JP2021527656A - プログラニュリンを含む融合タンパク質 - Google Patents

プログラニュリンを含む融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

プログラニュリンとＦｃポリペプチドとを含む融合タンパク質を、本明細書にて提供する。プログラニュリン関連障害（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性疾患）を処置するためにそのようなタンパク質を使用する方法も、本明細書にて提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１８日に出願された米国仮出願第６２／６８６，５７９号及び２０１８年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／７４６，３３８号の利益を主張し、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、認知症を有する全患者の５〜１０％、及び６５歳前に認知症を発症した患者の１０〜２０％を占める、進行性の神経変性障害である（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３−３４，２０１２（非特許文献１））。いくつかの遺伝子がＦＴＤに関連付けられているが、ＦＴＤにおいて最も頻繁に変異する遺伝子のうちの１つは、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、システインリッチなタンパク質であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）（プロエピセリン及びアクログラニンとしても知られる）をコードするＧＲＮである。ＧＲＮにおける浸透性の高い変異は、家族性ＦＴＤの常染色体優性形態の原因として、２００６年に最初に報告された（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４２（７１０５）：９１６−９，２００６（非特許文献２）、Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９２０−４（非特許文献３）、Ｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１５（２０）：２９８８−３００１，２００６（非特許文献４））。最近の推定では、ＧＲＮ変異は、家族歴が陽性であるＦＴＤ患者の５〜２０％、及び散発的症例の１〜５％を占めていると示唆されている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、上掲（非特許文献１））。
Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３−３４，２０１２ Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４４２（７１０５）：９１６−９，２００６ Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ Ａｕｇ ２４；４４２（７１０５）：９２０−４ Ｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１５（２０）：２９８８−３００１，２００６
説明
プログラニュリン関連障害（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性疾患）を処置するためのプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質及びそれらの使用方法が、本明細書にて提供される。
本開示の一態様は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチド二量体と、（ｂ）プログラニュリンポリペプチドとを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は療法に使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は神経変性疾患の処置に使用される。
本開示の別の態様は、（ａ）Ｆｃポリペプチドと、（ｂ）プログラニュリンポリペプチドとを含むタンパク質を含む。本態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、（ｉ）可変ドメインを含まず、（ｉｉ）ヒンジもしくは部分的ヒンジ領域を含み、及び／または（ｉｉｉ）Ｆｃポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合するような改変を含む。
別の態様では、（ａ）単一のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体と、（ｂ）（ａ）のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｃ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質が本明細書にて提供される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない。タンパク質は、厳密に１つのプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含むことができる。
本態様のいくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによってプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜５０、１〜２５、１〜２０または１〜１０アミノ酸長である。例えば、ポリペプチドリンカーは、３〜５０、３〜２５、５〜５０、５〜２５、５〜２０または１０〜２５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。フレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチなリンカー、例えば、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）であり得る。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、プログラニュリンポリペプチドに連結されている。
別の態様では、（ａ）第１のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第２のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合するタンパク質が、本明細書にて提供される。
本態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドの各々は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドの各々は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって第１のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されており、第２のＦｃポリペプチドは、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって第２のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜５０、１〜２５、１〜２０または１〜１０アミノ酸長である。例えば、ポリペプチドリンカーは、３〜５０、３〜２５、５〜５０、５〜２５、５〜２０または１０〜２５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。フレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチなリンカー、例えば、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）であり得る。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、第１のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は第２のプログラニュリンポリペプチドに連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端は第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端は、第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端は、第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されており、第２のＦｃポリペプチドのＣ末端は第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている。
先の２つの態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または第２のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドはそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ二量体は、Ｆｃヘテロ二量体である。
先の２つの態様のいくつかの実施形態では、ＥＵ付番に従って、Ｆｃポリペプチドのうちの一方はＴ３６６Ｗ置換を有し、他方のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を有する。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を含有する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１のアミノ酸配列を含む。
第２の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは第１のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは第２のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
先の２つの態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を含有し、第２のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。
第１の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７のアミノ酸配列を含む。
第２の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは第１のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは第２のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、天然ＦｃＲｎ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドはエフェクター機能を有しない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、天然Ｆｃ配列に対して血清半減期を延長するアミノ酸変化を含む。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的に結合する。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、トランスフェリン受容体のアピカルドメインに結合する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、その位置のうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つに置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２及び４１５を含む位置に１つ、２つ、３つ、または４つの置換をさらに含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置３８８にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置４２１に芳香族アミノ酸（例えば、位置４２１にＴｒｐまたはＰｈｅ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む：位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の位置を含む：位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、以下の１１個の位置を含む：位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する。
特定の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのＥＵインデックス位置３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、４１３、４１４、４１５、４１６、４２１、４２４及び４２６に対応する位置のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の残基は、欠失または置換されていない。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質のトランスフェリン受容体への結合は、トランスフェリンのトランスフェリン受容体への結合を実質的に阻害しない。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する。対応する野生型Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドであり得る。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドの脳内への取り込みは、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドの非存在下におけるプログラニュリンポリペプチドの取り込みと比較して、または第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドに対するトランスフェリン受容体結合をもたらす改変のないプログラニュリンポリペプチドの取り込みと比較して、少なくとも１０倍大きい。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは血液脳関門受容体に結合するようには改変されておらず、第２のＦｃポリペプチドはトランスフェリン受容体に特異的に結合するように改変されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドはトランスフェリン受容体に特異的に結合するように改変されており、第２のＦｃポリペプチドは血液脳関門受容体に結合するようには改変されていない。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ソルチリンまたはプロサポシンに結合する。特定の実施形態では、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ソルチリンに結合する。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、ＥＵ付番スキームに従って、第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含むタンパク質が本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含む。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、ＥＵ付番スキームに従って、第１のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含むタンパク質が本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７の配列を含む。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端がポリペプチドリンカーを通じて第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されており、第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端がポリペプチドリンカーを通じて第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されているタンパク質が、本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４の配列を含む。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端がポリペプチドリンカーを通じて第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されており、第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端がポリペプチドリンカーを通じて第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されているタンパク質が、本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含む。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端がポリペプチドリンカーを通じて第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されており、第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端がポリペプチドリンカーを通じて第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されているタンパク質が、本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含む。
別の態様では、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含むタンパク質であって、ＥＵ付番スキームに従って、第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含みかつＴｆＲ結合変異を含むタンパク質が、本明細書にて提供される。
本態様のいくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２〜２８５のいずれか１つの配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７〜２９０のいずれか１つの配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの各々は、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２〜２８５の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７〜２９０の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む。
特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む。特定の実施形態では、（ａ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む。
別の態様では、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、そのＦｃポリペプチドが、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含有するポリペプチドが、本明細書にて提供される。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によって、または、ポリペプチドリンカーによってプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、１〜５０、１〜２５、１〜２０または１〜１０アミノ酸長である。例えば、ポリペプチドリンカーは、３〜５０、３〜２５、５〜５０、５〜２５、５〜２０または１０〜２５アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、フレキシブルポリペプチドリンカーである。フレキシブルポリペプチドリンカーは、グリシンリッチなリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６））であり得る。
いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、プログラニュリンポリペプチドに連結されている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含有する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる改変を含む。特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させる改変は、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、天然Ｆｃ配列に対して血清半減期を延長するアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９〜２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１〜２３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３〜２４６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５〜２５８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ソルチリンまたはプロサポシンに結合する。特定の実施形態では、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ソルチリンに結合する。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を処置する方法であって、本明細書に開示されるタンパク質またはポリペプチドをそれを必要とする患者に投与する工程を含み、プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される方法が、本明細書にて提供される。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を有する患者におけるプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体の量を増加させる方法であって、本明細書に開示されるタンパク質またはポリペプチドを患者に投与する工程を含み、プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される方法が、本明細書にて提供される。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を有する患者におけるカテプシンＤ活性を低下させる方法であって、本明細書に開示されるタンパク質またはポリペプチドを患者に投与する工程を含み、プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される方法が、本明細書にて提供される。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を有する患者におけるリソソーム分解を増加させる方法であって、本明細書に開示されるタンパク質またはポリペプチドを患者に投与する工程を含み、プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される方法が、本明細書にて提供される。
本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、神経変性疾患である。本明細書に記載されている方法のいくつかの実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）ならびにパーキンソン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である。
いくつかの実施形態では、患者は、プログラニュリンポリペプチドをコードする遺伝子に変異を有する。
別の態様では、本明細書に記載のタンパク質のいずれか、または本明細書に記載のペプチドのいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が、本明細書にて提供される。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を処置するための、化合物を評価するための方法、または化合物、医薬組成物もしくはそれらの投与レジメンに対する対象の応答（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質に対する応答）をモニタリングするための方法であって、（ａ）プログラニュリン関連障害を有する対象からの試験試料中の１種以上のビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）種の存在量を測定することであって、ここで、試験試料または対象が、化合物またはその医薬組成物で処置（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質で処置）されている、測定すること、（ｂ）（ａ）で測定した１種以上のＢＭＰ種と１つ以上の参照値との間の存在量における差を比較すること、及び（ｃ）化合物、医薬組成物またはそれらの投与レジメン（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質）が、プログラニュリン関連障害を処置するための１種以上のＢＭＰ種レベルを改善させるかどうかを比較から判定することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書にて提供される方法は、別の試験試料または対象を別の化合物で処置して、１種以上のＢＭＰ種レベルを改善させる候補化合物を選択することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書にて提供される方法は、（ｄ）化合物（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質）の試験試料または対象への投与の量または頻度を維持または調整すること、及び（ｅ）化合物を試験試料または対象へ投与することをさらに含む。
別の態様では、プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象を同定するための方法であって、（ａ）対象からの試験試料中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定すること、（ｂ）（ａ）で測定した１種以上のＢＭＰ種と１つ以上の参照値との間の存在量における差を比較すること、及び（ｃ）対象がプログラニュリン関連障害を有しているかどうかを比較から判定することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書にて提供される方法は、プログラニュリン関連障害を処置するために、１種以上のＢＭＰ種レベルを改善させるための化合物（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質）を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害の１つ以上の徴候または症状のうちの少なくとも１つは、処置後に改善する。
いくつかの実施形態では、処置は、プログラニュリン、その誘導体またはその医薬組成物を対象に投与すること（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を投与すること）を含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリン誘導体は、プログラニュリンが血液脳関門を横断することを可能にする化学的部分またはペプチド断片（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質などのプログラニュリン誘導体）を含有する。いくつかの実施形態では、処置は、複数の対象または試験試料に化合物のライブラリーを投与することを含む。
いくつかの実施形態では、参照値は、参照対象または参照対象の集団から得た参照試料中で測定される。いくつかの実施形態では、参照値は、参照試料中で測定した１種以上のＢＭＰ種の存在量である。いくつかの実施形態では、参照試料は、試験試料と同じ型の細胞、組織または体液である。いくつかの実施形態では、異なる型の細胞、組織または体液からの少なくとも２つの参照値が測定される。
いくつかの実施形態では、参照試料は、健常対照である。いくつかの実施形態では、参照対象または参照対象の集団は、プログラニュリン関連障害を有しておらず、またはプログラニュリンレベルが低下していない。特定の実施形態では、参照対象または参照対象の集団は、そのような障害のいかなる徴候または症状も有していない。
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ種レベルは、プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象の骨髄細胞よりｉｎ ｖｉｔｒｏで得た骨髄由来マクロファージにおいて、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照と比較して上昇する。
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ種レベルは、プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象の肝臓、脳、脳脊髄液、血漿または尿において、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照と比較して低下する。
いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象の試験試料中のＢＭＰ種の存在量は、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照などの対照の参照値と比較して、少なくとも約１．２倍、１．５倍または２倍の差を有する。他の実施形態では、プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象の試験試料中のＢＭＰ種の存在量は、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照などの対照の参照値と比較して、約１．２倍〜約４倍の差を有する。いくつかの実施形態では、参照値と比較した差は、約２倍〜約３倍である。いくつかの実施形態では、対象は、プログラニュリンレベルの低下に伴う障害及び／またはプログラニュリンレベルの低下に伴う障害の１つ以上の徴候もしくは症状を有する。
いくつかの実施形態では、参照値は、処置前のＢＭＰ種の値である。いくつかの実施形態では、対象は、プログラニュリンレベルの低下またはプログラニュリン関連障害のために処置され、試験試料は、処置開始前の対象から得た１つ以上の処置前の試験試料及び処置開始後の対象から得た１つ以上の処置後の試験試料を含む。いくつかの実施形態では、方法は、健常対照と比較して、１種以上のＢＭＰ種の処置後の少なくとも１種の存在量が、１種以上のＢＭＰ種の処置前に対して改善を示す場合、対象が処置に応答していると判定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）対象より得た試験試料中の１種以上のビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）種の存在量を測定すること、（ｂ）化合物、医薬組成物またはそれらの投与レジメンで試験試料または対象を処置すること（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質で試験試料または対象を処置すること）、（ｃ）処置された対象から得た試験試料中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定すること、ならびに（ｄ）ステップ（ａ）及びステップ（ｃ）で測定した１種以上のＢＭＰ種の存在量を比較すること、ならびに（ｅ）化合物または投与レジメンがプログラニュリン関連障害を処置するためのＢＭＰレベルを改善させるかどうかを判定することを含む。
いくつかの実施形態では、２つ以上の処置後の試験試料を処置開始後の異なる時点で得て、方法は、処置後試料中で測定された１種以上のＢＭＰ種のうちの少なくとも１種の存在量が、処置前試料中で測定された対応する１種以上のＢＭＰ種の存在量よりも、ａ）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）において低い場合、またはｂ）肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において高い場合に、対象が処置に応答していると判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、処置後試料中で測定された１種以上のＢＭＰ種のうちの少なくとも１種の存在量が、処置前試料中で測定された対応する１種以上のＢＭＰ種の存在量よりも、ａ）ＢＭＤＭにおいて少なくとも約１．２倍低い場合、またはｂ）肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において少なくとも約１．２倍高い場合、対象は、処置に応答していると判定される。
いくつかの実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベルは、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照などの対照の参照値と比較した、処置前のＢＭＰ種レベルに対する改善である。いくつかの実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベルは、処置前のＢＭＰ種レベルの対照に対する値よりも、対照に近い値である。いくつかの実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベルは、対照と比較して、１５％、１０％または５％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベルは、健常対照と比較して、１０％または５％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、改善されたＢＭＰ種レベルは、健常対照と比較して、５％未満の差を有する。
いくつかの実施形態では、方法は、１種以上の処置後の試験試料の少なくとも１つにおいて測定された、１種以上のＢＭＰ種のうちの少なくとも１種の存在量が、健常対照の対応する参照値とほぼ同じである場合、対象が処置に応答していると判定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、試験試料もしくは参照試料または１つ以上の参照値は、細胞、組織、全血、血漿、血清、脳脊髄液、間質液、唾液、尿、大便、気管支肺胞洗浄液、リンパ液、精液、母乳、羊水もしくはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらに関連する。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、血球、赤血球、白血球、神経細胞、ミクログリア細胞、脳細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞、骨髄細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞は、培養細胞である。いくつかの実施形態では、培養細胞は、ＢＭＤＭ細胞またはＲＰＥ細胞である。
いくつかの実施形態では、組織は、脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織、肝組織、腎組織、筋組織、心臓組織、眼組織、網膜組織、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、弁組織またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試験試料及び／または参照試料は、細胞及び／または組織から精製されており、エンドソーム、リソソーム、細胞外小胞、エクソソーム、微小胞またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種は、２つ以上のＢＭＰ種を含む。いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（１６：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：０）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：３）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：２）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１６：０＿２２：５）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：５）、ＢＭＰ（１８：２＿１８：２）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：２＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種は、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、試験試料は培養細胞を含み、１種以上のＢＭＰ種はＢＭＰ（１８：１＿１８：１）を含む。いくつかの実施形態では、試験試料は血漿、組織、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び／または脳組織もしくは肝組織を含み、１種以上のＢＭＰ種はＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。いくつかの実施形態では、試験試料は肝組織を含み、１種以上のＢＭＰ種はＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試験試料はＣＳＦまたは尿を含み、１種以上のＢＭＰ種はＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。いくつかの実施形態では、試験試料はミクログリアを含み、１種以上のＢＭＰ種はＢＭＰ（１８：３＿２２：５）を含む。
いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種の存在量は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して測定される。いくつかの実施形態では、内部ＢＭＰ標準物質を使用して、ステップ（ａ）中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定し、及び／または対応する参照値を決定する。いくつかの実施形態では、内部ＢＭＰ標準物質は、対象及び／または参照対象もしくは参照対象の集団に天然に存在しないＢＭＰ種を含む。いくつかの実施形態では、内部ＢＭＰ標準物質は、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を含む。
いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、プログラニュリンの発現、プロセシング、グリコシル化、細胞取り込み、輸送、及び／または機能に関連する障害である。いくつかの実施形態では、対象及び／または参照対象もしくは参照対象の集団は、プログラニュリンレベルの低下及び／またはプログラニュリンレベルの低下に伴う障害を有し、試験試料は、候補化合物（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質）と接触している。いくつかの実施形態では、対象及び／または参照対象もしくは参照対象の集団は、プログラニュリンレベルの低下に伴う障害の１つ以上の徴候または症状を有する。いくつかの実施形態では、対象及び／または参照対象もしくは参照対象の集団は、グラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子に変異を有する。いくつかの実施形態では、ＧＲＮ遺伝子中の変異は、プログラニュリンの発現及び／または活性を低下させる。いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、アテローム性動脈硬化、ゴーシェ病または加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、ゴーシェ病１型である。いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、ＴＤＰ−４３に関連する障害である。他の実施形態では、ＴＤＰ−４３関連障害は、ＡＤまたはＡＬＳである。
いくつかの実施形態では、対象及び／または参照対象はヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌまたはブタである。
別の態様では、本開示は、対象におけるプログラニュリンレベルをモニタリングするためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、対象より得た試験試料及び／または参照対象もしくは参照対象の集団から得た参照試料中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定するための、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）標準物質を含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ標準物質は、対象及び／または参照対象に天然に存在しないＢＭＰ種を含む。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ標準物質は、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、対象及び／または参照対象から試料を得るための試薬、試料を処理するための試薬、１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定するための試薬、またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに含む。
別の態様では、本開示は、非ヒトトランスジェニック動物であって、（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメインと、（ｉｉ）その動物の天然ＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位とを含むキメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸、及び（ｂ）ＧＲＮ遺伝子のノックアウトを含み、キメラＴｆＲポリペプチドがその動物の脳内で発現する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
いくつかの実施形態では、アピカルドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アピカルドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、キメラＴｆＲポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、動物は、脳組織、肝組織、腎組織または肺組織中で、対応する同種の野生型動物の同じ組織におけるＴｆＲの発現レベルの２０％以内（例えば、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％または４％）のキメラＴｆＲポリペプチドのレベルを発現する。
いくつかの実施形態では、動物は、対応する同種の野生型動物における赤血球数、ヘモグロビンのレベルまたはヘマトクリットのレベルの２０％以内（例えば、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％または４％）の赤血球数、ヘモグロビンのレベルまたはヘマトクリットのレベルを含む。
いくつかの実施形態では、アピカルドメインをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％または９９％）の同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、動物は、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
いくつかの実施形態では、ＧＲＮ遺伝子のノックアウトは、ＧＲＮ遺伝子のエクソン１〜４の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、動物は、マウスまたはラットである。
別の態様では、本開示は、（ａ）ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチド二量体と、（ｂ）プログラニュリンポリペプチドとを含むタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、（ｃ）改変Ｆｃポリペプチド二量体をプログラニュリンポリペプチドに連結させるポリペプチドリンカーをさらに含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲのアピカルドメインに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１からなる群から選択される位置に、少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、一方のＦｃポリペプチドのその位置のうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２及び４１５を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に、１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む。
特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、一方のＦｃポリペプチドの位置３８８にＴｒｐを含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む：一方のＦｃポリペプチドの位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の位置を含む：一方のＦｃポリペプチドの位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するＦｃポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＣ末端は、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＣ末端を、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結させる。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端を、改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質のいずれかは、療法に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質のいずれかは、神経変性疾患の処置に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質のいずれかは、アルツハイマー病、原発性年齢関連タウオパチー、レビー小体認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症、グアムの筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ型パーキンソニズム、グアドループ型ＰＳＰ、ハラーフォルデン・シュパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須・ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ニーマン・ピック病Ｃ型、淡蒼球橋黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ ｏｎｌｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）からなる群から選択される神経変性疾患の処置に使用され得る。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含み、第２のＦｃポリペプチドが第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成し、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含み、第２のＦｃポリペプチドが第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成し、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドとを含み、第２のＦｃポリペプチドが第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成し、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含むタンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、（ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドとを含み、（ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含むタンパク質を提供する。
融合体１、融合体２及び融合体３の３種類のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の模式図を示す。融合体１及び融合体２では、ＰＧＲＮのＮ末端は、ＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有しないＦｃポリペプチドのＣ末端に、それぞれ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）及びＧ４Ｓリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）によって融合している。融合体３では、ＰＧＲＮのＣ末端は、ＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有しないＦｃポリペプチドのＮ末端に、（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって融合している。 １つのＰＧＲＮ分子をそれぞれ含有する融合タンパク質である融合体１、融合体２及び融合体３が、８５％超の純度で精製されたことを立証するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体４、融合体５及び融合体６を示す模式図である。融合体４では、２つのＰＧＲＮ分子の各々は、ＦｃポリペプチドのＣ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）によって融合している。一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＣ末端に融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のないＦｃポリペプチドのＣ末端に融合している。融合体５では、一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のない他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合している。融合体６では、２つのＰＧＲＮ分子の各々は、ＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＮ末端に融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のないＦｃポリペプチドのＮ末端に融合している。 ２つのＰＧＲＮ分子をそれぞれ含有するＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体４及び融合体５が、８５％超の純度で精製されたことを示す。 Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体７及び融合体８を示す模式図である。融合タンパク質である融合体７及び融合体８の両方は、ＴｆＲ結合変異を含有しないＦｃポリペプチドを含有する。融合体７では、ＰＧＲＮのＮ末端は、ＦｃポリペプチドのＣ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）。融合体８では、ＰＧＲＮのＣ末端は、ＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。 ＰＧＲＮ染色によって示された組換えＰＧＲＮ及びＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）の効率的な細胞取り込みを示す。 Ｆｃ染色によって示された組換えＰＧＲＮ及びＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）の効率的な細胞取り込みを示す。 Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）が、ＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるタンパク質分解欠損を回復させることができたことを示す。 Ｂｏｄｉｐｙ−ＢＳＡコンジュゲート（ＤＱ−ＢＳＡ）を使用したリソソーム内のタンパク質分解アッセイにおける、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体３、融合体４及び融合体５）の用量−反応を示す。 Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）が、ＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおいて観察された上昇したカテプシンＤ活性を回復させることができたことを示す。 図６Ａ〜Ｄは、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１が、ＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるリソソーム遺伝子Ｃｔｓｌ、Ｔｍｅｍ１０６ｂ及びＰｓａｐの上昇したｍＲＮＡレベルを回復させることができたことを示す。 図６−１の説明を参照のこと。 Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３が、これらの融合タンパク質を投与されたＷＴマウスの血漿試料及び肝臓試料において、類似の薬物動態プロファイルを表したことを示す。 投与４時間後におけるＷＴマウス及びｈＴｆＲマウスの脳溶解物及び肝臓溶解物中でそれぞれ測定した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の濃度（ｎＭ）を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。ビオチン化ヤギポリクローナルヒトプログラニュリン検出抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ番号ＢＡＦ２４２０）を使用してデータを作成した。 図９Ａは、ＷＴ中の融合体３に対して正規化した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の脳対血漿比を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。図９Ｂは、ＷＴ中の融合体３に対して正規化した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の脳対肝臓比を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。 投与４時間後におけるＷＴマウス及びｈＴｆＲマウスの脳溶解物及び肝臓溶解物中でそれぞれ測定した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の濃度（ｎＭ）を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。Ｆｃ中の部位を標的とする検出抗体を使用してデータを作成した。 投与４時間後におけるＷＴマウス及びｈＴｆＲマウスの脳溶解物及び肝臓溶解物中でそれぞれ測定した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の濃度を総タンパク質（ｍｇ）あたりのｎｇで示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。Ｆｃ中の部位を標的とする検出抗体を使用してデータを作成した。 ｈＴｆＲマウス及びＷＴマウスにおける、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１のそれぞれの平均血漿中濃度（ｎＭ）の経時的な片対数プロットを示す。 ｈＴｆＲマウス及びＷＴマウスにおける、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体３のそれぞれの平均血漿中濃度（ｎＭ）の経時的な片対数プロットを示す。 投与後０．２５時間におけるＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３のそれぞれの血漿中濃度（ｎＭ）を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。 投与後４時間におけるＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３のそれぞれの血漿中濃度（ｎＭ）を示す平均値及びＳＥＭを含む散布図を示す。 ＧＲＮノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）中のビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）種の、野生型と比較したレベルの上昇を示す。ＧＲＮノックアウトマウスのＢＭＤＭを、実施例１の表１に示すＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、上昇したＢＭＰ（１８：１＿１８：１）レベルが低下したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）中のビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）種の、野生型と比較したレベルの上昇を示す。ＧＲＮノックアウトマウスのＢＭＤＭを、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、上昇したＢＭＰ（２０：４＿２０：４）レベルが低下したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスのＢＭＤＭを、組換えプログラニュリン（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）またはレンチウイルスによって発現されたプログラニュリンで処置することにより、上昇したＢＭＰレベル（総ＢＭＰ）が低下したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスのＢＭＤＭを、組換えプログラニュリン（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）またはレンチウイルスによって発現されたプログラニュリンで処置することにより、上昇したＢＭＰレベル（１８：１＿１８：１）が低下したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスの末梢の肝臓、血漿及び尿中の、野生型と比較したＢＭＰ４４：１２の低下を示す。 脳脊髄液（ＣＳＦ）及び中枢神経系（ＣＮＳ）の脳中の、野生型と比較したＢＭＰ４４：１２の低下を示す。 ２〜１９ヶ月の範囲のＧＲＮノックアウトマウスが、野生型と比較して血漿中のＢＭＰ ４４：１２の年齢非依存性の低下を示したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、肝臓のＢＭＰ ４４：１２のレベルが上昇したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、肝臓のＢＭＰ ２０：４＿２０：４のレベルが上昇したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、血漿のＢＭＰ ４４：１２のレベルが上昇したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、尿のＢＭＰ ４４：１２のレベル（クレアチンに対して正規化）が上昇したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、ＣＳＦのＢＭＰ ４４：１２のレベルが上昇したことを示す。 ＧＲＮノックアウトマウスをＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２で処置することにより、脳のＢＭＰ ４４：１２及び２０：４＿２０：４のレベルがそれぞれ上昇したことを示す。 ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳において、融合体１１及び融合体１２がＢＢＢを通過することができたことを示す。 ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳において、融合体１１及び融合体１２がＢＢＢを通過することができたことを示す。 ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳において、融合体１１及び融合体１２がＢＢＢを通過することができたことを示す。
詳細な説明
Ｉ． 序論
本発明者らは、Ｆｃポリペプチドに連結されたプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質を開発した。これらのタンパク質を使用して、プログラニュリン関連障害（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性疾患）を処置することができる。場合によっては、タンパク質は二量体Ｆｃポリペプチドを含み、Ｆｃポリペプチドモノマーのうちの一方はプログラニュリンポリペプチドに連結されている。Ｆｃポリペプチドはプログラニュリンレベルを増加させることができ、場合によっては、タンパク質に追加の機能特性を付与するようにＦｃポリペプチドを改変することができる。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）（プロエピセリン及びアクログラニンとしても知られる）は、ヒト染色体１７ｑ２１に位置する遺伝子ＧＲＮによってコードされる、システインリッチなタンパク質である。プログラニュリンはリソソームタンパク質であるとともに、保存されたグラニュリンペプチドの７．５回のタンデムリピートからなる分泌タンパク質であり、その各々は約６０アミノ酸長であり、様々な細胞外プロテアーゼ（例えば、エラスターゼ）及びリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシンＬ）による切断を通じて放出され得る（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５−３３３，２０１７）。一般に、プログラニュリンは、自然免疫の制御において、ならびにプログラニュリンが様々なカテプシン及び他の加水分解酵素の活性及びレベルを調節するリソソームの機能において、細胞自律的役割及び細胞非自律的役割の両方を果たしていると考えられている（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、上掲）。プログラニュリンはまた、神経栄養性機能を有し、神経突起伸長及び神経細胞生存を促進する（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、上掲）。
血液脳関門（ＢＢＢ）を横切るプログラニュリンポリペプチドの送達を促進する融合タンパク質もまた、本明細書に記載される。これらのタンパク質は、二量体を形成するＦｃポリペプチド及び改変Ｆｃポリペプチド、ならびにＦｃ領域及び／または改変Ｆｃ領域に連結されたプログラニュリンポリペプチドを含む。改変Ｆｃ領域は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）などのＢＢＢ受容体に特異的に結合することができる。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別途示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のそのような分子などが含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値または範囲で既定された量を修飾するために使用される場合、その数値及び当業者に公知の値からの合理的な偏差、例えば、±２０％、±１０％または±５％は、詳述された値の意図する意味の範囲内であることを示す。
本明細書で使用する場合、「ＢＭＰ」という用語は、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸を指す。ＢＭＰは、式Ｉに示す構造を有する、負に荷電した（例えば、後期エンドソーム及びリソソーム内に通常存在するｐＨの）グリセロリン脂質である。
Figure 2021527656
ＢＭＰ分子は、２つの脂肪酸側鎖を含む。式Ｉ中、Ｒ及びＲ’は、独立して選択された飽和脂肪族鎖または不飽和脂肪族鎖を表し、各脂肪族鎖は通常、１４個、１６個、１８個、２０個または２２個の炭素原子を含有する。脂肪酸側鎖が不飽和の場合、脂肪酸側鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ以上の炭素−炭素二重結合を含み得る。さらに、ＢＭＰ分子は１つまたは２つのアルキルエーテル置換基を含有することができ、ここで、一方または両方の脂肪酸側鎖のカルボニル酸素は２つの水素原子で置き換えられている。特定のＢＭＰ種を説明するために本明細書で使用される命名法は、２つの脂肪酸側鎖を有する種を示し、脂肪酸側鎖の構造をＢＭＰ形式の括弧内に示す（例えば、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１））。数字は、「脂肪酸炭素原子の数：二重結合の数」の標準的な脂肪酸の表記形式に従う。接頭辞「ｅ−」は、アルキルエーテル置換基の存在を示すために使用され、脂肪酸側鎖のカルボニル酸素は２つの水素原子で置き換えられる。例えば、「ＢＭＰ（１６：０ｅ＿１８：０）」中の「ｅ」は、１６個の炭素原子を有する側鎖がアルキルエーテル置換基であることを示す。
「プログラニュリンポリペプチド」または「ＰＧＲＮポリペプチド」は、遺伝子ＧＲＮによってコードされるシステインリッチなリソソームタンパク質を指す。プログラニュリンポリペプチドは、ヒトプログラニュリン配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含み得る。プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１の配列を有する未成熟プログラニュリンであり得、その最初の１７個のアミノ酸はシグナルペプチドを示す。プログラニュリンポリペプチドは、１７個のアミノ酸のシグナルペプチドが切断された成熟プログラニュリンであり得る。成熟プログラニュリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含み得る。プログラニュリンポリペプチドは、非ヒト種、例えば、マウス（アクセッション番号ＮＰ＿０３２２０１．２）、ラット（ＮＰ＿０５８８０９．２またはＮＰ＿００１１３９３１４．１）及びチンパンジー（ＸＰ＿０１６７８７１４４．１またはＸＰ＿０１６７８７１４５．１）由来の配列を、未成熟形態または成熟形態のいずれかで含み得る。
「プログラニュリンポリペプチド変異体」または「ＰＧＲＮポリペプチド変異体」は、成熟野生型プログラニュリンポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％の配列同一性）を有する野生型プログラニュリンの機能的変異体を指す。プログラニュリンポリペプチド変異体は、野生型プログラニュリンの機能と類似した機能を有し得る。例えば、プログラニュリンポリペプチド変異体もまた、ソルチリンまたはプロサポシンに結合し、様々なリソソームタンパク質（例えば、カテプシン）の活性及びレベルを調節し、神経突起伸長及び神経細胞生存、及び／または本明細書に記載の他の任意の機能を促進する。プログラニュリンポリペプチド変異体は、完全長プログラニュリン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２）のグラニュリンＧ、グラニュリンＦ、グラニュリンＢ、グラニュリンＡ、グラニュリンＣ、グラニュリンＤ及びグラニュリンＥを含む。
「プログラニュリン関連障害」という用語は、発現、プロセシング、グリコシル化、細胞取り込み、輸送、及び／または機能を含む、プログラニュリンに関連する任意の病態を指す。「プログラニュリンレベルの低下に伴う障害」という用語は、細胞、組織及び／または対象内における正常な生理的機能を可能とするのに不十分な（すなわち、可能とするのに低すぎる）プログラニュリンのレベルから直接または間接的に生じた任意の病態、ならびにそのような状態の前兆を指す。いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害は、神経変性疾患（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）またはリソソーム蓄積症）である。
「プログラニュリンレベル」という用語は、対象内または試料（例えば、対象から得た試料）中のいずれかに存在するプログラニュリンの量、濃度及び／または活性のレベルを指す。プログラニュリンレベルは、存在するプログラニュリンの絶対的な量、濃度及び／または活性のレベルを指すことができ、または、相対的な量、濃度及び／または活性レベルを指すことができる。この用語はまた、存在するプログラニュリンポリペプチド及び／またはプログラニュリンｍＲＮＡ（例えば、ＧＲＮ遺伝子から発現されるもの）の量または濃度も指す。
「骨髄由来マクロファージ」または「ＢＭＤＭ」という用語は、哺乳動物の骨髄（例えば、対象より得られる骨髄）からｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されるまたは派生するマクロファージ細胞を指す。非限定的な例として、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などのサイトカインの存在下で、未分化骨髄細胞を培養することによりＢＭＤＭを生成することができる。
「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」は、本開示との関連で使用される場合、トランスフェリン受容体タンパク質１を指す。ヒトトランスフェリン受容体１ポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２に記載されている。他の種に由来するトランスフェリン受容体タンパク質１配列も知られている（例えば、チンパンジー（アクセッション番号ＸＰ＿００３３１０２３８．１）、アカゲザル（ＮＰ＿００１２４４２３２．１）、イヌ（ＮＰ＿００１００３１１１．１）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３５０６．１）、マウス（ＮＰ＿０３５７６８．１）、ラット（ＮＰ＿０７３２０３．１）及びニワトリ（ＮＰ＿９９０５８７．１））。「トランスフェリン受容体」という用語はまた、例示的な参照配列の対立遺伝子変異体、例えば、トランスフェリン受容体タンパク質１染色体座に位置する遺伝子によってコードされるヒト配列を包含する。完全長のトランスフェリン受容体タンパク質には、短いＮ末端細胞内領域、膜貫通領域及び大きな細胞外ドメインが含まれる。細胞外ドメインは、プロテアーゼ様ドメイン、ヘリカルドメイン及びアピカルドメインの３つのドメインを特徴とする。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、構造ドメインとしてのＩｇフォールドを特徴とする、天然免疫グロブリン重鎖ポリペプチドのＣ末端領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインを含む定常領域配列を含有し、少なくともヒンジ領域の一部を含有し得る。一般に、Ｆｃポリペプチドは可変領域を含有しない。
「改変Ｆｃポリペプチド」は、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有するが、天然Ｆｃポリペプチドの全体的なＩｇフォールドまたは構造を保持する、Ｆｃポリペプチドを指す。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃポリペプチド二量体」という用語は、２つのＦｃポリペプチドの二量体を指す。いくつかの実施形態では、２つのＦｃポリペプチドは、２つのＣＨ３ドメイン間の相互作用によって二量体化する。ヒンジ領域またはヒンジ領域の一部が２つのＦｃポリペプチドに存在する場合、１つ以上のジスルフィド結合もまた、２つの二量体化Ｆｃポリペプチドのヒンジ領域の間に形成され得る。
「改変Ｆｃポリペプチド二量体」は、少なくとも１つのＦｃポリペプチドが、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有する改変Ｆｃポリペプチドである、２つのＦｃポリペプチドの二量体を指す。例えば、改変Ｆｃポリペプチド二量体は、ＴｆＲに特異的に結合し、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃポリペプチド配列と比較して、少なくとも１つの変異、例えば、置換、欠失、または挿入を有する少なくとも１つの改変Ｆｃポリペプチドを有する。
「ＦｃＲｎ」という用語は、胎児性Ｆｃ受容体を指す。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃポリペプチドのクリアランスを減少させ、血清半減期を増加させる。ヒトＦｃＲｎタンパク質は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質に類似した約５０ｋＤａのサイズのタンパク質と、約１５ｋＤａのサイズのβ２−ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。
本明細書で使用する場合、「ＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合するＦｃポリペプチドの領域を指す。ヒトＩｇＧでは、ＥＵインデックスを使用して付番したＦｃＲｎ結合部位には、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｔ３０７、Ｅ３８０、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５及びＹ４３６が含まれる。これらの位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置２０〜２６、７７、１５０、１９８及び２０３〜２０６に対応する。
本明細書で使用する場合、「天然ＦｃＲｎ結合部位」は、ＦｃＲｎに結合し、かつＦｃＲｎに結合する天然Ｆｃポリペプチドの領域と同じアミノ酸配列を有するＦｃポリペプチドの領域を指す。
本明細書で使用する場合、「ＣＨ３ドメイン」及び「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン定常領域ドメインポリペプチドを指す。本出願の目的のために、ＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置３４１付近〜位置４４７付近のアミノ酸のセグメントを指し、ＣＨ２ドメインポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近〜位置３４０付近のアミノ酸のセグメントを指し、ヒンジ領域配列を含まない。ＣＨ２ドメインポリペプチド及びＣＨ３ドメインポリペプチドは、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）付番スキームによって付番される場合もあり、その場合、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃチャート付番（ＩＭＧＴウェブサイト）に従って、ＣＨ２ドメインの付番は１〜１１０であり、ＣＨ３ドメインの付番は１〜１０７である。ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部である。Ｆｃ領域は、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近〜位置４４７付近のアミノ酸のセグメントを指すが、本明細書で使用する場合、Ｆｃ領域は抗体のヒンジ領域の少なくとも一部を含む場合がある。例示的なヒンジ領域配列は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列の
Figure 2021527656
である。
ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインに関する「野生型」、「天然（ｎａｔｉｖｅ）」及び「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」という用語は、本明細書では、天然に生じる配列を有するドメインを指すものとして使用される。
本開示との関連において、突然変異体ポリペプチドまたは突然変異体ポリヌクレオチドに関する「突然変異体」という用語は、「変異体」と互換的に使用される。所与の野生型ＣＨ３ドメイン参照配列またはＣＨ２ドメイン参照配列に関する変異体には、天然の対立遺伝子変異体が含まれ得る。「非天然」のＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインは、天然の細胞中に存在せず、遺伝子改変によって、例えば、天然のＣＨ３ドメインまたはＣＨ２ドメインポリヌクレオチドまたはポリペプチドの遺伝子工学技術または変異誘発技術を使用して生成される、変異体ドメインまたは突然変異体ドメインを指す。「変異体」は、野生型に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、任意のドメインを含む。変異は、置換、挿入及び欠失を含み得る。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。
天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものと、それらのアミノ酸が後で改変されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の方式で機能する化学的化合物を指す。
天然α−アミノ酸には、限定されないが、アラニン（Ａｌａ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。天然α−アミノ酸の立体異性体には、限定されないが、Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ）、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）、Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）、Ｄ−ヒスチジン（Ｄ−Ｈｉｓ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｄ−アルギニン（Ｄ−Ａｒｇ）、Ｄ−リシン（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ｄ−ロイシン（Ｄ−Ｌｅｕ）、Ｄ−メチオニン（Ｄ−Ｍｅｔ）、Ｄ−アスパラギン（Ｄ−Ａｓｎ）、Ｄ−プロリン（Ｄ−Ｐｒｏ）、Ｄ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）、Ｄ−セリン（Ｄ−Ｓｅｒ）、Ｄ−トレオニン（Ｄ−Ｔｈｒ）、Ｄ−バリン（Ｄ−Ｖａｌ）、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）、Ｄ−チロシン（Ｄ−Ｔｙｒ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書において、アミノ酸は、一般に知られているそれらの３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字の記号のいずれかによって参照することができる。
「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用され、単一鎖中のアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、すべてがＬ−アミノ酸のもの、すべてがＤ−アミノ酸のもの、またはＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。
本明細書で使用する場合、「タンパク質」という用語は、単一鎖ポリペプチドの１つのポリペプチドまたは二量体（すなわち、２つ）または多量体（すなわち、３つ以上）のいずれかを指す。タンパク質の単一鎖ポリペプチドは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）または非共有結合相互作用によって連結され得る。
「保存的置換」、「保存的変異」または「保存的に改変された変異体」という用語は、あるアミノ酸の、類似の特徴を有すると分類され得る別のアミノ酸による置換を生じさせる変化を指す。このように定義された保存的アミノ酸グループの分類の例としては、Ｇｌｕ（グルタミン酸またはＥ）、Ａｓｐ（アスパラギン酸またはＤ）、Ａｓｎ（アスパラギンまたはＮ）、Ｇｌｎ（グルタミンまたはＱ）、Ｌｙｓ（リシンまたはＫ）、Ａｒｇ（アルギニンまたはＲ）及びＨｉｓ（ヒスチジンまたはＨ）を含む「荷電／極性グループ」；Ｐｈｅ（フェニルアラニンまたはＦ）、Ｔｙｒ（チロシンまたはＹ）、Ｔｒｐ（トリプトファンまたはＷ）及び（ヒスチジンまたはＨ）を含む「芳香族グループ」；ならびにＧｌｙ（グリシンまたはＧ）、Ａｌａ（アラニンまたはＡ）、Ｖａｌ（バリンまたはＶ）、Ｌｅｕ（ロイシンまたはＬ）、Ｉｌｅ（イソロイシンまたはＩ）、Ｍｅｔ（メチオニンまたはＭ）、Ｓｅｒ（セリンまたはＳ）、Ｔｈｒ（トレオニンまたはＴ）及びＣｙｓ（システインまたはＣ）を含む「脂肪族グループ」を挙げることができる。各グループ内において、サブグループを同定することもできる。例えば、荷電または極性アミノ酸のグループは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓで構成される「正に荷電したサブグループ」、Ｇｌｕ及びＡｓｐで構成される「負に荷電したサブグループ」、ならびにＡｓｎ及びＧｌｎで構成される「極性サブグループ」を含むサブグループに細分することができる。別の例では、芳香族または環状のグループは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ及びＴｒｐで構成される「窒素環サブグループ」、ならびにＰｈｅ及びＴｙｒで構成される「フェニルサブグループ」を含むサブグループに細分することができる。さらなる別の例では、脂肪族グループは、サブグループ、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ及びＡｌａで構成される「脂肪族非極性サブグループ」、ならびにＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓで構成される「脂肪族微極性サブグループ」に細分することができる。保存的変異の分類の例としては、前述のサブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、限定されないが、正電荷を維持することができるような、Ａｒｇの代わりにＬｙｓまたはその逆の置換；負電荷を維持することができるような、Ａｓｐの代わりにＧｌｕまたはその逆の置換；遊離−ＯＨを維持することができるような、Ｔｈｒの代わりにＳｅｒまたはその逆の置換；及び遊離−ＮＨ２を維持することができるような、Ａｓｎの代わりにＧｌｎまたはその逆の置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、疎水性を保持するために、例えば活性部位中で天然の疎水性アミノ酸に対して置換される。
２つ以上のポリペプチド配列との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメント及び目視検査により測定した場合に、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたり最大限一致するように比較及びアラインメントされるとき、特定の領域にわたって、同じであるかまたは特定のパーセンテージ、例えば、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。
ポリペプチドの配列比較については、通常、１つのアミノ酸配列が候補配列と比較する参照配列として機能する。最大アラインメントを得るために、当業者が利用可能な様々な方法、例えば、視覚的アラインメントまたは公知のアルゴリズムを使用した公的に利用可能なソフトウェアを使用してアラインメントを実施することができる。そのようなプログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）が挙げられる。最大アラインメントを得るためのアラインメントに使用されるパラメータは、当業者によって決定され得る。本出願の目的のためのポリペプチド配列の配列比較については、デフォルトパラメータを用いて２つのタンパク質配列をアラインメントするための、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの標準タンパク質ＢＬＡＳＴを使用する。
「に対応する」「を参照して決定された」または「を参照して付番した」という用語は、ポリペプチド配列中の所与のアミノ酸残基の同定との関連で使用する場合、所与のアミノ酸配列を参照配列と比較して最大限にアラインメントした場合の特定の参照配列の残基の位置を指す。したがって、例えば、改変Ｆｃポリペプチドのアミノ酸残基が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と最適にアラインメントしたときにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸と整列する場合、その残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸「に対応する」。参照配列にアラインメントするポリペプチドは、参照配列と同じ長さである必要はない。
本明細書で使用する場合、「結合親和性」という用語は、２つの分子間、例えば、ポリペプチド上の単一の結合部位と、それが結合する標的、例えばトランスフェリン受容体との間の非共有結合相互作用の強さを指す。したがって、例えば、特に示さない限り、または文脈から明らかでない限り、この用語はポリペプチドとその標的の間の１：１の相互作用を指し得る。結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を測定することにより定量化することができ、これは、結合速度定数（ｋａ、時間−１ Ｍ−１）で除した解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を指す。ＫＤは、複合体形成及び解離のカイネティクスを、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システム）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）などの結合平衡除外法、及びＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームの使用）を使用して測定することにより決定することができる。本明細書で使用する場合、「結合親和性」という用語は、ポリペプチドとその標的の間の１：１の相互作用を反映するような正式な結合親和性のみならず、強力な結合を反映し得るＫＤを算出する見かけの親和性をも含む。
本明細書に記載のトランスフェリン受容体結合改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドに言及する場合の、標的、例えば、トランスフェリン受容体に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という語句は、ポリペプチドが標的に、構造的に異なる標的、例えばトランスフェリン受容体ファミリーでない標的への結合よりもより高い親和性で、より高い結合力で、及び／またはより長い持続時間で結合する結合反応を指す。典型的な実施形態では、同じ親和性アッセイの条件下でアッセイした場合に、ポリペプチドは、無関係の標的と比較して、トランスフェリン受容体に対して少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１０００倍または１０，０００倍以上高い親和性を有する。本明細書で使用する場合、特定の標的（例えば、ＴｆＲ）「への特異的な結合」、「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、結合する標的に対して、例えば、１０−４Ｍ以下（例えば、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ）の平衡解離定数ＫＤを有する分子によって示され得る。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、種間で保存された（例えば、種間で構造的に保存された）、例えば、非ヒト霊長類及びヒト種の間で保存された（例えば、非ヒト霊長類及びヒト種の間で構造的に保存された）トランスフェリン受容体上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ヒトトランスフェリン受容体に排他的に結合し得る。
本明細書で使用する場合、「処置」、「処置する」などの用語は、一般に、所望の薬理学的作用及び／または生理学的作用を得ることを意味する。「処置する」または「処置」は、患者の生存における緩和、寛解、改善、生存期間もしくは生存率の向上、症状を減少させることもしくは障害を患者がより耐えられるものにすること、変性もしくは減退の速度を緩慢にすること、または患者の身体的もしくは精神的幸福を向上させることなどのあらゆる客観的及び主観的パラメータを含む、プログラニュリン関連障害、例えば、神経変性疾患（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）ならびにパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害ならびに加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む疾患の処置または改善における成功のあらゆる兆候を指し得る。症状の処置または改善は、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。処置の効果を、処置を受けていない個体または個体のプールと、または処置前もしくは処置の間の異なる時点での同じ患者と比較することができる。
本明細書で互換的に使用される「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス及びモルモット）、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマならびに他の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。一実施形態では、患者はヒトである。
「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、限定されないが、緩衝液、担体または保存剤などの、ヒトまたは動物における使用に生物学的または薬理学的に適合する非活性医薬品成分を指す。
本明細書で使用する場合、薬剤の「治療量」または「治療有効量」は、対象において疾患の症状を処置する薬剤の量である。
「投与する」という用語は、生物学的作用の所望の部位に薬剤、化合物または組成物を送達する方法を指す。これらの方法としては、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達または腹腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、静脈内投与される。
ＩＩＩ．プログラニュリン補充療法
いくつかの態様では、本明細書に記載されているのは、（ｉ）改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変）を含有し得るか、または野生型Ｆｃポリペプチドであり得るＦｃポリペプチド、及びプログラニュリンポリペプチド、ならびに（ｉｉ）改変（例えば、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変）を含有し得るか、または野生型Ｆｃポリペプチドであり得るＦｃポリペプチド、及び所望によりプログラニュリンポリペプチドを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合をもたらす改変を含有し得る。プログラニュリンポリペプチドは、神経変性疾患において欠損している場合がある。プログラニュリンポリペプチドは、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ならびにゴーシェ病及びアルツハイマー病（ＡＤ）などの他の疾患において欠損している場合がある。融合タンパク質に組み込まれたプログラニュリンポリペプチドは、ソルチリンまたはプロサポシンに結合し得る。特定の実施形態では、ソルチリンに対する融合タンパク質に組み込まれたプログラニュリンポリペプチド。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチド及び所望によりＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチド、例えば、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質は、プログラニュリンポリペプチドの変異体を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも２５％を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも１０％、または少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体は、ＦｃポリペプチドまたはＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドに連結されていない場合のその活性と比較して、その活性の少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％を保持する。本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列とを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質であり得る。本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列とを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質であり得る。本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列とを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質であり得る。本明細書に記載の融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列とを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を含む、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドへの融合は、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体の発現及び／または活性を減少させない。いくつかの実施形態では、ＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチドへの融合は、プログラニュリンポリペプチドの発現及び／または活性を減少させない。
ＩＶ．適応症
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドを含む本明細書に記載の融合タンパク質は、アルツハイマー病、原発性年齢関連タウオパチー、レビー小体認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症、グアムの筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ型パーキンソニズム、グアドループ型ＰＳＰ、ハラーフォルデン・シュパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須・ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ニーマン・ピック病Ｃ型、淡蒼球橋黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維型老年認知症からなる群から選択される１つ以上の神経変性疾患の処置に有用である。
プログラニュリン関連障害は、神経変性疾患であり得る。多くの神経変性疾患が、未消化のまたは部分的に消化された高分子の蓄積を特徴とするリソソーム蓄積症に起因するか、または関連付けられる可能性があり、これは、最終的には細胞及び生物の機能障害ならびに臨床的異常をもたらす。リソソーム蓄積症は、蓄積された基質の種類によって定義され、コレステロール蓄積症、スフィンゴリピド症、オリゴ糖症（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ）、ムコ脂質症、ムコ多糖症、リポタンパク質蓄積症、神経セロイドリポフスチン症などに分類され得る。場合によっては、リソソーム蓄積症には、リソソーム酵素の正常な翻訳後修飾に必要なタンパク質または適切なリソソーム輸送に必要なタンパク質などの、高分子の蓄積をもたらすタンパク質における欠損または異常も含まれる。リソソーム蓄積症に起因するか、または関連付けられる可能性がある神経変性疾患の例としては、例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）ならびにパーキンソン病が挙げられる。他のプログラニュリン関連障害の例としては、例えば、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）が挙げられる。そのようなプログラニュリン関連障害（例えば、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性疾患）は、本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドからベネフィットを得られる可能性がある。
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、進行性の神経変性障害である。ＦＴＤは、前頭葉及び側頭葉に選択的な影響を呈する、臨床的、病理学的及び遺伝的に不均一である疾患の範囲を含む（Ｇａｚｚｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８１７：７６−８５，２０１７）。ＦＴＤの臨床症状には、行動及び性格の変化、前頭部の実行障害及び言語機能障害が含まれる。臨床表現型の相違に基づいて、ＦＴＤの行動障害型（ｂｖＦＴＤ）及び非流暢／失文法型ＰＰＡ（ａｖＰＰＡ）または意味型ＰＰＡ（ｓｖＰＰＡ）のいずれかであり得る原発性進行性失語（ＰＰＡ）などの、異なる症状が同定されている。これらの臨床症状はまた、大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの非定型パーキンソニズムと重複する場合がある（Ｇａｚｚｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８１７：７６−８５，２０１７）。ＦＴＤは、神経細胞及びアストロサイト中のタウ病変または神経細胞中の細胞質ユビキチン封入体をはじめとする、様々な神経病理学的特徴を伴う。分子量４３ｋＤａのトランス活性化ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）は、ＦＴＤの症例の大部分及びＡＬＳにおいて蓄積する最も顕著なユビキチン化タンパク質病変である（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３７（７）：３８８−９８，２０１４）。ＦＴＤは、早発性認知症の重要な原因であり、症例の最大８０％が４５〜６４歳の間に発症する。この疾患はまた、顕著な家族性要素を示し、約３０〜５０％の症例で疾患の家族歴が報告されている（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、上掲）。
いくつかの遺伝子がＦＴＤに関連付けられているが、ＦＴＤにおいて最も頻繁に変異する遺伝子のうちの１つは、ヒト染色体１７ｑ２１に位置し、システインリッチなタンパク質であるプログラニュリン（プロエピセリン及びアクログラニンとしても知られる）をコードするＧＲＮである。最近の推定では、ＧＲＮ変異は、家族歴が陽性であるＦＴＤ患者の５〜２０％、及び散発的症例の１〜５％を占めていると示唆されている（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、上掲）。患者の脳の組織分析と組み合わせたＧＲＮノックアウトマウスの表現型の特性評価により、炎症及びリソソーム異常の両方が疾患の中核をなすことが示唆されているが、ＧＲＮ関連ＦＴＤにおける神経変性及び疾患過程の根底にある正確な分子機構及び細胞機構は明らかではない（Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５−３３３，２０１７）。実際、大量のグリオーシスが患者の皮質領域に存在し（Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１６５（４）：９２１−３５，２０１６）、リソソーム障害を意味するリソソーム色素であるリポフスチンが、前駆症状性の個体及び患者の双方を含む変異ＧＲＮの保因者の眼及び皮質で報告されている（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．９（３８５），２０１７）。
７０を超えるＧＲＮ疾患変異が報告され、遺伝子全体にわたりマッピングされており、その結果、それらの変異は機能喪失（ＬＯＦ）対立遺伝子であると確認または予測されている（Ｊｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．５４：１４５−１５４，２０１７）。ＦＴＤに関連付けられる大部分のヘテロ接合性変異は、主にナンセンスｍＲＮＡの崩壊の結果としてのｍＲＮＡレベルの約５０％の低下、及びプログラニュリンタンパク質レベルの同等の低下を引き起こす（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、上掲、Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、上掲）。低レベルのプログラニュリンはまた、前駆症状性の個体を含む保因者の血液（血清）及び脳脊髄液（ＣＳＦ）にも見られる（Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（６）：３２５−３３３，２０１７、Ｇｏｏｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． １０（１）：３１，２０１８、Ｍｅｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓ Ｅｘｔｒａ．６（２）：３３０−３４０，２０１６）。したがって、ハプロ不全がＧＲＮ関連ＦＴＤにおける主な疾患機構であると考えられており、保因者のプログラニュリンレベルを上昇させる治療的アプローチが、ＦＴＤの発症年齢及び進行を遅延させる可能性があることが示唆されている（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ、上掲、Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．、上掲）。この考えは、遺伝子ＴＭＥＭ１０６Ｂの変異体がプログラニュリンのレベルを２５％増強させ、かつＧＲＮ関連ＦＴＤの発症年齢を１３年遅延させることを示すヒト遺伝研究によって裏付けられる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１３２（５）：６３９−６５１，２０１６）。
保因者は、リソソーム蓄積症である神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）（バッテン病、発生率は出生１００，０００例中１〜２．５例、Ｃｏｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ．１３（８）：３６６，２０１３）として知られている幅広く異なる臨床表現型を呈するが、ホモ接合性のＧＲＮ変異も報告されている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．９０（６）：１１０２−７，２０１２、Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．４１：２００．ｅ１−２００．ｅ５，２０１６）。ＧＲＮは、実際、ＮＣＬに関連すると報告されている１４種の神経セロイドリポフスチン沈着症（ＣＬＮ）の遺伝子の１つであり、ＧＲＮはＣＬＮ１１としても知られている（Ｋｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１８３２（１１）：１８６６−８１，２０１３）。本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、抗炎症特性を示し、かつリソソーム機能を増強させる可能性があり、これらのいずれも、ＮＣＬにおいて有益であり得る。
ＧＢＡ遺伝子にホモ接合性変異を保有するゴーシェ病患者は、血清中に低レベルのプログラニュリンを有する（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ １１：１２７−１３７，２０１６）。ＧＢＡにヘテロ接合性変異を有するパーキンソン病患者もまた、低レベルのプログラニュリンを有する。本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、ゴーシェ病またはパーキンソン病の処置において治療上のベネフィットをもたらす可能性がある。
ＧＲＮにおける変異体は、ＡＤに関連付けられており（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、上掲、Ｂｒｏｕｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７１（９）：６５６−６４，２００８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ Ｄｉｓ．８（４）：２１６−２０，２０１１、Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ｂ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｇｅｎｅｔ．１５０Ｂ（５）：７４７−５０，２００９）、ＴＤＰ−４３病変は、ＡＤ患者の脳において一般的である（Ｙｏｕｍａｎｓ ａｎｄ Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２３７（１）：９０−５，２０１２）。プログラニュリン遺伝子の送達は、ＡＤのマウスモデルにおけるアミロイド負荷を減少させることも示されている（ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ａｎｄ Ｋａｙ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．１２（８）：ｅ０１８２８９６，２０１７）。したがって、本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、ＡＤの処置において治療上のベネフィットを付与する可能性がある。
ニーマン・ピック病Ａ型及びＢ型（ＮＰＡ及びＮＰＢ）は、酸性スフィンゴミエリナーゼをコードする遺伝子（ＳＭＰＤ１）における変異に起因する。ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、コレステロール輸送に関与する遺伝子、すなわち、ＮＰＣ１及びＮＰＣ２における変異に起因する（Ｋｏｌｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２１：８１−１０３，２００５、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１（２）：１１３−８，１９９９）。本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、ＮＰＡ、ＮＰＢ及び／またはＮＰＣの処置において治療上のベネフィットをもたらす可能性がある。
ＡＬＳ症例の大多数にはＴＤＰ−４３病変が存在し、これは、ＧＲＮ変異を保有する患者にも共通している（Ｐｅｔｋａｕ ａｎｄ Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３７（７）：３８８−９８，２０１４、Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．８（８）：４２３−３４，２０１２）。すべてのＡＬＳ症例のうち、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内のＧＧＧＧＣＣリピートの伸長は、最も一般的なＡＬＳの原因であり、ＦＴＤの重大な原因である。北アメリカ集団及びヨーロッパ集団で報告された平均変異頻度は、家族性ＡＬＳ患者が３７％、散発的ＡＬＳ患者が６％、家族性ＦＴＤ患者が２１％、及び散発的ＦＴＤ患者が６％である（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、上掲）。さらに、ＧＲＮ関連ＦＴＤにおいて保護的であるＴＭＥＭ１０６Ｂ変異体は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中にリピートの伸長を保有するＦＴＤ患者においてもまた保護的である（ｖａｎ Ｂｌｉｔｔｅｒｓｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７（３）：３９７−４０６，２０１４）。本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、リソソーム機能の促進及び／または炎症の低減によって、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤにおけるＴＤＰ−４３病変を低減させる可能性がある。
ＡＭＤは変性疾患であり、先進国における失明の主要な原因である。ＡＭＤは、網膜の中心近傍の小さな点であり鮮明な中心視覚に必要な眼の一部である、黄斑の損傷を引き起こす。眼内の変性変化及び視覚の喪失は、リソソーム機能の障害及び網膜後部の有害なタンパク質の蓄積に起因する（Ｖｉｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．８（７）：ｅ６９５６３，２０１３）。疾患の進行につれて中心視覚領域における網膜の感覚細胞が損傷し、中心視覚の喪失に至る。本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質またはポリペプチドは、ＡＭＤの処置において治療上のベネフィットをもたらす可能性がある。
Ｖ．血液脳関門（ＢＢＢ）受容体結合のためのＦｃポリペプチド改変
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って輸送することができる融合タンパク質である。そのようなタンパク質は、ＢＢＢ受容体に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む。ＢＢＢ受容体は、ＢＢＢ内皮ならびに他の細胞型及び組織型に発現する。いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
様々なＦｃ改変において示されるアミノ酸残基は、ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド中に導入されるものも含めて、本明細書中ではＥＵインデックス付番を使用して付番される。あらゆるＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃポリペプチドは、本明細書に記載の１つ以上の位置に改変、例えばアミノ酸置換を有し得る。
本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、天然Ｆｃ領域配列またはその断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、天然Ｆｃのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＦｃ領域配列である。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１〜１１０もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸１１１〜２１７、またはそれらの断片、例えば、少なくとも５０アミノ酸長もしくは少なくとも１００アミノ酸長以上の断片に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、改変（例えば、ヘテロ二量体化及び／またはＢＢＢ受容体結合を増強させる）Ｆｃポリペプチドは、天然Ｆｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも５０個のアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上、または少なくとも１００個以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のような天然Ｆｃ領域のアミノ酸配列に対応する、少なくとも２５個の連続するアミノ酸、または少なくとも３０個、３５個、４０個もしくは４５個の連続するアミノ酸、または５０個の連続するアミノ酸、または少なくとも６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個もしくは９５個以上の連続するアミノ酸、または１００個以上の連続するアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性のために改変されるドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインである。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のものであり得る。ＩｇＧ１抗体との関連において、ＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置３４１付近〜位置４４７付近のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢ受容体結合活性のために改変されるドメインは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ２ドメインである。ＣＨ２ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のものであり得る。ＩｇＧ１抗体との関連において、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近〜位置３４０付近のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８及び２９９を含むアミノ酸位置に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９及び２９０を含むアミノ酸位置に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４、２９６及び３００を含むアミノ酸位置に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０及び３３１を含むアミノ酸位置に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９及び４４０を含むアミノ酸位置に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つまたは７つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従うアミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１に少なくとも１つ、２つまたは３つの置換を含み、いくつかの実施形態では、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換を含む。
ＦｃＲｎ結合部位
特定の態様では、改変（例えば、ＢＢＢ受容体結合）Ｆｃポリペプチド、またはＢＢＢ受容体に特異的に結合しない本明細書に記載の融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合部位を含むこともできる。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、Ｆｃポリペプチドまたはその断片中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、天然ＦｃＲｎ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、天然ＦｃＲｎ結合部位のアミノ酸配列に対するアミノ酸の変化を含まない。いくつかの実施形態では、天然ＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧ結合部位、例えば、ヒトＩｇＧ結合部位である。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＦｃＲｎ結合を変化させる改変を含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、１つ以上の変異した、例えば置換されたアミノ酸残基を有し、この変異（複数可）は、血清半減期を増加させるか、または血清半減期を実質的に減少させない（すなわち、変異した位置に野生型残基を有する同等物の改変Ｆｃポリペプチドと比較して、同一条件下でアッセイした場合に血清半減期を２５％以下減少させる）。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位は、ＥＵ付番スキームに従う位置２５０〜２５６、３０７、３８０、４２８及び４３３〜４３６で置換された１つ以上のアミノ酸残基を有する。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合部位のまたはその近傍の１つ以上の残基は、改変ポリペプチドの血清半減期を延長させるために、天然のヒトＩｇＧ配列に対して変異している。いくつかの実施形態では、変異は、位置２５２、２５４及び２５６のうちの１つ、２つまたは３つに導入されている。いくつかの実施形態では、変異はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４の１つ、２つまたは３つすべてに置換を含む。いくつかの実施形態では、変異はＴ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｔ２５０及びＭ４２８に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置Ｍ４２８及びＮ４３４に置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ変異を含む。
ＶＩ．トランスフェリン受容体結合Ｆｃポリペプチド
本セクションでは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し、かつ血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って輸送することができる、本開示による改変Ｆｃポリペプチドの作製について説明する。
ＣＨ３ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ３ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されるＩｇＧ ＣＨ３ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のものであり得る。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ３ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置３４１付近〜位置４４７付近のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、かつトランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻止またはさもなければ阻害することなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換を含む。これらの位置に導入され得る例示的な置換を、実施例セクションの末尾の表６及び表７に示す。いくつかの実施形態では、位置３８８及び／または４２１のアミノ酸は、芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒである。いくつかの実施形態では、位置３８８のアミノ酸はＴｒｐである。いくつかの実施形態では、位置４２１の芳香族アミノ酸はＴｒｐまたはＰｈｅである。
いくつかの実施形態では、以下のような少なくとも１つの位置、すなわち、位置３８４のＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＭｅｔもしくはＶａｌ；位置３８６のＬｅｕ、Ｔｈｒ、ＨｉｓもしくはＰｒｏ；位置３８７のＶａｌ、Ｐｒｏもしくは酸性アミノ酸；位置３８８の芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ；位置３８９のＶａｌ、ＳｅｒもしくはＡｌａ；位置４１３の酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｈｒもしくはＰｒｏ；位置４１６のＴｈｒもしくは酸性アミノ酸；または位置４２１のＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓもしくはＰｈｅが置換されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。したがって、例えば、Ｉｌｅは位置３８４、３８６及び／または位置４１３に存在し得る。いくつかの実施形態では、位置３８７、４１３及び４１６の１つ、２つまたはそれぞれの位置における酸性アミノ酸は、Ｇｌｕである。他の実施形態では、位置３８７、４１３及び４１６の１つ、２つまたはそれぞれの酸性アミノ酸は、Ａｓｐである。いくつかの実施形態では、位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、４１３、４１６及び４２１の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべては、本段落に規定されるアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、先行する２段落に記載のように改変されたＦｃポリペプチドは、位置３９０に天然のＡｓｎを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３９０にＧｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う３８０、３９１、３９２及び４１５を含む位置に１つ、２つ、３つ、または４つの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＧｌｎは、位置３８０に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅは、位置３９１に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓは、位置３９２に存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕは、位置４１５に存在し得る。
特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の位置を含む：位置３８０のＴｒｐ、ＬｅｕもしくはＧｌｕ；位置３８４のＴｙｒもしくはＰｈｅ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８７のＧｌｕ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＡｓｎ；位置３９０のＳｅｒもしくはＡｓｎ；位置４１３のＴｈｒもしくはＳｅｒ；位置４１５のＧｌｕもしくはＳｅｒ；位置４１６のＧｌｕ；及び／または位置４２１のＰｈｅ。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下の１１個すべての位置を含む：位置３８０のＴｒｐ、ＬｅｕもしくはＧｌｕ；位置３８４のＴｙｒもしくはＰｈｅ；位置３８６のＴｈｒ；位置３８７のＧｌｕ；位置３８８のＴｒｐ；位置３８９のＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＡｓｎ；位置３９０のＳｅｒもしくはＡｓｎ；位置４１３のＴｈｒもしくはＳｅｒ；位置４１５のＧｌｕもしくはＳｅｒ；位置４１６のＧｌｕ；及び／または位置４２１のＰｈｅ。
特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８４にＬｅｕもしくはＭｅｔ；位置３８６にＬｅｕ、ＨｉｓもしくはＰｒｏ；位置３８７にＶａｌ；位置３８８にＴｒｐ；位置３８９にＶａｌもしくはＡｌａ；位置４１３にＰｒｏ；位置４１６にＴｈｒ；及び／または位置４２１にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３９１にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕもしくはＧｌｎ及び／または位置３９２にＧｌｎ、ＰｈｅもしくはＨｉｓをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｐは位置３８０に存在し、及び／またはＧｌｎは位置３９２に存在する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐを含まない。
他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８４にＴｙｒ、位置３８６にＴｈｒ、位置３８７にＧｌｕもしくはＶａｌ、位置３８８にＴｒｐ、位置３８９にＳｅｒ、位置４１３にＳｅｒもしくはＴｈｒ、位置４１６にＧｌｕ、及び／または位置４２１にＰｈｅを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３９０に天然のＡｓｎを含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕもしくはＧｌｎ及び／または位置４１５にＧｌｕをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３８０にＴｒｐ及び／または位置４１５にＧｌｕをさらに含む。
追加の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、位置４１４はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙもしくはＰｒｏであり、位置４２４はＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕもしくはＬｙｓであり、及び／または位置４２６はＳｅｒ、ＴｒｐもしくはＧｌｙである。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下の置換、すなわち、ＥＵ付番スキームに従う位置３８０にＴｒｐ、位置３８６にＴｈｒ、位置３８８にＴｒｐ、位置３８９にＶａｌ、位置４１３にＴｈｒもしくはＳｅｒ、位置４１５にＧｌｕ、及び／または位置４２１にＰｈｅのうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つに対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つのうちのＥＵインデックス位置３８４〜３９０及び／または４１３〜４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、４〜９０、９３〜９６及び１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つのうちのＥＵインデックス位置３８０〜３９０及び／または４１３〜４２１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つのうちのＥＵインデックス位置３８０〜３９２及び／または４１３〜４２６のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０）のいずれか１つに対して少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し、さらに、ＥＵインデックスに従って付番した位置のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個に次の通り、すなわち、位置３８０にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；位置３８４にＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＶａｌ；位置３８６にＬｅｕ、Ｔｈｒ、ＨｉｓまたはＰｒｏ；位置３８７にＶａｌ、Ｐｒｏまたは酸性アミノ酸；位置３８８に芳香族アミノ酸、例えば、Ｔｒｐ；位置３８９にＶａｌ、ＳｅｒまたはＡｌａ；位置３９０にＳｅｒまたはＡｓｎ；位置３９１にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＰｈｅ；位置３９２にＧｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；位置４１３に酸性アミノ酸、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｈｒまたはＰｒｏ；位置４１４にＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；位置４１５にＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６にＴｈｒまたは酸性アミノ酸；位置４２１にＴｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ；位置４２４にＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＬｙｓ；及び位置４２６にＳｅｒ、ＴｒｐまたはＧｌｙを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セクションＶＩＩに記載されている変異のような追加の変異を含み、これらとしては、限定されないが、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び／または血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）が挙げられる。例示として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜２１０は、これらの追加の変異のうちの１つ以上を含むＣＨ３ドメインに変異を有する改変Ｆｃポリペプチドの非限定的な例（例えば、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２０．１、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．２、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．３、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２３．４、クローンＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７．２及びクローンＣＨ３Ｃ．３５．２３）を提供する。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）ならびに血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））ならびに血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）ならびにエフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）ならびに血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））ならびに血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番を参照して付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８のいずれか１つの配列に対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９及び４４０に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５に示されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置４３７にＧｌｙ、位置４３８にＰｈｅ、及び／または位置４４０にＡｓｐを含む。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕは、位置４４０に存在する。特定の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下のような位置、すなわち、位置３４５のＰｈｅもしくはＩｌｅ；位置３４６のＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｌａもしくはＬｙｓ；位置３４７のＴｙｒ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＩｌｅもしくはＡｓｐ；位置３４９のＴｈｒもしくはＡｌａ；位置４３７のＧｌｙ；位置４３８のＰｈｅ；位置４３９のＨｉｓ Ｔｙｒ、ＳｅｒもしくはＰｈｅ；または位置４４０のＡｓｐに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９及び４４０の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
ＣＨ２ドメインに変異を含むＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ２ドメインに置換を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合活性のために改変されるＩｇＧ ＣＨ２ドメインなどのヒトＩｇ ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、任意のＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のものであり得る。ＩｇＧ抗体との関連において、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２３１付近〜位置３４０付近のアミノ酸のセグメントを指す。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＴｆＲのアピカルドメインに結合し、かつトランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻止またはさもなければ阻害することなく、ＴｆＲに結合し得る。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、実質的に阻害されない。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約５０％未満（例えば、約４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）阻害される。いくつかの実施形態では、トランスフェリンのＴｆＲへの結合は、約２０％未満（例えば、約１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）阻害される。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８及び２９０に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０に示されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２８７にＧｌｕ及び／または位置２８８にＴｒｐをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下のような位置、すなわち、位置２７４のＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＴｙｒもしくはＴｒｐ；位置２７６のＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡｌａもしくはＴｙｒ；位置２８３のＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＡｓｎもしくはＰｈｅ；位置２８５のＡｒｇ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＧｌｙ；位置２８６のＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇもしくはＶａｌ；位置２８７のＧｌｕ；位置２８８のＴｒｐもしくはＴｙｒ；位置２８９のＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌもしくはＡｓｐ；または位置２９０のＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＴｙｒもしくはＶａｌに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８及び２９０の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つすべては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２７４にＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎもしくはＴｙｒ；位置２７６にＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＡｌａもしくはＴｙｒ；位置２８３にＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＡｌａもしくはＡｓｎ；位置２８５にＡｒｇ、ＳｅｒもしくはＡｌａ；位置２８６にＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇもしくはＶａｌ；位置２８７にＧｌｕ；位置２８８にＴｒｐ；位置２８９にＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＰｈｅもしくはＶａｌ；及び／または位置２９０にＬｅｕ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎもしくはＴｙｒを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２８５にＡｒｇ、位置２８６にＴｙｒもしくはＴｒｐ、位置２８７にＧｌｕ、位置２８８にＴｒｐ、及び／または位置２９０にＡｒｇもしくはＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０のいずれか１つのうちのアミノ酸１〜１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８及び２９９に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５に示されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２７０にＰｒｏ、位置２９５にＧｌｕ及び／または位置２９７にＴｙｒをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下のような位置、すなわち、位置２６６のＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ＭｅｔもしくはＡｓｐ；位置２６７のＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＴｙｒ；位置２６８のＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＴｒｐもしくはＬｅｕ；位置２６９のＰｒｏ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＴｈｒもしくはＡｓｐ；位置２７０のＰｒｏ、ＶａｌもしくはＰｈｅ；位置２７１のＴｒｐ、Ｇｌｎ、ＴｈｒもしくはＧｌｕ；位置２９５のＧｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＬｅｕもしくはＴｒｐ；位置２９７のＴｙｒ、Ｈｉｓ、ＶａｌもしくはＡｓｐ；位置２９８のＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＡｓｎもしくはＶａｌ；または位置２９９のＴｙｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒもしくはＰｒｏに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８及び２９９の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個すべては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２６６にＰｒｏ、ＰｈｅもしくはＡｌａ；位置２６７にＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｌａもしくはＩｌｅ；位置２６８にＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＰｈｅもしくはＴｒｐ；位置２６９にＰｒｏ、ＶａｌもしくはＡｌａ；位置２７０にＰｒｏ；位置２７１にＴｒｐもしくはＧｌｎ；位置２９５にＧｌｕ；位置２９７にＴｙｒ；位置２９８にＴｈｒ、ＨｉｓもしくはＧｌｎ；及び／または位置２９９にＴｙｒ、Ａｓｎ、ＡｓｐもしくはＳｅｒを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２６６にＭｅｔ、位置２６７にＬｅｕもしくはＧｌｕ、位置２６８にＴｒｐ、位置２６９にＰｒｏ、位置２７０にＶａｌ、位置２７１にＴｈｒ、位置２９５にＶａｌもしくはＴｈｒ、位置１９７にＨｉｓ、位置１９８にＨｉｓ、ＡｒｇもしくはＡｓｎ、及び／または位置２９９にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２６６にＡｓｐ、位置２６７にＡｓｐ、位置２６８にＬｅｕ、位置２６９にＴｈｒ、位置２７０にＰｈｅ、位置２７１にＧｌｎ、位置２９５にＶａｌもしくはＬｅｕ、位置２９７にＶａｌ、位置２９８にＴｈｒ、及び／または位置２９９にＰｒｏを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５のいずれか１つのうちのアミノ酸１〜１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４及び３００に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の置換を含む。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０に示されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下のような位置、すなわち、位置２６８のＶａｌもしくはＡｓｐ；位置２６９のＰｒｏ、ＭｅｔもしくはＡｓｐ；位置２７０のＰｒｏもしくはＴｒｐ；位置２７１のＡｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｕもしくはＴｈｒ；位置２７２のＭｅｔ、ＴｙｒもしくはＴｒｐ；位置２９２のＬｅｕもしくはＴｒｐ；位置２９３のＴｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＬｙｓ；位置２９４のＳｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｌａもしくはＬｅｕ；位置２９６のＨｉｓ、ＬｅｕもしくはＰｒｏ；または位置３００のＶａｌもしくはＴｒｐに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４及び３００の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個すべては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２６８にＶａｌ、位置２６９にＰｒｏ、位置２７０にＰｒｏ、位置２７１にＡｒｇもしくはＴｒｐ、位置２７２にＭｅｔ、位置２９２にＬｅｕ、位置２９３にＴｈｒ、位置２９４にＳｅｒ、位置２９６にＨｉｓ、及び／または位置３００にＶａｌを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２６８にＡｓｐ、位置２６９にＭｅｔもしくはＡｓｐ、位置２７０にＴｒｐ、位置２７１にＧｌｕもしくはＴｈｒ、位置２７２にＴｙｒもしくはＴｒｐ、位置２９２にＴｒｐ、位置２９３にＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｙｓ、位置２９４にＬｙｓ、ＡｌａもしくはＬｅｕ、位置２９６にＬｅｕもしくはＰｒｏ、及び／または位置３００にＴｒｐを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０のいずれか１つのうちのアミノ酸１〜１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
いくつかの実施形態では、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従う位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０及び３３１に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の置換を有する。例示的な改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５に示されている。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置３３０にＴｒｐを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下のような位置、すなわち、位置２７２のＴｒｐ、Ｖａｌ、ＩｌｅもしくはＡｌａ；位置２７４のＴｒｐもしくはＧｌｙ；位置２７６のＴｙｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｕ；位置３２２のＳｅｒ、ＡｒｇもしくはＧｌｎ；位置３２４のＶａｌ、ＳｅｒもしくはＰｈｅ；位置３２６のＩｌｅ、ＳｅｒもしくはＴｒｐ；位置３２９のＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＡｓｐ；位置３３０のＴｒｐ；または位置３３１のＳｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＶａｌに少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０及び３３１の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つすべては、本段落に規定される置換を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、セット内の位置のうちの１つ以上における特定のアミノ酸の保存的置換、例えば、同じ電荷の分類、疎水性の分類、側鎖の環構造の分類（例えば、芳香族アミノ酸）、またはサイズの分類、及び／または極性もしくは非極性の分類内のアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、以下、すなわち、位置２７２がＴｒｐ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＡｌａ；位置２７４がＴｒｐまたはＧｌｙ；位置２７６がＴｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｕ；位置３２２がＳｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｎ；位置３２４がＶａｌ、ＳｅｒまたはＰｈｅ；位置３２６がＩｌｅ、ＳｅｒまたはＴｒｐ；位置３２９がＴｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＡｓｐ；位置３３０がＴｒｐ；及び位置３３１がＳｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＶａｌから選択される２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの位置を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、位置２７２にＶａｌもしくはＩｌｅ；位置２７４にＧｌｙ；位置２７６にＡｒｇ；位置３２２にＡｒｇ；位置３２４にＳｅｒ；位置３２６にＳｅｒ；位置３２９にＴｈｒ、ＳｅｒもしくはＡｒｇ；位置３３０にＴｒｐ；及び／または位置３３１にＬｙｓもしくはＡｒｇを含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５のいずれか１つのうちのアミノ酸１〜１１０に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５に対して、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが、そのうちの１つ、２つまたは３つのアミノ酸は置換されている。
ＶＩＩ．追加のＦｃポリペプチド変異
いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、独立して選択された改変を各々含み得るか、または野生型Ｆｃポリペプチド、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり得る、２つのＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合を付与する１つ以上の改変を含有する。一方または両方のＦｃポリペプチドに導入することができる他の変異の非限定的な例としては、例えば、Ｆｃポリペプチドの血清安定性を増加させるため、エフェクター機能を調節するため、グリコシル化に影響を与えるため、ヒトにおける免疫原性を低減させるため、及び／またはノブ及びホールのヘテロ二量体化をもたらすための変異が挙げられる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、対応する野生型Ｆｃポリペプチド（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチド）に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を独立して有する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドは、ノブ変異及びホール変異を含み、ヘテロ二量体の形成を促進し、かつホモ二量体の形成を妨害する。一般に改変は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、第２のポリペプチドの界面に対応するくぼみ（「ホール」）を導入し、その結果、ヘテロ二量体の形成を促進しそれによりホモ二量体の形成を妨害するために、突起をくぼみ内に配置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することにより構成される。突起と同一または同様のサイズの補完的なくぼみは、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、第２のポリペプチドの界面に生成される。いくつかの実施形態では、そのような追加の変異は、ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲへのポリペプチドの結合に対して悪影響を及ぼさないＦｃポリペプチド中の位置に存在する。
二量体化のためのノブ及びホールアプローチの一例示的な実施形態では、融合タンパク質に存在するＦｃポリペプチドのうちの一方の位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番）は、天然のトレオニンの代わりにトリプトファンを含む。二量体中の他方のＦｃポリペプチドは、位置４０７（ＥＵ付番スキームに従って付番）に、天然のチロシンの代わりにバリンを有する。他方のＦｃポリペプチドは、位置３６６（ＥＵ付番スキームに従って付番）の天然のトレオニンがセリンで置換されている置換、及び位置３６８（ＥＵ付番スキームに従って付番）の天然のロイシンがアラニンで置換されている置換をさらに含み得る。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質のＦｃポリペプチドのうちの一方は、Ｔ３６６Ｗノブ変異を有し、他方のＦｃポリペプチドはＹ４０７Ｖ変異を有しており、これは通常、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａホール変異を伴う。
いくつかの実施形態では、血清半減期を増強するための改変が導入され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番した位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニン及び位置２５６にグルタミン酸を含み得る。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含み得る。あるいは、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ置換を含み得る。あるいは、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｎ４３４ＳまたはＮ４３４Ａ置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる（すなわち、エフェクター機能を媒介するエフェクター細胞上に発現したＦｃ受容体に結合した際に、特定の生物学的機能を誘導する能力が低下している）改変を含み得る。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられるがこれらに限定されない。エフェクター機能は、抗体クラスによって変化し得る。例えば、天然ヒトＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ３抗体は、免疫系細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合するとＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を誘発することができ、天然ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４は、免疫細胞上に存在する適切なＦｃ受容体に結合するとＡＤＣＰ機能を誘発することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドを、ヘテロ二量体化のための他の改変、例えば、自然に帯電しているＣＨ３−ＣＨ３界面内の接触残基の静電的な操作または疎水性パッチの改変を含むように操作することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を調節する追加の改変を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させるか、または除去する改変を含み得る。エフェクター機能を低下させる例示的なＦｃポリペプチド変異には、ＣＨ２ドメインにおける、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２３４及び位置２３５での置換が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、位置２３４及び位置２３５にアラニン残基を含むことができる。したがって、一方または両方のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換を含み得る。
エフェクター機能を調節する追加のＦｃポリペプチド変異としては、以下のもの、すなわち、位置３２９に、プロリンがグリシンもしくはアルギニンで、またはＦｃのプロリン３２９とＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成されたＦｃ／Ｆｃγ受容体界面を破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換されている変異を有し得ることが挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的な置換としては、ＥＵ付番スキームに従うＳ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ及びＰ３３１Ｓが挙げられる。多重置換、例えば、ＥＵ付番スキームに従う、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域のＶ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＥ３１８Ａ；ならびにヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３６Ｅも存在する場合がある。いくつかの実施形態では、一方または両方のＦｃポリペプチドは、ＡＤＣＣを調節する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、ＥＵ付番スキームに従う位置２９８、３３３及び／または３３４での置換を含み得る。
追加の変異を含む例示的なＦｃポリペプチド
非限定的な例として、本明細書に記載の融合タンパク質に存在する一方または両方のＦｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、及び／または血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を含む追加の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異及び血清安定性を増加させる変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ノブ変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｗ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ノブ変異、エフェクター機能を調節する変異及び血清安定性を増加させる変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異及びエフェクター機能を調節する変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異及び血清安定性を増加させる変異を有するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ホール変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）、エフェクター機能を調節する変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／またはＰ３２９Ｇ（例えば、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ））、血清安定性を増加させる変異（例えば、ＥＵ付番スキームに従って付番したＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列に対する少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１３５のいずれか１つの配列を有するＦｃポリペプチドは、ホール変異、エフェクター機能を調節する変異及び血清安定性を増加させる変異を有するように改変され得る。
ＶＩＩＩ． プログラニュリンを含む例示的な融合タンパク質
いくつかの態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第１のＦｃポリペプチド及び第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または第２のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは改変Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、他方のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、エフェクター機能を低下させる１つ以上の改変を含有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、血清半減期を延長する１つ以上の改変を含有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合を付与する１つ以上の改変を含有する。
他の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、及び改変Ｆｃポリペプチドと二量体化してＦｃ二量体を形成するＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。プログラニュリンポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖のいずれかに連結され得る。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、第２のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は２つのプログラニュリンポリペプチドを含み、それぞれがポリペプチド鎖の一方に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖中の改変Ｆｃポリペプチドと同じＢＢＢ受容体に特異的に結合する、ＢＢＢ受容体結合ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体に特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、及びＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含み、改変ＦｃポリペプチドとＦｃポリペプチドは、二量体化してＦｃ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、第２のポリペプチド鎖に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＢＢＢ受容体、例えば、ＴｆＲに特異的に結合しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＴｆＲに結合し、かつＴ３６６Ｗ（ノブ）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、ならびにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含むＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換、ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれかに対して指定されたノブ変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、それぞれの配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００のいずれかに対して指定されたホール変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、それぞれの配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つを含み、Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＴｆＲに結合し、かつＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ホール）置換を含む改変Ｆｃポリペプチドを含む第１のポリペプチド鎖、ならびにＴ３６６Ｗ（ノブ）置換を含むＦｃポリペプチドを含む第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）置換、ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（ＹＴＥ）置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドは、位置２３４、２３５、２５２、２５４、２５６及び３６６にヒトＩｇＧ１野生型残基を含む。
いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれかに対して指定されたホール変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、それぞれの配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれかに対して指定されたノブ変異、ＬＡＬＡ変異及びＹＴＥ変異を含み、それぞれの配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つを含み、Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖に連結されているか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）によってＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチド及び／または改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２に対して９０％超もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０のいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖に連結されているか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）によってＦｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２に対して９０％超もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチド及び／または改変ＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖に連結されているか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３〜９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜２０２のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）によって改変Ｆｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２に対して９０％超もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜１００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質に存在するプログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する改変Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖に連結されているか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１〜１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１７２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０８のいずれか１つの配列を（例えば、融合ポリペプチドとして）含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、フレキシブルリンカーなどのリンカー、及び／またはヒンジ領域もしくはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）によって改変Ｆｃポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２に対して９０％超もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２の配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の同一性を有するＦｃポリペプチドを含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５〜１０８のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃポリペプチド及び／またはＦｃポリペプチドのＮ末端は、ＩｇＧ１ヒンジ領域の一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、ならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗ、ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗ、ならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列、及び（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７ＶならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６ＷならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗ、ならびにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、ならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗ、ならびにＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡＰＧ）変異、ならびにＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
前述の実施形態のいずれにおいても、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、ノブ変異Ｔ３６６Ｗを有する第１のＦｃポリペプチドならびにホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを有する第２のＦｃポリペプチドを含むことができ、第１のＦｃポリペプチドは、プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。
前述の実施形態のいずれにおいても、プログラニュリンポリペプチドを第２のＦｃポリペプチドに連結させて、２つのプログラニュリンポリペプチドを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を生成することもできる。例えば、第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端を、第１及び第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じてそれぞれ連結させることができる。別の例では、第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端を、第１及び第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じてそれぞれ連結させることができる。別の例では、第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端を第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結させることができ、第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端を第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結させることができる。別の例では、第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端を第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結させることができ、第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端を第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結させることができる。２つのプログラニュリンポリペプチドを含むＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質のいくつかの実施形態であって、２つのプログラニュリンポリペプチドのそれぞれがポリペプチドリンカーを通じてＦｃポリペプチドに連結されている場合、融合タンパク質中の２つのポリペプチドリンカーは同じであっても、または異なっていてもよい。例えば、２つのポリペプチドリンカーは、それぞれ独立してＧｌｙ４−Ｓｅｒリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）であってよい。
前述の実施形態のいずれにおいても、第１のＦｃポリペプチドまたは第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異を含み得る。第１のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３〜１４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５〜１５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７〜１６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９〜１８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１〜１９３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３〜２０５のいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、ＴｆＲ結合変異を含み得る。第２のＦｃポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜１３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１〜１６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３〜１７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５〜１８７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７〜１９９のいずれか１つの配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの両方は、ＴｆＲ結合変異を含み得る。
特定の実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、（ａ）プログラニュリンポリペプチドに直接またはポリペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）もしくはＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））を通じて連結されている第１のＦｃポリペプチドであって、ＥＵ付番スキームに従うホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃポリペプチド、ならびに（ｂ）ＥＵ付番スキームに従うノブ変異Ｔ３６６Ｗを含みかつＴｆＲ結合変異を含む第２のＦｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＣ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドのＮ末端は、第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に直接またはポリペプチドリンカーを通じて連結されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはその一部（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）にさらに連結され得る。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、及び／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ（ＬＳ）変異を含み得る。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８３の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８８の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８９の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または１００％の同一性を有する配列を含む。
前述の実施形態のいずれにおいても、部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１〜２９１のいずれか１つの配列に存在するグリシンリッチなリンカーは除去され得る。特定の実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、部分的ヒンジ及び／またはグリシンリッチなリンカーを含まないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１〜２９１のいずれか１つの配列を含む。他の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１〜２９１のいずれか１つの配列に存在する部分的ヒンジは、完全ヒンジ配列
Figure 2021527656
によって置換され得る。前述の実施形態のいずれにおいても、部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に存在するグリシンリッチなリンカーは除去され得る。特定の実施形態では、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、部分的ヒンジ及び／またはグリシンリッチなリンカーを含まないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含む。他の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に存在する部分的ヒンジは、完全ヒンジ配列
Figure 2021527656
によって置換され得る。
ＩＸ．結合特性
本明細書に記載の融合タンパク質は、広範囲にわたる結合親和性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体、例えばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する１ｐＭ〜１０μＭにわたる親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＴｆＲに対する親和性は、１ｎＭ〜５μＭまたは１０ｎＭ〜１μＭにわたる。
ＢＢＢ受容体、例えばＴｆＲへの結合を分析するための結合親和性、結合カイネティクス、及び交差反応性を分析するための方法は、当該技術分野において公知である。これらの方法としては、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、結合平衡除外法（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））及びウエスタンブロット分析が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡを使用して、結合親和性及び／または交差反応性を測定する。ＥＬＩＳＡアッセイを実施するための方法は当該技術分野において公知であり、以下の実施例セクションにも記載されている。いくつかの実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、結合親和性、結合カイネティクス及び／または交差反応性を測定する。いくつかの実施形態では、結合平衡除外法を使用して、結合親和性、結合カイネティクス及び／または交差反応性を測定する。いくつかの実施形態では、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法アッセイを使用して、結合親和性、結合カイネティクス及び／または交差反応性を測定する。
Ｘ． プログラニュリンポリペプチドとＦｃポリペプチドの間の結合
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、本明細書に記載されている２つのＦｃポリペプチドを含み、Ｆｃポリペプチドの一方または両方は、部分的または完全なヒンジ領域をさらに含み得る。ヒンジ領域は、任意の免疫グロブリンサブクラスまたはアイソタイプに由来してよい。例示的な免疫グロブリンヒンジは、ＩｇＧ１ヒンジ領域などのＩｇＧヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのアミノ酸配列
Figure 2021527656
またはその一部（例えば、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＦｃポリペプチドのＮ末端領域に存在する。
いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２７５のいずれか１つの配列に存在する部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））は、除去され得る。他の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２７５のいずれか１つの配列に存在する部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））は、完全ヒンジ
Figure 2021527656
によって置換され得る。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に存在する部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））は、除去され得る。他の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列に存在する部分的ヒンジ（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９））は、完全ヒンジ配列
Figure 2021527656
によって置換され得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーによってプログラニュリンポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ペプチド結合によって、または、ポリペプチドリンカーによってプログラニュリンポリペプチドに連結されており、例えば、Ｆｃポリペプチドは融合ポリペプチドである。プログラニュリンポリペプチドが、連結しているＦｃポリペプチドに対して回転可能となるようにポリペプチドリンカーを構成することができ、及び／またはポリペプチドリンカーは、プロテアーゼによる消化に対して耐性である。ポリペプチドリンカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはそれらの組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａなどのようなアミノ酸を含有するフレキシブルリンカーであり得る。そのようなリンカーは、公知のパラメータを使用して設計され、任意長のものであり得、かつ任意長の反復単位（例えば、Ｇｌｙ残基及びＳｅｒ残基の反復単位）を任意数含有し得る。例えば、リンカーは、２つ、３つ、４つもしくは５つ以上のＧｌｙ４−Ｓｅｒ反復などの反復、または単一のＧｌｙ４−Ｓｅｒを有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位、例えば、中枢神経系に存在する酵素によって切断可能なプロテアーゼ切断部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、例えば、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）によって、ＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、リンカーに連結されているかまたはプログラニュリンポリペプチドに直接連結されているヒンジ配列または部分的ヒンジ配列をＮ末端に含み得る。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、例えば、Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）２リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）によって、ＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣ末端は、プログラニュリンポリペプチドに直接連結されている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドとプログラニュリンポリペプチドとの間のポリペプチドリンカーは、３〜２００個（例えば、３〜１８０個、３〜１６０個、３〜１４０個、３〜１２０個、３〜１００個、３〜８０個、３〜６０個、３〜４０個、３〜２０個、３〜１０個、３〜５個、５〜２００個、１０〜２００個、２０〜２００個、４０〜２００個、６０〜２００個、８０〜２００個、１００〜２００個、１２０〜２００個、１４０〜２００個、１６０〜２００個、１８０〜２００個、３つ、５つ、７つ、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、または２００個）のアミノ酸を有することができる。好適なポリペプチドリンカーは、当該技術分野において公知であり（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９，２０１３に記載されているようなもの）、例えば、グリシン及びセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含有するポリペプチドリンカーを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリグリシンリンカー、例えば、（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎは１〜１０の間の整数である）であり得る。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、モチーフ、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７））ｎ、（ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４））ｎまたは（ＳＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５））ｎ（式中、ｎは１〜１０の間の整数である）の複数のモチーフまたは繰り返しモチーフを含有し得る。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン及びセリン以外のアミノ酸も含有し得、例えば、
Figure 2021527656
である。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーはまた、剛性ポリペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、剛性ポリペプチドリンカーは、セグメント内の水素結合及び／またはセグメント内の塩橋により安定化され得るα−ヘリックス立体構造をとることができる。剛性ポリペプチドリンカーの例としては、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９，２０１３に記載されているような、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９）（式中、ｎは２〜５の間の整数である）、及び（ＸＰ）ｎ（式中、ＸはＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、ｎは１〜１０の間の整数である）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、プログラニュリンポリペプチドは、化学的架橋剤によってＦｃポリペプチドに連結されている。そのようなコンジュゲートは、周知の化学的架橋剤及びプロトコールを使用して作製することができる。例えば、当業者に公知であり、ポリペプチドを目的の作用物質と架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤によって、タンパク質をコンジュゲートさせるためのより特異的なカップリング方法が設計できるようになり、これにより、ホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野において公知であり、それらとしては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはその水溶性類似体であるＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有するこれらの架橋剤を、一般により高い水溶性を有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。さらに、連結鎖内にジスルフィドブリッジを有するこれらの架橋剤を、代わりにアルキル誘導体として合成して、ｉｎ ｖｉｖｏでのリンカー切断量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性架橋剤及び光反応性架橋剤をはじめとする多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）及びジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス−［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）及びＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、有用な光反応性架橋剤の例である。
ＸＩ．融合タンパク質の効果の評価
プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む本明細書に記載の融合タンパク質の活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで活性を測定するアッセイをはじめとする様々なアッセイを使用して評価することができる。実施例に記載されているように、本明細書に記載の融合タンパク質の細胞取り込みは、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）ならびにヒトプログラニュリン及びヒトＦｃに対する抗体を用いた免疫染色を使用してアッセイすることができる。本明細書に記載の融合タンパク質で処置後の細胞におけるタンパク質分解活性は、実施例４に記載されているＤＱ−ＢＳＡアッセイを使用して測定することができる。ＧＲＮ変異に起因する細胞の影響（例えば、カテプシンＤ活性の増加、ならびにＣｔｓｌ、Ｔｍｅｍ１０６ｂ及びＰｓａｐなどのリソソーム遺伝子のｍＲＮＡレベルの上昇）を、本明細書に記載の融合タンパク質で細胞を処置した後に再度評価することができる（実施例６及び実施例７）。蛍光発生プローブ及びｑＰＣＲ技術を、これらのアッセイにおいて使用することができる。最後に、本明細書に記載の融合タンパク質の薬物動態特性及び脳の取り込みを、実施例９及び実施例１０に示すように、野生型マウス及び／またはトランスジェニックマウスを使用して測定することができる。
細胞試料については、アッセイは、細胞の破壊及び微小胞の破裂を含む場合がある。細胞の破壊は、凍結融解及び／または超音波処理を使用することにより実現することができる。いくつかの実施形態では、組織試料が評価される。組織試料は、微小胞を確実に破裂させるための超音波処理ステップの前に実施する、複数回の、例えば２回、３回、４回または５回以上の凍結融解（ｆｒｅｅ−ｔｈａｗ）サイクルを使用して評価することができる。
本明細書に記載のアッセイによって評価することができる試料としては、例えば、脳、肝臓、腎臓、肺、脾臓、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む融合タンパク質を投与された患者からのＣＳＦ試料が評価され得る。
ＸＩＩ．ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）
本明細書で提供されるのは、（例えば、試料内の、細胞内の、組織内の及び／または対象内の）プログラニュリンレベルをモニタリングする方法であって、プログラニュリンレベルを判定することが、（例えば、試料、細胞、組織及び／または対象内の）ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）の存在量を測定することを含む方法である。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、単一のＢＭＰ種の存在量が測定される。いくつかの実施形態では、２種以上のＢＭＰ種の存在量が測定される。いくつかの実施形態では、表３のＢＭＰ種の少なくとも２種、３種、４種または５種以上の存在量が測定される。２種以上のＢＭＰ種の存在量を測定する場合、異なるＢＭＰ種の任意の組み合わせを使用することができる。
いくつかの実施形態では、２種以上のＢＭＰ種の存在量を合計することができ、総存在量を参照値と比較することになる。例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３１種、３２種、３３種、３４種、３５種、３６種、３７種、３８種、３９種、４０種、４１種、４２種、４３種、４４種、４５種、４６種、４７種、４８種、４９種、５０種、５１種、５２種、５３種、５４種、５５種、５６種、５７種、５８種、５９種、６０種、６１種、６２種、６３種、６４種、６５種、６６種、６７種、６８種、６９種、７０種、７１種、７２種、７３種、７４種、７５種、７６種、７７種、７８種、７９種、８０種、８１種、８２種、８３種、８４種、８５種、８６種、８７種、８８種、８９種、９０種、９１種、９２種、９３種、９４種、９５種、９６種、９７種、９８種、９９種、１００種、１０１種、１０２種、１０３種、１０４種、１０５種、１０６種、１０７種、１０８種、１０９種、１１０種、１１１種、１１２種、１１３種、１１４種、１１５種、１１６種、１１７種、１１８種、１１９種、１２０種、１２１種、１２２種、１２３種、１２４種、１２５種、１２６種、１２７種、１２８種、１２９種、１３０種、１３１種、１３２種、１３３種、１３４種、１３５種、１３６種、１３７種、１３８種、１３９種、１４０種、１４１種、１４２種、１４３種、１４４種、１４５種、１４６種または１４７種以上のそれぞれのＢＭＰ種（例えば、表３に記載されているＢＭＰ種）の存在量を合計することができ、次に総存在量を参照値と比較する。
場合によっては、１種以上のＢＭＰ種は、ある種類の試料において、例えば、組織ベースの試料または血液試料に対する細胞ベースの試料（例えば、培養細胞）などのように別の試料と比較した場合、差次的に（例えば、より豊富にまたはより少なく）発現され得る。したがって、いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種の選択（すなわち、存在量の測定のための選択）は、試料の種類に依存する。いくつかの実施形態では、１種以上のＢＭＰ種は、例えば、試料（例えば、試験試料及び／または参照試料）が骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）である場合、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）を含む。他の実施形態では、１種以上のＢＭＰ種は、例えば、試料が組織（例えば、脳組織、肝組織）または血漿、尿もしくはＣＳＦを含む場合、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）を含む。
いくつかの実施形態では、内部ＢＭＰ標準物質（例えば、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０））を使用して試料中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定し、及び／または参照値を決定する（例えば、参照試料中の１種以上のＢＭＰ種の存在量を測定する）。例えば、試料中に存在する１種以上のＢＭＰ種の量を決定することができるように、内部ＢＭＰ標準物質の既知量を試料（例えば、試験試料及び／または参照試料）に添加して、較正点として機能させることができる。いくつかの実施形態では、試料からのＢＭＰの抽出または単離に使用する試薬（例えば、メタノール）を、内部ＢＭＰ標準物質に「添加」する。通常、内部ＢＭＰ標準物質は、対象内で天然に生じないものである。
ＸＩＩＩ． プログラニュリン関連障害を有しているか、または有するリスクがある対象の同定
いくつかの実施形態では、対象（例えば、標的の対象）は、試験試料における少なくとも１種の（例えば、少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、１０種、１５種、２０種、２５種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、５５種、６０種、６５種、７０種、７５種、８０種、８５種、９０種、９５種、１００種、１０５種、１１０種、１１５種、１２０種、１２５種、１３０種、１３５種、１４０種または１４５種以上の）ＢＭＰ種（例えば、表３に記載されているＢＭＰ種）の存在量が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の対応する細胞、組織または体液の参照値よりも高い場合（試験試料がＢＭＤＭである場合）、または低い場合（試験試料が肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿である場合）、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
いくつかの実施形態では、対象（例えば、標的の対象）は、ＢＭＰ（１６：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：０）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：３）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：２）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１６：０＿２２：５）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：５）、ＢＭＰ（１８：２＿１８：２）、ＢＭＰ（１６：０＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿１８：２）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：０ｅ＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：２＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）及びＢＭＰ（１８：３＿２２：５）からなる群から選択されるＢＭＰ種のうちの少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種または２３種すべて）の存在量が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の対応する細胞、組織または体液の参照値と比較して、ＢＭＤＭにおいて上昇している場合、または肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において減少している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
いくつかの実施形態では、対象（例えば、標的の対象）は、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）、ＢＭＰ（１８：０＿２０：４）、ＢＭＰ（２０：４＿２０：４）、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）、ＢＭＰ（２０：４＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２２：６）、ＢＭＰ（１８：１＿２０：４）、ＢＭＰ（１８：０＿２２：６）及びＢＭＰ（１８：３＿２２：５）からなる群から選択されるＢＭＰ種のうちの少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種すべて）の存在量が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の対応する細胞、組織または体液の参照値と比較して、ＢＭＤＭにおいて上昇している場合、または肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において減少している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）レベルが、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の参照値と比較してＢＭＤＭにおいて上昇している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。他の実施形態では、対象は、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の参照値と比較して血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び／または脳組織もしくは肝組織において低下している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。他の実施形態では、対象は、ＢＭＰ（２２：６＿２２：６）レベル及び／またはＢＭＰ（１８：３＿２２：５）レベルが肝組織において低下している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。他の実施形態では、対象は、ＢＭＰ（１８：３＿２２：５）レベルがミクログリアにおいて低下している場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
いくつかの実施形態では、対象（例えば、標的の対象）は、少なくとも１種の（例えば、試験試料中で測定した）ＢＭＰ種の存在量が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の対応する細胞、組織または体液の参照値と比較して、少なくとも約１．１倍（例えば、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍または１０倍以上）ＢＭＤＭにおいて高い場合、または肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において低い場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
いくつかの実施形態では、対象（例えば、標的の対象）は、少なくとも１種の（例えば、試験試料中で測定した）ＢＭＰ種の存在量が、参照値（例えば、対応する参照値）よりも少なくとも約１．２倍〜約４倍（例えば、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍または４倍）高い場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１種のＢＭＰ種の存在量が、健常対照またはプログラニュリン関連障害に無関係である対照の対応する細胞、組織または体液の参照値と比較して、約２倍〜約３倍（例えば、約２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍または３倍）ＢＭＤＭにおいて高い場合、または肝臓、脳、脳脊髄液、血漿もしくは尿において低い場合、プログラニュリン関連障害を有しているかまたはプログラニュリンレベルが低下していると判定される。
ＸＩＶ．処置に対する応答のモニタリング
一態様では、本開示は、対象（例えば、標的の対象）におけるプログラニュリンレベルをモニタリングするための方法を提供する。別の態様では、化合物、医薬組成物もしくはそれらの投与レジメンに対する対象の応答、またはプログラニュリン関連障害を処置するための任意の療法もしくは治療への応答（例えば、本明細書に記載のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質に対する応答）をモニタリングするための方法を提供する。
通常、試験試料中の１種以上のＢＭＰ種のそれぞれの存在量を、１つ以上の参照値（例えば、対応する参照値）と比較することになる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ値を、処置前及び１つ以上の処置後の時点で測定する。後の時点で測定した存在量の値を、処置前の値及び健常対照または罹患対照の値などの対照値と比較して、対象が療法に対してどのように応答しているかを判定することができる。１つ以上の参照値は、試験試料の細胞、組織または体液に対応する異なる細胞、組織または体液からのものであり得る。
いくつかの実施形態では、参照値は、参照試料中で測定した１種以上のＢＭＰ種の存在量である。参照値は、存在量の測定値（例えば、参照試料中で測定した存在量の値）である場合もあれば、または存在量の測定値から導出もしくは外挿される場合もある。いくつかの実施形態では、参照値は、例えば、参照値が複数の試料または対象の集団から得られる場合、値の範囲である。さらに、参照値は単一の値（例えば、存在量の測定値、平均値もしくは中央値）として、または標準偏差もしくは誤差の標準を伴うかもしくは伴わない値の範囲として表すことができる。
２つ以上の試験試料を（例えば、対象から）得る場合、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分もしくは６０分以上；約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間もしくは２４時間以上；約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間もしくは７日間以上；約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間もしくは１０週間以上；またはさらに長期間、試験試料を得る時点を離すことができる。３つ以上の試験試料を得る場合、各試験試料を得るときの間の時間間隔は、すべて同じであってもよく、間隔はすべて異なっていてもよく、またはそれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、第１の試験試料と第２の試験試料の両方を、対象が処置された後に対象（例えば、標的の対象）から得る。すなわち、第１の試験試料を、第２の試験試料よりも早い処置の間の時点で対象から得る。いくつかの実施形態では、第１の試験試料を、対象がプログラニュリンレベルの低下に伴う障害のために処置される前に得て（すなわち、処置前の試験試料）、第２の試験試料を、対象がプログラニュリンレベルの低下に伴う障害のために処置された後に得る（すなわち、処置後の試験試料）。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個以上）の処置前及び／または処置後の試験試料を対象から得る。さらに、得る処置前及び処置後の試験試料の数は、同じである必要はない。
いくつかの実施形態では、測定したＢＭＰ種の存在量が参照値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％以内である場合、対象は処置に応答していないと判定され得る。
対象（例えば、標的の対象）が、（例えば、プログラニュリンレベルの低下に伴う障害のための）処置に応答していない場合、いくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤（例えば、プログラニュリン）の投与量を変更（例えば、増加）し、及び／または投与間隔を変更する（例えば、投与間の時間を短縮する）。いくつかの実施形態では、対象が処置に応答していない場合、異なる治療剤を選択する。いくつかの実施形態では、対象が処置に応答していない場合、１つ以上の治療剤を中止する。
ＸＶ．ＢＭＰ検出技術
いくつかの実施形態では、抗体を使用して、１種以上のＢＭＰ種の存在量を検出及び／または測定することができる。抗体に結合したＢＭＰ種は、顕微鏡検査法または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって検出することができる。
他の実施形態では、本開示の方法に従って、質量分析法（ＭＳ）を使用して１種以上のＢＭＰ種の存在量を検出及び／または測定する。質量分析法は、化合物をイオン化し、得られたイオンをそれらの質量電荷比（ｍ／Ｑ、ｍ／ｑ、ｍ／Ｚまたはｍ／ｚと略される）によって選別する技術である。気体、液体または固体形態で存在し得る試料（例えば、ＢＭＰ分子を含む試料）をイオン化し、次いで、得られたイオンを電場及び／または磁場を通じて加速させ、それにより、イオンをそれらの質量電荷比によって分離する。最終的に、イオンはイオン検出器に衝突し、質量スペクトログラムが生成される。検出したイオンの質量電荷比を、それらの相対存在量とともに使用して、場合により、既知の質量（例えば、分子全体もしくはインタクトな分子の既知の質量）を検出したイオンの質量と相関させることによって、及び／または質量スペクトログラムで検出されたパターンの認識によって、親化合物（複数可）を同定することができる。
質量分析計は、通常、（１）試料導入装置（例えば、気化器）、（２）イオン化装置、（３）イオン経路及び（４）イオン検出器の少なくとも４つの主要な構成要素を含む。さらに、質量分析計は一般に、試料を導入装置に適した形態に転換し、及び／または試料内に存在する化合物を分離する装置を含み、これは、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー装置（例えば、液体クロマトグラフィーもしくはガスクロマトグラフィー）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）のための固体の標的または固体試料に適する別の手法であり得る。質量分析計は、一般に、検出信号の信号処理のための装置（例えば、アナログ−デジタルコンバータ（ＡＤＣ））及び／または検出信号の処理、分析及び表示のためのソフトウェアも含む。
試料導入装置は、後続の処理及び分析で必要とされる、固体または液体の検体の気相への転移を容易にする。イオン化装置は、例えば、ハードイオン化法（例えば、電子イオン化法）またはソフトイオン化法（例えば、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、化学イオン化法（ＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、ＭＡＬＤＩもしくは大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ））に利用することができる。ＥＳＩ法は、ある長さのキャピラリーチューブに溶液を通過させることを含み、そのチューブは終端まで高い正電位または負電位が印加されている。チューブの終端に到達した溶液は、溶媒蒸気中に溶液の極小の液滴を含む噴流または噴霧へと気化される。この液滴の噴霧は、凝縮を防止し溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発室を通過して流れる。液滴が小さくなるにつれ、類似の電荷間の自然な反発作用によりイオン及び中性分子が放出されるまで、電気的表面電荷密度が増加する。
イオン経路中で、イオンは、大気圧近傍環境から、イオンをそれらの質量電荷比に従って分離する質量分析計の低圧（例えば、高真空）環境へと移行し、イオン検出器に向かって移動される。イオン検出器は一般に、イオンによる衝突に応答して電子のカスケードを放出する電子増倍管またはマイクロチャンネルプレートである。
異なる種類の質量分析計を使用することができ、それらの例としては、セクターフィールド質量分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計及び四重極型質量分析計が挙げられる。セクターフィールド質量分析計は、静電場及び／または磁場を使用して、イオン経路及び／または速度を変更し、イオンの質量電荷比に従ってイオンの軌道を効果的に曲げる。より高い電荷及び／またはより小さな質量のイオンは、より低い電荷及び／またはより大きな質量のイオンよりも大きく偏向する。ＴＯＦ質量分析計は、電場を使用して特定の電位によってイオンを加速させ、イオンが検出器に衝突するまでに要する時間を測定する。すべてのイオンが同じ電荷を有している場合、それらの速度はそれらの質量の関数としてのみ異なり、より小さな質量のイオンが先に検出器に衝突する。四重極型質量分析計は、４本の平行棒の１つ以上のセット（４本の平行棒のセットは四重極として知られている）を用いて、４本の棒の間に生成された四重極電場（例えば、高周波（ＲＦ）四重極列（ｆｉｌｅ））を通過する際に、イオンの経路を安定化または不安定化させる振動する電場を発生させる。具体的には、質量電荷比の特定の範囲内のイオンのみが、任意の所与の時間で質量分析計を通過することができる。しかしながら、棒の電位を変化させることによって、幅広い範囲の質量電荷比を迅速に掃引することができる。質量電荷比は、連続的にまたは不連続な飛び（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｊｕｍｐ）を特定することのいずれかによって掃引することができる。
単一の質量分析計（例えば、四重極）を使用する単一質量分析法（ＭＳ）に対し、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）は、一連の質量分析計（例えば、３つの質量分析計）を使用して、複数のラウンドの質量分析法を実施し、通常、ラウンドの間に分子断片化ステップを有する。非限定的な例として、ＭＳ／ＭＳ装置は一般に３つの四重極型質量分析計を用いる。第１の四重極（Ｑ１）は、第１の質量フィルタとして機能して、目的の種またはタンパク質を大きな不均一な集団から分離することができる。第２の四重極（Ｑ２）は、Ｑ１を通過したイオンを安定化させる衝突室として機能することができ、イオンが衝突する低圧力ガスを充満させて、イオンの断片化を生じさせることができる（衝突誘発断片化（ＣＩＤ））。第３の四重極（Ｑ３）は、Ｑ２で生成された断片を分離してそれを検出器へと送る第２の質量フィルタとして機能することができる。あるいは、空間的タンデム質量分析法を実施する代わりに、四重極イオントラップを使用しかつ場が経時的に変化する場合などに、単一の質量分析計を使用して、タンデム質量分析法を経時的に実施することができる。簡潔に述べると、四重極イオントラップは、四重極型質量分析計と同じ物理学的原理に基づいて動作するが、イオンは四重極内にトラップされ（すなわち、イオンが脱出するのに必要な時間よりも速く電場が変化して）、四重極によって発生した電場を変化させることによって、経時的に選択的に放出される。
断片化のためのいくつかの方法を使用することができ、それらとしては、限定されないが、ＣＩＤ、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子脱離解離（ＥＤＤ）及び表面誘起解離（ＳＩＤ）が挙げられる。
タンデム質量分析計を使用して、フルスキャン、プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン、ニュートラルロススキャン及び選択（または多重）反応モニタリング（ＳＲＭまたはＭＲＭ）スキャンをはじめとする異なる種類の実験を実行することができる。フルスキャン実験では、両方の質量分析計（例えば、Ｑ１及びＱ３）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）はいかなる衝突ガスも含有しない。これにより、試料中に含まれるすべてのイオンを検出することができる。プロダクトイオンスキャン実験では、特定の質量電荷比を第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）用に選択し、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させて選択した質量電荷比を有するイオンを断片化し、次いで、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンする。これにより、選択したプリカーサーイオンのすべての断片イオンを検出することができる。プリカーサーイオンスキャン実験では、第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させてスキャン範囲内のイオンを断片化し、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）用に特定の質量電荷比を選択する。プロダクトイオンの検出の間の時間とその検出の直前に選択した特定の質量電荷比を相関させることにより、この種類の実験によって、ユーザーは、どのプリカーサーイオン（複数可）が目的のプロダクトイオンを発生させたのかを判定することができる。ニュートラルロススキャン実験では、第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）の全体の質量範囲（またはその一部）をスキャンし、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）を衝突ガスで充満させてスキャン範囲内のすべてのイオンを断片化し、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）は、プリカーサースキャン範囲内のすべての潜在的なイオンに生じた単一の特定の質量の断片化により引き起こされた喪失に対応する、特定の範囲にわたりスキャンする。この種類の実験により、目的の特定の化学基（例えば、メチル基）を共通して喪失したすべてのプリカーサーの同定が可能となる。ＭＲＭ実験では、ある特定の質量電荷比を第１の質量分析計（例えば、Ｑ１）用に選択し、第２の質量分析計（例えば、Ｑ２）に衝突ガスを充満させ、第３の質量分析計（例えば、Ｑ３）を、別の特定の質量電荷比用に設定する。この種類の実験により、第３の質量分析計において選択された生成物に断片化することが知られている分子の特異性の高い検出が可能となる。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ法は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２０１１）３２：５−３１にさらに記載されている。
さらに、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ技術は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）技術と連結させることができる。そのような液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）及びガスクロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）の方式では、通常ＭＳまたはＭＳ／ＭＳ単独で可能となるものよりも強化された質量分解及び質量測定が可能となる。
液体クロマトグラフィーは、流体が均一に微細物質のカラムを通って、またはキャピラリー通路を通って浸透する際に、流体溶液の１つ以上の構成成分を選択的に遅延させるプロセスを指す。遅延は、１つ以上の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間において、流体が固定相（複数可）に対して動く際の、混合物構成成分の分布の結果として生じる。「高圧液体クロマトグラフィー」としても知られている場合がある高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、移動相を圧力下で固定相（通常は高密度に圧縮されたカラム）に通過させることにより分離度が向上した、ＬＣの変形である。
さらに、「超高圧液体クロマトグラフィー」または「超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）」としても知られている超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）は、従来のＨＰＬＣ法よりもはるかに高い圧力を使用して作動する、ＨＰＬＣの変形である。
いくつかの実施形態では、カラム内の粒子のサイズは約２．０μｍ未満（例えば、約１．９μｍ、１．８μｍ、１．７μｍ、１．６μｍまたは１．５μｍ以下）である。いくつかの実施形態では、粒子サイズは、約１．７μｍである。
いくつかの実施形態では、カラムの作動圧力は約４００ｂａｒ〜約１，０００ｂａｒ（例えば、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１，０００ｂａｒ）である。
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの間、カラムの温度は約４０℃〜約６０℃（例えば、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃または６０℃）の間の温度で維持される。いくつかの実施形態では、カラムは、約５５℃の温度で維持される。
いくつかの実施形態では、カラムの流量は、約０．１０ｍＬ／分〜約０．５０ｍＬ／分（例えば、約０．１０ｍＬ／分、０．１１ｍＬ／分、０．１２ｍＬ／分、０．１３ｍＬ／分、０．１４ｍＬ／分、０．１５ｍＬ／分、０．１６ｍＬ／分、０．１７ｍＬ／分、０．１８ｍＬ／分、０．１９ｍＬ／分、０．２０ｍＬ／分、０．２１ｍＬ／分、０．２２ｍＬ／分、０．２３ｍＬ／分、０．２４ｍＬ／分、０．２５ｍＬ／分、０．２６ｍＬ／分、０．２７ｍＬ／分、０．２８ｍＬ／分、０．２９ｍＬ／分、０．３０ｍＬ／分、０．３１ｍＬ／分、０．３２ｍＬ／分、０．３３ｍＬ／分、０．３４ｍＬ／分、０．３５ｍＬ／分、０．３６ｍＬ／分、０．３７ｍＬ／分、０．３８ｍＬ／分、０．３９ｍＬ／分、０．４０ｍＬ／分、０．４１ｍＬ／分、０．４２ｍＬ／分、０．４３ｍＬ／分、０．４４ｍＬ／分、０．４５ｍＬ／分、０．４６ｍＬ／分、０．４７ｍＬ／分、０．４８ｍＬ／分、０．４９ｍＬ／分または０．５０ｍＬ／分）である。いくつかの実施形態では、流量は、約０．４０ｍＬ／分である。
勾配溶出を、２つの溶媒（例えば、Ａ溶媒及びＢ溶媒）を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、Ａ溶媒は水中の１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸であり、Ｂ溶媒は０．１％ギ酸を含むアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、勾配は、以下の方法、すなわち、Ａ５％及びＢ９５％で１分間、６分間かけてＡ５０％及びＢ５０％に変更、０．１分間かけてＡ５％及びＢ９５％に変更、次いで、Ａ５％及びＢ９５％で４．９分間保持する方法により生成される。ＬＣ、ＨＰＬＣまたはＵＨＰＬＣによって化合物が分離されると、それらを質量分析計に導入することができる。
ガスクロマトグラフィーは、分解せずに気化することができる化合物を分離及び／または分析するための方法を指す。移動相は通常、不活性ガス（例えば、ヘリウム）または非反応性ガス（例えば、窒素）であるキャリアガスであり、固定相は通常、「カラム」として機能するガラス管または金属管内部の不活性固体支持体上に配置された微視的な液体またはポリマー層である。目的のガス状化合物がカラム内の固定相と相互作用するにつれて、それら化合物は、差次的に遅延され、異なる時点でカラムから溶出する。次に、分離した化合物を質量分析計に導入することができる。
いくつかの実施形態では、抗体ベースの方法を使用して、１種以上のＢＭＰ種の存在量を検出及び／または測定する。好適な方法の非限定的な例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法及びＲＩＡ法を実施するための方法は、当技術分野において公知である。
本開示の方法において、試料が検出に十分な量のＢＭＰを含み、それによりその存在量を測定することができる限り、任意数の試料の種類を試験試料及び／または参照試料として使用することができる。非限定的な例としては、細胞、組織、血液（例えば、全血、血漿、血清）、体液（例えば、脳脊髄液、尿、気管支肺胞洗浄液、リンパ液、精液、母乳、羊水）、大便、唾液またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。適切な細胞型の非限定的な例としては、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、血球（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、赤血球、白血球）、神経細胞（例えば、脳細胞、大脳皮質細胞、脊髄細胞）、骨髄細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞（例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞などの網膜細胞）、絨毛膜絨毛細胞、筋細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、心臓細胞、リンパ節細胞またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は、細胞の一部を含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞または組織から精製されている。精製試料の非限定的な例としては、エンドソーム、リソソーム、細胞外小胞（例えば、エクソソーム、微小胞）及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態では、試料（例えば、試験試料及び／または参照試料）は、培養細胞である細胞を含む。非限定的な例としては、ＢＭＤＭ細胞及びＲＰＥ細胞が挙げられる。ＢＭＤＭは、例えば、ＰＢＭＣを含む試料を入手して、その中に含まれる単球を培養することにより得ることができる。
適切な組織試料の種類の非限定的な例としては、神経組織（例えば、脳組織、大脳皮質組織、脊髄組織）、肝組織、腎組織、筋組織、心臓組織、眼組織（例えば、網膜組織）、リンパ節、骨髄、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、弁組織及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、試験試料及び／または参照試料は、脳組織または肝組織を含む。いくつかの実施形態では、試験試料及び／または参照試料は、血漿を含む。
ＸＶＩ．核酸、ベクター及び宿主細胞
本明細書に記載されている融合タンパク質に含まれるポリペプチド鎖は、通常、組換え法を使用して調製される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されているＦｃポリペプチドを含むポリペプチド鎖のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸、ならびにポリペプチドをコードする核酸を複製するため、及び／またはポリペプチドを発現するために使用される核酸が導入された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核生物、例えば、ヒトの細胞である。
別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３〜２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３〜２７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１のいずれか１つの配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。
本開示は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列とを含む単離された核酸を提供する。
本開示は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列とを含む単離された核酸を提供する。
本開示は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列とを含む単離された核酸を提供する。
本開示は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列とを含む単離された核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、核酸コンストラクト内に含まれる。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、複製可能なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージミド、酵母染色体ベクター及び非エピソーム哺乳動物ベクターから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現コンストラクト内の１つ以上の制御ヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。ある一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、表面発現ライブラリーとしての使用に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、酵母における表面発現に適合する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ファージにおける表面発現に適合する。別の一連の実施形態では、核酸発現コンストラクトは、ミリグラム量またはグラム量でポリペプチドを単離することが可能な系におけるポリペプチドの発現に適合する。いくつかの実施形態では、系は、哺乳動物細胞発現系である。いくつかの実施形態では、系は、酵母細胞発現系である。
組換えポリペプチド生成のための発現媒体には、プラスミド及び他のベクターが含まれる。例えば、好適なベクターとしては、次のタイプのプラスミド、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド及びｐＵＣ由来プラスミドが挙げられる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ及びｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適する哺乳動物発現ベクターの例である。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バールウイルスなどのウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）を、真核細胞におけるポリペプチドの一過性発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターが挙げられる。追加の発現系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のウイルスの発現系が挙げられる。
任意の好適な宿主細胞にベクターを形質転換することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えば、細菌細胞または酵母細胞は、表面発現ライブラリーとしての使用に適合し得る。ある種の細胞では、ベクターは宿主細胞中で発現し、比較的大量のポリペプチドを発現する。そのような宿主細胞には、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び原核細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０細胞、Ｙ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞である。
本明細書に記載されている１つ以上のＦｃポリペプチド鎖をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な条件下で培養して、１つ以上のポリペプチドの発現を生じさせることができる。ポリペプチドは、ポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物から分泌させ、単離することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞質中にまたは膜画分中に保持して、細胞を回収して溶解し、望ましい方法を使用してポリペプチドを単離してもよい。
ＸＶＩＩ． 治療方法
本開示による融合タンパク質を、プログラニュリン関連障害（例えば、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）ならびにパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害ならびにＡＭＤ）を処置するために治療的に使用することができる。
プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む本明細書に記載の融合タンパク質は、治療有効量または治療有効用量で対象に投与することができる。例示的な投与量には、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲が含まれ、これらを使用することができる。しかしながら、投与量は、投与頻度、選択した投与経路、組成物の配合、患者の応答、状態の重症度、対象の体重及び処方医の判断を含む、いくつかの要因によって変化する場合がある。個別の患者による必要に応じて、投与量を経時的に増加または減少させることができる。いくつかの実施形態では、患者に最初に低用量を与え、次いで、患者が耐えられる有効な投与量まで増量する。
種々の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質は静脈内投与される。静脈内投与は、例えば、約１０分間〜約３０分間にわたる、または少なくとも１時間、２時間もしくは３時間にわたる注入によるものであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は静脈内ボーラスとして投与される。注入とボーラス投与の組み合わせを使用してもよい。
いくつかの非経口的な実施形態では、融合タンパク質は腹腔内投与、皮下投与、皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質は皮内投与または筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質は硬膜外投与などによる髄腔内投与、または側脳室内投与される。
他の実施形態では、融合タンパク質は、経口投与、経肺投与、鼻腔内投与、眼球内投与によって、または局所投与によって投与され得る。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤の配合による経肺投与を用いることもできる。
ＸＶＩＩＩ．医薬組成物及びキット
他の態様では、本開示による融合タンパク質を含む医薬組成物及びキットが提供される。
医薬組成物
本開示において使用するための製剤を調製するための指針は、当業者に公知である医薬調製物及び製剤についての多くの便覧に見ることができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている融合タンパク質を含み、１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤をさらに含む。薬学的に許容可能な担体には、生理学的に適合性があり、活性物質の活性を妨害しないか、またはさもなければ阻害しない任意の溶媒、分散媒またはコーティング剤が含まれる。
いくつかの実施形態では、担体は、静脈内投与、髄腔内投与、眼球内投与、側脳室内投与、筋肉内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、局所投与または皮下投与に適している。薬学的に許容可能な担体は、例えば、組成物を安定化させるように、またはポリペプチドの吸収を増加もしくは減少させるように作用する１つ以上の生理学的に許容可能な化合物を含むことができる。生理学的に許容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性物質のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定剤及び／または緩衝液を挙げることができる。その他の薬学的に許容可能な担体及びその配合もまた、当該技術分野で利用可能である。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、通常使用されている混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。以下の方法及び賦形剤は例示的なものである。
経口投与については、本明細書に記載の融合タンパク質を、当該技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体と組み合わせることにより製剤化することができる。そのような担体により、処置される患者の経口摂取用に、化合物（例えば本明細書に記載されている融合タンパク質）を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、エマルション、親油性懸濁液及び親水性懸濁液、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などとして製剤化することが可能となる。経口使用のための医薬調製物は、融合タンパク質と固体賦形剤とを混合し、場合により得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、所望により適切な助剤を添加後に錠剤または糖衣錠芯を得ることにより、得ることができる。好適な賦形剤としては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、及び／またはポリビニルピロリドンが挙げられる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加することができる。
上で開示されたように、本明細書に記載されている融合タンパク質は、例えば、ボーラス注射または持続注入による注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射の場合、融合タンパク質を水性または非水性溶媒、例えば、植物性または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールに溶解、懸濁または乳化させることによって、ならびに必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤及び保存剤などの通常使用されている添加剤とともに、製剤に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、生理学的に適合性のある緩衝液などの水溶液中に製剤化することができ、その非限定的な例としては、ハンクス液、リンゲル液及び生理的食塩水緩衝液が挙げられる。注射用製剤は、保存剤を添加した単位剤形、例えばアンプルまたは複数回用量の容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、例えば、活性物質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス中の徐放性製剤、制御放出製剤、持続放出製剤、時限放出製剤または遅延放出製剤での送達用に調製される。様々な種類の徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出製剤には、フィルムコーティング錠剤、多粒子またはペレット系、親水性または親油性の材料を使用したマトリックス技術、及び孔形成性賦形剤を含むワックス基剤の錠剤が含まれる。一般に、徐放性製剤は、天然に存在するかまたは合成のポリマー、例えばポリビニルピロリドンなどのポリマー性ビニルピロリドン；カルボキシビニル親水性ポリマー；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの疎水性及び／または親水性ヒドロコロイド；ならびにカルボキシポリメチレンを使用して調製することができる。
通常、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用するための医薬組成物は、無菌である。滅菌は、当該技術分野において公知の方法、例えば、加熱滅菌、蒸気滅菌、滅菌濾過または照射によって実現することができる。
本明細書に記載の医薬組成物の投与量及び望ましい薬物濃度は、想定される特定の用途に応じて変動し得る。好適な投与量については、前述のセクションＸＶＩＩにも記載されている。
キット
いくつかの実施形態では、プログラニュリン関連障害（例えば、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ、ＮＣＬ、ＮＰＡ、ＮＰＢ、ＮＰＣ、Ｃ９ＯＲＦ７２関連ＡＬＳ／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、ＡＤ、ゴーシェ病（例えば、ゴーシェ病２型及び３型）ならびにパーキンソン病）、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害ならびにＡＭＤ）の処置に使用するための、本明細書に記載されている融合タンパク質を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されている融合タンパク質を含み、プログラニュリン関連障害（例えば、神経変性疾患（例えば、ＦＴＤ））の処置に使用するための１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されている方法の実施のための指図書（すなわち、プロトコール）を含む説明用資料（例えば、プログラニュリンポリペプチドを含む融合タンパク質を、血液脳関門を横切って投与するためのキットを使用するための説明書）をさらに含む。説明用資料は通常、書面または印刷物で構成されるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保管することができ、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体が、本開示により企図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、磁気テープ、磁気カートリッジ、磁気チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などが挙げられるがこれらに限定されない。そのような媒体には、そのような説明用資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれ得る。
ＸＩＸ．トランスジェニック動物
さらに、本開示は、非ヒトトランスジェニック動物であって、（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメインと、（ｉｉ）その動物の天然ＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位とを含むキメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸、及び（ｂ）ＧＲＮ遺伝子のノックアウトを含み、キメラＴｆＲポリペプチドがその動物の脳内で発現する、非ヒトトランスジェニック動物も提供する。トランスフェリン受容体のキメラ形態には、非ヒト（例えば、マウス）哺乳動物のトランスフェリン結合部位及びトランスフェリン結合部位を含有するドメインに対して異種であるアピカルドメインが含まれる。これらのキメラ受容体は、特に、トランスフェリン結合部位がトランスジェニック動物種に由来する場合、及びアピカルドメインが霊長類（例えば、ヒトまたはサル）に由来する場合に、トランスジェニック動物において発現させることができる。キメラＴｆＲポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。非ヒト哺乳動物のトランスフェリン結合部位と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有するアピカルドメインとを含むキメラトランスフェリン受容体とをコードするポリヌクレオチドもまた、本明細書に記載されている。アピカルドメインをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１に対して少なくとも９５％（例えば、９７％、９８％または９９％）の同一性を有する核酸配列を含むことができる。トランスジェニック動物は、キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸に対してホモ接合性であっても、またはヘテロ接合性であってもよい。さらに、ＧＲＮ遺伝子のノックアウトは、ＧＲＮ遺伝子のエクソン１〜４の欠失を含むことができる。
トランスジェニックノックインマウスを作製するための方法は、文献に公表されており、当業者に周知である。ヒトＴｆＲノックインマウスを作製する方法には、例えば、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける単一細胞胚への前核注入、それに続く偽妊娠雌への胚移植が含まれる。より具体的には、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡを胚に導入する。ドナーＤＮＡは、マウスでの発現のためにコドン最適化されているヒトアピカルドメインコード配列をコードする。アピカルドメインコード配列は、左右の相同アームに隣接させることができる。ドナー配列は、アピカルドメインが４番目のマウスエクソンの後に挿入され、３’末端で９番目のマウスエクソンに直接隣接するように、このようにして設計される。次に、胚を受けた雌の子孫からのファウンダー雄を、野生型雌と交配させてＦ１ヘテロ接合性マウスを作製することができる。続いて、Ｆ１世代のヘテロ接合性マウスの繁殖からホモ接合性マウスを作製することができる。
本開示は、そのようなキメラＴｆＲ及びＧＲＮ遺伝子のノックアウトを発現する非ヒト、例えば、非霊長類のトランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）への結合によりＢＢＢを通過することができるポリペプチドをスクリーニングするための非ヒトトランスジェニック動物の使用も提供する。いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物は、天然のトランスフェリン受容体（マウストランスフェリン受容体（ｍＴｆＲ）など）を含有し、ここで、アピカルドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一なアミノ酸配列を有するオルソロガスなアピカルドメインで置換されており、これにより、天然のトランスフェリン結合部位及びトランスフェリン受容体をコードする配列の大部分、例えば、少なくとも７０％または少なくとも７５％がインタクトのままとなる。このように、この非ヒトトランスジェニック動物は、適切な鉄恒常性を維持するとともにトランスフェリンに結合してそれを輸送する能力を含む、非ヒト動物の内在性トランスフェリン受容体のトランスフェリン結合機能性を最大限に保持する。その結果、トランスジェニック動物は健常であり、脳疾患を処置するための治療法の発見及び開発に使用するのに適している。
ＸＸ．実施例
本開示を、特定の実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的のためのみに提供され、いかなる方法によっても本開示を限定することを意図しない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正され得る、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。使用する数字（例えば、量、温度など）に対して、正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差が存在する場合がある。本開示の実施には、特に示さない限り、当該技術分野の範囲内にあるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。さらに、特定のライブラリーに適用される操作のための方法が、本明細書に記載の他のライブラリーにも適用され得ることは、当業者には明らかであるはずである。
実施例１．組換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の発現及び精製。
組換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質をＥｘｐｉ２９３（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で発現させるために、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）の指示に従って、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３／プラスミドＤＮＡ複合体を用いて、細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）中、６〜８％ ＣＯ２の湿潤雰囲気で、細胞を３７℃でインキュベートした。トランスフェクション後の翌日、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクションエンハンサー１及び２を培養物に添加した。トランスフェクション後の９６時間後、遠心分離によって培地上清を回収した。清澄化した上清にＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を追加して、−８０℃で保存した。
組換え融合タンパク質の単離のために、清澄化した培地上清をＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填し、洗浄緩衝液Ｉ（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）及び洗浄緩衝液ＩＩ（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。融合タンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ３．０の５０ｍＭ ＱＢクエン酸塩緩衝液で溶出させた。溶出直後に、アルギニン−コハク酸塩緩衝液（１Ｍアルギニン、６８５ｍＭコハク酸、ｐＨ５．０）を添加してｐＨを調整した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １６／６０ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、タンパク質凝集体を単分散融合タンパク質から分離した。ＳＥＣの移動相を、アルギニン−コハク酸塩のｐＨ５．０緩衝液中に維持した。すべてのクロマトグラフィーステップを、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅシステムまたはＡＫＴＡ Ａｖａｎｔシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により実施した。
図１Ａは、融合体１、融合体２及び融合体３の３種類のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質を示す模式図である。融合体１及び融合体２では、ＰＧＲＮのＮ末端は、ＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有しないＦｃポリペプチドのＣ末端に、それぞれ（Ｇ４Ｓ）２リンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）及びＧ４Ｓリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）によって融合している。融合体３では、ＰＧＲＮのＣ末端は、ＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有しないＦｃポリペプチドのＮ末端に、（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって融合している。図１Ｂは、１つのＰＧＲＮ分子をそれぞれ含有する融合体１、融合体２及び融合体３が、８５％超の純度で精製されたことを示す。
図１Ｃは、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体４、融合体５及び融合体６を示す模式図である。融合体４では、２つのＰＧＲＮ分子の各々は、ＦｃポリペプチドのＣ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＣ末端に融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のないＦｃポリペプチドのＣ末端に融合している。融合体５では、一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のない他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に融合している。融合体６では、２つのＰＧＲＮ分子の各々は、ＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。一方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異（星で示す）を含有するＦｃポリペプチドのＮ末端に融合しており、これに対して、他方のＰＧＲＮ分子がＴｆＲ結合変異のないＦｃポリペプチドのＮ末端に融合している。図１Ｄは、２つのＰＧＲＮ分子をそれぞれ含有する融合タンパク質である融合体４及び融合体５が、８５％超の純度で精製されたことを示す。
他のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質には、融合体７及び融合体８が含まれる（図１Ｅ）。融合タンパク質である融合体７及び融合体８の両方は、ＴｆＲ結合変異を含有しないＦｃポリペプチドを含有する。融合体７では、ＰＧＲＮのＮ末端は、ＦｃポリペプチドのＣ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。融合体８では、ＰＧＲＮのＣ末端は、ＦｃポリペプチドのＮ末端にリンカー（Ｇ４Ｓ）２によって融合している。さらなるＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、各融合タンパク質の配列を示す以下の表１に記載されている。
（表１）Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮの配列
Figure 2021527656
Figure 2021527656
実施例２．ｈＴｆＲ及びソルチリンに結合する組換えＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質。
すべての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置にて、シリーズＳセンサーチップＣＭ５及びＨＢＳ−ＥＰ＋泳動用緩衝液を用いて２５℃で実施した。融合タンパク質のｈＴｆＲに対する結合親和性を測定するため、センサーチップにストレプトアビジンを固定化して、ビオチン化ＡｖｉＴａｇ−ｈＴｆＲをキャプチャーした。シングルサイクルカイネティクスを、２５ｎＭ〜２μＭの範囲の融合タンパク質分析物の３倍の濃度系列で使用することにより、８０秒の接触時間、１８０秒の解離時間及び３０μＬ／分の流量を可能とした。定常状態親和性モデルを使用して、融合タンパク質がｈＴｆＲに結合することができることを立証した。
ソルチリンに対する結合親和性を測定するために、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅヒト抗体キャプチャーキットを用いて固定化したセンサーチップを使用して、融合タンパク質をキャプチャーした。マルチサイクルカイネティクスを、０．４ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のソルチリン分析物の３倍の濃度系列で使用することにより、３００秒の接触時間、６００秒の解離時間及び３０μＬ／分の流量を可能とした。１：１のカイネティクスモデルを使用して、ソルチリン結合の結合カイネティクスを評価した。２つのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質のソルチリンへの結合親和性は、以下の通り、すなわち、融合体１：１９ｎＭ、融合体２：１９ｎＭであり、これは、文献中に報告されているＰＧＲＮに対するソルチリンの結合親和性（約１８ｎＭ）と類似している。融合体３は、ソルチリンに結合しないようであった。ＰＧＲＮのＣ末端でのＦｃ融合が、ＰＧＲＮのソルチリン結合部位を阻害する可能性がある。あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで使用した固定化したＦｃが、ソルチリンのＰＧＲＮのＣ末端への接近に対して立体障害を引き起こす可能性がある。
実施例３．細胞取り込み。
ＧＲＮ ＷＴマウス及びＫＯマウスから単離した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、５０ｎＭの組換えプログラニュリン（ＰＧＲＮ）（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）、５０ｎＭのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質またはヒトＰＧＲＮレンチウイルスで１６時間処置した。固定したＢＭＤＭを、ヒトＰＧＲＮに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びヒトＦｃに対する抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で免疫染色した。Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントイメージングプラットフォーム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を共焦点モードで用いて、細胞取り込みを定量化した。ＰＧＲＮ染色及びＦｃ染色の両方に示されるように（図２Ａ及び２Ｂ）、組換えＰＧＲＮ及び完全長Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）による処置により、細胞のＰＧＲＮにおいて力強い増加が生じ、効率的な取り込みが示された。グラニュリンＥ融合タンパク質（ノブ変異を有するＦｃポリペプチドと二量体化したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０（部分的ヒンジ−ホール変異を有するＦｃポリペプチド−（Ｇ４Ｓ）２−グラニュリンＥ融合体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１のアミノ酸４９７〜５９３）））を、陰性対照として使用した。
実施例４．タンパク質分解アッセイ。
ＤＱ−ＢＳＡアッセイ
ＤＱ−ＢＳＡ Ｒｅｄは、ＢＯＤＩＰＹ Ｒｅｄ色素と多量にコンジュゲートしたＢＳＡタンパク質である。ＤＱ−ＢＳＡ Ｒｅｄは、リソソーム内の系の常在プロテアーゼに対する蛍光発生基質（５９０ｎｍで最大励起、６１５ｎｍで最大発光）である。リソソーム内部でＤＱ−ＢＳＡがより小さな色素標識ペプチドに加水分解されると、大量のＢｏｄｉｐｙ色素の標識化により付与された強力な自己消光効果が軽減され、共焦点顕微鏡法による定量化に適用可能な蛍光の大幅な増加が生じる。
実験では、ＧＲＮ ＷＴマウス及びＫＯマウスから単離したＢＭＤＭを、完全培地中、最終濃度１０μｇ／ｍＬのＤＱ−ＢＳＡ Ｒｅｄで６時間処置した。この期間により、ＤＱ−ＢＳＡが液相エンドサイトーシスによって細胞内へ受動的に導入されるようになり、これは、リソソーム内のネットワーク全体へのＤＱ−ＢＳＡの分布をもたらし、最終的にはリソソームにおけるＤＱ−ＢＳＡのタンパク質分解をもたらす。
６時間の処置の完了後、ＢＭＤＭをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡで１５分間固定した。共焦点顕微鏡法用に細胞核を標識するために、固定したＢＭＤＭをＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で１０分間処置し、Ｏｐｅｒａ−Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントイメージングプラットフォーム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でイメージングした。未消光のＢｏｄｉｐｙ−Ｒｅｄシグナルを５６８ｎｍでの励起によって測定し、リソソーム内のタンパク質分解を、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に組み込まれた自動分析モジュールを使用して、細胞ごとに統合されたＢｏｄｉｐｙのスポット面積を算出することにより定量化した。
ＧＲＮ ＷＴ ＢＭＤＭ及びＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭを、５０ｎＭの組換えＰＧＲＮ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）、５０ｎＭのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質またはヒトＰＧＲＮレンチウイルスで４８時間前処置した。消光した蛍光発生Ｂｏｄｉｐｙ−ＢＳＡコンジュゲート（ＤＱ−ＢＳＡ Ｒｅｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、前処置したＢＭＤＭに最終濃度１０μｇ／ｍＬで６時間添加した。Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテントイメージングプラットフォーム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を共焦点モードで用いて、未消光のＢｏｄｉｐｙ−Ｒｅｄシグナルを５６８ｎｍでの励起によって測定した。リソソーム内のタンパク質分解を、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に組み込まれた自動分析モジュールを使用して、細胞ごとに統合されたＢｏｄｉｐｙのスポット面積を算出することにより定量化した。Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質は、ＫＯ ＢＭＤＭにおけるタンパク質分解欠損の異常の完全な回復（融合体１）または部分的な回復（融合体２及び融合体３）のいずれかを示した（図３）。図３に示すように、グラニュリンＥ融合タンパク質（ノブ変異を有するＦｃポリペプチドと二量体化したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０（部分的ヒンジ−ホール変異を有するＦｃポリペプチド−（Ｇ４Ｓ）２−グラニュリンＥ融合体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１のアミノ酸４９７〜５９３）））は、タンパク質分解を回復させることができなかった。
実施例５．Ｂｏｄｉｐｙ−ＢＳＡコンジュゲートの用量−反応。
Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１、融合体３、融合体４及び融合体５）の片対数の用量設定（１００ｎＭから１０ｐＭまで）を用いたＢｏｄｉｐｙ−ＢＳＡコンジュゲート（ＤＱ−ＢＳＡ）アッセイ中で、ＷＴ ＧＲＮ ＢＭＤＭ及びＫＯ ＧＲＮ ＢＭＤＭを２４時間処置した。リソソーム内のタンパク質分解を既述の通りに測定した。融合体５は、ＤＱ−ＢＳＡにおいて効力が増強されたことの証拠を示した（図４）。
実施例６．カテプシンＤアッセイ。
蛍光発生プローブを使用して、細胞溶解物中のカテプシンＤ活性を測定した。ＧＲＮ ＷＴ ＢＭＤＭ及びＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭを、５０ｎＭのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質で７２時間処置し、次にＣＳＴ溶解緩衝液で細胞を溶解させた。細胞溶解物を低ｐＨアッセイ緩衝液へと希釈して、蛍光発生プローブと混合した。カテプシンＤ活性をプレートリーダーで読み取り、無処置ＷＴに対する倍数として算出した。３種類の融合タンパク質（融合体１、融合体２及び融合体３）は、ＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおいて観察された上昇したカテプシンＤ活性を部分的に回復させることを示した（図５）。
実施例７．リソソーム遺伝子の調節不全。
ＧＲＮ ＷＴ ＢＭＤＭ及びＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭを、５ｎＭ〜５０ｎＭのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１で７２時間処置した。細胞を溶解させ、Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ＣＴキット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを抽出した。リソソーム遺伝子Ｃｔｓｌ、Ｔｍｅｍ１０６ｂ及びＰｓａｐのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した。Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１による処置は、ＧＲＮ ＫＯ ＢＭＤＭにおけるリソソーム遺伝子の上昇を部分的に回復させることを示した（図６Ｂ〜６Ｄ）。
実施例８．血漿及び肝臓における融合タンパク質の薬物動態特性。
ＷＴマウスにＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１または融合体３を１０ｍｇ／ｋｇで１回投与し、血漿試料を指定の時点で得た。ビーズホモジナイゼーションを使用して、ＣＳＴ溶解緩衝液中で肝臓をホモジナイズした。各Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の濃度を、Ｆｃ−キャプチャー−ＰＧＲＮ検出構造を使用して、血漿及び末端の（ｔｅｒｍｉｎａｌ）肝臓試料の両方においてＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＫプロファイルは、２種類の融合タンパク質で類似したクリアランス及び半減期を示す（図７Ａ及び７Ｂ）。
実施例９．ｈＴｆＲノックインマウスにおける融合タンパク質の脳の取り込み。
この試験は、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質（融合体１及び融合体３）が、ｈＴｆＲを発現するマウスの脳で検出され得るかどうかを確認することを目的とした（マウスの説明については、米国特許第１０，１４３，１８７号を参照されたい）。ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）がｈＴｆＲノックイン（ｈＴｆＲ．ＫＩ）マウスの脳内で検出され得るかどうか、及び検出された場合、ｈＴｆＲ．ＫＩマウスにおけるｈＰＧＲＮは、ｈＴｆＲを欠く注射された非トランスジェニックマウスにおけるｈＰＧＲＮに対して何倍増加するかを確認するために、ｈＴｆＲ．ＫＩ（ホモ接合性）マウス及び非トランスジェニックマウスに尾静脈を介して融合タンパク質を注射した。
材料及び方法
動物：この試験に使用したマウスは、ＪＡＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、８週齢の雄ｈＴｆＲ．ＫＩ（ホモ接合性）マウス１６匹及び非トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６ １０匹から構成されていた。少なくとも試験開始の７日前に、動物を標準的条件の飼育場に収容し、飼料及び水を自由摂取させた。
（表２）試験デザイン／実験群
Figure 2021527656
動物の実験群への割り付け：この試験に使用したすべての動物は雄であるが、同腹仔間の差異を考慮して各実験群に均等に分布させた。
処方：Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３を、それぞれ５．８７ｍｇ／ｍＬ及び４．９８ｍｇ／ｍＬで使用した。
全体的手順：組織を採取する際に実験条件を交替した。動物群及び試料採取物をランダム化した。
生存中の手順：３ｍｍランセット（ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ ａｎｉｍａｌ ｌａｎｃｅｔｓ）を使用して顎下出血を実施した。血漿の採取：血液をＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ５００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１３４１１０２）に採取し、１０回穏やかに反転させた。少量の（＜１００μＬ）血液については、血液をキャピラリーチューブを備えたＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ １００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１２７８１００）に採取した。血漿の調製まで、ＥＤＴＡチューブを冷蔵庫で直ちに保存した。保存と調製の間の時間は、１時間以下であった。採取時間及び処理時間を終始追跡した。チューブを４℃で７分間、１２，７００ｒｐｍで遠心分離した。血漿（最上層）をラバーシール付き０．６ｍＬマトリックスチューブに移した。マトリックスチューブをドライアイス上で急速冷凍してから、−８０℃に移行させた。
末端体液／組織採取手順：動物を２．５％のアバチンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により深く麻酔をかけ、次に以下に記載の通りの順序で組織を採取した。
心臓内灌流前に採取した試料：血漿の採取：２５ゲージ針を装着した１ｍＬのＴｅｒｕｍｏツベルクリンシリンジ（参照番号ＳＳ−０１Ｔ２５１６）（ＥＤＴＡによる前処理なし）を使用して、血液を心臓穿刺により採取した。次に、針を取り外して血液をＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ５００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１３４１１０２）に移し、１０回穏やかに反転させた。この手順の後、採取後の方法を、生存中の手順において前述したように続けた。
心臓内灌流後に採取した試料については、動物を５分間、５ｍＬ／分の流量で蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｉｐｕｌｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｆ１１０７０１）を使用して氷冷ＰＢＳで経心的に灌流した。採取の間に切開及び事前の重み付けが可能な組織については、試料を直接１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。組織は次の順序で採取した：肝臓（灌流後）：約１００ｍｇの肝臓を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに採取した。−８０℃に移行させる前に、エッペンドルフチューブをドライアイス上で急速冷凍した。脳：右半球をＰＫ及び他の脳小片に切開した。５０ｍｇのＰＫ及び残りの脳小片の両方を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに採取した。−８０℃に移行させる前に、エッペンドルフチューブをドライアイス上で急速冷凍した。左半球を新たに作製した４％パラホルムアルデヒド４ｍＬ中に４℃で７２時間入れ、次いで、３０％スクロースに７２時間移してから、凍結ミクロトームで３０μｍ／切片で冠状に切断した。
ホモジナイゼーションのためのプロトコール
ホモジナイゼーション緩衝液を、１×のＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０×細胞溶解緩衝液（カタログ番号９８０３）（１×緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍＬロイペプチン）を作製して、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル錠、Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４６９３１２４００１）及び１×ホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０６８３７００１）を追加することにより作製した。溶解緩衝液を１．５ｍＬチューブ中の脳及び肝臓試料の組織重量の約１０倍の容積で添加した。３ｍｍのタングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９９９７）を各チューブに添加し、チューブをＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｓに装填した。試料を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号８５３００）で、２９Ｈｚで６分間（３分間の運転を２回）ホモジナイズした。次に試料を取り出し、卓上遠心分離機で４℃で３０分間、最大速度（１８，０００×ｇ）で運転させた。上清を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ＢＣＡを使用してタンパク質濃度を測定した。
ＥＬＩＳＡにおけるｈＰＧＲＮのＦｃキャプチャーのためのプロトコール
ＥＬＩＳＡ用に、３８４ウェル透明マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ４６４７１８）に、ヒトＦｃに特異的なロバポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ番号７０９−００６−０９８）をコートした。キャプチャー抗体を、１μｇ／ｍＬの最終濃度まで炭酸水素ナトリウム緩衝液で希釈した。キャプチャーをコートする溶液２５μＬ／ウェルを各アッセイプレートに添加して、プレートを４℃で一晩インキュベートした。
アッセイの日に、自動プレート洗浄機（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してアッセイプレートをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、その後、８０μＬ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳＴ緩衝液中の５％ＢＳＡ）を添加した。アッセイプレートを室温にて少なくとも１時間、ブロッキング溶液中でインキュベートした。ブロッキングの間に、血漿、肝臓溶解物及び脳溶解物試料の希釈液を、９６ウェルのポリプロピレンＶ字底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ６５１２０１）内のアッセイ希釈緩衝液（ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡ）中で調製した。血漿用に、１：１０、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００及び１：１，０００，０００の段階希釈を調製した。肝臓用に、１：２０、１：１００、１：２００、１：４００及び１：８００の段階希釈を調製した。脳用に、１：１０及び１：４０の段階希釈を調製した。さらに、投与に使用したものと同じ原材料を使用して、融合体１及び融合体３の両方について、２ｎＭ〜０ｎＭの濃度範囲の標準曲線試料を作製した。すべての試料及び標準物質について、１００μｌの最小容積を９６ウェルプレート中に調製した。
ブロッキング後、プレート洗浄機を使用してアッセイプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、液体移送ロボット（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、各標準物質または試料（二連）２５μＬをアッセイプレートに移した。試料を移した後、アッセイプレートに蓋をして室温にて２時間インキュベートした。
ビオチン化ヤギポリクローナルヒトプログラニュリン検出抗体（Ｒ＆Ｄ番号ＢＡＦ２４２０、図８Ａ、８Ｂ、９Ａ及び９Ｂ）、またはＦｃ中の部位を標的とする別の検出抗体（図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ及び１１Ｂ）をアッセイ希釈緩衝液で最終濃度０．５μｇ／ｍＬまで希釈することにより、検出抗体溶液を調製した。試料のインキュベーション後、プレート洗浄機を使用してＰＢＳＴで（最初の３回の洗浄後、プレートを１８０度回転させて）６回プレートを洗浄し、２５μｌ／ウェルの検出溶液をプレートに添加した。アッセイプレートを検出抗体と室温にて１時間インキュベートし、その後、アッセイプレートをプレート洗浄機にてＰＢＳＴで３回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ番号０１６−０３０−０８４）の標準溶液を、ストレプトアビジン−ＨＲＰストックをアッセイ希釈緩衝液で１：５０，０００に希釈することにより調製した。２５μｌ／ウェルのこの溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温にて１時間インキュベートした。
ストレプトアビジン−ＨＲＰのインキュベーション後、プレート洗浄機でプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、２５μｌ／ウェルの１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号３４０２９）をアッセイプレートに添加した。アッセイプレートを室温にておよそ１０分間インキュベートして色を発生させ、その後、２５μｌ／ウェルのＢｉｏＦＸ ４５０ｎｍ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ番号ＬＳＴＰ−１０００−０１）を添加した。ストップ溶液を添加後、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）の吸光度モードを使用してプレートを読み取った。
ＥＬＩＳＡからの未加工の吸光度データを、まず、すべてのアッセイウェルから、（アッセイ希釈液中に試料または標準物質を含まないウェルからの）バックグラウンドの吸光度シグナルを除去することにより分析した。標準曲線の試料の平均値を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して４パラメータロジスティックモデルの式にフィットさせ、そのフィットを使用して、各血漿または組織溶解物試料中の融合体１及び融合体３の濃度（試料の希釈度に対して補正後）を算出した。脳及び肝臓溶解物については、濃度を１０倍し溶解物調製の際の組織の希釈度を調整して、元の組織試料における濃度値を得た。
結果
ｈＴｆＲマウス及びＷＴマウス中のＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の脳及び肝臓のレベルを図８Ａ及び８Ｂに示す（ビオチン化ヤギポリクローナルヒトプログラニュリン検出抗体（Ｒ＆Ｄ番号ＢＡＦ２４２０）を使用して作製した）。ｈＴｆＲマウスは、ＷＴマウスにおける取り込みと比較してＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の取り込みの著しい増加を示した。図９Ａ及び９Ｂは、ＷＴ中の融合体３に対して正規化した、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１及び融合体３の脳対血漿比及び脳対肝臓比をそれぞれ示す。さらに、図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ及び１１Ｂ（Ｆｃ中の部位を標的とする異なる検出抗体を使用して作製）もまた、ＷＴマウスにおける取り込みと比較して、ｈＴｆＲマウスが脳においてより多くのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の取り込みを有することを示す。
実施例１０．血漿における融合タンパク質の薬物動態特性。
ＷＴマウスにＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１または融合体３を１０ｍｇ／ｋｇで１回投与し、血漿試料を指定の時点で得た。各Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質の濃度を、Ｆｃ−キャプチャー−Ｆｃ検出構造を使用して、血漿試料においてＥＬＩＳＡによって測定した。使用した検出抗体は、融合タンパク質のＦｃ中の部位を検出する。図１２Ａ及び１２Ｂは、融合体１及び融合体３の平均血漿中濃度を示す。図１２Ｃ及び１２Ｄは、投与後０．２５時間及び４時間における融合体１及び融合体３の血漿中濃度を示す。
実施例１１．ＴｆＲに結合する改変Ｆｃポリペプチド。
この実施例では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合及び血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る輸送をもたらすための、Ｆｃポリペプチドに対する改変を説明する。
特に示さない限り、本セクションにおけるアミノ酸残基の位置は、ヒトＩｇＧ１野生型Ｆｃ領域に関するＥＵインデックス付番に基づき付番される。
位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１に改変を含む、Ｆｃポリペプチド（ＣＨ３Ｃクローン）の作製及び特性評価
アミノ酸位置３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１を含む位置に導入された改変を有するＦｃ領域を含有する酵母ライブラリーを、以下に記載の通りに作製した。ＴｆＲに結合する例示的なクローンを、実施例セクションの末尾の表６及び表７に示す。
追加の２ラウンドの選別後、単一クローンを配列決定し、４つのユニークな配列を同定した。これらの配列は、位置３８８に保存されたＴｒｐを有し、いずれも位置４２１に芳香族残基（すなわち、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＨｉｓ）を有していた。他の位置には多くの相違が存在していた。
ライブラリーから選択した４つのクローンを、Ｆａｂ断片へのＦｃ融合体としてＣＨＯ細胞または２９３細胞中で発現させ、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、次いで、ＥＬＩＳＡによって、ホロＴｆの存在下または非存在下でヒトＴｆＲへの結合についてスクリーニングした。クローンはすべてヒトＴｆＲに結合し、結合は、過剰な（５μＭ）ホロＴｆの添加による影響を受けなかった。内在的にヒトＴｆＲを発現する２９３Ｆ細胞への結合についても、クローンを試験した。全体的な結合は高親和性の陽性対照よりも大幅に弱かったものの、クローンは２９３Ｆ細胞に結合した。
次に、クローンＣＨ３Ｃ．３を試験クローンとして使用して、クローンがＴｆＲ発現細胞に内部移行することができるかどうかを試験した。接着性のＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレート中で約８０％コンフルエンスまで増殖させ、培地を除去し、試料（クローンＣＨ３Ｃ．３、抗ＴｆＲベンチマーク陽性対照抗体（Ａｂ２０４）、抗ＢＡＣＥ１ベンチマーク陰性対照抗体（Ａｂ１０７）及びヒトＩｇＧアイソタイプ対照（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手））を、１μＭの濃度で添加した。細胞を３７℃、８％ ＣＯ２濃度で３０分間インキュベートし、次いで洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００で透過処理して、抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体で染色した。さらに洗浄後、細胞をハイコンテント蛍光顕微鏡（すなわち、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（商標）システム）下でイメージングして、細胞ごとの斑点（ｐｕｎｃｔａ）の数を定量化した。１μＭにおいて、クローンＣＨ３Ｃ．３は陽性抗ＴｆＲ対照と類似の内部移行の傾向を示したが、一方で、陰性対照は内部移行を示さなかった。
クローンのさらなる操作
ヒトＴｆＲに対する初期ヒットの親和性を向上させるために、穏やかなランダム化アプローチを使用して追加のライブラリーを作製し、ここでは、ＤＮＡオリゴを作製して、最初の４つのヒットの各々に基づく穏やかな変異誘発を導入した。ＴｆＲに結合する追加のクローンを同定し、選択した。選択したクローンを２つの一般的な配列群に分類した。第１群のクローン（すなわち、クローンＣＨ３Ｃ．１８、クローンＣＨ３Ｃ．２１、クローンＣＨ３Ｃ．２５及びクローンＣＨ３Ｃ．３４）は、位置３８４に半保存されたＬｅｕ、位置３８６にＬｅｕまたはＨｉｓ、位置３８７及び３８９にそれぞれ保存または半保存されたＶａｌ、ならびに位置４１３、４１６及び４２１にそれぞれ半保存されたＰ−Ｔ−Ｗモチーフを有していた。第２群のクローンは、位置３８４に保存されたＴｙｒ、位置３８６〜３９０にモチーフＴＸＷＳＸ、ならびに位置４１３、４１６及び４２１にそれぞれ保存されたモチーフＳ／Ｔ−Ｅ−Ｆを有していた。各配列群の代表的なメンバーとして、クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５をさらなる試験に使用した。
エピトープマッピング
操作したＦｃ領域が、ＴｆＲのアピカルドメインに結合するかどうかを確認するために、ＴｆＲアピカルドメインをファージの表面に発現させた。アピカルドメインの適切なフォールディング及び提示のため、ループの１つをトランケートしなければならず、また配列を環状に変更する必要があった。クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５をＥＬＩＳＡプレート上にコートし、ファージＥＬＩＳＡプロトコールがそれに続いた。簡潔に述べると、１％のＰＢＳＡで洗浄及びブロッキング後、提示しているファージの希釈液を添加して、室温にて１時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄し抗Ｍ１３−ＨＲＰを添加して、さらに洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。このアッセイでは、クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５の両方が、アピカルドメインに結合した。
パラトープマッピング
Ｆｃドメイン中のどの残基がＴｆＲ結合に最も重要であるかを理解するために、一連の突然変異体クローンＣＨ３Ｃ．１８ Ｆｃ領域及び突然変異体クローンＣＨ３Ｃ．３５ Ｆｃ領域を生成し、ここで、各突然変異体は、ＴｆＲ結合レジスター中に野生型へ復帰変異した単一の位置を有していた。得られた変異体をＦｃ−Ｆａｂ融合体として組換えにより発現させ、ヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲへの結合について試験した。クローンＣＨ３Ｃ．３５については、位置３８８及び４２１が結合に重要であり、これらのいずれかの野生型への復帰突然変異は、ヒトＴｆＲへの結合を完全に除去した。
成熟クローンの結合特性評価
ＥＬＩＳＡへの結合を、前述の通りプレートにヒトＴｆＲまたはカニクイザルＴｆＲをコートして、精製したＦｃ−Ｆａｂ融合体変異体を用いて実施した。クローンＣＨ３Ｃ．１８成熟ライブラリーからの変異体であるクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１、クローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１９は、ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲにおよそＥＣ５０に相当する値で結合したが、一方で、親クローンＣＨ３Ｃ．１８及びＣＨ３Ｃ．３５は、ヒトＴｆＲにカニクイザルＴｆＲの１０倍超良好に結合した。
次に、改変Ｆｃポリペプチドがヒト細胞及びサル細胞に内部移行するかどうかを試験した。前述のプロトコールを使用して、ヒトＨＥＫ ２９３細胞及びアカゲザルＬＬＣ−ＭＫ２細胞における内部移行を試験した。ヒトＴｆＲ及びカニクイザルＴｆＲに同様に結合した変異体であるクローンＣＨ３Ｃ．３．２−５及びクローンＣＨ３Ｃ．３．２−１９は、クローンＣＨ３Ｃ．３５と比較して、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における内部移行が著しく向上した。
クローンの追加の操作
さらなる親和性成熟クローンＣＨ３Ｃ．１８及びクローンＣＨ３Ｃ．３５のための追加の操作には、直接相互作用、第２殻（ｓｅｃｏｎｄ−ｓｈｅｌｌ）相互作用または構造安定化により結合が増強した位置に追加の変異を加えることが含まれた。このことを、「ＮＮＫウォーク（ｗａｌｋ）」または「ＮＮＫパッチ」ライブラリーから作製及び選択することで実現した。ＮＮＫウォークライブラリーには、パラトープ近傍の残基のＮＮＫ変異を個々に作製することが含まれた。ＦｃγＲＩ（ＰＤＢ番号：４Ｗ４Ｏ）に結合したＦｃの構造を観察することにより、最初の改変位置近傍の４４個の残基を照合の候補として同定した。具体的には、次の残基、すなわち、Ｋ２４８、Ｒ２５５、Ｑ３４２、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｑ３４７、Ｔ３５９、Ｋ３６０、Ｎ３６１、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｋ３７０、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８５、Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｓ４０３、Ｋ４０９、Ｌ４１０、Ｔ４１１、Ｖ４１２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｑ４１８、Ｑ４１９、Ｇ４２０、Ｖ４２２、Ｆ４２３、Ｓ４２４、Ｓ４２６、Ｑ４３８、Ｓ４４０、Ｓ４４２、Ｌ４４３、Ｓ４４４、Ｐ４４５８、Ｇ４４６及びＫ４４７を、ＮＮＫ変異誘発の標的とした。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を使用して４４個の単一点ＮＮＫライブラリーを作製し、産物をプールして、他の酵母ライブラリーについて前述したように、エレクトロポレーションを介して酵母に導入した。
これらのミニライブラリー（それぞれが変異した位置を１つ有しており、２０個の変異体をもたらす）の組み合わせにより、高親和性結合を生じさせる任意の位置に対する酵母表面ディスプレイを使用して選択した小ライブラリーを作製した。選択は、前述の通りＴｆＲアピカルドメインタンパク質を使用して実施した。３ラウンドの選別後、濃縮した酵母ライブラリーからのクローンを配列決定し、特定の点変異がアピカルドメインタンパク質への結合を著しく向上させる、いくつかの「ホットスポット」位置を同定した。クローンＣＨ３Ｃ．３５については、これらの変異にはＥ３８０（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＧｌｎへの変異）及びＳ４１５（Ｇｌｕへの変異）が含まれた。クローンＣＨ３Ｃ．３５の単一突然変異体及び組み合わせ突然変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７〜３８に記載されている。クローンＣＨ３Ｃ．１８については、これらの変異にはＥ３８０（Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＬｅｕへの変異）及びＫ３９２（Ｇｌｎ、ＰｈｅまたはＨｉｓへの変異）が含まれた。クローンＣＨ３Ｃ．１８の単一突然変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜２６に記載されている。
クローンＣＨ３Ｃ．３５の親和性を向上させるための追加の成熟ライブラリー
ＮＮＫウォークライブラリーから変異の組み合わせを同定するための追加のライブラリーを、これらの周辺にいくつかの追加の位置を加えながら、先の酵母ライブラリーについて記載したように作製した。このライブラリーでは、ＹｘＴＥＷＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０２）及びＴｘｘＥｘｘｘｘＦモチーフが不変であり、Ｅ３８０、Ｋ３９２、Ｋ４１４、Ｓ４１５、Ｓ４２４及びＳ４２６の６つの位置が完全にランダム化されていた。位置Ｅ３８０及びＳ４１５は、それらがＮＮＫウォークライブラリーにおける「ホットスポット」であることから含まれた。位置Ｋ３９２、Ｓ４２４及びＳ４２６は、それらが結合領域を位置づけ得るコアの一部を構成することから含まれており、一方、Ｋ４１４は、位置４１５に隣接していることから選択された。
このライブラリーを、前述の通りカニクイザルＴｆＲアピカルドメインのみを用いて選別した。濃縮したプールを５ラウンドの後配列決定し、同定したユニークなクローンの改変領域の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２〜５９に記載する。
次のライブラリーを、主要な結合パラトープにおける許容可能な多様性をさらに探索するために設計した。最初の位置（３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１）に２つのホットスポット（３８０及び４１５）を加えたそれぞれをＮＮＫコドンで個別にランダム化して、酵母上で一連の単一位置飽和変異誘発ライブラリーを作製した。さらに、各位置を個別に野生型残基へ復帰させ、これらの個々のクローンを酵母上に提示した。位置３８０、３８９、３９０及び４１５のみが、野生型残基への復帰時にＴｆＲへの実質的な結合を保持した位置であることが確認された（いくらかは残存するが大幅に減少した結合が４１３の野生型への復帰で観察された）。
単一位置ＮＮＫライブラリーを、ヒトＴｆＲアピカルドメインに対する３ラウンドで選別し、バインダーの上位約５％を収集して、次いで各ライブラリーからの少なくとも１６個のクローンを配列決定した。結果は、クローンＣＨ３Ｃ．３５との関連において、各位置のどのアミノ酸がヒトＴｆＲへの結合を著しく減少させずに許容され得るかを示す。要約は以下の通りである。
位置３８０：Ｔｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；
位置３８４：ＴｙｒまたはＰｈｅ；
位置３８６：Ｔｈｒのみ；
位置３８７：Ｇｌｕのみ；
位置３８８：Ｔｒｐのみ；
位置３８９：Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ（野生型Ａｓｎ残基はある程度の結合を保持するようであるが、後のライブラリー選別には出現しなかった）；
位置３９０：ＳｅｒまたはＡｓｎ；
位置４１３：ＴｈｒまたはＳｅｒ；
位置４１５：ＧｌｕまたはＳｅｒ；
位置４１６：Ｇｌｕのみ；及び
位置４２１：Ｐｈｅのみ。
前述の残基は、クローンＣＨ３Ｃ．３５中に単一の変化としてまたは組み合わせて置換される場合、ＴｆＲアピカルドメインへの結合を保持したパラトープ多様性を表す。表７に示すものを含むこれらの位置に変異を有するクローン及びこれらのクローンのＣＨ３ドメインの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０に記載されている。
実施例１２．ＴｆＲ結合を付与するために改変され得る追加のＦｃ位置。
トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する追加の改変Ｆｃポリペプチドを、Ｆｃ領域の別の部位、例えば下記の位置に改変を含めて作製した。
位置２７４、２７６、２８３、２８５、２８６、２８７、２８８及び２９０（ＣＨ２Ａ２クローン）；
位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２９５、２９７、２９８及び２９９（ＣＨ２Ｃクローン）；
位置２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２９２、２９３、２９４及び３００（ＣＨ２Ｄクローン）；
位置２７２、２７４、２７６、３２２、３２４、３２６、３２９、３３０及び３３１（ＣＨ２Ｅ３クローン）；または
位置３４５、３４６、３４７、３４９、４３７、４３８、４３９及び４４０（ＣＨ３Ｂクローン）。
ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ３Ｂクローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１〜１１５に記載されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ａ２クローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６〜１２０に記載されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｃクローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１〜１２５に記載されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｄクローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６〜１３０に記載されている。ＴｆＲに結合する例示的なＣＨ２Ｅ３クローンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１〜１３５に記載されている。
実施例１３．方法。
ファージディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡ鋳型を合成し、ファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターは、ｏｍｐＡまたはｐｅｌＢリーダー配列、ｃ−Ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３）エピトープタグに融合したＦｃインサート、ならびにアンバー終止コドン、それに続くＭ１３コートタンパク質ｐＩＩＩを含有した。
改変のための所望の位置で「ＮＮＫ」トリコドンを含有するプライマーを作製し、ここで、Ｎは任意のＤＮＡ塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）であり、ＫはＧまたはＴのいずれかである。あるいは、「穏やかな」ランダム化のためのプライマーを使用し、ここでは、７０％の野生型塩基及び他の３つの塩基のそれぞれ１０％に対応する塩基の混合物を、各ランダム化位置のために使用した。ライブラリーを、ランダム化領域に対応するＦｃ領域の断片のＰＣＲ増幅を実施することにより作製し、次いで、ＳｆｉＩ制限部位を含有するエンドプライマーを使用してアセンブルし、次にＳｆｉＩで消化してファージミドベクターにライゲートした。あるいは、プライマーを使用してＫｕｎｋｅｌ変異誘発を実施した。ライゲートした産物またはＫｕｎｋｅｌ産物を、エレクトロコンピテントな株ＴＧ１のＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）より入手）に形質転換した。回復後、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させ、一晩増殖させた後にライブラリーファージを５％ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈降させ、ＰＢＳ中の１５％グリセロールに再懸濁させて使用まで凍結した。典型的なライブラリーのサイズは、約１０９〜約１０１１形質転換細胞の範囲であった。Ｆｃ二量体を、ｐＩＩＩに融合したＦｃとｐＩＩＩに結合していない可溶性Ｆｃとの間（後者は、ｐＩＩＩ前のアンバー終止コドンを理由に作製した）を対合させることによってファージ上に提示した。
酵母ディスプレイライブラリーの作製
野生型ヒトＦｃ配列をコードするＤＮＡ鋳型を合成し、酵母ディスプレイベクターに組み込んだ。ＣＨ２及びＣＨ３ライブラリーについては、ＦｃポリペプチドをＡｇａ２ｐ細胞壁タンパク質上に提示した。両方のベクターは、Ｋｅｘ２切断配列を有するプレプロリーダーペプチド及びＦｃの末端に融合したｃ−Ｍｙｃエピトープタグを含有していた。
酵母ディスプレイライブラリーを、断片の増幅をベクターに対して相同な末端を含有するプライマーを用いて実施したこと以外は、ファージライブラリーについて記載したものと類似の方法を使用してアセンブルした。新たに調製したエレクトロコンピテントな酵母（すなわち、株ＥＢＹ１００）を線状化ベクターでエレクトロポレーションし、ライブラリーインサートをアセンブルした。エレクトロポレーション法は当業者に公知である。選択的ＳＤ−ＣＡＡ培地中で回復後、酵母をコンフルエンスまで増殖させ、２回分割し、次いでＳＧ−ＣＡＡ培地に移すことによりタンパク質発現を誘導した。典型的なライブラリーのサイズは、約１０７〜約１０９形質転換細胞の範囲であった。Ｆｃ二量体を、隣接して提示したＦｃモノマーを対合させることによって形成した。
ファージ選択の一般的方法
ファージ法は、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ，２００１）を適用した。さらなるプロトコールの詳細は、この参考文献から得ることができる。
プレート選別法
抗原を、４℃で一晩、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレートにコートした（通常、１〜１０μｇ／ｍＬ）。ファージライブラリーを各ウェルに添加して、結合のために一晩インキュベートした。マイクロタイターウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）含有ＰＢＳで十分に洗浄して、ウェルを、酸（通常、５００ｍＭ ＫＣｌまたは１００ｍＭグリシンを含む５０ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で３０分間インキュベートすることにより、結合したファージを溶出させた。溶出したファージを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で中和させ、ＴＧ１細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅させ、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎａｃｉｌｌｉｎ）及び５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン含有２ＹＴ培地中で３７℃で一晩増殖させた。標的含有ウェルから溶出したファージの力価を、標的非含有ウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。続いて、結合の際のインキュベーション時間を短縮し、洗浄時間及び洗浄回数を増加させることによって選択のストリンジェンシーを高めた。
ビーズ選別法
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）より入手）を使用して、遊離アミンを介して抗原をビオチン化した。ビオチン化反応については、３〜５倍モル過剰のビオチン試薬をＰＢＳ中で使用した。Ｔｒｉｓで反応を停止させ、次いでＰＢＳ中で十分に透析した。ビオチン化抗原を、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒより入手したＭ２８０−ストレプトアビジンビーズ）上に固定化した。ファージディスプレイライブラリーを、室温にて１時間、抗原をコートしたビーズとインキュベートした。次に、未結合のファージを除去してビーズをＰＢＳＴで洗浄した。結合したファージを、５００ｍＭ ＫＣｌ（または０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７）含有５０ｍＭ ＨＣｌと３０分間インキュベートすることにより溶出させ、次に中和させてプレート選別について前述したように増殖させた。
３〜５ラウンドのパニング後、Ｆｃをファージ上で発現させるか、またはＥ．ｃｏｌｉペリプラズム中で可溶性に発現させるかのいずれかによって、単一クローンをスクリーニングした。そのような発現方法は当業者に公知であろう。個別のファージ上清またはペリプラズム抽出物を、抗原または陰性対照をコートしたブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに曝露させ、続いて、ペリプラズム抽出物に対するＨＲＰコンジュゲートヤギ抗Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈより入手）またはファージに対する抗Ｍ１３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出し、次に、ＴＭＢ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒより入手）で発色させた。バックグラウンドのおよそ５倍を超えるＯＤ４５０値を有するウェルを陽性クローンとみなし、配列決定した後、いくつかのクローンを可溶性Ｆｃ断片としてまたはＦａｂ断片へ融合させるかのいずれかで発現させた。
酵母選択の一般的方法
ビーズ選別（磁気補助細胞選別（ＭＡＣＳ））法
ＭＡＣＳ選択及びＦＡＣＳ選択を、Ａｃｋｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．２５（３），７７４に記載されているものと同様に実施した。ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＭ−２８０ストレプトアビジンビーズ）をビオチン化抗原で標識して、酵母（通常、５〜１０倍のライブラリー多様性）とインキュベートした。未結合の酵母を除去してビーズを洗浄し、結合した酵母を選択培地中で増殖させ、選択の後続のラウンドのために誘導した。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法
酵母を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で標識して、発現及びビオチン化抗原をモニタリングした（濃度は選別ラウンドに応じて変化させた）。いくつかの実験では、相互作用の結合力を増強させるため、抗原をストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と予め混合した。他の実験では、結合後にビオチン化抗原を検出し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で洗浄した。結合を有する一重項の酵母を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩセルソーターを使用して選別した。選別した酵母を選択培地中で増殖させ、次いで、後続の選択ラウンドのために誘導した。
濃縮した酵母集団を得た後、酵母をＳＤ−ＣＡＡ寒天培地プレートに播種し、単一コロニーを増殖させて発現を誘導し、次いで前述の通り標識して、標的へ結合するそれらの傾向を判定した。続いて、陽性の単一クローンを結合抗原について配列決定し、その後、いくつかのクローンを可溶性Ｆｃ断片としてまたはＦａｂ断片へ融合したものとしてのいずれかで発現させた。
スクリーニングの一般的方法
ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
クローンをパニングアウトプットから選択し、９６ウェルディープウェルプレートの個々のウェル中で増殖させた。クローンを、自己誘導培地（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより入手）を使用してペリプラズム発現を誘導するか、またはファージ上の個々のＦｃ変異体のファージディスプレイのためにヘルパーファージに感染させるかのいずれかとした。ＥＬＩＳＡプレートに抗原をコートし（通常は０．５ｍｇ／ｍＬで一晩）、次に１％ＢＳＡでブロッキングして、その後ファージまたはペリプラズム抽出物を添加した。１時間インキュベーションし、未結合タンパク質を洗い流した後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（すなわち、可溶性Ｆｃまたはファージに提示したＦｃのそれぞれに対する抗Ｆｃまたは抗Ｍ１３）を添加して３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、次に、ＴＭＢ試薬で発色させ、２Ｎ硫酸で停止させた。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））を使用して４５０ｎｍでの吸光度を定量化し、必要に応じて、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線をプロットした。いくつかのアッセイでは、結合ステップの間に可溶性トランスフェリンまたは他の競合剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を、通常は大幅なモル過剰で添加した。
フローサイトメトリーによるスクリーニング
Ｆｃ変異体ポリペプチド（ファージ上で発現させたもの、ペリプラズム抽出物中で発現させたもの、またはＦａｂ断片への融合体として可溶性に発現させたもののいずれか）を９６ウェルＶ字底プレート中の細胞（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中にウェルあたり約１００，０００細胞）に添加して、４℃で１時間インキュベートした。続いて、プレートを回転させ培地を除去して、次にＰＢＳＡで細胞を１回洗浄した。二次抗体（通常、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒより入手））を含有するＰＢＳＡ中に、細胞を再懸濁させた。３０分後、プレートを回転させ培地を除去して、ＰＢＳＡで細胞を１〜２回洗浄し、次に、プレートをフローサイトメーター（すなわち、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ フローサイトメーター）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して各条件について中央蛍光値を算出し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結合曲線をプロットした。
実施例１４．リピドミクス及び質量分析法。
質量分析法の試料調製
細胞（例えば、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ））をＰＢＳで十分に洗浄し、内部標準としてＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を添加したメタノールでＢＭＰ種を抽出した。メタノールによるＢＭＰ種の抽出後、試料をボルテックス混合し、４℃で２０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、さらなる分析のため、上清を液体クロマトグラフィー−質量分析バイアルに移した。
組織試料を計量（例えば、２０ｍｇ）し、次に、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒホモジナイザー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を添加したメタノール（２００μＬ）中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃で２０分間、１４，０００ｒｐｍで回転させた。次に、さらなる分析のため、上清を液体クロマトグラフィー−質量分析バイアルに移した。
生体液（１０μＬ）をＢＭＰ（１４：０＿１４：０）含有メタノール（１００μｌ）でタンパク質沈降させ、４℃で２０分間、１４，０００ｒｐｍで回転させた。次に、さらなる分析のため、上清を液体クロマトグラフィー−質量分析バイアルに移した。
リピドミクスの手順
全体的手順：脂質抽出の間、動物群及び試料採取物をランダム化した。
尿からの脂質及び代謝物の抽出：Ｔｈｅｒｍｏ Ｍａｔｒｉｘチューブに尿を採取して−８０℃で保存した。尿を氷上で解凍し、４℃で１０分間、１，０００×ｇで遠心分離して微粒子を除去した。１０μＬの尿を２．０ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２６０００４４）に、及び内部標準混合物（試料あたり２μＬ）を含有するＭＳグレードの氷冷メタノール２００μＬに移した。試料を５分間、２，５００ｒｐｍでボルテックスした。試料を４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離した。メタノール上清を９６ウェルプレート中のＬＣＭＳガラスバイアルに移した。ＬＣＭＳにかけるまで、試料を−８０℃で保存した。
血漿からの脂質及び代謝物の抽出：血漿試料を氷上で解凍した。血漿／血清（１０μＬ）または尿（２０μＬ）を２ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２６０００４４）に移した。内部標準混合物（試料あたり２μＬ）を含有するＭＳグレードの氷冷メタノール（２００μＬ）を５分間ボルテックスして、次に、４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離した。リピドミクス分析及びメタボロミクス分析のために、メタノール上清を９６ウェルプレート中のＬＣＭＳガラスバイアルに移した。ＬＣＭＳにかけるまで、試料を−８０℃で保存した。
脳からの脂質及び代謝物の抽出：マウス脳の前頭皮質（１８〜２０ｍｇ）を、５ｍｍのステンレス鋼ビーズ（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号６９９８９）を含有する、ドライアイス中に保存した２ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２６０００４４）に移した。内部標準混合物（試料あたり２μＬ）を含有するＭＳグレードのメタノール（４００μＬ）を添加した。組織をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて冷蔵室にて２５Ｈｚで３０秒ホモジナイズして、次に、４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離した（ビーズはチューブ内に残した）。メタノール上清を１．５ｍＬの新しいエッペンドルフバイアルに移し、−２０℃で１時間放置して、タンパク質をさらに沈殿させた。バイアルを４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離して、リピドミクス分析及びメタボロミクス分析のために、メタノール上清をＬＣＭＳガラスバイアルに移した。ＬＣＭＳにかけるまで、試料を−８０℃で保存した。
ＣＳＦからの脂質及び代謝物の抽出：ピペット法により、マウスからＣＳＦを採取した。ガラスバイアル中の内部標準混合物（試料あたり０．２μＬ）を含有するＭＳグレードの氷冷ＭｅＯＨ（１００μＬ）に、ＣＳＦ（５μＬ）を直接添加した。ＣＳＦ及びＭｅＯＨを含むガラスバイアルを５分間ボルテックスして、直接ＬＣＭＳにかけた。
肝臓からの脂質及び代謝物の抽出：肝臓（２０ｍｇ）を、５ｍｍのステンレス鋼ビーズ（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号６９９８９）を含有する、ドライアイス中に保存した２ｍＬのＳａｆｅ−Ｌｏｃｋエッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカタログ番号０２２６０００４４）に移した。次に、内部標準混合物（試料あたり２μＬ）を含有するＭＳグレードのメタノール（４００μＬ）を添加した。組織をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて（冷蔵室にて）２５Ｈｚで３０秒ホモジナイズして、４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離した（ビーズはチューブ内に残した）。メタノール上清を１．５ｍＬの新しいエッペンドルフバイアルに移し、−２０℃で３時間放置して、タンパク質をさらに沈殿させた。バイアルを４℃で２０分間、２１，０００×ｇで遠心分離して、リピドミクス分析及びメタボロミクス分析のために、メタノール上清をＬＣＭＳガラスバイアルに移した。ＬＣＭＳにかけるまで、試料を−８０℃で保存した。
液体クロマトグラフィー−質量分析法
ＢＭＰ分析を、エレクトロスプレー質量分析法（Ｓｃｉｅｘ ６５００＋ＱＴＲＡＰ、Ｓｃｉｅｘ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と連結した液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ Ｘ２システム、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ，ＵＳＡ）により実施した。各分析のために、試料５μＬを、５５℃、流量０．４０ｍＬ／分でＢＥＨアミド１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）に注入した。移動相Ａを、１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸を含む水で構成した。移動相Ｂを、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルで構成した。勾配を以下の通り、すなわち、０．０〜１．０分をＢ９５％で、１．０〜７．０分でＢ５０％まで、７．０〜７．１分でＢ９５％まで、及び７．１〜１２．０分をＢ９５％でプログラムした。エレクトロスプレーイオン化を、次の設定、すなわち、カーテンガスを２５で、衝突ガスを中等度に設定し、イオンスプレー電圧を−４５００で、温度を６００で、イオン源ガス１を５０で、イオン源ガス２を６０で、コリジョンエネルギーを−５０で、ＣＸＰを−１５で、ＤＰを−６０で、ＥＰを−１０で、滞留時間を２０ミリ秒で使用して陰イオンモードで実施した。Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３（Ｓｃｉｅｘ）を多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で使用して、データ収集を実施した。表３に記載されているＭＲＭトランジションパラメータを使用してＢＭＰ種を検出した。ＢＭＰ（１４：０＿１４：０）を内部標準として使用してＢＭＰ種を定量化した。ＢＭＰ種を、それらの保持時間及びＭＲＭ特性に基づいて同定した。同位体のオーバーラップの補正後、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ３．０２（Ｓｃｉｅｘ）を使用して定量化を実施した。ＢＭＰ種を総タンパク質量、組織重量または生体液容積のいずれかに対して正規化した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
プリカーサー（Ｑ１）［Ｍ−Ｈ］−及びプロダクトイオン（Ｑ３）のｍ／ｚトランジションを使用して、ＢＭＰ種を測定した。ＢＭＰ種を、表３に従ってＱ１値及びＱ３値から同定した。略称は、本明細書では２つの側鎖を有する種を指すものとして使用され、脂肪酸側鎖の構造をＢＭＰ形式中の括弧内に示す（例えば、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１））。数字は、脂肪酸炭素原子の数：二重結合の数の標準的な脂肪酸の表記形式に従う。接頭辞「ｅ−」は、アルキルエーテル置換基の存在を示すために使用され（例えば、ＢＭＰ（１６：０ｅ＿１８：０））、脂肪酸側鎖のカルボニル酸素は２つの水素原子で置き換えられている。あるいは、ＢＭＰ種を炭素原子の総数：二重結合の総数に従って総称的に指すことができ、類似の値を有する種は、それらのＱ１値及びＱ３値によって区別することができる。
（表３）ＢＭＰ種及びＭＲＭトランジションパラメータ
Figure 2021527656
Figure 2021527656
Figure 2021527656
Figure 2021527656
Figure 2021527656
Figure 2021527656
実施例１５．ＧＲＮノックアウトマウス由来のＢＭＤＭの処置。
ＢＭＤＭを、Ｔｒｏｕｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１３（８１）５０９６６と同様の方法を使用して（ただし、分化を誘導するために組換えＭ−ＣＳＦを細胞増殖培地に直接添加して）、野生型マウス及びＧＲＮノックアウトマウスの骨髄からｉｎ ｖｉｔｒｏで得た。ＢＭＤＭを、５０ｎＭのＦｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である表１の融合体１１及び融合体１２またはＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）対照で７２時間処置した。内部標準混合物を含有するメタノールの添加により細胞脂質を抽出し、ＢＭＰ存在量を、Ｑ−ｔｒａｐ ６５００（ＳＣＩＥＸ）で液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。図１３Ａ及び１３Ｂに示すように、ＢＭＰ（１８：１＿１８：１）及びＢＭＰ（２０：４＿２０：４）の存在量は、野生型対照と比較して、無処置ＧＲＮノックアウトマウス由来のＢＭＤＭにおいて増加した。さらに、図１３Ｃ及び１３Ｄに示す別の実験（３回の技術的反復）では、総ＢＭＰ及びＢＭＰ（１８：１＿１８：１）の存在量は、組換えプログラニュリン（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）またはレンチウイルスによって発現されたプログラニュリンのいずれかで処置したＧＲＮノックアウトＢＭＤＭで減少した。
グラニュリン（ＧＲＮ）ノックアウト動物由来のＢＭＤＭにおいて、存在量の増加が見出されたＢＭＰ種を表４に示す。特に顕著な存在量の増加を示した種に星印を付す。
（表４）ＧＲＮ ＫＯマウスのＢＭＤＭにおいて上昇したＢＭＰ種
Figure 2021527656
実施例１６．表現型を回復させるためのＧＲＮ ＫＯマウスの処置。
単回の５０ｍｇ／ｋｇの注射後に末梢及びＣＮＳのＧＲＮ ＫＯ表現型を回復させることができるかどうかを確認するために、表１の融合体１１及び融合体１２を尾静脈を介してＧＲＮ ＷＴ及びＧＲＮ ＫＯマウスに注射した。
材料及び方法
動物：この試験に使用したマウスは、ＪＡＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、３〜５ヶ月齢のＧＲＮ ＫＯマウス２１匹（雄ｎ＝１２、雌ｎ＝９）及びＧＲＮ ＷＴマウス１０匹（雄ｎ＝５、雌ｎ＝５）から構成されていた（表５）。少なくとも試験開始の７日前に、動物を標準的条件の飼育場に収容し、飼料及び水を自由摂取させた。
（表５）試験デザイン／実験群
Figure 2021527656
動物の実験群への割り付け：マウスを同腹仔、性別及び年齢の間の差異を考慮して各実験群に均等に分布させた。
処方：Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２を、それぞれ５．０５ｍｇ／ｍＬ及び４．９０ｍｇ／ｍＬの生理食塩水で使用した。
全体的手順：組織を採取する際に実験条件を交替した。動物群及び試料採取物をランダム化した。
生存中の手順：３ｍｍランセット（ＧｏｌｄｅｎＲｏｄ ａｎｉｍａｌ ｌａｎｃｅｔｓ）を使用して顎下出血を実施した。血漿の採取：血液をＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ５００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１３４１１０２）に採取し、１０回穏やかに反転させた。少量の（＜１００μＬ）血液については、血液をキャピラリーチューブを備えたＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ １００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１２７８１００）に採取した。血漿の調製まで、ＥＤＴＡチューブを冷蔵庫で直ちに保存した。保存と調製の間の時間は、１時間以下であった。採取時間及び処理時間を終始追跡した。チューブを４℃で７分間、１２，７００ｒｐｍで遠心分離した。血漿（最上層）をラバーシール付き０．６ｍＬマトリックスチューブに移した。マトリックスチューブをドライアイス上で急速冷凍してから、−８０℃に移行させた。尿の採取：プラスチックの計量ボートにマウスを拘束し、ほとんどのマウスに計量ボート内に尿を排出させることにより、尿を採取した。尿をｐ２００ピペットで採取し、ラバーシール付き０．６ｍＬマトリックスチューブに移した。マトリックスチューブをドライアイス上で急速冷凍してから、−８０℃に移行させた。
末端体液／組織採取手順：動物を２．５％のアバチンの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により深く麻酔をかけ、次に以下に記載の通りの順序で組織を採取した。
心臓内灌流前に採取した試料：血漿の採取：２５ゲージ針を装着した１ｍＬのＴｅｒｕｍｏツベルクリンシリンジ（参照番号ＳＳ−０１Ｔ２５１６）（ＥＤＴＡによる前処理なし）を使用して、血液を心臓穿刺により採取した。次に、針を取り外して血液をＥＤＴＡチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ５００ Ｋ３Ｅ、参照番号２０１３４１１０２）に移し、１０回穏やかに反転させた。この手順の後、採取後の方法を、生存中の手順において前述したように続けた。脳脊髄液の採取：後頸部の３つの筋層を小型剪刀及び鉗子で引き剥がし、血液からの汚染を防止するために、露出した大槽の周囲領域を焼灼して、Ｑ−ｔｉｐ及びＰＢＳで膜を洗浄した。膜を乾燥させ、２８ １／２ゲージのインスリンシリンジ針の先端で大槽を穿刺した。次に、ｐ２０ピペットを手早く先ほど穿刺した孔に配置し、ＣＳＦをピペットチップ内に吸い上げた。ＣＳＦを０．５ｍＬ Ｌｏ−ｂｉｎｄエッペンドルフチューブに入れ、４℃で７分間、１２，７００ｒｐｍで回転させた。ＣＳＦ上清を０．５ｍＬ Ｌｏ−ｂｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、ドライアイス上で急速冷凍してから、−８０℃に移行させた。
心臓内灌流後に採取した試料については、動物を５分間、５ｍＬ／分の流量で蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｉｐｕｌｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｆ１１０７０１）を使用して氷冷ＰＢＳで経心的に灌流した。採取の間に切開及び事前の重み付けが可能な組織については、試料を直接１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。組織は次の順序で採取した：肝臓（灌流後）：約１５０ｍｇの肝臓を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに採取した。−８０℃に移行させる前に、エッペンドルフチューブをドライアイス上で急速冷凍した。眼：両眼を取り外し、筋肉及び視神経を取り外して、眼を１本の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。−８０℃に移行させる前に、エッペンドルフチューブをドライアイス上で急速冷凍した。脳：嗅球及び小脳を除く右半球を採取し、計量してから１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。−８０℃に移行させる前に、エッペンドルフチューブをドライアイス上で急速冷凍した。
図１４〜２０に示すように、Ｆｃ二量体：ＰＧＲＮ融合タンパク質である融合体１１及び融合体１２の投与で、肝臓、血漿、尿、ＣＳＦ及び脳におけるＢＭＰレベルの増加及び回復が見出された。
実施例１７．ＢＢＢを通過する融合タンパク質。
ＧＲＮ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０１３１７５）とｈＴｆＲ ＫＩマウスとを交配させたＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、表１の融合体１１及び融合体１２を尾静脈を介して注射して、これらのＢＢＢを通過する能力について試験した。ｈＴｆＲ ＫＩマウスの説明は、国際特許公開第ＷＯ２０１８１５２２８５号に見ることができる。ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスを作製するために、繁殖の最初のラウンドにおいて、ＧＲＮヘテロ接合性（ＧＲＮ ＨＥＴ）マウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩホモ接合性（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ）マウスと交配させて、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴ子孫を作製した。次に、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＥＴマウスをＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交配させて、この２回目のラウンドにおいてＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭ子孫を得た。繁殖の３回目及び最後のラウンドでは、ＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスをＧＲＮ ＨＥＴ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスと交配させて、この試験で使用する最終のＧＲＮ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ．ＫＩ ＨＯＭマウスを作製した。
２〜３ヶ月齢のＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスに、生理食塩水（溶媒）、融合体７、融合体１１または融合体１２のいずれかを、尾静脈を介して静脈内に５０ｍｇ／ｋｇ投与した（表８）。処置後２４時間、マウスをアベルチン（ａｖｅｒｔｉｎｅ）で鎮静させ、心臓穿刺を行い血漿分離用に全血を採取した。動物を、冷却した１×ＰＢＳで５〜８分間または肝臓から血液が除去されるまで、速度５ｍＬ／分で経心的に灌流した。１００ｍｇの肝臓の一部を採取し、脳の左半球を採取してドライアイス上で直ちに急速冷凍した。
（表８）試験デザイン／実験群
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組織試料を計量し、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及び１×ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を追加した、重量で１０倍の容積の細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ベータ−グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４及び１μｇ／ｍＬロイペプチン）でホモジナイズした。試料を、３ｍｍの金属ビーズを備えたＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒを使用して、２９Ｈｚで３分間を２回でホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、試料を卓上遠心分離機で４℃で２０分間、最大速度で回転させた。上清を新しいチューブに移し、Ｆｃ−ＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｆｃをキャプチャーし、ＰＧＲＮを検出するＥＬＩＳＡ）及びＦｃ−Ｆｃ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｆｃをキャプチャーし、Ｆｃを検出するＥＬＩＳＡ）を、それらの試料を使用して実施した。
図２１Ａ〜２１Ｃのデータは、ＧＲＮ ＫＯ／ｈＴｆＲ．ＫＩマウスの脳において、融合体１１及び融合体１２がＢＢＢを通過することができたことを示す。
（表６）ＣＨ３ドメインの改変
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（表７）追加のＣＨ３ドメインの改変
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本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示目的のためのみであり、それらを考慮した種々の修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用する配列アクセッション番号の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
略式の配列表
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Claims (159)

  1. （ａ）単一のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体と、
    （ｂ）（ａ）のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    厳密に１つのプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体を含む、前記タンパク質。
  2. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記プログラニュリンポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 前記プログラニュリンポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 前記第１のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 前記ポリペプチドリンカーが１〜５０アミノ酸長である、請求項５に記載のタンパク質。
  7. 前記ポリペプチドリンカーがフレキシブルポリペプチドリンカーである、請求項５または６に記載のタンパク質。
  8. 前記フレキシブルポリペプチドリンカーがグリシンリッチなリンカーである、請求項７に記載のタンパク質。
  9. 前記グリシンリッチなリンカーが、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）である、請求項８に記載のタンパク質。
  10. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、前記プログラニュリンポリペプチドに連結されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. （ａ）第１のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）第２のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結された第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合する、
    前記タンパク質。
  12. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 前記第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドの各々が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載のタンパク質。
  14. 前記第１及び第２のプログラニュリンポリペプチドの各々が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 前記第１のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって前記第１のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって前記第２のプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  16. 前記ポリペプチドリンカーが１〜５０アミノ酸長である、請求項１５に記載のタンパク質。
  17. 前記ポリペプチドリンカーがフレキシブルポリペプチドリンカーである、請求項１５または１６に記載のタンパク質。
  18. 前記フレキシブルポリペプチドリンカーがグリシンリッチなリンカーである、請求項１７に記載のタンパク質。
  19. 前記グリシンリッチなリンカーが、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）である、請求項１８に記載のタンパク質。
  20. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端が前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  21. 前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端が前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  22. 前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端が前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されており、前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端が前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  23. 前記第１のＦｃポリペプチドが改変Ｆｃポリペプチドであり、及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが改変Ｆｃポリペプチドである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  24. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがそれぞれ、ヘテロ二量体化を促進する改変を含有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  25. 前記Ｆｃ二量体がＦｃヘテロ二量体である、請求項２４に記載のタンパク質。
  26. ＥＵ付番に従って、前記Ｆｃポリペプチドのうちの一方がＴ３６６Ｗ置換を有し、他方の前記ＦｃポリペプチドがＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を有する、請求項２４または２５に記載のタンパク質。
  27. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有し、前記第２のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｗ置換を含有する、請求項２６に記載のタンパク質。
  28. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記プログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
    前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１のアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜１０及び請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  29. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記第１のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
    前記第２のＦｃポリペプチドが前記第２のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    請求項１１〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  30. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｗ置換を含有し、
    前記第２のＦｃポリペプチドが前記Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する、
    請求項２６に記載のタンパク質。
  31. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記プログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
    前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７の配列を含む、
    請求項１〜１０、請求項２３〜２６及び請求項３０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  32. 前記第１のＦｃポリペプチドが前記第１のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
    前記第２のＦｃポリペプチドが前記第２のプログラニュリンポリペプチドに連結されており、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
    請求項１１〜２６及び請求項３０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  33. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが天然ＦｃＲｎ結合部位を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  34. 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第２のＦｃポリペプチドがエフェクター機能を有しない、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  35. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  36. エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である、請求項３５に記載のタンパク質。
  37. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、天然Ｆｃ配列に対して血清半減期を延長するアミノ酸変化を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  38. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む、請求項３７に記載のタンパク質。
  39. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置４３４でのＳｅｒまたはＡｌａの置換を含む、請求項３７に記載のタンパク質。
  40. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドがトランスフェリン受容体に特異的に結合する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  41. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、前記トランスフェリン受容体のアピカルドメインに結合する、請求項４０に記載のタンパク質。
  42. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む、請求項４０または４１に記載のタンパク質。
  43. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、前記位置のうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つに置換を含む、請求項４２に記載のタンパク質。
  44. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２及び４１５を含む位置に１つ、２つ、３つ、または４つの置換をさらに含む、請求項４２または４３に記載のタンパク質。
  45. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  46. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが位置３８８にＴｒｐを含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  47. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが位置４２１に芳香族アミノ酸を含む、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  48. 位置４２１の前記芳香族アミノ酸がＴｒｐまたはＰｈｅである、請求項４７に記載のタンパク質。
  49. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載のタンパク質：
    位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
  50. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の位置を含む、請求項４９に記載のタンパク質：
    位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
  51. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、以下の１１個の位置を含む、請求項５０に記載のタンパク質：
    位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
  52. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有するＣＨ３ドメインを有する、請求項５０または５１に記載のタンパク質。
  53. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのＥＵインデックス位置３８０、３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、４１３、４１４、４１５、４１６、４２１、４２４及び４２６に対応する位置のうちの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の残基が欠失または置換されていない、請求項５２に記載のタンパク質。
  54. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５２または５３に記載のタンパク質。
  55. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のタンパク質。
  56. 前記タンパク質の前記トランスフェリン受容体への結合が、トランスフェリンの前記トランスフェリン受容体への結合を実質的に阻害しない、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  57. 前記第１のＦｃポリペプチド及び／または前記第２のＦｃポリペプチドが、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  58. 前記対応する野生型Ｆｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである、請求項５７に記載のタンパク質。
  59. 前記プログラニュリンポリペプチドの脳内への取り込みが、
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドの非存在下における前記プログラニュリンポリペプチドの前記取り込みと比較して、または
    前記第１のＦｃポリペプチド及び／もしくは前記第２のＦｃポリペプチドに対するトランスフェリン受容体結合をもたらす改変のない前記プログラニュリンポリペプチドの前記取り込みと比較して、
    少なくとも１０倍大きい、
    請求項１〜５８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  60. 前記第１のＦｃポリペプチドが、血液脳関門受容体に結合するようには改変されておらず、
    前記第２のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合するように改変されている、
    請求項１〜５９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  61. 前記第１のＦｃポリペプチドが、トランスフェリン受容体に特異的に結合するように改変されており、
    前記第２のＦｃポリペプチドが、血液脳関門受容体に結合するようには改変されていない、
    請求項１〜５９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  62. 前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体がソルチリンまたはプロサポシンに結合する、請求項１〜６１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  63. 前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体がソルチリンに結合する、請求項６２に記載のタンパク質。
  64. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    ＥＵ付番スキームに従って、前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含む、
    前記タンパク質。
  65. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１の配列を含む、請求項６４に記載のタンパク質。
  66. 前記第２のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項６４に記載のタンパク質。
  67. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３の配列を含む、請求項６６に記載のタンパク質。
  68. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    ＥＵ付番スキームに従って、前記第１のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む、
    前記タンパク質。
  69. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７の配列を含む、請求項６８に記載のタンパク質。
  70. 前記第１のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項６８に記載のタンパク質。
  71. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７の配列を含む、請求項７０に記載のタンパク質。
  72. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    前記第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、
    前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、
    前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されており、前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されている、
    前記タンパク質。
  73. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８の配列を含む、請求項７２に記載のタンパク質。
  74. 前記第２のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項７２に記載のタンパク質。
  75. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４の配列を含む、請求項７４に記載のタンパク質。
  76. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    前記第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、
    前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、
    前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されており、前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている、
    前記タンパク質。
  77. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０の配列を含む、請求項７６に記載のタンパク質。
  78. 前記第２のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項７６に記載のタンパク質。
  79. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含む、請求項７８に記載のタンパク質。
  80. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じて第１のプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）ポリペプチドリンカーを通じて第２のプログラニュリンポリペプチドに連結された第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    前記第１及び第２のＦｃポリペプチドがＦｃ二量体を形成し、
    前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含み、
    前記第１のプログラニュリンポリペプチドのＮ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第１のＦｃポリペプチドのＣ末端に連結されており、前記第２のプログラニュリンポリペプチドのＣ末端が、前記ポリペプチドリンカーを通じて前記第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている、
    前記タンパク質。
  81. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０の配列を含む、請求項８０に記載のタンパク質。
  82. 前記第２のＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項８０に記載のタンパク質。
  83. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４の配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５の配列を含む、請求項８２に記載のタンパク質。
  84. （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含むタンパク質であって、
    ＥＵ付番スキームに従って、前記第１のＦｃポリペプチドがホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃポリペプチドがノブ変異Ｔ３６６Ｗを含みかつＴｆＲ結合変異を含む、
    前記タンパク質。
  85. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１または２８６の配列を含む、請求項８４に記載のタンパク質。
  86. 前記第２のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む、請求項８４に記載のタンパク質。
  87. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２〜２８５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７〜２９１のいずれか１つの配列を含む、請求項８６に記載のタンパク質。
  88. 前記第１のＦｃポリペプチドが、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む、請求項８４に記載のタンパク質。
  89. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８６の配列を含む、請求項８８に記載のタンパク質。
  90. 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドの各々が、ＥＵ付番スキームに従って、Ｐ３２９Ｇ変異を伴うかもしくは伴わないＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異ならびに／またはＭ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ変異をさらに含む、請求項８４に記載のタンパク質。
  91. （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５〜２２４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７〜２３６のいずれか１つの配列を含み、（ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２〜２８５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８７〜２９１の配列を含む、請求項９０に記載のタンパク質。
  92. プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されたＦｃポリペプチドを含むポリペプチドであって、
    前記Ｆｃポリペプチドが、別のＦｃポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含有する、
    前記ポリペプチド。
  93. 前記プログラニュリンポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列に対して９０％超または少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載のポリペプチド。
  94. 前記プログラニュリンポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２のアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載のポリペプチド。
  95. 前記Ｆｃポリペプチドが、ペプチド結合によってまたはポリペプチドリンカーによって前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体に連結されている、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  96. 前記ポリペプチドリンカーが１〜５０アミノ酸長である、請求項９５に記載のポリペプチド。
  97. 前記ポリペプチドリンカーがフレキシブルポリペプチドリンカーである、請求項９５または９６に記載のポリペプチド。
  98. 前記フレキシブルポリペプチドリンカーがグリシンリッチなリンカーである、請求項９７に記載のポリペプチド。
  99. 前記グリシンリッチなリンカーが、Ｇ４Ｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）または（Ｇ４Ｓ）２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６）である、請求項９８に記載のポリペプチド。
  100. 前記ＦｃポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が、前記プログラニュリンポリペプチドに連結されている、請求項９２〜９９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  101. 前記Ｆｃポリペプチドが、ＥＵ付番に従うＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含有する、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  102. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０１に記載のポリペプチド。
  103. 前記ＦｃポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を含有する、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  104. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０３に記載のポリペプチド。
  105. 前記Ｆｃポリペプチドが、エフェクター機能を低下させる改変を含む、請求項９２〜１０４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  106. エフェクター機能を低下させる前記改変が、ＥＵ付番に従う位置２３４でのＡｌａ及び位置２３５でのＡｌａの置換である、請求項１０５に記載のポリペプチド。
  107. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載のポリペプチド。
  108. 前記Ｆｃポリペプチドが、天然Ｆｃ配列に対して血清半減期を延長するアミノ酸変化を含む、請求項９２〜１０７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  109. 前記アミノ酸変化が、ＥＵ付番に従う位置４２８でのＬｅｕ及び位置４３４でのＳｅｒの置換を含む、請求項１０８に記載のポリペプチド。
  110. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９〜２２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１〜２３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３〜２４６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５〜２５８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０９に記載のポリペプチド。
  111. 前記ＦｃポリペプチドがＴｆＲ結合変異をさらに含む、請求項９２〜１１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  112. 前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体がソルチリンまたはプロサポシンに結合する、請求項９２〜１１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  113. 前記プログラニュリンポリペプチドまたはその変異体がソルチリンに結合する、請求項１１２に記載のポリペプチド。
  114. プログラニュリン関連障害を処置する方法であって、
    請求項１〜９１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを、それを必要とする患者に投与する工程を含み、
    前記プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される、
    前記方法。
  115. プログラニュリン関連障害を有する患者においてプログラニュリンポリペプチドまたはその変異体の量を増加させる方法であって、
    請求項１〜９１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを前記患者に投与する工程を含み、
    前記プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される、
    前記方法。
  116. プログラニュリン関連障害を有する患者においてカテプシンＤ活性を低下させる方法であって、
    請求項１〜９１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを前記患者に投与する工程を含み、
    前記プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される、
    前記方法。
  117. プログラニュリン関連障害を有する患者においてリソソーム分解を増加させる方法であって、
    請求項１〜９１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載のポリペプチドを前記患者に投与する工程を含み、
    前記プログラニュリン関連障害が、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、ＴＤＰ−４３に関連する障害及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）からなる群から選択される、
    前記方法。
  118. 前記プログラニュリン関連障害が神経変性疾患である、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）、ニーマン・ピック病Ａ型（ＮＰＡ）、ニーマン・ピック病Ｂ型（ＮＰＢ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、Ｃ９ＯＲＦ７２関連筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ＦＴＤ、散発的ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、ゴーシェ病及びパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記神経変性疾患が前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記患者が、前記プログラニュリンポリペプチドをコードする遺伝子に変異を有する、請求項１１４〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 請求項１〜９１のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項９２〜１１３のいずれか１項に記載のポリペプチドと、
    薬学的に許容可能な担体と
    を含む、医薬組成物。
  123. 非ヒトトランスジェニック動物であって、
    （ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアピカルドメイン、および
    （ｉｉ）前記動物の天然ＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位
    を含むキメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸と、
    （ｂ）ＧＲＮ遺伝子のノックアウトと
    を含み、
    前記キメラＴｆＲポリペプチドが前記動物の脳内で発現する、
    前記動物。
  124. 前記アピカルドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９６のアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載の動物。
  125. 前記アピカルドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９のアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載の動物。
  126. 前記キメラＴｆＲポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の動物。
  127. 脳組織、肝組織、腎組織または肺組織中で、対応する同種の野生型動物の同じ組織におけるＴｆＲの発現レベルの２０％以内の前記キメラＴｆＲポリペプチドのレベルを発現する、請求項１２３〜１２６のいずれか１項に記載の動物。
  128. 対応する同種の野生型動物における赤血球数、ヘモグロビンのレベルまたはヘマトクリットのレベルの２０％以内の赤血球数、ヘモグロビンのレベルまたはヘマトクリットのレベルを含む、請求項１２３〜１２７のいずれか１項に記載の動物。
  129. 前記アピカルドメインをコードする前記核酸の配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１２３〜１２８のいずれか１項に記載の動物。
  130. 前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードする前記核酸に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である、請求項１２３〜１２９のいずれか１項に記載の動物。
  131. 前記ＧＲＮ遺伝子の前記ノックアウトが、前記ＧＲＮ遺伝子のエクソン１〜４の欠失を含む、請求項１２３〜１３０のいずれか１項に記載の動物。
  132. マウスまたはラットである、請求項１２３〜１３１のいずれか１項に記載の動物。
  133. （ａ）ＴｆＲに特異的に結合する改変Ｆｃポリペプチド二量体と、
    （ｂ）プログラニュリンポリペプチドと
    を含む、タンパク質。
  134. （ｃ）前記改変Ｆｃポリペプチド二量体を前記プログラニュリンポリペプチドに連結させるポリペプチドリンカー
    をさらに含む、請求項１３３に記載のタンパク質。
  135. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、前記ＴｆＲのアピカルドメインに特異的に結合する、請求項１３３または１３４に記載のタンパク質。
  136. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う３８４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４１３、４１６及び４２１からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む、請求項１３３〜１３５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  137. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、一方のＦｃポリペプチドの前記位置のうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つに置換を含む、請求項１３３〜１３６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  138. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う３８０、３９１、３９２及び４１５を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つの置換をさらに含む、請求項１３３〜１３７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  139. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、一方のＦｃポリペプチドのＥＵ付番に従う４１４、４２４及び４２６を含む位置に、１つ、２つまたは３つの置換をさらに含む、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  140. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、一方のＦｃポリペプチドの位置３８８にＴｒｐを含む、請求項１３３〜１３９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  141. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、以下から選択される少なくとも１つの位置を含む、請求項１３３〜１４０のいずれか１項に記載のタンパク質：
    一方のＦｃポリペプチドの位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
  142. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、以下から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の位置を含む、請求項１３３〜１４１のいずれか１項に記載のタンパク質：
    一方のＦｃポリペプチドの位置３８０がＴｒｐ、ＬｅｕまたはＧｌｕ；位置３８４がＴｙｒまたはＰｈｅ；位置３８６がＴｈｒ；位置３８７がＧｌｕ；位置３８８がＴｒｐ；位置３８９がＳｅｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＡｓｎ；位置３９０がＳｅｒまたはＡｓｎ；位置４１３がＴｈｒまたはＳｅｒ；位置４１５がＧｌｕまたはＳｅｒ；位置４１６がＧｌｕ；及び位置４２１がＰｈｅ。
  143. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４〜３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７〜２１０のいずれか１つのうちのアミノ酸１１１〜２１７に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有する第１のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインを含む、請求項１３３〜１４２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  144. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３３〜１４３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  145. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１３３〜１４４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  146. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比較して、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するＦｃポリペプチドを含む、請求項１３３〜１４５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  147. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体が、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の可変領域配列ならびにそれらの抗原結合部分を含まない、請求項１３３〜１４６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  148. 前記改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＣ末端が、前記プログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１３３〜１４７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  149. 前記ポリペプチドリンカーが、前記改変Ｆｃポリペプチド二量体中の前記ＦｃポリペプチドのＣ末端を前記プログラニュリンポリペプチドのＮ末端に連結させる、請求項１３３、１３４及び１４８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  150. 前記プログラニュリンポリペプチドのＣ末端が、前記改変Ｆｃポリペプチド二量体中のＦｃポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１３３〜１４７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  151. 前記ポリペプチドリンカーが、前記プログラニュリンポリペプチドのＣ末端を前記改変Ｆｃポリペプチド二量体中の前記ＦｃポリペプチドのＮ末端に連結させる、請求項１３３、１３４及び１５０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  152. 療法に使用するための、請求項１〜９１及び請求項１３３〜１５１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  153. 神経変性疾患の処置に使用するための、請求項１〜９１及び請求項１３３〜１５１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  154. アルツハイマー病、原発性年齢関連タウオパチー、レビー小体認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症、グアムの筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ型パーキンソニズム、グアドループ型ＰＳＰ、ハラーフォルデン・シュパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須・ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ニーマン・ピック病Ｃ型、淡蒼球橋黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維型老年認知症（ｔａｎｇｌｅ ｏｎｌｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）からなる群から選択される神経変性疾患の処置に使用するための、請求項１〜９１及び請求項１３３〜１５１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  155. 神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、
    （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含み、
    （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、
    （ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含む、
    前記タンパク質。
  156. 神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、
    （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含み、
    （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、
    （ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０の配列を含む、
    前記タンパク質。
  157. 神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、
    （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含み、
    （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５の配列を含み、
    （ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む、
    前記タンパク質。
  158. 神経変性疾患の処置に使用するためのタンパク質であって、
    （ａ）ポリペプチドリンカーを通じてプログラニュリンポリペプチドに連結された第１のＦｃポリペプチドと、
    （ｂ）前記第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドと
    を含み、
    （ａ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７の配列を含み、
    （ｂ）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９１の配列を含む、
    前記タンパク質。
  159. 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、原発性年齢関連タウオパチー、レビー小体認知症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症、グアムの筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、大脳皮質基底核変性症、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、球状グリア性タウオパチー、認知症を伴うグアドループ型パーキンソニズム、グアドループ型ＰＳＰ、ハラーフォルデン・シュパッツ病、スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、那須・ハコラ病、神経原線維変化優位型認知症、ニーマン・ピック病Ｃ型、淡蒼球橋黒質変性症、パーキンソン病、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、亜急性硬化性全脳炎、及び神経原線維型老年認知症からなる群から選択される、請求項１５５〜１５８のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
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