CN107847592B

CN107847592B - 用于在淋巴瘤或白血病中诱导淋巴细胞增多的针对人csf-1r的抗体

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Publication number: CN107847592B
Application number: CN201680035606.6A
Authority: CN
Inventors: M·T·S·贝尔蒂拉奇欧; F·卡利加里斯-卡皮奥; G·加莱蒂; C·克莱因; C·里斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2022-01-21
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: US20180222985A1; HK1252860A1; CL2017003295A1; WO2016207312A1; AU2016282877A1; CA2987716A1; EP3313442B1; RU2018102575A; ZA201708074B; CR20170537A; BR112017027614A2; AU2016282877A8; KR20180012873A; EP3313442A1; JP2018525339A; PE20181050A1; MX2017016651A; IL256135A; CN107847592A; JP6811733B2

Abstract

本发明涉及在淋巴瘤和白血病中抗CSF‑1R诱导的淋巴细胞增多和结合人CSF‑1R的抗体与结合人CD20的抗体的组合疗法。

Description

用于在淋巴瘤或白血病中诱导淋巴细胞增多的针对人CSF-1R 的抗体

本发明涉及在诱导淋巴瘤或白血病的淋巴细胞增多中有用的人CSF-1R的抗体。本发明进一步涉及特定的结合人CSF-1R的抗体与特定的结合人CD20的抗体的组合疗法和与通过靶向巨噬细胞用于防止逃脱CD20靶向疗法的CSF-1R抑制剂组合用抗CD20抗体靶向表达CD20的癌症的方法。

发明背景

CSF-1R和CSF-1R抗体

自1986年起就知道人CSF-1受体(CSF-1R；集落刺激因子1受体；同义词：M-CSF受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，Fms原癌基因，c-fms，SEQ ID NO:62)(Coussens，L.等人，Nature 320(1986)277-280)。CSF-1R是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码(综述见例如Roth，P.和Stanley，E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181(1992)141-167)。

CSF-1R是CSF-1(集落刺激因子1，也称作M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子)的受体且介导此细胞因子的生物学效应(Sherr，C.J.等人，Cell 41(1985)665-676)。集落刺激因子-1受体(CSF-1R)(也称作c-fms)的克隆第一次记载于Roussel，M.F.等人，Nature 325(1987)549-552。在该出版物中，显示了CSF-1R具有依赖于该蛋白质的C端尾中的变化(包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合Cbl并由此调节受体下调)的转化潜力(Lee，P.S.等人，Embo J.18(1999)3616-3628)。最近，鉴定出CSF-1R的第二种配体，称作白介素-34(IL-34)(Lin，H.等人，Science 320(2008)807-811)。

目前知道两种结合CSF-1R胞外域的CSF-1R配体。第一种是CSF-1(集落刺激因子1，也称作M-CSF，巨噬细胞；SEQ ID NO:86)，在细胞外作为二硫化物连接的同二聚体找到(Stanley，E.R.等人，Journal of Cellular Biochemistry 21(1983)151-159；Stanley，E.R.等人，Stem Cells 12 Suppl.1(1995)15-24)。第二种是IL-34(人IL-34；SEQ ID NO:87)(Hume，D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。CSF-1R信号传导的主要生物学效应是造血前体细胞至巨噬细胞谱系(包括破骨细胞)的分化，增殖，迁移，和存活。CSF-1R的活化由其CSF-1R配体CSF-1(M-CSF)和IL-34介导。CSF-1(M-CSF)对CSF-1R的结合诱导同二聚体的形成和激酶通过酪氨酸磷酸化的活化(Li，W.等人，EMBO Journal.10(1991)277-288；Stanley，E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.46(1997)4-10)。

生物学活性同二聚体CSF-1在CSF-1受体胞外域(CSF-1R-ECD)的亚域D1至D3内结合CSF-1R。CSF-1R-ECD包含五个免疫球蛋白样亚域(命名为D1至D5)。胞外域(CSF-1R-ECD)的亚域D4至D5不涉及CSF-1结合(Wang，Z.等人，Molecular and Cellular Biology 13(1993)5348-5359)。亚域D4涉及二聚化(Yeung，Y-G.等人，Molecular&CellularProteomics 2(2003)1143-1155；Pixley，F.J.等人，Trends Cell Biol 14(2004)628-638)。

别的信号传导由分别连接PI3K/AKT和Ras/MAPK途径的PI3K之p85亚基和Grb2介导。这两种重要信号传导途径能调节增殖，存活和凋亡。其它结合磷酸化CSF-1R胞内域的信号传导分子包括STAT1，STAT3，PLCy，和Cb1(Bourette，R.P.和Rohrschneider，L.R.，GrowthFactors 17(2000)155-166)。

CSF-1R信号传导在免疫应答中，在骨再建中及在生殖系统中具有生理学作用。已经显示了CSF-1(Pollard，J.W.，Mol.Reprod.Dev.46(1997)54-61)或CSF-1R(Dai，X.M.等人，Blood 99(2002)111-120)任一敲除的动物具有骨石化，造血，组织巨噬细胞，和生殖表型，与CSF-1R在各种细胞类型中的作用一致。

Sherr，C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793涉及一些针对CSF-1R的抗体，它们抑制CSF-1活性。Ashmun，R.A.等人，Blood 73(1989)827-837涉及CSF-1R抗体。Lenda，D.等人，Journal of Immunology 170(2003)3254-3262涉及CSF-1缺陷小鼠中降低的巨噬细胞募集，增殖，和活化，导致肾炎症期间降低的管凋亡。Kitaura，H.等人，Journal of DentalResearch 87(2008)396-400提及一种抗CSF-1抗体，其抑制正牙牙齿移动。WO 2001/030381提及CSF-1活性抑制剂，包括反义核苷酸和抗体，虽然仅仅披露CSF-1反义核苷酸。WO 2004/045532涉及通过CSF-1拮抗剂的转移和骨丢失预防和转移癌治疗，仅仅披露拮抗性抗CSF-1抗体。WO 2005/046657涉及通过抗CSF-1抗体对炎性肠病的治疗。US 2002/0141994涉及集落刺激因子的抑制剂。WO 2006/096489涉及通过抗CSF-1抗体对类风湿性关节炎的治疗。WO2009/026303和WO 2009/112245涉及某些抗CSF-1R抗体，它们在胞外域(CSF-1R-ECD)的头三个亚域(D1至D3)内结合CSF-1R。WO2011/123381(A1)涉及针对CSF-1R的抗体。WO2011/070024涉及在二聚化域(D4至D5)内结合CSF-1R的某些抗CSF-1R抗体。

CD20和CD20抗体

CD20分子(又称作人B淋巴细胞限制性分化抗原或Bp35)是一种已经广泛描述的位于前B和成熟B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白(Valentine，M.A.等人，J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；及Einfeld，D.A.等人，EMBOJ.7(1988)711-717；Tedder，T.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic，I.等人，J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；Tedder，T.F.等人，J.Immunol.142(1989)2560-2568)。CD20在大于90％的B细胞非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson，K.C.等人，Blood 63(1984)1424-1433)，但是在造血干细胞，原B细胞，正常的浆细胞，或其它正常的组织上没有找到(Tedder，T.F.等人，J.Immunol.135(1985)973-979)。

存在着在其CD20结合模式和生物学活性方面显著不同的两种不同类型的抗CD20抗体(Cragg，M.S.等人，Blood 103(2004)2738-2743；及Cragg，M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052)。I型抗体(如例如利妥昔单抗(rituximab),一种具有85％或更高的岩藻糖量的非无岩藻糖基化抗体)在补体介导的细胞毒性中是有力的。

II型抗体(如例如托西莫单抗(Tositumomab)(B1)，11B8，AT80或人源化B-Ly1抗体)经由不依赖于胱天蛋白酶的凋亡及伴随的磷脂酰丝氨酸暴露而有效启动靶细胞死亡。

I型和II型抗CD20抗体分享的共同特征汇总于表1。

表1：I型和II型抗CD20抗体的特性

发明概述

本发明涉及一种结合CSF-1R的抗体，其用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多。

本发明涉及结合CSF-1R的抗体用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的用途。

本发明涉及一种治疗方法，该方法包括施用有效量的结合CSF-1R的抗体，用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多。

一个实施方案是结合CSF-1R的抗体用于制造用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的药物的用途。

在一个实施方案中，该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比。

在一个实施方案中，该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD19抗体和/或抗CD20抗体的治疗易感。

在一个实施方案中，该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞。

在一个实施方案中，该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD20抗体的治疗易感。

本发明进一步涉及一种结合人CSF-1R的抗体，其中该抗体用于与结合人CD20的抗体组合

i)用于治疗表达CD20的癌症；或

ii)用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性；或

iii)用于刺激细胞介导的免疫应答，特别是刺激细胞毒性T-淋巴细胞，刺激T细胞活性，或刺激巨噬细胞活性；或

iv)用于延迟癌症进展；或

v)用于延长罹患癌症的患者的存活。

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；

且其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

本发明进一步涉及一种与通过靶向巨噬细胞用于防止逃脱CD20靶向疗法的CSF-1R抑制剂组合，用抗CD20抗体靶向表达CD20的癌症的方法。

在一个实施方案中，用抗CSF1R抗体靶向该巨噬细胞。

在一个实施方案中，在此类方法中，该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；

且其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

在一个实施方案中，该抗体用于治疗癌症。

在一个优选的实施方案中，该抗体用于治疗表达CD20的癌症，如淋巴瘤(优选B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。

在一个优选的实施方案中，该抗体用于治疗多发性骨髓瘤。

在一个优选的实施方案中，该抗体用于治疗滤泡性淋巴瘤。

在一个优选的实施方案中，该抗体用于治疗何杰金氏病。

在一个实施方案中，该抗体用于预防或治疗转移。

在一个实施方案中，该抗体用于治疗炎性疾病。

在一个实施方案中，该抗体用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。

在一个实施方案中，该抗体用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性。

发明人发现了支持白血病细胞对单核细胞/巨噬细胞的体内依赖性的一组分子相互作用。本发明涉及如下发现，即CSF1R抑制降低白血病细胞载荷(尤其在骨髓中)且提高循环CD20+白血病细胞，如此提示两种不同抗体的治疗剂组合，一种靶向TAM且另一种靶向白血病细胞上的CD20分子。

本文所述特定抗体的此类组合疗法对需要CSF-1R和CD20靶向疗法的患者显示益处。发明人发现施用抗CSF1R抗体诱导显著的淋巴细胞增多，其使得淋巴瘤和白血病对抗CD20和/或抗CD19抗体治疗更加易感。而且，他们显示了循环CD20+白血病细胞的巨噬细胞消减相关升高代表与抗CD20抗体组合的治疗机会。基于升高的CD19+CD20+循环白血病细胞百分比，可以将特定的抗CSF-1R和抗CD20抗体的有效组合疗法施用于遭受淋巴瘤和白血病，尤其是表达CD20的淋巴瘤和白血病的患者。更加惊人地，当抗人CSF1R单抗与GA101联合时，白血病细胞消减显著升高。这一观察结果提示基于两种不同抗体(一种靶向TAM且另一种靶向CD20+循环细胞)的组合的一种新颖治疗策略。

附图说明

图1a-b 1a：GM-CSF或CSF-1(100ng/ml配体)的共培养物，分化成巨噬细胞的人单核细胞。添加hMab 2F11-e7分化6天后。在抗体处理第7天在CTG存活力测定法(

Promega)中测量细胞存活力。计算％细胞存活力：来自处理细胞的RLU信号除以来自无抗体的未处理对照的RLU信号(n＝4)。

1b：GM-CSF(M1)或M-CSF(M2)7天，分化成巨噬细胞的人单核细胞。通过间接荧光分析来分析表型-用抗CD163-PE，抗CD80-PE或抗HLA-DR/DQ/DP-Zenon-Alexa647标记染色。每条柱中的数值对应于均值比率荧光强度(MRFI)；用选定抗体(空心柱)和相应同种型对照(阴性对照；灰色实心柱)染色的细胞的均值荧光强度(MFI)之间的计算比率(均值±SD；n≥5)。

图2a-d 应用不同剂量的抗CSF-1R抗体hMab 2F11-e7之后猕猴中的CSF-1水平。

图3 在TAM存在下，由CD3和CD28活化诱导的T细胞扩充受到阻抑：自MC38肿瘤分离TAM并在CD3/CD28刺激存在下以所示比率与CFSE标记的CD8+T细胞一起共培养。3天后使用CFSE^低分裂细胞的珠量化来分析T细胞增殖。以一式三孔的均值+SEM描绘两项中的一项代表性实验。

图4 CLL异种移植系统中抗CSF1R单抗的抗白血病效果。

(A-B-C-D-E)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝3，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第27天杀死(A)。图中显示SP(B)和BM(C)中以CD45+控门的CD11b+F4/80+细胞的绝对数目的均值。图中显示BM中人CD19+细胞的绝对数目的均值(D)。图中显示SP中以hCD19+细胞控门的人CD19+细胞和Ann-PI+细胞的绝对数目的均值(E)。数据来自三个中的一个代表性实验。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，Student氏t检验。(F-G-H-I)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗)i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝7，白色圆圈)或留置不治疗(n＝7，黑色圆圈)并在第27和29天，最后一次单抗注射后48小时和96小时杀死(F)。图中显示第27，29天时SP中以hCD19+细胞控门的人CD19+细胞和Ann-PI+细胞的绝对数目的均值(G)。图中显示第27天时SP中以CD45+控门的CD11b+F4/80+细胞的绝对数目的均值(H)。图中显示第27天时SP中CD11b+MRC1+细胞对以CD45+控门的CSF1R+巨噬细胞集合的绝对数目的均值(I)。数据来自两个中的一个代表性实验。统计分析：*p<0.05，Student氏t检验。还见图S4。

图5 CLL异种移植系统中抗CSF1R单抗的抗白血病效果和存活影响。

(A-B-C)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝3，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第27天杀死(A)。图中显示PB中hCD19+(B)和hCD19+CD20+(C)细胞的百分比的均值。数据来自两个中的一个代表性实验。使用Student t检验计算统计学显著差异。**p<0.01，***p<0.001。(D-E)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠留置不治疗(n＝10，黑色圆圈)或用：30mg/kgi.v.抗CSF1R单抗(n＝11，白色圆圈；第+11，+25天)；或30mg/kg i.p.抗CD20单抗GA101(n＝10，蓝色圆圈；第+11，+25天)；或30mg/kg i.p.抗CD20单抗GA101(第+11，+25天)+30mg/kgi.v.抗CSF1R单抗(第+18，+32天)(n＝10，紫色圆圈)治疗并监测存活(D)。呈现Kaplan-Meier存活曲线(E)，使用时序检验实施统计分析。αCSF1R对对照：p＝0.01；αCD20对对照：p＝0.006；αCD20+αCSF1R对对照：p<0.0001；αCD20+αCSF1R对αCD20：p＝0.0585。

图6 巨噬细胞靶向对CLL小鼠模型的微环境的影响。

(A-B-C-D-E-F)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝4，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第27或29天杀死(A)。图中显示PB中以CD45+控门的CD11b+CSF1R+细胞的相对贡献的均值(B)。图中显示PB中以CD45+控门的CD11b+CSF1R-SSC高嗜中性细胞的相对贡献的均值(C)。图中显示PB中以CD45+控门的CD11b+Gr1+细胞的相对贡献的均值(D)。数据来自两个中的一个代表性实验。图中显示PB中以CD11b+F4/80^低控门的单核细胞Ly6C+Ly6G(E)和以CD11b+F4/80^低控门的粒细胞Ly6C^低 Ly6G^高(F)细胞的相对贡献的均值。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student氏t检验。(G-H-I-J-K)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用60μlclodrolip i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝4，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第26天杀死(G)。图中显示PB中以CD45+控门的CD11b+CSF1R-SSC^高嗜中性细胞的相对贡献的均值(H)。图中显示PB中以CD45+控门的CD11b+Gr1+细胞的相对贡献的均值(I)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+CSF1R-SSC^高嗜中性细胞的绝对数目的均值(J)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+Gr1+细胞的绝对数目的均值(K)。数据来自两个中的一个代表性实验。统计分析：*p<0.05，Student氏t检验。(L-M-N)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗i.v.治疗(第+11，+25天)(n＝4，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第27或29天杀死(A)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+CSF1R+细胞的绝对数目的均值(L)。数据来自两个中的一个代表性实验。图中显示BM中以CD11b+F4/80^低控门的单核细胞Ly6C+Ly6G-(M)和以CD11b+F4/80^低控门的粒细胞Ly6C^低 Ly6G^高(N)细胞的绝对数目的均值。统计分析：*p<0.05，Student氏t检验。(O-P-Q-R-S-T-U)将i.p.移植来自Eμ-TCL1转基因小鼠的白血病B细胞的C57BL/6小鼠用30mg/kg抗CSF1R单抗i.p.治疗(第+17，+23天)(n＝3，白色圆圈)或留置不治疗(n＝3，黑色圆圈)并在第26天杀死(O)。图中显示PB中CD44+CD62L+中心和CD44+CD62L^低/阴性效应记忆CD8+T细胞的相对贡献的均值(P)。图中显示BM(Q)和SP(R)中CD44+CD62L+中心和CD44+CD62L^低/阴性效应记忆CD8+T细胞的绝对数目的均值。通过流式细胞术测量细胞内IFNγ生成，而且图中显示CD8+CD44+IFNγ+T细胞的绝对数目的均值(S)。图中显示SP中以CD19+CD5+细胞控门的Ann+PI-细胞对整个B细胞集合的绝对数目的均值(T)。图中显示CD4+CD25+T细胞的绝对数目的均值(U)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student氏t检验。(V-W-X)将i.p.移植来自Eμ-TCL1转基因小鼠的白血病B细胞的C57BL/6小鼠用50μl of clodrolip i.p.治疗(在第17天开始，每3天)(n＝4，白色圆圈)或留置不治疗(n＝4，黑色圆圈)并在第24天杀死(V)。图中显示SP中CD44+CD62L+中心和CD44+CD62L低/阴性效应记忆CD8+T细胞的绝对数目的均值(W)。图中显示SP中CD4+CD25+T细胞的绝对数目的均值(X)。

图7 异种移植物小鼠的BM微环境：单核细胞和巨噬细胞群体

(A-B-C-D-E-F)在白血病的早期(n＝3)和晚期(n＝3)阶段杀死未注射(UN，黑色圆圈)或i.v.注射MEC1(白色圆圈)细胞(第0天)的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠并通过流式细胞术进行分析(A)。图中显示BM中hCD19+细胞的相对贡献的均值(B)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+CSF1R+细胞的绝对数目的均值(C)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+F4/80+细胞的绝对数目的均值(D)。图中显示BM中以CD45+控门的CD11b+MRC1+细胞对整个巨噬细胞集合(CD11b+F4/80+)的绝对数目的均值(E)。数据来自三个中的一个代表性实验。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student氏t检验。图中显示BM中CD86+MRC1+和CSF1R+MRC1+细胞对整个CD45+CD11b+集合的绝对数目的均值(F)。统计分析：*p<0.05，Student氏t检验。

图8 来自CLL异种移植物小鼠的BM基质细胞的细胞因子生成。

(A-B-C)在白血病的早期阶段(n＝5)杀死未注射(UN，黑色圆圈，n＝3)或i.v.注射MEC1(白色圆圈)细胞(第0天)的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠并通过流式细胞术进行分析。通过流式细胞术测量细胞内细胞因子生成。左边：图中显示BM中以CD45+控门的生成IL-17a的CD11b+Gr1+细胞的绝对数目的均值；右边：BM中以CD45+控门的生成IL-17a的CD11b+Gr1+细胞的流式细胞术代表图(A)。左边：生成IL-17a的非造血CD45-细胞的绝对数目的均值；右边：BM中生成IL-17a的非造血CD45-细胞的流式细胞术代表图(B)。左边：生成IL-2的非造血CD45-细胞的绝对数目的均值；右边：BM中生成IL-2的非造血CD45-细胞的流式细胞术代表图(C)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，Student氏t检验。

图9 异种移植物小鼠的单核细胞/巨噬细胞和MEC1白血病细胞的转录物组分析

(A-B-C-D-E-F)给Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠i.v.注射MEC1细胞并在白血病的早期阶段与年龄匹配的未移植Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠一起处死(n＝3/组)。自通过磁分离纯化的BM鼠核细胞/巨噬细胞分离RNA并加工用于Illumina全基因组基因表达直接杂交测定法。实施了来自异种移植的和未移植的(UN)小鼠的单核细胞/巨噬细胞之间的监督分析。热图呈现差异表达基因的分级聚簇(移植的对UN)(经过调整的P值<0.05)。通过减去该基因的均值表达，然后除以所有样品间的标准偏差，每一种基因的表达水平已经标准化。将这种定阶表达值(以Row Z得分表示)以红色-蓝色色阶绘图，其中红色指示高表达。将各组间的基因表达差异在功能上分类如下：核效应器，肿瘤抑制基因和翻译相关的(A)；细胞内功能(B)；膜/细胞外蛋白质(C)，凋亡相关的(D)和炎症介导物(E)。自通过磁分离纯化的BM浸润性人CD19+MEC1细胞分离RNA并加工用于Illumina全基因组基因表达直接杂交测定法。实施异种移植的和体外注射前的MEC1细胞之间的监督分析。热图呈现差异表达基因(异质移植对注射前)的分级聚簇(经过调整的P值<0.05)。描述了各组间牵涉单核细胞/巨噬细胞和B细胞相互作用的基因表达差异(F)。(G)通过流式细胞术分析i.v.注射MEC1细胞并在第21天处死的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠(n＝4，白色圆圈)和年龄匹配的未注射(UN)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠(n＝4，黑色圆圈)。左边：SP，BM和PE中以CD45+控门的CD11b+ICAM1+细胞对整个巨噬细胞集合(CD11b+F4/80+)的流式细胞术代表图。右边：图中显示SP，BM，PE中CD11b+ICAM1+细胞对以CD45+控门的整个巨噬细胞集合(CD11b+F4/80+)的绝对数目的均值。通过Student氏t检验分析统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图10 转录物组分析提示单核细胞/巨噬细胞与白血病细胞的交谈的作用(与图9相关)。

(A)来自未注射(UN)和i.v.注射MEC1细胞并在白血病的早期阶段处死的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠的BM的单核细胞/巨噬细胞中Fcgr1，Saa3，Icam1，Dleu2，Apoe，Tlr7的相对mRNA表达。表达针对β-肌动蛋白水平标准化。以均值±SD(n＝3/组)显示数据。(B)来自在白血病的早期阶段处死的异种移植物Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠(n＝3/组)的BM的MEC1B细胞和体外注射前细胞中CCL2，CEBPB，CR2，IL10，IL23R，ADAM10，PTEN，RNASET2的相对mRNA表达。表达针对β-肌动蛋白水平标准化。以均值±SD(n＝3/组)显示数据。(C)自18名CLL患者和4名健康供体收集新鲜外周血样品。通过流式细胞术对单核细胞分析ICAM1的表达。将CD14+单核细胞细分成CD14++CD16-经典单核细胞，CD14++CD16+中间单核细胞和CD14+CD16++非经典单核细胞。图中显示ICAM1+细胞对以CD14控门的单核细胞群体的相对贡献的均值±SD。(D-E)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠自第-1天开始每3/4天用2mg/kgi.v.ICAM1阻断性单抗克隆YN1/1.7.4预治疗(n＝3，白色三角形)或留置不未治疗(n＝3，黑色圆圈)并通过流式细胞术进行分析(D)。图中显示PB中人CD19+细胞的百分比和BM，SP和PE中人CD19+细胞的绝对数目的均值(E)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student氏t检验。

图11 通过巨噬细胞靶向对白血病细胞诱导的细胞死亡机制

(A)左边：在96孔板中单独地(c)，与渐增浓度的clodrolip(10μM，100μM，1000μM)和PBS脂质体(v，1000μM)分配MEC1细胞并在24，48和72小时实施发光测定法以评估MEC1细胞对该药物的敏感性。右边：在96孔板中单独地(c)，与抗人CSF1R单抗RG7155(hMab 2F11-e7IgG1同种型)(1-10μg/ml)一起分配MEC1细胞并在48和72小时后实施发光测定法以评估MEC1细胞对该药物的敏感性。

图12 TNF依赖性巨噬细胞介导的体内白血病细胞死亡的机制

(A-B-C-D-E-F-G)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠自第-1天开始每3天用200μl i.v.clodrolip预治疗(n＝4，白色圆圈)或不治疗(n＝3，黑色圆圈)并通过流式细胞术进行分析(A)。图中显示SP，BM，PB，PE中人CD19+细胞的百分比的均值(B)。图中显示PB中以CD45控门的CD11b+CSF1R+细胞的相对贡献的均值(C)。图中显示SP，BM，PE(D)和PB(E)中以CD45+控门的CD11b+F4/80+细胞的绝对数目或百分比的均值。图中显示SP，BM，PE(F)中以hCD19+细胞控门的Ann+PI+细胞的相对贡献和PB(G)中以hCD19+细胞控门的Ann-PI+细胞的相对贡献的均值。通过Student氏t检验分析统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

(H-I)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠留置不治疗(n＝6，黑色圆圈)或用60μl clodrolip(n＝4，白色圆圈)或60μl clodrolip(第+11，+25天)+10mg/kg依那西普(i.p.，第+10,+12,+15,+18,+21,+24天)(n＝6，红色三角形)i.v.治疗(第+11，+25天)并在第26天杀死(H)。图中显示BM中人CD19+细胞的绝对数目的均值(I)。通过Student氏t检验分析统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

(J-K)将i.v.MEC1攻击的(第0天)Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠留置不治疗(n＝5，黑色圆圈)或用30mg/kg抗CSF1R单抗(n＝7，白色圆圈)或30mg/kg抗CSF1R单抗(第+11，+25天)+10mg/kg依那西普(i.p.，第+10,+12,+15,+18,+21,+24天)(n＝6，红色三角形)i.v.治疗(第+11，+25天)并在第29天杀死(J)。图中显示SP中人CD19+细胞的绝对数目的均值(K)。通过Student氏t检验分析统计学显著性。*p<0.05。

图13 人中的单核细胞/巨噬细胞和白血病细胞

(G)通过下面的方程计算用抗CD20单抗GA101 10μg/ml，抗人CSF1R单抗RG7155(hMab 2F11-e7 IgG1同种型)(1-10μg/ml)，抗CD20单抗GA101 10μg/ml+抗人CSF1R单抗RG7155(hMab 2F11-e7IgG1同种型)(1-10μg/ml)处理48小时(n＝4)后的hCD19+CD5+(黑色圆圈)和hCD14+(白色圆圈)消减：100-％剩余细胞，其中％剩余细胞＝(处理样品中的绝对数目/未处理样品中的绝对数目)x100。水平条代表均值(*p<0.05；**p<0.01)，Student氏t检验。

图14 clodrolip对来自CLL患者(与图13相关的)的原代白血病细胞诱导的细胞死亡机制。

(A)通过负选择自CLL患者(n＝3，Pt#24-26)的PBMC纯化的在6孔板中单独地(C，黑色条)或与1000μM clodrolip一起(Clo，白色条)分配(一式三份)24小时的人原代CLL细胞中FAS的相对mRNA表达。表达针对β-肌动蛋白水平标准化。以均值±SD(n＝3/组)显示数据。使用Student t检验计算统计学显著差异。*p<0.05。

(B)通过负选择自一名CLL患者的PBMC纯化的在6孔板中单独地(C，黑色条)或与1000μM clodrolip一起(Clo，白色条)分配(一式三份)24小时的人原代CLL细胞中TNFR1，FADD，BID，TRAIL-R2的相对mRNA表达。表达针对β-肌动蛋白水平标准化。以均值±SD(n＝3/组)显示数据。使用Student t检验计算统计学显著差异。*p<0.05

(C)使用下面的方程计算在有(黑色条)或无(白色条)依那西普(10μg/ml)的情况下用100μM，500μM，1000μM clodrolip处理24小时(n＝3)后的hCD19+CD5+消减：100-％剩余细胞，其中％剩余细胞＝(处理样品中的绝对数目/未处理样品中的绝对数目)x100。(*p<0.05)，Student氏t检验。

(D)使用下面的方程计算在有(黑色条)或无(白色条)阻断性抗TRAIL-R2单抗(1μg/ml)的情况下用clodrolip 1000μM处理24小时(n＝3)后的hCD19+CD5+消减：100-％剩余细胞，其中％剩余细胞＝(处理样品中的绝对数目/未处理样品中的绝对数目)x100。(*p<0.05)，Student氏t检验。

发明详述

许多肿瘤特征在于突出的免疫细胞浸润，包括巨噬细胞。最初，认为免疫细胞是针对肿瘤的防御机制的一部分，但是最近的数据支持如下的观念，即数种免疫细胞群(包括巨噬细胞)可能事实上促进肿瘤进展。巨噬细胞特征在于它们的可塑性。取决于细胞因子微环境，巨噬细胞能展现所谓的M1或M2亚型。M2巨噬细胞参与阻抑肿瘤免疫。它们还在组织修复功能诸如血管发生和组织重塑(它们被肿瘤收编来支持生长)中发挥重要作用。与肿瘤促进性M2巨噬细胞相反，M1巨噬细胞经分泌炎性细胞因子和参与抗原呈递和吞噬展现抗肿瘤活性(Mantovani，A.等人，Curr.Opin.Immunol.2(2010)231-237)。

通过分泌各种各样的细胞因子，诸如集落刺激因子1(CSF-1)和IL-10，肿瘤细胞能够将巨噬细胞募集和塑造成M2亚型，而诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，IFN-γ等细胞因子将巨噬细胞编程朝向M1亚型。使用免疫组织化学，有可能区分共表达CD68和CD163的巨噬细胞亚群(它很可能是富集M2巨噬细胞的)和显示CD68+/MHC II+，或CD68+/CD80+免疫表型的亚集(很可能包括M1巨噬细胞)。CD68和CD163阳性巨噬细胞的细胞形状，大小，和空间分布与关于M2巨噬细胞的肿瘤促进作用(例如它们在肿瘤交叉基质和生命攸关肿瘤区域中的优先定位)发表的假说一致。相反，到处找到CD68+/MHC II类+巨噬细胞。它们在吞噬中的假定作用由凋亡细胞和坏死肿瘤区域附近CD68+/MHC II类+但CD163-免疫表型的簇反映。

不同巨噬细胞亚群的亚型和标志物表达与它们的功能状态有联系。M2巨噬细胞能通过下述各项支持肿瘤发生：

a)经分泌血管发生性因子诸如VEGF或bFGF增强血管发生，

b)经分泌基质金属蛋白酶(MMP)，生长因子和迁移因子(引导肿瘤细胞至血流及设立转移小生境)支持转移形成(Wyckoff，J.等人，Cancer Res.67(2007)2649-2656)，

c)通过分泌免疫阻抑性细胞因子诸如IL-4，Il-13，IL-1ra和IL-10(它们继而调节T调节细胞功能)在建立免疫阻抑性环境中发挥作用。相反，在临床前模型中已显示CD4阳性T细胞增强肿瘤促进性巨噬细胞的活性(Mantovani，A.等人，Eur.J.Cancer 40(2004)1660-1667；DeNardo，D.等人，Cancer Cell 16(2009)91-102)。

因而，在数种类型的癌症(例如乳腺，卵巢，何杰金氏淋巴瘤)中，M2亚型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的流行性已与较差的预后联系起来(Bingle，L.等人，J.Pathol.3(2002)254-265；Orre，M.,和Rogers，P.A.，Gynecol.Oncol.1(1999)47-50；Steidl，C.等人，N.Engl.J.Med.10(2010)875-885)。最近的数据显示CD163阳性巨噬细胞浸润在肿瘤和肿瘤分级中的相关性(Kawamura，K.等人，Pathol.Int.59(2009)300-305)。自患者肿瘤分离的TAM具有耐受表型且对肿瘤细胞不是细胞毒性的(Mantovani，A.等人，Eur.J.Cancer 40(2004)1660-1667)。然而，在细胞毒性T细胞存在下TAM的浸润与非小细胞肺癌中改善的存活有关且因此反映此肿瘤类型中更加突出的M1巨噬细胞浸润(Kawai，O.等人，Cancer 6(2008)1387-1395)。

最近，包含大量巨噬细胞和CD4阳性T细胞但少量细胞毒性CD8阳性T细胞的一种所谓免疫签名显示出与乳腺癌患者中的总体存活(OS)缩短有关联及代表一种独立预后因子(DeNardo，D.等人，Cancer Discovery 1(2011)54-67)。

与CSF-1在驱动M2巨噬细胞的促肿瘤发生功能中的作用一致，罕见肉瘤或局部攻击性结缔组织肿瘤诸如色素沉着绒毛结节性滑膜炎(PVNS)和腱鞘巨细胞肿瘤(TGCT)中部分由CSF-1基因易位所致的高CSF-1表达引起表达CSF-1的受体(集落刺激因子1受体(CSF-1R))的单核细胞和巨噬细胞积累，形成肿瘤块的大部(West，R.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 3(2006)690-695)。随后使用这些肿瘤来通过基因表达序型分析定义CSF-1依赖性巨噬细胞签名。在乳腺癌和平滑肌肉瘤患者肿瘤中，此CSF-1响应基因签名预测较差的预后(Espinosa，I.等人，Am.J.Pathol.6(2009)2347-2356；Beck，A.等人，Clin.Cancer Res.3(2009)778-787)。

CSF-1R属于受体酪氨酸激酶的III类亚家族且由c-fms原癌基因编码。CSF-1或IL-34的结合诱导受体二聚化，接着是自磷酸化和下游信号传导级联激活。CSF-1R的激活调节单核细胞和巨噬细胞的存活，增殖和分化(Xiong，Y.等人，J.Biol.Chem.286(2011)952-960)。

除单核细胞谱系的细胞和破骨细胞(它们与巨噬细胞衍生自相同造血前体)以外，还已发现CSF-1R/c-fms由数种人上皮癌诸如卵巢和乳腺癌及在平滑肌肉瘤和TGCT/PVNS中表达，尽管处于与巨噬细胞相比要低的表达水平。对于TGCT/PVNS，卵巢癌患者的腹水以及血清中升高的CSF-1(CSF-1R的配体)水平与较差的预后有关联(Scholl，S.等人，Br.J.Cancer 62(1994)342-346；Price，F.等人，Am.J.Obstet.Gynecol.168(1993)520-527)。而且，CSF 1R的组成性有活性突变体形式能够转化NIH3T3细胞，癌基因的特性之一(Chambers，S.，Future Oncol 5(2009)1429-1440)。

临床前模型提供CSF-1R作为肿瘤学靶物的验证。阻断CSF-1以及CSF-1R活性导致TAM募集降低。化疗导致肿瘤细胞中的CSF-1表达升高，引起TAM募集增强。在自发性转基因乳腺癌模型中，阻断CSF-1R与帕利他赛组合导致CD8阳性细胞毒性T细胞激活，引起肿瘤生长和转移性负荷降低(DeNardo，D.等人，Cancer Discovery 1(2011)54-67)。

自1986年起就知道人CSF-1R(CSF-1受体；同义词：M-CSF受体；巨噬细胞集落刺激因子1受体，Fms原癌基因，c-fms，SEQ ID NO:22)(Coussens，L.等人，Nature 320(1986)277-280)。CSF-1R是一种生长因子且由c-fms原癌基因编码(综述见例如Roth，P.和Stanley，E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181(1992)141-167)。

CSF-1R是CSF-1R配体CSF-1(巨噬细胞集落刺激因子，也称作M-CSF)(SEQ ID NO:86)和IL-34(SEQ ID NO:87)的受体且介导这些细胞因子的生物学效应(Sherr，C.J.等人，Cell 41(1985)665-676；Lin，H.等人，Science 320(2008)807-811)。集落刺激因子-1受体(也称作c-fms)的克隆第一次记载于Roussel，M.F.等人，Nature 325(1987)549-552。在该出版物中，显示了CSF-1R具有依赖于该蛋白质的C端尾中的变化(包括抑制性酪氨酸969磷酸化的丧失，其结合Cbl并由此调节受体下调)的转化潜力(Lee，P.S.等人，Embo J.18(1999)3616-3628)。

CSF-1R是一种单链，跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)及含有免疫球蛋白(Ig)基序的RTK家族的成员，特征在于该受体的胞外域(ECD)中5个重复的Ig样亚域D1-D5(Wang，Z.等人，Molecular and Cellular Biology 13(1993)5348-5359)。人CSF-1R胞外域(CSF-1R-ECD)(SEQ ID NO:64)包含所有五个胞外Ig样亚域D1-D5。人CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO:65)包含胞外Ig样亚域D1-D3和D5，但是缺失D4亚域。人CSF-1R片段D1-D3(SEQ ID NO:66)包含各个亚域D1-D3。列出了没有信号肽MGSGPGVLLLLLVATAWHGQ G(SEQ ID NO:67)的序列。人CSF-1R片段D4-D3(SEQ ID NO:85)包含相应亚域D4-D3。

目前知道两种结合CSF-1R胞外域的CSF-1R配体。第一种是CSF-1(集落刺激因子1，也称作M-CSF，巨噬细胞；人CSF-1，SEQ ID NO:86)，在细胞外作为二硫化物连接的同二聚体找到(Stanley，E.R.等人，Journal of Cellular Biochemistry 21(1983)151-159；Stanley，E.R.等人，Stem Cells 12Suppl.1(1995)15-24)。第二种是IL-34(人IL-34；SEQID NO:87)(Hume，D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。如此，在一个实施方案中，术语“CSF-1R配体”指人CSF-1(SEQ ID NO:86)和/或人IL-34(SEQ ID NO:87)。

对于实验，常常使用人CSF-1的活性149个氨基酸(aa)片段(SEQ ID NO:86的aa33-181)。人CSF-1的这种活性149aa片段(SEQ ID NO:86的aa33-181)包含在CSF-1的所有3种主要形式中且足以介导对CSF-1R的结合(Hume，D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。

CSF-1R信号传导的主要生物学效应是造血前体细胞至巨噬细胞谱系(包括破骨细胞)的分化，增殖，迁移，和存活。CSF-1R的活化由其CSF-1R配体CSF-1(M-CSF)和IL-34介导。CSF-1(M-CSF)对CSF-1R的结合诱导同二聚体的形成和激酶通过酪氨酸磷酸化的活化(Li，W.等人，EMBO Journal.10(1991)277-288；Stanley，E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.46(1997)4-10)。

胞内蛋白质酪氨酸激酶域被独特的插入域中断，该插入域也存在于其它相关RTKIII类家族成员中，包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，干细胞生长因子受体(c-Kit)和fins样细胞因子受体(FLT3)。不管这个生长因子受体家族中的结构同源性，它们具有截然不同的组织特异性功能。

CSF-1R主要在单核细胞谱系的细胞上及在雌性生殖道和胎盘中表达。另外，已经报告了皮肤中的朗格汉斯细胞(一种平滑肌细胞子集)(Inaba，T.等人，J.Biol.Chem.267(1992)5693-5699)，B细胞(Baker，A.H.等人，Oncogene 8(1993)371-378)和小胶质细胞(Sawada，M.等人，Brain Res.509(1990)119-124)中的CSF-1R表达。已知具有突变型人CSF-1R(SEQ ID NO:23)的细胞增殖不依赖配体刺激。

如本文中使用的，“结合人CSF-1R”或“特异性结合人CSF-1R”或“抗CSF-1R抗体”指抗体以K_D值1.0x 10^-8mol/l或更低(在一个实施方案中，以K_D值1.0x10^-9mol/l或更低)的结合亲和力特异性结合人CSF-1R抗原。结合亲和力用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术(

GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)。如此，如本文中使用的，“结合人CSF-1R的抗体”指以K_D 1.0x 10^-8mol/1或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^-8mol/l-1.0x10^-13mol/l)，在一个实施方案中，以K_D 1.0x10^-9mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^- ⁹mol/l-1.0x 10^-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人CSF-1R抗原的抗体。

CD20(又称为B淋巴细胞抗原CD20，B淋巴细胞表面抗原B1，Leu-16，Bp35，BM5，和LF5；序列以SwissProt数据库条目P11836为特征)是一种位于前B和成熟B淋巴细胞上的具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine,M.A.et al.,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；Tedder,T.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic,I.et al.,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；Einfeld,D.A.et al.,EMBO J.7(1988)711-717；Tedder,T.F.et al.,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。相应的人基因是跨膜4域，A亚家族，成员1，又称为MS4A1。此基因编码跨膜4A基因家族的一个成员。此初生蛋白质家族的成员以共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界为特征，并且在造血细胞和非淋巴样组织中展现出独特的表达样式。此基因编码B淋巴细胞表面分子，其在B细胞发育及分化成浆细胞中发挥作用。在一簇家族成员中，此家族成员定位于11q12。此基因的可变剪接产生编码同一蛋白质的两种转录物变体。

术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体，同等型和物种同系物。本发明的抗体对CD20抗原的结合通过灭活CD20而介导对表达CD20的细胞(例如，肿瘤细胞)的杀伤。可以通过下列一项或多项机制而发生对表达CD20的细胞的杀死：细胞死亡/凋亡诱导，ADCC和CDC。

如本领域中认可的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20，B淋巴细胞表面抗原B1，Leu-16，Bp35，BM5，和LF5。

依照本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合人CD20抗原的抗体。根据抗CD20抗体对CD20抗原的结合特性和生物学活性，两种类型的抗CD20抗体(I型和II型抗CD20抗体)可以依照Cragg,M.S.et al.,Blood 103(2004)2738-2743；及Cragg,M.S.et al.,Blood101(2003)1045-1052区别，参见表2。

表1：I型和II型抗CD20抗体的特性

II型抗CD20抗体的例子包括例如人源化B-Ly1抗体IgG1(一种嵌合的人源化IgG1抗体，如披露于WO 2005/044859中的)，11B8IgG1(如披露于WO 2004/035607中的)，和AT80IgG1。通常，IgG1同种型的II型抗CD20抗体显示特征性的CDC特征。与IgG1同种型的I型抗体相比，II型抗CD20抗体具有降低的CDC(若为IgG1同种型的话)。

I型抗CD20抗体的例子包括例如利妥昔单抗，HI47IgG3(ECACC，杂交瘤)，2C6IgG1(如披露于WO 2005/103081中的)，2F2IgG1(如披露于WO 2004/035607和WO 2005/103081的)和2H7IgG1(如披露于WO 2004/056312中的)。

“利妥昔单抗”抗体(参照抗体；I型抗CD20抗体的例子)是一种针对人CD20抗原的含有人γ1鼠恒定域的遗传工程嵌合单克隆抗体。此嵌合抗体含有人γ1恒定域，并且在1998年4月17日公告的归于IDEC Pharmaceuticals Corporation的US 5,736,137(Andersen等)中以名称“C2B8”鉴定。利妥昔单抗批准用于治疗复发性或顽固性低级或滤泡性，CD20阳性，B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者。体外作用机制研究已经显示了利妥昔单抗展现出人补体依赖性细胞毒性(CDC)(Reff,M.E.et al.,Blood 83(1994)435-445)。另外，它在测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定法中展现出显著的活性。利妥昔单抗不是无岩藻糖基化的。

如本文中使用的，“结合人CD20”或“特异性结合人CD20”或“抗CD20抗体”指抗体以K_D值1.0x 10^-8mol/l或更低(在一个实施方案中，以K_D值1.0x10^-9mol/l或更低)的结合亲和力特异性结合人CD20抗原。结合亲和力用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术(

GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)。如此，如本文中使用的，“结合人CD20的抗体”指以K_D1.0x 10^-8mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^-8mol/l-1.0x 10^-13mol/l)，在一个实施方案中，以K_D 1.0x10^-9mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^-9mol/l-1.0x 10^-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人CD20抗原的抗体。

在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体选自下组：hMab 2F11-c11，hMab 2F11-d8，hMab 2F11-e7，hMab 2F11-f12，和hMab 2F11-g1。

这些抗体记载于WO 2011/070024且特征在于包含下述本文所述VH和VL序列：

表2

在一个优选的实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体是hMab 2F11-e7(VH，SEQ ID NO:39；VL，SEQ ID NO:40)。

在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CD20的抗体是人源化B-Ly1抗体：

术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO 2005/044859和WO 2007/031875中所披露的人源化B-Ly1抗体，其通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化及接着的人源化自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1(参见Poppema,S.and Visser,L.,Biotest Bulletin 3(1987)131-139)获得(参见WO 2005/044859和WO 2007/031875)。这些“人源化B-Ly1抗体”详细披露于WO 2005/044859和WO 2007/031875中。

在一个实施方案中，“人源化B-Ly1抗体”具有选自下组的重链可变区(VH)：SEQ IDNO.69至SEQ ID NO.75(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH2，B-HH3，B-HH6，B-HH8，B-HL8，B-HL11和B-HL13)。在一个实施方案中，“人源化B-Ly1抗体”具有轻链可变区(VL)SEQID NO.76(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-KV1)。

这些抗体特征在于包含本文所述下述VH和VL序列：

表3

在一个优选的实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CD20的抗体选择人源化B-Ly1抗体B-HH6/B-KV1，其包含SEQ ID No.71(B-HH6)的重链可变区(VH)和SEQ IDNo.76(B-KV1)的轻链可变区(VL)。

此外，在一个实施方案中，人源化B-Ly1抗体是IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体。

依照本发明，依照记载于WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana,P.et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及WO 99/154342中的规程在Fc区中糖工程化改造(GE)此类无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体。在一个实施方案中，无岩藻糖基化糖工程人源化B-Ly1是B-HH6-B-KV1 GE。此类糖工程人源化B-Ly1抗体在Fc区中具有改变的糖基化样式，优选地具有降低的岩藻糖残基水平。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖总量的60％或更少(在一个实施方案中，岩藻糖的量是40％至60％，在另一个实施方案中，岩藻糖的量是50％或更少，且在又一个实施方案中，岩藻糖的量是30％或更少)。在另一个实施方案中，优选地，Fc区的寡糖是两分的。这些糖工程人源化B-Ly1抗体具有升高的ADCC。

在一个优选的实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CD20的抗体选择人源化B-Ly1抗体B-HH6/B-KV1，其包含SEQ ID No.71(B-HH6)的重链可变区(VH)和SEQ IDNo.76(B-KV1)的轻链可变区(VL)且是在Fc区中具有改变的糖基化样式的IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体，其中含有岩藻糖的寡糖的量介于Asn297处的寡糖总量的40％和60％之间。

与没有降低岩藻糖的抗CD20抗体不一样，依照本发明的无岩藻糖基化抗CD20抗体具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。

“具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的无岩藻糖基化抗CD20抗体”意指具有如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的升高的ADCC的无岩藻糖基化抗CD20抗体，如该术语在本文中所定义的。一种公认的体外ADCC测定法如下：

1)该测定法使用已知表达受抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；

2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；

3)依照下列方案来实施测定法：

i)使用标准的密度离心规程来分离PBMC，并将其以5x 10⁶个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；

ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90％的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里⁵¹Cr标记，用细胞培养基清洗两次，并以10⁵个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬浮；

iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔；

iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将50微升所得的抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的多种抗体浓度；

v)对于最大释放(MR)对照，含有经标记的靶细胞的平板中的3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2％

(VN)水溶液，代替抗体溶液(上述第iv点)；

vi)对于自发释放(SR)对照，含有经标记的靶细胞的平板中的3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，代替抗体溶液(上述第iv点)；

vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4℃温育1小时；

viii)将50微升PBMC悬浮液(上述第i点)添加至每孔以产生效应细胞:靶细胞比率25:1，并将平板在培养箱中在5％CO₂气氛下于37℃放置4小时；

ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER)；

x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100对每个抗体浓度计算比溶解的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化(参见上述第ix点)的平均放射性，MR是对MR对照(参见上述第v点)量化(参见上述第ix点)的平均放射性，而SR是对SR对照(参见上述第vi点)量化(参见上述第ix点)的平均放射性；

4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比溶解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比溶解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成，纯化，配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。

可以通过所述抗体的糖工程化来获得所述“升高的ADCC”，其意味着通过工程化改造其寡糖组分来增强单克隆抗体的所述天然的，细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US 6,602,684的。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指在存在补体的情况中依照本发明的抗体对人肿瘤靶细胞的溶解。优选地，通过在存在补体的情况中用依照本发明的抗CD20抗体处理表达CD20的细胞的制备物来测量CDC。若抗体在浓度100nM时在4小时后诱导20％或更多的肿瘤细胞溶解(细胞死亡)，则发现CDC。优选地，用经⁵¹Cr或Eu标记的肿瘤细胞及释放的⁵¹Cr或Eu测量来实施测定法。对照包括将肿瘤靶细胞与补体但不与抗体一起温育。

术语“无岩藻糖基化抗体”指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样式且具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)抗体。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量，这些结构称为G0，G1(α1,6或α1,3)或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体在Asn297处通常以至少85％的量进行岩藻糖基化。应当理解，如本文中所使用的，术语无岩藻糖基化抗体包括在其糖基化样式中没有岩藻糖的抗体。通常已知的是，抗体中典型的糖基化残基位置是依照EU编号系统的第297位的天冬酰胺(“Asn297”)。

“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中报告的EU索引，通过提及而将其明确收入本文)。

如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体意指其中的岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少(这意味着在Fc区中Asn297处的寡糖的至少40％或更多是无岩藻糖基化的)的IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)抗体。在一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的40％至60％。在另一个实施方案中，岩藻糖量是50％或更小，并且在又一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的30％或更小。依照本发明，“岩藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以平均值计算的，相对于附着于Asn297的所有寡糖(糖)(例如复合的，杂合的和高甘露糖结构)的总和，Asn297处寡糖(糖)链内所述寡糖(岩藻糖)的量(关于测定岩藻糖量的详细规程，见例如WO 2008/077546)。此外，在一个实施方案中，Fc区的寡糖是两分的。可以在工程化改造成表达至少一种核酸的糖修饰的宿主细胞中表达依照本发明的无岩藻糖基化抗体，所述核酸编码具有GnTIII活性的多肽，其量足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。或者，可以依照US 6,946,292降低或消除宿主细胞的α1,6-岩藻糖基转移酶活性以生成糖修饰的宿主细胞。可以例如通过发酵条件(例如发酵时间)或者通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗体来预先确定抗体岩藻糖基化的量。此类无岩藻糖基化抗体及相应的糖工程方法记载于WO 2005/044859,WO 2004/065540,WO 2007/031875,Umana,P.etal.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180,WO 99/154342,WO 2005/018572,WO 2006/116260,WO 2006/114700,WO 2005/011735,WO 2005/027966,WO 97/028267,US 2006/0134709,US 2005/0054048,US 2005/0152894,WO 2003/035835,WO 2000/061739。这些糖工程抗体具有升高的ADCC。依照本发明产生无岩藻糖基化抗体的其它糖工程方法记载于例如Niwa,R.et al.,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa,T.et al.,J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722。

如此，本发明的一方面是IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)，特异性结合CD20的，具有占Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体，其用于与本文所述CSF1R抗体组合治疗癌症。本发明的另一方面是IgG1或IgG3同种型的(优选地IgG1同种型的)，特异性结合CD20的，具有占Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与本文所述CSF1R抗体组合治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的60％和20％之间。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的60％和40％之间。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖(糖)总量的0％之间。

在本发明的一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

在一个实施方案中，该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含SEQID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；且其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

术语“表位”表示人CSF-1R或CD20中能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面聚组组成，而且表位通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于对前者而非后者的结合在变性溶剂存在下丧失。

如本文中使用的，“可变域”(轻链可变域(V_L)，重链可变域(V_H))表示轻和重链域对中的每一个，它们直接涉及抗体对抗原的结合。可变轻和重链域具有相同的整体结构，而且每个域包含四个框架(FR)区，它们的序列是广泛保守的，由三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采取β-片层构象，而且CDR可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体的重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，而且因此提供本发明的又一个目的。

术语“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。尤其地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。

如本文中使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。

如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)，和缬氨酸(val，V)。

抗体的“Fc部分”不直接涉及抗体对抗原的结合，但是展现出多种效应器功能。“抗体的Fc部分”是熟练技术人员公知的术语，而且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1，和IgA2。依照重链恒定区，不同类的免疫球蛋白分别称作α，δ，ε，γ，和μ。抗体的Fc部分直接涉及基于补体激活，C1q结合和Fc受体结合的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)是通过补体因子C1q结合大多数IgG抗体亚类的Fc部分启动的。虽然抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，但是对C1q的结合是由Fc部分中的限定结合位点引起的。此类结合位点是本领域现有技术中已知的，而且记载于例如Boackle，R.J.等人，Nature 282(1979)742-743；Lukas，T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.等人，Nature288(1980)338-344；Thommesen，J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.等人，J.Virology 75(2001)12161-12168；Morgan，A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0307434。此类结合位点是例如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(依照Kabat，E.A.的EU索引的编号方式，参见下文)。亚类IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活及C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统，而且不结合C1q和C3。

在一个实施方案中，依照本发明的抗体包含自人起源衍生的Fc部分和优选地，人恒定区的所有其它部分。如本文中使用的，术语“自人起源衍生的Fc部分”表示如下的Fc部分，其是属于亚类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的人抗体的Fc部分，优选来自人IgG1亚类的Fc部分，来自人IgG1亚类的突变型Fc部分(在一个实施方案中具有L234A+L235A上的突变)，来自人IgG4亚类的Fc部分或来自人IgG4亚类的突变型Fc部分(在一个实施方案中具有S228P上的突变)。在一个优选实施方案中，人重链恒定区是SEQ ID NO:58(人IgG1亚类)，在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是SEQ ID NO:59(具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类)，在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是是SEQ ID NO:60(人IgG4亚类)，而在另一个优选实施方案中，人重链恒定区是SEQ ID NO:61(具有突变S228P的人IgG4亚类)。在一个实施方案中，所述抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在一个实施方案中，所述最小限度的效应器功能源自效应器降低性Fc突变。在一个实施方案中，所述效应器降低性Fc突变为L234A/L235A或L234A/L235A/P329G或N297A或D265A/N297A。在一个实施方案中，为每种抗体选择的所述效应器降低性Fc突变彼此独立地选自包含L234A/L235A，L234A/L235A/P329G，N297A和D265A/N297A的组(由L234A/L235A，L234A/L235A/P329G，N297A和D265A/N297A组成的组)。

在一个实施方案中，本文所述抗体属于人IgG类(即属于IgG1亚类，IgG2亚类，IgG3亚类或IgG4亚类)。

在一个优选实施方案中，本文所述抗体属于人IgG1亚类或人IgG4亚类。在一个实施方案中，本文所述抗体属于人IgG1亚类。在一个实施方案中，本文所述抗体属于人IgG4亚类。

在一个实施方案中，本文所述抗体特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是本领域现有技术公知的，而且记载于例如Kabat，E.A.，(参见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。例如，一种有用的人重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:58。例如，一种有用的人轻链恒定区包含κ轻链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:57。

本发明包含用于治疗需要治疗的患者的方法，特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。

本发明包含依照本发明的抗体用于所述治疗的用途。

本发明的一个优选实施方案是本发明的CSF-1R抗体，其用于治疗“CSF-1R介导的疾病”，或本发明的CSF-1R抗体，其用于制备治疗“CSF-1R介导的疾病”的药物，可以如下描述：

CSF-1R信号传导有可能通过3种独特机制涉及肿瘤生长和转移。第一种是在源自雌性生殖系统(乳房/乳腺，卵巢，子宫内膜，宫颈)的肿瘤细胞中找到CSF配体和受体的表达(Scholl，S.M.等人，J.Natl.Cancer Inst.86(1994)120-126；Kacinski，B.M.，Mol.Reprod.Dev.46(1997)71-74；Ngan，H.Y.等人，Eur.J.Cancer 35(1999)1546-1550；Kirma，N.等人，Cancer Res 67(2007)1918-1926)，而且该表达与乳腺癌异种移植物生长以及乳腺癌患者中的较差预后有关。在一项研究中测试的急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病和脊髓发育不良患者的约10-20％中看到CSF-1R中的两处点突变，而且发现突变之一破坏受体周转(Ridge，S.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87(1990)1377-1380)。然而，没能在稍后的研究中确认突变的发生率(Abu-Duhier，F.M.等人，Br.J.Haematol.120(2003)464-470)。还在一些肝细胞癌(Yang，D.H.等人，HepatobiliaryPancreat.Dis.Int.3(2004)86-89)和特发性骨髓纤维变性(Abu-Duhier，F.M.等人，Br.J.Haematol.120(2003)464-470)病例中发现突变。最近，在自髓单核母细胞性白血病患者衍生的GDM-1细胞系中鉴定出CSF-1R中的Y571D突变(Chase，A.等人，Leukemia 23(2009)358-364)。

第二种机制基于阻断骨中的转移位点处经由M-CSF/CSF-1R的信号传导，其诱导破骨细胞发生，骨再吸收和溶骨性骨损害。乳腺癌，多发性骨髓瘤和肺癌是已经发现转移至骨并引起溶骨性骨病导致骨骼并发症的癌症的例子。由肿瘤细胞和基质释放的M-CSF与受体活化剂核因子κ-B配体-RANKL合作诱导造血髓样单核细胞祖先分化成成熟破骨细胞。在此过程中，M-CSF通过给予破骨细胞以存活信号来起许可因子的作用(Tanaka，S.等人，J.Clin.Invest.91(1993)257-263)。在破骨细胞分化和成熟期间用抗CSF-1R抗体抑制CSF-1R活性有可能预防转移性疾病中引起溶骨性疾病及有关骨骼相关事件的破骨细胞活性失衡。虽然乳腺癌，肺癌和多发性骨髓瘤通常导致溶骨性损害，但是在前列腺癌中，转移至骨最初具有成骨细胞性外观，其中升高的骨形成活性产生与正常骨的典型层状结构不同的“编织骨”。在疾病进展期间，骨损害展示显著的溶骨成分以及高血清水平的骨再吸收，而且提示抗再吸收疗法可能是有用的。二膦酸盐已经显示出抑制溶骨性损害形成及减少骨骼相关事件数目(只在具有激素不应性转移性前列腺癌的男性中)，但是在这点上，它们对成骨细胞损害的效果是有争议的，而且二膦酸盐至今未显示在预防骨转移或激素响应性前列腺癌中是有益的。抗再吸收剂在混合型溶骨/成骨细胞前列腺癌中的效果仍在进行临床研究(Choueiri，M.B.等人，Cancer Metastasis Rev.25(2006)601-609；Vessella，R.L.和Corey，E.，Clin.Cancer Res.12(20Pt 2)(2006)6285s-6290s)。

第三种机制基于最近在乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和宫颈癌的实体瘤中找到的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与较差的预后有关联的观察结果(Bingle，L.等人，J.Pathol.196(2002)254-265；Pollard，J.W.，Nat.Rev.Cancer 4(2004)71-78)。巨噬细胞被M-CSF和其它趋化因子募集至肿瘤。然后巨噬细胞可经由分泌血管发生性因子，蛋白酶和其它生长因子和细胞因子来促进肿瘤进展，而且可通过抑制CSF-1R信号传导来阻断。最近，Zins等人(Zins，K.等人，Cancer Res.67(2007)1038-1045)显示了肿瘤坏死因子α(TNFα)，M-CSF或二者组合的siRNA的表达会在小鼠异种移植物模型中在肿瘤内注射相应siRNA后将肿瘤生长降低34％到50％。由人SW620细胞分泌的靶向TNFα的siRNA降低小鼠M-CSF水平并导致肿瘤中的巨噬细胞减少。另外，用针对M-CSF的抗原结合片段处理MCF7肿瘤异种移植物在与化疗剂组合给予时确实导致40％肿瘤生长抑制，逆转对化疗剂的抗性及改善小鼠存活(Paulus，P.等人，Cancer Res.66(2006)4349-4356)。

TAM是慢性炎症和癌症之间出现的联系的唯一例子。炎症和癌症之间的联系有别的证据，如许多慢性病与升高的癌症风险有关，在慢性炎症位点处发生癌症，在许多癌症中发现炎症的化学介导物；消除炎症的细胞或化学介导物则抑制实验性癌症的发生，而且长期使用抗炎剂降低一些癌症的风险。许多炎性状况存在与癌症的联系，其中有幽门螺旋杆菌(H.pylori)诱导的胃炎对于胃癌，血吸虫病对于膀胱癌，HHVX对于卡波西(Kaposi)氏肉瘤，子宫内膜异位对于卵巢癌和前列腺炎对于前列腺癌(Balkwill，F.等人，Cancer Cell 7(2005)211-217)。巨噬细胞是慢性炎症中的关键细胞且有差异地响应其微环境。有两类巨噬细胞被认为是连续的功能状态的极端：M1巨噬细胞涉及1型反应。这些反应涉及微生物产物引起的激活及因此对致病性微生物的杀伤，产生反应氧中介物。另一个极端是M2巨噬细胞，其涉及2型反应，促进细胞增殖，调节炎症和适应性免疫及促进组织重塑，血管发生和修复(Mantovani，A.等人，Trends Immunol.25(2004)677-686)。导致瘤形成建立的慢性炎症通常与M2巨噬细胞有关。介导炎性反应的一种关键细胞因子是TNFα，顾名思义能在高剂量刺激抗肿瘤免疫和出血性坏死，但最近还发现由肿瘤细胞表达且起肿瘤促进物的作用(Zins，K.等人，Cancer Res.67(2007)1038-1045；Balkwill，F.，Cancer MetastasisRev.25(2006)409-416)。仍然需要更好地了解巨噬细胞关于肿瘤的具体作用，包括对其功能的潜在空间和时间依赖性及与特定肿瘤类型的关联。

如此，本发明的一个实施方案是本文所述CSF-1R抗体，与本文所述抗CD20抗体组合，用于治疗癌症。

本发明的实施方案的详细描述

在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CSF-1R的抗体，其用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多。

如本文中使用的，“在淋巴瘤或白血病中白血病细胞的淋巴细胞增多”指罹患/遭受淋巴瘤或白血病的患者的外周血中循环白血病细胞的绝对或相对升高。在一个实施方案中，该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比。在一个优选的实施方案中，该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比(还参见Hallek M,Cheson BD,Catovsky D,et al.Responseassessment in chronic lymphocytic leukemia treated with novel agents causingan increase of peripheral blood lymphocytes.Blood.Epub June 4,2012)。此类淋巴细胞增多的例子记载于例如下文，其中两次施用抗CSF1R单抗(图6A)诱导显著的淋巴细胞增多(图6B)，浸润组织变成外周血(PB)的一种治疗相关隔室转变。对用靶向BCR信号传导的药剂(例如依鲁替尼)治疗的CLL患者也描述了类似的淋巴细胞增多(Byrd et al.,N EnglJ Med.2013 Jul 4；369(1):32-42.)，但是之前对CSF-1R靶向剂从未看到过。

在又一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗方法，该方法包括施用有效量的结合CSF-1R的抗体，用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多或结合CSF-1R的抗体用于制造用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的药物的用途。

本发明进一步涉及前文所述抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比。在又一个实施方案中，本发明涉及本文所述抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD19抗体和/或抗CD20抗体的治疗易感。

本发明还涉及依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞，特别是，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD20抗体的治疗易感。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合疗法，其涵盖结合CSF-1R的抗体与结合CD20的抗体的共施用。该组合疗法可应用于

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

d)刺激细胞介导的免疫应答，特别是刺激细胞毒性T-淋巴细胞，刺激T细胞活性，或刺激巨噬细胞活性。在本发明的一个实施方案中，在治疗癌症期间发生刺激细胞介导的免疫应答。

在一个实施方案中，d)下所述刺激细胞介导的免疫应答涵盖刺激细胞毒性T-淋巴细胞的活性，或刺激巨噬细胞的活性。

已经显示在所治疗的罹患癌症的个体中应用所述组合疗法有力地改善基于CSF-1R的癌症疗法。本发明的发明人发现CSF-1R抗体增强CD20抗体治疗癌症，延迟肿瘤进展，或延长遭受癌症例如淋巴瘤或白血病的患者的存活的功效。延迟癌症进展，以及更长的总体存活代表对患者的主要益处。

供使用的抗体

本发明的一个方面涉及一种结合CSF-1R的抗体，或一种结合CSF-1R的抗体，其用于依照本发明的组合疗法。

供使用的抗CSF-1R抗体

在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CSF-1R的抗体，其中该抗体在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用，其用于

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

d)刺激细胞介导的免疫应答，特别是刺激细胞毒性T-淋巴细胞，刺激T细胞活性，或刺激巨噬细胞活性。

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活。

在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CSF-1R的抗体，其中该抗体在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用，其用于治疗癌症。在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CSF-1R的抗体，其中该抗体在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用，其用于延长罹患癌症的患者的存活。

供使用的抗CD20抗体

在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CD20的抗体，其中该抗体在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用，其用于

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活。

在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CD20的抗体，其中该抗体在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用，其用于治疗癌症。在一个实施方案中，本发明涉及一种结合CD20的抗体，其中该抗体在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用，其用于延长罹患癌症的患者的存活。

治疗方法

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其用于

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

d)刺激细胞介导的免疫应答，特别是刺激细胞毒性T-淋巴细胞，刺激T细胞活性，或刺激巨噬细胞活性，

其中该方法包括对有所需要的患者施用有效量的结合CSF-1R的抗体和有效量的结合CD20的抗体的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其用于

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活，

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其用于治疗癌症，其中该方法包括对有所需要的患者施用有效量的结合CSF-1R的抗体和有效量的结合CD20的抗体的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其用于延长罹患癌症的患者的存活，其中该方法包括对有所需要的患者施用有效量的结合CSF-1R的抗体和有效量的结合CD20的抗体的步骤。

抗体用于制造药物的用途

本发明的一个方面涉及一种结合CSF-1R的抗体，或一种结合CD20的抗体，其用于制造供依照本发明的组合疗法中使用的药物。

抗CSF-1R抗体的用途

在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体用于制造用于下述的药物的用途：

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活，

其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体用于制造用于延长罹患癌症的患者的存活的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。

抗CD20抗体的用途

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD20的抗体用于制造用于下述的药物的用途：

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

其中该抗体用于在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用。

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活，

其中该抗体用于在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CD20的抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用。在一个实施方案中，本发明涉及结合CD20的抗体用于制造用于延长罹患癌症的患者的存活的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用。

抗CSF-1R抗体和抗CD20抗体的用途

在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体和结合CD20的抗体用于制造用于下述的药物的用途：

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体和结合CD20的抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。在一个实施方案中，本发明涉及结合CSF-1R的抗体和结合CD20的抗体用于制造用于延长罹患癌症的患者的存活的药物的用途，其中该抗体用于在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用。

制品

本发明的一个方面涉及一种制品，其包含容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体或结合CD20的抗体的组合物，和包装插页，其指示该组合物的使用者在依照本发明的组合疗法中施用各种抗体。

包含抗CSF-1R抗体的制品

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CSF-1R的抗体施用于患者以

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

其中在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用该结合CSF-1R的抗体。

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CD20的抗体施用于患者以

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活，

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CSF-1R的抗体施用于患者以治疗癌症，其中在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用该结合CSF-1R的抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CSF-1R的抗体施用于患者以延长罹患癌症的患者的存活，其中在与结合CD20的抗体的组合疗法中施用该结合CSF-1R的抗体。

包含抗CD20抗体的制品

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CD20的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CD20的抗体施用于患者以

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

其中在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用该结合CD20的抗体。

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，或

c)延长罹患癌症的患者的存活，

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CD20的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CD20的抗体施用于患者以治疗癌症，其中在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用该结合CD20的抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CD20的抗体的组合物，和(b)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CD20的抗体施用于患者以延长罹患癌症的患者的存活，其中在与结合CSF-1R的抗体的组合疗法中施用该结合PD-1的抗体。

包含抗CSF-1R抗体和抗CD20抗体的制品

在一个实施方案中，本发明涉及一种制品，其包含(a)容器，该容器内的包含结合CSF-1R的抗体的组合物，和(b)容器，该容器内的包含结合CD20的抗体的组合物，和(c)包装插页，其指示该组合物的使用者将该结合CSF-1R的抗体和该结合CD20的抗体施用于患者以

a)治疗癌症，

b)延迟癌症进展，

c)延长罹患癌症的患者的存活，或

药物组合物

在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含结合CSF-1R的抗体，和结合CD20的抗体，其中每一种抗体与药学可接受载剂一起配制。

在所述药物组合物的一个实施方案中，该结合CSF-1R的抗体和该结合CD20的抗体分开配制。在所述药物组合物的另一个实施方案中，该结合CSF-1R的抗体和该结合CD20的抗体一起配制。

用于制造药物组合物的方法

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制造药物组合物的方法，其包括(a)配制结合CSF-1R的抗体与药学可接受载剂，和(b)分开配制结合CD20的抗体与药学可接受载剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制造药物组合物的方法，其包括与药学可接受载剂组合与结合CD20的抗体一起配制结合CSF-1R的抗体。

上述实施方案中使用的具体抗体

在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体选自由hMab2F11-c11，hMab 2F11-d8，hMab 2F11-e7，hMab 2F11-f12，和hMab 2F11-g1组成的组。

表2

这些抗体特征在于包含下述本文所述VH和VL序列：

表3

依照本发明，依照记载于WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana,P.et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及WO 99/154342中的规程在Fc区中糖工程化改造(GE)此类无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体。在一个实施方案中，无岩藻糖基化糖工程人源化B-Ly1是B-HH6-B-KV1GE。此类糖工程人源化B-Ly1抗体在Fc区中具有改变的糖基化样式，优选地具有降低的岩藻糖残基水平。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297处的寡糖总量的60％或更少(在一个实施方案中，岩藻糖的量是40％至60％，在另一个实施方案中，岩藻糖的量是50％或更少，且在又一个实施方案中，岩藻糖的量是30％或更少)。在另一个实施方案中，优选地，Fc区的寡糖是两分的。这些糖工程人源化B-Ly1抗体具有升高的ADCC。

如本文中使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌症，结肠癌，乳腺癌，子宫的癌症，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴门癌，何杰金(Hodgkin)氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆囊癌，中枢神经系统(CNS)新生物，脊柱轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑脊膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固形式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个优选的实施方案中，癌症指淋巴瘤(优选B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小无核裂细胞淋巴瘤(Small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，j)何杰金氏病。

在另一个优选的实施方案中，术语癌症指“表达CD20的癌症”，其中癌细胞显示CD20抗原的表达。在另一个优选的实施方案中，如本文中使用的，术语“表达CD20的癌症”指淋巴瘤(优选B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小无核裂细胞淋巴瘤(Small Non-Cleaved CellLymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，j)何杰金氏病。

在另一个优选的实施方案中，表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。在另一个实施方案中，表达CD20的癌症是套细胞淋巴瘤(MCL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，伯基特氏淋巴瘤，毛细胞白血病，滤泡性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，边缘区淋巴瘤，移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，HIV有关的淋巴瘤，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，或原发性CNS淋巴瘤。

在一个优选的实施方案中，该癌症或表达CD20的癌症是B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。在另一个优选的实施方案中，该癌症或表达CD20的癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，滤泡性淋巴瘤，多发性骨髓瘤。在另一个优选的实施方案中，该癌症或表达CD20的癌症是何杰金氏病。

类风湿性关节炎，银屑病关节炎和炎性关节病本身是CSF-1R信号传导抑制剂的潜在适应证，原因在于它们由巨噬细胞成分组成及不同程度的骨破坏(Ritchlin，C.T.等人，J.Clin.Invest.111(2003)821-831)。骨关节炎和类风湿性关节炎是由巨噬细胞在结缔组织中积累和巨噬细胞浸润入滑液(这至少部分是由M-CSF介导的)引起的炎性自身免疫病。Campbell，I.K.等人，J.Leukoc.Biol.68(2000)144-150证明了M-CSF在体外由人关节组织细胞(软骨细胞，滑液成纤维细胞)生成，而且发现于类风湿性关节炎患者的滑液中，提示它有助于滑膜组织增殖和巨噬细胞浸润，这与该疾病的发病机制有关。抑制CSF-1R信号传导有可能控制关节中的巨噬细胞数目及减轻来自有关骨破坏的疼痛。为了使不利影响最小化及进一步了解CSF-1R信号传导在这些适应证中的影响，一种方法是特异性抑制CSF-1R，而不靶向无数的其它激酶，诸如Raf激酶。

如此，本发明的另一个实施方案是特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段的CSF-1R抗体，与特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗CD20抗体组合，用于治疗类风湿性关节炎，银屑病关节炎，骨关节炎，炎性关节病，和炎症。

本发明包含结合人CSF-1R的抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)与抗CD20抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)的组合疗法，用于治疗癌症。

本发明包含结合人CSF-1R的抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)与抗CD20抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)的组合疗法，用于预防或治疗转移。

本发明包含结合人CSF-1R的抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)与抗CD20抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)的组合疗法，用于治疗炎性疾病。

本发明包含结合人CSF-1R的抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)与抗CD20抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)的组合疗法，用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。

本发明包含结合人CSF-1R的抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)与抗CD20抗体(其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)的组合疗法，用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性。

本发明包含抗体(特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)用于与抗CD20抗体组合治疗癌症或用于制备与本文所述抗CD20抗体组合治疗癌症的药物的用途。

本发明包含抗体(特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)用于与本文所述抗CD20抗体组合预防或治疗转移或用于制备与本文所述抗CD20抗体组合预防或治疗转移的药物的用途。

本发明包含抗体(特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)用于与本文所述抗CD20抗体组合治疗炎性疾病或用于制备与本文所述抗CD20抗体组合治疗炎性疾病的药物的用途。

本发明包含抗体(特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)用于与本文所述抗CD20抗体组合治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展或用于制备与本文所述抗CD20抗体组合治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展的药物的用途。

本发明包含抗体(特征在于包含结合人CSF-1R的抗体，其特征在于上文所述氨基酸序列和氨基酸序列片段)用于与本文所述抗CD20抗体组合刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性或用于制备与本文所述抗CD20抗体组合刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性的药物的用途。

在本发明的一个优选实施方案中，上文所述不同疾病中的组合治疗和医药用途中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且其中此类组合治疗中使用的结合CD20的抗体特征在于包含SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

优选通过重组手段来生产本文所述抗体。此类方法是现有技术广泛知道的，而且包括原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽且通常纯化至药学可接受纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在适宜的原核或真核宿主细胞中实施表达，诸如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，酵母，或大肠杆菌细胞，并自细胞(自上清液或在细胞裂解后)回收抗体。

抗体的重组生产是现有技术公知的，而且记载于例如综述性论文Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880。

抗体可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中，或部分纯化的或实质性纯的形式。通过标准技术实施纯化以消除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质，标准技术包括碱/SDS处理，CsCl成带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳，和本领域公知的其它技术。参见Ausubel，F.等人编，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishingand Wiley Interscience，New York(1987)。

NS0细胞中的表达记载于例如Barnes，L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬时表达记载于例如Durocher，Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变域的克隆记载于Orlandi，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；Norderhaug，L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)记载于Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，Cytotechnology30(1999)71-83，及Schlaeger，E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。

将依照本发明的重和轻链可变域与启动子，翻译起始，恒定区，3'非翻译区，聚腺苷酸化，和转录终止的序列组合以形成表达载体构建物。可以将重和轻链表达构建物组合入单一载体中，共转染，序贯转染，或分开转染入宿主细胞中，然后融合以形成表达双链的单一宿主细胞。

适合于原核生物的控制序列包括例如启动子，任选的操纵基因序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，增强子和聚腺苷酸化信号。

在将核酸放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的DNA序列是连续的，而且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析，恰当地将单克隆抗体与培养液分开。使用常规规程，容易分离编码单克隆抗体的DNA和RNA及测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将该DNA插入表达载体中，然后将该表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞)中，以获得该宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。

如本文中使用的，表述“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代受试细胞及自其衍生的培养物，不管转移的次数。还理解，由于有意的或无意的突变，所有后代的DNA内容可以不是精确相同的。包括具有在初始转化细胞所筛选的相同功能或生物学活性的变异后代。

在另一个方面，本发明提供含有一种或一组本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载体一起配制的组合物，例如药物组合物。

如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有生理学相容的溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等张和吸收/再吸收延迟剂，等等。优选地，载体适合于注射或输注。

可以通过本领域已知的多种方法来施用本发明的组合物。正如技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。

药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对药学活性物质的使用是本领域已知的。在水之外，载体可以是例如等张缓冲盐水溶液。

不管选择的施用路径，通过本领域技术人员知道的常规方法将可以以合适水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。

本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者，组合物，和施用模式有效实现期望治疗响应，对患者没有毒性的活性组分量(有效量)。选择的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括采用的本发明特定组合物或其酯，盐或酰胺的活性，施用路径，施用时间，采用的特定化合物的排泄速率，与采用的特定组合物组合使用的其它药物，化合物和/或材料，治疗的患者的年龄，性别，重量，状况，一般健康和在先医学史，及医学领域公知的类似因素。

术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指设计为降低或消除患者中的癌细胞数目，或者减轻癌症症状的规程或作用过程。癌症或另一种增殖性病症的“治疗方法”不必意味着实际上会消除癌细胞或其它病症，实际上会降低细胞数目或病症，或实际上会减轻癌症或其它病症的症状。经常，甚至会实施具有较低的成功概率，但是然而鉴于医学史和估计的患者存活预期认为诱导总体有益的作用过程的治疗癌症的方法。

术语“与……组合施用”，“共施用”，“组合疗法”或“组合治疗”指例如作为分开的配制剂/应用(或者作为一种单一配制剂/应用)施用本文所述抗CSF-1R和本文所述抗CD20抗体。共施用可以是同时的或者以任意次序序贯的，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的时段。同时或序贯(例如静脉内(i.v.)经由连续输注)共施用所述抗体和所述别的药剂。在序贯共施用这两种治疗剂时，在同一天在两次分开的施用中施用剂量，或者在第1天施用药剂之一，而在第2天至第7天，优选在第2天至第4天共施用第二种。如此，在一个实施方案中，术语“序贯地”意指在第一组分的剂量后7天内，优选在第一组分的剂量后4天内；而术语“同时地”意指同一时间。术语“共施用”就抗CSF-1R抗体和/或抗CD20抗体的维持剂量而言意指若治疗周期对于这两种药物都是合适的，例如每周，则可以同时共施用维持剂量。或者，例如，例如每第一至第三天施用别的药剂，而每周施用所述抗体。或者，在一天内或在几天内序贯共施用维持剂量。

不证自明的是，以“治疗有效量”(或仅为“有效量”)对患者施用抗体，所述治疗有效量是相应化合物或组合会引发研究人员，兽医，医学医生或其它临床医生寻找的组织，系统，动物或人的生物学或医学应答的量。

共施用量和共施用时机会取决于所治疗患者的类型(物种，性别，年龄，重量，等)和状况和所治疗疾病或状况的严重性。可以一次或在一系列治疗里，例如在同一天或在次日对患者适当地共施用所述抗CSF-1R抗体和别的药剂。

根据疾病的类型和严重性，约0.1mg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)所述抗CSF-1R抗体和/或抗CD20抗体是将两种药物共施用于患者的初始候选剂量。本发明包括依照本发明的抗体用于治疗罹患癌症(尤其是结肠，肺或胰腺癌)的患者的用途。

根据疾病的类型和严重性，约0.1mg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)所述抗CSF-1R抗体和/或抗CD20抗体是将两种药物共施用于患者的初始候选剂量。本发明包括依照本发明的抗体用于治疗罹患癌症(尤其是结肠，肺或前列腺癌)的患者的用途。

在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外，还可以施用化疗剂或靶向疗法。

在一个实施方案中，此类可以与本文所述抗CSF-1R抗体和本文所述抗CD20抗体一起施用的另外的化疗剂包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂，包括：氮芥，诸如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，异环磷酰胺(ifosfamide)，美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)，洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，和司莫司汀(semustine)(methyl-CCNU)；Temodal^TM(替莫唑胺(temozolamide))，乙撑亚胺/甲基蜜胺诸如三乙撑蜜胺(TEM)，三乙烯硫代磷酰胺(塞替派(thiotepa))，六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺(altretamine))；烃基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)；三嗪，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5FU)，氟脱氧尿苷，吉西他滨(gemcitabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷(cytarabine))，5-氮胞苷，2,2'-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，诸如6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，硫唑嘌呤(azathioprine)，T-脱氧柯福霉素(喷司他丁(pentostatin))，erythrohydroxynonyladenine(EHNA)，磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，诸如帕利他赛(paclitaxel)，长春花生物碱(包括长春碱(vinblastine)(VLB)，长春新碱(vincristine)，和长春瑞滨(vinorelbine))，泰索帝(taxotere)，雌莫司汀(estramustine)，和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)，道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，伊达比星(idarubicin)，博来霉素(bleomycin)，普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))，丝裂霉素C(mitomycin C)，和放线菌素(actinomycin)；酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物学应答改性剂，诸如干扰素-α，IL-2，G-CSF和GM-CSF；包括铂配位复合物的混杂剂，诸如奥沙利铂(oxaliplatin)，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，蒽二酮，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)，取代的脲，诸如羟基脲，甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼(procarbazine)，肾上腺皮质阻抑剂，诸如米托坦(mitotane)(o，p-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如强的松(prednisone)及等效物，地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；Gemzar^TM(吉西他滨(gemcitabine))，妊娠素，诸如己酸羟基孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)，乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)；雌激素，诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾酮(testosterone propionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)，促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；和非类固醇抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)。靶向后成机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，脱甲基化剂(例如Vidaza)和释放转录阻抑(ATRA)疗法也可以与抗原结合蛋白质组合。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(Taxol)，多西他赛(Taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)，多柔比星，舒尼替尼(Sutent)，索拉非尼(Nexavar)，和其它多激酶抑制剂，奥沙利铂，顺铂和卡铂，依托泊苷，吉西他滨，和长春碱。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(Taxol)，多西他赛(Taxotere)，经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)。在一个实施方案中，别的化疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)，亚叶酸，伊立替康，或奥沙利铂。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶，亚叶酸和伊立替康(FOLFIRI)。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(FOLFOX)。

与别的化疗剂的组合疗法的具体例子包括例如与紫杉烷(例如多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(例如Abraxane或Opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(Avastin)用于治疗乳腺癌的疗法；与卡铂，奥沙利铂，顺铂，帕利他赛，多柔比星(或经修饰的多柔比星(Caelyx或Doxil))，或拓扑替康(Hycamtin)用于卵巢癌的疗法；与多激酶抑制剂MKI(Sutent，Nexavar，或706)和/或多柔比星用于治疗肾癌的疗法；与奥沙利铂，顺铂和/或放射用于治疗鳞状细胞癌的疗法；与Taxol和/或卡铂用于治疗肺癌的疗法。

因此，在一个实施方案中，别的化疗剂选自下组：紫杉烷(多西他赛或帕利他赛)或经修饰的帕利他赛(Abraxane或Opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐单抗(用于治疗乳腺癌)。

在一个实施方案中，CSF-1R抗体/CD20抗体组合疗法不施用化疗剂或靶向疗法。

本发明还包含一种用于治疗患有此类疾病的患者的方法。

在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还可以施用靶向疗法。

在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还可以施用抗PD-L1或抗PD1抗体。

PD-1/PD-L1/PD-L2途径：

一种调节T细胞活化的重要负共刺激信号是由编程性死亡-1受体(PD-1)(CD279)及其配体结合配偶PD-L1(B7-H1，CD274；SEQ ID NO:88)和PD-L2(B7-DC，CD273)提供的。PD-1的负调节作用是通过PD-1敲除(Pdcd1^-/-)揭示的，其倾向于自身免疫。Nishimura等人，Immunity 11：141-51(1999)；Nishimura等人，Science 291：319-22(2001)。PD-1与CD28和CTLA-4有关，但是缺少容许同二聚化的近膜半胱氨酸。PD-1的胞质域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM，V/IxYxxL/V)。PD-1只结合PD-L1和PD-L2。Freeman等人，J.Exp.Med.192：1-9(2000)；Dong等人，Nature Med.5：1365-1369(1999)；Latchman等人，Nature Immunol.2：261-268(2001)；Tseng等人，J.Exp.Med.193：839-846(2001)。

PD-1能在T细胞，B细胞，天然杀伤T细胞，活化的单核细胞和树突细胞(DC)上表达。PD-1由活化的但不由未刺激的人CD4+和CD8+T细胞，B细胞和髓样细胞表达。这与更受局限的CD28和CTLA-4表达形成对比。Nishimura等人，Int.Immunol.8：773-80(1996)；Boettler等人，J.Virol.80：3532-40(2006)。已经自活化的人T细胞克隆了PD-1的至少4种变体，包括缺少(i)外显子2，(ii)外显子3，(iii)外显子2和3，或(iv)外显子2至4的转录物。Nielsen等人，Cell.Immunol.235：109-16(2005)。除PD-1Δex3外，在静息外周血单个核细胞(PBMC)中所有变体以与全长PD-1相似的水平表达。所有变体的表达在用抗CD3和抗CD28活化人T细胞后显著诱导。PD-1Δex3变体缺少跨膜域，且类似可溶性CTLA-4，其在自身免疫中发挥重要作用。Ueda等人，Nature 423：506-11(2003)。此变体在具有类风湿性关节炎的患者的滑液和血清中富集。Wan等人，J.Immunol.177：8844-50(2006)。

两种PD-1配体区别在于它们的表达样式。PD-L1在小鼠T和B细胞，CD，巨噬细胞，间充质干细胞和骨髓衍生肥大细胞上组成性表达。Yamazaki等人，J.Immunol.169：5538-45(2002)。PD-L1在广泛的非造血细胞(例如角膜，肺，血管上皮，肝非实质细胞，间充质干细胞，胰岛，胎盘合胞滋养层，角质形成细胞，等)上表达[Keir等人，Annu.Rev.Immunol.26：677-704(2008)]，而且在活化后在多种细胞类型上上调。I型和II型干扰素IFN均上调PD-L1。Eppihimer等人，Microcirculation 9：133-45(2002)；Schreiner等人，J.Neuroimmunol.155：172-82(2004)。细胞系中的PD-L1表达在MyD88，TRAF6和MEK受到抑制时降低。Liu等人，Blood 110：296-304(2007)。JAK2也已经与PD-L1诱导联系起来。Lee等人，FEBS Lett.580：755-62(2006)；Liu等人，Blood 110：296-304(2007)。磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)(一种修饰磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Akt信号传导的细胞磷酸酶)的丧失或抑制提高癌症中的转录后PD-L1表达。Parsa等人，Nat.Med.13：84-88(2007)。

PD-L2表达比PD-L1更受局限。PD-L2在DC，巨噬细胞，和骨髓衍生肥大细胞上可诱导表达。PD-L2还在约二分之一至三分之二的静息腹膜B1细胞上表达，但是不在常规B2B细胞上表达。Zhong等人，Eur.J.Immunol.37：2405-10(2007)。PD-L2+B1细胞结合磷脂酰胆碱，而且对于针对细菌抗原的先天免疫应答可能是重要的。IFN-γ对PD-L2的诱导部分依赖于NF-κB。Liang等人，Eur.J.Immunol.33：2706-16(2003)。PD-L2还可以在单核细胞和巨噬细胞上受GM-CF，IL-4和IFN-γ诱导。Yamazaki等人，J.Immunol.169：5538-45(2002)；Loke等人，PNAS 100:5336-41(2003)。

PD-1信号传导通常具有比对细胞增殖要大的对细胞因子生成的影响，对IFN-γ，TNF-α和IL-2生成有显著影响。PD-1介导的抑制性信号传导还依赖于TCR信号传导的强度，在低水平的TCR刺激投递较大的抑制。这种降低可以通过经由CD28的共刺激[Freeman等人，J.Exp.Med.192：1027-34(2000)]或IL-2的存在[Carter等人，Eur.J.Immunol.32：634-43(2002)]来克服。

越来越多的证据说明经由PD-L1和PD-L2的信号传导可能是双向的。就是说，在修饰TCR或BCR信号传导以外，信号传导还可以投递回到表达PD-L1和PD-L2的细胞。虽然用自具有瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症的患者分离的天然人抗PD-L2抗体处理树突细胞未发现上调MHC II或B7共刺激分子，但是此类细胞确实生成极大量的促炎症细胞因子，特别是TNF-α和IL-6，且刺激T细胞增殖。Nguyen等人，J.Exp.Med.196：1393-98(2002)。用这种抗体处理小鼠还(1)增强对移植的b16黑素瘤抗性和快速诱导肿瘤特异性CTL。Radhakrishnan等人，J.Immunol.170：1830-38(2003)；Radhakrishnan等人，CancerRes.64：4965-72(2004)；Heckman等人，Eur.J.Immunol.37：1827-35(2007)；(2)阻断变应性哮喘小鼠模型中气道炎性疾病发生。Radhakrishnan等人，J.Immunol.173：1360-65(2004)；Radhakrishnan等人，J.Allergy Clin.Immunol.116：668-74(2005)。

关于逆信号传导入树突细胞(“DC”)的进一步证据源自用可溶性PD-1(与Ig恒定区融合的PD-1EC域-“s-PD-1”)培养的骨髓衍生DC的研究。Kuipers等人，Eur.J.Immunol.36：2472-82(2006)。此sPD-1以通过施用抗PD-1可逆的方式抑制DC活化且提高IL-10生成。

另外，数项研究显示了PD-L1或PD-L2的一种不依赖于PD-1的受体。B7.1早就鉴定为PD-L1的结合配偶。Butte等人，Immunity 27：111-22(2007)。化学交联研究提示PD-L1和B7.1能经由它们的IgV样域相互作用。B7.1:PD-L1相互作用能诱导进入T细胞的抑制性信号。通过B7.1连接CD4+T细胞上的PD-L1或通过PD-L1连接CD4+T细胞上的B7.1投递抑制性信号。缺少CD28和CTLA-4的T细胞显示在通过抗CD3加B7.1包被珠刺激时降低的增殖和细胞因子生成。在缺少B7.1的所有受体(即CD28，CTLA-4和PD-L1)的T细胞中，T细胞增殖和细胞因子生成不再受抗CD3加B7.1包被珠抑制。这指示B7.1在CD28和CTLA-4缺失下经由T细胞上的PD-L1特异性起作用。类似地，缺少PD-1的T细胞在抗CD3加PD-L1包被珠存在下刺激时显示降低的增殖和细胞因子生成，证明PD-L1连接T细胞上的B7.1的抑制效果。当T细胞缺少PD-L1的所有已知受体(即没有PD-1和B7.1)时，T细胞增殖不再受抗CD3加PD-L1包被珠削弱。如此，PD-L1能经由B7.1或PD-1任一对T细胞发挥抑制效果。

B7.1和PD-L1之间的直接相互作用提示当前关于共刺激的理解是不全面的，而且强调对这些分子在T细胞上的表达的意义。关于PD-L1^-/-T细胞的研究指出T细胞上的PD-L1能下调T细胞的细胞因子生成。Latchman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：10691-96(2004)。因为PD-L1和B7.1均在T细胞，B细胞，DC和巨噬细胞上表达，所以这些细胞类型上的B7.1和PD-L1之间的定向相互作用是有可能的。另外，非造血细胞上的PD-L1可能与B7.1以及T细胞上的PD-1相互作用，这提出了PD-L1是否参与它们的调节的问题。关于B7.1:PD-L1相互作用的抑制性作用的一种可能的解释是T细胞PD-L1可能诱捕或隔离APC B7.1，不得与CD28相互作用。

结果是，拮抗经由PD-L1的信号传导(包括阻断PD-L1与PD-1，B7.1任一或二者相互作用，由此阻止PD-L1将负共刺激信号发送至T细胞和其它抗原呈递细胞)很可能增强响应感染(例如急性和慢性)的免疫和肿瘤免疫。另外，本发明的抗PD-L1抗体可以与PD-1:PD-L1信号传导的其它成分的拮抗剂(例如拮抗性抗PD-1和抗PD-L2抗体)组合。

Eμ-TCL1CLL小鼠模型中衰老相关免疫缺陷的背景中PD-L1/PD-1介导的CD8T-细胞功能障碍的机制记载于McClanahan F,et al,.Blood.2015 May 15.blood-2015-02-626754(电子出版早于印刷-PMID:25979947)。McClanahan F,et al,Blood.2015Mar 23.(pii:blood-2015-01-622936)提到在慢性淋巴细胞性白血病的小鼠模型中PD-L1检查点阻断防止免疫功能障碍和白血病发生。

术语“人PD-L1”指人蛋白质PD-L1(SEQ ID NO:97，PD-1信号传导，通常)。如本文中使用的，“结合人PD-L1”或“特异性结合人PD-L1”或“抗PD-L1抗体”指抗体以K_D值1.0x 10^- ⁸mol/l或更低(在一个实施方案中，以K_D值1.0x10^-9mol/l或更低)的结合亲和力特异性结合人PD-L1抗原。结合亲和力用标准结合测定法测定，诸如表面等离振子共振技术(

GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)。如此，如本文中使用的，“结合人PD-L1的抗体”指以K_D 1.0x 10^-8mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^-8mol/l-1.0x 10^-13mol/l)，在一个实施方案中，以K_D 1.0x10^-9mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x 10^-9mol/l-1.0x10^-13mol/l)的结合亲和力特异性结合人PD-L1抗原的抗体。

在一个优选的实施方案中，在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还可以施用抗PD-L1抗体。

在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的抗PD-L1抗体(结合人PD-L1的抗体)选自下组：243.55.S70，243.55.H1，243.55.H12，243.55.H37，243.55.H70，243.55.H89，243.55.S1，243.55.5，243.55.8，243.55.30，243.55.34，243.55.S37，243.55.49，243.55.51，243.55.62，和243.55.84。

这些抗体记载于WO 2010/77634(序列显示于WO 2010/77634的图11)且特征在于包含下述本文所述VH和VL序列：

表4

在本发明的一个实施方案中，依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-L1的抗体包含选自下组的可变域氨基酸序列：

-SEQ ID NO:78的可变重链域VH，和SEQ ID NO:81的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.S70”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:82的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.H1”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:83的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.H12”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:84的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.H37”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:85的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.H70”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:86的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.H89”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:87的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.S1”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:88的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.5”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:89的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.8”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:90的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.30”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:91的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.34”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:92的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.S37”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:93的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.49”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:94的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.51”的VH和VL域)；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:95的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.62”的VH和VL域)；和

-SEQ ID NO:80的可变重链域VH，和SEQ ID NO:96的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.84”的VH和VL域)。

在本发明的一个优选的实施方案中，依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-L1的抗体包含下述可变域氨基酸序列：SEQ ID NO:78的可变重链域VH，和SEQ ID NO:81的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-L1>“243.55.S70”的VH和VL域)。

在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的该抗PD-L1抗体(结合人PD-L1的抗体)是阿特珠单抗(CAS编号：1380723-44-3)。在本发明的一个优选的实施方案中，依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-L1的抗体包含阿特珠单抗(CAS编号：1380723-44-3)的可变重链域VH和可变轻链域VL的可变域氨基酸序列。

在一个实施方案中，在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还可以施用抗PD1抗体。在本发明的一个实施方案中，在依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-1的抗体结合人PD-1。

在本发明的一个实施方案中，依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-1的抗体包含下述可变域氨基酸序列：SEQ ID NO:98的可变重链域VH，和SEQ ID NO:99的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-1>nivolumab的VH和VL域)。

在本发明的一个实施方案中，依照本发明的组合疗法中使用的该结合PD-1的抗体包含下述可变域氨基酸序列：SEQ ID NO:100的可变重链域VH，和SEQ ID NO:101的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-1>pembrolizumab的VH和VL域)。

在另一个优选的实施方案中，在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还可以施用依鲁替尼(ibrutinib)。

依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)(USAN,[1]也称作PCI-32765且以名称Imbruvica销售)是一种靶向B-细胞恶性的抗癌药物。

因此，在一个实施方案中，在上文所述(具体CSF1R和CD20抗体的)方法和医疗用途中与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还组合施用和/或使用依鲁替尼(三重组合)。

本发明进一步提供一种用于制备包含有效量的依照本发明的抗体以及药学可接受载体的药物组合物的方法及依照本发明的抗体对此类方法的用途。

本发明进一步提供有效量的依照本发明的抗体用于制备药物制剂的用途，优选地，与药学可接受载体一起，用于治疗患有癌症的患者。

本发明还提供有效量的依照本发明的抗体用于制备药物制剂的用途，优选地，与药学可接受载体一起，用于治疗患有癌症的患者。

提供下面的实施例，序列表和附图来帮助理解本发明，所附权利要求书列出本发明的真实范围。理解的是，可以在所列规程中进行更改而不偏离本发明的精神。

序列说明

SEQ ID NO:1 重链CDR3，Mab 2F11

SEQ ID NO:2 重链CDR2，Mab 2F11

SEQ ID NO:3 重链CDR1，Mab 2F11

SEQ ID NO:4 轻链CDR3，Mab 2F11

SEQ ID NO:5 轻链CDR2，Mab 2F11

SEQ ID NO:6 轻链CDR1，Mab 2F11

SEQ ID NO:7 重链可变域，Mab 2F11

SEQ ID NO:8 轻链可变域，Mab 2F11

SEQ ID NO:9 重链CDR3，Mab 2E10

SEQ ID NO:10 重链CDR2，Mab 2E10

SEQ ID NO:11 重链CDR1，Mab 2E10

SEQ ID NO:12 轻链CDR3，Mab 2E10

SEQ ID NO:13 轻链CDR2，Mab 2E10

SEQ ID NO:14 轻链CDR1，Mab 2E10

SEQ ID NO:15 重链可变域，Mab 2E10

SEQ ID NO:16 轻链可变域，Mab 2E10

SEQ ID NO:17 重链CDR3，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:18 重链CDR2，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:19 重链CDR1，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:20 轻链CDR3，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:21 轻链CDR2，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:22 轻链CDR1，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:23 重链可变域，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:24 轻链可变域，hMab 2F11-c11

SEQ ID NO:25 重链CDR3，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:26 重链CDR2，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:27 重链CDR1，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:28 轻链CDR3，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:29 轻链CDR2，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:30 轻链CDR1，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:31 重链可变域，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:32 轻链可变域，hMab 2F11-d8

SEQ ID NO:33 重链CDR3，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:34 重链CDR2，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:35 重链CDR1，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:36 轻链CDR3，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:37 轻链CDR2，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:38 轻链CDR1，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:39 重链可变域，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:40 轻链可变域，hMab 2F11-e7

SEQ ID NO:41 重链CDR3，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:42 重链CDR2，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:43 重链CDR1，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:44 轻链CDR3，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:45 轻链CDR2，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:46 轻链CDR1，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:47 重链可变域，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:48 轻链可变域，hMab 2F11-f12

SEQ ID NO:49 重链CDR3，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:50 重链CDR2，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:51 重链CDR1，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:52 轻链CDR3，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:53 轻链CDR2，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:54 轻链CDR1，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:55 重链可变域，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:56 轻链可变域，hMab 2F11-g1

SEQ ID NO:57 人κ轻链恒定区

SEQ ID NO:58 自IgG1衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO:59 L234A和L235A上突变的自IgG1衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO:60 自IgG4衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO:61 S228P上突变的自IgG4衍生的人重链恒定区

SEQ ID NO:62 人野生型CSF-1R(wt CSF-1R)(包括信号序列)

SEQ ID NO:63 人突变型CSF-1R L301S Y969F(包括信号序列)

SEQ ID NO:64 人CSF-1R胞外域(域D1-D5)

SEQ ID NO:65 人CSF-1R片段delD4

SEQ ID NO:66 人CSF-1R片段域D1-D3

SEQ ID NO:67 信号肽

SEQ ID NO:68 引物

SEQ ID NO:69 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HH2

SEQ ID NO:70 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HH3

SEQ ID NO:71 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HH6

SEQ ID NO:72 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HH8

SEQ ID NO:73 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HL8

SEQ ID NO:74 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HL11

SEQ ID NO:75 重链可变域，人源化B-Ly1变体B-HL13

SEQ ID NO:76 轻链可变域(VL)，人源化B-Ly1变体B-KV1

SEQ ID NO:77 人CD20

SEQ ID NO:78 <PD-L1>243.55变体1的可变重链域VH

SEQ ID NO:79 <PD-L1>243.55变体2的可变重链域VH

SEQ ID NO:80 <PD-L1>243.55变体3的可变重链域VH

SEQ ID NO:81 <PD-L1>243.55变体1的可变轻链域VL

SEQ ID NO:82 <PD-L1>243.55变体2的可变轻链域VL

SEQ ID NO:83 <PD-L1>243.55变体3的可变轻链域VL

SEQ ID NO:84 <PD-L1>243.55变体4的可变轻链域VL

SEQ ID NO:85 <PD-L1>243.55变体5的可变轻链域VL

SEQ ID NO:86 <PD-L1>243.55变体6的可变轻链域VL

SEQ ID NO:87 <PD-L1>243.55变体7的可变轻链域VL

SEQ ID NO:88 <PD-L1>243.55变体8的可变轻链域VL

SEQ ID NO:89 <PD-L1>243.55变体9的可变轻链域VL

SEQ ID NO:90 <PD-L1>243.55变体10的可变轻链域VL

SEQ ID NO:91 <PD-L1>243.55变体11的可变轻链域VL

SEQ ID NO:92 <PD-L1>243.55变体12的可变轻链域VL

SEQ ID NO:93 <PD-L1>243.55变体13的可变轻链域VL

SEQ ID NO:94 <PD-L1>243.55变体14的可变轻链域VL

SEQ ID NO:95 <PD-L1>243.55变体15的可变轻链域VL

SEQ ID NO:96 <PD-L1>243.55变体16的可变轻链域VL

SEQ ID NO:97 人编程性死亡配体1

SEQ ID NO:98 <PD-1>nivolumab的可变重链域VH

SEQ ID NO:99 <PD-1>nivolumab的可变轻链域VL

SEQ ID NO:100 <PD-1>pembrolizumab的可变重链域VH

SEQ ID NO:101 <PD-1>pembrolizumab的可变轻链域VL

下面描述本发明的具体实施方案：

1.一种结合CSF-1R的抗体，其用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多。

2.结合CSF-1R的抗体用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的用途。

3.一种治疗方法，该方法包括施用有效量的结合CSF-1R的抗体，用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多。

4.结合CSF-1R的抗体用于制造用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的药物的用途。

5.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比。

6.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD19的和/或表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD19抗体和/或抗CD20抗体的治疗易感。

7.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞。

8.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD20抗体的治疗易感。

9.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

10.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体包含

SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL

11.依照任何前述实施方案的抗体，用途或方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体是在Fc区中具有改变的糖基化样式的IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体，其中含有岩藻糖的寡糖的量介于Asn297处的寡糖总量的40％和60％之间；且包含SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

12.A)一种结合人CSF-1R的抗体，其中该抗体用于与结合人CD20的抗体组合；或

B)结合人CSF-1R的抗体用于与结合人CD20的抗体的组合疗法的用途；或

C)一种治疗方法，该方法包括施用有效量的结合人CSF-1R的抗体，其中该抗体用于与结合人CD20的抗体组合；或

D)结合人CSF-1R的抗体制造用于与结合人CD20的抗体组合的药物的用途；

其中A)，B)，C)和D)下的抗体，用途或方法

i)用于治疗表达CD20的癌症；或

ii)用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性；或

iv)用于延迟癌症进展；或

v)用于延长罹患癌症的患者的存活，

且其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；

且其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

13.依照实施方案12的抗体，用途或方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体包含

SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

14.依照实施方案12的抗体，用途或方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

15.一种与通过靶向巨噬细胞用于防止逃脱CD20靶向疗法的CSF-1R抑制剂组合用抗CD20抗体靶向表达CD20的癌症的方法。

16.实施方案15的方法，其中用抗CSF1R抗体靶向巨噬细胞。

17.实施方案15或16的方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:23的重链可变域VH和SEQ ID NO:24的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:31的重链可变域VH和SEQ ID NO:32的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:47的重链可变域VH和SEQ ID NO:48的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:55的重链可变域VH和SEQ ID NO:56的轻链可变域VL；

且其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:69的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

b)SEQ ID NO:70的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

c)SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

d)SEQ ID NO:72的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

e)SEQ ID NO:73的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

f)SEQ ID NO:74的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL，或

g)SEQ ID NO:75的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

18.实施方案15或16的方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

其中该组合疗法中使用的结合人CD20的抗体包含

SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL

19.实施方案15或16的方法，

其中该组合疗法中使用的结合人CSF-1R的抗体包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL，且

20.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于治疗淋巴瘤和淋巴细胞性白血病。

21.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于治疗B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。

22.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于治疗多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，或何杰金氏病。

23.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中该癌症，淋巴瘤和白血病表达CD20。

24.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫力或延迟其进展。

25.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性。

26.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于预防或治疗转移。

27.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其用于治疗炎症疾病。

28.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中该结合人CSF-R的抗体和该结合人CD20的抗体是人IgG1亚类的。

29.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中在该抗CSF-1R抗体和抗CD20抗体组合疗法以外不施用另外的化疗剂和/或靶向疗法施。

30.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体同时共施用。

31.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体顺序共施用。

32.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还施用抗PD-L1抗体。

33.依照实施方案32的抗体，用途或方法，其中所使用的结合PD-L1的抗体包含选自下组的可变域氨基酸序列：

34.依照实施方案32的抗体，用途或方法，其中该结合PD-L1的抗体是阿特珠单抗。

35.依照实施方案32至34任一项的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-L1的抗体同时共施用。

36.依照实施方案32至34任一项的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-L1的抗体顺序共施用。

37.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还施用抗PD-1抗体。

38.依照实施方案37的抗体，用途或方法，其中该结合PD-1的抗体包含下述可变域氨基酸序列：

SEQ ID NO:98的可变重链域VH和SEQ ID NO:99的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-1>nivolumab的VH和VL域)。

39.依照实施方案38的抗体，用途或方法，其中该结合PD-1的抗体包含下述可变域氨基酸序列：

SEQ ID NO:100的可变重链域VH和SEQ ID NO:101的可变轻链域VL(对应于本文中公开的<PD-1>pembrolizumab的VH和VL域)。

40.依照实施方案37至39的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-1的抗体同时共施用。

41.依照实施方案37至39的抗体，用途或方法，其中该结合CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-1的抗体顺序共施用。

42.依照前述实施方案任一项的抗体，用途或方法，其中在与抗CD20抗体组合的抗CSF-1R抗体以外还施用依鲁替尼。

实验规程

小鼠

所有小鼠在无特定病原体的动物设施中饲养和繁殖，依照欧洲联盟指导方针且在圣拉斐尔科学研究院制度伦理委员会批准下处理。BALB/c背景上的Rag2^-/-γc^-/-小鼠由CIEA和Taconic慷慨提供，C57BL/6背景上的Eμ-TCL1转基因小鼠由Byrd博士慷慨提供，而野生型C57BL/6小鼠由Charles River Laboratories供应。

细胞和试剂

依照赫尔辛基宣言，如圣拉斐尔科学研究院(意大利米兰)的制度伦理委员会(方案VIVI-CLL)批准的那样，在知情同意后自RAI 0-1阶段CLL患者获得人原代样品。MEC1CLL细胞系自德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DMSZ)获得并在含10％胎牛血清和庆大霉素(15μg/mL；Sigma-Aldrich)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养。clodrolip和磷酸盐缓冲溶液(PBS)脂质体自ClodLip B.V.购买。抗小鼠CSF1R抗体2G2和抗人CSF1R抗体huMab 2F11-2e 7由德国彭茨贝格Roche创新中心提供。抗人CD20GA101(岩藻糖量介于40和60％之间的糖工程化人源化B-Ly1抗体BHH6-B-KV1 GE)由瑞士施利伦Roche创新中心提供。

体内研究

对于异种移植物研究，经由27号针用0.1mL盐水中的10x10⁶个MEC1细胞i.v.或s.c.攻击8周龄Rag2^-/-γc^-/-小鼠。根据实验，给小鼠注射clodrolip，抗小鼠CSF1R单抗，抗人CD20GA101单抗。对于转基因移植研究，用10x10⁶个自白血病雄性Eμ-TCL1转基因小鼠的脾纯化的细胞i.p.攻击16(第0天)C57BL/6雄性小鼠。根据实验，以不同剂量和日程表用clodrolip或抗CSF1R单抗治疗小鼠。

鼠细胞制备物

自小鼠收集PB，PE，SP，和股骨并分离细胞。通过在氯化铵溶液(ACK)裂解缓冲液(NH₄Cl 0.15M，KHCO₃ 10mM，Na₂EDTA 0.1mM，pH 7.2-7.4)中于室温温育5分钟来裂解来自BM，PE，SP和PB样品的红细胞。在将可结晶片段(Fc)受体用Fc封闭剂(BD Biosciences)于室温封闭10分钟之后，将来自PB，BM，PE，SP的细胞用下文所列抗体染色(15分钟，于4℃)并用Beckman Coulter FC500流式细胞仪分析。对于细胞内细胞因子检测，见下文。通过将细胞的百分比乘以脾细胞，腹膜细胞或自一根股骨冲洗下来的BM细胞的总数来获得绝对数目(图7(论文的图1)B-C-D-E除外，其中绝对数目指自股骨和胫骨二者冲洗下来的总BM细胞)。

鼠细胞流式细胞术

用下述抗体实施表型分析：PE-Cy7或PE大鼠抗小鼠CD11b(M1/70)，APC大鼠抗小鼠CD5(53-7.3)，PE-Cy7大鼠抗小鼠CD19(1D3)，APC或FITC大鼠抗小鼠CD45(30-F11)，FITC大鼠抗小鼠CD206(MR5D3)，FITC仓鼠抗小鼠CD54(3E2)，PE大鼠抗小鼠CD86(GL1)，FITC或PE-Cy7大鼠抗小鼠CD8(53-6.7)，FITC大鼠抗小鼠CD44(IM7)，PE大鼠抗小鼠CD62L(MEL-14)，PE-Cy7大鼠抗小鼠CD4(GK1.5)，APC大鼠抗小鼠CD25(PC61)，FITC大鼠抗小鼠Gr1(RB6-8C5)，FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒，通过BD Biosciences获得；FITC大鼠抗小鼠κ(187.1)，PE大鼠抗小鼠λ(JC5-1)，通过Beckman Coulter购买；PE抗小鼠F4/80(BM8)，FITC大鼠抗小鼠Ly6C(HK1.4)，APC大鼠抗小鼠Ly6G(1A8)，通过BioLegend获得；APC抗小鼠CSF1R(AFS98)，通过eBioscience购买；PE大鼠抗小鼠CSF1R(604B5 2E11)，通过AbD Serotec购买。

细胞内细胞因子检测

对于CD8T细胞上的IFNγ检测，将脾细胞在体外用伊屋诺霉素和布雷菲尔德菌素A刺激，并用FITC抗CD44，PE-Cy7抗CD8和APC抗小鼠IFNγ(XMG1.2，BD Biosciences)染色。对于基质细胞上的IL17a和IL2检测，用抗CD45，抗Gr1，抗CD11b标记细胞表面，然后将细胞清洗，固定并用Cytofix/Cytoperm-Perm/Wash(BD Biosciences)透化并用通过BDBiosciences购买的生物素-链霉亲合素-PE抗小鼠IL2(JES6-5H4)或PE抗小鼠IL17a(TC11-18H10)标记。

来自CLL样品的体外培养物和细胞消减测定法

将来自未治疗的CLL患者的新鲜PBMC以3x10⁶个细胞/ml在培养培养基中一式三份接种并在来自Pfizer的TNF-α拮抗剂依那西普(10μg/ml)或来自Adipogen AG的抗TRAIL-R2(人，1μg/ml)单抗(HS201)存在或缺失下用clodrolip或PBS脂质体(100，500，1000μM)处理30分钟和24小时。对于CSF1R抑制研究，将来自CLL患者的PBMC用抗人CSF1R单抗(1-10μg/ml)或抗人CSF1R单抗+抗CD20单抗GA101(10μg/ml)处理48小时。以(经处理样品中的绝对数目/对照样品中的绝对数目)x100计算经处理样品中剩余白血病CD19+CD5+或CD14+细胞的特定百分比。对于每一种条件，以总的可存活细胞数(锥虫蓝排除测定)x％可存活细胞(流式细胞术测定)计算剩余细胞的绝对数目。然后，如下计算特定细胞消减：100-％特定剩余细胞，如{Laprevotte，2013#46}记载的。

基因表达概况分析

遵循制造商的说明书在EasySep Magnet(StemCell Technologies)上经由Easysep负选择单核细胞富集试剂盒通过消减T，NK，树突细胞，祖细胞，粒细胞和红血球对来自鼠BM的hCD19-细胞次生富集单核细胞/巨噬细胞。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)实施RNA提取。严格遵照制造商的方案使用Illumina TotalPrep扩增试剂盒(Ambion-Lifetechnologies)加工200ng总RNA样品。随后，将生物素标记的cRNA在小鼠WG-6v2.0表达BeadChip(包含针对～45,000种转录物的探针)或人HT-12v4BeadChip(包含针对～47,000种转录物的探针)

上杂交16小时，接着是Cy3染色。杂交后，BeadChip经历清洗和链霉亲合素-Cy3(GE Healthcare Bio-Sciences)缀合物染色方案。一旦BeadChip加工完成，用Illumina BeadArray Reader扫描它。简言之，在BeadScan仪器上扫描阵列，并使用BeadStudio软件(Illumina)提取和汇总荧光强度，产生一组汇总的荧光测量结果。

统计分析

使用Student检验实施统计分析。以均值±SD表述数据，并认为P小于0.05的生长曲线的比较是统计学显著的。用时序检验实施存活曲线的比较。

小鼠基因型测定

通过基于PCR的筛选测定法对Eμ-TCL1转基因小鼠针对hTCL1转基因测定基因型，如{Bertilaccio，2011#1}先前记载的。

异种移植物研究

(第0天)经由27号针用0.1mL盐水中的10x10⁶个MEC1细胞i.v.攻击8周龄Rag2^-/-γc^-/-小鼠雄性小鼠，如(Bertilaccio MTS,Blood,2010)记载的。在一些实验中，在白血病攻击的第-1天开始每3天给小鼠i.v.注射clodrolip(200μl)或PBS脂质体(200μl)(作为对照)。根据实验，一周一次对小鼠监测重量并在白血病的早期阶段(第18-21天，7次clodrolip注射)或白血病的晚期阶段(第28-31天，5次clodrolip注射)杀死。分析PE，PB，SP和股骨BM。在选定的实验中，自小鼠股骨冲洗出BM细胞用于磁分离白血病细胞和单核细胞/巨噬细胞。在临床前实验中，(第0天)在左侧用0.1mL盐水中的10x10⁶个MEC1细胞s.c.攻击Rag2^-/-γc^-/-小鼠。一旦携带皮下肿瘤的小鼠发生可触知的肿瘤引流腋窝LN(TDAL)，在TDAL部位给它们s.c.注射clodrolip(60μl)(第+39，+45，+52，+56，+60，+63，+66天)或PBS脂质体(60μl)(作为对照)。一周一次对小鼠监测重量，肿瘤和LN生长(用测径器测量三个垂直直径)并在均值LN体积达到1000mm³或更大时杀死，这在达到临床体征和症状之前，依照伦理指导方针避免不必要的疼痛和不适。对于临床前目的，在白血病攻击的第11天开始也给(第0天)i.v.移植10x10⁶个MEC1细胞的Rag2^-/-γc^-/-小鼠i.v.注射clodrolip(60μl)并在第26-32天(在两周一次的clodrolip注射，两周治疗之后；在两次clodrolip注射之后，隔周)处死或监测存活(在两次clodrolip注射之后，隔周)。对于体内CSF1R抑制研究，在第+11，+25天给异种移植物小鼠i.v.注射抗CSF1R单抗并在第27-29天处死。对于存活实验，在第+11，+25天作为单一药剂或在组合设置中给异种移植物小鼠i.v.注射抗CSF1R或GA101单抗(单克隆抗体)。对于功能研究，对i.v.注射clodrolip或抗CSF1R单抗(在第+11，+25天)的异种移植物小鼠重复i.p.施用依那西普(Pfizer，10mg/Kg)并分别在第26或29天杀死。在一个实验中，自第-1天开始每3/4天用2mg/kg抗ICAM1阻断性单抗(YN1/1.7.4，Biolegend)预治疗异种移植物小鼠并在第+19天杀死。对于转基因研究，(第0天)用使用EasySep小鼠B-细胞富集试剂盒自白血病雄性Eμ-TCL1转基因小鼠的脾纯化的10x10⁶个细胞i.p.攻击8周龄同基因有免疫能力的C57BL/6雄性小鼠。通过流式细胞术评估所移植的CD19+CD5+Igk+细胞的纯度。在白血病攻击的第-1天开始每3天给小鼠i.p.注射clodrolip(200μl)(第-1，+2，+5，+8，+11，+14，+18天)或PBS脂质体(200μl)(作为对照)。在临床前研究中，在白血病攻击的+16或+17天开始每3/4天给移植小鼠施用clodrolip(50μl)或PBS脂质体(50μl)(作为对照)。一周一次对小鼠监测重量和白血病发生(通过PB样品的流式细胞术分析)并在第24-28天杀死。分析PE，PB，和器官(SP，LN，股骨BM)。对于体内CSF1R抑制研究，(第+17，+23天)用30mg/kg抗CSF1R单抗i.p.治疗移植小鼠并如上所述监测。

实施例

实施例1

对NIH3T3-CSF-1R重组细胞中由CSF-1诱导的CSF-1R磷酸化的抑制

将4.5x10³个用全长CSF-1R的表达载体以逆转录病毒方式感染的NIH 3T3细胞在DMEM(PAA，产品目录号E15-011)，2mM L-谷氨酰胺(Sigma，产品目录号G7513)，2mM丙酮酸钠，1x非必需氨基酸，10％FKS(PAA，产品目录号A15-649)和100μg/ml PenStrep(Sigma，产品目录号P4333[10mg/ml])中培养至它们达到汇合。此后用补充有亚硒酸钠[5ng/ml](Sigma，产品目录号S9133)，运铁蛋白[10μg/ml](Sigma，产品目录号T8158)，BSA[400μg/ml](Roche Diagnostics GmbH，产品目录号10735078)，4mM L-谷氨酰胺(Sigma，产品目录号G7513)，2mM丙酮酸钠(Gibco，产品目录号11360)，1x非必需氨基酸(Gibco，产品目录号11140-035)，2-巯基乙醇[0.05mM](Merck，产品目录号M7522)，100μg/ml和PenStrep(Sigma，产品目录号P4333)的无血清DMEM培养基(PAA，产品目录号E15-011)清洗细胞并在30μl相同培养基中温育16小时以使受体上调。将10μl的已稀释抗CSR-1R抗体加至细胞中1.5小时。然后用10μl的100ng/ml huCSF-1(人CSF-1的活性149aa片段(SEQ ID NO:86的aa33-181)；Biomol，DE，产品目录号60530)刺激细胞5分钟。温育后，去除上清液，将细胞用80μl的冰冷PBS清洗2次并加入50μl新鲜制备的冰冷裂解缓冲液(150mM NaCl/20mM TrispH7.5/1mM EDTA/1mM EGTA/1％Triton X-100/1片蛋白酶抑制剂片剂(Roche DiagnosticsGmbH，产品目录号1836170)每10ml缓冲液/10μl/ml磷酸酶抑制剂混合物1(Sigma，产品目录号P-2850，100x储液)/10μl/ml蛋白酶抑制剂1(Sigma，产品目录号P-5726，100x储液)/10μl/ml 1M NaF)。冰置30分钟后，将平板在平板摇床上剧烈振荡3分钟，然后以2200rpm离心10分钟(Heraeus Megafuge 10)。

用ELISA分析细胞裂解物中磷酸化的和总的CSF-1受体的存在。使用来自R&DSystems(产品目录号DYC3268-2)的试剂盒依照供应商的说明书检测磷酸化的受体。为了检测总的CSF-1R，用试剂盒中所包含的捕捉抗体将10μl的裂解物固定化在平板上。之后加入1:750稀释的生物素化抗CSF-1R抗体BAF329(R&D Systems)和1:1000稀释的链霉亲合素-HRP缀合物。60分钟后将平板用新鲜制备的

溶液显色并检测吸光度。数据计算为无抗体下阳性对照的百分比和所表达的磷酸化/总受体比率值。阴性对照限定为不加入M-CSF-1。使用抑制配体-受体相互作用的抗CSF-1R SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology，US，也可参阅Sherr，C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)作为参照对照。

表3：对CSF-1受体磷酸化的抑制的IC50计算值。

实施例2

在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对3D培养中的NIH3T3-CSF-1R重组细胞的生长抑制(CellTiterGlo测定法)

将用全长野生型CSF-1R(SEQ ID NO:62)或突变型CSF-1R L301S Y969F(SEQ IDNO:63)的表达载体经逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞在poly-HEMA(聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯，poly(2-hydroxyethylmethacrylate))(Polysciences，Warrington，PA，USA))包被(以防止粘附至塑料表面)的平皿上培养于补充有2mM L-谷氨酰胺，2mM丙酮酸钠和非必需氨基酸和10％胎牛血清(Sigma，Taufkirchen，Germany)的DMEM高葡萄糖培养基(PAA，Pasching，Austria)中。细胞接种于用5ng/ml亚硒酸钠，10mg/ml运铁蛋白，400μg/ml BSA和0.05mM 2-巯基乙醇替换血清的培养基中。在用100ng/ml huCSF-1(人CSF-1的活性149aa片段(SEQ IDNO:86的aa 33-181)；Biomol，DE，产品目录号60530)处理时，表达wtCSF-1R的细胞形成三维生长的密集椭球体，被称为停泊独立的特性。这些椭球体近似于原位实体肿瘤的三维结构和组织。突变型CSF-1R重组细胞能够不依赖于CSF-1配体而形成椭球体。调查依照本发明的抗CSF-1R抗体hMab 2F11-e7和抗CSF-1R抗体1.2.SM(WO 2009/026303中所述的配体置换性CSF-1R抗体)，CXIIG6(WO 2009/112245中所述的配体置换性CSF-1R抗体)，山羊多克隆抗CSF-1R抗体ab10676(abcam)，和SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology，US-还可参见Sherr，C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)和Mab R&D-Systems 3291。参照对照Mab R&D-Systems 3291未显示对突变型CSF-1R重组细胞增殖的抑制。

在不同浓度的抗体存在下将椭球体培养物温育3天以测定IC30(细胞生存能力被30％抑制的浓度)。最大浓度为20μg/ml。用CellTiterGlo测定法通过测量细胞的ATP含量来检测细胞的生存能力。

表4

实施例3

在用抗CSF-1R单克隆抗体处理下对人巨噬细胞分化的抑制(CellTiterGlo测定法)

使用RosetteSep^TM人单核细胞富集混合物(Stemcell Tech.-产品目录号15028)从外周血中分离人单核细胞。将富集的单核细胞群在37℃和5％CO₂的增湿气氛中接种于96孔微量滴定板(2.5x10⁴个细胞/孔)内补充了10％FCS(GIBCO-产品目录号011-090014M)，4mML-谷氨酰胺(GIBCO-产品目录号25030)和1x PenStrep(Roche产品目录号1074440)的100μlRPMI 1640(Gibco-产品目录号31870)中。当在培养基中加入150ng/ml huCSF-1时，可观察到清楚地分化成粘附性巨噬细胞。此分化通过添加抗CSF-1R抗体可被抑制。此外，单核细胞的生存受影响并可通过CellTiterGlo(CTG)分析进行分析。从抗体处理对单核细胞生存的浓度依赖性抑制，计算IC₅₀(见下表)。

表5

CSF-1R Mab	IC<sub>50</sub>[μg/ml]
		Mab 2F11	0.08

在分开的测试中，系列人源化形式的Mab 2F11，例如hMab 2F11-c11，hMab 2F11-d8，hMab 2F11-e7，hMab 2F11-f12，显示了0.07μg/ml(hMab 2F11-c11)，0.07μg/ml(hMab2F11-d8)，0.04μg/ml(hMab 2F11-e7)和0.09μg/ml(hMab 2F11-f12)的IC50值。

实施例4

使用RosetteSep^TM人单核细胞富集混合物(Stemcell Tech.-产品目录号15028)从外周血中分离人单核细胞。将富集的单核细胞群在37℃和5％CO₂的增湿气氛中接种于96孔微量滴定板(2.5x10⁴个细胞/孔)内补充了10％FCS(GIBCO-产品目录号011-090014M)，4mML-谷氨酰胺(GIBCO-产品目录号25030)和1x PenStrep(Roche产品目录号1074440)的100μlRPMI 1640(Gibco-产品目录号31870)中。当在培养基中加入150ng/ml huCSF-1时，可观察到清楚地分化成粘附性巨噬细胞。此分化通过添加抗CSF-1R抗体可被抑制。此外，单核细胞的生存受影响并可通过CellTiterGlo(CTG)分析进行分析。从抗体处理对单核细胞生存的浓度依赖性抑制，计算IC₅₀。人源化形式的Mab 2F11，例如hMab 2F11-c11，hMab 2F11-d8，hMab 2F11-e7，hMab 2F11-f12，显示了0.07μg/ml(hMab 2F11-c11)，0.07μg/ml(hMab2F11-d8)，0.04μg/ml(hMab 2F11-e7)和0.09μg/ml(hMab 2F11-f12)的IC50值。

实施例5

在抗CSF-1R单克隆抗体处理下对人M1和M2巨噬细胞分化的抑制(CellTiterGlo测定法)

使用RosetteSep^TM人单核细胞富集混合物(StemCell Tech.-产品目录号15028)自外周血分离人单核细胞。在增湿气氛中于37℃和5％CO₂在100μl补充有10％FCS(GIBCO-产品目录号011-090014M)，4mM L-谷氨酰胺(GIBCO-产品目录号25030)和1x PenStrep(Roche-产品目录号1 074 440)的RPMI 1640(Gibco-产品目录号31870)中将富集的单核细胞群接种入96孔微量滴定板(2.5x10⁴个细胞/孔)。在将100ng/ml huCSF-1添加至培养基达6天时，能清楚地观察到分化成贴壁的具有伸长的形态的M2巨噬细胞。在将100ng/ml huGM-CSF添加至培养基达6天时，能清楚地观察到分化成贴壁的具有圆形形态的M1巨噬细胞。这种分化与某些标志物的表达有关，诸如对于M2巨噬细胞而言的CD163和对于M1巨噬细胞而言的CD80或高的II类MHC，如通过流式细胞术评估的。用PBS清洗细胞，并且如果贴壁的话，使用PBS中的5mM EDTA溶液解离(于37℃达20分钟)。然后好好重悬浮细胞，用染色缓冲液(含5％FCS的PBS)清洗，并以300xg离心5分钟。在1ml染色缓冲液中重悬浮团粒，并在Neubauer槽中对细胞计数。在每个FACS管中转移大约1x10e5个细胞，以300xg离心5分钟，并在染色缓冲液中重悬浮。通过与1μg人IgG/2.5x10e4个细胞(JIR产品目录号009-000-003)一起在冰上在染色缓冲液中温育20分钟来封闭Fcγ受体。然后对于CD80和CD163检测而言将细胞与1.5μl抗体/2.5x10e4个细胞混合，而对于II类MHC检测而言使用5μl抗体/2.5x10e4个抗体：PE标记的小鼠抗人CD163(BD Bioscience产品目录号556018)，PE标记的小鼠抗人CD80(BD Bioscience产品目录号557227)和Alexa 647标记的小鼠抗人II类MHC(Dako产品目录号M0775)。通过使用Zenon Alexa 647小鼠IgG标记试剂盒(Invitrogen产品目录号Z25008)将Alexa 647标记物缀合至抗体。在冰上温育1小时后，用染色缓冲液清洗细胞两次，重悬浮，并于FACS Canto II进行测量。

独有地，特征在于CD163表达，CD80缺失和II类MHC表达低的M2巨噬细胞分化能通过添加人源化抗CSF-1R抗体hMab 2F11-e7来抑制。而且，M2而非M1巨噬细胞存活受到影响，而且能通过CellTiterGlo(CTG)分析来分析。抗体处理7天对巨噬细胞存活的浓度依赖性抑制描绘于图1a。通过流式细胞术评估的M1和M2巨噬细胞标志物表达显示于图1b。

实施例6

M2亚型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和T细胞之间的相关性-组合抗CSF-R1抗体和T细胞衔接剂的原理

为了调查TAM和T细胞之间的功能相关性，我们自MC38肿瘤分离TAM并将它们与CD8+T细胞一起共培养。

TAM阻抑测定法

酶促消化后使用两步方案自MC38肿瘤的单细胞悬浮液富集TAM：用CD11b-FITC(克隆M1/70)对单细胞染色，并通过抗FITC珠(Miltenyi)在MACS柱上正富集。自柱取出后，使用制造商提供的释放缓冲液方案解离抗FITC珠。最后，通过添加抗Ly6G和抗Ly6C正选择珠以自TAM制备物去除粒细胞和单核细胞的细胞来分离TAM。分析最终的细胞纯度，通常>90％。随后，在用抗CD3包被的U底板中以所示的对用CFSE标记的总CD3+T细胞的比率滴定TAM，并添加可溶性抗CD28。温育3天后如先前所述使用空白Sphero珠自CFSE^低细胞测定细胞增殖(Hoves，S.等人，Monocyte-derived human macrophages mediate anergy in allogeneicT cells and induce regulatory T cells.J.Immunol.177，2691-2698(2006))。在TAM存在下，由CD3和CD28活化诱导的T细胞扩充受到阻抑(见图3)。

实施例7

通过CSF-1R抑制靶向单核细胞/巨噬细胞可以用作CLL中的治疗策略

为了评估巨噬细胞靶向的治疗潜力，我们调查了抑制CSF1R信号传导且阻止来自单核细胞前体的巨噬细胞分化的单克隆抗体的抗白血病效果{Ries,2014#16}。给i.v.移植MEC1细胞的Rag2^-/-γc^-/-小鼠i.v.注射抗CSF1R单抗(30mg/kg，第+11，+25天)并在第27天，最后一次单抗注射后48小时处死(图4A)。巨噬细胞消减(图4B-C)显著减少BM中白血病B细胞的数目(图4D)且诱导SP中出现CD19+AnnV-PI+坏死白血病细胞(图4E)。为了确认CSF1R阻断降低SP中的疾病严重性，我们实施了一项时间过程实验，其中分别在最后一次单抗注射后48小时和96小时，在第27和29天处死小鼠(图4F)。CSF1R阻断能够稳定疾病且诱导随时间提高脾白血病细胞的坏死(图4G)。这种抗白血病效果与CSF1R+MRC1+M2样TAM的值得注意的且选择性的消减有关(图4H-I)。正如早就在实体瘤中显示的{Ries,2014#16}，CSF1R阻断与单核细胞消减一起(图6A-B)诱导PB中SSC^高嗜中性粒细胞(图S4C)和Gr1+髓样细胞的相对升高(图6D)，涵盖单核细胞(Ly6C+)和粒细胞(Ly6G+)子集二者(图6E-F)。值得注意的是，对clodrolip没有观察到这种效果(图6G-H-I-J-K)。在BM中，CSF1R阻断减少作为CD11b+CSF1R+(图6L)或Ly6C+(图6M-N)任一鉴定的单核细胞。在Eμ-TCL1tg移植模型中(图6O)，我们观察到PB(图6P)，BM(图6Q)和SP(图6R-S)中CD8+效应T细胞的明显增多，伴随凋亡白血病细胞的显著增多(图6T)和脾CD4+CD25+T细胞的减少(图6U)。相反，clodrolip不影响T细胞(图6V-W-X)。两次施用抗CSF1R单抗(图5A)诱导显著的淋巴细胞增多(图5B-C)，一种早就在用靶向BCR信号传导的药剂(例如依鲁替尼)治疗的CLL患者中看到的，与疾病进展无关的治疗相关过程(Byrd J.C.NEJM 2013)。由于单抗治疗提高CD19+CD20+循环白血病细胞的百分比(图5C)，因此我们通过组合抗CSF1R单抗与糖工程化II型CD20单抗，GA101测试了一种双管齐下办法(Moessner E Blood,2010)(图5D)。值得注意的是，抗小鼠CSF1R单抗作为单一药剂影响小鼠的存活(p＝0.01，αCSF1R单抗对未治疗)，而且在组合设置中甚至更加显著(p<0.0001，αCD20+αCSF1R单抗对未治疗)(图5E)。总之，这些发现指示在CLL的小鼠模型中CSF1R阻断提供治疗益处。而且，它们显示巨噬细胞消减相关循环CD20+白血病细胞增多代表与抗CD20抗体的组合的治疗机会。

CLL异种移植物小鼠中BM单核细胞和巨噬细胞的表征

我们询问单核细胞/巨噬细胞是否影响BM中的CLL生长。给8周龄Rag2^-/-γc^-/-小鼠静脉内(i.v.；第0天)注射MEC1细胞(CLL细胞系){Stacchini,1999#50}并在白血病生长的早期(第21天)或明显(第31天)阶段杀死(图7A)，此时BM中人CD19+白血病细胞的百分比分别为33.83±15.03和86±9.13(图7B)。我们发现明显白血病Rag2^-/-γc^-/-小鼠的BM中与早期白血病小鼠相比更少数目的CD11b+CSF1R+单核细胞和CD11b+F4/80+巨噬细胞(图7C-D)。值得注意的是，共表达巨噬细胞甘露糖受体(MRC1/CD206)，CSF1R和CD86的CD11b+细胞的丰度随白血病进展而升高(图7E-F)，这是与实体瘤进展有关的特征{De Palma,2013#48}(Noy&Pollard Immunity 2014)。

我们接下来评估具有早期白血病的Rag2^-/-γc^-/-小鼠的BM微环境的非白血病细胞中趋化因子，细胞因子和生长因子的表达，与未注射小鼠比较。使用磁珠对异种移植物小鼠的BM细胞消减人CD19+白血病细胞以实施RNA提取和qPCR阵列分析(RT² Profiler^TM)。如图7G中所示，白血病细胞的存在诱导独特的炎症概况。我们观察到具有白血病生长促进能力的细胞因子的显著上调(Yan XJ Blood 2011)，诸如Il6，Cd40lg，Il2和Il17a。Gr1+髓样衍生抑制细胞(MDSC)鉴定为IL-17a的来源(图8A)而非造血CD45-细胞鉴定为IL-17a(图8B)和IL-2(图8C)蛋白质生成的来源。上调的还有Il10，一种具有免疫抑制活性的细胞因子；Csf1，其促进单核细胞/巨噬细胞分化和存活；和多种趋化因子/基质细胞化学引诱物，像Ccl1，Ccl3，和Ccl4{De Palma,2013#48}(Noy&Pollard Immunity 2014)。此类细胞因子/趋化因子概况提示有益于白血病细胞生长的BM微环境。

为了特异性表征CLL相关单核细胞/巨噬细胞的分子概况(图7C-D)，使用Illumina杂交系统对自在第21天(早期白血病)处死的Rag2^-/-γc^-/-小鼠异种移植物小鼠的BM分离的单核细胞/巨噬细胞实施了全基因组转录概况分析。

与年龄匹配的，未注射的小鼠相比，牵涉164种转录物调控的复杂基因调节网络(84种上调和80种下调；1.6％的全部转录物；经过调整的P值<0.05)区分具有白血病的小鼠的单核细胞/巨噬细胞。将差异表达的基因组织成五个推定功能范畴，包括炎症和细胞内/细胞外功能，图9A-E中显示。平行地，我们还分析了自相同小鼠纯化的白血病MEC1细胞中发生的转录变化。在牵涉CLL进展的基因(像NOTCH1，BIRC3，和PTEN)以外，特别相关的是支持单核细胞/巨噬细胞-白血病细胞交谈的存在的基因的差异表达，包括IL10，RNASET2和CCL2(一种有力的单核细胞化学引诱物(Noy&Pollard Immunity 2014))(图9F)。我们还通过qPCR确认了一组选定基因在鼠单核细胞/巨噬细胞(图10A)和人MEC1细胞(图10B)二者中的差异表达。由于它在B细胞粘附，抗原呈递和激活中的作用(Batista F Nat Rev Immunol2009)，我们验证了来自脾(SP)，BM或腹膜渗出物(PE)的小鼠巨噬细胞(图9G)和CLL患者的人经典单核细胞(图10C)二者中ICAM1在蛋白质水平的上调。使用自第-1天起每3/4天施用的ICAM1阻断性单抗的异种移植研究(图10D)证明了它的抑制提高PB，SP和PE，但非BM中白血病细胞的数目(图10E)，因而提示ICAM1上调在不同组织中的功能相关性。

总之，这些发现指示CLL细胞深刻雕刻BM微环境且调控牵涉CLL细胞-单核细胞/巨噬细胞相互作用的多种基因转录物的表达。

由巨噬细胞靶向诱导的白血病细胞死亡是TNF依赖性的

作为下一步，我们评估了白血病细胞如何受到巨噬细胞靶向的影响。Clodrolip和抗人CSF-1R单抗(hMab 2F11-e7)在体外对白血病B细胞没有直接毒性，如通过对MEC1细胞实施的细胞毒性测定法显示的(图11A)。我们因此调查了clodrolip和抗CSF1R在体内可能诱导白血病细胞死亡的备选机制。为了解决这个问题，通过在第-1天开始每3天i.v.注射clodrolip(7次连续注射)对i.v.移植MEC1细胞的Rag2^-/-γc^-/-小鼠消减巨噬细胞并在最后一次治疗后1天处死(图12A)。在所有组织中由clodrolip诱导的白血病(图12B)和单核细胞/巨噬细胞(图12C-D-E)细胞负荷降低与白血病细胞凋亡的诱导平行，如SP和BM中CD19+AnnV+PI+晚期凋亡细胞和PB中CD19+AnnV-PI+坏死细胞的频率显著升高显示的(图12F-G)。这些结果确认了早就在抗CSF1R单抗治疗的小鼠的SP中观察到的CD19+AnnV-PI+坏死细胞增多(图4G)。clodrolip后白血病B细胞凋亡的诱导和白血病B细胞和单核细胞/巨噬细胞之间的相互作用还在时间过程实验中显现，其中在clodrolip缺失或存在下将GFP标记的单核细胞/巨噬细胞添加至来自Eμ-TCL1转基因小鼠的白血病细胞。有趣的是，AnnV/PI染色和流式细胞术分析显示clodrolip对白血病细胞凋亡的诱导只在单核细胞和巨噬细胞存在下发生(图11B)。

为了调查白血病细胞中经由clodrolip诱导的巨噬细胞杀伤诱导的细胞死亡途径，我们自移植Rag2^-/-γc^-/-小鼠的BM纯化了CD19+MEC1细胞并通过qPCR在RNA水平评估牵涉TNF，TRAIL，ROS，和FAS/FASL调节的细胞死亡途径的关键效应分子的表达。对于TNF途径，我们观察到TNFR1，FADD，BID，BAX和CASP3的上调表达(图S5C)。有趣的是，我们还发现TRAIL-R2和AIFM1的上调水平(图S5C)，后者牵涉ROS介导的细胞死亡{Joza,2009#49}。

为了确认TNF(图11C)牵涉巨噬细胞靶向诱导的白血病细胞死亡的机制，我们在用clodrolip或CSF1R单抗治疗的异种移植物Rag2^-/-γc^-/-小鼠中利用了依那西普，一种可溶性TNF受体融合蛋白{Deeg,2002#44}。在最后一次clodrolip注射后24小时处死i.v.移植MEC1细胞并注射clodrolip(i.v.，第+11，+25天)和依那西普(i.p.，在第+10天开始)的Rag2^-/-γc^-/-小鼠(图12H)。依那西普减轻BM中clodrolip诱导的白血病细胞消减(图12I)。在用CSF1R单抗i.v.治疗(第+11，+25天)并在最后一次注射单抗后96小时处死的异种移植物小鼠中(图7J)，SP中的抗白血病效果当TNF途径在体内被依那西普阻断时被消除(图12K)。

而且，我们在TCL1移植系统中使用阻断性抗体(克隆Kay10，Biolegend)功能性灭活FAS/FASL信号传导。FASL阻断没有消除用clodrolip(图11D-E-F-G)或aCSF1R(hMab2F11-e7)(图11H-I-J)治疗的移植小鼠的白血病细胞消减。相同的clodrolip结果通过将白血病B细胞移植入携带Fasl基因的缺无功能突变的Faslgld小鼠得到确认(图11E-F-G)。

这些发现使得我们得出结论，巨噬细胞杀伤主要经由TNF信号传导的诱导使得白血病细胞对凋亡敏感。

通过单核细胞/巨噬细胞杀伤来靶向人原代CLL细胞

最后，我们将在小鼠模型中搜集的相关分子和功能信息应用于人样品。我们首先通过免疫组织化学分析来自CLL患者的LN切片并观察到在增殖中心中CD68+巨噬细胞接近增殖中的(Ki67+)CLL细胞(图13A)。作为下一步，我们评估了人原代白血病细胞是否能受到clodrolip影响。Clodrolip在体外对白血病B细胞没有直接有毒效果，如通过对MEC1细胞(图11A)以及纯化的人原代CLL细胞(图13B)实施的细胞毒性研究显示的。然而，在用不同剂量的clodrolip处理CLL患者的未分级外周血单个核细胞(PBMC)(其含有白血病和正常造血细胞二者)时，我们观察到CD14+单核细胞和白血病B细胞二者的显著消减，早至处理后30分钟(图13C)，而且在24小时后甚至更加显著(图13D)。通过单核细胞杀伤诱导的大量白血病细胞死亡显示于图13E。通过接种来自CLL患者的消减了单核细胞的PBMC实施的Transwell实验显示了细胞-细胞接触并不必然诱导CLL死亡(图13F)。我们然后评估人原代白血病细胞中牵涉细胞死亡机制的关键效应分子的表达。为此目的，我们通过磁负选择自24小时clodrolip培养物和未处理对照培养物的PBMC纯化了白血病细胞。我们观察到所分析的所有处理样品中FAS的显著上调(图14A，n＝3)。在FAS以外，我们在一个患者的样品中观察到TNFR1，FADD，BID，TRAIL-R2的上调(图14B)，提示细胞死亡的数种途径(例如FAS/FASL，TRAIL和TNF)可能也牵涉由单核细胞/巨噬细胞诱导的人原代CLL细胞杀伤。

为了调查TNF和TRAIL在白血病细胞死亡的机制中的参与，我们利用了依那西普和一种阻断性抗人TRAIL-R2单抗(Germano G CC 2013)。如图14C-D中所示，在4份样品中的3份中，由clodrolip诱导的白血病细胞消减在阻断TNF(图S6C)和TRAIL信号传导(图14D)时降低。为了最终在来自CLL患者的原代细胞上测试巨噬细胞靶向策略的功效，用抗人CSF1R单抗(hMab 2F11-e7)处理PBMC(图13G)。我们观察到48小时后CD14+单核细胞和白血病B细胞二者的相关消减。更加惊人地，白血病细胞消减在抗人CSF1R单抗(hMab 2F11-e7)联合GA101时显著升高(图13G)。

总之，这些发现指示巨噬细胞杀伤或是恢复CLL对凋亡的敏感性或是直接诱导它们的死亡。它们进一步支持将这些发现转变成新颖组合疗法的基本原理。

我们关于已知通过诱导凋亡或抑制单核细胞分化来阻止新巨噬细胞形成的抗CSF1R单抗的数据证实了白血病克隆对单核细胞/巨噬细胞的依赖性，尤其在BM小生境中，那里正常情况下CSF1诱导单核细胞的分化和成熟{Ries,2014#16；MacDonald,2010#36}。通过clodrolip杀伤获得了单核细胞/巨噬细胞消减导致抗白血病效果的原理的证据。用治疗相关抗CSF1R单抗获得的结果与用clodrolip获得的结果平行。在不同小鼠模型中，巨噬细胞靶向削弱CLL细胞移植，而且甚至更加有趣的是，与惊人的抗白血病效果和显著的小鼠存活改善有关。

单核细胞/巨噬细胞集合的消减伴随白血病细胞的凋亡。说明体内白血病细胞死亡的分子机制看来需要TNF途径的关键分子的RNA上调。巨噬细胞靶向经由TNF信号传导的诱导使白血病细胞对凋亡敏感且经由TNF依赖性机制触发它们的死亡。我们关于人原代CLL细胞的体外发现和异种移植物小鼠在组合治疗后的存活改善确证了这种创新策略的强潜力。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

<120> 用于在淋巴瘤或白血病中诱导淋巴细胞增多的针对人CSF-1R的抗体

<130> P32943 FT

<150> EP15173638

<151> 2015-06-24

<150> EP16151129

<151> 2016-01-13

<160> 101

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

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1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

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<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 3

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1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

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1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

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65 70 75 80

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<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

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<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

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<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 12

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<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 13

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 14

Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr Val Ser

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 15

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe

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Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met

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Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu

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Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

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<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

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1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr

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Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

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<220>

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<213> 人工的

<220>

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<213> 人工的

<220>

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<213> 人工的

<220>

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<213> 人工的

<220>

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链可变域, hMab 2F11-c11

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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<213> 人工的

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<213> 人工的

<220>

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<220>

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<213> 人工的

<220>

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<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR2, hMab 2F11-d8

<400> 29

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR1, hMab 2F11-d8

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链可变域, hMab 2F11-d8

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Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链可变域, hMab 2F11-d8

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR3, hMab 2F11-e7

<400> 33

Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR2, hMab 2F11-e7

<400> 34

Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly

1 5 10 15

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR1, hMab 2F11-e7

<400> 35

Ser Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR3, hMab 2F11-e7

<400> 36

Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR2, hMab 2F11-e7

<400> 37

Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR1, hMab 2F11-e7

<400> 38

Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链可变域, hMab 2F11-e7

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链可变域, hMab 2F11-e7

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR3, hMab 2F11-f12

<400> 41

Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR2, hMab 2F11-f12

<400> 42

Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR1, hMab 2F11-f12

<400> 43

Thr Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR3, hMab 2F11-f12

<400> 44

Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR2, hMab 2F11-f12

<400> 45

Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR1, hMab 2F11-f12

<400> 46

Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 47

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链可变域, hMab 2F11-f12

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Thr Lys Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链可变域, hMab 2F11-f12

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR3, hMab 2F11-g1

<400> 49

Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val

1 5

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR2, hMab 2F11-g1

<400> 50

Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链CDR1, hMab 2F11-g1

<400> 51

Thr Tyr Asp Ile Ser

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR3, hMab 2F11-g1

<400> 52

Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR2, hMab 2F11-g1

<400> 53

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链CDR1, hMab 2F11-g1

<400> 54

Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 重链可变域, hMab 2F11-g1

<400> 55

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 轻链可变域, hMab 2F11-g1

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 57

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 58

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 58

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 59

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 在L234A和L235A上突变的衍生自IgG1的人重链恒定区

<400> 59

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 60

<211> 327

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 61

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 在S228P上突变的衍生自IgG4的人重链恒定区

<400> 61

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 62

<211> 972

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 62

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970

<210> 63

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 突变型CSF-1R L301S Y969F

<400> 63

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Ser Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

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500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Phe Gln Phe Cys

965 970

<210> 64

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人CSF-1R胞外域

<400> 64

Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg

50 55 60

Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu

65 70 75 80

Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val

85 90 95

Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp

100 105 110

Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro

115 120 125

Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr

130 135 140

Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala

145 150 155 160

Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val

165 170 175

Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser

195 200 205

Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys

210 215 220

Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys

225 230 235 240

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245 250 255

Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met

260 265 270

Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gln

275 280 285

Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys Val

290 295 300

Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp Thr Tyr Leu

305 310 315 320

Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala Thr

325 330 335

Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu

340 345 350

Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly

355 360 365

Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu

370 375 380

Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys

385 390 395 400

Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser

405 410 415

Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln Val Trp Asp

420 425 430

Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His Lys Val Thr

435 440 445

Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr

450 455 460

Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile

465 470 475 480

Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

485 490

<210> 65

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人CSF-1R片段delD4

<400> 65

Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp

20 25 30

Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg

50 55 60

Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu

65 70 75 80

Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val

85 90 95

Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp

100 105 110

Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro

115 120 125

Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr

130 135 140

Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala

145 150 155 160

Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val

165 170 175

Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser

195 200 205

Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys

210 215 220

Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys

225 230 235 240

Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn

245 250 255

Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met

260 265 270

Phe Phe Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn

275 280 285

Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn

290 295 300

Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala

305 310 315 320

Gln Val Leu Gln Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln

325 330 335

Glu Pro Phe His Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr

340 345 350

Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly

355 360 365

Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His

370 375 380

Pro Pro Asp Glu

385

<210> 66

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人CSF-1R片段D1-D3

<400> 66

Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp

20 25 30

Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg

50 55 60

Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu

65 70 75 80

Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val

85 90 95

Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp

100 105 110

Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro

115 120 125

Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr

130 135 140

Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala

145 150 155 160

Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val

165 170 175

Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu

180 185 190

Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser

195 200 205

Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys

210 215 220

Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys

225 230 235 240

Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn

245 250 255

Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met

260 265 270

Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gln

275 280 285

Asn Leu Ile Gln

290

<210> 67

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 信号肽

<400> 67

Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala

1 5 10 15

Trp His Gly Gln Gly

20

<210> 68

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 68

cacctccatg ttcttccggt accccccaga ggtaag 36

<210> 69

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH2)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH3)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH6)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH8)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL8)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL11)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL13)的重链可变区(VH)的氨基酸序列

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 76

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人源化B-Ly1抗体B-KV1的轻链可变区(VL) 的氨基酸序列

<400> 76

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val

115

<210> 77

<211> 297

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 77

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

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Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

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210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 78

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体1的可变重链域VH

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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100 105 110

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115

<210> 79

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体2的可变重链域VH

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 80

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体3的可变重链域VH

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 81

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体1的可变轻链域VL

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 82

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体2的可变轻链域VL

<400> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 83

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体3的可变轻链域VL

<400> 83

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Pro Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 84

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体4的可变轻链域VL

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 85

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体5的可变轻链域VL

<400> 85

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Asn Thr Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Val Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 86

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体6的可变轻链域VL

<400> 86

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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<210> 87

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体7的可变轻链域VL

<400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

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35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体8的可变轻链域VL

<400> 88

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体9的可变轻链域VL

<400> 89

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Tyr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 90

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体10的可变轻链域VL

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Tyr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 91

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体11的可变轻链域VL

<400> 91

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Phe Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 92

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体12的可变轻链域VL

<400> 92

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Tyr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 93

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体13的可变轻链域VL

<400> 93

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Tyr His Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 94

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体14的可变轻链域VL

<400> 94

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 95

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体15的可变轻链域VL

<400> 95

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Tyr Thr Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 96

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-L1> 243.55变体16的可变轻链域VL

<400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Phe Ile Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 97

<211> 290

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 97

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 98

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-1> nivolumab的可变重链域VH

<400> 98

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 99

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-1> nivolumab的可变轻链域VL

<400> 99

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 100

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-1> pembrolizumab的可变重链域VH

<400> 100

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 101

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> <PD-1> pembrolizumab的可变轻链域VL

<400> 101

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.结合人CSF-1R的抗体和结合人CD20的抗体制备用于在淋巴瘤或白血病中诱导白血病细胞的淋巴细胞增多的药物的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体包含 SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；且其中该结合人CD20的抗体包含 SEQ IDNO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

2.依照权利要求1的用途，其中该结合人CD20的抗体是在Fc区中具有改变的糖基化样式的IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体，其中含有岩藻糖的寡糖的量介于Asn297处的寡糖总量的40%和60%之间。

3.依照权利要求1或2的用途，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD20的循环白血病细胞的百分比。

4.依照权利要求1或2的用途，其中该淋巴细胞增多提高外周血中表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD20抗体的治疗易感。

5.依照权利要求1或2的用途，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞。

6.依照权利要求1或2的用途，其中该淋巴细胞增多提高表达CD20的循环白血病细胞的百分比且使得该淋巴瘤或白血病对抗CD20抗体的治疗易感。

7.依照权利要求1或2的用途，其中该淋巴瘤或白血病表达CD20。

8.结合人CSF-1R的抗体和结合人CD20的抗体制备用于下述的药物的用途：

i)用于治疗表达CD20的癌症；或

ii)用于刺激免疫应答或功能；或

iii)用于刺激细胞介导的免疫应答；或

iv)用于延迟表达CD20的癌症进展；或

v)用于延长罹患表达CD20的癌症的患者的存活，

其中该结合人CSF-1R的抗体特征在于包含

SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；

且其中该结合人CD20的抗体特征在于包含

SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

9.依照权利要求8的用途，

其中该结合人CD20的抗体是在Fc区中具有改变的糖基化样式的IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体，其中含有岩藻糖的寡糖的量介于Asn297处的寡糖总量的40%和60%之间。

10.依照权利要求8或9的用途，其中刺激免疫应答或功能是刺激T细胞活性。

11.依照权利要求8或9的用途，其中刺激细胞介导的免疫应答是刺激细胞毒性T-淋巴细胞，刺激T细胞活性，或刺激巨噬细胞活性。

12.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于治疗淋巴瘤和淋巴细胞性白血病。

13.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于治疗B-细胞非何杰金氏淋巴瘤。

14.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于治疗多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，或何杰金氏病。

15.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于治疗免疫相关疾病或延迟其进展。

16.依照权利要求15的用途，其中所述免疫相关疾病是肿瘤免疫力。

17.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于预防或治疗转移。

18.依照权利要求8或9的用途，其中所述药物用于治疗炎症疾病。

19.结合人CSF-1R的抗体和结合人CD20的抗体制备供下述方法使用的药物的用途，所述方法为与通过靶向巨噬细胞用于防止逃脱CD20靶向疗法的结合人CSF-1R的抗体组合，用结合人CD20的抗体靶向表达CD20的癌症的方法，其中该结合人CSF-1R的抗体包含 SEQ IDNO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；且其中该结合人CD20的抗体包含SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

20.依照权利要求19的用途，其中该结合人CD20的抗体是在Fc区中具有改变的糖基化样式的IgG1同种型的无岩藻糖基化抗体，其中含有岩藻糖的寡糖的量介于Asn297处的寡糖总量的40%和60%之间。

21.依照权利要求19或20的用途，其中用该结合人CSF-1R的抗体靶向巨噬细胞。

22.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中该结合人CSF-R的抗体和该结合人CD20的抗体是人IgG1亚类的。

23.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中在该结合人CSF-R的抗体和该结合人CD20的抗体以外不施用另外的化疗剂和/或靶向疗法。

24.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体同时共施用。

25.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体顺序共施用。

26.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中在该结合人CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体以外还施用抗PD-L1抗体。

27.依照权利要求26的用途，其中该结合PD-L1的抗体包含选自下组的可变域氨基酸序列：

-SEQ ID NO:78的可变重链域VH，和SEQ ID NO:81的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:82的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:83的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:84的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:85的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:86的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:87的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:88的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:89的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:90的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:91的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:92的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:93的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:94的可变轻链域VL；

-SEQ ID NO:79的可变重链域VH，和SEQ ID NO:95的可变轻链域VL；和

-SEQ ID NO:80的可变重链域VH，和SEQ ID NO:96的可变轻链域VL。

28.依照权利要求26的用途，其中该结合PD-L1的抗体是阿特珠单抗。

29.依照权利要求26的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-L1的抗体同时共施用。

30.依照权利要求26的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-L1的抗体顺序共施用。

31.依照权利要求1、2、8、9、19和20任一项的用途，其中在该结合人CSF-1R的抗体和该结合人CD20的抗体以外还施用抗PD-1抗体。

32.依照权利要求31的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-1的抗体同时共施用。

33.依照权利要求31的用途，其中该结合人CSF-1R的抗体，该结合人CD20的抗体，和该结合人PD-1的抗体顺序共施用。

34. 一种配制剂，其包含结合人CSF-1R的抗体和结合人CD20的抗体，其中该结合人CSF-1R的抗体包含 SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；且其中该结合人CD20的抗体包含 SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

35.依照权利要求34的配制剂，

36. 一种制品，其包含：包含结合人CSF-1R的抗体的药物组合物和包含结合人CD20的抗体的药物组合物，其中该结合人CSF-1R的抗体包含 SEQ ID NO:39的重链可变域VH和SEQ ID NO:40的轻链可变域VL；且其中该结合人CD20的抗体包含 SEQ ID NO:71的重链可变域VH和SEQ ID NO:76的轻链可变域VL。

37.依照权利要求36的制品，