KR20190133723A - 개선된 항원 결합 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 공개는 일반적으로 Fc 수용체 결합이 감소된 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체 및 이러한 항원 결합 수용체를 발현하는 T 세포에 관한 것이다. 더욱 정확히, 본 출원은 CD28 내부 및 경막 도메인에 커플링된 CD3 세포내 도메인으로 이루어지는 조작된 Fc 수용체를 다룬다. 세포외 부분은 바람직하게는 항 Pro329Gly 항체 가변 도메인으로 이루어진다. 암 치료 및 진단에서의 용도.
Description
본 발명은 일반적으로 Fc 수용체 결합이 감소된 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체 및 이러한 항원 결합 수용체를 발현하는 T 세포에 관한 것이다. 더욱 정확히, 본 발명은 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적으로 결합/그와 상호작용함으로써 동원되는 항원 결합 수용체로 형질감염된/형질도입된, T 세포에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 본 발명의 T 세포 및/또는 핵산 분자, 벡터 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 종양 표적화 항체/항체들을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양-특이적 항체와 함께 특정 질환의 치료 방법에서의 T 세포의 생산 및 용도 뿐만 아니라 T 세포 및/또는 치료적 항체를 포함하는 약학 조성물/약제를 제공하며, 여기에서 T 세포는 Fc 수용체 결합이 감소된 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적-종양 표적화 항체/항체들과의 조합으로 투여된다.
양자 T 세포 요법 (adoptive T cell therapy) (ACT) 은 암-특이적 T 세포를 사용하는 강력한 치료 접근법이다 (Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). ACT 은 T 세포 또는 키메라 항원 수용체를 사용하는 유전자 조작에 의해 특이적으로 만든 T 세포 또는 자연 발생 종양-특이적 세포를 사용할 수 있다 (Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) (2015), 62-68). ACT 은 후기 및 아니면 난치성 질환 예컨대 급성 림프성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 흑색종을 앓는 환자에서도 성공적으로 치료할 수 있고 차도를 유도할 수 있다 (Dudley et al., J Clin Oncol 26(32) (2008), 5233-5239; Grupp et al., N Engl J Med 368 (16) (2013), 1509-1518; Kochenderfer et al., J Clin Oncol. (2015) 33(6):540-549, doi: 10.1200/JCO.2014.56.2025. Epub 2014 Aug 25).
그러나, 인상 깊은 임상 효능에도 불구하고, ACT 은 치료-관련 독성에 의해 제한된다. ACT 에서 사용되는 조작된 T 세포의 특이성, 및 결과적인 온-타겟 및 오프-타겟 효과는 주로 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 에서 구현되는 종양 표적화 항원 결합 모이어티에 의해 추진된다. 종양 항원의 비-배타적 발현 또는 발현 수준의 일시적 차이는 치료의 용인될 수 없는 독성으로 인해 심각한 부작용 또는 심지어는 ACT 의 중단을 초래할 수 있다.
부가적으로, 효율적 종양 세포 용해를 위한 종양-특이적 T 세포의 이용가능성은 생체내에서 조작된 T 세포의 장기간 생존 및 증식 능력에 의존적이다. 다른 한편으로는, T 세포의 생체내 생존 및 증식은 제어되지 않는 CAR-T 응답의 지속성으로 인해 원치 않는 장기간 효과를 초래될 수 있다 (Grupp et al. 2013 N Engl J Med 368(16):1509-18, Maude et al. 2014 2014 N Engl J Med 371(16):1507-17).
심각한 치료 관련 독성을 제한하고 ACT 의 안전성을 개선하기 위한 하나의 접근법은 어답터 분자를 면역학적 시냅스에 도입함으로써 CAR-T 세포의 활성화 및 증식을 제한하는 것이다. 그러한 어답터 분자는 소분자 바이모듈 스위치 (bimodular switch) 예를 들어 최근에 기술된 폴레이트-FITC 스위치 (Kim et al. J Am Chem Soc 2015; 137:2832-2835) 를 포함한다. 추가의 접근법은 표적 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 특이성을 안내 및 유도하는 태그를 포함하는 인공적으로 변형된 항체를 포함했다 (Ma et al. PNAS 2016; 113(4):E450-458, Cao et al. Angew Chem 2016; 128:1-6, Rogers et al. PNAS 2016; 113(4):E459-468, Tamada et al. Clin Cancer Res 2012; 18(23):6436-6445).
그러나, 기존의 접근법은 여러 제약을 갖는다. 분자 스위치에 의존하는 면역학적 시냅스는 면역 반응을 유발하거나 또는 비특이적 오프-타겟 효과를 초래할 수 있는 부가적 요소의 도입을 요구한다. 게다가, 그러한 다성분 시스템의 복잡성은 치료 효능 및 용인성을 제한할 수 있다. 다른 한편으로는, 기존 치료적 모노클로날 항체에 태그 구조의 도입은 이러한 구성체의 효능 및 안전성 프로파일에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 표적화 종양 요법, 특히 양자 T 세포 요법은 암 환자의 필요를 충족시키기 위해서 개선될 필요가 있다. 따라서, ACT 의 안전성 및 효능을 개선시키고 상기 단점들을 극복할 잠재성을 갖는 개선된 수단을 제공하는 것이 여전히 요구된다.
본 발명은 일반적으로 Fc 수용체 결합이 감소된 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체 및 이러한 항원 결합 수용체를 발현하는 T 세포에 관한 것이다.
하나의 양태에서 본 발명은 앵커링 경막 도메인, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이며, 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 단편 결정가능 (fragment crystallizable) (Fc) 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fc 수용체는 Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체 (neonatal Fc receptor) (FcRn) 이다. 하나의 실시형태에서, Fc 수용체 결합은 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance) (SPR) 에 의해 25℃ 에서 측정된다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab, crossFab, 또는 scFab 이다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 이다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 이다.
하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다.
하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인이며, 특히 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:11 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인의 단편이며, 특히 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:13 의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인의 단편이다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 CD3z 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체는 CD28 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:13 의 아미노산 서열을 포함하고, 보조자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 세포외 도메인은 앵커링 경막 도메인으로, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다. 하나의 실시형태에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:17) 을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 공-신호전달 도메인에 또는 신호전달 도메인에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다. 하나의 실시형태에서, 신호전달 및/또는 공-신호전달 도메인은, 임의로 적어도 하나의 펩티드 링커를 통해, 연결된다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이며, scFv 단편은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편 또는 crossFab 단편이며, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나의 공-신호전달 도메인을 포함하며, 공-신호전달 도메인은 N-말단에서 앵커링 경막 도메인의 C-말단으로 연결된다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하며, 자극성 신호전달 도메인은 N-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 C-말단으로 연결된다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 이다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235 및 P329 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("PGLALA") 를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fcγ 수용체는 인간 FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIa 이다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 I253, H310 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 FcRn 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 FcRn 결합과 비교하여 감소된다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함한다:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6).
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:32 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:33 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:9 의 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:31 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:48 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:50 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:39 의 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 경쇄 폴리펩티드.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함한다:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS (SEQ ID NO:53);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY (SEQ ID NO:54); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO:57); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58).
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:61 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:62 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:61 의 중쇄 가변 영역 (VH); 및
b) SEQ ID NO:62 의 경쇄 가변 영역 (VL).
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:39 의 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 경쇄 폴리펩티드.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체의 중쇄 융합체 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 중쇄 융합체 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 조성물이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 의해 인코딩되는 폴리펩티드이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(들) 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 형질도입된 T 세포이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 본원에 기재된 바와 같은 형질도입된 T 세포이며, 형질도입된 T 세포는 표적 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR) 로 동시형질도입된다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 하기를 포함하는 키트이다:
(A)
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 하기를 포함하는 키트이다:
(A)
본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 하기를 포함하는 키트이다:
(A) 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 벡터; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
하나의 실시형태에서, 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 EU 번호매김에 따른 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인이며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 이다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235 및 P329 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("PGLALA") 를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 I253, H310 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 종양 세포의 표면 상의 항원에 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC) 의 분자에 결합된 펩티드에 특이적 결합을 할 수 있으며, 특히 항원은 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신) 및 CA-IX 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 섬유아세포 활성화 단백질 (fibroblast activation protein) (FAP), 암배 항원 (carcinoembryonic antigen) (CEA), 메소텔린 (mesothelin) (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (folate receptor 1) (FOLR1) 및 테나신 (tenascin) (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원에 특이적 결합을 할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포이며, 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트이다. 하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포이며, 치료는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여를 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없다.
하나의 실시형태에서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 치료될 대상체로부터 단리된 세포에서 유래한다. 하나의 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 치료될 대상체로부터 단리된 세포에서 유래하지 않는다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 대상체에서 질환을 치료하는 방법이며, 이 방법은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 투여하는 것 및 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 치료적 유효량의 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체를 투여하는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없다. 하나의 실시형태에서, T 세포는 부가적으로 대상체로부터 단리되고, 형질도입된 T 세포는 단리된 T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 벡터로 형질도입함으로써 생성된다. 하나의 실시형태에서, T 세포는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구성체로 또는 비-바이러스 벡터 구성체로 형질도입된다. 하나의 실시형태에서, 비-바이러스 벡터 구성체는 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터 (sleeping beauty minicircle vector) 이다.
하나의 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 정맥내 주입에 의해 투여된다. 하나의 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여에 앞서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉된다. 하나의 실시형태에서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여에 앞서 적어도 하나의 사이토카인과, 바람직하게는 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-15 (IL-15), 및/또는 인터류킨-21, 또는 그의 변이체와 접촉된다.
하나의 실시형태에서, 질환은 악성 질환이다. 하나의 실시형태에서, 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 표적 세포의 용해를 유도하는 방법이며, 이 방법은 표적 세포를 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 존재 하에 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없다.
하나의 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 하나의 실시형태에서, 표적 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신) 및 CA-IX 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 발현한다. 하나의 실시형태에서, 표적 세포는 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 및 테나신 (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 발현한다.
하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 형질도입된 T 세포는 약제의 제조를 위해 사용된다. 하나의 실시형태에서, 약제는 악성 질환의 치료를 위한 것이다.
도 1 은 본 발명에 따른 예시적 항원 결합 수용체의 구조를 나타낸다. 도 1A 는 항-P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 포맷 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 포맷의 구조를 보여준다. 보여지는 것은 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이다. 항원 결합 모이어티는 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 이루어진다. 둘 모두 (Gly4Ser)4 링커에 의해 연결된다. 가변 경쇄에 부착된, Gly4Ser 링커는 항원 인지 도메인을 CD28 경막 도메인 (transmembrane domain) (TM) 과 연결시키고, CD28 경막 도메인 (TM) 은 CD28 의 세포내 보조자극성 신호전달 도메인 (co-stimulatory signaling domain) (CSD) 에 융합되고, CD28 의 세포내 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 은 결국 CD3z 의 자극성 신호전달 도메인 (stimulatory signaling domain) (SSD) 에 융합된다. 도 1B 는 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 및 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 포맷의 구조를 보여준다. 보여지는 것은 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인이다. 항원 결합 모이어티는 Ig 중쇄 및 Ig 경쇄로 이루어진다. 중쇄에 부착된, Gly4Ser 링커는 항원 인지 도메인을 CD28 경막 도메인과 연결시키고, CD28 경막 도메인은 CD28 의 세포내 보조자극성 신호전달 도메인에 융합되고, CD28 의 세포내 보조자극성 신호전달 도메인은 결국 CD3z 의 자극성 신호전달 도메인에 융합된다.
도 2 는 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 예시적 발현 구성체의 모듈 조성을 예시하는 도해적 표현을 나타낸다. 도 2A 는 P392G-표적화 scFv 포맷을 나타낸다. 도 2B 는 P392G-표적화 Fab 포맷을 나타낸다.
도 3 는 본 발명의 항-P329G 항원 결합 수용체에 의해 인지되는 P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 보유하는 예시적 IgG1 분자를 나타낸다.
도 4 는 P329G 돌연변이를 보유하는 종양 관련 항원 (tumor associated antigen) (TAA) 결합된 IgG 의 도해적 표현을 나타낸다. 이러한 항체는 결국 항-P329G 항원 결합 수용체 발현 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, 그에 의해 T 세포가 활성화된다.
도 5 는 저카트 (Jurkat) NFAT T 세포 리포터 어세이의 도해적 표현을 보여준다. P329G 돌연변이를 보유하는 TAA 결합된 IgG 는 항-P329G 항원 결합 수용체 발현 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지될 수 있다. 이러한 인지는 세포의 활성화를 초래하며, 활성화는 발광 (cps) 을 측정함으로써 검출될 수 있다.
도 6 은 CD20 발현 SUDHDL4 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 관련 항원을 인지하고 다른 한편으로는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 6A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀 (sorted pool) 을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 6B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 7 은 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 7A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 5 를 이펙터 세포로서 사용하고, WSUDLCL2 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 2 를 이펙터 세포로서 사용하고, WSUDLCL2 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7C 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 5 를 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 2 를 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 를 종양 세포로서 사용했다.
도 8 은 부착성 FAP 발현 NIH/3T3-huFAP cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하여 수행된 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-FAP IgG 항체 클론 4B9 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 (isotype) 대조군으로서 포함시켰다. 도 8A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8C 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8D 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 9 는 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 둘 모두 P329G 돌연변이를 보유하는 항-CEA IgG 클론 A5B7 또는 항-CEA IgG 클론 T84 LCHA 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 9A 및 도 9B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 9C 및 도 9D 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 10 은 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 둘 모두 P329G 돌연변이를 보유하는 항-CEA 클론 CH1A1A 98 99 또는 항-CEA IgG 클론 hMN14 IgG 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 10A 및 도 10B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 10C 및 도 10D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 11 은 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-TNC IgG 클론 A2B10 을 IgG 항체로서 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 11A 및 도 11B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 11C 및 도 11D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 12A 및 도 12B 는 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-TNC IgG 클론 A2B10 을 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 13 은 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 종양 관련 항원을 검출하기 위해서 P329G 및 LALA 돌연변이, P329G 및 D265A 돌연변이, LALA 돌연변이 단독을 보유하거나 또는 돌연변이를 전혀 보유하지 않는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 13A 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 13B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다.
도 14 는 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 종양 관련 항원을 검출하기 위해서 P329G 및 LALA 돌연변이, P329G 돌연변이 단독, LALA 돌연변이 단독을 보유하거나 또는 돌연변이를 전혀 보유하지 않는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 14A 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 14B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다.
도 2 는 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 예시적 발현 구성체의 모듈 조성을 예시하는 도해적 표현을 나타낸다. 도 2A 는 P392G-표적화 scFv 포맷을 나타낸다. 도 2B 는 P392G-표적화 Fab 포맷을 나타낸다.
도 3 는 본 발명의 항-P329G 항원 결합 수용체에 의해 인지되는 P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 보유하는 예시적 IgG1 분자를 나타낸다.
도 4 는 P329G 돌연변이를 보유하는 종양 관련 항원 (tumor associated antigen) (TAA) 결합된 IgG 의 도해적 표현을 나타낸다. 이러한 항체는 결국 항-P329G 항원 결합 수용체 발현 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, 그에 의해 T 세포가 활성화된다.
도 5 는 저카트 (Jurkat) NFAT T 세포 리포터 어세이의 도해적 표현을 보여준다. P329G 돌연변이를 보유하는 TAA 결합된 IgG 는 항-P329G 항원 결합 수용체 발현 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지될 수 있다. 이러한 인지는 세포의 활성화를 초래하며, 활성화는 발광 (cps) 을 측정함으로써 검출될 수 있다.
도 6 은 CD20 발현 SUDHDL4 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 관련 항원을 인지하고 다른 한편으로는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 6A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀 (sorted pool) 을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 6B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 7 은 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 7A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 5 를 이펙터 세포로서 사용하고, WSUDLCL2 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 2 를 이펙터 세포로서 사용하고, WSUDLCL2 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7C 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 5 를 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 7D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 단일 클론 2 를 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 를 종양 세포로서 사용했다.
도 8 은 부착성 FAP 발현 NIH/3T3-huFAP cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하여 수행된 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-FAP IgG 항체 클론 4B9 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 (isotype) 대조군으로서 포함시켰다. 도 8A 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8C 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 8D 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 9 는 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 둘 모두 P329G 돌연변이를 보유하는 항-CEA IgG 클론 A5B7 또는 항-CEA IgG 클론 T84 LCHA 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 9A 및 도 9B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 9C 및 도 9D 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 10 은 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 둘 모두 P329G 돌연변이를 보유하는 항-CEA 클론 CH1A1A 98 99 또는 항-CEA IgG 클론 hMN14 IgG 를 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 10A 및 도 10B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 10C 및 도 10D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 11 은 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-TNC IgG 클론 A2B10 을 IgG 항체로서 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 도 11A 및 도 11B 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다. 도 11C 및 도 11D 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 12A 및 도 12B 는 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. P329G 돌연변이를 보유하는 항-TNC IgG 클론 A2B10 을 사용했으며, 이는 종양 관련 항원을 인지하고 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 추가로 P329G 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀을 이펙터 세포로서 사용했다.
도 13 은 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 종양 관련 항원을 검출하기 위해서 P329G 및 LALA 돌연변이, P329G 및 D265A 돌연변이, LALA 돌연변이 단독을 보유하거나 또는 돌연변이를 전혀 보유하지 않는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 13A 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 13B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다.
도 14 는 CD20 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이를 나타낸다. 종양 관련 항원을 검출하기 위해서 P329G 및 LALA 돌연변이, P329G 돌연변이 단독, LALA 돌연변이 단독을 보유하거나 또는 돌연변이를 전혀 보유하지 않는 항-CD20 IgG 항체 (GA101) 를 사용했으며, 이는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 도 14A 에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다. 도 14B 에서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하고, SUDHL4 세포를 종양 세포로서 사용했다.
상세한 설명
정의
용어는 하기에서 달리 정의하지 않으면, 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
"활성화 Fc 수용체" 는 항체의 Fc 도메인에 의한 관여 이후에 수용체-보유 세포를 자극하여 이펙터 기능을 수행하게 하는 신호전달 사건을 유발시키는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), 및 FcαRI (CD89) 를 포함한다.
항체-의존적 세포-매개 세포독성 ("ADCC") 은 면역 이펙터 세포에 의해 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기시키는 면역 기전이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해서, Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "감소된 ADCC" 는 상기 정의된 ADCC 의 기전에 의해 표적 세포 주변 배지 중 항체의 소정 농도에서, 소정 시점에 용해되는 표적 세포의 개수의 감소, 및/또는 ADCC 의 기전에 의해 소정 시점에 표적 세포의 소정 개수의 용해를 달성하는데 요구되는 표적 세포 주변의 배지 중 항체의 농도 증가로서 정의된다. ADCC 의 감소는 돌연변이되지 않았지만, (당업자에게 알려진) 동일한 표준 제조, 정제, 제제화 및 저장 방법을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되는 동일 항체에 의해 매개된 ADCC 에 대한 것이다. 예를 들어, ADCC 를 감소시키는 아미노산 돌연변이를 이의 Fc 도메인에 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC 의 감소는 Fc 도메인 내 이러한 아미노산 돌연변이가 없는 동일 항체에 의해 매개되는 ADCC 에 비해서이다. ADCC 를 측정하기 위한 적합한 어세이는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
작용제 (예를 들어, 항체) 의 "유효량" 은 투여되는 세포 또는 조직에서 생리적 변화를 야기시키는데 필요한 양을 의미한다.
"친화도" 는 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 수용체) 및 이의 결합 파트너 (예를 들어, 리간드) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시하지 않으면, 본원에서 사용되는 "결합 친화도" 는 결합쌍의 구성원 (예를 들어, 항원 결합 모이어티 및 항원 및/또는 수용체 및 이의 리간드) 간 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 의미한다. 이의 파트너 Y 에 대한 분자 X 의 친화도는 일반적으로, 해리 및 결합 속도 상수 (각각 koff 및 kon) 의 비율인, 해리 상수 (KD) 로 표시될 수 있다. 따라서, 당량의 친화도는 속도 상수의 비율이 동일하게 남아있는 한, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여, 당해 기술분야에 알려진 충분히-확립된 방법으로 측정될 수 있다. 친화도를 측정하기 위해 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명법 (SPR) 이고 측정에 바람직한 온도는 25℃ 이다.
용어 "아미노산" 은 천연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 것을 비롯하여, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린으로 이후에 변형되는 아미노산이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산으로서 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조는 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다. 아미노산은 그들의 통상적으로 알려진 3글자 기호를 통해서 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회가 추천하는 1글자 기호를 통해 본원에서 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 돌연변이" 는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 의미이다. 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의 조합은 최종 구성체에 도달하게 할 수 있고, 단 최종 구성체는 바람직한 특성, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 보유한다. 아미노산 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어, Fc 영역의 결합 특성을 변경하기 위한 목적을 위해, 비보존성 아미노산 치환, 즉 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 발생 아미노산 또는 20 개 표준 아미노산의 천연 발생 아미노산 유도체 (예를 들어, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록시리신) 에 의한 치환을 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 기술분야에 충분히 알려진 유전자 또는 화학 방법을 사용해 생성시킬 수 있다. 유전자 방법은 부위-지정 돌연변이유발법, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법에 의한 아미노산의 측쇄 기를 변경시키는 방법, 예컨대 화학적 변형이 또한 유용할 수 있다는 것을 고려한다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 본원에서 다양한 명명법이 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329 의 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly 로서 표시될 수 있다.
본원에서 용어 "항체" 는 광범위한 의미로 사용되고, 제한없이 그들이 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다클론 항체 및 항체 단편을 포함한, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 항체는 전체 면역글로불린 분자를 비롯하여 이러한 면역글로불린 분자의 일부에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 이 용어는 본원에서 논의되는 바와 같이, 변형 및/또는 변경된 항체 분자, 특히 돌연변이된 항체 분자에 관한 것이다. 이 용어는 또한 재조합적으로 또는 합성적으로 생성/합성된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 항체는 용어 면역글로불린과 호환되게 사용된다.
"항체 단편" 은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 제한없이 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 일정한 항체 단편의 고찰을 위해서, 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)] 을 참조한다. scFv 단편의 고찰을 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 를 참조하고, 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 출원 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 디아바디는 2가 또는 이특이적일 수 있는 2 개 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 를 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 문헌 [Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)] 에 기술되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 항체 단편이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조). 항체 단편은 본원에 기술된 바와 같이, 제한없이 온전한 항체의 단백질가수분해적 분해를 비롯하여 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지) 에 의한 생산을 포함한, 다양한 기술로 제조될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자" 는 이의 광범위한 의미로 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 유도체, 예를 들어 이의 단편을 비롯해 항원 결합 수용체 및 이의 유도체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 모이어티" 는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 의미한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 이것이 부착된 독립체 (예를 들어, 면역글로불린 또는 항원 결합 수용체) 가 표적 부위, 예를 들어 항원 결정기를 보유하는 특별한 유형의 종양 세포 또는 종양 기질 또는 종양 세포 상의 항원 결정부에 결합되는 면역글로불린에 대해 유도될 수 있게 한다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 이의 표적 항원을 통해서 신호전달을 활성화시킬 수 있고, 예를 들어 신호전달은 T 세포 상의 항원 결합 수용체와 항원 결정기의 결합 시에 활성화된다. 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 더욱 정의되는 바와 같은 항체 및 이의 단편을 비롯하여 항원 결합 수용체 및 이의 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에서 더욱 정의되고 당해 기술분야에 알려진 바와 같은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5 개 이소타임 중 어느 하나를 포함한다: α, δ, ε, γ, 또는 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 2 개 이소타입 중 어느 하나를 포함한다: κ 및 λ.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항원 결합 수용체" 는 앵커링 경막 도메인, 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 항원 결합 수용체는 상이한 공급원 유래의 폴리펩티드 부분으로 만들어질 수 있다. 따라서, 또한 "융합 단백질" 및/또는 "키메라 단백질" 로서 이해할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 본래 개별 단백질을 인코딩하는 둘 이상의 유전자 (또는 바람직하게 cDNA) 의 연결을 통해 생성된 단백질이다. 이러한 융합 유전자 (또는 융합 cDNA) 의 번역은 바람직하게 본래 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성시킨다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료법에서 사용을 위한 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성된다. 본 발명의 항원 결합 수용체에 대한 추가의 상세한 설명은 하기 본원에 기술되어 있다. 본 발명의 맥락에서, CAR (chimeric antigen receptor) 은 그 자체가 CD3z 및 CD28 의 세포내 신호전달 도메인과 융합된 앵커링 경막 도메인에 스페이서 서열에 의해 융합된 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 부분을 포함하는 항원 결합 수용체로 이해된다.
"항원 결합 부위" 는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위 또는 항원 결합 수용체는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2 개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 또는 scFv 분자는 전형적으로 1 개의 항원 결합 부위를 갖는다.
용어 "항원 결합 도메인" 은 항원의 일부분 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부분 또는 항원 결합 수용체를 의미한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인 (또한 가변 영역이라고도 함) 에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항원과의 결합에 관여하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL) 의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존성 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 초가변 영역 (HVR) 을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co, page 91 (2007)] 을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 일반적으로 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분하다.
본원에서 사용되는 용어 "ATD" 는 세포의 세포막(들)으로 통합될 수 있는 폴리펩티드 스트렛치를 한정하는 "앵커링 경막 도메인" 을 의미한다. ATM 은 세포외 및/또는 세포내 폴리펩티드 도메인에 더욱 융합될 수 있고 이들 세포외 및/또는 세포내 폴리펩티드 도메인은 역시 세포막에 한정될 것이다. 본 발명의 항원 결합 수용체의 맥락에서, ATM 은 본 발명의 항원 결합 수용체의 한정 및 막부착을 부여한다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 ATM, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 추가로, ATM 은 추가의 세포내 신호전달 도메인에 융합될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 수용체의 맥락에서 사용되는 용어 "∼에 결합하는" 은 "항원-상호작용-부위" 및 서로의 항원의 결합 (상호작용) 을 정의한다. 용어 "항원-상호작용-부위" 는 본 발명의 항원 결합 수용체에 따라서, 특정 항원 또는 항원의 특정 기 (즉, 돌연변이된 Fc 도메인) 와 특이적 상호작용하는 능력을 보이는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인지" 를 정의하는 것으로 이해한다. 용어 "특이적으로 인지하는" 은 본 발명에 따라서 항원 결합 수용체가 본원에서 정의하는 바와 같은 변형된 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있고/있거나 결합할 수 있지만 변형되지 않은 분자는 인지되지 않는다는 것을 의미한다. 항원 결합 수용체의 항원 결합 모이어티는 동일한 분자 상의 항이한 에피토프를 인지할 수 있고/있거나, 상호작용할 수 있고/있거나 결합할 수 있다. 이 용어는 항원 결합 수용체의 특이성, 즉 본원에 정의된 바와 같은 변형된 분자, 즉 돌연변이된 Fc 도메인의 특별한 영역들을 구별하는 이의 능력에 관한 것이다. 이의 특정 항원과 항원-상호작용-부위의 특이적 상호작용은 그 결과로 예를 들어 항원을 포함하는 폴리펩티드의 입체형태의 변화 유도, 항원을 포함하는 폴리펩티드의 올리고머화, 항원 결합 수용체의 올리고머화 등에 기인하여, 신호의 개시를 일으킬 수 있다. 따라서, 항원-상호작용-부위의 아미노산 서열의 특별한 모티프 및 항원은 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과를 비롯하여 상기 구조의 이차적 변형의 결과로서 서로 결합된다. 따라서, 용어 ∼에 결합하는은 선형 에피토프에 관한 것뿐만 아니라 또한 입체구성적 에피토프, 구조적 에피토프, 또는 표적 분자의 2 개 영역 또는 이의 일부분으로 이루어진 불연속 에피토프에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 입체구성적 에피토프는 폴리펩티드가 천연 단백질로 폴딩될 때 분자의 표면 상에 함께 오게되는 1차 서열에서 떨어져 있는 둘 이상의 개별 아미노산 서열에 의해 정의된다 (Sela, Science 166 (1969), 1365 및 Laver, Cell 61 (1990), 553-536). 게다가, 용어 "∼에 결합하는" 은 용어 "∼와 상호작용하는" 과 본 발명의 맥락에서 호환되게 사용된다. 특별한 표적 항원 결정기에 결합하는 항원 결합 수용체 또는 항체의 항원 결합 모이어티 (예를 들어, Fab 또는 scFv 도메인) 의 능력은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 장비에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 어세이 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 를 통해서 측정될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 미관련된 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는 특히 SPR 에 의해 측정되는 표적 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, 표적 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (KD) 를 갖는다. 본 발명에 따라 사용되는 용어 "특이적 결합" 은 본 발명의 분자가 유사한 구조의 (폴리-) 펩티드와, 즉, 본 발명의 항원 결합 수용체가 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 경우에 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 교차 반응하지 않거나 또는 본질적으로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적으로 결합한다/그와 상호작용한다. 조사 중인 구성체의 패널의 교차-반응성은 예를 들어 관심의 돌연변이된 Fc 도메인 뿐만 아니라 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 대해 통상의 조건 하에서 항원 결합 모이어티의 패널의 결합을 평가하여 시험될 수 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)] 및 [Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)]). 관심의 돌연변이된 Fc 도메인에 결합하지만 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는 구성체 (즉, Fab 단편, scFv 등) 만이 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적인 것으로 간주되고 본원에 제공된 방법에 따른 추가 실험에 선택된다. 이들 방법은 특히 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 Fc 도메인에 의한 결합 실험, 차단 및 경쟁 실험을 포함할 수 있다. 결합 실험은 또한 FACS 분석, 표면 플라스몬 공명 (SPR, 예를 들어, BIAcore®), 분석적 초원심분리, 등온 적정 열량계, 형광 이방성, 형광 분광법 또는 방사성 표지 리간드 결합 어세이를 포함한다.
본원에서 적용되는 용어 "CDR" 은 당해 기술분야에 충분히 알려진 "상보성 결정 영역"에 관한 것이다. CDR 은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하는 면역글로불린 또는 항원 결합 수용체의 일부분이다. CDR 은 분자의 가장 가변적인 부분이고 이들 분자의 항원 결합 다양성에 기여한다. 각각의 V 도메인에 3 개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 존재한다. CDR-H 는 가변 중쇄의 CDR 영역을 의미하고 CDR-L 은 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. VH 는 가변 중쇄를 의미하고 VL 은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-유래 영역의 CDR 영역은 "Kabat" (Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) 또는 "Chothia" (Nature 342 (1989), 877-883) 에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "CD3z" 는 "T-세포 수용체 T3 제타 사슬" 및 "CD247" 로도 알려진, T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬을 의미한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "키메라 수용체" 또는 "CAR" 은 CD3z 및 CD28 의 세포내 신호전달 도메인에 스페이서 서열에 의해 융합된 항원 결합 모이어티 (예를 들어, 단일 사슬 항체 도메인) 의 세포외 부분으로 구성된 항원 결합 수용체를 의미한다. 본 발명은 추가로 항원 결합 수용체를 제공하고, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 단편이다. 용어 "CAR" 은 이의 광범위한 형태로 임의로 하나 또는 몇개의 펩티드 링커를 통해서, CD3z 및 이의 단편 및 CD28 및 이의 단편을 포함하는 세포외 부분으로 구성된 항원 결합 수용체를 포함하는 것으로 이해된다.
항체 또는 면역글로불린의 "클래스" 는 이의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 5 개의 주요한 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 이 존재하고, 이들 중 몇개는 서브클래스 (이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 더욱 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 라고 한다.
"crossover Fab 분자" (또한 "crossFab" 또는 "crossover Fab 단편"이라고 함) 란 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 분자를 의미하며, 즉 crossFab 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 명확성을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되어 있는 crossFab 단편에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 crossover Fab 분자의 중쇄로서 언급된다. 반대로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되어 있는 crossFab 단편에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬은 본원에서 crossFab 단편의 중쇄로서 언급된다. 따라서, crossFab 단편은 중쇄 가변 및 경쇄 불변 영역 (VH-CL) 으로 구성된 중쇄 또는 경쇄, 및 경쇄 가변 및 중쇄 불변 영역 (VL-CH1) 으로 구성된 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이와 반대로, "통상의 Fab" 분자란 이의 천연 구성의, 즉 중쇄 가변 및 불변 영역 (VH-CH1) 으로 구성된 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 영역 (VL-CL) 으로 구성된 경쇄를 포함하는, Fab 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "CSD" 는 보조자극성 신호전달 도메인을 의미한다.
용어 "이펙터 기능" 은 항체 이소타입에 따라 다양한, 항체의 Fc 영역에 기인한 그들의 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포의 식균작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체) 의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "조작하다", "조작된", "조작하는" 은 펩티드 골격의 임의 조작 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작하는은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 측쇄기의 변형을 비롯하여, 이들 접근법의 조합을 포함한다.
용어 "발현 카세트" 는 표적 세포에서 특정한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 엘리먼트와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편에 도입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도, 전사하려는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"Fab 분자" 는 항원 결합 분자의 중쇄 ("Fab 중쇄") 의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄 ("Fab 경쇄") 의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진 단백질을 의미한다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역" 은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226, 또는 Pro230 으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 확장되는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 번호매김은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991] 에 기술된 바와 같이, EU 지수라고도 하는, "EU 번호매김" 체계에 따른다. 본원에서 사용되는 Fc 도메인의 서브유닛은 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2 개 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정하게 자기-회합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4개 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기의 서열로 표시된다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체" 는 2 개의 "전장 항체 중쇄" 및 2 개의 "전장 항체 경쇄" 로 이루어진 항체를 의미한다. "전장 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH-CH1-HR-CH2-CH3 로 축약되는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3); 및 IgE 서브클래스의 항체 경우 임의로 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어진 폴리펩티드이다. 바람직하게 "전장 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3 으로 이루어진 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단으로, VL-CL로 축약되는, 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어진 폴리펩티드이다. 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 은 κ (카파) 또는 λ (람다) 일 수 있다. 2 개의 전장 항체 사슬은 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이 및 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 폴리펩티드간 다이설파이드 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG (예를 들어, IgG 1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD, 및 IgE) 와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따라 사용되는 전장 항체는 단일 종 예를 들어 인간으로부터 유래할 수 있거나, 또는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 전장 항체, 즉, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체는 한 쌍의 VH 및 VL 에 의해 각각 형성되는 두 개의 항원 결합 부위를 포함하며, 두 개의 항원 결합 부위 둘 모두는 동일한 항원에 특이적으로 결합한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 전장 항체는 한 쌍의 VH 및 VL 에 의해 각각 형성되는 두 개의 항원 결합 부위를 포함하며, 두 개의 항원 결합 부위는 상이한 항원에 결합하며, 예를 들어 항체는 이중특이적이다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄 C-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
"융합된" 이란 성분 (예를 들어, Fab 및 경막 도메인) 이 하나 이상의 펩티드 링커를 통해서 또는 직접적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 것을 의미한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 호환되게 사용되고 이러한 세포의 자손을 포함하여, 외생성 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 초대 형질전환된 세포 및 계대수와 무관하게 그로부터 유래된 자손을 포함한 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용물이 완전하게 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명에 따라서 사용되는 항체를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 포유동물 배양된 세포, 몇가지만 언급하면, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포뿐만 아니라, 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직에 포함된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열이 초가변이고/이거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프") 인 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 의미한다. 일반적으로, 천연의 4개-사슬 항체는 6개 HVR 을 포함하는데, VH (H1, H2, H3) 에 3 개, 및 VL (L1, L2, L3) 에 3 개를 포함한다. HVR 은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR) 로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 최고의 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인지에 관여된다. VH의 CDR1 을 제외하고, CDR 은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역 (HVR) 은 또한 상보성 결정 영역 (CDR) 이라고 하고, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 일부분에 대해서 호환되게 본원에서 사용된다. 이러한 특정한 영역은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)] 에 기술되어 있고, 그 정의는 서로에 대해 비교시 아미노산 잔기의 서브셋 또는 중복을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항원 결합 수용체 또는 이의 변이체 및/또는 항체의 CDR 을 언급하는 정의의 적용은 본원에서 정의하고 사용하는 용어의 범주 내에 포함하고자 한다. 상기 인용된 참조 각각에 의해 정의되는 CDR 을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1 에 기재된다. 특정한 CDR 을 포괄하는 정확한 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 의존하여 다양할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어지면 어떠한 잔기가 특정한 CDR 을 포함하는가를 통상적으로 결정할 수 있다.
Kabat 등은 또한 임의 항체에 적용가능한 가변 영역 서열에 대한 번호매김 체계를 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외에 임의의 실험 데이타에 의존하지 않고, 임의 가변 영역 서열에 대해 이러한 카밧 번호매김 체계를 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용되는 "카밧 번호매김" 은 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Servieces, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 에 기재된 번호매김 체계를 의미한다. 다르게 명시되지 않으면, 항원 결합 모이어티 가변 영역 내 특별한 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 참조는 카밧 번호매김 체계에 따른다. 서열 목록의 폴리펩티드 서열은 카밧 번호매김 체계에 따라 번호매겨지지 않는다. 그러나, 서열 목록의 서열의 번호매김을 카밧 번호매김으로 전환시키는 것은 당업자의 통상의 기술 내에서 충분하다.
"개체" 또는 "대상체" 는 포유동물이다. 포유동물은 제한없이 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 인간 이외의 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트) 를 포함한다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된 핵산" 분자 또는 폴리뉴클레오티드란 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 용액 중 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 정상적으로 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 그 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 또는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 비롯하여, 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절성 엘리먼트 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95% 가 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각의 100 개 뉴클레오티드 당 최대 5 개의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의도한다. 달리 말해서, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 가 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서, 기준 서열의 뉴클레오티드의 최대 5% 는 결실될 수 있거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5%의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 그룹으로 또는 기준 서열 내 잔기 중에서 개별적으로 산재된, 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 실질적으로, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또 는 99% 가 동일한지 여부는 통상적으로 기지의 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대해 하기에 논의되는 것 (예를 들어, ALIGN-2) 을 사용하여 결정될 수 있다.
"단리된 폴리펩티드" 또는 이의 변이체 또는 유도체란 이의 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정한 정제 수준이 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 이의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 천연으로서 또는 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 재조합 폴리펩티드로서, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율 (%)" 은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 서열 동일성 백분율을 획득하기 위해 갭을 도입하고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환은 고려하지 않은 후에, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당해 기술분야의 기술 내에서 다양한 방식으로 획득될 수 있다. 당업자는 비교하려는 서열의 전장 상에서 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위해 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해서, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 사용해 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 가 만들었고, 소스 코드는 미국 저작권 협회 (U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559) 에서 사용자 문서로 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California) 에서 공공으로 입수가능하거나 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D 을 포함하는 UNIX 운용 체계 상에서 사용을 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 가변적이지 않다. ALIGN-2 이 아미노산 서열 비교에 적용되는 상황에서, 소정 아미노산 서열 B 에 대해, 그와, 또는 그에 대응하는 소정 아미노산 서열 A 의 아미노산 서열 동일성의 % (소정 아미노산 서열 B 에 대해, 그와, 또는 그에 대응하는 일정한 아미노산 서열 동일성 % 를 갖거나 또는 포함하는 소정 아미노산 서열 A 로서 대안적으로 표현될 수 있음) 는 다음과 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
여기서 X 는 그 프로그램의 A 및 B 의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 동일한 일치로서 점수매겨진 아미노산 잔기의 수이고 Y 는 B 의 아미노산 잔기의 총 개수이다. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우, B 에 대한 A 의 아미노산 서열 동일성 % 는 A 에 대한 B 의 아미노산 서열 동일성 % 와 갖지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 구체적으로 다르게 명시되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 % 는 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 얻어진다.
용어 "핵산 분자" 는 폴리뉴클레오티드에 의해 포함된 푸린- 및 피리미딘 염기를 포함하는 염기의 서열에 관한 것으로, 상기 염기는 핵산 분자의 1차 구조를 의미한다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, DNA 의 합성 형태 및 둘 이상의 이들 분자를 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 또한, 용어 핵산 분자는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에 기술된 핵산 분자는 당업자가 쉽게 이해하게 되는 바와 같이, 비천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다.
용어 "패키지 삽입부" 는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 증상, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제폼의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시서를 의미하는데 사용된다.
용어 "약학 조성물" 은 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가하게 유독한 추가 성분을 함유하지 않는 조제물을 의미한다. 약학 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(들)를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의, 약학 조성물 중 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 제한없이 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 는 아미드 결합 (펩티드 결합이라고도 알려짐) 을 통해 선형적으로 연결된 단량체 (아미노산) 로 구성된 분자를 의미한다. 용어 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산의 임의 사슬을 의미하고, 생성물의 특별한 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 사슬, 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬을 언급하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 폴리펩티드의 정의 내에 포함되고, 용어 폴리펩티드가 임의의 이들 용어 대신에 또는 그와 호환되게 사용될 수 있다. 용어 폴리펩티드는 또한 제한없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 의미하고자 한다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술로 제조될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학 합성을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 50 개 이상, 75 개 이상, 100 개 이상, 200 개 이상, 500 개 이상, 1,000 개 이상, 또는 2,000 개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 그들이 반드시 그러한 구조를 가질 필요는 없지만, 정해진 3차원 구조를 가질 수 있다. 정해진 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩되었다고 하고, 정해진 3차원 구조를 갖지 않지만, 대신에 다수의 상이한 입체구성을 채택할 수 있는 것은 언폴딩되었다고 한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 는 단리된 핵산 분자 또는 구성체, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 바이러스 유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA) 를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 비통상의 결합 (예를 들어, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA) 에 존재하는 것과 같은 아미드 결합) 을 포함할 수 있다. 용어 핵산 분자는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 존재하는, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다.
"감소된 결합", 예를 들어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들어 SPR 에 의해 측정시 개별 상호작용에 대한 친화도의 감소를 의미한다. 명확함을 위해서 이 용어는 또한 0 (또는 분석 방법의 검출 한계 이하) 까지 친화도의 감소, 즉 상호작용의 완전한 제거를 포함한다. 반 대로, "증가된 결합" 은 개별 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 의미한다.
용어 "조절 서열" 은 그들이 결찰되는 코딩 서열의 발현을 실행하는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 의존적으로 상이하다. 원핵생물에서, 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 종결인자를 포함한다. 진핵생물에서 일반적으로 제어 서열은 프로모터, 종결인자, 및 일부 예에서, 인핸서, 트랜스활성인자 또는 전사 인자를 포함한다. 용어 "제어 서열" 은 그 존재가 발현에 필수적인 모든 성분을 최소로 포함하고자 하고, 또한 추가의 유리한 성분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단일-사슬" 은 펩티드 결합에 의해 선형적으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 의미한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 scFv 단편, 즉 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인이다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일-사슬 Fab 분자이고, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시형태에서, Fab 경쇄 의 C-말단은 단일-사슬 Fab 분자 내 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.
본원에서 사용되는 용어 "SSD" 는 자극성 신호전달 도메인을 의미한다.
본원에서 사용되는 "치료" (및 이의 문법적 별형 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는") 는 치료하려는 개체에서 질환의 자연적 과정을 변경시키려는 시도의 임상적 중재술을 의미하고 임상 병리학적 과정 동안 또는 예방학적으로 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 제한없이 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환의 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체와 함께 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "표적 항원 결정기" 는 "표적 항원", "표적 에피토프" 및 "표적 세포 항원" 과 동의어이고, 항체가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위 (예를 들어, 아미노산의 인접하는 스트렛치 또는 비인접한 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체구성적 구성) 를 의미한다. 유용한 항원 결정기는 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스-감염된 세포의 표면, 다른 질환 세포의 표면, 면역 세포의 표면 상에서, 혈류 및/또는 세포외 매트릭스 (ECM) 에서 유리되어 존재할 수 있다. 본원에서 항원으로서 언급되는 단백질 (예를 들어, CD20, CEA, FAP, TNC) 은 달리 표시하지 않으면 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트) 와 같은 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원 유래 단백질의 임의의 천연 형태일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특이적 표적 단백질을 언급하는 경우에, 그 용어는 "전장", 미처리된 표적 단백질을 비롯하여 표적 세포에서 처리된 표적 단백질의 임의 형태를 포괄한다. 이 용어는 또한 표적 단백질의 천연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이싱 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적인 인간 표적 단백질은 제한없이 CD20, CEA, FAP, TNC, MSLN, FolR1, HER1 및 HER2 를 포함한다. 특이적 표적 항원 결정기에 결합하는 항체의 능력은 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 장비에서 분석) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적 결합 어세이 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 를 통해서 측정할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 미관련된 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 예를 들어 SPR 로 측정시 표적 항원에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M) 의 친화도 해리 상수 (KD) 로 표적 항원에 결합된다.
본 발명에 따른 "돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체", 즉, 치료적 항체는 하나, 둘, 셋 또는 더 많은 수의 결합 도메인을 가질 수 있고, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 항체는 단일 종으로부터 유래하는 전장이거나, 또는 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다. 두 개 이상의 항원 결합 도메인을 갖는 항체의 경우에, 일부 결합 도메인은 동일할 수 있고/있거나 동일한 특이성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "T 세포 활성화" 는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 이펙터 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 의미한다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적합한 어세이는 본원에 기술되고 당해 기술분야에 알려져 있다.
본 발명에 따라서 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR" 은 당해 기술분야에서 통상적으로 알려져 있다. 특히, 본원에서 용어 "T 세포 수용체" 는 임의의 T 세포 수용체를 의미하고, 단 하기의 3 개 기준을 충족한다: (i) 종양 특이성, (ii) 항원 또는 표적이 (대부분의) 종양 세포에서 발현되어야 하는 것을 의미하는, (대부분의) 종양 세포의 인지, 및 (iii) TCR 이 치료하려는 대상체의 HLA-유형과 일치. 이러한 맥락에서, 상기 언급된 3 개 기준을 충족하는 적합한 T 세포 수용체는 NY-ESO-1 (서열 정보(들)는 예를 들어, PCT/GB2005/001924 를 참조함) 및/또는 HER2neu (서열 정보(들)는 WO-A1 2011/0280894 를 참조함) 를 인지하는 수용체와 같이, 당해 기술분야에 알려져 있다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료적 유효량" 은 바람직한 치료적 또는 예방적 결과를 획득하기 위해, 필요한 시간 기간 동안 및 용량에서 유효한 양을 의미한다. 예를 들어 작용제의 치료적 유효량은 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화시키거나 또는 예방한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터" 는 "발현 구성체"와 동의어이고 표적 세포에서 작동적으로 회합된 특별한 유전자의 발현을 도입시켜서 유도시키는데 사용되는 DNA 분자를 의미한다. 이 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터를 비롯하여 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합되는 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 대량의 안정한 mRNA 의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 리보핵산 분자 또는 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항원 결합 수용체 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
돌연변이된 Fc 도메인(들)에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체
본 발명은 항체, 즉, 암 세포를 표적화하는 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 이며, 돌연변이된 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 P329G 이며, Fcγ 수용체에 대한 결합은 25℃ 에서 SPR 에 의해 측정시 감소된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 I253A, H310A 및 H435A 이며, 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합은 25℃ 에서 SPR 에 의해 측정시 감소된다.
본 발명은 또한 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, CD3+ T 세포, γδ T 세포 또는 자연 살해 (NK) T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체로 형질도입하는 것 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체 분자, 예를 들어 치료적 항체에 의한, 예를 들어, 종양으로의, 그들을 표적화되는 동원에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 종양-특이적 항원에 특이적 결합을 할 수 있다.
첨부된 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 개념의 증거로서, 본 발명에 따른 앵커링 경막 도메인 및 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체 pETR17096 (SEQ ID NO:19 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 SEQ ID NO:7) 는 P329G 돌연변이를 포함하는 치료적 항체 (SEQ ID NO ID: 112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항-CD20 항체에 의해 대표됨) 에 특이적 결합을 할 수 있도록 구축되었다. 항-P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 단백질 (SEQ ID NO:19 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 SEQ ID NO:7) 을 발현하는 형질도입된 T 세포 (저카트 NFAT T 세포) 는 CD20 양성 종양 세포와 함께 P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항-CD20 항체와의 공동인큐베이션에 의해 강하게 활성화될 수 있었다. 본 발명자들은 발명의 개념의 증거를 지지하기 위해서 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 수용체의 다수의 구성을 추가로 제공했다.
항-P329G-Fab-ds-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 단백질 (SEQ ID NOs: 44 (DNA) 및 39, 41 (단백질)) 을 발현하는 형질도입된 T 세포와 함께 종양 항원을 향해 유도되는 항체 (여기에서 항체는 P329G 돌연변이를 포함한다) 의 조합에 의한 종양 세포의 치료는 놀랍게도 항-P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (SEQ ID NOs: 19 (DNA) 및 7 (단백질)) 융합체 단백질을 발현하는 형질도입된 T 세포와 비교하여 형질도입된 T 세포의 더 강한 활성화를 초래한다 (참고, 예를 들어 도 6 및 8 내지 11).
따라서, 놀랍게도 예상 외로 발견된 점은 본 발명의 항원 결합 수용체로 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 종양-특이적 항체의 사용에 의해 특이적으로 자극되고, 연결 요소로서의 종양-특이적 항체에 의해 종양 세포로 동원될 수 있다는 점이다. 따라서, 놀랍게도 예상 외로 본 발명에서 보여진 점은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 종양-특이적 항체, 즉, 치료적 항체와, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는/그것으로 이루어지는 항원 결합 수용체로 형질도입된 T 세포를 짝짓는 것 (pairing) 은 T 세포의 특이적 활성화 및 종양 세포의 후속적 용해를 초래할 것이라는 점이다. 이러한 접근법은 종래의 T 세포 기반 접근법에 비해 유의한 안전성 이점을 보유하며, 그 이유는 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 부재 하에 불활성일 것이고, 그들의 이용가능성은 선택되는 항체 분자 구성에 의해 제어될 수 있기 때문이다 (즉, 더 짧은 반감기를 위해서 더 작은 분자 및 그 반대의 경우도 마찬가지). 따라서, 본 발명은 T 세포를 위한 안내로서 종양 세포를 마크 또는 표지하기 위해 IgG 유형 항체가 사용될 수 있고, IgG 유형 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 대한 특이성을 제공함으로써 형질도입된 T 세포가 종양 세포를 향해 특이적으로 표적화되는 범용 치료적 플랫폼을 제공한다. 종양 세포의 표면 상의 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 결합한 후에, 본원에 기재된 바와 같은 형질도입된 T 세포는 활성화되고, 종양 세포는 후속적으로 용해될 것이다. 이 플랫폼은 다양한 (기존의 또는 새로 개발된) 표적 항체의 사용 또는 상이한 항원 특이성을 갖지만 동일한 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 다수의 항체의 동시 적용을 허용함으로써 유연하고 특이적이다. 동시 적용되는 치료적 항체의 투여량을 조정함으로써 또는 상이한 항체 특이성 또는 구성으로 스위칭함으로써, T 세포 활성화의 정도는 추가로 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 형질도입된 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체의 동시 적용 없이는 불활성이며, 그 이유는 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인에 대한 돌연변이는 천연 또는 돌연변이되지 않은 면역글로불린에서는 발생하지 않기 때문이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 야생형 면역글로불린에서는 자연적으로 발생하지 않는다.
따라서, 본 발명은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체에 관한 것이며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합 및/또는 돌연변이된 Fc 도메인에 의해 유도되는 이펙터 기능은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인에 의한 Fc 수용체 결합 및/또는 돌연변이된 Fc 도메인에 의해 유도되는 이펙터 기능과 비교하여 감소된다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 치료적 항체를 암 요법에서 사용하는 것은 특히 바람직할 수 있으며, 그 이유는 이펙터 기능은 본원에서 추가로 기재되는 바와 같은 항체-기반 종양 요법의 심각한 부작용을 초래할 수 있기 때문이다.
본 발명의 맥락에서, 항원 결합 수용체는 T 세포에서 또는 상에서 자연적으로 발생하지 않는 세포외 도메인을 포함한다. 따라서, 항원 결합 수용체는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 세포에 대한 맞춤 결합 특이성을 제공할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 수용체(들)로 형질도입된 세포, 예를 들어 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있게 되지만 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에는 특이적 결합을 할 수 있게 되지 않는다. 특이성은 항원 결합 수용체의 세포외 도메인의 항원 결합 모이어티에 의해 제공되며, 그러한 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적인 것으로 여겨진다. 본 발명의 맥락에서 본원에서 설명되는 바와 같이, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 결합/그와 상호작용하지만, 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 결합/그와 상호작용하지 않는다.
항원 결합 모이어티
본 발명의 예시적 실시형태에서, 개념의 증거로서, 앵커링 경막 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체가 제공되며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 적어도 하나는 종래의 Fab 단편, 즉, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄로 이루어지는 Fab 분자이다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 적어도 하나는 crossFab 단편, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되어 있는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄로 이루어지는 Fab 분자이다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 적어도 하나는 scFv 단편이다. 특정 그러한 실시형태에서, 가변 중쇄 (VH) 의 C-말단은 scFv 분자 내의 가변 경쇄 (VL) 의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 적어도 하나는 단일-사슬 Fab 분자, 즉, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 특정 그러한 실시형태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일-사슬 Fab 분자 내의 Fab 중쇄의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결된다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티는 예를 들어 포유동물 면역계의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 그러한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 Burns in Methods in Molecular Biology 295:1-12 (2005) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 본 발명의 항원 결합 모이어티는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리의 스크리닝을 통해 단리될 수 있다. 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위한 방법은 예를 들어, [Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)] 에서 고찰된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 바람직한 결합 특성을 보유하는 항원 결합 모이어티에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 기술분야에 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들어 [Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016)]; [Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)] 및 [Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)] 뿐만 아니라 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)] 에 고찰되어 있고, 예를 들어 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)] 및 [Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 에 더욱 기술되어 있다. 일정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 개별적으로 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 통해 클로닝되어 파지 라이브러리로 무작위로 조합되고, [Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)] 에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-사슬 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서, 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원 유래의 라이브러리는 하이브리도마 제작 요구없이 면역원에 대해 고친화도 항원 결합 모이어티를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레파토리를 (예를 들어, 인간 유래) 클로닝하고 [Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)] 에 기술된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비자기 및 또한 자기 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한 [Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)] 에 기술된 바와 같이, 고도의 가변성 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관 내에서 재배열을 수행하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하고, 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 절편을 클로닝하여 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 공개 특허는 에를 들어, 미국 특허 제5,750,373호; 제7,985,840호; 제7,785,903호 및 제8,679,490호 뿐만 아니라 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936 및 2009/0002360 을 포함한다. 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위해 당해 기술분야에 알려진 방법의 추가 예는 리보솜 및 mRNA 디스플레이를 비롯하여, 박테리아, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포 상에허 항체 디스플레이 및 선택을 위한 방법을 포함한다. 효모 표면 디스플레이를 위한 방법은 예를 들어, [Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)] 및 [Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)] 뿐만 아니라 [Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)] 에 고찰되어 있다. 리보솜 디스플레이를 위한 방법은 예를 들어, [He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)] 및 [Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)] 에 기술되어 있다.
본 발명의 맥락에서, 본원에서 제공되는 것은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체이다. 따라서, 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 세포, 즉, T 세포는 항체, 즉, 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있다. Fc 도메인은 항체, 즉, 치료적 항체에게, 표적 조직에서의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 특성을 제공한다. 동시에 그것은, 그러나, 바람직한 항원-보유 세포로 보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로 치료적 항체의 바람직하지 않은 표적화를 초래할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 동시-활성화는 사이토카인 방출을 초래할 수 있으며, 이는 치료적 항체의 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과잉 활성화 및 심각한 부작용을 초래한다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는 심지어는 면역 세포의 잠재적 파괴로 인해 치료적 항체의 효능을 감소시킬 수 있다. 따라서, 당해 기술 분야에 알려진 치료적 항체는, 예를 들어, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 이펙터 기능을 나타내도록 조작 또는 돌연변이될 수 있다. 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 사용하여 시험관내에서 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 발현하는 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포를 표적화하고/하거나 생체내에서 표적 세포에 특이적 결합을 할 수 있는 항체로 표지된 표적 세포, 즉, 종양 세포를 표적화할 수 있으며, 여기에서 항체는 본원에 기재된 바와 같은 조작된 및/또는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명의 예시적 실시형태에서, 개념의 증거로서, 제공되는 것은 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체 및 상기 항원 결합 수용체를 발현하는 이펙터 세포이다. P329G 돌연변이는 Fcγ 수용체에 대한 결합 및 관련된 이펙터 기능을 감소시킨다. 따라서, P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 또는 상실된 친화도로 Fcγ 수용체에 결합한다. 본 발명의 대안적 예시적 실시형태에서, 개념의 증거로서 제공되는 것은 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체이다. AAA 돌연변이는 FcRn 에 대한 결합을 본질적으로 없앤다.
그러나, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 Fc 수용체 (FcR) 에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능이 감소된, 개선된 또는 약화된 항체가 당해 기술분야에서 널리 사용된다. 따라서, 본원에서 제공되는 것은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체이며, 그러한 항체는 본원에서 또한 표적 항체로서 언급된다. 따라서, 하나의 실시형태에서 본 발명의 항원 결합 수용체는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 이펙터 기능으로 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 표적 항체에 특이적 결합을 할 수 있다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 표적 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 포함한다 (미국 특허 No. 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서 돌연변이를 포함하는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 No. 7,332,581). FcR 에 대한 결합이 개선된 또는 약화된 특정 항체 변이체가 기재되어 있다 (참고, 예를 들어, 미국 특허 No. 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)). 특정 실시형태에서, ADCC 을 개선하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 번호매김) 에서의 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항체 돌연변이체에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 FcRn 결합을 감소 또는 약화시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, Fc 영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 번호매김) 에서의 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 위치 253, 310 및 435 에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서 돌연변이는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A 이다. 참고, 예를 들어, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.
특정 실시형태에서, FcRn 결합을 감소 또는 약화시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, Fc 영역의 위치 310 및/또는, 433 및/또는 436 (잔기의 EU 번호매김) 중 하나에서 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항체 돌연변이체에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 위치 310, 433 및 436 에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서 돌연변이는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서의 H310A, H433A 및 Y436A 이다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, Fc 영역의 위치 252 및/또는, 254 및/또는 256 (잔기의 EU 번호매김) 에서 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 위치 252, 254, 및 256 에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서 돌연변이는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서의 M252Y, S254T 및 T256E 이다. 특정 실시형태에서, FcγR 결합을 약화시키는 아미노산 돌연변이, 예를 들어, Fc 영역의 위치 234, 235 및 329 (잔기의 EU 번호매김) 에서 돌연변이를 포함하는 Fc 영역을 포함하는 항체 돌연변이체에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체가 제공된다. 하나의 실시형태에서 돌연변이는 L234A 및 L235A (LALA) 이다. 특정 실시형태에서, 표적 항체 돌연변이체는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서 D265A 및/또는 P329G 를 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서 돌연변이는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서의 P329G ("PG") 이다. 또다른 실시형태에서, 돌연변이는 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 이다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 안정적 연합을 할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 구성되는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인이다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 하나의 실시형태에서 돌연변이된 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인 과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 이펙터 기능을 나타낸다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 L234, L235, 및 P329 (카밧 번호매김) 의 군으로부터 선택되는 하나 이상 위치에 있다. 하나의 특정 실시형태에서 Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 세 개의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 상기 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A 및 P329G 이다. 하나의 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시형태에서 이펙터 기능은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 이다.
특정 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 P329G 돌연변이를 포함한다. 따라서, P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 또는 상실된 친화도로 Fcγ 수용체에 결합한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
(a)
RYWMN (SEQ ID NO:1) 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열;
(b)
EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2) 의 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c)
PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3) 의 CDR H3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d)
RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4) 의 경쇄 (CDR L) 1 아미노산 서열;
(e)
GTNKRAP (SEQ ID NO:5) 의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f)
ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6) 의 CDR L3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6 의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a)
RYWMN (SEQ ID NO:1) 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열;
(b)
EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2) 의 CDR H2 아미노산 서열;
(c)
PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3) 의 CDR H3 아미노산 서열;
및 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d)
RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4) 의 경쇄 (CDR L) 1 아미노산 서열;
(e)
GTNKRAP (SEQ ID NO:5) 의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f)
ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6) 의 CDR L3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:32 로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:33 로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:32 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:33 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:33 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:9 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다. 하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다.
바람직한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, Fab 단편은 SEQ ID NO:40 의 중쇄 및 SEQ ID NO:41 의 경쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 링커로 이루어지는 폴리펩티드인 scFv 단편이며, 상기 가변 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 구성 중 하나를 갖는다: a) VH-링커-VL 또는 b) VL-링커-VH. 바람직한 실시형태에서, scFv 단편은 구성 VH-링커-VL 을 갖는다.
바람직한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, scFv 단편은 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열을 포함한다.
대안적 특정 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인은 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함한다. AAA 돌연변이는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합을 감소시킨다. 따라서, AAA 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 또는 상실된 친화도로 FcRn 에 결합한다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
(a)
SYGMS (SEQ ID NO:53) 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열;
(b)
SSGGSY (SEQ ID NO:54) 의 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c)
LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55) 의 CDR H3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d)
RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56) 의 경쇄 (CDR L) 1 아미노산 서열;
(e)
KVSNRFS (SEQ ID NO:57) 의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f)
FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58) 의 CDR L3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:55 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:58 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:55 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:58 의 경쇄 CDR 을 포함한다.
바람직한 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a)
SYGMS (SEQ ID NO:53) 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열;
(b)
SSGGSY (SEQ ID NO:54) 의 CDR H2 아미노산 서열;
(c)
LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55) 의 CDR H3 아미노산 서열;
및 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d)
RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56) 의 경쇄 (CDR L) 1 아미노산 서열;
(e)
KVSNRFS (SEQ ID NO:57) 의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f)
FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58) 의 CDR L3 아미노산 서열.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:61 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:62 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:61 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:62 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab, crossFab 또는 scFab 단편이다. 하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다. 특정 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, Fab 단편은 SEQ ID NO:64 의 중쇄 및 SEQ ID NO:65 의 경쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이다. 특정 실시형태에서 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하며, scFv 단편은 SEQ ID NO:60 의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 추가의 실시형태에서 세포외 도메인에 포함되는 항원 결합 모이어티는 단일 사슬 Fab 단편 또는 scFab 이다.
Fab 및 scFab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다. 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 항원 결합 모이어티, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 Fab, crossFab, scFv 및 scFab 단편은 VH 및 VL 도메인 사이에 사슬간 다이설파이드 브릿지를 도입함으로써 추가로 안정화될 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 항원 결합 수용체에 포함되는 Fab 단편(들), crossFab 단편(들), scFv 단편(들) 및/또는 scFab 단편(들)은 시스테인 잔기의 삽입 (예를 들어, 카밧 번호매김에 따른 가변 중쇄에서의 위치 44 및 가변 경쇄에서의 위치 100) 을 통해 사슬간 다이설파이드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 그러한 안정화된 항원 결합 모이어티는 첨부된 실시예 및 도면에서 용어 "ds" 로 언급된다.
앵커링 경막 도메인
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 포유동물 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 프로테아제는 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 경막 도메인의 아미노산 서열을 가수분해할 수 있는 단백질가수분해 효소를 의미한다. 이 용어 프로테아제는 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 특히 CD-명명법에 의해 정해진 경막 단백질의 임의의 앵커링 경막 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인에 결합시 T 세포, 바람직하게 CD8+ T 세포를 활성화시키는, 본 발명의 항원 결합 수용체를 생성시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 앵커링 경막 도메인은 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 경막 도메인의 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 앵커링 경막 도메인에 대한 예는 예를 들어, SEQ ID NO:11 로 본원에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CD28 의 경막 도메인이다 (SEQ ID NO:24 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨). 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 경막 도메인은 SEQ ID NO:11 에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고/그로 이루어질 수 있다 (SEQ ID NO:24 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨).
본 발명의 예시적인 실시형태에서, 개념의 증거로서, SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:22 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 을 포함하는 항원 결합 모이어티, 및 SEQ ID NO:71 (SEQ ID NO:70 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 로서 본원에서 표시된 CD28 의 단편/폴리펩티드 (인간 CD28 의 Uniprot 등재 번호는 P10747 임 (서열의 버전 번호 173 및 버전 1)) 부분을 포함하는 항원 결합 수용체가 제공된다. 대안적으로, 특히 CD 명명법으로 제공되는, 경막 도메인을 갖는 임의의 단백질은 본 발명의 항원 결합 수용체 단백질의 앵커링 경막 도메인으로서 사용될 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:71 에 표시된 인간 전장 CD28 (SEQ ID NO:70 에 표시된 cDNA 에 의해 인코딩됨) 의 아미노산 153 내지 179, 154 내지 179, 155 내지 179, 156 내지 179, 157 내지 179, 158 내지 179, 159 내지 179, 160 내지 179, 161 내지 179, 162 내지 179, 163 내지 179, 164 내지 179, 165 내지 179, 166 내지 179, 167 내지 179, 168 내지 179, 169 내지 179, 170 내지 179, 171 내지 179, 172 내지 179, 173 내지 179, 174 내지 179, 175 내지 179, 176 내지 179, 177 내지 179 또는 178 내지 179 에 위치된 CD28 의 앵커링 경막 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:11 에 표시된 바와 같은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:24 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
(a)
C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:64 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b)
SEQ ID NO:65 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
(a)
C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:40 및 SEQ ID NO:49 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b)
SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:50 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
(a)
C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:40 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b)
SEQ ID NO:41 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
하나의 바람직한 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함한다:
(a)
C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:49 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b)
SEQ ID NO:50 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:60 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:34 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 바람직한 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서 제공되는 것은 앵커링 경막 도메인 및 P329G 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFab 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체이며, scFv 단편은 C-말단에서 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커를 통해, 융합된 SEQ ID NO:34 의 아미노산 서열을 포함한다.
자극성 신호전달 도메인 (SSD) 및 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD)
바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 바람직하게 T 세포 활성화를 제공하는, 자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 쥐과/마우스 또는 인간 CD3z (인간 CD3z 의 UniProt 등재 번호는 P20963 (서열번호 2 를 갖는 버전 번호 177; 쥐과/마우스 CD3z 의 UniProt 등재 번호는 P24161 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9D3G3 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 143 및 서열 번호 1 을 가짐) 임), Fcgr3A (인간 FCGR3A 의 UniProt 등재번호는 P08637 (서열번호 2 를 갖는 버전 번호 178) 임), 또는 NKG2D (인간 NKG2D 의 UniProt 등재 번호는 P26718 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 151) 임; 쥐과/마우스 NKG2D 의 UniProt 등재 번호는 O54709 (서열번호 2 를 갖는 버전 번호 132) 임) 의 단편/폴리펩티드 단편인 자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체에 포함되는 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, Fcgr3A 또는 NKG2D 의 전장의 폴리펩티드 부분/단편일 수 있다. CD3z, 또는 NKG2D 의 쥐과/마우스 전장의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NOs: 96 (CD3z), 100 (Fcgr3A) 또는 104 (NKG2D) (SEQ ID NOs:97 (CD3z), 101 (FCGR3A) 또는 105 (NKG2D) 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 쥐과/마우스) 로서 표시된다. 인간 전장 CD3z, Fcgr3A 또는 NKG2D 의 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:94 (CD3z), 98 (FCGR3A) 또는 102 (NKG2D) (SEQ ID NOs:95 (CD3z), 99 (FCGR3A) 또는 103 (NKG2D) 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 인간) 로서 본원에서 표시된다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 자극성 도메인으로서 CD3z, Fcgr3A 또는 NKG2D 의 단편을 포함할 수 있고, 단 적어도 하나의 신호전달 도메인이 포함된다. 특히, CD3z, Fcgr3A, 또는 NKG2D 의 임의의 부분/단편은 적어도 하나의 신호전달 모티브가 포함되는 한 자극성 도메인으로서 적합하다. 그러나, 더 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 더욱 바람직하게는, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 SEQ ID NOs:94 (CD3z), 98 (FCGR3A) 또는 102 (NKG2D) (SEQ ID NOs:95 (CD3z), 99 (FCGR3A) 또는 103 (NKG2D) 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 인간) 로서 본원에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함될 수 있는 인간 CD3z 의 단편/폴리펩티드 부분은 SEQ ID NO:13 (SEQ ID NO:26 에 표시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어진다. 따라서, 하나의 실시형태에서 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 활성을 갖는 것을 특징으로 하고 SEQ ID NO:13 에 표시된 바와 같은 서열 또는 SEQ ID NO:13 과 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 서열을 포함한다. 자극성 신호전달 도메인 (SSD) 을 포함하는 항원 결합 수용체의 특별한 입체구성이 하기 및 실시예 및 도면에 제공된다. 자극성 신호전달 활성은 예를 들어, ELISA (IL-2, IFNγ, TNFα)로 측정되는 증강된 사이토카인 방출, 증강된 증식 활성 (증강된 세포수로 측정), 또는 LDH 방출 어세이로 측정시 증강된 용해 활성으로 결정될 수 있다.
게다가, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 바람직하게 T 세포에 대해 추가의 활성을 제공하는 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 쥐과/마우스 또는 인간 CD28 (인간 CD28 의 UniProt 등재 번호는 P10747 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 173) 이고; 쥐과/마우스 CD28 의 UniProt 등재 번호는 P31041 (서열번호 2 를 갖는 버전 번호 134) 임), CD137 (인간 CD137 의 UniProt 등재 번호는 Q07011 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 145) 이고; 쥐과/마우스 CD137 의 UniProt 등재 번호는 P20334 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 139) 임), OX40 (인간 OX40 의 UniProt 등재 번호는 P23510 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 138) 이고; 쥐과/마우스 OX40 의 UniProt 등재 번호는 P43488 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 119) 임), ICOS (인간 ICOS 의 UniProt 등재 번호는 Q9Y6W8 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 126) 임); 쥐과/마우스 ICOS 는 Q9WV40 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9JL17 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 102 및 서열 버전 2) 임), CD27 (인간 CD27 의 UniProt 등재 번호는 P26842 (서열번호 2 를 갖는 버전 번호 160) 임); 쥐과/마우스 CD27 의 UniProt 등재 번호는 P41272 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 137) 임), 4-1-BB (쥐과/마우스 4-1-BB 의 UniProt 등재 번호는 P20334 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 140) 이고; 인간 4-1-BB 의 UniProt 등재 번호는 Q07011 (서열 버전을 갖는 버전 번호 146) 임), DAP10 (인간 DAP10 은 Q9UBJ5 (서열번호 1 을 갖는 버전 번호 25) 이고; 쥐과/마우스 DAP10 의 UniProt 등재 번호는 Q9QUJ0 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9R1E7 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 101 및 서열 번호 1) 임) 또는 DAP12 (인간 DAP12 의 UniProt 등재 번호는 O43914 (버전 번호 146 및 서열번호 1) 이고; 쥐과/마우스 DAP12 의 UniProt 등재 번호는 O054885 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q9R1E7 (2차 인용가능 수탁 번호) (버전 번호 123 및 서열번호 1) 임) 의 폴리펩티드 부분/단편인 보조자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 하나 이상의, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 본원에 정의된 바와 같은 보조자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 제1 보조자극성 신호전달 도메인으로서 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 CD28 의 폴리펩티드 부분/단편을 포함할 수 있고 제2 보조자극성 신호전달 도메인은 쥐과/마우스 또는 바람직하게 인간 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12, 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 보조자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 더 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함된 보조자극성 신호전달 도메인(들)은 SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO:25 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 항원 결합 수용체에 임의로 포함될 수 있는 보조자극성 신호전달 도메인은 전장 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 폴리펩티드 부분/단편이다. 쥐과/마우스 전장 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, CD27, DAP10 또는 DAP12 의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NOs:69 (CD27), 73 (CD28), 77 (CD137), 81 (OX40), 85 (ICOS), 89 (DAP10) 또는 93 (DAP12) (SEQ ID NOs:68 (CD27), 72 (CD28), 76 (CD137), 80 (OX40), 84 (ICOS), 88 (DAP10) 또는 92 (DAP12) 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 쥐과/마우스) 로 제시된다. 그러나, 인간 서열이 본 발명의 맥락에서 가장 바람직하기 때문에, 본원에 제공되는 항원 결합 수용체 단백질에 임의로 포함될 수 있는 보조자극성 신호전달 도메인은 인간 전장 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 의 폴리펩티드 부분/단편이다. 인간 전장 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NOs: 67(CD27), 71 (CD28), 75 (CD137), 79 (OX40), 83 (ICOS), 87 (DAP10) 또는 91 (DAP12) (SEQ ID NOs: 66 (CD27), 70 (CD28), 74 (CD137), 78 (OX40), 82 (ICOS), 86 (DAP10) 또는 90 (DAP12) 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 인간) 로서 제시된다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인로서 CD28 또는 이의 단편을 포함한다. 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인으로서 CD28 의 단편을 포함할 수 있고, 단 CD28 의 적어도 하나의 신호전달 도메인이 포함된다. 특히, CD28 의 임의의 부분/단편은 CD28 의 적어도 하나의 신호전달 모티브가 포함되는 한 본 발명의 항원 결합 수용체에 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체 단백질에 포함되는 CD28 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO:25 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 본 발명에서, 보조자극성 신호전달 도메인으로서 기능하는 CD28 의 세포내 도메인은 서열(들) YMNM (SEQ ID NO:106) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:107) 을 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항원 결합 수용체는 인간 기원으로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체에 포함될 수 있는 인간 CD28 의 폴리펩티드 부분/단편은 SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO:25 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 에 표시된 아미노산을 포함할 수 있고 또는 그로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 활성을 갖는 것을 특징으로 하고, SEQ ID NO:12 에 제시된 서열 또는 SEQ ID NO:12와 비교하여 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 서열을 포함한다. 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 을 포함하는 항원 결합 수용체의 특별한 입체구조는 하기 및 실시예 및 도면에 제공된다. 보조자극성 신호전달 활성은 ELISA에 측정시 증가된 사이토카인 방출 (IL-2, IFNγ, TNFα), 증강된 증식 활성 (증강된 세포수로 측정), 또는 LDH 방출 어세이로 측정시 증강된 용해 활성을 통해 결정될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 인간 CD28 유전자 (Uni Prot 등재 번호: P10747 (등재 버전: 173 의 수탁 번호 및 서열의 버전 1)) 로부터 유래될 수 있고 형질도입된 T 세포처럼, 본원에 기술된 형질도입된 세포의 사이토카인 생성, 증식 및 용해 활성으로서 정의되는, CD28 활성을 제공한다. CD28 활성은 사이토카인 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 인터루킨 2 (IL-2) 의 ELISA 또는 유세포측정에 의한 사이토카인의 방출, 예를 들어 ki67-측정에 의해 측정된 T 세포의 증식, 유세포측정에 의한 세포 정량, 또는 표적 세포의 실시간 임피던스 측정으로 평가되는 용해 활성으로 측정될 수 있다 (예를 들어, [Thakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506]; [Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202]; [Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296]; [Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988]; Duwell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837], [Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161] 에 기술된 바와 같은 예를 들어 ICELLligence 장비를 사용함). 보조자극성 신호전달 도메인 PYAP (SEQ ID NO:107 의 AA 208 내지 211 및 YMNM (SEQ ID NO:106 의 AA 191 내지 194) 는 상기에 열거된 CD28 폴리펩티드의 기능 및 기능적 효과에 유리하다. YMNM 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:106 에 표시되어 있고; PYAP 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:107 에 제시되어 있다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 수용체에서, CD28 폴리펩티드는 바람직하게 서열 YMNM (SEQ ID NO:106) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:107) 을 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 서열 YMNM (SEQ ID NO:106) 및/또는 PYAP (SEQ ID NO:107) 를 갖는 CD28 폴리펩티드의 세포내 도메인은 예를 들어, 형질도입된 T 세포와 같이, 본원에 기술된 형질도입된 세포의 사이토카인 생성, 증식 및 용해 활성으로서 정의된, CD28 활성을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열 (인간) (SEQ ID NO:25 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 을 갖는다. 그러나, 본 발명의 항원 결합 수용체에서, 이들 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 각각 FMNM (SEQ ID NO:108) 및/또는 AYAA (SEQ ID NO:109) 로 돌연변이될 수 있다. 이들 돌연변이 중 하나는 증식하는 능력에 영향없이 사이토카인을 방출하는 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 세포의 능력을 감소시키고, 유리하게 생존능 및 따라서 형질도입된 세포의 치료적 잠재성을 연장시키는데 사용될 수 있다. 또는, 달리 말해서, 이러한 비기능적 돌연변이는 바람직하게 생체내에서 본원에 제공된 항원 결합 수용체가 형질도입된 세포의 지속성을 증강시킨다. 그러나 이들 신호전달 모티브는 본원에 제공된 항원 결합 수용체의 세포내 도메인 내 임의 부위에 존재할 수 있다.
링커 및 신호 펩티드
더욱이, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 링커 (또는 "스페이서") 를 포함할 수 있다. 링커는 일반적으로 최대 20 개 아미노산 길이를 갖는 펩티드이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 신호전달 도메인 사이에 링커를 포함할 수 있다. 그러한 링커는 그들이 항원 결합 수용체의 상이한 폴리펩티드 (즉, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 신호전달 도메인) 가 독립적으로 폴딩되고 예상되로 거동되는 가능성을 증가시키는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 포유동물 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖지 않는 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인은 단일-사슬 다기능성 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 단일 사슬 융합 구성체는 예를 들어 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인(들), 앵커링 경막 도메인(들), 보조자극성 신호전달 도메인(들) 및/또는 자극성 신호전달 도메인(들)을 포함하는 폴리펩티드(들)로 이루어질 수 있다. 대안적 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 단일 사슬 융합 구성체가 아닌 항원 결합 모이어티를 포함하고, 즉 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 단편이다. 그러한 실시형태에서 항원 결합 수용체는 오직 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단일 사슬 융합 구성체가 아니다. 바람직하게는 이러한 구성체는 본원에 기술된 바와 같이 면역글로불린 경쇄와 조합된 단일 사슬 중쇄 융합 폴리펩티드를 포함하게 되며, 예를 들어, 중쇄 융합 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄(들), 앵커링 경막 도메인(들), 보조자극성 신호전달 도메인(들) 및/또는 자극성 신호전달 도메인(들)을 포함하고, 면역글로불린 경쇄(들)과 조합된다. 따라서, 항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 동일하거나 또는 상이한 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체에서 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인과 앵커링 경막 도메인 사이의 링커는 SEQ ID NO:17 에 표시된 아미노 및 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 따라서, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및/또는 자극성 도메인은 펩티드 링커에 의해서 또는 대안적으로 도메인의 직접 융합에 의해서 서로 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 일부 실시형태에서 세포외 도메인에 포함되는 항원 결합 모이어티는 10 개 내지 약 25 개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된, 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 의 가변 영역의 융합 단백질인 단일-사슬 가변 단편 (scFv) 이다. 링커는 일반적으로 유연성을 위해 글리신을 비롯하여, 가용성의 경우 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 연결할 수 있거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체에서 링커는 SEQ ID NO:16 에서 제시되는 아미노 및 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 scFv 항원 결합 모이어티는 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 항체 특이성을 유지한다. scFv 항체는, 예를 들어 Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96) 에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 세포외 도메인에 포함된 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 단일 사슬 Fab 단편 또는 scFab이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서 중 하나를 갖고: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL, 상기 링커는 적어도 30 개 아미노산, 바람직하게는 32 개 내지 50 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이의 천연 다이설파이드 결합을 통해 안정화된다.
본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 세포외 도메인에 포함된 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드인 크로스오버 단일 사슬 Fab 단편이고, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기의 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL; 여기서 VH 및 VL은 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함께 형성하고, 상기 링커는 적어도 30 개 아미노산의 폴리펩티드이다.
본원에서 제공되는 항원 결합 수용체 또는 이의 일부분은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 T 세포막의 표면으로 단백질을 보낼 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항원 결합 수용체에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO:110 (SEQ ID NO:111 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨) 에 제시된 바와 같은 아미노 및 아미노산 서열을 가질 수 있다.
돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 T 세포 활성화 항원 결합 수용체
본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체의 성분은 항원 결합 수용체를 활성화시키는 T 세포를 생성시키기 위해 다양한 입체구성으로 서로 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인에 연결된, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL) 으로 구성된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 도메인은 임의로 펩티드 링커를 통해서, VL 도메인의 N-말단과 C-말단에 융합된다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인 및/또는 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 특별한 이러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 및 임의로 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되며, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 임의로, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 특정한 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 자극성 신호전달 도메인 및 보조자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되며, 여기서 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 대안적인 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 자극성 신호전달 도메인 대신에 앵커링 경막 도메인에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, 여기서 VH 도메인은 C-말단에서 VL 도메인의 N-말단과 융합되고, VL 도메인은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다.
바람직한 실시형태에서, 결합 모이어티 중 하나는 Fab 단편 또는 crossFab 단편이다. 바람직한 하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과, 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 대안적인 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과, 임의로 펩티드 링커를 통해서 융합된다. 다른 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인 및/또는 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 특별한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 연결된 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 및 임의로 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직하게, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 연결된 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 자극성 신호전달 도메인 및 보조자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합되고, 자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 자극성 신호전달 도메인 대신에 앵커링 경막 도메인에 연결된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 Fab 또는 crossFab 단편, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인 및 자극성 신호전달 도메인으로 본질적으로 이루어지고, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 펩티드 링커를 통해 융합되고, 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합되고, 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단과 융합된다.
항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인 및 자극성 신호전달 및/또는 보조자극성 신호전달 도메인은 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20 개 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해서 또는 직접적으로 서로 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당해 기술분야에 알려져 있고 본원에 기재되어 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 "n" 은 일반적으로 1 내지 10 의 수, 전형적으로 2 내지 4이다. 항원 결합 모이어티 및 앵커링 경막 모이어티를 연결시키기 위해 바람직한 펩티드 링커는 SEQ ID NO:17 에 따른 GGGGS (G4S) 이다. 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 를 연결시키는데 적합한 예시적인 펩티드 링커는 SEQ ID NO:16 에 따라 GGGSGGGSGGGSGGGS (G4S)4 이다.
부가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역 (의 일부분) 을 포함할 수 있다. 특히 항원 결합 모이어티가 앵커링 경막 도메인의 N-말단과 융합된 경우에, 추가적인 펩티드 링커와 함께 또는 없이, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부분을 통해서 융합될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항원 결합 수용체는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는 항원 결합 수용체는 특히 항원 결합 수용체의 높은 발현을 필요로 하는 경우에, 유용하고 바람직하다. 이러한 경우에서, 표적 세포 항원에 특이적인 하나를 초과하는 항원 결합 모이어티의 존재는 항원 결합 수용체의 발현 효율을 제한할 수 있다. 그러나, 다른 경우에서, 예를 들어 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 또는 표적 세포 항원의 가교를 가능하게 하기 위해서, 표적 세포 항원에 특이적인 2 개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체를 갖는 것이 유리할 것이다.
하나의 특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인, 특히 IgG1 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 하나의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab 또는 crossFab 이다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편의 C-말단에서 또는 Fab 또는 crossFab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 하나의 실시형태에서 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:16) 을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:11) 의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:12) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:13) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 리포터 단백질에, 특히 GFP 또는 그의 증강된 유사체에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (증간된 녹색 형광 단백질) 의 N-말단에, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:18 에 따른 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) 이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 단편이며, 돌연변이된 Fc 도메인은 P329G 돌연변이를 포함한다. P329G 돌연변이는 Fcγ 수용체 결합을 감소시킨다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD) 을 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 scFv-ATD-CSD-SSD 을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 scFv-G4S-ATD-CSD-SSD 을 가지며, 여기에서 G4S 는 SEQ ID NO:17 의 서열 GGGGS 를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질이 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 부가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편이며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR 을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편이며, 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 단편은 SEQ ID NO:1 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3 의 중쇄 CDR 3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:4 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH) 을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:32 로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:33 로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 는 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:8 및 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:9 을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:34 의 아미노산 서열을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:31 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:31 의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:11) 이다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:12) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:13) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 리포터 단백질에, 특히 GFP 또는 그의 증강된 유사체에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (증간된 녹색 형광 단백질) 의 N-말단에, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:18 의 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) 이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 돌연변이된 Fc 도메인은 P329G 돌연변이를 포함하며, P329G 돌연변이는 Fcγ 수용체 결합을 감소시킨다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD) 을 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 Fab-ATD-CSD-SSD 을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 Fab-G4S-ATD-CSD-SSD 을 가지며, 여기에서 G4S 는 SEQ ID NO:17 의 서열 GGGGS 를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질이 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 부가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR 을 포함하는 Fab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN (SEQ ID NO:1), CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2), CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4), CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP (SEQ ID NO:5) 및 CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) SEQ ID NO:1 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3 의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:4 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는, P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
하나의 실시형태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
a) N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드;
(i) SEQ ID NO:1 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:2 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:3 의 중쇄 CDR 3 을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인 및
b) SEQ ID NO:4 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:5 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:6 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는 경쇄.
하나의 실시형태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
a) N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드;
(i) 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:8;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인 및
b) SEQ ID NO:9 의 경쇄 가변 도메인 (VL).
하나의 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:40 또는 SEQ ID NO:49 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 중쇄, 및 SEQ ID NO:41 또는 SEQ ID NO:50 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fab 단편이다. 바람직한 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:40 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO:41 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fab 단편이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:48 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:50 의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:41 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
대안적 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인, 특히 IgG1 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 하나의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab 또는 crossFab 이다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편의 C-말단에서 또는 Fab 또는 crossFab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 하나의 실시형태에서 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:16) 을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:11) 의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:12) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:13) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 리포터 단백질에, 특히 GFP 또는 그의 증강된 유사체에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (증간된 녹색
형광 단백질) 의 N-말단에, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:18 에 따른 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) 이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 단편이며, 돌연변이된 Fc 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함한다. I253A, H310A 및 H435A 돌연변이는 FcRn 수용체 결합을 감소시킨다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD) 을 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 scFv-ATD-CSD-SSD 을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 scFv-G4S-ATD-CSD-SSD 을 가지며, 여기에서 G4S 는 SEQ ID NO:17 의 서열 GGGGS 를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질이 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 부가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편이며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:55 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 CDR SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편이며, 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS (SEQ ID NO:53), CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY (SEQ ID NO:54), CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56), CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO:57) 및 CDR L3 아미노산 서열 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 단편인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 단편은 SEQ ID NO:53 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:54 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:55 의 중쇄 CDR 3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:56 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:57 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:58 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH) 을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 는 SEQ ID NO:61 의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 SEQ ID NO:62 의 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 scFv 분자인 항원 결합 모이어티, 여기에서 scFv 은 SEQ ID NO:60 의 아미노산 서열을 포함함;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편이다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 앵커링 경막 도메인은 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:11) 이다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 앵커링 경막 도메인은 C-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 본원에서 이전에 기재된 바와 같은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:12) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체의 보조자극성 신호전달 도메인은 C-말단에서 자극성 신호전달 도메인의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 보조자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서 보조자극성 신호전달 도메인은 서열: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:13) 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 리포터 단백질에, 특히 GFP 또는 그의 증강된 유사체에 융합된다. 하나의 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 C-말단에서 eGFP (증간된 녹색 형광 단백질) 의 N-말단에, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커를 통해, 융합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 링커는 SEQ ID NO:18 의 GEGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A) 이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 돌연변이된 Fc 도메인은 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하며, I253A, H310A 및 H435A 돌연변이는 FcRn 수용체 결합을 감소시킨다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체는 앵커링 경막 도메인 (ATD), 보조자극성 신호전달 도메인 (CSD) 및 자극성 신호전달 도메인 (SSD) 을 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 Fab-ATD-CSD-SSD 을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 항원 결합 수용체는 구성 Fab-G4S-ATD-CSD-SSD 을 가지며, 여기에서 G4S 는 SEQ ID NO:17 의 서열 GGGGS 를 포함하는 링커이다. 임의로, 리포터 단백질이 항원 결합 수용체의 C-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 부가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:55 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경쇄 CDR 을 포함하는 Fab 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 모이어티는 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS (SEQ ID NO:53), CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY (SEQ ID NO:54), CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55), 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56), CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO:57) 및 CDR L3 아미노산 서열 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58) 을 포함한다.
하나의 실시형태에서 본 발명은 N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
(i) SEQ ID NO:53 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:54 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:55 의 중쇄 CDR 3, SEQ ID NO:56 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:57 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:58 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는, I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 분자인 항원 결합 모이어티;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인.
하나의 실시형태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
a) N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드;
(i) SEQ ID NO:53 의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 1, SEQ ID NO:54 의 중쇄 CDR 2, SEQ ID NO:55 의 중쇄 CDR 3 을 포함하는 중쇄;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인 및
b) SEQ ID NO:56 의 경쇄 CDR 1, SEQ ID NO:57 의 경쇄 CDR 2 및 SEQ ID NO:58 의 경쇄 CDR 3 을 포함하는 경쇄.
하나의 실시형태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 수용체를 제공한다:
a) N-말단으로부터 C-말단으로 순서대로 하기를 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드;
(i) 중쇄 가변 도메인 (VH) SEQ ID NO:61;
(ii) 펩티드 링커, 특히 SEQ ID NO:17 의 펩티드 링커;
(iii) 앵커링 경막 도메인, 특히 SEQ ID NO:11 의 앵커링 경막 도메인;
(iii) 보조자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:12 의 보조자극성 신호전달 도메인; 및
(iv) 자극성 신호전달 도메인, 특히 SEQ ID NO:13 의 자극성 신호전달 도메인 및
b) 경쇄 가변 도메인 (VL) SEQ ID NO:62.
하나의 특정 실시형태에서 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:64 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO:65 의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 경쇄를 포함하는 Fab 단편이다.
특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:63 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:65 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:63 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 융합체 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:65 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
특정 대안적 실시형태에서, 본 발명의 항원 결합 수용체, Fab 경쇄 폴리펩티드 및 Fab 중쇄 융합체 폴리펩티드는, 임의로 링커 펩티드를 통해, 서로와 융합된다. Fab 중쇄 및 경쇄의 융합체는 Fab 중쇄 및 경쇄의 짝짓기를 개선할 수 있고, 또한 본 발명의 항원 결합 수용체 중 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킬 수 있다. 항원 결합 수용체의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위한 대안적 전략은 예를 들어 도 2 에 도시된 바와 같이 동일한 플라스미드로부터의 중쇄 및 경쇄 구성체 둘 모두의 발현을 가능하게 하는 내부 리보솜 진입부를 사용하는 것이다.
특정 실시형태에서 항원 결합 수용체는 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고 (즉, 항원 결합 모이어티는 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체되어 있는 crossFab 중쇄를 포함함), 이는 결국 앵커링 경막 도메인과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다 (VL(1)-CH1(1)-ATD). 일부 실시형태에서 항원 결합 수용체는 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제 1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다 (VH(1)-CL(1)). 특정 실시형태에서 폴리펩티드는, 예를 들어, 다이설파이드 결합에 의해 공유 연결된다. 대안적 실시형태에서 항원 결합 수용체는 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고 (즉, 항원 결합 모이어티는 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체되어 있는 crossFab 중쇄를 포함함), 이는 결국 앵커링 경막 도메인과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다 (VH(1)-CL(1)-ATD). 일부 실시형태에서 항원 결합 수용체는 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다 (VL(1)-CH1(1)). 특정 실시형태에서 폴리펩티드는, 예를 들어, 다이설파이드 결합에 의해 공유 연결된다.
임의의 상기 실시형태에 따르면, 항원 결합 수용체의 성분 (예를 들어, VH 및 VL, 항원 결합 모이어티, 앵커링 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인, 자극성 신호전달 도메인) 은 직접 또는 본원에서 기재되거나 또는 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로는 약 2-20 개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는, 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하며, 여기에서 n 은 일반적으로 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 4 의 수이다.
예시적 T 세포 활성화 항원 결합 수용체
첨부된 실시예에서 및 도 1A 에서 예시적으로 보여지는 바와 같이, 본 발명의 개념의 증거로서, P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항체에 결합하는/그것을 향해 유도되는/그것과 또는 그것 상에서 상호작용하는 하나의 안정화된 scFv 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체 "항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096" (SEQ ID NO:7) 가 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인으로서의 CD28 의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서의 CD3z 의 단편을 추가로 포함한다. 항체 결합 분자 "항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17096" 의 서열 (아미노산 및 cDNA) 은 표 2 및 3 에 제시되어 있다.
게다가, 도 1B 에서 예시되는 바와 같이, 본 발명의 개념의 추가의 증거로서, P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항체에 결합하는/그것을 향해 유도되는/그것과 또는 그것 상에서 상호작용하는 하나의 안정화된 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체 "항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100" (SEQ ID NOs: 39, 41) 가 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인으로서의 CD28 의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서의 CD3z 의 단편을 추가로 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17100" 의 서열 (아미노산 및 DNA) 은 표 4 및 5 에 제시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가의 증거로서, P329G 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항체에 결합하는/그것을 향해 유도되는/그것과 또는 그것 상에서 상호작용하는 하나의 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체 "항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17594" (SEQ ID NOs: 48, 50) 가 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인으로서의 CD28 의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서의 CD3z 의 단편을 추가로 포함한다. 항원 결합 수용체 "항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17594" 의 서열 (아미노산 및 DNA) 은 표 6 및 7 에 제시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가의 증거로서, I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항체에 결합하는/그것을 향해 유도되는/그것과 또는 그것 상에서 상호작용하는 하나의 scFv 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체 "항-AAA scFv" (SEQ ID NO:59) 가 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인으로서의 CD28 의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서의 CD3z 의 단편을 추가로 포함한다. 항체 결합 분자 "항-AAA scFv" 의 서열 (아미노산 및 cDNA) 은 하기 표 8 및 9 에 제시되어 있다.
본 발명의 개념의 추가의 증거로서, I253A, H310A 및 H435A 돌연변이를 Fc 도메인에 포함하는 항체에 결합하는/그것을 향해 유도되는/그것과 또는 그것 상에서 상호작용하는 하나의 Fab 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 수용체 "항-AAA Fab" (SEQ ID NOs: 63, 65) 가 구축되었다. 구성체는 CD28 경막 도메인, 보조자극성 신호전달 도메인으로서의 CD28 의 단편 및 자극성 신호전달 도메인으로서의 CD3z 의 단편을 추가로 포함한다. 항체 결합 분자 "항-AAA scFv" 의 서열 (아미노산 및 cDNA) 은 하기 표 10 및 11 에 제시되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(들)을 제공한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(들) 및 본원에서 추가로 기재되는 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 분자(들)을 포함하는 키트이다.
키트
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 및/또는 본 발명의 항원 결합 수용체로 형질도입된 세포, 바람직하게는 T 세포 및, 임의로, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체/항체들을 포함하는 또는 그것으로 이루어지는 키트이며, 여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있다.
따라서, 제공되는 것은 하기를 포함하는 키트이다:
(A)
본 발명의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
추가로 제공되는 것은 하기를 포함하는 키트이다:
(A)
본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 키트는 형질도입된 T 세포, 단리된 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 치료적 항체, 예를 들어 종양 특이적 항체이다. 종양 특이적 항원은 당해 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기재되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 항체는 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다. 본 발명에 따른 키트는 형질도입된 T 세포 또는 형질도입된 T 세포를 생성하는 폴리뉴클레오티드/벡터를 포함한다. 이러한 맥락에서, 형질도입된 T 세포는 범용 T 세포이며, 그 이유는 그것이 소정의 종양에 특이적이지 않으나 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체에 따라 임의의 종양을 표적화할 수 있기 때문이다. 본원에서 제공되는 것은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 예이며, 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 임의의 항체가 본원에서 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서 항체의 돌연변이된 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 이펙터 기능을 나타낸다. 하나의 그러한 실시형태에서 돌연변이된 Fc 도메인 (또는 상기 Fc 돌연변이된 도메인을 포함하는 항체) 은 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체) 과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체) 과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 이펙터 기능을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인 (또는 상기 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체) 은 실질적으로 Fc 수용체에 결합 및/또는 이펙터 기능을 유도하지 않는다. 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시형태에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시형태에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 특이적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특이적으로 인간 FcγRIIIa 이다. 하나의 실시형태에서 이펙터 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 실시형태에서 이펙터 기능은 ADCC 이다. 하나의 실시형태에서 돌연변이된 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 실질적으로 변경된 결합 친화도를 나타낸다. 하나의 실시형태에서 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시형태에서 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시형태에서 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더욱 특이적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특이적으로 인간 FcγRIIIa 이다. 바람직하게는, 각각의 이들 수용체에 대한 결합은 감소된다. 일부 실시형태에서 보체 성분에 대한 결합 친화도, 구체적으로 C1q 에 대한 결합 친화도가 또한 감소된다.
특정 실시형태에서 항체의 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 이펙터 기능을 갖도록 돌연변이된다. 감소된 이펙터 기능은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 그에 제한되지 않는다: 감소된 보체 의존적 세포독성 (CDC), 감소된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 감소된 항체-의존적 세포성 식균작용 (ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 마크로파지에 대한 감소된 결합, 단핵구에 대한 감소된 결합, 다형핵 세포에 대한 감소된 결합, 세포자멸사를 유도하는 감소된 직접 신호전달, 표적-결합된 항체의 감소된 가교, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 프라이밍. 하나의 실시형태에서 감소된 이펙터 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 실시형태에서 감소된 이펙터 기능은 감소된 ADCC 이다. 하나의 실시형태에서 감소된 ADCC 은 조작되지 않은 Fc 도메인 (또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 항체) 에 의해 유도되는 ADCC 의 20% 미만이다.
하나의 실시형태에서 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329 의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시형태에서 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329 의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A 를 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 P329 에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시형태에서 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G 이다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 P329 에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331 로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시형태에서 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S 이다. 특정 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235 에서 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("P329G LALA") 를 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 (뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 없애며, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함되는 PCT 공보 No. WO 2012/130831 에 기재된 바와 같다. WO 2012/130831 은 또한 그러한 돌연변이체 Fc 도메인의 제조 방법 및 그것의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 이펙터 기능의 확인 방법을 기재한다.
특정 실시형태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 이펙터 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 임의로 P329G 를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 돌연변이 S228P, L235E 및 임의로 P329G 를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시형태에서 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 하나의 그러한 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 N297 에서의 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌 (N297A) 또는 아스파르트산 (N297D) 으로 대체하는 아미노산 돌연변이를 포함한다.
본원에서 위에서 및 PCT 공보 No. WO 2012/130831 에서 기재된 Fc 도메인에 더하여, Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능이 감소된 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 포함한다 (미국 특허 No. 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 돌연변이를 포함하는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 (미국 특허 No. 7,332,581) 를 포함하는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서 돌연변이를 포함하는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전학 또는 화학 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 수식에 의해 제조될 수 있다. 유전학 방법은 인코딩 DNA 서열의 자리-지정 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 올바른 뉴클레오티드 변화는 예를 들어 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들어, ELISA 에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 표준 기구 예컨대 BIAcore 기구 (GE Healthcare) 를 사용하여 쉽게 확인될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화도는 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 항체의 이펙터 기능은 당해 기술 분야에 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 어세이의 다른 예는 미국 특허 No. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 미국 특허 No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 어세이 방법이 이용될 수 있다 (참고, 예를 들어, 유동세포분석법을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 어세이 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 어세이 (Promega, Madison, WI)). 그러한 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 동물 모델 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998) 에서 개시된 것에서 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q 에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, 일부 실시형태에서 Fc 도메인이 감소된 이펙터 기능을 갖도록 조작되는 경우에, 상기 감소된 이펙터 기능은 감소된 CDC 을 포함한다. C1q 결합 어세이를 수행하여 항체가 C1q 에 결합하고 그에 따라 CDC 활성을 갖는지 여부를 확인할 수 있다. 참고, 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 어세이가 수행될 수 있다 (참고, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
하나의 실시형태에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합 친화도가 감소된다. 특정 실시형태에서 본 발명에 따른 돌연변이된 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 FcRn 수용체에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 하나의 그러한 실시형태에서 Fc 도메인 (또는 을 포함하는 항체 상기 Fc 도메인) 은 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항체) 과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인 (또는 을 포함하는 항체 천연 IgG1 Fc 도메인) 과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 이펙터 기능을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 도메인 (또는 상기 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체) 은 신생아 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않는다. 특정 실시형태에서 Fc 수용체는 FcRn 수용체이다. 하나의 실시형태에서 Fc 수용체는 인간 FcRn 수용체이다. 특정 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 I253, H310 및 H435 에서 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 특정한 실시형태에서 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함한다. 하나의 그러한 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "AAA" 조합은 인간 IgG1 Fc 도메인의 FcRn 수용체 결합을 거의 완전히 없앤다.
특정 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 CD20 에 특이적 결합을 할 수 있고, SEQ ID NO:112 의 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 FAP 에 특이적 결합을 할 수 있고, SEQ ID NO:114 의 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:115 의 경쇄 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 CEA 에 특이적 결합을 할 수 있고, SEQ ID NO:116 의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:117 의 경쇄 서열, SEQ ID NO:118 의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:119 의 경쇄 서열, SEQ ID NO:120 의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:121 의 경쇄 서열, 또는 SEQ ID NO:122 의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:123 의 경쇄 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 테나신 (TNC) 에 특이적 결합을 할 수 있고, SEQ ID NO:124 의 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:125 의 경쇄 서열을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 이중특이적 항체, 예를 들어 T-세포 활성화 이중특이적 항체이다. 하나의 그러한 실시형태에서 이중특이적 항체는 T-세포 활성화 표적, 특히 CD3 에 특이적 결합을 할 수 있는 제 1 결합 모이어티, 및 본원에 기재된 바와 같은 종양 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 제 2 결합 모이어티를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이된 Fc 영역을 포함하는 항체는 이중특이적이고, Her2 에 특이적 결합을 할 수 있으며, 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:126 의 제 1 중쇄 서열, SEQ ID NO:127 의 제 1 경쇄 서열, SEQ ID NO:128 의 제 2 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:129 의 제 2 경쇄 서열을 포함한다.
본 발명의 예시적 실시형태에서, 개념의 증거로서, SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:7 에 제시된 아미노산 서열 ("항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO:19 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)) 을 포함하는 키트가 제공된다. 대안적으로, 키트는 SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:31 에 제시된 아미노산 서열 ("항-P329G-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO:35 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)) 을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 맥락에서 키트는 SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:39 에 제시된 아미노산 서열 ("항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO:44 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)) 을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:48 에 제시된 아미노산 서열 ("항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD" (SEQ ID NO:51 에 제시된 DNA 서열에 의해 인코딩됨)) 을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:59 에 제시된 아미노산 서열 ("항-AAA-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD") 을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 맥락에서 키트는 SEQ ID NO:112 의 중쇄 및 SEQ ID NO:113 의 경쇄를 포함하는 항체와 조합된 SEQ ID NO:63 에 제시된 아미노산 서열 ("항-AAA-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD") 을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 맥락에서 키트는 SEQ ID NO:112 및 SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114 및 SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116 및 SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118 및 SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 및 SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122 및 SEQ ID NO:123, 및 SEQ ID NO:124 및 SEQ ID NO:125 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 적어도 하나의 항체 분자를 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 맥락에서 키트는 이중특이적 항체 분자, 특히 SEQ ID NO:128 의 제 1 중쇄, SEQ ID NO:129 의 제 1 경쇄, SEQ ID NO:130 의 제 2 중쇄 및 SEQ ID NO:131 의 제 2 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명의 키트의 일부는 바이알 또는 보틀 또는 용기 또는 다수용기 유닛의 조합에 개별적으로 포장될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 키트는 부모 세포, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 T 세포를 본 발명의 항원 결합 수용체(들)로 형질도입시킬 수 있고 GMP (good manufacturing practice; 우수 의약품 제조 관리 기준) (http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm 하에 유럽연합 집행위원회가 공개한 우수 의약품 제조 관리 기준에 대한 지침에서 기술된 바와 같은, 우수 의약품 제조 관리 기준) 조건 하에서 인큐베이션시킬 수 있는 (밀폐된) 백 세포 인큐베이션 시스템을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 키트는 단리/수득된 환자 T 세포를 본 발명의 항원 결합 수용체(들)로 형질도입시킬 수 있고 GMP 하에 인큐베이션시킬 수 있는 (밀폐된) 백 세포 인큐베이션 시스템을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 맥락에서, 키트는 또한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체(들)를 인코딩하는 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 특히 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있고 예를 들어 연구 도구 또는 의료 도구로서 본원에 언급된 다양한 적용분에야 적용될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게는 당업자에게 알려진 표준 절차를 따른다.
이러한 맥락에서, 환자 유래 세포, 바람직하게는 T 세포는 위에 기재된 바와 같은 키트를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 본 발명의 항원 결합 수용체로 형질도입될 수 있다. 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인은 T 세포에서 또는 상에서 자연적으로 발생하지 않는다. 따라서, 본 발명의 키트로 형질도입된 환자 유래 세포는 항체, 예를 들어 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 능력을 획득할 것이고, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체와의 상호작용을 통해 표적 세포의 제거/용해를 유도할 수 있게 될 것이며, 치료적 항체는 종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 (즉 내생적으로 발현되는) 종양-특이적 항원에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체의 세포외 도메인의 결합은 T 세포를 활성화시키고, 그것을 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체를 통해 종양 세포와 물리적으로 접촉시킨다. 형질도입되지 않은 또는 내생적 T 세포 (예를 들어 CD8+ T 세포) 는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 결합할 수 없다. 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포는 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인에 돌연변이를 포함하지 않는 치료적 항체에 의해 영향을 받지 않은 채로 남는다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 수용체 분자를 발현하는 T 세포는 생체내에서 및/또는 시험관내에서 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인에 돌연변이를 포함하는 항체의 존재 하에 표적 세포를 용해하는 능력을 갖는다. 당해 표적 세포는, 본원에 기재된 바와 같은 치료적 항체의 적어도 하나의, 바람직하게는 두 개의, 결합 도메인에 의해 인지되는, 표면 분자, 즉, 종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 종양-특이적 항원을 발현하는 세포를 포함한다. 그러한 표면 분자는 본원에서 아래에서 특성기재된다.
표적 세포의 용해는 당해 기술분야에 알려진 방법으로 검출될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 특히 생리학적 시험관내 어세이를 포함한다. 이러한 생리학적 어세이는 예를 들어, 세포막 무결성의 소실에 의해 세포 세멸을 모니터링할 수 있다 (예를 들어, FACS 기반 프로피듐 아이오다이드 어세이, 트립판 블루 유입 어세이, 측광성 효소 방출 어세이 (LDH), 방사측정 51Cr 방출 어세이, 형광측정 유로피움 방출 및 칼세인 AM 방출 어세이). 추가의 어세이는 예를 들어 측광성 MTT, XTT, WST-1 및 alamarBlue 어세이, 방사측정 3H-Thd 도입 어세이에 의한 세포 생존능의 모니터링, 세포 분열 활성을 측정하는 클론원성 어세이, 및 미토콘드리아 경막 구배를 측정하는 형광측정 로다민123 어세이를 포함한다. 또한, 아폽토시스는 예를 들어 FACS-기반 포스파티딜세린 노출 어세이, ELISA-기반 TUNEL 시험, 캐스파제 활성 어세이 (측광성, 형광측정 또는 ELISA-기반) 또는 변화된 세포 형상의 분석 (수축, 막 수포) 을 통해서 모니터링될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포이다. 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체는 T 세포의 표면 내 및/또는 그 위에 천연적으로 포함되지 않고 정상 (비형질도입) T 세포 내 또는 그 위에서 (내생적으로) 발현되지 않는 분자에 관한 것이다. 따라서, T 세포 내 및/또는 그 위의 본 발명의 항원 결합 수용체는 T 세포에 인공적으로 도입된다. 본 발명의 맥락에서 상기 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 본원에 정의된 바와 같이 치료하려는 대상체로부터 단리/수득될 수 있다. 따라서, 인공적으로 도입되어 이후에 상기 T 세포의 표면 내 및/또는 위에 제시되는 항원 결합 수용체는 (시험관 내 또는 생체 내에서) (Ig-유래) 면역글로불린, 바람직하게는 항체에, 특히 항체의 Fc 도메인에 접근가능한 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 도메인을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 인공적으로 도입된 이들 분자는 하기 본원에 기재된 바와 같이 (레트로바이러스 또는 렌티바이러스) 형질도입 후 상기 T 세포의 표면 내 및/또는 그 위에 제시된다. 따라서, 형질도입 이후에, 본 발명에 따른 T 세포는 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인에 특정 돌연변이를 포함하는 면역글로불린, 바람직하게는 (치료적) 항체에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(들)에 의해 인코딩되는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 또는 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "형질도입된 T 세포" 는 유전자 변형된 T 세포 (즉, 핵산 분자가 의도적으로 도입된 T 세포) 에 관한 것이다. 본원에서 제공된 형질도입된 T 세포는 본 발명의 벡터를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본원에서 제공된 형질도입된 T 세포는 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 본 발명의 형질도입된 T 세포는 외래 DNA (즉, T 세포에 도입된 핵산 분자) 를 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 T 세포일 수 있다. 특히, 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 T 세포의 게놈으로 안정하게 통합될 수 있다. mRNA 형질감염을 사용하여, 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자는 일식적으로 발현될 수 있다. 바람직하게, 본원에서 제공되는 형질도입된 T 세포는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터) 를 통해서 T 세포로 핵산 분자를 도입시켜 유전자 변형시켰다. 따라서, 항원 결합 수용체의 발현은 항상적일 수 있고 항원 결합 수용체의 세포외 도메인이 세포 표면 상에서 검출가능할 수 있다. 항원 결합 수용체의 이러한 세포외 도메인은 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체의 완전한 세포외 도메인뿐만 아니라 이의 일부분을 포함할 수 있다. 필요한 최소 크기는 항원 결합 수용체에서 항원 결합 모이어티의 항원 결합 부위이다.
발현은 또한 항원 결합 수용체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에서 T 세포에 도입되는 경우에 조건성일 수 있거나 또는 유도성일 수 있다. 이러한 유도성 또는 억제성 프로모터의 예는 알콜 디히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터 및 트랜스활성인자 단백질 AlcR을 함유하는 전사 시스템일 수 있다. 상이한 농업용 알콜-기반 제제를 사용하여 alcA 프로모터에 연결된 관심 유전자의 발현을 제어한다. 뿐만 아니라, 테트라사이클린-반응성 프로모터 시스템은 테트라사이클린의 존재 하에서 유전자 발현 시스템을 활성화시키거나 또는 억제시키는 기능을 할 수 있다. 이 시스템의 엘리먼트의 일부는 테트라사이클린 억제인자 단백질 (TetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO), 및 TetR 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 단백질 16 (VP16) 활성화 서열의 융합체인 테트라사이클린 트랜스활성인자 융합 단백질 (tTA) 을 포함한다. 또한, 스테로이드-반응성 프로모터, 금속-조절 또는 발병기전-관련 (PR) 단백질 관련 프로모터가 사용될 수 있다.
발현은 사용된 시스템에 의존적으로, 항상적 또는 구성적일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 수용체는 본원에서 제공된 형질도입된 T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 항원 결합 수용체의 세포외 부분 (즉, 항원 결합 수용체의 세포외 도메인은 세포 표면 상에서 검출될 수 있는 한편, 세포내 부분 (즉, 보조자극성 신호전달 도메인(들) 및 자극성 신호전달 도메인) 은 세포 표면에서 검출가능하지 않다. 항원 결합 수용체의 세포외 도메인의 검출은 이러한 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 또는 세포외 도메인이 결합할 수 있는 돌연변이된 Fc 도메인을 사용하여 수행될 수 있다. 세포외 도메인은 유세포측정 또는 현미경을 통해 이들 항체 또는 Fc 도메인을 사용해 검출될 수 있다.
본 발명의 형질도입된 세포는 임의의 면역 세포일 수 있다. 이들은 제한없이 B-세포, T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, γδ T 세포, 선천성 림프 세포, 마크로파지, 단핵구, 수지상 세포 또는 호중구를 포함한다. 우선적으로, 상기 면역 세포는 림프구, 우선적으로 NK 또는 T 세포이다. 상기 T 세포는 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포를 포함한다. 백혈구의 표면 상에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 촉발은 세포가 기원하는 계통과 무관하게 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체와 함께 표적 세포에 대한 세포의 세포독성을 야기하게 될 것이다. 세포독성은 항원 결합 수용체에 대해 선택된 자극성 신호전달 도메인 또는 보조자극성 신호전달 도메인과 무관하게 일어나게 되고 추가의 사이토카인의 외생적 공급에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명의 형질도입된 세포는 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+-T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 (NK) T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL) 세포, 골수 세포, 또는 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 바람직하게, 본원에서 제공되는 형질도입된 세포는 T 세포 (예를 들어, 자기유래 T 세포), 더 바람직하게, 형질도입된 세포는 CD8+ T 세포이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 CD8+ T 세포이다. 또한, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 자기유래 T 세포이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 형질도입된 세포는 바람직하게는 자기유래 CD8+ T 세포이다. 대상체로부터 단리된 자기유래 세포 (예를 들어, T 세포) 의 사용 이외에도, 본 발명은 또한 동종이계 세포의 사용을 고려한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 형질도입된 세포는 또한 동종이계 세포, 예컨대 동종이계 CD8+ T 세포일 수 있다. 동종이계 세포의 사용은 세포, 바람직하게는 T 세포가 외래 항원-제시 세포 (APC) 에 의해 제시된 특이적 항원 에피토프를 인지할 수 있다는 사실을 기반으로 하고, 단 APC는 T 세포에 의해 인지되는 항원 에피토프와 함께, 특이적 반응 세포 개체군, 즉 T 세포 개체군을 제한하는, MHC 분자, 클래스 I 또는 클래스 II 를 발현한다. 따라서, 용어 동종이계는 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 세포에 의해서 치료하게 되는 개체/대상체에게 상용성인 인간 백혈구 항원 (HLA) 인 미관련 도너 개체/대상체로부터의 미관련 유래의 세포를 의미한다. 자기유래 세포는 본원에 기재된 형질도입된 세포로 치료하려는 대상체로부터 상기 본원에 기재된 바와 같이 단리/수득된 세포를 의미한다.
본 발명의 형질도입된 세포는 추가의 핵산 분자, 예를 들어 T 세포 수용체를 인코딩하는 핵산 분자로 공동-형질도입될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은 T 세포에 본 발명의 벡터를 형질도입시키는 단계, 상기 형질도입된 세포 내 또는 그 위에서 항원 결합 수용체의 발현을 허용하는 조건 하에 형질도입된 T 세포를 배양하는 단계 및 상기 형질도입된 T 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 형질도입된 세포는 바람직하게는 다음의 과정에 의해 생성된다: 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포) 는 대상체 (바람직하게, 인간 환자) 로부터 단리/수득된다. 환자 또는 도너로부터 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포) 를 단리/수득하기 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 본 발명의 맥락에서 환자 또는 도너 유래의 세포 (예를 들어, T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포) 는 골수의 제거 또는 채혈에 의해 단리될 수 있다. 환자의 샘플로서 세포를 단리/수득 후, 세포 (예를 들어, T 세포) 는 샘플의 다른 성분으로부터 분리된다. 샘플로부터 세포 (예를 들어, T 세포) 를 분리하기 위한 방법은 알려져 있고, 제한없이, 예를 들어 환자 또는 도너 유래의 말초 혈액 샘플로부터 세포를 수득하기 위한 백혈구분리반출술, FACSort 장비를 사용한 세포의 단리/수득, 미세조작기 또는 수동으로 생존 세포를 보유하는 신선한 생검 표본으로부터 사멸 세포의 현존 채취를 포함한다 (예를 들어, [Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342]; [Robbins, Clin. Oncol. 29 (201 1), 917-924] 또는 [Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58] 참조). 단리/수득된 세포 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 이후에 예를 들어 항-CD3 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 및 항-CD28 단일클론 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 인터루킨-2 (IL-2) 를 사용하여 배양 및 확장시킨다 (예를 들어, [Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342] 또는 [Dudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239] 참조).
후속 단계에서 세포 (예를 들어, T 세포) 는 당해 기술분야에 알려진 방법을 통해 인공적으로/유전자적으로 변형/형질도입시킨다 (예를 들어, [Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386] 참조). 세포 (예를 들어, T 세포) 에 형질도입시키기 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 제한없이 핵산 또는 재조합 핵산이 형질도입되는 경우에, 예를 들어 전기천공 방법, 칼슘 포스페이트 방법, 양이온 지질 방법 또는 리포솜 방법을 포함한다. 형질도입하려는 핵산은 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약, 예를 들어 Lipofectamine (Invitrogen 제품, 카탈로그 번호: 11668027) 을 사용하여 통상적으로 고도로 효율적으로 형질도입될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터는 그 벡터가 플라스미드 벡터 (즉, 바이러스 벡터가 아닌 벡터) 인 한 상기 언급된 핵산과 동일한 방식으로 형질도입될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 세포 (예를 들어, T 세포) 를 형질도입시키기 위한 방법은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 T 세포 형질도입, 비바이러스 벡터 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터) 를 비롯하여 mRNA 형질감염을 포함한다. "mRNA 형질감염" 은 형질도입시키려는 세포에서, 관심 단백질, 예컨대 이 경우에서는 본 발명의 항원 결합 수용체를 일시적으로 발현시키기 위한 당업자에게 충분히 알려진 방법을 의미한다. 간단히 세포는 전기천공 시스템 (예컨대, 예를 들어 Gene Pulser, Bio-Rad) 을 사용해 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 mRNA 로 전기천공되고 그 이후에 상기 기술된 바와 같은 표준 세포 (예를 들어, T 세포) 배양 프로토콜에 의해 배양될 수 있다 ([Zhao et al., Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159] 참조). 본 발명의 형질도입되는 세포는 T 세포, 가장 바람직하게는 CD8+ T 세포이고, 렌티바이러스, 또는 가장 바람직하게는 레트로바이러스 T 세포 형질도입에 의해 생성된다.
이러한 맥락에서, T 세포를 형질도입시키기 위해 적합한 레트로바이러스 벡터는 예컨대 SAMEN CMV/SRa (Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 및 LXSN (Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), 또는 pMX (de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136) 와 같이 당해 기술분야에 알려져 있다. 본 발명의 맥락에서, 세포 (예를 들어, T 세포) 를 형질도입시키기 위해 적합한 렌티바이러스 벡터는 예를 들어 PL-SIN 렌티바이러스 벡터 (Hotta et al., Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI (Campeau et al., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (Addgene Catalogoue No.:22036), FUGW (Lois et al., Science 295(5556) (2002), 868-872), pLVX-EF1 (Addgene Catalogue No.: 64368), pLVE (Brunger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu et al., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang et al., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang et al., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab. 33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (Addgene Catalogoue No.: 62053), pLS (Miyoshi et al., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik et al., J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi et al., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser et al., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr et al., J Mol Neurosci. 22(1-2) (2004), 5-11), 또는 pLEX (Addgene Catalogue No.: 27976) 가 있다.
본 발명의 형질도입된 T 세포/T 세포들은 바람직하게는 그들의 천연 환경 밖에서, 제어된 조건 하에 성장된다. 특히, 용어 "배양하는" 은 다세포 진핵생물 (바람직하게는 인간 환자) 로부터 유래되는 세포 (예를 들어, 본 발명의 형질도입된 세포(들)) 가 시험관 내에서 성장하는 것을 의미한다. 세포를 배양하는 것은 그들의 본래 조직 근원으로부터 분리시킨 세포를 살아있게 유지시키는 실험실 기술이다. 본원에서 본 발명의 형질도입된 세포는 상기 형질도입된 세포 내 또는 그 위에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다. 발현을 가능하게 하는 조건 또는 이식유전자 (즉, 본 발명의 항원 결합 수용체의 것) 는 당해 기술분야에서 통상적으로 알려져 있고 예를 들어, 효현성 항-CD3- 및 항-CD28 항체, 및 사이토카인 예컨대 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 7 (IL-7), 인터루킨 12 (IL-12) 및/또는 인터루킨 15 (IL-15) 의 첨가를 포함한다. 배양되는 형질도입된 세포 (예를 들어, CD8+ T) 에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 발현 이후에, 형질도입된 세포는 배양물 (즉, 배양 배지) 로부터 회수 (즉, 재추출) 된다.
따라서, 또한 본 발명에 포함되는 것은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 세포, 바람직하게는 T 세포, 특히 CD8+ T 이다.
핵산 분자
본 발명의 추가 양상은 본 발명의 하나 또는 몇개의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 및 벡터이다. 본 발명의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 SEQ ID NOs:19, 30, 35, 38, 44, 47, 51 및 52 에 제시되어 있다. 본 발명의 핵산 분자는 조절 서열의 제어 하에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 수용체의 유도되는 발현을 가능하게 하는 프로모터, 전사 인핸서 및/또는 서열이 적용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 핵산 분자는 항상성 또는 유도성 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 적합한 프로모터는 예를 들어 CMV 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), UBC 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), PGK (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), EF1A 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), CAGG 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), SV40 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), COPIA 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), ACT5C 프로모터 (Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611), TRE 프로모터 (Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611), Oct3/4 프로모터 (Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)), 또는 Nanog 프로모터 (Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24) 가 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터(들)에 관한 것이다. 본원에서 용어 벡터는 도입된 숙주 세포 (즉, 형질도입된 세포) 에서 자체적으로 복제될 수 있는 원형 또는 선형 핵산 분자에 관한 것이다. 많은 적합한 벡터는 분자 생물학의 당업자에게 알려져 있고, 그의 선택은 바람직한 기능에 따라 좌우되고 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 당업자에게 충분히 알려진 방법, 예를 들어 참고로, [Sambrook et al. (상동) 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)] 에 기술된 방법을 사용하여 다양한 플라스미드 및 벡터를 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포에 전달을 위해 리포솜으로 재구성될 수 있다. 하기에 더욱 상술되는 바와 같이, 클로닝 벡터는 DNA 의 개별 서열을 단리하는데 사용되었다. 관련 서열은 특정한 폴리펩티드의 발현이 필요한 박현 벡터에 전달될 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322, pGA18 및 pGBT9 를 포함한다. 전형적인 발현 벡터는 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT 를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 상기 핵산 분자(들)에 작동적으로 연결된 조절 서열인 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터(들)에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서 벡터는 폴리시스트론일 수 있다. 이러한 조절 서열 (제어 엘리먼트) 은 당업자에게 알려져 있고, 프로모터, 스플라이스 카세트, 번역 개시 코돈, 번역 및 벡터(들)에 삽입부를 도입시키기 위한 삽입 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 핵산 분자(들)는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 발현을 가능하게 하는 상기 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 상기 벡터(들)는 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 벡터(들)라는 것을 파악한다. 작동적으로 연결된은 그렇게 기술된 성분들이 그들이 그들의 의도하는 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재하는 근접위치를 의미한다. 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 상용성인 조건 하에서 획득되는 방식으로 결찰된다. 제어 서열이 프로모터인 경우에, 바람직하게는 이중 가닥 핵산이 사용된다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 맥락에서 언급된 벡터(들)는 발현 벡터(들)이다. 발현 벡터는 선택된 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 구성체이고 선택된 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공한다. 발현 벡터(들)는 예를 들어 클로닝 벡터(들), 이원 벡터(들) 또는 통합 벡터(들)일 수 있다. 발현은 바람직하게는 번역가능한 mRNA로 핵산의 전사를 포함한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포에서 발현을 보장하는 조절 엘리먼트는 당업자에게 잘 알려져 있다. 진핵생물 세포의 경우에서 그들은 정상적으로 전사의 개시를 보장하는 프로모터 및 임의로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 원핵생물 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절 엘리먼트는 예를 들어 이. 콜라이에서의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵생물 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 조절 엘리먼트의 예에는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-, SV40, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이 있다.
전사의 개시를 담당하는 엘리먼트 이외에도 이러한 조절 엘리먼트는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 사용되는 발현 시스템에 따라서, 폴리펩티드를 세포 구획으로 유도시킬 수 있거나 또는 배지로 분비시킬 수 있는 신호 펩티드를 인코딩하는 리더 서열이 언급된 핵산 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있고 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 또한 예를 들어 첨부된 실시예를 참조한다.
리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게, 주변세포질 공간 또는 세포외 매질로 번역된 단백질 또는 이의 일부분의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열과 적절한 단계로 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 바람직한 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순한 정제를 부여하는 N-말단 식별 펩티드를 포함하는 항원 결합 수용체를 코딩할 수 있고, 상기를 참고한다. 이러한 맥락에서, 적합한 발현 벡터는 당해 기술분야에 알려져 있고 예컨대 오카야마-베르그 (Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150) 또는 pSPORT1 (GIBCO BRL) 이 있다.
본 발명의 맥락에서, 발현 제어 서열은 진핵생물 세포를 형질도입 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터의 진핵생물 프로모터 시스템일 수 있지만, 원핵생물 세포를 위한 제어 서열도 역시 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 세포에 도입되면, 세포는 뉴클레오티드 서열의 높은 발현 수준에 적합한 조건 하에서 그리고 바람직하게는 유지된다. 추가의 조절 엘리먼트는 전사를 비롯하여 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 유리하게, 본 발명의 상기 기술된 벡터는 선별 및/또는 득점 (scorable) 마커를 포함한다. 형질감염된 세포 및 예를 들어, 식물 조질 및 식물의 선별에 유용한 선별 마커 유전자는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 에 대한 선별을 기반으로 하는 항대사산물 내성 (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), 아미노글리코시드, 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는, npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485) 를 포함한다. 추가의 선별 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있게 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노스를 이용할 수 있게 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627), 및 오르니틴 디카복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO 에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 디카복실라제) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 또는 블라스티시딘 S 에 대한 내성을 부여하는 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) 유래 디아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338) 가 기술된 바 있다.
유용한 득점 마커가 또한 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 입수가능하다. 유리하게, 상기 마커는 루시퍼라제 코딩 유전자 (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), 녹색 형광발광 단백질 (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) 또는 β-글루쿠로니다제 (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907) 이다. 이러한 실시형태는 언급된 벡터를 함유하는 세포, 조직 및 유기체의 간단하고 신속한 스크리닝에 특이 유용하다.
상기 기술된 바와 같이, 언급된 핵산 분자(들)는 예를 들어, 양자 T 세포 요법뿐만 아니라 또한 유전자 요법 목적을 위해서, 세포에서 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하기 위한 벡터(들)의 일부분으로서 또는 단독으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항원 결합 수용체 중 어느 하나를 인코딩하는 DNA 서열(들)을 함유하는 핵산 분자 또는 벡터(들)는 세포에 도입되어서 관심 폴리펩티드를 생성시킨다. 생체외 또는 생체내 기술을 통해 세포로 치료적 유전자를 도입시키는 것을 기반으로 하는 유전자 요법은 유전자 전달의 가장 중요한 적용 중 하나이다. 시험관내 또는 생체내 유전자 요법을 위한 유전자-전달 시스템 또는 방법을 위한 적합한 벡터, 방법 또는 유전자 전달 시스템은 문헌에 기술되어 있고, 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 [Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539]; [Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919]; [Anderson, Science 256 (1992), 808-813]; [Verma, Nature 389 (1994), 239]; [Isner, Lancet 348 (1996), 370-374]; [Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086]; [Onodera, Blood 91 (1998), 30-36]; [Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699]; [Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292]; [Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51]; [Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716]; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859; US 5,589,466; 또는 [Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640] 를 참조한다. 언급된 핵산 분자(들) 및 벡터(들)는 세포에 직접 도입 또는 리보솜, 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 를 통한 도입을 위해 디자인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 세포는 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, CD3+ T 세포, γδ T 세포 또는 자연 살해 (NK) T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포이다.
상기에 따라서, 본 발명은 본원에 정의된 항원 결합 수용체의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드 및 박테리오파지를 구동시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 바이러스 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연합 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 표적화된 세포 개체군으로 언급된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 전달을 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 충분히 알려진 방법은 예를 들어, Sambrook 등 (상동), Ausubel (1989, 상동) 또는 다른 표준 참고서에 기술된 기술을 사용해 재조합 벡터(들)를 구축하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 언급된 핵산 분자 및 벡터는 표적 세포로 전달을 위해 리포솜으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 가변적인, 충분히 알려진 방법을 통해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염이 원핵생물 세포에 일반적으로 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있으며, [Sambrook, 상동] 을 참조한다. 언급된 벡터는 특히 pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo 일 수 있다. 벡터 pEF-DHFR, pEF-ADA 및 pEF-neo는 당해 기술분야에서, 예를 들어, 문헌 [Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025] 및 [Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150] 에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 형질전환 또는 형질감염시킨 T 세포를 제공한다. 상기 T 세포는 T 세포 또는 이의 전구체 세포에 상기 기술된 벡터 중 적어도 하나 또는 상기 기술된 핵산 분자 중 적어도 하나를 도입시켜 생성시킬 수 있다. T 세포에 상기 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 존재는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 상기 기술된 항원 결합 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다. 본 발명의 벡터는 폴리시스트론일 수 있다.
T 세포 또는 이의 전구체 세포에 도입되는 기술된 핵산 분자(들) 또는 벡터(들)은 세포의 게놈에 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다.
종양 특이적 항원
상기에 언급된 바와 같이, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 본원에서 기재된 항체의 (Ig-유래) 도메인(들)은 세포 표면 분자, 즉 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생되는 종양-특이적 항원에 대해 특이성을 갖는 항원-상호작용-부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 항체는 본원에 기재된 항원 결합 수용체를 포함하는 본원에 기재된 바와 같이 형질도입된 T 세포를 종양 세포와 물리적으로 접촉하게 되고, 여기서 형질도입된 T 세포는 활성화된다. 본 발명의 형질도입된 T 세포의 활성화는 본원에 기재된 바와 같이 종양 세포의 용해를 일으킬 수 있다.
종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생되는 종양 마커의 예는 하기 본원에 제공되어 있고 제한없이, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), CEA (암배 항원), p95 (p95HER2), BCMA (B-세포 성숙화 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 암 항원 12-5 (CA-12-5), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MUC-1 (뮤신-1), A33-항원, PSMA (전립선-특이적 막 항원), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 카본 탈수 효소 IX (CA-IX), 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC) 의 분자에 결합된 펩티드를 포함한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체는 FAP (섬유아세포 활성화 단백질), CEA (암배 항원), p95 (p95HER2), BCMA (B-세포 성숙화 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 암 항원 12-5 (CA-12-5), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MUC-1 (뮤신-1), A33-항원, PSMA (전립선-특이적 막 항원), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 카본 탈수 효소 IX (CA-IX), 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC) 의 분자에 결합하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 세포의 표면에 자연적으로 발생하는 항원/마커에 특이적 결합을 할 수 있는 항체, 즉, 치료적 항체의 돌연변이된 Fc 도메인에 결합한다.
A33-항원, BCMA (B-세포 성숙화 항원), 암 항원 12-5 (CA-12-5), 카본 탈수 효소 IX (CA-IX), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA (암배 항원), EpCAM (상피 세포 부착 분자), FAP (섬유아세포 활성화 단백질), FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3), 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), HER-1 (인간 상피 성장 인자 1), HER-2 (인간 상피 성장 인자 2), HER-3 (인간 상피 성장 인자 3), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련 (HLA-DR), MSLN (메소텔린), MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), MUC-1 (뮤신-1), PSMA (전립선 특이적 막 항원), PSMA (전립선-특이적 막 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), p95 (p95HER2), 트랜스페린-수용체, TNC (테나신), 인간 영양아층 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 의 (인간) 구성원의 서열(들)은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이타로부터 입수가능하고 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed%3Ayes에서 검색할 수 있다. 이들 (단백질) 서열은 또한 주석달린 변형 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에서 제공되는 간결한 서열의 상동성 서열, 및 또한 유전적 대립유전자 변이체 등을 사용하는 기술 및 방법을 제공한다. 바람직하게는 본원의 간결한 서열의 이러한 변이체 등이 사용된다. 바람직하게, 이러한 변이체는 유전자 변이체이다. 당업자는 또한 게놈 DNA를 비롯하여 mRNA/cDNA 의 등재 번호를 포함할 수 있는, 이들 데이타은행 등재 항목에서 이들 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 쉽게 추론할 수 있다. (인간) FAP (섬유아세포 활성화 단백질) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q12884 (등재 버전 168, 서열 버전 5) 로부터 수득될 수 있고; (인간) CEA (암배 항원) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P06731 (등재 버전 171, 서열 버전 3) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) EpCAM (상피 세포 부착 분자) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P16422 (등재 버전 117, 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) MSLN (메소텔린) 의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 Q13421 (버전 번호 132; 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) FMS-유사 티로신 키나제 3 (FLT-3) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P36888 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q13414 (2차 수탁 번호) (버전 번호 165 및 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸) 의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 Q6UVK1 (버전 번호 118; 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) 폴레이트 수용체 1 (FOLR1) 의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 P15328 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q53EW2 (2차 수탁 번호) (버전 번호 153 및 서열 버전 3) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) 영양막 세포-표면 항원 2 (Trop-2) 의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 P09758 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q15658 (2차 수탁 번호) (버전 번호 172 및 서열 버전 3) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) PSCA (전립선 줄기 세포 항원) 의 서열(들)은 UniProt 등재 번호 O43653 (1차 인용가능 수탁 번호) 또는 Q6UW92 (2차 수탁 번호) (버전 번호 134 및 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-1 (상피 성장 인자 수용체) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P00533 (등재 버전 177, 서열 버전 2) 으로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-2 (수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-2) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P04626 (등재 버전 161, 서열 버전 1) 으로부터 수득될 수 있거나; (인간) HER-3 (수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-3) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P21860 (등재 버전 140, 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD20 (B-림프구 항원 CD20) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P11836 (등재 버전 117, 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD22 (B-림프구 항원 CD22) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P20273 (등재 버전 135, 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) CD33 (B-림프구 항원 CD33) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P20138 (등재 버전 129, 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) CA-12-5 (뮤신 16) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q8WXI7 (등재 버전 66, 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) HLA-DR의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q29900 (등재 버전 59, 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) MUC-1 (뮤신-1) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P15941 (등재 버전 135, 서열 버전 3) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) A33 (세포 표면 A33 항원) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q99795 (등재 버전 104, 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) PSMA (글루타메이트 카르복시펩티다제 2) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q04609 (등재 버전 133, 서열 버전 1) 로부터 수득될 수 있거나; (인간) 트랜스페린 수용체의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q9UP52 (등재 버전 99, 서열 버전 1) 및 P02786 (등재 버전 152, 서열 버전 2) 으로부터 수득될 수 있거나; (인간) TNC (테나신) 의 서열은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 P24821 (등재 버전 141, 서열 버전 3) 로부터 수득될 수 있거나; 또는 (인간) CA-IX (카본산 탈수 효소 IX) 의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이타베이스 등재번호 Q16790 (등재 버전 115, 서열 버전 2) 로부터 수득될 수 있다.
치료적 용도 및 치료 방법
본원에서 제공되는 분자 또는 구성체 (즉, 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 및 키트) 는 의학적 상황에서, 특히 악성 질환의 치료에 특히 유용하다. 예를 들어, 종양은 종양 세포에 특이적이고 돌연변이된 Fc 도메인를 포함하는 치료적 항체와 함께 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트는 악성 질환의 치료에서 사용되고, 특히 여기서 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다.
치료의 종양 특이성은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체에 의해 제공되며, 항체는 본 발명의 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다. 이러한 맥락에서, 형질도입된 T 세포는 범용 T 세포이며, 그 이유는 그것이 소정의 종양에 특이적이지 않으나 본 발명에 따라 사용되는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체에 따라 임의의 종양을 표적화할 수 있기 때문이다.
이러한 맥락에서 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암/암종 또는 혈액의 암일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 전립선암, 신세포암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 혈액 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 종양성 질환 및/또는 림프종은 이들 의학적 징후(들)에 대해 유도된 특별한 구성체로 치료될 수 있다. 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체와 조합된 본 발명의 형질도입된 T 세포에 대한 표시는 종양 항원에 대한 치료적 항체의 특이성에 의해 제공된다. 예를 들어, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체로 치료될 수 있으며, 여기에서 항체는 (인간) EpCAM (종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 종양-특이적 항원으로서) 에 대해 유도된다.
위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 HER1, 바람직하게는 인간 HER1 을 향해 유도된다. 게다가, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 MCSP, 바람직하게는 인간 MCSP 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 FOLR1, 바람직하게는 인간 FOLR1 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 Trop-2, 바람직하게는 인간 Trop-2 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 PSCA, 바람직하게는 인간 PSCA 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 EGFRvIII, 바람직하게는 인간 EGFRvIII 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 MSLN, 바람직하게는 인간 MSLN 을 향해 유도된다. 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 HER2, 바람직하게는 인간 HER2 을 향해 유도된다. 위암 및/또는 폐암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 HER3, 바람직하게는 인간 HER3 을 향해 유도된다. B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 CD20, 바람직하게는 인간 CD20 을 향해 유도된다. B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22 을 향해 유도된다. 골수성 백혈병은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 CD33, 바람직하게는 인간 CD33 을 향해 유도된다. 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 CA12-5, 바람직하게는 인간 CA12-5 을 향해 유도된다. 위장암, 백혈병 및/또는 비인두 암종은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 HLA-DR, 바람직하게는 인간 HLA-DR 을 향해 유도된다. 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 MUC-1, 바람직하게는 인간 MUC-1 을 향해 유도된다. 결장암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 A33, 바람직하게는 인간 A33 을 향해 유도된다. 전립선암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA 을 향해 유도된다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 트랜스페린 수용체, 바람직하게는 인간 트랜스페린 수용체를 향해 유도된다. 췌장암, 폐암 및/또는 유방암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 트랜스페린 수용체, 바람직하게는 인간 트랜스페린 수용체를 향해 유도된다. 신장암은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 치료적 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본 발명의 형질도입된 T 세포로 치료될 수 있으며, 항체는 CA-IX, 바람직하게는 인간 CA-IX 을 향해 유도된다.
따라서, 본 발명은 또한 질환, 악성 질환 예컨대 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및/또는 혈액의 암의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명의 맥락에서 질환의 치료를 위한 특정한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 대상체로부터 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체로 형질도입시키는 단계; 및
(c) 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
본 발명의 맥락에서, 상기 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포, 및/또는 치료적 항체/항체들은 정맥내 주입을 통해 상기 대상체에게 공동-투여된다.
더욱이, 본 발명의 맥락에서 본 발명은 질환의 치료를 위한 방법을 제공하며, 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 대상체로부터 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체로 형질도입시키는 단계;
(c) 임의로 상기 단리된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 T 세포 수용체로 공동-형질도입시키는 단계;
(d) T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계; 및
(e) 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
상기 언급된 단계 (d) (T 세포 예컨대 TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계를 언급) 는 또한 (자극성) 사이토카인 예컨대 인터루킨-2 및/또는 인터루킨-15 (IL-15) 의 존재 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 언급된 단계 (d) (T 세포 예컨대 TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 의해 확장시키는 단계를 언급) 는 또한 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-7 (IL-7) 및/또는 인터루킨-21 (IL-21) 의 존재 하에서 수행될 수 있다.
치료 방법은, 또한, 본 발명에 따라 사용되는 항체의 투여를 포함한다. 상기 항체는 형질도입된 T 세포가 투여되기 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 형질도입된 T 세포의 투여는 정맥내 주입에 의해 수행될 것이다. 본 발명의 맥락에서 형질도입된 T 세포는 치료하려는 대상체로부터 단리/수득된다.
조성물
게다가, 본 발명은 돌연변이된 Fc 도메인(들)을 갖는 항체 분자(들), 본 발명의 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포(들)을 포함하는 조성물 (약제), 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산 분자(들) 및 벡터(들), 및/또는 및 하나 이상의 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 조성물은, 임의로, 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한 제형을 추가로 포함하는 약학 조성물이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포 및/또는 상기 형질도입된 T 세포를 포함하는 조성물과의 조합으로 투여될 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체 분자를 포함하는 약학 조성물 (약제) 이 제공되며, 상기 항체 분자는 본 발명의 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학 조성물" 은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여를 위한 조성물에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 환자가 질환을 앓는 본 발명의 맥락에서, 상기 질환은 악성 질환, 특히 상피, 내피 또는 중피 기원의 암/암종 또는 혈액의 암이다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 전립선암, 신세포암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들어, 고환암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 혈액 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 약학 조성물/약제는 비경구, 경피, 관내, 동맥내, 정맥내, 척추강내 투여를 위한 또는 조직 또는 종양 내로 직접 주입에 의하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 및/또는 형질도입된 T 세포를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 조성물/약제는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함하는 약학 조성물/약제는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포를 포함하는 조성물/약제와의 조합으로 투여될 것이며, 상기 T 세포는 치료될 대상체로부터 수득되었다.
용어 "조합되는" 의 사용은 치료 섭생법의 성분이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 따라서, 본원에서 기재되는 약학 조성물/약제는 본 발명의 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 본원에 정의된 바와 같은 항체의 투여를 포함한다. 본원에서 사용되는 "조합되는" 은 또한 본원에 이전에 정의된 바와 같은 항체 및 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포의 투여 사이의 타이밍을 제한하지 않는다. 따라서, 두 개의 성분이 동시에/병행하여 투여되지 않을 때, 투여는 1 분, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간에 의해 또는 당업자에 의해 용이하게 결정되는 및/또는 본원에서 기재되는 기재되는 임의의 적합한 시간차에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "조합되는" 은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포가 대상체에게 투여되기 전에 함께 예비인큐베이션되는 상황을 포함한다. 따라서, 두 개의 성분은 투여 전에, 예를 들어, 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분 또는 1 시간 동안 또는 당업자에 의해 용이하게 결정되는 임의의 적합한 시간 동안 예비인큐베이션될 수 있다. 본 발명은, 또다른 바람직한 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포가 동시에/병행하여 투여되는 치료 섭생법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포가 투여된 후에 투여될 수 있다.
추가로, 본원에서 사용되는 "조합되는" 은 개시된 치료 섭생법을 즉각적 순서로의 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 본 발명의 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포의 투여 (즉, 두 성분 중 하나의 투여, 그에 뒤이어 (특정 시간 간격 후에) 그 사이에 임의의 기타 치료 프로토콜의 투여 및/또는 실행 없이 다른 성분의 투여) 로 제한하지 않는다. 그러므로, 본 발명의 치료 섭생법은 또한 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자 및 본 발명에 따른 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포의 별개의 투여를 포함하며, 투여는 질환 또는 그의 증상의 치료 또는 예방에 필요한 및/또는 적합한 하나 이상의 치료 프로토콜에 의해 분리된다. 그러한 개입 치료 프로토콜의 예는 진통제의 투여; 화학치료제의 투여, 질환 또는 그의 증상의 외과적 처리를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 따라서, 본원에서 개시되는 치료 섭생법은 본원에 기재된 바와 같은 또는 당해 기술 분야에 알려진 바와 같은 질환, 또는 그의 증상의 치료 또는 예방에 적합한 하나의, 또는 하나 초과의 치료 프로토콜과 함께, 또는 그러한 치료 프로토콜 없이 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
상기 약학 조성물(들)/약물(들)은 주입 또는 주사를 통해서 환자에게 투여되는 것이 특히 고려된다. 본 발명의 맥락에서 본원에서 기술된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 형질도입된 T 세포는 주입 또는 주사를 통해서 환자에게 투여될 것이다. 적합한 조성물/약제의 투여는 상이한 방식, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물/약제는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 충분히 알려진 통상의 방법으로 제제화될 수 있다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 용량 용법은 참관의 및 임상적 요인들에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 충분히 알려진 바와 같이, 어느 한 환자를 위한 용량은 환자의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여하려는 특정 화합물, 성별, 투여 시기 및 경로, 전신 건강, 및 동시발생적으로 투여되는 다른 약물을 포함하여, 많은 인자들에 따라 좌우된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정규 투여로서 용법은 1일 당 1 ㎍ 내지 5 g 유닛의 범위여야 한다. 그러나, 연속 주입을 위해 보다 바람직한 용량은 1시간 당 체중 킬로그램 당 0.01 ㎍ 내지 2 mg, 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 1 mg, 보다 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 100 ㎍, 보다 더 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 50 ㎍ 및 가장 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 10 ㎍ 유닛의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 용량은 하기 본원에 나열된다. 과정은 주기적인 평가를 통해 모니터링될 수 있다. 용량은 가변적일 것이지만 DNA 의 정맥내 투여에 바람직한 용량은 대략 106 내지 1012 카피의 DNA 분자이다.
본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어 정맥내일 것이고, 형질도입된 T 세포는 또한 예를 들어 동맥 내 부위에 카테터를 통해서, 표적 부위에 대해 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조제물은 멸균 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수용성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 염수 및 완충 배지를 포함한, 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링커 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스 기반의 것) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 단백질성 담체, 예를 들어 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 단백질성 항체 구성체 또는 동일한 것을 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터 (본 발명에서 기재된 바와 같음), 및/또는 세포에 더하여, 약학 조성물의 의도하는 용도에 따라서, 추가의 생물학적 활성제를 포함할 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 작용제는 위장계에 작용하는 약물, 정균제로서 작용하는 약물, 고뇨산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물 (예를 들어, 코르티코스테로이드), 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당해 기술분야에 알려진 T 세포 보조자극성 분자 또는 사이토카인과 같은 작용제일 수 있다.
본 발명의 조성물(들)/약물(들)의 투여를 위해 가능한 징후는 악성 질환 예컨대 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암, 특히 상피 암/암종 예컨대 유방암, 결장암, 전립선암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들어, 난소암, 고환암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 폐암, 위암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 혈액 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종과 같은 다른 종양성 질환이다.
본 발명은 다른 화합물, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 세포 증식 또는 세포 자극을 위한 활성화 신호를 제공할 수 있는 분자와의 공동-투여 프로토콜을 더욱 고려한다. 상기 분자는 예를 들어 T 세포에 대한 추가의 주요 활성화 신호 (예를 들어, 추가의 보조자극성 분자: B7 패밀리의 분자, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, 항-CTLA-4, 항-PD-1), 또는 추가의 사이토카인 인터루킨 (예를 들어, IL-2) 일 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은 또한 임의로 검출을 위한 수단 및 방법을 추가로 포함하는 진단 조성물일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 제공되는 것은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 키트, 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포이다. 본 발명의 맥락에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원 결합 수용체가 제공되며, 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 하나 이상의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 및/또는 발현하는 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 것이고, 상기 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포는 치료될 대상체로부터 수득되었다. 상기 약제는 악성 질환 특히 상피, 내피 또는 중피 기원 또는 혈액의 암/암종의 치료 방법에서 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 전립선암, 신세포암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 기타 종양성 질환 예컨대 혈액 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
게다가, 본 발명의 맥락에서 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항체는 종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 종양-특이적 항원에 결합하며, 상기 항체 분자는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체를 포함하는 상기 대상체로부터의 형질도입된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 것이다. 본 발명의 맥락에서 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 전립선암, 신세포암, 두경부암, 피부암 (흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들어, 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 기타 종양성 질환 예컨대 혈액 종양, 신경교종, 육종 또는 골육종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
게다가, 본 발명에 따르면, 종양 항원, 바람직하게는 인간 종양 항원 (종양 세포의 표면 상에서 자연 발생적인 종양-특이적 항원으로서) 에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인을 포함하고 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 분자 또는 구성체 (즉, 본원에서 기재되는 항체 분자) (여기에서 본 발명의 항원 결합 수용체의 본원에서 정의되는 세포외 도메인은 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도된다/그에 결합한다/그것과 상호작용한다) 는 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료를 위해 제공된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, 종양 항원, 바람직하게는 인간 종양 항원에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 두 개의 결합 도메인을 포함하고 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체 분자 (여기에서 항원 결합 수용체의 본원에서 정의되는 세포외 도메인은 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도된다/그에 결합한다/그것과 상호작용한다) 가 제공된다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료에서 사용하기 위한, (i) 종양 항원, 바람직하게는 인간 종양 항원에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 두 개의 결합 도메인, 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료에서 사용하기 위한, (i) HER1, 바람직하게는 인간 HER1 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암의 치료에서 사용하기 위한, (i) HER2, 바람직하게는 인간 HER2 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위암 및/또는 폐암의 치료에서 사용하기 위한, (i) HER3, 바람직하게는 인간 HER3 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CEA, 바람직하게는 인간 CEA 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) p95, 바람직하게는 인간 p95 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) BCMA, 바람직하게는 인간 BCMA 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) MSLN, 바람직하게는 인간 MSLN 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) MCSP, 바람직하게는 인간 MCSP 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CD19, 바람직하게는 인간 CD19 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에서 사용하기 위한, (i) CD20, 바람직하게는 인간 CD20 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에서 사용하기 위한, (i) CD22, 바람직하게는 인간 CD22 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CD38, 바람직하게는 인간 CD38 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체, 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CD52Flt3, 바람직하게는 인간 CD52Flt3 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) FolR1, 바람직하게는 인간 FolR1 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교아세포종 및/또는 구강암의 치료에서 사용하기 위한, (i) Trop-2, 바람직하게는 인간 Trop-2 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CA-12-5, 바람직하게는 인간 CA-12-5 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 위장암, 백혈병 및/또는 비인두 암종의 치료에서 사용하기 위한, (i) HLA-DR, 바람직하게는 인간 HLA-DR 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암의 치료에서 사용하기 위한, (i) MUC-1, 바람직하게는 인간 MUC-1 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 결장암의 치료에서 사용하기 위한, (i) A33, 바람직하게는 인간 A33 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체 분자; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 전립선암의 치료에서 사용하기 위한, (i) PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) PSCA, 바람직하게는 인간 PSCA 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체 분자; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) 트랜스페린-수용체, 바람직하게는 인간 트랜스페린-수용체에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체 분자; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암의 치료에서 사용하기 위한, (i) 테나신, 바람직하게는 인간 테나신에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
하나의 실시형태에서, 제공되는 것은 신장암의 치료에서 사용하기 위한, (i) CA-IX, 바람직하게는 인간 XA-IX 에 대항하는 하나 또는 두 개의 결합 도메인(들), 및 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는, 항체 분자; 및 (ii) 돌연변이된 Fc 도메인에게로 유도되는/그에 결합하는/그것과 상호작용하는 본 발명에 따른 항원 결합 수용체이다.
예시적 실시형태
1. 앵커링 경막 도메인, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 단편 결정가능 (Fc) 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 항원 결합 수용체.
2. 실시형태에서 1 의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fc 수용체는 Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 인 항원 결합 수용체.
3. 실시형태에서 1 또는 2 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, Fc 수용체 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 25℃ 에서 측정되는 항원 결합 수용체.
4. 실시형태에서 1 내지 3 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab, crossFab 또는 scFab 인 항원 결합 수용체.
5. 실시형태에서 1 내지 4 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인인 항원 결합 수용체.
6. 실시형태에서 1 내지 5 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인이며, 특히 앵커링 경막 도메인은 SEQ ID NO:11 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
7. 실시형태에서 1 내지 6 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 수용체.
8. 실시형태에서 1 내지 7 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택되는 항원 결합 수용체.
9. 실시형태에서 1 내지 8 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z 의 세포내 도메인 또는 이의 단편이며, 특히적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:13 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
10. 실시형태에서 1 내지 9 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택되는 항원 결합 수용체.
11. 실시형태에서 1 내지 10 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 또는 이의 단편이며, 특히, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
12. 실시형태에서 1 내지 11 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 CD3z 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체는 CD28 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체.
13. 실시형태에서 12 의 항원 결합 수용체로서, 자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:13 의 아미노산 서열을 포함하고, 보조자극성 신호전달 도메인은 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
14. 실시형태에서 1 내지 13 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 세포외 도메인은 앵커링 경막 도메인으로, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
15. 실시형태에서 14 의 항원 결합 수용체로서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGGGS (SEQ ID NO:17) 을 포함하는 항원 결합 수용체.
16. 실시형태에서 1 내지 15 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 앵커링 경막 도메인은 공-신호전달 도메인에 또는 신호전달 도메인에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
17. 실시형태에서 1 내지 16 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 신호전달 및/또는 공-신호전달 도메인은, 임의로 적어도 하나의 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
18. 실시형태에서 1 내지 17 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이며, scFv 단편은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
19. 실시형태에서 1 내지 17 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편 또는 crossFab 단편이며, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
20. 실시형태에서 7 내지 19 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 하나의 공-신호전달 도메인을 포함하며, 공-신호전달 도메인은 N-말단에서 앵커링 경막 도메인의 C-말단으로 연결되는 항원 결합 수용체.
21. 실시형태에서 20 의 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 수용체는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 부가적으로 포함하며, 자극성 신호전달 도메인은 N-말단에서 보조자극성 신호전달 도메인의 C-말단으로 연결되는 항원 결합 수용체.
22. 실시형태에서 1 내지 21 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인인 항원 결합 수용체.
23. 실시형태에서 1 내지 22 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 인 항원 결합 수용체.
24. 실시형태에서 1 내지 23 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이체 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc (SEQ ID NO: 130) 의 잔기 117, 118, 136, 180, 193, 212, 214, 및 318 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L117A, L118A, I136A, N180A, H193A, P212G, P214G 및/또는 H318A 인 항원 결합 수용체.
25. 실시형태에서 1 내지 24 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235 및 P329 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("PGLALA") 를 포함하는 항원 결합 수용체.
26. 실시형태에서 1 내지 25 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fcγ 수용체는 인간 FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIa 인 항원 결합 수용체.
27. 실시형태에서 1 내지 26 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이체 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc (SEQ ID NO: 130) 의 위치 212 에서 아미노산 치환을 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 P212G 인 항원 결합 수용체.
28. 실시형태에서 1 내지 24 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 I253, H310 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 FcRn 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 FcRn 결합과 비교하여 감소되는 항원 결합 수용체.
29. 실시형태에서 1 내지 24 또는 28 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 돌연변이체 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc (SEQ ID NO: 130) 의 위치 136, 193, 및 318 에서 아미노산 치환을 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 I136A, H193A, 및 H318A ("AAA") 인 항원 결합 수용체.
30. 실시형태에서 1 내지 27 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6).
31. 실시형태에서 1 내지 27 또는 30 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:32 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:33 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함하는 항원 결합 수용체.
32. 실시형태에서 1 내지 27, 30 또는 31 의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:8 의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:9 의 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함하는 항원 결합 수용체.
33. 실시형태에서 1 내지 27 또는 30 내지 32 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:31 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
34. 실시형태에서 33 의 항원 결합 수용체로서, SEQ ID NO:7 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
35. 실시형태에서 1 내지 27 또는 30 내지 32 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
a) SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:48 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 및 SEQ ID NO:50 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드.
36. 실시형태에서 35 의 항원 결합 수용체로서, 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
a) SEQ ID NO:39 의 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 경쇄 폴리펩티드.
37. 실시형태에서 1 내지 24 또는 28 내지 29 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS (SEQ ID NO:53);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY (SEQ ID NO:54); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO:57); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58).
38. 실시형태에서 1 내지 24, 28, 29 또는 37 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 SEQ ID NO:61 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO:62 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) 을 포함하는 항원 결합 수용체.
39. 실시형태에서 1 내지 24, 28, 29 또는 37 내지 38 의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
a) SEQ ID NO:61 의 중쇄 가변 영역 (VH); 및
b) SEQ ID NO:62 의 경쇄 가변 영역 (VL).
40. 실시형태에서 1 내지 24, 28, 29 또는 37 내지 39 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 scFv 이며, 항원 결합 수용체는 SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
41. 실시형태에서 40 의 항원 결합 수용체로서, SEQ ID NO:59 의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 수용체.
42. 실시형태에서 1 내지 27 또는 30 내지 32 중 어느 하나의 항원 결합 수용체로서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 Fab 단편이며, 항원 결합 수용체는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
a) SEQ ID NO:39 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 폴리펩티드.
43. 실시형태에서 42 의 항원 결합 수용체로서, 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
a) SEQ ID NO:39 의 중쇄 융합체 폴리펩티드; 및
b) SEQ ID NO:41 의 경쇄 폴리펩티드.
44. 실시형태에서 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
45. 실시형태 1 내지 32, 35 내지 39 및 42 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체의 중쇄 융합체 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
46. 실시형태 1 내지 32, 35 내지 39 및 42 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 조성물로서, 중쇄 융합체 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
47. 실시형태 44 또는 45 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 46 의 조성물에 의해 인코딩되는 폴리펩티드.
48. 실시형태 44 의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 45 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
49. 실시형태 44 의 폴리뉴클레오티드, 실시형태 46 의 조성물 또는 실시형태 48 의 벡터를 포함하는 형질도입된 T 세포.
50. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포.
51. 실시형태 49 또는 50 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 형질도입된 T 세포는 표적 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR) 로 동시형질도입되는 형질도입된 T 세포.
52. 하기를 포함하는 키트:
(A)
실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
53. 하기를 포함하는 키트:
(A)
실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
54. 하기를 포함하는 키트:
(A)
실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 실시형태 46 의 조성물 또는 실시형태 48 의 벡터; 및
(B)
돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음.
55. 실시형태에서 52 내지 54 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인인 키트.
56. 실시형태에서 52 내지 55 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fc 수용체는 Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 인 키트.
57. 실시형태에서 56 의 키트로서, Fc 수용체 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 25℃ 에서 측정되는 키트.
58. 실시형태에서 52 내지 57 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 인 키트.
59. 실시형태에서 52 내지 58 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235 및 P329 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G ("PGLALA") 를 포함하는 키트.
60. 실시형태에서 52 내지 59 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함하는 키트.
61. 실시형태에서 52 내지 60 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 I253, H310 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하는 키트.
62. 실시형태에서 52 내지 61 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 종양 세포의 표면 상의 항원에 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC) 의 분자에 결합된 펩티드에에 특이적 결합을 할 수 있으며, 특히 항원은 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신) 및 CA-IX 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키트.
63. 실시형태에서 52 내지 62 중 어느 하나의 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1) 및 테나신 (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 키트.
64. 실시형태에서 52 내지 63 중 어느 하나의 키트로서, 약제로서 사용하기 위한 키트.
65. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체 또는 실시형태 49 내지 51 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 약제로서 사용하기 위한 것이며, 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
66. 실시형태에서 52 내지 63 중 어느 하나의 키트로서, 질환의 치료에서 사용하기 위한, 특히 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 키트.
67. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체 또는 실시형태 49 내지 51 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포로서, 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 것이며, 치료는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여를 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
68. 실시형태 66 또는 67 에 따른 용도를 위한 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트로서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트.
69. 실시형태 66 내지 68 에 따른 용도를 위한 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 종양 세포의 표면 상의 항원에 및/또는 인간 주요 조직적합 복합체 (MHC) 의 분자에 결합된 펩티드에 특이적 결합을 할 수 있으며, 특히 항원은 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신) 및 CA-IX 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트.
70. 실시형태 66 내지 69 에 따른 용도를 위한 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트로서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1) 및 테나신 (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트.
71. 실시형태 66 내지 70 중 어느 하나에 따른 용도를 위한 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트로서, 형질도입된 T 세포는 치료될 대상체로부터 단리된 세포에서 유래하는 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트.
72. 실시형태 66 내지 70 중 어느 하나에 따른 용도를 위한 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트로서, 형질도입된 T 세포는 치료될 대상체로부터 단리된 세포에서 유래하지 않는 항원 결합 수용체, 형질도입된 T 세포 또는 키트.
73. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 투여하는 것 및 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 치료적 유효량의 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체를 투여하는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 치료 방법.
74. 실시형태 73 의 방법으로서, T 세포를 대상체로부터 단리하는 것 및 단리된 T 세포를 실시형태 44 의 폴리뉴클레오티드, 실시형태 46 의 조성물 또는 실시형태 48 의 벡터로 형질도입하여 형질도입된 T 세포를 생성하는 것을 부가적으로 포함하는 치료 방법.
75. 실시형태 74 의 방법으로서, T 세포는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구성체로 또는 비-바이러스 벡터 구성체로 형질도입되는 치료 방법.
76. 실시형태 75 의 방법으로서, 비-바이러스 벡터 구성체는 슬리핑 뷰티 미니서클 벡터인 치료 방법.
77. 실시형태 73 내지 76 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 정맥내 주입에 의해 투여되는 치료 방법.
78. 실시형태 73 내지 77 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여에 앞서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉되는 치료 방법.
79. 실시형태 73 내지 78 중 어느 하나의 방법으로서, 형질도입된 T 세포는 대상체에게 투여에 앞서 적어도 하나의 사이토카인과, 바람직하게는 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-7 (IL-7), 인터류킨-15 (IL-15), 및/또는 인터류킨-21, 또는 그의 변이체와 접촉되는 치료 방법.
80. 실시형태 73 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 질환은 악성 질환인 치료 방법.
81. 실시형태 73 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 치료 방법.
82. 표적 세포의 용해를 유도하는 방법으로서, 표적 세포를 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 존재 하에 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 유도 방법.
83. 실시형태 82 의 방법으로서, 표적 세포는 암 세포인 유도 방법.
84. 실시형태 82 또는 83 중 어느 하나의 방법으로서, 표적 세포는 FAP, CEA, p95, BCMA, EpCAM, MSLN, MCSP, HER-1, HER-2, HER-3, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, FOLR1, Trop-2, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (뮤신), A33-항원, PSMA, PSCA, 트랜스페린-수용체, TNC (테나신) 및 CA-IX 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 발현하는 유도 방법.
85. 실시형태 82 내지 84 중 어느 하나의 방법으로서, 표적 세포는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 및 테나신 (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원을 발현하는 유도 방법.
86. 약제의 제조를 위한 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나의 항원 결합 수용체, 실시형태 44 및 45 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 49 내지 51 중 어느 하나의 형질도입된 T 세포의 용도.
87. 실시형태 86 의 용도로서, 약제는 악성 질환의 치료를 위한 것인 용도.
88. 실시형태 86 의 용도로서, 약제는 질환의 치료를 위한 것인 용도.
89. 실시형태 87 의 용도로서, 상기 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
90. 실시형태 88 의 용도로서, 상기 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
이들 및 다른 실시형태가 개시되며 본 발명의 설명 및 실시예에 포괄된다. 본 발명에 따라 적용되는 항체, 방법, 용도 및 화합물 중 어느 하나에 관한 추가 문헌은 예를 들어 전자 장비를 사용하여 공공 도서관 및 데이타베이스에서 검색할 수 있다. 예를 들어, 인터넷에서 이용가능한 공용 데이타베이스 "Medline" 은 예를 들어 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html 에서 이용할 수 있다. 추가의 데이타베이스 및 주소, 예컨대 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ 는 당업자에게 알려져 있으며, 또한 http://www.lycos.com 을 사용해 얻을 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반 설명을 고려하여 다양한 다른 실시형태가 실시될 수 있다는 것을 이해한다.
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기술된 바와 같은 DNA를 조작하기 위한 표준 방법이 사용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조사의 지시서에 따라 사용되었다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌 [Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242] 에 제공되어 있다.
DNA 시퀀싱
DNA 서열은 이중 가닥 시퀀싱을 통해 결정하였다.
유전자 합성
바람직한 유전자 절편은 적절한 주형을 사용한 PCR을 통해 생성시키거나 또는 자동 유전자 합성을 통해 PCR 생성물 및 합성 올리고뉴클레오티드로부터 Geneart AG (Regensburg, Germany) 에서 합성하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측접된 유전자 절편은 표준 클로닝/시퀀싱 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA 는 형질전환된 박테리아로부터 정제하여 UV 분광법으로 농도를 결정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 시퀀싱을 통해 확증하였다. 유전자 절편은 개별 발현 벡터로 서브클로닝이 가능하도록 적합한 제한효소 부위를 갖도록 디자인되었다. 모든 구성체는 진핵생물 세포로 분비되도록 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 인코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 디자인되었다.
단백질 정제
단백질은 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상청액으로부터 정제되었다. 간략하게, 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼 (GE healthcare) 에 적용하였고 PBS 로 세척하였다. 항체의 용리는 pH 2.8과 이후 샘플의 즉각적인 중화에 의해 달성하였다. 응집된 단백질은 PBS 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare) 를 통해 단량체 항체로부터 분리시켰다. 단량체 항체 분획을 모으고, 예를 들어 MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 (필요하면) 농축시켰고, 냉동시키고 -20℃ 또는 -80℃ 에서 저장하였다. 샘플의 일부분은 예를 들어 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 통한 후속 단백질 분석 및 분석적 특성규명을 위해 제공되었다.
SDS-PAGE
NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen) 은 제조사의 지시서에 따라 사용되었다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 겔 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (환원성 겔, NuPAGE® 항산화제 러닝 완충액 첨가제 포함) 또는 MOPS (비환원성 겔) 러닝 완충액이 사용되었다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 결정을 위해서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 가 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 간략하게, 단백질 A 정제된 항체를 Agilent HPLC 1100 시스템 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼 또는 Dionex HPLC-시스템 상에서 2 x PBS 중의 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 에 적용되었다. 용리된 단백질은 UV 흡광도 및 피크 영역의 적분에 의해 정량되었다. BioRad 겔 여과 표준물 151-1901가 표준물로서 제공되었다.
항체 생산
국제 특허 출원 공보 No. WO2012/130831A1 에 기재된 방법에 따르면 Pro329Gly, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이를 불변 영역에 도입하여 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 없앴다. 따라서, I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 불변 영역에 도입하여 FcRn 에 대한 결합을 없앴다. 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 포유동물 발현 벡터로 동시트랜스펙션시킴으로써 각각의 항체를 생산했다. 세포를 1:1 비의 중쇄 및 경쇄에 관한 당해 발현 벡터로 형질감염시켰다.
저카트 NFAT T 세포의 렌티바이러스 형질도입
렌티바이러스 벡터를 생성시키기 위해서, 항원 결합 수용체의 올바른 조립을 위한 개별 DNA 서열을 항상적으로 활성화되는 인간 사이토메갈로바이러스 최초기 프로모터 (CMV) 하에서 렌티바이러스 폴리뉴클레오티드 벡터에 인프레임으로 클로닝되었다. 레트로바이러스 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE), 중심 폴리푸린 트랙 (cPPT) 엘리먼트, pUC 복제 기원 및 박테리아의 증식 및 선별을 용이하게 하는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자를 함유하였다.
기능적 바이러스 입자를 생성시키기 위해서, Lipofectamine LTX™ 기반 형질감염은 60-70% 융합성 Hek293T 세포 (ATCC CRL3216) 및 CAR 함유 벡터를 비롯하여 pCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV 전달 벡터를 3:1:1:1 비율로 사용하여 수행하였다. 48시간 후에 상청액을 수집하고, 5 분 동안 250g 에서 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 0.45 또는 0.22 ㎛ 폴리에테르술폰 필터를 통해 여과시켰다. 농축된 바이러스 입자 (Lenti-x-Concentrator, Takara) 를 사용하여 저카트 NFAT 세포 (Signosis) 에 형질도입시켰다. 양성 형질도입 세포는 FACSARIA 분류기 (BD Bioscience) 를 사용하여 풀로서 또는 단일 클론으로서 분류되었다. 적절한 밀도로 세포 확장 후 저카트 NFAT T 세포를 실험에 사용하였다.
실시예 1
여기에서 기재되는 것은 CD20 발현 SUDHDL4 종양 세포를 표적 세포로서 및 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀 (도 6A) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 풀 (도 6B) 을 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 IgG 을 IgG 로서 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 항원을 인지하고 다른 한편으로는 형질도입된 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 양성 대조군으로서 96 웰 플레이트 (Cellstar Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 를 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 4℃ 에서 밤새 또는 적어도 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에 PBS 를 완전히 제거했다. 이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다. 관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, 성장 배지에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 또는 1:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트 (triplicates) 로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다. 다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다. 20h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더 (reader), 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
5:1 (동그란 점) 또는 1:1 (정사각형) 비로 20 h 동안 표적 및 이펙터 세포의 공동배양시 그래프는 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 IgG 를 항체로서 사용할 때 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 뿐만 아니라 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 용량-의존적 활성화를 보여준다 (도 6 A 및 B, 흑색으로 표시됨). P329G LALA 돌연변이를 갖지 않는 GA101 IgG (도 6 A 및 B, 회색으로 표시됨) 를 사용한 경우에, 형질도입된 저카트 NFAT T 세포의 활성화가 검출가능하지 않았다. 각각의 점은, 각각 기술적 듀플리케이트로서 수행된, 생물학적 듀플리케이트 (duplicates) 의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 2
여기에서 기재되는 것은 CD20 발현 SUDHDL4 (도 7C 및 7D) 또는 WSUDLCL2 (도 7A 및 7B) 종양 세포를 표적 세포로서 및 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT 세포의 단일 클론을 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 IgG 을 IgG 로서 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 항원을 인지하고 다른 한편으로는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다. 관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, 성장 배지에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 10:1, 5:1 또는 1:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다. 다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다. 20h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
10:1 (동그란 점), 5:1 (정사각형) 또는 1:1 (삼각형) 비로 20 h 동안 표적 및 이펙터 세포의 공동배양시 그래프는 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 GA101 IgG 를 항체로서 사용할 때 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 용량-의존적 활성화를 보여준다 (도 7A-D , 흑색으로 표시됨). P329G LALA 돌연변이를 갖지 않는 GA101 IgG (도 7A-D, 회색으로 표시됨) 를 사용한 경우에, 1 ㎍/㎖ 의 최고 항체 농도에서 형질도입된 저카트 NFAT T 세포의 오직 적은 활성화가 검출가능했다. 각각의 점은 기술적 듀플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 3
여기에서 기재되는 것은 부착성 FAP 발현 NIH/3T3-huFAP cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하여 수행되는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. 이펙터 세포로서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8A) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8C) 의 분류된 풀을 사용했다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 FAP 4B9 IgG 을 IgG 로서 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 항원을 인지하고 다른 한편으로는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. P329G LALA 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다. 양성 대조군으로서 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 의 웰을 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 적어도 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에 PBS 를 완전히 제거했다. 부착성 NIH/3T3-huFAP cl 19 표적 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 탈착된 세포를 DMEM+4.5g LD-글루코스+L-글루타민+25mM HEPES+10%FCS 및 1% Glutamax 에 재현탁시켰다. 이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 T 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다. 관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, 성장 배지에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다. 다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서, 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96-웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다. 20 h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96-웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
도 8 B 및 8 D 는 상이한 대조군 조건과 비교되는 둘 모두 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 FAP 4B9 항체와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8 D) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8 B) 의 데이타를 나타낸다.
1 ㎍/㎖ FAP 4B9 P329G LALA 와 인큐베이션시, 저카트 NFAT T 세포 (도 8 B 및 8 D 흑색 삼각형) 뿐만 아니라 표적 세포 단독 (도 8 B 및 8 D 뒤집힌 흑색 삼각형) 은 임의의 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다.
또한 저카트 NFAT T 세포는 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 FAP 4B9 항체 (도 8 B 및 도 8 D 흑색 다이아몬드) 와 공동배양시 발광 신호를 보이지 않는다. 반면에 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 FAP 4B9 항체와 공동배양된 저카트 NFAT 세포의 CD3 의존적 활성화는 검출가능한 발광 신호 (백색 동그란 점) 를 통해 그들의 기능성을 입증한다.
표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 FAP 4B9 항체와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8 B 백색 사각형) 의 CD3 의존적 활성화 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 8 D 백색 사각형으로 표시됨) 의 활성화는 최고 발광 신호를 보여주며, 그 이유는 그것이 CAR 매개 활성화를 CD3 매개 활성화와 조합하기 때문이다. CD3 매개 발광 신호는 또한 CAR 가 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 DP47/vk3 항체 (도 8 B 및 도 8 D 뒤집힌 백색 삼각형) 와 인큐베이션될 때 가시적이다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 4
여기에서 기재되는 것은 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. 이펙터 세포로서 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 9 A) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 9 C) 의 분류된 풀을 사용했다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는, CEA A5B7 IgG 또는 CEA T84 LCHA IgG 을 사용했다. 추가로 P329G LALA 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다.
양성 대조군으로서 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 의 웰을 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에, PBS 를 완전히 제거했다.
부착성 MKN45 표적 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 탈착된 세포를 DMEM+4.5g LD-글루코스+L-글루타민 +25mM HEPES+10%FCS 및 1% Glutamax 에 재현탁시켰다.
이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다.
관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, RPMI-1640 + 10%FCS + 1% Glutamax 에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다.
표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다.
다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다.
20 h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
20 h 동안 5:1 비로 표적 및 이펙터 세포의 공동배양시 (도 9 A 및 C, 동그란 점) 그래프는 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 CEA A5B7 를 항체로서 사용했을 때 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 뿐만 아니라 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 용량-의존적 활성화를 보여준다 (도 9 A 및 C 회색 동그란 점). P329G LALA 돌연변이를 포함하는 CEA T84 LCHA 의 사용은 오직 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포에 대해서만 용량 의존적 활성화를 보여줬다 (도 9 A 흑색 동그란 점). 반면에, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체를 사용할 때 오직 1 ㎍/㎖ 의 최고 항체 농도에서 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화가 검출가능했다.
P329G LALA 돌연변이를 포함하는 대조군 항체 DP47/vk3 IgG (도 9 A 및 C, 흑색 삼각형) 를 사용한 경우에, 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 저카트 NFAT T 세포 또는 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화가 검출가능하지 않았다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
도 9 B 및 9 D 는 상이한 대조군 조건과 비교되는 둘 모두 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 CEA T8 LCHA P329G LALA 또는 CEA A5B7 P329G LALA 항체와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 9 B) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 9 D) 의 데이타를 나타낸다.
1 ㎍/㎖ CEA T8 LCHA P329G LALA 와 인큐베이션시, 저카트 NFAT CAR T 세포 단독 (도 9 B 및 9 D 흑색 다이아몬드) 뿐만 아니라 표적 세포 단독 (도 9 B 및 9 D 백색 동그라미) 은 임의의 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다.
또한 저카트 NFAT T 세포는 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG (도 9 B 및 도 9 D 백색 정사각형 및 백색 다이아몬드) 와 공동배양시 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다. 반면에 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG 와 공동배양된 저카트 NFAT T 세포의 CD3 의존적 활성화는 검출가능한 발광 신호를 통해 그들의 기능성을 입증한다 (도 9 B 및 D 회색 X 표).
표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG 와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 저카트 NFAT T 세포 (도 9 B 흑색 별모양 및 회색 별모양) 의 CD3 의존적 활성화 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포 (도 9 D 흑색 별모양 및 회색 별모양) 의 활성화는 최고 발광 신호를 보여주며, 그 이유는 CAR 매개 활성화 및 CD3 매개 활성화가 조합되기 때문이다. CD3 매개 발광 신호는 또한 CAR 가 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 DP47/vk3 항체 (도 9 B 및 도 9 D, 회색 플러스부호) 와 인큐베이션될 때 가시적이다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 5
여기에서 기재되는 것은 부착성 CEA 발현 MKN45 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. 이펙터 세포로서, 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 Jukat NFAT T 세포 (도 10 C) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 10 A) 의 분류된 풀을 사용했다. 둘 모두 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 CH1A1A 98 99 또는 CEA hMN14 IgG 를 사용했다. 추가로 P329G LALA 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다.
양성 대조군으로서 96-웰 플레이트 (Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 의 웰을 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에, PBS 를 완전히 제거했다.
부착성 MKN45 표적 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 탈착된 세포를 DMEM+4.5g LD-글루코스+L-글루타민 +25mM HEPES+10%FCS 및 1% Glutamax 에 재현탁시켰다.
이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다.
관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, RPMI-1640 + 10%FCS + 1% Glutamax 에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다.
표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다.
다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다.
20 h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96-웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
5:1 비로 표적 세포 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 20 h 공동배양시 (도 10 A 흑색 및 회색 동그란 점), CEA hMN14 항체 또는 CH1A1A 98 99 항체를 항체로서 사용했을 때 (도 9 A 및 B, 회색 동그란 점), 활성화가 검출가능하지 않다. 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포는 0.1 및 1 ㎍/㎖ 의 CEA hMN14 항체 또는 CH1A1A 98 99 항체 (도 10 C 흑색 및 회색 동그란 점) 둘 모두에서 적은 활성화를 보인다.
P329G LALA 돌연변이를 포함하는 대조군 항체 DP47/vk3 IgG (도 10 A 및 C, 흑색 삼각형) 를 사용한 경우에, 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화도 검출가능하지 않았고, 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화도 검출가능하지 않았다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
도 10 B 및 10 D 는 상이한 대조군 조건과 비교되는 둘 모두 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 CEA hMN14 항체 또는 CH1A1A 98 99 항체와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 D) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 NFAT T 세포 (도 9D) 의 데이타를 나타낸다.
CD3 를 활성화 자극으로서 사용한 경우를 제외하고는, 모든 수행된 대조군 실험은 임의의 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 6
여기에서 기재되는 것은 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. 이펙터 세포로서, 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 C) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 A) 의 분류된 풀을 사용했다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 TNCA2B10 을 IgG 로서 사용했다. 추가로 P329G LALA 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다.
양성 대조군으로서 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 의 웰을 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에, PBS 를 완전히 제거했다.
부착성 CT26TNC cl 19 표적 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 탈착된 세포를 RPMI-1630+10%FCS 및 1% Glutamax+ 15 ㎍/㎖ 퓨로마이신에 재현탁시켰다.
이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 T 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다.
관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, RPMI-1640 + 10%FCS + 1% Glutamax 에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다.
표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다.
다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다.
20 h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
20 h 동안 5:1 비로 표적 및 이펙터 세포의 공동배양시 (도 11 A 및 C 흑색 동그란 점) 그래프는 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 TNC A2B10 을 항체로서 사용했을 때 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 뿐만 아니라 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 용량-의존적 활성화를 보여준다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 대조군 항체 DP47/vk3 IgG (도 11 A 및 C 흑색 동그란 점) 를 사용한 경우에, 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화도 검출가능하지 않았고, 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화도 검출가능하지 않았다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
도 11 B 및 11 D 는 상이한 대조군 조건과 비교되는 둘 모두 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 TNC A2B10 와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 D) 또는 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 B) 의 데이타를 나타낸다.
저카트 NFAT T 세포는 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG 와 공동배양시 임의의 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다 (도 11 B 및 도 11 D 백색 삼각형). 반면에 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG 와 공동배양된 저카트 NFAT 세포의 CD3 의존적 활성화는 검출가능한 발광 신호를 통해 그들의 기능성을 입증한다 (도 11 B 및 도 11 D 백색 정사각형).
표적 세포 및 1 ㎍/㎖ IgG 와 공동배양된 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 B 백색 동그라미) 의 CD3 의존적 활성화는 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 11 D 백색 동그라미) 의 활성화는 최고 발광 신호를 보여주며, 그 이유는 CAR 매개 활성화 및 CD3 매개 활성화가 조합되기 때문이다. CD3 매개 발광 신호는 또한 CAR 가 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 DP47/vk3 항체와 인큐베이션될 때 가시적이다 (도 11 B 및 도 11 D, 흑색 다이아몬드). 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 7
여기에서 기재되는 것은 부착성 TNC 발현 CT26TNC cl 19 종양 세포를 표적 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. 이펙터 세포로서, 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 분류된 풀 (도 12 A) 을 사용했다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 TNCA2B10 을 IgG 로서 사용했다. 추가로 P329G LALA 돌연변이를 보유하는 IgG DP47/vk3 을 동형 대조군으로서 포함시켰다.
양성 대조군으로서 96-웰 플레이트 (Greiner-bio-one, CAT-No. 655185) 의 웰을 10 ㎍/㎖ CD3 항체 (Biolegend® 로부터의) 로 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 에서 1h 동안 37℃ 에서 코팅했다. CD3 코팅된 웰을 PBS 로 2 회 세정하고, 최종 세정 단계 후에, PBS 를 완전히 제거했다.
부착성 CT26TNC cl 19 표적 세포를 PBS 로 1 회 세정하고, 트립신을 사용하여 탈착시켰다. 탈착된 세포를 RPMI-1630+10%FCS 및 1% Glutamax+ 15 ㎍/㎖ 퓨로마이신에 재현탁시켰다.
이펙터 세포 또는 저카트 NFAT 야생형 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 그러므로 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax (성장 배지) 에 재현탁시켰다.
관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, RPMI-1640 + 10%FCS + 1% Glutamax 에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다.
표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다.
다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, P329G LALA 돌연변이를 포함하는 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ul/웰의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다.
20 h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ul ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다.
20 h 동안 5:1 비로 표적 및 이펙터 세포의 공동배양시 (도 12 A 흑색 동그란 점) 그래프는 0.01 ㎍/㎖ 의 P329G LALA 돌연변이를 포함하는 TNC A2B10 로 시작하는 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 용량-의존적 활성화를 보여준다. P329G LALA 돌연변이를 포함하는 대조군 항체 DP47/vk3 IgG (도 12 A 및 C 회색 동그란 점) 를 사용한 경우에, 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 활성화가 검출가능하지 않았다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 모든 값은 기준선 보정하여 표시되어 있다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
도 12 B 는 상이한 대조군 조건과 비교되는 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 TNC A2B10 항체와 공동배양된 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포의 데이타를 나타낸다.
표적 세포와 함께 그러나 항체의 부재 하에 인큐베이션된 항-P329G-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 발현 저카트 NFAT T 세포 (도 12 B 흑색 정사각형) 뿐만 아니라 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 TNC A2B10 항체와 함께 인큐베이션된 저카트 NFAT 세포 (도 12 B 백색 동그란 점) 는 검출가능한 발광 신호를 보이지 않는다. 반면에 CD3 코팅된 웰에 플레이팅된 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 TNC A2B10 와 공동배양된 저카트 NFAT 세포는 분명한 발광 신호를 보인다.
추가로, CD3 코팅된 웰에서, 표적 세포 및 1 ㎍/㎖ 의 TNC A2B10 또는 1 ㎍/㎖ DP47/vk3 항체와 인큐베이션된 항-P329G--CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD Fab 발현 저카트 NFAT T 세포는 높은 발광 신호를 보인다. 각각의 점은 기술적 트리플리케이트의 평균 값을 나타낸다. 표준 편차는 에러 바에 의해 표시된다.
실시예 8
여기에서 기재되는 것은 CD20 발현 SUDHDL4 종양 세포를 표적 세포로서 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (도 13A) 또는 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (도 13B) 발현 저카트 NFAT 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. P329G LALA, D265A P329G 돌연변이, LALA 돌연변이 단독을 포함하는 또는 돌연변이를 전혀 포함하지 않는 GA101 IgG 를 IgG 로서 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 항원을 인지하고 다른 한편으로는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 이펙터 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax 에 재현탁시켰다. 관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, 성장 배지에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 96-웰 현탁 배양 플레이트 (Greiner-bio one) 에 플레이팅했다. 다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, 상이한 항체의 계열 희석물을 2 ㎖ 딥 웰 플레이트 (Axygen®) 를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 200 ㎕/웰 의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 10 pg/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 50 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 96 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다. 20h 인큐베이션 후에 각각의 웰의 내용물을 멀티채널 피펫을 사용하여 아래 위로 10 회 피펫팅에 의해 혼합했다. 100 ㎕ 세포 현탁액을 새로운 백색 넓적 투명 바닥 96 웰 플레이트 (Greiner-bio-one) 로 옮기고, 100 ㎕ ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가했다. 어둠 속에서 회전식 셰이커에서 300 rpm 및 RT 에서 15 min 인큐베이션 후에 Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 발광을 측정했다. 그래프는 P329G 돌연변이 또는 P329G 및 LALA 돌연변이 (그러나 LALA 돌연변이 단독은 아님) 를 보유하는 항체를 사용할 때에만 표적 세포의 용량 의존적 활성화를 보인다. 추가로, GA101 야생형 항체를 사용하는 경우에, 이펙터 세포의 활성화는 검출가능하지 않다.
실시예 9
여기에서 기재되는 것은 CD20 발현 SUDHDL4 종양 세포를 표적 세포로서 및 항-P329G-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (도 14A) 또는 항-P329G-ds-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD (도 14B) 발현 저카트 NFAT 세포의 풀을 이펙터 세포로서 사용하는 저카트 NFAT T 세포 리포터 어세이이다. P329G LALA, P329G 돌연변이 단독, LALA 돌연변이 단독을 포함하는 또는 돌연변이를 전혀 포함하지 않는 GA101 IgG 을 IgG 로서 사용했으며, 이는 한편으로는 종양 항원을 인지하고 다른 한편으로는 저카트 NFAT T 세포에 의해 인지된다. 이펙터 세포를 계수하고, Cedex HiRes 를 사용하여 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 세포 현탁액의 적당한 앨리쿼트를 210g 에서 5 min 동안 실온 (RT) 에서 펠렛화하고, 신선한 RPMI-160+10% FCS+1% Glutamax 에 재현탁시켰다. 관심의 항원을 발현하는 표적 세포를 계수하고, 또한 그들의 생활력에 대해 확인했다. 세포 수를, 이펙터 세포에 대해 기재된 바와 유사하게, 성장 배지에서 1x106 생세포/㎖ 로 조정했다. 표적 세포 및 이펙터 세포를 5:1 E:T 비 (총 110.000 세포/웰) 로 트리플리케이트로 384-웰 플레이트에 플레이팅했다. 다음 단계로서, 관심의 항원을 표적화하는, 상이한 항체의 계열 희석물을 96 웰 플레이트를 사용하여 성장 배지에서 제조했다. 30 ㎕/웰 의 최종 부피에서 1 ㎍/㎖ 내지 10 pg/㎖ 범위의 최종 농도를 얻기 위해서, 상이한 희석물의 10 ㎕ 앨리쿼트를 각각의 웰에 피펫팅했다. 384 웰 플레이트를 2 min 동안 190g 및 RT 에서 원심분리했다. Parafilm® 으로 밀봉된, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 습한 분위기에서 인큐베이션했다. 20h 인큐베이션 후에, 6 ㎕ 의 ONE-Glo™ Luciferase Assay (Promega) 를 첨가하고, Tecan® Spark10M 플레이트 리더, 검출 시간으로서 1 sec/웰 을 사용하여 판독을 즉시 수행했다. 그래프는 P329G 돌연변이 또는 P329G 및 LALA 돌연변이 (그러나 LALA 돌연변이 단독은 아님) 을 보유하는 항체를 사용할 때에만 표적 세포의 용량 의존적 활성화를 보여준다. 추가로, GA101 야생형 항체를 사용하는 경우에는 이펙터 세포의 활성화가 검출가능하지 않다.
예시적 서열
*
*
*
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche Ltd
<120> Improved antigen binding receptors
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<160> 130
<170> PatentIn version 3.5
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35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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130 135 140
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Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val
245 250 255
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
260 265 270
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
275 280 285
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
290 295 300
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
305 310 315 320
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
325 330 335
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
340 345 350
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
355 360 365
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370 375 380
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
385 390 395 400
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
405 410 415
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
420 425 430
Arg
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<223> Anti-P329G-ds VH
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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165 170 175
Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr
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Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile
195 200 205
Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu
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Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly
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<213> Artificial sequence
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
85 90 95
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
100 105 110
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
130 135 140
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
165 170 175
Leu Pro Pro Arg
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<223> eGFP
<400> 15
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
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Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
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Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> (G4S)4 linker
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> G4S linker
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> T2A linker
<400> 18
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 19
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion pETR17096
<400> 19
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120
tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180
ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240
cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360
tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480
gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540
aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600
gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660
aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720
gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780
ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840
ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900
agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960
cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020
agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080
tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140
agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260
aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagg 1356
<210> 20
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds VH
<400> 20
gaggtgaagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcgccg ccagcggctt cgacttcagc aggtactgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagt gtctggagtg gatcggcgag atcacccccg acagcagcac catcaactac 180
acccccagcc tgaaggacaa gttcatcatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga tcaaggtgag gagcgaggac accgccctgt actactgcgt gaggccctac 300
gactacggcg cctggttcgc cagctggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcc 357
<210> 21
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds VL
<400> 21
caggccgtgg tgacccagga gagcgccctg accaccagcc ccggcgagac cgtgaccctg 60
acctgcagga gcagcaccgg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggag 120
aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaagagggc ccccggcgtg 180
cccgccaggt tcagcggcag cctgatcggc gacaaggccg ccctgaccat caccggcgcc 240
cagaccgagg acgaggccat ctacttctgc gccctgtggt acagcaacca ctgggtgttc 300
ggctgtggca ccaagctgac cgtgctg 327
<210> 22
<211> 799
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-scFv
<400> 22
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120
tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180
ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240
cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360
tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480
gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540
aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600
gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660
aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720
gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780
ggcaccaagc tgaccgtgc 799
<210> 23
<211> 647
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IRES EV71, internal ribosomal entry side
<400> 23
cccgaagtaa cttagaagct gtaaatcaac gatcaatagc aggtgtggca caccagtcat 60
accttgatca agcacttctg tttccccgga ctgagtatca ataggctgct cgcgcggctg 120
aaggagaaaa cgttcgttac ccgaccaact acttcgagaa gcttagtacc accatgaacg 180
aggcagggtg tttcgctcag cacaacccca gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaac 240
ccccatgggc gaccatggca gtggctgcgt tggcggcctg cccatggaga aatccatggg 300
acgctctaat tctgacatgg tgtgaagtgc ctattgagct aactggtagt cctccggccc 360
ctgattgcgg ctaatcctaa ctgcggagca catgctcaca aaccagtggg tggtgtgtcg 420
taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattcct 480
atattggctg cttatggtga caatcaaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca 540
tccggtgtgc aacagggcaa ctgtttacct atttattggt tttgtaccat tatcactgaa 600
gtctgtgatc actctcaaat tcattttgac cctcaacaca atcaaac 647
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATM
<400> 24
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 25
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28CSD
<400> 25
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD3z SSD
<400> 26
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 27
<211> 540
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28ATM-CD28-CD3z
<400> 27
ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60
gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag aggagcaggc tgctgcacag cgactacatg 120
aacatgaccc ccaggaggcc cggccccacc aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180
agggacttcg ccgcctacag gagcagggtg aagttcagca ggagcgccga cgcccccgcc 240
taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag ggaggagtac 300
gacgtgctgg acaagaggag gggcagggac cccgagatgg gcggcaagcc caggaggaag 360
aacccccagg agggcctgta taacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcctacagc 420
gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 480
ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccagg 540
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> T2A element
<400> 28
tccggagagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 60
agg 63
<210> 29
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> eGFP
<400> 29
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtga 717
<210> 30
<211> 2136
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP fusion pETR17096
<400> 30
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120
tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180
ggcaagtgtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240
cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360
tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480
gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540
aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600
gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660
aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720
gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggctgt 780
ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840
ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900
agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960
cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020
agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080
tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140
agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260
aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaggtccg gagagggcag aggaagtctt 1380
ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctaggg tgagcaaggg cgaggagctg 1440
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1500
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1560
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 1620
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1680
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1740
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1800
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1860
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1920
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1980
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2040
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2100
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtga 2136
<210> 31
<211> 433
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-scFv- CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
<400> 31
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
130 135 140
Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
165 170 175
Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr
180 185 190
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile
195 200 205
Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu
210 215 220
Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val
245 250 255
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
260 265 270
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
275 280 285
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
290 295 300
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
305 310 315 320
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
325 330 335
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
340 345 350
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
355 360 365
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
385 390 395 400
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
405 410 415
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
420 425 430
Arg
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G VH
<400> 32
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G VL
<400> 33
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 34
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-scFv
<400> 34
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
130 135 140
Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
165 170 175
Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr
180 185 190
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile
195 200 205
Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu
210 215 220
Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 35
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
<400> 35
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120
tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180
ggcaagggtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240
cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360
tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480
gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540
aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600
gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660
aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720
gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggcggt 780
ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840
ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900
agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960
cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020
agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080
tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140
agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260
aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagg 1356
<210> 36
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G VH
<400> 36
gaggtgaagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaagctg 60
agctgcgccg ccagcggctt cgacttcagc aggtactgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gtctggagtg gatcggcgag atcacccccg acagcagcac catcaactac 180
acccccagcc tgaaggacaa gttcatcatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga tcaaggtgag gagcgaggac accgccctgt actactgcgt gaggccctac 300
gactacggcg cctggttcgc cagctggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcc 357
<210> 37
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G VL
<400> 37
caggccgtgg tgacccagga gagcgccctg accaccagcc ccggcgagac cgtgaccctg 60
acctgcagga gcagcaccgg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggag 120
aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaagagggc ccccggcgtg 180
cccgccaggt tcagcggcag cctgatcggc gacaaggccg ccctgaccat caccggcgcc 240
cagaccgagg acgaggccat ctacttctgc gccctgtggt acagcaacca ctgggtgttc 300
ggcggtggca ccaagctgac cgtgctg 327
<210> 38
<211> 2136
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP fusion
<400> 38
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgag 60
gtgaagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaagctgagc 120
tgcgccgcca gcggcttcga cttcagcagg tactggatga actgggtgag gcaggccccc 180
ggcaagggtc tggagtggat cggcgagatc acccccgaca gcagcaccat caactacacc 240
cccagcctga aggacaagtt catcatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgatca aggtgaggag cgaggacacc gccctgtact actgcgtgag gccctacgac 360
tacggcgcct ggttcgccag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cgccggaggg 420
ggcggaagtg gtggcggggg aagcggcggg ggtggcagcg gagggggcgg atctcaggcc 480
gtggtgaccc aggagagcgc cctgaccacc agccccggcg agaccgtgac cctgacctgc 540
aggagcagca ccggcgccgt gaccaccagc aactacgcca actgggtgca ggagaagccc 600
gaccacctgt tcaccggcct gatcggcggc accaacaaga gggcccccgg cgtgcccgcc 660
aggttcagcg gcagcctgat cggcgacaag gccgccctga ccatcaccgg cgcccagacc 720
gaggacgagg ccatctactt ctgcgccctg tggtacagca accactgggt gttcggcggt 780
ggcaccaagc tgaccgtgct gggagggggc ggatccttct gggtgctggt ggtggtgggc 840
ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg accgtggcct tcatcatctt ctgggtgagg 900
agcaagagga gcaggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag gaggcccggc 960
cccaccagga agcactacca gccctacgcc ccccccaggg acttcgccgc ctacaggagc 1020
agggtgaagt tcagcaggag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1080
tataacgagc tgaacctggg caggagggag gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc 1140
agggaccccg agatgggcgg caagcccagg aggaagaacc cccaggaggg cctgtataac 1200
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagagg 1260
aggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1320
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaggtccg gagagggcag aggaagtctt 1380
ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctaggg tgagcaaggg cgaggagctg 1440
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 1500
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 1560
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 1620
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 1680
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1740
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1800
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1860
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1920
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1980
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2040
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2100
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtga 2136
<210> 39
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-Fab- heavy chain-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR17100
<400> 39
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
245 250 255
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
260 265 270
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
290 295 300
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
305 310 315 320
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
325 330 335
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
340 345 350
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
355 360 365
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
370 375 380
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
385 390 395 400
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
<210> 40
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-Fab heavy chain
<400> 40
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 41
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti P329G-ds-Fab light chain
<400> 41
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CL
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 43
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CH1
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 44
<211> 2645
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-Fab-heavy chain-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR17100
<400> 44
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60
gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120
tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180
cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240
gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300
accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360
tgtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720
gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780
atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840
aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900
ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960
gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020
taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080
gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140
gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200
gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260
gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320
gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380
gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440
agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500
gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagtgtctgg 1560
agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620
acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680
tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740
tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800
ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860
gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920
cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980
gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040
acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100
gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160
ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220
acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280
cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340
ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400
agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460
ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520
acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580
agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640
ccagg 2645
<210> 45
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CL
<400> 45
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 46
<211> 309
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CH1
<400> 46
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 180
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgc 309
<210> 47
<211> 3425
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-ds-Fab-heavy chain-CD28TM-CD28CSD-CD3ZSSD-eGFP fusion
pETR17100
<400> 47
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60
gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120
tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180
cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240
gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300
accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360
tgtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720
gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780
atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840
aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900
ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960
gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020
taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080
gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140
gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200
gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260
gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320
gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380
gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440
agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500
gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagtgtctgg 1560
agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620
acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680
tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740
tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800
ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc gctctgggct 1860
gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc ggagccctga 1920
cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat agcctgagca 1980
gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc 2040
acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100
gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160
ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220
acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280
cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340
ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400
agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460
ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520
acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580
agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640
ccaggtccgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 2700
gccctagggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 2760
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 2820
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 2880
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 2940
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 3000
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 3060
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 3120
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 3180
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 3240
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 3300
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 3360
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 3420
agtga 3425
<210> 48
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-Fab-heavy chain-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR17594
<400> 48
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
245 250 255
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
260 265 270
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
290 295 300
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
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Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
325 330 335
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
340 345 350
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
355 360 365
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
370 375 380
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
385 390 395 400
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
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<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-Fab heavy chain
<400> 49
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 50
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-Fab light chain
<400> 50
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-Fab-heavy chain-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
pETR17594
<400> 51
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacgggtgt gcattcccag 60
gccgtggtga cccaggagag cgccctgacc accagccccg gcgagaccgt gaccctgacc 120
tgcaggagca gcaccggcgc cgtgaccacc agcaactacg ccaactgggt gcaggagaag 180
cccgaccacc tgttcaccgg cctgatcggc ggcaccaaca agagggcccc cggcgtgccc 240
gccaggttca gcggcagcct gatcggcgac aaggccgccc tgaccatcac cggcgcccag 300
accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360
ggtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720
gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780
atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840
aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900
ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960
gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020
taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080
gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140
gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200
gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260
gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320
gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380
gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440
agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500
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agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620
acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680
tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740
tcgccagctg gggccagggc accctggtga ccgtgagcgc cgctagcacc aagggcccct 1800
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acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100
gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160
ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220
acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280
cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340
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agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460
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agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640
ccagg 2645
<210> 52
<211> 3425
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-P329G-Fab-heavy chain-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP fusion
pETR17594
<400> 52
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accgaggacg aggccatcta cttctgcgcc ctgtggtaca gcaaccactg ggtgttcggc 360
ggtggcacca agctgaccgt gctgcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagga attccccgaa 720
gtaacttaga agctgtaaat caacgatcaa tagcaggtgt ggcacaccag tcataccttg 780
atcaagcact tctgtttccc cggactgagt atcaataggc tgctcgcgcg gctgaaggag 840
aaaacgttcg ttacccgacc aactacttcg agaagcttag taccaccatg aacgaggcag 900
ggtgtttcgc tcagcacaac cccagtgtag atcaggctga tgagtcactg caacccccat 960
gggcgaccat ggcagtggct gcgttggcgg cctgcccatg gagaaatcca tgggacgctc 1020
taattctgac atggtgtgaa gtgcctattg agctaactgg tagtcctccg gcccctgatt 1080
gcggctaatc ctaactgcgg agcacatgct cacaaaccag tgggtggtgt gtcgtaacgg 1140
gcaactctgc agcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tcctatattg 1200
gctgcttatg gtgacaatca aaaagttgtt accatatagc tattggattg gccatccggt 1260
gtgcaacagg gcaactgttt acctatttat tggttttgta ccattatcac tgaagtctgt 1320
gatcactctc aaattcattt tgaccctcaa cacaatcaaa cgccaccatg ggatggagct 1380
gtatcatcct cttcttggta gcaacagcta ccggtgtgca ctccgaggtg aagctgctgg 1440
agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgaa gctgagctgc gccgccagcg 1500
gcttcgactt cagcaggtac tggatgaact gggtgaggca ggcccccggc aagggtctgg 1560
agtggatcgg cgagatcacc cccgacagca gcaccatcaa ctacaccccc agcctgaagg 1620
acaagttcat catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgatcaagg 1680
tgaggagcga ggacaccgcc ctgtactact gcgtgaggcc ctacgactac ggcgcctggt 1740
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acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc ggagggggcg 2100
gatccttctg ggtgctggtg gtggtgggcg gcgtgctggc ctgctacagc ctgctggtga 2160
ccgtggcctt catcatcttc tgggtgagga gcaagaggag caggctgctg cacagcgact 2220
acatgaacat gacccccagg aggcccggcc ccaccaggaa gcactaccag ccctacgccc 2280
cccccaggga cttcgccgcc tacaggagca gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc 2340
ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg 2400
agtacgacgt gctggacaag aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga 2460
ggaagaaccc ccaggagggc ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct 2520
acagcgagat cggcatgaag ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc 2580
agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc 2640
ccaggtccgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 2700
gccctagggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 2760
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 2820
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 2880
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 2940
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 3000
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 3060
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 3120
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 3180
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 3240
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 3300
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 3360
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 3420
agtga 3425
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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Ser Ser Gly Gly Ser Tyr
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA CDR H3 Kabat
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA CDR L1 Kabat
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<213> Artificial sequence
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<223> Anti-AAA CDR L2 Kabat
<400> 57
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA CDR L3 Kabat
<400> 58
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 457
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA-scFv-CD28ATM-CD28CSD-CD3zSSD fusion
<400> 59
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
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65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
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Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
165 170 175
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
180 185 190
Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
210 215 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
225 230 235 240
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
245 250 255
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
275 280 285
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
290 295 300
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
305 310 315 320
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
325 330 335
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
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Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
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Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
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Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
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Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
420 425 430
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
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Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA-scFv
<400> 60
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
165 170 175
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
180 185 190
Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
210 215 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
225 230 235 240
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
245 250 255
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
260 265 270
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA VL
<400> 62
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
245 250 255
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
260 265 270
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
275 280 285
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
290 295 300
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
325 330 335
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
340 345 350
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
355 360 365
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
370 375 380
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
385 390 395 400
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
405 410 415
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA-Fab heavy chain
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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
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Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-AAA-Fab light chain
<400> 65
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 66
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
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accccggcgc cgaaaagctg cccggaacgc cattattggg cgcagggcaa actgtgctgc 120
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cagtgcgatc cgtgcattcc gggcgtgagc tttagcccgg atcatcatac ccgcccgcat 240
tgcgaaagct gccgccattg caacagcggc ctgctggtgc gcaactgcac cattaccgcg 300
aacgcggaat gcgcgtgccg caacggctgg cagtgccgcg ataaagaatg caccgaatgc 360
gatccgctgc cgaacccgag cctgaccgcg cgcagcagcc aggcgctgag cccgcatccg 420
cagccgaccc atctgccgta tgtgagcgaa atgctggaag cgcgcaccgc gggccatatg 480
cagaccctgg cggattttcg ccagctgccg gcgcgcaccc tgagcaccca ttggccgccg 540
cagcgcagcc tgtgcagcag cgattttatt cgcattctgg tgatttttag cggcatgttt 600
ctggtgttta ccctggcggg cgcgctgttt ctgcatcagc gccgcaaata tcgcagcaac 660
aaaggcgaaa gcccggtgga accggcggaa ccgtgccatt atagctgccc gcgcgaagaa 720
gaaggcagca ccattccgat tcaggaagat tatcgcaaac cggaaccggc gtgcagcccg 780
<210> 67
<211> 260
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr
20 25 30
Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
35 40 45
Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His
65 70 75 80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys
85 90 95
Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys
100 105 110
Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His
130 135 140
Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met
145 150 155 160
Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr
165 170 175
His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile
180 185 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
195 200 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
225 230 235 240
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
245 250 255
Ala Cys Ser Pro
260
<210> 68
<211> 750
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 68
atggcgtggc cgccgccgta ttggctgtgc atgctgggca ccctggtggg cctgagcgcg 60
accctggcgc cgaacagctg cccggataaa cattattgga ccggcggcgg cctgtgctgc 120
cgcatgtgcg aaccgggcac cttttttgtg aaagattgcg aacaggatcg caccgcggcg 180
cagtgcgatc cgtgcattcc gggcaccagc tttagcccgg attatcatac ccgcccgcat 240
tgcgaaagct gccgccattg caacagcggc tttctgattc gcaactgcac cgtgaccgcg 300
aacgcggaat gcagctgcag caaaaactgg cagtgccgcg atcaggaatg caccgaatgc 360
gatccgccgc tgaacccggc gctgacccgc cagccgagcg aaaccccgag cccgcagccg 420
ccgccgaccc atctgccgca tggcaccgaa aaaccgagct ggccgctgca tcgccagctg 480
ccgaacagca ccgtgtatag ccagcgcagc agccatcgcc cgctgtgcag cagcgattgc 540
attcgcattt ttgtgacctt tagcagcatg tttctgattt ttgtgctggg cgcgattctg 600
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ccgtgcccgt atagctgccc gcgcgaagaa gaaggcagcg cgattccgat tcaggaagat 720
tatcgcaaac cggaaccggc gttttatccg 750
<210> 69
<211> 250
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 69
Met Ala Trp Pro Pro Pro Tyr Trp Leu Cys Met Leu Gly Thr Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Ser Ala Thr Leu Ala Pro Asn Ser Cys Pro Asp Lys His Tyr
20 25 30
Trp Thr Gly Gly Gly Leu Cys Cys Arg Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
35 40 45
Phe Val Lys Asp Cys Glu Gln Asp Arg Thr Ala Ala Gln Cys Asp Pro
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Thr Ser Phe Ser Pro Asp Tyr His Thr Arg Pro His
65 70 75 80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Phe Leu Ile Arg Asn Cys
85 90 95
Thr Val Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ser Cys Ser Lys Asn Trp Gln Cys
100 105 110
Arg Asp Gln Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Ala Leu
115 120 125
Thr Arg Gln Pro Ser Glu Thr Pro Ser Pro Gln Pro Pro Pro Thr His
130 135 140
Leu Pro His Gly Thr Glu Lys Pro Ser Trp Pro Leu His Arg Gln Leu
145 150 155 160
Pro Asn Ser Thr Val Tyr Ser Gln Arg Ser Ser His Arg Pro Leu Cys
165 170 175
Ser Ser Asp Cys Ile Arg Ile Phe Val Thr Phe Ser Ser Met Phe Leu
180 185 190
Ile Phe Val Leu Gly Ala Ile Leu Phe Phe His Gln Arg Arg Asn His
195 200 205
Gly Pro Asn Glu Asp Arg Gln Ala Val Pro Glu Glu Pro Cys Pro Tyr
210 215 220
Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Ala Ile Pro Ile Gln Glu Asp
225 230 235 240
Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Phe Tyr Pro
245 250
<210> 70
<211> 660
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 70
atgctgcgcc tgctgctggc gctgaacctg tttccgagca ttcaggtgac cggcaacaaa 60
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aaatatagct ataacctgtt tagccgcgaa tttcgcgcga gcctgcataa aggcctggat 180
agcgcggtgg aagtgtgcgt ggtgtatggc aactatagcc agcagctgca ggtgtatagc 240
aaaaccggct ttaactgcga tggcaaactg ggcaacgaaa gcgtgacctt ttatctgcag 300
aacctgtatg tgaaccagac cgatatttat ttttgcaaaa ttgaagtgat gtatccgccg 360
ccgtatctgg ataacgaaaa aagcaacggc accattattc atgtgaaagg caaacatctg 420
tgcccgagcc cgctgtttcc gggcccgagc aaaccgtttt gggtgctggt ggtggtgggc 480
ggcgtgctgg cgtgctatag cctgctggtg accgtggcgt ttattatttt ttgggtgcgc 540
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<210> 71
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 72
<211> 654
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 72
atgaccctgc gcctgctgtt tctggcgctg aactttttta gcgtgcaggt gaccgaaaac 60
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ctgttttgct atggcctgct ggtgaccgtg gcgctgtgcg tgatttggac caacagccgc 540
cgcaaccgcc tgctgcagag cgattatatg aacatgaccc cgcgccgccc gggcctgacc 600
cgcaaaccgt atcagccgta tgcgccggcg cgcgattttg cggcgtatcg cccg 654
<210> 73
<211> 218
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 73
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln
1 5 10 15
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val
20 25 30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val
50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val
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Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr
130 135 140
Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val
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195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
210 215
<210> 74
<211> 768
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 74
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acctgtgaca tatgcaggca gtgtaaaggt gttttcagga ccaggaagga gtgttcctcc 240
accagcaatg cagagtgtga ctgcactcca gggtttcact gcctgggggc aggatgcagc 300
atgtgtgaac aggattgtaa acaaggtcaa gaactgacaa aaaaaggttg taaagactgt 360
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tctccagccg acctctctcc gggagcatcc tctgtgaccc cgcctgcccc tgcgagagag 540
ccaggacact ctccgcagat catctccttc tttcttgcgc tgacgtcgac tgcgttgctc 600
ttcctgctgt tcttcctcac gctccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaaactc 660
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 720
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<213> Homo sapiens
<400> 75
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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<211> 768
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 76
atgggcaaca actgctataa cgtggtggtg attgtgctgc tgctggtggg ctgcgaaaaa 60
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cataacgcgg aatgcgaatg cattgaaggc tttcattgcc tgggcccgca gtgcacccgc 300
tgcgaaaaag attgccgccc gggccaggaa ctgaccaaac agggctgcaa aacctgcagc 360
ctgggcacct ttaacgatca gaacggcacc ggcgtgtgcc gcccgtggac caactgcagc 420
ctggatggcc gcagcgtgct gaaaaccggc accaccgaaa aagatgtggt gtgcggcccg 480
ccggtggtga gctttagccc gagcaccacc attagcgtga ccccggaagg cggcccgggc 540
ggccatagcc tgcaggtgct gaccctgttt ctggcgctga ccagcgcgct gctgctggcg 600
ctgattttta ttaccctgct gtttagcgtg ctgaaatgga ttcgcaaaaa atttccgcat 660
atttttaaac agccgtttaa aaaaaccacc ggcgcggcgc aggaagaaga tgcgtgcagc 720
tgccgctgcc cgcaggaaga agaaggcggc ggcggcggct atgaactg 768
<210> 77
<211> 256
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 77
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 78
<211> 831
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
atgtgcgtgg gcgcgcgccg cctgggccgc ggcccgtgcg cggcgctgct gctgctgggc 60
ctgggcctga gcaccgtgac cggcctgcat tgcgtgggcg atacctatcc gagcaacgat 120
cgctgctgcc atgaatgccg cccgggcaac ggcatggtga gccgctgcag ccgcagccag 180
aacaccgtgt gccgcccgtg cggcccgggc ttttataacg atgtggtgag cagcaaaccg 240
tgcaaaccgt gcacctggtg caacctgcgc agcggcagcg aacgcaaaca gctgtgcacc 300
gcgacccagg ataccgtgtg ccgctgccgc gcgggcaccc agccgctgga tagctataaa 360
ccgggcgtgg attgcgcgcc gtgcccgccg ggccatttta gcccgggcga taaccaggcg 420
tgcaaaccgt ggaccaactg caccctggcg ggcaaacata ccctgcagcc ggcgagcaac 480
agcagcgatg cgatttgcga agatcgcgat ccgccggcga cccagccgca ggaaacccag 540
ggcccgccgg cgcgcccgat taccgtgcag ccgaccgaag cgtggccgcg caccagccag 600
ggcccgagca cccgcccggt ggaagtgccg ggcggccgcg cggtggcggc gattctgggc 660
ctgggcctgg tgctgggcct gctgggcccg ctggcgattc tgctggcgct gtatctgctg 720
cgccgcgatc agcgcctgcc gccggatgcg cataaaccgc cgggcggcgg cagctttcgc 780
accccgattc aggaagaaca ggcggatgcg catagcaccc tggcgaaaat t 831
<210> 79
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 80
<211> 816
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 80
atgtatgtgt gggtgcagca gccgaccgcg ctgctgctgc tggcgctgac cctgggcgtg 60
accgcgcgcc gcctgaactg cgtgaaacat acctatccga gcggccataa atgctgccgc 120
gaatgccagc cgggccatgg catggtgagc cgctgcgatc atacccgcga taccctgtgc 180
catccgtgcg aaaccggctt ttataacgaa gcggtgaact atgatacctg caaacagtgc 240
acccagtgca accatcgcag cggcagcgaa ctgaaacaga actgcacccc gacccaggat 300
accgtgtgcc gctgccgccc gggcacccag ccgcgccagg atagcggcta taaactgggc 360
gtggattgcg tgccgtgccc gccgggccat tttagcccgg gcaacaacca ggcgtgcaaa 420
ccgtggacca actgcaccct gagcggcaaa cagacccgcc atccggcgag cgatagcctg 480
gatgcggtgt gcgaagatcg cagcctgctg gcgaccctgc tgtgggaaac ccagcgcccg 540
acctttcgcc cgaccaccgt gcagagcacc accgtgtggc cgcgcaccag cgaactgccg 600
agcccgccga ccctggtgac cccggaaggc ccggcgtttg cggtgctgct gggcctgggc 660
ctgggcctgc tggcgccgct gaccgtgctg ctggcgctgt atctgctgcg caaagcgtgg 720
cgcctgccga acaccccgaa accgtgctgg ggcaacagct ttcgcacccc gattcaggaa 780
gaacataccg atgcgcattt taccctggcg aaaatt 816
<210> 81
<211> 272
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 81
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 82
<211> 597
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
atgaaaagcg gcctgtggta tttttttctg ttttgcctgc gcattaaagt gctgaccggc 60
gaaattaacg gcagcgcgaa ctatgaaatg tttatttttc ataacggcgg cgtgcagatt 120
ctgtgcaaat atccggatat tgtgcagcag tttaaaatgc agctgctgaa aggcggccag 180
attctgtgcg atctgaccaa aaccaaaggc agcggcaaca ccgtgagcat taaaagcctg 240
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gtgaccctga ccggcggcta tctgcatatt tatgaaagcc agctgtgctg ccagctgaaa 420
ttttggctgc cgattggctg cgcggcgttt gtggtggtgt gcattctggg ctgcattctg 480
atttgctggc tgaccaaaaa aaaatatagc agcagcgtgc atgatccgaa cggcgaatat 540
atgtttatgc gcgcggtgaa caccgcgaaa aaaagccgcc tgaccgatgt gaccctg 597
<210> 83
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Val Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val
35 40 45
Gln Gln Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Tyr Asn Leu Asp His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu
115 120 125
His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe Trp Leu Pro
130 135 140
Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
145 150 155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro
165 170 175
Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
<210> 84
<211> 600
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 84
atgaaaccgt atttttgccg cgtgtttgtg ttttgctttc tgattcgcct gctgaccggc 60
gaaattaacg gcagcgcgga tcatcgcatg tttagctttc ataacggcgg cgtgcagatt 120
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gtgctgtgcg aactgaccaa aaccaaaggc agcggcaacg cggtgagcat taaaaacccg 240
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gaacgcaacc tgagcggcgg ctatctgcat atttatgaaa gccagctgtg ctgccagctg 420
aaactgtggc tgccggtggg ctgcgcggcg tttgtggtgg tgctgctgtt tggctgcatt 480
ctgattattt ggtttagcaa aaaaaaatat ggcagcagcg tgcatgatcc gaacagcgaa 540
tatatgttta tggcggcggt gaacaccaac aaaaaaagcc gcctggcggg cgtgaccagc 600
<210> 85
<211> 200
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 85
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser
20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val
35 40 45
Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu
50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro
65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu
85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser
100 105 110
Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
115 120 125
Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu
130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile
145 150 155 160
Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp
165 170 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys
180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser
195 200
<210> 86
<211> 279
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 86
atgattcatc tgggccatat tctgtttctg ctgctgctgc cggtggcggc ggcgcagacc 60
accccgggcg aacgcagcag cctgccggcg ttttatccgg gcaccagcgg cagctgcagc 120
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<210> 87
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Val Gly Ala Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
85 90
<210> 88
<211> 237
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 88
atggatccgc cgggctatct gctgtttctg ctgctgctgc cggtggcggc gagccagacc 60
agcgcgggca gctgcagcgg ctgcggcacc ctgagcctgc cgctgctggc gggcctggtg 120
gcggcggatg cggtgatgag cctgctgatt gtgggcgtgg tgtttgtgtg catgcgcccg 180
catggccgcc cggcgcagga agatggccgc gtgtatatta acatgccggg ccgcggc 237
<210> 89
<211> 79
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 89
Met Asp Pro Pro Gly Tyr Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Gln Thr Ser Ala Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Met Ser Leu
35 40 45
Leu Ile Val Gly Val Val Phe Val Cys Met Arg Pro His Gly Arg Pro
50 55 60
Ala Gln Glu Asp Gly Arg Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
65 70 75
<210> 90
<211> 342
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 90
atggggggac ttgaaccctg cagcaggctc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60
ggtctccgtc ctgtccaggc ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120
ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180
gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240
aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300
gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaat ga 342
<210> 91
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys
<210> 92
<211> 345
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 92
atgggggctc tggagccctc ctggtgcctt ctgttccttc ctgtcctcct gactgtggga 60
ggattaagtc ccgtacaggc ccagagtgac actttcccaa gatgcgactg ttcttccgtg 120
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ctggctgtgt actctctggg ccgcctggtc tcccgaggtc aagggacagc ggaagggacc 240
cggaaacaac acattgctga gactgagtcg ccttatcagg agcttcaggg tcagagacca 300
gaagtataca gtgacctcaa cacacagagg caatattaca gatga 345
<210> 93
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 93
Met Gly Ala Leu Glu Pro Ser Trp Cys Leu Leu Phe Leu Pro Val Leu
1 5 10 15
Leu Thr Val Gly Gly Leu Ser Pro Val Gln Ala Gln Ser Asp Thr Phe
20 25 30
Pro Arg Cys Asp Cys Ser Ser Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile
35 40 45
Val Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Leu Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr
50 55 60
Ser Leu Gly Arg Leu Val Ser Arg Gly Gln Gly Thr Ala Glu Gly Thr
65 70 75 80
Arg Lys Gln His Ile Ala Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln
85 90 95
Gly Gln Arg Pro Glu Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Gln Tyr
100 105 110
Tyr Arg
<210> 94
<211> 164
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 95
<211> 492
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 95
atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60
gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120
atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagag 180
ccccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480
ccccctcgct aa 492
<210> 96
<211> 164
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 96
Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr Ala
35 40 45
Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn
100 105 110
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Pro Arg
<210> 97
<211> 495
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 97
atgaagtgga aagtgtctgt tctcgcctgc atcctccacg tgcggttccc aggagcagag 60
gcacagagct ttggtctgct ggatcccaaa ctctgctact tgctagatgg aatcctcttc 120
atctacggag tcatcatcac agccctgtac ctgagagcaa aattcagcag gagtgcagag 180
actgctgcca acctgcagga ccccaaccag ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga 240
gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag 300
cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca 360
gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc 420
ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcagacc 480
ctggcccctc gctaa 495
<210> 98
<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 99
<211> 762
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 99
atgtggcagc tgctgctgcc gaccgcgctg ctgctgctgg tgagcgcggg catgcgcacc 60
gaagatctgc cgaaagcggt ggtgtttctg gaaccgcagt ggtatcgcgt gctggaaaaa 120
gatagcgtga ccctgaaatg ccagggcgcg tatagcccgg aagataacag cacccagtgg 180
tttcataacg aaagcctgat tagcagccag gcgagcagct attttattga tgcggcgacc 240
gtggatgata gcggcgaata tcgctgccag accaacctga gcaccctgag cgatccggtg 300
cagctggaag tgcatattgg ctggctgctg ctgcaggcgc cgcgctgggt gtttaaagaa 360
gaagatccga ttcatctgcg ctgccatagc tggaaaaaca ccgcgctgca taaagtgacc 420
tatctgcaga acggcaaagg ccgcaaatat tttcatcata acagcgattt ttatattccg 480
aaagcgaccc tgaaagatag cggcagctat ttttgccgcg gcctgtttgg cagcaaaaac 540
gtgagcagcg aaaccgtgaa cattaccatt acccagggcc tggcggtgag caccattagc 600
agcttttttc cgccgggcta tcaggtgagc ttttgcctgg tgatggtgct gctgtttgcg 660
gtggataccg gcctgtattt tagcgtgaaa accaacattc gcagcagcac ccgcgattgg 720
aaagatcata aatttaaatg gcgcaaagat ccgcaggata aa 762
<210> 100
<211> 261
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 100
Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln Trp Leu Leu Pro Pro Leu
1 5 10 15
Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp Arg Gln Ser Ala Ala Leu
20 25 30
Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu Lys
35 40 45
Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly Asn
50 55 60
Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln Val
65 70 75 80
Gln Ala Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr
85 90 95
Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu Gly
100 105 110
Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Arg Val Phe Leu
115 120 125
Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys Leu
130 135 140
Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His
145 150 155 160
His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His Ser
165 170 175
Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly Ser Thr Gln His Gln Ser
180 185 190
Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile
195 200 205
Ser Leu Val Trp Tyr His Thr Ala Phe Ser Leu Val Met Cys Leu Leu
210 215 220
Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr Val Arg Arg Asn Leu Gln
225 230 235 240
Thr Pro Arg Glu Tyr Trp Arg Lys Ser Leu Ser Ile Arg Lys His Gln
245 250 255
Ala Pro Gln Asp Lys
260
<210> 101
<211> 786
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 101
atgtttcaga atgcacactc tggaagccaa tggctacttc caccactgac aattctgctg 60
ctgtttgctt ttgcagacag gcagagtgca gctcttccga aggctgtggt gaaactggac 120
cccccatgga tccaggtgct caaggaagac atggtgacac tgatgtgcga agggacccac 180
aaccctggga actcttctac ccagtggttc cacaacggga ggtccatccg gagccaggtc 240
caagccagtt acacgtttaa ggccacagtc aatgacagtg gagaatatcg gtgtcaaatg 300
gagcagaccc gcctcagcga ccctgtagat ctgggagtga tttctgactg gctgctgctc 360
cagacccctc agcgggtgtt tctggaaggg gaaaccatca cgctaaggtg ccatagctgg 420
aggaacaaac tactgaacag gatctcattc ttccataatg aaaaatccgt gaggtatcat 480
cactacaaaa gtaatttctc tatcccaaaa gccaaccaca gtcacagtgg ggactactac 540
tgcaaaggaa gtctaggaag tacacagcac cagtccaagc ctgtcaccat cactgtccaa 600
gatccagcaa ctacatcctc catctctcta gtctggtacc acactgcttt ctccctagtg 660
atgtgcctcc tgtttgcagt ggacacgggc ctttatttct acgtacggag aaatcttcaa 720
accccgaggg agtactggag gaagtccctg tcaatcagaa agcaccaggc tcctcaagac 780
aagtga 786
<210> 102
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly
50 55 60
Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Ala Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn
65 70 75 80
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
85 90 95
Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
100 105 110
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
115 120 125
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
180 185 190
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
195 200 205
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
210 215
<210> 103
<211> 648
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103
atgggctgga ttcgcggccg ccgcagccgc catagctggg aaatgagcga atttcataac 60
tataacctgg atctgaaaaa aagcgatttt agcacccgct ggcagaaaca gcgctgcccg 120
gtggtgaaaa gcaaatgccg cgaaaacgcg agcccgtttt ttttttgctg ctttattgcg 180
gtggcgatgg gcattcgctt tattattatg gtggcgattt ggagcgcggt gtttctgaac 240
agcctgttta accaggaagt gcagattccg ctgaccgaaa gctattgcgg cccgtgcccg 300
aaaaactgga tttgctataa aaacaactgc tatcagtttt ttgatgaaag caaaaactgg 360
tatgaaagcc aggcgagctg catgagccag aacgcgagcc tgctgaaagt gtatagcaaa 420
gaagatcagg atctgctgaa actggtgaaa agctatcatt ggatgggcct ggtgcatatt 480
ccgaccaacg gcagctggca gtgggaagat ggcagcattc tgagcccgaa cctgctgacc 540
attattgaaa tgcagaaagg cgattgcgcg ctgtatgcga gcagctttaa aggctatatt 600
gaaaactgca gcaccccgaa cacctatatt tgcatgcagc gcaccgtg 648
<210> 104
<211> 232
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 104
Met Ala Leu Ile Arg Asp Arg Lys Ser His His Ser Glu Met Ser Lys
1 5 10 15
Cys His Asn Tyr Asp Leu Lys Pro Ala Lys Trp Asp Thr Ser Gln Glu
20 25 30
Gln Gln Lys Gln Arg Leu Ala Leu Thr Thr Ser Gln Pro Gly Glu Asn
35 40 45
Gly Ile Ile Arg Gly Arg Tyr Pro Ile Glu Lys Leu Lys Ile Ser Pro
50 55 60
Met Phe Val Val Arg Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala Ile Arg Phe Thr
65 70 75 80
Leu Asn Thr Leu Met Trp Leu Ala Ile Phe Lys Glu Thr Phe Gln Pro
85 90 95
Val Leu Cys Asn Lys Glu Val Pro Val Ser Ser Arg Glu Gly Tyr Cys
100 105 110
Gly Pro Cys Pro Asn Asn Trp Ile Cys His Arg Asn Asn Cys Tyr Gln
115 120 125
Phe Phe Asn Glu Glu Lys Thr Trp Asn Gln Ser Gln Ala Ser Cys Leu
130 135 140
Ser Gln Asn Ser Ser Leu Leu Lys Ile Tyr Ser Lys Glu Glu Gln Asp
145 150 155 160
Phe Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val Gln Ile
165 170 175
Pro Ala Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ser Leu Ser Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Thr Leu Val Glu Ile Pro Lys Gly Ser Cys Ala Val Tyr
195 200 205
Gly Ser Ser Phe Lys Ala Tyr Thr Glu Asp Cys Ala Asn Leu Asn Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Met Lys Arg Ala Val
225 230
<210> 105
<211> 696
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 105
atggcgctga ttcgcgatcg caaaagccat catagcgaaa tgagcaaatg ccataactat 60
gatctgaaac cggcgaaatg ggataccagc caggaacagc agaaacagcg cctggcgctg 120
accaccagcc agccgggcga aaacggcatt attcgcggcc gctatccgat tgaaaaactg 180
aaaattagcc cgatgtttgt ggtgcgcgtg ctggcgattg cgctggcgat tcgctttacc 240
ctgaacaccc tgatgtggct ggcgattttt aaagaaacct ttcagccggt gctgtgcaac 300
aaagaagtgc cggtgagcag ccgcgaaggc tattgcggcc cgtgcccgaa caactggatt 360
tgccatcgca acaactgcta tcagtttttt aacgaagaaa aaacctggaa ccagagccag 420
gcgagctgcc tgagccagaa cagcagcctg ctgaaaattt atagcaaaga agaacaggat 480
tttctgaaac tggtgaaaag ctatcattgg atgggcctgg tgcagattcc ggcgaacggc 540
agctggcagt gggaagatgg cagcagcctg agctataacc agctgaccct ggtggaaatt 600
ccgaaaggca gctgcgcggt gtatggcagc agctttaaag cgtataccga agattgcgcg 660
aacctgaaca cctatatttg catgaaacgc gcggtg 696
<210> 106
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 YMNM
<400> 106
Tyr Met Asn Met
1
<210> 107
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 PYAP
<400> 107
Pro Tyr Ala Pro
1
<210> 108
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 FMNM
<400> 108
Phe Met Asn Met
1
<210> 109
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CD28 AYAA
<400> 109
Ala Tyr Ala Ala
1
<210> 110
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Signal peptide
<400> 110
Ala Thr Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val His Ser
20
<210> 111
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Signal peptide DNA sequence
<400> 111
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcc 57
<210> 112
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 (GA101) heavy chain
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 113
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CD20 (GA101) light chain
<400> 113
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 114
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-FAP(4B9) PGLALA heavy chain
<400> 114
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 115
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-FAP(4B9) light chain
<400> 115
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 116
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (A5B7) PGLALA heavy chain
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 117
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (A5B7) light chain
<400> 117
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala
20 25 30
Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
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<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66LCHA) PGLALA heavy chain
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (T84.66LCHA) light chain
<400> 119
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (CH1A1A98/992F1) light chain
<400> 121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (hMN14) PGLALA heavy chain
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 123
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-CEA (hMN14) light chain
<400> 123
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 124
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-TNC (2B10) PGLALA heavy chain
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 125
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-TNC (2B10) light chain
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 126
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-HER2 (PER) PG LALA heavy chain 1
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 127
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-HER2 (PER) light chain 1
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Anti-HER2 (PER) PG LALA heavy chain 2
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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<223> Anti-HER2 (PER) light chain 2
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Claims (30)
- 앵커링 경막 도메인, 및 항원 결합 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체로서, 항원 결합 모이어티는 돌연변이된 단편 결정가능 (Fc) 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 돌연변이된 Fc 도메인은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항에 있어서, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fc 수용체 결합과 비교하여 감소되며, 특히 Fc 수용체는 Fcγ 수용체 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 scFv, Fab, crossFab 또는 scFab 인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커링 경막 도메인은 CD8, CD3z, FCGR3A, NKG2D, CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 또는 DAP12 경막 도메인 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경막 도메인이며, 특히 앵커링 경막 도메인은 CD28 경막 도메인 또는 이의 단편인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인 및/또는 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z, FCGR3A 및 NKG2D 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택되며, 특히 적어도 하나의 자극성 신호전달 도메인은 CD3z 세포내 도메인 또는 이의 단편인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS, DAP10 및 DAP12 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어지는 군으로부터 개별적으로 선택되며, 특히 적어도 하나의 보조자극성 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 또는 이의 단편인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 수용체는 CD28 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 자극성 신호전달 도메인을 포함하고, 항원 결합 수용체는 CD3z 의 세포내 도메인, 또는 이의 단편을 포함하는 하나의 보조자극성 신호전달 도메인을 포함하는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 scFv 단편이며, scFv 단편은 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티는 Fab 또는 crossFab 단편이며, Fab 또는 crossFab 단편은 중쇄의 C-말단에서 앵커링 경막 도메인의 N-말단에, 임의로 펩티드 링커를 통해, 연결되는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 L234, L235, I253, H310, P331, P329 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 특히 아미노산 돌연변이는 L234A, L235A, I253A, N297A, H310A, P329G 및/또는 H435A 인 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 아미노산 돌연변이 P329G 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 Fcγ 수용체 결합과 비교하여 감소되는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따른 I253, H310 및 H435 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 를 포함하며, 돌연변이된 Fc 도메인의 FcRn 결합은 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인의 FcRn 결합과 비교하여 감소되는 항원 결합 수용체.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 P329G 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN (SEQ ID NO:1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD (SEQ ID NO:2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS (SEQ ID NO:3); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP (SEQ ID NO:5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV (SEQ ID NO:6). - 제 1 항 내지 제 11 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티는 I253A, H310A 및 H435A ("AAA") 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없으며, 항원 결합 모이어티는 하기를 포함하는 항원 결합 수용체:
(i) 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)
(a) 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS (SEQ ID NO:53);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY (SEQ ID NO:54); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY (SEQ ID NO:55); 및
(ii) 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
(d) 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE (SEQ ID NO:56);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO:57); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:58). - 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제 17 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포.
- 하기를 포함하는 키트:
(A) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포; 및
(B) 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음. - 하기를 포함하는 키트:
(A) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및
(B) 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체;
여기에서 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없음. - 제 20 항 또는 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체는 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), 암배 항원 (CEA), 메소텔린 (MSLN), CD20, 폴레이트 수용체 1 (FOLR1), 및 테나신 (TNC) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원에 특이적 결합을 할 수 있는 키트.
- 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 키트.
- 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료에서 사용하기 위한, 특히 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 키트.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항 또는 제 19 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포로서, 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항 또는 제 19 항에 있어서, 악성 질환의 치료에서 사용하기 위한 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포로서, 치료는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 항원 결합 수용체를 발현하는 형질도입된 T 세포의 투여를 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 항원 결합 수용체 또는 형질도입된 T 세포.
- 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포를 투여하는 것 및 형질도입된 T 세포의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 치료적 유효량의 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체를 투여하는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 치료 방법.
- 표적 세포의 용해를 유도하는 방법으로서, 표적 세포를 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하는 항체의 존재 하에 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있는 형질도입된 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 항원 결합 수용체는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 있으나 돌연변이되지 않은 부모 Fc 도메인에 특이적 결합을 할 수 없는 유도 방법.
- 악성 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 항원 결합 수용체, 제 17 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 19 항의 형질도입된 T 세포의 용도.
- 실시예 중 어느 하나 또는 첨부된 도면 중 어느 하나를 참조하여 본원에 실질적으로 기재된 바와 같은 항원 결합 수용체.
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