術語「巨噬細胞活化」指例如能夠分泌大範圍之生物活性化合物(諸如若干促炎性細胞介素)的巨噬細胞之刺激及共刺激表面分子、增強的抗原呈現或與活化相關之其他表面標記物之表現。 根據本發明之「巨噬細胞活化劑」係選自CD40促效劑、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群。 「具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤」係指包含腫瘤細胞及浸潤CSF-1R表現腫瘤相關巨噬細胞(TAM)或組織常駐巨噬細胞之異質腫瘤。 量測血清中之前驅體人類CD14+CD16+(陽性)單核球作為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之替代物，因為此血液單核球之恢復與後續腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之恢復相關。如本文所使用之術語「在血清中之CD14+CD16+陽性單核球顯著恢復之後(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)」係指 例如在一實例1B中，已使藥力學模型適合人類CD14+CD16+單核球資料。基於初步種群分析，以750 mg之劑量投與的Q6W顯示CD14+CD16+單核球之恢復朝向。 由於使用抗CSF-1R抗體之第一次治療導致血清中之腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及其前驅體人類CD14+CD16+(陽性)單核球之極大減少/清除，選擇治療週期之長度以提供足夠時間使得達成與腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之後續恢復相關的此人類CD14+CD16+(陽性)單核球血液單核球之顯著恢復，以致TAM不持續清除。而且與CD40促效劑之組合治療可發揮其強協同抗腫瘤功效。 CSF-1R係由CSF-1R基因編碼的蛋白質。其控制M2巨噬細胞之生成、分化及功能，其繼而支持腫瘤生長及轉移形成且分泌免疫抑制細胞介素，在患者中導致較差預後。另外，已顯示在若干人類癌症(諸如卵巢及乳癌)中CSF-1R陽性巨噬細胞之存在不僅與血管密度增加相關而且與較差臨床結果相關。選擇性抑制M2類似TAMs之CSF-1R抑制劑已在臨床前模型中證明有活性(DeNardo, D.等人，Cancer Discovery 1 (2011) 54-67；Lin, E.等人，J. Exp. Med. 193 (2001) 727-740)。CSF-1R活性之阻斷引起TAM之募集減少，且與化學療法組合，協同作用造成腫瘤生長及轉移負荷減少。近期資料已顯示在患有PVNS及TGCT之患者中，偵測到CSF-1之過度表現且其部分由CSF-1R基因之移位而介導(West, R.B.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 (2006) 690-695)。在乳癌中，CSF-1反應基因印記(gene signature)之存在預測復發及轉移之風險(Beck, A.等人，Clin. Cancer Res. 3 (2009) 778-787)。 許多腫瘤之特徵在於顯著免疫細胞(包括巨噬細胞)浸潤。起初認為免疫細胞係抗腫瘤防禦機制之部分，但近期資料支持若干免疫細胞群，包括巨噬細胞，實際上可促進腫瘤進展之觀點。巨噬細胞之特徵為其可塑性。根據細胞介素微環境，巨噬細胞可呈現所謂的M1或M2亞型。M2巨噬細胞參與腫瘤免疫性之抑制。其亦在組織修復功能，諸如血管形成及組織重構，中起重要作用，其由腫瘤收編(coopted)以支持生長。與促進腫瘤之M2巨噬細胞對比，M1巨噬細胞經由分泌發炎細胞介素展現抗腫瘤活性且其參與抗原呈現及噬菌作用(Mantovani, A.等人，Curr. Opin. Immunol. 2 (2010) 231-237)。 藉由分泌諸如群落刺激因子1 (CSF-1)及IL-10之各種細胞介素，腫瘤細胞能夠募集且將巨噬細胞塑造為M2亞型，而藉由分泌諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之細胞介素，IFN-γ將巨噬細胞定向為M1亞型。使用免疫組織化學，有可能區分共表現CD68與及CD163之巨噬細胞亞群，其可能富集M2巨噬細胞，且顯示CD68+/MHC II+或CD68+/CD80+免疫表型之子集可能包括M1巨噬細胞。CD68及CD163陽性巨噬細胞之細胞形狀、大小及空間分佈與公開的關於M2巨噬細胞例如藉由其在中之較佳位置及活腫瘤區域來促進腫瘤之作用的假說一致。相比而言，普遍存在CD68+/MHC類II+巨噬細胞。其在噬菌作用方面之假設作用由CD68+/MHC類II+之團簇反映而非接近凋亡細胞及壞死腫瘤區域之CD163免疫表型。 不同巨噬細胞亞群之亞型及標記物表現與其功能狀態有關。M2巨噬細胞可支持腫瘤形成，其藉由： a) 經由分泌血管形成因子，諸如VEGF或bFGF，來增強血管形成， b) 經由分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases；MMP)、生長因子及引導腫瘤細胞至血流且建立轉移生態位之遷移因子來支持轉移形成(Wyckoff, J.等人，Cancer Res. 67 (2007) 2649-2656)， c) 藉由分泌諸如IL-4、Il-13、IL-1ra及IL-10之免疫抑制細胞介素，其繼而調節T調節性細胞功能，來發揮建立免疫抑制環境之作用。相反，已顯示CD4陽性T細胞在臨床前模型中增強腫瘤促進巨噬細胞之活性(Mantovani, A.等人，Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667；DeNardo, D.等人，Cancer Cell 16 (2009) 91-102)。 相應地，已認為若干癌症類型(例如乳癌、卵巢癌、霍奇金氏淋巴瘤)中M2亞型腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之發病率與較差預後有關(Bingle, L. 等人，J. Pathol. 3 (2002) 254-265；Orre, M.及Rogers, P.A., Gynecol. Oncol. 1 (1999) 47-50；Steidl, C.等人，N. Engl. J. Med. 10 (2010) 875-885)。近期資料顯示腫瘤中之CD163陽性巨噬細胞浸潤與腫瘤級別之相關性(Kawamura, K.等人，Pathol. Int. 59 (2009) 300-305)。自患者腫瘤分離之TAM具有耐受性表型且對腫瘤細胞無細胞毒性(Mantovani, A.等人，Eur. J. Cancer 40 (2004) 1660-1667)。然而，在非小細胞肺癌中，在細胞毒性T細胞存在下TAM之浸潤與提高的存活相關，且因此反映出在此腫瘤類型中之更顯著M1巨噬細胞浸潤(Kawai, O.等人，Cancer 6 (2008) 1387-1395)。 CSF-1R屬於受體酪胺酸激酶之III類子族且由c-fms原癌基因編碼。CSF-1或IL-34之結合誘導受體二聚，隨後自體磷酸化且下游傳信級聯活化。CSF-1R之活化調節單核球及巨噬細胞之存活、增殖及分化(Xiong, Y.等人，J. Biol. Chem. 286 (2011) 952-960)。 除衍生自與巨噬細胞相同之造血前驅體的單核球的譜系之細胞及蝕骨細胞之外，亦發現CSF-1R/c-fms由若干人類上皮癌症(諸如卵巢及乳癌)表現且在平滑肌肉瘤及TGCT/PVNS中表現，儘管以相比於巨噬細胞較低之表現量。正如TGCT/PVNS之情況，已認為在卵巢癌患者之血清以及腹水中提高的CSF-1、CSF-1R之配位體之量與較差預後相關(Scholl, S.等人，Br. J. Cancer 62 (1994) 342-346；Price, F.等人，Am. J. Obstet. Gynecol. 168 (1993) 520-527)。另外，CSF 1R之組成活性突變形式能夠轉型NIH3T3細胞，此為致癌基因之特性之一(Chambers, S., Future Oncol 5 (2009) 1429-1440)。 自1986年起已已知人類CSF-1R (CSF-1受體；同義詞：M-CSF受體；巨噬細胞群落刺激因子1受體、Fms原癌基因、c-fms、SEQ ID NO:24)(Coussens, L.等人，Nature 320 (1986) 277-280)。CSF-1R係生長因子且由c-fms原癌基因編碼(經評述於例如Roth, P.及Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 (1992) 141-167中)。 CSF-1R係CSF-1R配位體CSF-1 (巨噬細胞群落刺激因子，亦稱作M-CSF)(SEQ ID No:28)及IL-34(SEQ ID No:29)之受體且調節此等細胞介素之生物作用(Sherr, C.J.,等人，Cell 41 (1985) 665-676；Lin, H.等人，Science 320 (2008) 807-811)。群落刺激因子1受體(亦稱作c-fms)之選殖第一次經描述於Roussel, M.F.等人，Nature 325 (1987) 549-552中。在該公開案中展示CSF-1R具有依賴於蛋白質之C-末端尾端中之變化的轉型潛能，其包括結合Cbl且從而調節受體衰減性調節之抑制性酪胺酸969磷酸化之缺失(Lee, P.S.等人，Embo J. 18 (1999) 3616-3628)。 CSF-1R係單鏈的跨膜受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase；RTK)且係含有免疫球蛋白(Ig)基元的RTK家族之成員，其由受體之胞外域(ECD)中之5個重複Ig類子域D1至D5表徵 (Wang, Z.等人，Molecular and Cellular Biology 13 (1993) 5348-5359)。人類CSF-1R胞外域(CSF-1R-ECD)(SEQ ID NO:25)包含全部五個Ig類胞外子域D1至D5。人類CSF-1R片段D1至D3 (SEQ ID NO:26)包含各別子域D1至D3。序列以不含訊息肽之形式列出。人類CSF-1R片段D4至D5 (SEQ ID NO: 27)包含各別子域D4至D5。 目前已知兩種結合於CSF-1R之胞外域的CSF-1R配體。第一種係CSF-1 (群落刺激因子1，亦稱作M-CSF，巨噬細胞；人類CSF-1，SEQ ID NO:28)且作為二硫鍵連接的均二聚體發現於胞外(Stanley, E.R等人，Journal of Cellular Biochemistry 21 (1983) 151-159；Stanley, E.R.等人，Stem Cells 12 Suppl. 1 (1995) 15-24)。第二種係IL-34 (人類IL-34；SEQ ID NO: 29)(Hume, D. A.等人，Blood 119 (2012) 1810-1820)。因此在一個實施例中術語「CSF-1R配位體」係指人類CSF-1 (SEQ ID NO:28)及/或人類IL-34 (SEQ ID NO:29)。 通常使用人類CSF-1之活性149胺基酸(aa)片段(SEQ ID NO:28之aa 33-181)用於實驗。人類CSF-1活性之此149 aa片段(SEQ ID NO:28之aa 33-181)包含於CSF-1之全部3個主要形式中且足以介導與CSF-1R之結合(Hume, D. A.等人，Blood 119 (2012) 1810-1820)。 CSF-1R傳訊之主要生物作用係對巨噬細胞譜系(包括蝕骨細胞)之造血前驅體細胞之分化、增殖、遷移及存活。CSF-1R之活化係藉由其CSF-1R配位體、CSF-1 (M-CSF)及IL-34介導。CSF-1 (M-CSF)結合於CSF-1R誘導均二聚體之形成及藉由酪胺酸磷酸化之激酶之活化(Li, W.等人，EMBO Journal.10 (1991) 277-288；Stanley, E.R.等人，Mol. Reprod. Dev. 46 (1997) 4-10)。 如本文所用，「結合於人類CSF-1R」或「特異性結合於人類CSF-1R」或「結合於人類CSF-1R之」或「抗CSF-1R抗體」係指抗體以1.0 × 10
- 8
mol/l或更低之K
D
值，在一個實施例中，以1.0 × 10
- 9
mol/l或更低之K
D
值的結合親和力特異性結合於人類CSF-1R抗原。結合親和力由標準結合分析確定，諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)。因此，如本文所使用之「結合於人類CSF-1R之抗體」係指抗體以1.0 × 10
- 8
mol/l或更低(在一個實施例中1.0 × 10
- 8
mol/l-1.0 × 10
- 13
mol/l)之K
D
，在一個實施例中以1.0 × 10
- 9
mol/l或更低(在一個實施例中1.0 × 10
- 9
mol/l-1.0 × 10
- 13
mol/l)之K
D
的結合親和力特異性結合於人類CSF-1R抗原。 在一個實施例中，用於本文所述之組合療法之結合於人類CSF-1R之抗體選自由以下組成之群： hMab 2F11-c11、hMab 2F11-d8、hMab 2F11-e7、hMab 2F11-f12及hMab 2F11-g1。 此等抗體描述於WO2011/070024中且其特徵為包含如本文所描述之以下VH及VL序列：
表 1 ：
描述於本發明中之此等抗CSF-1R抗體結合於人類CSF-1R之胞外域，在一個實施例中結合於構成受體二聚界面之膜鄰近域D4及D5。 在一個實施例中其結合於域D1至D3。在一個實施例中，用於本文所描述之組合療法的結合於人類CSF-1R之抗體揭示於WO 2009/026303、WO 2009/112245、WO2011/123381、WO2011/140249、WO2012/110360中(其全部以引用之方式併入)。 描述於本發明中之抗CSF-1R抗體阻斷CSF-1、IL-34介導的以及配位體獨立的受體活化，其導致誘導在CSF-1存在下活體外分化的類M2巨噬細胞之細胞凋亡同時避開GM-CSF分化的類M1巨噬細胞。在人類乳癌組織中，M2(CD68+/CD163+)巨噬細胞與CSF 1R表現巨噬細胞係共定位的。 CD40抗原係屬於腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor Receptor；TNF-R)家族之50 kDa細胞表面糖蛋白。(Stamenkovic等人，EMBO J. 8:1403-10 (1989)。) CD40在許多正常細胞類型及腫瘤細胞類型中表現，包括B淋巴細胞、樹狀細胞、單核球、巨噬細胞、胸腺上皮、內皮細胞、纖維母細胞及平滑肌細胞。(Paulie S.等人，Cancer Immunol. Immunother. 20:23-8 (1985)；Banchereau J.等人，Adv. Exp. Med. & Biol. 378:79-83 (1995)；Alderson M. R.等人，J. of Exp. Med. 178:669-74 (1993); Ruggiero G.等人，J. of Immunol. 156:3737-46 (1996)；Hollenbaugh D.等人，J. of Exp. Med. 182:33-40 (1995)；Yellin M. J.等人，J. of Leukocyte Biol. 58:209-16 (1995)；及Lazaar A. L.等人，J. of Immunol. 161:3120-7 (1998)。) CD40在所有B淋巴瘤中及70%之所有實體腫瘤中表現。儘管CD40係組成性表現的，其在抗原呈現細胞中由成熟訊號，諸如LPS、IL-1β、IFN-γ及GM-CSF上調。 CD40活化在調節體液及細胞免疫反應方面發揮重要作用。無CD40活化之抗原呈現可導致耐受，而CD40傳訊可逆轉此類耐受，藉由所有抗原呈現細胞(antigen presenting cells；APC)增強抗原呈現，引起輔助細胞介素及趨化介素之分泌，增加共刺激分子表現及傳訊，且刺激免疫細胞之溶胞活性。CD40在B細胞增殖、成熟及類別轉換方面發揮決定性作用。(Foy T. M.等人，Ann. Rev. of Immunol. 14:591-617 (1996)。) CD40傳訊路徑之干擾引起異常血清免疫球蛋白同型分佈、CD4+ T細胞啟動之缺失及二級體液反應中之缺陷。舉例而言，X性聯高IgM症候群係與人類CD40L基因之突變相關之疾病，且其表徵為受影響個體不能產生除IgM同型抗體之外抗體，表明有效免疫反應需要CD40與CD40L之間之生產性相互作用。 藉由CD40L之CD40參與引起CD40細胞質域與TNF-R相關因子(TNF-R associated factors；TRAF)之關聯。(Lee H. H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1421-6 (1999)；Pullen S. S.等人，Biochemistry 37:11836-45 (1998)；Grammar A. C.等人，J. of Immunol. 161:1183-93 (1998)；Ishida T. K.等人，Proc. Acad Acad. Sci. USA 93:9437-42 (1996)；Pullen S. S.等人，J. of Biol. Chem. 274:14246-54 (1999))。與TRAF之相互作用可在活化NFkappa B及Jun/AP1路徑方面達到頂點。(Tsukamoto N.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1234-9 (1999)；Sutherland C. L.等人，J. of Immunol. 162:4720-30 (1999)。) 根據細胞類型，此傳訊引起增強的細胞介素分泌，諸如IL-6(Jeppson J. D.等人，J. of Immunol. 161:1738-42 (1998)；Uejima Y.等人，Int. Arch. of Allergy & Immunol. 110:225-32, (1996))、IL-8 (Gruss H. J.等人，Blood 84:2305-14 (1994)；von Leoprechting A.等人，Cancer Res. 59:1287-94 (1999)；Denfeld R. W.等人，Europ. J. of Immunol. 26:2329-34 (1996))、IL-12 (Cella M.等人，J. of Exp. Med. 184:747-52 (1996)；Ferlin W. G.等人，Europ. J. of Immunol. 28:525-31 (1998)；Armant M.等人，Europ. J. of Immunol. 26:1430-4 (1996)；Koch F.等人，J. of Exp. Med. 184:741-6 (1996)；Seguin R.及L. H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179:467-74 (1999)；Chaussabel D.等人，Infection & Immunity 67:1929-34 (1999))、IL-15 (Kuniyoshi J. S.等人，Cellular Immunol. 193:48-58 (1999))及趨化介素(MIP1α、MIP1β、RANTES及其他)(McDyer J. F.等人，J. of Immunol. 162:3711-7 (1999)；Schaniel C.等人，J. of Exp. Med. 188:451-63 (1998)；Altenburg A.等人，J. of Immunol. 162:4140-7 (1999)；Deckers J. G.等人，J. of the Am. Society of Nephrology 9:1187-93 (1998))；增加的I類及III類MHC表現(Santos-Argumedo L.等人，Cellular Immunol. 156:272-85 (1994))；及增加的黏著分子(例如ICAM)表現(Lee H. H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1421-6 (1999)；Grousson J.等人，Archives of Dermatol. Res. 290:325-30 (1998)；Katada Y.等人，Europ. J. of Immunol. 26:192-200 (1996)；Mayumi M.等人，J. of Allergy & Clin. Immunol. 96:1136-44 (1995)；Flores-Romo L.等人，Immunol. 79:445-51 (1993))及共刺激分子(例如B7)表現(Roy M.等人，Europ. J. of Immunol. 25:596-603 (1995)；Jones K. W.及C. J. Hackett, Cellular Immunol. 174:42-53 (1996)；Caux C.等人，Journal of Exp. Med. 180:1263-72 (1994)；Kiener P. A.等人，J. of Immunol. 155:4917-25 (1995))。由CD40參與誘導的細胞介素增強T細胞存活及活化。 除增強細胞及免疫功能之外，CD40活化之作用包括：藉由趨化介素及細胞介素之細胞募集及分化；單核球之活化；溶胞T淋巴細胞(cytolytic T lymphocyte；CTL)及自然殺手(natural killer；NK)細胞之溶胞活性增加；CD40陽性腫瘤中之細胞凋亡之誘導；CD40陽性腫瘤之免疫原性之增強；及腫瘤特異性抗體產生。亦已充分建立CD40活化在細胞介導免疫反應方面之作用，且其評述於以下中：Grewal等人，Ann. Rev. of Immunol. 16:111-35 (1998)；Mackey等人，J. of Leukocyte Biol. 63:418-28 (1998)；及Noelle R. J., Agents & Actions -- Suppl. 49:17-22 (1998)。 使用交叉啟動模型系統之研究顯示APC之CD40活化可替代用於溶胞T淋巴細胞(CTL)生成之輔助T細胞需求。(Bennett等人，Nature 393:478-480 (1998)。)來自CD40L缺乏小鼠之證據顯示輔助T細胞激活中對CD40傳訊之明顯需求。(Grewal I. S.等人，Science 273:1864-7 (1996)；Grewal I. S.等人，Nature 378:617-20 (1995)。) CD40活化另外轉化耐受性抗原攜帶B細胞為勝任APC。(Buhlmann J. E.等人，Immunity 2:645-53 (1995)。) CD40活化誘導帶狀血液先驅細胞之成熟及分化為樹狀細胞。(Flores-Romo L.等人，J. of Exp. Med. 185:341-9 (1997)；Mackey M. F.等人，J. of Immunol. 161:2094-8 (1998)。) CD40活化亦誘導單核球分化為功能樹狀細胞。(Brossart P.等人，Blood 92:4238-47 (1998)。) 此外，CD40活化經由APC-CD40誘導的細胞介素增強NK細胞之溶胞活性(Carbone E.等人，J. of Exp. Med. 185:2053-60 (1997)；Martin-Fontecha A.等人，J. of Immunol. 162:5910-6 (1999))。此等觀察表明，藉由誘導APC之成熟、分泌輔助細胞介素、上調共刺激分子及增強效應功能，CD40在啟動及增強免疫反應方面發揮主要作用。 CD40傳訊在體液及細胞毒性免疫反應之啟動及成熟中之決定性作用使得此系統成為用於免疫增強之理想目標。此類增強對於建立對腫瘤抗原之有效免疫反應可為尤其重要，其通常經由活化APC之交叉啟動呈現於免疫系統。(Huang A. Y.等人，Ciba Foundation Symp. 187:229-44 (1994)；Toes R. E. M.等人，Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998)；Albert M. L.等人，Nature 392:86-9 (1998)；Bennett S. R.等人，J. of Exp. Med. 186:65-70 (1997)。) 多個研究組已展示CD40活化用於活體外及活體內抗腫瘤反應之效果。(Toes R. E. M.等人，Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998)。) 兩個研究組，使用腎細胞癌及皮下腫瘤之肺轉移模型藉由經病毒轉型細胞已分別展示CD40活化可逆轉對腫瘤特異性抗原之耐受而導致T細胞之有效抗腫瘤啟動。(Sotomayor E. M.等人，Nature Medicine 5:780-787 (1999)；Diehl L.等人，Nature Medicine 5:774-9 (1999)。) 藉由在SCID小鼠中之人類乳癌株模型中之CD40L及抗CD40抗體治療，亦報導了無免疫細胞存在下之抗腫瘤活性。(Hirano A.等人，Blood 93:2999-3007 (1999)。) 近期顯示藉由抗CD40抗體之CD40活化在小鼠模型中根除CD40+及CD40-淋巴瘤。(French R. R.等人，Nature Medicine 5:548-53 (1999)。) 此外，由Glennie及同事之先前研究得出結論，藉由抗CD40抗體之傳訊活性在誘導活體內腫瘤清除方面比其他能夠募集效應子之抗表面標記物抗體更有效。(Tutt A. L.等人，J. of Immunol. 161:3176-85 (1998)。與此等觀測結果一致，當測試抗CD40抗體活體內抗CD40+腫瘤細胞之活性時，大多數但並非全部之腫瘤破壞活性與CD40傳訊相關而非ADCC。(Funakoshi S.等人，J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996)。) 在另一研究中，骨髓樹狀細胞經各種試劑活體外處理且測試活體內抗腫瘤活性。此等研究展示CD40L刺激的DC係建立抗腫瘤反應之最成熟且最有效細胞。 藉由對比野生型及CD40-/-小鼠對腫瘤疫苗之反應，亦已展示CD40在抗腫瘤免疫性中之主要作用。此等研究顯示CD40-/-小鼠不能實現在正常小鼠中觀測到之腫瘤免疫性。(Mackey M. F.等人，Cancer Research 57:2569-74 (1997)。) 在另一研究中，來自攜帶腫瘤的小鼠之脾細胞經腫瘤細胞刺激且經活化抗CD40抗體活體外處理，且顯示增強腫瘤特異性CTL活性。(Donepudi M.等人，Cancer Immunol. Immunother. 48:153-164 (1999)。) 此等研究展示CD40在CD40陽性及陰性腫瘤中之抗腫瘤免疫性中佔據決定性位置。由於CD40在淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、大部分之鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌及肝臟癌及一些乳癌及結腸直腸癌中表現，CD40之活化可具有大範圍臨床應用。 如本文所使用之「CD40促效劑」包括促效CD40/CD40L相互作用之任何部分。如在此上下文中所使用之CD40較佳指人類CD40，因此CD40促效劑較佳為人類CD40之促效劑。典型地此等部分將係「促效性CD40抗體」或「促效性CD40L多肽」。此等抗體包括例如尤其促效CD40/CD40L結合相互作用之人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體、scFv及抗體片段。在一個較佳實施例中，促效性CD40抗體將包含嵌合的完全人類或人類化的CD40抗體。在另一較佳實施例中，促效性CD40抗體將包含嵌合的完全人類或人類化的CD40抗體。 「促效劑」與細胞上之受體組合且啟動與由受體之天然配位體啟動之類似或相同的反應或活性。「CD40促效劑」誘導任何或所有(但不限於)以下反應：B細胞增殖及/或分化；經由類似於ICAM-1、E-選擇蛋白、VC AM及類似者之分子的細胞間黏著之上調；諸如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF及類似者之促炎性細胞介素之分泌；經由CD40受體藉由路徑諸如TRAF(例如TRAF2及/或TRAF3)、諸如NIK (NF-kB誘導激酶)之MAP激酶、I-κ B (IKK/β)、轉錄因子NF-kB、Ras之路徑及MEK/ERK路徑、PI3K AKT路徑、P38 MAPK路徑及類似者之訊號轉導；藉由類似於XIAP、mcl-1、bcl-x及類似者之分子之抗凋亡信號之轉導；B及/或T細胞記憶體生成；B細胞抗體產生；II級MHC及CD80/86之B細胞同型轉換、細胞表面表現之上調及類似者。 促效活性預期為：如B細胞反應分析所量測，促效活性大於藉由負控制誘導之促效活性至少30%、10 35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。 在一個較佳實施例中，如B細胞反應分析所量測，CD40促效劑具有大於藉由負控制誘導之促效活性至少2倍或至少3倍之促效活性。 因此，例如，在所關注之B細胞反應為B細胞增殖之情況下，促效活性將誘導一定程度之B細胞增殖，即大於藉由負控制誘導之B細胞增殖之程度至少2倍或至少3倍。 在一個實施例中，不結合於CD40之抗體充當負控制。「無顯著促效活性」之物質，如B細胞反應分析所量測，將展現大於藉由負控制誘導之促效活性不超過約25%的促效活性，較佳大於藉由負控制誘導之促效活性不超過約20%、15%、10%、5%、1%、0.5%或甚至不超過約0.1%。 如本文所使用之「促效性CD40抗體」或「活化CD40抗體」或「促效性或活化抗CD40抗體」意謂結合於人類CD40且當添加至表現CD40之細胞、組織或生物中時使一或多種CD40活動增加至少約20%之抗體。在一些實施例中，抗體活化CD40活性至少40%、50%、60%、70%、80%、85%。 在一些實施例中，活化抗體在CD40L存在下添加。 在另一較佳實施例中，如下量測促效性CD40抗體之促效活性：
細胞株 Jy 之免疫原性藉由抗 CD40 抗體之增加
在RPMI培養基中培養且保持CD40陽性JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)(「Jy細胞」)。用本發明之抗CD40抗體(21.4.1)或同型匹配抗體(抗KLH)在完全RPMI培養基中培育JIYOYE細胞24小時。隨後將細胞洗滌且用25 mg絲裂黴素C (Sigma)/7 ml培養基處理60 min。隨後將此等細胞與經分離人類T細胞以1:100比率在37攝氏度(5% CO
2
)下一起培育6天。T細胞隨後經採集、洗滌，且測定抗新鮮鉻51 (New England Nuclear，Boston，Mass。)標記的JIYOYE細胞之CTL活性之水準。特異性CTL活性經計算為特定細胞溶解%=(細胞溶解Jy (cpm)-自發細胞溶解(cpm))/(總細胞溶解(cpm)-自發細胞溶解(cpm))。 在一個較佳實施例中，如本文所使用之促效性CD40抗體，如在活體外JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)分析中所量測(上述)，在CD40陽性JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)中增加免疫原性至少50%。 促效性CD40抗體在本文中又稱抗CD40活化抗體，其可經由若干重要機制促進腫瘤根除。首先在此等中係用於增強的腫瘤抗原處理及呈現之主體樹狀細胞之活化以及CD40陽性腫瘤細胞自身之增強的抗原呈現或免疫原性導致腫瘤特異性CD4+及CD8+淋巴細胞之活化。其他抗腫瘤活性可藉由CD40傳訊之其他免疫增強作用(趨化介素及細胞介素之產生、募集及活化單核球及增強的CTL及NK溶胞活性)以及藉由誘導細胞凋亡或藉由刺激引起ADCC之體液反應的CD40+腫瘤之直接殺滅來介導。凋亡腫瘤細胞及染色腫瘤細胞亦可成為藉由CD40活化APC處理且呈現之腫瘤特異性抗原之重要來源。 本發明描述一種結合人類CD40且充當CD40促效劑之經分離抗體或其抗原結合部分。 促效性CD40抗體描述於例如Beatty等人，Science 331 (2011) 1612-1616；R. H. Vonderheide等人，J Clin Oncol 25, 876 (2007)；Khalil, M等人，Update Cancer Ther. 2007 June 1; 2(2): 61-65中，作為模型抗體之促效劑CD40大鼠抗小鼠IgG2a mAb FGK45描述於S. P. Schoenberger等人，Nature 393, 480 (1998)中，小鼠交叉反應促效性CD40抗體殖株1C10描述於Santos-Argumedo L.等人，Cell Immunol. 156 (1994) 272-285及Heath AW等人Eur J Immunol 24 (1994) 1828-34中。 臨床試驗中之實例例如CP-870,893及達西珠單抗(dacetuzumab)(一種促效劑CD40抗體，CAS號880486-59-9，SGN-40；人類化S2C6抗體)(Khalil，M等人，Update Cancer Ther. 2007年6月1日；2(2): 61-65)。另一促效性抗體係ADC-1013，根據WO 2016/023960第54頁。 在一個較佳實施例中，促效性CD40抗體係由CP研發之完全人類IgG2促效性CD40抗體CP-870,893。其以3.48 × 10
- 10
M之KD結合人類CD40，但不阻斷CD40L之結合(參見例如，U.S.7,338,660或EP1476185，其中CP-870,893描述為抗體21.4.1)。CP-870,893 (7,338,660之抗體21.4.1) 之特徵為包含(a)重鏈可變域胺基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:11)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO:42)(b)輕鏈可變域胺基酸序列：DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCR ASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:12)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO:44)；及/或具有藉由具有美國菌種保存中心(American Type Culture Collection；ATCC)寄存編號PTA-3605的融合瘤21.4.1 製備之抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域胺基酸序列。達西珠單抗及其他人類化S2C6抗體描述於US 6,946,129及US 8,303,955中。 因而在一個較佳實施例中，用於與抗CSF-1R抗體之組合療法中之促效性CD40抗體之特徵為包含(a)重鏈可變域胺基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:11)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO:42)(b)輕鏈可變域胺基酸序列：DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:12)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO:44)；及/或具有藉由具有美國菌種保存中心(ATCC)寄存編號PTA-3605的融合瘤21.4.1 製備之抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域胺基酸序列。達西珠單抗及其他人類化S2C6抗體描述於US 6,946,129及US 8,303,955中。 在一個較佳實施例中，用於與抗CSF-1R抗體之組合療法中之促效性CD40抗體係人類化S2C6抗體。人類化S2C6抗體係例如基於鼠mAB S2C6之重鏈及輕鏈可變域之CDR1、CDR2及CDR3 (作為PTA-110儲存於ATCC)。鼠mAB S2C6之重鏈及輕鏈可變域之CDR1、CDR2及CDR3描述且揭示於US 6,946,129中。在一個實施例中促效性CD40抗體係達西珠單抗。在一個實施例中促效性CD40抗體之特徵為包含(a)重鏈可變域胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:13)(b)輕鏈可變域胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQ QKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:14)。 在一個實施例中促效性CD40抗體係人類抗體。如本文所使用，術語「人類抗體」意謂其中可變域及恆定域序列係衍生自人類序列之抗體。人類促效性CD40抗體詳細描述於WO 03/040170中，其整個揭示案在此以引用之方式併入。人類抗體於本發明之治療方法中提供實質性優點，因為預期其最小化與在人類患者中使用非人類抗體相關之免疫原性反應及過敏反應。 其他適用於本發明之例示性人類抗CD40抗體包括具有命名為 3.1.1、3.1.1 H-A78T、3.1.1 H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1 H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1、24.2.1、3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V及23.28.1L-C92A之抗體之胺基酸序列之抗體，其描述於WO03/040170中，以及包含例示性抗體中之任一者之CDR或可變區之抗體。 在本發明之一個實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類CSF-1R之抗體之特徵為包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL；且 用於組合療法之促效性CD40抗體之特徵為包含 a) SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL，或 在本發明之一個較佳實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類CSF-1R之抗體之特徵為包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 用於組合療法之促效性CD40抗體之特徵為包含 SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL。 在某些實施例中，癌症或腫瘤治療抑制癌細胞增殖、抑制或預防腫瘤重量或體積之增加及/或引起腫瘤重量或體積之降低。在一些實施例中，癌症治療延長患者存活期。在某些實施例中，相比於未經治療彼等，腫瘤生長得以抑制至少50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實施例中，癌症或腫瘤係CD40陽性的。 在本發明中，術語「CD40L」或此項技術中作為替代其已知之「CD154」包括所有哺乳動物(例如人類、大鼠、非人類靈長類、鼠) CD40L以及至少結合於相應哺乳動物CD40多肽(例如人類CD40)之片段、變異體、寡聚物及其共軛物。在本發明中經投與的CD40L可包含CD40L多肽或編碼該CD40L多肽之DNA。此類CD40L多肽及DNA尤其包括原生CD40L序列及如於Immunex美國專利第6,410,711號、美國專利第6,391,637號、美國專利第5,981,724號、美國專利第5,961,974號及美國公開申請案第20040006006號中所揭示之片段、變異體及其寡聚物，其專利及申請案之全部及其中所揭示之CD40L序列皆以全文引用之方式併入本文中。 根據本發明，CD40L多肽可用作CD40促效劑且尤其包含原生CD40L序列及如於Immunex美國專利第6,410,711號、美國專利第6,391,637號、美國專利第5,981,724號、美國專利第5,961,974號及美國公開申請案第20040006006號中所揭示之片段、變異體及其寡聚物，其專利及申請案之全部及其中所揭示之CD40L序列皆以全文引用之方式併入本文中。
PD-1/PD-L1/PD-L2 路徑 ：
重要陰性共刺激訊號調節T細胞活化藉由經程式化死亡-1受體(programmed death-1；PD-1)(CD279)及其結合搭配物PD-L1 (B7-H1，CD274；SEQ ID NO:31)及PD-L2 (B7-DC，CD273)之配位體提供。PD-1之陰性調節性作用藉由PD-1耗盡(Pdcd1-/-)顯示，其傾向於自體免疫。Nishimura等人，Immunity 11: 141-51 (1999)；Nishimura等人，Science 291: 319-22 (2001)。 PD-1與CD28及CTLA-4相關，但缺乏允許均二聚之膜鄰近半胱胺酸。PD-1之細胞質域含有基於免疫受體酪胺酸的抑制基元(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ITIM，V/IxYxxL/V)。PD-1僅結合於PD-L1及PD-L2。Freeman等人，J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000)；Dong等人，Nature Med. 5: 1365-1369 (1999)；Latchman等人，Nature Immunol. 2: 261-268 (2001)；Tseng等人，J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)。 PD-1可在T細胞、B細胞、自然殺手T細胞、活化單核球及樹狀細胞(dendritic cells；DC)上表現。PD-1由活化的但不經非刺激性人類CD4+及CD8+活化的T細胞、B細胞及骨髓細胞表現。此與更受限制的CD28及CTLA-4之表現相反。Nishimura等人，Int. Immunol. 8: 773-80 (1996)；Boettler等人，J. Virol. 80: 3532-40 (2006)。存在已經選殖於活化人類T細胞之至少4個PD-1變異體，其包括缺乏(i)外顯子2，(ii)外顯子3，(iii)外顯子2及3或(iv)外顯子2至4之轉錄本。Nielsen等人，Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)。除PD-1 Dex3之外，在靜息外周血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)中所有變異體均以與全長PD-1類似之水準表現。在用抗CD3及抗CD28活化人類T細胞時，顯著誘導所有變異體之表現。PD-1 Dex3變異體缺乏跨膜域，及相似於可溶CTLA-4，其在自體免疫中發揮重要作用。Ueda等人，Nature 423: 506-11 (2003)。此變異體富集於患有類風濕性關節炎之患者之滑液及血清中。Wan等人，J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)。 兩種PD-1配位體在其表現模式上不同。PD-L1組成性地表現在小鼠T細胞及B細胞、CD、巨噬細胞、間葉幹細胞及骨髓衍生的肥大細胞上。Yamazaki等人，J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)。PD-L1在大範圍非造血細胞(例如角膜、肺、血管上皮、肝臟非實質性細胞、間葉幹細胞、胰臟胰島、胎盤融合細胞滋養層、角質細胞等)上表現[Keir 等人，Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)]，且活化之後在多個細胞類型上上調。I型及II型干擾素IFN皆上調PD-L1。Eppihimer等人，Microcirculation 9: 133-45 (2002)；Schreiner等人，J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)。當MyD88、TRAF6及MEK受到抑制時，細胞株中之PD-L1表現降低。Liu等人，Blood 110: 296-304 (2007)。PD-L1誘導亦已涉及JAK2。Lee等人，FEBS Lett. 580: 755-62 (2006)；Liu等人，Blood 110: 296-304 (2007)。磷酸酯酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog；PTEN)，即一種調節磷脂醯肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase；PI3K)及Akt傳訊之細胞磷酸酯酶之缺失或抑制增加癌症中之後轉錄PD-L1表現。Parsa等人，Nat. Med. 13: 84-88 (2007)。 PD-L2表現比PD-L1更受限制。PD-L2誘導性地表現在DC、巨噬細胞及骨髓衍生的肥大細胞上。PD-L2亦表現在約一半至三分之二之靜息腹膜B1細胞上但不表現在習知B2B細胞上。Zhong等人，Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)。PD-L2+ B1細胞結合膽鹼磷脂且可能對抗細菌抗原之先天性免疫反應很重要。藉由IFN-γ之PD-L2誘導部分依賴於NF-κB。 Liang等人，Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)。PD-L2亦可藉由M-CF、IL-4及IFN-γ在單核球及巨噬細胞上誘導。Yamazaki等人，J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)；Loke等人，PNAS 100:5336-41 (2003)。 藉由在IFN-γ、TNF-α及IL-2產生方面之顯著作用，PD-1傳訊典型地在細胞介素生成方面比在細胞增殖方面具有更大作用。PD-1介導的抑制性傳訊亦取決於TCR傳訊之強度，其在較低水準之TCR刺激下提供更大抑制。 此降低可藉由經CD28共刺激[Freeman等人，J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)]或在IL-2之存在下共刺激[Carter等人，Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)]克服。 已有證據證明經由PD-L1及PD-L2之傳訊可為雙向的。亦即，除了調節TCR或BCR傳訊之外，亦可將傳訊輸送回表現PD-L1及PD-L2之細胞。雖然未發現自患有瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症之患者分離的具有天然人類抗PD-L2抗體之樹狀細胞之治療上調MHC II或B7共刺激分子，但是此類細胞確實產生更大量之促炎性細胞介素，尤其係TNF-α及IL-6，且刺激T細胞增殖。Nguyen等人，J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)。具有此抗體之小鼠之治療亦(1)增強對移植b16黑素瘤之抗性且快速誘導腫瘤特異性CTL。Radhakrishnan等人，J. Immunol. 170: 1830-38 (2003)；Radhakrishnan等人，Cancer Res. 64: 4965-72 (2004)；Heckman等人，Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)；(2)在過敏性哮喘之小鼠模型中阻斷呼吸道發炎疾病之發展。Radhakrishnan等人，J. Immunol. 173: 1360-65 (2004)；Radhakrishnan等人，J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)。 逆轉傳訊至樹狀細胞(「DC」)之進一步證據產生於使用可溶PD-1 (融合至Ig恆定區之PD-1 EC域-「s-PD-1」)培養骨髓衍生的DC之研究。 Kuipers等人，Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)。此sPD-1以經由抗PD-1之投與而達成可逆之方式抑制DC活化且增強IL-10產生。 此外，若干研究顯示一種獨立於PD-1之用於PD-L1或PD-L2的受體。 B7.1已經鑑定為用於PD-L1之結合搭配物。Butte等人，Immunity 27: 111-22 (2007)。化學交聯研究表明PD-L1及B7.1可經由其IgV類域相互作用。B7.1:PD-L1相互作用可誘導通向T細胞之抑制訊號。 藉由B7.1之PD-L1在CD4+ T細胞上之連接或藉由PD-L1之B7.1在CD4+ T細胞上之連接產生抑制訊號。當經抗CD3加B7.1塗佈的珠粒刺激時缺乏CD28及CTLA-4之T細胞顯示降低的增殖及細胞介素生成。在缺乏所有B7.1之受體(亦即CD28、CTLA-4及PD-L1)的T細胞中，T細胞增殖及細胞介素生成不再經抗CD3加B7.1塗佈的珠粒抑制。此表明在無CD28及CTLA-4存在下B7.1特異性地經由T細胞上之PD-L1起作用。相似地，當在抗CD3加PD-L1塗佈珠粒存在下刺激時，缺乏PD-1之T細胞顯示降低的增殖及細胞介素生成，在T細胞上展現PD-L1在B7.1上之連接之抑制作用。當T細胞缺乏所有已知PD-L1之受體時(亦即無PD-1及B7.1)，T細胞增殖不再經抗CD3加PD-L1塗佈的珠粒減弱。因此，PD-L1可在T細胞上經由B7.1或PD-1發揮抑制作用。 B7.1與PD-L1之間的直接相互作用表明目前對共刺激之理解不完全，且低估了此等分子在T細胞上之表現之重要性。PD-L1-/-T細胞之研究表明T細胞上之PD-L1可下調T細胞細胞介素生成。Latchman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)。因為PD-L1及B7.1皆在T細胞、B細胞、DC巨噬細胞上表現，存在在此等細胞類型上B7.1與PD-L1之間之定向相互作用的潛能。此外，在非造血細胞上之PD-L1可與B7.1相互作用以及與T細胞上之PD-1相互作用，提出PD-L1是否參與其調節之問題。對於B7.1:PD-L1相互作用之抑制作用的一個可能解釋係T細胞PD-L1可能自與CD28之相互作用中截留或分離出APC B7.1。 其結果為經由PD-L1之傳訊之拮抗，包括阻斷PD-L1與PD-1或B7.1或二者之相互作用，從而防止PD-L1傳送陰性共刺激訊號至T細胞及其他抗原呈現細胞可能增強對感染(例如急性及慢性)反應之免疫及腫瘤免疫性。此外，本發明之抗PD-L1抗體可與PD-P1:PD-L1傳訊之其他組分之拮抗劑，例如拮抗劑抗PD-1及抗PD-L2抗體組合。 術語「人類PD-L1」係指人類蛋白質PD-L1 (SEQ ID NO:31，典型地係PD-1傳訊)。如本文所使用，「結合於人類PD-L1」或「特異性結合於人類PD-L1」或「結合於人類PD-L1之」或「抗PD-L1抗體」或「拮抗性抗PD-L1」係指抗體以1.0 × 10
- 8
mol/l或更低之K
D
值，在一個實施例中，以1.0 × 10
- 9
mol/l或更低之K
D
值的結合親和力特異性結合於人類PD-L1抗原。 結合親和力由標準結合分析，諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)測定。因此，如本文所使用之「結合於人類PD-L1之抗體」係指抗體以1.0 × 10
- 8
mol/l或更低(在一個實施例中1.0 × 10
- 8
mol/l-1.0 × 10
- 13
mol/l)之K
D
，在一個實施例中以1.0 × 10
- 9
mol/l或更低(在一個實施例中1.0 × 10
- 9
mol/l-1.0 × 10
- 13
mol/l)之K
D
的結合親和力特異性結合於人類PD-L1抗原。 在一個實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類PD-L1之抗體係阿特珠單抗(atezolizumab)，其特徵為包含以下如本文所描述之VH及VL序列：
表 2 ：
在本發明之一個實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類CSF-1R之抗體之特徵為包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL；且 用於組合療法中之結合於人類PD-L1之抗體之特徵為包含 a) SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL，或 在本發明之一個較佳實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類CSF-1R之抗體之特徵為包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 用於組合療法中之結合於人類PD-L1之抗體之特徵為包含 SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL。
TLRs 及鐸樣受體 ( TLR ) 配位體 ， 尤其 TLR9 及 TLR9 促效劑
用於癌症療法之不同實驗性鐸樣受體促效劑已描述(Galluzzi等人，OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716)，一般而言，鐸樣受體(TLRs)係因其對保守微生物組分(諸如脂多糖及雙股RNA)反應而活化先天免疫系統之能力而為人所熟知的原型模式識別受體(pattern recognition receptors；PRR)。累積證據表明TLRs之功能不受限於針對侵入病原體誘發先天性免疫反應。實際上，已顯示TLRs參與組織修復及受傷誘導的再生以及參與抗癌的適應性免疫反應。特別地，TLR4傳訊顯示為樹狀細胞之細胞相關腫瘤抗原之有效處理及交叉呈現所需，其事實上係對一些抗癌藥物之最佳治療反應的基礎。因此，TLRs構成抗癌免疫反應之活化/加強之顯著治療目標。與此觀點一致，長期使用之製劑，諸如寇雷(Coley)毒素(經殺死的化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)與黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)細菌之混合物)及卡介苗(bacillus Calmette-Guérin)(BCG，最初研發為抗肺結核疫苗的牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)之減毒株)，二者均已與一致的抗癌反應相關，有效地活化TLR2及TLR4傳訊。 根據目前公認的模型，TLRs係以均二聚體或雜二聚體操作且表現在細胞膜上(主要結合蛋白脂質MAMPs之TLRs，亦即TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6及TLR10)或在內體中(偵測微生物核酸之TLRs，亦即TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)。TLR10為人類TLRs中唯一的孤兒受體，亦已顯示與TLR2共位於吞噬體上，表明其可能與TLR2共有結合醯基化脂肽之能力。然而，尚未報導在此問題上之結論性資料。TLR11-13不編碼在人類基因體中。在小鼠中，TLR11-13組成性地表現在中樞神經系統中且對囊蟲病反應經若干倍誘導。據報導21 TLR11識別由弓蟲(Toxoplasma gondii)表現之肌動蛋白結合蛋白(profilin)類似蛋白質且已定位在內質網上。TLR13亦顯示定位在胞內，其中其將特異性偵測水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)。至今，TLR12之配位體特異性及胞內定位仍未探索。 因此概言之，不同鐸樣受體具有不同功能、結構及表現模式。因此，其配位體及促效劑亦具有不同功能及作用模式。例如LPS即TLR2及TLR4之天然配位體，亦已知為內毒素，早在20世紀60年代就已經發現其具有抗癌特性，當時甚至尚未猜想存在TLR。 Toll樣受體(TLR)係在先天性免疫系統中起關鍵作用之一類蛋白質。其為通常表現於崗哨細胞(諸如巨噬細胞及樹狀細胞)中之單一、跨膜、非催化型受體，其識別源自微生物之結構上保守之分子。一旦此等微生物已破壞諸如皮膚或腸道黏膜之物理障壁其便由TLR識別，此活化免疫細胞反應。TLR包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12及TLR13，儘管後兩者未發現於人類中。(Mahla, RS等人，Front Immunol 4 (2013) 248)。 TLR配位體： 由於鐸樣受體(及其他先天性免疫受體)之特異性其在進化過程中無法輕易地改變，此等受體識別不斷地與威脅(亦即病原體或細胞壓力)相關之分子且高度針對此等威脅(亦即不會誤認為係在生理條件下正常表現之自身分子)。認為符合此要求之病原體相關分子對病原體之功能係至關重要的且難以經由突變改變；據稱，其進化保守。在病原體中在某種程度上保守的特點包括：細菌細胞表面脂多醣(lipopolysaccharides；LPS)、脂蛋白、脂肽及脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan)；蛋白質，諸如來自細菌鞭毛之鞭毛蛋白；病毒之雙股RNA；或細菌及病毒性DNA之未甲基化CpG島；亦及在真核DNA之啟動子中發現之CpG島；以及某些其他RNA及DNA分子。對於大多數TLR，現已藉由基因標靶(亦稱為「基因剔除」)，即一種在小鼠中可使個別基因選擇性地缺失之技術建立起配位體識別特異性。 習知TLR配位體之總結可參見下表(Waltenbaugh C等人Immunology. Lippincott's Illustrated reviews. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2008)第17頁)。
表 3 ：
由鐸樣受體活化引起定型發炎反應已引起推測：鐸樣受體之內源性活化因子可能參與自身免疫疾病。已猜測TLR結合於宿主分子，該等宿主分子包括血纖維蛋白原(參與血液凝結)、熱休克蛋白質(heat shock proteins；HSP)、HMGB1、胞外基質組分及自身DNA (其通常藉由核酸酶降解，但在發炎性條件及自身免疫條件下其可與內源性蛋白質形成複合物，變得對此等核酸酶具有抗性且能夠作為TLR7或TLR9進入內體TLR中)。此等內源性配位體通常作為非生理性細胞死亡之結果生成(Kawai, T.等人；Nature Immunology. 11 (2010) 373-384)。 簡短概述：用於不同TLR之配位體。 TLR-1：-細菌脂蛋白及肽聚糖 TLR-2：- 細菌肽聚糖 TLR-3：-雙股RNA TLR-4：-脂多醣 TLR-5：-細菌鞭毛 TLR-6：-細菌脂蛋白 TLR-7：-單股RNA，細菌性及病毒性 TLR-8：-單股RNA，細菌性及病毒性，經吞噬細菌RNA。[30] TLR-9：- CpG DNA TLR-10：-未知 TLR-11：-來自弓蟲，亦可能致腎盂腎炎細菌，之肌動蛋白結合蛋白 TLR-12：-來自弓蟲之肌動蛋白結合蛋白 TLR-13：-細菌核糖體RNA TLR9主要發現於B細胞、單核球、巨噬細胞及類漿細胞樹狀細胞DC之內體隔室。(Galluzzi等人，OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716)。TLR9之主要配位體係細菌/病毒DNA，不同於其哺乳動物對應體，用於提高的未甲基化CpG寡去氧核苷酸之頻率。實際上，鑒於哺乳動物DNA無免疫刺激活性，細菌/病毒DNA之投與誘導活體內有效Th1免疫反應，其在TLR9
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小鼠中完全取消。CpG寡去氧核苷酸(或CpG ODN)係較短單股合成DNA分子，其含有後接胍三磷酸去氧核苷酸(「G」)之胞苷三磷酸去氧核苷酸(「C」)。「P」係指連續核苷酸之間的磷酸二酯連接，儘管一些ODN替代地具有經修飾的硫代磷酸酯(phosphorothioate；PS)主鏈。當此等CpG基元係未甲基化的時，其充當免疫刺激劑(Weiner, GJ等人PNAS 94 (1997) 10833-7)。 由於CpG基元在微生物基因組中豐富而在脊椎動物基因組中罕見，將其視為病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns；PAMP)。(Bauer, S; Current Topics in Microbiology and Immunology 270 (2002) 145-54)。CpG PAMP由模式識別受體(PRR)鐸樣受體9 (TLR9)識別，其僅在人類及其他較高靈長類之B細胞及類漿細胞樹狀細胞(plasmacytoid dendritic cells；pDC)中組成性表現(Rothenfusser, S等人Human immunology 63 (2002) 1111-9)。 合成CpG ODN不同於微生物DNA，此係因為其具有部分或完全硫代磷酸酯化的(phosphorothioated；PS)主鏈而非典型磷酸二酯主鏈及在3'端、5'端或二者上之多G尾端。PS修飾保護ODN不受體內諸如DNase的核酸酶之降解且多G尾端增強細胞吸收(Dalpke, AH等人，Immunology 106 (2002) 102-12)。多G尾端形成分子間四聯體，其產生高分子量聚集物。此等聚集物與多G序列賦予的增強的活性有關而非該序列自身。 此等含有未甲基化的CpG基元之合成寡去氧核苷酸(CpG ODN)，諸如ODN 1826，已作為佐劑得到廣泛研究 (Steinhagen F.等人，2011; Vaccine 29(17):3341-55)。此等CpG基元在細菌DNA中以比哺乳動物DNA大20倍的頻率存在(Hemmi H.等人，2000. Nature 408: 740-5)。CpG ODN促效TLR9，其在人類B細胞及類漿細胞樹狀細胞(pDC)上表現，從而誘導Th1主導的免疫反應(Coffman等人，2010. Immunity 33(4):492-503)。在嚙齒動物及非人類靈長類中實施之臨床前研究及人類臨床試驗已展示，CpG ODN可顯著提高疫苗-特異性抗體反應(Steinhagen F.等人，2011; Vaccine 29(17):3341-55)。 已顯示諸多序列刺激TLR9，其在CpG二聚體數目及位置方面以及側接CpG二聚體之精確鹼基序列方面存在變化。此導致CpG ODN之類別或分類之創建，基於其序列、二級結構及對人類外周血液單核細胞(PBMC)之作用，其全部係TLR9促效劑。CpG ODN之三個主要類別係A類、B類及C類，其在其免疫刺激活動方面不同(Krug A.等人，2001, Eur J Immunol, 31(7): 2154-63)。另外，CpG ODN以物種特異性方式活化TLR9(Bauer, S.等人，2001, PNAS, 98(16):9237-42)。第一類A類ODN中之一者ODN 2216在2001年由Krug等人描述(參見上文) ODN之此類明顯地不同於上述B類ODN(亦即ODN 2006)，此係因為其刺激大量I型干擾素之生成(最重要的一個係IFNα)且誘導pDC之成熟。 A類ODN亦係NK細胞經由間接細胞介素傳訊之強活化因子。A類ODN典型地在一個或兩個末端上含有7至10個經PS修飾的鹼基，其抵抗藉由核酸酶之降解且增加ODN之壽命。以上規則嚴格地界定類，但在此等「規則」內之序列變化係可能的。亦應注意對序列之改變將影響反應之幅度。舉例而言，內部回文序列在長度上可為4至8個鹼基對且按鹼基之次序變化，然而發現相比於若干其他序列模式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'最具活性。存在於DNA股之任一末端上之多G尾端可在長度甚至數目方面有所變化，但其存在對分子之活性至關重要。 B類ODN(亦即ODN 2007)係人類B細胞及單核球成熟之強刺激物。其亦刺激pDC之成熟，但比A類ODN程度小且IFNα之量極小。在此類中之最強ODN具有三個6聚體序列。由於B類ODN誘導強體液性免疫反應之能力，其已作為治療劑經廣泛研究，使其成為理想疫苗佐劑。 ODN 1826係對小鼠TLR9特異之B型CpG ODN。B型CpG ODN含有具有一或多個CpG二核苷酸的完全硫代磷酸酯主鏈且可強效活化B細胞(Krug A.等人，2001, Eur J Immunol, 31(7): 2154-63)。ODN 1826，已測試小鼠反應性替代物TLR9促效劑在諸多動物模式中作為佐劑(Bauer, S.等人，2001, PNAS, 98(16):9237-42)。在小鼠中之研究顯示投與ODN 1826可誘導抗原呈現細胞之活化及指示Th1免疫反應之I型IFN抗病毒活性8至9(Longhi Mp.等人，2009, J Exp Med 206: 1589-602)。 而且，據報導向攜帶腫瘤的嚙齒動物投與B型CpG寡核苷酸(單獨或與化學治療劑或肽疫苗組合)發揮有效抗癌作用。於2000年4月啟動了測試CpG-7909用於腫瘤病症之安全性及功效的首次I期/II期臨床試驗。大約在同一時期，CpG-7909開始作為用於癌症不相關病症之佐劑(主要係抗病毒疫苗)被廣泛研究，顯示無嚴重副作用及鼓舞人心的功效。 在過去十年間，CpG-7909 (作為獨立藥劑或組合化學療法及/或接種疫苗方法)之安全性及抗癌潛能已在大量I期/II期臨床試驗中研究，包括針對白血病、淋巴瘤、基底細胞癌、黑素瘤、食道鱗狀細胞癌、NSCLC、腎細胞癌及前列腺癌患者之研究。已知若干TLR9促效劑且目前在臨床測試中研發出阿托莫特(Agatolimod)(含有3個CpG基元之合成24聚體寡核苷酸二十三烷鈉鹽；Pfizer)、GNKG168 (CpG ODN；SBI Biotech)、IMO-2055 (含有未甲基化的CpG二核苷酸之合成寡核苷酸；Idera Pharmaceuticals)、MGN-1703 (Mologen)。典型地此等TLR9促效劑用於不同癌症之治療中： Schroder K等人，J Leukoc Biol. 81(6) (2007) 1577-90係關於TLR促效劑(含未甲基化CpG之DNA(CpG DNA))、小鼠TlR9表現之調節且定義IFN-γ放大小鼠巨噬細胞對CpG DNA反應的分子機制。 術語「鐸樣受體9」(TLR9，CD289；SEQ ID NO:32)係指鐸樣受體(TLR)家族之蛋白，其在病原體識別及先天性免疫之活化方面發揮重要作用。TLR在果蠅與人類之間高度保守且共享結構及功能類似性。其識別在傳染媒介物上表現之病原體相關分子模式(PAMP)，且介導發展有效免疫性所必需之細胞介素的產生。各種TLR展現不同表現模式。此基因優先在免疫細胞豐富的組織，諸如脾臟、淋巴結、骨髓及外周血液白細胞中表現。在小鼠及人類中之研究表明此受體調節細胞對細菌DNA中之未甲基化的CpG二核苷酸之反應以建立先天性免疫反應。 TLR9主要發現於B細胞、單核球、巨噬細胞及類漿細胞樹狀細胞DC之內體隔室。(Galluzzi等人，OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716)。TLR9之主要配位體係細菌/病毒DNA，不同於其哺乳動物對應體，用於提高的未甲基化CpG寡去氧核苷酸之頻率。實際上，鑒於哺乳動物DNA無免疫刺激活性，細菌/病毒DNA之投與誘導活體內有效Th1免疫反應，其在TLR9
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小鼠中完全取消。CpG寡去氧核苷酸(或CpG ODN)係較短單股合成DNA分子，其含有後接胍三磷酸去氧核苷酸(「G」)之胞苷三磷酸去氧核苷酸(「C」)。「P」係指連續核苷酸之間的磷酸二酯連接，儘管一些ODN替代地具有經修飾的硫代磷酸酯(PS)主鏈。當此等CpG基元係未甲基化的時，其充當免疫刺激劑(Weiner, GJ等人，PNAS 94 (1997) 10833-7)。因此「鐸樣受體9促效劑」(TLR9促效劑)之特徵為結合於鐸樣受體9且刺激TLR9免疫反應。例如在一個實施例中鐸樣受體9促效劑(TLR9促效劑)之特徵為在人類類漿細胞樹狀細胞(pDC)上結合於鐸樣受體9且誘導此等類漿細胞樹狀細胞(pDC)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12 (升高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)。 由於CpG基元在微生物基因組中豐富而在脊椎動物基因組中罕見，將其視為病原體相關分子模式(PAMP)(Bauer, S; Current Topics in Microbiology and Immunology 270 (2002) 145-54)。CpG PAMP由模式識別受體(PRR)鐸樣受體9 (TLR9)識別，其僅在人類及其他較高靈長類之B細胞及類漿細胞樹狀細胞(pDC)中組成性表現(Rothenfusser, S等人，Human immunology 63 (2002) 1111-9)。 合成CpG ODN不同於微生物DNA，此係因為其具有部分或完全硫代磷酸酯化的(PS)主鏈而非典型磷酸二酯主鏈及在3'端、5'端或二者上之多G尾端。PS修改保護ODN不受體內諸如DNase的核酸酶之降解且多G尾端增強細胞吸收(Dalpke, AH等人，Immunology 106 (2002) 102-12)。多G尾端形成分子間四聯體，其產生高分子量聚集物。此等聚集物與多G序列賦予的增強的活性有關而非序列自身。 此等含有未甲基化的CpG基元之合成寡去氧核苷酸(CpG ODN)，諸如ODN 1826，已作為佐劑得到廣泛研究(Steinhagen F.等人，2011; Vaccine 29(17):3341-55)。此等CpG基元在細菌DNA中以比哺乳動物DNA大20倍的頻率存在(Hemmi H.等人，2000. Nature 408: 740-5)。CpG ODNs促效TLR9，其在人類B細胞及類漿細胞樹狀細胞(pDC)上表現，從而誘導Th1主導的免疫反應(Coffman等人，2010. Immunity 33(4):492-503)。 在嚙齒動物及非人類靈長類中實施之臨床前研究及人類臨床試驗已展示，CpG ODN可顯著提高疫苗-特異性抗體反應(Steinhagen F.等人，2011; Vaccine 29(17):3341-55)。 已顯示諸多序列刺激TLR9，其在CpG二聚體數目及位置方面以及側接CpG二聚體之精確鹼基序列方面存在變化。此導致CpG ODN之類別或分類之創建，基於其序列、二級結構及對人類外周血液單核細胞(PBMC)之作用，其全部係TLR9促效劑。CpG ODN之三個主要類別係A類、B類及C類，其在其免疫刺激活動方面不同(Krug A.等人，2001, Eur J Immunol, 31(7): 2154-63)。另外，CpG ODN以物種特異性方式活化TLR9 (Bauer, S.等人，2001, PNAS, 98(16):9237-42)。第一類A類ODN中之一者ODN 2216在2001年由Krug等人描述(參見上文) ODN之此類明顯地不同於上述B類ODN(亦即ODN 2006)，此係因為其刺激大量I型干擾素之生成(最重要的一個係IFNα)且誘導pDC之成熟。 A類ODN亦係NK細胞經由間接細胞介素傳訊之強活化因子。A類ODN典型地在一個或兩個末端上含有7至10個經PS修飾的鹼基，其抵抗藉由核酸酶之降解且增加ODN之壽命。以上規則嚴格地界定類，但在此等「規則」內之序列變化係可能的。亦應注意對序列之變化將影響反應之幅度。舉例而言，內部回文序列在長度上可為4至8個鹼基對且按鹼基之次序變化，然而發現相比於若干其他序列模式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'最具活性。存在於DNA股之任一末端上之多G尾端可在長度及甚至數目方面有所變化，但其存在對分子之活性至關重要。 B類ODN(亦即ODN 2007)係人類B細胞及單核球成熟之強刺激物。其亦刺激pDC之成熟，但比A類ODN程度更小且IFNα之量極小。在此類中之最強ODN具有三個6聚體序列。由於B類ODN誘導強體液性免疫反應之能力，其已作為治療劑經廣泛研究，使其成為理想疫苗佐劑。 ODN 1826係對小鼠TLR9特異之B型CpG ODN。B型CpG ODN含有具有一或多個CpG二核苷酸的完全硫代磷酸酯主鏈且可強有力地活化B細胞(Krug A.等人，2001, Eur J Immunol, 31(7): 2154-63)。ODN 1826，已測試小鼠反應性替代物TLR9促效劑在諸多動物模式中作為佐劑(Bauer, S.等人，2001, PNAS, 98(16):9237-42)。在小鼠中之研究顯示投與ODN 1826可誘導抗原呈現細胞之活化及指示Th1免疫反應之I型IFN抗病毒活性8-9 (Longhi Mp.等人，2009, J Exp Med 206: 1589-602)。 而且，據報導向攜帶腫瘤的嚙齒動物投與B型CpG寡核苷酸(單獨或與化學治療劑或肽疫苗組合)發揮有效抗癌作用。於2000年4月啟動了測試CpG-7909用於腫瘤病症之安全性及功效的首次I期/II期臨床試驗。大約在同一時期，CpG-7909開始作為用於癌症不相關病症之佐劑(主要係抗病毒疫苗)被廣泛研究，顯示無嚴重副作用及鼓舞人心的功效。 在過去十年間，CpG-7909 (作為獨立藥劑或組合化學療法及/或接種疫苗方法)之安全性及抗癌潛能已在大量I期/II期臨床試驗中研究，包括針對白血病、淋巴瘤、基底細胞癌、黑素瘤、食道鱗狀細胞癌、NSCLC、腎細胞癌及前列腺癌患者之研究。已知若干TLR9促效劑且目前在臨床測試中研發出阿托莫特(含有3個CpG基元之合成24聚體寡核苷酸二十三烷鈉鹽；Pfizer)、GNKG168 (CpG ODN；SBI Biotech)、IMO-2055 (含有未甲基化的CpG二核苷酸之合成寡核苷酸；Idera Pharmaceuticals)、MGN-1703 (Mologen)。典型地此等TLR9促效劑用於不同癌症之治療中： 含有未甲基化的CpG基元之細菌及合成DNA充當TLR9之促效劑且誘導Th1型免疫反應特徵。TLR9促效劑之免疫刺激作用係多因素的且視核苷酸序列、主鏈之性質及特異性結構基元之存在而定。基於誘導的細胞介素特徵，已描述TLR9促效劑之三個獨立類型：A類、B類及C類。TLR9促效劑之各類由允許形成產生不同免疫特徵的結構(或無結構)的不同核苷酸序列構成。 充當TLR9之促效劑的寡核苷酸之結構-活性關係經系統地研究(Kandimalla, E.R.及Agrawal, S. (2005)於Toll and Toll Receptors: An Immunologic Perspective (Rich, T.編)，第181-212頁，Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York)。在寡核苷酸中CpG基元之存在係TLR9刺激所需要的。具有磷酸二酯及硫代磷酸酯主鏈之寡核苷酸刺激TLR9介導的免疫反應。通常使用硫代磷酸酯主鏈寡核苷酸，因為與磷酸二酯寡核苷酸相比其對藉由廣泛核酸酶之降解之敏感較小。在核苷酸間磷酸二酯鍵上引入硫原子引起Rp及SP非對映異構體之形成；硫代磷酸酯連鍵之Rp非對映異構體刺激出比SP非對映異構體更強之TLR9介導的免疫反應。在胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之間及與胞嘧啶(C)及鳥嘌呤(G)相鄰之磷酸酯上之負電荷亦係TLR9介導的活性所需要的。藉由在此等位置上合併甲基磷酸連鍵導致的電荷抵消引起免疫刺激活性之損失。而且，TLR9活化亦視側接CpG二核苷酸之序列、核苷酸主鏈之性質及二級結構而定。 側接序列在TLR9刺激中發揮顯著作用 在CpG基元中之C或G核苷酸之糖環之2'位置引入的化學修飾引起TLR9促效劑之免疫刺激活性之損失。此外，含有化學修飾(諸如甲基磷酸連鍵、2'-烷基或3'-去氧或-烷基核糖核苷、非核苷酸連接子或側接序列中之無鹼基核苷酸)的TLR9促效劑之研究表明在第四至第六核苷酸位置5'併入至CpG二核苷酸的取代物顯著增強免疫刺激活性。大體而言，併入至CpG二核苷酸遠端之3'-側邊序列中之修飾具有視修飾之性質而定的作用。 TLR9需要促效劑之自由5'端用於刺激 雖然具有兩個CpG基元之可利用性，但是經由其5'末端連接的兩個CpG寡核苷酸不活化免疫細胞。當相同寡核苷酸經由其3'末端連接時，其產生與具有單個5'末端之親體CpG寡核苷酸相比更高且獨特的細胞介素特徵。此等係證明TLR9活化要求可接入的或自由5'端且受體讀段來自5'端之序列之首次研究。轉錄因子NF-κB由含有兩個5'端之TLR9促效劑快速活化，但此等化合物具有與J774細胞中之MAPK (有絲分裂原活化蛋白激酶)路徑上之習知TLR9促效劑相同之活性。 此等研究表明含有兩個5'端之促效劑輔助受體之二聚引起免疫反應之快速活化。而且，TLR9活化可經自由5'端及合成免疫刺激基元之適合呈現來調變，引起下游細胞介素誘導特徵之變化。與此等結果一致，近期研究已顯示TLR9以二聚體存在且結合於單股寡核苷酸。然而，僅含有CpG基元的寡核苷酸在受體中引起構形的變化，導致免疫傳訊路徑之活化。 寡核苷酸經由其3'端附接不僅提供兩個5'端用於最佳TLR9活化而且增加抗3'末端核酸酶之穩定性。具有磷酸二酯主鏈且短至經由其3´端連接之5及6核苷酸(nt)的寡核苷酸充當有效TLR9促效劑且產生免疫反應。而且，含有TLR9促效劑之新穎結構之經口投藥誘導有效黏膜免疫反應，充當具有抗原之佐劑，且在小鼠模型中由於其在胃腸道中穩定性更大而預防及逆轉花生過敏。 TLR9刺激所需之胞嘧啶及鳥嘌呤之官能基 如上文所描述，在CpG二核苷酸內引入之改變結構及構形的某些化學修飾導致促效劑之免疫刺激活性之損失。一個此類修飾係在TLR9促效劑之CpG基元中之胞嘧啶之5位置處的甲基之替換。脊椎動物使用此特性區分自身DNA與細菌DNA之彼等，其含有更多未甲基化的CpG基元。 代替胞嘧啶之各種嘧啶類似物(Y)，諸如5-OH-dC、dU、dP、1-(2´-去氧-β-D-呋喃核糖基)-2-側氧基-7-去氮-8-甲基-嘌呤、N3-Me-dC及N4-Et-dC之作用(Kandimalla, E.R.等人(2001) Bioorg. Med. Chem. 9, 807-813；Kandimalla, E.R.等人，S. (2003) PNAS. 100, 14303-14308；或Putta, M.R.等人，S. (2006) Nucleic Acids Res. 34, 3231-3238)。為理解鳥嘌呤之不同官能基在識別TLR9中之作用，檢測在CpG中代替鳥嘌呤之若干嘌呤核鹼基(R)，諸如7-去氮-dG、N1-Me-dG、2-胺基-D-嘌呤、水粉蕈素、2-胺基-dA、7-去氮-D-黃嘌呤、K-鹼及dI (Kandimalla, E.R.等人(2001) Bioorg. Med. Chem. 9, 807-813；Kandimalla, E.R.等人(2003) PNAS. 100, 14303-14308；Putta, M.R.等人，(2006) Nucleic Acids Res. 34, 3231-3238；Kandimalla, E.R.等人(2003) Nucleic Acids Res. 31, 2393-2400；或Kandimalla, E.R.等人(2005) PNAS. 102, 6925-6930)。此等研究引起用於免疫調製之替代的合成核苷酸基元(YpG、CpR)之發展且已展示由某些雜環鹼基變異體之TLR9之接收。 新穎合成TLR9促效劑(S. Agrawal及E.R. Kandimalla, Biochemical Society Transactions (2007) 35, (1461-1467))：上文所描述之新穎結構及合成免疫刺激基元之組合為吾等提供產生新穎合成TLR9促效劑之組合庫之工具。對小鼠、人類及猴體系中之不同核苷酸組合物中之具有兩個5´端且含有合成CpR二核苷酸若干TLR9促效劑之系統研究表明：核苷酸序列及二級結構在調變免疫反應方面起作用。基於此等研究，吾人已大體上鑑別出TLR9之合成促效劑之兩種不同基團。 在一個實施例中TLR9促效劑之特徵為在類漿細胞樹狀細胞(pDC)中誘導IFN-α、IL-6及/或IL-12 (升高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)。在一個實施例中，TLR9促效劑之特徵為在人類類漿細胞樹狀細胞(pDC)中升高IFN-α之含量(如藉由如下或例如在WO2010/088395中所述之夾心式ELISA所量測) 用於量測在人類pDC中藉由用於本發明之組合治療之TLR9促效劑的IFN-α誘導(升高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)之分析： 人類PBMC分離：來自新鮮抽取的健康志願者血液之外周血液單核細胞(PBMC)(CBR Laboratories，Boston，MA)經Ficoll密度梯度離心方法(Histopaque-1077，Sigma)分離。 人類pDC分離：根據製造商之說明書使用BDC A4細胞分離套組(Miltenyi Biotec)藉由陽性選擇自新鮮獲得的健康人類志願者之血液PBMC中分離人類類漿細胞樹狀細胞(pDC)。 以1 × 10
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個細胞/毫升將人類pDC塗覆在96孔盤中。將來自表I中之個體免疫調節化合物溶解於DPBS (pH 7.4；Mediatech)中，以0、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0 .micro.g/ml.之劑量添加至細胞培養物中。隨後將細胞在37 ℃下培育24小時且收集上清液用於流式螢光檢測術多重分析或ELISA分析。 IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量藉由夾心式ELISA來量測。所需試劑，包括細胞介素抗體及標準物，可購自PharMingen。 多年來，已知IFN-α作為抗病毒細胞介素。其刺激Thl細胞發展，因而促進含有CG的DNA分子之作用。在小鼠及人類惡性病中IFN-α亦呈現抗腫瘤活性且能夠降低移植的腫瘤細胞之腫瘤形成力，部分藉由活化細胞毒性T細胞且從而增加腫瘤細胞細胞溶解之可能性。NK細胞及巨噬細胞活性(二者對於抗腫瘤細胞毒性亦很重要)亦藉由IFN-α增強(Brassard等人，J. Leukoc. Biol. 2002 71: 565-81)。因此，在用本發明之DNA結構刺激時IFN-α之量增加被預期為有益於癌症治療。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)嘌呤-磷酸-鳥苷(RpG)基元(RpG ODN)，其中TLR9促效劑刺激TLR9(在一個實施例中TLR9促效劑誘導類漿細胞樹狀細胞(pDCs)之成熟；在一個實施例中TLR9促效劑之特徵為人類B細胞成熟作用) 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元之寡去氧核苷酸(CpG ODN)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係A類CpG ODN。 在一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其包含 a)在5'端或3'端或兩端上之多G序列 b)內部回文序列； c)包含於內部回文內之GC二核苷酸，及 d)部分地經PS修飾之主鏈 A類ODN典型地在一個或兩個末端上含有7至10個經PS修飾的鹼基，其抵抗藉由核酸酶之降解且增加ODN之壽命。以上規則嚴格地界定類，但在此等「規則」內之序列變化係可能的。內部回文序列在長度上可為4至8個鹼基對且按鹼基之次序變化，然而發現相比於若干其他序列模式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'最具活性。在DNA股之任一末端存在之多G尾端可在長度及數目方面變化。 在一個實施例中A類CpG ODN (Xueqing Liang等人，Blood. 2010 June 17; 115(24): 5041-5052)係選自由以下組成之群：CpG ODN 2216 (5'-ggGGGACGATCGTCgggggG-3') (SEQ ID NO:17) CpG ODN PB4 (5'-tcgGACGATCGTCgggggG-3') (SEQ ID NO:18)；或CpG ODN 1002 (5'-ggGGTCGTTCGTCGTTgggggG-3') (SEQ ID NO:19)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係B類CpG ODN。 在一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係包含寡去氧核苷酸，其包含 a)一或多個6聚體未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元5'-PU Py C G Py Pu-3' (一或多個6聚體5'-RYCGYR-3' 6-聚體(R=A或G；Y=T或C)) b)完全硫代磷酸酯化的(經PS修飾)主鏈；及 c)長度為18至28個核苷酸 在一個實施例中，B類CPG ODN係選自由以下組成之群：CpG-28、CpG-685 (GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech)、CpG-684及CpG-7909 (CPG-ODN 2006，PF-3512676，阿托莫特)。 CpG-7909 (CpG 2006，PF-3512676，阿托莫特)係含有多個胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元之合成24聚體硫代磷酸酯寡去氧核苷酸(d(P-硫基)(T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T)DNA)(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3')(SEQ ID NO:20)或其衍生物類二十三烷鈉鹽中之一者。製備描述於例如WO 9818810或US 7223741中。 CpG-685 (GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech)係具有免疫刺激活性之合成21聚體基於未甲基化的CpG基元的寡去氧核苷酸(ODN)(685，5'-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3')(SEQ ID NO:21)。CpG685 (GNKG168)，即經設計以直接標靶在B細胞中調節細胞反應之鐸樣受體9的21聚體完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸，在SCID小鼠中顯示抗腫瘤作用且正處於SBI Biotech公司用於治療人類慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)之臨床研發中。在此，在血漿及細胞溶解物中進行敏感性及特異性分析以支持其臨床前藥理學研究。CpG寡去氧核苷酸GNKG168結合且活化鐸樣受體9 (TLR9)且藉由胞吞作用吸收細胞；一旦經內化其可活化多個傳訊轉導路徑，導致釋放多種細胞介素，諸如免疫球蛋白(Ig)、干擾素(IFN)、白細胞間介素(IL)及腫瘤壞死因子(TNF)。 CpG-684係合成23聚體基於未甲基化的CpG基元的寡去氧核苷酸(ODN) 684，5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3' (SEQ ID NO:22)； CpG-28合成的基於未甲基化的CpG基元的寡去氧核苷酸(ODN)，其含有具有免疫刺激活性之多個未甲基化的CpG基元(CpG ODN)重複區(5'-TAAACGTTATAACGTTATGACGTCAT-3')(SEQ ID NO:23)及有完全硫代磷酸酯主鏈(Carpentier AF等人Front Biosci. 2003;8:e115-e127；Meng Y等人Int J Cancer. 2005;116:992-997；或Carpentier A等人Neuro-Oncology 2006;8:60-66)。在經由胞吞作用進入細胞時，CpG-28活化多個傳訊轉導路徑，導致多種細胞介素之釋放。CpG-28具有免疫調節特性，其直接活化B淋巴細胞、樹狀細胞及NK細胞，導致刺激先天性免疫及抗體依賴性細胞細胞毒性(antibody-dependant cell cytotoxicity；ADCC)。此外，此媒介物經由細胞介素(IL-12及IFN γ)之釋放而間接調節T細胞反應，以誘導優先轉移至Th1(輔助)表型，導致增強的CD8+細胞細胞毒性。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係含有嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元之寡去氧核苷酸(YpG ODN)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元之寡去氧核苷酸(CpR ODN)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係IMO-2055 (Idera)(由3'-3'-連接的結構及合成CpR (R=2'-去氧-7-去氮鳥苷)基元組成之ODN) 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)。 在本發明之一個實施例中，用於本發明之組合治療中之TLR9促效劑係基於dSLIM®技術(此技術描述於WO2001/07055中)之基於含有CpG基元的寡去氧核苷酸圓形ODN(例如如WO2012/085291中所描述之來自Mologen之MGN-1703)。 在本發明之一個實施例中，TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG ODN 2216、CpG ODN 1002、CpG-28、CpG-685、CpG-684、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。在本發明之一個實施例中，TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-685、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。在一個實施例中，TLR9促效劑係選自由CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703組成之群。 在本發明之一個實施例中，用於本文所描述之組合療法中之結合於人類CSF-1R抗體之特徵為包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL； 且 用於組合療法中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元之寡去氧核苷酸(CpG ODN)) 在本發明之一個較佳實施例中，用於本文所描述之組合療法中的結合於人類CSF-1R之抗體之特徵為包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL， 且 用於組合療法中之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元之寡去氧核苷酸(CpG ODN)) 術語「抗原決定基」表示能夠特異性結合於抗體之蛋白質決定子。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基區別在於，在變性溶劑存在下，與前者之結合消失，但與後者之結合未消失。 如本文所使用之「可變域」(輕鏈可變域VL、重鏈可變域VH)表示直接參與抗體與抗原之結合之輕鏈域及重鏈域對中之各者。可變輕鏈域及可變重鏈域具有相同通式結構，且各域包含序列廣泛保守的藉由三個「高變區」(或互補決定區(complementary determining regions，CDR))連接之四個框架(FR)區。框架區採用β-片層構形且CDR可形成連接β-片層結構之迴路。各鏈中之CDR藉由框架區保持在其三維結構中且與來自其他鏈CDR一起形成抗原結合位點。抗體之重鏈及輕鏈CDR3區在根據本發明之抗體之結合特異性/親和力方面發揮尤其重要作用且因此提供本發明之進一步目標。 術語「抗體之抗原結合部分」在用於本文中時係指抗體之胺基酸殘基，其負責抗原結合。抗體之抗原結合部分包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區為不同於如本文所定義之高變區殘基之可變域區。因此，抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域包括：自N末端至C末端，域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。尤其，重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最多且定義抗體之特性的區。根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，MD (1991)之標準定義及/或來自「高變迴路」之殘基來確定CDR及FR區。 如本文所使用，術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。 如本申請案內所用，術語「胺基酸」表示天然存在之羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。 抗體之「Fc部分」不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能。「抗體之Fc部分」係熟習此項技術者熟知之術語且界定於抗體之木瓜蛋白酶裂解之基體上。根據其重鏈恆定區之胺基酸序列，抗體或免疫球蛋白劃分成以下各類別：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，且其中若干類別可進一步劃分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。根據重鏈恆定區，免疫球蛋白之不同類別分別稱作α、d、e、γ及μ。抗體之Fc部分直接參與ADCC (抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)及CDC (補體依賴性細胞毒性)，基於補體活化、C1q結合及Fc受體結合。補體活化(complement activation；CDC)藉由補體因子C1q與大多數IgG抗體子類之Fc部分之結合來啟動。雖然補體系統上之抗體之影響取決於某些條件，但C1q結合係由Fc部分內之界定結合位點造成。此類結合位點在目前先進技術中已知且由例如Boackle, R.J.等人，Nature 282 (1979) 742-743；Lukas, T.J.等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.及Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E.等人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等人，J. Immunol.164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等人，J. Virology 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324；EP 0 307 434描述。此類結合位點例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329 (根據Kabat, E.A.之EU指標編號，參見下文)。子類抗體IgG1、IgG2及IgG3通常顯示補體活化及C1q及C3結合，然而IgG4不活化補體系統且不結合C1q及C3。 在一個實施例中，本發明之抗體包含源自人類來源之Fc部分，且較佳為人類恆定區之所有其他部分。如本文所使用之術語「源自人類來源之Fc部分」表示Fc部分，其係人類子類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體之任一Fc部分，較佳來自人類IgG1子類之Fc部分、來自人類IgG1子類之突變Fc部分(在一個實施例中，突變在L234A+L235A上)、來自人類IgG4子類之Fc部分或來自人類IgG4子類之突變Fc部分 (在一個實施例中，突變在S228P上)。在一個較佳實施例中人類IgG1子類之人類重鏈恆定區，在另一較佳實施例中人類重鏈恆定區屬於人類IgG1子類，具有突變L234A、L235A及P329，在另一較佳實施例中，人類重鏈恆定區屬於人類IgG4子類，且在另一個較佳實施例中人類重鏈恆定區屬於人類IgG4子類，具有突變S228P。在一個實施例中，該抗體可具有減小的或最小的效應功能。在一個實施例中，最小效應功能由無效應Fc突變產生。在一個實施例中，無效應Fc突變係L234A/L235A或L234A/L235A/P329G或N297A或D265A/N297A。在一個實施例中，各抗體之無效應Fc突變彼此獨立地選自包含以下(由以下組成)之群：L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、N297A及D265A/N297A。 在一個實施例中本文所描述之抗體屬於人類IgG類(亦即屬於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類)。 在一較佳實施例中，本文所描述之抗體屬於人類IgG1子類或屬於人類IgG4子類。在一個實施例中本文所描述的抗體屬於人類IgG1子類。在一個實施例中本文所描述之抗體屬於人類IgG4子類。 在一個實施例中，本文所述之抗體之特徵在於恆定鏈屬於人類來源。此類恆定鏈在目前先進技術中已熟知及由例如 Kabat, E.A.描述(參見例如Johnson, G.及Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)。舉例而言，適用的人類重鏈恆定區包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。舉例而言，適用的人類輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:33之κ輕鏈恆定區之胺基酸序列。 本發明包含一種治療需要治療之患者之方法，其特徵為向患者投與治療有效量之根據本發明之抗體。 本發明包含用於所述療法的根據本發明之抗體之用途。 本發明之一個實施例係本文所描述之CSF-1R抗體，與選自如本文所描述之促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群的巨噬細胞活化劑組合用於癌症治療。 本發明之一個實施例係本文所描述之CSF-1R抗體，其組合如本文所描述之促效性CD40抗體用於癌症治療。 本發明之一個實施例係本文所描述之CSF-1R抗體，其組合如本文所描述之拮抗性PD-L1抗體用於癌症治療。 在本發明之一個較佳實施例中，癌症係實體腫瘤。 在本發明之另一較佳實施例中，癌症係黑素瘤、結腸直腸癌或間皮瘤。 如本文所使用之術語「癌症」可為例如肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤、淋巴細胞性白血病，其包括以上癌症中之任一者之難治形式或以上癌症中之一或多者之組合。在一個較佳實施例中，此類癌症為乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。在一個較佳實施例中，癌症為乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌或前列腺癌。在另一較佳實施例中，此類癌症係乳癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、腎癌、腎臟癌、肝癌、頭頸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、胃癌瘤、食道癌、間皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。在一個較佳實施例中，此類癌症之特徵進一步為CSF -1或CSF-1R表現或過度表現。本發明之另一實施例係本發明之CSF-1R抗體，其用於原發腫瘤及新癌轉移之同步治療。因此本發明之另一實施例係本發明之CSF-1R抗體，其用於治療牙周炎、組織細胞增多症X、骨質疏鬆、佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone；PDB)、癌症療法所致之骨質流失、假體周圍骨質溶解、糖皮質激素誘導的骨質疏鬆、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨關節炎、發炎性關節炎及發炎。 本文所描述之抗體較佳藉由重組方法產生。此類方法在目前先進技術中廣泛已知，且包括在原核及真核細胞中之蛋白表現，其具有抗體多肽之後續分離且通常純化至醫藥學上可接受純度。編碼輕鏈及重鏈或其片段的蛋白表現核酸藉由標準方法插入至表現載體中。表現在適合原核或真核宿主細胞，諸如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌(E. coli)細胞及自細胞回收之抗體(來自上清液或在細胞溶解之後)中進行。 抗體之重組製備在目前先進技術中熟知且描述於，例如，以下之綜述文章中：Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161；Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880。 抗體可存在於整個細胞、細胞溶解物中或以部分純化或實質上純淨形式存在。進行純化以藉由標準技術消除其他細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質，該等標準技術包括鹼性/SDS處理、CsCl結合、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術。參見Ausubel, F.等人編Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。 在NS0細胞中之表現由例如，Barnes, L.M.等人，Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.M.等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270描述。短暫表現由例如，Durocher, Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描述。可變域之選殖由Orlandi, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, L.等人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述。較佳短暫表現體系(HEK 293)由Schlaeger, E.-J及Christensen, K.在Cytotechnology 30 (1999) 71-83中及由 Schlaeger, E.-J.在J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199中描述。 將本發明之重鏈及輕鏈可變域與啟動子序列、轉譯啟動序列、恆定區序列、3'非轉譯區序列、多腺苷酸化序列及轉錄終止序列組合以形成表現載體結構。重鏈及輕鏈表現結構可組合成單個載體，共轉染、串聯轉染或分別地轉染至宿主細胞，其隨後融合形成表現重鏈及輕鏈二者之單個宿主細胞。 適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、強化子及多腺苷酸化訊號。 當核酸置於與另一個核酸序列之功能關係中時，其係「可操作地連接的」。舉例而言，若前序列或分泌引導物之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA係可操作地連接的；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列係可操作地連接的；或若核糖體結合位點經定位以便輔助轉譯，則其與編碼序列係可操作地連接的。一般而言，「可操作地連接的」意謂所連接的DNA序列係相連的，且在分泌引導物之情況中，係相連的且在閱讀框架內。然而，增強子不必為相連的。連接藉由在便利限制性位點處接合來實現。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸接附子或連接子。 藉由習知免疫球蛋白純化步驟，諸如蛋白A瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和層析，將單株抗體適合地自培養物培養基中分離。編碼單株抗體之DNA及RNA易於使用習知步驟分離及定序。融合瘤細胞可充當此類DNA及RNA之來源。一旦經分離，DNA可插入至表現載體中，該等表現載體隨後轉染至不另外產生免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞，諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞，以在宿主細胞中得到重組單株抗體之合成。 如本文所使用，表達「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換地使用且所有此類標示包括子代。因此，詞語「轉型體」及「轉型細胞」包括主要個體細胞及自其衍生之培養物，不考慮轉移數目。亦應理解由有意或無意突變所致，所有子代可能不會具有精確相同的DNA內含物。包括具有與最初轉型細胞中所篩檢的相同之功能或生物活性的變異體子代。 在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其含有一個本發明之單株抗體或本發明之單株抗體之組合，或其抗原結合部分，其與醫藥學上可接受之載劑調配在一起。 如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收/再吸收延遲劑及類似物。較佳，載劑適合用於注射或輸注。 本發明之組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應視所需結果而變化。 醫藥學上可接受之載劑包括用於製備無菌注射溶液或分散液之無菌水性溶液或分散液及無菌散劑。此類介質及試劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中已知的。除了水之外，載劑可以係，例如等張緩衝鹽水溶液。 不論所選擇之投藥途徑，可以適合含水形式使用的本發明之化合物及/或本發明之醫藥組合物係藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。 本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量含量可變化，以獲得針對特定患者、組合物及投藥模式有效地達成所需治療反應而對患者無毒性的活性成分之量。所選劑量含量將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明之特定組合物、或其酯、鹽或醯胺之活性；投藥途徑；投藥時間；待採用之特定化合物之排泄速率；與所採用特定組合物組合之其他藥物、化合物及/或材料；待治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。 術語「治療方法」或其等效物在用於例如癌症時係指經設計以降低或消除患者中癌細胞之數量或緩解癌症症狀之作用之程序或過程。癌症或其他增生性病症之「治療方法」未必意謂將實際上消除癌細胞或其他病症，實際上減少細胞數目或減輕病症，或實際上緩解癌症或其他病症之症狀。通常，即使一種治療癌症之方法成功的可能性較低，但考慮到患者之病史及估計存活期，仍將實施，儘管如此視其為總體有利的行動。 術語「組合投與」或「共同投與(co-administration)」、「共同投與(co-administering)」、「組合療法」或「組合治療」係指例如作為單獨的調配物/施用藥(或作為一個單個調配物/施用藥)投與如本文所描述之抗CSF-1R與選自如本文所描述之促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群的巨噬細胞活化劑。共同投與可為同時或以任一順序依序的，其中存在一時間段，期間兩個(或所有)活性劑在各別治療週期內同時發揮其生物活性，其中如本文所描述之抗CSF-1R與選自如本文所描述之促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群之巨噬細胞活化劑共同投與，且其中在無抗CSF1R治療的各別進一步治療週期中存在一時間段，其中CSF1R抗體不發揮生物活性且血清中之腫瘤相關巨噬細胞(TAM)及/或其前驅體人類CD14+CD16+單核球之含量已恢復(例如至抗CSF-1R治療之前的初始含量之約80%)。(例如經由靜脈內(i.v.))連續輸液同時或依序共同投與。在一個實施例中共同投與係同時的。在一個實施例中共同投與係依序的。(例如經由靜脈內(i.v.))連續輸液同時或依序共同投與。 不言而喻，以「治療有效量」(或簡稱「有效量」)向病患投與抗體，該量為將引發研究人員、獸醫、醫學醫生或其他臨床醫生所探尋之組織、系統、動物或人類之生物或醫學反應的各別化合物或組合之量。 共同投與之劑量及共同投與之時機將視進行治療之患者之類型(種族、性別、年齡、體重等)及病症及進行治療之疾病或病症之嚴重度而定。將該抗CSF-1R抗體及其他藥劑一次性或經一系列治療，例如在同一天或在該天之後，適合地共同投與患者。 除了抗CSF-1R抗體以及選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群的巨噬細胞活化劑之外，亦可投與化學治療劑。 在一個實施例中，可與如本文所描述之抗CSF-1R抗體及選自本文所描述之促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群的巨噬細胞活化劑一起投與的此類其他化學治療劑包括但不限於，包括烷基化劑的抗腫瘤劑，其包括：氮芥，諸如甲基二(氯乙基)胺、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)及氯芥苯丁酸；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)及司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)；替莫達(Temodal)(TM)(替莫唑胺)、諸如三伸乙基三聚氰胺(TEM)之伸乙亞胺/甲基三聚氰胺、三乙烯、噻替派(噻替派(thiotepa))、六甲三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺(altretamine))；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)；三嗪，諸如達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)；抗代謝物，其包括葉酸類似物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及曲美沙特(trimetrexate)，嘧啶類似物，諸如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟去氧尿苷、吉西他濱(gemcitabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮胞苷、2,2'-二氟去氧胞核，嘌呤類似物，諸如6-巰基嘌呤(6-merca.rho.topurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguamne)、硫唑嘌呤、T-去氧柯福黴素(deoxycoformycin)(噴司他汀(pentostatin))、赤式羥基壬基腺嘌呤(EHNA)、氟達拉賓磷酸鹽(fludarabine phosphate)及2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine)，2-CdA)；包括抗有絲分裂藥物之天然產物，諸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春花生物鹼，包括長春鹼(vinblastine)(VLB)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞賓(vinorelbine)、紫杉德(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)及雌莫司汀磷酸鹽；表鬼臼毒素類藥(pipodophylotoxins)，諸如依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)；抗生素，諸如放線菌素(actinomycin)D 、道諾黴素(daunomycin)(紅比黴素(rubidomycin))、小紅莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、艾達黴素(idarubicin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)(光神黴素(mithramycin))、絲裂黴素(mitomycin) C 及放線菌素；酶，諸如L-天冬醯胺酶；生物反應修飾因子，諸如干擾素-α、IL-2、G-CSF及GM-CSF；包括鉑配位錯合物之雜項藥劑，諸如奧沙利鉑(oxaliplatin)、順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)、諸如米托蒽醌之蒽二酮、諸如羥脲之取代脲、包括N-甲基肼(MIH)及丙卡巴肼(procarbazine)之甲基肼衍生物、諸如米托坦(mitotane)(o, p-DDD)及胺麩精之腎上腺皮質抑制劑；包括腎上腺皮質類固醇拮抗劑之激素及拮抗劑，諸如潑尼松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)及胺麩精；健擇(Gemzar)(TM)(吉西他濱)、孕激素，諸如羥基孕酮己酸鹽、甲羥孕酮乙酸鹽及乙酸甲地孕酮；雌激素，諸如己烯雌酚及乙炔基雌二醇等效物；抗雌激素，諸如他莫昔芬(tamoxifen)；包括睪固酮丙酸鹽及氟甲睾酮/等效物之雄激素；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、促性腺激素釋放激素類似物及亮丙立德(leuprolide)；及非類固醇抗雄激素，諸如氟他胺。亦可組合標靶表觀遺傳機制之療法與抗原結合蛋白，該等療法包括(但不限於)組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、去甲基劑(例如維達紮(Vidaza))及轉錄抑制解除(ATRA)療法。在一個實施例中，化學治療劑選自由以下組成之群：紫杉烷(taxane)(如太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西他賽(docetaxel)(紫杉德)、經改質太平洋紫杉醇(例如阿布拉生(Abraxane)及歐帕西(Opaxio))、小紅莓、舒尼替尼(sunitinib)(舒癌特(Sutent))、索拉非尼(sorafenib)(雷沙瓦(Nexavar))及其他多重激酶抑制劑奧沙利鉑、順鉑及卡鉑、依託泊苷、吉西他濱及長春鹼。在一個實施例中，化學治療劑選自由以下組成之群：紫杉烷(如紫杉醇(太平洋紫杉醇)、多西他賽(紫杉德)、經改質太平洋紫杉醇(例如阿布拉生及歐帕西)。在一個實施例中，其他化學治療劑選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)或奧沙利鉑。在一個實施例中，化學治療劑為5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸及伊立替康(FOLFIRI)。在一個實施例中，化學治療劑為5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑(FOLFOX)。在一個較佳實施例中，無其他化學治療劑與抗CSF-1R抗體以及抗CD40抗體一起投與。 與其他化學治療劑之組合療法之特定實例包括例如紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)或經改質太平洋紫杉醇(例如阿布拉生或歐帕西)、小紅莓)、卡培他濱(capecitabine)及/或貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin))治療乳癌之療法；用卡鉑、奧沙利鉑、順鉑、太平洋紫杉醇、小紅莓(或經改質小紅莓(楷萊(Caelyx)或多希(Doxil)))或拓朴替康(topotecan)(和美新(Hycamtin))治療卵巢癌症，用多重激酶抑制劑、MKI(舒癌特、雷沙瓦或706)及/或小紅莓治療腎臟癌症之療法；用奧沙利鉑、順鉑及/或輻射治療鱗狀細胞癌之療法；用紫杉醇及/或卡鉑治療肺癌之療法。 因此，在一個實施例中其他化學治療劑係選自以下之群：紫杉烷(多西他賽或太平洋紫杉醇或改質太平洋紫杉醇(阿布拉生或歐帕西)、小紅莓、卡培他濱及/或貝伐單抗，其用於乳癌治療。 在一個較佳實施例中，無其他化學治療劑與抗CSF-1R抗體以及抗CD40抗體一起投與。
胺基酸序列之描述
SEQ ID NO:1 重鏈可變域，hMab 2F11-c11 SEQ ID NO:2 輕鏈可變域，hMab 2F11-c11 SEQ ID NO:3 重鏈可變域，hMab 2F11-d8 SEQ ID NO:4 輕鏈可變域，hMab 2F11-d8 SEQ ID NO:5 重鏈可變域，hMab 2F11-e7 SEQ ID NO:6 輕鏈可變域，hMab 2F11-e7 SEQ ID NO:7 重鏈可變域，hMab 2F11-f12 SEQ ID NO:8 輕鏈可變域，hMab 2F11-f12 SEQ ID NO:9 重鏈可變域，hMab 2F11-g1 SEQ ID NO:10 輕鏈可變域，hMab 2F11-g1 SEQ ID NO:11 CD40促效抗體CP-870,893之重鏈可變域(U.S.7,338,660之抗體21.4.1) SEQ ID NO:12 CD40促效抗體CP-870,893之輕鏈可變域(U.S.7,338,660之抗體21.4.1) SEQ ID NO:13 CD40促效抗體人類化S2C6變異體之重鏈可變域 SEQ ID NO:14 CD40促效抗體人類化S2C6變異體之輕鏈可變域 SEQ ID NO:15 抗PD-L1抗體阿特珠單抗之重鏈可變域 SEQ ID NO:16 抗PD-L1抗體阿特珠單抗之輕鏈可變域 SEQ ID NO:17 TLR9促效劑CpG ODN 2216 SEQ ID NO:18 TLR9促效劑CpG ODN PB4 SEQ ID NO:19 TLR9促效劑CpG ODN 1002 SEQ ID NO:20 TLR9促效劑CpG-7909 (CpG 2006，PF-3512676，阿托莫特) SEQ ID NO:21 TLR9促效劑CpG-685 (GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech) SEQ ID NO:22 TLR9促效劑CpG-684 SEQ ID NO:23 TLR9促效劑CpG-28 SEQ ID NO:24 例示性人類CSF-1R(wt CSF-1R) SEQ ID NO:25 人類CSF-1R胞外域(域D1至D5) SEQ ID NO:26 人類CSF-1R片段域D1至D3 SEQ ID NO:27 人類CSF-1R片段域D4至D5 SEQ ID NO:28 人類CSF-1 SEQ ID NO:29 人類IL-34 SEQ ID NO:30 例示性人類CD40 SEQ ID NO:31 例示性人類PD-L1 SEQ ID NO:32 例示性人類鐸樣受體9(TLR9) SEQ ID NO:33 人類κ輕鏈恆定區 SEQ ID NO:34 源自IgG1之人類重鏈恆定區 SEQ ID NO:35 在L234A及L235A上突變的源自IgG1之人類重鏈恆定區 SEQ ID NO:36 源自IgG4之人類重鏈恆定區 SEQ ID NO:37 來源於在S228P上突變之IgG4之人類重鏈恆定區
在下文中 ， 描述本發明之特定實施例 ：
1A. 一種結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a)癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅以每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 1B. 一種結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a)癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在血清中之CD14+CD16+陽性單核球顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 1C. 一種結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a)癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在CD163+/CD68+陽性腫瘤相關巨噬細胞顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 2. 用於如實施例1A或1B或1C中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅以每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 3. 用於如實施例1至2中任一者之治療之抗CSF-1R抗體 ，其中治療週期之長度係在2週與4週之間(在一個較佳實施例中，治療週期之長度係18天與24天之間且在另一個較佳實施例中治療週期之長度係(約)3週)。 4. 用於如實施例1至3中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中抗CSF-1R抗體以600-1200 mg之劑量投與(在一個實施例中以750-1100 mg之劑量，在一個實施例中以750-1000 mg、900-1000 mg之劑量，在實施例中以750 mg，在一個實施例中以900 mg，在一個實施例中以1000 mg)。 5. 用於如實施例1至4中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體且在各週期中以4-16 mg之劑量投與(在一個實施例中以8-16 mg之劑量)。 6. 用於如實施例1至4中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體且在各週期中以1100-1300 mg之劑量投與(在一個實施例中以1200 mg之劑量)。 7. 用於如實施例1至6中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中組合療法用於治療諸如腫瘤免疫性之免疫相關疾病或延緩該疾病之進展。 8. 用於如實施例1至6中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中組合療法用於刺激免疫反應或功能，諸如T細胞活性。 9. 用於如實施例1至8中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中抗CSF-1R抗體包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL。 10. 用於如實施例1至5、7至9中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體。 11. 用於如實施例11之治療之抗CSF-1R抗體， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 促效性CD40抗體包含 SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL。 12. 用於如實施例1至4、6至9中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體。 13. 用於如實施例12之治療之抗CSF-1R抗體， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 拮抗性PD-L1抗體包含 SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL。 14. 用於如實施例1至4、7至9中任一者之治療之抗CSF-1R抗體，其中巨噬細胞活化劑係TLR9促效劑。 15. 用於如實施例14之治療之抗CSF-1R抗體， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 其中TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳寡去氧核苷酸含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN))。
在下文中 ， 描述本發明之特定實施例 ：
1A. 一種包含結合於人類CSF-1R之抗體的醫藥組合物或藥劑，其用於 a)癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 1B. 一種包含結合於人類CSF-1R之抗體的醫藥組合物或藥劑，其用於 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在血清中之CD14+CD16+陽性單核球顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 1C. 一種包含結合於人類CSF-1R之抗體的醫藥組合物或藥劑，其用於 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在CD163+/CD68+陽性腫瘤相關巨噬細胞顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 2. 如實施例1A或1B或1C中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅以每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 3. 如實施例1至2中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中治療週期之長度係在2週與4週之間(在一個較佳實施例中治療週期之長度係18天與24天之間，且在另一個較佳實施例中治療週期之長度係(約)3週)。 4. 如實施例1至3中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中抗CSF-1R抗體以600-1200 mg之劑量投與(在一個實施例中以750-1100 mg之劑量，在一個實施例中以750-1000 mg、900-1000 mg之劑量，在實施例中以750 mg，在一個實施例中以900 mg，在一個實施例中以1000 mg)。 5. 如實施例1至4中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體且在各週期中以4-16 mg之劑量投與(在一個實施例中以8-16 mg之劑量)。 6. 如實施例1至4中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體且在各週期中以1100-1300 mg之劑量投與(在一個實施例中以1200 mg之劑量)。 7. 如實施例1至6中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中組合療法用於治療諸如腫瘤免疫性之免疫相關疾病或延緩該疾病之進展。 8. 如實施例1至6中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中組合療法用於刺激免疫反應或功能，諸如T細胞活性。 9. 如實施例1至8中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中抗CSF-1R抗體包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL。 10. 如實施例1至5、7至9中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體。 11. 如實施例10之醫藥組合物或藥劑， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 促效性CD40抗體包含 SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL。 12. 如實施例1至4、6至9中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體。 13. 如實施例13之醫藥組合物或藥劑， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 拮抗性PD-L1抗體包含 SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL。 14. 如實施例1至4、7至9中任一者之醫藥組合物或藥劑，其中巨噬細胞活化劑係TLR9促效劑。 15. 如實施例14之醫藥組合物或藥劑， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 其中TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳寡去氧核苷酸含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN))。
在下文中 ， 描述本發明之特定實施例 ：
1A. 一種結合於人類CSF-1R之抗體之用途，其用於製造用於以下之藥劑 a)癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 1B. 一種結合於人類CSF-1R之抗體之用途，其用於製造用於以下之藥劑 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在血清中之CD14+CD16+陽性單核球顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 1C. 一種結合於人類CSF-1R之抗體之用途，其用於製造用於以下之藥劑 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在CD163+/CD68+陽性腫瘤相關巨噬細胞顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 2. 如實施例1A或1B或1C中任一者之用途，其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅以每隔一週期(在一個實施例中以每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 3. 如實施例1至2中任一者之用途，其中治療週期之長度係在2週與4週之間(在一個較佳實施例中治療週期之長度係18天與24天之間，且在另一個較佳實施例中治療週期之長度係(約)3週)。 4. 如實施例1至3中任一者之用途，其中抗CSF-1R抗體以600-1200 mg之劑量投與(在一個實施例中以750-1100 mg之劑量，在一個實施例中以750-1000 mg、900-1000 mg之劑量，在實施例中以750 mg，在一個實施例中以900 mg，在一個實施例中以1000 mg)。 5. 如實施例1至4中任一者之用途，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體且在各週期中以4-16 mg之劑量投與(在一個實施例中以8-16 mg之劑量)。 6. 如實施例1至4中任一者之用途，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體且在各週期中以1100-1300 mg之劑量投與(在一個實施例中以1200 mg之劑量)。 7. 如實施例1至6中任一者之用途，其中組合療法用於治療諸如腫瘤免疫性之免疫相關疾病或延緩該疾病之進展。 8. 如實施例1至6中任一者之用途，其中組合療法用於刺激免疫反應或功能，諸如T細胞活性。 9. 如實施例1至8中任一者之用途，其中抗CSF-1R抗體包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL。 10. 如實施例1至5、7至9中任一者之用途，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體。 11. 如實施例10之用途， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 促效性CD40抗體包含 SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL。 12. 如實施例1至4、6至9中任一者之用途，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體。 13. 如實施例12之用途， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 拮抗性PD-L1抗體包含 SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL。 14. 如實施例1至4、7至9中任一者之用途，其中巨噬細胞活化劑係TLR9促效劑。 15. 如實施例14之用途， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 其中TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳寡去氧核苷酸含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN))。
在下文中 ， 描述本發明之特定實施例 ：
1A. 一種治療方法，該方法包含投與(有效量之)結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合(有效量之)巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅每隔一週期(在一個實施例中每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 1B. 一種治療方法，該方法包含投與(有效量之)結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a) 癌症之治療，或 b)患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合(有效量之)巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在血清中之CD14+CD16+陽性單核球顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 1C. 一種治療方法，該方法包含投與(有效量之)結合於人類CSF-1R之抗體，其用於 a) 癌症之治療，或 b) 患有具有CSF-1R表現型巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者之治療， 其中在第一治療週期中組合(有效量之)巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體，該巨噬細胞活化劑選自促效性CD40抗體、鐸樣受體(TLR)配位體、TLR促效劑、拮抗性PD-L1抗體之群， 且其中，接下來僅在CD163+/CD68+陽性腫瘤相關巨噬細胞顯著恢復之後組合巨噬細胞活化劑來投與抗CSF-1R抗體(在一個實施例中恢復大於60%，在一個實施例中大於80%)。 2. 如實施例1A或1B或1C中任一者之方法，其中在之後的治療週期中抗CSF-1R抗體僅以每隔一週期(在一個實施例中以每隔兩週期)組合巨噬細胞活化劑來投與，而巨噬細胞活化劑在各治療週期中投與。 3. 如實施例1至2中任一者之方法，其中治療週期之長度係在2週與4週之間(在一個較佳實施例中治療週期之長度係18天與24天之間，且在另一個較佳實施例中治療週期之長度係(約)3週)。 4. 如實施例1至3中任一者之方法，其中抗CSF-1R抗體以600-1200 mg之劑量投與(在一個實施例中以750-1100 mg之劑量，在一個實施例中以750-1000 mg、900-1000 mg之劑量，在實施例中以750 mg，在一個實施例中以900 mg，在一個實施例中以1000 mg)。 5. 如實施例1至4中任一者之方法，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體且在各週期中以4-16 mg之劑量投與(在一個實施例中以8-16 mg之劑量)。 6. 如實施例1至4中任一者之方法，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體且在各週期中以1100-1300 mg之劑量投與(在一個實施例中以1200 mg之劑量)。 7. 如實施例1至6中任一者之方法，其中組合療法用於治療諸如腫瘤免疫性之免疫相關疾病或延緩該疾病之進展。 8. 如實施例1至6中任一者之方法，其中組合療法用於刺激免疫反應或功能，諸如T細胞活性。 9. 如實施例1至8中任一者之方法，其中抗CSF-1R抗體包含 a) SEQ ID NO:1之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:2之輕鏈可變域VL，或 b) SEQ ID NO:3之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:4之輕鏈可變域VL，或 c) SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，或 d) SEQ ID NO:7之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:8之輕鏈可變域VL，或 e) SEQ ID NO:9之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:10之輕鏈可變域VL。 10. 如實施例1至5、7至9中任一者之方法，其中巨噬細胞活化劑係促效性CD40抗體。 11. 如實施例10之方法， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 促效性CD40抗體包含 SEQ ID NO:11之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:12之輕鏈可變域VL。 12. 如實施例1至4、6至9中任一者之方法，其中巨噬細胞活化劑係拮抗性PD-L1抗體。 13. 如實施例12之方法， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 拮抗性PD-L1抗體包含 SEQ ID NO:15之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:16之輕鏈可變域VL。 14. 如實施例1至4、7至9中任一者之方法，其中巨噬細胞活化劑係TLR9促效劑。 15. 如實施例14之方法， 其中抗CSF-1R抗體包含 SEQ ID NO:5之重鏈可變域VH及SEQ ID NO:6之輕鏈可變域VL，且 其中TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其含有a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN)；b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基元(YpG ODN)；或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基元(CpR ODN)(較佳寡去氧核苷酸含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基元(CpG ODN))。
實例 抗 CSF - 1R 抗體與巨噬細胞活化促效性 CD40 抗體之組合 實例 1A ： 抗 CSF - R 抗體 + 巨噬細胞活化促效性 CD40 抗體之協同功效 ( 圖 1 )
將雌性C57BL/6N小鼠(6至8週大，獲自Charles Rive)皮下接種10
6
MC38結腸直腸腺癌腫瘤細胞。藉由測徑規測量監測腫瘤生長曲線，且一旦腫瘤大小達到平均250 mm
3
則分組用於用以下處理： a)IgG同型對照抗體：30 mg/kg 鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell)；或 b)抗CD40抗體：4 mg/kg大鼠IgG2a抗體，殖株FGK45 (BioXCell)；或 c)抗CSF-1R抗體：30 mg/kg倉鼠-小鼠嵌合抗體殖株2G2 (Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)；或 d)抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合：經組合，同時處理，如b)及c)中投藥。 將抗CSF-1R抗體或相應IgG1對照抗體每週投與，直至腫瘤完全消退或動物達到終結標準，而抗CD40抗體僅在第10天伴隨抗CSF-1R抗體投與一次。總體研究設計描繪於圖1A中。 圖1B描繪直至腫瘤體積達到≥ 700 mm
3
之無進展存活期，證明CSF-1R與CD40抗體組合治療之協同抗腫瘤功效。對用抗CSF-1R抗體與抗CD40抗體組合處理且在排斥原發性腫瘤時保持無腫瘤至少30天之小鼠藉由皮下接種5 × 10
6
MC38至對側側腹來進行再攻擊。圖1C顯示，相比於未經處理小鼠，先前經抗CSF-1R抗體與抗CD40抗體組合處理的小鼠之再攻擊產生快速腫瘤排斥。實際上，全部8隻先前經組合處理的小鼠在第二次腫瘤注射之後第21天無腫瘤。此等結果表明，抗CSF-1R與抗CD40抗體組合治療可誘導腫瘤-細胞特異性免疫反應。
實例 1B ： 在抗 CD40 與 抗 CSF1R 抗體之組合治療之前 CD8 α 陽性 T 細胞 之清除破壞抗 CSF - R 抗體與巨噬細胞活化劑類促效性 CD40 抗體之協同效應 ( 圖 2 )
將雌性C57BL/6N小鼠(6至8週大，獲自Charles Rive)皮下接種10
6
MC38結腸直腸腺癌腫瘤細胞。藉由測徑規測量監測腫瘤生長曲線，且一旦腫瘤大小達到平均地190 mm
3
則分配小鼠分組用於用以下清除性抗體處理； a) 抗CD8α抗體；4mg/kg小鼠IgG2a，殖株53-6.7 (BioXCell)；或 b)抗CD4抗體；4mg/kg小鼠IgG2b，殖株GK1.5 (Biolegend)；或 c) 抗NK1.1抗體；4mg/kg小鼠IgG2a，殖株PK136 (BioXCell)； 當腫瘤大小達到平均190mm
3
時開始使用抗CD8α抗體、抗CD4抗體及抗NK1.1抗體清除淋巴細胞。每隔一天給予一次抗體，進行四次。在清除性抗體之兩次劑量及三次劑量之間，將動物進一步用以下處理： d) 媒劑對照：0.9% 鈉鹽水(僅清除抗體對照)，或 e) IgG同型對照抗體：30 mg/kg 鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell)；或 f) 抗CD40抗體：4 mg/kg大鼠IgG2a抗體，殖株FGK45 (BioXCell)；或 g) 抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合：30 mg/kg倉鼠-小鼠嵌合抗體殖株2G2 (Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)； 將抗CSF-1R抗體或相應IgG1對照抗體每週投與，直至腫瘤完全消退或動物達到終結標準，而抗CD40抗體僅在第11天與抗CSF-1R抗體同時投與一次。總體研究設計描繪於圖2A中。 圖2B顯示，在抗CD40及CSF-1R腫瘤攜帶小鼠中，CD8陽性T細胞之清除導致對存活期之有利作用之破壞。在此等小鼠中，CD4陽性T細胞或NK1.1表現NK細胞之清除均不影響存活期。此強調，在經組合處理之小鼠中啟動了細胞毒性T細胞反應。值得注意的是，清除CD4陽性細胞且僅用抗CD40處理的小鼠之存活期相比於經清除其他淋巴細胞亞型之小鼠顯著增強(10隻小鼠中4隻無腫瘤)。此可表明，在進行抗CD40治療之MC38腫瘤攜帶小鼠中，抑制性CD4陽性T細胞(例如調節T細胞)亦對總存活期具有負面影響。
實例 1C ： 抗 CSF - R 抗體與巨噬細胞活化劑類促效性 CD40 抗體之協同功效視腫瘤相關巨噬細胞 ( TAM ) 之存在而定 ( 圖 3 )
將雌性C57BL/6N小鼠(6至8週大，獲自Charles Rive)用10
6
MC38結腸直腸腺癌腫瘤細胞進行皮下接種。藉由測徑規測量監測腫瘤生長曲線且在第3天開始上預處理。分配動物用於用以下抗體預處理： a)IgG同型對照抗體：30 mg/kg 鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell，完全Fc勝任型抗體)；或 b)IgG同型對照抗體之Fc失效(FcØ)變異體：30 mg/kg人類IgG1，抗地高辛(anti-Digoxigenin)(US 2012/0251531 A1)；或 c) 抗CSF-1R抗體Fc-失效(FcØ)變異體：30 mg/kg倉鼠-人類嵌合抗體，殖株2G2之CDR (Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)在人類IgG1 PG LALA FcØ上(Roche專利US 2012/0251531 A1) 針對功效讀取，在腫瘤接種之後第3天及第9天將小鼠腹膜內注射抗體(a至c)中之任一者且隨後進一步按腫瘤大小(平均120 mm
3
)分配以在第11天用以下抗體處理： d) IgG同型對照抗體：30 mg/kg鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell)；或 e)抗CD40抗體：4 mg/kg大鼠IgG2a抗體，殖株FGK45 (BioXCell)；或 f) 抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合(30 mg/kg倉鼠-小鼠嵌合抗體殖株2G2；Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)。 針對組合處理，動物僅用抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體同時處理一次。總體研究設計描繪於圖3A中。 流式細胞測量術：在投與組合處理之前第11天對每預處理組中之4隻小鼠之腫瘤上使用流式細胞測量術測定TAM清除之功效。用完全Fc勝任型CSF-1R抗體處理(殖株2G2，在第3天及第9天處理，30 mg/kg；Ries等人Cancer Cell 2014, 25:846-859)充當正控制。針對流動式細胞量測分析，收集腫瘤且在機械破裂時使用分散酶II (最終1mg/ml，Roche #04942078001)、膠原蛋白酶IV (最終1mg/ml，Sigma Aldrich #L5138)及DNAse I (最終0.01%；Roche #11284932001)在37℃下於DPBS (PAN-Biotech，#P04-36500)中分解30 min。在40µm細胞過濾器(EASYstrainer，Greiner #542 040)上進行單細胞懸浮且洗滌細胞之後，使用Pharm溶解緩衝液根據製造商之說明書(BD Pharmingen，#558995)移除紅血球。將細胞(2 × 10
6
)最終在中125μl FACS緩衝液(DPBS+5% FSC (Gibco，#10500-038)、5mM EDTA (Invitrogen，#15575-038))再懸浮，且在添加以下抗體之前使用Fc阻斷抗體(殖株2.4G2，BD Pharmingen，#553142)培育5分鐘，在冰上培育30分鐘及再次清洗：
在Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)上獲取資料之前添加DAPI (Roche，#10236276001)，以便排除失效細胞。使用FlowJo軟體10版分析資料且使用GraphPad Prism軟體6.07版統計評估。 在施加組合治療之前清除TAM，以便顯示抗CSF-1R與抗CD40抗體之組合作用實際上係視巨噬細胞而定(參見實例1A)。抗CD40抗體之功能視經由FcRIIb之交聯而定(Li及Ravetch, Science 2011, 333:1030-1034；White等人Journal of Immunology 2001, 187:1754-63；Richmann及Vonderheide, Cancer Immunology Research 2013, 2: 19-26)，在預處理期間當使用30mg/kg之鼠類IgG1 (同型或抗CSF-1R抗體)時其可能經阻斷。因此，對缺失Fc受體功能(FcØ變異體)之情況採用同型對照及抗CSF-1R抗體用於預處理。為使用此FcØ抗體變異體確認TAM之清除，在第11天對其他動物之腫瘤進行流式細胞分析。藉由以下標記物組合鑑別TAM：DAPI
-
CD45
+
CD11b
+
F4/80
高
Ly6G
陰性
Ly6C
低
。如圖3B中所示，抗CSF-1RFcØ變異體在2次處理之後在清除TAM方面與相應Fc勝任型及Fc靜止(Fc-silent)抗體變異體一樣有效。 在用抗CD40或抗CD40與抗CSF-1R抗體之組合處理之前預清除TAM的存活期研究之結果展示於圖3C中。相比於對照預處理，在抗CD40與抗CSF-1R組合處理之前使用CSF-1RFcØ抗體清除TAM完全破壞組合療法之存活期益處(在研究結束時10隻小鼠中沒有小鼠無腫瘤)。用同型對照預處理攜帶腫瘤之小鼠確實導致當經CD40/CSF-1R組合處理時10隻小鼠中之7隻完全排斥腫瘤。此等結果強調巨噬細胞在促進抗CD40與抗CSF-1R抗體組合治療之功效方面之重要作用。
實例 1D ： CSF - 1R 傳訊阻斷加強 CD40 mAb 調節的腫瘤相關巨噬細胞 ( TAM ) 朝向強促炎性表型之極化 ( 圖 4 )
將雌性C57BL/6N小鼠(6至8週大，獲自Charles Rive)皮下接種10
6
MC38結腸直腸腺癌腫瘤細胞。藉由測徑規測量監測腫瘤生長曲線，且一旦腫瘤大小達到平均220 mm
3
則分組用於用以下處理： a) IgG同型對照抗體：30 mg/kg 鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell)；或 b) 抗CD40抗體：4 mg/kg大鼠IgG2a抗體，殖株FGK45 (BioXCell)；或 c) 抗CSF-1R抗體：30 mg/kg倉鼠-小鼠嵌合抗體殖株2G2 (Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)；或 d) 抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合：經組合，同時處理，如b)及c)中投藥。 所有抗體均投與一次且在16小時之後獲得腫瘤。用於細胞分類目的，如實例1C中所描述地處理且染色腫瘤用於流式細胞測量術。使用FACS Aria II儀器(BD Bioscience)將細胞分類，以每組4隻動物且如圖4A中所示進行閘控用於分類。獲得三種不同骨髓細胞群(每樣品最少10,000個細胞經分類 )： a) 單核球性MDSC (骨髓衍生的抑制細胞)： CD45
+
CD11b
+
F4/80
低
Ly6G
陰性
Ly6C
高
b)TAM前驅體： CD45
+
CD11b
+
F4/80
低
Ly6G
陰性
Ly6C
低
c) TAM (腫瘤相關巨噬細胞)：CD45
+
CD11b
+
F4/80
高
Ly6G
陰性
Ly6C
低
對經分類的細胞群進行RNA定序分析且使用基於描述於以下研究中之方法的自產工具處理原始數據：Langmead, B.及Salzberg, S.L., Nat Methods 9 (2012) 357-359；Mortazavi, A.等人，Nat Methods 5 (2008) 621-628，針對來自各處理組之各細胞群中之各基因產生經正規化的基因表現值。 使用可公開獲得的工具對所得基因表現值進行特徵分析(Sandmann, T.等人，Bioinformatics 30 (2014) 127-128)。結果係威爾卡森/曼-惠特尼(Wilcoxon/Mann-Whitney)秩和統計，代表由處理組相比於其他之特徵表示的路徑或表型之活化水準或可能性水準。對於各處理組進行三個比較，例如將抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合處理組分別與抗CD40組、抗CSF-1R組及IgG同型對照組比較。 特徵係一組功能相關基因，典型地由旨在表徵所關注之生物表型的化學或基因擾動實驗之生物信息學分析界定，例如不同巨噬細胞亞型(M1 對比M2)或LPS刺激的巨噬細胞對比未刺激的巨噬細胞。各種細胞類型(例如免疫細胞、癌細胞、乳腺上皮細胞)之擾動之88個特徵，其涉及LPS、干擾素或TNF刺激，用於檢測一般免疫活化作用。所有88個特徵均獲自分子特徵資料庫(Molecular Signatures Database)(MSigDB，Subramanian A.等人，PNAS 102 (2005) 15545-50)。七個特徵用於檢測M1/M2表型；在此等七個特徵中，三個係獲自已公開的研究(Schmieder A.等人，Semin Cancer Biol. 22(4) (2012) 289-97；Martinez F.O.等人，Blood121(9): (2013) e57-69)且四個係在Roche產生，其使用Affymetrix微陣列芯片上描繪之活體外分化的巨噬細胞基因表現資料。 圖4B概括無控制處理組(列)及骨髓細胞群(行)中之各者之分析結果。「X」表示在所有三個用於處理組之比較中無顯著或恆定的活化/抑制。總體而言，在三個無控制處理中，在進行分析的時間點，抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合係唯一在所有三個骨髓亞型中明確誘導出活化類M1作用(頂部圖)且在所有三個骨髓亞型中明確誘導出一般免疫活化類作用(底部圖)的處理。
實例 1E ： CD40 及 CSF - 1R 由人類 TAM 表現 ( IRIS IHC )( 圖 5 )
將來自結腸直腸癌(CRC)、間皮瘤及三陰性乳癌(TNBC)之患者樣品切成2.5 μm經福馬林固定的、石蠟嵌入的組織切片。在Ventana Benchmark XT上使用NEXES 10.6版軟體按IHC方案將切片染色用於FOXP3 (1 µg/mL，236A/E7，Abcam ab20034)、呈雙工模式之CD40 (1:100，Spring Bioscience，E3704)與CD68 (RTU，KP-1，Ventana Medical Systems，790-2931)、CD163 (RTU，MRQ-26，Ventana Medical Systems，760-4437)及CSF1R (1 µg/mL，29，Roche Diagnostics GmbH)。 將切片進行CC1 (基於三羥甲基胺基甲烷的細胞調理劑1)處理32分鐘，隨後抗體培育(FOXP3：在37℃下1小時，CD40：在37℃下32分鐘，CD68：在37℃下32分鐘，CD163：在37℃下16分鐘，CSF1R：在37℃下32分鐘)，且使用OptiView DAB (FOXP3、CD40、CSF1R)偵測系統或ultraView-DAB (CD163)或ultraView-Red (CD68)偵測體系偵測陽性染色。使用Ventana iScan HT亮視野掃描儀將載片以20×掃描，且藉由委員會認證的病理學家使用基於組稀疏模型(Chen及Chukka, doi:10.1016/j.compmedimag.2015.04.001)之算法分析。 所得不同生物標記之密度值彼此成對相關。所得相關性係數在圖5中以熱圖之方式可視化以給出簡單明瞭的不同標記物之間的關係之概述：紅色視野顯示陽性相關性，藍色視野顯示陰性相關性。除其他以外，CSF1R陽性細胞之密度與CD40
+
/CD68
+
細胞成正向相關，指示在此等標記物中之潛在的共表現，觀測到在間皮瘤及CRC子集中顯著。相比之下，在TNBC子集中未發現顯著相關性。(圖5)
實例 1F ： CD40 與 CSF - 1R 組合在臨床前小鼠模型中具有良好耐受性 ( 圖 6 )
將雌性C57BL/6N小鼠(6至8週大，獲自Charles Rive)皮下接種10
6
MC38結腸直腸腺癌腫瘤細胞。藉由測徑規測量監測腫瘤生長曲線，且一旦腫瘤大小達到平均260 mm
3
則分組用於用以下處理： a) IgG同型對照抗體：30 mg/kg 鼠類IgG1，殖株MOPC-21 (BioXCell)；或 b) 抗CD40抗體：4 mg/kg大鼠IgG2A抗體，殖株FGK45 (BioXCell)；或 c)抗CSF-1R抗體：30 mg/kg倉鼠-小鼠嵌合抗體殖株2G2 (Ries等人，Cancer Cell 25:846-859, 2014)；或 d) 抗CD40抗體與抗CSF-1R抗體之組合：經組合，同時處理，如b)及c)中投藥。 所有抗體均在第11天投與一次且在指定時間點監測動物之體重。由每組n=5至10隻小鼠來計算平均標準差(Mean ± SEM)。 抗CD40治療僅誘導暫態體重損失，其與抗CD40與抗CSF1R組合相當。在第17天(處理開始6天之後)相比於抗CD40、抗CSF-1R或IgG對照處理動物未偵測到體重上之差異(圖6)。
實例 1G ： 腫瘤相關巨噬細胞 ( TAM ) 自持續清除至暫態清除組合巨噬細胞活化劑類似 CD40 促效劑 的 CSF1R 治療之轉化 ( 圖 7 及圖 8 ) 在探索性群 Q6W 中艾瑪圖單抗 ( 包含 SEQU ID No : 5 及 SEQ ID NO : 7 之 VH 及 VL 的抗 CSFR 抗體 ， 作為 Ig1 κ 恆定域 ) 之劑量及排程基本原理
替代治療排程旨在研究在巨噬細胞由於艾瑪圖單抗投藥而初始減少之後巨噬細胞之再生是否係有利的。已鑑別活體內臨床前模型具有巨噬細胞依賴性以驅動最大功效。為獲得巨噬細胞之再生，將測試艾瑪圖單抗之Q6W投藥排程。針對此方案已選擇固定(平緩)投藥，因為不期望對總體暴露之體表面積(body surface area；BSA)或體重之強影響。 量測血清中之前驅體人類CD14+CD16+單核球作為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之替代物，因為此血液單核球之恢復與後續腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之恢復相關。 已建立擬合目前可獲得的人類CD14+CD16+單核球資料的藥力學模型。基於初步種群分析，在Q6W之投藥區間即將結束之際(約7天)，投與750 mg劑量Q6W顯示CD14+CD16+單核球之恢復(圖5)。此估計的單核球恢復亦與艾瑪圖單抗之線性PK之損失及在Q6W之投藥區間即將結束之際靶點飽和度之降低一致(圖7)。 基於研究BP27772之PK分析(100-3000 mg Q2W；N=36患者)，艾瑪圖單抗之PK顯示為自100至900 mg Q2W非線性。C
max
及AUC皆顯示大於劑量比例之增加，伴有在相同劑量範圍上總清除之降低，表明艾瑪圖單抗之消除在此等劑量達成之暴露下主要係靶點介導的。高於900 mg，暴露以約劑量比例方式增加至3000 mg，其表明靶點介導的消除已飽和。 包含線性及非線性清除路徑二者的二室PK模型已擬合目前可獲得的人類資料。非線性清除路徑可能與在治療開始時受體之靶點含量相關且可視為代表性TMDD。二室模型中之非線性消除亦可用於預測靶點介導的消除之飽和度(靶點飽和度之替代物)。AUC
最終
及CL指定TMDD對總體CL之貢獻在600 mg劑量處開始降低且在900 mg及更高劑量處達到最小，表明劑量≥900 mg達到≥90%靶點飽和度(Q2W)(圖8)。 自200 mg開始，在皮膚及腫瘤活檢體中觀測到巨噬細胞之劑量/全身暴露依賴型降低，其在100 µg/mL之C
ave
達到平台期，其大致對應於針對單藥療法及組合太平洋紫杉醇之≥900 mg劑量。亦研究其他外周血液生物標記，諸如單核球及CSF-1含量。此等外周血液生物標記之劑量/暴露趨勢類似於組織生物標記(巨噬細胞)且在≥900 mg達到平台期。基於迄今可獲得的資料，為達成巨噬細胞之最大清除，將需要≥90%靶點飽和度。 測試結腸直腸癌(CRC)或黑素瘤(MEL)患者(n=至多50)。研究將以兩步方法實施，藉由測試具有更長投藥區間以便在藉由抗CSF-1R抗體艾瑪圖單抗之初始減少之後允許巨噬細胞前驅體單核球以及相關巨噬細胞之再生的艾瑪圖單抗之替代投藥排程來研究前驅體單核球以及相關巨噬細胞恢復： 在步驟1a中(插入部分)，自艾瑪圖單抗初次輸注六週將針對TAM之潛在恢復、皮膚巨噬細胞以及循環單核球分析用促效性CD40抗體Q3W (以研究之部分I定義的MTD)及艾瑪圖單抗Q6W (750mg)處理之第一組10個患者。 艾瑪圖單抗之起始劑量係750mg Q6W，其根據臨床建模界定。 以防在n=10可評估配對的腫瘤活檢體下TAM未恢復，可以額外n=10患者(步驟1b)測試第二次劑量或投藥排程。第二次劑量及投藥排程將選自劑量增加之最新資料及進行中的擴展組。 在艾瑪圖單抗輸注之後6週觀測到TAM之恢復之情況下，將另外招募至多30個患者至此擴展組(步驟2)。若在第一次劑量及排程之調適之後未觀測到TAM恢復，將終止此研究組。
實例 1H ： 抗腫瘤活性意義上之臨床功效將如下評估 ：
● 最佳總體反應. ● 總體反應率(Overall response rate；ORR)，定義為部分反應率加完全反應率，藉由在初始記錄之後≥4週重複評估確認。 ● 無進展存活期(Progressive-free survival；PFS)，定義為自第一次研究處理至第一次出現疾病進展或死亡(無論哪個先出現)之時間。 ● 反應之持續時間(Duration of response；DOR)，定義為自第一次出現記錄的目標反應之時間至任何起因之進展或死亡(無論哪個先出現)之時間。 ● 臨床效益率(Clinical benefit rate；CBR)，定義為部分反應率加完全反應率加穩定疾病率。 最佳總體反應、目標反應及疾病進展將藉由調查員評估且藉由使用習知RECIST v1.1及經修改的RECIST標準的主要評論確定。若可獲得，強烈推薦呈遞可選的最近期(距第1週期第1天之前不大於6個月)研究前電腦斷層(computed tomography ；CT)掃描(歷史CT掃描)。此掃描將與研究期間收集的掃描相比較以測定縱向腫瘤生長動力學。