbourn, J. et al, Methods 36 (2005) 61-68およびKlimka, A. et al, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（FRシャフリングへの「誘導選択（guided selection）」アプローチに関する記載がある）にも、さらに記載されている。

ヒト化に使用しうるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使って選択されるフレームワーク領域（例えばSims, M.J. et al., J. Immunol. 151（1993）2296-2308参照）;特定サブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289;およびPresta, L.G. et al, J. Immunol. 151（1993）2623-2632参照）;ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13（2008）1619-1633参照）;およびFRライブラリーのスクリーニングによって得られるフレームワーク領域（例えばBaca, M. et al, J. Biol. Chem. 272（1997）10678-10684およびRosok, M.J. et al, J. Biol. Chem. 271（19969 22611-22618参照）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

III.3. ヒト抗体由来の結合部位
ある特定の態様において、多重特異性抗体中の結合部位のうちの1つまたは2つは、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体軽鎖可変ドメイン（VL）から構成される。ある特定の態様において、可変ドメインはヒト抗体に由来する。

ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな手法を使って産生することができる。ヒト抗体は、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374およびLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459に概説されている。

ヒト抗体は、抗原による攻撃に応答して無傷のヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷の抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製しうる。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しており、それらは内在性免疫グロブリン遺伝子座と置き換わっているか、または染色体外に存在するか、もしくはその動物の染色体にランダムに組み込まれている。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法に関する総説として、Lonberg, N., Nat. Biotech. 23（2005）1117-1125を参照されたい。また、例えばXENOMOUSE（商標）技術が記載されているUS 6,075,181およびUS 6,150,584; HUMAB（登録商標）技術が記載されているUS 5,770,429; K-M MOUSE（登録商標）技術が記載されているUS 7,041,870; VELOCIMOUSE（登録商標）技術が記載されているUS 2007/0061900;免疫再構成マウスが記載されているWO 2007/131676も参照されたい。そのような動物によって生成された無傷の抗体からのヒト可変領域はさらに改変されることができる。

ヒト抗体はハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株については記載がある（例えばKozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp.51-63;およびBoerner, P. et al, J. Immunol. 147 (1991) 86-95を参照されたい）。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体も、Li, J. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103（2006）3557-3562に記載されている。さらなる方法として、例えばUS 7,189,826（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生に関する記載がある）およびNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト-ヒトハイブリドーマに関する記載がある）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937およびVollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191にも記載されている。

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。そのような可変ドメイン配列は、次に、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための手法を以下に説明する。

III.4. ライブラリー由来の抗体結合部位
ある特定の態様において、多重特異性抗体中の結合部位のうちの1つまたは2つは、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体軽鎖可変ドメイン（VL）から構成される。ある特定の態様において、可変ドメインは、1種類または複数種類の所望の活性を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。

例えば当技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするためのさまざまな方法が公知である。そのような方法は、例えばHoogenboom, H.R. et al, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37に総説があり、また例えばMcCafferty, J. et al, Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al, Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;およびLee, C.V. et al, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132に、さらに記載されている。

ある特定のファージディスプレイ法では、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455に記載されているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組み換えた後、そのライブラリーを抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、抗体フラグメントを、単鎖Fv（scFv）フラグメントとして、またはFabフラグメントとして、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高アフィニティー結合部位を与える。あるいは、Griffiths, A.D. et al, EMBO J. 12 (1993) 725-734に記載されているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、広範な非自己抗原に対する抗体、そしてまた自己抗原に対する抗体の、単一の供給源とすることもできる。最後に、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388に記載されているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使って高度に可変なCDR3領域をコードすると共に、インビトロで再編成を行うことにより、ナイーブライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許公報としては、例えば、US 5,750,373、ならびにUS 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936、およびUS 2009/0002360が挙げられる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書では、ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。

IV. ヘテロ多（二）量体化ドメイン
2つの環状融合ポリペプチドが正しく会合して本明細書で報告される多重特異性抗体を形成することを確実にするためには、さまざまな技術を使用することができる。それらの一つは、いわゆる「ノブ・イン・ホール」工学である（例えばUS 5,731,168）。多環状融合ポリペプチドは、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果を工作すること（WO 2009/089004）; 2つまたはそれ以上の環状融合ポリペプチドを架橋すること（例えばUS 4,676,980およびBrennan, M. et al, Science 229 (1985) 81-83参照）;ロイシンジッパーを用いて二環状融合ポリペプチドを産生すること（例えばKostelny, S.A. et al, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553参照）によって、作製してもよい。

「CH3ドメイン」は、Fc領域においてCH2ドメインのC末端側にある残基（すなわちIgGの341番目前後のアミノ酸残基から447番目前後のアミノ酸残基まで）のストレッチを含む。本発明の抗体では、それぞれ1つのCH3ドメインが、第3結合部位のVH₃ドメインおよびVL₃ドメインのC末端に配置されている。本明細書における「CH3ドメイン」は、多重特異性抗体内で互いに向かい合う2つのCH3ドメインの二量体化を促進するために、天然CH3ドメインのアミノ酸配列が少なくとも1つの相異なるアミノ酸置換（すなわちCH3ドメインのアミノ酸配列の改変）に供されたバリアントCH3ドメインである。

ヘテロ二量体化をサポートすることを目的とするCH3改変のためのいくつかのアプローチは、例えば、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。

通例、当技術分野において公知のヘテロ二量体化アプローチでは、一方の操作されたCH3ドメインを含む重鎖が同じ構造を有する他方の重鎖ともはやホモ二量体化することができないように、一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインの両方が、相補的な様式で操作される。これにより、一方の操作されたCH3ドメインを含む重鎖は、相補的な様式で操作されたCH3ドメインを含む他方の重鎖とヘテロ二量体化することを強いられる。

当技術分野において公知のヘテロ二量体化アプローチの1つは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」技術であり、これは例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO 96/027011、Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9（1996）617-621、Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681およびWO 98/050431に、いくつか例を挙げて詳述されている。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造において2つのCH3ドメイン間に形成される境界面内で、一方のCH3ドメインでは突起（「ノブ」）が、そして他方のCH3ドメインではくぼみ（「ホール」）が、それぞれ生じるように、各CH3ドメイン上の特定のアミノ酸が操作される。多重特異性抗体の三次構造において、一方のCH3ドメインに導入された突起は、他方のCH3ドメインに導入されたくぼみ内に配置可能である。

多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインはノブ・イントゥ・ホール技術に従って変更される。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では「CH3（KiH）操作多重特異性抗体」ともいう（ここで、「KiH」という略語は「ノブ・イントゥ・ホール技術」を意味する）。したがってこの態様によれば、CH3（KiH）操作多重特異性抗体では、一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、CH3ドメインが、ヘテロ二量体化を促進するように変更されている。

言い換えると、この態様は、抗体定常ドメイン3を含む第1ポリペプチドと抗体定常ドメイン3を含む第2ポリペプチドとを含む本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインが、それぞれのCH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1ポリペプチドのCH3ドメインおよび第2ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列がそれぞれ、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
- 一方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から少なくとも1つのアミノ酸残基が、この元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって境界面内に突起を生成し、突起が、一方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置しており、かつ突起が、境界面内で他方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置可能であり、かつ
- 他方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から少なくとも1つのアミノ酸残基が、この元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって境界面内にくぼみを生成し、くぼみが、他方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置し、かつそのくぼみ内に、一方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起が配置可能である、
CH3（KiH）操作多重特異性抗体に関する。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインのうちの一方はT366W突然変異を含み、それぞれ他方のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインのうちの一方はT366WおよびG407Y突然変異を含み、それぞれ他方のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の別の一態様において、CH3ドメインのうちの一方はT366W、R409D、およびK370E突然変異を含み、それぞれ他方のCH3ドメインはT366S、L368A、Y407V、D399K、およびE357K突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

上記で定義したノブ・イントゥ・ホール技術による改変に代えて、またはそれらと組み合わせて、本発明の多重特異性抗体のCH3ドメインは、ヘテロ二量体化を促進するために、当技術分野において公知の他のヘテロ二量体化アプローチ、好ましくはWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、およびWO 2013/096291に記載されているものに基づいて、変更される。

多重特異性抗体の別の一態様では、ノブ・イントゥ・ホール技術による改変に代えて、またはそれらと組み合わせて、（例えばEP 1870459に記載されているように）CH3/CH3ドメイン境界面中の特異的アミノ酸位置への、反対電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって、CH3ドメインが変更される。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（＋/-）操作多重特異性抗体」ともいう（ここで、「＋/-」という略語はそれぞれのCH3ドメインに導入された反対電荷のアミノ酸を意味する）。したがってこの態様において、CH3（＋/-）操作多重特異性抗体では、一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することにより、CH3ドメインが、ヘテロ二量体化を促進するように変更されている。

言い換えると、この態様は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む本発明のCH3（＋/-）操作多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインは、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれに、抗体の三次構造において、該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第1アミノ酸が正荷電アミノ酸で置換され、かつ他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第2アミノ酸が負荷電アミノ酸で置換されている、CH3（＋/-）操作多重特異性抗体に関する。

本発明のCH3（＋/-）操作多重特異性抗体の一態様において、正荷電アミノ酸はK、RおよびHから選択され、かつ負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。

本発明のCH3（＋/-）操作多重特異性抗体の一態様において、正荷電アミノ酸はKおよびRから選択され、かつ負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。

本発明のCH3（＋/-）操作多重特異性抗体の一態様において、正荷電アミノ酸はKであり、かつ負荷電アミノ酸はEである。

本発明のCH3（＋/-）操作多重特異性抗体の一態様において、一方のCH3ドメインでは、409番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸RがDで置換され、370番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがEで置換され、かつそれぞれ他方のCH3ドメインでは、399番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸DがKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）がKで置換される。

多重特異性抗体の別の一態様では、CH3ドメインがジスルフィドで安定化される。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（S-S）操作多重特異性抗体」ともいう（ここで、「S-S」という略語はジスルフィド安定化を意味する）。したがってこの態様では、CH3（S-S）操作多重特異性抗体において、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、CH3ドメインが、ヘテロ二量体化を促進するように変更されている。

言い換えると、この態様は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む本発明のCH3（S-S）操作多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインは、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれに、抗体の三次構造において、該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第1アミノ酸がシステインで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第2アミノ酸がシステインで置換され、導入されたシステイン残基によって一方のポリペプチドのCH3ドメインと他方のポリペプチドのCH3ドメインの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、第2アミノ酸は境界面内で第1アミノ酸と向かい合っている、CH3（S-S）操作多重特異性抗体に関する。

CH3（S-S）操作多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインは、一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによって、ジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。CH3（S-S）操作多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインは、一方のCH3ドメイン中のS354C突然変異と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによって、ジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

多重特異性抗体のさらに別の好ましい態様において、CH3ドメインはジスルフィドで安定化され、かつノブ・イントゥ・ホール技術に従って変更される。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（KSS）操作多重特異性抗体」ともいう（ここで、「K」という略語はノブ・イントゥ・ホール技術を意味し、「SS」はジスルフィド安定化を意味する）。したがってこの態様によれば、CH3（KSS）操作多重特異性抗体では一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成と、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の追加の導入とによって、CH3ドメインが、ヘテロ二量体化を促進するように変更されている。

言い換えると、この態様は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインが、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、かつ第1ポリペプチドのCH3ドメインおよび第2ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列がそれぞれ、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
- 一方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から少なくとも1つのアミノ酸残基が、この元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって境界面内に突起を生成し、突起が一方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置し、かつ突起が、境界面内で他方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置可能であり、かつ
- 他方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から少なくとも1つのアミノ酸残基が、この元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによってくぼみを境界面内に生成し、くぼみが他方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置し、かつそのくぼみ内に一方のポリペプチドのCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起が配置可能であり、かつ
- 一方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から第1アミノ酸がシステインで置換され、かつ他方のポリペプチドのCH3ドメインでは境界面中に位置する一組のアミノ酸の中から第2アミノ酸がシステインで置換され、導入されたシステイン残基によって一方のポリペプチドのCH3ドメインと他方のポリペプチドのCH3ドメインとの間にジスルフィド架橋が形成されうるように第2アミノ酸が境界面内で第1アミノ酸と向かい合っている、
CH3（KSS）操作多重特異性抗体に関する。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様では、「ノブ」鎖のCH3ドメインにE356CまたはS354C突然変異が導入され、「ホール」鎖のCH3ドメインにY349C突然変異が導入される。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366W突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366WおよびG407Y突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366W、R409D、およびK370E突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、Y407V、D399K、およびE357K突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

多重特異性抗体のさらに別の好ましい態様において、CH3ドメインはジスルフィドで安定化され、かつCH3/CH3ドメイン境界面中の特異的アミノ酸位置への、反対電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって、変更されている。この態様の多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（＋/-/SS）操作多重特異性抗体」ともいう（ここで、「＋/-」という略語は反対電荷のアミノ酸を意味し、「SS」はジスルフィド安定化を意味する）。したがってこの態様において、CH3（（＋/-/SS）操作多重特異性抗体では、一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することと、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の追加の導入とによって、CH3ドメインが、ヘテロ二量体化を促進するように変更されている。

言い換えると、この態様は、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとを含む本発明のCH3（＋/-/SS）操作多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインは、それぞれの抗体CH3ドメインの間に位置する境界面を形成し、第1ポリペプチドのCH3ドメインと第2ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれに、抗体の三次構造において、該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
- 一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第1アミノ酸は正荷電アミノ酸で置換され、かつ
- 他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第2アミノ酸は負荷電アミノ酸によって置換され、
- 一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第1アミノ酸がシステインで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、境界面中に位置する一組のアミノ酸のうち、第2アミノ酸がシステインで置換され、導入されたシステイン残基によって一方のポリペプチドのCH3ドメインと他方のポリペプチドのCH3ドメインの間にジスルフィド架橋が形成されうるように、第2アミノ酸は境界面内で第1アミノ酸と向かい合っている、
CH3（＋/-/SS）操作多重特異性抗体に関する。

本発明の一態様において、多重特異性抗体の第3結合部位はジスルフィドで安定化される。したがってVH₃およびVL₃ドメインは、VH₃ドメインとVL₃ドメインの間にジスルフィド結合が形成されるような、VH₃ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入とVL₃ドメインにおける1つのシステイン残基の導入とによって変更される。本発明の一態様において、多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインとVL₃ドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによってジスルフィドで安定化される:
- VH₃の44番目およびVL₃の100番目、
- VH₃の105番目およびVL₃の43番目、または
- VH₃の101番目およびVL₃の100番目。

好ましい一態様において、第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化される。

好ましい本発明の一態様では、多重特異性抗体の第3結合部位がジスルフィドで安定化され、かつCH3ドメインがジスルフィドで安定化される。

この理論に拘束されるわけではないが、本発明の多重特異性抗体の変更されたポリペプチドの異なるドメインにおけるこの改変によって形成される少なくとも2つのジスルフィド結合は、野生型IgGヒンジジスルフィド相互作用を置き換え、それによって、第3結合部位への抗原アクセスを可能にしつつ、ヘテロ二量体化をサポートする。

本発明の一態様では、多重特異性抗体の第1および/または第2結合部位も、VHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）に互いに独立してシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VHの44番目およびVLの100番目、
- VHの105番目およびVLの43番目、または
- VHの101番目およびVLの100番目。

一態様において、本発明のCH3（S-S）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインとVL₃ドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VH₃の44番目およびVL₃の100番目、
- VH₃の105番目およびVL₃の43番目、または
- VH₃の101番目およびVL₃の100番目。

本発明の好ましい一態様において、本発明のCH3（S-S）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化される。

本発明の別の好ましい一態様において、本発明のCH3（S-S）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化され、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異および他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異によってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明の別の好ましい一態様では、CH3ドメイン内でのノブ・イントゥ・ホール改変によってヘテロ二量体化がサポートされ、加えて、多重特異性抗体の第3結合部位およびCH3ドメインがそれぞれジスルフィドで安定化される。この態様の多重特異性抗体では、ノブ・イントゥ・ホール改変を加えられた重鎖のヘテロ二量体化は、公知のノブ・イントゥ・ホールアプローチとは対照的に、CH3ドメイン内に位置するのではなく、異なるドメイン中（すなわちVH₃ドメインとVL₃ドメインの間）に位置する人工的鎖間ジスルフィド結合によって、さらにサポートされる。この態様の抗体では、第3結合モジュール（VH₃-CH3ポリペプチドおよびVL₃-CH3ポリペプチドを含む）のヘテロ二量体化が、4つの別個の相互作用、すなわち（i）VH₃とVL₃の間の天然の相互作用、（ii）VH₃/VL₃境界面におけるジスルフィド安定化、（iii）CH3/CH3境界面におけるジスルフィド安定化、および（iv）CH3/CH3境界面におけるノブ・イントゥ・ホール改変によって促進される。これにより、ホモ二量体の形成ではなくヘテロ二量体の形成が促進され、抗体の安定性が改良される。

一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインとVL₃ドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VH₃の44番目およびVL₃の100番目、
- VH₃の105番目およびVL₃の43番目、または
- VH₃の101番目およびVL₃の100番目。

本発明の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化される。

本発明の別の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化され、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明の別の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化され、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366W突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明の別の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化され、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366WおよびG407Y突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、およびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明の別の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化され、一方のポリペプチド（「ノブ」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366W、R409D、およびK370E突然変異を含み、かつ他方のポリペプチド（「ホール」を含むポリペプチド）のCH3ドメインはT366S、L368A、Y407V、D399K、およびE357K突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは一方のCH3ドメイン中のE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）と他方のCH3ドメイン中のY349C突然変異とによってジスルフィドで安定化される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。

本発明の別の好ましい一態様では、CH3/CH3ドメイン境界面中の特異的アミノ酸位置への、反対電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって、ヘテロ二量体化がサポートされ、加えて、多重特異性抗体の第3結合部位およびCH3ドメインがそれぞれジスルフィドで安定化される。この態様の多重特異性抗体では、改変されたポリペプチドのヘテロ二量体化が、CH3ドメイン内に位置するのではなく、異なるドメイン中（すなわちVH₃ドメインとVL₃ドメインの間）に位置する人工的鎖間ジスルフィド結合によって、さらにサポートされる。一態様において、本発明のCH3（＋/-/SS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインとVL₃ドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化される:
- VH₃の44番目およびVL₃の100番目、
- VH₃の105番目およびVL₃の43番目、または
- VH₃の101番目およびVL₃の100番目。

本発明の好ましい一態様において、本発明のCH3（＋/-/SS）操作多重特異性抗体の第3結合部位は、VH₃ドメインの44番目およびVL₃ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィドで安定化される。

多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを改変してヘテロ二量体化を強制するためのさらなる手法は（「ノブ・イントゥ・ホール」技術の他にも）当技術分野では公知である。これらの技術、とりわけWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、およびWO2013/096291に記載されているものは、ここでは、本発明の多重特異性抗体との組み合せで、「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替的選択肢として考えられる。ヘテロ二量体化をサポートするためにこれらの改変のうちの1つを含む多重特異性抗体を、本明細書ではさらに、「CH3操作」多重特異性抗体という。

EP 1870459に記載のアプローチでは、CH3ドメインのヘテロ二量体化が、両者、すなわち第1重鎖と第2重鎖の間のCH3/CH3ドメイン境界面中の特異的アミノ酸位置への、反対電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく（本明細書ではさらに「CH3（＋/-）操作多重特異性抗体」という）。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2013/157953に記載のアプローチを使用する。本発明のCH3操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがKで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがDで置換される。本発明のCH3操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがKで置換され、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがKで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがDで置換される。

本発明のCH3操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがKで置換され、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがKで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがDで置換される。加えて、他方のポリペプチドのCH3ドメインには、以下の置換のうちの少なくとも1つが含まれる:349番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YはEで置換され、349番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YはDで置換され、368番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LはEで置換される。一態様では、368番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがEで置換される。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2012/058768に記載のアプローチを使用する。本発明のCH3操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがYで置換され、407番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YがAで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがAで置換され、409番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがFで置換される。別の一態様では、上述の置換に加えて、他方のポリペプチドのCH3ドメインにおいて、411番目（元はT）、399番目（元はD）、400番目（元はS）、405番目（元はF）、390番目（元はN）、および392番目（元はK）のアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換される。好ましい置換は、
- N、R、Q、K、D、E、およびWから選択されるアミノ酸による411番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Tの置換、
- R、W、YおよびKから選択されるアミノ酸による399番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Dの置換、
- E、D、R、およびKから選択されるアミノ酸による400番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Sの置換、
- I、M、T、S、V、およびWから選択されるアミノ酸による405番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Fの置換、
- R、K、およびDから選択されるアミノ酸による390番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Nの置換、ならびに
- V、M、R、L、F、およびEから選択されるアミノ酸による392番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸Kの置換
である。

（WO 2012/058768に従って操作された）本発明のCH3操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、351番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸LがYで置換され、407番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YがAで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがVで置換され、409番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがFで置換される。本発明のCH3操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、407番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YがAで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがAで置換され、409番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがFで置換される。最後に述べた態様において、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、392番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがEで置換され、411番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがEで置換され、399番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸DがRで置換され、400番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸SがRで置換される。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/143545に記載のアプローチを使用する。本発明のCH3操作多重特異性抗体の一態様において、両ポリペプチドのCH3ドメインにおけるアミノ酸改変は、368番目および/または409番目に導入される。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチを使用する。WO2011/090762は「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸改変に関する。本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがWで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、407番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YがAで置換される。本発明のCH3（KiH）操作多重特異性抗体の別の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、366番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸TがYで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、407番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸YがTで置換される。

IgG2アイソタイプである本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチを使用する。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2009/089004に記載のアプローチを使用する。本発明のCH3操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、392番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KまたはNが負荷電アミノ酸（好ましい一態様ではEまたはD、好ましい一態様ではD）で置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、399番目のアミノ酸D、356番目のアミノ酸EもしくはD、または357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が正荷電アミノ酸（好ましい一態様ではKまたはR、好ましい一態様ではK）で置換される（好ましい一態様では、399番目または356番目のアミノ酸がKで置換される）。さらなる一態様では、前述の置換に加えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KまたはRが負荷電アミノ酸（好ましい一態様ではEまたはD、好ましい一態様ではD）で置換される。さらに別の一態様では、前述の置換に加えて、または前述の置換に代えて、一方のポリペプチドのCH3ドメインにおいて、439番目のアミノ酸Kおよび/または370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が互いに独立して負荷電アミノ酸（好ましい一態様ではEまたはD、好ましい一態様ではD）で置換される。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/147901に記載のアプローチを使用する。本発明のCH3操作多重特異性抗体の一態様において、一方のポリペプチドのCH3ドメインでは、253番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがEで置換され、282番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸DがKで置換され、322番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがDで置換され、他方のポリペプチドのCH3ドメインでは、239番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸DがKで置換され、240番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸EがKで置換され、292番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のアミノ酸KがDで置換される。

本発明の多重特異性抗体の一態様では、多重特異性抗体の第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/110205に記載のアプローチを使用する。

上述のヘテロ二量体化戦略によってCH3ドメインを操作することに加えて、またはそれに代えて、追加の鎖間ジスルフィド架橋の導入により、ヘテロ二量体が安定化される（Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270（1997）26-35、Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16（1998）677-681）。これも、本明細書では、「CH3ドメインのジスルフィド安定化」という。

V. 組換えの方法およびの組成物
本発明の多重特異性抗体は、例えばUS 4,816,567に記載されているように、組換えの方法および組成物を使って産生することができる。一態様では、本明細書に記載の多重特異性抗体をコードする1つまたは複数の単離された核酸が提供される。そのような核酸は、1つの環状融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列を、また任意で第2環状融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列を（例えば二環状融合ポリペプチドの第1環状融合ポリペプチドおよび第2環状融合ポリペプチドを）コードしうる。さらなる一態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる一態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一態様において、宿主細胞は、本発明の多重特異性抗体の場合であれば、第1環状融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクターと第2環状融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクターとを含むか、またはそれら2つの核酸を含む単一のベクターを含む（例えばそれらで形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えばY0、NS0、Sp2/0細胞）である。一態様では、本発明の多重特異性抗体を作製する方法であって、上記で提供される多重特異性抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、多重特異性抗体の発現に適した条件下で培養する工程、および任意で多重特異性抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収する工程を含む、方法が提供される。

本発明による多重特異性抗体を組換え産生するためには、環状融合ポリペプチドをコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は従来の方法を使って容易に産生しうる。

多重特異性抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、本発明による多重特異性抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要でない場合は特に、細菌中で産生しうる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS 5,648,237、US 5,789,199およびUS 5,840,523を参照されたい（大腸菌における抗体フラグメントの発現についての記載があるCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology、Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254も参照されたい）。発現後に、多重特異性抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。

原核生物だけでなく、糸状菌または酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する本発明による多重特異性抗体の産生をもたらす、真菌株および酵母株を含めて、環状融合ポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である（Gerngross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414; Li, H. et al, Nat. Biotech.24 (2006) 210-215参照）。

本発明によるグリコシル化された多重特異性抗体を発現させるための適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と一緒に使用しうるバキュロウイルス株は、数多く同定されている。

植物細胞培養物を宿主として用いることもできる（例えばUS 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術に関する記載がある）参照）。

脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、懸濁状態での成長に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）;ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載の293または293細胞）;ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）;マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252などに記載のTM4細胞）;サル腎臓細胞（CV1）;アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）;ヒト子宮頸癌細胞（HELA）;イヌ腎臓細胞（MDCK;バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）;ヒト肺細胞（W138）;ヒト肝臓細胞（Hep G2）;マウス乳房腫瘍（MMT060562）;Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68などに記載のTRI細胞; MRC5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、DHFR^- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説としては、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NH (2004) pp.255-268を参照されたい。

VI.アッセイ
本発明による多重特異性抗体は、ポリペプチドのその標的への結合を決定するための当技術分野において公知のさまざまなアッセイによって、同定すること、スクリーニングすること、またはそれらの物理的/化学的特性および/もしくは生物学的活性を特徴決定することができる。

VII.イムノコンジュゲート
本発明は、1つまたは複数の細胞障害性作用物質、例えば化学療法剤または化学療法薬、成長阻害性作用物質、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体にコンジュゲートされた本発明による多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。

一態様において、イムノコンジュゲートは、本発明による多重特異性抗体が、以下に限定するわけではないが以下を含む1つまたは複数の薬物にコンジュゲートされている、本発明による多重特異性抗体-薬物コンジュゲートである:メイタンシノイド（US 5,208,020、US 5,416,064およびEP 0 425 235 B1参照）;アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（US 5,635,483、US 5,780,588、およびUS 7,498,298参照）;ドラスタチン;カリケアマイシンまたはその誘導体（US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001およびUS 5,877,296; Hinman, L.M. et al, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342;およびLode, H.N. et al, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928参照）;アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz, F. et al, Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al, J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343;およびUS 6,630,579号参照）;メトトレキサート;ビンデシン;タキサン類、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル;トリコテセン;およびCC1065。

別の一態様において、イムノコンジュゲートは、以下に限定するわけではないが以下を含む酵素活性毒素またはそのフラグメントにコンジュゲートされた、本発明による多重特異性抗体を含む:ジフテリア毒素A鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類。

別の一態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートが形成されるように放射性原子にコンジュゲートされた、本発明による多重特異性抗体を含む。放射性コンジュゲートの作製にはさまざまな放射性同位体を用いることができる。例として、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²、およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばTC^99mまたはI¹²³を含むか、核磁気共鳴（NMR）イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られている）用のスピンラベル、例えば、ヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含みうる。

本発明による多重特異性抗体と細胞障害性作用物質のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジプイミデートHCl）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などといった、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を使って作製しうる。例えばリシンイムノトキシンは、Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、環状融合ポリペプチドに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的キレート剤である（WO 94/11026参照）。リンカーは、細胞における細胞障害性薬の放出を容易にする「切断可能リンカー」でありうる。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131;US 5,208,020）を使用しうる。

本明細書におけるイムノコンジュゲートでは、架橋試薬を使って調製された、例えば限定するわけではないが（Pierce Biotechnology, Inc.、米国、イリノイ州ロックフォードから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を使って調製された、上述のコンジュゲートが特に考えられるが、それらに限定されるわけではない。

VIII.診断および検出のための方法および組成物
ある特定の態様において、本発明による多重特異性抗体はいずれも、生物学的試料におけるその標的の存在を検出するのに役立つ。本明細書において使用する「検出する」という用語は、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の態様において、生物学的試料は血液、血清、血漿、細胞、または組織を含む。

一態様では、診断方法または検出方法に使用するための、本発明による多重特異性抗体が提供される。さらなる一局面では、生物学的試料における本発明による多重特異性抗体の標的の存在を検出する方法が提供される。ある特定の態様において、本方法は、生物学的試料を、本発明による多重特異性抗体と、多重特異性抗体のその標的への結合を許容する条件下で、接触させる工程、および多重特異性抗体とその標的との間に複合体が形成されるかどうかを検出する工程を含む。そのような方法はインビトロ法またはインビボ法でありうる。一態様において、本発明による多重特異性抗体は、該多重特異性抗体による治療に適格な対象を選択するために使用される。

ある特定の態様では、標識された本発明による多重特異性抗体が提供される。ラベルとしては、直接的に検出されるラベルまたは部分（例えば蛍光ラベル、発色団ラベル、高電子密度ラベル、化学発光ラベル、および放射性ラベル）、ならびに例えば酵素反応または分子相互作用などによって間接的に検出される部分、例えば酵素またはリガンドが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例示的ラベルとして、放射性同位体³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、および¹³¹I、発蛍光団、例えば希土類キレート化合物またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（US 4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を使って色素前駆体を酸化する酵素、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼと共役させた複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカルなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

IX. 薬学的製剤
本発明による多重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような多重特異性抗体を1種類または複数種類の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.)(1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体としては、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が、さらに挙げられる。rhuPH20を含むある特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1種類または複数種類の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。

例示的な凍結乾燥抗体製剤はUS 6,267,958に記載されている。水性抗体製剤としてはUS 6,171,586およびWO 2006/044908に記載されているものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。

本明細書における製剤は、処置される特定適応症の必要に応じて、2種類以上の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。

活性成分は、例えばコアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th, Osol, A. (ed.)(1980)に開示されている。

徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、環状融合ポリペプチドを含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にある、半透過性マトリックスが挙げられる。

インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。

X.治療方法および治療組成物
本発明による多重特異性抗体はいずれも治療方法に使用しうる。

一局面では、医薬として使用するための本発明による多重特異性抗体が提供される。さらなる局面では、疾患の処置において使用するための本発明による多重特異性抗体が提供される。ある特定の態様では、処置方法において使用するための本発明による多重特異性抗体が提供される。ある特定の態様において、本発明は、個体に有効量の本発明による多重特異性抗体を投与する工程を含む、疾患を有する個体を処置する方法において使用するための多重特異性抗体を提供する。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療用物質を投与することを、さらに含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」は好ましくはヒトである。

さらなる一局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本発明による多重特異性抗体の使用を提供する。一態様において、医薬は疾患を処置するための医薬である。さらなる一態様において、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与する工程を含む、疾患の処置方法において使用するための医薬である。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療用物質を投与することを、さらに含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。

さらなる一局面において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様において、本方法は、そのような疾患を有する個体に、有効量の本発明による多重特異性抗体を投与する工程を含む。そのような一態様において、本方法は、個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療用物質を投与することを、さらに含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。

さらなる一局面において、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本発明による多重特異性抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様において、薬学的製剤は、本発明による多重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の一態様において、薬学的製剤は、本発明による多重特異性抗体のいずれかと、少なくとも1つの追加治療用物質とを含む。

本発明による多重特異性抗体は、単独で、または他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば本発明による多重特異性抗体は、少なくとも1つの追加治療用物質と同時投与しうる。

上記のそのような併用療法は、併用投与（この場合は2つまたはそれ以上の治療用物質が同じ製剤または別個の製剤に含まれている）を包含すると共に、個別投与も包含し、その場合は、本発明による多重特異性抗体の投与を、1種類または複数種類の追加治療用物質の投与の前に、1種類または複数種類の追加治療用物質の投与と同時に、および/または1種類または複数種類の追加治療用物質の投与の後に、行うことができる。一態様において、多重特異性抗体の投与と追加治療用物質の投与は、互いに約1ヶ月以内、または約1、約2、もしくは約3週間以内、または約1、約2、約3、約4、約5、もしくは約6日以内に行われる。適合する本発明による多重特異性抗体は放射線療法と併用することもできる。

本発明による多重特異性抗体（および任意の追加治療用物質）は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与、そして局所処置にとって望ましい場合は、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路で、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によって、行うことができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬スケジュールが、本明細書では考えられる。

本発明による多重特異性抗体は、優良医療規範（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、調合され、かつ投与される。この文脈において考慮すべき因子としては、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が挙げられる。多重特異性抗体は、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている1種類または複数種類の作用物質と共に製剤化する必要があるわけではないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在する多重特異性抗体の量、障害または処置のタイプ、および上記で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、上述したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載する投薬量の約1～99％で、または実験的/臨床的に適当であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。

疾患の防止または処置に関して、本発明による多重特異性抗体の適当な投薬量（単独で使用する場合、または1種類もしくは複数種類の他の追加治療用物質と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、多重特異性抗体ドのタイプ、疾患の重症度および経過、本発明による多重特異性抗体を防止のために投与するのか治療のために投与するのか、治療歴、患者の病歴、および多重特異性抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存することになる。多重特異性抗体は、患者に1回で、または一連の処置で、適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば1回または複数回の独立した投与によるか、または持続注入によるかを問わず、約1μg/kg～15mg/kg（例えば0.5mg/kg～10mg/kg）の多重特異性抗体を、患者に投与するための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kg～100mg/kg、またはそれ以上に及ぶかもしれない。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、持続される。多重特異性抗体の例示的投薬量の一つは約0.05mg/kg～約10mg/kgの範囲にあるだろう。したがって約0.5mg/kg、約2.0mg/kg、約4.0mg/kg、または約10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は（例えば患者が多重特異性抗体の投与を約2回～約20回、例えば約6回受けることになるように）間欠的に、例えば毎週または3週ごとに投与することができる。高用量の初回負荷量を投与した後に、それより低い用量を1回または複数回投与することができる。ただし他の投薬レジメンも役立ちうる。この治療の進行は、従来の手法およびアッセイによって容易に監視される。

上記の製剤または治療方法はいずれも、本発明による多重特異性抗体の代わりに、または本発明による多重特異性抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使って実行しうると理解される。

XI.製造物
本発明の別の局面では、障害の処置、防止、および/または診断に有用な材料が入っている製造物が提供される。製造物は、容器、および容器上のまたは容器に付属するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな材料から形成されうる。容器は、組成物を単独で、または状態を処置、防止および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静注用バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は、本発明による多重特異性抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらにまた、製造物は、（a） 本発明による多重特異性抗体を含む組成物が入っている第1容器と、（b） さらなる細胞障害性作用物質または他の治療用物質を含む組成物が入っている第2容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造物は、さらに、特定の状態を処置するために当該組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えてまたはこれに加えて、製造物はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第2（または第3）の容器を含みうる。これは、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどをさらに含みうる。

本明細書において言及するあらゆる文献（科学文献、書物、または特許）は参照により本明細書に組み入れられる。

以下の実施例および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手法には、本発明の要旨から逸脱することなく、改変を加えることができると理解される。

本明細書において報告する環状融合ポリペプチドの一般構造の略図。 本明細書において報告する二環状融合ポリペプチドの一般構造の略図。 IgGタイプの普通の抗体および本明細書において報告する例示的二環状融合ポリペプチドの結合部位間の配向および空間的距離。 異なるコントースボディ型のUV消光クロマトグラム（280nm）。 質量分析による本明細書において報告する環状融合ポリペプチドの生成物品質分析。 「VH-in」配向（Fc領域に近い）および「VH-out」配向（Fc領域から離れている）にあるVHドメインの相対的な位置および配向の略図。 「VH-in」配向（Fc領域に近い）および「VH-out」配向（Fc領域から離れている）にあるVHドメインの相対的な位置および配向の略図。 本明細書において報告する二重特異性二環状融合ポリペプチドの産生に使用された各配向を有する抗cMET環状融合ポリペプチドの例示的な鎖。 2つの環状融合ポリペプチドおよび第3 VH/VL対を含む、本発明の多重特異性抗体。上図;概略、下図;三次元モデル。 LeY/ビオチンTriFabコントースボディのKappaSelect精製培養上清のSECクロマトグラム（上側）およびSDS-page（下側）。 TriFabコントースボディLeY/ビオチンのm/zスペクトル。 LeY/ビオチン-TriFabコントースボディのFACS分析。 二重特異性抗LeY/CD3 TriFabコントースボディの略図。 抗LeY/CD3 TriFabコントースボディのクーマシー染色SDS PAGEゲル;kDa＝キロダルトン（分子量マーカー）;nr＝非還元;r＝還元。 MCF7細胞とのインキュベーションに使用した二重特異性抗LeY/CD3 TriFabコントースボディおよび二重特異性TriFabの略図。 抗LeY TriFab（陽性対照）、（ii）抗LeY/X TriFab（XはMCF7上に存在しない;陰性対照）、（iii）本発明の抗LeY/CD3 TriFabコントースボディの、用量依存的な、MCF7細胞の細胞死滅。

XII.実施例
以下は本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的説明を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうると理解される。

材料および方法
組換えDNA法
Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使ってDNAをマニピュレートした。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。

遺伝子およびオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH（ドイツ、レーゲンスブルク）において、化学合成によって調製された。合成された遺伝子フラグメントを増殖/増幅用の大腸菌（E. coli）プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシークエンシングによって検証した。あるいは、短い合成DNAフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって集合させるか、PCRによって集合させた。各オリゴヌクレオチドは、metabion GmbH（ドイツ、プラネック-マルティンストリート）によって調製された。

試薬類
市販の化学品、抗体、およびキットはすべて、別段の言明がある場合を除き、製造者のプロトコールに従って、提供された製品をそのまま使用した。

実施例1
環状融合ポリペプチド用の発現プラスミドの構築
本明細書において報告する環状融合ポリペプチドを発現させるために、次に挙げる機能的要素を含む転写単位を使用した。
- イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター（P-CMV）、
- ヒト重鎖免疫グロブリン5'-非翻訳領域（5'UTR）、
- マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- 各環状融合ポリペプチドをコードする核酸、および
- ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（BGH pA）。

基本的/標準的な哺乳動物発現プラスミドは、発現させようとする所望の遺伝子を含む発現単位/カセットの他に、
- 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製起点、および
- 大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。

実施例2
環状融合ポリペプチドの発現
環状融合ポリペプチドの一過性発現は、トランスフェクション試薬293-free（Novagen）を使用し、懸濁培養に適応したHEK293F（FreeStyle 293-F細胞; Invitrogen）細胞において行った。

細胞を、125ml振とうフラスコ中で、融解後に、少なくとも4回は、希釈によって継代した（体積30ml）（37℃、7％CO₂、湿度85％、135rpmでインキュベート/振とうする）。

細胞を250mlの体積で3×10⁵細胞/mlまで拡大培養した。3日後に、細胞を分割し、1リットル振とうフラスコ中、250mlの体積に、7×10⁵細胞/mlの密度で新たに播種した。トランスフェクションは、24時間後に、1.4～2.0×10⁶細胞/ml前後の細胞密度で行われることになる。

トランスフェクション前に、250μgのプラスミドDNAを、予熱（水浴; 37℃）したOpti-MEM（Gibco）で、10mlの最終体積に希釈した。その溶液を穏やかに混合し、最長5分間、室温でインキュベートした。次に333.3μlの293-freeトランスフェクション試薬を、DNA-OptiMEM溶液に加えた。その後、その溶液を穏やかに混合し、15～20分間、室温でインキュベートした。混合物の全量を、250mlのHEK細胞培養体積で1L振とうフラスコに加えた。

37℃、7％CO₂、湿度85％、135rpmで6日間または7日間、インキュベート/振とうする。

上清を、2,000rpm、4℃で10分間の第1遠心分離工程によって収穫した。次に、4,000rpm、4℃で20分間の第2遠心分離のために、上清を新しい遠心フラスコに移した。その後、無細胞上清を0.22μmボトルトップフィルタで濾過し、冷凍庫（-20℃）で保存した。

実施例3
環状融合ポリペプチドの精製
抗体を含有する培養上清を濾過し、2つのクロマトグラフィー工程によって精製した。PBS（1mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl）、pH7.4で平衡化したHiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を捕捉した。結合していないタンパク質を平衡緩衝液で洗浄することによって除去し、抗体を50mMクエン酸緩衝液、pH2.8で回収し、溶出後直ちに、1Mトリス塩基、pH9.0でpH6.0に中和した。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、第2精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーは20mMヒスチジン緩衝液、0.14M NaCl、pH6.0中で行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブレンを装着したUltrafree-CL遠心フィルタユニット（Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ）で濃縮し、-80℃で保存した。

実施例4
抗Her2環状融合ポリペプチドの結合
表面プラズモン共鳴Her2受容体結合
チップ表面: CM5チップ。
T: アッセイ設定1および2の場合、それぞれ37℃および25℃。
ランニング緩衝液: PBS＋0.05％（v/v）Tween 20。
希釈緩衝液: ランニング緩衝液＋0.1％BSA。
分析物: アッセイ設定1の場合、c（HER2 ECD）＝0.41～900nM;
アッセイ設定2の場合、c（二量体抗Her2コントースボディ）＝3.7～300nM、
c（トラスツズマブ）＝3.7～300nM。
リガンド: アッセイ設定1の場合、抗ヒトFc領域抗体を介して結合した二量体抗Her2コントースボディ、トラスツズマブ;
アッセイ設定2の場合、ペルツズマブを介して結合したHer2-ECD。

応答単位数は分子量に正比例する。分析物結合の理論的最大は、Her2 ECDの公知の結合レベルに基づく。100％＝1分子の二量体抗Her2コントースボディまたはトラスツズマブは、それぞれ2分子のHER2 ECDに結合する。

実施例5
ADCCアッセイ-ACEA
BT-474細胞を、Accutaseで「可溶化」し、培地中でカウントし、2×10E5細胞/mlの細胞密度にした。50μlの培地を96ウェルプレートの各ウェルにピペッティングし、バックグラウンド効果をACEAで測定し、最後に、50μlの細胞懸濁液/ウェル（＝10,000細胞/ウェル）を加えた。プレートをACEAに入れて、15分後のセルインデックス（cell index）を測定した。次に培地をピペッティングによって除去し、洗浄工程をAIM-V培地で行い、50μlの抗体を三つの異なる濃度で加えた。ナチュラルキラー細胞をカウントし、細胞密度が6×10E5になるように、AIM-Vに入れた。50μl（E/Tは3:1で30,000細胞/ウェル）をACEAに加え、セルインデックスを5分ごとに測定した。24時間後に実験を停止し、2時間後および4時間後にADCCを算出した。

実施例6
質量スペクトル分析
PNGase FはRoche Diagnostics GmbHから入手した（14.3U/μl;リン酸ナトリウム、EDTAおよびグリセロールに溶解した状態）。IgG抗体のヒンジ領域中で特異的に切断するプロテアーゼを、消化の前に凍結乾燥物から新たに再構成した。

PNGase Fによる酵素的脱グリコシル化
50μgのコントースボディを10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.1で最終濃度0.6mg/mlまで希釈し、1μlのPNGase Fにより、37℃で16時間、脱グリコシル化した。

酵素的切断
脱グリコシル化された試料を200mMトリス緩衝液、pH8.0で最終濃度0.5mg/mlまで希釈してから、IgG特異的プロテアーゼにより、37℃で1時間、消化した。

ESI-QTOF質量分析
2％ギ酸（v/v）を含む40％アセトニトリルを使って、Sephadex G25カラム（Kronlab、5×250mm、TAC05/250G0-SR）でのHPLCにより、試料を脱塩した。TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を備えたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-QTOF MSによって、全質量を決定した。較正はヨウ化ナトリウム（Waters ToF G2-Sample Kit 2 Part: 700008892-1）で行った。消化されたコントースボディについて、データ収集を1000～4000m/z（ISCID: 30eV）で行った。生質量スペクトルを評価し、個々の相対モル質量に変換した。結果の視覚化のために、プロプライエタリ・ソフトウェアを使って、デコンボリューションされた質量スペクトルを生成した。

実施例7
TriFabコントースボディの精製
抗体を含有する培養上清を濾過し、2つのクロマトグラフィー工程によって精製した。TriFabコントースボディは、分子がCH2ドメインを欠いており、それゆえに機能的Fc領域が存在しないので、標準的なプロテインL（KappaSelect）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。PBS（1mM KH₂PO₄、10mM Na₂HPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl）、pH7.4で平衡化したKappaSelect（GE Healthcare）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を捕捉した。結合していないタンパク質を平衡緩衝液で洗浄することによって除去し、抗体を50mMクエン酸緩衝液、pH2.8で回収し、溶出後直ちに、1Mトリス塩基、pH9.0でpH6.0に中和した。Superdex 200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、第2精製工程として使用した。このサイズ排除クロマトグラフィーは20mMヒスチジン緩衝液、0.14M NaCl、pH6.0中で行った。抗体含有溶液を、Biomax-SKメンブレンを装着したUltrafree-CL遠心フィルタユニット（Millipore、マサチューセッツ州ビルリカ）で濃縮し、-80℃で保存した。

実施例8
TriFabコントースボディのFACS分析
生成したTriFabコントースボディの結合機能性を評価するために、FACS分析を適用した。そこで、LeY抗原を発現するMCF7細胞を、ビオチン-Cy5コンジュゲートにばく露するか（陰性対照）、陰性対照としての非結合性TriFabコントースボディにばく露し、細胞の洗浄後に、ビオチン-Cy5コンジュゲートにばく露するか（陰性対照II）、またはTriFabコントースボディにばく露し、続いて添加されるビオチン-Cy5にばく露して、細胞の蛍光を評価した。図12に結果を示す。

実施例9
TriFabコントースボディはT細胞誘導性腫瘍細胞死滅を効率よく媒介する
T細胞誘導性腫瘍細胞死滅におけるTriFabコントースボディフォーマットの適性を評価するために、第3結合実体として抗CD3結合実体を使用した（図13）。VH配列およびVL配列は、US 2015/0166661 A1に記載されているCD3結合物質の例示的な配列である。ここでは任意の抗CD3 Fvを代用することができる。これは単に一例として選ばれたものである。この抗LeY/CD3 TriFabコントースボディは、SEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:37のポリペプチドを含む。

抗LeY/CD3 TriFabコントースボディの発現および精製（上記実施例で概説したように実施）は、8mg/L発現体積の収量で達成された。クーマシー染色SDS PAGE分析では、予測された重量に明瞭なバンドが存在する（図14）。

LeY陽性MCF7細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、さまざまな濃度の（i）陽性対照としての抗LeY TriFab、（ii）XがMCF7細胞上に存在しない、陰性対照としての抗LeY/X TriFab、および（iii）抗LeY/CD3 TriFabコントースボディにばく露した（図15参照）。T細胞媒介性死滅を評価するために、健常ドナーの全血からのPBMC（Ficoll（登録商標）Paque Plus精製により、製造者の説明書（GE Healthcare）に従って単離したもの）を5:1の比で加えた。その後、培養物を37℃および5％CO₂で48時間維持し、次に、腫瘍細胞溶解の度合を評価した（LDH放出アッセイを製造者の説明書（Cytotoxicity Detection Kit（LDH）、Roche）に従って適用））。TriFabコントースボディは、ピコモル濃度域でさえ、用量依存的死滅を誘導することが確認された。陽性対照抗LeY/CD3 TriFab（約120pM）と比較して、TriFabコントースボディは、有意に低いIC₅₀値（約2.4pM）を示した（図16）。

さまざまなLeY/CD3 TriFabコントースボディの発現収量:

Claims (15)

1. 3つの抗原結合部位を含みかつ2つの環状融合ポリペプチドからなる、多重特異性抗体であって、
   （a）第1環状融合ポリペプチドが、第1結合ドメインの第1部分、第1結合ドメインの第2部分、および第3結合ドメインの第1部分を含み、ここで、
   - 該第1結合ドメインの第1部分が、該第3結合ドメインの第1部分のN末端に第1ペプチド性リンカーを介して融合されており、
   - 該第1結合ドメインの第2部分が、該第3結合ドメインの第1部分のC末端に第2ペプチド性リンカーを介して融合されており、
   - 該第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH1-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL1-CL1）であり、ここで、該第1結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には該第1結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、かつ
   - 該第1結合ドメインの第1部分と該第1結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第1抗原結合部位であり、
   （b）第2環状融合ポリペプチドが、第2結合ドメインの第1部分、第2結合ドメインの第2部分、および該第3結合ドメインの第2部分を含み、ここで、
   - 該第2結合ドメインの第1部分が、該第3結合ドメインの第2部分のN末端に第3ペプチド性リンカーを介して融合されており、
   - 該第2結合ドメインの第2部分が、該第3結合ドメインの第2部分のC末端に第4ペプチド性リンカーを介して融合されており、
   - 該第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメント（VH2-CH1）または軽鎖Fabフラグメント（VL2-CL1）であり、ここで、該第2結合ドメインの第1部分が重鎖Fabフラグメントである場合には該第2結合ドメインの第2部分が軽鎖Fabフラグメントであるかまたはその逆であり、
   - 該第2結合ドメインの第1部分と該第2結合ドメインの第2部分が、互いに連結されており、かつ全体として第2抗原結合部位であり、
   （c）該第3結合ドメインの第1部分と該第3結合ドメインの第2部分が全体として第3抗原結合部位であり、ここで、
   - 該第3結合ドメインの第1部分が、可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VH3-CH3）または可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチド（VL3-CH3）のどちらか一方であり、
   - 該第2結合ドメインの第1部分が可変軽鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドである場合には該第3結合ドメインの第2部分が可変重鎖-CH3ドメイン融合ポリペプチドであるか、またはその逆であり、
   - 該第3結合ドメインの第1部分と該第3結合ドメインの第2部分が、互いに連結されて第3抗原結合部位を形成し、
   2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
   （i）一方のCH3ドメインに生成された突起が、他方のCH3ドメインに生成されたくぼみに配置可能であるような、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる一方のCH3ドメインにおける突起の生成と、少なくとも1つの元のアミノ酸残基をこの元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによる他方のCH3ドメインにおけるくぼみの生成とによって、もしくは
   一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、または
   （ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるような、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、または
   （iv）（i）および（ii）の改変の両方によって、
   ヘテロ二量体化を促進するように変更されており、
   該多重特異性抗体が定常重鎖ドメイン2（CH2）およびヒンジ領域を欠いている、
   該多重特異性抗体。
2. 前記第1抗原結合部位および/または前記第2抗原結合部位および/または前記第3抗原結合部位が互いに独立して、VHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を形成するために以下の位置（ナンバリングはKabatに従う）においてシステイン残基を導入することによって、ジスルフィドで安定化されている、請求項1に記載の多重特異性抗体:
   - VHの44番目およびVLの100番目、
   - VHの105番目およびVLの43番目、または
   - VHの101番目およびVLの100番目。
3. 前記第1ペプチド性リンカー、第2ペプチド性リンカー、第3ペプチド性リンカー、および第4ペプチド性リンカーが、少なくとも5個のアミノ酸のペプチドである、請求項1または2に記載の多重特異性抗体。
4. 前記第1ペプチド性リンカーおよび第3ペプチド性リンカーがSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有し、かつ前記第2ペプチド性リンカーおよび第4ペプチド性リンカーがSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する、請求項1～3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
5. VH3ドメインのC末端が一方のCH3ドメインのN末端に直接接続されており、かつVL3ドメインのC末端が他方のCH3ドメインのN末端に直接接続されている、請求項1～4のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
6. 三価である、請求項1～5のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
7. 二重特異性である（前記第1結合部位が第1抗原に結合し、前記第2結合部位が第2抗原に結合し、かつ前記第3結合部位が第3抗原に結合し、ここで、第1抗原、第2抗原、および第3抗原のうちの2つが同じ抗原でありかつ残りの抗原が異なる抗原である）か、または、三重特異性である（前記第1結合部位が第1抗原に結合し、前記第2結合部位が第2抗原に結合し、かつ前記第3結合部位が第3抗原に結合し、ここで、第1抗原、第2抗原、および第3抗原が異なる抗原である）、請求項1～6のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
8. 前記第1結合ドメインの第1部分と該第1結合ドメインの第2部分が、ジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されており、かつ/または前記第2結合ドメインの第1部分と該第2結合ドメインの第2部分がジスルフィド結合によって互いに共有結合的に連結されている、請求項1～7のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
9. 前記第3結合部位がヒトCD3に特異的に結合する、請求項1～8のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
10. 以下の工程を含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体の調製のための方法:
    - 該多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    - 該多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
    - 宿主細胞培養物から該多重特異性抗体を回収する工程。
11. 請求項10に記載の方法によって産生される多重特異性抗体。
12. 請求項1～9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体のポリペプチドをコードする一組の核酸。
13. 請求項12に記載の核酸を含む発現ベクター、または、それぞれが請求項12に記載の核酸のうちの1つを含む一組の発現ベクター。
14. 請求項12に記載の核酸を含む宿主細胞。
15. 請求項1～9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物。

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