JP7138094B2 - マクロファージ活性化剤と組み合わせた抗ｃｓｆ－１ｒ抗体の間欠投与 - Google Patents

Description

本発明は、マクロファージ活性化剤と組み合わせた抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の間欠投与、そのような組み合わせ療法を用いる、対応する薬学的組成物又は医薬に関する。

ＣＳＦ－１Ｒ抗体とＣＳＦ－１Ｒ抗体
ヒトＣＳＦ－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ；コロニー刺激因子１受容体；同義語：Ｍ－ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、Ｆｍｓがん原遺伝子、ｃ－ｆｍｓ）が、１９８６年以来知られている（Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280）。ＣＳＦ－１Ｒは、増殖因子であり、ｃ－ｆｍｓがん原遺伝子によりコードされる（例えば、Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-167に総説あり）。

ＣＳＦ－１Ｒは、ＣＳＦ－１（コロニー刺激因子１、Ｍ－ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子とも呼ばれる）の受容体であり、このサイトカインの生物学的効果を媒介する（Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676）。コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ）（ｃ－ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に初めて記載された。この文献において、ＣＳＦ－１Ｒは、Ｃｂｌに結合しそれにより受容体の下方制御を調節する抑制性チロシン９６９リン酸化の欠損を含む、タンパク質のＣ末端テールの変化に依存する形質転換能を有することが示された（Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628）。最近、インターロイキン－３４（ＩＬ－３４）と命名されたＣＳＦ－１Ｒの第２のリガンドが同定された(Lin, H., et al, Science 320 (2008) 807-811)。

現在、ＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに結合する二つのＣＳＦ－１Ｒリガンドが既知である。そのうち第１のリガンドは、ＣＳＦ－１（コロニー刺激因子１、Ｍ－ＣＳＦとも呼ばれる、マクロファージ； 配列番号２８） であり、ジスルフィドに結合したホモダイマーとして細胞外に見られる（Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159; Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24）。第２のリガンドは、ＩＬ－３４（ヒトＩＬ－３４；配列番号２９）（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）である。ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）への、造血性前駆体細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ－１Ｒの活性化は、そのＣＳＦ－１ＲリガンドであるＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）及びＩＬ－３４により媒介される。ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）のＣＳＦ－１Ｒに対する結合は、チロシンリン酸化によるキナーゼの活性化及びホモダイマーの形成を誘導する(Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288; Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10)。

生物学的に活性のホモダイマーＣＳＦ－１は、ＣＳＦ－１受容体の細胞外ドメイン （ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）のサブドメインＤ１からＤ３内でＣＳＦ－１Ｒに結合する。ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤは、五つの免疫グロブリン様サブドメイン（Ｄ１～Ｄ５）を含む。細胞外ドメイン（ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）のサブドメインＤ４～Ｄ５は、ＣＳＦ－１の結合に関与していない（Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359）。サブドメインＤ４は、二量体化に関与している（Yeung, Y-G., et al Molecular & Cellular Proteomics 2 (2003) 1143-1155; Pixley, F. J., et al., Trends Cell Biol. 14 (2004) 628-638）。

更なるシグナル伝達は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路にそれぞれ接続するＧｒｂ２及びＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニットにより媒介される。これら二つの重要なシグナル伝達経路は、増殖、生存及びアポトーシスを調節することができる。ＣＳＦ－１Ｒのリン酸化細胞内ドメインに結合する他のシグナル伝達分子は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＬＣｙ、及びＣｂｌを含む（Bourette, R.P. and Rohrschneider, L.R., Growth Factors 17 (2000) 155-166）。

ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達は、骨リモデリング及び生殖器系において、免疫応答に生理的役割を有する。ＣＳＦ－１（Pollard, J.W., Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 54-61) 又はCSF-1R (Dai, X.M., et al., Blood 99 (2002) 111-120）のノックアウト動物は、それぞれの細胞型において、ＣＳＦ－１Ｒのための役割と一致する、大理石骨病表現型、造血性表現型、組織マクロファージ表現型、及び生殖表現型を有することが示されている。

Sherr, C.J., et al., Blood 73 (1989) 1786-1793は、ＣＳＦ－１活性を阻害するＣＳＦ－１Ｒに対するいくつかの抗体に関する。Ashmun, R.A., et al., Blood 73 (1989) 827-837は、ＣＳＦ－１Ｒ抗体に関する。Lenda, D., et al., Journal of Immunology 170 (2003) 3254-3262は、ＣＳＦ－１－欠乏マウスにおけるマクロファージ動員、増殖、及び活性化の低減が腎臓の炎症の間の管状アポトーシスの減少を招くことに言及している。Kitaura, H., et al., Journal of Dental Research 87 (2008) 396-400は、歯の矯正移動を阻害する抗ＣＳＦ－１抗体に言及している。国際公開第２００１／０３０３８１号は、アンチセンスヌクレオチド及び抗体を含むＣＳＦ－１活性阻害剤に言及しているが、ＣＳＦ－１アンチセンスヌクレオチドを開示しているのみである。ＷＯ公開第２００４／０４５５３２号は、ＣＳＦ－１アンタゴニストによる腫瘍転移及び骨損失の予防と転移性がんの治療とに言及しているが、アンタゴニストとして抗ＣＳＦ－１－抗体を開示しているのみである。国際公開第２００５／０４６６５７号は、抗ＣＳＦ－１抗体による炎症性腸疾患の治療に関する。米国特許出願公開第２００２／０１４１９９４号は、コロニー刺激因子の阻害剤に関する。国際公開第２００６／０９６４８９号は、抗ＣＳＦ－１抗体による関節リウマチの治療に関する。国際公開第２００９／０２６３０３号及び国際公開第２００９／１１２２４５号は、細胞外ドメイン（ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）の最初の三つのサブドメイン（Ｄ１～Ｄ３）内でＣＳＦ－１Ｒに結合する特定の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体に関する。国際公開第２０１１／１２３３８１号、同第２０１１／１４０２４９号、同第２０１２／１１０３６０号は、ＣＳＦ－１Ｒに対する抗体に関する。国際公開第２０１１／０７００２４号は、二量体化ドメイン（Ｄ４～Ｄ５）内でＣＳＦ－１Ｒに結合する特定の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体に関する。

国際公開第２０１３／１３２０４４号、同第２０１４／１７３８１４号、及び同第２０１５／０３６５１１号は特に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と、アゴニストＣＤ４０抗体、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体等の様々なマクロファージ活性化剤との併用療法に関する。抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の途中（intermediate）遅延又は停止を含む治療スキームとの併用療法が抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体とマクロファージ活性化剤双方の連続共投与を含む治療スキームよりも有利であることが見出された。

がんと戦うために増幅細胞傷害性Ｔ細胞を利用する、がん免疫療法の組み合わせは、患者の治療における主要な焦点となっている。腫瘍中のＴ細胞抑制性腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）を排除するＣＳＦ－１Ｒ遮断剤は、コンビナトリアル免疫療法の新規の担い手である。驚くべきことに、本発明者らは、その治療効果のためにエフェクター細胞としてＴＡＭを必要とするアゴニストＣＤ４０抗体がＴＡＭ枯渇ＣＳＦ－１Ｒ抗体と組み合わされたときに様々ながんマウスモデルにおいて完全寛解を誘導することを見出した。選別された単球及びＴＡＭ集団のｅｘ ｖｉｖｏ分析は、それらがＣＳＦ－１Ｒ ｍＡｂによって排除される前に、併用治療のみが炎症促進性ＴＡＭの即時の一過性かつ特有の活性化をもたらすことを明らかにした。

ＴＡＭ及びＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇実験は、この組み合わせの治療的利益が双方の集団の存在に依存することを示した。結腸直腸がん患者は、ＴＡＭ上でのＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０の共発現を示し、最近開始された臨床試験においてこの組み合わせで治療されるであろう。

免疫抑制性腫瘍随伴マクロファージの枯渇と活性化ＣＤ４０抗体との組み合わせは、マクロファージ浸潤に応じて様々な腫瘍モデルにおいて完全な腫瘍拒絶をもたらす。様々なヒトがん患者からの有病率データは、双方ともＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０の共発現を示すことを示した。

抗ＣＳＦ１Ｒと抗ＣＤ４０の併用治療が抗ＣＳＦ１Ｒによる全ＴＡＭの完全枯渇の前に施される場合、表現型の変化があり、併用治療の強い相乗的な抗腫瘍効果が見られる。対照的に、抗ＣＳＦ１Ｒと抗ＣＤ４０の併用治療の前にすべてのＴＡＭが完全に事前枯渇した場合、相乗的な抗腫瘍効果は観察され得ない。つまり結果として、抗ＣＳＦ１Ｒと抗ＣＤ４０の併用治療の強力な抗腫瘍効果のためには、マクロファージが必要とされる。

よって、次の相乗的な併用治療のために、マクロファージのリカバリーが必要とされる。

したがって本発明の一態様は、
ａ） がん（好ましくは固形腫瘍、メラノーマ、結腸直腸がん、中皮腫）の治療、又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であり、
ここで、この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化剤と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
かつ、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化剤と組み合わせて２サイクル毎にしか投与されないが、マクロファージ活性化剤は各治療サイクルで投与される。

本発明の別の態様は、
ａ） がん（好ましくは固形腫瘍、メラノーマ、結腸直腸がん、中皮腫）の治療、又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であり、
ここで、この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化剤と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化剤との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）。

本発明の別の態様は、
ａ） がん（好ましくは固形腫瘍、メラノーマ、結腸直腸がん、中皮腫）の治療、又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であり、
ここで、この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化剤と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化剤との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）。

本発明の一実施態様は、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であり、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化剤と組み合わせて２サイクル毎にしか投与されないが、マクロファージ活性化剤は各治療サイクルで投与される。

本発明の一実施態様は、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であり、治療サイクルの長さは２‐４週間；好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さは１８‐２４日間；好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さは（約）３週間である。

本発明の一実施態様は、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であり、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は６００－１２００ｍｇの用量（好ましい一実施態様では７５０－１１００ｍｇの用量；一実施態様では７５０－１０００ｍｇの用量；別の実施態様では９００－１０００ｍｇの用量；別の実施態様では７５０ｍｇの用量；別の実施態様では９００ｍｇの用量；別の実施態様では１０００ｍｇの用量）で投与される。

本発明の一実施態様は、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であり、マクロファージ活性化剤はアゴニストＣＤ４０抗体であり、アゴニストＣＤ４０抗体は各サイクルで４－１６ｍｇの用量（好ましい一実施態様では８－１６ｍｇの用量）で投与される。

本発明の一実施態様は、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であり、マクロファージ活性化剤はアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体であり、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体は各サイクルで１１００－１３００ｍｇの用量（好ましい一実施態様では１２００の用量）で投与される。

本発明の一実施態様は、併用療法が腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行の遅延における使用のためのものである、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体である。

本発明の一実施態様は、併用療法がＴ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激ことにおける使用のためのものである、上記の治療のうちの１つにおける使用のための、記載された抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体である。

抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ－１Ｒを用いる併用治療は、ＭＣ３８腫瘍の完全な寛解をもたらす。（Ａ）全体的な研究デザイン。（Ｂ）生存の読み出し。腫瘍体積が７００ｍｍ^３以上になったマウスは、グラフから削除した。数字は、７１日目の試験終了時の併用群（１群当たりｎ＝１０）における無腫瘍マウスの総計を示す。（Ｃ）５ｘ１０^６個の腫瘍細胞を用いる、無腫瘍マウスの再チャレンジ。キャリパー測定により、腫瘍体積を毎日モニターした。 抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ－１Ｒの併用治療前のＣＤ８α陽性Ｔ細胞の枯渇は、ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける高い生存率を無効にする。（Ａ）全体的な研究デザイン。（Ｂ）生存の読み出し。１１日目は、抗ＣＤ４０陽性／陰性抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の開始を示す。抗ＣＤ４０は１回しか投与されなかったが、抗ＣＳＦ－１Ｒはその日から毎週投与された。腫瘍体積が７００ｍｍ^３以上になったマウスは、グラフから削除した。数字は、７１日目の試験終了時の併用群（１群当たりｎ＝１０）における無腫瘍マウスの総計を示す。 抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ－１Ｒの併用治療の前のＴＡＭの枯渇は、ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける高い生存率を無効にする。（Ａ）全体的な研究デザイン。（Ｂ）ＴＡＭのフローサイトメトリー分析（ＤＡＰＩ^－ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^ｈｉｇｈＬｙ６Ｇ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗ）、１群当たりｎ＝４；一元配置分散分析による統計分析、＊＊＊ｐ≦０．０００１。（Ｃ）生存の読み出し。腫瘍体積が７００ｍｍ^３以上になったマウスは、グラフから削除した。数字は、４９日目の試験終了時（１群当たりｎ＝１０）の無腫瘍マウスの総計を示す。 図４は、骨髄細胞に対するＲＮＡ配列決定実験を示す。 骨髄細胞分析のためのゲーティング戦略。 ＲＮＡｓｅｑデータを利用可能な８８のシグネチャーと比較するシグネチャー解析の概要。 定量化ＩＨＣ分析の相関。ＣＲＣ：結腸直腸がん；ＴＮＢＣ：トリプルネガティブ乳がん 抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ－１Ｒの組み合わせは、ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおいて耐容性が良い。 ７５０ｍｇ Ｑ６Ｗ投与後のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球及び抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体エマクツズマブ（エマクツズマブ）薬物動態のシミュレートされた中央値プロファイル。 エマクツズマブの静脈内投与後のＴＭＤＤモデルを用いて計算された平均目標飽和度。

用語「マクロファージ活性化」は、例えばいくつかの炎症誘発性サイトカインなどの種々の生物活性化合物を分泌することができるマクロファージの刺激及び、共刺激表面分子、増強された抗原提示マーカー又は活性化に関連するその他の表面マーカーの発現をいう。

本発明による「マクロファージ活性化剤」は、ＣＤ４０アゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択される。

「ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を有する腫瘍」とは、腫瘍細胞と浸潤性ＣＳＦ－１Ｒ発現腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）又は組織常在性マクロファージとを含む異質腫瘍をいう。

腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）の代わりに、血清中の前駆体ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（陽性）単球が測定されるが、それは、この血中単球のリカバリーがその後の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）のリカバリーと相関するためである。本明細書で使用される「血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）という用語は、

例えば実施例１Ｂでは、薬力学的モデルをヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球データにフィットさせた。予備集団分析に基づくと、６週間ごと（Ｑ６Ｗ）に投与される７５０ｍｇの用量は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球がリカバリーに向かうことを示す。

抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体による第１の治療は血清中の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）及びその前駆体ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（陽性）単球の激しい減少／枯渇をもたらすため、治療サイクルの長さは、このヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（陽性）単球血中単球（monocytes blood monocytes）の顕著なリカバリーがその後の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）のリカバリーと相関するのに十分な時間を与えるように選択され、その結果ＴＡＭは継続的に枯渇しない。また、ＣＤ４０アゴニストとの併用治療は、その強力な相乗的な抗腫瘍効力を発揮することができる。

ＣＳＦ－１Ｒは、ＣＳＦ－１Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＳＦ－１ＲはＭ２マクロファージの産生、分化及び機能を制御し、その結果マクロファージが腫瘍増殖及び転移形成を助け、患者における予後不良をもたらす免疫抑制性サイトカインを分泌する。更に、いくつかのヒトのがん（卵巣がん及び乳がんなど）におけるＣＳＦ－１Ｒ陽性マクロファージの存在は、血管密度の増加だけでなく臨床的転帰の悪化とも相関することが示されている。選択的にＭ２様ＴＡＭを阻害するＣＳＦ－１Ｒ阻害剤は、前臨床モデルにおいて活性を示した（DeNardo, D. et al., Cancer Discovery 1 (2011) 54-67; Lin, E. et al., J. Exp. Med. 193 (2001) 727-740）。ＣＳＦ－１Ｒ活性の遮断はＴＡＭの動員の減少をもたらし、化学療法と組み合わせて、相乗作用が腫瘍増殖及び転移負荷の減少をもたらす。最近のデータは、ＰＶＮＳ及びＴＧＣＴを有する患者においてＣＳＦ－１の過剰発現が検出され、それは部分的にはＣＳＦ－１Ｒ遺伝子の転座によって媒介されることを示している（West, R.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 (2006) 690-695）。乳がんにおいて、ＣＳＦ－１応答遺伝子シグネチャーの存在は、再発及び転移のリスクを予測する（Beck, A. et al., Clin. Cancer Res. 3 (2009) 778-787）。

多くの腫瘍は、マクロファージを含む免疫細胞の顕著な浸潤によって特徴付けられる。当初、免疫細胞は腫瘍に対する防御機構の一部と考えられていたが、最近のデータは、マクロファージを含む複数の免疫細胞集団が、実は腫瘍の進行を促進しているかもしれないという見解をサポートするものである。マクロファージはその可塑性によって特徴付けられる。サイトカインの微小環境に応じて、マクロファージはいわゆるＭ１又はＭ２サブタイプを呈することができる。Ｍ２マクロファージは、腫瘍免疫の抑制に関与している。Ｍ２マクロファージは、例えば血管新生及び組織リモデリングなど、増殖を助けるために腫瘍に利用される組織修復機能にも重要な役割を果たしている。腫瘍を促進するＭ２マクロファージとは対照的に、Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカインの分泌、並びに抗原提示及び貪食への関与を介して抗腫瘍活性を呈する（Mantovani, A. et al., Curr. Opin. Immunol. 2 (2010) 231-237）。

コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１）及びＩＬ－１０などのサイトカインを分泌することにより、腫瘍細胞はマクロファージを動員してＭ２サブタイプを成形することができ、一方、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＦＮ－ガンマなどのサイトカインはマクロファージをＭ１サブタイプに向けてプログラミングする。免疫組織化学を用いて、ＣＤ６８とＣＤ１６３を共発現するマクロファージ亜集団（Ｍ２マクロファージが豊富である可能性が高い）と、ＣＤ６８＋／ＭＨＣ ＩＩ＋又はＣＤ６８＋／ＣＤ８０＋免疫表現型を示すサブセット（Ｍ１マクロファージを含む可能性が高い）とを区別することが可能である。ＣＤ６８及びＣＤ１６３陽性マクロファージの細胞の形状、大きさ及び空間分布は、例えば腫瘍を横切る基質と重要な腫瘍領域におけるＭ２マクロファージの優先的位置に基づいて、Ｍ２マクロファージの腫瘍促進の役割に関する公開されている仮説と一致している。対照的に、ＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋マクロファージは、遍在的に見られる。貪食におけるこれらの仮説的役割は、アポトーシス細胞及び壊死腫瘍領域近傍の、ＣＤ１６３－を除くＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋の免疫表現型のクラスターに反映される。

種々のマクロファージ亜集団のサブタイプ及びマーカー発現は、それらの機能状態にリンクしている。Ｍ２マクロファージは、
ａ） ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦなどの血管新生因子の分泌により血管新生を増強すること、
ｂ） マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、増殖因子、及び血流に腫瘍細胞を導いて転移性ニッチを構築する遊走因子の分泌により転移形成を補助すること（Wyckoff, J. et al., Cancer Res. 67 (2007) 2649-2656）
ｃ） ＩＬ－４、Ｉｌ－１３、ＩＬ－１ｒａ及びＩＬ－１０などの免疫抑制性サイトカインを分泌することにより免疫抑制的環境の構築に関与し、その結果制御性Ｔ細胞機能を調節すること
によって、腫瘍形成を補助することができる。反対に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、前臨床モデルにおいて腫瘍促進マクロファージの活性を増強することが示されている（Mantovani, A. et al., Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667; DeNardo, D. et al., Cancer Cell 16 (2009) 91-102）。

したがって、いくつかの種類のがん（例： 乳がん、卵巣がん、ホジキンリンパ腫）では、Ｍ２サブタイプ腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）の有病率が予後不良と関連している（Bingle, L. et al., J. Pathol. 3 (2002) 254-265; Orre, M., and Rogers, P.A., Gynecol. Oncol. 1 (1999) 47-50; Steidl, C. et al., N. Engl. J. Med. 10 (2010) 875-885）。最近のデータは、腫瘍におけるＣＤ１６３陽性マクロファージ浸潤と腫瘍悪性度の相関を示している（Kawamura, K. et al., Pathol. Int. 59 (2009) 300-305）。患者の腫瘍から単離されたＴＡＭは、耐性表現型を有し、腫瘍細胞に対して細胞傷害性ではなかった（Mantovani, A. et al., Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667）。しかしながら、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下におけるＴＡＭの浸潤は、非小細胞肺がんにおける生存率の改善と相関し、したがってこの腫瘍型において更に顕著なＭ１マクロファージ浸潤を示している （Kawai, O. et al., Cancer 6 (2008) 1387-1395）。

ＣＳＦ－１Ｒは、受容体チロシンキナーゼのクラスＩＩＩサブファミリーに属し、ｃ－ｆｍｓがん原遺伝子によりコードされる。ＣＳＦ－１又はＩＬ－３４の結合は、受容体の二量体化とそれに続く自己リン酸化、及び下流のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導する。ＣＳＦ－１Ｒの活性化は、単球及びマクロファージの生存、増殖及び分化を調節する(Xiong, Y. et al., J. Biol. Chem. 286 (2011) 952-960）。

マクロファージと同じ造血性前駆体に由来する単球系統の細胞及び破骨細胞に加えて、ＣＳＦ－１Ｒ／ｃ－ｆｍｓは、いくつかのヒト上皮がん、例えば卵巣がん及び乳がんによって、平滑筋肉腫及びＴＧＣＴ／ＰＶＮＳ内に、マクロファージと比較して低い発現レベルであるものの、発現することも分かっている。ＴＧＣＴ／ＰＶＮＳの場合、卵巣がん患者の血清及び腹水における、ＣＳＦ－１ＲのリガンドであるＣＳＦ－１のレベルの上昇が予後不良と相関している（Scholl, S. et al., Br. J. Cancer 62 (1994) 342-346; Price, F. et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 168 (1993) 520-527）。更に、ＣＳＦ １Ｒの恒常的に活性な突然変異体は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換することができ、これはがん遺伝子の特性の一つである（Chambers, S., Future Oncol 5 (2009) 1429-1440）。

ヒトＣＳＦ－１Ｒ（ＣＳＦ－１受容体；同義語：Ｍ－ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ｍｓがん原遺伝子、ｃ－ｆｍｓ、配列番号２４）は、１９８６年以来既知である（Coussens, L., et al., Nature 320 (1986) 277-280）。ＣＳＦ－１Ｒは、増殖因子であり、ｃ－ｆｍｓがん原遺伝子によりコードされる（例えば、Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-167に総説あり）。

ＣＳＦ－１Ｒは、ＣＳＦ－１ＲリガンドＣＳＦ－１（マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ－ＣＳＦとも呼ばれる）（配列番号２８）及びＩＬ－３４（配列番号２９）の受容体であり、これらサイトカインの生物学的効果を媒介する（Sherr, C.J., et al., Cell 41 (1985) 665-676; Lin, H., et al., Science 320 (2008) 807-811）。コロニー刺激因子１受容体（ｃ－ｆｍｓとも呼ばれる） のクローニングは、Roussel, M.F., et al., Nature 325 (1987) 549-552に初めて記載された。その文献において、ＣＳＦ－１Ｒが、Ｃｂｌに結合することにより受容体の下方制御を調節する抑制性のチロシン９６９リン酸化の欠損を含むタンパク質のＣ末端鎖における変化に依存する変換能を有することが示された（Lee, P.S., et al., Embo J. 18 (1999) 3616-3628）。

ＣＳＦ－１Ｒは、一本鎖の膜貫通型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫを含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフのファミリーのメンバーであり、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）における５つの反復Ｉｇ様サブドメインＤ１～Ｄ５によって特徴付けられる（Wang, Z., et al Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359)。ヒトＣＳＦ－１Ｒ細胞外ドメイン（ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）（配列番号２５）は、５つの細胞外Ｉｇ様サブドメインＤ１-Ｄ５のすべてを含む。ヒトＣＳＦ－１Ｒ断片Ｄ１－Ｄ３（配列番号２６）はそれぞれ、サブドメインＤ１－Ｄ３を含む。配列は、シグナルペプチドなしで列挙される。ヒトＣＳＦ－１Ｒ断片Ｄ４－Ｄ５（配列番号２７）はそれぞれ、サブドメインＤ４－Ｄ５を含む。

現在、ＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに結合する二つのＣＳＦ－１Ｒリガンドが既知である。そのうち第１のリガンドは、ＣＳＦ－１（コロニー刺激因子１、Ｍ－ＣＳＦとも呼ばれる、マクロファージ；ヒトＣＳＦ－１、配列番号２８）であり、ジスルフィドに結合したホモダイマーとして細胞外に見られる（Stanley, E.R. et al., Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159; Stanley, E.R. et al., Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24）。第２のリガンドは、ＩＬ－３４（ヒトＩＬ－３４；配列番号２９）（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）である。したがって、一実施態様では、用語「ＣＳＦ－１Ｒリガンド」はヒトＣＳＦ－１（配列番号２８）及び／又はヒトＩＬ－３４（配列番号２９）を指す。

実験のために、ヒトＣＳＦ－１の活性１４９アミノ酸（ａａ）断片（配列番号２８のａａ３３～１８１）が使用される。ヒトＣＳＦ－１のこの活性１４９ａａ断片（配列番号２８のａａ ３３－１８１）は、ＣＳＦ－１の３つの主要形態すべてに含まれており、ＣＳＦ－１Ｒへの結合を媒介するのに十分である（Hume, D. A. , et al, Blood 119 (2012) 1810-1820）。

ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）への、造血性前駆体細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ－１Ｒの活性化は、そのＣＳＦ－１ＲリガンドであるＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）及びＩＬ－３４により媒介される。ＣＳＦ－１（Ｍ－ＣＳＦ）のＣＳＦ－１Ｒに対する結合は、チロシンリン酸化によるキナーゼの活性化及びホモダイマーの形成を誘導する（Li, W. et al, EMBO Journal.10 (1991) 277-288; Stanley, E.R., et al., Mol. Reprod. Dev. 46 1997 - 4 -1０）。

本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合」又は「ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合」又は「ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する」又は「抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８モル／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９モル／ｌ以下の結合アフィニティーでヒトＣＳＦ－１Ｒ抗原に特異的結合する抗体を指す。結合アフィニティーは、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ－ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。したがって、本明細書で使用される「ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－８モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－９モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）の結合アフィニティーでヒトＣＳＦ－１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。

一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、以下からなる群より選択される。
ｈＭａｂ ２Ｆ１１－ｃ１１、ｈＭａｂ ２Ｆ１１－ｄ８、ｈＭａｂ ２Ｆ１１－ｅ７、ｈＭａｂ ２Ｆ１１－ｆ１２、及びｈＭａｂ ２Ｆ１１－ｇ１

これら抗体は、国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されており、本明細書に記載のように以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とする。
表１

本発明に記載されるこれらの抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、ヒトＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに結合し、一実施態様では、受容体二量体形成面を構成する膜近位ドメインＤ４及びＤ５に結合する。

一実施態様では、それらはドメインＤ１～Ｄ３に結合する。一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用される、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、国際公開第２００９／０２６３０３号、国際公開第２００９／１１２２４５号、国際公開第２０１１／１２３３８１号、国際公開第２０１１／１４０２４９号、国際公開第２０１２／１１０３６０号（これらはすべて、参照により援用される）に開示されている。

本発明に記載の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、受容体のＣＳＦ－１、ＩＬ－３４媒介性及びリガンド非依存性活性化をブロックし、結果としてＭ１様ＧＭ－ＣＳＦ分化マクロファージを使わずにＣＳＦ－１の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭ２様マクロファージのアポトーシスを誘導する。ヒトの乳がん組織では、Ｍ２（ＣＤ６８＋／ＣＤ１６３＋）マクロファージ及びＣＳＦ １Ｒ発現マクロファージが共局在化している。

ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ－Ｒ）ファミリーに属する５０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。（Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10 (1989)）ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞を含む、多くの正常及び腫瘍細胞型で発現される。（Paulie S. et al., Cancer Immunol. Immunother. 20:23-8 (1985); Banchereau J. et al., Adv. Exp. Med. & Biol. 378:79-83 (1995); Alderson M. R. et al., J. of Exp. Med. 178:669-74 (1993); Ruggiero G. et al., J. of Immunol. 156:3737-46 (1996); Hollenbaugh D. et al., J. of Exp. Med. 182:33-40 (1995); Yellin M. J. et al., J. of Leukocyte Biol. 58:209-16 (1995); and Lazaar A. L. et al., J. of Immunol. 161:3120-7 (1998).）ＣＤ４０は、すべてのＢリンパ腫で、また、すべての固形腫瘍の７０％で発現される。恒常的に発現されているが、ＣＤ４０は、ＬＰＳ、ＩＬ－１ベータ、ＩＦＮ－ガンマ及びＧＭ－ＣＳＦなどの成熟シグナルによって、抗原提示細胞において上方制御される。

ＣＤ４０活性化は、液性及び細胞性免疫応答の調節に重要な役割を果たす。ＣＤ４０活性化を伴わない抗原提示は、耐性をもたらし得るが、ＣＤ４０シグナル伝達はそのような耐性を逆転させ、すべての抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示を増強させ、ヘルパーサイトカイン及びケモカインの分泌をもたらし、共刺激分子発現及びシグナル伝達を高め、免疫細胞の細胞溶解反応を刺激する。ＣＤ４０は、Ｂ細胞の増殖、成熟、及びクラスの切り替えに重要な役割を果たす。（Foy T. M. et al., Ann. Rev. of Immunol. 14:591-617 (1996).）ＣＤ４０シグナル伝達経路の破壊は、異常な血清免疫グロブリンアイソタイプ分布、ＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングの欠如、及び二次液性応答の欠陥をもたらす。例えば、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群は、ヒトＣＤ４０Ｌ遺伝子の突然変異に関連し、罹患個体がＩｇＭアイソタイプ以外の抗体を産生できないことを特徴とする疾患であり、それは、効果的な免疫応答のためにＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの間に生産的相互作用が必要であることを示唆している。

ＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、ＣＤ４０細胞質ドメインとＴＲＡＦ（ＴＮＦ－Ｒ関連因子）との会合をもたらす（Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1421-6 (1999); Pullen S. S. et al., Biochemistry 37:11836-45 (1998); Grammar A. C. et al., J. of Immunol. 161:1183-93 (1998); Ishida T. K. et al., Proc. Acad Acad. Sci. USA 93:9437-42 (1996); Pullen S. S. et al., J. of Biol. Chem. 274:14246-54 (1999))。ＴＲＡＦとの相互作用は、ＮＦカッパＢ経路とＪｕｎ／ＡＰ１経路の双方の活性化をもたらし得る。（Tsukamoto N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1234-9 (1999); Sutherland C. L. et al., J. of Immunol. 162:4720-30 (1999).）細胞型に応じて、このシグナル伝達は、ＩＬ－６（Jeppson J. D. et al., J. of Immunol. 161:1738-42 (1998); Uejima Y. et al., Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110:225-32, (1996)、IL-8 (Gruss H. J. et al., Blood 84:2305-14 (1994); von Leoprechting A. et al., Cancer Res. 59:1287-94 (1999); Denfeld R. W. et al., Europ. J. of Immunol. 26:2329-34 (1996))、IL-12 (Cella M. et al., J. of Exp. Med. 184:747-52 (1996); Ferlin W. G. et al., Europ. J. of Immunol. 28:525-31 (1998); Armant M. et al., Europ. J. of Immunol. 26:1430-4 (1996); Koch F. et al., J. of Exp. Med. 184:741-6 (1996); Seguin R. and L. H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179:467-74 (1999); Chaussabel D. et al., Infection & Immunity 67:1929-34 (1999))、IL-15 (Kuniyoshi J. S. et al., Cellular Immunol. 193:48-58 (1999))及びケモカイン(ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ他) (McDyer J. F. et al., J. of Immunol. 162:3711-7 (1999); Schaniel C. et al., J. of Exp. Med. 188:451-63 (1998); Altenburg A. et al., J. of Immunol. 162:4140-7 (1999); Deckers J. G. et al., J. of the Am. Society of Nephrology 9:1187-93 (1998)）等のサイトカインの分泌向上；ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの発現増加（Santos-Argumedo L. et al., Cellular Immunol. 156:272-85 (1994)）；並びに接着分子（例：ＩＣＡＭ）及び共刺激分子（例：Ｂ７）の発現増加(Lee H. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1421-6 (1999); Grousson J. et al., Archives of Dermatol. SD (Res) 290:325-30 (1998); Katada Y. et al., Europ. J. of Immunol. 26:192-200 (1996); Mayumi M. et al., J. of Allergy & Clin. Immunol. 96:1136-44 (1995); Flores-Romo L. et al., Immunol. 79:445-51 (1993)) (Roy M. et al., Europ. J. of Immunol. 25:596-603 (1995); Jones K. W. and C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174:42-53 (1996); Caux C. et al., Journal of Exp. Med. 180:1263-72 (1994); Kiener P. A. et al., J. of Immunol. 155:4917-25 (1995)）をもたらす。ＣＤ４０の関与によって誘導されるサイトカインは、Ｔ細胞の生存と活性化を高める。

細胞及び免疫機能の増強に加えて、ＣＤ４０活性化の効果には、ケモカイン及びサイトカインによる細胞の動員及び分化；単球の活性化；細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解反応の増加；ＣＤ４０陽性腫瘍におけるアポトーシスの誘導；ＣＤ４０陽性腫瘍の免疫原性の増強；並びに腫瘍特異的抗体産生が含まれる。また、細胞媒介性免疫応答におけるＣＤ４０活性化の役割も十分に確立されており、Grewal et al., Ann. Rev. of Immunol. 16:111-35 (1998); Mackey et al., J. of Leukocyte Biol. 63:418-28 (1998); and Noelle R. J., Agents & Actions -- Suppl. 49:17-22 (1998)で概説されている。

クロスプライミングモデル系を用いた研究から、ＡＰＣのＣＤ４０活性化が、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生させるためのヘルパーＴ細胞の必要性に取って代わり得ることが示された。（Bennett et al., Nature 393:478-480 (1998).）ＣＤ４０Ｌ欠損マウスからのエビデンスは、ヘルパーＴ細胞プライミングにおけるＣＤ４０シグナル伝達の明確な必要性を示している。（Grewal I. S. et al., Science 273:1864-7 (1996); Grewal I. S. et al., Nature 378:617-20 (1995).）ＣＤ４０活性化は、さもなければ寛容原性の抗原担持Ｂ細胞をコンピテントＡＰＣに変換する。（Buhlmann J. E. et al., Immunity 2:645-53 (1995).）ＣＤ４０活性化は、臍帯血前駆細胞の樹状細胞への成熟と分化を誘導する。（Flores-Romo L. et al., J. of Exp. Med. 185:341-9 (1997); Mackey M. F. et al., J. of Immunol. 161:2094-8 (1998).）ＣＤ４０活性化はまた、単球の機能的樹状細胞への分化を誘導する。（Brossart P. et al., Blood 92:4238-47 (1998).）更にＣＤ４０活性化は、ＡＰＣ－ＣＤ４０誘導サイトカインを介してＮＫ細胞の細胞溶解反応を増強する（Carbone E. et al., J. of Exp. Med. 185:2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. et al., J. of Immunol. 162:5910-6 (1999).）。これらの観察は、ＣＤ４０が、ＡＰＣの成熟、ヘルパーサイトカインの分泌、共刺激分子の上方制御及びエフェクター機能の増強を誘導することによって、免疫応答の開始及び増強における重要な役割を果たすことを示している。

液性及び細胞傷害性免疫応答の開始及び成熟におけるＣＤ４０シグナル伝達の重要な役割によって、この系は免疫増強の理想的な標的となる。そのような増強は、一般に活性化ＡＰＣのクロスプライミングを介して免疫系に提示される腫瘍抗原に対する有効な免疫応答を開始するために特に重要であり得る。(Huang A. Y. et al., Ciba Foundation Symp. 187:229-44 (1994); Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998); Albert M. L. et al., Nature 392:86-9 (1998); Bennett S. R. et al., J. of Exp. Med. 186:65-70 (1997).）

いくつかのグループがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍反応に対するＣＤ４０活性化の有効性を実証した。（Toes R. E. M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998).）２つのグループは、腎細胞がんの肺転移モデル及びウイルス形質転換細胞による皮下腫瘍を用いたが、ＣＤ４０活性化が腫瘍特異的抗原に対する耐性を逆転させ、結果としてＴ細胞の効率的な抗腫瘍プライミングをもたらすことを別々に実証した。（Sotomayor E. M. et al., Nature Medicine 5:780-787 (1999); Diehl L. et al., Nature Medicine 5:774-9 (1999).）免疫細胞の非存在下での抗腫瘍活性は、ＳＣＩＤマウスのヒト乳がん株モデルにおけるＣＤ４０Ｌ及び抗ＣＤ４０抗体治療でも報告された。（Hirano A. et al., Blood 93:2999-3007 (1999).）抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０活性化は、マウスモデルにおいてＣＤ４０＋及びＣＤ４０－リンパ腫を根絶することが最近示された。（French R. R. et al., Nature Medicine 5:548-53 (1999).）更に、Ｇｌｅｎｎｉｅ及びその共同研究者による以前の研究は、抗ＣＤ４０抗体によるシグナル伝達活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍クリアランスを誘導するのに、エフェクターを動員することができる他の抗表面マーカー抗体よりも効果的であると結論づけている。（Tutt A. L. et al., J. of Immunol. 161:3176-85 (1998).）これらの所見と一致して、抗ＣＤ４０抗体をｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ４０＋腫瘍細胞に対する活性について試験した場合、殺腫瘍活性のすべてではないが大半がＡＤＣＣよりもむしろＣＤ４０シグナル伝達と関連していた。（Funakoshi S. et al., J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996).）別の研究では、骨髄樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで様々な薬剤で処理し、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性について試験した。これらの研究は、ＣＤ４０Ｌ刺激ＤＣが抗腫瘍応答を開始する、最も成熟し、かつ、最も効果的な細胞であることを証明した。

また、抗腫瘍免疫におけるＣＤ４０の本質的な役割も、腫瘍ワクチンに対する野生型及びＣＤ４０－／－マウスの応答を比較することによって実証されている。これらの研究は、ＣＤ４０－／－マウスが正常マウスで観察される腫瘍免疫を達成することができないことを示している。（Mackey M. F. et al., Cancer Research 57:2569-74 (1997).）別の研究では、担腫瘍マウスからの脾細胞を腫瘍細胞で刺激し、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化抗ＣＤ４０抗体で処理し、その後腫瘍特異的ＣＴＬ活性が増強されることが示された。（Donepudi M. et al., Cancer Immunol. Immunother. 48:153-164 (1999).）これらの研究は、ＣＤ４０陽性及び陰性腫瘍の双方に関して、ＣＤ４０が抗腫瘍免疫において重要な位置を占めることを証明している。ＣＤ４０はリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、鼻咽頭、膀胱、卵巣及び肝臓のがんの大半、並びにいくつかの乳がん及び結腸直腸がんにおいて発現するため、ＣＤ４０の活性化は、広範囲の臨床適用を有し得る。

本明細書で使用する「ＣＤ４０アゴニスト」は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をアゴナイズする任意の部分を含む。この文脈で使用されるＣＤ４０は、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、したがってＣＤ４０アゴニストは好ましくは、ヒトＣＤ４０のアゴニストである。典型的には、このような部分は、「アゴニストＣＤ４０抗体」又は「アゴニストＣＤ４０Ｌポリペプチド」であろう。このような抗体は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合相互作用を特異的にアゴナイズする、例えばヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、及び抗体断片を含む。好ましい一実施態様において、アゴニストＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含む。別の好ましい実施態様において、アゴニストＣＤ４０抗体は、キメラ、完全ヒト又はヒト化ＣＤ４０抗体を含む。

「アゴニスト」は細胞上の受容体と結合し、受容体の天然リガンドによって開始される反応又は活性と類似又は同一の反応又は活性を開始する。「ＣＤ４０アゴニスト」は、次の応答のいずれか又はすべてを誘導する：Ｂ細胞の増殖及び／又は分化；ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、ＶＣ ＡＭ等の分子を介する細胞間接着の上方制御；ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ等の炎症誘発性サイトカインの分泌；ＴＲＡＦ（例えばＴＲＡＦ２及び／又はＴＲＡＦ３）、ＮＩＫ（ＮＦ－ｋＢ誘発キナーゼ）などのＭＡＰキナーゼ、Ｉ－カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ／ベータ．）、転写因子ＮＦ－ｋＢ、Ｒａｓ、及びＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ ＡＫＴ経路、Ｐ３８ ＭＡＰＫ経路等の経路によるＣＤ４０受容体を介するシグナル伝達；ＸＩＡＰ、ｍｃｌ－１、ｂｃｌ－ｘ等の分子による抗アポトーシスシグナルの伝達；Ｂ及び／又はＴ細胞のメモリー生成；Ｂ細胞抗体産生；Ｂ細胞アイソタイプスイッチ、ＭＨＣクラスＩＩ及びＣＤ８０／８６等の細胞表面発現の上方制御（但しこれらに限定されない）。

アゴニスト活性とは、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定される、ネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性よりも少なくとも３０％、１０ ３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％高いアゴニスト活性が意図される。

好ましい一実施態様では、ＣＤ４０アゴニストは、Ｂ細胞応答のアッセイで測定される、ネガティブコントロールにより誘導されるアゴニスト活性より少なくとも２倍又は少なくとも３倍大きいアゴニスト活性を有する。

したがって、例えば目的のＢ細胞応答がＢ細胞増殖である場合、アゴニスト活性は、ネガティブコントロールにより誘導されるＢ細胞増殖のレベルよりも少なくとも２倍又は少なくとも３倍高いＢ細胞増殖のレベルの誘導であろう。

一実施態様において、ＣＤ４０に結合しない抗体は、ネガティブコントロールとして機能する。「顕著なアゴニスト活性を含まない」物質は、Ｂ細胞応答のアッセイにおいて測定して、ネガティブコントロールによって誘導されるアゴニスト活性よりも多くて約２５％高い、好ましくは多くて約２０％高い、１５％高い、１０％高い、５％高い、１％高い、０．５％高い、又は多くても約０．１％高いアゴニスト活性を示すであろう。

本明細書で使用される「アゴニストＣＤ４０抗体」又は「活性化ＣＤ４０抗体」又は「アゴニスト又は活性化抗ＣＤ４０抗体」は、ヒトＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０を発現する細胞、組織又は生物に添加すると、１種以上のＣＤ４０活性を少なくとも約２０％増大させる抗体を意味する。いくつかの実施態様では、該抗体は、ＣＤ４０活性を少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％活性化する。

いくつかの実施態様では、該活性化抗体は、ＣＤ４０Ｌの存在下で添加される。

別の好ましい実施態様では、アゴニストＣＤ４０抗体のアゴニスト活性は以下のように測定される。

［抗ＣＤ４０抗体による細胞株Ｊｙの免疫原性の増加］
ＣＤ４０陽性ＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８７）（「Ｊｙ細胞」）を培養し、ＲＰＭＩ培地中で維持した。ＪＩＹＯＹＥ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中で、本発明の抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）又はアイソタイプ適合抗体（抗ＫＬＨ）と共にインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、２５ｍｇのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）／７ｍｌの培地で６０分間処理した。その後、この細胞を単離ヒトＴ細胞と１：１００の比で３７℃で６日間インキュベートした（５％ ＣＯ２）。その後、Ｔ細胞を収集し、洗浄し、ＣＴＬ活性のレベルを、新鮮クロム５１（マサチューセッツ州ボストンのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）標識ＪＩＹＯＹＥ細胞に対して決定した。特異的ＣＴＬ活性を、特異的細胞溶解％＝（細胞溶Ｊｙ（ｃｐｍ）－自然細胞溶解（ｃｐｍ））／（全細胞溶解（ｃｐｍ）－自然細胞溶解（ｃｐｍ））として計算した。

好ましい一実施態様において、本明細書で使用されるアゴニストＣＤ４０抗体は、（上述の）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８７）アッセイで測定して、ＣＤ４０陽性ＪＩＹＯＹＥ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８７）における免疫原性を少なくとも５０％増加させる。

本明細書において抗ＣＤ４０活性化抗体とも呼ばれるアゴニストＣＤ４０抗体は、いくつかの重要な機構を介して腫瘍根絶に寄与し得る。その中でも最も重要なのが、腫瘍抗原プロセシング及び提示の増強、並びにＣＤ４０陽性腫瘍細胞自体の抗原提示又は免疫原性の増強のための宿主樹状細胞の活性化であり、これは結果として腫瘍特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の活性化をもたらす。更なる抗腫瘍活性がＣＤ４０シグナル伝達の他の免疫増強効果（ケモカイン及びサイトカインの産生、単球の動員及び活性化（recruitment and activation monocytes）、並びにＣＴＬ及びＮＫ細胞溶解反応の増強）によって媒介され得、また、アポトーシスの誘導による又はＡＤＣＣをもたらす液性応答を刺激することによるＣＤ４０＋腫瘍の直接殺傷によって媒介され得る。アポトーシス細胞及び瀕死細胞もまた、ＣＤ４０活性化ＡＰＣによってプロセシング及び提示される腫瘍特異的抗原の重要な供給源になり得る。

本発明は、ヒトＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニストとして作用する単離された抗体又はその抗原結合部分について記載する。

アゴニストＣＤ４０抗体は、例えばBeatty et al., Science 331 (2011) 1612-1616, R. H. Vonderheide et al., J Clin Oncol 25, 876 (2007); Khalil, M, et al., Update Cancer Ther. 2007 June 1; 2(2): 61-65, an agonist CD40 rat anti-mouse IgG2a mAb FGK45に記載されており、また、モデル抗体はS. P. Schoenberger, et al, Nature 393, 480 (1998))；マウス交差反応性アゴニストＣＤ４０抗体クローン１Ｃ１０はSantos-Argumedo L. et al., Cell Immunol. 156 (1994) 272-285及びHeath AW et al. Eur J Immunol 24 (1994) 1828-34に記載されている。臨床試験の例は、例えばＣＰ－８７０、８９３及びダセツズマブ（アゴニストＣＤ４０抗体、ＣＡＳ番号８８０４８６－５９－９、ＳＧＮ－４０； ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体）である(Khalil, M, et al, Update Cancer Ther. 2007 June 1; 2(2): 61-65）。別のアゴニスト抗体は、国際公開第 ２０１６／０２３９６０号の５４頁のＡＤＣ－１０１３である。

好ましい一態様において、アゴニストＣＤ４０抗体はＣＰ－８７０，８９３であり、これはファイザーによって開発された完全ヒトＩｇＧ２アゴニストＣＤ４０抗体である。それは３．４８×１０^－１０ＭのＫＤでヒトＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０Ｌの結合はブロックしない（例えばＣＰ－８７０，８９３が抗体２１．４．１として記載されている米国特許第７３３８６６０号又はＥＰ第１４７６１８５号を参照のこと）。ＣＰ－８７０，８９３（米国特許第７３３８６６０号の抗体２１．４．１）は、（ａ）ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ ＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）（米国特許第７３３８６６０号の配列番号４２に相当）の重鎖可変ドメインアミノ酸配列（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）（米国特許第７３３８６６０号の配列番号４４に相当）の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含むこと；及び／又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）寄託番号ＰＴＡ－３６０５を有するハイブリドーマ２１．４．１により産生された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。
ダセツズマブ及びその他のヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、米国特許第６９４６１２９号及び米国特許第８３０３９５５号に記載されている。

したがって、好ましい一実施態様において、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体との併用療法において使用されるアゴニストＣＤ４０抗体は、（ａ）ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ ＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１）（米国特許第７３３８６６０号の配列番号４２に相当）の重鎖可変ドメインアミノ酸配列（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）（米国特許第７３３８６６０号の配列番号４４に相当）の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含むこと；及び／又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）寄託番号ＰＴＡ－３６０５を有するハイブリドーマ２１．４．１により産生された抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。
ダセツズマブ及びその他のヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、米国特許第６９４６１２９号及び米国特許第８３０３９５５号に記載されている。

好ましい一実施態様では、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体との併用療法において使用されるアゴニストＣＤ４０抗体は、ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体である。ヒト化Ｓ２Ｃ６抗体は、例えばマウスｍＡＢ Ｓ２Ｃ６（ＰＴＡ－１１０としてＡＴＣＣに寄託されている）の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、２及び３をベースとする。マウスｍＡＢ Ｓ２Ｃ６の重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、２及び３は、米国特許第６９４６１２９号に記載及び開示されている。一実施態様では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ダセツズマブである。一実施態様では、アゴニストＣＤ４０抗体は、（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＶＩＰＮＡＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＦＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＩＹＷＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号１３）の重鎖可変ドメインアミノ酸配列（ｂ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＦＬＨＷ ＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴ ＹＦＣＳＱＴＴＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号１４）の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含むことによって特徴付けられる。

一実施様態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」とは、可変及び定常ドメイン配列がヒト配列に由来する抗体である。ヒトアゴニストＣＤ４０抗体は、全開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／０４０１７０号に詳細に記載されている。ヒト抗体は、ヒト患者における非ヒト抗体の使用に関連する免疫原性及びアレルギー反応を最小限に抑えると期待されるため、本発明の治療方法において実質的な利点を提供する。

本発明に有益なその他の例示的なヒト抗ＣＤ４０抗体には、国際公開第０３／０４０１７０号に記載の、３．１．１、３．１．１ Ｈ－Ａ７８Ｔ、３．１．１ Ｈ－Ａ７８Ｔ－Ｖ８８Ａ－Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１ Ｈ－Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ－Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ－Ａ７８Ｔ－Ｖ８８Ａ－Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ－Ｌ４Ｍ－Ｌ８３Ｖ、及び２３．２８．１Ｌ－Ｃ９２Ａと呼ばれる抗体のアミノ酸配列を有する抗体、並びにこれらの例示的抗体のいずれかのＣＤＲ又は可変領域を含む抗体が含まれる。

本発明の一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とし；また、
本併用療法において使用されるアゴニストＣＤ４０抗体は、
ａ） 配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とし；又は

本発明の好ましい一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし、また、
本併用療法において使用されるアゴニストＣＤ４０抗体は、
配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする。

特定の実施態様では、がん又は腫瘍治療は、がん細胞の増殖を阻害し、腫瘍の重量又は体積の増加を阻害又は防止し、かつ／又は腫瘍の重量又は体積のの減少を引き起こす。いくつかの実施態様では、がん治療は、患者の生存期間を延ばす。特定の実施態様では、腫瘍増殖は、治療されていないものと比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％，阻害される。いくつかの実施態様では、がんは、ＣＤ４０陽性である。

本発明において、当該技術分野で代替的に知られている用語「ＣＤ４０Ｌ」又は「ＣＤ１５４」は、すべての哺乳動物（例えばヒト、ラット、非ヒト霊長類、マウス）ＣＤ４０Ｌの断片、変異体、オリゴマー及びコンジュゲートを含み、これらは、少なくとも対応する哺乳動物ＣＤ４０ポリペプチド、例えばヒトＣＤ４０に結合する。本発明において、投与されるＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌポリペプチド又は前記ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＤＮＡを含み得る。このようなＣＤ４０Ｌポリペプチド及びＤＮＡは特に、Ｉｍｍｕｎｅｘ社の米国特許第６４１０７１１号；米国特許第６３９１６３７号；米国特許第５９８１７２４号；米国特許第５９６１９７４及び米国特許出願公開第２００４０００６００６号に開示されている天然ＣＤ４０Ｌ配列、並びにそれらの断片、変異体及びオリゴマーを含み、これらすべての特許及び出願、並びにこれらに開示されているＣＤ４０Ｌ配列は、その全体が参照により本明細書に援用される。

ＣＤ４０Ｌポリペプチドは本発明によるＣＤ４０アゴニストとして使用することができ、特に、Ｉｍｍｕｎｅｘ社の米国特許第６４１０７１１号；米国特許第６３９１６３７号；米国特許第５９８１７２４号；米国特許第５９６１９７４及び米国特許出願公開第２００４０００６００６号に開示されている天然ＣＤ４０Ｌ配列、並びにそれらの断片、変異体及びオリゴマーを含み、これらすべての特許及び出願、並びにこれらに開示されているＣＤ４０Ｌ配列は、その全体が参照により本明細書に援用される。

［ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路］
Ｔ細胞活性化を調節する重要なネガティブ共刺激シグナルは、プログラム死－１受容体（ＰＤ－１）（ＣＤ２７９）、そのリガンド結合パートナーＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４；配列番号３１）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ－１のネガティブな調節の役割は、自己免疫を生じさせる傾向のあるＰＤ－１のノックアウト（Ｐｄｃｄ１－／－）によって明らかになった。Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001）。ＰＤ－１は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に関連しているが、ホモ二量体化を可能にする、膜に近いシステインを欠いている。ＰＤ－１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含む。ＰＤ－１はＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２にのみ結合する。Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)。

ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化された単球及び樹状細胞（ＤＣ）上に発現し得る。ＰＤ－１は、活性化されているが刺激されてはいないヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄によって発現される。これは、ＣＤ２８とＣＴＬＡ－４のもっと制限された発現とは対照的である。Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)。活性化されたヒトＴ細胞からクローニングされた、少なくとも４つのＰＤ－１変異体が存在し、それには（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２及び３又は（ｉｖ）エクソン２～４を欠く転写が含まれる。Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)。ＰＤ－１Δｅｘ３を例外として、すべての変異体は、休止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において完全長ＰＤ－１と同様のレベルで発現する。すべての変異体の発現は、ヒトＴ細胞の活性化に際し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によって顕著に誘発される。ＰＤ－１Δｅｘ３変異体は、膜貫通ドメインを欠き、自己免疫において重要な役割を果たす可溶型ＣＴＬＡ－４に類似している。Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)。この変異体は、関節リウマチ患者の骨液及び漿液中に濃縮される。Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006).

２つのＰＤ－１リガンドは、発現パターンを異にしている。ＰＤ－Ｌ１は、マウスＴ及びＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞及び骨髄由来のマスト細胞上に恒常的に発現する。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)。ＰＤ－Ｌ１は、広い範囲の非造血細胞 （例えば角膜細胞、肺細胞、血管上皮細胞、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤のシンシチウム栄養芽層、ケラチノサイト等）上に発現し［Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)］、活性化後複数の細胞型で上方制御される。Ｉ型及びＩＩ型双方のインターフェロンＩＦＮがＰＤ－Ｌ１を上方制御する。Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)。細胞株におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＭＥＫが抑制されると低下する。Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ＪＡＫ２は、ＰＤ－Ｌ１誘発にも関与している。Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びＡｋｔシグナル伝達を修飾する細胞ホスファターゼであるホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）の欠失又は抑制は、がんにおける転写後のＰＤ－Ｌ１発現を増加させた。Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)。

ＰＤ－Ｌ２の発現は、ＰＤ－Ｌ１より制限されている。ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来のマスト細胞上に誘導的に発現する。ＰＤ－Ｌ２は、静止腹膜Ｂ１細胞の約半分から三分の二にも発現するが、従来のＢ２ Ｂ細胞上には発現しない。Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)。ＰＤ－Ｌ２＋Ｂ１細胞は、ホスファチジルコリンに結合し、細菌抗原に対する自然免疫応答にとって重要であり得る。ＩＦＮ－ガンマによるＰＤ－Ｌ２の誘発は、部分的にＮＦ－κＢに依存する。Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003）。ＰＤ－Ｌ２は、ＧＭ－ＣＦ、 ＩＬ－４及びＩＦＮ－ガンマにより単球及びマクロファージにも誘発され得る。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003)。

ＰＤ－１シグナル伝達は典型的には、細胞増殖よりサイトカイン生成に大きな影響を有し、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２生成に大きな影響を有する。ＰＤ－１が媒介する抑制性シグナル伝達も、ＴＣＲシグナル伝達の強度に依存しており、低レベルのＴＣＲ刺激でより大きな阻害が送達される。このような低減は、ＣＤ２８による共刺激により［Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)］又はＩＬ－２の存在により［Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)］克服され得る。

ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２によるシグナル伝達が二方向性であるというエビデンスが増えている。すなわち、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達の調節に加えて、シグナル伝達は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞とＰＤ－Ｌ２を発現する細胞へと連続的になされる。ワルデンシュトレームガンマグロブリン血症患者から単離された、天然ヒト抗ＰＤ－Ｌ２抗体による樹状細胞の処理は、ＭＨＣ ＩＩ又はＢ７共刺激分子を上方制御しなかったが、このような細胞は、より多量の炎症誘発性サイトカイン、特にＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－６を生成し、Ｔ細胞の増殖を刺激した。nGUYEN ET AL., j. eXP. mED. 196: 1393-98 (2002)。また、この抗体でのマウスの治療は、（１）移植されたｂ１６メラノーマに対する耐性を高め、かつ、腫瘍特異的ＣＴＬを急速に誘導し；Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)；（２）アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて気道炎症性疾患の発症を阻止した；Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)。

樹状細胞（「ＤＣ」）への逆シグナル伝達の更なるエビデンスは、可溶性ＰＤ－１と共に培養された骨髄由来のＤＣの研究により得られたものである（Ｉｇ定常領域に融合させたＰＤ－１ ＥＣドメイン－「ｓ－ＰＤ－１」）。Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)。このｓＰＤ－１は、抗ＰＤ－１の投与により可逆的にＤＣ活性化を阻害し、ＩＬ－１０の生成を増大させた。

加えて、複数の研究は、ＰＤ－１とは無関係な、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の受容体を示している。Ｂ７．１は、既にＰＤ－Ｌ１の結合パートナーとして同定されている。Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)。化学的架橋の研究は、ＰＤ－Ｌ１及びＢ７．１がそれらのＩｇＶ様ドメインを介して相互作用しうることを示唆している。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用は、阻害シグナルをＴ細胞中に誘導することができる。Ｂ７．１によるＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ－Ｌ１のライゲーション又はＰＤ－Ｌ１によるＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＢ７．１のライゲーションは、阻害シグナルを送達する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３陽性Ｂ７．１コーティングビーズで刺激されたとき、増殖及びサイトカイン生成の低減を示す。Ｂ７．１の受容体のすべて （すなわち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１）を欠くＴ細胞では、Ｔ細胞増殖とサイトカイン生成は、もはや抗ＣＤ３陽性Ｂ７．１コーティングビーズによって阻害されない。これは、Ｂ７．１がＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４の非存在下でＴ細胞上のＰＤ－Ｌ１により特異的に作用することを示している。同様に、ＰＤ－１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３陽性ＰＤ－Ｌ１コーティングビーズの存在下で刺激されたとき、増殖とサイトカイン生成の低減を示したが、これは、Ｔ細胞上でのＢ７．１に対するＰＤ－Ｌ１ライゲーションの抑制効果を実証するものである。Ｔ細胞がＰＤ－Ｌ１のすべての既知の受容体を欠くとき （すなわちＰＤ－１とＢ７．１もない）、Ｔ細胞増殖は、抗ＣＤ３陽性ＰＤ－Ｌ１コーディングビーズによっても、もはや減少しなかった。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７．１又はＰＤ－１により、Ｔ細胞に対し抑制効果を発揮することができる。

Ｂ７．１とＰＤ－Ｌ１の直接的相互作用は、共刺激に対する現行の理解は不十分であり、Ｔ細胞上におけるこれら分子の発現に対する重要性を過小評価していることを示唆する。ＰＤ－Ｌ１－／－Ｔ細胞の研究は、Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１がＴ細胞サイトカイン生成を下方制御できることを示す。Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)。ＰＤ－Ｌ１とＢ７．１の双方がＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージ上に発現することから、これらの細胞型上でＢ７．１とＰＤ－Ｌ１との間の指向性相互作用が存在する可能性がある。加えて、非造血細胞上のＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７．１及びＰＤ－１と相互作用することができ、それらの調節にＰＤ－Ｌ１が関与しているのかどうかという疑問を投げかけている。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害効果の一つの可能な説明は、Ｔ細胞ＰＤ－Ｌ１が、ＣＤ２８との相互作用からＡＰＣ Ｂ７．１を捕捉又は分離させ得るということである。

結果として、ＰＤ－１、Ｂ７．１又はこれらの双方とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックすることにより、ＰＤ－Ｌ１がネガティブな共刺激シグナルをＴ細胞及び他の抗原提示細胞に送ることを防ぐことを含む、ＰＤ－Ｌ１によるシグナル伝達の拮抗作用は、感染症（例えば急性及び慢性）に反応する免疫及び腫瘍免疫を増強させる可能性が高い。加えて、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の他の成分のアンタゴニスト、例えばアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体と組み合わせることができる。

用語「ヒトＰＤ－Ｌ１」は、ヒトタンパク質ＰＤ－Ｌ１（配列番号３１、典型的にはＰＤ－１シグナル伝達）を指す。本明細書で使用される「ヒトＰＤ－Ｌ１への結合」又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合」又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する」又は「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８モル／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９モル／ｌ以下の結合アフィニティーでヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合アフィニティーは、例えば表面プラズモン共鳴法（スウェーデン、ウプサラのＧＥ－ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））などの標準的な結合アッセイで決定される。したがって、本明細書で使用される「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－８モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－９モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）の結合アフィニティーでヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。

一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、本明細書に記載の以下のＶＨ及びＶＬ配列を含むことを特徴とするアテゾリズマブである。
表２：

本発明の一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とし；また、
本併用療法において使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、
ａ） 配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とし；又は

本発明の好ましい一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とし、また、
本併用療法において使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、
配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする。

［ＴＬＲ及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、特にＴＬＲ９及びＴＬＲ９アゴニスト］
がん治療のための様々な実験的Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストが記載されている（Galluzzi et al., OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は一般に、リポ多糖及び二本鎖ＲＮＡなどの保存された微生物成分に応答して自然免疫系を活性化する能力で最もよく知られている、プロトタイプのパターン認識受容体（ＰＲＲ）である。蓄積しているエビデンスは、ＴＬＲの機能が侵入病原体に対する自然免疫応答の誘発に限定されないことを示している。ＴＬＲは実際、組織修復及び傷害誘導性再生、並びにがんに対する適応免疫応答に関与することが示されている。特に、ＴＬＲ４シグナル伝達は、樹状細胞による細胞関連腫瘍抗原の効率的なプロセシング及び交差提示に必要とされるようであり、事実上、いくつかの抗がん薬物に対する最適な治療応答の基礎となっている。したがって、ＴＬＲは、抗がん免疫応答の活性化／増強のための優れた治療標的を構成する。この考えに沿って、例えばＣｏｌｅｙ毒素（死滅した化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）と霊菌（Streptococcus pyogenes）との混合物）及びカルメット・ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ、元々は結核に対するワクチンとして開発されたマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の弱毒株）（これらは双方とも一貫した抗がん反応と関連している）などの古くから使われている調製物は、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４シグナル伝達を活性化する。

現在受け入れられているモデルによれば、ＴＬＲは、二量体又はヘテロ二量体として作用し、原形質膜ＭＡＭＰ（proteo-lipidic MAMP）に主に結合するＴＬＲ、すなわちＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６及びＴＬＲ１０）ででもエンドゾーム（微生物核酸を検出するＴＬＲ、すなわちＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９）においても発現する。ヒトＴＬＲの中で唯一オーファン受容体であるＴＬＲ１０もまた、ファゴソームにおいてＴＬＲ２と共局在することが示されており、これは、ＴＬＲ１０がアシル化リポペプチドを結合する能力をＴＬＲ２と共有し得ることを示唆している。しかしながら、この問題に関する決定的なデータはまだ報告されていない。ＴＬＲ１１-１３は、ヒトゲノムにおいてはコードされていない。マウスでは、ＴＬＲ１１-１３は中枢神経系において恒常的に発現され、嚢虫症２１に応答して数倍の誘導を受ける。ＴＬＲ１１は、トキソプラズマ・ゴンディによって発現されるプロフィリン様タンパク質を認識し、小胞体に局在していると報告されている。ＴＬＲ１３は細胞内に局在するようにも見え、そこでそれは水疱性口内炎ウイルスを特異的に検出するであろう。これまでのところ、ＴＬＲ１２のリガンド特異性及び細胞内局在は未発見のままである。

したがって要約すると、異なるＴｏｌｌ様受容体は、異なる機能、構造及び発現パターンを有する。その結果、これらのリガンド及びアゴニストもまた、異なる機能及び作用様式を有する。例えばＬＰＳ、すなわちエンドトキシンとしても知られる、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４の天然リガンドは、ＴＬＲの存在が疑われてもいなかった１９６０年代に早くも発見されていた抗がん特性を有する。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、自然免疫系において重要な役割を果たすタンパク質の一種である。Ｔｏｌｌ様受容体は、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する、マクロファージ及び樹状細胞などのセンチネル細胞において通常発現される単一の、膜貫通型非触媒受容体である。これらの微生物が皮膚又は腸管粘膜などの物理的障壁を突破すると、それらは免疫細胞応答を活性化するＴＬＲによって認識される。ＴＬＲには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２及びＴＬＲ１３が含まれるが、最後の２つはヒトにおいては発見されていない。（Mahla, RS, et al, Front Immunol 4 (2013) 248）。

［ＴＬＲリガンド］
Ｔｏｌｌ様受容体（及び他の自然免疫受容体）は、その特異性のために進化の過程で容易に変化することはできず、絶えず脅威（すなわち病原体又は細胞ストレス）に関連する分子を認識し、これらの脅威に対して非常に特異的である（すなわち、生理学的条件下で通常発現される自己分子と間違われることがない）。この要件を満たす病原体関連分子は、病原体の機能にとって重要であって、突然変異によって変化することは難しいと考えられており、進化的に保存されていると言われる。病原体における幾分保存された特徴には、細菌細胞表面リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質、リポペプチド及びリポアラビノマンナン；細菌鞭毛由来のフラジェリンなどのタンパク質；ウイルスの二本鎖ＲＮＡ；又は細菌性及びウイルス性ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧアイランド；並びに真核生物ＤＮＡのプロモーターに見られるＣｐＧアイランドのもの；並びにある種の他のＲＮＡ及びＤＮＡ分子が含まれる。ほとんどのＴＬＲについて、リガンド認識特異性は現在、遺伝子ターゲティング（「遺伝子ノックアウト」としても知られる）によって確立されているが、これは、マウスにおいて個々の遺伝子を選択的に欠失させることができる技術である。

既知のＴＬＲリガンドの概要については、以下の表を参照のこと（Waltenbaugh C, et al Immunology. Lippincott’s Illustrated reviews. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2008) p. 17)。
表３：

Ｔｏｌｌ様受容体活性化によって引き起こされる常同的な炎症反応は、Ｔｏｌｌ様受容体の内因性活性化因子が自己免疫疾患に関与するかもしれないという推測を導いた。ＴＬＲは、線維素原（血液凝固に関与）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＨＭＧＢ１、細胞外マトリックス成分及び自己ＤＮＡ（通常はヌクレアーゼによって分解されるが、炎症及び自己免疫条件下では、内因性タンパク質と不育剛体を形成することができ、これらのヌクレアーゼに対して耐性となり、エンドソームＴＬＲ又はＴＬＲ９へのアクセスを得る）を含む宿主分子への結合が疑われている。これらの内因性リガンドは通常、非生理学的細胞死の結果として産生される（Kawai, T. et al; Nature Immunology. 11 (2010) 373-384）。

様々なＴＬＲのリガンドの概要
ＴＬＲ－１：－ 細菌リポタンパク質及びペプチドグリカン
ＴＬＲ－２：－ 細菌ペプチドグリカン
ＴＬＲ－３：－ 二本鎖ＲＮＡ
ＴＬＲ－４：－ リポ多糖
ＴＬＲ－５：－ 細菌鞭毛
ＴＬＲ－６：－ 細菌リポタンパク質
ＴＬＲ－７：－ 一本鎖ＲＮＡ、細菌及びウイルス
ＴＬＲ－８：－ 一本鎖ＲＮＡ、細菌及びウイルス、貪食細菌ＲＮＡ．［３０］
ＴＬＲ－９：－ ＣｐＧ ＤＮＡ
ＴＬＲ－１０：－ 不明
ＴＬＲ－１１：－ トキソプラズマ・ゴンディ由来のプロフィリン、おそらく尿路病原菌
ＴＬＲ－１２：－ トキソプラズマ・ゴンディ由来のプロフィリン
ＴＬＲ－１３：－ 細菌リボソームＲＮＡ

ＴＬＲ９は主に、Ｂ細胞、単球、マクロファージ及び形質細胞様樹状細胞のエンドソームコンパートメントにおいて見出される（Galluzzi et al., OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716）。ＴＬＲ９主リガンドは細菌性／ウイルス性ＤＮＡであり、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの頻度が高いという点でその哺乳動物の対応物とは異なる。確かに、哺乳動物ＤＮＡは免疫刺激活性を有しないが、細菌性／ウイルス性ＤＮＡの投与はｉｎ ｖｉｖｏで強力なＴｈ１免疫応答を誘導し、ＴＬＲ９^－／－マウスではこれは完全に抑制される。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（又はＣｐＧ ＯＤＮ）は、シチジン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）、続いてグアニジン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続したヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指すが、いくつかのＯＤＮは、代わりに修飾ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有する。これらのＣｐＧモチーフがメチル化されていないとき、それらは免疫刺激剤として作用する（Weiner, GJ; et al, PNAS 94 (1997) 10833-7）。

ＣｐＧモチーフは、微生物ゲノムに豊富に存在するが脊椎動物ゲノムには稀であるため、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と見なされる（Bauer, S; Current Topics in Microbiology and Immunology 270 (2002) 145-54）。ＣｐＧ ＰＡＭＰは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識され、ヒト及び他の高等霊長類のＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）でのみ恒常的に発現される（Rothenfusser, S; et al, Human immunology 63 (2002) 1111-9）。

合成ＣｐＧ ＯＤＮは、典型的なホスホジエステル骨格の代わりに部分的又は完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ）骨格と、３’末端、５’末端又はその双方にポリＧテールとを有するという点で、微生物ＤＮＡと異なる。ＰＳ修飾は体内のＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解からＯＤＮを保護し、ポリＧテールは細胞取り込みを高める（Dalpke, AH et al, Immunology 106 (2002) 102-12）。ポリＧテールは、高分子量の凝集体を生じる分子間四分子（intermolecular tetrads）を形成する。この凝集体は、ポリＧ配列自体ではなく、該配列が与える活性の増大に関与している。

ＯＤＮ １８２６などの非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含むこのような合成オリゴデオキシヌクレオチドは、アジュバントとして広く研究されてきた（Steinhagen F. et al., 2011; Vaccine 29(17):3341-55）。このようなＣｐＧモチーフは、哺乳動物ＤＮＡと比較して、細菌性ＤＮＡ中に２０倍高い頻度で存在する（Hemmi H. et al., 2000. Nature 408: (740-5）。ＣｐＧ ＯＤＮは、ヒトＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上に発現するＴＬＲ９をアゴナイズし、それによりＴｈ１優勢の免疫応答を誘導する（Coffman et al., 2010. Immunity 33(4):492-503）。げっ歯類及び非ヒト霊長類で行われた前臨床試験、並びにヒトの臨床試験は、ＣｐＧ ＯＤＮがワクチン特異的抗体反応を顕著に改善できることを実証した（Steinhagen F. et al., 2011; Vaccine 29(17):3341-55）。

多数の配列が、ＣｐＧ二量体の数及び位置、並びにＣｐＧ二量体に隣接する正確な塩基配列を変化させてＴＬＲ９を刺激することが示されている。これにより、それらの配列、二次構造、及びヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する効果に基づいて、すべてがＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ ＯＤＮのクラス又はカテゴリーの創設に至った。ＣｐＧ ＯＤＮｓの３つの主なクラスは、Ａ、Ｂ及びＣクラスであり、これらは免疫活性が異なっている（Krug A. et al., 2001, Eur J Immunol, 31(7): (2154-63）。更に、ＣｐＧ ＯＤＮは、種特異的にＴＬＲ９を活性化する（Bauer, S. et al., 2001, PNAS, 98(16):9237-42）。第１のＡのクラスＯＤＮの１つであるＯＤＮ ２２１６は、２００１年にＫｒｕｇらによって記述された （上記参照）。このクラスのＯＤＮは、それが大量のＩ型インターフェロン（最も重要なものはＩＦＮα）の産生を刺激し、ｐＤＣの成熟を誘導するという点で、前述のＢクラスのＯＤＮ（すなわちＯＤＮ ２００６）とは明らかに異なっていた。

ＡクラスのＯＤＮはまた、間接的サイトカインシグナル伝達を介したＮＫ細胞の強力な活性化剤でもある。ＡクラスのＯＤＮは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に抵抗し、ＯＤＮの寿命を延ばす７－１０のＰＳ修飾塩基を片方の末端又は両末端に含む。上記の規則は厳密にクラスを定義するが、これらの「規則」内の配列のばらつきは考えられる。配列に対する変更は応答の大きさに影響を与えることにも留意されたい。例えば、内部パリンドローム配列は長さが４～８塩基対で、塩基の順序が変わり得るが、他のいくつかの配列と比較した場合、５’－Ｐｕ Ｐｕ ＣＧ Ｐｕ Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｙ－３’というパターンが最も活性であることが見出された。ＤＮＡ鎖のいずれかの末端に見出されるポリＧテールは、長さ及び数さえ異なり得るが、その存在は分子の活性にとって重要である。

ＢクラスのＯＤＮ（すなわちＯＤＮ ２００７）は、ヒトＢ細胞及び単球の成熟の強力な刺激因子である。刺激因子はまた、ｐＤＣの成熟を刺激するが、それはＡクラスのＯＤＮ及び非常に少量のＩＦＮαよりも少ない程度である。このクラスで最も強力なＯＤＮは、３つの６ｍｅｒ配列を有する。ＢクラスのＯＤＮは、それをワクチンアジュバントとして理想的にならしめる、強力な液性免疫応答を誘導する能力ゆえに、治療薬として広く研究されてきた。

ＯＤＮ １８２６は、マウスＴＬＲ９に特異的なＢタイプのＣｐＧ ＯＤＮである。ＢタイプのＣｐＧ ＯＤＮは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む完全なホスホロチオエート骨格を含み、Ｂ細胞を強く活性化することができる（Krug A. et al., 2001, Eur J Immunol, 31(7): (2154-63）。マウス反応性代替アゴニストであるＯＤＮ １８２６は、多数の動物モデルにおいてアジュバントとして試験されている（Bauer, S. et al., 2001, PNAS, 98(16):9237-42）。マウスでの研究は、ＯＤＮ １８２６投与が抗原提示細胞の活性化及びＴｈ１免疫応答を示すＩ型ＩＦＮ抗ウイルス活性８－９を誘導できることを示した（Longhi Mp. et al., 2009, J Exp Med 206: (1589-602）。

更に、担腫瘍げっ歯類へのＢタイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与（単独で、又は化学療法剤若しくはペプチドワクチンと組み合わせて）は、強力な抗がん効果を発揮すると報告されている。２０００年４月に、腫瘍学的適応症に対するＣｐＧ－７９０９の安全性と効力をテストするための初期第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が開始された。ほぼ同時期に、ＣｐＧ－７９０９は、がんとは無関係の適応症のためのアジュバント（主に抗ウイルスワクチン）として広く研究され始めたが、重篤な副作用も示さず、効果を促している。

過去１０年間で、ＣｐＧ－７９０９（単剤として、又は化学療法及び／又はワクチン接種のアプローチとの併用）の安全性及び抗がんポテンシャルが、白血病、リンパ腫、基底細胞がん、メラノーマ１（１melanoma）、食道扁平上皮がん、ＮＳＣＬＣ、腎細胞がん及び前立腺がんの患者での研究を含め、多数の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で研究されてきた。アガトリモド（３ＣｐＧモチーフを含む合成２４量体オリゴヌクレオチドのトリコサナトリウム（tricosasodium）塩；ファイザー）ＧＮＫＧ１６８（ＣｐＧ ＯＤＮ；ＳＢＩバイオテック）、ＩＭＯ－２０５５（非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド；アイデラ・ファーマシューティカルズ）、ＭＧＮ－１７０３（Ｍｏｌｏｇｅｎ）など、いくつかのＴＬＲ９アゴニストが知られており、臨床試験で現在開発されている。通常、これらのＴＬＲ９アゴニストは、様々ながんの治療に使用される。

Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ＫらのＪ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．８１（６）（２００７） １５７７－９０は、ＴＬＲアゴニスト（非メチル化ＣｐＧ含有ＤＮＡ（ＣｐＧ ＤＮＡ））、マウスＴｌＲ９発現の調節に関し、ＩＦＮ－ガンマがマウスマクロファージのＣｐＧ ＤＮＡに対する応答を増幅する分子機構を明らかにしている。

用語「Ｔｏｌｌ様受容体９」（ＴＬＲ９、ＣＤ２８９；配列番号３２）は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのタンパク質を指し、これは病原体認識と自然免疫の活性化において基本的役割を果たしている。ＴＬＲは、ショウジョウバエからヒトまで高度に保存されており、構造的及び機能的類似性を共有している。ＴＬＲは、感染病原体上に発現する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、有効な免疫の発生に必要なサイトカインの産生を媒介する。種々のＴＬＲが異なる発現パターンを示す。この遺伝子は、脾臓、リンパ節、骨髄及び末梢血白血球等の免疫細胞が豊富な組織で優先的に発現する。マウス及びヒトにおける研究は、この受容体が細菌性ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに対する細胞応答を媒介して、自然免疫応答を開始することを示している。

ＴＬＲ９は主に、Ｂ細胞、単球、マクロファージ及び形質細胞様樹状細胞のエンドソームコンパートメントにおいて見出される（Galluzzi et al., OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716）。ＴＬＲ９主リガンドは細菌性／ウイルス性ＤＮＡであり、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの頻度が高いという点でその哺乳動物の対応物とは異なる。確かに、哺乳動物ＤＮＡは免疫刺激活性を有しないが、細菌性／ウイルス性ＤＮＡの投与はｉｎ ｖｉｖｏで強力なＴｈ１免疫応答を誘導し、ＴＬＲ９^－／－マウスではこれは完全に抑制される。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（又はＣｐＧ ＯＤＮ）は、シチジン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）、続いてグアニジン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続したヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指すが、いくつかのＯＤＮは、代わりに修飾ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有する。これらのＣｐＧモチーフがメチル化されていないとき、それらは免疫刺激剤として作用する（Weiner, GJ; et al, PNAS 94 (1997) 10833-7）。したがって、「Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト」（ＴＬＲ９アゴニスト）は、Ｔｏｌｌ様受容体９への結合及びＴＬＲ９免疫応答の刺激を特徴とする。例えば、一実施態様では、Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト（ＴＬＲ９アゴニスト）は、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上のＴｏｌｌ様受容体９への結合によって、及びこのような形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２の誘導（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２のレベルの上昇）によって特徴付けられる。

ＣｐＧモチーフは、微生物ゲノムに豊富に存在するが脊椎動物ゲノムには稀であるため、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と見なされる（Bauer, S; Current Topics in Microbiology and Immunology 270 (2002) 145-54）。ＣｐＧ ＰＡＭＰは、パターン認識受容体（ＰＲＲ） Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識され、ヒト及び他の高等霊長類のＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）でのみ恒常的に発現される（Rothenfusser, S; et al, Human immunology 63 (2002) 1111-9）。

合成ＣｐＧ ＯＤＮは、典型的なホスホジエステル骨格の代わりに部分的又は完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ）骨格と、３’末端、５’末端又はその双方にポリＧテールとを有するという点で、微生物ＤＮＡと異なる。ＰＳ修飾は体内のＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解からＯＤＮを保護し、ポリＧテールは細胞取り込みを高める（Dalpke, AH et al, Immunology 106 (2002) 102-12）。ポリＧテールは、高分子量の凝集体を生じる分子間四分子を形成する。この凝集体は、ポリＧ配列自体ではなく、該配列が与える活性の増大に関与している。

ＯＤＮ １８２６などの非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含むこのような合成オリゴデオキシヌクレオチドは、アジュバントとして広く研究されてきた（Steinhagen F. et al., 2011; Vaccine 29(17):3341-55）。このようなＣｐＧモチーフは、哺乳動物ＤＮＡと比較して、細菌性ＤＮＡ中に２０倍高い頻度で存在する（Hemmi H. et al., 2000. Nature 408: (740-5）。ＣｐＧ ＯＤＮは、ヒトＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上に発現するＴＬＲ９をアゴナイズし、それによりＴｈ１優勢の免疫応答を誘導する（Coffman et al., 2010. Immunity 33(4):492-503）。げっ歯類及び非ヒト霊長類で行われた前臨床試験、並びにヒトの臨床試験は、ＣｐＧ ＯＤＮがワクチン特異的抗体反応を顕著に改善できることを実証した（Steinhagen F. et al., 2011; Vaccine 29(17):3341-55）。

多数の配列が、ＣｐＧ二量体の数及び位置、並びにＣｐＧ二量体に隣接する正確な塩基配列を変化させてＴＬＲ９を刺激することが示されている。これにより、それらの配列、二次構造、及びヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する効果に基づいて、すべてがＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ ＯＤＮのクラス又はカテゴリーの創設に至った。ＣｐＧ ＯＤＮｓの３つの主なクラスは、Ａ、Ｂ及びＣクラスであり、これらは免疫活性が異なっている（Krug A. et al., 2001, Eur J Immunol, 31(7): (2154-63）。更に、ＣｐＧ ＯＤＮは、種特異的にＴＬＲ９を活性化する（Bauer, S. et al., 2001, PNAS, 98(16):9237-42）。第１のＡクラスのＯＤＮの１つであるＯＤＮ ２２１６は、２００１年にＫｒｕｇらによって記述された（上記参照）。このクラスのＯＤＮは、それが大量のＩ型インターフェロン（最も重要なものはＩＦＮα）の産生を刺激し、ｐＤＣの成熟を誘導するという点で、前述のＢクラスのＯＤＮ （すなわちＯＤＮ ２００６）とは明らかに異なっていた。

ＡクラスのＯＤＮはまた、間接的サイトカインシグナル伝達を介したＮＫ細胞の強力な活性化剤でもある。ＡクラスのＯＤＮは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に抵抗し、ＯＤＮの寿命を延ばす７－１０のＰＳ修飾塩基を片方の末端又は両末端に含む。上記の規則は厳密にクラスを定義するが、これらの「規則」内の配列のばらつきは考えられる。配列に対する変更は応答の大きさに影響を与えることにも留意されたい。例えば、内部パリンドローム配列は長さが４～８塩基対で、塩基の順序が変わり得るが、他のいくつかの配列と比較した場合、５’－Ｐｕ Ｐｕ ＣＧ Ｐｕ Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｙ－３’というパターンが最も活性であることが見出された。ＤＮＡ鎖のいずれかの末端に見出されるポリＧテールは、長さ及び数さえ異なり得るが、その存在は分子の活性にとって重要である。

ＢクラスのＯＤＮ（すなわちＯＤＮ ２００７）は、ヒトＢ細胞及び単球の成熟の強力な刺激因子である。刺激因子はまた、ｐＤＣの成熟を刺激するが、それはＡクラスのＯＤＮ及び非常に少量のＩＦＮαよりも少ない程度である。このクラスで最も強力なＯＤＮは、３つの６ｍｅｒ配列を有する。ＢクラスのＯＤＮは、それをワクチンアジュバントとして理想的にならしめる、強力な液性免疫応答を誘導する能力ゆえに、治療剤として広く研究されてきた。

ＯＤＮ １８２６は、マウスＴＬＲ９に特異的なＢタイプのＣｐＧ ＯＤＮである。ＢタイプのＣｐＧ ＯＤＮは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む完全なホスホロチオエート骨格を含み、Ｂ細胞を強く活性化することができる（Krug A. et al., 2001, Eur J Immunol, 31(7): (2154-63）。マウス反応性代替アゴニストであるＯＤＮ １８２６は、多数の動物モデルにおいてアジュバントとして試験されている（Bauer, S. et al., 2001, PNAS, 98(16):9237-42）。マウスでの研究は、ＯＤＮ １８２６投与が抗原提示細胞の活性化及びＴｈ１免疫応答を示すＩ型ＩＦＮ抗ウイルス活性８－９を誘導できることを示した（Longhi Mp. et al., 2009, J Exp Med 206: (1589-602）。

更に、担腫瘍げっ歯類へのＢタイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与（単独で、又は化学療法剤若しくはペプチドワクチンと組み合わせて）は、強力な抗がん効果を発揮すると報告されている。２０００年４月に、腫瘍学的適応症に対するＣｐＧ－７９０９の安全性と効力をテストするための初期第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が開始された。ほぼ同時期に、ＣｐＧ－７９０９は、がんとは無関係の適応症のためのアジュバント（主に抗ウイルスワクチン）として広く研究され始めているが、重篤な副作用も示さず、効果を促している。

過去１０年間で、ＣｐＧ－７９０９（単剤として、又は化学療法及び／又はワクチン接種のアプローチとの併用）の安全性及び抗がんポテンシャルが、白血病、リンパ腫、基底細胞がん、メラノーマ１（１ｍｅｌａｎｏｍａ）、食道扁平上皮がん、ＮＳＣＬＣ、腎細胞がん及び前立腺がんの患者での研究を含め、多数の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で研究されてきた。アガトリモド（３ＣｐＧモチーフを含む合成２４量体オリゴヌクレオチドのトリコサナトリウム（ｔｒｉｃｏｓａｓｏｄｉｕｍ）塩；ファイザー）ＧＮＫＧ１６８（ＣｐＧ ＯＤＮ；ＳＢＩバイオテック）、ＩＭＯ－２０５５（非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチド；アイデラ・ファーマシューティカルズ）、ＭＧＮ－１７０３（Ｍｏｌｏｇｅｎ）．など、いくつかのＴＬＲ９アゴニストが知られており、臨床試験で現在開発されている。通常、これらのＴＬＲ９アゴニストは、様々ながんの治療に使用される。

非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌性及び合成ＤＮＡは、ＴＬＲ９のアゴニストとして作用し、Ｔｈ１型免疫応答プロファイルを誘導する。ＴＬＲ９アゴニストの免疫刺激作用は多因子性であり、ヌクレオチド配列、骨格の性質及び特定の構造モチーフの存在に依存する。誘導されたサイトカインプロファイルに基づいて、３つの異なるタイプのＴＬＲ９アゴニスト、Ａ、Ｂ及びＣクラスが記述されている。ＴＬＲ９アゴニストの各クラスは、異なる免疫プロファイルを生成する構造（又は構造なし）の形成を可能にする異なるヌクレオチド配列から構成される。

ＴＬＲ９のアゴニストとして作用するオリゴヌクレオチドの構造活性相関は体系的に研究された（Kandimalla, E.R. and Agrawal, S. (2005) in Toll and Toll Receptors: An Immunologic Perspective (Rich, T., ed.), pp. 181-212, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York ）。オリゴヌクレオチド中のＣｐＧモチーフの存在は、ＴＬＲ９刺激に必要とされる。ホスホジエステル及びホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９媒介性免疫応答を刺激する。ホスホロチオエート骨格オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドよりも、遍在するヌクレアーゼによる分解を受けにくいため、一般的に使用あれている。ヌクレオチド間ホスホジエステル結合への硫黄原子の導入は、Ｒｐ及びＳｐジアステレオ異性体の形成をもたらし、ホスホロチオエート結合のＲｐジアステレオマーは、Ｓｐジアステレオマーよりも強いＴＬＲ９媒介性免疫応答を刺激する。シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の間及びそれらと隣接するリン酸塩の負電荷もまた、ＴＬＲ９媒介性活性に必要である。これらの位置にメチルホスホネート結合を組み入れることによる電荷の中和は、免疫刺激活性の喪失をもたらす。更にＴＬＲ９活性化は、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する配列、ヌクレオチド骨格の性質及び二次構造にも依存する。

［隣接配列はＴＬＲ９刺激において重要な役割を果たす］
ＣｐＧモチーフのＣ又はＧヌクレオチドの糖環の２’位に化学修飾が導入されると、ＴＬＲ９アゴニストの免疫刺激活性が失われる。更に、隣接配列中にメチルホスホネート結合、２’－アルキル若しくは３’－デオキシ若しくは－アルキルリボヌクレオシド、非ヌクレオチドリンカー又は無塩基ヌクレオチド等の化学修飾を含むＴＬＲ９アゴニストの研究は、ＣｐＧジヌクレオチドの５´の４番目から６番目のヌクレオチド位置に組み込まれた置換は免疫刺激活性を著しく高めることを示している。一般に、ＣｐＧジヌクレオチドの遠位の３´隣接配列に組み込まれた修飾は、その修飾の性質に応じて効果がある。

［ＴＬＲ９は刺激のためにアゴニストの遊離５´末端を必要とする］
両５’末端を介して結合した２つのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、２つのＣｐＧモチーフがあるにもかかわらず、免疫細胞を活性化しない。同じオリゴヌクレオチドがそれらの両３´末端を介して連結されている場合、それらは１つの５´末端を有する親ＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも高くかつ異なるサイトカインプロファイルを生じる。これらは、ＴＬＲ９活性化のためのアクセス可能又は遊離５’末端の必要性と、受容体が５’末端から配列を読み取ることを実証した最初の研究である。転写因子ＮＦ－κＢは２つの５´末端を含むＴＬＲ９アゴニストによって急速に活性化されるが、これらの化合物は、Ｊ７７４細胞におけるＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路に対して従来のＴＬＲ９アゴニストと同じ活性を示有する。

これらの研究は、２つの５’末端を含むアゴニストが受容体の二量体化を促進し、免疫反応を急速に活性化することを示唆している。更にＴＬＲ９活性化は、遊離５´末端と合成免疫刺激モチーフの適切な提示を通して調節され、下流のサイトカイン誘導プロファイルの変化をもたらし得る。これらの結果と一致して、最近の研究は、ＴＬＲ９が二量体形態で存在し、一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することを示した。但し、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのみが受容体におけるコンフォメーション変化を引き起こし、免疫シグナル伝達経路の活性化をもたらす。

両３’末端を介したオリゴヌクレオチドの結合は、ＴＬＲ９の最適な活性化のために２つの５´末端を提供するだけでなく、３´エキソヌクレアーゼに対する安定性も向上させる。ホスホジエステル骨格を持ち、両３’末端を介して結合した５及び６ｎｔほどに短いオリゴヌクレオチドは、強力なＴＬＲ９アゴニストとして作用し、免疫応答を生成する。更に、ＴＬＲ９アゴニストを含有する新しい構造体の経口投与は、強力な粘膜免疫応答を誘導し、抗原とのアジュバントとして作用し、胃腸管におけるＴＬＲ９アゴニストのより高い安定性によってマウスモデルにおけるピーナッツアレルギーを予防及び逆転させる。

［ＴＬＲ９刺激に必要なシトシン及びグアニンの官能基］
上記のように、構造及びコンフォメーションを変化させる、ジヌクレオチド内に導入された特定の化学修飾は、アゴニストの免疫刺激活性の喪失をもたらす。そのような修飾の１つは、ＴＬＲ９アゴニストのＣｐＧモチーフ中のシトシンの５位にあるメチル基の置換である。脊椎動物はこの特徴を利用して、自己ＤＮＡと、非メチル化ＣｐＧモチーフをより多く含有する細菌性ＤＮＡのそれを区別する。

シトシンに代わる、５－ＯＨ－ｄＣ、ｄＵ、ｄＰ、１－（２’－デオキシ－β－Ｄ－リボフラノシル）－２－オキソ－７－デアザ－８－メチル－プリン、Ｎ３－Ｍｅ－ｄＣ及びＮ４－Ｅｔ－ｄＣ等の種々のピリミジンアナログ（Ｙ）の作用(Kandimalla, E.R., et al (2001) Bioorg. Med. Chem. 9, 807-813; Kandimalla, E.R., et al, S. (2003) PNAS. 100, 14303-14308; or Putta, M.R., et al, S. (2006) Nucleic Acids Res. 34 (3231-3238）ＴＬＲ９の認識におけるグアニンの異なる官能基の役割を理解するために、ＣｐＧにおいてグアニンの代わりに、７－デアザ－ｄＧ、Ｎ１－Ｍｅ－ｄＧ、２－アミノ－Ｄ－プリン、ネブラリン、２－アミノ－ｄＡ、７－デアザ－Ｄ－キサンチン、Ｋ塩基及びｄＩ等のいくつかのプリン核酸塩基（Ｒ）が試験された（Kandimalla, E.R., et al (2001) Bioorg. Med. Chem. 9, 807-813; Kandimalla, E.R., et al. <2003> PRT 100, 14303-14308; Putta, M.R., et al, (2006) Nucleic Acids Res. 34, 3231-3238; Kandimalla, E.R., et al (2003) Nucleic Acids Res. 31, 2393-2400; 又は Kandimalla, E.R., et al. <2005> PRT 102 (6925-6930）。これらの研究は、免疫調節のための新しい合成ヌクレオチドモチーフ（ＹｐＧ、ＣｐＲ）の開発をもたらし、特定の複素環塩基変異体のＴＬＲ９による受容を実証した。

ＴＬＲ９の新規の合成アゴニスト（S. Agrawal and E.R. Kandimalla, Biochemical Society Transactions (2007) 35, (1461-1467)）：上記の新しい構造体と合成免疫刺激モチーフとの組み合わせは、本発明者らにＴＬＲ９の新規合成アゴニストのコンビナトリアルライブラリーを作製するためのツールを提供した。マウス、ヒト及びサルの系での、２つの５’末端を持ち、合成ＣｐＲジヌクレオチドを異なるヌクレオチド組成で含むいくつかのＴＬＲ９アゴニストの体系的な研究は、ヌクレオチド配列及び二次構造が免疫応答の調節において役割を果たすことを示唆する。これらの研究に基づいて、本発明者らはＴＬＲ９の合成アゴニストの２つの異なる群を大まかに同定した。

一実施態様では、Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト（ＴＬＲ９アゴニスト）は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２の誘導（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２のレベルの上昇）によって特徴付けられる。一実施態様では、ＴＬＲ９アゴニストは、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）におけるＩＦＮ－アルファの上昇（後述の又は例えば国際公開第２０１０／０８８３９５号に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定して）によって特徴付けられる。

［ヒトｐＤＣにおける本発明の併用療法において使用されるＴＬＲ９アゴニストによるＩＦＮ－アルファ誘導（ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２のレベルの上昇）を測定するためのアッセイ］：
ヒトＰＢＭＣ単離：新たに採取した健康なボランティアの血液（マサチューセッツ州ボストンのＣＢＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077, Sigma）によって単離する。

ヒトｐＤＣ分離：ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＢＤＣ Ａ４細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたポジティブセレクションにより、製造者の指示に従って、新たに得られた健康なヒトのボランティアの血液ＰＢＭＣから単離された。

ヒトｐＤＣを、１ｍｌ当たり１ｘ１０^６個の細胞を用いてウェルディッシュにプレーティングする。表Ｉの個々の免疫調節化合物をＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）に溶解し、０、０．１、０．３、１．０、３．０又は１０．０マイクロｇ／ｍｌの用量で細胞培養物に添加する。その後、細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、上清をｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。

ＩＦＮ－アルファのレベルでは、ＩＬ－６及び／又はＩＬ－１２がサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される。サイトカイン抗体及び標準物質を含む必要な試薬は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入することができる。

ＩＦＮ－アルファは、長年抗ウイルスサイトカインとして知られている。それは、細胞発生を刺激し、それ故ＣＧ含有ＤＮＡ分子の作用を促進する。ＩＦＮ－アルファはまた、マウス及びヒトの悪性腫瘍において抗腫瘍活性を示し、かつ部分的には、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化し、それにより腫瘍細胞の細胞溶解の可能性を増大させることによって移植腫瘍細胞の腫瘍形成性を減少させることができる。抗腫瘍細胞傷害性にも重要なＮＫ胞及びマクロファージの活性は、ＩＦＮ－アルファによっても増加する（Brassard et al., J. Leukoc. Biol. 2002 71 (565-81）。したがって、本開示のＤＮＡコンストラクトでの刺激でＩＦＮアルファの量を増加させることは、がんの治療に有益であると期待される。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）プリン－リン酸－グアノシン（ＲｐＧ）モチーフ（ＲｐＧ ＯＤＮｓ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドであり、ＴＬＲ９アゴニストはＴＬＲ９を刺激する（一実施態様では、ＴＬＲ９アゴニストは形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成熟を誘導し；一実施態様では、ＴＬＲ９アゴニストはヒトＢ細胞成熟によって特徴付けられる）。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ＡクラスのＣｐＧ ＯＤＮである。

一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、
ａ） ５’末端又は３’末端又は両末端のポリＧ配列
ｂ） 内部パリンドローム配列
ｃ） 内部パリンドローム配列内に含まれるＧＣジヌクレオチド、及び
ｄ） 部分的にＰＳ修飾された骨格
を含むオリゴデオキシヌクレオチドである。

ＡクラスのＣｐＧ ＯＤＮは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に抵抗し、ＯＤＮの寿命を延ばす７－１０のＰＳ修飾塩基を片方の末端又は両末端に含む。上記の規則は厳密にクラスを定義するが、これらの規則内の配列のばらつきは考えられる。内部パリンドローム配列は長さが４～８塩基対で、塩基の順序が変わり得るが、他のいくつかの配列と比較した場合、５’－Ｐｕ Ｐｕ ＣＧ Ｐｕ Ｐｙ ＣＧ Ｐｙ Ｐｙ－３’というパターンが最も活性であることが見出された。ＤＮＡ鎖のいずれかの末端に見出されるポリＧテールは、長さ及び数が変化し得る。

一実施態様では、ＡクラスのＣｐＧ ＯＤＮ（Xueqing Liang,et al, Blood. 2010 June 17; 115(24): 5041-5052 ）は、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６（５’－ｇｇＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇＧ－３’）（配列番号１７） ＣｐＧ ＯＤＮ ＰＢ４（５’－ｔｃｇＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇＧ－３’）（配列番号１８）；又はＣｐＧ ＯＤＮ １００２（５’－ｇｇＧＧＴＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴｇｇｇｇｇＧ－３’）（配列番号１９）からなる群より選択される。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ＢクラスのＣｐＧ ＯＤＮである。

一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、
ａ） １つ以上の６ｍｅｒ非メチル化シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ５’－Ｐｕ Ｐｙ Ｃ Ｇ Ｐｙ Ｐｕ－３’（１つ以上の６ｍｅｒ ５’－ＲＹＣＧＹＲ－３’ ６ｍｅｒ（Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｙ＝Ｔ又はＣ））
ｂ） 完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ修飾）骨格；及び
ｃ） 長さ１８－２８ヌクレオチド
を含むオリゴデオキシヌクレオチドである。

一実施態様では、ＢクラスのＣＰＧ ＯＤＮは、ＣｐＧ－２８、ＣｐＧ－６８５（ＧＮＫＧ１６８；ＣｐＧ ＯＤＮ；ＳＢＩバイオテック）、ＣｐＧ－６８４及びＣｐＧ－７９０９（ＣＰＧ－ＯＤＮ ２００６、ＰＦ－３５１２６７６、Ａｇａｔｏｌｉｍｏｄ）からなる群より選択される。

ＣｐＧ－７９０９（ＣｐＧ ２００６、ＰＦ－３５１２６７６、Ａｇａｔｏｌｉｍｏｄ）は、複数のシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ又はその誘導体の１つ（トリコサナトリウム塩など）を含有する、合成の２４量体ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチド （ｄ（Ｐ－チオ）（Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｔ－Ｔ）ＤＮＡ）（５’－ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ－３’） （配列番号２０）である。その調製は、例えば国際公開第９８１８８１０号又は米国特許第７２２３７４１号に記載されている。

ＣｐＧ－６８５（ＧＮＫＧ１６８； ＣｐＧ ＯＤＮ； ＳＢＩバイオテック）は、免疫刺激活性を有する、合成、２１量体、非メチル化ＣｐＧモチーフベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（６８５、５’－ｔｃｇｔｃｇａｃｇｔｃｇｔｔｃｇｔｔｃｔｃ－３’）（配列番号２１）である。Ｂ細胞における細胞応答を媒介するＴｏｌｌ様受容体９を直接標的とするように設計された、２１量体の完全ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドであるＣｐＧ６８５（ＧＮＫＧ１６８）は、ＳＣＩＤマウスにおいて抗腫瘍効果を示し、ヒト慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）の治療用にＳＢＩバイオテック株式会社により臨床開発中である。今回、その前臨床薬理研究を支援するために、高感度かつ特異的なアッセイが血漿及び細胞可溶化物において開発された。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＧＮＫＧ１６８は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）に結合してそれを活性化し、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。一旦内在化すると、それは免疫グロブリン（Ｉｇ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン （ＩＬ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の複数のサイトカイン放出をもたらす多数のシグナル伝達経路を活性化し得る。

ＣｐＧ－６８４は、合成、２３量体、非メチル化ＣｐＧモチーフベースのオリゴデオキシヌクレオチド （ＯＤＮ） ６８４、５’－ｔｃｇａｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃ－３’（配列番号２２）；完全にホスホロチオエート化された骨格による、免疫活性を有する非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）の複数の反復を含有するＣｐＧ－２８合成非メチル化ＣｐＧモチーフベースのオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（５’－ＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＡＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴ－３’）（配列番号２３）（Carpentier AF, et al Front Biosci. 2003;8:e115-e127; Meng Y, et al, Int J Cancer. 2005;116:992-997；又はCarpentier A, et al. Neuro-Oncology 2006;8:60-66）である。エンドサイトーシスを介して細胞に入ると、ＣｐＧ－２８は多数のシグナル伝達経路を活性化し、その結果複数のサイトカインの放出をもたらす。ＣｐＧ－２８は、Ｂリンパ球、樹状及びＮＫ細胞の直接的活性化を伴う免疫調節特性を有し、その結果、自然免疫及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の刺激がもたらされる。更に、この作用物質は、サイトカイン（ＩＬ－１２及びＩＦＮガンマ）の放出を介してＴ細胞応答を間接的に調節し、Ｔｈ１（ヘルパー）表現型への優先的シフトを誘導してＣＤ８＋細胞傷害性を高める。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ＩＭＯ－２０５５（アイデラ）（３’－３’－結合構造及び合成ＣｐＲ（Ｒ＝２’－デオキシ－７－デアザグアノシンからなるＯＤＮ）モチーフ）である。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

本発明の一実施態様では、本発明の併用治療において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ｄＳＬＩＭ（登録商標）技術に基づくオリゴデオキシヌクレオチドベースのＣｐＧモチーフ含有環状ＯＤＮ（例えば、国際公開第２０１２／０８５２９１号に記載のＭｏｌｏｇｅｎ社のＭＧＮ－１７０３）である（この技術は国際公開第２００１／０７０５５号に記載されている）。

本発明の一実施態様では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６ ＣｐＧ ＯＤＮ １００２ ＣｐＧ－２８、ＣｐＧ－６８５、ＣｐＧ－６８４、ＣｐＧ－７９０９、ＩＭＯ－２０５５又はＭＧＮ－１７０３からなる群より選択される。本発明の一実施態様では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ－６８５、ＣｐＧ－６８４、ＣｐＧ－７９０９、ＩＭＯ－２０５５又はＭＧＮ－１７０３からなる群より選択される。一実施様態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ－７９０９、ＩＭＯ－２０５５又はＭＧＮ－１７０３からなる群より選択される。

本発明の一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とし；
かつ
本併用療法において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である。

本発明の好ましい一実施態様では、本明細書に記載の併用療法において使用されるヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ
を有することを特徴とし、
かつ
本併用療法において使用されるＴＬＲ９アゴニストは、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である。

用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を通常有する。コンフォメーションエピトープと非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で後者でなく前者への結合が失われるという点で区別される。

本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」（軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対の各々を意味する。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、三つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、配列が広く保存されている四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、ベータ－シートコンフォメーションを採り、ＣＤＲは、ベータ－シート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造に保持され、もう一方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。

本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書に記載の超可変可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を規定する。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変可変ループ」からの残基に従って決定される。

本明細書で使用する場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシアルファ－アミノ酸の群を意味する。

抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。「抗体のＦｃ部分」は、当業者によく知られている用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。抗体又は免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分類され、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれａ、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分に規定された結合部位により引き起こされる。そのような結合部位は当該技術分野で既知であり、例えばBoackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R.及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；ＥＰ第０３０７４３４号により記載されている。そのような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、 Ｎ２９７、Ｅ３１８、 Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９である（番号付けはＫａｂａｔ， Ｅ．Ａ．のＥＵインデックスに従う。下記参照）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

一実施態様において、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の他のすべての部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスの変異Ｆｃ部分（一実施態様ではＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ部分又はヒトＩｇＧ４サブクラスの変異Ｆｃ部分（一実施態様ではＳ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかであるＦｃ部分を指す。好ましい一実施態様ではヒト重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１サブクラスのもの、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり、別の好ましい実施態様ではヒト重鎖定常領域は変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様では、前記抗体は、低下した又は最少のエフェクター機能を有する。一実施態様では、最少のエフェクター機能は、エフェクターを有しない（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）Ｆｃ変異に起因する。一実施態様では、エフェクターを有しないＦｃ変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。一実施態様では、エフェクターを有しないＦｃ変異は、各抗体のために、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ及びＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む（からなる）群から互いに独立して選択される。

一実施態様では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧクラス（すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラス）の抗体である。

好ましい一実施態様では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様では、本明細書に記載されるのは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様では、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体である。

一実施態様において、本明細書に記載される抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。そのような定常鎖は、当該技術分野でよく知られており、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている（例えばJohnson, G.及びWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照)。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号３３のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。

本発明は、患者に対して治療的有効量の本発明による抗体を投与することを特徴とする、治療法を必要とする患者の治療のための方法を含む。

本発明は、記載の治療法のための、本発明による抗体の使用を含む。

本発明の一実施態様は、本明細書記載のアゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせてがんの治療に使用するための、本明細書に記載のＣＳＦ－１Ｒ抗体である。

本発明の一実施態様は、本明細書に記載される抗ＣＤ４０抗体と組み合わせてがんの治療に使用するための、本明細書に記載されるＣＳＦ－１Ｒである。

本発明の一実施態様は、本明細書に記載のアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせてがんの治療に使用するための、本明細書に記載のＣＳＦ－１Ｒである。

本発明の一実施態様において、がんは固形腫瘍である。

本発明の別の好ましい実施態様において、がんは、メラノーマ、結腸直腸がん又は中皮腫である。

本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん（bronchioloalviolar cell lung cancer）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚メラノーマ又は眼球内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（上記がんの難治性型、又は上記がんの一若しくは複数の組合せを含む）であり得る。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、結腸直腸がん、メラノーマ、頭頚部がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、卵巣がん，子宮頚がん、肺がん又は前立腺がんである。別の好ましい実施態様では、そのようながんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頚部がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃がん（gastric carcinoma cancer）、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫である。好ましい一実施態様では、そのようながんは、ＣＳＦ－１又はＣＳＦ－１Ｒの発現又は過剰発現によって更に特徴付けられる。本発明の更なる実施態様は、原発腫瘍及び新規転移の同時治療における使用のための、本発明のＣＳＦ－１Ｒ抗体である。したがって本発明の別の実施態様は、歯周炎、ヒスチオサイトーシスＸ、骨粗鬆症、骨ページェット病（ＰＤＢ）、がん治療に起因する骨損失、人工関節周囲骨溶解、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、炎症性関節炎、及び炎症の治療における使用のための、本発明のＣＳＦ－１Ｒ抗体である。

本明細書に記載の抗体は、好ましくは組換え手段により製造される。そのような方法は、当該技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核又は真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又は大腸菌細胞において実施され、抗体は、これらの細胞から（上清から又は細胞溶解後に）リカバリーされる。

抗体の組換え製造は、当該技術分野でよく知られており、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説記事に記載されている。

抗体は、全細胞中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製されたか若しくは実質的に純粋な形態中に存在し得る。精製は、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術により除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。

ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）は、Schlaeger, E.-J.及びChristensen, K.によるCytotechnology 30 (1999) 71-83、並びにSchlaeger, E.-J.によるJ. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。

本発明の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列及び転写終結配列と組み合わせたものである。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターに組み込まれ、宿主細胞にコトランスフェクト、連続トランスフェクト又は別々にトランスフェクトされ、その後融合されて、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。

原核生物に適切な制御配列は、例えばプロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されており、又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合は、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続していて、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーといった一般的な免疫グロブリン精製手順により、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として機能し得る。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、その後、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞中にトランスフェトされ、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、すべてのそのような名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。また、計画的な又は偶然の突然変異に起因してすべての子孫がＤＮＡ量において厳密に同一でなくてもよいことが理解される。元々の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。

別の態様において、本発明は、組成物、例えば薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体若しくはそれらの抗原結合部分のうちの一つ又は組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する、あらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。

本発明の組成物は、当該技術分野において知られている多様な方法により投与され得る。当業者により認識されているように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化するものである。

薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。水の他に、担体は、例えば等張緩衝生理食塩水とすることができる。

選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。

本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく（有効量）、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために、多様であってよい。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態及び既往歴を含む種々の薬物動態因子、並びに医学の技術分野において良く知られている同様の因子に依存するであろう。

用語「治療方法」又はこれと同義の用語は、例えばがんに適用される場合、患者におけるがん細胞の数を減少若しくは消滅させるように、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は一連の行為を指す。がん又は他の増殖性疾患の「治療方法」は、がん細胞若しくは他の疾患が実際に取り除かれること、細胞の数若しくは疾患が実際に低減されること、又はがん若しくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。がんの治療方法はしばしば、成功の可能性が低くても実施されるであろうが、それは、患者の病歴及び推定余命を考慮して、それでも全体的に有益な作用過程を誘導するとみなされている。

用語「と組み合わせて投与される」又は「共投与」、「共投与すること」、「併用療法」又は「併用治療」は、本明細書に記載の抗ＣＳＦ－１Ｒ及び、例えば別個の製剤／用法として（又は１つの製剤／用法として）、本明細書に記載のアゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体からなる群より選択されるマクロファージ活性化物質の投与を指す。共投与は、同時でも、任意の順序で逐次的であってもよく、双方（又はすべて）の活性物質がその生物活性を各治療サイクル内で同時に発揮する時間があり、その治療サイクルでは、本明細書に記載の抗ＣＳＦ－１Ｒと、本明細書に記載のアゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体からなる群より選択されるマクロファージ活性化物質の双方が共投与され、かつ、抗ＣＳＦ１Ｒ治療なしの更なる各治療サイクルにおいて、ＣＳＦ１Ｒ抗体の生物活性が全く発揮されない時間があり、血清中の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）及び／又はその前駆体ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のレベルがリカバリーしている（例えば抗ＣＳＦ－１Ｒ治療前の元のレベルの約８０％まで）。共投与は、同時又は、連続的注入によって逐次的（例えば静脈内注射（ｉ．ｖ．））である。一実施態様では、共投与は、同時である。一実施態様では、共投与は、逐次的である。共投与は、同時又は逐次的（例えば連続的注入による静脈内注射（ｉ．ｖ．））である。

それぞれの化合物の量又は併用量が研究者、獣医、医師又はその他の臨床家が求める組織、系、動物若しくはヒトの生物学的又は医学的奏功を引き出す量である「治療的有効量」（又は単に「有効量」）で抗体が患者に投与されることは、自明である。

共投与の量及び共投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重など）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度に依存する。前記抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と更なる作用物質は、単回で、又は一連の治療にわたって、例えば同日又は翌日、患者に適切に共投与される。

アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わされる抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体に加えて、化学療法剤も投与され得る。

一実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体及び、本明細書に記載のアゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と共に投与され得るこのような追加の化学療法剤には、限定されないが、アルキル化剤を含む抗悪性腫瘍剤（ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルを含む）；ニトロソウレア、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）；テモダール（商標）（テモゾロマイド）、エチレンイミン／メチルメラミン、例えばトリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン；トリアジン、例えばダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸アナログ（例えばメトトレキサート及びトリメトレキサート）、ピリミジンアナログ（例えば５－フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２’－ジフルオロデオキシシチジン）、プリンアナログ（例えば６－メルカプトプリン、６－チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｍｎｅ）、アザチオプリン、Ｔ－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）を含む代謝拮抗剤；パクリタキセル、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン及びビノレルビンを含む）、タキソテール、エストラムスチン及びエストラムスチンホスフェート等の有糸分裂阻害剤を含む天然物；ピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ及びアクチノマイシン；酵素、例えばＬ－アスパラギナーゼ；生物学的応答調節剤、例えばインターフェロン－アルファ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ；白金配位錯体（例えばオキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン）、置換尿素（例えばヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含む）、副腎皮質抑制剤（例えばミトタン（ｏ，ｐ－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド）を含む様々な薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（例えばプレドニゾンとその同等物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミド）を含むホルモン及びアンタゴニスト；ジェムザール（商標）（ゲムシタビン）、プロゲスチン（例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール）；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド；並びに非ステロイド性抗アンドロゲン（例えばフルタミド）が含まれる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばビダーザ）及び転写抑制解除（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティック機構を標的とする療法も、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばパクリタキセル（タキソール））、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ）等）、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）及び他の多種キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、及びビンブラスチンからなる群より選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ）等）からなる群より選択される。一実施態様では、追加的化学療法剤は、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。好ましい一実施態様では、抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と共に追加的化学療法剤を投与することはない。

追加的化学療法剤との併用療法の特定の例は、例えば、乳がんの治療のためにタキサン（例えばドセタキセル又はパクリタキセル）又は修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）を用いる療法；卵巣がんのためにカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾されたドキソルビシン（カエリクス又はドキシル）），又はトポテカン（ハイカムチン）を用いる療法；腎臓がんの治療のために多種キナーゼ阻害剤（ＭＫＩ）（スーテント、ネクサバール又は７０６）及び／又はドキソルビシンを用いる療法；扁平上皮がんの治療のためにオキサリプラチン、シスプラチン及び／又は放射線を用いる療法；肺がんの治療のためにタキソール及び／又はカルボプラチンを用いる療法を含む。

したがって、一実施態様では、追加的化学療法剤は、乳がんの治療のためのタキサン（ドセタキセル又はパクリタキセル又は修飾されたパクリタキセル（アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブの群から選択される。

好ましい一実施態様では、抗ＣＤ４０抗体と組み合わせて抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と共に追加的化学療法剤を投与することはない。

以下では、本発明の特定の実施態様について説明する。

１Ａ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であって、
この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
かつ、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、抗体。

１Ｂ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であって、
この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、抗体。

１Ｃ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体であって、
この抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、抗体。

２．
実施態様１Ａ又は１Ｂ又は１Ｃに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

３．
実施態様１又は２の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、治療サイクルの長さが２‐４週間（好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが１８‐２４日間、及び別の好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが（約）３週間）である、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

４．
実施態様１－３のいずれか一つにおける使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、６００－１２００ｍｇの用量（一実施態様では７５０－１１００ｍｇの用量；一実施態様では７５０－１０００の用量；実施態様では９００－１０００ｍｇ；一実施態様では７５０；一実施態様では９００；一実施態様では１０００）で投与される、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

５．
実施態様１－４のいずれか一つにおける使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体であり、かつ、各サイクルに４－１６ｍｇの用量（一実施態様では８－１６ｍｇの用量）で投与される、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

６．
実施態様１－４のいずれか一つにおける使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体であり、かつ、各サイクルに１１００－１３００ｍｇの用量（一実施態様では１２００の用量）で投与される、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

７．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、併用療法が腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためのものである、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

８．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、併用療法がＴ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

９．
実施態様１から８のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１０．
実施態様１－５、７－９のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体である、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１１．
実施態様１１に記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アゴニストＣＤ４０抗体が
配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１２．
実施態様１－４、６－９のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体である、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１３．
実施態様１２に記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体が
配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１４．
実施態様１－４、７－９のいずれか一つに記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、マクロファージ活性化物質がＴＬＲ９アゴニストである、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

１５．
実施態様１４に記載の治療における使用のための抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
ＴＬＲ９アゴニストが、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体。

以下では、本発明の特定の実施態様について説明する。

１Ａ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
かつ、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、薬学的組成物又は医薬。

１Ｂ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、薬学的組成物又は医薬。

１Ｃ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、薬学的組成物又は医薬。

２．
実施態様１Ａ又は１Ｂ又は１Ｃに記載の薬学的組成物又は医薬であって、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、薬学的組成物又は医薬。

３．
実施態様１又は２に記載の薬学的組成物又は医薬であって、治療サイクルの長さが２‐４週間（好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが１８‐２４日間、及び別の好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが（約）３週間）である、薬学的組成物又は医薬。

４．
実施態様１－３のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量（一実施態様では７５０－１１００ｍｇの用量；一実施態様では７５０－１０００の用量；実施態様では９００－１０００ｍｇ；一実施態様では７５０；一実施態様では９００；一実施態様では１０００）で投与される、薬学的組成物又は医薬。

５．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体であり、かつ、各サイクルに４－１６ｍｇの用量（一実施態様では８－１６ｍｇの用量）で投与される、薬学的組成物又は医薬。

６．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体であり、かつ、各サイクルに１１００－１３００ｍｇの用量（一実施態様では１２００の用量）で投与される、薬学的組成物又は医薬。

７．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、併用療法が腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためのものである、薬学的組成物又は医薬。

８．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、併用療法がＴ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである、薬学的組成物又は医薬。

９．
実施態様１から８のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む、薬学的組成物又は医薬。

１０．
実施態様１－５、７－９のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体である、薬学的組成物又は医薬。

１１．
実施態様１０に記載の薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アゴニストＣＤ４０抗体が
配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、薬学的組成物又は医薬。

１２．
実施態様１－４、６－９のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体である、薬学的組成物又は医薬。

１３．
実施態様１３に記載の薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体が
配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、薬学的組成物又は医薬。

１４．
実施態様１－４、７－９のいずれか一つに記載の薬学的組成物又は医薬であって、マクロファージ活性化物質がＴＬＲ９アゴニストである、薬学的組成物又は医薬。

１５．
実施態様１４に記載の薬学的組成物又は医薬であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
ＴＬＲ９アゴニストが、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である、薬学的組成物又は医薬。

以下では、本発明の特定の実施態様について説明する。

１Ａ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
のための医薬の製造における、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
かつ、後続の治療サイクルは、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、使用。

１Ｂ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
のための医薬の製造における、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、使用。

１Ｃ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
のための医薬の製造における、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択されるマクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、使用。

２．
実施態様１Ａ又は１Ｂ又は１Ｃに記載の使用であって、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、使用。

３．
実施態様１又は２に記載の使用であって、治療サイクルの長さが２‐４週間（好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが１８‐２４日間、及び別の好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが（約）３週間）である、使用。

４．
実施態様１－３のいずれか一つに記載の使用であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量（一実施態様では７５０－１１００ｍｇの用量；一実施態様では７５０－１０００の用量；実施態様では９００－１０００ｍｇ；一実施態様では７５０；一実施態様では９００；一実施態様では１０００）で投与される、使用。

５．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の使用であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体であり、かつ、各サイクルに４－１６ｍｇの用量 （一実施態様では８－１６ｍｇの用量）で投与される、使用。

６．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の使用であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体であり、かつ、各サイクルに１１００－１３００ｍｇの用量（一実施態様では１２００の用量）で投与される、使用。

７．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の使用であって、併用療法が腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためのものである、使用。

８．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の使用であって、併用療法がＴ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものある、使用。

９．
実施態様１から８のいずれか一つに記載の使用であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む、使用。

１０．
実施態様１－５、７－９のいずれか一つに記載の使用であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体である、使用。

１１．
実施態様１０に記載の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アゴニストＣＤ４０抗体が
配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、使用。

１２．
実施態様１－４、６－９のいずれか一つに記載の使用であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体である、使用。

１３．
実施態様１２に記載の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体が
配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、使用。

１４．
実施態様１－４、７－９のいずれか一つに記載の使用であって、マクロファージ活性化物質がＴＬＲ９アゴニストである、使用。

１５．
実施態様１４に記載の使用であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
ＴＬＲ９アゴニストが、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である、使用。

以下では、本発明の特定の実施態様について説明する。

１Ａ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体（の有効量）を投与することを含む治療方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択される（有効量の）マクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
かつ、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、治療方法。

１Ｂ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体（の有効量）を投与することを含む治療方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択される（有効量の）マクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、治療方法。

１Ｃ．
ａ） がんの治療；又は
ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者の治療
における使用のための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体（の有効量）を投与することを含む治療方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体の群から選択される（有効量の）マクロファージ活性化物質と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がマクロファージ活性化物質との組み合わせでのみ投与される（一実施態様ではリカバリーは６０％超、一実施態様では８０％超）、治療方法。

２．
実施態様１Ａ又は１Ｂ又は１Ｃに記載の方法であって、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体はマクロファージ活性化物質と組み合わせて２サイクル毎（一実施態様では３サイクル毎）にしか投与されないが、マクロファージ活性化物質は各治療サイクルで投与される、方法。

３．
実施態様１又は２に記載の方法であって、治療サイクルの長さが２‐４週間（好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが１８‐２４日間、及び別の好ましい一実施態様では、治療サイクルの長さが（約）３週間）である、方法。

４．
実施態様１－３のいずれか一つに記載の方法であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量（一実施態様では７５０－１１００ｍｇの用量；一実施態様では７５０－１０００の用量；実施態様では９００－１０００ｍｇ；一実施態様では７５０；一実施態様では９００；一実施態様では１０００）で投与される、方法。

５．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の方法であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体であり、かつ、各サイクルに４－１６ｍｇの用量（一実施態様では８－１６ｍｇの用量）で投与される、方法。

６．
実施態様１－４のいずれか一つに記載の方法であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体であり、かつ、各サイクルに１１００－１３００ｍｇの用量（一実施態様では１２００の用量）で投与される、方法。

７．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の方法であって、併用療法が腫瘍免疫などの免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためである、方法。

８．
実施態様１から６のいずれか一つに記載の方法であって、併用療法がＴ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである、方法。

９．
実施態様１から８のいずれか一つに記載の方法であって、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含む、方法。

１０．
実施態様１－５、７－９のいずれか一つに記載の方法であって、マクロファージ活性化物質がアゴニストＣＤ４０抗体である、方法。

１１．
実施態様１０に記載の方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アゴニストＣＤ４０抗体が
配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、方法。

１２．
実施態様１－４、６－９のいずれか一つに記載の方法であって、マクロファージ活性化物質がアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体である、方法。

１３．
実施態様１２に記載の方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
アンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体が
配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、方法。

１４．
実施態様１－４、７－９のいずれか一つに記載の方法であって、マクロファージ活性化物質がＴＬＲ９アゴニストである、方法。

１５．
実施態様１４に記載の方法であって、
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が
配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含み、かつ、
ＴＬＲ９アゴニストが、ａ）シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）ｂ）ピリミジン－リン酸－グアノシン（ＹｐＧ）モチーフ（ＹｐＧ ＯＤＮ）又はｃ）シトシン－リン酸－プリン（ＣｐＲ）モチーフ（ＣｐＲ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド（好ましくはシトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ（ＣｐＧ ＯＤＮ）を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）である、方法。

［抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体とマクロファージ活性化アゴニストＣＤ４０抗体の併用］
実施例１Ａ：抗ＣＳＦ－Ｒ抗体＋マクロファージ活性化アゴニストＣＤ４０抗体の相乗的な効力（図１）

メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより入手）に、１０^６個のＭＣ３８結腸直腸腺癌腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長曲線をキャリパー測定によりモニターし、腫瘍サイズが平均２５０ｍｍ^３に達したら、以下を用いる治療のために群を分けた。
ａ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｂ） 抗ＣＤ４０抗体：４ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ２ａ抗体、クローンＦＧＫ４５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｃ） 抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体：３０ｍｇ／ｋｇハムスター－マウスキメラ抗体クローン２Ｇ２（Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）；又は
ｄ） 抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせ：：併用、同時治療、投与量はｂ）及びｃ）のとおり。

抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体又はそれぞれのＩｇＧ１コントロール抗体は、腫瘍が完全に退行するまで又は動物が終了基準に達するまで毎週投与したが、抗ＣＤ４０抗体は一度だけ、１０日目に抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と同時に投与した。全体的な試験デザインを図１Ａに示す。

図１Ｂは、腫瘍体積が≧７００ｍｍ^３に達するまでの無増悪生存期間を示し、ＣＳＦ－１ＲとＣＤ４０抗体の併用治療の相乗的な抗腫瘍効果を実証している。抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と抗ＣＤ４０抗体の組み合わせで治療され、原発腫瘍の拒絶後少なくとも３０日間無腫瘍であったマウスの反対側の脇腹への皮下接種によって、５ｘ１０^６個のＭＣ３８を再チャレンジした。図１Ｃは、抗ＣＤ４０抗体と組み合わせた抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体で以前に治療されたマウスの再チャレンジが、ナイーブマウスと比較して、急速な腫瘍拒絶をもたらしたことを示す。実際、２回目の腫瘍注射後２１日目までに、以前に併用治療された８頭すべてのマウスが無腫瘍であった。これらの結果は、抗ＣＳＦ－１Ｒと抗ＣＤ４０抗体の併用治療が腫瘍細胞特異的免疫応答を誘発し得ることを示している。

実施例１Ｂ：抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ１Ｒ抗体の併用治療前のＣＤ８α陽性Ｔ細胞の枯渇は、抗ＣＳＦ－Ｒ抗体と、アゴニストＣＤ４０抗体のようなマクロファージ活性化剤との相乗効果を無効にする（図２）。

メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより入手）に、１０^６個のＭＣ３８結腸直腸腺癌腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長曲線をキャリパー測定によりモニターし、腫瘍サイズが平均１９０ｍｍ^３に達したら、以下の枯渇抗体を用いる治療のためにマウスを分けた。
ａ） 抗ＣＤ８α抗体；４ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ２ａ、クローン５３－６．７（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｂ） 抗ＣＤ４抗体；４ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ２ｂ、クローンＧＫ１．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；又は
ｃ） 抗ＮＫ１．１抗体；４ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ２ａ、クローンＰＫ１３６（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；

抗ＣＤ８α、抗ＣＤ４及び抗ＮＫ１．１抗体を用いたリンパ球の枯渇は、腫瘍サイズが平均１９０ｍｍ^３に達したときに開始した。抗体は２日ごとに４回与えられた。２～３回の枯渇抗体投与の間に、動物をさらに以下で治療した。
ｄ） ビヒクルコントロール：０．９％ナトリウム生理食塩水（枯渇抗体単独コントロール）、又は
ｅ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｆ） 抗ＣＤ４０抗体：４ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ２ａ抗体、クローンＦＧＫ４５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｇ） 抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせ：３０ｍｇ／ｋｇハムスター－マウスキメラ抗体クローン２Ｇ２（Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）；

抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体又はそれぞれのＩｇＧ１コントロール抗体は、腫瘍が完全に退行するまで又は動物が終了基準に達するまで毎週投与したが、抗ＣＤ４０抗体は一度だけ、１１日目に抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体と同時に投与した。全体的な試験デザインを図２Ａに示す。

図２Ｂは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の枯渇が抗ＣＤ４０及びＣＳＦ－１Ｒ腫瘍担持マウスの生存に対する有益な効果の消滅をもたらすことを示す。ＣＤ４陽性Ｔ細胞もＮＫ１．１発現ＮＫ細胞も枯渇していないため、これらのマウスの生存に影響を与えなかった。これは、細胞傷害性Ｔ細胞応答がこの組み合わせで治療されたマウスにおいて開始されることをはっきり示す。注目すべきことに、ＣＤ４陽性細胞を枯渇させ、かつ抗ＣＤ４０単独で治療したマウスの生存は、他のリンパ球サブタイプを枯渇させたマウスと比較して、顕著に改善された（１０頭中４頭のマウスが無腫瘍）。このことは、抑制性ＣＤ４陽性Ｔ細胞（例えば制御性Ｔ細胞）もまた、抗ＣＤ４０治療の際にＭＣ３８腫瘍担持マウスの全生存に悪影響を及ぼすことを示し得る。

実施例１Ｃ：抗ＣＳＦ－Ｒ抗体と、アゴニストＣＤ４０抗体などのマクロファージ活性化物質との相乗的な効力は、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）の存在に依存する（図３）。

１０^６個のＭＣ３８結腸直腸腺癌腫瘍細胞を用いて、メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより入手）に皮下接種した。腫瘍成長曲線をキャリパー測定によりモニターし、前治療を３日目に開始した。動物を以下の抗体による前治療のために分けた。

ａ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、完全Ｆｃコンピテント抗体）；又は
ｂ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体のＦｃ ｄｅａｄ（ＦｃO）変異体：３０ｍｇ／ｋｇヒトＩｇＧ１、 抗ジゴキシゲニン （米国特許出願公開第２０１２／０２５１５３１号）；又は
ｃ） 抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体Ｆｃ ｄｅａｄ（ＦｃO）変異体：３０ｍｇ／ｋｇハムスター－ヒトキメラ抗体、ヒトＩｇＧ１ ＰＧ ＬＡＬＡ ＦｃOのクローン２Ｇ２のＣＤＲ（Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）（ロッシュの特許 米国特許出願公開第２０１２／０２５１５３１号）

効果の読み出しのため、腫瘍接種後３日目及び９日目に、マウスにいずれかの抗体（ａ－ｃ）を腹腔内注射し、その後腫瘍サイズ（平均１２０ｍｍ^３）で更にマウスを分け、１１日目に以下の抗体で治療した。
ｄ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｅ） 抗ＣＤ４０抗体：４ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ２ａ抗体、クローンＦＧＫ４５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｆ） 抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせ（３０ｍｇ／ｋｇハムスター－マウスキメラ抗体クローン２Ｇ２：Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）

併用治療のために、動物を抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体で一度だけ同時に治療した。全体的な試験デザインを図３Ａに示す。

フローサイトメトリー：前治療群当たり４頭のマウスの腫瘍について、フローサイトメトリーを用い、コンビナトリアル治療の投与前、１１日目にＴＡＭ枯渇に対する効果を決定した。完全ＦｃコンピテントＣＳＦ－１Ｒ抗体（クローン２Ｇ２、３日目及び９日目の治療、３０ｍｇ／ｋｇ；Ries et al. Cancer Cell 2014, 25:846-859）による治療は、陽性コントロールとして機能した。フローサイトメトリー分析のために腫瘍を収集し、ＤＰＢＳ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃Ｐ０４－３６５００）中３７℃で３０分間、ディスパーゼＩＩ（最終１ｍｇ／ｍｌ、ロッシュ＃０４９４２０７８００１）、コラゲナーゼＩＶ（最終１ｍｇ／ｍｌ、シグマアルドリッチ＃Ｌ５１３８）及びＤＮＡｓｅＩ（最終０．０１％；ロッシュ＃１１２８４９３２００１）を用いる．機械的破砕によって消化した。４０μｍ細胞ストレーナー（ＥＡＳＹｓｔｒａｉｎｅｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃５４２ ０４０）で単細胞懸濁液を流し、細胞を洗浄した後、Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ Ｂｕｆｆｅｒを用い、製造業者の説明書（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５８９９５）に従って赤血球を除去した。最後に、細胞（２ｘ１０^６）を１２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ＋５％ＦＳＣ（Ｇｉｂｃｏ、＃１０５００－０３８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５５７５－０３８））に再懸濁させ、Ｆｃブロック抗体（クローン ２．４Ｇ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５３１４２）を用いて５分間インキュベートした後、以下の抗体を添加し、氷上で３０分間インキュベートし、再度洗い流した。

死細胞を除外するために、ＤＡＰＩ（ロッシュ、＃１０２３６２７６００１）をＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）でのデータ取得の前に加えた。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０を用いてデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０７を用いて統計的に評価した。

抗ＣＳＦ－１Ｒと抗ＣＤ４０抗体の併用効果（実施例１Ａ参照）が実際にマクロファージに依存していることを示すために、併用療法を適用する前にＴＡＭを枯渇させた。抗ＣＤ４０抗体の機能は、ＦｃＲＩＩｂ（Li & Ravetch, Science 2011, 333:1030-1034; White et al. Journal of Immunology 2001, 187:1754-63; Richmann & Vonderheide, Cancer Immunology Research 2013, 2: 19-26）を介した架橋に依存し、前治療中に３０ｍｇ／ｋｇ のマウスＩｇＧ１（アイソタイプ又は抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体）を使用する場合、ブロックされる可能性がある。したがって、Ｆｃ受容体機能を欠く抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体（ＦｃO変異体）及びアイソタイプコントロールを前治療に使用した。このＦｃO抗体変異体を用いてＴＡＭの枯渇を確認するために、フローサイトメトリー分析を１１日目に追加の動物の腫瘍に対して行った。ＴＡＭは、ＤＡＰＩ^－ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^ｈｉｇｈＬｙ６Ｇ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗのマーカーの組み合わせによって同定された。図３Ｂに示すように、抗ＣＳＦ－１Ｒ ＦｃO変異体は、それぞれのＦｃコンピテント及びＦｃサイレント抗体変異体で２回処理した後にＴＡＭを枯渇させるのと同程度有効である。

抗ＣＤ４０抗体又は抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせのいずれかによる治療前のＴＡＭの枯渇前生存試験の結果を図３Ｃに示す。抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ－１Ｒの併用治療の前のＣＳＦ－１Ｒ ＦｃO抗体を用いたＴＡＭの枯渇は、コントロールの前治療と比較して、併用療法の生存利益を完全に無効にした（試験終了時点で、マウス１０頭中、無腫瘍はゼロ）。アイソタイプコントロールによる担腫瘍マウスの前治療は、ＣＤ４０／ＣＳＦ－１Ｒの組み合わせで治療した場合、マウス１０頭中７頭が腫瘍を完全に拒絶した。これらの結果は、抗ＣＤ４０及び抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体治療の併用の効果促進におけるマクロファージの重要な役割を明確に示している。

実施例１Ｄ： ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達遮断は、強力な炎症誘発性表現型への腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）のＣＤ４０ ｍＡｂ制御された極性化(CD40 mAb-regulated polarization）を増加させる（図４）。

メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）に、１０^６個のＭＣ３８結腸直腸腺がん腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長曲線をキャリパー測定によりモニターし、腫瘍サイズが平均２２０ｍｍ^３に達したら、以下を用いる治療のために群を分けた。
ａ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｂ） 抗ＣＤ４０抗体：４ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ２ａ抗体、クローンＦＧＫ４５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｃ） 抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体：３０ｍｇ／ｋｇハムスター－マウスキメラ抗体クローン２Ｇ２（Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）；又は
ｄ） 抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせ：：併用、同時治療、投与量はｂ）及びｃ）のとおり。

すべての抗体を１回投与し、１６時間後に腫瘍を得た。細胞選別のために、フローサイトメトリーについて実施例１Ｃに記載のとおりに腫瘍を処置し、染色した。ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ機器（ＢＤバイオサイエンス）を用いて１群当たり４頭の動物から細胞を選別し、図４Ａに示すように選別のためにゲートした。以下の３つの異なる骨髄細胞集団が得られた（１試料当たり最小１０，０００個の細胞が選別された）：
ａ） 単球性ＭＤＳＣ（骨髄由来サプレッサー細胞）：
ＣＤ４５^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ Ｆ４／８０^ｌｏｗ Ｌｙ６Ｇ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ} Ｌｙ６Ｃ^ｈｉｇｈ
ｂ） ＴＡＭ前躯体：
ＣＤ４５^＋ ＣＤ１１ｂ^＋ Ｆ４／８０^ｌｏｗ Ｌｙ６Ｇ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ} Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗ
ｃ） ＴＡＭ（腫瘍随伴マクロファージ）：ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^ｈｉｇｈＬｙ６Ｇ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}Ｌｙ６Ｃ^ｌｏｗ

ＲＮＡ配列解析が選別された細胞集団に対して実施され、生データはLangmead, B. & Salzberg, S.L., Nat Methods 9 (2012) 357-359; Mortazavi, A. et al., Nat Methods 5 (2008) 621-628の研究に記載された方法に基づいて社内ツールを用いて処理され、各処置群からの各細胞集団中の各遺伝子について正規化した遺伝子発現値を得た。

得られた遺伝子発現値について、一般的に利用可能なツールを用いてシグネチャー解析を実施した（Sandmann, T. et al., Bioinformatics 30 (2014) 127-128）。結果は、他の処置群と比較した処置群のシグネチャーによって表される経路又は表現型の活性化レベル又は可能性レベルを表すウィルコクソン／マン・ホイットニーの順位和統計である。各処置群について３回の比較を行った。例えば抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の併用処置群を抗ＣＤ４０、抗ＣＳＦ－１Ｒ及びＩｇＧアイソタイプコントロール群に対して個別に比較した。

シグネチャーとは、目的の生物学的表現型を特徴付けることを意図した化学的又は遺伝的摂動実験のバイオインフォマティクス分析から通常決定される機能的に関連する遺伝子セット、例えば異なるマクロファージサブタイプ（Ｍ１対Ｍ２）又はＬＰＳ刺激マクロファージ対非刺激マクロファージである。ＬＰＳ、インターフェロン又はｔＴＮＦ刺激を含む、様々な細胞型（例えば免疫細胞、がん細胞、乳腺上皮細胞）の８８個のシグネチャーを使用して、一般的な免疫活性化効果を調べた。８８個のシグネチャーはすべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅから得られた（MSigDB, Subramanian A. et al., PNAS 102 (2005) 15545-50）。７つのシグネチャーを使用してＭ１／Ｍ２表現型を調べたが、これら７つのうちの３つは公表されている研究（Schmieder A. et al., Semin Cancer Biol. 22(4) (2012) 289-97; Martinez F.O. et al., Blood121(9): (2013) e57-69）から得られ、４つはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイチップ上でプロファイリングされたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージの遺伝子発現データを用いて、ロッシュにおいて生成された。

図４Ｂは、非コントロール治療群（横の列）及び骨髄細胞集団（縦の列）のそれぞれについての分析結果を要約したものである。「Ｘ」は、治療群についての３つの比較すべてにわたって顕著な又は一貫した活性化／阻害がないことを示す。全体としては、３つの非コントロール治療のうち、抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせが、分析時点で３つの骨髄サブタイプすべてにおける活性化Ｍ１様効果（上部パネル）及び３つの骨髄サブタイプすべてにおける一般的な免疫活性化様効果（底部パネル）を明確に誘導する唯一の治療である。

実施例１Ｅ： ＣＤ４０及びＣＳＦ－１ＲはヒトＴＡＭによって発現される（ＩＲＩＳ ＩＨＣ）（図５）。

患者試料を、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、中皮腫及びトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）からの２．５μｍホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に切断した。切片を、ＮＥＸＥＳバージョン１０．６ソフトウェアを使用しＶｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴで、ＦＯＸＰ３（１μｇ／ｍＬ、２３６Ａ／Ｅ７、Ａｂｃａｍ ａｂ２００３４）、ＣＤ６８（ＲＴＵ、ＫＰ－１、ベンタナ・メディカル・システムズ、７９０－２９３１）と二重でＣＤ４０（１：１００、スプリングバイオサイエンス、Ｅ３７０４）、ＣＤ１６３ （ＲＴＵ、ＭＲＱ－２６、ベンタナ・メディカル・システムズ、７６０－４４３７）及びＣＳＦ１Ｒ（１μｇ／ｍＬ、２９、ロシュ・ダイアゴノスティックス株式会社）についてＩＨＣプロトコールを用いて染色した。

切片を、３２分間のＣＣ１（トリスベースの細胞コンディショニング１）処理、続いて抗体インキュベーション（ＦＯＸＰ３：３７℃で１時間、ＣＤ４０：３７℃で３２分間、ＣＤ６８：３７℃で３２分間、ＣＤ１６３：３７℃で１６分間、ＣＳＦ１Ｒ：３７℃で３２分間）に供し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ（ＦＯＸＰ３、ＣＤ４０、ＣＳＦ１Ｒ）検出システム又はｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢ（ＣＤ１６３）又はＲｅｄ（ＣＤ６８）検出システムを用いて陽性染色を検出した。スライドは、Ｖｅｎｔａｎａ ｉＳｃａｎ ＨＴ明視野スキャナーを使用して２０倍でスキャンし、グループスパースモデル（group sparsity model）（Chen and Chukka, doi:10.1016/j.compmedimag.2015.04.001）に基づくアルゴリズムを使用し、ボード認定の病理学者によって分析された。

異なるバイオマーカーの得られた密度値は、それぞれの間で対で相関していた。得られた相関係数を図５のヒートマップに視覚化し、異なるマーカー間の関係を簡単に概観できるようにした。赤のフィールドは正の相関を示し、青のフィールドは負の相関を示す。とりわけＣＳＦ１Ｒ陽性細胞の密度は、ＣＤ４０^＋／ＣＤ６８^＋細胞と正の相関があり、中皮腫及びＣＲＣサブセットにおいて顕著に観察されたこれらのマーカーの潜在的な共発現を示している。一方、ＴＮＢＣサブセットでは顕著な相関は見られなかった。（図５）

実施例１Ｆ ＣＤ４０とＣＳＦ－１Ｒの組み合わせは、前臨床マウスモデルにおいて耐容性が良い（図６）。

メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６－８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手）に、１０^６個のＭＣ３８結腸直腸腺がん腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍成長曲線をキャリパー測定によりモニターし、腫瘍サイズが平均２６０ｍｍ^３に達したら、以下を用いる治療のために群を分けた。
ａ） ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：３０ｍｇ／ｋｇマウスＩｇＧ１、クローンＭＯＰＣ－２１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｂ） 抗ＣＤ４０抗体：４ｍｇ／ｋｇラットＩｇＧ２Ａ抗体、クローンＦＧＫ４５（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）；又は
ｃ） 抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体：３０ｍｇ／ｋｇハムスター－マウスキメラ抗体クローン２Ｇ２（Ries et al., Cancer Cell 25:846-859, 2014）；又は
ｄ） 抗ＣＤ４０抗体と抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の組み合わせ：：併用、同時治療、投与量はｂ）及びｃ）のとおり。

すべての抗体を１１日目に１回投与し、動物の体重を表示した時点で測定した。平均±ＳＥＭを、１群当たりｎ＝５～１０頭のマウスから計算した。

抗ＣＤ４０療法単独では一過性の体重減少が誘導されたが、これは抗ＣＤ４０と抗ＣＳＦ１Ｒの組み合わせと同等であった。１７日目（治療開始後６日目）、抗ＣＤ４０、抗ＣＳＦ－１Ｒ又はＩｇＧコントロール治療動物と比較して、体重の差は検出されなかった（図６）。

実施例１Ｇ： ＣＤ４０アゴニストなどのマクロファージ活性化物質と組み合わせた、ＣＳＦ１Ｒ療法の持続性から一過性の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）枯渇への移行（図７及び８）
探索的コホートＱ６Ｗにおけるエマクツズマブ（Ｉｇ１カッパ定常ドメインとして、配列番号５及び配列番号７のＶＨ及びＶＬを含む抗ＣＳＦＲ抗体）の用量及びスケジュールの根拠
代替の治療スケジュールは、エマクツズマブ投与によるマクロファージの最初の減少の後にマクロファージの再増殖が有益であるかどうかを調査することを目的としている。前臨床モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで最大の効力を発揮するマクロファージ依存性を明らかにした。マクロファージの再増殖を可能にするためには、エマクツズマブのＱ６Ｗ投与スケジュールがテストされるであろう。このプロトコールでは、全体的な曝露に対する体表面積（ＢＳＡ）又は体重の影響が大きいとは考えられないため、固定（フラット）投与が選択されている。

腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）の代わりに、血清中の前駆体ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球が測定されるが、それは、この血中単球のリカバリーがその後の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）のリカバリーと相関するためである。

薬力学的モデルを、現在利用可能なヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球データにフィットさせた。予備集団分析に基づくと、Ｑ６Ｗで投与される７５０ｍｇの用量は、Ｑ６Ｗの投与間隔の終わりに向かってＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球のリカバリーを示す（～７日）（図５）。この推定単球リカバリーは、エマクツズマブの線状ＰＫの喪失及びＱ６Ｗの投与間隔の終わりに向かっての目標飽和度の減少とも一致している（図７）。

研究ＢＰ２７７７２のＰＫ分析（１００－３０００ｍｇ Ｑ２Ｗ；患者Ｎ=３６）のＰＫ分析に基づくと、エマクツズマブのＰＫは、１００～９００ｍｇ Ｑ２Ｗまで非線形であることが示された。Ｃ_ｍａｘとＡＵＣの双方とも、同じ用量範囲での総クリアランスの減少を伴って、用量比例増加よりも大きな増加を示したが、これは、エマクツズマブの消失がこれらの用量で達成された曝露において主に標的介在性であることを示している。９００ｍｇを超えると、曝露はおよそ３０００ｍｇまで用量比例的に増加したが、これは、標的介在性消失が飽和したことを示す。

線形と非線形双方のクリアランス経路を含む２コンパートメントＰＫモデルを、現在利用可能なヒトのデータに当てはめた。非線形クリアランス経路が治療開始時の受容体の標的レベルに関連している可能性があり、ＴＭＤＤを表すと見なすことができる。２コンパートメントモデルにおける非線形消失は、標的介在性消失の飽和を予測するのにも使用可能である（目標飽和度の代わり）。ＡＵＣ_ｌａｓｔ及びＣＬは、総ＣＬに対するＴＭＤＤの寄与が６００ｍｇの用量で減少し始め、９００ｍｇ以上の用量で最小に達することを示すが、これは、≧９００ｍｇの用量が≧９０％の目標飽和度に達したことを示す（Ｑ２Ｗ）（図８）。

マクロファージの用量／全身曝露依存性の減少が２００ｍｇ以降から皮膚及び腫瘍生検において観察され、これはＣ_ａｖｅ １００μｇ／ｍＬからプラトーに達し、単剤療法の用量及びパクリタキセルとの併用での用量である≧９００ｍｇにほぼ相当した。単球及びＣＳＦ－１レベルなど、追加の末梢血バイオマーカーも調べた。これらの末梢血バイオマーカーの用量／曝露傾向は、組織バイオマーカー（マクロファージ）と同様であり、≧９００ｍｇでプラトーに達した。現在までに入手可能なデータに基づくと、マクロファージの最大枯渇を達成するためには≧９０％の目標飽和度が求められるであろう。

結腸直腸がん（ＣＲＣ）又はメラノーマ（ＭＥＬ）患者を試験する（ｎ＝５０まで）。この研究は、より長い投与間隔を有するエマクツズマブの代替投与スケジュールを試験して、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体エマクツズマブによる最初の減少後のマクロファージ前駆体単球及び関連するマクロファージの再増殖を可能にすることによって、前駆単球及び関連するマクロファージリカバリーを調べる２ステップアプローチで行われる。

ステップ１ａ（導入）では、（試験の第Ｉ部に記載のＭＴＤの）アゴニストＣＤ４０抗体Ｑ３Ｗ及びエマクツズマブＱ６Ｗ（７５０ｍｇ）で治療された最初の１０名の患者は、最初のエマクツズマブ注入から６週間後のＴＡＭ、皮膚マクロファージ及び循環単球の潜在的リカバリーについて分析される。エマクツズマブの開始用量７５０ｍｇ Ｑ６Ｗは、臨床モデリングに基づいて決定された。

ｎ＝１０の評価可能な対腫瘍生検においてＴＡＭがリカバリーしなかった場合、追加のｎ＝１０名の患者において第２の用量又は投与スケジュールを試験することができる（ステップ１ｂ）。第２の用量及び投与スケジュールは、用量漸増コホート及び進行中の用量拡大コホートの新たなデータから選択される。

エマクツズマブ注入後６週間でＴＡＭのリカバリーが観察された場合、最大で３０名の患者がこの拡大コホートにさらに勧誘される（ステップ２）。用量及びスケジュールの最初の適応後にＴＡＭのリカバリーが観察されなかった場合、この研究は中止される。

実施例１Ｈ： 抗腫瘍活性という意味での臨床有効性は以下のように評価される。

・最良総合効果
・部分奏効率と完全奏効率の合計として定義される全奏効率（ＯＲＲ）。初回文書化の４週間以上後に繰り返し評価して確認される。
・無増悪生存期間（ＰＦＳ）：最初の試験治療から最初の疾患の進行又は死亡のいずれか先に発生した方までの期間として定義される。
・応答持続時間（ＤＯＲ）：文書化された他覚症状が発生してから、何らかの原因による進行又は死亡のいずれか先に発生した方までの時間として定義される。
・臨床的有用率（ＣＢＲ）：部分奏効率＋完全奏効率＋病勢安定率として定義される。

最良総合効果、他覚症状及び疾患の進行は、治験責任医師の評価、並びに従来のＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１及び改訂版ＲＥＣＩＳＴ判断基準の双方を用いた中央審査によって決定される。利用可能であれば、最新の（サイクル１の１日目の６か月前まで）試験前コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン（過去のＣＴスキャン）の任意選択の提出が強く勧奨される。このスキャンを試験中に収集したスキャンと比較して、長期的な腫瘍増殖動態を決定する。

Claims (10)

1. ａ） がんを治療するための；又は
   ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者を治療するための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む医薬であって、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
   かつ、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がアゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて２サイクル毎にのみ投与され、一方、アゴニストＣＤ４０抗体は各治療サイクルで投与され、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量で投与され、かつ、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、医薬。
2. ａ） がんを治療するための；又は
   ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者を治療するための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む医薬であって、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
   それに続いて、血清中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋陽性単球の顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がアゴニストＣＤ４０抗体との組み合わせでのみ投与され、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量で投与され、かつ、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、医薬。
3. ａ） がんを治療するための；又は
   ｂ） ＣＳＦ－１Ｒ発現マクロファージ浸潤を伴う腫瘍を有する患者を治療するための、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含む医薬であって、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、アゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて第１の治療サイクルで投与され、
   それに続いて、ＣＤ１６３＋／ＣＤ６８＋陽性腫瘍随伴マクロファージの顕著なリカバリー後に、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がアゴニストＣＤ４０抗体との組み合わせでのみ投与され、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が６００－１２００ｍｇの用量で投与され、かつ、
   抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、医薬。
4. 請求項１又は２又は３のいずれか一項に記載の医薬であって、後続の治療サイクルで、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体がアゴニストＣＤ４０抗体と組み合わせて２サイクル毎にのみ投与され、一方、アゴニストＣＤ４０抗体は各治療サイクルで投与される、医薬。
5. 治療サイクルの長さが２～４週間である、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬。
   
6. アゴニストＣＤ４０抗体が各サイクルに４－１６ｍｇの用量で投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬。
7. 併用療法が免疫関連疾患の治療又は進行遅延における使用のためのものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬。
8. 併用療法が免疫応答又は機能の刺激における使用のためのものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬。
9. 抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体が、
   ａ） 配列番号１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｂ） 配列番号３の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号４の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｃ） 配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｄ） 配列番号７の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号８の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｅ） 配列番号９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１０の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
   請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬。
10. アゴニストＣＤ４０抗体が配列番号１１の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１２の軽鎖可変ドメインＶＬを含む、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬。

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