CN105949313A - 抗体Fc变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含Fc变体的工程化多肽及其用途。更具体而言，描述了显示减少的效应子功能的Fc变体。这些变体导致对患有可以用抗体治疗的疾病的患者的益处，其中对于所述患者，降低抗体引起的效应子功能是期望的。

Description

抗体Fc变体
本申请是申请日为2012年3月27日的、发明名称为“抗体Fc变体”的中国专利申请201280016318.8(PCT/EP2012/055393)的分案申请。
技术领域
本发明涉及包含Fc区的变体的多肽。更具体而言，本发明涉及含有Fc区的多肽，其中，由于多肽的Fc区中的一个或多个氨基酸取代，所述多肽具有改变的效应子功能。
发明概述
本发明涉及抗体变体领域，提供包含具有减少的效应子功能(如减少的ADCC和/或C1q结合)的Fc变体的多肽。
具体而言，本发明提供包含野生型人IgG Fc区的Fc变体的多肽，该Fc变体包含Pro329位的氨基酸取代和至少一个其他氨基酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，且其中与包含野生型IgG Fc区的多肽相比，该多肽显示降低的对人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力，且其中该多肽诱导的ADCC降低至含有野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％。
在一个具体实施方案中，在上述多肽中野生型人Fc区的Pro329被取代为甘氨酸、或精氨酸、或大得足以破坏Fc/Fcγ受体界面中的脯氨酸夹心的氨基酸残基，其中所述脯氨酸夹心在Fc的脯氨酸329和FcgRIII的色氨酸残基Trp 87及Trp 110之间形成(Sondermann等:Nature 406,267-273(2000年7月20日)。在本发明的另一方面，Fc变体中的该至少一个其他氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，且在另一实施方案中，该至少一个其他氨基酸取代是人IgG1Fc区的L234A和L235A、或人IgG4Fc区的S228P和L235E。
在本发明的另一方面，与包含野生型人IgG Fc区的多肽相比，本发明提供的多肽对包含人受体FcγI、FcγIIA和C1q的组中的至少一种其他受体显示降低的亲和力。在本发明的再一方面，多肽包含人IgG1或IgG4Fc区。在本发明的再一方面，多肽是抗体或Fc融合蛋白质。
在另一实施方案中，与包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的血小板聚集相比，包含Fc变体的多肽诱导的血小板聚集降低。在再一实施方案中，与包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的CDC相比，本发明的多肽显示强烈降低的CDC。
在本发明的另一实施方案中，提供上述包含Fc变体的多肽用作药物。在一个具体实施方案中，该多肽是抗-CD9抗体，其特征在于，含有野生型Fc区的该多肽包含SEQ ID NO:9作为重链可变区以及SEQ ID NO:8作为轻链可变区。
在本发明的另一方面，提供上述多肽用于治疗疾病，其中，有利的是，与包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的效应子功能相比，包含Fc变体的多肽的效应子功能强烈降低。
在另一实施方案中，提供上述多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中有利的是，与包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的效应子功能相比，包含野生型人IgG Fc区的Fc变体的多肽的效应子功能强烈降低。
在本发明的另一方面，提供治疗患有疾病的个体的方法，其中有利的是，与包含野生型人Fc多肽的多肽诱导的效应子功能相比，包含野生型人IgG Fc区的Fc变体的多肽的效应子功能强烈降低，该方法包括对个体施用有效量的上述多肽。
本发明的再一方面是包含野生型人IgG Fc区的Fc变体的多肽的用途，在所述多肽中该人IgG Fc区的Pro329被甘氨酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，其中该多肽显示降低的对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力，用于下调ADCC至包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％、和/或用于下调ADCP。
本发明的另一方面是包含野生型人IgG Fc区的Fc变体的多肽的用途，在所述多肽中人IgG Fc区的Pro329被甘氨酸取代，且其中该Fc变体还包含在人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E的至少两个其他氨基酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，其中该多肽显示降低的对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力，用于下调ADCC至包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于下调ADCP。
本发明的另一方面是上述多肽的用途，其中与包含野生型人Fc区的多肽诱导的血小板聚集相比，上述多肽诱导的血小板聚集降低，其中该多肽是血小板活化抗体。
在本发明的另一方面，提供治疗患有疾病的个体的方法，其中用多肽治疗该个体，在所述多肽中人IgG Fc区的Pro329被甘氨酸取代，其中残基按照Kabat的EU索引编号，其中所述多肽的特征在于，与包含野生型人IgG Fc区的多肽相比，强烈降低的与FcγRIIIA和/或FcγRIIA的结合，该方法包括对个体施用有效量的所述多肽。
在本发明的再一方面，用于所述方法的多肽还包含在人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E的至少两个其他氨基酸取代。
背景技术
单克隆抗体具有极大的治疗潜力，在当今的医学投资组合中发挥重要作用。在过去十年中，制药产业中明显的趋势是开发单克隆抗体(mAb)作为治疗剂用于治疗多种疾病，如癌症、哮喘、关节炎、多发性硬化等。单克隆抗体主要在遗传改造的哺乳动物细胞培养物中作为重组蛋白质制备。
抗体的Fc区(即跨结构域CH2、CH3和部分铰链区的抗体重链的末端)变异性有限，涉及实现抗体所发挥的生理学作用。归因于抗体的Fc区的效应子功能随抗体的种类和亚类而不同，且包括抗体通过Fc区与细胞上的特定Fc受体(“FcR”)的结合，这触发多种生物学反应。
这些受体典型地具有介导与Fc结合的胞外域、跨膜区及可以在细胞内介导一些信号发放事件的胞内域。这些受体在包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞和T细胞的多种免疫细胞中表达。Fc/FcγR复合物的形成将这些细胞招募至所结合抗原的部位，典型地导致信号传导和随后的免疫反应，如炎症介质的释放、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的一种潜在机制。表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体、随后引起靶细胞的裂解——该细胞介导的反应称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Ravetch等,Annu Rev Immunol 19(2001)275-290)。表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体、随后引起靶细胞的吞噬——该细胞介导的反应称为抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)。此外，在分子的Fc区上的一个重叠部位还控制补体介导的不依赖于细胞的细胞毒性功能(也称为补体依赖性细胞毒性(CDC))的活化。
对于IgG类的Ab，ADCC和ADCP由Fc区与称为Fcγ受体(FcγR)的受体家族的结合控制。在人类中，此蛋白质家族包含FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIIB(Raghavan和Bjorkman,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.12(1996)181–220；Abes等,ExpertReviews VOL 5(6),(2009)735-747)。FcγR在多种免疫细胞上表达，Fc/FcγR复合物的形成将这些细胞招募至所结合抗原的部位，典型地导致信号传导和随后的免疫反应，如炎症介质的释放、B细胞活化、胞吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。此外，FcγRI、FcγRIIA/c和FcγRIIIA是活化性受体，其特征在于胞内免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，而FcγRIIB具有抑制基序(ITIM)并因此是抑制性的。此外，de Reys等,Blood,81,(1993)1792-1800得出结论，单克隆抗体(例如CD9)诱导的血小板活化和聚集由抗原识别及后随的Fc结构域依赖性步骤启动，所述步骤涉及FcγRII受体(还见：Taylor等,Blood 96(2000)4254-4260)。FcγRI以高亲和力结合单体IgG，但FcγRIII和FcγRII是低亲和力受体，与复合或聚集的IgG相互作用。
补体炎症级联是先天免疫反应的部分，对个体防御感染的能力至关重要。另一重要的Fc配体是补体蛋白质C1q。Fc与C1q结合介导称为补体依赖的细胞毒性(CDC)的过程。C1q能够结合六个抗体，但与两个IgG结合就足以活化补体级联。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶形成复合物来形成补体途径的C1复合物。
在许多情况下，由免疫球蛋白的Fc区介导的结合和效应子功能的刺激高度有利，例如对于CD20抗体，但是，在某些情况下，减少或甚至消除效应子功能可以更有利。这对设计用来将药物(例如毒素和同位素)递送至靶细胞的那些抗体尤其正确，其中Fc/FcγR介导的效应子功能将把健康免疫细胞带到该致死性载荷附近，导致正常淋巴组织随同靶细胞一起被耗竭(Hutchins等,PNAS USA 92(1995)11980-11984；White等,AnnuRev Med 52(2001)125-145)。在这些情况下，使用招募补体或效应细胞弱的抗体将极其有益(还见Wu等,Cell Immunol 200(2000)16-26；Shields等,J.Biol Chem 276(9)(2001)6591-6604；US 6,194,551；US 5,885,573；和PCT公开WO 04/029207)。
在其他情况下，例如，当目的是阻断广泛表达的受体与它的关连配体的相互作用时，有利的是，减少或消除所有抗体效应子功能来降低不想要的毒性。另外，在治疗性抗体显示出跨越多种人组织的杂乱结合的情况下，慎重的是，将效应子功能的靶向限制于一组多样的组织来限制毒性。最后但同样重要的是，抗体与FcγRII受体的亲和力降低，对通过FcγRII受体结合而诱导血小板活化和聚集的抗体(这将是此类抗体的严重副作用)，将尤其有利。
虽然存在某些亚类的人免疫球蛋白缺乏特定效应子功能，但没有缺乏所有效应子功能的已知天然免疫球蛋白。一个替代方法可以是改造或突变Fc区中负责效应子功能的关键残基。例如见PCT公开WO 2009/100309(Medimmune)、WO 2006/076594(Xencor)、WO 1999/58572(Univ.Cambridge)、US 2006/0134709(Macrogenics)、WO 2006/047350(Xencor)、WO 2006/053301(Xencor)、US 6,737,056(Genentech)、US 5,624,821(Scotgen Pharmaceuticals)和US 2010/0166740(Roche)。
IgG与活化性和抑制性Fcγ受体或补体第一成分(C1q)的结合依赖于定位在铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区域对FcγR和补体C1q结合至关重要，且具有独特的序列。取代233-236位的人IgG1和IgG2残基及327、330和331位的IgG4残基大幅降低了ADCC和CDC(Armour等,Eur.J.Immunol.29(8)(1999)2613-2624；Shields等,J.Biol.Chem.276(9)(2001)6591-6604)。Idusogie等,J.Immunol 166(2000)2571-2575作图定位了rituxan的C1q结合部位，并显示Pro329Ala降低了Rituximab结合C1q和活化补体的能力。已报道用Ala取代Pro329导致与FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA受体的结合减弱(Shields等,J.Biol.Chem.276(9)(2001)6591-6604)，但此突变也曾被描述为对FcγRI和FcγRII显示出野生型样的结合，并且在与FcγRIIIA受体的结合上表现出仅非常小的减少(Genentech的EP 1 068 241中的表1和表2)。
Oganesyan等,Acta Cristallographica D64(2008)700-704将三重突变L234F/L235E/P331S引入铰链下部和C2H结构域，并显示人IgG1分子与人C1q受体、FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA的结合活性降低。
对具有强烈降低的ADCC和/或ADCP和/或CDC的抗体，仍然存在尚未得到满足的需求。因此，本发明的目的是鉴定这类抗体。令人惊奇地，已发现，将Pro329的脯氨酸残基突变为甘氨酸导致FcγRIIIA和FcγRIIA受体的意外的强烈抑制、以及ADCC和CDC的强烈抑制。此外，Pro329与例如L234A和L235A(LALA)的组合突变导致C1q、FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA的意外的强烈抑制。因此，例如，在破坏Fc/Fcγ受体界面中的脯氨酸夹心方面，在329位，甘氨酸看起来意外地优于其他氨基酸取代，如丙氨酸。
附图简述
图1
在25℃，用Biacore T100仪器(GE Healthcare)，通过表面等离振子共振(SPR)，测量了不同FcγR对免疫球蛋白的结合亲和力。
a)针对GA101(GA)抗体变体(IgG1-P329G、IgG4-SPLE和IgG1-LALA突变)和P-选择蛋白(PS)抗体变体(IgG1-P329G、IgG1-LALA和IgG4-SPLE)以及野生型抗体，测试了FcγRI结合亲和力。
b)针对CD9抗体变体(IgG1野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、IgG4-SPLE/P329G)以及野生型抗体，测试了FcγRI结合亲和力。
c)针对CD9抗体变体(IgG1野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/LALA、IgG4-SPLE/P329G)以及野生型抗体，测试了FcγRIIA(R131)结合亲和力。作为受体浓度的函数，显示经标化后的反应。
d)针对CD9(此处称为“TA”)抗体变体(IgG1野生型、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-LALA、IgG1–LALA/P329G)和P-选择蛋白(pSel)抗体变体(IgG4野生型、IgG4-SPLE)以及野生型抗体，测试了FcγRIIB结合亲和力。
e)针对CD9抗体变体(IgG1野生型、IgG4-SPLE、IgG1-LALA、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-P329G、IgG1-LALA/P329G)以及野生型抗体，测试了FcγRIIIA-V158结合亲和力。作为受体浓度的函数，显示经标化后的反应。
图2
针对P-选择蛋白(PS)抗体变体(IgG1野生型、P329G、IgG4-SPLE)和CD20(GA)抗体变体(IgG1野生型、P329G和IgG4-SPLE)，测试了C1q结合。
图3
招募免疫效应细胞的效力取决于Fc变体的类型。将Fc变体包被在ELISA平板上，并加入用人FcγRIIIA转染的人NK92效应细胞。用酯酶测定试验，测量活化的NK细胞的溶细胞活性的诱导。
a)分析了CD20(GA101)抗体变体(野生型、LALA、P329G、P329G/LALA)。b)分析了CD20(GA101)抗体变体(引入了P329R或P329G突变)。为了对任何效应细胞招募功能具有更强的信号，以糖工程化形式产生所有变体。
图4
如通过经典的ADCC测定试验所测量，招募免疫效应细胞的效力取决于Fc变体的类型。将转染了人FγcRIIIA的人NK92细胞系作为效应细胞，将CD20阳性Raji细胞用作靶细胞。测试了不同的糖工程化CD20抗体(GA101G(2))和非糖工程化CD20抗体(GA101)变体(引入了P329G、P329A或LALA突变)。
a)非糖工程化CD20抗体：已分别将P329G、LALA和P329G/LALA突变引入该抗体。
b)糖工程化CD20抗体：已分别将P329G、P329A和LALA突变引入该抗体。
图5
依赖补体的细胞毒性(CDC)测定试验。针对在SUDH-L4靶细胞上介导CDC的功效，分析了非糖工程化和糖工程化的CD20(GA101)抗体的不同Fc变体。
a)非糖工程化的CD20：已分别将P329G、LALA和P329G/LALA突变引入该抗体。
b)糖工程化的CD20：已分别将P329G、P329A和LALA突变引入该抗体。
图6
a)人IgG1变体的Fc结合聚糖的糖谱。包含LALA、P329G、P329A或P329G/LALA突变的hIgG1的Fc结合寡糖上半乳糖基化的百分比仅极小地不同于野生型抗体的。
b)相对半乳糖基化：具有引入的IgG1P329G/LALA突变的四种不同IgG。针对它们在Hek293EBNA细胞中表达后半乳糖基化的量，比较了四种不同的V结构域。
图7
全血测定试验中抗体诱导的血小板聚集。针对两种供体测量鼠IgG1诱导的血小板聚集，两种供体在它们依赖于抗体浓度的反应上不同。
a)供体A，b)供体B。
发明详述
定义
在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中的残基的编号是Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号，其在此明确引入作为参考。“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合部位与它的结合配偶体(例如抗原或Fc受体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体/Fc受体或抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)来表示。可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)来测量亲和力。用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案在下文中描述。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此改变的亲本抗体相比，此改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
“氨基酸修饰”指一个预定的氨基酸序列中的氨基酸序列改变。示例性修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。本文优选的氨基酸修饰是取代。例如Fc区的指定位置上的“氨基酸修饰”指：该指定残基的取代或缺失、或邻近该指定残基插入至少一个氨基酸残基。“邻近”指定残基插入意指，其一至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N端或C端。
“氨基酸取代”指，将预定的氨基酸序列中存在的至少一个氨基酸残基替代为另外的不同“取代”氨基酸残基。该一个或多个取代残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)，且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。优选地，取代残基不是半胱氨酸。用一个或多个非天然存在的氨基酸残基取代也涵盖在本文的氨基酸取代的定义中。“非天然存在的氨基酸残基”指上文所列的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够在多肽链中共价结合邻近的氨基酸残基(一个或多个)。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，如描述于Ellman等,Meth.Enzym.202(1991)301-336中的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等,Science 244(1989)182和Ellman等,上引文的方法。简言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化阻抑型tRNA，然后体外转录和翻译RNA。
“氨基酸插入”指将至少一个氨基酸掺入预定的氨基酸序列。虽然插入通常为一个或两个氨基酸残基的插入，但本申请考虑更大的“肽插入”，例如约三个至约五个或甚至多达约十个氨基酸残基的插入。插入的残基(一个或多个)可以如上文所公开的是天然存在或非天然存在的。
“氨基酸缺失”指从预定的氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。
本文以最广泛的含义使用术语“抗体”，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
本文所用的术语“抗体变体”指野生型抗体的变体，其特征在于，相对于野生型抗体，抗体变体中发生氨基酸序列的改变，例如通过突变在野生型抗体中引入特定的氨基酸残基。
本文所用术语“抗体的效应子功能(一种或多种)”或“效应子功能”指，由IgG的Fc效应子结构域(一个或多个)(例如免疫球蛋白的Fc区)贡献的功能。这种功能可以例如通过Fc效应子结构域(一个或多个)与具有吞噬或溶胞活性的免疫细胞上的Fc受体的结合、或通过Fc效应子结构域(一个或多个)与补体系统成分的结合来实现。典型的效应子功能是ADCC、ADCP和CDC。
“抗体片段”指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指这样的抗体，其在竞争测定试验中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多，且反过来，参考抗体在竞争测定试验中将该抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文提供示例性竞争测定试验。
“依赖抗体的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492的464页上表3中。
术语“依赖抗体的细胞吞噬作用”和“ADCP”指这样的过程，其中，抗体包被的细胞被与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬性免疫细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞)全部或部分地内化。
术语“结合结构域”指多肽中与另一分子结合的区域。在FcR的情况下，结合结构域可以包含该多肽链(例如其α链)中负责结合Fc区的部分。一个有用的结合结构域是FcRα链的胞外域。
本文所用的术语与Fc受体“结合”意指，在例如BIAcore(R)测定试验(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)中，抗体与Fc受体的结合。
在BIAcore(R)测定试验中，使Fc受体结合于表面，并通过表面等离振子共振(SPR)测量变体(例如已引入突变的抗体变体)的结合。通过术语ka(自抗体/Fc受体复合物上抗体的结合速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)，定义结合的亲和力。备选地，可以就共振信号高度和解离行为，将SPR传感图的结合信号直接与参考的响应信号比较。
“C1q”是包含免疫球蛋白Fc区的结合部位的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，其是依赖补体的细胞毒性(CDC)途径的第一成分。人C1q可以从例如Quidel,San Diego,Calif.购得。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的独特性在于它不与另一结构域紧密配对。相反，在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两个N连接的分枝糖链。推测该糖可能提供对结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域(Burton,Molec.Immunol.22(1985)161-206)。
“CH3结构域”包含Fc区中C端至CH2结构域的残基序列(即IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中的生理学病症，其典型地特征在于失调的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、涎腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和多种类型的头颈癌。
本文所用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞及从其衍生的培养物，而不考虑传代的数目。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代可能不具有精确相同的DNA内容。本发明包括，与针对最初转化的细胞所筛选的功能或生物学活性相比，具有相同的功能或生物学活性的突变体后代。对于旨在采用不同名称的情形，从上下文中将是清楚的。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链衍生自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种。
抗体的“种类”指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如氨甲喋呤、adriamicin、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、阿霉素(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的多种抗肿瘤或抗癌剂。
术语“依赖补体的细胞毒性”或CDC指诱导细胞死亡的机制，其中结合靶标的抗体的Fc效应子结构域(一个或多个)活化一系列酶促反应，造成孔洞在靶细胞膜中形成。典型地，抗原-抗体复合物，诸如抗体包被的靶细胞上的抗原-抗体复合物，结合并活化补体成分C1q，其转而活化补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的活化还可以导致补体成分在靶细胞表面上的沉积，其通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)利于ADCC。
“病症”是可以从用多肽(如含有Fc变体的抗体)的治疗中受益的任何病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易感所讨论的病症的那些病理状况。在一个实施方案中，病症是癌症。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞活化。
本文所用的“降低的效应子功能”指，与对照(例如具有野生型Fc区的多肽)相比，特定的效应子功能(例如ADCC或CDC)降低至少20％，本文所用的“强烈降低的效应子功能”指与对照相比，特定的效应子功能(例如ADCC或CDC)降低至少50％。
物质(例如药物制剂)的“有效量”指，按照所需的剂量和时间段，可以有效地达到希望的治疗或预防结果的量。
本文的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其含有至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
“变体Fc区”包含由于至少一个本文定义的“氨基酸修饰”而与“天然”或“野生型”序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中从约一个至约十个氨基酸取代，且优选从约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，且最优选与之具有至少约90％同源性，更优选与之具有至少约95％同源性。
本文所用的术语“Fc变体”指在Fc结构域中包含修饰的多肽。本发明的Fc变体按照组成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，P329G是相对于亲本Fc多肽在329位用甘氨酸取代脯氨酸的Fc变体，其中编号按照EU索引。野生型氨基酸的身份可以不指定，在这种情况下，前述变体称为P329G。对于本发明中讨论的所有位置，编号按照EU索引。EU索引或Kabat中的EU索引或EU编号方案指，EU抗体的编号(Edelman等,Proc Natl Acad Sci USA 63(1969)78-85，在此整体引入作为参考)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。实例包括美国专利号6,586,207；WO 98/48032；WO 03/073238；US 2004/0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；Chin,J.W.等,Journal of the American ChemicalSociety 124(2002)9026-9027；Chin,J.W.和Schultz,P.G.,ChemBioChem11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等,PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；及Wang,L.和Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10；全都整体引入作为参考。
术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，如抗体或免疫黏附素(见下文定义)。
术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(活化性受体)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(见M.,Annu.Rev.Immunol.15(1997)203-234中的综述)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492；Capel等,Immunomethods 4(1994)25-34；及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-41中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括有待将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等,J.Immunol.117(1976)587；和Kim等,J.Immunol.24(1994)249)。
本文所用的“IgG Fc配体”意指来自任何生物的这样的分子，优选多肽，其与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物。Fc配体包括但不限于FcγR、FcγR、FcγR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等,Immunological Reviews 190(2002)123-136，整体引入作为参考)。Fc配体还可以包括未发现的结合Fc的分子。特别的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文所用的“Fc配体”意指来自任意生物的这样的分子，优选多肽，其与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物。
本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcgammaR”意指，结合IgG抗体Fc区且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，此家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIA(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIB(包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2)和FcγRIIc；FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIA(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIB-NA1和FcγRIIB-NA2)(Jefferis等,Immunol Lett 82(2002)57-65，整体引入作为参考)，以及任意未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任意未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
本文所用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指，结合IgG抗体Fc区且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知，功能性FcRn蛋白质包含两条多肽，常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，FcRn或FcRn蛋白质指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。
本文所用的“野生型或亲本多肽”意指未修饰的多肽，其随后被修饰以产生变体。野生型多肽可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的变体或改造形式。野生型多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“野生型免疫球蛋白”意指用于通过修饰来产生变体的未修饰的免疫球蛋白多肽，本文所用的“野生型抗体”意指用于通过修饰来产生变体抗体的未修饰的抗体。应注意，“野生型抗体”包括下文所述的已知的商业、重组产生的抗体。
术语“可结晶片段(Fc)多肽”是抗体分子的部分，其与效应分子和细胞相互作用。它包含免疫球蛋白重链的C端部分。
术语“构架区”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构、或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，且可以用例如本文公开的多种测定试验来评估。
“铰链区”一般定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22(1985)161-206)。可以通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同的位置上，将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
Fc区的“下铰链区”通常定义为临铰链区C端的残基序列，即Fc区的残基233至239。
“同源性”定义为：在比对序列并根据需要引入空位来达到最大百分比同源性后，氨基酸序列变体中相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序为本领域公知。一个这种计算机程序是Genentech编写的“Align 2”，其于1991年12月10日与用户文件提交给美国版权局，Washington,D.C.20559。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指其中已引入了外源核酸的细胞，包括该细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸内容可以与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是这样的抗体，其具有与如下抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列，所述抗体是人或人细胞产生的抗体、或是源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体。人抗体的此定义明确地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞表达至少FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。可以从其天然来源，例如从血液或本文所述的PBMC，分离效应细胞。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的，全部或基本上全部的FR对应于人抗体的。人源化抗体可以可选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指，抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构上规定的环(“高变环”)的每一个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1)、氨基酸残基50-56(L2)、氨基酸残基89-97(L3)、氨基酸残基31-35B(H1)、氨基酸残基50-65(H2)和氨基酸残基95-102(H3)(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在CDR的称为缩简CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于氨基酸残基31-34(L1)、氨基酸残基50-55(L2)、氨基酸残基89-96(L3)、氨基酸残基31-35B(H1)、氨基酸残基50-58(H2)和氨基酸残基95-102(H3)(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有说明，本文按照Kabat等,上引文，编号可变结构域中的HVR残基及其他残基(例如FR残基)。
“免疫复合物”指在至少一个靶分子和至少一个异源的含Fc区多肽相互结合形成更大分子量的复合物时形成的相对稳定的结构。免疫复合物的实例是抗原-抗体聚集体和靶分子-免疫黏附素聚集体。除非另有说明，本文所用的术语“免疫复合物”指离体复合物(即，非其可能见于自然界中的形式或情形)。但是，可以对哺乳动物施用免疫复合物，例如以评价免疫复合物在哺乳动物中的清除。
“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂的一个或多个异源分子缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(例如母牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已从它的天然环境的成分中分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的大于95％或99％纯度。评估抗体纯度的方法的综述见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848(2007)79-87。
“分离的”多肽是已鉴定并从其天然环境的成分中分开和/或回收的多肽。其天然环境中的污染成分是可干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选实施方案中，将多肽纯化至：(1)通过Lowry法测定，大于95％重量的多肽，且最优选超过99％重量；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝染色或优选银染、在还原或非还原条件下SDS-PAGE显示的同质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，这是因为不存在该多肽的天然环境中的至少一种成分。但是，通常，通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
“分离的”核酸指已从其天然环境的成分中分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置上。
“分离的编码抗体的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括单个载体或分开的载体中的该(一个或多个)核酸分子、及存在于宿主细胞中的一个或多个位置上的该(一个或多个)核酸分子。
在本文中使用时，词语“标记”指直接或间接与多肽缀合的可检测的化合物或组合物。标记可以是本身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
本文所用的术语“配体结合结构域”指任何天然的细胞表面受体或其任何区域或衍生物，所述区域或衍生物至少保留对应的天然受体的定性配体结合能力。在一个具体实施方案中，受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族成员同源的胞外域的细胞表面多肽。不是免疫球蛋白超基因家族成员，但也明确地为此定义所涵盖的其他受体是，细胞因子的受体，尤其是具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、血细胞生成素和神经生长因子受体超家族成员，及细胞黏附分子，例如(E-、L-和P-)选择蛋白。
本文所用的术语“单克隆抗体”指，获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，除了例如包含天然突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能变体抗体(这类变体通常以微小的量存在)外，该群体包含的抗体个体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，待按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法、和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由通过二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域和可变结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至两个类型之一，称为κ和λ。
“天然序列Fc区”包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
当一个核酸被放置在与另一核酸序列的功能关系中时，它是“有效连接”的。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA是有效连接的；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该编码序列是有效连接的；或者如果核糖体结合位点被放置在利于翻译的位置上，则它与编码序列是有效连接的。通常，“有效连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，且在分泌前导序列的情况下是邻接且在读框内的。但是，增强子不必是邻接的。连接可以通过在方便的限制位点的连接来实现。如果不存在这类位点，则可以按照方便的实践，使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“包装说明书”用来指习惯上包含在治疗产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用途、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于这类治疗产品的使用的警告。
本文所用的“位置”意指蛋白质的序列中的位置。可以连续或按照确立的形式(例如用于抗体编号的EU索引)编号位置。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基(包括天然或非天然氨基酸残基)的聚合物，且不限制最小长度。
因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包含在该定义之内。该定义涵盖全长蛋白质及其片段二者。该术语还包括多肽的翻译后修饰，包括例如糖基化、唾液酰化、乙酰化和磷酸化。
此外，本文的“多肽”还指修饰的蛋白质，如对天然序列的单个或多个氨基酸残基缺失、添加和取代，只要蛋白质保持希望的活性。例如，可以进行丝氨酸残基取代来消除单个反应性半胱氨酸或去除二硫键，或者可以进行保守氨基酸取代来消除切割位点。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是无意的，如通过产生该蛋白质的宿主的突变、或通过聚合酶链反应(PCR)扩增引起的错误。
本文所用的术语“野生型多肽”和“野生型(人)Fc区”分别指这样的多肽和Fc区，其包含由于未引入一种或多种本文公开的Fc区修饰而缺乏该修改的氨基酸序列，其可以用作例如对照。野生型多肽可以包含天然序列Fc区、或具有早已存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或取代)的Fc区。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，且其不包含对该制剂所施用的个体具有不可接受的毒性的其它成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分外的成分，其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的多肽是这样的多肽，与亲本多肽或与包含天然序列Fc区的多肽相比，其具有增强或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性。对FcR“显示增加的结合”的多肽变体以比亲本多肽好的亲和力结合至少一种FcR。对FcR“显示减少的结合”的多肽变体以比亲本多肽差的亲和力结合至少一种FcR。例如按本文实施例中所测定，与天然序列IgG Fc区相比，这类对FcR显示减少的结合的变体可以与FcR具有很少的结合或无明显结合，例如0-20％的FcR结合。
与亲本多肽相比以“降低的亲和力”结合FcR的多肽是这样的多肽，当在结合测定试验中多肽变体和亲本多肽的量基本相同时，其以比亲本抗体实质性降低的结合亲和力结合任何一种或多种上述FcR。例如，与亲本多肽相比，具有降低的FcR结合亲和力的多肽变体可以显示在FcR结合亲和力上的约1.15倍至约100倍，例如约1.2倍至约50倍降低，其中例如按本文实施例中所公开，测定FcR结合亲和力。
比亲本或野生型多肽“在人效应细胞的存在下效率较低地介导依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)”的包含Fc变体的多肽是这样的多肽，当用于测定试验中的多肽变体和亲本抗体的量基本相同时，该多肽在体外或在体内以实质性较低的效率介导ADCC。通常，用本文公开的体外ADCC测定试验来鉴定这类变体，但可以考虑用于例如在动物模型等中测定ADCC活性的其他测定试验或方法。优选的变体，例如在本文公开的体外测定试验中，在介导ADCC上比亲本低效约1.5倍至约100倍，例如约2倍至约50倍。
“受体”是能够结合至少一个配体的多肽。优选的受体是具有胞外配体结合结构域和可选地其他结构域(例如跨膜结构域、胞内域和/或膜锚着点)的细胞表面受体。待在本文描述的测定试验中评价的受体可以是完整受体或其片段或衍生物(例如包含与一种或多种异源多肽融合的受体的结合结构域的融合蛋白质)。此外，待评价其结合特性的受体可以存在于细胞中或是分离的、以及可选地包被在测定平板或某种其他固相上。
术语“受体结合性结构域”用来指受体(包括细胞黏附分子)的任何天然配体、或这种天然配体的任何区域或衍生物，所述区域或衍生物至少保留对应的天然配体的定性受体结合能力。此定义明确还包括来自上述受体的配体的结合序列。
本文所用的“治疗”(及其语法变体)指试图改变所治疗的个体的天然过程的临床干预，其可以为了预防或在临床病理的过程中实施。治疗的期望效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态、及缓解或改善的预后。在一些实施方案中，用本发明的抗体来延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
本文所用的“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指，由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指该蛋白质本身、包含该蛋白质的组合物或编码它的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如约一个至约七十个氨基酸修饰，优选与亲本相比具有约一个至约五个氨基酸修饰。本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％同源性，最优选至少约90％同源性，更优选至少约95％同源性。变体蛋白质可以指该变体蛋白质本身、包含该蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。因此，本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体的抗体，本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本IgG的抗体，本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.(2007)91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补VL或VH结构域的文库，分离结合特定抗原的抗体。见例如Portolano等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson等,Nature 352(1991)624-628。
本文所用的术语“载体”指能够扩增与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体、以及掺入至其所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
本申请涉及包含氨基酸修饰的多肽，该氨基酸修改调节与Fc受体，尤其是与Fcγ受体的结合。
发明详述
本发明涉及用于制备包含Fc变体的多肽的方法。可以用本领域可得的用于产生包含Fc区的多肽或抗体的技术，制备“亲本”、“起始”、“非变体”或野生型多肽。在本发明的优选实施方案中，亲本多肽是抗体，且用于产生抗体的示例性方法更详细地描述于下面的部分中。但是，亲本多肽可以是包含Fc区的任何其他多肽，例如免疫黏附素。下文更详细地描述用于制备免疫黏附素的方法。
在备选实施方案中，可以按照本文公开的方法产生变体Fc区(Fc变体)，且此Fc变体可以与所选择的异源多肽(如抗体可变结构域或受体或配体的结合结构域)融合。
野生型多肽包含Fc区。通常，野生型多肽的Fc区将包含天然或野生型序列Fc区，且优选人天然序列Fc区(人Fc区)。但是，野生型多肽的Fc区也可以相对于天然序列Fc区具有一个或多个早已存在的氨基酸序列改变或修饰。例如，Fc区的C1q或Fcγ结合活性可以在先前已被改变(下文更详细地描述其他类型的Fc区修饰)。在另一实施方案中，亲本多肽Fc区是“概念性的”，虽然它不物理存在，但抗体工程可以决定希望的变体Fc区氨基酸序列、并产生包含该序列的多肽或编码希望的变体Fc区氨基酸序列的DNA。
但是，在本发明的优选实施方案中，编码野生型多肽的Fc区的核酸是可获得的，并改变此核酸序列来产生编码Fc区变体的变体核酸序列。
可以通过本领域已知的多种方法，制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于，对早先制备的编码该多肽的DNA进行的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒诱变。
定点诱变是用于制备取代变体的优选方法。此技术为本领域公知(见例如Carter等,Nucleic Acids Res.13(1985)4431-4443及Kunkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)488)。简言之，在进行DNA的定点诱变中，通过如下，改变起始DNA：首先使编码期望突变的寡核苷酸与起始DNA的单链杂交。杂交后，用杂交的寡核苷酸作为引物，用起始DNA的单链作为模板，用DNA聚合酶合成完整的第二链。由此，编码期望突变的寡核苷酸被掺入到所得的双链DNA中。
PCR诱变也适合用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。见Higuchi,inPCR Protocols,Academic Press(1990)177-183页；和Vallette等,Nuc.Acids Res.17(1989)723-733。简言之，当在PCR中用小量的模板DNA作为起始物质时，可以用序列略不同于模板DNA中的对应区域的引物来产生相对大量的特定DNA片段，该DNA片段仅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。
用于制备变体的另一方法，盒诱变，可以基于Wells等,Gene 34(1985)315-323所述的技术。
本发明的一个实施方案涵盖包含抗体的Fc区的多肽，其包含对Fc区的至少一个氨基酸残基的添加、取代或缺失，从而导致对至少一种Fc受体的亲和力降低或消除。Fc区与许多受体或配体相互作用，包括但不限于Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白质C1q和其他分子(如A蛋白和G蛋白)。这些相互作用是多种效应子功能和下游信号传导事件所必需的，包括但不限于依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的细胞吞噬作用(ADCP)和依赖补体的细胞毒性(CDC)。因此，在某些实施方案中，相对于如下多肽，本发明的变体对负责效应子功能的Fc受体具有降低或消除的亲和力，其中所述多肽，相对于包含本发明Fc变体的多肽，具有相同的氨基酸序列但不包含该Fc区的至少一个氨基酸残基添加、取代或缺失(本文中也称为“野生型多肽”)。在某些实施方案中，包含本发明Fc变体的多肽含有至少一个或多个以下特性：降低或消除的效应子功能(ADCC和/或CDC和/或ADCP)、降低或消除的与Fc受体的结合、降低或消除的与C1q的结合、或降低或消除的毒性。更特别地，本发明的实施方案提供：具有降低的对Fc受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA)和/或补体蛋白质C1q的亲和力的抗-CD20(与GA101或GA相同)、抗-CD9(与TA相同)和抗-选择蛋白(pSel)抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，该Fc区含有至少一个在P329位的氨基酸残基的添加、取代或缺失，其中恒定区的编号系统是Kabat等,NIH Publication 91(1991)3242,National Technical InformationService,Springfield,VA中所示的EU索引的编号系统。
在一个具体实施方案中，本发明的多肽包含野生型人Fc多肽的Fc变体，该变体在Pro329位包含氨基酸取代，其中该IgG Fc区中残基的编号是Kabat中EU索引的编号。还在另一实施方案中，该变体包含至少一个其他氨基酸取代。
还在另一实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽具有氨基酸取代、缺失或添加，其破坏或减小Fc多肽的区域和/或与Fcγ受体的界面中的脯氨酸夹心的功能。
在另一实施方案中，用比脯氨酸小或大的氨基酸取代Pro329。还在另一实施方案中，取代氨基酸是Gly、Ala或Arg。在本发明的另一方面，用甘氨酸取代Fc多肽的Pro329。
还在另一实施方案中，该包含Fc变体的多肽具有至少一个其他氨基酸取代、添加或缺失。还在另一实施方案中，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，该变体显示降低的与人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体的亲和力。
在另一实施方案中，与包含野生型人Fc区的多肽相比，该包含Fc变体的多肽显示降低的与人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体的亲和力。在另一实施方案中，与FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA的至少一个的亲和力降低，还在另一实施方案中，与FcγRI和FcγRIIIA的亲和力降低，还在另一实施方案中，与FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA的亲和力降低，还在本发明的另一方面，与FcγRI受体、FcγRIIIA受体和C1q的亲和力降低，还在本发明的另一方面，与FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA和C1q受体的亲和力降低。
还在另一实施方案中，该包含Fc变体的多肽诱导的ADCC降低，且在优选实施方案中，ADCC降低至包含野生型Fc多肽的多肽诱导的ADCC的至少20％。还在本发明的另一方面，包含野生型Fc多肽的多肽诱导的ADCC和CDC被降低或消除，且还在另一方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含上述Fc变体的多肽显示降低的ADCC、CDC和ADCP。
在一个实施方案中，包含Fc变体的多肽中的该至少一个其他氨基酸取代选自：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。
在本发明的某个方面，包含Fc变体的多肽包含抗体。还在本发明的另一方面，包含Fc变体的多肽包含人IgG1或IgG4Fc区。还在本发明的另一方面，该变体是IgG1或IgG4抗体。
在本发明的另一方面，包含Pro329Fc变体的多肽进一步在Fc区中包含与抗体的稳定性提高相关的至少一个氨基酸残基的添加、取代或缺失。还在本发明的另一方面，包含上述Fc变体的多肽与Fcn受体的亲和力仅是轻微地(例如不超过包含野生型Fc多肽的多肽的亲和力的10-20％)被改变。
在一个实施方案中，包含Fc变体的多肽中的该氨基酸残基的添加、取代或缺失发生在Fc区的228和/或235位，其中恒定区的编号系统是Kabat,等中所示的EU索引的编号系统。
在一个具体实施方案中，通过另一氨基酸来取代该包含Fc变体的多肽中的228位丝氨酸和/或235位亮氨酸。
在一个具体实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽包含在228位含有氨基酸取代的Fc区，其中用脯氨酸取代丝氨酸残基。
在一个具体实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽包含在235位含有氨基酸取代的Fc区，其中用谷氨酸取代亮氨酸残基。
在一个具体实施方案中，包含Fc变体的多肽包含三重突变：P329位的氨基酸取代、S228P和L235E突变(P329/SPLE)。
在另一具体实施方案中，包含Fc变体的多肽含有人IgG4区域。
在一个实施方案中，氨基酸残基的添加、取代或缺失发生在Fc区的234和/或235位，其中恒定区的编号系统是Kabat等中所示的EU索引的编号系统。
在一个具体实施方案中，通过另一氨基酸来取代包含Fc变体的多肽中的234位亮氨酸和/或235位亮氨酸。
在一个具体实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽包含在234位含有氨基酸取代的Fc区，其中用丙氨酸取代亮氨酸残基。
在一个具体实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽包含在235位含有氨基酸取代的Fc区，其中用丝氨酸取代亮氨酸残基。
在一个具体实施方案中，包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变：Pro329位的氨基酸取代、L234A和L235A突变(P329/LALA)。
在另一具体实施方案中，上述多肽包含人IgG1区域。
虽然优选改变与FcγR的结合，但本文也考虑对新生儿受体(FcRn)具有改变的结合亲和力的Fc区变体。预期对FcRn具有改善的亲和力的Fc区变体具有更长的血清半衰期，且这类分子将在希望所施用的多肽具有长半衰期的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，例如以治疗慢性疾病或病症。相反，预期具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区变体具有较短的半衰期，且这类分子可以例如，在缩短的循环时间可能有利时，对哺乳动物施用，例如对于体内诊断成像、或对于当长时间在血流中循环时具有毒性副作用的多肽，等。预期具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区变体跨过胎盘的可能性较小，因此可以用于在孕妇中治疗疾病或病症。
对FcRn具有改变的结合亲和力的Fc区变体包括在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任何一个或多个上包含Fc区氨基酸修饰的那些。显示减少的与FcRn的结合的变体通常将在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447中的任何一个或多个上包含Fc区氨基酸修饰；具有增加的与FcRn的结合的变体通常将在氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的任何一个或多个上包含Fc区氨基酸修饰。
在另一实施方案中，本发明的抗体可以是任何种类(例如但不限于IgG、IgM和IgE)的任何一种。在某些实施方案中，本发明的抗体是IgG类抗体的成员。在一个具体实施方案中，本发明的抗体属于IgGl、IgG2或IgG4亚类。在另一具体实施方案中，本发明的抗体属于IgG1亚类，且包含以下氨基酸取代：Fc区的P329G和/或L234A和L235A。在备选实施方案中，本发明的抗体属于IgG4亚类。在一个具体实施方案中，本发明的抗体属于IgG4亚类，且包含以下氨基酸取代：Fc区的P329G和/或S228P和L235E。在某些实施方案中，可以通过将可变结构域或其片段与包含一个或多个本文公开的氨基酸取代的Fc结构域组合，以产生本发明的修饰抗体。在其他实施方案中，可以通过在Fc结构域中引入一个或多个氨基酸取代残基，修饰包含Fc结构域的抗体，从而产生本发明的修饰抗体。
减少的与Fc配体的结合
本领域技术人员将理解，本发明的抗体可以具有改变的(相对于未修饰的抗体)FcγR和/或C1q结合特性(结合特性的实例包括但不限于，结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和结合速率(分别为koff和kon)、结合亲和力和/或亲和性(avidity))，且某些改变是或多或少期望的。本领域已知，平衡解离常数(KD)定义为koff/kon。本领域技术人员可以确定哪种动力学参数对给定的抗体应用最重要。例如，减少与一种或多种正调节物(例如FcγRIIIA)的结合和/或增强与抑制性Fc受体(例如FcγRIIB)的结合的修饰将适合用于降低ADCC活性。因此，结合亲和力(例如平衡解离常数(KD))的比值可以指示本发明抗体的ADCC活性是增强还是降低。此外，减少与C1q的结合的修饰将适合用于降低或消除CDC活性。可以通过本领域已知的用于测定Fc-FcγR相互作用(即Fc区与FcγR的特异性结合)的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)，确定Fc区对其配体的亲和力和结合特性，所述体外测定方法包括但不限于平衡法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如分析)及其他方法，如间接结合测定试验、竞争性抑制测定试验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析(例如凝胶过滤)。这些及其他方法可以利用在所检查的一种或多种成分上的标记、和/或利用包括但不限于生色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记的多种检测方法。关于结合亲和力和动力学的详细描述可以见于Paul,W.E.编辑,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中。
在本发明的一个方面，包含野生型人Fc区的Fc变体的多肽(该变体包含Pro329位的氨基酸取代和至少一个其他氨基酸取代)，与包含该野生型Fc多肽的多肽相比，显示降低的对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体的亲和力。在一方面，包含本发明Fc变体的多肽显示的对Fc受体的亲和力比野生型Fc多肽低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在一方面，对于一种或多种Fc受体(包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIA、FcγRII和FcγRIII(CD 16，包括同种型FcγRIIIA))，与未修饰的抗体相比，包含本发明Fc变体的多肽显示降低的结合亲和力。
在一方面，与未修饰的抗体相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对FcγRI(CD64)、FcγRIIA和FcγRIIIA的结合亲和力。
在一方面，与未修饰的抗体相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对FcγRIIA和FcγRIIIA的结合亲和力。
在一方面，与未修饰的抗体相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对FcγRI(CD64)和FcγRIIIA的结合亲和力。
在本发明的一个方面，显示降低的对Fc受体的结合亲和力的包含本发明Fc变体的多肽还显示降低的对C1q受体的亲和力。
在某方面，与野生型多肽相比，包含本发明Fc变体的多肽不包含在FcγRIIB受体结合上的并行增加。在本发明的某些方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含Fc变体的多肽具有降低的对人受体FcγIIIA及对至少一种其他受体的亲和力，其中所述至少一种其它受体为包含人受体FcγIIA、FcγIIIB和C1q的组中的至少一种其它受体。在本发明的另一方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含Fc变体的多肽，对人受体FcγIIIA及对包含人受体FcγIIA、FcγIIIB和C1q的组中的至少两种其他受体，具有降低的亲和力。在本发明的另一方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含Fc变体的多肽对人FcγRIA、FcγIIIA、FcγIIA、FcγIIIB和C1q具有降低的亲和力。还在本发明的另一方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含Fc变体的多肽对人受体FcγRIA、FcγIIIA、FcγIIA、FcγIIIB和C1q具有降低的亲和力。
在本发明的一个方面，相对于未修饰的抗体，包含本发明Fc变体的多肽显示降低的对FcγRI或FcγRIIA的亲和力。在本发明的一个方面，包含Fc变体的多肽对FcγRI或FcγRIIA显示的亲和力，比野生型多肽的亲和力，低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在本发明的一个方面，包含Fc变体的多肽对FcγRI或FcγRIIA显示的亲和力，比野生型多肽的亲和力，低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。
在本发明的一个方面，相对于未修饰的抗体，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对FcγRIIIA的亲和力。在一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRIIIA显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在本发明的一个方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRIIIA显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。
本领域理解，FcγRIIIA的F1-58V等位基因变体具有改变的抗体结合特征。在一个实施方案中，相对于野生型多肽，包含本发明的Fc变体的多肽以降低的亲和力结合FcγRIIIA受体。在一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRIIIA(Fl 58V)显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在本发明的一个方面，相对于未修饰的抗体，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对C1q受体的亲和力。在一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对C1q受体显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在本发明的一个方面，包含本发明的Fc变体的多肽对C1q显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。
在本发明的一个方面，包含本发明的Fc变体的多肽对人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(Fl 58V)或C1q受体显示的亲和力比野生型多肽低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。
在本发明的另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(Fl 58V)和/或C1q受体显示的亲和力分别在约10nM至100nM、10nM至1μM、100nM至约100μM、或约100nM至约10μM、或约100nM至约1μM、或约1nM至约100μM、或约10nM至约100μM、或约1μM至约100μM、或约10μM至约100μM之间。在某些实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(Fl 58V)或C1q受体显示的亲和力大于100nM、500nM、1μM、大于5μM、大于10μM、大于25μM、大于50μM、或大于100μM。
在本发明的另一方面，与野生型多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示提高的对FcγRIIB的亲和力。在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRIIB显示的亲和力，与未修饰的抗体相比，未改变或增加至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽对FcγRIIB受体显示的亲和力，与野生型多肽相比，提高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
在本发明的另一方面，本发明的变体对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA或FcγRIIIA(Fl 58V)或C1q受体显示的亲和力低于100μM、低于50μM、低于10μM、低于5μM、低于2.5μM、低于1μM、或低于100nM、或低于10nM。
减少的效应子功能
在本发明的某些方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽调节效应子功能。
还在本发明的另一方面，此调节是ADCC和/或ADCP和/或CDC的调节。在本发明的另一方面，此调节是在效果上的下调或降低。还在本发明的另一方面，这是ADCC的调节，还在本发明的另一方面，此调节是ADCC的下调。还在本发明的另一方面，此调节是ADCC和CDC的下调，还在另一实施方案中，这是仅ADCC的下调，还在另一实施方案中，这是ADCC和CDC和/或ADCP的下调。还在本发明的另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽下调或减少ADCC/CDC和ADCP。
在本发明的另一方面，包含Fc变体的多肽诱导的ADCC或CDC或ADCP的减少或下调是，减少至由包含野生型Fc区的多肽分别诱导的ADCC或CDC或ADCP的观察值的0、2.5、5、10、20、50或75％。
还在本发明的另一方面，包含本发明Fc变体的多肽诱导的ADCC的调节是在效力上的降低，从而与包含野生型Fc多肽的多肽相比，该Fc变体的EC50降低约>10倍。
还在另一方面，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，本发明的变体在人效应细胞的存在下无任何明显的ADCC和/或CDC和/或ADCP。
还在本发明的另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低(例如降低至少20％)或强烈降低(例如降低至少50％)的效应子功能，其可以是ADCC(下调)、CDC和/或ADCP的降低。
降低的ADCC活性
可以进行体外和/或体内细胞毒性测定试验，确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定试验，确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、RII和RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的464页表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于：美国专利号5,500,362(见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；US5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以利用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于这类测定的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在动物模型(诸如公开于Clynes等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中的动物模型)中，评估目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定试验，确认抗体不能结合C1q，并因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定试验(见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202(1996)163；Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。还可以用本领域已知的方法(见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12)(2006)1759-1769)，进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
可以考虑，通过用于测定一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的体外功能测定试验，表征包含本发明的Fc变体的多肽。在某些实施方案中，本发明的抗体在体内模型(如本文中描述和公开的)中与在基于体外的测定试验中具有相似的结合特性和效应细胞功能。但是，本发明不排除：本发明的变体在基于体外的测定试验中不显示期望的表型但在体内显示期望的表型。在一个实施方案中，与未修饰的野生型Fc多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的ADCC活性。在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽比未修饰的抗体显示低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍的ADCC活性。还在另一实施方案中，相对于未修饰的抗体，本发明的抗体显示降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的ADCC活性。在本发明的另一方面，包含Fc变体的多肽诱导的ADCC的降低或下调是，降低至分别由包含野生型Fc区的多肽诱导的ADCC或CDC或ADCP的观察值的0、2.5、5、10、20、50或75％。在某些实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽不具有可检测到的ADCC活性。在特定实施方案中，ADCC活性的降低和/或消除可以归因于包含本发明的Fc变体的多肽对Fc配体和/或受体的降低亲和力。在本发明的一个具体实施方案中，ADCC的下调是效力的降低，从而与野生型Fc多肽相比，该包含Fc变体的多肽的EC50降低约10倍或更多。
还在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽调节ADCC和/或CDC和/或ADCP。在一个具体方面，本发明的变体显示降低的CDC和ADCC和/或ADCP活性。
降低的CDC活性
补体活化途径由补体系统的第一成分(C1q)与分子(例如与关联抗原复合的抗体)的结合起始。为了评估补体活化，可以进行例如描述于Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202(1996)163中的CDC测定。
可以通过ELISA夹心型免疫测定，分析不同变体与C1q的结合特性。半数最大反应时的抗体浓度确定EC50值。此读出值被报告为：与在同一平板上测量的参考标准的相对差异以及样品和参考的变异系数。
在一个实施方案中，相对于野生型多肽，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的对C1q的亲和力。在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽显示对C1q受体的亲和力比野生型多肽低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽对C1q显示的亲和力比野生型多肽的亲和力低至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。在另一实施方案中，本发明的变体对C1q显示的亲和力在约100nM至约100μM、或约100nM至约10μM、或约100nM至约1μM、或约1nM至约100μM、或约10nM至约100μM、或约1μM至约100μM、或约10μM至约100μM之间。在某些实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽对C1q显示的亲和力大于1μM、大于5μM、大于10μM、大于25μM、大于50μM或大于100μM。
在一个实施方案中，与野生型Fc多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的CDC活性。在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽显示比野生型多肽低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍的CDC活性。还在另一实施方案中，相对于野生型多肽，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％的CDC活性。在某些方面，包含本发明的Fc变体的多肽不显示可检测的CDC活性。在特定实施方案中，CDC活性的降低和/或消除可以归因于包含Fc变体的多肽对Fc配体和/或受体的亲和力降低。
降低的抗体相关毒性
本领域理解，生物疗法可能具有不良毒性问题，该问题与指导免疫系统识别并攻击不想要的细胞和/或靶标的复杂性质相关。当识别和/或靶向攻击不发生在需要治疗的地方时，可能出现诸如不良毒性等后果。例如，非靶向组织的抗体染色可以指示潜在的毒性问题。
在一方面，与野生型多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示减少的非靶向组织染色。在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽显示减少的非靶向组织染色，其比野生型Fc多肽的染色低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在另一实施方案中，本发明的变体显示减少的非靶向组织染色，相对于野生型Fc多肽，其减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％。
在一个实施方案中，与野生型多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低的抗体相关毒性。在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽显示比野生型多肽的毒性低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍的毒性。在另一方面，相对于野生型多肽，包含本发明的Fc变体的多肽显示降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％的毒性。
血小板聚集
在本发明的一个方面，野生型多肽诱导血小板活化和/或血小板聚集，其变体(即包含Fc变体的多肽)显示减少或甚至消除的血小板活化和/或聚集。还在本发明的另一方面，该野生型多肽是靶向血小板蛋白质的抗体。还在另一方面，该抗体是CD9抗体。还在另一实施方案中，此CD9抗体在P329G位和/或在L234A/L235A或S228P/L235E位具有突变(P329G/LALA,P329G/SPLE)。在另一具体实施方案中，该抗体表征为SEQ ID NO:8-14。
本领域理解，生物疗法可能具有血小板聚集的副作用。可以用体外和体内测定试验来测量血小板聚集。认为体外测定试验可以反映体内情况。
在一方面，与野生型多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽在体外测定中显示减少的血小板聚集。在另一方面，包含本发明的Fc变体的多肽在体外测定中显示减少的血小板聚集，其比野生型多肽的血小板聚集低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽在体外测定中显示减少的血小板聚集，相对于野生型多肽，其减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％。
还在另一方面，与野生型多肽相比，包含本发明的Fc变体的多肽显示减少的体内血小板聚集。在另一方面，本发明的变体在体内测定中显示减少的血小板聚集，其比野生型Fc多肽的血小板聚集低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在另一实施方案中，包含本发明的Fc变体的多肽在体内测定中显示减少的血小板聚集，相对于野生型多肽，其减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％。
内化抗体
本发明的变体可以与细胞表面抗原结合，该细胞表面抗原可以发挥内化作用、进而将抗体带入细胞。一旦进入细胞内，变体可以被释放至细胞质、靶向特定区室、或回收至细胞表面。在一些实施方案中，本发明的变体与发挥内化作用的细胞表面抗原结合。在其他实施方案中，本发明的抗体可以被靶向细胞的特定细胞器或区室。还在其他实施方案中，本发明的变体可以在内化后被回收至细胞表面或周边。
在一个具体实施方案中，本发明的抗体对p-选择蛋白、CD9、CD19、CD81、CCR5或CXCR5、IL17a或Il-33特异。
抗体制备
在本发明的优选实施方案中，按照本发明的教导修饰的含Fc区多肽是抗体。用于产生抗体的技术如下：
抗原选择和预备
在多肽是抗体时，其抗目的抗原。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，且对患有疾病或病症的哺乳动物施用抗体可以在该哺乳动物中产生治疗益处。但是，也考虑抗非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原；见美国专利号5,091,178)的抗体。
当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，如生长因子。示例性抗原包括诸如以下的分子：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节活化的正常T细胞表达和分泌蛋白，regulatedon activation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；及任意上列多肽的片段。
本发明所涵盖的抗体的优选分子靶标包括CD蛋白，如CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子，如VEGF；组织因子(FR)；α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。
可以用适宜的抗原或其片段(可选地与其他分子缀合)作为免疫原来产生抗体。对于跨膜分子，如受体，可以用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。备选地，可以用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这类细胞可以衍生自天然来源(例如癌细胞系)或可以是已通过重组技术转化而表达该跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域技术人员而言显而易见。
多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物中引起多克隆抗体。可能有用的是，用双官能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或其中R和R1是不同烷基的碳二亚胺)，将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合。
以抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物，其中将例如100μg或5μg的该蛋白或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中的例如1/10初始量的肽或缀合物，加强免疫动物。7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物，直至效价平台期。优选地，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原与不同的蛋白质缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。另外，可以适宜地用诸如明矾等聚集剂来增强免疫反应。
单克隆抗体
单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature,256(1975)495描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
在杂交瘤法中，按上文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物(如仓鼠或猕猴)，以引起淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress(1986)59-103页)。
将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是高效融合、支持所选择的产抗体细胞稳定高水平产生抗体、且对诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从Salk Institute Cell DistributionCenter,San Diego,Calif.USA获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可从American Type Culture Collection,Rockville,Md.USA获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.,Immunol.133(1984)3001；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987)51-63页)。
针对抗抗原的单克隆抗体的产生，测定生长杂交瘤细胞的培养基。优选地，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定试验，测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
鉴定出产生具有希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986)59-103页)。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在动物中作为腹水肿瘤，体内培养该杂交瘤细胞。
适宜地，可以通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，从培养基、腹水或血清分离该亚克隆分泌的单克隆抗体。
编码单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码该单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为这种DNA的优选来源。一旦分离，即可以将该DNA放入表达载体中，然后将该表达载体转染入宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或原不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。下文将更详细地描述抗体的重组生产。
在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty,J.等,Nature 348(1990)552-554中的技术产生的抗体噬菌体文库，分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352(1991)624-628和Marks等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology10(1992)779-783)、以及组合感染和体内重组以作为用于构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21(1993)2265-2266)。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代技术。
还可以修饰该DNA，例如用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(1984)6851-6855)，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接。
典型地，这类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者它们可以取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域以产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合部位和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。
抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，如以下测定试验中描述的，用Fab形式的目的抗体及其抗原进行放射性标记的抗原或Fc受体结合测定(RIA)，以确定Kd。通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用微小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原，测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了确定用于测定的条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml的捕获性抗-Fab抗体(Cappel Labs)过夜包被多孔板(ThermoScientific)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如，与抗-VEGF抗体，Fab-12，的评估一致，在Presta等,Cancer Res.57(1997)4593-4599中)。然后过夜孵育目的Fab；但是，孵育可以持续更长时期(例如约65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移至捕获平板在室温孵育(例如孵育1小时)。然后去除溶液，用含0.1％聚山梨糖酯20的PBS洗涤平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数平板10分钟。对于每种Fab，选择给出小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一实施方案，以～10个反应单位(RU)，用固定化抗原或Fc受体CM5芯片，在25℃使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用表面等离振子共振测定来测量Kd值。简言之，按照供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后按5μl/分钟的流速注入，以达到约10个反应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速，在25℃，在含0.05％聚山梨糖酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中，将两倍系列稀释的Fab(例如0.78nM至500nM)注入。通过同时拟合结合传感图和解离传感图，用简单的一对一Langmuir结合模型( Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，其中如在分光计，如装配停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，在浓度渐增的抗原的存在下，含20nM抗-抗原的抗体(Fab形式)的PBS pH7.2在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，及下文描述的其他片段。某些抗体片段的综述见Hudson等,Nat.Med.9(2003)129-134。scFv片段的综述见例如Pluckthün,in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,NewYork),269-315页(1994)；还见WO 93/16185；和美国专利号US 5,571,894和US 5,587,458。包含挽救受体结合表位残基且具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论见美国专利号US 5,869,046。
双抗体(diabody)是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9(2003)129-134；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)还描述于Hudson等,Nat.Med.9(2003)129-134中。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利号US 6,248,516 B1)。
可以通过多种技术，包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，制备抗体片段。
嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号US 4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(1984)6851-6855)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其结合抗原的片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，而保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，而FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体可选地还可以包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如HVR残基衍生自的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并进一步描述于例如Riechmann等,Nature332(1988)323-329；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn等,Methods 36(2005)61-68；和Klimka等,Br.J.Cancer,83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
可以用来进行人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法(best–fitmethod)选择的构架区(见例如Sims等,J.Immunol.151(1993)2296)；衍生自特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992)4285；和Presta等,J.Immunol.,151(1993)2623)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和自筛选FR文库得到的构架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684；和Rosok等,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-74及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，其中该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述见Lonberg,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。还见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870；描述技术的美国专利申请公开号US2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合，进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系。(见例如Kozbor,J.Immunol.,133(1984)3001；Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)51-63页；和Boerner等,J.Immunol.,147(1991)86.)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103(2006)3557-3562中。其他方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(trioma)技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology 20(3)(2005)927-937及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology 27(3)(2005)185-91中。
还可以通过如下产生人抗体：分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列。然后可以将该可变结构域序列与希望的人恒定区组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
文库衍生的抗体
可以针对具有一种或多种希望的活性的抗体，筛选组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等,in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37(O’Brien等编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并进一步描述于例如McCafferty,J.等,Nature 348(1990)552-554；Clackson等,Nature 352(1991)624-628；Marks等,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks和Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248 161-175(Lo编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2)(2004)299-310；Lee等,J.Mol.Biol.340(5)(2004)1073-1093；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)(2004)12467-12472；及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2)(2004)119-132中。
在某些噬菌体展示方法中，分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12(1994)433-455中所述从该文库筛选结合抗原的噬菌体。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths等,EMBO J,12(1993)725-734所述，克隆(例如从人)幼稚库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的单一抗体来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227(1992)381-388所述，通过从干细胞克隆未重排V基因区段，并用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并实现体外重排，以合成制备幼稚文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利申请公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
本文将分离自人抗体文库的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性中的一种针对特定抗原，另一种针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与抗原的两个不同表位结合。还可以用双特异性抗体来将细胞毒性剂定位至表达该抗体所结合的抗原的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305(1983)537；WO 93/08829；及Traunecker等,EMBO J.10(1991)3655)和“knob-in-hole”改造(见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：工程化改造静电转向作用以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229(1985)81)；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5)(1992)1547-1553)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(scFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152(1994)5368)；按例如Tutt等,J.Immunol.147(1991)60中所述制备三特异性抗体。
本文还包含具有三个或更多个功能性抗原结合部位的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(octopus antibody)(见例如US 2006/0025576 A1)。
本文的抗体或片段还包括含有与一个特定抗原以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用Fab”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
对抗原具有改变的结合亲和力的抗体变体
在某些实施方案中，可能希望改善与抗原的结合亲和力和/或抗体的其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失和/或在抗体的氨基酸序列内插入和/或取代残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如抗原结合。
取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供还在Fc部分以外的部分具有一个或多个氨基酸取代的包含Fc变体的多肽。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中“保守取代”的表头下显示保守取代。表1中“示例性取代”的表头下显示更实质性的改变，下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望的活性(例如保留/改善的抗原结合或降低的免疫原性)筛选产物。
表1：
原残基 示例性取代 保守取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
按照共同的侧链性质分组：
(1)疏水性：Ile、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选择用于进一步研究的所得到的一种或多种变体将具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)来例如改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子所编码的残基)(见例如Chowdhury,Method Mol.Biol.207(2008)179-196)、和/或在SDR(a-CDR)中进行这类改变，针对结合亲和力测试得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择而进行的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等,in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37(O’Brien等编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种，在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法，其中随机化几个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟，特别地鉴定涉及抗原结合的HVR残基。尤其通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这些改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR之外进行。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells,Science 244(1989)1081-1085所述，一种用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对最初的取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选物被靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽的融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体来提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而方便地实现对抗体添加或缺失糖基化位点。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于Fc区的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的二天线型寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297。见例如Wright等,TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可以包含多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在二天线型寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
本发明进一步提供具有唾液酸酰化寡糖的包含Fc变体的多肽，例如其中提供附着于抗体Fc区的Fc核心寡糖的差异唾液酸酰化。这类多肽可以具有增加的唾液酸酰化和/或减少的ADCC功能。例如Kaneko等,Science313(2006)670–673描述了这类抗体变体的实例。
半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可能希望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基取代抗体的一个或多个残基。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的易于接近的部位。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性巯基放置在抗体的易于接近的部位，并可以用来将抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合来产生免疫缀合物(本文进一步描述)。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任意一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可以按例如美国专利号7,521,541中所述产生半胱氨酸工程化的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体来包含本领域已知且易于得到的其它非蛋白质性部分。适合用于衍生抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropylene glycol同聚物、prolypropylene oxide/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在制备中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附着于抗体的聚合物的数目可以不同，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据包括但不限于抗体要改善的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于治疗等考虑因素，确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。
在另一实施方案中，提供抗体与可以通过暴露于辐射而被选择性加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任意波长，且包括但不限于这样的波长，该波长不损害普通细胞，但加热该非蛋白质性部分至可以杀死靠近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
重组方法和组合物
可以用例如按美国专利号4,816,567所述的重组方法和组合物，产生抗体。在一个实施方案中，提供分离的编码本文所述抗体变体的核酸。这类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗体变体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体变体的重组生产，分离例如上文所述的编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。抗体片段和多肽在细菌中的表达，见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还见Charlton,Methods in MolecularBiology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ)，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊分离在可溶级分中的抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”的真菌和酵母菌株，这导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。见Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414和Li等,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的多种杆状病毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或肾细胞(BHK))；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology 248(2003)255-268(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ)。
测定试验
可以通过本领域已知的多种测定试验，就物理/化学性质和/或生物学活性，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体。
结合测定试验和其他测定试验
在一方面，可以例如通过诸如ELISA、Western印迹的已知方法，就抗原结合活性，测试本发明的抗体。
在示例性竞争测定试验中，在包含结合抗原(例如)的第一标记抗体和第二未标记抗体的溶液中孵育固定化的抗原，其中测试第二抗体与第一抗体竞争结合抗原的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照，在包含第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中孵育固定化的抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，然后测量与固定化抗原结合的标记的量。相对于对照样品，如果与固定化抗原结合的标记的量在测试样品中实质性降低，则指示第二抗体与第一抗体竞争结合抗原(见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A LaboratoryManual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文抗体。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，该药物包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)(见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425235 B1)；auristatin，如monomethylauristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利号5,635,483、5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53(1993)3336-3342；及Lode等,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环类化合物(anthracycline)，如柔红霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(见Kratz等,Current Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16(2006)358-362；Torgov等,Bioconj.Chem.16(2005)717-721；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King等,J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；及美国专利号6,630,579)；氨基蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷类(taxane)，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(palitaxel)、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯；及CC1065。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合形成放射性缀合物的本文所述的抗体。可用多种放射性同位素来产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用多种双官能蛋白质偶联剂来产生抗体和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等,Science 238(1987)1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰酸基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。见例如WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari等,Cancer Res.52(1992)127-131；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用包括但不限于如下的市售交联剂(例如来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)制备的这类缀合物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗体变体都用于检测与该抗体结合的抗原在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供可以用于诊断或检测的方法中的抗体变体。在另一方面，提供检测与该抗体变体结合的抗原在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括使生物样品与本文所述的抗体在允许抗体与抗原结合的条件下接触生物样品，并检测抗体和抗原之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，用抗体变体来选择适合抗体治疗的个体，例如，当该抗体结合的抗原是用于选择患者的生物标志时。
可以用本发明的抗体诊断的示例性病症包括癌症、心血管疾病、神经病症和糖尿病。
在某些实施方案中，提供标记的抗体变体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(如酶或配体)。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(如HRP，乳过氧化物酶，或微氧化酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等。
药物制剂
可以通过将具有希望的纯度的抗体与一种或多种可选的可药用载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式，制备本文所述抗体变体的药物制剂。可药用载体一般在所利用的剂量和浓度下对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苯索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体进一步包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。包括rHuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将sHASEGP与诸如软骨素酶的一种或多种额外糖胺聚糖酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括描述于美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中的那些，后者制剂包含组氨酸-乙酸缓冲液。
制剂还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性成分，优选相互无不利影响且具有互补活性的那些。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗乳液中。这类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质可以是成形物品的形式，例如膜或微囊。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地例如通过滤过无菌滤膜来达到。
治疗方法和组合物
本文提供的任何多肽均可以用于治疗方法。
在本发明的一个具体方面，本发明的多肽用于治疗疾病。在一个更具体的方面，该疾病是这样，其中，与包含野生型Fc多肽的多肽相比，变体的效应子功能强烈(至少50％)降低是有利的。
在一个具体方面，本发明的多肽用于制备用于治疗疾病的药物，其中与野生型Fc多肽相比，该多肽的效应子功能强烈降低是有利的。在另一具体方面，本发明的多肽用于制备用于治疗疾病的药物，其中与野生型Fc多肽相比，该多肽的效应子功能降低至少20％是有利的。
另一方面是治疗患有疾病的个体的方法，其中与野生型Fc多肽相比，变体的效应子功能强烈降低是有利的，该方法包括对该个体施用有效量的本发明的多肽。
效应子功能的强烈降低是：效应子功能，比野生型多肽诱导的效应子功能，降低至少50％。
疾病是例如其中例如ADCC、ADCP或CDC不应破坏所靶向的细胞的所有疾病。此外，这对如下抗体也是正确的，其中所述抗体被设计用来将药物(例如毒素和同位素)递送至靶细胞，其中Fc/FcγR介导的效应子功能会将健康免疫细胞带到接近该致死性荷载的附近，从而导致正常淋巴组织随同靶细胞一起被消耗(Hutchins等,PNAS USA 92(1995)11980-11984；White等,Annu Rev Med 52(2001)125-145)。在这些情况下，使用招募补体或效应细胞弱的抗体将极其有益(见例如Wu等,CellImmunol 200(2000)16-26；Shields等,J.Biol Chem 276(9)(2001)6591-6604；US 6,194,551；US 5,885,573；和PCT公开WO 04/029207)。
在其他情况下，例如，当目的是阻断广泛表达的受体与它的关联配体的相互作用时，减少或消除所有抗体效应子功能来降低不想要的毒性，可以是有利的。另外，在治疗性抗体显示跨越多种人组织的杂乱结合的情况下，谨慎的是，将效应子功能的靶向限制于一组多样的组织来限制毒性。
另外，对于激动剂抗体，如果这些抗体显示降低的效应子功能，则将非常有帮助。
可以用多肽变体治疗的病症很多，且包括癌症(例如在抗体变体结合HER2受体、血管生成素受体或血管内皮生长因子受体(VEGF)时)；变应性病症，如哮喘(用抗-IgE抗体)；LFA-1介导的病症(例如在多肽变体是抗-LFA-1或抗-ICAM-1抗体时)；神经和代谢病症。
在抗体结合HER2受体时，该病症优选是表达HER2的癌症，例如特征在于HER2受体的过量表达的良性或恶性肿瘤。这类癌症包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、涎腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和多种类型的头颈癌。
可以通过任何适宜的手段来施用多肽或抗体变体，其包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，以及如果希望进行局部免疫抑制治疗，损伤内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，可以通过脉冲输注来适宜地施用抗体变体，尤其是用剂量递减的多肽变体。优选通过注射来给药，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长久的。
对于疾病的预防或治疗，多肽或抗体变体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重度和过程、为了预防还是治疗的目的而施用多肽变体、之前的治疗、患者临床病史、对多肽变体的反应、及主治医师的判断。在一次或在一系列治疗中适宜地对患者施用多肽变体。
取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的多肽或抗体变体是，例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注，对患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素，典型的日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗持续至出现希望的疾病症状的抑制。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定试验，可以容易地监测此治疗的进展。
在某些实施方案中，本发明提供抗体变体或多肽用于治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括对该个体施用有效量的抗体变体。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种额外治疗剂，例如下文所述。在其它实施方案中，本发明提供抗体变体用于在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖或耗竭B细胞，其包括对该个体施用对抑制血管发生、抑制细胞增殖或耗竭B细胞有效的抗体变体。以上任一个实施方案中，“个体”优选是人。
在另一方面，本发明提供抗体变体或多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症或炎性疾病。在另一实施方案中，该药物用于治疗癌症、糖尿病、神经病症或炎症的方法，该方法包括对患有癌症、糖尿病、神经病症或炎症的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的例如下文所述的至少一种其它治疗剂。在另一实施方案中，该药物用于抑制血管发生、抑制细胞增殖或耗竭B细胞。
在另一实施方案中，药物用于在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖或耗竭B细胞的方法，该方法包括对该个体施用对抑制血管发生、抑制细胞增殖或耗竭B细胞有效的量的药物。以上任一个实施方案中的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供包含任何本文提供的抗体变体的药物制剂，例如用于以上治疗方法中的任一种。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗体变体和可药用载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文提供的任意抗体变体和至少一种例如下文所述的其它治疗剂。
本发明的抗体可以在治疗中单独或与其他活性剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种其它治疗剂共同施用。
上文指出的这类组合疗法涵盖组合施用(两种或更多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在施用该其它治疗剂和/或助剂之前发生、同时发生和/或之后发生。本发明的抗体还可以与放射疗法组合使用。
可以通过任何适宜的手段来施用本发明的抗体(和任何其它治疗剂)，其包括胃肠外、肺内和鼻内，和如果希望进行局部治疗，损伤内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何适宜的途径来给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的或长期的。本文考虑多种给药方案，包括但不限于，单次或在多种时间点多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
以符合良好医疗实践的方式，配制、给药和施用本发明的抗体。在此考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病的病因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。无需但可选地，与目前用来预防或治疗所讨论的病症的一种或多种活性剂一起，配制抗体。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、病症或治疗的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和给药途径施用，或者以本文所述剂量的1％至99％施用，或通过经验/临床上确定为适当的任何剂量和任何途径施用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(在单独使用或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和过程、为了预防性还是治疗性目的而施用抗体、之前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适宜地对患者施用抗体。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是，例如通过一次或多次分开的施用，或通过连续输注，对患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素，典型的日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗通常将持续直至出现希望的疾病症状的抑制。抗体的一个示例性剂量将在从约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的抗体)。可以施用最初较高的荷载剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。但是，也可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定，可以容易地监测此治疗的进展。
应理解，可以用本发明的免疫缀合物取代或加上本发明的抗体来实施以上制剂或治疗方法的任一个。
制成品
在本发明的另一方面，提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制成品。制成品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳组合物，其自身或与另一组合物组合对治疗、预防和/或诊断病症有效，且可以具有无菌进出口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示，该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制成品可以包含(a)组合物包含在其中的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)组合物包含在其中的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制成品可以进一步包含指示该组合物可以用来治疗特定病症的包装说明书。备选地或此外，制成品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。制成品可以进一步包含从商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
应理解，以上制成品中的任一种都可以包含本发明的免疫缀合物取代或加上抗体变体。
多肽的非治疗性用途
本发明的抗体变体可以用作亲和纯化剂。在此方法中，用本领域公知的方法将抗体变体固定在诸如Sephadex树脂或滤纸的固相上。使固定的多肽变体与包含待纯化的抗原的样品接触，然后用适宜的溶剂洗涤支持物，该溶剂将基本上去除样品中除待纯化的抗原外的所有物质，待纯化的抗原与固定化的抗体变体结合。最后，用另一适宜的溶剂(如甘氨酸缓冲液pH5.0)洗涤支持物，该溶剂将从多肽变体释放抗原。
抗体变体还可以用于诊断测定试验，例如用于检测目的抗原在特定细胞、组织或血清中的表达。
对于诊断应用，通常用可检测部分标记抗体变体。许多标记可用，其一般可以分为以下种类：
(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I。可以用描述于例如Coligen等,Current Protocols in Immunology,卷1和2,Ed.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991)中的技术，用放射性同位素标记多肽变体，并可以用闪烁计数测量放射活性。
(b)可以获得荧光标记，如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。可以用公开于例如Protocols in Immunology,上引文中的技术，将荧光标记与多肽变体缀合。可以用荧光计定量荧光。
(c)可以获得多种酶-底物标记，美国专利号4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶通常催化可以生色底物的化学变化，这可以用多种技术测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度测定法测量。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应变为电子激发的，然后可以发出可以测量的光(例如用化学发光计)或将能量贡献给荧光受体。酶标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan等,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use inEnzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(ed J.Langone&H.VanVunakis),Academic press,New York,73:147-166(1981)中。
酶-底物组合的实例包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)以及过氧化氢作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺)或3,3′,5,5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)；
(ii)碱性磷酸酶(AP)以及对-硝基苯磷酸盐作为生色底物；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶以及生色底物(例如对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)。
本领域技术人员可以获得许多其他酶-底物组合。这些的一般描述见美国专利号4,275,149和4,318,980。
有时，标记与多肽变体间接缀合。熟练的技术人员将意识到达到此目的的多种技术。例如，多肽可以与生物素缀合，上述三个宽泛的标记种类之任何均可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此可以以这种间接方式将标记与多肽变体缀合。备选地，为了达到标记与多肽变体的间接缀合，使多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，使上文提到的不同类型标记之一与抗-半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)缀合。由此，可以达到标记与多肽变体的间接缀合。
在本发明的另一方面，无需标记抗体变体，其存在可以用结合多肽变体的标记抗体检测。
本发明的抗体变体可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques,(1987)147-158页,CRC Press,Inc.。
抗体变体还可以用于体内诊断测定。通常，用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记多肽变体，使得可以用免疫闪烁照相法定位抗原或表达它的细胞。虽然已为了理解的清晰性的目的以举例说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但不应将该描述和实例解释为限制本发明的范围。
序列表描述
SEQ ID NO:1人κ轻链
SEQ ID NO:2人λ轻链
SEQ ID NO:3人IgG1(高加索人同种异型)
SEQ ID NO:4人IgG1(非洲裔美国人同种异型)
SEQ ID NO:5人IgG1LALA-突变体(高加索人同种异型)
SEQ ID NO:6人IgG4
SEQ ID NO:7人IgG4SPLE-突变体，其代表κ轻链、λ轻链、IgG1和IgG4的示例性人序列(可以作为产生本发明的变体的基础)
在SEQ ID NO:3-5，人IgG1同种异型的序列中，按照Kabat EU索引的P329区定位在212位，而该P329区在SEQ ID NO:6和7中可以见于209位。
SEQ ID NO:8mAb 40A746.2.3的κ轻链
SEQ ID NO:9mAb 40A746.2.3的野生型IgG1的重链
SEQ ID NO:10mAb 40A746.2.3的IgG1P329G的重链
SEQ ID NO:11mAb 40A746.2.3的IgG1LALA/P329G的重链
SEQ ID NO:12mAb 40A746.2.3的IgG4SPLE的重链
SEQ ID NO:13mAb 40A746.2.3的IgG4SPLE/P329G的重链
SEQ ID NO:14mAb 40A746.2.3的IgG1LALA的重链
实施例
以下七个实施例是本发明的方法和组合物的实例。应理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。
虽然已为了理解的清晰性的目的以举例说明和实例的方式详细描述了前述发明，但不应将该描述和实例解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以其整体引入作为参考。
实施例1
抗体
对于下文所述的实验，使用抗CD9(见SEQ ID 8-14)、抗P-选择蛋白(序列描述于WO 2005/100402中)和抗CD20(同义词：GA101，序列描述于EP 1 692 182中)的抗体。
用基于PCR的诱变，产生本文所述的所有变体，例如选择蛋白、CD9、CD20(GA101)和CD20(GA101)糖工程化的结合性抗体的P329G,P329A,P329R SPLE,LALA,P329G/LALA,P329G/SPLE变体(按照EU命名编号)。在HEK-EBNA或HEK293(CD9Fc变体)系统中表达IgG分子，并用A蛋白层析和大小排除层析纯化。
实施例2
不同Fcγ受体与免疫球蛋白的结合亲和力的测定
在25℃，用Biacore T100仪器(GE Healthcare)，通过表面等离振子共振(SPR)，测量了不同FcγR对免疫球蛋白的结合亲和力。
系统被良好地建立用于研究分子相互作用。它允许连续实时监测配体/分析物的结合，因此允许测定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。折射率的变化指示：由固定化的配体与在溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上固定的配体，则质量增加，而在解离的情况下，质量减少。
对于1:1相互作用，无论结合分子注射在表面上或固定在表面上，应观察不到结果的不同。因此，取决于配体或对应的分析物的溶解性和可得性，使用了不同的设定(其中，Fcγ受体分别作为配体或分析物)。
对于FcγRI，在pH 4.5，使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒和CM5芯片，固定了10000共振单位(RU)的识别多聚组氨酸序列的捕获系统(pentaHis单克隆抗体，Qiagen Hilden，目录号34660)。以5μl/分钟的流速，使用60秒的脉冲，以5μg/ml的浓度捕获了FcγRI。使0至100nM范围内的不同浓度的抗体在298K以30μl/分钟的流速通过流动池120秒，以记录结合相。解离相监测多达240秒，并通过将样品溶液转为运行缓冲液来触发。以30ml/分钟的流速用pH 2的甘氨酸溶液洗涤2分钟，再生表面。对于所有实验，选择由GE Healthcare提供的HBS-P+缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.05％(v/v)表面活性剂P20)。通过减去获自未捕获FcγRI的表面的反应，校正本体折射率差异。也减去空白注射(＝双参照)。
通过用BIA评价软件包分析用几个不同浓度获得的传感曲线，确定平衡解离常数(KD)，定义为ka/kd。数据的拟合遵循适宜的结合模型。
对于FcγRIIA和FcγRIIIAV158，通过使用由GE提供的胺偶联试剂盒(pH 4.5，以10μg/ml的浓度)，将10000共振单位(RU)的待测单克隆抗体固定至CM5芯片上。
在298K，使0至12800nM范围内的不同浓度FcγRIIA和IIIA以5μl/分钟的流速通过流动池120秒，以记录结合相。解离相监测多达240秒，且通过将样品溶液转为运行缓冲液来触发。以30ml/分钟的流速用3mMNaOH/1M NaCl溶液洗涤0.5分钟，再生表面。对于所有实验，选择了由GE Healthcare提供的HBS-P+缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,150mMNaCl,0.05％(v/v)表面活性剂P20)。
通过减去获自无捕获抗体的表面的反应，校正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双参照)。
通过用BIA评价软件包分析用几个不同浓度获得的传感曲线，确定了平衡解离常数(KD)。数据的拟合遵循适宜的结合模型，使用稳态拟合。
对于FcγRIIB，在pH 4.5，使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒和CM5芯片，固定了10000共振单位(RU)的识别多聚组氨酸序列的捕获系统(pentaHis单克隆抗体，Qiagen Hilden，目录号34660)。以5μl/分钟的流速，使用120秒的脉冲，按5μg/ml的浓度捕获FcγRIIB。以1340nM的浓度，使不同抗体在298K以5μl/分钟的流速通过流动池60秒，以记录结合相。解离相监测多达120秒，且通过将样品溶液转为运行缓冲液来触发。按30ml/分钟的流速用pH 2.5的甘氨酸溶液洗涤0.5分钟，再生表面。对于所有实验，选择了由GE Healthcare提供的HBS-P+缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,0.05％(v/v)表面活性剂P20)。
通过减去获自未捕获FcγRIIB的表面的反应，校正本体折射率差异。还减去空白注射(＝双参照)。
由于FcγRIIB对野生型IgG1非常低的内在亲和力，未计算亲和力，而评估了定性结合。
下表总结引入Fc部分的突变对与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIAV1-58(A)的结合的影响，以及对ADCC(在无(BLT)和有靶细胞(ADCC)的情况下测量)和对C1q结合(B)的影响。
表2A：
FcγRI FcγRIIaR131 FcγRIIIAV158 FcγRIIB
WT IgG1 ++(5nM) ++(2μM) +(0,7μM) ++
IgG4SPLE - +/-(10μM) -(>20μM) +
IgG1P329G ++(6nM) -(>20μM) -(>20μM) -
IgG1P329A ge ++(8nM) +(4.4μM) +(1,8μM) +
IgG1P329G LALA - -(>20μM) -(>20μM) -
IgG1P329G ge ++(10nM) -(>20μM) -(>10μM) -
*++for ge IgG1
30nM
表2B：
--与wt相比强烈降低/失活，-与wt相比降低，+与wt相互作用相当，n.d.未测定，/无结果
更详细地，获得了以下结果：
对FcγRI受体的亲和力
向P-选择蛋白、CD20和CD9抗体的Fc多肽中引入了P329G、P329A、SPLE和LALA突变，并用Biacore系统测量了与FcγRI的结合亲和力。具有P329G突变的抗体仍然与FcγR1结合(图1a和1b)，但三重突变P329G/LALA和P329G/SPLE的引入分别导致了几乎检测不到结合的抗体(图1b)。LALA或SPLE突变比P329G单独更多地减少与该受体的结合，但小于与P329G的组合(图1a和1b)。因此，P329G与LALA或SPLE突变的组合，比P329G突变或双突变LALA或SPLE单独，有效得多。CD20IgG1野生型抗体的kd值为4.6nM，同一抗体的P329G突变体的kd值为5.7M，但对于三重突变体P329G/LALA，由于几乎检测不到抗体与FcγRI受体的结合，故未能确定kd值。抗体本身(即，无论CD9或CD20或p-选择蛋白被测试)对结合亲和力具有微小的影响。
对FcγRIIA受体的亲和力
向CD9抗体的Fc多肽中分别引入了P329G、SPLE和LALA突变，并用Biacore系统测量了与FcγRIIA-R131受体的结合亲和力。标化结合水平，使得捕获的mAb代表100RU。所以对于1:1化学计量，预期不超过约20RU。图1c显示，向Fc变体中引入LALA、SPLE/P329G、P329G和LALA/P329G突变，强烈减少与FcγRIIA受体的结合。不同于与FcγR1受体的结合，单独引入P329G突变能够非常强烈地阻断与该受体的结合，至或多或少地类似于三重突变P329G/LALA的程度(图1c)。
与FcγRIIB受体的亲和力
向CD9和P-选择蛋白抗体的Fc多肽中分别引入了SPLE、LALA、SPLE/P329G和LALA/P329G突变，并用Biacore系统测量了与FcγRIIB受体的结合亲和力。图1d显示，在LALA和三重突变体P329G/LALA、P329G/SPLE中，与FcγRIIB受体的结合强烈减少。
与FcγRIIIA受体的亲和力
向CD9的Fc多肽中引入了P329G、LALA、SPLE、P329G/LALA和SPLE/P329G突变，并用Biacore系统测量了与FcγRIIIA-V158受体的结合亲和力。P329G突变和三重突变P329G/LALA最强烈地减少与FcγRIIIA受体的结合，至几乎检测不到的水平。P329G/SPLE也导致强烈降低的结合亲和力，突变SPLE和LALA仅分别轻微降低与FcγRIIIA受体的结合亲和力(图1c)。
实施例3
C1Q ELISA
通过ELISA夹心型免疫测定，分析了包含Fc变体的不同多肽与C1q的结合特性。以10μg/ml至0μg/ml之间的8个浓度，将每种变体偶联至疏水性Maxisorp 96孔板。此偶联模拟抗体的复合，其是C1q分子的高亲和力结合的先决条件。洗涤后，孵育样品以允许C1q结合。进一步的洗涤后，通过多克隆兔抗-hC1q抗体来检测结合的C1q分子。随后的洗涤步骤后，加入酶标记的抗-兔-Fcγ特异性抗体。通过加入可以被该酶转化为有色产物的底物，使免疫学反应可见。得到的吸光度(通过光度测定法测量)与结合该待研究抗体的C1q的量成比例。计算变体-C1q相互作用的EC50值。将来自生色反应的吸光度单位对抗体的浓度作图。半数最大反应时的抗体浓度确定EC50值。此读出值被报到为：与在同一平板上测量的参考标准的相对差异以及样品和参考的变异系数。
类似于SPLE突变，引入P-选择蛋白或CD20抗体的P329G突变强烈减少与C1q的结合(图2)。表3总结变体与C1q受体结合的计算EC 50值。C1q属于补体活化蛋白，在补体活化经典途径中发挥主要作用，该途径导致膜攻击复合体的形成。C1q还涉及其他免疫学过程，如吞噬作用的增强、凋亡细胞的清除、或病毒的中和。因此，可以预期，此处显示的减少C1q结合的突变(例如P329G和SPLE，以及非常可能地还有包含前述单突变的三重突变)强烈降低C1q的上述功能。
表3：
抗体 EC50值
P-选择蛋白IgG1wt 1.8
GA101IgG1wt 2.4
P-选择蛋白IgG1_P329G 2.7
P-选择蛋白IgG4SPLE 3.0
GA101IgG1P329G 5.5
GA101IgG4SPLE >10
实施例4
无靶细胞的ADCC，BLT测定试验
在适宜的96平底孔板中在PBS中4℃过夜包被待测试的抗体(CD20(GA101)和CD9)。用PBS洗涤平板后，用PBS/1％BSA在室温下封闭剩余的结合位点1小时。同时，收获效应细胞(转染以表达低或高亲和力人FcγRIII的NK-92细胞系)，弃掉封闭缓冲液后，将200 000活细胞/孔接种在100μl/孔AIM V培养基中。用100μl/孔皂苷缓冲液(含0.5％皂苷+1％BSA的PBS)来测定效应细胞的最大酯酶释放。在培养箱中37℃、5％CO2孵育细胞3小时。3小时后，将20μl/孔的上清与180μl/孔BLT底物(含0.2mM BLT+0.11mM DTNB的0.1M Tris-HCL，pH 8.0)混合，并在37℃孵育30分钟，然后在微板阅读器中在405nm读平板。将最大释放(皂苷处理的细胞)设为100％，未刺激的细胞(无抗体包被)设为0％释放，确定酯酶释放的百分比。
野生型CD20抗体(GA101wt(1))显示溶细胞活性的强烈诱导。LALA变体显示酯酶释放的明显减少，而P329G和P329G/LALA变体未显示任何ADCC活性(如3a)。图3b显示不仅P329位换为G导致明显降低的溶细胞活性，而且P329换为R329也导致明显降低的溶细胞活性(CD20抗体)。因此，类似于甘氨酸，精氨酸似乎破坏抗体中该脯氨酸夹心的功能。此处针对P329G突变体观察到的强烈降低的ADCC最有可能源自强烈减少的与FcγRIIA和FcγRIIIA受体的结合(见图1c和图1e)。
实施例5
具有靶细胞的ADCC
人外周血单个核细胞(PBMC)用作为效应细胞，并使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO63178USA)基本上按厂家的说明制备。简言之，用肝素化的注射器从志愿者采集静脉血。用PBS(不含Ca++或Mg++)1:0.75-1.3稀释血液，并铺在Histopaque-1077上。无制动地室温(RT)400x g离心该梯度30分钟。收集包含PBMC的中间相，用PBS(按来自两个梯度的细胞计，50ml)洗涤，并通过在RT下300x g离心10分钟来收集。用PBS重悬沉淀后，计数PBMC，并通过在RT下200x g离心10分钟来进行第二次洗涤。然后将细胞重悬在适当的培养基中用于后续流程。对于PBMC和NK细胞，用于ADCC测定的效应细胞与靶细胞的比分别为25:1和10:1。按适当的浓度在AIM-V培养基中预备效应细胞，以向圆底96孔板的每个孔加入50ml。靶细胞是培养在含有10％FCS的DMEM中的人B淋巴瘤细胞(例如Raji细胞)。在PBS中洗涤靶细胞，计数，并按每毫升30万个重悬在AIM-V中，以便按每个微孔加入30’000个细胞在100ml中。抗体稀释在AIM-V中，在50ml中加至之前接种的靶细胞，并允许在RT下与靶细胞结合10分钟。然后加入效应细胞，在含有5％CO2的增湿空气中37℃孵育平板4小时。通过用细胞毒性检测试剂盒(Roche Diagnostics,Rotkreuz,瑞士)测量自损伤细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放，评估对靶细胞的杀伤。4小时的孵育后，800x g离心平板。从每个孔转移100ml上清至新的透明平底96孔板。每孔加入100ml来自试剂盒的颜色底物缓冲液。用SOFTmax PRO软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089,USA)，在ELISA阅读器中在490nm测定颜色反应的Vmax值至少10分钟。从仅包含靶细胞和效应细胞而不含抗体的孔测量自发性LDH释放。从仅包含靶细胞和1％TritonX-100的孔测定最大释放。按以下，计算特异性抗体介导的杀伤的百分比：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x是特定抗体浓度下Vmax的平均值，SR是自发性释放的Vmax的平均值，MR是最大释放的Vmax的平均值。
如通过经典ADCC测定试验所测定，招募免疫效应细胞的效力取决于Fc变体的类型。在此，用人FcgRIIIA转染的人NK92细胞系作为效应细胞，用CD29阳性Raji细胞作为靶细胞。如图4a中可见，其中甘氨酸取代脯氨酸(P329G)的GA101(CD20)Fc变体的ADCC强烈降低，双突变体P329G/LALA的ADCC也以相似的程度降低。相反，LALA突变的ADCC降低较弱。为了更好地在不同变体之间进行区分，还以糖工程化的形式产生了变体以增强ADCC效力。可以观察到，亲本分子(GA101(CD20))如预期地显示强ADCC。LALA形式的ADCC效力强烈受损。P329G突变体非常强烈地降低ADCC；比GA101(CD20)抗体的P329A变体，导致多得多的降低(图4b)。
实施例6
补体活性
计数靶细胞，用PBS洗涤，按每毫升100万个细胞，重悬在AIM-V(Invitrogen)中。在平底96孔板中每孔接种50ml细胞。在AIM-V中制备抗体稀释液，并在50ml中加至细胞。使抗体在室温下与细胞结合10分钟。新鲜融化人血清补体(Quidel)，用AIM-V稀释3倍，在50ml中加至孔。按厂家所述制备兔补体(Cedarlane Laboratories)，用AIM-V稀释3倍，并在50ml中加至孔。作为对照，56℃加热补体源30分钟，之后加入测定试验。37℃孵育测定平板2小时。通过测量LDH释放，测定对细胞的杀伤。简言之，300x g离心平板3分钟。将每孔的50ml上清转移至新的96孔板，加入50ml来自细胞毒性试剂盒(Roche)的测定试剂。用ELISA阅读器的动态测量确定了与上清中的LDH浓度对应的Vmax。通过在1％Triton X-100的存在下孵育细胞，测定了最大释放。
分析了不同Fc变体在SUDH-L4靶细胞上介导CDC。非糖工程化的GA101分子显示明显的CDC诱导。LALA变体仅在最高浓度下显示活性，而P329G和P329G/LALA变体不显示任何CDC活性(图5a)。此外，糖工程化的GA101分子的LALA变体以及P329G和P329A变体未显示任何CDC活性(图5b)。
实施例7
人IgG1的糖谱
通过MALDI/TOF-MS以阳离子模式分析了在Fc区内包含突变(旨在废除与Fcγ受体的结合)的人IgG1抗体的糖谱(中性寡糖)。
按厂家的说明，用唾液酸酶(QA-Bio)处理人(h)IgG1变体，去除末端唾液酸。随后按之前所述(Ferrara,C等,Biotech.Bioeng.93(2006)851-861)，通过PNGase F(QA-Bio)消化，释放hIgG1的中性寡糖。按之前所述(Ferrara,C等,Biotech.Bioeng.93(2006)851-861)，以阳离子模式通过质谱(Autoflex,Bruker Daltonics GmbH)分析了糖谱。
人IgG1的中性Fc结合聚糖的糖谱被表征为三个主要的m/z峰，其可以分配至无(G0)末端半乳糖残基、具有一个(G1)或两个(G2)末端半乳糖残基的岩藻糖基化复杂寡糖。
分析了在Fc区内包含突变(旨在废除与Fc受体的结合)的hIgG1的糖谱，并与针对野生型抗体获得的糖谱相比较。在Fc内包含突变之一(P329G、LALA、P329A、P329G/LALA)的IgG变体显示与野生型抗体相似的糖谱，Fc结合聚糖是岩藻糖基化的复杂寡糖(数据未显示)。如通过丙氨酸取代241、243、263、265或301位的氨基酸所观察到的，Fc内的突变可以影响末端半乳糖基化和末端唾液酸化的水平(Lund,J.等,J.Immunol.157(1996)4963–4969)。
图6a显示此处所述的不同hIgG1Fc变体的半乳糖基化的相对百分比。在不同宿主中表达抗体时可以观察到轻微的变异，但未观察到末端半乳糖基化的明显差异。
图6b显示4种不同抗体的野生型和IgG1-P329G/LALA的半乳糖基化含量的变异性，其中比较了在Hek293EBNA细胞中表达时四种不同的V结构域的半乳糖基化的量。
实施例8
全血测定中抗体诱导的血小板聚集
全血血小板聚集分析使用来自Dynabyte的Multiplate仪器。首先，自正常人供体抽取20ml血液，并转入蛭素管(Dynabyte Medical,#MP0601)。将minicell impedance装置(Dynabead#MP0021)插入Multiplate仪器用于测定。然后，向小池中加入175μl 0.9％NaCl。向小池中加入抗体来获得最终的测试浓度。然后，加入175μl人血，并在37℃孵育3分钟。在37℃自动起始阻抗分析另外6分钟。通过定量曲线下面积作为血小板聚集的量度，由此分析数据。
CD9抗体已显示诱导血小板活化和血小板聚集(Worthington等,Br.J.Hematol.74(2)(1990)216-222)。之前已显示由结合血小板的抗体所诱导的血小板聚集涉及与FcγRIIA的结合(de Reys等,Blood 81(1993)1792-1800)。如上文所示，引入CD9抗体中的突变LALA、P329G、P329G/LALA和P329G/SPLE强烈减少CD9抗体与FcγRIIA受体的结合(图1c)。
通过在抗体中引入P329G和LALA三重突变，使得与野生型抗体相比FcγRIIA结合强烈减少，从而消除了CD9抗体诱导的活化(通过钙流出测量，数据未显示)以及血小板聚集(见图7a和7b)。鼠IgG1在低抗体浓度(0.1-1μ/ml)下诱导血小板聚集。在较高的浓度下，过度刺激血小板导致聚集反应的沉默(3-30μg/ml)。用chim-hu-IgG4-SPLE观察了供体变异性。图6a中显示较高抗体浓度下chim-hu-IgG4-SPLE反应者的数据，图6b中显示chim-hu-IgG4-SPLE非反应者的数据。对于抗体变体chim-hu-IgG1-LALA、chim-hu-IgG-WT-P329G、chim-hu-IgG1-LALA-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q，没有血液样品显示任何聚集反应。对照：未处理的血液样品中的自发聚集(背景)；ADP诱导的(ADP)和凝血酶类似物诱导的(TRAP6)血小板聚集。同种型对照：鼠IgG1(鼠同种型)和人IgG4-SPLE(hu-IgG4-SPLE同种型)。
这些数据的一种可能的解释是，具有三重突变的CD9抗体与FcγRIIA受体的结合减少是针对这类突变体抗体观察到的血小板聚集减少的原因。原则上，因此可能通过在抗体的Fc部分中引入上述能够减少与FcγRIIA受体结合的突变，防止作为抗体治疗的毒性副作用的血小板聚集。

Claims (12)

1.包含野生型人IgG1Fc区的Fc变体的多肽，所述Fc变体包含Pro329位的氨基酸取代和至少一个其他氨基酸取代，其中用甘氨酸取代野生型人Fc区的Pro329，其中所述至少一个其他氨基酸取代是人IgG1Fc区的L234A和L235A，其中按照Kabat的EU索引编号残基。
2.权利要求1的多肽，其中野生型人IgG1多肽诱导ADCC，且其中所述IgG1Fc变体多肽诱导的ADCC降低至包含野生型人IgG1Fc区的多肽诱导的ADCC的0-20％。
3.权利要求1或2的多肽，其中，相比于包含野生型人IgG1Fc区的多肽，包含Fc变体的所述多肽对负责效应子功能的Fc受体显示降低的或消除的亲和力。
4.权利要求1-3之任一项的多肽，其中所述多肽是抗体或Fc融合蛋白。
5.权利要求1-4之任一项的多肽，其中野生型人IgG1多肽诱导血小板聚集，并且其中与包含野生型人IgG1Fc区的多肽诱导的血小板聚集相比，所述IgG1Fc变体多肽诱导的血小板聚集减少。
6.权利要求1-5之任一项的多肽，其中野生型人IgG1多肽诱导CDC，并且其中与包含野生型人IgG1Fc区的多肽诱导的CDC相比，所述IgG1Fc变体多肽诱导的CDC强烈减少。
7.包含权利要求1-6之任一项的多肽和可药用载体的药物制剂。
8.权利要求1-6之任一项的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自：癌症、炎症、糖尿病和神经病症。
9.权利要求8的用途，其中，药物用于下调FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRI受体。
10.权利要求1-6之任一项的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中下调FcγRIIIA、FcγRIIA和FcγRI受体是有利的。
11.权利要求1-6之任一项的多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中，与包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的效应子功能相比，所述多肽的效应子功能强烈降低是有利的。
12.权利要求11的多肽，其中效应子功能是ADCC。
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