CN115160440A - 新型双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型抗体结构的双特性抗体、编码所述双特性抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述双特性抗体的免疫缀合物、包含所述双特性抗体或免疫缀合物的药物组合物、以及它们在疾病的免疫治疗、预防、诊断上的用途；本发明的双特性抗体包含至少两个抗原结合位点，其中一个可以为免疫球蛋白Fab的抗原结合位点，另一个抗原结合位点是由两个相互配合的结构域共同形成，它们不直接相连，而是通过连接子分别串联于免疫球蛋白Fab同一重链或同一轻链的N端和C端，由Fab重链或轻链可变区与恒定区形成的空间角度介导在空间上相互交叉，从而使得两个结构域相互作用形成所述另一个抗原结合位点。

Description

新型双特异性抗体
技术领域
本发明涉及新型抗体结构的双特性抗体、编码所述双特性抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述双特性抗体的免疫缀合物、包含所述双特性抗体或所述免疫缀合物的药物组合物、以及它们在疾病的免疫治疗、预防或诊断上的用途。
背景技术
抗体分子正日益成为针对各种疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。随着对癌症和其他多种疾病的研究，认识到了往往有多种信号转导通路参与疾病的发生和发展，因此使得仅针对一种靶点的单特异性抗体通常并不足以发挥对疾病的治疗作用，从而在临床应用上存在一些局限性。
多特异性抗体，如双特异性抗体，作为研究工具、诊断工具和作为治疗剂是重要的。这很大一部分是由于可以选择这样的抗体以高特异性和亲和力结合两个或多个抗原或一个抗原上存在的两个或多个表位的事实。例如，当一种抗原位于特定的免疫细胞上，另一种抗原位于疾病细胞上时，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)可以将特定的免疫细胞重新定向至疾病细胞，以增强免疫细胞对疾病细胞的杀伤力。另外，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)也能够设计为同时作用于两种或多种不同介质的信号转导通路。这些优势特性为多特异性抗体(例如，双特异性抗体)开辟了广阔的应用前景。
双特异性抗体始于20世纪60年代连接不同抗体的Fab片段以形成双特异性F(ab’)2分子的制备技术。在杂交瘤技术，特别是重组抗体技术的推动下飞速发展，各种双特异性分子结构和构建策略不断涌现。
根据识别不同抗原或抗原表位的结合域的结构不同，双特异性抗体不同结合域可有不同的组合方式，大致可分为Fab-Fab,Fab-Fv和Fv-Fv组合。
(一)Fab-Fab
即识别抗原或抗原表位的结合域均为Fab。代表结构有：通过大鼠和小鼠杂交瘤细胞再次融合技术hybridhybridomas产生的Triomab，利用各种Fc异源二聚体技术(如Knob-in-Hole,电荷配对，SEED,BEAT，LUZ-Y，Duobody等)和避免Fab错配技术(如CrossMab,共用轻链，单链Fab,κλ-body,Orthogonal Fab，Duetmab,TCR-CαCβ等)产生的各类bsIgG，多种Fab串联方式产生的类IgG分子(如Tandem orthogonal Fab-IgG,FIT-IgG,BiXAb等)，利用化学交联技术产生的IgG-IgG,各类Fab交联技术产生的Fab连接分子(如F(ab')2,DockandLock等)。该组合两个抗原识别结合域同时使用Fab能完整保留原抗体的高亲和力，结构更接近天然IgG，具有较高的稳定性。但为了避免两个不同Fab之间重轻链的错配，需要使用共同轻链或引入突变形成有倾向的配对。共用轻链技术不仅造成了识别loop多样性的降低，增加了筛选负担，同时也使大量现有的、已通过验证的优秀抗体无法使用。引入的形成正确配对倾向的突变则有破坏Fab天然结构和引起免疫反应的风险，另外引入的突变通常也不能完全避免错配的发生给后续的纯化工作造成困难。
(二)Fab-Fv
即识别抗原或抗原表位的结合域一个为Fab，另一个则为Fv，广义的Fv可包含单链可变区抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)、工程化改造的有特异性识别功能的多肽或蛋白结构域(如Anticalins,Bicyclic peptides,DARPins,Fynomers等)、配体或受体分子及工程化改造的配体或受体分子等。代表结构有：scFv-Fab,scFv-IgG,DVD-IgG,Fab-scFv-Fc,sdAb-Fab,sdAb-IgG,Zybody等。
(三)Fv-Fv
即识别抗原或抗原表位的结合域均为Fv。代表结构有：BiTE,Diabody,DART,TandAb,scFv-Fc,scFv-sdAb,Tandem sdAb,sdAb-Fc等。该组合方式非常灵活，能方便地构建多价和多特异性结合分子，但往往大幅降低了亲和力和稳定性，有易于聚集倾向。
虽然现有技术中已经公开了多种双特异性抗体形式，但是由于一方面双特异性抗体识别不同抗原或抗原表位的亲和力存在差异，另一方面双特异性抗体各抗原结合位点之间的相对位置、走向以及自由度也极大地影响不同结合域发挥功能，因而双特异性抗体的效能也不尽相同，例如在利用募集免疫细胞(特别是T细胞、NK细胞)靶向肿瘤细胞机制的双特异性抗体中，由于不同结构双特异性抗体在诱导免疫突触形成时有着不同的能力，因此造成了不同的肿瘤细胞裂解活性，从而影响该抗体的临床应用。
因此，本领域仍然需要可供选择的具有改善性能的双特异性抗体结构。本发明的一个优选实施方案提供了新的双特异性抗体结构(VFV-Ig,Variable domain-Fab-Variable domain Immunoglobulin)，其有利于双特异性抗体分子介导的不同细胞间的相互作用，例如高效诱导效应细胞杀伤靶细胞的能力，且其易于在体外的培养细胞中有效表达，不需要复杂的生产工艺。本发明提供的新结构的双特异性抗体能够选择性地保持各抗原结合位点与相应的不同表位结合的亲和力，且在结合不同表位的时候互相之间不会产生空间位阻的干扰，具有良好的成药性；进一步地，本发明提供的双特异性抗体样式是物理稳定的和生物学稳定的，这允许该抗体具有更好的生产性和可发展性。
发明概述
本发明公开了通过抗体工程方法构建的一类新型的抗体分子。所述抗体分子能够以高亲和力和高特异性与两种抗原结合。本发明还提供了编码所述抗体分子的核酸分子、用于产生所述抗体分子的表达载体、宿主细胞和方法。
本发明涉及一类双或多特异性抗体，其包含至少两个抗原结合位点，其中一个可以为免疫球蛋白Fab的抗原结合位点，另一个抗原结合位点是由两个相互配合的结构域(例如VH结构域和VL结构域)相互作用形成；两个相互配合的结构域通过连接子分别串联于Fab同一重链或者同一轻链的N端和C端，这两个结构域本身并不直接相连，而是由Fab重链或者轻链可变区与恒定区形成的空间角度介导在空间上相互交叉，从而使得两个结构域相互作用形成所述另一个抗原结合位点；例如图1晶体结构所示的双特异性抗体，为本发明一优选实施方案提供的双特异性抗体(VFV-Ig,Variable domain-Fab-Variable domainImmunoglobulin)。
本发明抗体分子中的抗原结合位点可以结合不同的抗原，或者可以结合相同抗原分子中的不同表位。不特别地限制本发明的抗体分子特异性结合的抗原类型，抗原可以是例如细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。在一个实施方案中，本发明的抗体分子特异性结合的抗原选自肿瘤相关抗原、免疫检查点分子、血管新生诱导因子、肿瘤坏死因子受体超家族成员和免疫系统中的共刺激分子，以及这些分子的配体和/或受体。
在本发明通篇内容中，除非特别指出，否则缩写“VH”指抗体重链可变结构域，“CH1”指抗体重链的第一恒定结构域，“VL”指抗体轻链可变结构域，“CL”指抗体轻链恒定结构域，“L1”和“L2”分别指连接子序列，“VHa”与“VLa”指来自相同的抗体a的VH和VL，“VHb”与“VLb”指来自相同的抗体b的VH和VL。本发明中给出的多肽结构均采用从N末端至C末端方向的顺序依次列出。
因此，在一个方面，本发明提供了具有以下一种或多种结构的抗体分子：
A.具有Hxb结构的双特异性抗体
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有两种抗原结合位点的双特异性抗体(其结构在本文中称为Hxb结构，如图2B所示)，其至少包含两条多肽链，其中一条多肽链包含VHa-L1-VHb-CH1-L2-VLa或由其组成，另一条多肽链包含VLb-CL或者由其组成，其中VHa与VLa来自相同的抗体a并配对形成结合第一抗原的第一抗原结合位点，VHb与VLb来自相同的抗体b并配对形成结合第二抗原的第二抗原结合位点。
其中第一抗原结合位点所采用的结构类似Fv结构，第二抗原结合位点所采用的结构更类似天然抗体的Fab结构，因此，就亲和力而言，第二抗原结合位点相较于第一抗原结合位点更高地保留了衍生其的抗体的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的VH和VL可以来自特异性抗肿瘤相关抗原、抗免疫检查点分子、抗血管新生诱导因子、抗肿瘤坏死因子受体超家族成员或抗免疫系统中的共刺激分子的抗体。
优选地，可以用第二抗原结合位点识别肿瘤抗原，第一抗原结合位点识别免疫细胞相关靶点，因为第二抗原结合位点较第一抗原结合位点更好地保留了衍生其的抗体的亲和力，能够高效地识别肿瘤细胞，更利于治疗抗体在肿瘤组织的富集，提升治疗效果；另一方面，使用亲和力有所降低的第一抗原结合位点识别免疫细胞，能够一定程度上降低治疗抗体在免疫组织的驻留，利于治疗抗体循环至肿瘤环境，较低的亲和力也在一定程度上降低了免疫细胞的过度激活，减少治疗的副作用，提升了治疗的安全性。
在一些具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体、抗41BB抗体。在另一些具体实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa或VLb分别包含选自SEQ ID NO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29、30、31、32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa或VLb分别包含选自SEQ IDNO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:33、34、35、36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:29或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:33或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-3，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2。在一些实施方案中，L1选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQID NO:26)。L2选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:3和15，或包含SEQ ID NO:3和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:3和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:3和15组成。
在另一个实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为(GGGGS)2，L2为GGGGSGG，进一步地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:9和15，或包含SEQID NO:9和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:9和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:9和15组成。在另一个实施方案中，L1为(GGGGS)2G，L2为GGGGSGG，进一步地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:10和15，或包含SEQ ID NO:10和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:10和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ IDNO:10和15组成。
在另一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD3抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:31的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:35的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:31的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:31具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:35的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:35具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:31或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:35或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸长，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-3，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2。在一些实施方案中，L1选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQID NO:26)。L2选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:13和15，或包含SEQ ID NO:13和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:13和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:13和15组成。
在另一个实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:32的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:36的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:32的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:36的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:32或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:36或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-3，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2。在一些实施方案中，L1选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQID NO:26)。L2选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:14和15，或包含SEQ ID NO:14和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:14和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:14和15组成。
B.具有Hxa结构的双特异性抗体
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有两种抗原结合位点的双特异性抗体(其结构在本文中称为Hxa结构,如图2A所示)，其至少包含两条多肽链，其中一条多肽链包含VLa-L1-VHb-CH1-L2-VHa或由其组成，另一条多肽链包含VLb-CL或者由其组成，其中VHa与VLa来自相同的抗体a并配对形成结合第一抗原的第一抗原结合位点，VHb与VLb来自相同的抗体b并配对形成结合第二抗原的第二抗原结合位点。
其中第一抗原结合位点所采用的结构类似Fv结构，第二抗原结合位点所采用的结构更类似天然抗体的Fab结构，因此，就亲和力而言，第二抗原结合位点相较于第一抗原结合位点更高地保留了衍生其的抗体的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的VH和VL可以来自特异性抗肿瘤相关抗原、抗免疫检查点分子、抗血管新生诱导因子、抗肿瘤坏死因子受体超家族成员或抗免疫系统中的共刺激分子的抗体。
优选地，如上文所述，可以用第二抗原结合位点识别肿瘤抗原，第一抗原结合位点识别免疫细胞相关靶点。
在一些具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一些具体实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa或VLb分别包含选自SEQ ID NO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29、30、31、32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa或VLb分别包含选自SEQ IDNO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:33、34、35、36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:29或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:33或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-2，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-2，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-6。在一些实施方案中，L1选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)。L2选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQ ID NO:26)。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:1和15，或包含SEQ ID NO:1和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:1和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:1和15组成。
C.具有Lxa结构的双特异性抗体
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有两种抗原结合位点的双特异性抗体(其结构在本文中称为Lxa结构,如图2C所示)，其至少包含两条多肽链，其中一条多肽链包含VHa-L1-VLb-CL-L2-VLa或由其组成，另一条多肽链包含VHb-CH1或者由其组成，其中VHa与VLa来自相同的抗体并配对形成结合第一抗原的第一抗原结合位点，VHb与VLb来自相同的抗体并配对形成结合第二抗原的第二抗原结合位点。
其中第一抗原结合位点所采用的结构类似Fv结构，第二抗原结合位点所采用的结构更类似天然抗体的Fab结构，因此，就亲和力而言，第二抗原结合位点相较于第一抗原结合位点更高地保留了衍生其的抗体的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的VH和VL可以来自特异性抗肿瘤相关抗原、抗免疫检查点分子、抗血管新生诱导因子、抗肿瘤坏死因子受体超家族成员或抗免疫系统中的共刺激分子的抗体。
优选地，如上所述，可以用第二抗原结合位点识别肿瘤抗原，第一抗原结合位点识别免疫细胞相关靶点。
在一些具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一些具体实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa或VLb分别包含选自SEQ ID NO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29、30、31、32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa或VLb分别包含选自SEQ IDNO:33、34、35、36的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:33、34、35、36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:29或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:33或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸长。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-2，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6。在一些实施方案中，L1选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)。L2选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQ ID NO:26)。
在进一步的实施方案中，L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3，
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2和16，或包含SEQ ID NO:2和16所示的6个CDR并与SEQ ID NO:2和16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:2和16组成。
在一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:32的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:36的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:32的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:36的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:36具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:32或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:36或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-2，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6。在一些实施方案中，L1选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)。L2选自(GGGGS)3(SEQID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQ ID NO:26)。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体中的L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:5和18，或包含SEQ ID NO:5和18所示的6个CDR并与SEQ ID NO:5和18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:5和18组成。
D.具有Lxb结构的双特异性抗体
在一个实施方案中，本发明提供了一种含有两种抗原结合位点的双特异性抗体(其结构在本文中称为Lxb结构,如图2D所示)，其至少包含两条多肽链，其中一条多肽链包含VLa-L1-VLb-CL-L2-VHa或由其组成，另一条多肽链包含VHb-CH1或者由其组成，其中VHa与VLa来自相同的抗体a并配对形成结合第一抗原的第一抗原结合位点，VHb与VLb来自相同的抗体b并配对形成结合第二抗原的第二抗原结合位点。
其中第一抗原结合位点所采用的结构类似Fv结构，第二抗原结合位点所采用的结构更类似天然抗体的Fab结构，因此，就亲和力而言，第二抗原结合位点相较于第一抗原结合位点更高地保留了衍生其的抗体的亲和力。
在一些实施方案中，本发明的VH和VL可以来自特异性抗肿瘤相关抗原、抗免疫检查点分子、抗血管新生诱导因子、抗肿瘤坏死因子受体超家族成员或抗免疫系统中的共刺激分子的抗体。
优选地，如上文所述，可以用第二抗原结合位点识别肿瘤抗原，第一抗原结合位点识别免疫细胞相关靶点。
在一些具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一些具体实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含选自SEQ ID NO:29的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:29具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLa包含选自SEQ ID NO:33的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ IDNO:33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，并且VHb包含选自SEQ ID NO:30的HCDR1、HCDR2和HCDR3并与SEQ ID NO:30具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，VLb包含选自SEQ ID NO:34的LCDR1、LCDR2和LCDR3并与SEQ ID NO:34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的VHa包含SEQ ID NO:29或由其组成，VLa包含SEQ ID NO:33或由其组成，并且VHb包含SEQ ID NO:30或由其组成，VLb包含SEQ IDNO:34或由其组成。
在某些实施方案中，连接子L1和L2可以包括甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。在某些实施方案中，所述连接子具有约1至约50个氨基酸，优选具有约15个氨基酸。在另一些实施方案中，L1和L2可以相同或者不同。在一些实施方案中，L1为(GGGGS)n，其中n＝1-6，或为(GGGGS)nG，其中n＝1-6，L2为(GGGGS)n，其中n＝1-2，或者为(GGGGSGG)n，其中n＝1-2。在一些实施方案中，L1选自(GGGGS)3(SEQ ID NO:24)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:25)、(GGGGS)2G(SEQID NO:26)。L2选自GGGGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSGG(SEQ ID NO:28)
在进一步的实施方案中，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。
在进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:2和17，或包含SEQ ID NO:2和17所示的6个CDR并与SEQ ID NO:2和17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:2和17组成。
在一个实施方案中，上述Hxb、Hxa、Lxa或Lxb结构的双特异性抗体可以分别作为基础模块，分别与人免疫球蛋白Fc、铰链区(Hinge)、Fab及其变体连接，能够形成各种结构VFV-Ig，如图2所示。这些各种结构的VFV-Ig不仅降低了结合分子的聚集趋势，而且能够延长结合分子的半衰期、增加抗原结合位点位点数目、提高生物学功能，扩大其应用范围。
下面给出基于上述定义的Hxb、Hxa、Lxa或Lxb结构所获得的其他各种VFV-Ig结构的双特异性抗体。
Hxa-Fc结构
在一个具体的实施方案中，两个如上所述的Hxa结构的双特异性抗体的VHa与抗体的Fc区的N端连接，形成Hxa-Fc结构，如图2E所示。Fc区可以是本领域技术人员已知的任何适合的Fc区，在一个优选的实施方案中，Fc区来自人免疫球蛋白IgG2。
在一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，在一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。在一个具体实施方案中，所述Hxa-Fc结构的双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:6和15，或包含SEQ ID NO:6和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:6和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:6和15组成。
Hxb-Fc结构
在一个具体的实施方案中，两个如上所述的Hxb结构的双特异性抗体的VLa与抗体的Fc区的N端连接，形成Hxb-Fc结构，如图2F所示。Fc区可以是本领域技术人员已知的任何适合的Fc区，在一个优选的实施方案中，Fc区来自人免疫球蛋白IgG2。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一个实施方案中，VHb与VLb选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。
在一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。在更具体的实施方案中，所述Hxb-Fc结构的双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:7和15，或包含SEQ ID NO:7和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:7和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:7和15组成。
在另一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)2，L2为GGGGSGG。在更具体的实施方案中，所述Hxb-Fc结构的双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:11和15，或包含SEQ ID NO:11和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:11和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:11和15组成。
在另一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD3抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在另一个具体实施方案中，VHa与VLa选自抗CD3抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。更具体地，所述Hxb-Fc结构双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:13和15，或包含SEQ ID NO:13和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:13和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQID NO:13和15组成。
在一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。更优选地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQID NO:14和15，或包含SEQ ID NO:14和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:14和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:14和15组成。
Lxa-Fc结构
在一个实施方案中，两个如上所述的Lxa结构的双特异性抗体的CH1与抗体的Fc区的N端连接，形成Lxa-Fc结构，如图2G所示。Fc区可以是本领域技术人员已知的任何适合的Fc区，在一个优选的实施方案中，Fc区来自人免疫球蛋白IgG2。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一个实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。更优选地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:5和16，或包含SEQ ID NO:5和16所示的6个CDR并与SEQ ID NO:5和16具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:5和16组成。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。更具体地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:5和18，或包含SEQ ID NO:5和18所示的6个CDR并与SEQ ID NO:5和18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:5和18组成。
Lxb-Fc结构
在一个优选的实施方案中，两个如上所述的Lxb结构的双特异性抗体的CH1与抗体的Fc区的N端连接，形成Lxb-Fc结构，如图2H所示。Fc区可以是本领域技术人员已知的任何适合的Fc区，在一个优选的实施方案中，Fc区来自人免疫球蛋白IgG2。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗GPC3抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一个实施方案中，VHb与VLb选自抗CD16抗体、抗GPC3抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS。更具体地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:5和17，或包含SEQ ID NO:5和17所示的6个CDR并与SEQ ID NO:5和17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:5和17组成。
Fab-Hxb结构
在一个的实施方案中，Hxb结构的双特异性抗体的VHa与Fab的CH1 C端连接，形成Fab-Hxb结构，如图2I所示。两个Fab区可以是本领域技术人员已知的任何Fab，在一个实施方案中，两个Fab区可以是相同的或者不同的。在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一个实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为GGGGS，L2为(GGGGS)3。更具体地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:4和15，或包含SEQ ID NO:4和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:4和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:4和15组成。
在另一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗CD3抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
Hxb-铰链区结构
在一个实施方案中，两个Hxb结构的双特异性抗体的VLa分别与铰链区端连接，形成Hxb-铰链区结构，如图2J所示。铰链区可以是本领域技术人员已知的任何铰链区，在一个优选的实施方案中，铰链区可以是人免疫球蛋白IgG1。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体、抗CD3抗体或抗41BB抗体。在另一个实施方案中，VHb与VLb选自抗GPC3抗体、抗Her2抗体或抗CD20抗体。
在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个实施方案中，VHa与VLa选自抗CD16抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体，L1为(GGGGS)3，L2为GGGGS，或者L1为(GGGGS)2，L2为GGGGSGG。更具体地，所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:8和15，或包含SEQ ID NO:8和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:8和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:8和15组成，或所述双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列分别包含如SEQ IDNO:12和15，或包含SEQ ID NO:12和15所示的6个CDR并与SEQ ID NO:12和15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，或由SEQ ID NO:12和15组成。
在另一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗CD3抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。在一个优选实施方案中，VHa与VLa选自抗41BB抗体，VHb与VLb选自抗GPC3抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体还可以包含第三抗原结合位点，所述第三抗原结合位点是基于抗体分子的结合域，特别是Fab、scFv、VHH；或者所述第三抗原结合位点是基于其他具有抗原结合功能分子的结合域。
在具体的实施方案中，所述第三抗原结合位点与第一或者第二抗原相同或者不同。
在第二方面，本发明提供了编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的多核苷酸。
在第三方面，本发明提供了包含编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的多核苷酸的载体，优选提供了表达载体。
在第四方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。例如，所述宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，优选CHO细胞、HEK293细胞；所述宿主细胞是原核细胞，优选是大肠杆菌细胞。
在第五方面，本发明提供了用于产生本发明抗体分子的方法，所述方法包括步骤(i)在适于表达所述抗体分子的条件下培养本发明的宿主细胞，和(ii)从所述宿主细胞或所述培养基回收所述抗体分子。
在第六方面，本发明提供了包含本发明抗体分子的免疫缀合物，以及包含本发明抗体分子或免疫缀合物的药物组合物。本文公开的抗体分子可以单独或与其他药物或其他治疗模式联合用来治疗、预防和/或诊断疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)、肿瘤等。
在第七方面，本发明提供了本发明的抗体分子、免疫缀合物和药物组合物的用途，用作在个体中治疗和/或预防疾病的药物或用作疾病的诊断工具。优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)、肿瘤。
在第八方面，本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明的抗体分子、免疫缀合物和药物组合物。在一个实施方案中，所述疾病是自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)、肿瘤。
附图说明
图1Hxb和Lxb晶体结构示意图，箭头指示抗原结合位点位置及走向。(A)Hxb；(B)Lxb。深色代表重链，浅色代表轻链。
图2本发明涉及的各种VFV-Ig双特异性抗体结构示意图。(A)Hxa；(B)Hxb；(C)Lxa；(D)Lxb；(E)Hxa-Fc；(F)Hxb-Fc；(G)Lxa-Fc；(H)Lxb-Fc；(I)Fab-Hxb；(J)Hxb-铰链区。其中用深色代表重链，浅色代表轻链。实心填充区域代表恒定区，条纹区域代表可变区。
图3本发明涉及的各种VFV-Ig双特异性抗体和对照抗体序列信息，及ProteinA或Protein G一步纯化后单体纯度百分比(HPLC-SEC)。
图4VFV-Ig结构GPC3×CD16双特异性抗体与GPC3表达细胞结合检测。(A)GPC3×CD16 Hxa、GPC3×CD16 Lxa、GPC3×CD16 Hxb、GPC3×CD16 Lxb和对照GC33 Fab与表达GPC3的293细胞(GPC3-293)、293细胞结合能力检测；(B)GPC3×CD16 Fab-Hxb和对照GC33 Fab与GPC3-293细胞结合能力检测；(C)GPC3×CD16 Hxa-Fc、GPC3×CD16 Lxa-Fc、GPC3×CD16Hxb-Fc、GPC3×CD16 Lxb-Fc和对照GC33 mAb与GPC3-293细胞结合能力检测；(D)GPC3×CD16 Hxb10、GPC3×CD16 Hxb11、GPC3×CD16 Hxb-铰链区和对照GC33Fab与GPC3-293细胞结合能力检测。
图5VFV-Ig结构GPC3×CD16双特异性抗体与CD16a表达细胞结合检测。(A)GPC3×CD16 Hxa、GPC3×CD16 Lxa、GPC3×CD16 Hxb、GPC3×CD16 Lxb与表达CD16a的293细胞(CD16a-293)结合能力检测；(B)GPC3×CD16 Fab-Hxb与CD16a-293细胞和293细胞结合能力检测；(C)GPC3×CD16 Hxa-Fc、GPC3×CD16 Lxa-Fc、GPC3×CD16 Hxb-Fc、GPC3×CD16 Lxb-Fc和对照CD16a抗体与CD16a-293细胞和293细胞结合能力检测；(D)GPC3×CD16 Hxb10、GPC3×CD16 Hxb11、GPC3×CD16 Hxb-铰链区与CD16a-293细胞结合能力检测。
图6流式细胞术检测肿瘤细胞表面GPC3表达。(A)HepG2细胞；(B)Huh7细胞。
图7VFV-Ig结构GPC3×CD16双特异性抗体诱导PBMC杀伤靶细胞的活性检测。(A)GPC3×CD16 Hxa、GPC3×CD16 Lxa、GPC3×CD16 Hxb、GPC3×CD16Lxb诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(B)GPC3×CD16 Fab-Hxb诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(C)GPC3×CD16 Hxa-Fc、GPC3×CD16 Lxa-Fc、GPC3×CD16Hxb-Fc和对照GC33抗体诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(D)GPC3×CD16Hxa-Fc、GPC3×CD16 Lxa-Fc、GPC3×CD16 Hxb-Fc、GPC3×CD16 Lxb-Fc诱导的HepG2细胞杀伤活性检测。
图8(E)GPC3×CD16 Hxb、GPC3×CD16 Hxb10、GPC3×CD16 Hxb11诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(F)GPC3×CD16 Hxb-Fc、GPC3×CD16 Hxb-铰链区诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(G)GPC3×CD16 Hxb-Fc、GPC3×CD16Hxb10-Fc、GPC3×CD16 Hxb-铰链区、GPC3×CD16 Hxb10-铰链区诱导的HepG2细胞杀伤活性检测；(H)GPC3×CD16 Hxb-Fc诱导的Huh7细胞杀伤活性检测。
图9GPC3×CD3 Hxb-Fc细胞结合及Jurkat细胞激活活性检测。(A)GPC3×CD3 Hxb-Fc和对照GC33抗体与GPC3-293细胞结合能力检测；(B)GPC3×CD3 Hxb-Fc与Jurkat细胞结合能力检测；(C)靶细胞介导的GPC3×CD3Hxb-Fc依赖的NFAT-GFP-Jurkat细胞激活检测。
图10VFV-Ig结构GPC3×41BB双特异性抗体细胞结合检测。(A)GPC3×41BB Lxa-Fc、GPC3×41BB Hxb-Fc和对照GC33抗体与GPC3-293细胞结合能力检测；(B)GPC3×41BBLxa-Fc、GPC3×41BB Hxb-Fc和对照Utomilumab抗体与41BB-293细胞结合能力检测。
图11VFV-Ig结构GPC3×CD3双特异性抗体介导的HepG2肿瘤细胞杀伤活性检测。(A)介导的人PBMC细胞杀伤活性检测，效应细胞/靶细胞＝10:1；(B)介导的激活的T细胞杀伤活性检测，效应细胞/靶细胞＝5:1；(C)介导的激活的T细胞杀伤活性检测，效应细胞/靶细胞＝3:1。
图12对照结构GPC3×CD3双特异性抗体。(A)IgG-scFv结构；(B)KIH，Knob-in-Hole结构。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
I.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“抗原结合蛋白”、“抗原结合多肽”在本文中可互换使用，指包括抗原结合区或抗原结合部分的蛋白质或多肽，对与其结合的另一分子具有强亲和力。
术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和呈现期望的抗原结合活性的抗体片段、抗原结合蛋白、融合蛋白等。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。在一个给定的VH或VL氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的方案的任一一种或其组合确定，所述方案包括例如：Chothia(Chothia等人(1989)Nature 342:877-883),Kabat(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health andHuman Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)。本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合及人为评估确定边界。
术语“抗原结合片段”、“抗体片段”在本文中可以互换使用，是指，非完整抗体的分子，其包括完整抗体的部分，所述部分结合该完整抗体所结合的抗原和/或表位。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)。所述Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段(其它抗体片段的更详细的描述请参见：基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul编辑,RavenPress,N.Y.(1993))。所述Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性连接子连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv。可以通过化学方法、重组DNA方法或蛋白酶消化法获得所述抗体片段。
如本文所用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子中与抗原实际结合的区域，包括例如由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的VH/VL对。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体分子包含至少两个抗原结合位点。
如本文所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。
如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。本文提供的抗体通常是双特异性抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences ofProteins ofImmunological Interes,第5版,Public Health Service,National InstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗癌症或细胞增殖性疾病的有效性。Fc区的修饰包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、和添加多个Fc。对Fc的修饰还可以改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，从而实现更低频率的给药和因而增加的方便和减少的材料使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731，734-735页。
术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“连接子”或“接头”是指由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接抗体中的各个可变结构域。在某些实施方案中，所述接头可以为约1至约100个氨基酸长，例如，约1至50个氨基酸长。在一个实施方案中，连接肽是G/S连接肽，包括氨基酸序列(GGGGS)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数。在一个实施方案中，所述柔性连接子是(GGGGS)nG、(GGGGSGG)n。接头的非限制性实例公开于Shen等，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)和WO 2014/087010中，将其内容全部按引用并入本文中。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的流式细胞结合测定法。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。在本文的一些实施方案中，第一抗原、第二抗原、第三抗原是三种不同的抗原。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗药或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱等)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
在本发明中，就抗体序列而言，氨基酸序列同一性百分数通过将候选抗体序列与参考抗体序列最佳比对后，在一个优选方案中按照Kabat编号规则进行最佳比对后，予以确定。在本文中，在不指定比较窗(即待比较的目标抗体区域)的情况下，将适用于在参考抗体序列的全长上进行比对。在一些实施方案中，就抗体而言，序列同一性可以分布在整个重链可变区和/或整个轻链可变区上，或序列百分数同一性可以仅限定于构架区，而对应CDR区的序列保持100％相同。
类似地，就抗体序列而言，基于比对，可以确定相对于参考抗体在目标抗体区域具有氨基酸改变的候选抗体。
在本发明中，“保守性取代”是指导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸的氨基酸改变。可以通过本领域已知的标准方法，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将氨基酸修饰如取代引入本发明的抗体中。
提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。在一个优选的方面，保守取代残基来自以下的保守替代表A，优选地为表A中所示的优选保守取代残基。
表A
Figure BDA0003695724300000261
Figure BDA0003695724300000271
术语“N端”指N端的最末氨基酸，术语“C端”指C端的最末氨基酸。
抗体CDR区、“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”(在本文中与“超变区”、“HVR”可以互换使用)，是抗体可变区中主要负责与抗原表位结合的氨基酸区域。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案。例如，Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触性”(Contact)HVR基于对可获得的复杂晶体结构的分析。根据不同的CDR确定方案，这些HVR中的每一个HVR/CDR的残基如下所述。
Figure BDA0003695724300000272
Figure BDA0003695724300000281
HVR也可以是根据Kabat编号系统位于如下Kabat残基位置的HVR序列：
VL中的位置24-36或24-34(LCDR1)，位置46-56或50-56(LCDR2)，和位置89-97或89-96位置(LCDR3)；和VH中的位置26-35或27-35B(HCDR1)，位置50-65或49-65(HCDR2)，和位置93-102、94-102或95-102(HCDR3)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下Kabat残基位置的HVR序列：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置27-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置93-102(HCDR3)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR是根据Kabat编号系统位于如下Kabat残基位置的HVR序列：
VL中的位置24-34(LCDR1)、位置50-56(LCDR2)、和位置89-97(LCDR3)，以及VH中的位置26-35B(HCDR1)、位置50-65(HCDR2)、和位置95-102(HCDR3)。
HVR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”或“HVR”或“HVR序列”涵盖以上述任一种方式确定的HVR或CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
“铰链区”通常是指人IgG1的氨基酸Glu216至Pro230(参见Burton，Molec.Immunol.22:161-206(1986))。在某些实施方案中，通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“感染性疾病”是指病原体引发的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、寄生虫感染或真菌感染。
II.本发明的抗体分子
本发明所涉及的双特异性抗体结构(VFV-Ig)，其充分利用抗体Fab结合域的可变区与恒定区(即VH与CH1或者VL与CL)所形成的空间角度，介导串联于同一Fab片段重链(或轻链)首尾的抗原结合片段(例如VH和VL)在空间相互作用交叉形成第二抗原结合位点Fv，从而大大降低了第二结合域Fv的自由度，使两个抗原结合域(例如Fab和Fv)之间形成较为固定的相反走向。可根据不同靶标的生物学性质有倾向性地选择不同结合域的结构，发挥组合优势。
该VFV-Ig结构有利于双特异性抗体分子介导的不同细胞间的相互作用，例如高效诱导效应细胞杀伤靶细胞的能力。且易于在体外的培养细胞中有效表达，不需要复杂的生产工艺。本发明的双特异性抗体结构能够保持该双特异性抗体中的各抗原结合位点与相应的不同表位结合的亲和力，且在结合不同表位的时候互相之间不会产生空间位阻的干扰，具有良好的成药性。进一步地，本发明的双特异性抗体样式是物理稳定的和生物学稳定的，这允许该抗体具有更好的生产性和可发展性。
此外，由于本申请双特异性抗体分子中针对一个抗原的分子采用了结合能力相对削弱的Fv结构，因此，相较于原完整全抗体而言，各VFV-Ig结构的双特异性抗体结合相应抗原的活性相对较弱。这种设计一方面可以避免免疫细胞的过度激活，从而降低分子的免疫原性，另一方面也避免了双特异性抗体在免疫组织的过度驻留，有利于在肿瘤组织的富集，从而提高治疗效果。
发明人发现通过改变连接子长度，可进一步优化降低双特异性抗体的聚集趋势，提高单体产率，并提高其生物学活性。
在一些实施方案中，本发明抗体分子中的Fab片段来源于单克隆抗体并且可来源于任何类型的抗体，包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE及其亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链结构域可来源于κ链或λ链。另外，本文所用的Fab片段也可通过重组制备。在一些实施方案中，本发明抗体分子的Fab片段中的CH1结构域、CL结构域均来自人免疫球蛋白的相应部分或具有与之基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多同一)的序列。
本发明的双特异性抗体分子所针对的抗原包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。
在一些实施方案中，本发明的抗体分子具有说明书附图2中例示的任一结构。
下面例示一些本发明的抗体分子
i)在一个实施方案中，本发明的抗体分子是抗GPC3和CD16的双特异性抗体
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族之一。GPC3可能参与发育中的细胞分裂或癌细胞生长，已有资料表明GPC3可作为肝细胞癌治疗和诊断的潜在靶点(M.Feng和M.Ho，2014，FEBS Letters 588：377–382；SHIRAKAWA et al,2009,INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 34:649-656)。
CD16(也称作FcyRIII)是一种对某些与抗体依赖细胞毒性(ADCC)有关的IgGs的Fc片段具有低亲和性的受体，该受体是得到最好表征的负责引发NK细胞对靶细胞的溶解的膜受体(Mandelboim等1999.PNAS 96:5640-5644)。人FcyRIII具有FcyRIIIA和FcyRIIIB两种亚型，它们的胞外免疫球蛋白结合区域序列具有96％的序列同一性(van de Winkel和Capel，1993,Immunol Today 14(5):215-221)，利用双特异性抗体同时靶向癌细胞抗原和CD16A能够有效募集免疫细胞，如NK细胞，杀伤清楚靶标肿瘤细胞，从而实现癌症治疗(UweReusch et al 2014,mAbs,6:3,728–739)。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含特异性结合GPC3的Fab片段和抗CD16的Fv。对于所述特异性结合GPC3的Fab片段，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗GPC3抗体的Fab片段；对于所述抗CD16的Fv，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗CD16抗体的Fv片段。
在一个实施方案中，本发明的抗GPC3/CD16双特异性抗体分子具有如附图2A-J中例示的任一结构。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD16双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个重链互补决定区(CDR)与轻链CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸改变(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD16双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6个重链与轻链互补决定区(CDR)并与SEQ ID NO:30/34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD16双特异性抗体中的所述特异性结合CD16的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:29/33的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸变化(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD16双特异性抗体中的所述特异性结合CD16的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:29/33的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6个CDR并与SEQ ID NO:29/33具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
ii)在一个实施方案中，本发明的抗体分子是抗GPC3和CD3的双特异性抗体
CD3是T淋巴细胞表面特异分子，其为T淋巴细胞受体(TCR)复合体的组成部分，TCR在细胞表面的表达、抗原识别及信号传导中是必不可少的。通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。CD3的单克隆抗体可以诱导或阻止T淋巴细胞活化。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含特异性结合GPC3的Fab片段和抗CD3的Fv。对于所述特异性结合GPC3的Fab片段，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗GPC3抗体的Fab片段；对于所述抗CD3的Fv，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗CD3抗体的Fv片段。
在一个实施方案中，本发明的抗GPC3/CD3双特异性抗体分子具有如附图2A-J中例示的任一结构。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸变化(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6个CDR并与SEQ ID NO:30/34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合CD3的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:31/35的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸变化(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合CD3的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:31/35的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6CDR并与SEQ ID NO:31/35具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
iii)在一个实施方案中，本发明的抗体分子是抗GPC3和CD41BB的双特异性抗体
41BB(也称作CD137，TNFRSF9等)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质，存在于广泛的免疫细胞亚系包括激活的NK和NKT细胞、调节性T细胞、树突状细胞(DC)、刺激的肥大细胞、分化中的髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中(Wang,2009,Immunological Reviews229:192-215)。对于41BB受体的刺激能够有效激活免疫细胞，如T细胞、NK细胞等，从而增强免疫疗法对于肿瘤的治疗，目前以41BB为靶点的多项临床试验正在开展中(Cariad Chester et al,2017,Blood doi:10.1182/blood-2017-06-741041)。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含特异性结合GPC3的Fab片段和抗CD41BB的Fv。对于所述特异性结合GPC3的Fab片段，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗GPC3抗体的Fab片段；对于所述抗CD41BB的Fv，其包含衍生自任何现有技术中报导的抗CD41BB抗体的Fv片段。
在一个实施方案中，本发明的抗GPC3/CD41BB双特异性抗体分子具有如附图2A-J中例示的任一结构。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD41BB双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸变化(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合GPC3的Fab片段包含衍生自SEQ ID NO:30/34的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6个CDR并与SEQ ID NO:30/34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD3双特异性抗体中的所述特异性结合CD41BB的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:32/36的成对重链可变区序列/轻链可变区序列中所含的全部6个CDR，或者与所述6个CDR中的一个或多个CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸变化(例如，氨基酸置换或缺失)的序列，但是该氨基酸改变基本上不影响所述双特异性抗体的功能。
在一个实施方案中，本发明抗GPC3/CD41BB双特异性抗体中的所述特异性结合CD41BB的Fv片段包含衍生自SEQ ID NO:32/36的成对重链可变区序列/轻链可变区序列的6个CDR并与SEQ ID NO:31/35具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。
不特别地限制本发明双特异性抗体(例如抗GPC3/CD16双特异性抗体、抗GPC3/CD3双特异性抗体、抗GPC3/CD41BB双特异性抗体)中重链恒定区CH1结构域和Fc区(包含CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域)的类型，优选地是衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白重链恒定区的相应结构域，或与之基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多同一)的序列。更优选地，所述重链恒定区CH1结构域和Fc区衍生自人IgG1免疫球蛋白的重链恒定区的CH1结构域和Fc区，或与之基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多同一)的序列。
在一个实施方案中，本发明在Fc结构域中包含影响抗体效应子功能的氨基酸突变。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是LALA突变。
在具体的实施方案中，本发明的抗GPC3/CD16双特异性抗体包含SEQ ID NO:1所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:2所示重链和SEQ ID NO:16所示轻链；包含SEQ ID NO:3所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:2所示重链和SEQ ID NO:17所示轻链；包含SEQ ID NO:4所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:5所示重链和SEQ ID NO:16所示轻链；包含SEQ ID NO:5所示重链和SEQ ID NO:17所示轻链；包含SEQ ID NO:6所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:7所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:8所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:9所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:10所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:11所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链；包含SEQ ID NO:12所示重链和SEQ IDNO:15所示轻链，或与任一所述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一)的序列。本发明的抗GPC3/CD16双特异性抗体能够同时与GPC3和CD1蛋白结合，且维持了与亲本抗体相当的亲和力常数。
在具体的实施方案中，本发明的抗GPC3/CD3双特异性抗体包含SEQ ID NO:13所示重链和SEQ ID NO:15所示轻链，或与任一所述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一)的序列。本发明的抗GPC3/CD3双特异性抗体能够同时与GPC3和CD3蛋白结合，且维持了与亲本抗体相当的亲和力常数。
在具体的实施方案中，本发明的抗GPC3/CD41BB双特异性抗体包含SEQ ID NO:5所示重链和SEQ ID NO:18所示轻链；包含SEQ ID NO:14所示重链和SEQ ID NO:18所示轻链，或与任一所述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一)的序列。本发明的抗GPC3/CD41BB双特异性抗体能够同时与GPC3和CD41BB蛋白结合，且维持了与亲本抗体相当的亲和力常数。
下表给出本申请示例性的序列及其编号：
Figure BDA0003695724300000351
Figure BDA0003695724300000361
Figure BDA0003695724300000371
Figure BDA0003695724300000381
Figure BDA0003695724300000391
Figure BDA0003695724300000401
III.本发明的抗体分子变体
在某些实施方案中，构思了本文例示的双特异性抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善双特异性抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码双特异性抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备双特异性抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
在某些实施方案中，本文通过对抗体添加或缺失糖基化位点而提供双特异性抗体的糖基化变体，以提高或降低抗体糖基化的程度。
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包括包含在一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
IV.免疫缀合物
本发明的抗体分子能够重组融合于或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽以产生融合蛋白。蛋白质、多肽或肽与抗体融合或缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929和EP 367,166。
另外，本发明的抗体分子可以与标记序列(如肽)融合以促进纯化。
在其他实施方案中，本发明的抗体分子与诊断剂或可检测剂缀合。这类抗体可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的效力)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶(例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)；辅基(例如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)；荧光物质(例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明等)；发光物质(例如但不限于鲁米诺)；生物发光物质(例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白)；放射性物质(例如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)等；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本发明还包括与治疗性部分缀合的抗体分子的用途。抗体分子可缀合到治疗性部分，如细胞毒素(例如细胞生长抑制剂或细胞杀伤剂)，治疗剂或放射性金属离子，例如α发射体。术语“细胞毒素”或“细胞毒性剂”包括有害于细胞的任何物质。
另外，本发明的抗体分子可以与调节给定生物学反应的治疗性部分或药物部分缀合。治疗性部分或药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活物、凋亡剂、抗血管生成剂或生物学反应调节物，例如淋巴因子。
另外，本发明的抗体分子可以缀合至治疗性部分如放射性金属离子，如α-发射体如213Bi或可用于使放射金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)缀合至多肽的大环螯合剂。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附着到抗体上。这类接头分子是本领域公知的并且在Denardo等人,1998,Clin Cancer Res.4(10):2483-90中描述，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。
用于治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如Arnon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy”，引自MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编著)，第243-256页(AlanR.Liss,Inc.1985)。
抗体也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
V.本发明的抗体分子的生产和纯化
本发明的抗体分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码所述抗体分子的任意一条多肽链和/或多条多肽链的多核苷酸分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离所述多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明的抗体分子的任何种类的细胞系统。适于复制和支持本发明的抗体分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的本发明抗体分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods inMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO、HEK293或NSO细胞。
本领域已知在这些宿主细胞系统中表达外源基因的标准技术。在一个实施方案中，提供了产生本发明的抗体分子的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗体分子的条件下培养如本文中提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述抗体分子的多核苷酸，并且从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体分子。
如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
VI.药物组合物和试剂盒
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本文所述的抗体分子。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
本文中还公开了本文所述的抗体分子与一种以上治疗剂组合后获得的组合物，所述治疗剂选自以下类别(i)-(iii)中的一个、两个或全部类别：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的药物；(ii)增强效应细胞反应(例如，B细胞和/或T细胞活化和/或动员)的药物；或(iii)减少免疫抑制的药物。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹腔(i.p.)、肌内)注射。在一个优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体分子。在另一个优选实施方案中，通过肌内、腹腔或皮下注射施用抗体分子。
如本文所用的短语“肠胃外施用“和“肠胃外方式施用”意指除了肠施用和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、皮内、腹腔、经气管、皮下注射和输注。
治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或冻干形式。可以通过将活性化合物(即抗体分子)以要求的量加入适宜的溶剂中，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和其他成分。可以使用包衣剂如卵磷脂等。在分散体的情况下，可以通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适宜流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起可注射组合物的延长吸收。
在某些实施方案中，可以口服施用本发明的抗体分子，例如随惰性稀释剂或可食用载体一起经口施用。本发明的抗体分子也可以封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中、压缩成片剂或直接掺入受试者的膳食中。对于口服治疗施用，所述化合物可以随赋形剂一起掺入并且以可摄取的片剂、颊用片剂、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。为了通过非肠胃外施用方法施用本发明的抗体分子，可能需要将所述抗体分子与防止其失活的材料包衣或随这种材料共施用。还可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述抗体分子。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明的抗体分子抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。
包含本文所述抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。
VII.抗体分子的用途
本文公开的抗体分子具有体外和体内诊断用途以及治疗性和预防性用途。例如，可以将这些分子施用至体外或离体的培养细胞或施用至受试者，例如，人类受试者，以治疗、预防和/或诊断多种抗原相关的疾病，例如癌症、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)。
在一个方面，本发明提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与如本文所述的抗体分子接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述抗体分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测相关抗原。可以使用的检测方法包括免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、ELISA测定、PCR技术(例如，RT-PCR)或体内成像技术。一般地，体内和体外检测方法中所用的抗体分子直接或间接地用可检测物质标记以促进检测结合的或未结合的结合物。合适的可检测物质包括多种生物学活性酶、辅基、荧光物质、发光物质、顺磁(例如，核磁共振活性)物质和放射性物质。
在一些实施方案中，体内确定相关抗原的水平和/或分布，例如，以非侵入方式确定(例如，通过使用合适的成像技术(例如，正电子发射断层摄影术(PET)扫描)检测可检测物标记的本发明抗体分子。在一个实施方案中，例如，通过检测用PET试剂(例如，18F-氟脱氧葡萄糖(FDG))以可检测方式标记的本发明抗体分子，体内测定相关抗原的水平和/或分布。
在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述抗体分子和使用说明书的诊断试剂盒。
在另一个方面，本发明涉及使用本发明的抗体分子体内用来治疗或预防需要在受试者中调节免疫应答的疾病，从而抑制或减少相关疾病如癌性肿瘤、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性传染病或败血症)的出现或复发。可以单独使用本发明的抗体分子。备选地，抗体分子可以与其他癌症治疗剂/预防剂组合施用。当本发明的抗体分子与一种或多种其他药物组合施用时，这种组合可以按任何顺序施用或者同时施用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体分子。在另一个实施方案中，本发明提供一种防止受试者中疾病出现或者复发的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本文所述的抗体分子。
在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的癌包括但不限于实体瘤、血液学癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多发性骨髓瘤)及转移性病灶。在一个实施方案中，癌是实体瘤。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌，如侵袭肺、乳房、卵巢、淋巴样、胃肠道的(例如，结肠)、肛门、生殖器和生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，脑、神经的或神经胶质细胞)、头和颈、皮肤(例如，黑素瘤)、鼻咽(例如，分化或未分化的转移性或局部复发性鼻咽癌)和胰的那些癌、以及腺癌，包括恶性肿瘤，如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。
在一些实施方案中，癌选自黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃肠道间质肿瘤(GIST)、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、胃癌、血液学恶性病(例如，淋巴瘤)。
在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原体或常规疫苗对其未及完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、(甲型、乙型和丙型)肝炎、流感、疱疹、贾弟鞭毛虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。本发明例示的抗体分子对PD-L1阻断作用特别可用来对抗随感染过程推移出现变异抗原的病原体(如HIV)所建立的感染。这些变异抗原在施用抗人PD-L1抗体时能够被视为外来抗原，由此，本发明例示的抗体分子能够通过PD-L1激发不受负向信号抑制的强烈T细胞反应。
在一些实施方案中，用本发明的抗体分子治疗和/或预防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，来下调免疫系统。可以通过施用本发明抗体分子治疗和/或预防的自身免疫疾病的例子包括但不限于斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎节段性回肠炎、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎等。可以通过施用本发明抗体分子治疗和/或预防的炎性疾病的例子包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、过敏性疾病、败血性休克、肺纤维化、关节炎和因慢性病毒性或细菌性感染产生的慢性炎症。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
除非另外指明，实施本发明将利用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们属于本领域的技术范围。此类技术在以下文献中得到充分说明：“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press，Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，以及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等人编辑，1994)；Singleton等人，Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)；和March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure，第4版，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)，它们为本领域的技术人员提供在本申请中使用的多个术语的一般指导。
实施例1双特异性抗体分子构建
为验证本发明公开的各种VFV-Ig结构的双特异性抗体分子均有相应的功能，作为示例，分别构建以下分子组合的各种VFV-Ig结构双特异性抗体分子：GPC3×CD16、GPC3×CD3和GPC3×41BB。其中，抗人GPC3人源化单克隆抗体序列信息来自专利US 2007/0190599A1，抗人CD16a单克隆抗体序列信息来自专利US 2009/0214574 A1，抗人CD3e人源化单克隆抗体序列信息来自专利US 2018/0057597 A1，抗人4-1BB人源化单克隆抗体(Utomilumab)序列信息来自专利US 2013/0078240 A1，如下所示：
抗人CD16a单克隆抗体:
重链可变区(VHCD16)(SEQ ID NO:29):
Figure BDA0003695724300000481
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
轻链可变区(VLCD16)(SEQ ID NO:33):
Figure BDA0003695724300000482
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
抗人GPC3人源化单克隆抗体
重链可变区(VHGPC3)(SEQ ID NO:30):
Figure BDA0003695724300000483
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
轻链可变区(VLGPC3)(SEQ ID NO:34):
Figure BDA0003695724300000484
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
抗人CD3e人源化单克隆抗体
重链可变区(VHCD3)(SEQ ID NO:31):
Figure BDA0003695724300000485
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
轻链可变区(VLCD3)(SEQ ID NO:35):
Figure BDA0003695724300000486
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
抗人4-1BB人源化单克隆抗体
重链可变区(VH41BB)(SEQ ID NO:32):
Figure BDA0003695724300000491
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
轻链可变区(VL41BB)(SEQ ID NO:36):
Figure BDA0003695724300000492
其中Kabat互补决定区以下划线给出。
本申请获得的各种VFV-Ig结构的双特异性抗体分子的结构示意图如图2所示，并根据抗体分子重链可变区、轻链可变区等的不同排列方式分别命名为(A)Hxa；(B)Hxb；(C)Lxa；(D)Lxb；(E)Hxa-Fc；(F)Hxb-Fc；(G)Lxa-Fc；(H)Lxb-Fc；(I)Fab-Hxb和(J)Hxb-铰链区。除非另外说明，否则上下文中述及诸如Hxa、Hxb等的指代意指具有相应Hxa、Hxb结构的双特异性抗体分子。例如，在涉及GPC3×CD16分子的上下文中，“Hxa”、“Hxa分子”或“Hxa结构”指具有如图2所示Hxa结构的GPC3×CD16分子。
分子构建方法
根据本申请说明书、图3及序列表中公开的序列信息，将各个双特异性抗体的氨基酸序列逆翻译成相应核苷酸序列，并对核苷酸序列进行密码子优化后做全基因合成(委托GenScript完成)，其中部分序列采用overlap PCR法拼接完成，所有抗体的表达均使用相同的小鼠免疫球蛋白信号肽：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:37)。然后分别将所得编码DNA序列采用标准分子克隆方法(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual)克隆至pCDNA3.4(Thermo Fisher Scientific)表达载体。所得表达载体的质粒DNA经内毒素控制质粒中等规模抽提试剂盒(Qiagen)制备，用于细胞转染。
实施例2抗体表达、纯化与分析
抗体表达
根据制造商的说明，采用PEI(PolyScience)转染方法，通过将如实施例1制备的表达本申请各个抗体的pCDNA3.4载体转染悬浮培养的293细胞产生抗体。简述为，将293细胞悬浮培养于无血清CD培养基(ACROBiosystems)中，密度维持在0.5-3×10^6/mL之间，转染前一天将细胞按密度1×10^6/mL传代。转染当天细胞应生长至2×10^6/mL左右，细胞活率>95％。按照每mL细胞加入1ug DNA的用量(重轻链摩尔比为1:1.2)，预先分别溶解DNA和PEI于1/20转染细胞体积的Opti-MEM I Reduced Serum Media培养基中，然后将PEI溶液逐滴加入到DNA溶液中涡旋充分混匀(DNA与PEI比例为1：2.5)，室温孵育15分钟后逐滴加入到293细胞悬液中，于37℃8％CO2摇床中125rpm培养约7天，至活细胞比率<50％，离心收集培养上清。
抗体纯化及定量
室温，4000g离心5分钟收集上述细胞培养上清，经0.45um滤膜过滤后，使用ProteinA(含Fc抗体)或者Protein G(不含Fc抗体)预装柱(GE Life Sciences)根据生产商的说明进行纯化，经纯化的抗体使用超滤管(Thermo Fisher Scientific)进行浓缩及换液，所有抗体最终均换液至PBS缓冲液中，并使用BCA(Pierce)法进行定量，将各个抗体的终浓度均调整至约1mg/mL。
抗体HPLC-SEC分析
为了进一步研究在溶液中的各种结构VFV-Ig双特异性抗体的物理特性，使用尺寸排阻色谱法(SEC)来分析每一种蛋白质。各取50ul终浓度约1mg/mL的抗体蛋白溶液施加于
Figure BDA0003695724300000501
SuperSW3000的300×4.6mm柱(TOSOH)上。使用HPLC仪器进行SEC。所有蛋白质都使用UV检测，在280nm下测定。
根据实验结果发现，Hxa,Hxb,Lxa和Lxb形式的GPC3×CD16双特异性结构均能良好表达，其中Fv与抗体重链融合的Hxa,Hxb结构表达量高于Fv与抗体轻链融合的Lxa和Lxb结构(图3)。
HPLC-SEC分析显示Hxa,Hxb,Lxa和Lxb结构均有不同程度的聚体形成，其中在Hxb结构中聚体产生的比例最低，单体比例达到了78.65％。为了进一步提高抗体的表达，降低聚体的含量，作为示例，发明人选择Hxb结构做进一步的研究。根据晶体结构，发明人优化了Hxb结构的2个连接子长度，其中发现所产生的Hxb10和Hxb11结构的单体比例分别提升到了91.49％和90.32％(图3)。
GPC3×CD16组合双特异性抗体通过与Fc融合产生的Hxa-Fc,Hxb-Fc,Lxa-Fc和Lxb-Fc结构相比融合前，在表达时的单体比例也都有一定程度的提高，特别是Hxb-Fc达到了93.81％。与Fab融合产生的Fab-Hxb更是达到了97.75％(图3)。
对Hxb结构2个连接子长度进行的优化，也同样提高了铰链区融合结构Hxb-铰链区的单体比例(GPC3×CD16 Hxb-铰链区：83.86％；GPC3×CD16 Hxb10-铰链区：93.79％)，但对于原本单体比例比较高的Hxb-Fc则无明显效果。
此外，根据GPC3xCD16结果，优选Hxb-Fc结构构建的其它组合双特异性抗体，如GPC3×CD3和GPC3×41BB也均能成功表达，进一步证实VFV-Ig结构双特异性抗体的可行性(图3)。
实施例3双特异性抗体结合能力检测
细胞培养
实施例中使用的293细胞和Jurkat细胞均购自中科院细胞库，按照说明书的方法进行培养。
GPC3-293、CD16a-293及41BB-293细胞株构建
表达人GPC3、CD16a和4-1BB的真核表达pCMV3载体(带有Hygromycin抗性)均购自艺翘神州生物科技有限公司，根据生产商的说明，采用PEI转染方法将所述载体分别转染293细胞，48小时后将细胞培养基更换为含有终浓度为800ug/mL Hygromycin(ThermoFisher Scientific)的选择培养基，常规条件培养一周后采用有限稀释法进行单克隆筛选，单克隆细胞经流式细胞术检测确认GPC3、CD16a或4-1BB表达后分别命名为GPC3-293细胞、CD16a-293细胞或41BB-293细胞，将所述细胞维持培养于含终浓度为200ug/mLHygromycin的完全培养基中。
流式细胞术检测抗体结合能力
使用胰酶(Gibco)消化生长至汇合的GPC3-293、CD16a-293和41BB-293细胞，然后通过加入含血清的完全培养基终止消化，将细胞在室温下，300g离心5分钟，弃上清然后重悬于0.5％FBS-PBS(PBS,HyClone；FBS,Gibco)中，将细胞以10万个细胞/孔的浓度加入培养皿，然后分别加入经3倍梯度稀释的抗体，使抗体在培养基中的终浓度分别为100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.14、0nM，一式两份，4℃孵育1小时。弃培养基，使用0.5％FBS-PBS洗涤2次，添加新鲜培养基，然后加入荧光色素标记的二抗(对于含Fc的抗体，使用anti-Fc荧光抗体，对于不含Fc的抗体，使用anti-Fab荧光抗体，所述抗体均购自Abcam)4℃孵育0.5小时，弃培养基，使用0.5％FBS-PBS洗涤后，使用流式细胞仪(BD Biosciences)检测。
根据实验结果发现，Hxa,Hxb,Lxa和Lxb结构的GPC3×CD16分子均能有效结合表达GPC3的293细胞，但不与293细胞(空白对照)结合。除Lxa和Lxb结构的GPC3×CD16分子结合表达GPC3的293细胞的能力有所下降之外，Hxa、Hxb和Hxb10、Hxb11结构的GPC3×CD16分子则较好地保持了与对照抗体GC33-Fab(自行构建表达)相似的细胞结合能力(图4A/4D)。此外，与Fab和铰链区融合的Fab-Hxb和Hxb-铰链区结构的GPC3×CD16分子也均保持了较高的细胞结合活性(图4B/4D)。与原抗体GC33相比，与Fc融合的Hxa-Fc,Hxb-Fc,Lxa-Fc和Lxb-Fc结构的GPC3×CD16分子结合细胞的能力均有不同程度的下降，其中相较于Lxa-Fc和Lxb-Fc结构的GPC3×CD16分子，Hxa-Fc和Hxb-Fc结构的GPC3×CD16分子则较好地保持了结合活性，与原抗体GC33更为接近(图4C)。
为检测各种结构的GPC3×CD16双特异性抗体另外一端CD16的细胞结合活性，使用经转染表达CD16a的293细胞进行流式细胞术检测(基本方法同上)。结果显示，各VFV-Ig结构的GPC3×CD16双特异性抗体均能有效结合表达CD16a的293细胞(图5)。其中Lxa和Lxa-Fc结构的GPC3×CD16分子表现出了更强的结合能力，Lxb和Lxb-Fc结构的GPC3×CD16分子结合活性较弱，Hxa和Hxa-Fc以及Hxb和Hxb-Fc结构的GPC3×CD16分子则介于两者之间。
由于采用了结合能力相对削弱的Fv结构，相较于原完整全抗体CD16a-mAb(自行构建表达)，相应各VFV-Ig结构的GPC3×CD16双特异性抗体的CD16结合活性相对较弱，从而具有如下优势：一方面可以避免免疫细胞的过度激活，从而降低分子的免疫原性，另一方面也避免了双特异性抗体在免疫组织的过度驻留，有利于在肿瘤组织的富集，从而提高治疗效果。
此外，使用GPC3-293细胞和Jurkat T细胞淋巴瘤细胞以及GPC3-293细胞和41BB-293细胞所做的细胞结合检测，也进一步证实了VFV-Ig结构的GPC3×CD3和GPC3×41BB双特异性抗体分子两个不同抗原结合位点的结合能力(图9A/B和图10A/B)，并同样具有上述优势。
实施例4双特异性抗体生物活性检测
细胞培养：实施例中使用的HepG2、Huh7和Jurkat细胞均购自中科院细胞库，按照说明维持培养。
双特异性抗体介导的杀伤活性检测
为检测各种VFV-Ig结构双特异性抗体生物学活性，Ficoll(GE Healthcare)分离的PBMC细胞与靶细胞按一定比例(对于针对GPC3×CD16的双特异性抗体，比例为20:1(PBMC:HepG2或PBMC:Huh7)；针对GPC3×CD3的双特异性抗体,比例为10:1(PBMC:HepG2)；GPC3×CD3双特异性抗体当使用激活T细胞时，比例是5:1或3:1,PBMC:HepG2)，于37℃，5％CO2培养箱内在5％FBS培养基中共孵育20小时，同时分别加入梯度稀释的各种结构的双特异性抗体分子(从10nM起做4倍或5倍连续梯度稀释)，使用LDH检测试剂盒(Promega)检测培养上清中裂解细胞释放的LDH酶量，计算细胞杀伤比率。
实验结果表明，各VFV-Ig结构的GPC3×CD16双特异性抗体均能高效介导免疫细胞杀伤GPC3阳性肿瘤细胞HepG2，在Hxa,Hxb,Lxa和Lxb结构中，Hxb展现出了最强的HepG2细胞杀伤效果，EC50达到了0.02396nM(Hxb)(图7A)，此外，连接子长度的优化也在一定程度上进一步增强了杀伤效果，EC50分别达到了0.0131nM(Hxb10)和0.01686nM(Hxb11)(图8E)。类似地，在与Fc融合的Hxa-Fc,Hxb-Fc,Lxa-Fc和Lxb-Fc结构中Hxb-Fc同样展现出了最强的杀伤效果，且远强于GPC3单克隆抗体GC33(图7C/D)。相较Hxb结构，Hxb-Fc和Hxb-铰链区杀伤效果大大增强，EC50分别达到了0.005165nM和0.002918nM(图8F)。此外，对于GPC3表达相对较低的肿瘤细胞Huh7，Hxb-Fc也能有效介导杀伤(图6B和图8H)。
为了进一步验证VFV-Ig结构双特异性抗体活性，使用相同的抗体序列分别构建了另外两种现有临床阶段类似结构的Fab-Fv组合双特异性抗体，GPC3×CD3 IgG-scFv(图12A，其中该结构的重链序列如SEQ ID NO:40所示)和GPC3×CD3 KIH(图12B，该分子在Fc区具有knob-in-hole结构，因此具有两条不同的重链，序列分别如SEQ ID NO:38、39所示)，使用PBMC作为杀伤效应细胞的活性检测显示，GPC3×CD3的VFV-Ig结构Hbx-Fc介导的杀伤活性明显强于另外两种对照结构抗体(KIH和IgG-scFv)，EC50分别为：0.00666nM(Hbx-Fc)、0.02462nM(KIH)和0.01204nM(IgG-scFv)(图11A)。
考虑到KIH结构使用了人IgG1-Fc(N297A)而Hbx-Fc和IgG-scFv均使用了人IgG2-Fc，为排除不同类型Fc介导PBMC细胞中不同免疫细胞功能差异造成的差异，使用CD3/CD28磁珠分选后激活培养的T细胞作为杀伤效应细胞，再次比较三种结构GPC3×CD3双特异性抗体介导的杀伤活性，结果显示，Hbx-Fc仍然明显强于另外两种对照结构抗体，当效应细胞与靶细胞比例为5:1时，EC50分别为：0.002885nM(Hbx-Fc)、0.006083nM(KIH)和0.005761nM(IgG-scFv)(图11B)；当效应细胞与靶细胞比例为3:1时，EC50分别为：0.006595nM(Hbx-Fc)、0.01406nM(KIH)和0.01392nM(IgG-scFv)(图11C)。
双特异性抗体介导的Jurkat细胞激活检测
NFAT-GFP-Jurkat细胞株构建
为构建NFAT效应元件驱动的EGFP表达的慢病毒载体，NFAT效应原件(取自pGL430[luc2P NFAT-RE Hygro]，Promega)克隆至慢病毒表达载体pHAGE-NFkB-TA-LUC-UBC-GFP-W(Addgene)Spe I/Cla I酶切位点中，使用包装质粒pMD2.G(Addgene)和psPAX2(Addgene)进行病毒包装，并感染Jurkat细胞。感染后一周使用5ug/mL的PHA-P刺激感染的细胞，24小时后使用流式细胞仪分选GFP阳性单克隆Jurkat细胞，正常培养分选的单克隆细胞至克隆团出现并传代，即为NFAT-GFP-Jurkat细胞株。
双特异性抗体介导的NFAT-GFP-Jurkat细胞激活检测
为验证VFV-Ig结构GPC3×CD3双特异性抗体介导T细胞激活的能力，取5万NFAT-GFP-Jurkat细胞分别与等比例的HepG2、GPC3-293或293细胞(为阴性对照)共孵育，同时加入梯度稀释的GPC3×CD3双特异性抗体(从10nM起做4倍梯度系列稀释)，24小时后使用流式细胞仪检测激活的Jurkat细胞的GFP表达。
实验结果表明，VFV-Ig结构双特异性抗体GPC3×CD3 Hxb×Fc能够有效介导GPC3阳性细胞激活Jurkat细胞报告基因表达，并且激活强度与GPC3的表达丰度正相关(图9C)。
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Claims (20)

1.一种分离的双特异性抗体，其包含至少两条多肽链，所述两条多肽链能够配对形成第一抗原结合位点和第二抗原结合位点；其中，
所述两条多肽链中，一条多肽链包含VLb-CL，另一条多肽链包含VHa-L1-VHb-CH1-L2-VLa或者VLa-L1-VHb-CH1-L2-VHa；或者，
所述两条多肽链中，一条多肽链包含VHb-CH1，另一条多肽链包含VHa-L1-VLb-CL-L2-VLa或者VLa-L1-VLb-CL-L2-VHa；
其中，VHa是所述第一抗原结合位点的重链可变结构域，VHb是所述第二抗原结合位点的重链可变结构域；CH1是重链的第一恒定结构域，VLa是所述第一抗原结合位点的轻链可变结构域，VLb是所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，L1和L2分别为连接子序列，并且VHa与VLa配对形成所述第一抗原结合位点，VHb与VLb配对形成结合所述第二抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一或第二抗原结合位点识别肿瘤抗原；优选地，所述第一和第二抗原结合位点中的一个识别肿瘤抗原，另一个识别免疫细胞相关靶点；更优选地，第二抗原结合位点识别肿瘤抗原，第一抗原结合位点识别免疫细胞相关靶点。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中，所述VHa与VLa分别来源于抗CD16抗体、抗CD32抗体、抗CD64抗体、抗CD3抗体、抗NKG2D抗体、抗Her2抗体或抗41BB抗体的重链可变结构域与轻链可变结构域。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述VHb与VLb分别来源于抗GPC3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗BCMA抗体、抗CD123抗体、抗Her2抗体或抗EpCAM抗体的重链可变结构域与轻链可变结构域。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述VHa或VHb分别包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32的序列，VLa或VLb分别包含选自SEQ ID NO:33、34、35、36的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述连接子L1与L2分别选自包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基的连接子序列；优选地，所述连接子L1与L2长度各自为约1至约50个氨基酸；优选为约1至约15个氨基酸；更优选地，所述连接子L1与L2分别选自(GGGGS)n，(GGGGS)nG，(GGGGS)n，(GGGGSGG)n，其中n＝1-6；再优选地，所述连接子L1与L2分别选自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含Fc。
8.如权利要求7所述的双特异性抗体，其中，所述Fc来自人免疫球蛋白IgG分子或者其突变体，优选来自人免疫球蛋白IgG2或者其突变体。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其中，
所述两条多肽链中，一条多肽链包含VLb-CL，另一条多肽链包含VHa-L1-VHb-CH1-L2-VLa-H-Fc或者VLa-L1-VHb-CH1-L2-VHa-H-Fc；或者，
所述两条多肽链中，一条多肽链包含VHb-CH1-H-Fc，另一条多肽链包含VHa-L1-VLb-CL-L2-VLa或者VLa-L1-VLb-CL-L2-VHa；
其中，H是人IgG的铰链区，Fc是人IgG的Fc或者其突变体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含人IgG的CH3结构域或其突变体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含人IgG的铰链区或其突变体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包含第三个抗原结合域，所述第三个抗原结合域包括但不限于Fab、scFv、VHH。
13.编码如权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体的核酸序列。
14.包含权利要求13所述核酸序列的载体，优选地，所述载体是表达载体。
15.包含权利要求13所述核酸序列或权利要求14所述载体的宿主细胞，优选地所述宿主细胞是哺乳动物细胞；或者，所述宿主细胞是原核细胞。
16.产生如权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体的方法，包括步骤(i)在适于表达所述双特异性抗体的条件下培养权利要求15的宿主细胞，和(ii)从所述宿主细胞或所述培养基回收所述双特异性抗体。
17.免疫缀合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的双特异性抗体和与所述双特异性抗体缀合的一个或多个异源分子；优选地，所述异源分子是细胞毒素。
18.药物组合物，包含如权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体或如权利要求17所述免疫缀合物，以及药用载体；优选的，所述药物组合物还包含至少一种其他有效成分。
19.如权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体、如权利要求18所述的药物组合物、如权利要求17所述的免疫缀合物在制备用于治疗和/或预防受试者的疾病的药物或用作疾病诊断的工具中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述受试者是人类，所述疾病选自肿瘤、自身免疫病、急性或慢性炎性疾病、感染性疾病。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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