JP2023545707A - スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ酵素を含む融合タンパク質及びその方法 - Google Patents

スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ酵素を含む融合タンパク質及びその方法 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて輸送することができ、スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含むタンパク質である。ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを治療するためにそのようなタンパク質を使用する方法も提供する。特に、ある特定の実施形態は、（ａ）第１のＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）アミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び（ｂ）第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチド、を含むタンパク質を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１４日出願の米国仮出願第６３／０９１，８００号に対する優先権を主張する。上に参照された出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
サンフィリッポ症候群、またはＭＰＳＩＩＩは、リソソーム機能のある特定の欠陥に起因する希少神経変性障害である。サンフィリッポ症候群の最も一般的なタイプはＡ型であり、ＳＧＳＨ遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる。Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）活性が不十分であると、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖が蓄積し、複数の臓器及び組織、特に脳及び脊髄においてリソソーム機能障害が起こる。サンフィリッポ症候群の治療は依然として大部分が支持的である；欠乏している酵素は静脈内投与することができるが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて組換え酵素を送達することが困難であるため、脳にはほとんど影響がない。したがって、サンフィリッポ症候群Ａの末梢神経系と中枢神経系（ＣＮＳ）の両方の症状を治療する、より効果的な治療法が必要である。
したがって、本明細書で提供されるのは、ＢＢＢを通過し、サンフィリッポ症候群Ａの末梢症状及びＣＮＳ症状の両方を治療する能力を有する特異的酵素補充療法である。特に、ある特定の実施形態は、（ａ）第１のＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）アミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び（ｂ）第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチド、を含むタンパク質を提供し、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に対する少なくとも８０％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う位置３８９にＡｌａを有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合するか、またはＴｆＲに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合する。ある特定の実施形態では、タンパク質のＴｆＲへの結合は、トランスフェリンのＴｆＲへの結合を実質的に阻害しない。特定の実施形態では、タンパク質は、約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、または場合により約１５０ｎＭ～約４００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。ある特定の実施形態では、タンパク質を、対象の血液脳関門を通過させて輸送することができる。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列は、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列は、配列番号５８～６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列は、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列は、配列番号５８～６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。ある特定の実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチリンカーである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＳ（配列番号７）、Ｇ４Ｓ（配列番号８）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９）である。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含有する。ある特定の実施形態では、ＥＵ付番に従って、Ｆｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１２～１９及び２８～３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４～４１及び５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２４～２７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１４～１９及び２６～３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１４、１５、２８、及び２９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１８、１９、３０、及び３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６１～８８及び１１７～１１８のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６１～６８、７３～７６、８１～８４及び１１７～１１８のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６～４１及び５０～５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６、３７、５４、及び５５のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４０、４１、５６、及び５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～１１６、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対するアミノ酸変化を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置２５２でのＴｙｒ、位置２５４でのＴｈｒ、及び位置２５６でのＧｌｕの置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６１～６８、７３～７６、及び８１～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～９６、１０１～１０４、及び１０９～１１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６１～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６３または６４のアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９１または９２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１０３または１０４のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８３または８４のアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１１１または１１２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６５～６８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９３～９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含み；第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨアミノ酸配列の脳内への取り込みは、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの非存在下でのＳＧＳＨアミノ酸配列の取り込みと比較して、または第２のＦｃポリペプチドに対するＴｆＲ結合をもたらす改変のないＳＧＳＨ酵素の取り込みと比較して、少なくとも１０倍大きい。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するように改変されておらず、第２のＦｃポリペプチドはＴｆＲに特異的に結合するように改変されている。
ある特定の実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。
ある特定の実施形態では、ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、Ｆｃポリペプチドは、ｉ）配列番号３７に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、ｉｉ）別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を有し、ｉｉｉ）ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合するか、またはＴｆＲに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片；ポリペプチドリンカー；及びＦｃポリペプチド、を含む融合ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：Ｆｃポリペプチド；ポリペプチドリンカー；及びＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片、を含む融合ポリペプチドである。
ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する。ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含み、Ｆｃポリペプチドは、他のＦｃポリペプチドに二量体化される。したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に記載のＦｃポリペプチド及び他のＦｃポリペプチドを含むタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。ある特定の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、そのような宿主細胞は、他のＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドを作製する方法である。
ある特定の実施形態は、ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを生成する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドをコードする第１の核酸配列；及び第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチドをコードする第２の核酸配列、を含むポリヌクレオチドの対を提供する。ある特定の実施形態はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対を含む１つもしくは複数のベクターも提供する。ある特定の実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対、または本明細書に記載の１つもしくは複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド、及び第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチド、を含むタンパク質を生成するための方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチドの対が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドと、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを治療する方法であって、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする患者におけるその治療に使用するための、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする患者におけるそれを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドの使用を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させる方法であって、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを患者に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるのに使用するための、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドを提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質または本明細書に記載のポリペプチドの使用を提供する。
ある特定の実施形態では、毒性代謝産物は、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖を含む。
Ａは、ＳＧＳＨ酵素とＦｃポリペプチドヒンジ領域との間の様々なリンカー長を有する例示的なＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の図解を示す。Ｂは、ＳＧＳＨ酵素とＦｃポリペプチドヒンジ領域との間の様々なリンカー長を有する例示的なＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の図解を示す。Ｃは、ＳＧＳＨ酵素とＦｃポリペプチドヒンジ領域との間の様々なリンカー長を有する例示的なＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の図解を示す。 ＬＣＭＳで測定したＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質のｆＧｌｙ含有量を示す。 ＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の酵素活性のインビトロ評価を示す。 ３５Ｓパルス追跡アッセイを使用した、ＭＰＳＩＩＩＡ患者及び健常対照の線維芽細胞におけるＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質の細胞活性の評価を示す。 ＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の血清濃度を示す。 ２時間後のＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の肝臓濃度を示す。 ８時間後のＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の肝臓濃度を示す。 ＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の脳内濃度を示す。 肝臓における総ヘパラン硫酸レベルを示す。 脳内の総ヘパラン硫酸レベルを示す。 ＣＳＦにおける総ヘパラン硫酸レベルを示す。 ２つの異なるＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の投与後の脳内の総ヘパラン硫酸レベルを示す。
現在、サンフィリッポ症候群Ａの治療のための新しい治療薬、特に神経認知表現型を治療する治療薬が必要とされている。本明細書に記載されているのは、ＥＴＶ：ＳＧＳＨと呼ばれる特定の酵素補充療法であり、これには、ＢＢＢを通過し、サンフィリッポ症候群Ａの末梢及びＣＮＳ症状の両方を治療する能力がある。本明細書で使用される場合、「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ」という用語は、ＢＢＢを通過させて輸送することができ、それぞれがＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に結合（例えば、融合）している第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含む二量体タンパク質を指す。実施例で考察されるように、サンフィリッポ症候群Ａのネズミマウスモデルは、ＥＴＶ：ＳＧＳＨの単回静脈内投与後に、脳内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の５０％を超える減少及びＣＳＦにおけるＧＡＧの８０％を超える減少を示した。
ＳＧＳＨ酵素－ＦＣ融合ポリペプチドを含むタンパク質分子
本明細書に記載されるように、ある特定の実施形態は、ＳＧＳＨ酵素－Ｆｃ融合ポリペプチドを含むタンパク質分子を提供する。タンパク質に組み込まれたＳＧＳＨ酵素は、触媒的に活性である、すなわち、酵素活性を保持する。いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質は、（ｉ）改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変）を含有し得るか、または野生型Ｆｃポリペプチドであり得るＦｃポリペプチド；及びＳＧＳＨ酵素、ならびに（ｉｉ）血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変、及び場合により１つまたは複数の追加の改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変）を含有するＦｃポリペプチド；及びＳＧＳＨ酵素、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、野生型ＳＧＳＨの触媒活性断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素は、配列番号５８、５９及び６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＳＧＳＨタンパク質のバリアントまたは触媒活性断片である。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素の触媒活性バリアントまたは断片は、野生型ＳＧＳＨ酵素の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質に存在するＳＧＳＨ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも２５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％を保持する。いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに接合されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％を保持する。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドへの融合は、ＳＧＳＨ酵素、またはその触媒活性バリアントもしくは断片の活性を低下させない。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドへの融合は、ＳＧＳＨ酵素の活性を低下させない。
Ｆｃポリペプチド改変
本明細書に記載の融合タンパク質に組み込まれたＦｃポリペプチドは、ある特定の改変を含み得る。例えば、Ｆｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変を含み得る。さらに、ＦＣポリペプチドは、ヘテロ二量体化を促進する、血清安定性または血清半減期を増加させる、エフェクター機能を調節する、グリコシル化に影響を与える、及び／またはヒトにおける免疫原性を低下させる改変など、他の改変を含んでもよい。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、一方のＦｃは野生型Ｆｃポリペプチド、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり；他方のＦｃは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合するように改変されており、場合により、１つまたは複数の追加の改変をさらに含む。ある特定の他の実施形態では、両方のＦｃポリペプチドはそれぞれ、独立して選択された改変（例えば、本明細書に記載の改変）を含む。
種々のＦｃ改変において指定されるアミノ酸残基は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド中に導入されるものを含め、本明細書において、ＥＵインデックス付番を使用して付番される。任意のＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチドは、本明細書に記載の１つまたは複数の位置に、改変、例えば、アミノ酸置換を有し得る。
本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、ネイティブＦｃ領域配列またはその断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長、もしくはそれ以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ネイティブＦｃのアミノ酸配列は、配列番号１のＦｃ領域配列である。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１１０もしくは配列番号１のアミノ酸１１１～２１７、またはそれらの断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長もしくはそれ以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、ネイティブＦｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも５０個のアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上、または少なくとも１００個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１のようなネイティブＦｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも２５個の連続するアミノ酸、または少なくとも３０個、３５個、４０個もしくは４５個の連続するアミノ酸、または５０個の連続するアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上の連続するアミノ酸、または１００個のもしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。
血液脳関門（ＢＢＢ）受容体結合のための改変
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させて輸送することができる融合タンパク質である。このようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する、改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮、ならびに他の細胞型及び組織型で発現する。いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質はＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、約５０ｎＭ～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する（例えば、特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１００～約５００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１００ｎＭ～約３００ｎＭ、または約１５０ｎＭ～約２５０ｎＭ、または約２００ｎＭ～約２５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約２３０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。特定の実施形態では、タンパク質は、約１５０～約４００ｎＭ、または約２００～約４００ｎＭ、または約２５０ｎＭ～約３５０ｎＭ、または約３００～約３５０ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ３ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されるＩｇＧ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４からのものであり得る。ＩｇＧ抗体の文脈では、ＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番された位置ほぼ３４１～位置ほぼ４４７のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、かつトランスフェリンのＴｆＲへの結合を遮断することも阻害することもなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う、アミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、４１３、４１５、４１６及び４２１に置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。
追加の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う４１４、４２４及び４２６で構成される位置に１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、位置４１４はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙもしくはＰｒｏであり、位置４２４はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕもしくはＬｙｓであり、及び／または位置４２６はＳｅｒ、ＴｒｐもしくはＧｌｙである。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸１１１～２１７に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号３２のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸１１１～２１６に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号３２または３３のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２または３３に対する少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；配列番号３２または３３のＥＵインデックス位置３８０、３８４～３９０及び／または４１３～４２１のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２または３３に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２または３３に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２または３３に対する少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を含む。
追加のＦｃポリペプチド変異
いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチドを含み、一方または両方のＦｃポリペプチドはそれぞれ、独立して選択された改変（例えば、本明細書に記載の改変）を含む。一方または両方のＦｃポリペプチドに導入され得る他の変異の非限定的な例としては、例えば、Ｆｃポリペプチドの血清安定性または血清半減期を増加させる変異、エフェクター機能を調節する変異、グリコシル化に影響を与える変異、ヒトにおける免疫原性を低下させる変異、及び／またはノブ及びホールによるヘテロ二量体化をもたらす変異が挙げられる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは独立して、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃポリペプチド）に対する少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるノブ変異及びホール変異を含む。一般に、改変は、突起が空洞内に配置されてヘテロ二量体形成を促進し、ひいてはホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの界面で突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの界面で対応する空洞（「ホール」）を導入する。突起は、第一のポリペプチドの界面の小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一または類似のサイズの埋め合わせとなる空洞は、第二のポリペプチドの界面に、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換えることによって作成される。いくつかの実施形態では、このような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲへのポリペプチドの結合に悪影響を与えないＦｃポリペプチドの位置にある。
二量体化のためのノブ及びホールアプローチの一例示的な実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドのうちの一方の位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番された）は、ネイティブトレオニンの代わりにトリプトファンを含む。二量体の他方のＦｃポリペプチドは、位置４０７（ＥＵ付番スキームに従って付番された）にネイティブチロシンの代わりにバリンを有する。他方のＦｃポリペプチドはさらに置換を含んでもよく、この場合、位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番された）のネイティブトレオニンがセリンで置換され、位置３６８（ＥＵ付番スキームに従って付番された）のネイティブロイシンがアラニンで置換される。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質のＦｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、他方のＦｃポリペプチドはＹ４０７Ｖ変異を有しており、これは通常、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａホール変異を伴う。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する。ある特定の他の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。
いくつかの実施形態では、血清半減期を増強するための改変を、導入することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニン及び位置２５６にグルタミン酸を含み得る。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ置換を有し得る。代替的に、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を有し得る。代替的に、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変、すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現したＦｃ受容体に結合した際に、ある特定の生物学的機能を誘導する能力が低下している改変を含み得る。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられるがこれらに限定されない。エフェクター機能は、抗体のクラスによって異なる場合がある。例えば、ネイティブヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞に存在する適切なＦｃ受容体に結合するとＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘発することができ、ネイティブヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞に存在する適切なＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＰ機能を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドを、ヘテロ二量体化のための他の改変、例えば、天然に荷電したＣＨ３－ＣＨ３界面内の接触残基の静電的な操作または疎水性パッチ改変を含むように操作することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を調節する追加の改変を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させるか、または除去する改変を含んでもよい。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異としては、ＣＨ２ドメインにおける、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２３４及び位置２３５での置換が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、位置２３４及び位置２３５にアラニン残基を含むことができる。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含んでもよい。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異としては、以下のもの、すなわち、位置３２９に、プロリンがグリシンもしくはアルギニンで、またはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されたＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換されている変異を有し得ることが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例示的な置換としては、ＥＵ付番スキームに従うＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、及びＰ３３１Ｓが挙げられる。複数の置換もまた存在する場合がある、例えば、ＥＵ付番スキームに従う、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ；ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ、ならびにヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅ。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２９８、３３３、及び／または３３４での置換を有し得る。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端Ｌｙｓ残基は、本明細書に記載のＦｃポリペプチドにおいて除去される（すなわち、ＥＵ付番スキームに従う、位置４４７のＬｙｓ残基）。
追加の変異を含む例示的なＦｃポリペプチド
本明細書に記載の非限定的な例として、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、及び／または血清安定性もしくは血清半減期を増加させる変異（例えば、（ｉ）ＥＵ付番を参照して付番されたＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ、または（ｉｉ）ＥＵ付番スキームに従って付番されたＭ４２８Ｌを伴うかまたは伴わないＮ４３４Ｓ）、を含む追加の変異を含んでもよい。例として、配列番号１２～１９、２４～３１、３４～４１、及び４８～５７は、これらの追加の変異の１つまたは複数を含む改変Ｆｃポリペプチドの非限定的な例を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ならびに配列番号１、２、３２及び３３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変してもよい。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、ならびに配列番号２４及び２５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２４及び２５のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、ならびに配列番号３４及び３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４または３５に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４または３５に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４及び３５のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、ならびに配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ突然変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、ならびに配列番号２６及び２７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号２６及び２７のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ突然変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号３６～４１及び５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３６～４１及び５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３６～４１及び５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号３６～４１及び５４～５７のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびに配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異を有するように改変してもよい。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、ならびに配列番号１２及び１３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１２及び１３のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））、ならびに配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、３２、及び３３のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変することができる。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、ならびに配列番号１４～１９及び２８～３１のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号１４～１９及び２８～３１のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び／またはＰ３２９ＧまたはＰ３２９Ｓ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ））を含み、配列番号５０～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号５０～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号５０～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、配列番号５０～５３のいずれか１つの配列を含む。
ＦｃＲｎ結合部位
ある特定の態様では、改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチド、またはＢＢＢ受容体に特異的に結合しない本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃポリペプチドまたはその断片中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ネイティブＦｃＲｎ結合部位のアミノ酸配列に対するアミノ酸変化を含まない。いくつかの実施形態では、ネイティブＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧ結合部位、例えば、ヒトＩｇＧ結合部位である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、１つまたは複数の変異した、例えば置換されたアミノ酸残基を有し、この変異（複数可）は、血清半減期を増加させるか、または血清半減期を実質的に減少させない（すなわち、変異した位置に野生型残基を有する同等物の改変Ｆｃポリペプチドと比較して、同一条件下でアッセイした場合に血清半減期を２５％以下減少させる）。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵ付番スキームに従う位置２５０～２５６、３０７、３８０、４２８及び４３３～４３６で置換された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位のまたはその近傍の１つもしくは複数の残基は、改変ポリペプチドの血清半減期を延長させるために、ネイティブヒトＩｇＧ配列に対して変異している。いくつかの実施形態では、変異は、位置２５２、２５４及び２５６のうちの１つ、２つまたは３つに導入されている。いくつかの実施形態では、変異はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４の１つ、２つまたは３つすべてに置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はＴ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｔ２５０及びＭ４２８に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｍ４２８及びＮ４３４に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ変異を含む。
Ｆｃポリペプチドに結合したＳＧＳＨ酵素
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、本明細書に記載されている２つのＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃポリペプチドの一方または両方は、部分的または完全なヒンジ領域をさらに含み得る。ヒンジ領域は、任意の免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプからのものであり得る。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧ１ヒンジ領域などのＩｇＧヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）またはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＦｃポリペプチドのＮ末端領域に存在する。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。
ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドリンカーによってＳＧＳＨ酵素に接合されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によって、または、ペプチドリンカーによってＳＧＳＨ酵素に接合されており、例えば、Ｆｃポリペプチドは融合ポリペプチドである。ＳＧＳＨ酵素が、接合しているＦｃポリペプチドに対して回転可能となるようにペプチドリンカーを構成することができ、及び／またはペプチドリンカーは、プロテアーゼによる消化に対して耐性である。ペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含有するフレキシブルリンカー（例えば、グリシンリッチリンカー）であり得る。そのようなリンカーは、公知のパラメータを使用して設計され、任意長のものであり得、かつ任意長の反復単位（例えば、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基の反復単位）を任意数含有し得る。例えば、リンカーは、２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号８）反復などの反復、または単一のＧｌｙ４－Ｓｅｒ（配列番号８）を有し得る。他の態様では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号７）であってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位、例えば、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なプロテアーゼ切断部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素は、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号７）、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒリンカー（配列番号８）または（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号９）によって、ＦｃポリペプチドのＮ末端に接合されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカーに接合されているかまたはＳＧＳＨ酵素に直接接合されているヒンジ配列または部分的ヒンジ配列をＮ末端に含み得る。
いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素は、例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号７）、Ｇｌｙ４－Ｓｅｒリンカー（配列番号８）または（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号９）によって、ＦｃポリペプチドのＣ末端に接合されている。いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣ末端は、ＳＧＳＨ酵素に直接接合されている。
いくつかの実施形態では、ＳＧＳＨ酵素は、化学的架橋剤によってＦｃポリペプチドに接合されている。そのようなコンジュゲートは、周知の化学的架橋試薬及びプロトコルを使用して作製することができる。例えば、当業者に公知であり、ポリペプチドを目的の作用物質と架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤によって、タンパク質をコンジュゲートさせるためのより特異的なカップリング方法が設計できるようになり、これにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当技術分野において公知であり、それらとしては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体であるＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４－スクシンイミジルオキシカルボニル－ａ－メチル－ａ－（２－ピリジルジチオ）－トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド部分を有するこれらの架橋剤を、一般により高い水溶性を有するＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。さらに、連結鎖内にジスルフィド架橋を有する架橋剤は、インビボでのリンカー切断の量を低減させるために、代わりにアルキル誘導体として合成することができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤及び光反応性架橋剤を含む多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス－［Ｂ－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ－スクシンイミジル－６（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。
ＳＧＳＨ酵素－ＦＣ融合ポリペプチドを含む例示的なタンパク質分子
いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、第１のＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；及び第２のＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチドを含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含み；第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドである。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチド（すなわち改変Ｆｃポリペプチド）は、１つまたは複数の追加の改変を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変Ｆｃポリペプチドは、他方のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つまたは複数の改変を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つまたは複数の改変を含有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖；ならびに、ＴｆＲに結合し、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換をさらに含むか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、１）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換；ならびに２）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、すなわちＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号３４～４１のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４～４１のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４～４１のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号３４～４１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、ならびに配列番号１２～１９のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号１２～１９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４～４１のいずれか１つを含み、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１２～１９のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号５４～５７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２８～３１のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号２８～３１のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｔ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖；ならびに、ＴｆＲに結合し、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む第２のＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換をさらに含むか、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、１）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）置換；またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｓ（ＬＡＬＡＰＳ）置換；ならびに２）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ホール変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、配列番号４８～５３のいずれか１つに対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号４８～５３のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ノブ変異、ＬＡＬＡ／ＬＡＬＡＰＧ／ＬＡＬＡＰＳ変異、及び／またはＹＴＥ変異を含み、ならびに配列番号２４～２７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号２４～２７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つを含み、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２４～２７のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する第１のＳＧＳＨ酵素は、配列番号１２～１９のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されているか、あるいは配列番号１２～１９のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＧＳＨ酵素は、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２８～３１のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号２８～３１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＧＳＨ酵素は、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含む；あるいは配列番号５８～６０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドに連結された第１のＳＧＳＨ配列は、配列番号６１～６８、７３～７６、８１～８４及び１１７～１１８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号６１～６８、７３～７６、８１～８４及び１１７～１１８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３４～４１のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３４～４１のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号３４～４１のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号３４～４１のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＳＧＳＨ酵素は、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５４～５７のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号５４～５７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＳＧＳＨ酵素は、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含む；あるいは配列番号５８～６０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに連結された第２のＳＧＳＨ配列は、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み；あるいは配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１～６４のいずれか１つの配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号８９～９２のいずれか１つの配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６５～６８のいずれか１つの配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９３～９６のいずれか１つの配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７３～７６のいずれか１つの配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０１～１０４のいずれか１つの配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８１～８４のいずれか１つの配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０９～１１２のいずれか１つの配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１７～１１８のいずれか１つの配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１９～１２０のいずれか１つの配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１または６２の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号８９または９０の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６５または６６の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９３または９４の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６３または６４の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９１または９２の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６４の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９２の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６７または６８の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９５または９６の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６８の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９６の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７３または７４の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０１または１０２の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７５または７６の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０３または１０４の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７６の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０４の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８１または８２の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０９または１１０の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８３または８４の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１１または１１２の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８４の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１２の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１７の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１９の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１８の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１２０の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する第１のＳＧＳＨ酵素は、配列番号２４～２７のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖に連結されているか、あるいは配列番号２４～２７のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＧＳＨ酵素は、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第１のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＳＧＳＨ酵素は、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含む；あるいは配列番号５８～６０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドに連結された第１のＳＧＳＨ配列は、配列番号６９～７２、７７～８０、及び８５～８８のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し；あるいは配列番号６９～７２、７７～８０、及び８５～８８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４８～５３のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号４８～５３のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み、あるいは配列番号４８～５３のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＳＧＳＨ酵素は、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、配列番号６）によって第２のＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、第２のＳＧＳＨ酵素は、配列番号５８～６０のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するＳＧＳＨ配列を含む；あるいは配列番号５８～６０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドに連結された第２のＳＧＳＨ配列は、配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つに対する少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、かつＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち、位置３８０にＧｌｕ；位置３８９にＡｌａ；及び位置３９０にＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し、ならびにＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち位置３８０にＧｌｕ；位置３８４にＴｙｒ；位置３８６にＴｈｒ；位置３８７にＧｌｕ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＡｌａ；位置３９０にＡｓｎ；位置４１３にＴｈｒ；位置４１５にＧｌｕ；位置４１６にＧｌｕ；及び位置４２１にＰｈｅを含み、あるいは配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６９または７０の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９７または９８の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７１または７２の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号９９または１００の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７７または７８の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０５または１０６の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７９または８０の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１０７または１０８の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８５または８６の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１３～１１４の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８７または８８の配列を含む第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、及び配列番号１１５～１１６の配列を含む第２のＳＧＳＨ－Ｆｃポリペプチドを含む。
本明細書に記載の融合タンパク質及び他の組成物は、広範囲にわたる結合親和性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する１ｐＭ～１０μＭにわたる親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、１ｎＭ～５μＭまたは１０ｎＭ～１μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約５０ｍＭ～約５００ｎＭ、または約１００ｎＭ～約５００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約５０ｎＭ～約３００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約１００ｎＭ～約３５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約１５０ｎＭ～約４００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、約２００ｎＭ～約４５０ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、一価の親和性である。
タンパク質活性の評価
ＳＧＳＨ酵素を含む本明細書に記載の融合タンパク質の活性は、実施例セクションに記載のものなど、人工基質を使用してインビトロで活性を測定するアッセイを含む、種々のアッセイを使用して評価することができる。インビトロでＳＧＳＨ活性を測定するための他の例示的なプロトコルは、例えばＷＯ２０１９／０７０５７７で提供される。
いくつかの実施形態では、組織試料を評価する。組織試料は、上記のアッセイを使用して評価することができるが、ただし、微小胞を確実に破裂させるために、超音波処理ステップの前に、複数回の、例えば２回、３回、４回または５回以上の凍結融解（ｆｒｅｅ－ｔｈａｗ）サイクルが通常含まれる。
本明細書に記載のアッセイによって評価することができる試料としては、脳、肝臓、腎臓、肺、脾臓、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵素－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質）を受けた患者からのＣＳＦ試料を評価することができる。
核酸、ベクター、及び宿主細胞
本明細書に記載の融合タンパク質に含まれるポリペプチド鎖は、通常、組換え法を使用して調製される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸、ならびにポリペプチドをコードする核酸を複製するため、及び／またはポリペプチドを発現するために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えば、ヒト細胞である。
別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド鎖の１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチド配列のうちの１つをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチド配列のうちの２つをコードする。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
いくつかの実施形態はまた、各核酸配列が本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列の対を提供する。例えば、ある特定の実施形態は、核酸配列の対を提供し、この対の第１の核酸配列は、第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチドをコードし；及びこの対の第２の核酸配列は、第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが核酸コンストラクト内に含まれるか、またはポリヌクレオチドの対が１つまたは複数の核酸コンストラクト内に含まれる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター、及び非エピソーム哺乳動物ベクターから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現コンストラクト中の１つまたは複数の制御性ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ある一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、表面発現ライブラリーとしての使用に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、酵母における表面発現に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージにおける表面発現に適合する。別の一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、ミリグラム量またはグラム量でポリペプチドを単離することが可能な系におけるポリペプチドの発現に適合する。いくつかの実施形態では、系は、哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、系は、酵母細胞発現系である。
組換えポリペプチド生成のための発現ビヒクルには、プラスミド及び他のベクターが含まれる。例えば、好適なベクターには、以下のタイプのプラスミド、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドが含まれる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏ、及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン・バールウイルスなどのウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）を、真核細胞におけるポリペプチドの一過性発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。追加の発現系には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び他のウイルスの発現系が含まれる。
ベクターは、任意の好適な宿主細胞に形質転換させることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えば、細菌または酵母細胞は、表面発現ライブラリーとしての使用に適合し得る。ある種の細胞では、ベクターは宿主細胞中で発現し、比較的大量のポリペプチドを発現する。そのような宿主細胞には、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び原核細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞である。
本明細書に記載の１つまたは複数のＦｃポリペプチド鎖をコードする発現ベクター（複数可）でトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な条件下で培養して、１つまたは複数のポリペプチドの発現を生じさせることができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中にまたは膜画分中に保持して、細胞を回収して溶解し、所望の方法を使用してポリペプチドを単離してもよい。
治療方法
本明細書に記載の融合タンパク質は、サンフィリッポ症候群Ａを治療するために治療上使用することができる。
従って、ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させる方法であって、本明細書に記載のタンパク質を対象に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させるのに使用するための、本明細書に記載のタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを有する対象における毒性代謝産物（例えば、ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖）の蓄積を減少させるための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質の使用を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａを治療する方法であって、本明細書に記載のタンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする対象におけるその治療に使用するための、本明細書に記載のタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態は、サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする対象におけるそれを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載のタンパク質の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＳＧＳＨ酵素に連結された）の投与によって、本明細書に記載の融合タンパク質に連結されていない場合のＳＧＳＨの取り込みと比較して、または参照タンパク質（例えば、ＴｆＲ結合をもたらす第２のＦｃポリペプチドへの改変を有さない、本明細書に記載の融合タンパク質）に連結されたＳＧＳＨの取り込みと比較して、脳内のＳＧＳＨのＣｍａｘが改善される（例えば、増加する）。
いくつかの実施形態では、脳内のＳＧＳＨのＣｍａｘは、本明細書に記載の融合タンパク質に連結されていない場合のＳＧＳＨの取り込みと比較して、または参照タンパク質（例えば、ＴｆＲ結合をもたらす第２のＦｃポリペプチドへの改変を有さない、本明細書に記載の融合タンパク質）に連結されたＳＧＳＨの取り込みと比較して、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．２倍、２．４倍、２．６倍、２．８倍、３倍、４倍、５倍、６倍、またはそれ以上改善される（例えば、増加する）。
本明細書に記載の融合タンパク質は、治療有効量または治療有効用量で対象に投与される。
種々の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質は静脈内投与される。
いくつかの非経口的な実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、硬膜外投与などによる髄腔内投与、または側脳室内投与される。
他の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、経口投与、経肺投与、鼻腔内投与、眼球内投与によって、または局所投与によって投与することができる。経肺投与は、例えば、吸入器またはネブライザー、及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、採用することができる。
医薬組成物及びキット
他の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットが提供される。
医薬組成物
本開示に使用するための製剤を調製するための指針は、当業者に既知の医薬品及び製剤についての多くのハンドブックに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている融合タンパク質を含み、１つまたは複数の薬学的に許容される担体及び／または賦形剤をさらに含む。薬学的に許容される担体としては、任意の溶媒、分散媒、またはコーティングが挙げられ、これらは、活性薬剤と生理学的に適合し、活性薬剤の活性を妨害しないか、または別様に阻害しない。
本明細書に記載の医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動する場合がある。例示的な用量は、本明細書に記載されている。
キット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む、サンフィリッポ症候群Ａの治療に使用するためのキットを提供する。
いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の追加の治療剤をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の融合タンパク質を含み、サンフィリッポ症候群Ａの神経学的症状の治療に使用するための１つまたは複数の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法を実施するための指示（すなわち、プロトコル）（例えば、血液脳関門を通過させてＳＧＳＨ酵素を含む融合タンパク質を投与するためのキットを使用するための使用説明書）を含有する説明資料をさらに含む。説明資料は通常、書面または印刷資料を含むが、それらに限定されない。このような使用説明書を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることが可能な任意の媒体が、本開示によって企図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）等が挙げられるがこれらに限定されない。このような媒体は、このような説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含む場合がある。
ある特定の定義
本明細書で使用する場合、内容が明らかに別段に示されている場合を除き、「ある、１つの（ａ）」、「ある、１つの（ａｎ）」及び「この、その（ｔｈｅ）」という単数形には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への参照は、２つ以上のそのような分子などを含み得る。
本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で指定された量を修正するために使用される場合、その数値及び当業者に公知の値からの妥当な偏差、例えば、±２０％、±１０％または±５％が、記載された値の意図する意味の範囲内であることを示す。
本明細書で互換的に使用される場合、「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、及びモルモット）、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、及び他の哺乳動物種を含む哺乳動物を指す。一実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは、サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする患者である。いくつかの実施形態では、患者は、サンフィリッポ症候群Ａの１つまたは複数の徴候または症状を有する。
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトまたは動物での使用に対して生物学的に、または薬理学的に適合する非活性医薬成分、例えば、限定されないが、緩衝液、担体、または保存料を指す。
「投与する」という用語は、薬剤（例えば、本明細書に記載のＥＴＶ：ＳＧＳＨ療法などのサンフィリッポ症候群Ａ治療剤）、化合物、または組成物（例えば、医薬組成物）を生物学的作用の所望の部位に送達する方法を指す。これらの方法としては、経口、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、または腹腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、静脈内投与される。
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形形態）は、治療されている個体の自然過程を変えるための臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程の間に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、病状の回復または緩解、及び寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。
「有効量」という語句は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害のうちの１つもしくは複数の症状を減弱させる、改善する、もしくは排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態もしくは障害のうちの１つもしくは複数の症状の発症を予防もしくは遅延させる、本明細書に記載の化合物の量を意味する。
本明細書に開示される物質／分子の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの要因に従って変動し得る。治療有効量は、物質／分子の毒性または有害な効果を、治療上有益な効果が上回る量を包含する。「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間にて、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において用いられるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ないであろう。
本明細書で使用される「スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ」、「Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ」、または「ＳＧＳＨ」は、ヘパラン硫酸のリソソーム分解に関与する酵素であるＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＥＣ３．１０．１．１）を指す。この遺伝子の変異は、ヘパラン硫酸の分解障害に起因するリソソーム蓄積障害ムコ多糖症ＩＩＩの１タイプであるサンフィリッポ症候群Ａに関連している。Ｆｃポリペプチドを含むタンパク質の成分として本明細書で使用される「ＳＧＳＨ」という用語は、触媒的に活性であり、野生型ＳＧＳＨまたはその断片の対立遺伝子及びスプライスバリアントを含む機能的バリアントを包含する。ヒトＳＧＳＨの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリＰ５１６８８で入手可能であり、１７ｑ２５．３のヒトＳＧＳＨ遺伝子によってコードされる。完全長配列は、配列番号５８として提供される。本明細書で使用される「成熟」ＳＧＳＨ配列は、天然に存在する完全長ポリペプチド鎖のシグナル配列を欠くポリペプチド鎖の形態を指す。成熟ヒトＳＧＳＨポリペプチドのアミノ酸配列は、完全長ヒト配列のアミノ酸２１～５０２に対応する配列番号５９として提供される。本明細書で使用される「短縮化された」ＳＧＳＨ配列は、天然に存在する完全長ポリペプチド鎖の触媒的に活性な断片を指す。ヒトＳＧＳＨの構造は十分に特徴付けられている。例示的な構造は、ＰＤＢアクセッションコード４ＭＨＸで利用可能である。チンパンジーを含む非ヒト霊長類のＳＧＳＨ配列も記載されている（ＵｎｉＰｒｏｔエントリＫ７Ｃ２１８）。マウスＳＧＳＨ配列は、ＵｎｉｐｒｏｔエントリＱ９ＥＱ０８で入手可能である。ＳＧＳＨバリアントは、例えば、同一条件下でアッセイした場合、対応する野生型ＳＧＳＨまたはその断片の活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。触媒活性ＳＧＳＨ断片は、例えば、同一条件下でアッセイした場合、対応する完全長ＳＧＳＨまたはそのバリアントの活性の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有する。
本明細書で使用される、「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」とは、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、配列番号１０で規定される。他の種に由来するトランスフェリン受容体タンパク質１の配列も知られている（例えば、チンパンジー、アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１、アカゲザル、ＮＰ＿００１２４４２３２．１、イヌ、ＮＰ＿００１００３１１１．１、畜牛、ＮＰ＿００１１９３５０６．１、マウス、ＮＰ＿０３５７６８．１、ラット、ＮＰ＿０７３２０３．１、及びニワトリ、ＮＰ＿９９０５８７．１）。「トランスフェリン受容体」という用語はまた、例示的な参照配列、例えば、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体座における遺伝子によってコードされるヒト配列の対立遺伝子バリアントも包含する。完全長トランスフェリン受容体タンパク質は、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、３つのドメイン、すなわち、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン、及びアピカルドメインを特徴とする。ヒトトランスフェリン受容体１のアピカルドメイン配列は、配列番号１１に規定される。
本明細書で使用される「融合タンパク質」または「［ＳＧＳＨ酵素］－Ｆｃ融合タンパク質」は、ＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結された（例えば、融合した）第１のＦｃポリペプチド（すなわち、「［ＳＧＳＨ］－Ｆｃ融合ポリペプチド」）；及び第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む二量体タンパク質を指す。第２のＦｃポリペプチドはまた、ＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結（例えば、融合）することができる。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって、ＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはそれらの触媒活性断片に連結することができる。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、他のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合を付与する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を有さない。第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない。
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」または「［ＳＧＳＨ酵素］－Ｆｃ融合ポリペプチド」は、ＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはその触媒活性断片に連結（例えば、融合）したＦｃポリペプチドを指す。Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーによって、ＳＧＳＨ酵素、ＳＧＳＨ酵素バリアント、またはそれらの触媒活性断片に連結することができる。Ｆｃポリペプチドは、別のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体への結合を付与する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つまたは複数の改変を含有する改変Ｆｃポリペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドを特徴とする天然に存在する免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含有し、少なくともヒンジ領域の一部を含有し得る。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含有しない。
「改変Ｆｃポリペプチド」とは、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有するが、ネイティブＦｃポリペプチドの全般的なＩｇフォールドまたは構造を保持するＦｃポリペプチドを指す。
「ＦｃＲｎ」という用語は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃポリペプチドのクリアランスを低下させ、血清半減期を延長する。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に類似した約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２－ミクログロブリンから構成されるヘテロ二量体である。
本明細書で使用される場合、「ＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＥＵインデックスを使用して付番したＦｃＲｎ結合部位には、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｔ３０７、Ｅ３８０、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５及びＹ４３６が含まれる。これらの位置は、配列番号１の位置２０～２６、７７、１５０、１９８及び２０３～２０６に対応する。
本明細書で使用される場合、「ネイティブＦｃＲｎ結合部位」とは、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域でありかつＦｃＲｎに結合する天然に存在するＦｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有するＦｃポリペプチドの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的で、ＣＨ３ドメインポリペプチドとは、ＥＵに従って付番した位置ほぼ３４１から位置ほぼ４４７のアミノ酸セグメントを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドとは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置ほぼ２３１から位置ほぼ３４０のアミノ酸セグメントを指し、ヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのポリペプチドはまた、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）付番スキームによっても付番される場合があり、この場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｈａｒｔの付番（ＩＭＧＴウェブサイト）によれば、ＣＨ２ドメインの付番は１～１１０であり、ＣＨ３ドメインの付番は１～１０７である。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域とは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置ほぼ２３１から位置ほぼ４４７のアミノ酸のセグメントを指すが、本明細書で使用される場合、抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。例示的なヒンジ領域の配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５）である。
「天然に存在する」、「ネイティブ」または「野生型」は、人工的に生成されたものとは異なるものとして自然界に見出される物体を説明するために使用される。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在するヌクレオチド配列であって、自然界の供給源から単離することができ、実験室で意図的に改変されていないものは、天然に存在する。さらに、「野生型」とは、正常な遺伝子、または既知の変異のない自然界に見出される生物を指す。
例えば、ＣＨ３またはＣＨ２ドメインに関する「野生型」、「ネイティブ」及び「天然に存在する」という用語は、天然において存在する配列を有するドメインを指すために本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、変異ポリペプチドまたは変異ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、「バリアント」と互換的に使用される。所与の野生型ＣＨ３またはＣＨ２ドメインの参照配列に関するバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントを含むことができる。「非天然」に生じるＣＨ３またはＣＨ２ドメインとは、細胞に天然には存在せず、ネイティブＣＨ３ドメインもしくはＣＨ２ドメインポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば、遺伝子操作技術または変異導入技術を使用した遺伝子改変によって生成されるバリアントまたは変異体ドメインを指す。「バリアント」には、野生型に関して少なくとも１つのアミノ酸の変異を含む任意のドメインが含まれる。変異には、置換、挿入、及び欠失を含めることができる。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。
天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにそれらのアミノ酸が後で改変されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化学化合物を指す。
天然に存在するα－アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するα－アミノ酸の立体異性体としては、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）、Ｄ－システイン（Ｄ－Ｃｙｓ）、Ｄ－アスパラギン酸（Ｄ－Ａｓｐ）、Ｄ－グルタミン酸（Ｄ－Ｇｌｕ）、Ｄ－フェニルアラニン（Ｄ－Ｐｈｅ）、Ｄ－ヒスチジン（Ｄ－Ｈｉｓ）、Ｄ－イソロイシン（Ｄ－Ｉｌｅ）、Ｄ－アルギニン（Ｄ－Ａｒｇ）、Ｄ－リジン（Ｄ－Ｌｙｓ）、Ｄ－ロイシン（Ｄ－Ｌｅｕ）、Ｄ－メチオニン（Ｄ－Ｍｅｔ）、Ｄ－アスパラギン（Ｄ－Ａｓｎ）、Ｄ－プロリン（Ｄ－Ｐｒｏ）、Ｄ－グルタミン（Ｄ－Ｇｌｎ）、Ｄ－セリン（Ｄ－Ｓｅｒ）、Ｄ－トレオニン（Ｄ－Ｔｈｒ）、Ｄ－バリン（Ｄ－Ｖａｌ）、Ｄ－トリプトファン（Ｄ－Ｔｒｐ）、Ｄ－チロシン（Ｄ－Ｔｙｒ）、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで言及され得る。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、一本鎖におけるアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び非天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、完全にＬ－アミノ酸、完全にＤ－アミノ酸、またはＬアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物を含み得る。
本明細書で使用される、「タンパク質」という用語は、ポリペプチドまたは一本鎖ポリペプチドの二量体（すなわち、２つ）もしくは多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって、または非共有相互作用によって接合することができる。
「保存的置換」、「保存的変異」、または「保存的に改変されたバリアント」という用語は、類似の特徴を有すると分類され得る別のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる改変を指す。このようにして定義される保存的アミノ酸群の分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リジンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）、及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「荷電／極性群」、Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）、及び（ヒスチジンまたはＨ）を含めた「芳香族群」、ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）、及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含めた「脂肪族群」を挙げることができる。各群内で、下位群もまた識別され得る。例えば、荷電または極性アミノ酸の群は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓを含む「正に荷電した下位群」、Ｇｌｕ及びＡｓｐを含む「負に荷電した下位群」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎを含む「極性下位群」を含めた下位群に分割され得る。別の例では、芳香族または環状群は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、及びＴｒｐを含む「窒素環下位群」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒを含む「フェニル下位群」を含めた下位群に分割され得る。別のさらなる例では、脂肪族群は、下位群、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、及びＡｌａを含む「脂肪族非極性下位群」ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓを含む「脂肪族微極性下位群」に分割され得る。保存的変異の分類の例としては、上記下位群内のアミノ酸、例えば、限定されないが、正の荷電が維持され得るようにＬｙｓをＡｒｇで、またはその逆、負の荷電が維持され得るように、ＧｌｕをＡｓｐで、またはその逆、遊離の－ＯＨが維持され得るように、ＳｅｒをＴｈｒで、またはその逆、及び遊離の－ＮＨ２が維持され得るように、ＧｌｎをＡｓｎで、またはその逆のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、天然に存在する疎水性アミノ酸と、例えば、活性部位で置換され、疎水性を保存する。
２つ以上のポリペプチド配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメント及び目視検査により測定した場合に、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたり最大限一致するように比較及びアラインメントされるとき、特定の領域にわたって、同じであるかまたは特定のパーセンテージ、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％もしくはそれ以上同一であるアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態では、参照配列に対して指定されたパーセント同一性を有する配列は、１つまたは複数の保存的置換によって参照配列とは異なる。
ポリペプチドの配列比較の場合、通常は１つのアミノ酸配列が参照配列として機能し、これを候補配列と比較する。アラインメントは、当業者に利用可能な様々な方法、例えば、視覚によるアラインメントを用いて、または既知のアルゴリズムを用いた公開されているソフトウェアを用いて行い、最大のアラインメントを達成することができる。このようなプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大のアラインメントを達成するためにアラインメントに使用されるパラメータは、当業者によって決定され得る。本出願の目的で、ポリペプチド配列の配列比較に関しては、２種のタンパク質配列をデフォルトのパラメータで整列させるためのＢＬＡＳＴＰアルゴリズム標準タンパク質ＢＬＡＳＴが使用される。
ポリペプチド配列における所与のアミノ酸残基の特定との関連で使用される場合の「～に対応する」、「～を参照して決定される」、または「～を参照して付番される」という表現は、所与のアミノ酸配列が最大限にアラインメントされ、参照配列と比較される場合の特定の参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変Ｆｃポリペプチド中のアミノ酸残基は、当該残基を配列番号１に対して最適にアラインメントしたときに配列番号１のアミノ酸と一致する場合、配列番号１のアミノ酸に「対応する」。参照配列に対してアラインメントされるポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、互換的に、任意の長さのヌクレオチド鎖を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖の中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。本明細書で企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「結合親和性」という用語は、２つの分子間、例えば、ポリペプチド上の単一の結合部位と、それが結合する標的、例えばトランスフェリン受容体との間の非共有結合相互作用の強さを指す。したがって、例えば、別段示されない限り、または文脈から明らかでない限り、この用語はポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を指す場合がある。結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができ、これは、結合速度定数（ｋａ、時間－１Ｍ－１）で除した解離速度定数（ｋｄ、時間－１）を指す。ＫＤは、複合体形成及び解離の動態の測定、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム；ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外法（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）アッセイ；及びＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームを使用する）を使用することによって決定され得る。本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、ポリペプチドとその標的との間の１：１の相互作用を反映するものなどの公式の結合親和性のみならず、強力な結合を反映し得るＫＤが算出される見かけの親和性も含む。
本明細書で使用される場合、標的、例えばＴｆＲに「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、本明細書に記載の操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体を指す場合、それにより、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体が、構造的に異なる標的に結合するよりも、より高い親和性、より高いアビディティ、及び／またはより長い持続時間で標的に結合する、結合反応を指す。典型的な実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、同じアフィニティーアッセイ条件下でアッセイした場合、無関係の標的と比較して、特異的標的、例えば、ＴｆＲに対して少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上大きい親和性を有する。本明細書で使用する場合、特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「への特異的な結合」、「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、結合する標的に対して、例えば、１０－４Ｍ以下（例えば、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍまたは１０－１２Ｍ）の平衡解離定数ＫＤを有する分子によって示され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、種間で保存された（例えば、種間で構造的に保存された）、例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で保存された（例えば、非ヒト霊長類とヒト種との間で構造的に保存された）ＴｆＲ上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチド、ＴｆＲ結合ペプチド、またはＴｆＲ結合抗体は、ヒトＴｆＲに排他的に結合し得る。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、生殖系列可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子、または結合（Ｊ）遺伝子に由来し（かつ定常（Ｃμ及びＣδ）遺伝子セグメントには由来しない）、抗体に抗原と結合する特異性を与える、抗体重鎖または軽鎖中のドメインを指す。通常、抗体の可変領域は、３つの超可変「相補性決定領域」が散在する４つの保存された「フレームワーク」領域を含む。
「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書において互換的に使用され、その可変領域を介して抗原に特異的に結合する能力を保持した１つまたは複数の抗体の断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片）、Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片から構成される二価断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ならびにＶＨ（重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の実施例は非限定的であることを意図している。
実施例１：Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）を含む融合タンパク質の構築。
設計及びクローニング
（ｉ）成熟ヒトＳＧＳＨ酵素がＦｃ領域を含むヒトＩｇＧ１断片に融合した第１の融合ポリペプチド（「ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド」）、及び（ｉｉ）成熟ヒトＳＧＳＨ酵素が、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合を付与するＦｃ領域に変異を含有する改変ヒトＩｇＧ１断片に融合した第２の融合ポリペプチド（「改変Ｆｃポリペプチド」）を含有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質を設計した。特に、ＳＧＳＨ断片がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に融合したＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを作成した。場合によっては、ＳＧＳＨとＩｇＧ１断片との間にリンカーを配置して、２つの断片間の立体障害を軽減した。すべてのコンストラクトにおいて、シグナルペプチドＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＹＡ（配列番号：１２１）を融合の上流に挿入して分泌を促進し、ＳＧＳＨをアミノ酸Ｒ２１－Ｌ５０２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ－Ｐ５１６８８）で構成されるように短縮化した。使用したヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の断片は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｐ０１８５７の配列のアミノ酸Ｄ１０４－Ｋ３３０（ＥＵ付番、位置２２１～４４７、ヒンジの１０アミノ酸（位置２２１～２３０）を含む）に対応する。改変Ｆｃポリペプチドに融合したＳＧＳＨを含有する第２の融合ポリペプチドを、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドと同時トランスフェクトして、２つのＳＧＳＨ酵素を有するヘテロ二量体融合タンパク質（「ｂｉｚｙｍｅ」）を生成した。一部のコンストラクトでは、ＩｇＧ１断片に追加の変異が含まれており、これにより２つのＦｃ領域のヘテロ二量体化が容易になる。したがって、実施例で使用されるＴｆＲ結合を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質は、ｉ）ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド；及びｉｉ）第２のＳＧＳＨ分子に融合した改変Ｆｃポリペプチドを含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドによって形成される二量体（「ｂｉｚｙｍｅ」）である。
ＴｆＲ結合を付与する変異を欠く対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質を、同様に設計及び構築した。配列番号６１及び６３のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドと、配列番号６９及び７１のいずれか１つの配列を有する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドとを含む、例示的な対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が生成された。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６２または６４の配列を有し、及び／または第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号７０または７２の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号６１、６３、６９及び７１）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号６２、６４、７０及び７２から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号６１～６４のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号７３～７６のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＳリンカー（配列番号７）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号８１～８４のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素は（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）リンカー（配列番号９）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ホール変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号６５～６８のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ホール変異及びＬＡＬＡ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチド配列のＣ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含むＦｃ－ＳＧＳＨ融合ポリペプチドは、配列番号１１７～１１８のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドの配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号８９～９２のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によって改変Ｆｃポリペプチドに接合し、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドの配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１０１～１０４のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＳリンカー（配列番号７）によってＦｃポリペプチドに接合し、ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドの配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１０９～１１２のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号９）によって改変Ｆｃポリペプチドに接合し、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ノブ変異及びＬＡＬＡＰＳ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドの配列のＮ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号９３～９６のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によって改変Ｆｃポリペプチドに接合し、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
ノブ変異及びＬＡＬＡ変異を有するＴｆＲ結合改変Ｆｃポリペプチドの配列のＣ末端に融合した成熟ヒトＳＧＳＨ配列を含む、ＴｆＲに結合するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１１９～１２０のいずれか１つの配列を有する。ＳＧＳＨ酵素はＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）によって改変Ｆｃポリペプチドに接合し、改変ＦｃポリペプチドのＮ末端はＩｇＧ１ヒンジ領域（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ；配列番号６）の一部を含んでいた。
第１の「Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１」）が生成され、これは、配列番号６１及び６３のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号８９及び９１のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６２または６４の配列を有し、及び／またはＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号９０または９２の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号６１、６３、８９及び９１）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号６２、６４、９０及び９２から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
第２の「Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造２」）が生成され、これは、配列番号７３及び７５のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１０１及び１０３のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号７４または７６の配列を有し、及び／またはＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号１０２または１０４の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造２という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号７３、７５、１０１及び１０３）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号７４、７６、１０２及び１０４から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
第３の「Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造３」）が生成され、これは、配列番号８１及び８３のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１０９及び１１１のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号８２または８４の配列を有し、及び／またはＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号１１０または１１２の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造３という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号８１、８３、１０９及び１１１）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号８２、８４、１１０及び１１２から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
第４の「Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４」）が生成され、これは、配列番号６５及び６７のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号９３及び９５のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６６または６８の配列を有し、及び／またはＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号９４または９６の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号６５、６７、９３及び９５）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号６６、６８、９４及び９６から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
「Ｃ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造５」）が生成され、これは、配列番号１１７及び１１８のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１１９及び１２０のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造５という用語は、配列番号１１７及び１１９を含むタンパク質分子；配列番号１１８及び１２０を含むタンパク質分子；または配列番号１１７及び／または１１８を配列番号１１９及び／または１２０と組み合わせて含む混合物を指すために使用することができる。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ（例えば、上記の構造）を含む組成物は、非プロセシング配列を有するタンパク質分子を含む組成物；１つまたは複数のプロセシング配列を含むタンパク質分子を含む組成物；またはプロセシングタンパク質分子と非プロセシングタンパク質分子を含む混合物、を指すために使用してもよい。
組換えタンパク質の発現及び精製
Ｆｃ領域に融合した組換えＳＧＳＨ酵素を発現させるために、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、製造元の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキットを使用して、関連するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした。細胞は、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）内で３７℃、５％ＣＯ２及び１２５ｒｐｍで、製造元のプロトコルに記載されているように、フィードを補充したＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で増殖させた。簡単に説明すると、対数増殖しているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞に、培養体積１ｍＬあたり０．８μｇの全ＤＮＡプラスミドを、６×１０６細胞／ｍｌの密度でトランスフェクトした。ＳＧＳＨ融合体を発現する培養物に、５：１のプラスミド比（ＳＧＳＨ：ＳＵＭＦ１）で補因子ＳＵＭＦ１を発現するプラスミドを同時トランスフェクトした。コードされたＳＵＭＦ１配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿１８２７６０に記載されている。トランスフェクション後、細胞を３７℃に戻し、トランスフェクションの１８～２２時間後、トランスフェクトされた培養物に、示されているようにフィードを補充した。トランスフェクトされた細胞培養上清を、トランスフェクションの１２０時間後に、２０分から３，５００ｒｐｍで遠心分離することにより回収した。清澄化した上清を濾過し（０．２２μＭのメンブレン）、４℃で保存した。
ＴｆＲ結合を付与する操作されたＦｃ領域を含む（または含まない）ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して細胞培養上清から精製した。上清を、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用する）にロードした。次に、そのカラムを、１０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ３．６を使用して溶出した。溶出直後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８（１：７希釈）を使用して画分を中和した。溶出画分におけるＳＧＳＨ－Ｆｃ融合体の均質性を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣならびに非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを含む複数の技術によって評価した。
実施例２：ＳＧＳＨ融合タンパク質の特徴付け。
融合タンパク質のホルミルグリシン及びＭ６Ｐ含有量
ＳＧＳＨの酵素活性及び融合タンパク質の輸送に影響を与えるＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質のある特定の特性を特徴付けるために、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質のホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）含有量及びマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量を評価した。実施例１に記載のＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１）及び対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（ＴｆＲ結合を欠く）を、分析に使用した。
ｆＧｌｙ含有量の測定。Ｃｙｓ及びＦＧｌｙ含有ペプチドの同一性及び量を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同時に評価した。簡単に説明すると、約２０μｇのＳＧＳＨ融合タンパク質を、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）により還元し、ヨードアセトアミドによりアルキル化し、トリプシンによりタンパク質分解的に消化させた（７０℃で２時間）。ギ酸でクエンチされた反応物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチドの定量分析を、ＵＶ／Ｖｉｓ及びＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）に結合したＵＨＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）における液体クロマトグラフィーによって実行した。分析のために、ＣＳＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）に４０℃で、０．１％ギ酸を含む水の移動相とともに試料を注入した。次に、試料を、０．１％ギ酸を含む水（Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）をそれぞれ含有する、１％Ｂから７０％Ｂまでの４５分間の直線勾配にかけた。質量分析計を、正モードでのフルマススキャンで操作した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅソフトウェアを使用して、ピーク面積またはいわゆる曲線下面積（ＡＵＣ）を積算した。以下の、位置７０にＳＧＳＨシステイン（ＣＸＰＸＲモチーフ（配列番号１２６）を含有する３つの主要なトリプシンペプチド）を積算した：（１）遊離Ｃｙｓ、ＮＡＦＴＳＶＳＳＣＳＰＳＲ（配列番号１２７）（２＋、ｍ／ｚ６７１．８０６）；（２）アルキル化カルバミドメチルＣｙｓ：ＮＡＦＴＳＶＳＳＣ（ＣＡＭ）ＳＰＳＲ（配列番号１２８）（２＋、ｍ／ｚ７００．３１７）及び（３）ＦＧｌｙペプチド：ＮＡＦＴＳＶＳＳ（Ｆｇｌｙ）ＳＰＳＲ（配列番号１２９）（２＋、ｍ／ｚ６６３．８１０）。計算によるＦＧｌｙの％は、３つのＦＧｌｙペプチドのＡＵＣを、ＦＧｌｙペプチド及び遊離Ｃｙｓペプチド及びアルキル化ＣｙｓペプチドのＡＵＣの合計で除し、１００を掛けたものに基づいている。ＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨのｆＧｌｙ含有量は、互いに類似していることが見出された（図２）。
マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量の測定。液体クロマトグラフィー－質量分析法分析によって、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質のＭ６Ｐ含有量を測定した。組換え精製タンパク質（２０μｇ）を、５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０に緩衝液交換した。５μｇのタンパク質を採取し、安定同位体標識（ＳＩＬ）１３Ｃ６マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ－ＩＳ、Ｏｍｉｃｒｏｎｂｉｏ Ｉｎｃ、カタログ＃、ＭＡＮ－０５、試料あたり１２５ｎｇ）を内部標準としてスパイクした。タンパク質試料に、６．６Ｍトリフルオロ酢酸溶液１２０μＬを加え、これをヒーターブロックを使用して９５℃で１０５分間振とうしながら加水分解させた。窒素流で乾燥させた試料をアセトニトリル（ＡＣＮ）で洗浄し、再度乾燥させた。５０μＬのＡＣＮ：水（２０：８０、ｖ：ｖ）に再懸濁した最終ペレットを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。Ｍ６Ｐ分析を、ＵＶ／Ｖｉｓ及びＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレーイオン化質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）に結合したＵＨＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）における液体クロマトグラフィーによって実行した。試料は、ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ）１．９μｍ、２．１×１５０ｍｍに、０．１％ギ酸を含む水の移動相に負イオン化モードで６０℃にて注入し、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルの勾配で溶出した。データは、Ｍ６Ｐ及びＭ６Ｐ内部標準（ＩＳ）を含み、包含時間１．６～２．２分で負モードでの並列反応モニタリング（ＰＲＭ）取得を使用して収集し、前駆体が２５９．０２２４（Ｍ６Ｐ）及び２６５．０４２６（Ｍ６Ｐ－ＩＳ）であった。Ｍ６Ｐ／Ｍ６Ｐ－ＩＳのＡＵＣ比を使用して、タンパク質から放出されたＭ６Ｐの分子量を計算し、タンパク質１モルあたりのＭ６Ｐのモル数を得た。ＳＧＳＨ－Ｆｃ及びＥＴＶ：ＳＧＳＨのＭ６Ｐ含有量を表１に示す。

操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はヒトＴｆＲに結合する
操作されたＴｆＲ結合を有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が、ヒトＴｆＲと相互作用する改変Ｆｃドメインの能力に影響を与えるかどうかを判定するために、ヒトＴｆＲに対するＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１（実施例１）の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップを、抗ヒトＦａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のヒトＦａｂ捕捉キット）で固定化した。５μｇ／ｍＬのＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質を各フローセルで１分間捕捉し、ヒトアピカルドメインＴｆＲの連続３倍希釈液を３０μＬ／分の流速で注入した。各試料を、３分間の会合及び３分間の解離で分析した。各注入後、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）を使用して、チップを再生した。結合反応は、無関係のＩｇＧを同様の密度で捕捉したフローセルからのＲＵを差し引くことで補正した。定常状態の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１を使用して、平衡状態での応答を濃度に対してフィッティングすることによって得た。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析により、Ｆｃ領域に操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が、ヒトＴｆＲに結合することが明らかになった。特に、ヒトＴｆＲに対するＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１の結合親和性は、約２３０ｎＭであると決定された。
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ及び細胞内で活性である。
操作されたＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ及び細胞活性を評価して、ＳＧＳＨがヒトＩｇＧ断片に融合した場合にその酵素活性を維持することが実証された。組換えＳＧＳＨのインビトロ活性は、人工基質を使用した２ステップの蛍光酵素アッセイを使用して測定した。具体的には、アッセイ緩衝液（０．０３Ｍ酢酸ナトリウム、０．１２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で希釈した２０μＬの１ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル２－デオキシ－２－スルファミノ－ａ－Ｄ－グルコピラノシドナトリウム塩基質（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ、＃ＥＭ０６６０２）を、１０～２０μＬの１４０ｎＭ ＳＧＳＨと混合した。第１の反応物は、３７℃で１７時間インキュベートし、その後１０μＬの０．２Ｍリン酸－クエン酸緩衝液、ｐＨ６．７により終了させた。次に、１０μＬ（０．５Ｕ）の酵母α－グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ０６６０－７５０ＵＮ）を加えて第２の反応を開始し、３７℃で２４時間インキュベートし、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．３を加えて停止させた。次に、反応溶液の蛍光を測定した（３６５ｎｍでの励起及び４５０ｎｍでの発光）。４－メチルウンベリフェロンの標準曲線を線形回帰によってフィッティングさせて、生成物の量を計算し、全基質切断の１０％未満であることを確認した。比活性（ｆｍｏｌ生成物／分／ｐｍｏｌ ＳＧＳＨ）は、生成物の量を反応時間及びＳＧＳＨのモル量で除すことによって計算した。
インビトロ酵素活性アッセイによって、ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が活性であり、Ｆｃ－ＳＧＳＨ（対照；実施例１）とＥＴＶ：ＳＧＳＨ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１；実施例１）との間で類似していることを実証した（図３）。
ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質の細胞活性を、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者及び健常対照由来の線維芽細胞でも、３５Ｓパルスチェイスアッセイを使用して調査し、このアッセイでは、３５Ｓを、以前に記載されているように、新しく合成されたＧＡＧに組み込む（Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． １１（８）： ２９２８－２９３４ ［２０１４］）。ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者の線維芽細胞はＳＧＳＨ活性を欠いているため、これにより３５Ｓシグナルの蓄積が増加する。ＥＴＶ：ＳＧＳＨ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１）を含むＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｓ３５標識物質の蓄積を減少させるための低いピコモルの細胞ＥＣ５０を示し（図４）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ患者由来細胞において非常に有効であった。
操作されたＴｆＲ結合部位を有するＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＭＰＳＩＩＩのマウスモデルにおける脳送達の改善を示す。
ＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が、対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して脳送達の改善を示したかどうかを判定するために、ヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩ）マウスに、４０ｍｇ／ｋｇのＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＳＧＳＨ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１）またはＴｆＲ結合を付与する変異を欠く対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＳＧＳＨ：Ｆｃ」）（実施例１を参照）を投与し、肝臓及び脳内のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、投与後２時間及び８時間で測定した。分析に使用されたＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質は上記に記載されており、実施例１に従って調製した（本明細書では、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１）及び対照ＳＧＳＨ－Ｆｃと呼ぶ）。Ｆｃ断片に特異的なポリクローナルロバ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃７０９－００６－０９８）を、３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４６４７１８）に、一晩コーティングした。プレートを５％ＢＳＡでブロック後、希釈した血清、脳、及び肝臓のライセートとともにインキュベートした。次に、Ｆｃ断片に特異的なＨＲＰコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－０３６－０９８）を検出のために加えた。ＴＭＢ基質を使用してプレートを発色させ、硫酸で停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで測定した。標準曲線は、３倍希釈系列で２０００～２．７４ｐＭで個々に構築し、５パラメーターロジスティック曲線を使用してフィッティングさせた。ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスは、国際特許公開第ＷＯ２０１８／１５２２８５号に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、マウスＴｆｒｃ遺伝子内のヒトＴｆｒｃアピカルドメインを発現させて作製した。得られたキメラＴｆＲは、内因性プロモーターの制御下にてインビボで発現させた。結果を図５～７に示す。
ＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質の投与により、対照ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、投与後２時間で脳への取り込みがおよそ６倍増加し、投与後８時間で脳内濃度がおよそ４倍増加した（図７）。肝臓における融合タンパク質の蓄積は、ＥＴＶ：ＳＧＳＨとＳＧＳＨ：Ｆｃの両方について２時間で同等であったが、投与後８時間で大幅に（およそ３０倍）減少して、ＥＴＶ：ＳＧＳＨは、ＳＧＳＨ：Ｆｃと比較してより低いレベルを示した（図６）。血清中の融合タンパク質の濃度は、投与後０．５、１、２、４、及び８時間で、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して測定した。血清ＰＫは、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ及びＳＧＳＨ：Ｆｃの両方について２時間で同等であったが、ＥＴＶ：ＳＧＳＨは、投与後２時間～８時間の間で、ＳＧＳＨ：Ｆｃと比較してより低いレベルを示した（図５）。ＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質の脳内レベルは、対照ＳＧＳＨ：Ｆｃ融合タンパク質と比較して８時間上昇したままであったが、より速い末梢クリアランスが、投与後２時間から８時間までの脳及び肝臓濃度の低下の原因であり得る。まとめると、これらのデータは、ＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質とＴｆＲとの相互作用により、全般に末梢分布を維持しながら、脳曝露が大幅に改善することを示している。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨの静脈内投与は脳内のＧＡＧを減少させる
上記の、及び実施例１に従って調製されたＴｆＲ結合ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（本明細書ではＥＴＶ：ＳＧＳＨと呼ばれる）について観察された脳曝露の改善によって、脳内の蓄積基質の対応する減少が生じたどうかを調査するために、マウスＴｆＲにノックインされたヒトＴｆＲアピカルドメインを有するスルファミダーゼ変異を含有するマウスモデルを作製した（本明細書では、Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウス、または代替的にＳＧＳＨＤ３１Ｎ；ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスと呼ばれる）。新規スルファミダーゼ変異であるＤ３１Ｎを含有するＳｇｓｈｍｐｓ３ａマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＪＡＸストック＃００３７８０）から入手した。簡単に説明すると、ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩ雄性マウスを、雌性Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａヘテロ接合マウスと交配させて、ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩホモ接合バックグラウンドのＳｇｓｈｍｐｓ３ａ変異のホモ接合マウスを作製した。この研究で使用されたマウスは混合性であり、１２時間の明暗サイクルの下で、食物（ＬａｂＤｉｅｔ ＪＬ 照射６Ｆ）及び水を自由に摂取させて飼育した。
Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスに、４０ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量のＥＴＶ：ＳＧＳＨ（Ｂｉｚｙｍｅ構造１）またはＳＧＳＨ－Ｆｃを静脈内注射により投与し、薬力学的応答を評価した（融合タンパク質については実施例１を参照のこと）。特に、Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスの肝臓、脳、及びＣＳＦ ＨＳレベルに対するＥＴＶ：ＳＧＳＨの末梢投与の効果を、生理食塩水、ＳＧＳＨ－Ｆｃ（４０ｍｇ／ｋｇ体重）、またはＥＴＶ：ＳＧＳＨ（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した３月齢のＳｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスを使用して（ｎ＝８／群）決定した。３月齢の同腹仔ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスに生理食塩水をｉ．ｖ．注射し、これらを対照として使用した。単回投与の３日後に犠死させた、ＥＴＶ：ＳＧＳＨを注射したＳｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスのサブセット（ｎ＝４）を除いて、すべての動物を、単回投与の７日後に犠死させた。血清、ＣＳＦ、肝臓、及び脳を収集し、ドライアイスで急速凍結した。
ヘパラン硫酸由来の二糖は、以下に説明するＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用して、インビボで測定した。簡単に説明すると、すべての組織及び体液を収集した後、直ちに凍結して－８０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩを３０Ｈｚで３分間使用して、組織アリコート（５０ｍｇ）を水（７５０μＬ）中で均質化した。ホモジネートを９６ウェルディーププレートに移し、９６チップ超音波処理装置（Ｑ Ｓｏｎｉｃａ）を使用して１０×１秒のパルスで超音波処理した。超音波処理したホモジネートを、２，５００×ｇで３０分間、４℃で遠心させ、細胞破片をペレット化した。得られたライセートをきれいな９６ウェルディーププレートに移し、ＢＣＡを実行して総タンパク質を定量した。試料中のヘパラン硫酸（ＨＳ）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に対応する二糖に消化された。１０μｇの総タンパク質ライセートまたは３μｌのＣＳＦを、ＰＣＲプレート中で消化緩衝液［１１１ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、０．１１ｍＭ ＣａＯＡｃ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０］中のヘパリナーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩと共に、３０℃で振とうしながら３時間インキュベートした。３時間後、ＥＤＴＡ及び２０ｎｇの内部標準Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（ＨＤ００９、Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を各試料に加え、混合物を９５℃で１０分間煮沸して酵素を不活化した。消化した試料を３，３６４×ｇで５分間遠心させ、上清を酢酸セルロースフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＵＮ０３０１０）に移し、３，３６４×ｇで５分間遠心させた。得られた溶出液をガラスバイアル中で等量のアセトニトリルと混合し、以下のように質量分析によって分析した。
体液及び組織中のＨＳ由来二糖の定量化を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）と結合した液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、ＵＳＡ）により実行した。各分析では、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７ｍｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に、流速０．４ｍＬ／分、カラム温度５０℃で試料を注入した。移動相Ａは１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む水で構成され、移動相Ｂは０．１％ギ酸を含むアセトニトリルで構成されていた。勾配を、以下のようにプログラムした：８５％Ｂで０．０～１．０分、８５％Ｂ～５０％Ｂで１．０～５．０分、５０％Ｂ～８５％Ｂで５．０～６．０分、８５％Ｂで６～８．０分保持する。エレクトロスプレーイオン化を、以下の設定を適用して負イオン化モードで実行した：カーテンガス ３０；衝突ガス 中程度；イオンスプレー電圧 －４５００；温度 ４５０℃；イオン源ガス１ ５０；及びイオン源ガス２ ６０。Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を、多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）を使用して、以下の設定：滞留期間 ３０ｍ秒；衝突エネルギー －３０；デクラスタリング電位 －８０；入口電位 －１０；衝突セル出口電位 －１０を用いて、データ取得を実行した。個々の二糖種は、市販の参照標準（Ｉｄｕｒｏｎ Ｌｔｄ）を使用して、保持時間及びＭＲＭトランジションに基づいて同定した。以下の二糖トランジションを監視した：Ｄ０Ａ０（ＨＳ）、ｍ／ｚ ３７８．１＞８７．０；Ｄ０Ｓ０（ＨＳ）、ｍ／ｚ ４１６．１＞１３８．０；Ｄ４ＵＡ－２Ｓ－ＧｌｃＮＣＯＥｔ－６Ｓ（内部標準）ｍ／ｚ ４７２．０＞９７．０。二糖の量を、ＢＣＡアッセイで測定された総タンパク質レベル、または試料ごとに使用された体液の量に対して正規化した。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨが脳内の基質レベルを低下させるかどうかを判定するために、酵素の単回投与後にＳｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスでＨＳレベルを評価した。ＳＧＳＨ－Ｆｃは、単回投与後の脳ＨＳレベルの低下には効果がなかった（図９）。しかし、ＥＴＶ：ＳＧＳＨによって、脳ＨＳレベルが単回投与後３日目及び７日目にそれぞれおよそ５０％及び５７％低下した（図９）。これにより、ＣＳＦ ＨＳレベルが単回投与の３日後及び７日後にそれぞれおよそ７０％及び８０％低下した（図１０）。両方の分子によって、１週間後に肝臓のＨＳレベルが効果的に低下し（図８）、ＴｆＲ結合がこれらの組織における薬力学的応答に悪影響を及ぼさないことを実証している。図８～１０のデータは、平均値＋／－平均値の標準誤差で表される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意ではない）。まとめると、これらのデータは、ＥＴＶ：ＳＧＳＨによって酵素の脳への曝露が有意に増加し、末梢とＣＮＳの両方で基質の蓄積が確実に減少することを実証している。
実施例３：ＥＴＶ：ＳＧＳＨ ｂｉｚｙｍｅ構造の生成物品質属性。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の異なるＢｉｚｙｍｅ構造を、生成物の品質に関して評価した。この研究のために、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１（実施例１）を、異なるＴｆＲ結合Ｆｃ領域を有する構造（ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造６、以下に記載）と比較した。両方の構造は、以下に記載する追加の精製ステップを用いて、実施例１に記載したように調製した。
結果
Ｂｉｚｙｍｅ構造１及びＢｉｚｙｍｅ構造６について測定されたヒトＴｆＲ親和性は、同等であった（ＫＤはそれぞれ約２９０ｎＭ対約２４５ｎＭ）。
Ｂｉｚｙｍｅ構造１の発現力価は約３０～４０ｍｇ／Ｌであると判定されたのに対し、Ｂｉｚｙｍｅ構造６の発現力価はわずかに低く測定された（約１２～２３ｍｇ／Ｌ）。
Ｂｉｚｙｍｅ構造１とＢｉｚｙｍｅ構造６の両方のプロテインＡクロマトグラフィー精製後の回収率を評価した。Ｂｉｚｙｍｅ構造１とＢｉｚｙｍｅ構造６の両方の後プロテインＡプールの分析により、少なくとも約８０％の無傷のＥＴＶ構造（ノブとホールの対を含む改変Ｆｃ二量体の維持）を伴う約５０～６０％の純度が示された（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）。両方のｂｉｚｙｍｅ構造の後プロテインＡのプールを、さらに精製するために疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）にかけた（以下に説明）。Ｂｉｚｙｍｅ構造１のＨＩＣ後プールは、＞９０％の無傷のＥＴＶ構造を伴い、＞９５％（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）の純度レベルを達成し、一方、Ｂｉｚｙｍｅ構造６のＨＩＣ後プールは、＞９０％の無傷のＥＴＶ構造を伴い、約８５％（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）の純度レベルを達成した。Ｂｉｚｙｍｅ構造６でより高い純度レベル（＞９０％）を達成するには、追加の精製ステップが必要であり、これにより精製後のタンパク質の収量及び回収率が低下する可能性がある。
したがって、Ｂｉｚｙｍｅ構造１及びそのＰ３２９Ｓバリアント（Ｂｉｚｙｍｅ構造４）は、より大規模な生成に移行するための好ましい構造として特定された。
実験方法
第６の「Ｎ末端ｂｉｚｙｍｅ」ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造６」）が生成され、これは、配列番号６１及び６３のいずれか１つの配列を有する第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチド、ならびに配列番号１２２及び１２４のいずれか１つの配列を有する、ＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含んでいた。ＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、細胞培養生成中にさらにプロセシングして、第１のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号６２または６４の配列を有し、及び／またはＴｆＲに結合する第２のＳＧＳＨ－Ｆｃ融合ポリペプチドが配列番号１２３または１２５の配列を有するようにしてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造６という用語は、非プロセシング配列（すなわち、配列番号６１、６３、１２２及び１２４）を有するタンパク質分子；１つまたは複数のプロセシング配列（すなわち、配列番号６２、６４、１２３及び１２５から選択される）を含むタンパク質分子；またはプロセシング及び非プロセシングタンパク質分子を含む混合物を指すために使用することができる。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造６は、実施例１に記載されているように、以下の改変を伴って発現及び精製された：プロテインＡアフィニティーカラムから溶出されたプールされたタンパク質画分の中和を、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を用いて標的ｐＨ６．０まで実行した。次に、中和されたプロテインＡプールを、１Ｍクエン酸ナトリウムで調整して、最終濃度０．６Ｍクエン酸ナトリウムとした。プールした画分を、ブチルＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムにロードし、０．６Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄し、（ｉ）１０ＣＶにわたる０．６Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）からＷＦＩへの５０％段階勾配を介して、続いて（ｉｉ）５ＣＶにわたる０．６Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）からＷＦＩへの１００％段階勾配によって溶出した。
溶出画分におけるＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の均質性を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣならびに非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを含む複数の技術によって評価した。ヒトＴｆＲに対する親和性を、実施例２に記載されるように測定した。
実施例４：ＥＴＶ：ＳＧＳＨについて異なるｂｉｚｙｍｅ構造の静脈内投与により、脳内のＧＡＧの同等の減少を達成する。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ融合タンパク質の異なるｂｉｚｙｍｅ構造を、ＭＰＳ ＩＩＩのマウスモデルにおける脳のＧＡＧレベルへの影響に関して評価した。この研究では、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１を、Ｆｃ領域にＰ３２９Ｓ変異を含有する対応する構造（ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４）と比較した。
結果
実施例２に記載の方法を使用して、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）含有量、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量、及びヒトＴｆＲ親和性についてｂｉｚｙｍｅ構造を分析した。表２に、各ｂｉｚｙｍｅ構造の分析結果を示す。Ｂｉｚｙｍｅ構造１及びＢｉｚｙｍｅ構造４のＨＩＣ後プール画分は、＞９０％の無傷のＥＴＶ構造を伴い、＞９５％の純度レベル（ＨＰＬＣ－ＳＥＣで測定）を達成した。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ構造が脳内の基質レベルを低下させるかどうかを判定するために、ＥＴＶ：ＳＧＳＨタンパク質の単回投与後にＳｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスでＨＳレベルを評価した。ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１及びＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４の両方によって、脳ＨＳレベルが単回投与後７日でそれぞれ約６３％及び５９％低下した（図１１）。図１１のデータは、平均＋／－平均の標準誤差で表す。このデータは、ＥＴＶ：ＳＧＳＨの両方のｂｉｚｙｍｅ構造により、脳内の基質蓄積が確実に減少したことを実証している。投与後７日で両方のｂｉｚｙｍｅ構造の脳への取り込みは検出可能であり、各コホートからサンプリングされた脳組織において０．５ｎＭを超えるものとして定量化した。
実験方法
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１を、実施例３に記載のように発現させかつ精製した。
ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４は、関連するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした安定なＣＨＯ細胞株から発現し、発現力価、安定性、ならびに発現した及び精製されたタンパク質の活性の評価によって選択された。簡単に説明すると、ＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳノックアウト細胞株（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に、関連するＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトし（融合タンパク質とＳＵＭＦ１をコードするプラスミドの同時トランスフェクション）、次に、目的の遺伝子を発現する安定な細胞株を生成するための選択を行った。次に、細胞株を、流加生成用の市販のＣＨＯ細胞培養培地（例えば、場合によりＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に供した。培養物を３７℃で５日間維持した後、温度を３２℃に変更した。１２日目に細胞培養物を回収し、遠心分離し、上清を市販のもの（０．８μｍ／０．２μｍメンブレンフィルター）に通して滅菌濾過し、４℃で保存した。融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、細胞培養上清から精製した。上清を、分取スケールＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸプロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用する）にロードした。次に、カラムを２カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳで洗浄し、続いて４ＣＶの０．４Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０、続いて３ＣＶのＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質は、５０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ３．７を使用して溶出した。溶出直後に、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ１１を使用して標的ｐＨを６．０にして、画分を中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィーの前に、中和されたプロテインＡプールを、１：１．３の比率で、１Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ６．０により調整した。調整したプロテインＡプールを、ブチルＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムにロードし、０．６Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ６．０で洗浄し、その後２５ＣＶにわたる０．６Ｍクエン酸ナトリウムからＷＦＩへの２０～５５％勾配により溶出した。溶出画分における融合タンパク質の均質性を、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣならびに非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣを含む複数の技術によって評価した。
融合タンパク質を、実施例２に記載の方法を使用して、ホルミルグリシン（ｆＧｌｙ）含有量、Ｍ６Ｐ含有量、及びＴｆＲ親和性について分析した。
Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウス（実施例２）に、単回用量のＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１またはＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４を静脈内注射により投与し、脳曝露及び薬力学的応答を評価した。Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスにおける脳ＨＳレベルに対するＥＴＶ：ＳＧＳＨ ｂｉｚｙｍｅ構造の末梢投与の効果を、生理食塩水、ＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造１（１５ｍｇ／ｋｇ体重）、またはＥＴＶ：ＳＧＳＨ Ｂｉｚｙｍｅ構造４（１５ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射された９月齢のＳｇｓｈｍｐｓ３ａ×ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウスを使用して判定した（ｎ＝４～５／群）。生理食塩水をｉ．ｖ．注射した９月齢の同腹子ＴｆＲｍｕ／ｈｕ ＫＩマウス（非ＭＰＳ ＩＩＩマウス）を、対照として使用した。すべての動物を、単回投与の７日後に犠死させた。脳組織を収集し、ドライアイスで急速凍結した。ＥＴＶ：ＳＧＳＨ及びヘパラン硫酸由来二糖の脳への取り込みを、実施例２に記載のように測定した。

すべての出版物、特許、及び特許文書は、参照により個別に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、種々の具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して記載してきた。しかしながら、本発明の主旨及び範囲内に留まりながら、多くの変形及び改変を行うことができることを理解されたい。

Claims (85)

  1. タンパク質であって、
    ａ．第１のＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）アミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド；
    ｂ．第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチド、を含み、前記第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合することができ；前記第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に対する少なくとも８０％の同一性を有し、ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する配列を含む、前記タンパク質。
  2. 前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち
    ｉ． 位置３８４にＴｙｒ；
    ｉｉ． 位置３８６にＴｈｒ；
    ｉｉｉ． 位置３８７にＧｌｕ；
    ｉｖ． 位置３８８にＴｒｐ；
    ｖ． 位置４１３にＴｈｒ；
    ｖｉ． 位置４１５にＧｌｕ；
    ｖｉｉ． 位置４１６にＧｌｕ；及び
    ｖｉｉｉ． 位置４２１にＰｈｅを含む、請求項２に記載のタンパク質。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質であって、対象の血液脳関門を通過させて輸送することができる、前記タンパク質。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質であって、約１００ｎＭ～約５００ｎＭ、または場合により約１５０ｎＭ～約４００ｎＭの親和性でＴｆＲに結合する、前記タンパク質。
  6. 前記第２のＦｃポリペプチドが、前記ＴｆＲのアピカルドメインに結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. 前記タンパク質の前記ＴｆＲへの前記結合が、トランスフェリンの前記ＴｆＲへの結合を実質的に阻害しない、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列が、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  9. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列が、配列番号５８～６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のタンパク質。
  10. 前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列が、配列番号５８～６０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. 前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列が、配列番号５８～６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 前記第１のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  13. 前記第２のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  14. 前記ポリペプチドリンカーがフレキシブルポリペプチドリンカーである、請求項１２または１３に記載のタンパク質。
  15. 前記フレキシブルポリペプチドリンカーがグリシンリッチリンカーである、請求項１４に記載のタンパク質。
  16. 前記ポリペプチドリンカーが、ＧＳ（配列番号７）、Ｇ４Ｓ（配列番号８）または（Ｇ４Ｓ）２（配列番号９）である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  17. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  18. 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. 前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が、前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  20. 前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  21. 前記第１のＦｃポリペプチドの前記Ｎ末端が、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；前記第２のＦｃポリペプチドの前記Ｎ末端が、前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  22. 前記第１のＦｃポリペプチドの前記Ｃ末端が、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結され；前記第２のＦｃポリペプチドの前記Ｃ末端が、前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  23. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含有する、請求項１～２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  24. ＥＵ付番に従って、前記Ｆｃポリペプチドのうちの一方が、Ｔ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を有する、請求項２３に記載のタンパク質。
  25. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｗ置換を含有する、請求項２４に記載のタンパク質。
  26. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１２～１９及び２８～３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３４～４１及び５４～５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のタンパク質。
  27. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する、請求項２４に記載のタンパク質。
  28. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号２４～２７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４８～５３のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のタンパク質。
  29. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ネイティブＦｃＲｎ結合部位を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  30. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を有しない、請求項１～２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  31. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  32. エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である、請求項３１に記載のタンパク質。
  33. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１４～１９及び２６～３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のタンパク質。
  34. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１４、１５、２８、及び２９のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
  35. 前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１８、１９、３０、及び３１のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
  36. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６１～８８及び１１７～１１８のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のタンパク質。
  37. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６１～６８、７３～７６、８１～８４及び１１７～１１８のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のタンパク質。
  38. 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３６～４１及び５０～５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２～３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  39. 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３６、３７、５４、及び５５のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のタンパク質。
  40. 前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号４０、４１、５６、及び５７のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のタンパク質。
  41. 前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号８９～１１６、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２～３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  42. 前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載のタンパク質。
  43. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、血清半減期を延長する、ネイティブＦｃ配列に対するアミノ酸変化を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  44. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置２５２でのＴｙｒ、位置２５４でのＴｈｒ、及び位置２５６でのＧｌｕの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  45. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  46. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む、請求項４３に記載のタンパク質。
  47. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６１～６８、７３～７６、及び８１～８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号８９～９６、１０１～１０４、及び１０９～１１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
  48. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６１～６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号８９～９２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
  49. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６３または６４のアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号９１または９２のアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載のタンパク質。
  50. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１０３または１０４のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
  51. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号８３または８４のアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１１１または１１２のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
  52. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６５～６８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号９３～９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のタンパク質。
  53. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号６７または６８のアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号９５または９６のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のタンパク質。
  54. 前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号１１８のアミノ酸配列を含み；前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列に連結された前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
  55. 前記ＳＧＳＨアミノ酸配列の脳内への取り込みが、前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドの非存在下での前記ＳＧＳＨアミノ酸配列の取り込みと比較して、または前記第２のＦｃポリペプチドに対するＴｆＲ結合をもたらす前記改変のないＳＧＳＨ酵素の取り込みと比較して、少なくとも１０倍大きい、請求項１～５４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  56. 前記第１のＦｃポリペプチドが、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するように改変されておらず、前記第２のＦｃポリペプチドが、ＴｆＲに特異的に結合するように改変されている、請求項１～５５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  57. 免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域配列またはその抗原結合部分を含まない、請求項１～５６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  58. ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、前記Ｆｃポリペプチドは、ｉ）トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合することができる；ｉｉ））配列番号３７に対する少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、ｉｉｉ）別のＦｃポリペプチドとのそのヘテロ二量体化を促進する１つまたは複数の改変を含有する；及びｉｖ）ＥＵ付番に従う、位置３８９にＡｌａを有する、前記ポリペプチド。
  59. 前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、位置３８０にＧｌｕ；及び位置３９０にＡｓｎをさらに含む、請求項５８に記載のポリペプチド。
  60. 前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う、以下の位置に、すなわち
    ｉ． 位置３８４にＴｙｒ；
    ｉｉ． 位置３８６にＴｈｒ；
    ｉｉｉ． 位置３８７にＧｌｕ；
    ｉｖ． 位置３８８にＴｒｐ；
    ｖ． 位置４１３にＴｈｒ；
    ｖｉ． 位置４１５にＧｌｕ；
    ｖｉｉ． 位置４１６にＧｌｕ；及び
    ｖｉｉｉ． 位置４２１にＰｈｅを含む、請求項５９に記載のポリペプチド。
  61. 前記Ｆｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって、前記ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結される、請求項５８～６０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  62. Ｎ末端からＣ末端まで：前記ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片；前記ポリペプチドリンカー；及び前記Ｆｃポリペプチド、を含む融合ポリペプチドである、請求項６１に記載のポリペプチド。
  63. Ｎ末端からＣ末端まで：前記Ｆｃポリペプチド；前記ポリペプチドリンカー；及び前記ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片、を含む融合ポリペプチドである、請求項６１に記載のポリペプチド。
  64. 前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する、請求項５８～６３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  65. 配列番号９７～１００、１０５～１０８、及び１１３～１１６のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載のポリペプチド。
  66. 前記ＦｃポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を含有する、請求項５８～６３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  67. 配列番号８９～９６、１０１～１０４、１０９～１１２、及び１１９～１２０のいずれか１つに対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載のポリペプチド。
  68. 請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチド及び前記他のＦｃポリペプチドを含むタンパク質。
  69. 請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  70. 請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  71. 請求項７０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  72. 請求項７０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  73. 前記他のＦｃポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７２に記載の宿主細胞。
  74. ＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、または触媒活性断片に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドを生成する方法であって、請求項７０に記載のポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドが発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  75. 請求項１～５７のいずれか１項に記載の、前記第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１の核酸配列；及び前記第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２の核酸配列、を含む、ポリヌクレオチドの対。
  76. 請求項７５に記載のポリヌクレオチドの対を含む、１つまたは複数のベクター。
  77. 請求項７５に記載のポリヌクレオチドの対、または請求項７６に記載の１つもしくは複数のベクターを含む宿主細胞。
  78. 第１のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第１のＦｃポリペプチド、及び第２のＳＧＳＨアミノ酸配列、ＳＧＳＨバリアントアミノ酸配列、またはその触媒活性断片に連結された第２のＦｃポリペプチド、を含むタンパク質を生成するための方法であって、請求項７５に記載のポリヌクレオチドの対が発現する条件下で宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
  79. サンフィリッポ症候群Ａを治療する方法であって、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  80. サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする患者におけるその治療に使用するための、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  81. サンフィリッポ症候群Ａの治療を必要とする患者におけるそれを治療するための医薬の調製における、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
  82. サンフィリッポ症候群Ａを有する患者において毒性代謝産物の蓄積を減少させる方法であって、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチドを、前記患者に投与することを含む、前記方法。
  83. サンフィリッポ症候群Ａを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるのに使用するための、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  84. サンフィリッポ症候群Ａを有する患者における毒性代謝産物の蓄積を減少させるための医薬の調製における、請求項１～５７及び６８のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項５８～６７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
  85. 前記毒性代謝産物が、ヘパラン硫酸由来オリゴ糖を含む、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の方法、タンパク質または使用。
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