TW202144572A - 治療臉肩胛肱骨肌肉失養症之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示用於治療臉肩胛肱骨肌肉失養症之聚核酸分子、醫藥組合物及方法。

Description

治療臉肩胛肱骨肌肉失養症之組合物及方法
利用RNA誘導之基因沈默的基因抑制提供幾個層級之控制：轉錄失活、短小干擾RNA (siRNA)-誘導之mRNA降解及siRNA誘導之轉錄弱化。在一些情況下，RNA干擾(RNAi)在多個細胞分裂中提供持久的影響。因此，RNAi代表適用於藥物靶標驗證、基因功能分析、路徑分析及疾病治療的可用方法。參考文獻併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經具體且個別地指示以引用的方式併入一般。
在某些實施例中，本文揭示用於調節與肌肉萎縮(muscle atrophy)，尤其臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)相關之基因的聚核酸分子及醫藥組合物。在一些實施例中，本文亦描述用本文揭示之聚核酸分子或聚核酸分子結合物治療肌肉萎縮，尤其FSHD的方法。
在某些實施例中，本文揭示一種聚核酸分子結合物，其包含與聚核酸分子結合之抗體或其抗原結合片段，該聚核酸分子與DUX4 之目標序列雜交，且該聚核酸分子結合物介導針對DUX4 之RNA干擾。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含非人類抗體或其結合片段、人類抗體或其抗原結合片段、人類化抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、單株抗體或其抗原結合片段、單價Fab'、二價Fab2、單鏈可變片段(scFv)、雙功能抗體、微型抗體、奈米抗體、單域抗體(sdAb)或駱駝抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為抗運鐵蛋白受體抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且其中有義股及/或反義股包含至少一個2'修飾之核苷酸、至少一個經修飾之核苷酸間鍵或至少一個反向無鹼基部分。在某些實施例中，聚核苷酸與DUX4之目標序列之至少8個連續鹼基雜交。在某些實施例中，聚核苷酸為約8至約50個核苷酸長或約10至約30個核苷酸長。在某些實施例中，聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且該有義股包含與選自SEQ ID NO:1-70或SEQ ID NO:141-210之序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致。替代地及/或另外，聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且該反義股包含與選自SEQ ID NO:71-140或SEQ ID NO:211-280之序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致。
在某些實施例中，聚核苷酸包含至少一個2'修飾之核苷酸，且另外，該2'修飾之核苷酸包含2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之核苷酸；或包含鎖核酸(LNA)或乙烯核酸(ENA)；或包含其組合。在某些實施例中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵包含硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵。在某些實施例中，聚核酸分子包含3個或更多個選自以下之2'修飾之核苷酸：2'-O-甲基及2'-去氧-2'-氟。在某些實施例中，聚核酸分子包含5'端乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸，諸如美國公開案第2019/0192681號中描述之彼等。
在某些實施例中，2'修飾之核苷酸為2'-O-甲基修飾之核苷酸，且2'-O-甲基修飾之核苷酸處於有義股及/或反義股之5'端。在一些實施例中，2'-O-甲基修飾之核苷酸為嘌呤核苷酸，或2'-O-甲基修飾之核苷酸為吡啶核苷酸。在某些實施例中，有義及/或反義股在5'端包含至少兩個、三個、四個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸。
在某些實施例中，聚核酸分子結合物包含將目標細胞結合部分連接至聚核酸部分的連接子。在此類實施例中，連接子為C1-C6烷基連接子，或連接子為同型雙官能連接子或異型雙官能連接子，且包含順丁烯二醯亞胺基、二肽部分、苯甲酸基團或其衍生物。替代地及/或另外，連接子為可裂解或不可裂解連接子。在某些實施例中，聚核酸部分與目標細胞結合部分之間的比率為約1:1、2:1、3:1或4:1。
在某些實施例中，聚核酸部分介導針對人類DUX4 之RNA干擾且調節受試者之肌肉失養症的症狀。在一些實施例中，與未處理細胞中之DUX4基因之mRNA轉錄本的數量相比，RNA干擾包含減少DUX4基因之mRNA轉錄本之表現至少50%、至少60%或至少70%或更多。替代地及/或另外，RNA干擾包含影響細胞中選自包含以下或由以下組成之群的標記基因之表現：MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。在一些實施例中，影響標記基因之表現係減少標記基因之表現至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多。在一些實施例中，肌肉失養症為臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)。
在某些實施例中，聚核酸分子結合物包含式(I)：A-X-B之分子，其中A為抗體或其抗原結合片段，B為與DUX4 之目標序列雜交的聚核酸分子，X為與A之半胱胺酸殘基結合的鍵或非聚合連接子。
在某些實施例中，本文揭示一種醫藥組合物，其包含如本文所描述之聚核酸分子結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物經調配為奈米粒子調配物。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於非經腸、口服、鼻內、經頰、直腸、經皮或靜脈內、皮下或鞘內投與。
FSHD之症狀包括對骨骼肌之影響。受FSHD影響之骨骼肌包括眼睛及口腔周圍之肌肉、肩部之肌肉、上臂之肌肉、小腿之肌肉、腹部肌肉及髖部肌肉。在一些情況下，FSHD之症狀亦影響視覺及聽覺。在一些情況下，FSHD之症狀亦影響心臟或肺之功能。在一些情況下，FSHD之症狀包括肌無力、肌肉萎縮、肌肉失養、炎症痛、攣縮、脊柱側彎(scioliosis)、脊柱前彎(lordosis)、換氣不足、視網膜異常、暴露於角膜炎、輕度聽覺損失及EMG異常。如本文中所使用，術語肌肉萎縮係指廣泛範圍的肌肉相關之FSHD效應。
在某些實施例中，本文揭示一種用於治療有需要之受試者之肌肉失養症的方法，其藉由提供如本文所描述之聚核酸結合物且向該有需要之受試者投與聚核酸結合物以治療該肌肉失養症。聚核酸結合物使得人類DUX4 之mRNA轉錄本的數量減少。在一些實施例中，聚核酸部分介導針對人類DUX4之RNA干擾，調節受試者之肌肉萎縮。在某些實施例中，RNA干擾包含影響受肌肉失養症影響之細胞中選自包含以下或由以下組成之群的標記基因之表現：MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。較佳地，肌肉失養症為臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)。
在某些實施例中，本文揭示一種如本文所描述之聚核酸分子結合物或醫藥組合物的用途，其用於治療經診斷患有或疑似患有臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)之受試者。在某些實施例中，本文亦揭示一種如本文所描述之聚核酸分子結合物或醫藥組合物之用途，其用於製造供治療經診斷患有或疑似患有臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)之受試者用的藥劑。
在某些實施例中，本文揭示一種套組，其包含如本文所描述之聚核酸分子結合物或醫藥組合物。
交叉參考
本申請案主張2020年3月19日申請之美國臨時申請案第62/992,071號及2020年8月17日申請之美國臨時申請案第63/066,655號之權益，其中之各者以全文引用之方式併入本文中。
肌肉萎縮為肌肉質量損失或肌肉之進展性弱化及退化，諸如控制運動之骨骼或隨意肌、心肌及平滑肌。包括廢用、饑餓、癌症、糖尿病及腎衰竭之各種病理生理學狀況，或用糖皮質素治療會導致肌肉萎縮及強度損失。肌肉萎縮之表型效應係藉由各種分子事件誘導，該等分子事件包括抑制肌蛋白質合成、增強肌蛋白質之轉化、衛星細胞分化之異常調節及肌纖維類型之異常轉化。
FSHD係一種不存在經批准治療方法的罕見進展性及致殘性疾病。FSHD係肌肉失養症之最常見形式之一且同等地影響兩種性別，通常在青少年及年輕人中發病。FSHD之特徵在於最初使得臉部、肩部、手臂及軀幹之肌無力且進展至下肢及骨盆帶之肌無力。骨胳肌無力導致明顯的身體侷限性，包括會導致不能微笑或交流的臉部肌肉之進展性損失、難以使用手臂進行日常生活活動及難以下床，許多患者最終變成依賴於使用輪椅進行日常出行活動。大部分患有FSHD之患者亦報導經歷慢性疼痛、焦慮及抑鬱。
FSHD係由於骨骼肌中之基因DUX4異常表現導致DUX4蛋白質之不適當存在而引起的。DUX4本身為誘導表現其他基因之轉錄因子且其為那些引起肌肉病變的經不適當表現之下游基因。通常，DUX4驅動基因表現限於生殖系及早期幹細胞發育。在患有FSHD之患者中，骨骼肌中之DUX4蛋白質會調節其他基因產物，其中一些對於肌肉具有毒性。DUX4驅動基因表現異常之證據係區分受FSHD影響之肌肉組織與健康肌肉的主要分子特徵。FSHD中之DUX4表現異常之結果是肌肉死亡並被脂肪替代，從而導致骨骼肌無力及進展性失能。資料表明減少DUX4基因之表現及其下游轉錄程序可提供緩解疾病的治療途徑以在其根本原因上治療FSHD。
存在兩種方式，可使DUX4基因不沈默，或去抑制。在構成大致95%之FSHD患者的FSHD1中，存在導致染色體4之長臂端附近區中之DNA陣列(已知為D4Z4，其在該染色體之子端粒區中具有重複序列)縮短的突變。D4Z4區經異常縮短且含有1至10個重複序列而非正常的11至100個重複序列。此收縮會引起D4Z4區之低甲基化及DUX4之去抑制。患有FSHD2之患者並不具有有意義的D4Z4重複序列收縮，但在調節基因(已知為SMCHD1基因)中具有突變，該等突變通常有助於經由DNA甲基化抑制DUX4基因。當由於SMCHD1基因突變導致D4Z4區之低甲基化而失去彼抑制時，DUX4經不適當地表現，進而誘導疾病狀態。圖1展示FSHD病變之例示性圖式。
核酸(例如，RNAi)療法係具有高選擇性及特異性之靶向療法。然而，在一些情況下，核酸療法亦因較差的胞內吸收、有限的血液穩定性及非特異性的免疫刺激而受阻。為解決此等問題，研究了核酸組合物之各種修飾，諸如針對更佳穩定及/或較低毒性之新穎連接子、針對提高目標特異性及/或目標遞送之結合部分優化，及針對提高穩定性及/或降低脫靶效應之核酸聚合物修飾。
在一些實施例中，構成核酸組合物之不同組分的配置或順序進一步影響胞內吸收、穩定性、毒性、療效及/或非特異性免疫刺激。舉例而言，若核酸組分包括結合部分、聚合物及聚核酸分子(或聚核苷酸)，則結合部分、聚合物及/或聚核酸分子(或聚核苷酸)之順序或配置(例如，結合部分-聚核酸分子-聚合物、結合部分-聚合物-聚核酸分子或聚合物-結合部分-聚核酸分子)進一步影響胞內吸收、穩定性、毒性、療效及/或非特異性免疫刺激。
在一些實施例中，本文中所描述包括用於治療臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)，尤其與此相關之肌肉失養及/或肌肉萎縮的聚核酸分子及聚核酸分子結合物。在一些情況下，本文中所描述之聚核酸分子結合物增強胞內吸收、穩定性及/或療效。在一些情況下，聚核酸分子結合物包含與聚核酸分子結合之抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，聚核酸分子與DUX4 (較佳地，人類DUX4)之目標序列雜交。
本文中所描述之其他實施例包括治療FSHD之方法，該等方法包含向受試者投與本文中所描述之聚核酸分子或聚核酸分子結合物。聚核酸分子
在某些實施例中，聚核酸分子與雙重同源匣4 (Double homeobox 4；DUX4)基因之目標序列雜交。在一些情況下，本文中所描述之聚核酸分子與人類DUX4基因(DUX4 )之目標序列雜交且減少肌肉細胞中之DUX4 mRNA。
在一些實施例中，聚核酸分子包含與選自SEQ ID NO:1-70之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，聚核酸分子包含與選自SEQ ID NO:141-210之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，聚核酸分子包含與選自SEQ ID NO:71-140之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，聚核酸分子包含與選自SEQ ID NO:211-280之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，聚核酸分子包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。在一些情況下，第一聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO:1-70之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，第二聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO:71-140之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，聚核酸分子包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。在一些情況下，第一聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO:141-210之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，第二聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO：211-280之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股(例如，隨從股)及反義股(例如，引導股)。在一些情況下，有義股(例如，隨從股)包含與選自SEQ ID NO:1-70之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，反義股(例如，引導股)包含與選自SEQ ID NO:71-140之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股(例如，隨從股)及反義股(例如，引導股)。在一些情況下，有義股(例如，隨從股)包含與選自SEQ ID NO:141-210之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，反義股(例如，引導股)包含與選自SEQ ID NO:211-280之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些情況下，有義股包含與選自SEQ ID NO:1、2、3、6、14、36、52、56、61、62、63、65、66之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，反義股包含與選自SEQ ID NO:71、72、73、76、84、106、122、127、131、132、133、135、136之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，siRNA包含如表11中顯示之有義股及反義股。
在一些情況下，有義股包含與選自SEQ ID NO:141、142、143、146、176、192、196、201、202、203、205、206之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，反義股包含與選自SEQ ID NO:211、212、213、216、246、262、266、271、272、273、275、276之序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。在一些情況下，siRNA包含如表12中顯示之有義股及反義股。
在一些實施例中，本文中所描述之聚核酸分子包含RNA或DNA。在一些情況下，聚核酸分子包含RNA。在一些情況下，RNA包含短干擾RNA (siRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、雙股RNA (dsRNA)、轉移RNA (tRNA)、核糖體RNA (rRNA)或異質核RNA (hnRNA)。在一些情況下，RNA包含shRNA。在一些情況下，RNA包含miRNA。在一些情況下，RNA包含dsRNA。在一些情況下，RNA包含tRNA。在一些情況下，RNA包含rRNA。在一些情況下，RNA包含hnRNA。在一些情況下，寡核苷酸為二胺基磷酸酯N-𠰌啉基寡聚物(PMO)，其為在𠰌啉環之主鏈經二胺基磷酸酯鍵連接後所建構的短單股寡核苷酸類似物。在一些情況下，RNA包含siRNA。在一些情況下，聚核酸分子包含siRNA。
在一些實施例中，聚核酸分子為約8至約50個核苷酸長。在一些實施例中，聚核酸分子為約10至約50個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約10至約30個、約15至約30個、約18至約25個、約18至約24個、約19至約23個或約20至約22個核苷酸長。
在一些實施例中，聚核酸分子為約50個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約45個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約40個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約35個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約30個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約25個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約20個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約19個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約18個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約17個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約16個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約15個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約14個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約13個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約12個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約11個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約10個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子為約8個核苷酸長。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約8與約50個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約50個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約45個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約40個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約35個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約30個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約25個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約10與約20個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約15與約25個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約15與約30個核苷酸之間。在一些情況下，聚核酸分子之長度介於約12與約30個核苷酸之間。
在一些實施例中，聚核酸分子包含第一聚核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含第二聚核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。在一些情況下，第一聚核苷酸為有義股或隨從股。在一些情況下，第二聚核苷酸為反義股或引導股。
在一些實施例中，聚核酸分子為第一聚核苷酸。在一些實施例中，第一聚核苷酸為約8至約50個核苷酸長。在一些實施例中，第一聚核苷酸為約10至約50個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約10至約30個、約15至約30個、約18至約25個、約18至約24個、約19至約23個或約20至約22個核苷酸長。
在一些實施例中，第一聚核苷酸為約50個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約45個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約40個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約35個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約30個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約25個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約20個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約19個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約18個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約17個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約16個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約15個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約14個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約13個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約12個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約11個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約10個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸為約8個核苷酸長。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約8與約50個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約50個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約45個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約40個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約35個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約30個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約25個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約10與約20個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約15與約25個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約15與約30個核苷酸之間。在一些情況下，第一聚核苷酸之長度介於約12與約30個核苷酸之間。
在一些實施例中，聚核酸分子為第二聚核苷酸。在一些實施例中，第二聚核苷酸為約8至約50個長。在一些實施例中，第二聚核苷酸為約10至約50個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約10至約30個、約15至約30個、約18至約25個、約18至約24個、約19至約23個或約20至約22個核苷酸長。
在一些實施例中，第二聚核苷酸為約50個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約45個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約40個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約35個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約30個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約25個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約20個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約19個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約18個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約17個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約16個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約15個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約14個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約13個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約12個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約11個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約10個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸為約8個核苷酸長。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約8與約50個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約50個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約45個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約40個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約35個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約30個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約25個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約10與約20個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約15與約25個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約15與約30個核苷酸之間。在一些情況下，第二聚核苷酸之長度介於約12與約30個核苷酸之間。
在一些實施例中，聚核酸分子包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子進一步包含鈍端、突出端或其組合。在一些情況下，鈍端為5'鈍端、3'鈍端或兩者。在一些情況下，突出端為5'突出端、3'突出端或兩者。在一些情況下，突出端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含1、2、3、4、5或6個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含1、2、3或4個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含1個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含2個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含3個非鹼基配對核苷酸。在一些情況下，突出端包含4個非鹼基配對核苷酸。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且該反義股在3'端包括兩個非鹼基配對核苷酸作為突出，而有義股不具有突出端。視情況，在此類實施例中，非鹼基配對核苷酸具有TT、dTdT或UU之序列。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且該有義股在5'端具有一或多個與反義序列互補之核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子之序列與DUX4之目標序列至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%互補。在一些實施例中，DUX4 之目標序列為DUX4 中具有約10至50個鹼基對長、約15至50個鹼基對、15至40個鹼基對長、15至30個鹼基對長或15至25個鹼基對長序列的核酸序列，其中目標序列之第一核苷酸起始於編碼區中或5'或3'-未轉譯區(UTR)中之DUX4 mRNA轉錄本中之任一核苷酸。舉例而言，可選擇目標序列之第一核苷酸以使得其起始於DUX mRNA之編碼或非編碼區(5'或3'-未轉譯區)中之核酸位置(nal，自DUX mRNA之全長之5'端開始編號，例如，5'端第一核苷酸為nal.1) 1、nal 2、nal 3、nal 4、nal 5、nal 6、nal 7、nal 8、nal 9、nal 10、nal 11、nal 12、nal 13、nal 14、nal 15、nal 15、nal 16、nal 17或任何其他核酸位置。在某些實施例中，可選擇目標序列之第一核苷酸以使得其起始於以下內或在以下之間的一位置：nal 10- nal 15、nal 10- nal 20、nal 50- nal 60、nal 55- nal 65、nal 75- nal 85、nal 95- nal 105、nal 135- nal 145、nal 155- nal 165、nal 225- nal 235、nal 265- nal 275、nal 275- nal 285、nal 285- nal 295、nal 325- nal 335、nal 335- nal 345、nal 385- nal 395、nal 515- nal 525、nal 665- nal 675、nal 675- nal 685、nal 695- nal 705、nal 705- nal 715、nal 875- nal 885、nal 885- nal 895、nal 895- nal 905、nal 1035- nal 1045、nal 1045- nal 1055、nal 1125- nal 1135、nal 1135- nal 1145、nal 1145- nal 1155、nal 1155- nal 1165、nal 1125- nal 1135、nal 1155- nal 1165、nal 1225- nal 1235、nal 1235- nal 1245、nal 1275- nal 1285、nal 1285- nal 1295、nal 1305- nal 1315、nal 1125- nal 1135、nal 1155- nal 1165、nal 1225- nal 1235、nal 1235- nal 1245、nal 1275- nal 1285、nal 1285- nal 1295、nal 1305- nal 1315、nal 1315- nal 1325、nal 1335- nal 1345、nal 1345- nal 1355、nal 1525- nal 1535、nal 1535- nal 1545、nal 1605- nal 1615、nal 1615-c.1625、nal 1625- nal 1635。
在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少50%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少60%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少70%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少80%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少90%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少95%互補。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列至少99%互補。在一些情況下，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列100%互補。
在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列具有5個或更少個錯配。在一些實施例中，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列具有4個或更少個錯配。在一些情況下，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列具有3個或更少個錯配。在一些情況下，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列具有2個或更少個錯配。在一些情況下，聚核酸分子之序列與本文中所描述之目標序列具有1個或更少個錯配。
在一些實施例中，在可能結合於DUX4 之目標序列的所有聚核酸分子中選擇一組聚核酸分子以產生聚核酸分子庫。在某些實施例中，經由一或多個自候選物中消除不太適宜的聚核酸分子的步驟來電腦模擬實施此選擇程序。舉例而言，在一些實施例中，選擇程序包含消除單核苷酸多型性(SNP)及/或MEF ＜ -5之一或多種聚核酸分子的步驟。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除人類總轉錄本中具有0及1個錯配(MM)之一或多種聚核酸分子的步驟(以使得僅允許之命中為DUX、DUX5及DBET)。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除人類基因內區中具有0個MM之一或多種聚核酸分子的步驟(以使得僅允許之命中為DUX1、DUX5及DBET假基因)。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除與FLExDUX4 FSHD小鼠模型中使用之DUX4人類序列具有一個MM之一或多種聚核酸分子的步驟。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除預測存活率＜60之一或多種聚核酸分子的步驟。替代地及/或另外，此選擇程序包含正向攜載預測存活率≥60之一或多種聚核酸分子。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除與已知miRNA 1-1000之種子區具有一個匹配之一或多種聚核酸分子的步驟。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含消除%GC含量為75及更大之一或多種聚核酸分子的步驟。替代地及/或另外，在一些實施例中，選擇程序包含選擇8個或更少個具有2個MM之預測脫靶命中的步驟。在一些實施例中，對於區295-1132 (nal 295-1132)，允許具有2個MM的12個或更少個預測脫靶命中。
在一些實施例中，經由一或多個自候選物中消除不太適宜的聚核酸分子的連續步驟來電腦模擬實施選擇程序。舉例而言，在一些實施例中，選擇程序開始於收集候選聚核酸分子以產生庫。根據該庫，第一消除步驟包含消除單核苷酸多型性(SNP)及/或MEF ＜ -5之一或多種聚核酸分子。隨後，第二消除步驟包含消除人類總轉錄本中具有0及1個MM之一或多種聚核酸分子(以使得僅允許之命中為DUX、DUX5及DBET)。隨後，第三消除步驟包含消除人類基因內區中具有0個MM之一或多種聚核酸分子(以使得僅允許之命中為DUX1、DUX5及DBET假基因)。隨後，下一個消除步驟包含消除與FLExDUX4 FSHD小鼠模型中使用之DUX4人類序列具有一個MM的一或多種聚核酸分子。隨後，下一步驟係正向攜載預測存活率≥60之唯一或一或多種聚核酸分子。接著，消除步驟包含消除與已知miRNA 1-1000之種子區具有一個匹配的一或多種聚核酸分子。隨後，消除步驟繼續消除%GC含量為75及更大的一或多種聚核酸分子。隨後，最後的選擇程序包含8個或更少個具有2個MM之預測脫靶命中，除允許至多12個命中的區295-1132之外。
在一些實施例中，聚核酸分子與本文中所描述之目標序列雜交的特異性為聚核酸分子與目標序列具有95%、98%、99%、99.5%或100%序列互補性。在一些情況下，雜交為高度嚴格的雜交狀況。
在一些實施例中，聚核酸分子具有降低的脫靶效應。在一些情況下，「脫靶」或「脫靶效應」係指針對既定目標之聚核酸聚合物藉由直接地或間接地與另一mRNA序列、DNA序列或細胞蛋白質或其他部分相互作用而引起不希望效應的任何情況。在一些情況下，由於其他轉錄本與聚核酸分子之有義及/或反義股之間的部分同源性或互補性，當其他轉錄本同時降解時會發生「脫靶效應」。
在一些實施例中，聚核酸分子包含天然或合成或人工核苷酸類似物或鹼基。在一些情況下，聚核酸分子包含DNA、RNA及/或核苷酸類似物之組合。在一些情況下，合成或人工核苷酸類似物或鹼基包含核糖部分、磷酸酯部分、核苷部分中之一或多者或其組合處之修飾。
在一些實施例中，核苷酸類似物或人工核苷酸鹼基包含具有核糖部分之2'羥基處之修飾之核酸。在一些情況下，修飾包括H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R為烷基部分。例示性烷基部分包括但不限於鹵素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(一級胺、二級胺或三級胺)、醯胺、醚、酯、醇及氧。在一些情況下，烷基部分進一步包含修飾。在一些情況下，修飾包含偶氮基、酮基、醛基、羧基、硝基、亞硝基、腈基、雜環基(例如咪唑基、肼基或羥胺基)、異氰酸酯基或氰酸酯基，或含硫基團(例如亞碸基、碸基、硫基或雙硫鍵)。在一些情況下，烷基部分進一步包含雜取代。在一些情況下，雜環基之碳經氮、氧或硫取代。在一些情況下，雜環取代包括但不限於N-𠰌啉基、咪唑及N-吡咯啶基。
在一些情況下，2'羥基處之修飾為2'-O-甲基修飾或2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾。在一些情況下，2'-O-甲基修飾將甲基添加至核糖部分之2'羥基，然而2'O-甲氧基乙基修飾將甲氧基乙基添加至核糖部分之2'羥基。下文說明腺苷分子之2'-O-甲基修飾及尿苷之2'O-甲氧基乙基修飾之例示性化學結構。
Figure 02_image003
2'-O-甲基-腺苷         2'-O-甲氧基乙基尿苷
在一些情況下，2'羥基處之修飾為2'-O-胺丙基修飾，其中包含丙基連接子之經延伸之胺基將胺基結合至2'氧。在一些情況下，此修飾藉由每個糖引入一個來自胺基之正電荷來中和寡核苷酸分子之磷酸酯衍生之總體負電荷且由此改善歸因於其兩性離子特性之細胞吸收特性。下文說明2'-O-胺丙基核苷胺基磷酸酯之例示性化學結構。
Figure 02_image005
2'-O-胺丙基核苷胺基磷酸酯
在一些情況下，2'羥基處之修飾為經鎖定或橋聯之核糖修飾(例如經鎖定之核酸或LNA)，其中在2'碳處結合之氧分子藉由亞甲基連接至4'碳，因此形成2'-C,4'-C-氧基-亞甲基連接之雙環核糖核苷酸單體。下文說明LNA化學結構之例示性圖示。左側顯示之圖示突出顯示LNA單體之化學連接性。右側顯示之圖示突出顯示LNA單體之呋喃醣環之經鎖定之3'-內(3 E)構形。
Figure 02_image007
LNA (經鎖定之核酸)
在一些情況下，2'羥基處之修飾包含乙烯核酸(ENA)，諸如將糖構形鎖定成C3 '-內糖波狀構形之2'-4'-乙烯橋聯之核酸。ENA為經橋聯之核酸類別之亦包含LNA之經修飾核酸的部分。下文說明ENA及經橋聯之核酸之例示性化學結構。
Figure 02_image009
在一些實施例中，2'羥基處之額外修飾包括2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。
在一些實施例中，核苷酸類似物包含經修飾之鹼基，諸如(但不限於)5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞嘧啶核苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞啶、5-甲基尿苷；及5位置具有修飾之其他核苷酸，5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵胞苷、5-鹵尿苷、4-乙醯基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞啶、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基胺乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸(諸如7-去氮-腺苷)、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫基鹼基(諸如2-硫代尿苷及4-硫代尿苷及2-硫代胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷(queuosine)、古嘌苷(archaeosine)、萘基及經取代之萘基、任何O-烷基化及N-烷基化嘌呤及嘧啶(諸如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基及經修飾之苯基(諸如胺基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、用作G形夾核苷酸的經修飾之胞嘧啶、8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-經取代之尿嘧啶及胸嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基烷基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。經修飾之核苷酸亦包括關於糖部分經修飾之彼等核苷酸以及具有糖或其非核糖基之類似物之核苷酸。舉例而言，在一些情況下，糖部分為或基於甘露糖、阿拉伯糖、葡萄哌喃糖、半乳哌喃糖、4'-硫基核糖及其他糖、雜環或碳環。術語核苷酸亦包括在此項技術中稱為通用鹼基之核苷酸。作為舉例，通用鹼基包括但不限於3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素(nebularine)。
在一些實施例中，核苷酸類似物進一步包含N-𠰌啉基、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯、1',5'-無水己糖醇核酸(HNA)或其組合。N-𠰌啉基或二胺基磷酸酯N-𠰌啉基寡聚物(PMO)包含合成分子，該等合成分子之結構藉由偏離正常糖及磷酸酯結構而模擬天然核酸結構。在一些情況下，五員核糖環經含有四個碳、一個氮及一個氧之六員N-𠰌啉基環取代。在一些情況下，核糖單體係藉由二胺基磷酸酯基而非磷酸酯基連接。在該等情況下，主鏈更改移除使N-𠰌啉基中性分子能夠在不藉助於諸如由帶電寡核苷酸使用之細胞遞送劑之細胞遞送劑而穿過細胞膜的所有正電荷及負電荷。
Figure 02_image011
在一些實施例中，肽核酸(PNA)不含有糖環或磷酸酯鍵，且鹼基經連接且適當地藉由寡甘胺酸樣分子間隔，因此消除主鏈電荷。
Figure 02_image013
在一些實施例中，一或多種修飾視情況發生在核苷酸間鍵處。在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵包括但不限於硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、5'-伸烷基膦酸酯、5'-甲基膦酸酯、3'-伸烷基膦酸酯、三氟化硼、具有3'-5'鍵或2'-5'鍵之硼烷磷酸酯及硒磷酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯、氫膦酸酯鍵、膦酸烷酯、烷基硫代膦酸酯、芳基硫代膦酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯、3'-烷基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯、哌𠯤磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、酮、碸、磺醯胺、碳酸酯、胺基甲酸酯、亞甲基氫偶氮基、亞甲基二甲基氫偶氮基、甲縮醛、硫代甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、硫代醯胺、具有核乙醯基之鍵、胺乙基甘胺酸、矽基或矽氧烷鍵、具有或不具有例如1至10個碳雜原子之飽和或不飽和及/或經取代及/或含有雜原子之烷基或環烷基鍵、具有N-𠰌啉基結構之鍵、醯胺、聚醯胺(其中鹼基直接地或間接地連接至主鏈之氮雜氮)及其組合。硫代磷酸酯反義寡核苷酸(PS ASO)為包含硫代磷酸酯鍵之反義寡核苷酸。下文說明例示性PS ASO。
Figure 02_image015
在一些情況下，修飾為諸如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修飾之甲基或硫醇修飾。下文說明例示性硫醇膦酸酯核苷酸(左側)及甲基膦酸酯核苷酸(右側)。
Figure 02_image017
在一些情況下，經修飾之核苷酸包括但不限於說明為以下之2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯：
Figure 02_image019
在一些情況下，經修飾之核苷酸包括但不限於說明為以下之己糖醇核酸(或1',5'-無水己糖醇核酸(HNA))：
Figure 02_image021
在一些實施例中，一或多種修飾進一步視情況包括核糖部分、磷酸酯主鏈及核苷修飾或3'端或5'端處之核苷酸類似物修飾。舉例而言，3'端視情況包括3'陽離子基團，或藉由用3'-3'鍵使3'端處之核苷反轉。在另一替代方案中，3'端視情況與例如3' C5-胺基烷基dT之胺基烷基結合。在額外替代方案中，3'端視情況與無鹼基位點結合，例如與無嘌呤核酸或無嘧啶核酸位點結合。在一些情況下，5'端與例如5'-O-烷胺基取代基之胺基烷基結合。在一些情況下，5'端與無鹼基位點結合，例如與無嘌呤核酸或無嘧啶核酸位點結合。
在一些實施例中，聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多種。在一些情況下，聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些實施例中，人工核苷酸類似物包括經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-𠰌啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。在一些情況下，聚核酸分子包含選自以下之人工核苷酸類似物中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種：經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-𠰌啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。在一些情況下，聚核酸分子包含經2'-O-甲基修飾之核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些情況下，聚核酸分子包含經2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些情況下，聚核酸分子包含硫醇膦酸酯核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約5%至約100%修飾、約10%至約100%修飾、約20%至約100%修飾、約30%至約100%修飾、約40%至約100%修飾、約50%至約100%修飾、約60%至約100%修飾、約70%至約100%修飾、約80%至約100%修飾，及約90%至約100%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約90%修飾、約20%至約90%修飾、約30%至約90%修飾、約40%至約90%修飾、約50%至約90%修飾、約60%至約90%修飾、約70%至約90%修飾及約80%至約100%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約80%修飾、約20%至約80%修飾、約30%至約80%修飾、約40%至約80%修飾、約50%至約80%修飾、約60%至約80%修飾及約70%至約80%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約70%修飾、約20%至約70%修飾、約30%至約70%修飾、約40%至約70%修飾、約50%至約70%修飾及約60%至約70%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約60%修飾、約20%至約60%修飾、約30%至約60%修飾、約40%至約60%修飾及約50%至約60%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約50%修飾、約20%至約50%修飾、約30%至約50%修飾及約40%至約50%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約40%修飾、約20%至約40%修飾及約30%至約40%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約30%修飾及約20%至約30%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含約10%至約20%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含約15%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%或約40%至約60%修飾。
在其他情況下，聚核酸分子包含至少約15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含至少約1、約2、約3、約4約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22種或更多種修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22種或更多種經修飾之核苷酸。
在一些情況下，約5%至約100%之聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約5%之聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約10%之聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約15%之聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約20%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約25%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約30%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約35%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約40%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約45%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約50%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約55%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約60%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約65%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約70%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約75%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約80%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約85%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約90%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約95%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約96%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約97%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約98%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約99%之聚核酸分子包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約100%之聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，人工核苷酸類似物包括經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-𠰌啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。
在一些實施例中，聚核酸分子包含約1至約25種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約1種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約2種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約3種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約4種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約5種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約6種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約7種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約8種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約9種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約10種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約11種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約12種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約13種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約14種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約15種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約16種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約17種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約18種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約19種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約20種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約21種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約22種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約23種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約24種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約25種修飾，其中修飾包含本文中所描述之人工核苷酸類似物。
在一些實施例中，聚核酸分子係由兩個獨立聚核苷酸裝配，其中一個聚核苷酸包含聚核酸分子之有義股且第二個聚核苷酸包含聚核酸分子之反義股。在其他實施例中，有義股經由連接子分子連接至反義股，該連接子分子在一些情況下為聚核苷酸連接子或非核苷酸連接子。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股中之嘧啶核苷酸包含2'-O-甲基嘧啶核苷酸且有義股中之嘌呤核苷酸包含2'-去氧嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股中所存在之嘧啶核苷酸包含2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且其中有義股中所存在之嘌呤核苷酸包含2'-去氧嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中嘧啶核苷酸在存在於該反義股中時為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且嘌呤核苷酸在存在於該反義股中時為2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中嘧啶核苷酸在存在於該反義股中時為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且其中嘌呤核苷酸在存在於該反義股中時包含2'-去氧-嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且有義股及反義股中之至少一者具有複數個(例如，兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個等) 2'-O-甲基或2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，複數個2'-O-甲基或2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸中的至少兩者為連續核苷酸。在一些實施例中，連續的2'-O-甲基或2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸位於有義股及/或反義股之5'端處。在一些實施例中，連續的2'-O-甲基或2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸位於有義股及/或反義股之3'端處。在一些實施例中，聚核酸分子之有義股在其5'端及/或3'端，或兩者處包括至少四個、至少五個、至少六個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸。視情況，在此類實施例中，聚核酸分子之有義股在聚核苷酸之5'端處的至少四個、至少五個、至少六個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸的3'端處，或在聚核苷酸之3'端處的至少四個、至少五個、至少六個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸的5'端處包括至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸。亦視情況，此至少兩個、至少三個、至少四個2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸為連續的核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且有義股及反義股中之至少一者具有位於有義股及/或反義股之5'端處的2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股中之至少一者具有位於有義股及/或反義股之3'端處的2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，位於有義股及/或反義股之5'端處的2'-O-甲基修飾之核苷酸為嘌呤核苷酸。在一些實施例中，位於有義股及/或反義股之5'端處的2'-O-甲基修飾之核苷酸為吡啶核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且反義股在5'端處具有兩個或更多個連續的2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且反義股在3'端處具有兩個或更多個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且反義股具有至少2、3、4、5、6或7個連續的2'-O-甲基修飾之核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且有義股包含核酸5'-nsnsnnnnNfNfNfnnnnnnnnsnsa-3' (小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基)、Nf = 2'-F (氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾)。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且反義股包含核酸5'-UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu-3' (小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基)、Nf = 2'-F (氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾)。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，且有義股包含核酸5'-nsnsnnnnNfNfNfnnnnnnnnsnsa-3' (小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基)、Nf = 2'-F(氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾)且反義股包含核酸5'-UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu-3' (小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基)、Nf = 2'-F (氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾)。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包括有義股之5'端、3'端，或5'端及3'端兩者處之端帽部分。在其他實施例中，端帽部分為經反轉之去氧無鹼基部分。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含反義股之3'端處之甘油基修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包含一或多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子；且其中反義股包含約1至約10個或更多個，具體言之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包含約1至約25個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子；且其中反義股包含約1至約25個或更多個，具體言之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經約1至約25個或更多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股,其中反義股包含一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵)，及/或約一或多個(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子。在一些實施例中，反義股包含約1至約10個或更多個，具體言之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端，或3'端及5'端兩者處之端帽分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含約1至約25個或更多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之端帽分子；且其中反義股包含約1至約25個或更多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之端帽分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經約1至約5個(例如約1、2、3、4、5個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之端帽分子化學修飾。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子為在聚核酸分子之各股中具有約1至約25個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵之經化學修飾之短干擾核酸分子。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含反義股之3'端處之磷酸酯主鏈修飾。替代地及/或另外，聚核酸分子包含有義股及反義股，且有義股包含反義股之5'端處之磷酸酯主鏈修飾。在一些情況下，磷酸酯主鏈修飾為硫代磷酸酯。在一些實施例中，有義股或反義股具有三個經由兩個硫代磷酸酯主鏈偶合之連續核苷。
在另一實施例中，本文所描述之聚核酸分子包含2'-5'核苷酸間鍵。在一些情況下，2'-5'核苷酸間鍵係處於一或兩個序列股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處。在額外情況下，2'-5'核苷酸間鍵存在於一或兩個序列股內之各種其他位置處，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個，包括聚核酸分子之一或兩個股中之嘧啶核苷酸之每一核苷酸間鍵，包含2'-5'核苷酸間鍵；或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個，包括聚核酸分子之一或兩個股中之嘌呤核苷酸之每一核苷酸間鍵，包含2'-5'核苷酸間鍵。
在一些實施例中，聚核酸分子為介導細胞或經復原活體外系統中之RNAi活性之單股聚核酸分子，其中聚核酸分子包含與目標核酸序列具有互補性之單股聚核苷酸，且其中聚核酸中所存在之一或多個嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，或替代地，複數個嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸)，且其中聚核酸中所存在之任何嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸，或替代地，複數個嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸)；及視情況存在於反義序列之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之端帽修飾，聚核酸分子在聚核酸分子之3'端處視情況進一步包含約1至約4個(例如約1、2、3或4個)末端2'-去氧核苷酸，其中末端核苷酸進一步包含一或多個(例如1、2、3或4個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且其中聚核酸分子視情況進一步包含諸如5'端磷酸酯基的末端磷酸酯基。
在一些情況下，當與天然聚核酸分子相比時，本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多者對核酸酶具有抗性，該等核酸酶諸如核糖核酸酶(諸如RNA酶H)、去氧核糖核酸酶(諸如DNA酶)或核酸外切酶(諸如5'-3'核酸外切酶及3'-5'核酸外切酶)。在一些情況下，包含經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-𠰌啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合之人工核苷酸類似物對核酸酶具有抗性，該等核酸酶諸如核糖核酸酶(諸如RNA酶H)、去氧核糖核酸酶(諸如DNA酶)或核酸外切酶(諸如5'-3'核酸外切酶及3'-5'核酸外切酶)。在一些情況下，經2'-O-甲基修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-胺丙基修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-去氧修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-去氧-2'-氟修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-胺丙基(2'-O-AP)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經LNA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經ENA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經HNA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，N-𠰌啉基具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經PNA修飾之聚核酸分子對核酸酶具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經甲基膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經硫醇膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，包含2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，本文所描述之5'結合物抑制5'-3'核酸外切裂解。在一些情況下，本文所描述之3'結合物抑制3'-5'核酸外切裂解。
在一些實施例中，相對於等效天然聚核酸分子而言，本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多者對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。相對於等效天然聚核酸分子而言，包含經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-𠰌啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸或2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之人工核苷酸類似物中之一或多者對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-甲基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-胺丙基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-去氧修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-去氧-2'-氟修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-胺丙基(2'-O-AP)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經LNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經ENA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經PNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經HNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經N-𠰌啉基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經甲基膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經硫醇膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，包含2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，經增加之親和力係以較低Kd、較高熔化溫度(Tm)或其組合說明。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子為手性純(或立體純)聚核酸分子或包含單一對映異構體之聚核酸分子。在一些情況下，聚核酸分子包含L-核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含D-核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子組合物包含少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、、2%、1%或更少的其鏡對映異構體。在一些情況下，聚核酸分子組合物包含少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或更少的外消旋混合物。在一些情況下，聚核酸分子為以下中所描述之聚核酸分子：美國專利公開案第2014/194610號及第2015/211006號；及PCT公開案第WO2015107425號。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子經進一步修飾以包括適體結合部分。在一些情況下，適體結合部分為DNA適體結合部分。在一些情況下，適體結合部分為阿法默(Alphamer) (Centauri Therapeutics)，其包含辨識特定細胞表面目標之適體部分及呈現特定抗原決定基以連接至循環抗體之部分。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子經進一步修飾以包括如以下中所描述之適體結合部分：美國專利第8,604,184號、第8,591,910號及第7,850,975號。
在額外實施例中，本文所描述之聚核酸分子經修飾以提高其穩定性。在一些實施例中，聚核酸分子為RNA (例如siRNA)。在一些情況下，藉由上文所描述之修飾中之一或多者對聚核酸分子進行修飾以提高其穩定性。在一些情況下，聚核酸分子在2'羥基位置處經修飾，諸如藉由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾或藉由經鎖定或橋聯之核糖構形(例如LNA或ENA)進行。在一些情況下，聚核酸分子經2'-O-甲基及/或2'-O-甲氧基乙基核糖修飾。在一些情況下，聚核酸分子亦包括N-𠰌啉基、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及/或2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯以提高其穩定性。在一些情況下，聚核酸分子為手性純(或立體純)聚核酸分子。在一些情況下，手性純(或立體純)聚核酸分子經修飾以提高其穩定性。用以提高穩定性以進行遞送之針對RNA之合適修飾為熟習此項技術者顯而易知。
在一些情況下，聚核酸分子為包含自補有義區及反義區之雙股聚核苷酸分子，其中反義區包含與目標核酸分子或其部分及具有與該目標核酸序列或其部分對應之核苷酸序列之有義區中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在一些情況下，聚核酸分子係由兩個獨立聚核苷酸組裝，其中一股為有義股且另一股為反義股，其中反義及有義股為自補的(例如，各股包含與另一股中之核苷酸序列互補的核苷酸序列；諸如其中反義股及有義股形成雙螺旋或雙股結構，例如其中雙股區為約19、20、21、22、23或更多個鹼基對)；反義股包含與目標核酸分子中之核苷酸序列或其部分互補的核苷酸序列且有義股包含與目標核酸序列或其部分對應的核苷酸序列。替代地，聚核酸分子係單個寡核苷酸組裝，其中聚核酸分子之自補有義及反義區藉助於一或多個基於核酸或基於非核酸之連接子連接。
在一些情況下，聚核酸分子為具有自補有義區及反義區之具有雙螺旋體、不對稱雙螺旋體、髮夾或不對稱髮夾二級結構之聚核苷酸，其中反義區包含與獨立目標核酸分子或其部分及具有與該目標核酸序列或其部分對應之核苷酸序列之有義區中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在其他情況下，聚核酸分子為具有兩個或更多個環結構及包含自補有義區及反義區之主幹之圓形單股聚核苷酸，其中反義區包含與目標核酸分子或其部分及具有與該目標核酸序列或其部分對應之核苷酸序列之有義區中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且其中對圓形聚核苷酸進行活體內或活體外加工以生成能夠介導RNAi的活性聚核酸分子。在額外情況下，聚核酸分子亦包含具有與目標核酸分子或其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列的單股聚核苷酸(例如在該聚核酸分子不需要在聚核酸分子內存在與目標核酸序列或其部分對應之核苷酸序列的情況下)，其中單股聚核苷酸進一步包含末端磷酸酯基，諸如5'-磷酸酯(參見例如Martinez等人, 2002, Cell., 110, 563-574及Schwarz等人, 2002, Molecular Cell, 10, 537-568)或5',3'-二磷酸酯。
在一些情況下，不對稱髮夾為直鏈聚核酸分子，其包含反義區、包含核苷酸或非核苷酸之環部分，及包含比反義區少之核苷酸之有義區，在一定程度上有義區具有足夠的互補核苷酸以與反義區鹼基配對且形成具有環之雙螺旋體。舉例而言，不對稱髮夾聚核酸分子包含具有足以介導細胞或活體外系統中之RNAi之長度(例如約19至約22個核苷酸)之反義區及包含約4至約8個核苷酸之環區，以及具有約3至約18個與反義區互補之核苷酸之有義區。在一些情況下，不對稱髮夾聚核酸分子亦包含經化學修飾之5'端磷酸酯基。在額外情況下，不對稱髮夾聚核酸分子之環部分包含核苷酸、非核苷酸、連接子分子或結合物分子。
在一些實施例中，不對稱雙螺旋體為具有兩個包含有義區及反義區之獨立股之聚核酸分子，其中有義區包含比反義區少之核苷酸，在一定程度上有義區具有夠的互補核苷酸以與反義區鹼基配對且形成雙螺旋體。舉例而言，不對稱雙螺旋體聚核酸分子包含具有足以介導細胞或活體外系統中之RNAi之長度(例如約19至約22個核苷酸)之反義區及具有約3至約18個與反義區互補之核苷酸之有義區。
在一些情況下，通用鹼基係指用其間幾乎無區別之天然DNA/RNA鹼基中之各者形成鹼基對之核苷酸鹼基類似物。通用鹼基之非限制性實例包括如此項技術中已知之C-苯基、C-萘基及其他芳族衍生物、肌苷、唑甲醯胺及諸如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚及6-硝基吲哚之硝基唑衍生物(參見例如Loakes, 2001,Nucleic Acids Research , 29, 2437-2447)。聚核酸分子合成
在一些實施例中，本文中所描述之聚核酸分子係使用此項技術中已知之程序使用化學合成及/或酶促接合反應來構築。舉例而言，聚核酸分子係使用天然存在之核苷酸或經設計以提高分子之生物穩定性或提高形成於聚核酸分子與目標核酸之間的雙螺旋體之物理穩定性的經各種修飾之核苷酸來化學合成。例示性方法包括以下中描述之彼等：美國專利第5,142,047號；第5,185,444號；第5,889,136號；第6,008,400號；及第6,111,086號；PCT公開案第WO2009099942號；或歐洲公開案第1579015號。額外例示性方法包括以下中描述之彼等：Griffey等人, 「2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides」，J. Med. Chem .39 (26):5100-5109 (1997))；Obika等人. 「Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering」，Tetrahedron Letters 38 (50): 8735 (1997)；Koizumi, M. 「ENA oligonucleotides as therapeutics」，Current opinion in molecular therapeutics 8 (2): 144-149 (2006)；及Abramova等人, 「Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities」，Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726 (2009)。替代地，聚核酸分子係使用聚核酸分子已以反義方向次選殖至其中(亦即，由插入之聚核酸分子轉錄的RNA將為所關注之目標聚核酸分子的反義方向)之表現載體以生物學方式產生。
在一些實施例中，聚核酸分子係經由串聯合成方法合成，其中兩股經合成為由可裂解連接子間隔開的單個相鄰寡核苷酸片段或股，該可裂解連接子隨後經裂解以提供雜交且允許純化雙螺旋體之獨立片段或股。
在一些情況下，聚核酸分子亦由兩個不同的核酸股或片段組裝，其中一個片段包括分子之有義區且第二片段包括分子之反義區。
用於併入例如糖、鹼基及磷酸酯修飾的額外修飾方法包括：Eckstein等人，國際公開PCT第WO 92/07065號；Perrault等人，Nature ， 1990，344，565-568，Pieken等人，Science ， 1991, 253, 314-317，Usman及Cedergren，Trends in Biochem. Sci. ， 1992，17，334-339；Usman等人國際公開PCT第WO 93/15187號；Sproat，美國專利第5,334,711號及Beigelman等人，1995，J. Biol. Chem. ，270, 25702；Beigelman等人，國際PCT公開案第WO 97/26270號；Beigelman等人，美國專利第5,716,824號；Usman等人，美國專利第5,627,053號；Woolf等人，國際PCT公開案第WO 98/13526號；Thompson等人於1998年4月20日申請之美國序列號60/082,404；Karpeisky等人，1998,Tetrahedron Lett., 39, 1131；Earnshaw及Gait, 1998,Biopolymers (Nucleic Acid Sciences ), 48, 39-55；Verma及Eckstein, 1998,Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134；及Burlina等人，1997,Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010。該等公開案描述用以確定在不調節催化的情況下將糖、鹼基及/或磷酸酯修飾及類似者併入核酸分子中之位置的一般方法及策略。
在一些情況下，雖然用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或5'-甲基膦酸酯鍵對聚核酸分子核苷酸間鍵進行化學修飾會提高穩定性，但過量的修飾有時會導致毒性或減小活性。因此，當設計核酸分子時，此等核苷酸間鍵之量在一些情況下經減至最少。在此類情況下，此等鍵之濃度減小會降低此等分子之毒性，提高其功效且增高特異性。聚核酸分子結合物
在一些實施例中，聚核酸分子(B)進一步結合至多肽(A)以遞送至所關注之位點。在一些情況下，至少一個多肽A結合至至少一個B。在一些情況下，至少一個多肽A結合至至少一個B以形成A-B結合物。在一些實施例中，至少一個A結合至B之5'端、B之3'端、B上之內部位點或其任何組合。在一些情況下，至少一個多肽A結合至至少兩個B。在一些情況下，至少一個多肽A結合至至少2、3、4、5、6、7、8個或更多個B。
在一些情況下，聚核酸分子結合至多肽(A)及視情況選用之聚合部分(C)。在一些實施例中，至少一個多肽A結合於至少一個B之一個末端處，而至少一個C結合於該至少一個B之相反末端處以形成A-B-C結合物。在一些情況下，至少一個多肽A結合於至少一個B之一個末端處，而至少一個C結合於該至少一個B上之內部位點處。在一些情況下，至少一個多肽A直接結合至至少一個C。在一些情況下，至少一個B經由至少一個C間接地結合至至少一個多肽A以形成A-C-B結合物。
在一些情況下，至少一個B及/或至少一個C及視情況選用之至少一個D結合至至少一個多肽A。在一些情況下，至少一個B在末端(例如，5'端或3'端)處結合至至少一個多肽A或經由內部位點結合至至少一個多肽A。在一些情況下，至少一個C直接結合至至少一個多肽A或經由至少一個B間接結合至至少一個多肽A。在經由至少一個B間接結合時，至少一個C結合於與至少一個多肽A於B上之相同末端處，與至少一個多肽A相反之末端處，或獨立地結合於內部位點。在一些情況下，至少一個額外多肽A進一步結合至至少一個多肽A、結合至B或結合至C。在額外情況下，至少一個D視情況直接地或間接地結合至至少一個多肽A、至少一個B或至少一個C。在直接地結合至至少一個多肽A時，至少一個D另外視情況結合至至少一個B以形成A-D-B結合物或視情況結合至至少一個B及至少一個C以形成A-D-B-C結合物。在一些情況下，至少一個D直接地結合至至少一個多肽A且間接地結合至至少一個B及至少一個C以形成D-A-B-C結合物。在間接地結合至至少一個多肽A時，至少一個D另外視情況結合至至少一個B以形成A-B-D結合物或視情況結合至至少一個B及至少一個C以形成A-B-D-C結合物。在一些情況下，至少一個額外D進一步結合至至少一個多肽A、結合至B或結合至C。結合部分
在一些實施例中，結合部分A為多肽。在一些情況下，該多肽為抗體或其片段。在一些情況下，該片段為結合片段。在一些情況下，抗體或其抗原結合片段包含人類化抗體或其抗原結合片段、鼠類抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、單株抗體或其抗原結合片段、具有輕鏈域及重鏈域之結合片段、具有兩個輕鏈域及兩個重鏈域之結合片段、具有兩個或更多個輕鏈域及重鏈域之結合片段、單價Fab'、二價Fab2 、F(ab)'3 片段、單鏈可變片段(scFv)、雙scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微型抗體、奈米抗體、三功能抗體、四功能抗體、二硫鍵穩定化Fv蛋白(dsFv)、單域抗體(sdAb)、Ig NAR、駱駝抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或其結合片段，或其經化學修飾之衍生物。
在一些實施例中，結合部分A為雙特異性抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，雙特異性抗體為三功能抗體或雙特異性微型抗體。在一些情況下，雙特異性抗體為三功能抗體。在一些情況下，三功能抗體為包含用於兩種不同抗原之結合位點之全長單株抗體。
在一些情況下，雙特異性抗體為雙特異性微型抗體。在一些情況下，雙特異性微型抗體包含二價Fab2 、F(ab)'3 片段、雙scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微型抗體、三功能抗體、四功能抗體或雙特異性T細胞接合子(BiTE)。在一些實施例中，雙特異性T細胞接合子為含有兩個單鏈可變片段(scFv)之融合蛋白，其中兩個scFv靶向兩種不同抗原之抗原決定基。
在一些實施例中，結合部分A為雙特異性微型抗體。在一些情況下，A為雙特異性Fab2 。在一些情況下，A為雙特異性F(ab)'3 片段。在一些情況下，A為雙特異性雙scFv。在一些情況下，A為雙特異性(scFv)2 。在一些實施例中，A為雙特異性雙功能抗體。在一些實施例中，A為雙特異性微型抗體。在一些實施例中，A為雙特異性三功能抗體。在其他實施例中，A為雙特異性四功能抗體。在其他實施例中，A為雙特異性T細胞接合子(BiTE)。
在一些實施例中，結合部分A為三特異性抗體。在一些情況下，三特異性抗體包含F(ab)'3 片段或三功能抗體。在一些情況下，A為三特異性F(ab)'3 片段。在一些情況下，A為三功能抗體。在一些實施例中，A為如Dimas等人, 「Development of a trispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target three different antigens on tumor cells」, Mol. Pharmaceutics, 12(9): 3490-3501 (2015)中所描述之三特異性抗體。
在一些實施例中，結合部分A為識別細胞表面蛋白之抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，結合部分A為識別肌肉細胞上之細胞表面蛋白的抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，結合部分A為識別骨骼肌細胞上之細胞表面蛋白的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，例示性抗體包括(但不限於)抗肌凝蛋白抗體、抗運鐵蛋白受體抗體及識別肌肉特異性激酶(MuSK)之抗體。在一些情況下，抗體為抗運鐵蛋白受體(抗CD71)抗體。
在一些實施例中，抗體為抗運鐵蛋白受體(抗CD71)抗體，該抗運鐵蛋白抗體特異性結合於運鐵蛋白受體(TfR)，較佳地特異性結合於運鐵蛋白受體1 (TfR1)，或更佳地特異性結合於人類運鐵蛋白受體1 (TfR1) (或人類CD71)。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含可變重鏈(VH)區及可變輕鏈(VL)區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列。
在一些實施例中，抗運鐵蛋白受體抗體之VH區包含選自表1之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列。表 1
名稱 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
13E4_VH1 YTFTNYWMH 281 EINPINGRSNYAQKFQG 282 GTRAMHY 283
13E4_VH2* YTFTNYWMH 281 EINPINGRSNYAEKFQG 284 GTRAMHY 283
13E4_VH3 YTFTNYWMH 281 EINPIQGRSNYAEKFQG 285 GTRAMHY 283
*13E4_VH2與抗運鐵蛋白受體抗體13E4_VH4共用相同的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列
在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 282、284或285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體之VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X3 係選自N或S，X4 係選自A或G，X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體之VL區包含選自表2之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。表 2
名稱 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
13E4_VL1* RTSENIYNNLA 286 AATNLAD 287 QHFWGTPLT 288
13E4_VL3 RTSENIYNNLA 286 AATNLAE 289 QHFWGTPLTF 290
13E4_VL4 RTSENIYSNLA 291 AGTNLAD 292 QHFWGTPLTF 290
*13E4_VL1與抗轉鐵蛋白受體抗體13E4_VL2共用相同的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列
在一些情況下，VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、包含SEQ ID NO: 287、289或292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X3 係選自N或S。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X4 係選自A或G，且X5 係選自D或E。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 287、289或292及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 287之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288之LCDR3序列。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 289之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，VL區含：包含SEQ ID NO: 291之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X3 係選自N或S，X4 係選自A或G，X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、包含SEQ ID NO: 287、289或292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X3 係選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X4 係選自A或G，且X5 係選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 287、289或292及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 287之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO:286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 289之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG，其中X1 係選自N或Q且X2 係選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO:291之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、包含SEQ ID NO: 287、289或292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X3 係選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X4 係選自A或G，且X5 係選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 287、289或292及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在，且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 287之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 282之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 291之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、包含SEQ ID NO: 287、289或292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X3 係選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X4 係選自A或G，且X5 係選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 287、289或292及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X6 存在或不存在且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 287之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 289之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 284之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 291之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA、包含SEQ ID NO: 287、289或29之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X3 係選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 及包含SEQ ID NO: 288或290之LCDR3序列，其中X4 係選自A或G，且X5 係選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286或291之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 287、289或292及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X6 存在或不存在且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 ，其中X5 係選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則其為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 287之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 288之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 286之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 289之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 281之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 285之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 283之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 291之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 292之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 290之LCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區之序列包含與SEQ ID NO: 293-296之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且VL區之序列包含與SEQ ID NO: 298-301之約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中，VH區包含選自SEQ ID NO: 293-296 (表3)之序列，且VL區包含選自SEQ ID NO: 298-301 (表4)之序列。表3及表4中之加下劃線區域指代各別CDR1、CDR2或CDR3序列。表 3
名稱 VH 序列 SEQ ID NO:
13E4_VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 293
13E4_VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 294
13E4_VH3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 295
13E4_VH4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 296
13E4_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMH WVKQRPGQGLEWIGEINPINGRSNYGERFKT KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAMHY WGQGTSVTVSS 297
表 4
名稱 VL 序列 SEQ ID NO:
13E4_VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKSPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIK 298
13E4_VL2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIK 299
13E4_VL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAE GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIK 300
13E4_VL4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSNLA WYQQKPGKAPKLLIYAGTNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFANYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIK 301
13E4_VL DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRTSENIYNNLA WYQQKQGKSPQLLVYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGNYYCQHFWGTPLT FGAGTKLELK 302
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含如表5中所說明之VH區及VL區。表 5
   13E4_VH1 (SEQ ID NO: 13) 13E4_VH2 (SEQ ID NO: 14) 13E4_VH3 (SEQ ID NO: 15) 13E4_VH4 (SEQ ID NO: 16)
13E4_VL1 (SEQ ID NO: 298) SEQ ID NO: 293 + SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 294 + SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 295 + SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 296 + SEQ ID NO: 298
13E4_VL2 (SEQ ID NO: 299) SEQ ID NO: 293 + SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 294 + SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 295 + SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 296 + SEQ ID NO: 299
13E4_VL3 (SEQ ID NO: 300) SEQ ID NO: 293 + SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 294 + SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 295 + SEQ ID NO: 300 SEQ ID NO: 296 + SEQ ID NO: 300
13E4_VL4 (SEQ ID NO: 301) SEQ ID NO: 293 + SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO: 294 + SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO: 295 + SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO: 296 + SEQ ID NO: 301
在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG構架、IgA構架、IgE構架或IgM構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG構架(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG1構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2 (例如IgG2a或IgG2b)構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2a構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2b構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG3構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG4構架。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含例如CH1域、CH2域、CH3域、鉸鏈區或其組合之構架區中之一或多種突變。在一些情況下，一或多種突變使抗體穩定且/或延長半衰期。在一些情況下，一或多種突變調節Fc受體相互作用，減弱或消除諸如FcyR、抗體依賴型細胞介導之細胞毒性(ADCC)或補體依賴型細胞毒性(CDC)之Fc效應功能。在額外情況下，一或多種突變調節糖基化。
在一些實施例中，一或多種突變位於Fc區中。在一些情況下，Fc區包含殘基位置L234、L235處之突變或其組合。在一些情況下，突變包含L234及L235。在一些情況下，突變包含L234A及L235A。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含殘基位置L234、L235、D265、N297、K322、L328或P329處之突變或其組合。在一些情況下，突變包含L234及L235與殘基位置K322、L328或P329處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及K322處之突變。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及L328處之突變。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及P329處之突變。在一些情況下，Fc區包含D265及N297處之突變。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G或其組合。在一些情況下，Fc區包含L234A及L235A與K322G、L328R或P329G之組合。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及K322G。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及L328R。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及P329G。在一些情況下，Fc區包含D265A及N297G。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含殘基位置L235、L236、D265、N297、K322、L328或P329處之突變或該等突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L235及L236處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235及L236處之突變與殘基位置K322、L328或P329處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及K322處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及L328處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及P329處之突變。在一些情況下，Fc區包含D265及N297處之突變。在一些情況下，殘基位置係參照IgG2b。
在一些實施例中，Fc區包含L235A、L236A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G或其組合。在一些情況下，Fc區包含L235A及L236A。在一些情況下，Fc區包含L235A及L236A與K322G、L328R或P329G之組合。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及K322G。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及L328R。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及P329G。在一些情況下，Fc區包含D265A及N297G。在一些情況下，殘基位置係參照IgG2b。
在一些實施例中，Fc區包含殘基位置L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328處之突變，其中殘基對應於SEQ ID NO: 303之位置233、234、264、296、321、327及328。在一些情況下，Fc區包含L233及L234處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233及L234處之突變與殘基位置K321、L327或P328處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及K321處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及L327處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及K321處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及P328處之突變。在一些情況下，Fc區包含D264及N296處之突變。在一些情況下，涵蓋與IgG1、IgG2、IgG3或IgG4構架中之殘基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328等效之位置。在一些情況下，亦涵蓋針對與IgG1、IgG2或IgG4構架中之SEQ ID NO: 303之殘基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328對應之殘基的突變。
在一些實施例中，Fc區包含L233A、L234A、D264A、N296G、K321G、L327R或P328G，其中殘基對應於SEQ ID NO: 303之位置233、234、264、296、321、327及328。在一些情況下，Fc區包含L233A及L234A。在一些情況下，Fc區包含L233A及L234A與K321G、L327R或P328G之組合。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及K321G。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及L327R。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及K321G。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及P328G。在一些情況下，Fc區包含D264A及N296G。
在一些實施例中，人類IgG恆定區例如經胺基酸修飾進行修飾以更改抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，該胺基酸修飾描述於以下中：Natsume等人, 2008Cancer Res ,68 (10): 3863-72；Idusogie等人, 2001J Immunol ,166 (4): 2571-5；Moore等人, 2010mAbs ,2 (2): 181-189；Lazar等人, 2006PNAS ,103 (11): 4005-4010, Shields等人, 2001JBC ,276 ( 9): 6591- 6604；Stavenhagen等人, 2007Cancer Res ,67 (18): 8882-8890；Stavenhagen等人, 2008Advan. Enzyme Regul. ,48 : 152-164；Alegre等人, 1992J Immunol ,148 : 3461-3468；綜述於Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs,25 (1): 1-11中。
在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體為包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)之全長抗體。在一些情況下，重鏈(HC)包含選自表6之序列。在一些情況下，輕鏈(LC)包含選自表7之序列。帶下劃線的區表示各別CDR。表 6
名稱 HC 序列 SEQ ID NO:
13E4_VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 303
13E4_VH1_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 304
13E4_VH1_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 305
13E4_VH1_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 306
13E4_VH1_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 307
13E4_VH1_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 308
13E4_VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 309
13E4_VH2_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 310
13E4_VH2_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 311
13E4_VH2_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 312
13E4_VH2_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 313
13E4_VH2_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 314
13E4_VH3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 315
13E4_VH3_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 316
13E4_VH3_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 317
13E4_VH3_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 318
13E4_VH3_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 319
13E4_VH3_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMH YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 320
13E4_VH4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 321
13E4_VH4_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 322
13E4_VH4_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 323
13E4_VH4_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 324
13E4_VH4_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 325
13E4_VH4_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 326
表 7
名稱 LC 序列 SEQ ID NO:
13E4_VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKSPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 327
13E4_VL2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 328
13E4_VL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAE GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 329
13E4_VL4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSNLA WYQQKPGKAPKLLIYAGTNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFANYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 330
在一些實施例中，與參考抗轉鐵蛋白受體抗體相比，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體具有經改善之血清半衰期。在一些情況下，與參考抗轉鐵蛋白受體抗體相比，經改善之血清半衰期為至少30分鐘、1小時、1.5小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更長時間。
在一些實施例中，結合部分A非特異性地結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由離胺酸殘基或半胱胺酸殘基以非位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由離胺酸殘基(例如，結合部分A中存在之離胺酸殘基)以非位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由半胱胺酸殘基(例如，結合部分A中存在之半胱胺酸殘基)以非位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。
在一些實施例中，結合部分A以位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、在5'端處、在3'端處、非天然胺基酸或酶修飾之殘基或酶催化之殘基經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由離胺酸殘基(例如，結合部分A中存在之離胺酸殘基)經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由半胱胺酸殘基(例如，結合部分A中存在之半胱胺酸殘基)經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A在5'端處經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A在3'端處經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由非天然胺基酸經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。在一些情況下，結合部分A經由酶修飾之殘基或酶催化之殘基經由位點特異性方式結合至聚核酸分子(B)。
在一些實施例中，一或多個聚核酸分子(B)結合至結合部分A。在一些情況下，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個或更多個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約1個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約2個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約3個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約4個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約5個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約6個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約7個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約8個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約9個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約10個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約11個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約12個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約13個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約14個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約15個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，約16個聚核酸分子結合至一個結合部分A。在一些情況下，一或多個聚核酸分子為相同的。在其他情況下一或多個聚核酸分子為不同的。
在一些實施例中，與結合部分A結合之聚核酸分子(B)之數目形成一比率。在一些情況下，該比率稱為DAR (藥物比抗體)比率，其中如本文中所提及之藥物為聚核酸分子(B)。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約1或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約2或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約3或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約4或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約5或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約6或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約7或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約8或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約9或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約10或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約11或更大。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約12或更大。
在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約1。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約2。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約3。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約4。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約5。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約6。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約7。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約8。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約9。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約10。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約11。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約12。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約13。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約14。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約15。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為約16。
在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為1。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為2。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為4。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為6。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為8。在一些情況下，聚核酸分子(B)比結合部分A之DAR比率為12。
在一些情況下，與包含聚核酸分子(B)而不含結合部分A之結合物相比，包含聚核酸分子(B)及結合部分A之結合物具有改良之活性。在一些情況下，經改良之活性使得增強生物學上相關之功能，例如改良穩定性、親和力、結合、功能活性及治療或預防疾病狀態之療效。在一些情況下，疾病狀態為基因之一或多個突變外顯子的結果。在一些情況下，與包含聚核酸分子(B)而不含結合部分A之結合物相比，包含聚核酸分子(B)及結合部分A之結合物使得一或多個突變外顯子之外顯子跳躍增加。在一些情況下，與包含聚核酸分子(B)而不含結合部分A之結合物相比，包含聚核酸分子(B)及結合部分A之結合物中的外顯子跳躍增加至少或約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或大於95%。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段係單獨或以組合形式使用此項技術中已知之習知技術，例如藉由使用胺基酸缺失、插入、取代、添加及/或藉由重組及/或此項技術中已知之任何其他修飾(例如，轉譯後及化學修飾，諸如糖基化及磷酸化)來進一步修飾。在一些情況下，修飾進一步包含用於調節與Fc受體之相互作用的修飾。在一些情況下，一或多種修飾包括例如國際公開案第WO97/34631號中描述之彼等修飾，該公開案揭示了參與Fc域與FcRn受體之間的相互作用的胺基酸殘基。用於將此類修飾引入抗體或抗原結合片段之胺基酸序列基礎之核酸序列中的方法為熟習此項技術者所熟知的。
在一些情況下，抗原結合片段進一步涵蓋其衍生物且包括含有至少一個CDR之多肽序列。
在一些情況下，如本文中所使用之術語「單鏈」意謂雙特異性單鏈構築體之第一及第二域經共價連接，較佳地呈可由單核酸分子編碼之共線胺基酸序列形式。
在一些情況下，雙特異性單鏈抗體構築體係關於包含兩個抗體衍生之結合域的構築體。在此類實施例中，雙特異性單鏈抗體構築體為串聯雙scFv或雙功能抗體。在一些情況下，scFv含有藉由連接肽連接之VH及VL域。在一些情況下，連接子之長度及序列足以確保第一及第二域各自可彼此獨立地保持其不同的結合特異性。
在一些實施例中，如本文中所使用之與…結合或與…相互作用定義了至少兩個抗原相互作用位點彼此之結合/相互作用。在一些情況下，抗原相互作用位點限定了多肽之模體，該多肽之模體顯示了與特異性抗原或抗原之特異性基團進行特異性相互作用的能力。在一些情況下，結合/相互作用亦理解為限定特異性識別。在此類情況下，特異性識別係指抗體或其抗原結合片段能夠與各目標分子之至少兩個胺基酸特異性地相互作用及/或結合。舉例而言，特異性識別係關於抗體分子之特異性，或其區別目標分子之特定區的能力。在額外情況下，抗原相互作用位點與其特異性抗原之特定相互作用會引起信號之起始，例如歸因於誘導抗原之構形變化、抗原之低聚合等。在其他實施例中，結合係藉由「鑰鎖原理(key-lock-principle)」之特異性來舉例說明的。因此，在一些情況下，抗原相互作用位點與抗原之胺基酸序列中的特異性模體根據其一級、二級或三級結構以及該結構之二級修飾產物彼此結合。在此類情況下，抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用亦使該位點與抗原簡單結合。
在一些情況下，特異性相互作用進一步係指抗體或抗原結合片段之降低的交叉反應或降低的脫靶效應。舉例而言，結合至所關注之多肽/蛋白質但並不或基本上並不結合至其他多肽中之任一者的抗體或抗原結合片段被視為對所關注之多肽/蛋白質具有特異性。抗原相互作用位點與特異性抗原之特定相互作用之實例包含配位體針對其受體之特異性，例如抗原決定子(抗原決定基)與抗體之抗原結合位點之相互作用。額外結合部分
在一些實施例中，結合部分為血漿蛋白質。在一些情況下，血漿蛋白質包含白蛋白。在一些情況下，結合部分A為白蛋白。在一些情況下，白蛋白藉由本文中所描述之結合化學物質中之一或多者結合至聚核酸分子。在一些情況下，白蛋白藉由自然接合化學物質結合至聚核酸分子。在一些情況下，白蛋白藉由離胺酸結合結合至聚核酸分子。
在一些情況下，結合部分為類固醇。例示性類固醇包括膽固醇、磷脂、二醯甘油及三醯甘油、脂肪酸、碳氫化合物(其為飽和、不飽和的，包含取代)，或其組合。在一些情況下，類固醇為膽固醇。在一些情況下，結合部分為膽固醇。在一些情況下，膽固醇藉由本文中所描述之結合化學物質中之一或多者結合至聚核酸分子。在一些情況下，膽固醇藉由自然接合化學物質結合至聚核酸分子。在一些情況下，膽固醇藉由離胺酸結合結合至聚核酸分子。
在一些情況下，結合部分為聚合物，包括(但不限於)與細胞上之比表面標記結合之聚核酸分子適體。在此情況下，結合部分為不與目標基因或mRNA雜交，但實際上能夠以與抗體結合於細胞表面標記之其特異性抗原決定基類似的方式選擇性地結合於細胞表面標記的聚核酸。
在一些情況下，結合部分為肽。在一些情況下，肽包含約1至約3 kDa。在一些情況下，肽包含約1.2至約2.8 kDa、約1.5至約2.5 kDa或約1.5至約2 kDa。在一些情況下，肽為雙環肽。在一些情況下，雙環肽為受限雙環肽。在一些情況下，結合部分為雙環肽(例如，來自Bicycle Therapeutics之雙環)。
在額外情況下，結合部分為小分子。在一些情況下，小分子為抗體募集小分子。在一些情況下，抗體募集小分子包含目標結合端及抗體結合端，其中目標結合端能夠識別細胞表面受體並其與相互作用。舉例而言，在一些情況下，包含麩胺酸脲化合物之目標結合端能夠與PSMA相互作用，藉此增強抗體與表現PSMA之細胞的相互作用。在一些情況下，結合部分為以下中描述之小分子：Zhang等人., 「A remote arene-binding site on prostate specific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules」，J Am Chem Soc. 132(36): 12711-12716 (2010)；或McEnaney等人., 「Antibody-recruiting molecules: an emerging paradigm for engaging immune function in treating human disease」，ACS Chem Biol. 7(7): 1139-1151 (2012)。抗體或其抗原結合片段之產生
在一些實施例中，本文中所描述之多肽(例如，抗體及抗原結合片段)係使用此項技術中已知之適用於合成多肽(例如，抗體)之任何方法，特定言之藉由化學合成或藉由重組表現來產生，且較佳地藉由重組表現技術來產生。
在一些情況下，抗體或其抗原結合片段以重組方式表現，且編碼抗體或抗原結合片段之核酸係由以化學方式合成之寡核苷酸(例如如Kutmeier等人, 1994, BioTechniques 17:242中所描述)裝配，此涉及合成含有編碼抗體之序列部分之重疊寡核苷酸，使彼等寡核苷酸融合且接合，且隨後藉由PCR擴增經接合之寡核苷酸。
可替代地，編碼抗體之核酸分子視情況藉由使用可與序列之3'端及5'端雜交之合成引子進行PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針進行選殖來由合適源(例如抗體cDNA庫，或由表現免疫球蛋白之任何組織或細胞生成之cDNA庫)生成。
在一些情況下，抗體或其抗原結合視情況藉由使諸如兔之動物免疫以生成多株抗體或更佳地藉由例如如Kohler及Milstein (1975,Nature 256:495-497)所描述或如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁)所描述生成單株抗體來生成。可替代地，視情況藉由針對結合特定抗原之Fab片段殖株對Fab表現庫進行篩選(例如如Huse等人, 1989,Science 246:1275-1281中所描述)或藉由對抗體庫進行篩選(參見例如Clackson等人, 1991,Nature 352:624；Hane等人, 1997Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937)來獲得編碼至少抗體之Fab部分之殖株。
在一些實施例中，使用經研發用於藉由來自具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子之剪接基因連同來自具有適當生物活性之人類抗體分子之基因一起產生「嵌合抗體」的技術(Morrison等人, 1984,Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger等人, 1984,Nature 312:604-608；Takeda等人, 1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗體為其中不同部分來源於不同動物物種，諸如具有來源於鼠單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區(例如人類化抗體)之動物物種的分子。
在一些實施例中，經描述用於產生單鏈抗體之技術(美國專利第4,694,778號；Bird, 1988,Science 242:423-42；Huston等人, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及Ward等人, 1989,Nature 334:544-54)適用於產生單鏈抗體。單鏈抗體係藉由以下形成：經由胺基酸橋連接Fv區之重鏈及輕鏈片段，產生單鏈多肽。亦視情況使用用於裝配大腸桿菌(E. coli)中之功能Fv片段之技術(Skerra等人, 1988,Science 242:1038-1041)。
在一些實施例中，藉由習知技術(例如電穿孔、脂質體轉染及磷酸鈣沈澱)將包含抗體之核苷酸序列之表現載體或抗體之核苷酸序列轉移至宿主細胞，且隨後藉由習知技術培養經轉染之細胞以產生抗體。在特定實施例中，藉由組成性、可誘導或組織特異性啟動子調節抗體之表現。
在一些實施例中，多種宿主表現載體系統用以表現本文中所描述之抗體或其抗原結合片段。此等宿主表現系統代表產生且隨後純化抗體之編碼序列所藉以之載具，而且代表在經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現抗體或其抗原結合片段的細胞。此等宿主表現系統包括但不限於微生物體，諸如經含有編碼抗體或其抗原結合片段之序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌(B. subtilis ))；經含有編碼抗體或其抗原結合片段之序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia ))；經含有編碼抗體或其抗原結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經含有編碼抗體或其抗原結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)及菸草嵌紋病毒(TMV))感染或經含有編碼抗體或其抗原結合片段之序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因體之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BH、293、293T、3T3細胞)。
為長期高產量產生重組蛋白，較佳的係穩定表現。在一些情況下，穩定地表現抗體之細胞株視情況經工程改造。宿主細胞可經受適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體轉型。在引入外來DNA之後，使經工程改造之細胞在增濃培養基中生長1-2天，且隨後轉換成選擇性培養基。重組質體中之可選標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成變異區(foci)，之後將該等變異區選殖且擴增至細胞株中。此方法可有利地用以對表現抗體或其抗原結合片段之細胞株進行工程改造。
在一些情況下，使用多個選擇系統，包括但不限於單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人, 1977,Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski, 192,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人, 1980,Cell 22:817)基因分別用於tk−細胞、hgprt−細胞或aprt−細胞中。此外，抗代謝物抗性用作選擇以下基因之基礎：dhfr，其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人, 1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hare等人, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；neo，其賦予對胺基醣苷G-418之抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及Wu, 1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993,Science 260:926-932；以及Morgan及Anderson, 1993,Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月,TIB TECH 11(5):155-215)；及hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人, 1984,Gene 30:147)。可使用之重組DNA技術中通常已知之方法描述於Ausubel等人(編, 1993,Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990,Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual , Stockton Press, NY；及第12章及第13章, Dracopoli等人(編), 1994,Current Protocols in Human Genetics , John Wiley & Sons, NY.；Colberre-Garapin等人, 1981,J. Mol. Biol . 150:1)中。
在一些情況下，抗體之表現量係藉由載體擴增來增加(綜述參見Bebbington及Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning , 第3卷. (Academic Press, New York, 1987))。當表現抗體之載體系統中的標記物可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑的含量增加將增加標記基因複本之數目。由於擴增區與抗體之核苷酸序列相關聯，故抗體之產生亦將增加(Crouse等人, 1983,Mol. Cell Biol. 3:257)。
在一些情況下，使用此項技術中已知之用於純化或分析抗體或抗體結合物之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力(特別地藉由蛋白A之後針對特定抗原之親和力)及篩分管柱層析法)、離心、差異可溶性或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術進行。例示性層析法包括但不限於強陰離子交換層析法、疏水性相互作用層析法、粒徑篩析層析法及快速蛋白質液相層析法。結合化學物質
在一些實施例中，聚核酸分子B結合至結合部分。在一些實施例中，聚核酸分子B以式A-X-B (X為結合A及B之連接子)結合至結合部分。在一些情況下，結合部分包含胺基酸、肽、多肽、蛋白質、抗體、抗原、毒素、激素、脂質、核苷酸、核苷、糖、碳水化合物、諸如聚乙二醇及聚丙二醇之聚合物，以及所有此等類別之物質的類似物或衍生物。結合部分之額外實例亦包括類固醇，諸如膽固醇、磷脂、二醯甘油及三醯甘油、脂肪酸、碳氫化合物(例如，飽和、不飽和或含有取代)、酶受質、生物素、長葉毛地黃配質(digoxigenin)及多醣。在一些情況下，結合部分為抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，聚核酸分子進一步結合至聚合物及視情況選用之內體裂解部分。
在一些實施例中，聚核酸分子藉由化學接合方法結合至結合部分。在一些情況下，聚核酸分子藉由自然連接結合至結合部分。在一些情況下，如以下中所描述進行結合：Dawson等人，「Synthesis of proteins by native chemical ligation」，Science 1994 ,266 , 776-779；Dawson等人，「Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives」，J. Am. Chem. Soc .1997 , 119, 4325-4329；Hackeng等人，「Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology.」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 , 96, 10068-10073；或Wu等人，「Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol」，Angew. Chem. Int. Ed. 2006 ,45 , 4116-4125。在一些情況下，如美國專利第8,936,910號中所描述進行結合。在一些實施例中，聚核酸分子經由天然接合化學物質位點特異性地或非特異性地結合至結合部分。
在一些情況下，聚核酸分子藉由定點方法利用「無痕跡」偶合技術(Philochem)結合至結合部分。在一些情況下，「無痕跡」偶合技術利用結合部分上之N端1,2-胺基硫醇基，隨後使其與含有醛基之聚核酸分子結合。(參見Casi等人，「Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery」JACS 134 (13): 5887-5892 (2012))。
在一些情況下，聚核酸分子藉由定點方法利用併入至結合部分中之非天然胺基酸結合至結合部分。在一些情況下，非天然胺基酸包含對乙醯基苯丙胺酸(pAcPhe)。在一些情況下，pAcPhe之酮基選擇性地偶合至烷氧基-胺衍生之結合部分以形成肟鍵。(參見Axup等人，「Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids」，PNAS 109 (40): 16101-16106 (2012))。
在一些情況下，聚核酸分子藉由定點方法利用酶催化方法結合至結合部分。在一些情況下，定點方法利用SMARTag™技術(Catalent, Inc.)。在一些情況下，SMARTag™技術包含藉由甲醯基甘胺酸生成酶(FGE)在醛標籤存在下經由氧化方法由半胱胺酸生成甲醯基甘胺酸(FGly)殘基，且後續經由肼基-Pictet-Spengler (HIPS)接合來使FGly結合至烷基肼官能化聚核酸分子。(參見Wu等人，「Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag」，PNAS 106 (9): 3000-3005 (2009)；Agarwal等人，「A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification」，PNAS 110 (1): 46-51 (2013))。
在一些情況下，酶催化方法包含微生物轉麩醯胺酸酶(mTG)。在一些情況下，聚核酸分子利用微生物轉麩醯胺酸酶催化方法結合至結合部分。在一些情況下，mTG催化辨識序列內之麩醯胺酸之醯胺側鏈與官能化聚核酸分子之一級胺之間之共價鍵的形成。在一些情況下，mTG係由茂源鏈黴菌(Streptomyces mobaraensis)產生。(參見Strop等人， 「Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates」，Chemistry and Biology 20 (2) 161-167 (2013))。
在一些情況下，聚核酸分子藉由如PCT公開案第WO2014/140317號中所描述之利用序列特異性轉肽酶的方法結合至結合部分。
在一些情況下，聚核酸分子藉由如美國專利公開案第2015/0105539號及第2015/0105540號中所描述之方法結合至結合部分。聚合物結合部分
在一些實施例中，聚合物部分C進一步結合至本文中所描述之聚核酸分子、本文中所描述之結合部分或其組合。在一些情況下，聚合物部分C以式A-X1 -B-X2 -C (X1 、X2 作為兩個分別結合A及B、B及C的連接子)結合至聚核酸分子。在一些情況下，聚合物部分C結合至結合部分。在其他情況下，聚合物部分C結合至聚核酸分子-結合部分分子。在額外情況下，如上述所示，結合聚合物部分C。
在一些情況下，聚合物部分C為由分支鏈或非支鏈單體之長鏈及/或單體於二維或三維中之交聯網狀結構組成的天然或合成聚合物。在一些情況下，聚合物部分C包括多醣、木質素、橡膠或聚烷醚(例如聚乙二醇)。在一些情況下，至少一種聚合物部分C包括但不限於α-二羥基聚乙二醇、ω-二羥基聚乙二醇、基於生物可降解內酯之聚合物(例如聚丙烯酸、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烴、聚醯胺、聚氰基丙烯酸酯、聚醯亞胺、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylenterephthalat) (又稱為聚(對苯二甲酸乙二酯)(poly(ethylene terephthalate))、PET、PETG或PETE)、聚伸丁二醇(PTG)或聚胺基甲酸酯)以及其混合物。如本文所使用，混合物係指相同化合物內之不同聚合物之使用且參考嵌段共聚物。在一些情況下，嵌段共聚物為其中聚合物之至少一個部分由另一聚合物之單體建構之聚合物。在一些情況下，聚合物部分C包含聚烷醚。在一些情況下，聚合物部分C包含PEG。在一些情況下，聚合物部分C包含聚乙烯醯亞胺(PEI)或羥乙基澱粉(HES)。
在一些情況下，C為PEG部分。在一些情況下，PEG部分係在聚核酸分子之5'端處結合，而結合部分係在聚核酸分子之3'端處結合。在一些情況下，PEG部分係在聚核酸分子之3'端處結合，而結合部分係在聚核酸分子之5'端處結合。在一些情況下，PEG部分結合至聚核酸分子之內部位點。在一些情況下，PEG部分、結合部分或其組合結合至聚核酸分子之內部位點。在一些情況下，結合為直接結合。在一些情況下，結合係經由天然接合進行。
在一些實施例中，聚烷醚(例如，PEG)為多分散或單分散化合物。在一些情況下，多分散材料包含不同分子量之材料之分散分佈，其特徵在於平均重量(重量平均)大小及分散度。在一些情況下，單分散PEG包含一種尺寸之分子。在一些實施例中，C為多分散或單分散聚烷醚(例如PEG)且所指示之分子量代表例如PEG之聚烷醚分子之分子量的平均值。
在一些實施例中，聚烷醚(例如，PEG)之分子量為約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da。
在一些實施例中，C為聚烷醚(例如，PEG)且其分子量為約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da。在一些實施例中，C為PEG且其分子量為約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約200 Da。在一些情況下，C之分子量為約300 Da。在一些情況下，C之分子量為約400 Da。在一些情況下，C之分子量為約500 Da。在一些情況下，C之分子量為約600 Da。在一些情況下，C之分子量為約700 Da。在一些情況下，C之分子量為約800 Da。在一些情況下，C之分子量為約900 Da。在一些情況下，C之分子量為約1000 Da。在一些情況下，C之分子量為約1100 Da。在一些情況下，C之分子量為約1200 Da。在一些情況下，C之分子量為約1300 Da。在一些情況下，C之分子量為約1450 Da。在一些情況下，C之分子量為約1500 Da。在一些情況下，C之分子量為約1600 Da。在一些情況下，C之分子量為約1700 Da。在一些情況下，C之分子量為約1800 Da。在一些情況下，C之分子量為約1900 Da。在一些情況下，C之分子量為約2000 Da。在一些情況下，C之分子量為約2100 Da。在一些情況下，C之分子量為約2200 Da。在一些情況下，C之分子量為約2300 Da。在一些情況下，C之分子量為約2400 Da。在一些情況下，C之分子量為約2500 Da。在一些情況下，C之分子量為約2600 Da。在一些情況下，C之分子量為約2700 Da。在一些情況下，C之分子量為約2800 Da。在一些情況下，C之分子量為約2900 Da。在一些情況下，C之分子量為約3000 Da。在一些情況下，C之分子量為約3250 Da。在一些情況下，C之分子量為約3350 Da。在一些情況下，C之分子量為約3500 Da。在一些情況下，C之分子量為約3750 Da。在一些情況下，C之分子量為約4000 Da。在一些情況下，C之分子量為約4250 Da。在一些情況下，C之分子量為約4500 Da。在一些情況下，C之分子量為約4600 Da。在一些情況下，C之分子量為約4750 Da。在一些情況下，C之分子量為約5000 Da。在一些情況下，C之分子量為約5500 Da。在一些情況下，C之分子量為約6000 Da。在一些情況下，C之分子量為約6500 Da。在一些情況下，C之分子量為約7000 Da。在一些情況下，C之分子量為約7500 Da。在一些情況下，C之分子量為約8000 Da。在一些情況下，C之分子量為約10,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約12,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約20,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約35,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約40,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約50,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約60,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約100,000 Da。
在一些實施例中，聚烷醚(例如，PEG)包含離散的環氧乙烷單元(例如，四個至約48個環氧乙烷單元)。在一些情況下，包含離散環氧乙烷單元之聚烷醚為直鏈。在其他情況下，包含離散環氧乙烷單元之聚烷醚為分支鏈。
在一些情況下，聚合物部分C為包含離散環氧乙烷單元之聚烷醚(例如，PEG)。在一些情況下，聚合物部分C包含約4至約48個環氧乙烷單元。在一些情況下，聚合物部分C包含約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47或約48個環氧乙烷單元。
在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約4至約48個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含以下之離散PEG：例如約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47或約48個環氧乙烷單元。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約4個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約5個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約6個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約7個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約8個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約9個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約10個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約11個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約12個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約13個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約14個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約15個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約16個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約17個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約18個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約19個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約20個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約21個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約22個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約23個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約24個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約25個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約26個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約27個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約28個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約29個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約30個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約31個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約32個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約33個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約34個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約35個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約36個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約37個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約38個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約39個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約40個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約41個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約42個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約43個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約44個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約45個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約46個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約47個環氧乙烷單元之離散PEG。在一些情況下，聚合物部分C為包含例如約48個環氧乙烷單元之離散PEG。
在一些情況下，聚合物部分C為dPEG® (Quanta Biodesign Ltd)。
在一些實施例中，聚合物部分C包含基於陽離子黏液酸之聚合物(cMAP)。在一些情況下，cMAP包含至少一個重複次單元之一或多個次單元，且次單元結構表示為式(V)：
Figure 02_image023
式V
其中m在每次出現時獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，較佳4至6或5；且n在每次出現時獨立地為1、2、3、4或5。在一些實施例中，m及n為例如約10。
在一些情況下，cMAP進一步結合至PEG部分，生成cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情況下，PEG部分之範圍為約500 Da至約50,000 Da。在一些情況下，PEG部分之範圍為約500 Da至約1000 Da、大於1000 Da至約5000 Da、大於5000 Da至約10,000 Da、大於10,000至約25,000 Da、大於25,000 Da至約50,000 Da或此等範圍中之兩者或更多者之任何組合。
在一些情況下，聚合物部分C為cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情況下，聚合物部分C為cMAP-PEG共聚物。在其他情況下，聚合物部分C為mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物。在額外情況下，聚合物部分C為cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。
在一些實施例中，聚合物部分C結合至聚核酸分子、結合部分，及視情況結合至如上述所示之內體裂解部分。內體裂解部分或細胞膜穿透部分
在一些實施例中，式(I)：A-X1 -B-X2 -C之分子進一步包含額外結合部分。在一些情況下，額外結合部分為內體裂解部分及/或細胞膜穿透部分。在一些情況下，內體裂解部分為細胞隔室釋放組分，諸如能夠自此項技術中已知之任何細胞隔室，諸如內體、溶酶體、內質網(endoplasmic reticulum，ER)、高基氏體(Golgi apparatus)、微管、過氧化體或具有區室之其他泡狀體中釋放的化合物。在一些情況下，內體裂解部分包含內體裂解多肽、內體裂解聚合物、內體裂解脂質或內體裂解小分子。在一些情況下，內體裂解部分包含內體裂解多肽。在其他情況下，內體裂解部分包含內體裂解聚合物。在一些情況下，細胞膜穿透部分包含細胞穿透肽(CPP)。在其他情況下，細胞膜穿透部分包含細胞穿透脂質。在其他情況下，細胞膜穿透部分包含細胞穿透小分子。內體裂解多肽及細胞膜穿透多肽
在一些實施例中，式(I)：A-X1 -B-X2 -C之分子進一步與內體裂解多肽結合。在一些情況下，內體裂解多肽為pH依賴型膜活性肽。在一些情況下，內體裂解多肽為兩親性多肽。在額外情況下，內體裂解多肽為肽模擬物。在一些情況下，內體裂解多肽包含INF、蜂毒肽、黏液素(meucin)或其各別衍生物。在一些情況下，內體裂解多肽包含INF或其衍生物。在其他情況下，內體裂解多肽包含蜂毒肽或其衍生物。在額外情況下，內體裂解多肽包含黏液素或其衍生物。
在一些情況下，INF7為24殘基多肽，彼等序列包含CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA (SEQ ID NO: 331)或GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ ID NO: 332)。在一些情況下，INF7或其衍生物包含以下之序列：GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG (SEQ ID NO: 333)、GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2 (SEQ ID NO: 334)或GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K (GalNAc)2 (SEQ ID NO: 335)。
在一些情況下，蜂毒肽為26殘基多肽，彼等序列包含CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ (SEQ ID NO: 336)或GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 337)。在一些情況下，蜂毒肽包含如美國專利第8,501,930號中所描述之多肽序列。
在一些情況下，黏液素為來源於蒙古正鉗蠍(scorpion Mesobuthus eupeus)之毒腺之抗微生物肽(AMP)。在一些情況下，黏液素包含：黏液素-13，彼等序列包含IFGAIAGLLKNIF-NH2 (SEQ ID NO: 338)；及黏液素-18，彼等序列包含FFGHLFKLATKIIPSLFQ (SEQ ID NO: 339)。
在一些情況下，內體裂解多肽包含其中其序列與INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或黏液素或其衍生物具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或黏液素或其衍生物。
在一些情況下，內體裂解多肽為INF7或其衍生物。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 331-335具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 331具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 332-335具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 331。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 332-335。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 331組成。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 332-335組成。
在一些情況下，內體裂解多肽為蜂毒素或其衍生物。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 336或337具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 336具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 337具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 286。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 337。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 336組成。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 337組成。
在一些情況下，內體裂解部分為黏液素或其衍生物。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 338或339具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 338具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含與SEQ ID NO: 339具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 338。在一些情況下，內體裂解部分包含SEQ ID NO: 339。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 338組成。在一些情況下，內體裂解部分由SEQ ID NO: 339組成。
在一些情況下，內體裂解部分包含如表8中所說明之序列。表 8
名稱 來源 胺基酸序列 SEQ ID NO: 類型
Pep-1 來自猴病毒40大抗原及HIV反轉錄酶之NLS KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 340 初級兩親性
pVEC VE-鈣黏蛋白 LLIILRRRRIRKQAHAHSK 341 初級兩親性
VT5 合成肽 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD 342 β片兩親性
C105Y 1-抗胰蛋白酶 CSIPPEVKFNKPFVYLI 343 -
轉運素(Transportan) 甘丙胺素及黃蜂毒素 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 344 初級兩親性
TP10 甘丙胺素及黃蜂毒素 AGYLLGKINLKALAALAKKIL 345 初級兩親性
MPG    來自HIV gp41之融合序列及SV40 T抗原之NLS之疏水域 GALFLGFLGAAGSTMGA 346 β片兩親性
gH625 I型HSV之醣蛋白gH HGLASTLTRWAHYNALIRAF 347 次級兩親性α-螺旋形
CADY PPTG1肽 GLWRALWRLLRSLWRLLWRA 348 次級兩親性α-螺旋形
GALA 合成肽 WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA 349 次級兩親性α-螺旋形
INF 流行性感冒HA2融合肽 GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC 350 次級兩親性α-螺旋形/pH依賴型膜活性肽
HA2E5-TAT 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2次單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG 351 次級兩親性α-螺旋形/pH依賴型膜活性肽
HA2-穿透蛋白 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2次單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGRQIKIWFQNRRMKW KK-醯胺 352 pH依賴型膜活性肽
HA-K4 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2次單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG-SSKKKK 353 pH依賴型膜活性肽
HA2E4 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2次單元 GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC 354 pH依賴型膜活性肽
H5WYG HA2類似物 GLFHAIAHFIHGGWH GLIHGWYG 355 pH依賴型膜活性肽
GALA-INF3- (PEG)6-NH INF3融合肽 GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAA- (PEG)6-NH2    356 pH依賴型膜活性肽
CM18-TAT11 殺菌肽-A-蜂毒素2-12 (CM18 )融合肽 KWKLFKKIGAVLKVLTTG-YGRKKRRQRRR 357 pH依賴型膜活性肽
在一些情況下，內體裂解部分包含經由拮抗諸如Bcl-2及/或Bcl-xL之抑制因子目標來誘導細胞凋亡之Bak BH3多肽。在一些情況下，內體裂解部分包含以下中所描述之Bak BH3多肽：Albarran等人, 「Efficient intracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsive carrier」,Reactive & Functional Polymers 71 : 261-265 (2011)。
在一些情況下，內體裂解部分包含如PCT公開案第WO2013/166155號或第WO2015/069587號中所描述之多肽(例如穿透細胞之多肽)。內體裂解脂質
在一些實施例中，內體裂解部分為脂質(例如促融脂質)。在一些實施例中，式(I)：A-X1 -B-X2 -C之分子進一步與內體裂解脂質(例如，促融脂質)結合。例示性促融脂質包括：1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)及N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)乙胺(XTC)。
在一些情況下，內體裂解部分為PCT公開案第WO09/126,933號中所描述之脂質(例如促融脂質)。內體裂解小分子
在一些實施例中，內體裂解部分為小分子。在一些實施例中，式(I)：A-X1 -B-X2 -C之分子進一步與內體裂解小分子結合。適用作內體裂解部分之例示性小分子包括但不限於：奎寧、氯奎、羥基氯奎、胺酚喹(amodiaquins/carnoquines)、阿莫吡喹(amopyroquines)、伯胺喹(primaquines)、甲氟喹(mefloquines)、硫酸氯喹(nivaquines)、鹵甲丙二苯卓(halofantrines)、醌亞胺或其任何組合。在一些情況下，喹啉內體裂解部分包括(但不限於) 7-氯-4-(4-二乙胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉(氯奎寧)；7-氯-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉(羥基氯奎)；7-氟-4-(4-二乙胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉；4-(4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-二乙基-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氯-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉(去甲基氯奎)；7-氟-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉)；4-(4-二乙基-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羥基-乙基)-胺基-1-甲基丁胺基-)喹啉；7-羥基-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；羥基氯奎磷酸酯；7-氯-4-(4-乙基-(2-羥乙基-1)-胺基-1-丁胺基)喹啉(去甲基羥基氯奎)；7-氟-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；8-[(4-氨基戊基)胺基-6-甲氧基二氫氯喹啉；1-乙醯基-1,2,3,4-四氫喹啉；8-[(4-胺基戊基)胺基]-6-甲氧基喹啉二鹽酸鹽；1-丁醯基-1,2,3,4-四氫喹啉；3-氯-4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉、4-[(4-二乙基-胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；3-氟-4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉、4-[(4-二乙胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉；4-[(4-二乙胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；3,4-二氫-1-(2H)-喹啉羧基醛；1,1'-五亞甲基二喹啉鎓二碘化物；8-喹啉醇硫酸鹽及其胺基、醛、羧酸、羥基、鹵素、酮、巰基及乙烯基衍生物或類似物。在一些情況下，內體裂解部分為Naisbitt等人(1997,J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893)及美國專利第5,736,557號中所描述之小分子。細胞穿透多肽 (CPP)
在一些實施例中，細胞穿透多肽包含具有5-30個胺基酸之帶正電短肽。在一些實施例中，細胞穿透多肽包含富含精胺酸或離胺酸之胺基酸序列。在一些實施例中，細胞穿透多肽包括表9中所列舉之任何多肽或其組合。表 9
肽 序列 SEQ ID NO
觸角足突變穿透蛋白(43-58) RQIKIWFQNRRMKWKK 358
HIV-1 TAT蛋白(48-60) GRKKRRQRRRPPQ 359
pVEC鈣黏素(615-632) LLIILRRRIRKQAHAHSK 360
轉運素甘丙胺素/黃蜂毒素 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 361
MPG HIV-gp41/SV40 T-抗原 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV 362
Pep-1 HIV-反轉錄酶/SV40 T-抗原 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 363
聚精胺酸 R(n); 6 ＜ n ＜ 12 364
MAP KLALKLALKALKAALKLA 365
R6W3 RRWWRRWRR 366
NLS CGYGPKKKRKVGG 367
8-離胺酸 KKKKKKKK 368
ARF (1-22) MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV 369
天青蛋白-p28 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD 370
連接子
在一些實施例中，本文所描述之連接子為可裂解連接子或不可裂解連接子。在一些情況下，連接子為可裂解連接子。在其他情況下，連接子為不可裂解連接子。
在一些情況下，連接子為非聚合連接子。非聚合連接子係指不含有藉由聚合方法生成之單體之重複單元之連接子。例示性非聚合連接子包括但不限於C1 -C6 烷基(例如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基)、同型雙官能交叉連接子、異型雙官能交叉連接子、肽連接子、無痕連接子、自我分解型連接子、基於順丁烯二醯亞胺之連接子或其組合。在一些情況下，非聚合連接子包含C1 -C6 烷基(例如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基)、同型雙官能交叉連接子、異型雙官能交叉連接子、肽連接子、無痕連接子、自我分解型連接子、基於順丁烯二醯亞胺之連接子或其組合。在額外情況下，非聚合連接子不包含超過兩個相同類型之連接子，例如超過兩個同型雙官能交叉連接子或超過兩個肽連接子。在另外情況下，非聚合連接子視情況包含一或多個反應性官能基。
在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋上文所描述之聚合物。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋聚合物部分C所涵蓋之聚合物。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋聚烷醚(例如PEG)。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋PEG。
在一些情況下，連接子包含同型雙官能連接子。例示性同型雙官能連接子包括但不限於羅曼特氏試劑(Lomant's reagent)二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫代雙(丙酸磺基丁二醯亞胺酯) (DTSSP)、辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基丁二醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二丁二醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基丁二醯亞胺酯(磺基DST)、伸乙基糖基雙(丁二醯亞胺基丁二酸酯) (EGS)、戊二酸二丁二醯亞胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二丁二醯亞胺酯(DSC)、二亞胺代己二酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代雙丙醯亞胺酸酯(DTBP)、1,4-二-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含有芳基鹵之化合物(DFDNB) (諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、己二酸二醯肼、碳醯肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基聯苯、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。
在一些實施例中，連接子包含異型雙官能連接子。例示性異雙官能連接子包括(但不限於)胺反應性及硫氫基交叉連接子，諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫基))丙酸N-丁二醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基丁二醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(sMCC)、磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBs)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯(磺基-MB)、N-丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(sIAB)、磺基丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺酸基-sIAB)、丁二醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基丁二醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)丁二醯亞胺酯(GMBs)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸丁二醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸丁二醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羧酸丁二醯亞胺酯(sIAC)、6-((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)羧酸丁二醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝苯酯(NPIA)；羰基反應性及硫氫基反應性交叉連接子，諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼(PDPH)；胺反應性及光反應性交叉連接子，諸如N-羥基丁二醯亞胺基-4-疊氮柳酸(NHs-AsA)、N-羥基磺基丁二醯亞胺基-4-疊氮柳酸(磺酸基-NHs-AsA)、磺基丁二醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基丁二醯亞胺基-2-(對疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基丁二醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基丁二醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺(ANB-NOs)、磺基丁二醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-丁二醯亞胺基-4(4-疊氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、N-磺基丁二醯亞胺基(4-疊氮苯基)-1,3'-二硫丙酸酯(磺基-sADP)、4-(對疊氮苯基)丁酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基丁二醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基丁二醯亞胺酯 (磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸對硝苯酯(ρNPDP)、對硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)；硫氫基反應性及光反應性交叉連接子，諸如1-(對疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(對疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(APDP)、苯甲酮-4-碘乙醯胺；苯甲酮-4-順丁烯二醯亞胺羰基反應性及光反應性交叉連接子，諸如對疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)；羧酸酯反應性及光反應性交叉連接子，諸如4-(對疊氮水楊基胺基)丁胺(AsBA)；及精胺酸反應性及光反應性交叉連接子，諸如對疊氮苯基乙二醛(APG)。
在一些情況下，連接子包含反應性官能基。在一些情況下，反應性官能基包含對結合部分上所存在之親電子基團具有反應性之親核基團。例示性親電子基團包括羰基-諸如醛、酮、羧酸、酯、醯胺、烯酮、醯基鹵化物或酸酐。在一些實施例中，反應性官能基為醛。例示性親核基團包括醯肼、肟、胺基、肼、縮胺基硫脲、肼羧酸酯及芳基醯肼。
在一些實施例中，連接子包含順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基亦稱為順丁烯二醯亞胺間隔子。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基進一步涵蓋己酸，形成順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，連接子包含順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，連接子為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在其他情況下，順丁烯二醯亞胺基包含順丁烯二醯亞胺基甲基，諸如上文所述之丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)或磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)。
在一些實施例中，順丁烯二醯亞胺基為自穩定順丁烯二醯亞胺。在一些情況下，自穩定順丁烯二醯亞胺利用二胺基丙酸(DPR)以鄰近順丁烯二醯亞胺併入鹼性胺基以提供硫代丁二醯亞胺環水解之分子內催化，藉此使順丁烯二醯亞胺避免經由逆邁克爾(Michael)反應發生消除反應。在一些情況下，自穩定順丁烯二醯亞胺為Lyon等人, 「Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates」,Nat. Biotechnol. 32 (10):1059-1062 (2014)中所描述之順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，連接子包含自穩定順丁烯二醯亞胺。在一些情況下，連接子為自穩定順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，連接子包含肽部分。在一些情況下，肽部分包含超過至少2、3、4、5或6個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分包含至多2、3、4、5、6、7、或8個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分包含約2、約3、約4、約5或約6個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分為可裂解肽部分(例如以酶方式或以化學方式)。在一些情況下，肽部分為不可裂解肽部分。在一些情況下，肽部分包含Val-Cit (纈胺酸-瓜胺酸)、Gly-Gly-Phe-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly。在一些情況下，連接子包含諸如以下之肽部分：Val-Cit (纈胺酸-瓜胺酸)、Gly-Gly-Phe-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly。在一些情況下，連接子包含Val-Cit。在一些情況下，連接子為Val-Cit。
在一些實施例中，連接子包含苯甲酸基團或其衍生物。在一些情況下，苯甲酸基團或其衍生物包含對胺基苯甲酸(PABA)。在一些情況下，苯甲酸基團或其衍生物包含γ-胺基丁酸(GABA)。
在一些實施例中，連接子包含呈任何組合形式之順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團中之一或多者。在一些實施例中，連接子包含順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團之組合。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，肽基團為val-cit。在一些情況下，苯甲酸基團為PABA。在一些情況下，連接子包含mc-val-cit基團。在一些情況下，連接子包含val-cit-PABA基團。在額外情況下，連接子包含mc-val-cit-PABA基團。
在一些實施例中，連接子為自我分解型連接子或自我消除型連接子。在一些情況下，連接子為自我分解型連接子。在其他情況下，連接子為自我消除型連接子(例如環化自我消除型連接子)。在一些情況下，連接子包含美國專利第9,089,614號或PCT公開案第WO2015038426號中所描述之連接子。
在一些實施例中，連接子為樹突狀類型連接子。在一些情況下，樹突狀類型連接子包含分支化多官能連接子部分。在一些情況下，樹突狀類型連接子用於增加聚核苷酸B與結合部分A之莫耳比。在一些情況下，樹突狀類型連接子包含PAMAM樹突狀聚合物。
在一些實施例中，連接子為無痕連接子或其中在裂解之後不留下與結合部分A、聚核苷酸B、聚合物C或內體裂解部分D之連接子部分(例如原子或連接子基團)的連接子。例示性無痕連接子包括但不限於鍺連接子、矽連接子、硫連接子、硒連接子、氮連接子、磷連接子、硼連接子、鉻連接子或苯基醯肼連接子。在一些情況下，連接子為如Hejesen等人, 「A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry」,Org Biomol Chem 11 (15): 2493-2497 (2013)中所描述之無痕芳基-三氮烯連接子。在一些情況下，連接子為Blaney等人, 「Traceless solid-phase organic synthesis」,Chem. Rev .102 : 2607-2024 (2002)中所描述之無痕連接子。在一些情況下，連接子為如美國專利第6,821,783號中所描述之無痕連接子。
在一些情況下，連接子為以下中所描述之連接子：美國專利第6,884,869號；第7,498,298號；第8,288,352號；第8,609,105號；或第8,697,688；美國專利公開案第2014/0127239號；第2013/028919號；第2014/286970號；第2013/0309256號；第2015/037360號；或第2014/0294851號；或PCT公開案第WO2015057699號；第WO2014080251號；第WO2014197854號；第WO2014145090號；或第WO2014177042號。
在一些實施例中，X1 及X2 各自獨立地為鍵或非聚合連接子。在一些情況下，X1 及X2 各自獨立地為鍵。在一些情況下，X1 及X2 各自獨立地為非聚合連接子。
在一些情況下，X1 為鍵或非聚合連接子。在一些情況下，X1 為鍵。在一些情況下，X1 為非聚合連接子。在一些情況下，連接子為C1 -C6 烷基。在一些情況下，X1 為C1 -C6 烷基，諸如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基。在一些情況下，C1 -C6 烷基為未經取代之C1 -C6 烷基。如在連接子之情形下且詳言之在X1 之情形下所使用，烷基意謂含有至多六個碳原子之飽和直鏈或分支鏈烴基。在一些情況下，X1 包括上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。在一些情況下，X1 包括異型雙官能連接子。在一些情況下，X1 包括sMCC。在其他情況下，X1 包括視情況結合至C1 -C6 烷基之異型雙官能連接子。在其他情況下，X1 包括視情況結合至C1 -C6 烷基之sMCC。在額外情況下，X1 不包括上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。
在一些情況下，X2 為鍵或連接子。在一些情況下，X2 為鍵。在其他情況下，X2 為連接子。在額外情況下，X2 為非聚合連接子。在一些實施例中，X2 為C1 -C6 烷基。在一些情況下，X2 為上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。在一些情況下，X2 為上文所描述之同型雙官能連接子。在一些情況下，X2 為上文所描述之異型雙官能連接子。在一些情況下，X2 包含諸如上文所描述之順丁烯二醯亞胺基己醯基(maleimidocaproyl；mc)或自我穩定型順丁烯二醯亞胺基之順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，X2 包含諸如Val-Cit之肽部分。在一些情況下，X2 包含諸如PABA之苯甲酸基團。在額外情況下，X2 包含順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團之組合。在額外情況下，X2 包含mc基團。在額外情況下，X2 包含mc-val-cit基團。在額外情況下，X2 包含val-cit-PABA基團。在額外情況下，X2 包含mc-val-cit-PABA基團。使用方法
肌肉萎縮係指肌肉質量之損失及/或肌肉之進展性弱化及退化。在一些情況下，由於高速率之蛋白質降解、低速率之蛋白質合成或兩者之組合而出現肌肉質量之損失及/或肌肉之進展性弱化及退化。在一些情況下，高速率之肌蛋白質降解係由於肌蛋白質代謝所致(亦即，肌蛋白質分解以便使用胺基酸作為葡萄糖新生之基質)。
在一個實施例中，肌肉萎縮係指肌肉強度大量損失。肌肉強度大量損失意謂相對於對照受試者中之同一肌肉組織而言，受試者中之患病、受傷或未使用肌肉組織之強度降低。在一實施例中，肌肉強度大量損失為相對於對照受試者中之同一肌肉組織而言，強度降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。在另一實施例中，肌肉強度大量損失意謂相對於非使用期之前的同一受試者中之同一肌肉組織之肌肉強度而言，未使用肌肉組織中之強度降低。在一實施例中，肌肉強度大量損失為相對於非使用期之前的同一受試者中之同一肌肉組織之肌肉強度而言，降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。
在另一實施例中，肌肉萎縮係指肌肉質量大量損失。肌肉質量大量損失意謂相對於對照受試者中之同一肌肉組織而言，受試者中之患病、受傷或未使用肌肉組織中之肌肉體積減小。在一實施例中，肌肉體積大量損失為相對於對照受試者中之同一肌肉組織而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。在另一實施例中，肌肉質量大量損失意謂相對於非使用期之前的同一受試者中之同一肌肉組織之肌肉體積而言，未使用肌肉組織中之肌肉體積減小。在一實施例中，肌肉組織大量損失為相對於非使用期之前的同一受試者中之同一肌肉組織之肌肉體積而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。視情況藉由評估肌肉之截面面積量測肌肉體積，該評估係諸如藉由磁共振成像(例如藉由肌肉體積/截面面積(CSA) MRI方法)進行。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之肌肉萎縮的方法，其包含提供本文所描述之聚核酸分子及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之聚核酸分子或本文所描述之聚核酸分子結合物以減少人類DUX4 之mRNA轉錄物的數量。在一些情況下，肌肉萎縮係與臉肩胛肱骨肌肉失養症(FSHD)相關聯。聚核酸部分介導針對人類DUX4之RNA干擾以便調節受試者之肌肉萎縮。在一些實施例中，受DUX4表現影響之一或多個標記基因之表現亦藉由減少人類DUX4 之 表現來改變或調節(例如，減少)。標記基因包括但不限於MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。在一些實施例中，與未處理細胞相比，一或多個標記基因之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些實施例中，與未處理細胞相比，一或多個標記基因(作為整體或複合物)之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之肌肉萎縮的方法，其包含提供本文所描述之siRNA抗體結合物及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之siRNA抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些情況下，肌肉萎縮係與FSHD相關聯。siRNA抗體結合物介導針對人類DUX4 mRNA之RNA干擾以便治療受試者之肌肉萎縮，其包含向受試者投與治療有效量之本文所描述之siRNA抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之肌肉萎縮的方法，其包含提供本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物(DUX4 siRNA結合物或DUX4-AOC)及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些情況下，肌肉萎縮係與FSHD相關聯。DUX4 siRNA抗體結合物介導針對人類DUX4 mRNA之RNA干擾以便治療受試者之肌肉萎縮，其包含向受試者投與治療有效量之本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之FSHD的方法，其包含提供本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物(DUX4 siRNA結合物或DUX4-AOC)及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些情況下，FSHD為1型FSHD (FSHD1)。在一些情況下，FSHD為2型FSHD。DUX4 siRNA抗體結合物介導針對人類DUX4 mRNA之RNA干擾以便治療受試者之FSHD，其包含向受試者投與治療有效量之本文所描述之DUX4 siRNA結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些實施例中，受DUX4表現影響之一或多個標記基因之表現量亦藉由減少人類DUX4之表現量來改變或調節。DUX4生物標記基因包括但不限於MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。
在一些實施例中，本文中描述一種藉由減少人類DUX4之mRNA轉錄物的含量來緩解患有FSHD之受試者之症狀的方法，其包含提供本文所描述之DUX4 siRNA抗體結合物(DUX4 siRNA結合物或DUX4-AOC)及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之siRNA結合物。在一些情況下，FSHD為1型FSHD (FSHD1)。在一些情況下，FSHD為2型FSHD。在另一實施例中，本文中描述一種藉由減少人類DUX4之mRNA轉錄物之含量或減少DUX4蛋白質之含量來緩解FSHD患者之症狀的方法，其包含提供本文所描述之siRNA結合物及向該FSHD患者投與治療有效量之本文所描述之siRNA結合物。
在一些情況下，FSHD之症狀會影響骨骼肌。受FSHD影響之骨骼肌包括眼睛及口腔周圍之肌肉、肩部之肌肉、上臂之肌肉、小腿之肌肉、腹部肌肉及髖部肌肉。在一些情況下，FSHD之症狀亦影響視覺及聽覺。在一些情況下，FSHD之症狀亦影響心臟或肺之功能。在一些情況下，FSHD之症狀包括肌無力、肌肉萎縮、肌肉失養、炎症痛、攣縮、脊柱側彎(scioliosis)、脊柱前彎(lordosis)、換氣不足、視網膜異常、暴露於角膜炎、輕度聽覺損失及EMG異常。
在一些實施例中，本文中描述一種藉由減少人類DUX4之mRNA轉錄物之含量或減少DUX4蛋白質之含量來改良FSHD患者之骨骼肌功能的方法，其包含向該FSHD患者投與治療有效量之本文所描述之siRNA結合物的步驟。在一些情況下，FSHD為1型FSHD (FSHD1)。在一些情況下，FSHD為2型FSHD。在一些實施例中，本文中描述一種藉由減少人類DUX4之mRNA轉錄物之含量或減少DUX4蛋白質之含量來改良患有FSHD之患者之骨骼肌功能、視覺、聽覺、心臟功能或肺功能的方法，其包含向該FSHD患者投與治療有效量之本文所描述之siRNA結合物的步驟。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之FSHD的方法，其包含提供本文所描述之反義寡核苷酸(ASO)抗體結合物(ASO結合物)及向該受試者投與治療有效量之本文所描述之ASO抗體結合物及降低該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些情況下，FSHD為1型FSHD (FSHD1)。在一些情況下，FSHD為2型FSHD。ASO結合物介導針對人類DUX4 mRNA之RNA干擾以便治療受試者之FSHD，其包含向受試者投與治療有效量之本文所描述之ASO抗體結合物及減少該受試者中之人類DUX4之mRNA轉錄物的含量。在一些實施例中，受DUX4表現影響之一或多個標記基因之表現量亦藉由減少人類DUX4之表現量來改變或調節。DUX4生物標記基因包括但不限於MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。
在一些實施例中，本文中描述一種治療受試者之FSHD的方法。在一些情況下，FSHD受試者罹患有FSHD1。在其他情況下，FSHD受試者罹患有FSHD2。在另一實施例中，FSHD受試者具有由染色體4之長臂之D4Z4區中之遺傳及表觀遺傳分子改變而引起的異常表現DUX4蛋白質之肌肉細胞。肌肉細胞中之遺傳分子改變為導致FSHD受試者之染色體4之含有1至10個重複序列而非正常11至100個重複序列之D4Z4區收縮的突變。肌肉細胞中之表觀遺傳分子改變為導致FSHD受試者之染色體4之D4Z4區低甲基化的改變。在一些情況下，肌肉細胞為骨骼肌細胞。醫藥調配物
在一些實施例中，本文所描述之醫藥調配物係藉由多個投與途徑投與至受試者，該等投與途徑包括但不限於非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內)、經口、鼻內、頰內、經直腸或經皮投與途徑。在一些情況下，本文所描述之醫藥組合物經調配以用於非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內、動脈內、腹膜內、鞘內、腦內、腦室內或顱內)投與。在其他情況下，本文所描述之醫藥組合物經調配以用於經口投與。在再其他情況下，本文所描述之醫藥組合物經調配以用於鼻內投與。
在一些實施例中，醫藥調配物包括但不限於水性液體分散液、自乳化型分散液、固溶體、脂質分散液、氣霧劑、固體劑型、散劑、立即釋放調配物、控制釋放調配物、速熔調配物、錠劑、膠囊、丸劑、延遲釋放調配物、延長釋放調配物、脈衝釋放調配物、多微粒調配物(例如奈米粒子調配物)及混合立即與控制釋放調配物。
在一些情況下，醫藥調配物包括多微粒調配物。在一些情況下，醫藥調配物包括奈米粒子調配物。在一些情況下，奈米粒子包含cMAP、環糊精或脂質。在一些情況下，奈米粒子包含固體脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、自乳化型奈米粒子、脂質體、微乳液或膠束溶液。其他例示性奈米粒子包括但不限於：順磁奈米粒子、超順磁奈米粒子、金屬奈米粒子、富勒烯類材料、無機奈米管、樹突狀聚合物(諸如具有共價附接金屬螯合物)、奈米纖維、奈米角、奈米洋蔥(nano-onions)、奈米棒、奈米繩及/或量子點。在一些情況下，奈米粒子為金屬奈米粒子，例如鈧、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、釔、鋯、鈮、鉬、釕、銠、鈀、銀、鎘、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉑、金、釓、鋁、鎵、銦、錫、鉈、鉛、鉍、鎂、鈣、鍶、鋇、鋰、鈉、鉀、硼、矽、磷、鍺、砷、銻奈米粒子及其組合、合金或氧化物。
在一些情況下，奈米粒子包括核或核及殼，如同核殼奈米粒子。
在一些情況下，奈米粒子進一步塗佈有用於連接功能元件(例如用本文所描述之聚核酸分子或結合部分中之一或多者)之分子。在一些情況下，塗料包含硫酸軟骨素、硫酸聚葡萄糖、羧甲基聚葡萄糖、海藻酸、果膠、鹿角菜膠、褐藻糖膠、膠洋硫菜、金屬化四聯吡咯環、刺梧桐樹膠、結蘭膠、三仙膠、玻尿酸、葡萄糖胺、半乳胺糖、幾丁質(或幾丁聚醣)、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚離胺酸、聚精胺酸、組織蛋白、魚精蛋白、卵白蛋白或糊精或環糊精。在一些情況下，奈米粒子包含經石墨烯塗佈之奈米粒子。
在一些情況下，奈米粒子之至少一個尺寸為小於約500 nm、400 nm、300 nm、200 nm或100 nm。
在一些情況下，奈米粒子調配物包含順磁奈米粒子、超順磁奈米粒子、金屬奈米粒子、富勒烯樣材料、無機奈米管、樹突狀聚合物(諸如具有經共價連接之金屬螯合物)、奈米纖維、奈米角、奈米洋蔥、奈米棒、奈米繩或量子點。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子或結合部分直接地或間接地結合至奈米粒子。在一些情況下，至少1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個本文所描述之聚核酸分子或結合部分直接地或間接地結合至奈米粒子。
在一些實施例中，醫藥調配物包含遞送載體(例如，重組載體)，將聚核酸分子遞送至細胞中。在一些情況下，重組載體為DNA質體。在其他情況下，重組載體為病毒載體。例示性病毒載體包括來源於腺相關病毒、反轉錄病毒、腺病毒或α病毒之載體。在一些情況下，能夠表現聚核酸分子之重組載體提供於目標細胞中之穩定表現。在額外情況下，使用提供聚核酸分子之短暫表現之病毒載體。
在一些實施例中，醫藥調配物包括基於與本文所揭示之組合物的相容性及所需劑型之釋放特徵性質選擇之載劑或載劑材料。例示性載劑材料包括例如黏合劑、懸浮劑、崩解劑、填充劑、界面活性劑、增溶劑、穩定劑、潤滑劑、潤濕劑、稀釋劑及其類似物。醫藥學上相容之載劑材料包括但不限於阿拉伯膠、明膠、膠態二氧化矽、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、甘油、矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、膽固醇、膽固醇酯、酪蛋白鈉、大豆卵磷脂、牛膽酸、磷脂醯膽鹼、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸二鉀、纖維素及纖維素結合物、硬脂醯基乳酸糖鈉、角叉菜膠、單甘油酸酯、二甘油酯、預膠凝化澱粉及其類似物。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第十九版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995);Hoover, John E.,Remington's Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975;Liberman, H.A.及Lachman, L.,編,Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；及Pharmaceutical Dosage Fo rmsand Drug Delivery Systems, 第七版(Lippincott Williams & Wilkins1999)。
在一些情況下，醫藥調配物進一步包括pH調節劑或緩衝劑，其包括酸，諸如乙酸、
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酸、檸檬酸、乳酸、磷酸及鹽酸；鹼，諸如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉及參-羥甲基胺基甲烷；及緩衝劑，諸如檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉及氯化銨。此類酸、鹼及緩衝劑以維持組合物之pH在可接受範圍內所需之量包括在內。
在一些情況下，醫藥調配物包括使組合物之重量滲透濃度在可接受範圍中所需之量的一或多種鹽。此類鹽包括具有鈉、鉀或銨陽離子及氯離子、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子之鹽；適合之鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及硫酸銨。
在一些情況下，醫藥調配物進一步包括用以穩定化合物之稀釋劑，因為其可提供更穩定的環境。溶解於緩衝溶液中之鹽(其亦可提供pH控制或維持)在此項技術中用作稀釋劑，包括(但不限於)磷酸鹽緩衝鹽水溶液。在某些情況下，稀釋劑增加組合物之體積以促進壓縮或形成足夠體積以用於膠囊填充之均勻摻合物。此類化合物包括例如乳糖、澱粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、諸如Avicel® 之微晶纖維素；磷酸氫鈣、二水合磷酸二鈣、磷酸三鈣、磷酸鈣；無水乳糖、噴霧乾燥乳糖；預膠凝化澱粉、可壓縮糖，諸如Di-Pac® (Amstar)；甘露醇、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素乙酸硬脂酸酯、基於蔗糖之稀釋劑、糖粉；單水合硫酸單氫鈣、二水合硫酸鈣；三水合乳酸鈣、葡萄糖結合劑；水解穀類固體、直鏈澱粉；粉末狀纖維素、碳酸鈣；甘胺酸、高嶺土；甘露醇、氯化鈉；肌醇、膨潤土及其類似物。
在一些情況下，醫藥調配物包括有助於物質分裂或崩解之崩解劑(disintegration agent/disintegrant)。術語「崩解」包括當與胃腸流體接觸時劑型溶解及分散兩者。崩解劑之實例包括澱粉，例如天然澱粉，諸如玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；預膠凝化澱粉，諸如National 1551或Amijel® ；或羥基乙酸澱粉鈉，諸如Promogel® 或Explotab® ；纖維素，諸如木材產品；甲基結晶纖維素，例如Avicel® 、Avicel® PH101、Avicel® PH102、Avicel® PH105、Elcema® P100、Emcocel® 、Vivacel® 、Ming Tia® 及Solka-Floc® ；甲基纖維素、交聯羧甲纖維素或交聯纖維素，諸如交聯羧基甲基纖維素鈉(Ac-Di-Sol® )、交聯羧基甲基纖維素或交聯之交聯羧甲纖維素；交聯澱粉，諸如羥基乙酸澱粉鈉；交聯聚合物，諸如交聯聚維酮；交聯聚乙烯吡咯啶酮；海藻酸鹽，諸如海藻酸或海藻酸之鹽，諸如海藻酸鈉；黏土，諸如Veegum® HV (矽酸鎂鋁)、膠，諸如瓊脂、瓜爾膠、槐豆膠、加拉亞膠(Karaya)、果膠或黃蓍膠；羥基乙酸澱粉鈉；膨潤土；天然海綿；界面活性劑；樹脂，諸如陽離子交換樹脂；柑桔渣；月桂基硫酸鈉；月桂基硫酸鈉與澱粉之組合；及其類似物。
在一些情況下，醫藥調配物包括填充劑，諸如乳糖、碳酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、微晶纖維素、纖維素粉末、右旋糖、葡萄糖結合劑、聚葡萄糖、澱粉、預膠凝化澱粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化鈉、聚乙二醇及其類似物。
潤滑劑及滑動劑亦視情況包括於本文所述之醫藥調配物中以用於防止、減少或抑制材料之黏附或摩擦。例示性潤滑劑包括例如硬脂酸；氫氧化鈣；滑石；硬脂基反丁烯二酸鈉；烴，諸如礦物油；或氫化植物油，諸如氫化大豆油(Sterotex® )；高碳數脂肪酸及其鹼金屬鹽及鹼土金屬鹽，諸如鋁、鈣、鎂、鋅、硬脂酸、硬脂酸鈉、甘油、滑石、蠟、Stearowet® 、
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酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、白胺酸、聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇，諸如Carbowax™；油酸鈉、苯甲酸鈉、二十二烷酸甘油酯、聚乙二醇、月桂基硫酸鎂或月桂基硫酸鈉；膠態二氧化矽，諸如Syloid™、Cab-O-Sil® ；澱粉，諸如玉米澱粉、聚矽氧油、界面活性劑及其類似物。
塑化劑包括用於使微膠囊化材料或膜包衣軟化以使其脆性較低之化合物。適合的塑化劑包括例如聚乙二醇(諸如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350及PEG 800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纖維素及三乙酸甘油酯(triacetin)。塑化劑亦可充當分散劑或濕潤劑。
增溶劑包括諸如以下之化合物：三醋精、三乙基檸檬酸酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium doccusate)、維生素E TPGS、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、N-羥基乙基吡咯啶酮、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥基丙基環糊精、乙醇、正丁醇、異丙醇、膽固醇、膽汁鹽、聚乙二醇200-600、四氫呋喃聚乙二醇醚、二乙二醇單乙醚、丙二醇及二甲基異山梨醇及其類似物。
穩定劑包括諸如任何抗氧化劑、緩衝劑、酸、防腐劑及其類似物之化合物。
懸浮劑包括諸如以下之化合物：聚乙烯吡咯啶酮，例如聚乙烯吡咯啶酮K12、聚乙烯吡咯啶酮K17、聚乙烯吡咯啶酮K25或聚乙烯吡咯啶酮K30；乙烯基吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)；聚乙二醇，例如聚乙二醇可具有約300至約6000，或約3350至約4000，或約7000至約5400之分子量；羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥甲基纖維素乙酸酯硬脂酸酯；聚山梨醇酯-80；羥乙基纖維素；海藻酸鈉；膠，諸如黃蓍膠及阿拉伯膠、瓜爾膠、三仙膠(包括黃原膠)；糖；纖維素材料，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素；聚山梨醇酯-80；海藻酸鈉；聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯；聚乙氧基化脫水山梨醇單月桂酸酯；聚維酮及其類似物。
界面活性劑包括化合物，諸如月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium docusate)、Tween 60或80、三乙酸甘油酯、維生素E TPGS、脫水山梨醇單油酸酯、聚氧化乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、膽汁鹽、單硬脂酸甘油酯、環氧乙烷與環氧丙烷之共聚物(例如Pluronic® (BASF))及其類似者。其他界面活性劑包括聚氧化乙烯脂肪酸甘油酯及植物油，例如聚氧化乙烯(60)氫化蓖麻油；及聚氧化乙烯烷基醚及烷基苯基醚，例如辛苯聚醇10、辛苯聚醇40。在一些實施例中，包括界面活性劑以提高物理穩定性或用於其他目的。
黏度增強劑包括例如甲基纖維素、黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素乙酸酯硬脂酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸酯、阿拉伯膠、聚葡萄胺糖及其組合。
潤濕劑包括諸如以下之化合物：油酸、單硬脂酸甘油酯、脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧化乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧化乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、多庫酯鈉(sodium docusate)、油酸鈉、月桂基硫酸鈉、多庫酯鈉(sodium doccusate)、三醋精、Tween 80、維生素E TPGS、銨鹽及其類似物。治療方案
在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物以用於治療性應用。在一些實施例中，每天一次、每天兩次、每天三次或更多次投與醫藥組合物。每日(daily/every day)一次、每隔一天、一週五天、一週一次、每隔一週、每月兩週、每月三週、每月一次、每月兩次、每月三次、兩個月一次、三個月一次、四個月一次、五個月一次、六個月一次或更長時間一次投與醫藥組合物。投與醫藥組合物至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、18個月、2年、3年或更長。
在一些實施例中，同時、依序或以間隔時間段投與一或多種醫藥組合物。在一些實施例中，同時投與一或多種醫藥組合物。在一些情況下，依序投與一或多種醫藥組合物。在額外情況下，以間隔時間段投與一或多種醫藥組合物(例如在第一天首先投與第一醫藥組合物，接著在投與至少第二醫藥組合物之前間隔至少1、2、3、4、5天或更長時間)。
在一些實施例中，共投與兩種或更多種不同醫藥組合物。在一些情況下，同時共投與兩種或更多種不同醫藥組合物。在一些情況下，依序共投與兩種或更多種不同醫藥組合物，且投藥之間無時間間隙。在其他情況下，依序共投與兩種或更多種不同醫藥組合物，且投藥之間有約0.5小時、1小時、2小時、3小時、12小時、1天、2天、或更長時間間隙。
在患者狀態改善之情況下，在醫生判斷後連續地進行組合物投與；可替代地，所投與之組合物之劑量暫時減少或暫時中止達特定時間長度(亦即「藥物假期」)。在一些情況下，藥物假期之長度在2天與1年之間變化，包括僅例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。藥物假期期間之劑量減少為10%至100%，包括僅例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
一旦患者之病狀發生改善，則在必要時投與維持劑量。隨後，根據病狀可將投與劑量或頻率或兩者降低至維持改善之疾病、病症或病狀的水準。
在一些實施例中，與此類量相對應之給定藥劑之量視諸如以下之因素而變化：特定化合物、疾病之嚴重程度、需要治療之受試者或宿主之屬性(例如重量)，然而通常以此項技術中已知之方式根據圍繞該病例之特定情形來確定，該等特定情形包括例如所投與之特定藥劑、投與途徑及所治療之受試者或宿主。在一些情況下，所需劑量宜以單次劑量或分次劑量呈遞，該等分次劑量同時(或在較短時間段內)投與或以適當的時間間隔投與，例如以每天兩次、三次、四次或更多次亞劑量形式。
前述範圍僅為例示，因為關於個別治療方案之變數數目巨大，且此等推薦值之巨大偏差不常見。此類劑量視許多變數而改變，該等變數不限於所用化合物之活性、待治療之疾病或病狀、投藥模式、個別受試者之需要、所治療之疾病或病狀之嚴重程度，及從業者之判斷。
在一些實施例中，此類治療方案之毒性及治療功效藉由標準醫藥程序、在細胞培養物或實驗動物中確定，包括(但不限於)測定LD50 (使群體50%致死的劑量)及ED50 (使群體50%治療有效的劑量)。毒性與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可以LD50與ED50之間的比率表示。展現高治療指數之化合物較佳。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料用於調配用於人類之劑量範圍。此類化合物之劑量較佳處於循環濃度之範圍內，其包括具有最小毒性之ED50。劑量視所採用劑型及所用投與途徑而在此範圍內變化。套組 / 製品
在某些實施例中，本文揭示與本文所描述之組合物及方法中之一或多者一起使用之套組及製品。此類套組包含載劑、封裝或經分隔以接收一或多個容器(諸如小瓶、管道及其類似物)之容器，各容器包含一種待用於本文所述方法之各別要素。適合的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及試管。在一個實施例中，容器係由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。
本文所提供之製品含有封裝材料。醫藥封裝材料之實例包括(但不限於)泡殼封裝、瓶子、管、袋、容器及適於所選調配物及預期投與及處理模式的任何封裝材料。
舉例而言，該等容器包括本文所描述之目標核酸分子。此類套組視情況包括與其在本文所述方法中使用有關的鑑別說明或標籤或說明書。
套組通常包括列出含量之標籤及/或使用說明書，及藥品說明書與使用說明書。典型地亦包括一組說明書。
在一個實施例中，標籤在容器上或與容器關聯。在一個實施例中，當形成標籤之字母、編號或其他特徵附著、成型或蝕刻於容器本身中時，標籤可位於容器之上，當標籤存在於容器或亦固持容器之載體內時，標籤可與容器關聯，例如呈藥品說明書形式。在一個實施例中，標籤用於指示待用於特定治療性應用之內容物。標籤亦指示內容物之使用說明，諸如在本文所描述之方法中。
在某些實施例中，醫藥組合物在容納有一種或多種含有本文所提供化合物之單位劑型的藥包或分配裝置中進行呈遞。藥包例如含有金屬或塑膠箔，諸如泡殼包裝。在一個實施例中，藥包或分配裝置附有投藥說明書。在一個實施例中，藥包或分配器亦附有與容器關聯之注意事項，其呈管制醫藥品之製造、使用或銷售之政府機構指定的形式，該注意事項反映該機構批准該藥物用於人類或獸醫學投與的形式。此類注意事項例如為經美國食品及藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration)核准用於處方藥物的標籤，或核准之藥品說明書。在一個實施例中，亦製備於相容醫藥載劑中調配之含有本文所提供之化合物之組合物，將其置於適當的容器中且標記以用於治療所指示之病狀。特定術語
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習所主張之主題所屬技術者通常所瞭解相同之含義。應理解，前述一般描述及以下詳細描述僅為例示性及解釋性的且不限制所主張之任何標的物。在本申請案中，除非另有特定陳述，否則單數之使用包括複數。必須指出，除非上下文另外清楚指定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。在本申請案中，除非另有陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(include/includes/included)」，不具限制性。
如本文所使用，範圍及量可以「約」特定值或範圍表示。約亦包括準確量。因此「約5 µL」意指「約5 µL」以及「5 µL」。一般而言，術語「約」包括將預期在實驗誤差內的量。
本文使用之章節標題僅出於組織目的而不應被視為限制所述標的物。
如本文所用，術語「個體」、「受試者」及「患者」意謂任何哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物為非人類。該等術語中無一者需要健康照護工作者(例如醫生、註冊護士、護士從業者、醫師助理、勤雜工或臨終關懷工作者)之監督(例如持續或間歇監督)或受限於特徵為該監督的情境。
術語「治療有效量」係關於足以在哺乳動物受試者中提供所需治療效果的聚核酸分子結合物之量。在一些情況下，該量為向(諸如人類)患者投與以治療、預防、防止病症或復發病症之發病，治癒、延緩、減輕病症或復發病症之嚴重程度，緩解病症或復發病症之至少一個症狀，或使患者之存活期延長超出在不存在此治療的情況下所預測之存活期的單個或多個劑量。當然，用於提供治療有效量之特定聚核酸分子結合物之劑量水準視傷害類型，受試者之年齡、體重、性別、醫學病況，病狀之嚴重程度，投藥途徑及採用之特定抑制劑而變化。在一些情況下，如本文所描述，聚核酸分子結合物之治療有效量最初由細胞培養及動物模型估算。舉例而言，在細胞培養方法中測定之IC50 值視情況充當動物模型中之起始點，而動物模型中測定之IC50 值視情況用以找到對於人類之治療有效劑量。
骨骼肌或隨意肌通常藉由肌腱固定至骨骼且通常用於實行骨骼移動，諸如運動或維持姿勢。雖然一些骨骼肌控制通常作為無意識反射(例如，姿勢肌或隔膜)來維持，但骨骼肌會對有意識控制作出反應。平滑肌或不隨意肌發現於器官及結構(諸如食道、胃、腸、子宮、尿道及血管)之壁內。
骨骼肌進一步劃分成兩種廣義類型：I型(或「慢抽搐」)及II型(或「快抽搐」)。I型肌纖維密集有毛細管且富含粒線體及肌血球素，從而使I型肌肉組織生成特徵性紅色。在一些情況下，I型肌纖維可攜帶更多氧氣且使用脂肪或碳水化合物作為燃料來維持有氧運動。I型肌纖維收縮持續長時間段但用極小力。II型肌纖維可進一步細分成在收縮速度及所產生之力二者方面不同之三種主要子類型(IIa、IIx及IIb)。II型肌纖維快速而有力收縮，但極快速疲勞，且因此在肌肉收縮變得疼痛之前僅產生短暫之厭氧運動爆發。
不同於骨骼肌，平滑肌並非在有意識控制下。
心肌亦為不隨意肌，但在結構上更接近地類似骨骼肌且僅在心臟中發現。心肌及骨骼肌為條紋的，原因在於其含有包裝成高度規則排列之集束之肌節。相反地，平滑肌細胞之肌原纖維並非排列成肌節且因此不為條紋的。
肌肉細胞涵蓋促成肌肉組織之任何細胞。例示性肌肉細胞包括肌母細胞、衛星細胞、肌管及肌原纖維組織。
如此處所使用，肌肉力與截面積(CSA)成比例，且肌肉速度與肌肉纖維長度成比例。因此，比較各種肌肉之間的截面積及肌纖維能夠提供肌肉萎縮之指示。此項技術中已知用以量測肌肉強度及肌肉重量之各種方法，參見例如由Lippincott Williams & Wilkins在2000年公佈的Hazel M. Clarkson之「Musculoskeletal assessment: Joint range of motion and manual muscle strength」。藉由電腦斷層掃描及超音波評估產生所選定肌肉組織之斷層掃描影像為量測肌肉質量之額外方法。
術語抗體寡核苷酸結合物(AOC)係指結合至核苷酸之抗體。
術語siRNA結合物或siRNA抗體結合物係指結合至siRNA之抗體。
術語DUX4 siRNA結合物或DUX4 siRNA抗體結合物係指結合至與人類DUX4 mRNA之目標序列雜交之siRNA的抗體。
術語DUX4-AOC係指結合至與人類DUX4 mRNA之目標序列雜交之siRNA的抗體。實例
此等實例僅為了說明目的而提供且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。實例 1. 針對 人類全長 DUX4 轉錄本之生物資訊學 siRNA 庫設計
圖2展示DUX4 siRNA之電腦模擬選擇程序之流程圖。收集可結合於DUX4或DUX4之預先確定之區的所有siRNA之序列以產生DUX4 siRNA之起始集合。根據DUX siRNA之起始集合，第一消除步驟包含消除單核苷酸多型性(SNP)及/或MEF ＜ -5之一或多種DUX siRNA。隨後，第二消除步驟包含消除人類總轉錄本中具有0及1個MM之DUX siRNA (以使得僅允許之命中為DUX、DUX5及DBET)。隨後，第三消除步驟包含消除人類基因內區中具有0個錯配(MM)之DUX siRNA (以使得僅允許之命中為DUX1、DUX5及DBET假基因)。隨後，下一個消除步驟包含消除與FLExDUX4 FSHD小鼠模型中使用之DUX4人類序列具有一個MM的DUX siRNA。隨後，下一步驟係正向攜載預測存活率≥60之唯一或一或多種DUX siRNA。接著，消除步驟包含消除與已知miRNA 1-1000之種子區具有一個匹配的一或多種DUX siRNA。隨後，消除步驟繼續消除%GC含量為75及更大的DUX siRNA分子。隨後，最後的選擇程序包含8個或更少個具有2個MM之預測脫靶命中，除允許至多12個命中的區295-1132之外。使用此系列之選擇步驟，最後70種候選DUX siRNA可選自1694種DUX siRNA之起始集合。圖3展示DUX4 mRNA轉錄本(NM_001306068)中之此選定DUX4 siRNA之位置及數量。
所鑑別之siRNA候選物在其序列中共用常見特徵，如下表10所示。所鑑別之siRNA具有大部分2'-O-Me修飾，其中2'-F修飾僅位於有義股之位置7、8、9上且2-'F僅位於反義股之位置1、2、6、14、16上。另外，所鑑別之siRNA在各股上包含4個硫代酸酯修飾，位於各5'及3'端之最後2個鍵處。所鑑別之siRNA進一步包含在反義股之5'端之第一位置處之「Uf」，無論實際目標mRNA序列如何(與有義股之3'端之最後一個位置處的「a」偶合)。所鑑別之siRNA進一步包含在僅反義股之3'端處的「uu」突出，在有義股之3'端處無突出。所鑑別之siRNA之最佳化可包含與隨從股或引導股之膦酸乙烯酯核苷酸、反向無鹼基部分或胺連接子。表 10
雙螺旋名稱 有義股序列(5´-3´) ( 隨從股) 反義股序列(5´-3´) ( 引導股)
DUX4模板 nsnsnnnnNfNfNfnnnnnnnnsnsa UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu
vpN =膦酸乙烯酯2'-MOE；大寫字母(N) = 2'-OH (核糖)；小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基) dN = 2'-H (去氧)；Nf = 2'-F (氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾；iB =反向無鹼基
表11、12及13示出用於調節人類DUX4的所鑑別之siRNA候選物。表 11
名稱 19 聚體 起始位點 SEQ ID NO 有義/ 隨處_ 序列(5'-3') SEQ ID NO 反義 / 引導 _ 序列 (5'-3')
NM_001306068_11_29 11 1 cgacaccctcggacagcac 71 gtgctgtccgagggtgtcg
NM_001306068_57_75 57 2 acggcgacggagactcgtt 72 aacgagtctccgtcgccgt
NM_001306068_58_76 58 3 cggcgacggagactcgttt 73 aaacgagtctccgtcgccg
NM_001306068_59_77 59 4 ggcgacggagactcgtttg 74 caaacgagtctccgtcgcc
NM_001306068_60_78 60 5 gcgacggagactcgtttgg 75 ccaaacgagtctccgtcgc
NM_001306068_61_79 61 6 cgacggagactcgtttgga 76 tccaaacgagtctccgtcg
NM_001306068_62_80 62 7 gacggagactcgtttggac 77 gtccaaacgagtctccgtc
NM_001306068_63_81 63 8 acggagactcgtttggacc 78 ggtccaaacgagtctccgt
NM_001306068_77_95 77 9 ggaccccgagccaaagcga 79 tcgctttggctcggggtcc
NM_001306068_78_96 78 10 gaccccgagccaaagcgag 80 ctcgctttggctcggggtc
NM_001306068_79_97 79 11 accccgagccaaagcgagg 81 cctcgctttggctcggggt
NM_001306068_99_117 99 12 cctgcgagcctgctttgag 82 ctcaaagcaggctcgcagg
NM_001306068_102_120 102 13 gcgagcctgctttgagcgg 83 ccgctcaaagcaggctcgc
NM_001306068_137_155 137 14 tcgccaccagagaacggct 84 agccgttctctggtggcga
NM_001306068_160_178 160 15 caggccatcggcattccgg 85 ccggaatgccgatggcctg
NM_001306068_162_180 162 16 ggccatcggcattccggag 86 ctccggaatgccgatggcc
NM_001306068_163_181 163 17 gccatcggcattccggagc 87 gctccggaatgccgatggc
NM_001306068_231_249 231 18 gcaccggcgggaatctcgg 88 ccgagattcccgccggtgc
NM_001306068_232_250 232 19 caccggcgggaatctcggc 89 gccgagattcccgccggtg
NM_001306068_274_292 274 20 ccagaaggccggcgaaagc 90 gctttcgccggccttctgg
NM_001306068_276_294 276 21 agaaggccggcgaaagcgg 91 ccgctttcgccggccttct
NM_001306068_277_295 277 22 gaaggccggcgaaagcgga 92 tccgctttcgccggccttc
NM_001306068_285_303 285 23 gcgaaagcggaccgccgtc 93 gacggcggtccgctttcgc
NM_001306068_287_305 287 24 gaaagcggaccgccgtcac 94 gtgacggcggtccgctttc
NM_001306068_292_310 292 25 cggaccgccgtcaccggat 95 atccggtgacggcggtccg
NM_001306068_293_311 293 26 ggaccgccgtcaccggatc 96 gatccggtgacggcggtcc
NM_001306068_294_312 294 27 gaccgccgtcaccggatcc 97 ggatccggtgacggcggtc
NM_001306068_389_407 389 28 agacgggcctcccggagtc 98 gactccgggaggcccgtct
NM_001306068_524_542 524 29 cctcgtgggtcgccttcgc 99 gcgaaggcgacccacgagg
NM_001306068_525_543 525 30 ctcgtgggtcgccttcgcc 100 ggcgaaggcgacccacgag
NM_001306068_679_697 679 31 gaggggatctcccaacctg 101 caggttgggagatcccctc
NM_001306068_704_722 704 32 cgcgcggggatttcgccta 102 taggcgaaatccccgcgcg
NM_001306068_705_723 705 33 gcgcggggatttcgcctac 103 gtaggcgaaatccccgcgc
NM_001306068_708_726 708 34 cggggatttcgcctacgcc 104 ggcgtaggcgaaatccccg
NM_001306068_893_911 893 35 tgcttgcgccacccacgtc 105 gacgtgggtggcgcaagca
NM_001306068_1132_1150 1132 36 ctggcgagcccggagtttc 106 gaaactccgggctcgccag
NM_001306068_1134_1152 1134 37 ggcgagcccggagtttctg 107 cagaaactccgggctcgcc
NM_001306068_1158_1176 1158 38 ggcgcaacctctcctagaa 108 ttctaggagaggttgcgcc
NM_001306068_1159_1177 1159 39 gcgcaacctctcctagaaa 109 tttctaggagaggttgcgc
NM_001306068_1163_1181 1163 40 aacctctcctagaaacgga 110 tccgtttctaggagaggtt
NM_001306068_1236_1254 1236 41 cagcgaggaagaataccgg 111 ccggtattcttcctcgctg
NM_001306068_1237_1255 1237 42 agcgaggaagaataccggg 112 cccggtattcttcctcgct
NM_001306068_1238_1256 1238 43 gcgaggaagaataccgggc 113 gcccggtattcttcctcgc
NM_001306068_1284_1302 1284 44 gttgggacggggtcgggtg 114 cacccgaccccgtcccaac
NM_001306068_1290_1308 1290 45 acggggtcgggtggttcgg 115 ccgaaccacccgaccccgt
NM_001306068_1294_1312 1294 46 ggtcgggtggttcggggca 116 tgccccgaaccacccgacc
NM_001306068_1295_1313 1295 47 gtcgggtggttcggggcag 117 ctgccccgaaccacccgac
NM_001306068_1315_1333 1315 48 gcggtggcctctctttcgc 118 gcgaaagagaggccaccgc
NM_001306068_1316_1334 1316 49 cggtggcctctctttcgcg 119 cgcgaaagagaggccaccg
NM_001306068_1317_1335 1317 50 ggtggcctctctttcgcgg 120 ccgcgaaagagaggccacc
NM_001306068_1321_1339 1321 51 gcctctctttcgcggggaa 121 ttccccgcgaaagagaggc
NM_001306068_1340_1358 1340 52 cacctggctggctacggag 122 ctccgtagccagccaggtg
NM_001306068_1350_1368 1350 53 gctacggaggggcgtgtct 123 agacacgcccctccgtagc
NM_001306068_1351_1369 1351 54 ctacggaggggcgtgtctc 124 gagacacgcccctccgtag
NM_001306068_1539_1557 1539 55 acgtgcaagggagctcgct 125 agcgagctcccttgcacgt
NM_001306068_1540_1558 1540 56 cgtgcaagggagctcgctg 126 cagcgagctcccttgcacg
NM_001306068_1541_1559 1541 57 gtgcaagggagctcgctgg 127 ccagcgagctcccttgcac
NM_001306068_1610_1628 1610 58 caccttccgacgctgtcta 128 tagacagcgtcggaaggtg
NM_001306068_1611_1629 1611 59 accttccgacgctgtctag 129 ctagacagcgtcggaaggt
NM_001306068_1612_1630 1612 60 ccttccgacgctgtctagg 130 cctagacagcgtcggaagg
NM_001306068_1613_1631 1613 61 cttccgacgctgtctaggc 131 gcctagacagcgtcggaag
NM_001306068_1615_1633 1615 62 tccgacgctgtctaggcaa 132 ttgcctagacagcgtcgga
NM_001306068_1616_1634 1616 63 ccgacgctgtctaggcaaa 133 tttgcctagacagcgtcgg
NM_001306068_1619_1637 1619 64 acgctgtctaggcaaacct 134 aggtttgcctagacagcgt
NM_001306068_1632_1650 1632 65 aaacctggattagagttac 135 gtaactctaatccaggttt
NM_001306068_336_354 336 66 ctttgagaaggatcgcttt 136 aaagcgatccttctcaaag
NM_001306068_672_690 672 67 gccggcagaggggatctcc 137 ggagatcccctctgccggc
NM_001306068_882_900 882 68 gggccaaggggtgcttgcg 138 cgcaagcaccccttggccc
NM_001306068_884_902 884 69 gccaaggggtgcttgcgcc 139 ggcgcaagcaccccttggc
NM_001306068_1045_1063 1045 70 atgcaaggcatcccggcgc 140 gcgccgggatgccttgcat
表 12
名稱 19 聚體起始位點 SEQ ID NO 有義/ 隨處_ 序列(5'-3') SEQ ID NO 反義 / 引導 _ 序列 (5'-3')
NM_001306068_11_29 11 141 csgsacacCfCfUfcggacagcsasa 211 UfsUfsgcuGfuccgaggGfuGfucgsusu
NM_001306068_57_75 57 142 ascsggcgAfCfGfgagacucgsusa 212 UfsAfscgaGfucuccguCfgCfcgususu
NM_001306068_58_76 58 143 csgsgcgaCfGfGfagacucgususa 213 UfsAfsacgAfgucuccgUfcGfccgsusu
NM_001306068_59_77 59 144 gsgscgacGfGfAfgacucguususa 214 UfsAfsaacGfagucuccGfuCfgccsusu
NM_001306068_60_78 60 145 gscsgacgGfAfGfacucguuusgsa 215 UfsCfsaaaCfgagucucCfgUfcgcsusu
NM_001306068_61_79 61 146 csgsacggAfGfAfcucguuugsgsa 216 UfsCfscaaAfcgagucuCfcGfucgsusu
NM_001306068_62_80 62 147 gsascggaGfAfCfucguuuggsasa 217 UfsUfsccaAfacgagucUfcCfgucsusu
NM_001306068_63_81 63 148 ascsggagAfCfUfcguuuggascsa 218 UfsGfsuccAfaacgaguCfuCfcgususu
NM_001306068_77_95 77 149 gsgsacccCfGfAfgccaaagcsgsa 219 UfsCfsgcuUfuggcucgGfgGfuccsusu
NM_001306068_78_96 78 150 gsasccccGfAfGfccaaagcgsasa 220 UfsUfscgcUfuuggcucGfgGfgucsusu
NM_001306068_79_97 79 151 ascscccgAfGfCfcaaagcgasgsa 221 UfsCfsucgCfuuuggcuCfgGfggususu
NM_001306068_99_117 99 152 cscsugcgAfGfCfcugcuuugsasa 222 UfsUfscaaAfgcaggcuCfgCfaggsusu
NM_001306068_102_120 102 153 gscsgagcCfUfGfcuuugagcsgsa 223 UfsCfsgcuCfaaagcagGfcUfcgcsusu
NM_001306068_137_155 137 154 uscsgccaCfCfAfgagaacggscsa 224 UfsGfsccgUfucucuggUfgGfcgasusu
NM_001306068_160_178 160 155 csasggccAfUfCfggcauuccsgsa 225 UfsCfsggaAfugccgauGfgCfcugsusu
NM_001306068_162_180 162 156 gsgsccauCfGfGfcauuccggsasa 226 UfsUfsccgGfaaugccgAfuGfgccsusu
NM_001306068_163_181 163 157 gscscaucGfGfCfauuccggasgsa 227 UfsCfsuccGfgaaugccGfaUfggcsusu
NM_001306068_231_249 231 158 gscsaccgGfCfGfggaaucucsgsa 228 UfsCfsgagAfuucccgcCfgGfugcsusu
NM_001306068_232_250 232 159 csasccggCfGfGfgaaucucgsgsa 229 UfsCfscgaGfauucccgCfcGfgugsusu
NM_001306068_274_292 274 160 cscsagaaGfGfCfcggcgaaasgsa 230 UfsCfsuuuCfgccggccUfuCfuggsusu
NM_001306068_276_294 276 161 asgsaaggCfCfGfgcgaaagcsgsa 231 UfsCfsgcuUfucgccggCfcUfucususu
NM_001306068_277_295 277 162 gsasaggcCfGfGfcgaaagcgsgsa 232 UfsCfscgcUfuucgccgGfcCfuucsusu
NM_001306068_285_303 285 163 gscsgaaaGfCfGfgaccgccgsusa 233 UfsAfscggCfgguccgcUfuUfcgcsusu
NM_001306068_287_305 287 164 gsasaagcGfGfAfccgccgucsasa 234 UfsUfsgacGfgcgguccGfcUfuucsusu
NM_001306068_292_310 292 165 csgsgaccGfCfCfgucaccggsasa 235 UfsUfsccgGfugacggcGfgUfccgsusu
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NM_001306068_294_312 294 167 gsasccgcCfGfUfcaccggauscsa 237 UfsGfsaucCfggugacgGfcGfgucsusu
NM_001306068_389_407 389 168 asgsacggGfCfCfucccggagsusa 238 UfsAfscucCfgggaggcCfcGfucususu
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NM_001306068_1632_1650 1632 205 asasaccuGfGfAfuuagaguusasa 275 UfsUfsaacUfcuaauccAfgGfuuususu
NM_001306068_336_354 336 206 csusuugaGfAfAfggaucgcususa 276 UfsAfsagcGfauccuucUfcAfaagsusu
NM_001306068_672_690 672 207 gscscggcAfGfAfggggaucuscsa 277 UfsGfsagaUfccccucuGfcCfggcsusu
NM_001306068_882_900 882 208 gsgsgccaAfGfGfggugcuugscsa 278 UfsGfscaaGfcaccccuUfgGfcccsusu
NM_001306068_884_902 884 209 gscscaagGfGfGfugcuugcgscsa 279 UfsGfscgcAfagcacccCfuUfggcsusu
NM_001306068_1045_1063 1045 210 asusgcaaGfGfCfaucccggcsgsa 280 UfsCfsgccGfggaugccUfuGfcaususu
vpN =膦酸乙烯酯2'-MOE；大寫字母(N) = 2'-OH (核糖)；小寫字母(n) = 2'-O-Me (甲基) dN = 2'-H (去氧)；Nf = 2'-F (氟)；s =硫代磷酸酯主鏈修飾；iB =反向無鹼基表 13
SEQ ID NO 有義/ 隨從_ 序列(5'-3') SEQ ID NO 反義 / 引導 _ 序列 (5'-3')
371 CTGCCTCTCCACCAGCCCA 372 TGGGCTGGTGGAGAGGCAG
373 GCAGAGATGGAGAGAGGAA 374 TTCCTCTCTCCATCTCTGC
375 GCGGTTTCCTCCGGGACAA 376 TTGTCCCGGAGGAAACCGC
377 GGACGACGGAGGCGTGATT 378 AATCACGCCTCCGTCGTCC
379 CGGGCACCCGGAAACATGCAGGGAA 380 TTCCCTGCATGTTTCCGGGTGCCCG
381 CCGGAAACATGCAGGGAAG 382 CTTCCCTGCATGTTTCCGG
383 GAAATGAACGAGAGCCACA 384 TGTGGCTCTCGTTCATTTC
385 TGGCACACTCAAGACTCCCACGGAG 386 CTCCGTGGGAGTCTTGAGTGTGCCA
387 CCACGGAGGTTCAGTTCCA 388 TGGAACTGAACCTCCGTGG
389 ACCACCACCACCACCACCA 390 TGGTGGTGGTGGTGGTGGT
391 CGCCATTCATGAAGGGGTG 392 CACCCCTTCATGAATGGCG
393 CATGAAGGGGTGGAGCCTG 394 CAGGCTCCACCCCTTCATG
395 GAGCCTGCTTTGAGCGGAA 396 TTCCGCTCAAAGCAGGCTC
397 CCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTT 398 AAAGCGATCCTTCTCAAAGGCTCGG
399 GGCAGGGCGCCCGCGCAGG 400 CCTGCGCGGGCGCCCTGCC
401 GATGATTAGTTCAGAGATA 402 TATCTCTGAACTAATCATC
實例 2. siRNA 序列及合成
在固相上使用標準胺基磷酸酯化學物質完全裝配所有siRNA單股且經由HPLC進行純化。使純化單股雙螺旋化以得到雙股siRNA。所有siRNA隨從股含有呈不同形式之結合柄C6 -NH2 及/或C6 -SH，一個位於該股之各端處。該一或多個結合柄經由反向無鹼基磷酸二酯或硫代磷酸酯與siRNA隨從股或siRNA引導股連接。以下為活體內實驗中使用之形式之代表性結構。
Figure 02_image025
在隨從股或引導股之5'端具有C6-NH2 結合柄及在隨從股或引導股之3'端具有C6 -SH的siRNA之代表性結構。
Figure 02_image027
在5'端具有C6 -NH2 結合柄及在3'端具有C6-S-PEG之siRNA隨從股或引導股之代表性結構。
Figure 02_image029
在5'端具有C6 -NH2 結合柄及在3'端具有C6 -S-NEM之siRNA隨從股或引導股之代表性結構。
Figure 02_image031
在5'端具有C6-N-SMCC結合柄及在3'端具有C6 -S-NEM之siRNA隨從股之代表性結構。
Figure 02_image033
在5'端具有PEG及在3'端具有C6 -SH之siRNA隨從股或引導股之代表性結構。
Figure 02_image035
在5'端具有C6 -S-NEM及在3'端具有C6 -NH2 之siRNA隨從股或引導股之代表性結構。實例 3. 結合物合成
以下結構示出本文所描述之例示性A-X1 -B-X2 -Y(式I)架構。
Figure 02_image037
架構 -1 ：抗體-Cys-SMCC-5'-隨從股。此結合物係藉由與隨從股之5'端處之順丁烯二醯亞胺(SMCC)的抗體鏈間半胱胺酸結合生成。
Figure 02_image039
架構 -2 ： 抗體-Cys-SMCC-3'-隨從股。此結合物係藉由與隨從股之3'端處之順丁烯二醯亞胺(SMCC)的抗體鏈間半胱胺酸結合生成。
Figure 02_image041
ASC 架構 -3 ： 抗體-Cys-bisMal-3'-隨從股。此結合物係藉由與隨從股之3'端處之雙順丁烯二醯亞胺(bisMal)連接子的抗體鏈間半胱胺酸結合生成。
Figure 02_image043
ASC 架構 -4 ：Fab-Cys-bisMal-3'-隨從股之模型結構。此結合物係藉由與隨從股之3'端處之雙順丁烯二醯亞胺(bisMal)連接子的Fab鏈間半胱胺酸結合生成。
Figure 02_image045
ASC 架構 -5 ：抗體siRNA與附接至一個抗體分子之兩個不同siRNA結合的模型結構。此結合物係藉由將SSB及HPRT siRNA之混合物結合至經還原之mAb鏈間半胱胺酸，進而結合至各siRNA之隨從股之3'端處的雙順丁烯二醯亞胺(bisMal)連接子來生成。
Figure 02_image047
ASC 架構 -6 ：抗體siRNA與附接之兩個不同siRNA結合的模型結構。此結合物係藉由將SSB及HPRT siRNA之混合物結合至經還原之mAb鏈間半胱胺酸，進而結合至各siRNA之隨從股之3'端處的順丁烯二醯亞胺(SMCC)連接子來生成。實例 3.1 使用 SMCC 連接子之抗體 siRNA 結合物合成
Figure 02_image049
合成流程 -1 ： 經由抗體半胱胺酸結合之抗體 -Cys-SMCC-siRNA-PEG 結合物
步驟 1 ： 用 TCEP 進行抗體鏈間二硫鍵還原
用硼砂緩衝液(pH 8)對抗體進行緩衝液更換且達到10 mg/ml濃度。向此溶液中添加2當量之含TCEP之水，且在室溫下旋轉2小時。用含有5 mM EDTA之pH 7.4 PBS對所得反應混合物進行緩衝液更換，且在室溫下將其添加至SMCC-C6-siRNA或SMCC-C6-siRNA-C6-NHCO-PEG-XkDa (2當量) (X = 0.5 kDa至10 kDa)於含有5 mM EDTA之pH 7.4 PBS中的溶液中且旋轉隔夜。藉由分析型SAX管柱層析法對反應混合物之分析顯示抗體siRNA結合物以及未反應之抗體及siRNA。
步驟 2 ：純化
如實例3.4中所描述，藉由AKTA explorer FPLC使用陰離子交換層析法-1純化粗反應混合物。分離含有DAR1及DAR＞2抗體-siRNA-PEG結合物之溶離份，濃縮且用pH 7.4 PBS進行緩衝液更換。
步驟 3 ： 分析經純化之結合物
藉由SEC、SAX層析及SDS-PAGE表徵經分離之結合物。藉由分析型HPLC使用陰離子交換層析法-2或陰離子交換層析法-3評估結合物之純度。兩種方法描述於實例3.4中。經分離之DAR1結合物通常在分析型SAX方法的9.0±0.3 min時溶離，且其純度大於90%。典型的DAR＞2半胱胺酸結合物含有大於85%的DAR2及小於15%的DAR3。
實例 3.2. 使用雙順丁烯二醯亞胺 (BisMal) 連接子之抗體 siRNA 結合物合成
Figure 02_image051
合成流程 2 ： 抗體 -Cys-BisMal-siRNA-PEG 結合物
步驟 1 ：用 TCEP 進行抗體還原
用硼砂緩衝液(pH 8)對抗體進行緩衝液更換且達到5 mg/ml濃度。向此溶液中添加2當量之含TCEP之水，且在室溫下旋轉2小時。用含有5 mM EDTA之pH 7.4 PBS對所得反應混合物進行更換且在室溫下添加至BisMal-C6-siRNA-C6-S-NEM (2當量)與含有5 mM EDTA之pH 7.4 PBS中的溶液中，且保持在4℃下隔夜。藉由分析型SAX管柱層析法對反應混合物之分析顯示抗體siRNA結合物以及未反應之抗體及siRNA。
步驟 2 ：純化
藉由AKTA explorer FPLC使用陰離子交換層析法-1純化粗反應混合物。分離含有DAR1及DAR2抗體-siRNA結合物之溶離份，濃縮且用pH 7.4 PBS進行緩衝液更換。
步驟 -3 ： 分析經純化之結合物
藉由質譜或SDS-PAGE表徵經分離之結合物。藉由分析型HPLC使用陰離子交換層析法-2或陰離子交換層析法-3以及粒徑篩析層析法-1評估結合物之純度。
實例 3.3. 由 mAb 生成 Fab' 及 與 siRNA 結合
Figure 02_image053
流程 -3 ：生成 Fab-siRNA 結合物
步驟 1 ：用胃蛋白酶進行抗體消化
用pH 4.0，20 mM乙酸鈉/乙酸緩衝液對抗體進行緩衝液更換且達到5 mg/ml濃度。添加固定化胃蛋白酶(Thermo Scientific，產品#20343)且在37℃下培育3小時。反應混合物使用30 kDa MWCO Amicon自旋過濾器及pH 7.4 PBS進行過濾。收集滯留物且使用粒徑篩析層析法進行純化以分離F(ab')2。隨後藉由10當量之TCEP使收集之F(ab')2還原且在室溫下在pH 7.4 PBS中與SMCC-C6 -siRNA-PEG5結合。SAX層析法對反應混合物之分析顯示Fab-siRNA結合物以及未反應之Fab及siRNA-PEG。
步驟 2 ：純化
藉由AKTA explorer FPLC使用陰離子交換層析法-1純化粗反應混合物。分離含有DAR1及DAR2 Fab-siRNA結合物之溶離份，濃縮且用pH 7.4 PBS進行緩衝液更換。
步驟 -3 ： 分析經純化之結合物
藉由分析型HPLC使用陰離子交換層析法-2或陰離子交換層析法-3以及SEC方法-1評估經分離之結合物之特徵及純度。
實例 3.4. 純化及分析方法
陰離子交換層析法 (SAX)-1. 1. 管柱：Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um 2. 溶劑A：20 mM TRIS緩衝液，pH 8.0；溶劑B：20 mM TRIS，1.5 M NaCl，pH 8.0；流動速率：6.0 ml/min 3. 梯度： a. %A               %B      管柱體積 b. 100          0        1.00 c. 60       40       18.00 d. 40       60       2.00 e. 40       60       5.00 f.  0        100     2.00 g. 100          0        2.00
陰離子交換層析 (SAX) 法 -2 1. 管柱：Thermo Scientific, ProPacTM SAX-10, Bio LCTM , 4 X 250 mm 2. 溶劑A：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇；溶劑B：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇，1.5 M NaCl；流動速率：0.75 ml/min 3. 梯度： a. 時間    %A %B b. 0.0      90  10 c. 3.00    90  10 d. 11.00  40  60 e. 13.00  40  60 f.  15.00  90  10 g. 20.00  90  10
陰離子交換層析 (SAX) 法 -3 1. 管柱：Thermo Scientific, ProPacTM SAX-10, Bio LCTM, 4 X 250 mm 2. 溶劑A：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇；溶劑B：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇，1.5 M NaCl 3. 流動速率：0.75 ml/min 4. 梯度： a. 時間    %A     %B b. 0.0      90       10 c. 3.00    90       10 d. 11.00  40       60 e. 23.00  40       60 f.  25.00  90       10 g. 30.00  90       10
粒徑篩析層析 (SEC) 法 -1 1. 管柱：TOSOH Biosciences, TSKgelG3000SW XL, 7.8  X 300 mm, 5µM 2. 移動相：150 mM磷酸鹽緩衝液 3. 流動速率：1.0 ml/min，持續15 min
實例 3.5. 使用雙順丁烯二醯亞胺 (BisMal) 連接子之抗體 siRNA 結合物合成
步驟 1 ：用 TCEP 進行抗體還原
用25mM硼酸鹽緩衝液(pH 8)及1mM DTPA對抗體進行緩衝液更換且達到10 mg/ml濃度。向此溶液中添加4當量於相同硼酸鹽緩衝液中之TCEP且在37℃下培育2小時。在室溫下將所得反應混合物與BisMal-siRNA (1.25當量)於pH 6.0 10 mM乙酸鹽緩衝液中之溶液組合且保持在4℃下隔夜。藉由分析型SAX管柱層析法對反應混合物之分析顯示抗體siRNA結合物以及未反應之抗體及siRNA。用10 EQ N-乙基順丁烯二醯亞胺(於DMSO中，在10 mg/mL下)處理反應混合物以覆蓋任何剩餘游離半胱胺酸殘基。
步驟 2 ：純化
藉由AKTA Pure FPLC使用陰離子交換層析(SAX)法-1純化粗反應混合物。分離含有DAR1及DAR2抗體-siRNA結合物之溶離份，濃縮且用pH 7.4 PBS進行緩衝液更換。
陰離子交換層析法 (SAX)-1.
管柱：Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
溶劑A：20 mM TRIS緩衝液，pH 8.0；溶劑B：20 mM TRIS，1.5 M NaCl，pH 8.0；流動速率：6.0 ml/min
梯度： a.         %A      %B      管柱體積 b.         100 0        1 c.         81       19       0.5 d.         50       50       13 e.         40       60       0.5 f.          0        100      0.5 g.         100 0        2
陰離子交換層析 (SAX) 法 -2
管柱：Thermo Scientific, ProPacTM SAX-10, Bio LCTM , 4 X 250 mm
溶劑A：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇；溶劑B：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇，1.5 M NaCl；流動速率：0.75 ml/min
梯度： a.         時間    %A      %B b.         0.0      90       10 c.         3.00    90       10 d.         11.00  40       60 e.         14.00  40       60 f.          15.00  20       80 g.         16.00  90       10 h.         20.00  90       10實例 4. 肌細胞核中 DUX4 之表現圖譜
評估來源於健康個體及FSHD患者之肌管的DUX4表現。如圖4中所示，對肌管進行免疫染色以偵測DUX4表現。藉由標記DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)及肌鈣蛋白T對肌肉細胞之細胞核及細胞質進行免疫染色。如所示，DUX4表現可以低分散的方式在小於1%之肌細胞核中偵測到，從而表明直接自細胞偵測DUX4表現可能在確定DUX4 siRNA活性之作用方面具有挑戰性。實例 5. 經 DUX4 siRNA 處理之 FSHD 供體肌肉細胞中之 DUX4 相關標記基因 之 表現圖譜
使用兩種DUX4 siRNA (siDUX4-1及siDUX4-4揭示於Geng LN等人，Dev.Cell , 2012中)處理病變之肌肉細胞(FSHD供體肌肉細胞)，且定量五種DUX4相關生物標記基因之RNA表現量，如圖5中之條形圖所示。如所示，與基線(100%)相比，siDUX4-1及siDUX4-4兩者均顯著地減少MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4及LEUTX之表現。更特定言之，與基線(100%)相比，siDUX4-4使MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4及LEUTX之表現減少至少約75%。DUX4-目標基因作為生物標記對於量測siRNA介導之DUX4下調具有敏感性。
實例 6. 經培養之 FSHD 初級肌管中 DUX4 siRNA 介導之 5 種 DUX4- 目標生物標記基因表現之減少及 DUX4- 目標生物標記基因之 FSHD 複合物 使用來源於FSHD1患者之初級肌母細胞(MB06)來驗證FSHD複合物作為可靠的替代生物標記以評估公佈的2種DUX4 siRNA (siDUX4-1及siDUX4-4 (Geng LN等人，Dev. Cell , 2012))在劑量依賴性濃度下之DUX4 siRNA活性。將FSHD初級肌母細胞(MB06 (FSHD1))在推薦之培養基中生長。在接種之前，在37℃下，96孔組織培養盤(Costar)用每孔50 µL之1%基質膠塗佈至少2小時，且用PBS洗滌2次。在塗佈之後，將肌母細胞以4000個細胞/孔接種一式四份而不含抗生素，且轉染之前保持24 h。在轉染當天，根據製造商之「向前轉染」說明書將DUX4-4 siRNA與可商購的轉染劑脂染胺RNAiMAX (Life Technologies)及OptiMEM (Life Technologies)進行調配。藉由整合式DNA技術(IDT)合成DUX4-4 siRNA。用25 nM之高濃度的DUX4-4 siRNA在9-倍連續稀釋下對肌母細胞進行轉染。轉染後24小時，藉由含15% KOSR之分化培養基誘導肌原性分化。在誘導分化之後4天，將肌管收集於Trizol中且儲存於-80℃下直至加工處理。使用Direct-zol-96 RNA分離套組(Zymo)根據製造商說明書進行RNA分離。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)使用SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems)將100至500 ng之純化RNA轉化成cDNA。使用QuantStudio 6或7 Flex Real-Time PCR儀器(Applied Biosystems)，藉由qPCR使用TaqMan Fast Universal Master Mix II (Thermo Fisher)及TaqMan探針(Thermo Fisher)對cDNA進行分析，一式兩份。藉由QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3 (Applied Biosystems)分析資料。評估5種DUX4-目標基因之表現量：MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、KHDC1L及TRIM43。針對兩種參考基因複合物AHSA1及RPL27，對DUX4-目標基因表現進行標準化。藉由使用2-ΔΔCt 方法(Livak及Schmittgen，Methods 2001)測定目標mRNA表現相對於模擬處理細胞之百分比。圖6A-B展示經培養之FSHD初級肌管中的DUX4 siRNA介導之5種DUX4-目標生物標記基因表現減少。在經培養之FSHD初級肌管中，DUX4 siRNA減少5種個別DUX4-目標生物標記基因(MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、KHDC1L及TRIM43) (圖6A)或作為5種DUX4-目標生物標記基因之FSHD複合物(圖6B)之表現。實例 7 . DUX4 siRNA 庫篩選 - 在 MB02 及 MB06 中以 2 個 濃度 (10 及 0.5 nM )進行 第一輪
在此實例中，針對70種DUX4 siRNA在兩種FSHD初級肌母細胞株(MB02(FSHD1)及MB06(FSHD1))中之活性對其進行篩選以鑑別更適宜的siRNA候選物。細胞以4,000個細胞/孔之密度接種(MW96)且接著用DUX4 siRNA轉染一式四份，以及工具siRNA作為對照。在以10 nM濃度接種之後24小時進行轉染。在接種之後2天(轉染之後24小時)，用15% KOSR (於DMEM/F-12中)培養基誘導肌原性分化。視細胞株而定，在誘導分化之後3或4天，收集樣品。藉由RT-qPCR評估DUX4下游目標基因表現(針對複合物AHSA1及RPL27管家基因表現值進行標準化)。此實例中所示之資料表示為均值FSHD複合物-/+SEM。N=4。 圖7展示藉由監測MB02 (FSHD1)及MB06 (FSHD1)細胞株中之ACTA1表現評估在10 nM濃度之siDUX4下的肌管分化及存活率的條形圖。 圖8展示藉由量測FSHD複合物表現篩選70種DUX4 siRNA在10 nM濃度下之活性的條形圖(FSHD複合物之計算：Dct = (Av.ct 4 DUX4目標基因)-(Av.ct 2 HKGs)，DDct = Dct (siDUX4)-Dct (模擬)，複合物= 2^-DDct*100 (%))。
圖9展示藉由量測FSHD複合物表現篩選70種DUX4 siRNA在0.5 nM濃度下之活性的條形圖。如本文中所使用，FSHD複合物由4種DUX4-目標基因MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、KHDC1L構成。如表15中所示，當針對HKG複合物(AHSA1、RPL27)進行標準化時(n=4)，FSHD複合物表現之下調與複合物中之個別基因之下調充分相關，表明FSHD複合物表現之有效下調為DUX4 siRNA效能之良好指示符。表 15
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表 15 ( 續 )
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如圖10中所示，從具有70種siRNA候選物之DUX4 siRNA庫中，消除以10 nM在至少一種細胞株中具有低於70% KD的37種候選物。隨後，消除在兩種細胞株中導致ACTA1表現小於70%的3種額外siRNA候選物。隨後，消除以0.5 nM在兩種細胞株中具有零活性(＜10% KD)的2種額外siRNA候選物，得到總共28種siRNA候選物用於下一個篩選過程。表16列出該等選定之28種DUX4 siRNA及在選定之28種DUX4 siRNA之10 nM及0.5 nM濃度下兩種細胞株中之FSHD複合物表現之下調(亦如圖11A及11B中之條形圖所示)。表 16
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人類多型性之資料庫在重複序列中並不可靠且多型性位置可能丟失。因此，在此輪選擇中，出於驗證選定之DUX4 siRNA在多種來源於FSHD患者之肌母細胞中具有活性的目的，消除在兩種肌母細胞株中之一者中顯示較差性能的siRNA。圖12展示70種siRNA根據其在兩種肌母細胞株中下調FSHD複合物之功效的分佈。KD相關分析鑑別出僅在用於完全庫篩選之兩種FSHD初級肌母細胞株中之一者中有效的約10%之DUX4 siRNA。實例 8. DUX4 siRNA 庫篩選 - 以 10 nM 在四種不同患者來源之初級肌母細胞株中進行第二輪
在此實例中，使用總共9種高品質FSHD患者來源之初級肌母細胞株(6種FSHD1，3種FSHD2)。藉由將該等細胞培養在分化培養基(含15% KOSR之DMEM/F-12)中來創建允許可靠偵測FSHD肌管內部中之DUX4目標基因表現的條件。針對各細胞株特定地選擇時間點。所有9種FSHD細胞株均顯示針對工具DUX4 siRNA之濃度依賴性反應。
圖13展示四種不同患者來源之初級肌母細胞株(MB01、MB05、MB11、MB12)中之ACTA1表現量之條形圖。前28種DUX4 siRNA中的大部分並未影響此等細胞株中之ACTA1表現量，而少許siRNA在測試之額外4種FSHD初級細胞株中顯示ACTA1表現量減少大於30% (MB11中有8種，MB05中有3種、MB12中有3種，及MB01中無一種)。另外，如圖14中所示，前28種DUX4 siRNA在所有四種額外FSHD初級細胞株中均顯示活性。幾種siRNA在三種株MB05、MB11、MB12中顯示大於75% KD。總體而言，MB01中之KD水準較低。圖15展示前28種DUX4 siRNA以10 nM濃度在所有FSHD細胞株(MB01、MB02、MB05、MB06、MB11、MB12)中之活性。
前14種DUX4 siRNA係選自前28種DUX4 siRNA。選擇的該前14種DUX4 siRNA為i)顯示無或有極少細胞毒性(視覺鑑別及評估ACTA1表現量)之siRNA，及ii)以10nM及0.5nM濃度均顯示最佳活性之siRNA。表17列出前14種DUX4 siRNA及在選定之14種DUX4 siRNA的10 nM及0.5 nM濃度下在六種初級FSHD細胞株(MB01、MB02、MB05、MB06、MB11、MB12)中之FSHD複合物表現之下調，及在10 nM濃度下在六種初級FSHD細胞株中之ACTA1表現之下調。表18列出前14種DUX4 siRNA及所有9種FSHD初級肌管中之FSHD複合物表現之下調。表 17
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表 18
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實例 9. 評估前 14 種 DUX4 siRNA 在 MB02 、 MB05 及 MB06 中之濃度反應效價
此實例中之實驗目標為選擇針對脫靶分析具有最佳Emax及效價的8種siRNA。使用三種FSHD初級肌母細胞株(MB02、MB05、MB06)。將細胞以4,000個細胞/孔之密度接種(MW96)且用選定之14種DUX4 siRNA進行轉染，一式四份。在接種之後24小時進行轉染。在接種之後2天(轉染之後24小時)用15% KOSR (於DMEM/F-12中)培養基誘導肌原性分化。視細胞株而定，在誘導分化之後3或4天，收集樣品。藉由RT-qPCR評估DUX4下游目標基因表現(針對複合物AHSA1及RPL27管家基因表現值進行標準化)。資料表示為平均值-/+ SEM。N=4。
圖16A至C展示14種選定之DUX4 siRNA在三種FSHD患者來源之初級肌管(分別為MB02、MB05、MB06)中之濃度反應。前14種DUX4 siRNA中之大部分在三種FSHD患者來源之初級肌母細胞株中的DUX-4-目標基因表現減少大於75%。亦觀測到siRNA之間的效價差異視細胞株而介於60至100倍之間。表19至22展示在三種FSHD患者來源之初級肌管中基於FSHD複合物評估的DUX4 siRNA之效價。表 19
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表 20
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表 21
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表 22
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實例 11. 經培養之FSHD初級肌管中抗體-DUX4 siRNA結合物(DUX4-AOC)介導之FSHD複合物(DUX4-目標生物標記基因之複合物)表現之減少。
在FSHD1患者來源之初級肌管(MB06)中評估16種DUX4-AOC (8種vpUq AOC或8種Non-VP AOC)之活體外濃度反應效價及最大功效。AOC之DUX4 siRNA之引導股在該股之5'處含乙烯基膦酸酯(vpUq)或在該股之5'端處不含乙烯基膦酸酯(Non-VP)。
針對人類TfR1之人類IgG1抗體在藉由用雙重基因載體轉染CHOK1SV GS-KO宿主細胞株所形成之CHO穩定池中表現。使用蛋白質A親和力層析法自細胞培養上清液中捕獲抗體。使用疏水性相互作用層析(減少聚集物)及陰離子交換層析(減少宿主細胞DNA及內毒素)進一步純化所得抗體。將最終抗體以20 mg/mL之濃度進行緩衝液更換成PBS或50 mM檸檬酸鈉緩衝液，pH 6.5。藉由粒徑篩析層析法評估抗體之純度。
在固相上使用標準胺基磷酸酯化學物質裝配引導股及充分互補RNA隨從股且經由HPLC進行純化。使純化單股雙螺旋化以得到雙股siRNA。產生在5'端處具有經乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸結構的引導股。隨從股經由硫代磷酸酯-反向無鹼基-磷酸二酯連接子在5'端具有結合柄。
使用隨機半胱胺酸結合方法產生抗體寡核苷酸結合物(AOC)。在與順丁烯二醯亞胺連接子-siRNA結合之前，抗體之鏈間二硫鍵用TCEP進行部分還原。使用強陰離子交換層析純化反應混合物以確保藥物-抗體比率(DAR)等於1(亦即，一個抗體分子有一個siRNA分子)。將收集之AOC溶離份濃縮，緩衝液更換成PBS及使用0.2 µm過濾器進行無菌過濾。使用強陰離子交換層析、粒徑篩析層析法及SDS-PAGE評估AOC之純度。
將FSHD初級肌母細胞(MB06 (FSHD1))在推薦之培養基中生長。在接種之前，在37℃下，96孔組織培養盤(Costar)用每孔50 µL之1%基質膠塗佈至少2小時，且用PBS洗滌2次。在塗佈之後，將肌母細胞以4000個細胞/孔接種一式四份。接種之後2天，藉由含15% KOSR之分化培養基誘導肌原性分化。誘導分化之後24小時，將siDUX4-AOC以100 nM之高濃度在10倍連續稀釋下添加於培養基中。未處理之細胞保持作為相對的對照組。在與DUX4-AOC一起培育3天之後，將肌管收集於Trizol中且儲存於-80℃下直至加工處理。使用Direct-zol-96 RNA分離套組(Zymo)根據製造商說明書進行RNA分離。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)使用SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems)將100至500 ng之純化RNA轉化成cDNA。使用QuantStudio 6或7 Flex Real-Time PCR儀器(Applied Biosystems)，藉由qPCR使用TaqMan Fast Universal Master Mix II (Thermo Fisher)及TaqMan探針(Thermo Fisher)對cDNA進行分析，一式兩份。藉由QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3 (Applied Biosystems)分析資料。藉由計算FSHD複合物得分來評估DUX4-目標基因表現量，其將針對兩種參考基因(AHSA1及RPL27)進行標準化之4種DUX4-目標基因(MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX及KHDC1L)之表現量進行整合。
圖18A至B展示經培養之FSHD初級肌管中DUX4-AOC介導之DUX4-目標生物標記基因表現減少的劑量反應曲線。在FSHD1患者來源之初級肌管中，大部分含乙烯基膦酸酯之DUX4-AOC (圖18A)及幾種不含乙烯基膦酸酯之DUX4-AOC (圖18B)使得4種DUX4-目標生物標記基因(MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX及KHDC1L)之FSHD複合物之表現減少。總體而言，DUX4-AOC使得DUX4-目標生物標記基因表現減少且AOC中之DUX4 siRNA上存在乙烯基膦酸酯會促進DUX4-目標生物標記基因表現減少。實例 12. 3 種 不同鼠類骨骼肌中 Malat1-siRNA AOC 介導之活體內經核定位之 Inc-RNA Malat1 mRNA 含量減少
藉由在尾部靜脈單IV推注注射5 mL/kg體重之Malat1 或 Scramble AOC向野生型雌性CD-1小鼠(大約6-8週齡)給藥一次，其中siRNA結合至鼠類抗運鐵蛋白受體(mTfR1)抗體，劑量為0.3、1、3、6 mg/kg體重(siRNA量)。處理後2週，將肌肉組織樣品收集於含有陶瓷珠之試管中，快速冷凍於液氮中，且接著在1 mL冷Trizol中使用FastPrep-24 (MP Biomedicals)進行均質化。將均質物上清液用於使用Direct-zol-96 RNA分離套組(Zymo)根據製造商說明書進行RNA分離。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)使用SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems)將100至500 ng之純化RNA轉化成cDNA。使用QuantStudio 6或7 Flex Real-Time PCR儀器(Applied Biosystems)，藉由qPCR使用TaqMan Fast Universal Master Mix II (Thermo Fisher)及TaqMan探針(Thermo Fisher)對cDNA進行分析，一式兩份。藉由QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3 (Applied Biosystems)分析資料。針對參考基因Ppib ， 對目標基因表現進行標準化。使用2-ΔΔCt 方法測定處理樣品中之目標mRNA表現相對於對照處理組之百分比。資料表示為相對於PBS對照組之% (均值±SEM；針對siMalat1及siScramble AOC，N=4，針對PBS組，N=5)。
圖19展示小鼠之骨骼肌中Malat1 siRNA-AOC介導之活體內經核定位之Inc-RNA Malat1含量減少。向小鼠單次投與至多6 mg/kg之Malat1 siRNA-AOC (siRNA劑量)在給藥後2週，使得骨骼肌中之核Malat1 表現減少至多80%。核Malat1 mRNA表現量之減少指示活體內AOC靶向核RNA以降解之能力。實例 13. 在 8- 週時間段內 ， 在 3 mg/kg siRNA AOC 之單劑量下鼠類骨骼肌中持續的 AOC 介導之活體內 SSB mRNA 含量減少
藉由在尾部靜脈單IV推注注射5 mL/kg體重的與鼠類抗TfR1 (mTfR1)抗體結合之不含乙烯基膦酸酯(Non-VP)或含乙烯基膦酸酯(vpUq)之Ssb siRNA (3 mg/kg體重之(siRNA量)劑量)向野生型雄性C57BL/6小鼠(大致12至16週齡)給藥一次。在給藥之後的以下時間點收集腓腸肌：第1天、第7天、第14天、第28天、第43天及第57天。將肌肉置放於含有陶瓷珠之試管中，快速冷凍於液氮中，且接著在1 mL冷Trizol中使用FastPrep-24 (MP Biomedicals)進行均質化。將均質物上清液用於使用Direct-zol-96 RNA分離套組(Zymo)根據製造商說明書進行RNA分離。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)使用SimpliAmp Thermal Cycler (Applied Biosystems)將100至500 ng之純化RNA轉化成cDNA。使用QuantStudio 6或7 Flex Real-Time PCR儀器(Applied Biosystems)，藉由qPCR使用TaqMan Fast Universal Master Mix II (Thermo Fisher)及TaqMan探針(Thermo Fisher)對cDNA進行分析，一式兩份。藉由QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3 (Applied Biosystems)分析資料。針對參考基因Ppib，對Ssb 基因表現進行標準化。使用2-ΔΔCt 方法測定處理樣品中之目標mRNA表現相對於對照處理組(PBS)之百分比。資料表示為相對於PBS對照組之% (均值±SEM；針對siSsb-AOC，N=4，針對PBS組，N=3至5)。
圖20展示在8週時間段內，在3 mg/kg siRNA之單劑量下鼠類骨骼肌中SSB siRNA-AOC介導之活體內SSB mRNA含量減少。在3 mg/kg (siRNA劑量)單次投與不含乙烯基膦酸酯(Non-VP)及含乙烯基膦酸酯(vpUq)之SSB siRNA-AOC之後，在小鼠骨骼肌中實現持續的AOC介導之活體內SSB mRNA表現量減少。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示案之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述的本揭示案之實施例之各種替代例可在實踐本揭示案時使用。預期以下申請專利範圍界定本揭示案之範疇，且因此涵蓋在此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
在隨附申請專利範圍中細緻闡述本發明之各種態樣。將參考闡述其中利用本發明原理之說明性實施例及下文隨附圖式之以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優勢的較佳理解。該專利申請檔案含有至少一個彩製圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利申請公開案之複本。
圖 1 示出FSHD病變之圖式。
圖 2 展示電腦模擬(in silico)選擇DUX4 siRNA之流程圖。
圖 3 示出DUX4 mRNA轉錄本中之選定DUX4 siRNA之位置及數量。
圖 4 展示肌細胞核中DUX4表現之免疫螢光偵測。
圖 5 展示siRNA介導之DUX4目標生物標記基因表現減少的條形圖。
圖 6A 至 B 展示經培養之FSHD初級肌管中siRNA介導之DUX4目標生物標記基因表現減少的圖式及經培養之FSHD初級肌管中siRNA介導之DUX4目標生物標記基因表現減少的FSHD複合物。
圖 7 展示在濃度為10 nM之DUX4 siRNA的處理下，肌管中之ACTA1基因表現的條形圖。
圖 8 展示在濃度為10 nM之DUX4 siRNA的處理下，肌管中之FSHD複合物表現。
圖 9 展示在濃度為0.5 nM之DUX4 siRNA的處理下，肌管中之FSHD複合物表現。
圖 10 展示基於初始篩選之資料選擇DUX4前28個siRNA的流程圖。
圖 11A 至 B 展示在用濃度為10 nM及0.5 nM之DUX4 siRNA處理後，兩種FSHD初級肌管中之FSHD複合物表現。
圖 12 展示鑑別在一或多種FSHD初級肌管中有效之DUX4 siRNA的KD相關分析。
圖 13 展示在濃度為10 nM之DUX4 siRNA的處理下，患者來源之肌管中之ACTA1基因表現。
圖 14 展示在濃度為10 nM之DUX4 siRNA的處理下，患者來源之肌管中之FSHD複合物表現。
圖 15 展示在DUX4 siRNA之處理下，6種患者來源之肌管中之FSHD複合物表現。
圖 16A 至 C 展示在14種選定DUX4 siRNA之處理下，3種患者來源之肌管中之FSHD複合物表現之圖式。
圖 17 A 至 C 展示在8種選定DUX4 siRNA之處理下，3種FSHD患者來源之肌管中之FSHD複合物表現之圖式。
圖 18 A 至 B 展示在8種不含乙烯基膦酸酯之抗體DUX4-siRNA結合物(DUX4-AOC)或8種含乙烯基膦酸酯之抗體DUX4-siRNA結合物的處理下，經培養FSHD初級肌管中之FSHD複合物表現之圖式。
圖 19 展示小鼠之骨骼肌中AOC介導之活體內核定位Inc-RNA Malat1含量減少的圖式。
圖 20 展示在8週時間段內，在3 mg/kg siRNA之單劑量下鼠類骨骼肌中持續的SSB-AOC介導之活體內SSB mRNA含量減少的圖式。
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Claims (21)

  1. 一種聚核酸分子結合物，其包含： 與聚核酸分子結合之抗體或其抗原結合片段，該聚核酸分子與DUX4 之目標序列雜交；及 其中該聚核酸分子結合物介導針對DUX4 之RNA干擾。
  2. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該抗體或其抗原結合片段為抗運鐵蛋白受體抗體或其抗原結合片段。
  3. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該抗體或其結合片段包含非人類抗體或其抗原結合片段、人類抗體或其抗原結合片段、人類化抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、單株抗體或其抗原結合片段、單價Fab'、二價Fab2、單鏈可變片段(scFv)、雙功能抗體、微型抗體、奈米抗體、單域抗體(sdAb)或駱駝抗體或其抗原結合片段。
  4. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核苷酸與DUX4 之目標序列之至少8個連續鹼基雜交。
  5. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核苷酸為約8至約50個核苷酸長或約10至約30個核苷酸長。
  6. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且該有義股包含與選自SEQ ID NO:1至70或SEQ ID NO:141至210之序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致。
  7. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且該反義股包含與選自SEQ ID NO:71至140或SEQ ID NO:211至280之序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致。
  8. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子包含有義股及/或反義股，且其中該有義股及/或該反義股包含至少一個2'修飾之核苷酸、至少一個經修飾之核苷酸間鍵或至少一個反向無鹼基部分。
  9. 如請求項8之聚核酸分子結合物，其中該2'修飾之核苷酸： 包含2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、2'-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之核苷酸； 包含鎖核酸(locked nucleic acid；LNA)或乙烯核酸(ENA)；或 包含其組合。
  10. 如請求項8之聚核酸分子結合物，其中該至少一個經修飾之核苷酸間鍵包含硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵。
  11. 如請求項8之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子包含3個或更多個選自以下的2'修飾之核苷酸：2'-O-甲基修飾之核苷酸及2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸。
  12. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子包含5'端乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸。
  13. 如請求項8之聚核酸分子結合物，其中該有義及/或反義股在5'端包含至少兩個、三個、四個連續的該2'-O-甲基修飾之核苷酸。
  14. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子結合物包含將該抗體或其抗原結合片段連接至該聚核酸分子的連接子。
  15. 如請求項14之聚核酸分子結合物，其中該連接子為C1-C6烷基連接子、同型雙官能連接子或異型雙官能連接子，且包含順丁烯二醯亞胺基、二肽部分、苯甲酸基團或其衍生物、可裂解連接子或不可裂解連接子。
  16. 如請求項1之聚核酸分子結合物，其中該聚核酸分子與該抗體或其抗原結合片段之間的比率為約1:1、2:1、3:1或4:1。
  17. 一種如請求項1至16中任一項之聚核酸分子結合物的用途，其用於製造用以治療受試者之臉肩胛肱骨肌肉失養症(Facioscapulohumeral muscular dystrophy；FSHD)的藥劑。
  18. 如請求項17之用途，其中該聚核酸分子介導針對人類DUX4之RNA干擾且調節該受試者之肌肉萎縮。
  19. 如請求項17之用途，其中與未處理細胞中之DUX4基因之mRNA轉錄本的數量相比，該RNA干擾包含減少DUX4基因之mRNA轉錄本之表現至少50%、至少60%或至少70%或更多。
  20. 如請求項17之用途，其中該聚核酸分子結合物減少該受試者之細胞中選自由以下組成之群的標記基因之表現：MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L及LEUTX。
  21. 如請求項20之用途，其中與未處理細胞相比，該標記基因之表現減少至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多。
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