CN118265544A - 治疗面肩肱型肌营养不良的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于治疗面肩肱型肌营养不良(FSHD)的多核酸分子、药物组合物和方法。

Description

治疗面肩肱型肌营养不良的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2021年9月16日提交的美国临时申请号63/245,123的权益，其全部内容以引用方式整体并入本文。
背景技术
肌萎缩是指诸如控制运动的骨骼肌或随意肌、心肌和平滑肌等肌肉的肌肉质量损失或进行性弱化和退化。包括废用、饥饿、癌症、糖尿病和肾功能衰竭在内的各种病理生理病况或用糖皮质激素治疗会导致肌萎缩和力量下降。肌萎缩的表型效应是由各种分子事件引起的，包括抑制肌肉蛋白质合成、增加肌肉蛋白质转换、卫星细胞分化的异常调节以及肌肉纤维类型的异常转化。
FSHD是一种罕见的、进行性的和致残的疾病，目前尚无批准的治疗方法。FSHD是最常见的肌营养不良之一，无偏好地影响两性，通常在青少年和年轻人中发病。FSHD的特征是进行性骨骼肌丧失，最初导致面部、肩部、手臂和躯干肌肉无力，然后发展为下肢和腰带肌肉无力。骨骼肌无力会导致严重的身体限制，包括面部肌肉的逐渐丧失，导致无法微笑或交流，难以使用手臂进行日常生活活动和难以起床，许多患者最终依赖于使用轮椅进行日常活动。大多数FSHD患者还报告有慢性疼痛、焦虑和抑郁。
FSHD是由骨骼肌中基因DUX4的异常表达引起的，导致DUX4蛋白的不适当存在。通过RNA诱导的基因沉默进行的基因抑制提供了几种控制水平：转录失活、小干扰RNA(siRNA)诱导的mRNA降解和siRNA诱导的转录弱化。在一些情况下，RNA干扰(RNAi)对多细胞分裂提供持久的影响。因此，RNAi代表了可用于药物靶标验证、基因功能分析、途径分析和疾病治疗的可行方法。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用的方式并入一样。
发明内容
在一些方面，本文描述了一种多核酸分子缀合物，其包含：缀合至与DUX4的靶序列杂交的多核酸分子的抗体或其抗原结合片段；其中多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:72、76、126或131-136的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，其中多核酸分子在2、6、14和16位包含2’-F修饰的核苷酸，并且其中多核酸分子缀合物介导针对DUX4的RNA干扰。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包括非人抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体或其抗原结合片段、单价Fab'、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或骆驼科抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，多核酸分子的长度为约16至约30个核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链包含UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu、usNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu或vpNsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsus中的至少一个的核酸序列，其中vpN＝乙烯基膦酸酯VpUq，小写字母(n)＝2’-O-Me修饰的，Nf＝2’-F修饰的，并且s＝硫代磷酸酯骨架修饰。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链包含与选自SEQ ID NO:2、6、56或61-66的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，其中有义链包含至少2个或至少3个连续的2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链包含与选自SEQ ID NO:2、6、56或61-66的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，多核酸分子包含硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，多核酸分子包含六个或更多个选自2’-O-甲基和2’-脱氧-2’-氟的2’修饰的核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子包含5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸选自：其中B是杂环碱基部分；R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核酸分子的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，有义链和/或反义链在5’端或3’端包含至少两个、至少三个或至少四个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含通过抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基或赖氨酸残基将抗体或其抗原结合片段连接至多核酸分子的接头。在一些实施方案中，接头是C1-C6烷基接头。在一些实施方案中，接头是同双官能接头或异双官能接头，并且包含马来酰亚胺基团、二肽部分、苯甲酸基团或其衍生物。在一些实施方案中，接头是可切割或不可切割的接头。在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含的多核酸分子与抗体或其抗原结合片段之间的比率为约1:1、2:1、3:1或4:1。在一些实施方案中，多核酸分子介导针对人DUX4的RNA干扰并调节对象的肌萎缩。在一些实施方案中，RNA干扰包括与未处理细胞中DUX4基因的mRNA转录物的量相比，使DUX4基因的mRNA转录物的表达降低至少50％、至少60％或至少70％或更多。在一些实施方案中，RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L和LEUTX。在一些实施方案中，RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。在一些实施方案中，影响标志物基因的表达是使标志物基因的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更多。在一些实施方案中，肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在一些方面，本文描述的是一种药物组合物，其包含本文所述的多核酸分子缀合物；以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊、直肠、透皮、静脉内、皮下或鞘内施用。
在一些方面，本文描述的是一种用于治疗有需要的对象的肌营养不良的方法，其包括：提供如本文所述的多核酸缀合物；以及向有需要的对象施用多核酸缀合物以治疗肌营养不良，其中多核酸缀合物减少人DUX4的mRNA转录物的量。在一些实施方案中，多核酸缀合物介导针对人DUX4的RNA干扰并调节对象的肌营养不良。在一些实施方案中，RNA干扰包括影响标志物基因在受肌营养不良影响的细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。在一些实施方案中，肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在一些方面，本文描述的是本文所述的多核酸分子缀合物或本文所述的药物组合物用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的用途。在一些实施方案中，本文描述的是本文所述的多核酸分子缀合物或本文所述的药物组合物用于制造用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的药物的用途。在一些方面，本文描述的是一种包含本文所述的多核酸分子缀合物或本文所述的药物组合物的试剂盒。
在一些方面，本文描述的是一种介导针对DUX4的RNA干扰的多核酸分子，其中多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
在一些方面，本文描述的是一种介导针对DUX4的RNA干扰的双链多核酸分子，其中双链多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，并且有义链包含与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
在一些方面，本文描述的是一种介导针对DUX4的RNA干扰的双链多核酸分子，其中双链多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含含有与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的核酸序列，并且有义链包含含有与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在某些方面，本文公开了用于调节与肌萎缩、尤其是面肩肱型肌营养不良(FSHD)相关的基因的多核酸分子和药物组合物。在一些方面，本文还描述了用本文公开的多核酸分子或多核酸分子缀合物治疗肌萎缩、尤其是FSHD的方法。
在某些方面，本文公开了一种多核酸分子缀合物，其包含缀合至与DUX4的靶序列杂交的多核酸分子的抗体或其抗原结合片段，并且多核酸分子缀合物介导针对DUX4的RNA干扰。在某些方面，抗体或其抗原结合片段包括非人抗体或其结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体或其抗原结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或骆驼科抗体或其抗原结合片段。在某些方面，抗体或其抗原结合片段是抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且其中有义链和/或反义链各自独立地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个经修饰的核苷酸间连接，或至少一个反向无碱基部分。在某些方面，多核苷酸与DUX4的靶序列的至少8个连续碱基杂交。在某些方面，多核苷酸的长度为约8至约50个核苷酸或长度为约10至约30个核苷酸。在某些方面，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:1-70或SEQ ID NO:141-210的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。可替代地和/或另外地，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:71-140或SEQ ID NO:211-280的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。可替代地和/或另外地，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:142、146、196、201-206、412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列是相同的。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列是相同的。
在某些方面，多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸，并且进一步地，2’修饰的核苷酸包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸，或包含锁核酸(LNA)或乙烯核酸(ENA)，或包含其组合。在某些方面，至少一个经修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在某些方面，多核酸分子包含三个或更多个选自2’-O-甲基和2’-脱氧-2’-氟的2’修饰的核苷酸。在某些方面，多核酸分子包含5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；R4和R5独立地选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自锁核酸(LNA)或乙烯核酸(ENA)。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
另一个实施方案提供了多核酸分子缀合物的多核酸分子，其中至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸为：
在某些方面，2’修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且2’-O-甲基修饰的核苷酸位于有义链和/或反义链的5’端。在一些方面，2’-O-甲基修饰的核苷酸是嘌呤核苷酸，或2’-O-甲基修饰的核苷酸是吡啶核苷酸。在某些方面，有义链和/或反义链在5’端包含至少两个、三个、四个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在某些方面，多核酸分子缀合物包含将靶细胞结合部分与多核酸部分连接的接头。在此类方面，接头是C1-C6烷基接头，或接头是同双官能接头或异双官能接头，并且包含马来酰亚胺基团、二肽部分、苯甲酸基团或其衍生物。可替代地和/或另外地，接头是可切割或不可切割的接头。在某些方面，多核酸部分与靶细胞结合部分之间的比率为约1:1、2:1、3:1或4:1。
在某些方面，多核酸部分介导针对人DUX4的RNA干扰并调节对象的肌营养不良或肌萎缩的症状。在一些方面，RNA干扰包括与未处理细胞中DUX4基因的mRNA转录物的量相比，使DUX4基因的mRNA转录物的表达降低至少50％、至少60％或至少70％或更多。可替代地和/或另外地，RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自包括MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L和LEUTX或由它们组成的组。在一些方面，影响标志物基因的表达是使标志物基因的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更多。在一些方面，肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。可替代地和/或另外地，RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自包括WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD或由它们组成的组。在一些方面，影响标志物基因的表达是使标志物基因的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更多。在一些方面，肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在某些方面，多核酸分子缀合物包含式(I)的分子：A-X-B，其中A是抗体或其抗原结合片段，B是与DUX4的靶序列杂交的多核酸分子，X是键或非聚合接头，其与A的半胱氨酸残基缀合。
在某些方面，本文公开的是一种药物组合物，其包含如本文所述的多核酸分子缀合物，以及药学上可接受的赋形剂。在一些方面，药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。在一些方面，药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊、直肠、透皮或静脉内、皮下或鞘内施用。
FSHD的症状包括对骨骼肌的影响。受FSHD影响的骨骼肌包括眼睛和嘴巴周围的肌肉、肩部肌肉、上臂肌肉、小腿肌肉、腹部肌肉和臀部肌肉。在一些情况下，FSHD的症状也会影响视力和听力。在一些情况下，FSHD的症状也会影响心脏或肺的功能。在一些情况下，FSHD的症状包括肌无力、肌萎缩、肌营养不良、疼痛性炎症、挛缩、脊柱侧弯、脊柱前凸、换气不足、视网膜异常、暴露于角膜炎、轻度听力损失和EMG异常。如本文所用，术语肌萎缩是指FSHD的广泛的肌肉相关影响。
在某些方面，本文公开了一种用于治疗有需要的对象的肌营养不良的方法，所述方法通过提供如本文所述的多核酸缀合物并向有需要的对象施用多核酸缀合物以治疗肌营养不良。多核酸缀合物减少人DUX4的mRNA转录物的量。在一些方面，多核酸部分介导针对人DUX4的RNA干扰调节对象的肌萎缩。在某些方面，RNA干扰包括影响DUX4的标志物基因在受肌营养不良影响的细胞中的表达，所述标志物基因选自包括MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L和LEUTX或由它们组成的组。在某些方面，RNA干扰包括影响DUX4的标志物基因在受肌营养不良影响的细胞中的表达，所述标志物基因选自包括WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD或由它们组成的组。
优选地，肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在某些方面，本文公开了如本文所述的多核酸分子缀合物或药物组合物用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的用途。在某些方面，本文还公开了如本文所述的多核酸分子缀合物或药物组合物用于制造用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的药物的用途。
在某些方面，本文公开了一种试剂盒，其包含如本文所述的多核酸分子缀合物或药物组合物。
附图说明
在所附权利要求书中详细阐明了本公开的各个方面。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性方面加以阐述的详细描述以及以下附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解。
图1图示了FSHD病理学图。
图2显示了DUX4 siRNA的计算机模拟选择的流程图。
图3图示了DUX4 mRNA转录物中所选DUX4 siRNA的位置和数量。
图4A示出FSHD小鼠模型中的骨骼肌中DUX4-靶基因的体内下调的图。
图4B示出DUX-4siRNA的体内肌肉组织浓度的图。
图5A图示了在过客链或引导链的5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-SH的siRNA的代表性结构。
图5B图示了5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-S-PEG的siRNA过客链或引导链的代表性结构。
图5C图示了5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-S-NEM的siRNA过客链或引导链的代表性结构。
图5D图示了5’端具有C6-N-SMCC缀合柄且3’端具有C6-S-NEM的siRNA过客链的代表性结构。
图5E图示了5’端具有PEG且3’端具有C6-SH的siRNA过客链或引导链的代表性结构。
图5F图示了5’端具有C6-S-NEM且3’端具有C6-NH2缀合柄的siRNA过客链或引导链的代表性结构。
图6A图示了抗体-Cys-SMCC-5’-过客链(架构-1)。该缀合物通过与过客链5’端的马来酰亚胺(SMCC)的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。
图6B图示了抗体-Cys-SMCC-3’-过客链(架构-2)。该缀合物通过与过客链3’端的马来酰亚胺(SMCC)的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。
图6C图示了抗体-Cys-bisMal-3’-过客链(ASC架构-3)。该缀合物通过与过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。
图6D图示了Fab-Cys-bisMal-3’-过客链的模型结构(ASC架构-4)。该缀合物通过与过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头的Fab链间半胱氨酸缀合而生成。
图6E图示了抗体siRNA缀合物的模型结构(ASC架构-5)，其中两个不同的siRNA与一个抗体分子连接。该缀合物通过将SSB siRNA和HPRT siRNA的混合物在每个siRNA过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头处缀合至还原的mAb链间半胱氨酸而生成。
图6F图示了抗体siRNA缀合物的模型结构(ASC架构-6)，其中连接有两个不同的siRNA。该缀合物通过将SSB siRNA和HPRT siRNA的混合物在每个siRNA过客链3’端的马来酰亚胺(SMCC)接头处缀合至还原的mAb链间半胱氨酸而生成。
图7A图示了通过抗体半胱氨酸缀合的抗体-Cys-SMCC-siRNA-PEG缀合物的示例性合成方案(合成方案-1)。
图7B图示了抗体-Cys-BisMal-siRNA-PEG缀合物的示例性合成方案(合成方案-2)。
图7C图示了Fab-siRNA缀合物生成的示例性合成方案(合成方案-3)。
具体实施方式
FSHD是由骨骼肌中基因DUX4的异常表达引起的，导致DUX4蛋白的不适当存在。DUX4本身是转录因子，其诱导其他基因的表达，正是这些不恰当表达的下游基因导致了肌肉病理学改变。通常DUX4驱动的基因表达仅限于生殖系和早期干细胞发育。在FSHD患者中，骨骼肌中的DUX4蛋白调节其他基因产物，其中一些对肌肉有毒性。异常DUX4驱动的基因表达的证据是区分受FSHD影响的肌肉组织与健康肌肉的主要分子特征。FSHD中异常DUX4表达的结果是肌肉死亡并被脂肪替代，导致骨骼肌无力和进行性残疾。数据表明，降低DUX4基因及其下游转录程序的表达可以从根本原因上为治疗FSHD提供一种改变疾病的治疗方法。
DUX4基因可以通过两种方式去沉默或去阻遏。在FSHD1(约占95％的FSHD患者)中，存在导致第4号染色体长臂端部附近区域(称为D4Z4)的DNA阵列缩短的突变，该区域在染色体的亚端粒区域具有重复。D4Z4区域异常缩短，包含1-10个重复而不是正常的11到100个重复。这种收缩导致D4Z4区域的低甲基化和DUX4的去阻遏。FSHD2患者不具有有意义的D4Z4重复收缩，但在调节基因(称为SMCHD1基因)中有突变，该基因通常通过DNA甲基化导致DUX4基因的阻遏。当由于SMCHD1基因的突变导致D4Z4区域的低甲基化而失去这种阻遏时，DUX4会不适当地表达，从而诱发疾病状态。图1显示了FSHD病理学的示意图。
核酸(例如，RNAi)疗法是具有高选择性和特异性的靶向疗法。然而，在一些情况下，核酸疗法也受到细胞内摄取不良、血液稳定性有限和非特异性免疫刺激的阻碍。为了解决这些问题，探索了核酸组合物的各种修饰，例如，用于更好地稳定和/或降低毒性的新型接头，用于提高靶标特异性和/或靶标递送的结合部分的优化，以及用于提高稳定性和/或降低脱靶效应的核酸聚合物修饰。
在一些方面，构成核酸组合物的不同组分的排列或顺序进一步影响细胞内摄取、稳定性、毒性、功效和/或非特异性免疫刺激。例如，如果核酸组分包括结合部分、聚合物和多核酸分子(或多核苷酸)，则该结合部分、聚合物和/或多核酸分子(或多核苷酸)的顺序或排列(例如，结合部分-多核酸分子-聚合物、结合部分-聚合物-多核酸分子或聚合物-结合部分-多核酸分子)进一步影响细胞内摄取、稳定性、毒性、功效和/或非特异性免疫刺激。
在一些方面，本文描述的包括多核酸分子和多核酸分子缀合物，用于治疗面肩肱型肌营养不良(FSHD)、尤其是与此相关的肌营养不良和/或肌萎缩。在一些情况下，本文所述的多核酸分子缀合物增强细胞内摄取、稳定性和/或功效。在一些情况下，多核酸分子缀合物包含缀合至多核酸分子的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，多核酸分子与DUX4(优选人DUX4)的靶序列杂交。在一些情况下，核酸分子与具有登录号NM_001306068的人DUX4的靶序列杂交。在一些情况下，核酸分子与具有SEQ ID NO:439的人DUX4的靶序列杂交。
本文所述的其他方面包括治疗FSHD的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的多核酸分子或多核酸分子缀合物。
多核酸分子
在某些方面，多核酸分子与双同源盒4(DUX4)基因的靶序列杂交。在一些情况下，本文所述的多核酸分子与人DUX4基因(DUX4)的靶序列杂交并减少肌细胞中的DUX4 mRNA。
在一些方面，多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:1-70的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些方面，多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:141-210的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些方面，多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:71-140的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些方面，多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:211-280的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些方面，多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:142、146、196、201-206、412-420或430-438的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些方面，多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-70的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，第二多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:71-140的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:141-210的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，第二多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:211-280的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些情况下，第一多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，第二多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些方面，多核酸分子包含有义链(例如，过客链)和反义链(例如，引导链)。在一些情况下，有义链(例如，过客链)包含与选自SEQ ID NO:1-70的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，反义链(例如，引导链)包含与选自SEQ ID NO:71-140的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些方面，多核酸分子包含有义链(例如，过客链)和反义链(例如，引导链)。在一些情况下，有义链(例如，过客链)包含与选自SEQ ID NO:141-210的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，反义链(例如，引导链)包含与选自SEQ ID NO:211-280的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，有义链(例如，过客链)包含与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，反义链(例如，引导链)包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些情况下，有义链包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、6、14、36、52、56、61、62、63、65或66的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，反义链包含与选自SEQ ID NO:71、72、73、76、84、106、122、127、131、132、133、135或136的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，siRNA包含如表11所示的有义链和反义链。
在一些情况下，有义链包含与选自SEQ ID NO:141、142、143、146、176、192、196、201、202、203、205或206的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，反义链包含与选自SEQ ID NO:211、212、213、216、246、262、266、271、272、273、275或276的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，siRNA包含如表12所示的有义链和反义链。
在一些情况下，有义链包含与选自表14和表15中的SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些情况下，反义链包含与选自表14和表15中的SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列是相同的。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列是相同的。
在一些方面，多核酸分子的序列具有至少14、15、16、17、18或19个连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQ ID NO:142、146、196或201-206、或SEQ ID NO:412-420或430-438中的任一个相差不超过3个核苷酸、不超过2个核苷酸或不超过1个核苷酸。在一些方面，多核酸分子是单链的。在一些方面，多核酸分子是双链的。
在一些方面，本文所述的多核酸分子包含RNA或DNA。在一些情况下，多核酸分子包含RNA。在一些情况下，RNA包含短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)或异源核RNA(hnRNA)。在一些情况下，RNA包含shRNA。在一些情况下，RNA包含miRNA。在一些情况下，RNA包含dsRNA。在一些情况下，RNA包含tRNA。在一些情况下，RNA包含rRNA。在一些情况下，RNA包含hnRNA。在一些情况下，寡核苷酸是磷酸二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)，其是短的单链寡核苷酸类似物，其建立在通过磷酸二酰胺键连接的吗啉环的骨架上。在一些情况下，RNA包含siRNA。在一些情况下，多核酸分子包含siRNA。
在一些方面，多核酸分子的长度是约8至约50个核苷酸。在一些方面，多核酸分子的长度是约10至约50个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、或约20至约22个核苷酸。
在一些方面，多核酸分子的长度是约50个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约45个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约40个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约35个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约30个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约25个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约20个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约19个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约18个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约17个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约16个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约15个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约14个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约13个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约12个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约11个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约10个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度是约8个核苷酸。在一些情况下，多核酸分子的长度在约8与约50个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约50个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约45个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约40个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约35个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约30个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约25个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约10与约20个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约15与约25个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约15与约30个核苷酸之间。在一些情况下，多核酸分子的长度在约12与约30个核苷酸之间。
在一些方面，多核酸分子包含第一多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含第二多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸为有义链或过客链。在一些情况下，第二多核苷酸为反义链或引导链。
在一些方面，多核酸分子是第一多核苷酸。在一些方面，第一多核苷酸的长度是约8至约50个核苷酸。在一些方面，第一多核苷酸的长度是约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约45个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约40个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约35个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约20个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约19个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约18个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约17个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约16个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约15个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约14个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约13个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约12个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约11个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约10个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度是约8个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约8至约50个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约50个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约45个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约40个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约35个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约25个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约10至约20个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约15至约25个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约15至约30个核苷酸之间。在一些情况下，第一多核苷酸的长度在约12至约30个核苷酸之间。
在一些方面，多核酸分子是第二多核苷酸。在一些方面，第二多核苷酸的长度是约8至约50个核苷酸。在一些方面，第二多核苷酸的长度是约10至约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约10至约30、约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约45个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约40个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约35个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约20个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约19个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约18个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约17个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约16个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约15个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约14个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约13个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约12个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约11个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约10个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度是约8个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约8至约50个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约50个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约45个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约40个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约35个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约30个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约25个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约10至约20个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约15至约25个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约15至约30个核苷酸之间。在一些情况下，第二多核苷酸的长度在约12至约30个核苷酸之间。
在一些方面，多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，多核酸分子进一步包含平末端、突出端或其组合。在一些情况下，平末端是5’平末端、3’平末端或两者。在一些情况下，突出端是5’突出端、3’突出端或两者。在一些情况下，突出端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含1、2、3、4、5或6个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含1、2、3或4个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含1个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含2个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含3个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，突出端包含4个非碱基配对核苷酸。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链包含两个非碱基配对核苷酸作为3’端的突出端，而有义链没有突出端。任选地，在这样的方面中，非碱基配对核苷酸具有TT、dTdT或UU的序列。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链在5’端具有一个或多个与反义序列互补的核苷酸。
在一些方面，多核酸分子的序列与DUX4的靶序列至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％互补。在一些方面，DUX4的靶序列是DUX4中的约10-50个碱基对长度、约15-50个碱基对长度、15-40个碱基对长度、15-30个碱基对长度、或15-25个碱基对长度序列的核酸序列，其中靶序列的第一个核苷酸起始于DUX4 mRNA转录物编码区或5’或3’-未翻译区域(UTR)中的任何核苷酸。例如，可以选择靶序列的第一个核苷酸，使其起始于核酸位置(nal，从DUX mRNA全长的5’端开始的数字，例如，5’端第一个核苷酸是nal.1)1、nal 2、nal 3、nal 4、nal 5、nal 6、nal 7、nal 8、nal 9、nal10、nal 11、nal 12、nal 13、nal 14、nal 15、nal15、nal 16、nal 17、或DUX mRNA的编码或非编码区(5’或3’-非翻译区)中的任何其他核酸位置。在一些方面，可以选择靶序列的第一个核苷酸以使其起始于以下范围之中或之间的位置处：nal 10-nal 15、nal 10-nal 20、nal 50-nal 60、nal 55-nal 65、nal 75-nal 85、nal 95-nal 105、nal 135-nal 145、nal155-nal 165、nal 225-nal 235、nal 265-nal 275、nal 275-nal 285、nal 285-nal 295、nal 325-nal 335、nal 335-nal 345、nal 385-nal 395、nal 515-nal 525、nal 665-nal675、nal 675-nal 685、nal 695-nal 705、nal 705-nal 715、nal 875-nal 885、nal 885-nal 895、nal 895-nal 905、nal 1035-nal 1045、nal 1045-nal 1055、nal 1125-nal1135、nal 1135-nal 1145、nal 1145-nal 1155、nal 1155-nal 1165、nal 1125-nal 1135、nal 1155-nal 1165、nal 1225-nal 1235、nal 1235-nal 1245、nal 1275-nal 1285、nal1285-nal 1295、nal 1305-nal 1315、nal 1125-nal 1135、nal 1155-nal 1165、nal 1225-nal 1235、nal 1235-nal 1245、nal 1275-nal 1285、nal 1285-nal 1295、nal 1305-nal1315、nal 1315-nal 1325、nal 1335-nal 1345、nal 1345-nal 1355、nal 1525-nal 1535、nal 1535-nal 1545、nal 1605-nal 1615、nal 1615-c.1625、nal 1625-nal 1635。
在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少50％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少60％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少70％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少80％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少90％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少95％互补。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少99％互补。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列100％互补。
在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有五个或更少的错配。在一些方面，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有四个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有三个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有两个或更少的错配。在一些情况下，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有一个或更少的错配。
在一些方面，选择所有多核酸分子中可能与DUX4的靶序列结合的一组多核酸分子以产生多核酸分子文库。在某些方面，这种选择过程是通过一个或多个从候选者中消除不太理想的多核酸分子的步骤以计算机模拟进行。例如，在一些方面，选择过程包括消除具有单核苷酸多态性(SNP)和/或MEF＜-5的一种或多种多核酸分子的步骤。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除在人转录组中具有0和1个错配(MM)的一种或多种多核酸分子的步骤(使得只允许命中是DUX、DUX5和DBET)。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除在人基因内区域中具有0个MM的一种或多种多核酸分子的步骤(使得只允许命中是DUX1、DUX5和DBET假基因)。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除对于FLExDUX4FSHD小鼠模型中使用的DUX4人序列具有MM的一种或多种多核酸分子的步骤。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除预测生存力<60的一种或多种多核酸分子的步骤。可替代地和/或另外地，这样的选择过程包括继续使用预测生存力≥60的一种或多种多核酸分子。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除与已知miRNA 1-1000的种子区域具有匹配的一种或多种多核酸分子的步骤。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括消除％GC含量为75及以上的一种或多种多核酸分子的步骤。可替代地和/或另外地，在一些方面，选择过程包括八个或更少的具有2个MM的预测脱靶命中的选择步骤。在一些方面，对于区域295-1132(nal 295-1132)，允许12个或更少的具有2个MM的预测脱靶命中。
在一些方面，选择过程是通过一个或多个从候选者中消除不太理想的多核酸分子的连续步骤以计算机模拟进行。例如，在一些方面，选择过程从收集候选多核酸分子以产生文库开始。从文库中，第一消除步骤包括消除具有单核苷酸多态性(SNP)和/或MEF<-5的一种或多种多核酸分子。然后，第二消除步骤包括消除在人转录组中具有0和1个MM的一种或多种多核酸分子(使得只允许命中是DUX、DUX5和DBET)。然后，第三消除步骤包括消除在人基因内区域中具有0个MM的一种或多种多核酸分子(使得只允许命中是DUX1、DUX5和DBET假基因)。然后，下一个消除步骤包括消除对于FLExDUX4FSHD小鼠模型中使用的DUX4人序列具有MM的一种或多种多核酸分子。然后，下一步骤是仅继续使用或继续使用预测生存力≥60的一种或多种多核酸分子。接下来，消除步骤包括消除与已知miRNA 1-1000的种子区域具有匹配的一种或多种多核酸分子。然后，消除步骤继续消除％GC含量为75及以上的一种或多种多核酸分子。然后，最终选择过程包括八个或更少的具有2个MM的预测脱靶命中，但区域295-1132除外，对于其最多允许12个命中。
在一些方面，与本文所述的靶序列杂交的多核酸分子的特异性是该多核酸分子与靶序列具有95％、98％、99％、99.5％或100％的序列互补性。在一些情况下，该杂交是高度严格的杂交条件。
在一些方面，多核酸分子具有降低的脱靶效应。在一些情况下，“脱靶”或“脱靶效应”是指其中针对给定靶标的多核酸聚合物通过直接或间接地与另一mRNA序列、DNA序列或者细胞蛋白质或其他部分相互作用而引起非预期效应的任何情况。在一些情况下，当由于其他转录物与多核酸分子的有义链和/或反义链之间的部分同源性或互补性而导致其他转录物同时降解时，发生“脱靶效应”。
在一些方面，多核酸分子包含天然或合成或人工核苷酸类似物或碱基。在一些情况下，多核酸分子包含DNA、RNA和/或核苷酸类似物的组合。在一些情况下，合成或人工核苷酸类似物或碱基在核糖部分、磷酸部分、核苷部分或其组合中的一种或多种处包含修饰。
在一些方面，核苷酸类似物或人工核苷酸碱基包含在核糖部分的2’羟基处具有经修饰的核酸。在一些情况下，该修饰包括H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为烷基部分。示例性的烷基部分包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯、仲或叔胺)、酰胺、醚、酯、醇和氧。在一些情况下，该烷基部分进一步包含修饰。在一些情况下，该修饰包括偶氮基团、酮基团、醛基团、羧基、硝基、亚硝基、腈基、杂环(例如，咪唑、肼基或羟基氨基)基团、异氰酸酯或氰酸酯基团，或者含硫基团(例如，亚砜、砜、硫化物和二硫化物)。在一些情况下，该烷基部分进一步包含杂取代。在一些情况下，杂环基团的碳被氮、氧或硫取代。在一些情况下，杂环取代包括但不限于吗啉代、咪唑和吡咯烷子基。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-甲基修饰或2’-O-甲氧基乙基(2’O-MOE)修饰。在一些情况下，2’-O-甲基修饰向核糖部分的2’羟基添加甲基，而2’O-甲氧基乙基修饰向核糖部分的2’羟基添加甲氧基乙基。腺苷分子的2’-O-甲基修饰和尿苷的2’-O-甲氧基乙基修饰的示例性化学结构如下所示。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-氨基丙基修饰，其中包含丙基接头的延伸胺基团将胺基团与2’氧结合。在一些情况下，该修饰通过每个糖从胺基团引入一个正电荷来中和寡核苷酸分子的磷酸酯衍生的总负电荷，并且由于其两性离子性质而改善了细胞摄取性质。2’-O-氨基丙基核苷亚磷酰胺的示例性化学结构如下所示。
在一些情况下，在2’羟基处的修饰是锁定或桥接的核糖修饰(例如，锁核酸或LNA)，其中结合在2’碳上的氧分子通过亚甲基连接至4’碳，从而形成2’-C、4’-C-氧基-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。LNA的化学结构的示例性表示如下所示。左侧所示的表示突出了LNA单体的化学连接性。右侧所示的表示突出了LNA单体的呋喃糖环的锁定的3’-内(3E)构象。
在一些情况下，2’羟基处的修饰包括乙烯核酸(ENA)，例如2’-4’-亚乙基桥接的核酸，其将糖构象锁定为C3’-内糖折叠(puckering)构象。ENA是桥接核酸类别的修饰核酸的一部分，该修饰核酸也包含LNA。ENA和桥接核酸的示例性化学结构如下所示。
在一些方面，2’羟基处的另外的修饰包括2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
在一些方面，核苷酸类似物包含经修饰的碱基，诸如但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位具有经修饰的其他核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其他硫基碱基如2-硫基尿苷和4-硫基尿苷和2-硫基胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-烷基化和N-烷基化嘌呤和嘧啶如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羟乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和经修饰的苯基如氨基酚或2,4,6-三甲氧基苯、充当G夹(clamp)核苷酸的经修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。经修饰的核苷酸还包括糖部分被修饰的那些核苷酸，以及具有非核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，在一些情况下，糖部分是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4’-硫基核糖和其他糖、杂环或碳环。术语核苷酸还包含本领域已知的通用碱基。例如，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。
在一些方面，核苷酸类似物进一步包含吗啉代、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺、1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)或其组合。吗啉代或磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)包括其结构模拟天然核酸结构但偏离正常的糖和磷酸酯结构的合成分子。在一些情况下，五元核糖环被含有四个碳、一个氮和一个氧的六元吗啉代环取代。在一些情况下，核糖单体通过磷酸二酰胺基团而不是磷酸酯基团连接。在这样的情况下，骨架改变去除所有正电荷和负电荷，使得吗啉代中性分子能够穿过细胞膜而无需借助细胞递送剂，诸如带电荷的寡核苷酸所使用的细胞递送剂。
在一些方面，肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯连接，并且碱基通过寡聚甘氨酸样分子连接并适当间隔，因此消除了骨架电荷。
在一些方面，一个或多个修饰任选地发生在核苷酸间连接处。在一些情况下，经修饰的核苷酸间连接包括但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸盐、5’-甲基膦酸酯、3’-亚烷基膦酸酯、三氟化硼、3’-5’连接或2’-5’连接的硼烷磷酸酯和硒代磷酸酯、磷酸三酯、硫代烷基磷酸三酯、氢膦酸酯连接、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、芳基硫代膦酸酯、磷酸硒酯、磷酸二硒酯、次磷酸酯、磷酰胺、3’-烷基磷酰胺、氨基烷基磷酰胺、硫代磷酰胺、磷酸哌嗪酯、硫代苯胺磷酸酯、苯胺磷酸酯、酮类、砜类、磺胺类、碳酸酯、氨基甲酸酯、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼、甲缩醛、硫代甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲亚氨基、硫基酰胺、与核糖乙酰基团的连接、氨基乙基甘氨酸、甲硅烷基或硅氧烷连接、带有或不带有杂原子的例如1至10个碳的烷基或环烷基连接(其是饱和或不饱和的和/或取代的和/或含有杂原子)、具有吗啉代结构的连接、酰胺、聚酰胺(其中碱基直接或间接与主链的氮杂氮连接)、及其组合。硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)是包含硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸。示例性PS ASO如下所示。
在一些情况下，修饰是甲基或硫醇修饰，如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修饰。示例性的硫醇膦酸酯核苷酸(左)和甲基膦酸酯核苷酸(右)如下所示。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于如下所示的2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺：
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；R4和R5独立地选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自锁核酸(LNA)或乙烯核酸(ENA)的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于选自以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
其中B是杂环碱基部分；R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且J是与多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于为以下的一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸：
在一些情况下，经修饰的核苷酸包括但不限于如下所示的己糖醇核酸(或1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA))：
在一些方面，一个或多个修饰进一步任选地包括核糖部分、磷酸骨架和核苷的修饰，或者3’或5’末端处的核苷酸类似物的修饰。例如，3’末端任选地包含3’阳离子基团，或用3’-3’连接在3’末端处反转核苷。在另一替代方案中，3’末端任选地与氨基烷基缀合，例如3’C5-氨基烷基dT。在另外的替代方案中，3’末端任选地与无碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。在一些情况下，5’末端与氨基烷基缀合，例如与5’-O-烷基氨基取代基缀合。在一些情况下，5’末端与无碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。
在一些方面，多核酸分子包含一种或多种本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25或更多种本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，人工核苷酸类似物包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸，LNA，ENA，PNA，HNA，吗啉代，甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸，2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺，或其组合。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25或更多种选自以下的人工核苷酸类似物：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸，LNA，ENA，PNA，HNA，吗啉代，甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸，2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺，或其组合。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、或更多种2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25或更多种2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25或更多种硫醇膦酸酯核苷酸。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约90％至约100％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约70％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含约15％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。
在另外的情况下，多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。
在一些方面，多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22或更多个修饰。
在一些情况下，多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多种修饰的核苷酸。
在一些情况下，约5至约100％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约10％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约15％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约20％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约25％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约30％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约35％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约40％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约45％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约50％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约55％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约60％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约65％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约70％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约75％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约80％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约85％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约90％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约95％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约96％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约97％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约98％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约99％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约100％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，人工核苷酸类似物包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺，或其组合。
在一些方面，多核酸分子包含约1至约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约1个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约2个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约3个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约4个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约5个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约6个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约7个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约8个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约9个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约10个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约11个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约12个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约13个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约14个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约15个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约16个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约17个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约18个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约19个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约20个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约21个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约22个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约23个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约24个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些方面，多核酸分子包含约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。
在一些方面，多核酸分子由两个单独的多核苷酸组装而成，其中一个多核苷酸包含有义链，而第二个多核苷酸包含该多核酸分子的反义链。在其他方面，有义链经由接头分子与反义链连接，在一些情况下，该接头分子是多核苷酸接头或非核苷酸接头。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中的嘧啶核苷酸包含2’-O-甲基嘧啶核苷酸，而有义链中的嘌呤核苷酸包含2’-脱氧嘌呤核苷酸。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中存在的嘧啶核苷酸包含2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸，并且其中有义链中存在的嘌呤核苷酸包含2’-脱氧嘌呤核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸，并且嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时是2’-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸，并且其中嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时包含2’-脱氧-嘌呤核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链和反义链中的至少一个具有多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个等)2’-O-甲基或2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸。在一些方面，其中多个2’-O-甲基或2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸中的至少两个是连续的核苷酸。在一些方面，其中连续的2’-O-甲基或2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸位于有义链和/或反义链的5’端。在一些方面，其中连续的2’-O-甲基或2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸位于有义链和/或反义链的3’端。在一些方面，多核酸分子的有义链在其5’端和/或3’端或两者处包括至少四个、至少五个、至少六个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。任选地，在这样的方面，多核酸分子的有义链在多核苷酸的5’端的至少四个、至少五个、至少六个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸的3’端，或在多核苷酸的3’端的至少四个、至少五个、至少六个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸的5’端包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸。还任选地，这样的至少两个、至少三个、至少四个2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸是连续的核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链和反义链中的至少一个具有位于有义链和/或反义链的5’端的2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些方面，有义链和反义链中的至少一个具有位于有义链和/或反义链的3’端的2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些方面，位于有义链和/或反义链的5’端的2’-O-甲基修饰的核苷酸是嘌呤核苷酸。在一些方面，位于有义链和/或反义链的5’端的2’-O-甲基修饰的核苷酸是吡啶核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链在5’端具有两个或更多个连续的2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链在3’端具有两个或更多个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链具有至少2、3、4、5、6或7个连续的2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链包含5’-nsnsnnnnNfNfNfnnnnnnnnsnsa-3’的核酸(小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)，Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰)。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链包含5’-UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu-3’的核酸(小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)，Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰)。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链包含5’-nsnsnnnnNfNfNfnnnnnnnnsnsa-3’的核酸(小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)，Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰)并且反义链包含5’-UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu-3’的核酸(小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)，Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰)。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链在有义链的5’端、3’端或者5’端和3’端两者包括末端帽部分。在其他方面，末端帽部分是反向脱氧无碱基部分。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链在反义链的3’端包含甘油基修饰。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，和任选的在有义链的3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约10个或更多个，特别是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选的在反义链的3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子。在其他方面，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸经2’-脱氧、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含约1个至约25个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在有义链的3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在反义链的3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子。在其他方面，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸经2’-脱氧、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸化学修饰，具有或不具有约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽分子。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3，4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或在有义链和/或反义链的3’端、5’端或3’端和5’端两者的一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在有义链的3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子。在一些方面，反义链包含约1至约10个或更多个，特别是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或更多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在反义链的3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子。在其他方面，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个嘧啶核苷酸经2’-脱氧、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子。
在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在有义链的3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子；并且反义链包含约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6，7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及任选的在反义链的3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子。在其他方面，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸经2’-脱氧、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸化学修饰，具有或不具有约1个至约5个，例如约1、2、3、4、5个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或3’端和5’端两者的末端帽分子。
在一些方面，本文所述的多核酸分子是经化学修饰的短干扰核酸分子，在多核酸分子的每条链中具有约1至约25个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些方面，多核酸分子包含有义链和反义链，并且反义链在反义链的3’端包含磷酸骨架修饰。可替代地和/或另外地，多核酸分子包含有义链和反义链，并且有义链在反义链的5’端包含磷酸骨架修饰。在一些情况下，磷酸骨架修饰是硫代磷酸酯。在一些方面，有义链或反义链具有通过两个硫代磷酸酯骨架偶联的三个连续核苷。
在另一个实施方案中，本文所述的多核酸分子包含2’-5’核苷酸间连接。在一些情况下，2’-5’核苷酸间连接位于一条或两条序列链的3’端、5’端或者3’端和5’端两者。在其他情况下，2’-5’核苷酸间连接存在于一条或两条序列链内的各个其他位置，例如，多核酸分子的一条或两条链中的嘧啶核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个(包括每一个)核苷酸间连接包含2’-5’核苷酸间连接，或者多核酸分子的一条或两条链中的嘌呤核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个(包括每一个)核苷酸间连接包含2’-5’核苷酸间连接。
在一些方面，多核酸分子是在细胞或重构的体外系统中介导RNAi活性的单链多核酸分子，其中该多核酸分子包含与靶核酸序列具有互补性的单链多核苷酸，并且其中一个或多个存在于该多核酸中的嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸，或者多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸)，并且其中该多核酸中存在的任何嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸)，以及任选地存在于反义序列的3’端、5’端或者3’端和5’端两者的末端帽修饰，该多核酸分子任选地在多核酸分子的3’端还包含约1个至约4个(例如，约1、2、3或4个)末端2’-脱氧核苷酸，其中该末端核苷酸进一步包含一个或多个(例如，1、2、3或4个)硫代磷酸酯核苷酸间连接，并且其中该多核酸分子任选地还包含末端磷酸基团，例如5’末端磷酸基团。
在一些情况下，与天然多核酸分子相比，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对以下核酸酶具有抗性：例如核糖核酸酶(例如RNase H)、脱氧核糖核酸酶(例如DNase)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶)。在一些情况下，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的人工核苷酸类似物，LNA，ENA，PNA，HNA，吗啉代，甲基膦酸酯核苷酸，硫醇膦酸酯核苷酸，2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺，或其组合的人工核苷酸类似物对以下核酸酶具有抗性：例如核糖核酸酶(例如RNase H)、脱氧核糖核酸酶(例如DNase)或核酸外切酶(例如5’-3’核酸外切酶和3’-5’核酸外切酶)。在一些情况下，2’-O-甲基修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-脱氧修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-脱氧-2’-氟修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNaseH、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，LNA修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，ENA修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，HNA修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，吗啉代具有核酸酶抗性(例如，RNaseH、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，PNA修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，硫醇膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，包含2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子具有核酸酶抗性(例如，RNase H、DNase、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)。在一些情况下，本文所述的5’缀合物抑制5’-3’核酸外切切割。在一些情况下，本文所述的3’缀合物抑制3’-5’核酸外切切割。
在一些方面，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸，或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的一种或多种人工核苷酸类似物相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-甲基修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-脱氧修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-脱氧-2’-氟修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，LNA修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，ENA修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，PNA修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，HNA修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，吗啉代修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，硫醇膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，包含2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子相对于同等的天然多核酸分子具有增加的对其mRNA靶标的结合亲和力。在一些情况下，增加的亲和力用较低的Kd、较高的熔解温度(Tm)或其组合来说明。
在一些方面，本文所述的多核酸分子是手性纯的(或立体纯的)多核酸分子，或是包含单一对映异构体的多核酸分子。在一些情况下，多核酸分子包含L-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含D-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的其镜像对映异构体。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的外消旋混合物。在一些情况下，多核酸分子是在美国专利公开号：2014/194610和2015/211006以及PCT公开号WO2015107425中描述的多核酸分子。
在一些方面，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含适体缀合部分。在一些情况下，适体缀合部分是DNA适体缀合部分。在一些情况下，适体缀合部分是Alphamer(Centauri Therapeutics)，其包含识别特定细胞表面靶标的适体部分和呈现特定表位以供连接至循环抗体的部分。在一些情况下，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含如美国专利号：8,604,184、8,591,910和7,850,975中所述的适体缀合部分。
在另外的方面，本文所述的多核酸分子经修饰以增加其稳定性。在一些实施方案中，多核酸分子是RNA(例如siRNA)。在一些情况下，多核酸分子通过一个或多个上述修饰而被修饰以增加其稳定性。在一些情况下，多核酸分子在2’羟基位置被修饰，例如通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、或2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰或通过锁定或桥接的核糖构象(例如，LNA或ENA)。在一些情况下，多核酸分子被2’-O-甲基和/或2’-O-甲氧基乙基核糖修饰。在一些情况下，多核酸分子还包括吗啉代、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和/或2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺以增加其稳定性。在一些情况下，多核酸分子是手性纯(或立体纯)的多核酸分子。在一些情况下，手性纯(或立体纯)多核酸分子经修饰以增加其稳定性。对RNA进行适当的修饰以增加递送稳定性对于技术人员来说是显而易见的。
在一些情况下，多核酸分子是包含自身互补的有义区和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在一些情况下，多核酸分子由两个单独的多核苷酸组装而成，其中一条链是有义链，而另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(例如，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区域为约19、20、21、22、23个或更多个碱基对)；反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。可替代地，多核酸分子由单个寡核苷酸组装而成，其中该多核酸分子的自身互补的有义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。
一些情况下，多核酸分子是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的有义区和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在其他情况下，多核酸分子是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义区和反义区的茎，其中反义区包含与靶核酸中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中该环状多核苷酸在体内或体外加工，以生成能够介导RNAi的活性多核酸分子。在另外的情况下，多核酸分子还包含单链多核苷酸，其具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列(例如，在这种多核酸分子不需要在多核酸分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列时)，其中该单链多核苷酸进一步包含末端磷酸基团，如5’-磷酸或5’,3’-二磷酸。
在一些情况下，不对称发夹是线性多核酸分子，其包含反义区、包含核苷酸或非核苷酸的环部分以及包含比反义区更少的核苷酸的有义区，该更少的程度是使得有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区发生碱基配对并与环形成双链体。例如，不对称发夹多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19个至约22个核苷酸)和包含约4个至约8个核苷酸的环区域，以及具有约3个至约18个与反义区互补的核苷酸的有义区。在一些情况下，不对称发夹多核酸分子还包含经化学修饰的5’末端磷酸基团。在另外的情况下，不对称发夹多核酸分子的环部分包含核苷酸、非核苷酸、接头分子或缀合物分子。
在一些方面，不对称双链体是具有包含有义区和反义区的两条单独链的多核酸分子，其中有义区包含比反义区更少的核苷酸，该更少的程度使得有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区发生碱基配对并形成双链体。例如，不对称双链体多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19个至约22个核苷酸)和具有约3个至约18个与反义区互补的核苷酸的有义区。
在一些情况下，通用碱基是指与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，它们之间几乎没有区别。通用碱基的非限制性实例包括如本领域已知的C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、唑类羧酰胺和硝基唑衍生物，如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚。
多核酸分子合成
在一些方面，使用本领域已知的程序，使用化学合成和/或酶促连接反应构建本文所述的多核酸分子。例如，使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸以化学方式合成多核酸分子，该经修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或者增加多核酸分子与靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性。示例性方法包括在美国专利号5,142,047；5,185,444；5,889,136；6,008,400和6,111,086；PCT公开号WO2009099942；或欧洲公开号1579015中描述的那些方法。另外的示例性方法包括在以下文献中描述的那些方法：Griffey等人,“2’-O-aminopropyl ribonucleotides:a zwitterionic modification that enhancesthe exonuclease resistance and biological activity of antisenseoligonucleotides,”J.Med.Chem.39(26):5100-5109(1997))；Obika等人"Synthesis of2’-O,4’-C-methyleneuridine and-cytidine.Novel bicyclic nucleosides having afixed C3,-endo sugar puckering".Tetrahedron Letters 38(50):8735(1997)；Koizumi,M."ENA oligonucleotides as therapeutics".Current opinion in moleculartherapeutics 8(2):144–149(2006)；和Abramova等人,“Novel oligonucleotideanalogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies:newchemical possibilities,”Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726(2009)。可替代地，使用表达载体以生物学方式产生多核酸分子，其中多核酸分子已经以反义方向(即，从插入的多核酸分子转录的RNA将会与感兴趣的靶多核酸分子呈反义方向)亚克隆到该表达载体中。
在一些方面，通过串联合成方法合成多核酸分子，其中两条链被合成为由可切割接头隔开的单个连续寡核苷酸片段或链，随后将其切割以提供单独的片段或链，它们杂交并允许纯化双链体。
在一些情况下，多核酸分子还由两个不同的核酸链或片段组装而成，其中一个片段包括有义区，而第二个片段包括该分子的反义区。
用于并入例如糖、碱基和磷酸修饰的其他修饰方法包括：Eckstein等人,国际公开PCT号WO 92/07065；Perrault等人,Nature,1990,344,565-568；Pieken等人,Science,1991,253,314-317；Usman和Cedergren,Trends in Biochem.Sci.,1992,17,334-339；Usman等人,国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat,美国专利号5,334,711和Beigelman等人,1995,J.Biol.Chem.,270,25702；Beigelman等人,国际PCT公开号WO 97/26270；Beigelman等人,美国专利号5,716,824；Usman等人,美国专利号5,627,053；Woolf等人,国际PCT公开号WO 98/13526；Thompson等人,1998年4月20日提交的美国系列号60/082,404；Karpeisky等人,1998,Tetrahedron Lett.,39,1131；Earnshaw和Gait，1998,Biopolymers(NucleicAcid Sciences),48,39-55；Verma和Eckstein，1998,Annu.Rev.Biochem.,67,99-134；和Burlina等人,1997,Bioorg.Med.Chem.,5,1999-2010。这些出版物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入核酸分子中的位置而无需调节催化的一般方法和策略。
在一些情况下，虽然采用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5’-甲基膦酸酯连接对多核酸分子核苷酸间连接的化学修饰改善了稳定性，但过度修饰有时会引起毒性或降低活性。因此，当设计核酸分子时，在一些情况下，这些核苷酸间连接的量被最小化。在这样的情况下，这些连接的浓度的降低导致这些分子的毒性降低、功效增加以及特异性提高。
多核酸分子缀合物
在一些方面，多核酸分子(B)进一步缀合至多肽(A)，以递送到感兴趣的位点。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少一个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少一个B以形成A-B缀合物。在一些方面，至少一个A缀合至B的5’末端、B的3’末端、B上的内部位点或其任意组合。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少两个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合至至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个B。
在一些情况下，多核酸分子缀合至多肽(A)和任选的聚合部分(C)。在一些方面，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而至少一个C在至少一个B的相对末端缀合以形成A-B-C缀合物。在一些情况下，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而C中的至少一个在至少一个B的内部位点缀合。在一些情况下，至少一个多肽A直接缀合至至少一个C。在一些情况下，至少一个B通过至少一个C间接缀合至至少一个多肽A以形成A-C-B缀合物。
在一些情况下，至少一个B和/或至少一个C以及任选的至少一个D缀合至至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个B在末端(例如，5’末端或3’末端)缀合至至少一个多肽A，或者通过内部位点缀合至至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个C直接缀合至至少一个多肽A，或者通过至少一个B间接地缀合至至少一个多肽A。如果通过至少一个B间接缀合，则至少一个C与至少一个多肽A在相同的末端缀合在B上、与至少一个多肽A在相对的末端缀合，或者独立地在内部位点缀合。在一些情况下，至少一个另外的多肽A进一步缀合至至少一个多肽A、B或C。在另外的情况下，至少一个D任选地直接或间接地缀合至至少一个多肽A、至少一个B或至少一个C。如果直接缀合至至少一个多肽A，则至少一个D也任选地缀合至至少一个B，以形成A-D-B缀合物，或者任选地缀合至至少一个B和至少一个C，以形成A-D-B-C缀合物。在一些情况下，至少一个D直接缀合至至少一个多肽A，并间接缀合至至少一个B和至少一个C，以形成D-A-B-C缀合物。如果间接缀合至至少一个多肽A，则至少一个D还任选地缀合至至少一个B，以形成A-B-D缀合物，或者任选地缀合至至少一个B和至少一个C，以形成A-B-D-C缀合物。在一些情况下，至少一个另外的D进一步缀合至至少一个多肽A、B或C。
结合部分
在一些方面，结合部分A是多肽。在一些情况下，多肽是抗体或其片段。在一些情况下，片段是抗原结合片段。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段包含人源化抗体或其抗原结合片段、鼠抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体或其抗原结合片段、具有轻链结构域和重链结构域的结合片段、具有两个轻链结构域和两个重链结构域的结合片段、具有两个或更多个轻链结构域和重链结构域的结合片段、单价Fab'、二价Fab2、F(ab)’3片段、单链可变片段(scFv)、双-scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单结构域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其结合片段、或其化学修饰的衍生物。
在一些方面，结合部分A是双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体或双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体。在一些情况下，该三官能抗体是全长单克隆抗体，其包含针对两种不同抗原的结合位点。
在一些情况下，双特异性抗体是双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性微抗体包括二价Fab2、F(ab)’3片段、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、三抗体、四抗体或双特异性T细胞接合物(BiTE)。在一些方面，该双特异性T细胞接合物是包含两个单链可变片段(scFv)的融合蛋白，其中这两个scFv靶向两种不同抗原的表位。
在一些方面，结合部分A是双特异性微抗体。在一些情况下，A为双特异性Fab2。在一些情况下，A为双特异性F(ab)’3片段。在一些情况下，A为双特异性双scFv。在一些情况下，A为双特异性(scFv)2。在一些方面，A为双特异性双抗体。在一些方面，A为双特异性微抗体。在一些方面，A为双特异性三抗体。在其他方面，A为双特异性四抗体。在其他方面，A为双特异性T细胞接合物(BiTE)。
在一些方面，结合部分A是三特异性抗体。在一些情况下，该三特异性抗体包括F(ab)’3片段或三抗体。在一些情况下，A为三特异性F(ab)’3片段。在一些情况下，A为三抗体。在一些方面，A为三特异性抗体，如Dimas等人,“Development of a trispecific antibodydesigned to simultaneously and efficiently target three different antigens ontumor cells,”Mol.Pharmaceutics,12(9):3490-3501(2015)所述。
在一些方面，结合部分A是识别细胞表面蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别肌细胞上的细胞表面蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别骨骼肌细胞上的细胞表面蛋白的抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，示例性的抗体包括但不限于抗肌球蛋白抗体、抗转铁蛋白受体抗体和识别肌肉特异性激酶(MuSK)的抗体。在一些情况下，抗体是抗转铁蛋白受体(抗CD71)抗体。
在一些方面，当抗体是抗转铁蛋白受体(抗CD71)抗体时，抗转铁蛋白抗体特异性结合转铁蛋白受体(TfR)，优选地，特异性结合转铁蛋白受体1(TfR1)，或更优选地，特异性结合人转铁蛋白受体1(TfR1)(或人CD71)。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中所述VH区包含：包含SEQ ID NO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列。
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体的VH区包含选自表1的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
表1
*13E4_VH2与抗转铁蛋白受体抗体13E4_VH4共享相同的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列
在一些方面，VH区包含：包含SEQ ID NO:281的HCDR1序列；包含SEQ ID NO:282、284或285的HCDR2序列；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列。在一些情况下，VH区包含：包含SEQ ID NO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列。在一些情况下，VH区包含：包含SEQ ID NO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列。在一些情况下，VH区包含：包含SEQID NO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列。
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体的VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、LCDR2序列AX4TNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X3选自N或S，X4选自A或G，X5选自D或E，并且X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体的VL区包含选自表2的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
表2
*13E4_VL1与抗转铁蛋白受体抗体13E4_VL2共享相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列
在一些情况下，VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、包含SEQ ID NO:287、289或292的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X3选自N或S。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列AX4TNLAX5和包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X4选自A或G，并且X5选自D或E。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列SEQID NO:287、289或292和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X5选自D或E并且X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:287的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288的LCDR3序列。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:289的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，VL区包含：包含SEQ ID NO:291的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:292的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、LCDR2序列AX4TNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X3选自N或S，X4选自A或G，X5选自D或E，X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、包含SEQ IDNO:287、289或292的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X3选自N或S。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列AX4TNLAX5和包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X4选自A或G，X5选自D或E。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO:287、289或292和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X5选自D或E并且X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:287的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:288的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:289的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1GRSNYAX2KFQG，其中X1选自N或Q，X2选自Q或E；以及包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:291的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:292的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、包含SEQ ID NO:287、289或292的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X3选自N或S。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列AX4TNLAX5和包含SEQ IDNO:288或290的LCDR3序列，其中X4选自A或G，X5选自D或E。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:2的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO:287、289或292和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X5选自D或E并且X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:287的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:288的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:9的LCDR2序列和包含SEQID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:282的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:291的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:292的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、包含SEQ ID NO:287、289或292的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X3选自N或S。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列AX4TNLAX5和包含SEQ IDNO:288或290的LCDR3序列，其中X4选自A或G，X5选自D或E。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO:287、289或292和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X5选自D或E并且X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:287的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:288的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:289的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:284的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:291的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:292的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：LCDR1序列RTSENIYX3NLA、包含SEQ ID NO:287、289或29的LCDR2序列以及包含SEQ ID NO:288或290的LCDR3序列，其中X3选自N或S。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列AX4TNLAX5和包含SEQ IDNO:288或290的LCDR3序列，其中X4选自A或G，X5选自D或E。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286或291的LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO:287、289或292和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5和LCDR3序列QHFWGTPLTX6，其中X5选自D或E，X6存在或不存在，如果存在，则为F。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:287的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:288的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:286的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:289的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区包含：包含SEQ IDNO:281的HCDR1序列、包含SEQ ID NO:285的HCDR2序列和包含SEQ ID NO:283的HCDR3序列；并且VL区包含：包含SEQ ID NO:291的LCDR1序列、包含SEQ ID NO:292的LCDR2序列和包含SEQ ID NO:290的LCDR3序列。
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体包含VH区和VL区，其中VH区的序列与SEQ IDNO:293-296具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且VL区的序列与SEQ ID NO:298-301具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些方面，VH区包含选自SEQ ID NO:293-296(表3)的序列，并且VL区包含选自SEQ ID NO:298-301(表4)的序列。表3和表4中带下划线的区域表示各自的CDR1、CDR2或CDR3序列。
表3
表4
在一些方面，抗转铁蛋白受体抗体包含如表5所示的VH区和VL区。
表5
在一些方面，本文所述的抗转铁蛋白受体抗体包含IgG框架、IgA框架、IgE框架或IgM框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG框架(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG1框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG2(例如，IgG2a或IgG2b)框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG2a框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG2b框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG3框架。在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含IgG4框架。
在一些情况下，抗转铁蛋白受体抗体包含框架区(例如CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链区或其组合)中的一个或多个突变。在一些情况下，一个或多个突变是为了稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，一个或多个突变是为了调节Fc受体相互作用，以减少或消除Fc效应子功能，例如FcγR、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在另外的情况下，一个或多个突变是为了调节糖基化。
在一些方面，一个或多个突变位于Fc区中。在一些情况下，Fc区包含残基位置L234、L235或其组合处的突变。在一些情况下，突变包含L234和L235。在一些情况下，突变包含L234A和L235A。在一些情况下，残基位置是参考IgG1。
在一些情况下，Fc区包含残基位置L234、L235、D265、N297、K322、L328或P329或其组合处的突变。在一些情况下，突变包含与残基位置K322、L328或P329处的突变组合的L234和L235。在一些情况下，Fc区包含L234、L235和K322处的突变。在一些情况下，Fc区包含L234、L235和L328处的突变。在一些情况下，Fc区包含L234、L235和P329处的突变。在一些情况下，Fc区包含D265和N297处的突变。在一些情况下，残基位置是参考IgG1。
在一些情况下，Fc区包含L234A、L235A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G，或其组合。在一些情况下，Fc区包含与K322G、L328R或P329G组合的L234A和L235A。在一些情况下，Fc区包含L234A、L235A和K322G。在一些情况下，Fc区包含L234A、L235A和L328R。在一些情况下，Fc区包含L234A、L235A和P329G。在一些情况下，Fc区包含D265A和N297G。在一些情况下，残基位置是参考IgG1。
在一些情况下，Fc区包含残基位置L235、L236、D265、N297、K322、L328或P329处的突变，或这些突变的组合。在一些情况下，Fc区包含L235和L236处的突变。在一些情况下，Fc区包含与在残基位置K322、L328或P329处的突变组合的在L235和L236处的突变。在一些情况下，Fc区包含L235、L236和K322处的突变。在一些情况下，Fc区包含L235、L236和L328处的突变。在一些情况下，Fc区包含L235、L236和P329处的突变。在一些情况下，Fc区包含D265和N297处的突变。在一些情况下，残基位置是参考IgG2b。
在一些方面，Fc区包含L235A、L236A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G，或其组合。在一些情况下，Fc区包含L235A和L236A。在一些情况下，Fc区包含与K322G、L328R或P329G组合的L235A和L236A。在一些情况下，Fc区包含L235A、L236A和K322G。在一些情况下，Fc区包含L235A、L236A和L328R。在一些情况下，Fc区包含L235A、L236A和P329G。在一些情况下，Fc区包含D265A和N297G。在一些情况下，残基位置是参考IgG2b。
在一些方面，Fc区包含残基位置L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328处的突变，其中这些残基对应于SEQ ID NO:303的位置233、234、264、296、321、327和328。在一些情况下，Fc区包含L233和L234处的突变。在一些情况下，Fc区包含与残基位置K321、L327或P328处的突变组合的L233和L234处的突变。在一些情况下，Fc区包含L233、L234和K321处的突变。在一些情况下，Fc区包含L233、L234和L327处的突变。在一些情况下，Fc区包含L233、L234和K321处的突变。在一些情况下，Fc区包含L233、L234和P328处的突变。在一些情况下，Fc区包含D264和N296处的突变。在一些情况下，考虑与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4框架中的残基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328的等效位置。在一些情况下，还考虑了与IgG1、IgG2或IgG4框架中SEQ ID NO:23的残基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328相对应的残基的突变。
在一些方面，Fc区包含L233A、L234A、D264A、N296G、K321G、L327R或P328G，其中残基对应于SEQ ID NO:303的位置233、234、264、296、321、327和328。在一些情况下，Fc区包含L233A和L234A。在一些情况下，Fc区包含与K321G、L327R或P328G组合的L233A和L234A。在一些情况下，Fc区包含L233A、L234A和K321G。在一些情况下，Fc区包含L233A、L234A和L327R。在一些情况下，Fc区包含L233A、L234A和K321G。在一些情况下，Fc区包含L233A、L234A和P328G。在一些情况下，Fc区包含D264A和N296G。
在一些方面，人IgG恒定区经修饰以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，具有Natsume等人,2008 Cancer Res,68(10):3863-72；Idusogie等人,2001 J Immunol,166(4):2571-5；Moore等人,2010 mAbs,2(2):181-189；Lazar等人,2006 PNAS,103(11):4005-4010；Shields等人,2001 JBC,276(9):6591-6604；Stavenhagen等人,2007 Cancer Res,67(18):8882-8890；Stavenhagen等人,2008Advan.Enzyme Regul.,48:152-164；Alegre等人,1992 J Immunol,148:3461-3468；综述于Kaneko和Niwa,2011Biodrugs,25(1):1-11中描述的氨基酸修饰。
在一些方面，本文所述的抗转铁蛋白受体抗体是全长抗体，包含重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，重链(HC)包含选自表6的序列。在一些情况下，轻链(LC)包含选自表7的序列。下划线区域表示各自的CDR。
表6
表7
在一些方面，本文所述的抗转铁蛋白受体抗体与参考抗转铁蛋白受体抗体相比具有改善的血清半衰期。在一些情况下，改善的血清半衰期比参考抗转铁蛋白受体抗体长至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。
在一些方面，结合部分A非特异地性缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基或半胱氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基(例如，存在于结合部分A中的赖氨酸残基)以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过半胱氨酸残基(例如存在于结合部分A中的半胱氨酸残基)以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。
在一些方面，结合部分A以位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基、半胱氨酸残基、在5’末端、在3’末端、非天然氨基酸或酶修饰或酶催化的残基通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基(例如存在于结合部分A中的赖氨酸残基)通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过半胱氨酸残基(例如存在于结合部分A中的半胱氨酸残基)通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在5’末端通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在3’末端通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过非天然氨基酸通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过酶修饰的或酶催化的残基通过位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。
在一些方面，一个或多个多核酸分子(B)缀合至结合部分A。在一些情况下，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约1个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约2个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约3个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约4个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约5个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约6个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约7个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约8个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约9个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约10个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约11个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约12个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约13个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约14个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约15个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约16个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，一个或多个多核酸分子是相同的。在其他情况下，一个或多个多核酸分子是不同的。
在一些方面，缀合至结合部分A的多核酸分子(B)的数目形成比值。在一些情况下，该比值被称为DAR(药物-抗体)比，其中如本文提及的药物为多核酸分子(B)。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约2或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约4或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约5或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约6或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约7或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约8或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约9或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约10或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约11或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约12或更大。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约4。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约5。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约7。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约9。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约10。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约11。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约12。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约13。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约14。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约15。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约16。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为4。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为12。
一些情况下，与包含多核酸分子(B)不含结合部分A的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物具有改善的活性。在一些情况下，改善的活性导致增强的生物学相关功能，例如，改善的稳定性、亲和力、结合、功能活性和在治疗或预防疾病状态中的功效。在一些情况下，该疾病状态是基因的一个或多个突变外显子的结果。在一些情况下，与包含多核酸分子(B)不含结合部分A的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物导致一个或多个突变外显子的外显子跳跃增加。在一些情况下，与包含多核酸分子(B)不含结合部分A的缀合物相比，在包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物中，外显子跳跃增加至少或大约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％。
在一些方面，使用本领域已知的常规技术进一步修饰抗体或抗原结合片段，例如通过单独或组合地使用本领域已知的氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或通过重组和/或任何其他修饰(例如，翻译后修饰和化学修饰，例如糖基化和磷酸化)。在一些情况下，修饰进一步包括用于调节与Fc受体相互作用的修饰。在一些情况下，一个或多个修饰包括在例如国际公开号WO97/34631中描述的那些，其公开了参与Fc结构域和FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基。用于在抗体或抗原结合片段的氨基酸序列下的核酸序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员熟知的。
在一些情况下，抗原结合片段还包括其衍生物并且包括含有至少一个CDR的多肽序列。
在一些情况下，如本文所用的术语“单链”意指双特异性单链构建体的第一结构域和第二结构域共价连接，优选地为单个核酸分子可编码的共线氨基酸序列的形式。
在一些情况下，双特异性单链抗体构建体涉及包含两个抗体衍生的结合结构域的构建体。在这样的方面，双特异性单链抗体构建体是串联双scFv或双抗体。在一些情况下，scFv含有通过接头肽连接的VH和VL结构域。在一些情况下，接头的长度和序列足以确保第一结构和第二结构域中的每一个可以彼此独立地保留其差异结合特异性。
在一些方面，如本文所用的结合或相互作用定义了至少两个抗原相互作用位点彼此的结合/相互作用。在一些情况下，抗原相互作用位点定义了多肽的基序，该基序显示出与特定抗原或特定抗原组特异性相互作用的能力。在一些情况下，结合/相互作用也被理解为定义特异性识别。在这种情况下，特异性识别是指抗体或其抗原结合片段能够与每个靶分子的至少两个氨基酸特异性相互作用和/或结合。例如，特异性识别涉及抗体分子的特异性，或涉及其区分靶分子特定区域的能力。在另外的情况下，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用导致信号的启动，例如，由于诱导抗原的构象变化、抗原的寡聚化等。在进一步的方面，结合以“键锁原理(key-lock-principle)”的特异性为例。因此，在一些情况下，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序和抗原由于它们的一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰的结果而彼此结合。在这种情况下，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也导致该位点与抗原的简单结合。
在一些情况下，特异性相互作用还指抗体或抗原结合片段的交叉反应性降低或脱靶效应降低。例如，与感兴趣的多肽/蛋白质结合但不与或基本上不与任何其他多肽结合的抗体或抗原结合片段被认为对感兴趣的多肽/蛋白质具有特异性。抗原相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用的示例包括配体对其受体的特异性，例如抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用。
另外的结合部分
在一些方面，结合部分是血浆蛋白质。在一些情况下，该血浆蛋白质包括白蛋白。在一些情况下，结合部分A是白蛋白。在一些情况下，白蛋白通过本文所述的一种或多种缀合化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，白蛋白通过天然连接化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，白蛋白通过赖氨酸缀合而缀合至多核酸分子。
在一些情况下，结合部分是类固醇。示例性的类固醇包括胆固醇、磷脂、二酰基甘油和三酰基甘油、脂肪酸、饱和的、不饱和的、包含取代的烃，或其组合。在一些情况下，该类固醇是胆固醇。在一些情况下，该结合部分是胆固醇。在一些情况下，胆固醇通过本文所述的一种或多种缀合化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，胆固醇通过天然连接化学法缀合至多核酸分子上。在一些情况下，胆固醇通过赖氨酸缀合而缀合至多核酸分子。
在一些情况下，结合部分是聚合物，包括但不限于与细胞上的特定表面标志物结合的多核酸分子适体。在这种情况下，该结合部分是这样的多核酸，其不与靶基因或mRNA杂交，而是类似于与细胞表面标志物的其特定表位结合的抗体，能够选择性地与细胞表面标志物结合。
在一些情况下，结合部分是肽。在一些情况下，该肽具有约1至约3kDa。在一些情况下，该肽具有约1.2至约2.8kDa、约1.5至约2.5kDa或约1.5至约2kDa。在一些情况下，该肽是双环肽。在一些情况下，该双环肽是受约束的双环肽。在一些情况下，该结合部分是双环肽(例如，来自Bicycle Therapeutics的双环化合物)。
在另外的情况下，结合部分是小分子。在一些情况下，该小分子是募集抗体的小分子。在一些情况下，该募集抗体的小分子包含靶标结合末端和抗体结合末端，其中靶标结合末端能够识别细胞表面受体并与之相互作用。例如，在一些情况下，包含谷氨酸脲化合物的靶标结合末端使得能够与PSMA相互作用，从而增强与表达PSMA的细胞的抗体相互作用。在一些情况下，结合部分是Zhang等人,“A remote arene-binding site on prostatespecific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules,”JAm Chem Soc.132(36):12711-12716(2010)；或McEnaney等人,“Antibody-recruitingmolecules:an emerging paradigm for engaging immune function in treating humandisease,”ACS Chem Biol.7(7):1139-1151(2012)中描述的小分子。
抗体或其抗原结合片段的产生
在一些方面，本文所述的多肽(例如抗体和抗原结合片段)使用本领域已知可用于合成多肽(例如抗体)的任何方法，尤其是通过化学合成或通过重组表达产生，并且优选通过重组表达技术产生。
在一些情况下，抗体或其抗原结合片段被重组表达，编码抗体或抗原结合片段的核酸由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242中所述)，其涉及合成包含编码抗体的部分序列的重叠寡核苷酸，这些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可替代地，任选地通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物的PCR扩增，或者通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针的克隆，从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或由表达免疫球蛋白的任何组织或细胞生成的cDNA文库)生成编码抗体的核酸分子。
在一些情况下，抗体或其抗原结合任选地通过以下来产生：对动物如兔进行免疫以产生多克隆抗体，或更优选地，通过产生单克隆抗体，如Kohler和Milstein(1975,Nature256:495-497)所述或如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)所述。可替代地，任选地通过以下方法来获得编码抗体的至少Fab部分的克隆：针对结合特定抗原的Fab片段的克隆来筛选Fab表达文库(例如，如在Huse等人,1989,Science 246:1275-1281中所述)或筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人,1991,Nature 352:624；Hane等人,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)。
在一些方面，使用被开发用于通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接而产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature312:604-608；Takeda等人,1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。
在一些方面，针对产生单链抗体所描述的技术(美国专利号4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于产生单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链多肽来形成单链抗体。还任选地使用在大肠杆菌(E.coli)中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些方面，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。在具体方面，抗体的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些方面，多种宿主表达载体系统用于表达本文所述的抗体或其抗原结合片段。此类宿主表达系统代表运载体，通过其产生抗体编码序列并且随后纯化，而且也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其抗原结合片段的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体或其抗原结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体或其抗原结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体或其抗原结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体或其抗原结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有抗体或其抗原结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述哺乳动物细胞系统含有重组表达构建体，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期高产量生产，优选稳定表达。在一些情况下，任选地对稳定表达抗体的细胞系进行工程改造。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标志物转化宿主细胞。在引入外源DNA后，工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成灶，然后将其克隆并扩增成细胞系。该方法可以有利地用于工程改造表达抗体或其抗原结合片段的细胞系。
在一些情况下，使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等人,1980,Cell 22:817)基因。此外，使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：DHFR，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O’Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；GPT，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH 11(5):155-215)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。重组DNA技术领域中公知的可使用的方法描述于Ausubel等人(编著),1993,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,Gene Transferand Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；以及Dracopoli等人(编著),1994,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY.的第12和13章；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1。
在一些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域已知的用于纯化或分析抗体或抗体缀合物的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是针对蛋白A后的特定抗原的亲和色谱法，以及大小柱色谱法)、离心、差异溶解度，或通过用于纯化蛋白质的其他任何标准技术。示例性的色谱方法包括但不限于强阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、大小排阻色谱法和快速蛋白质液相色谱法。
缀合化学
在一些方面，多核酸分子B缀合至结合部分。在一些方面，多核酸分子B缀合至式A-X-B中的结合部分(X是缀合A和B的接头)。在一些情况下，结合部分包含氨基酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、抗原、毒素、激素、脂质、核苷酸、核苷、糖、碳水化合物、聚合物如聚乙二醇和聚丙二醇、以及所有这些类别物质的类似物或衍生物。结合部分的其他实例还包括类固醇，例如胆固醇、磷脂、二酰基甘油和三酰基甘油、脂肪酸、烃(例如饱和、不饱和或包含取代)、酶底物、生物素、洋地黄毒苷和多糖。在一些情况下，结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，多核酸分子进一步缀合至聚合物，并且任选地缀合至内体溶解部分。
在一些方面，多核酸分子通过化学连接过程缀合至结合部分。在一些情况下，多核酸分子通过天然连接缀合至结合部分。在一些情况下，缀合如下所述：Dawson等人,“Synthesis of proteins by native chemical ligation,”Science 1994,266,776–779；Dawson等人,“Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through theUse of Thiol Additives,”J.Am.Chem.Soc.1997,119,4325–4329；Hackeng等人,“Proteinsynthesis by native chemical ligation:Expanded scope by using straightforwardmethodology.,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,10068–10073；或Wu等人,“Buildingcomplex glycopeptides:Development of a cysteine-free native chemical ligationprotocol,”Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,4116–4125。在一些情况下，缀合如美国专利号8,936,910所述。在一些方面，多核酸分子经由天然连接化学法位点特异性或非特异性地缀合至结合部分。
在一些情况下，多核酸分子通过利用“无痕”偶联技术(Philochem)的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该“无痕”偶联技术利用结合部分上的N-末端1,2-氨基硫醇基团，其随后与含有醛基团的多核酸分子缀合(参见Casi等人,“Site-specific tracelesscoupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies forpharmacodelivery,”JACS134(13):5887-5892(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用并入结合部分中的非天然氨基酸的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该非天然氨基酸包括对乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe)。在一些情况下，pAcPhe的酮基团选择性地与衍生自烷氧基-胺的缀合部分偶联以形成肟键(参见Axup等人,“Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnaturalamino acids,”PNAS109(40):16101-16106(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用酶催化过程的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该定点方法利用SMARTagTM技术(Catalent,Inc.)。在一些情况下，SMARTagTM技术包括通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)在醛标签的存在下通过氧化过程从半胱氨酸生成甲酰甘氨酸(FGly)残基，随后经由肼基-Pictet-Spengler(HIPS)连接将FGly缀合至烷基肼官能化多核酸分子(参见Wu等人,“Site-specific chemical modification of recombinantproteins produced in mammalian cells by using the genetically encodedaldehyde tag,”PNAS 106(9):3000-3005(2009)；Agarwal等人,“A Pictet-Spenglerligation for protein chemical modification,”PNAS110(1):46-51(2013))。
在一些情况下，酶催化过程包含微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。在一些情况下，多核酸分子利用微生物转谷氨酰胺酶催化的过程缀合至结合部分。在一些情况下，mTG催化识别序列内谷氨酰胺的酰胺侧链与官能化多核酸分子的伯胺之间的共价键形成。在一些情况下，mTG由茂源链霉菌(Streptomyces mobarensis)产生(参见Strop等人,“Locationmatters:site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics ofantibody drug conjugates,”Chemistry and Biology 20(2)161-167(2013))。
在一些情况下，多核酸分子通过如PCT公开号WO2014/140317中描述的方法缀合至结合部分，该方法利用序列特异性转肽酶。
在一些情况下，多核酸分子通过如美国专利公开号2015/0105539和2015/0105540中描述的方法缀合至结合部分。
聚合物缀合部分
在一些方面，聚合物部分C进一步缀合至本文所述的多核酸分子、本文所述的结合部分或其组合。在一些情况下，聚合物部分C缀合至多核酸分子，分子式为A-X1-B-X2-C(X1、X2作为分别缀合A与B、B与C的两个接头)。在一些情况下，聚合物部分C缀合至结合部分。在其他情况下，聚合物部分C缀合至多核酸分子结合部分分子。在另外的情况下，聚合物部分C是缀合的，如上文所示。
在一些情况下，聚合物部分C是天然或合成聚合物，其由支链或非支链单体的长链和/或二维或三维单体的交联网络组成。在一些情况下，聚合物部分C包括多糖、木质素、橡胶或聚环氧烷(例如，聚乙二醇)。在一些情况下，至少一个聚合物部分C包括但不限于α-二羟基聚乙二醇、ω-二羟基聚乙二醇、可生物降解的基于内酯的聚合物，例如聚丙烯酸、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚酰胺、聚氰基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯(也称为聚(对苯二甲酸乙二酯)、PET、PETG或PETE)、聚丁二醇(PTG)或聚氨酯及其混合物。如本文所用的，混合物是指在同一化合物内以及涉及在嵌段共聚物中使用不同聚合物。在一些情况下，嵌段共聚物是其中至少一部分聚合物由另一聚合物的单体构成的聚合物。在一些情况下，聚合物部分C包括聚环氧烷。在一些情况下，聚合物部分C包括PEG。在一些情况下，聚合物部分C包括聚乙烯酰亚胺(PEI)或羟乙基淀粉(HES)。
在一些情况下，C为PEG部分。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的5’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的3’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的3’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的5’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该PEG部分、结合部分或其组合缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该缀合是直接缀合。在一些情况下，该缀合经由天然连接进行。
在一些方面，聚环氧烷(例如，PEG)是多分散或单分散化合物。在一些情况下，多分散材料包含不同分子量的材料的分散分布，其特征在于平均重量(重均)大小和分散性。在一些情况下，单分散PEG包含一种大小的分子。在一些实施方案中，C为多分散或单分散的聚环氧烷(例如，PEG)，并且指示的分子量表示聚环氧烷(例如，PEG)分子的分子量的平均值。
在一些方面，聚环氧烷(例如，PEG)的分子量为约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da。
在一些方面，C为聚环氧烷(例如，PEG)，并且具有约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da的分子量。在一些方面，C为PEG，并且具有约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da的分子量。在一些情况下，C的分子量为约200Da。在一些情况下，C的分子量为约300Da。在一些情况下，C的分子量为约400Da。在一些情况下，C的分子量为约500Da。在一些情况下，C的分子量为约600Da。在一些情况下，C的分子量为约700Da。在一些情况下，C的分子量为约800Da。在一些情况下，C的分子量为约900Da。在一些情况下，C的分子量为约1000Da。在一些情况下，C的分子量为约1100Da。在一些情况下，C的分子量为约1200Da。在一些情况下，C的分子量为约1300Da。在一些情况下，C的分子量为约1400Da。在一些情况下，C的分子量为约1450Da。在一些情况下，C的分子量为约1500Da。在一些情况下，C的分子量为约1600Da。在一些情况下，C的分子量为约1700Da。在一些情况下，C的分子量为约1800Da。在一些情况下，C的分子量为约1900Da。在一些情况下，C的分子量为约2000Da。在一些情况下，C的分子量为约2100Da。在一些情况下，C的分子量为约2200Da。在一些情况下，C的分子量为约2300Da。在一些情况下，C的分子量为约2400Da。在一些情况下，C的分子量为约2500Da。在一些情况下，C的分子量为约2600Da。在一些情况下，C的分子量为约2700Da。在一些情况下，C的分子量为约2800Da。在一些情况下，C的分子量为约2900Da。在一些情况下，C的分子量为约3000Da。在一些情况下，C的分子量为约3250Da。在一些情况下，C的分子量为约3350Da。在一些情况下，C的分子量为约3500Da。在一些情况下，C的分子量为约3750Da。在一些情况下，C的分子量为约4000Da。在一些情况下，C的分子量为约4250Da。在一些情况下，C的分子量为约4500Da。在一些情况下，C的分子量为约4600Da。在一些情况下，C的分子量为约4750Da。在一些情况下，C的分子量为约5000Da。在一些情况下，C的分子量为约5500Da。在一些情况下，C的分子量为约6000Da。在一些情况下，C的分子量为约6500Da。在一些情况下，C的分子量为约7000Da。在一些情况下，C的分子量为约7500Da。在一些情况下，C的分子量为约8000Da。在一些情况下，C的分子量为约10,000Da。在一些情况下，C的分子量为约12,000Da。在一些情况下，C的分子量为约20,000Da。在一些情况下，C的分子量为约35,000Da。在一些情况下，C的分子量为约40,000Da。在一些情况下，C的分子量为约50,000Da。在一些情况下，C的分子量为约60,000Da。在一些情况下，C的分子量为约100,000Da。
在一些方面，聚环氧烷(例如，PEG)包含离散的环氧乙烷单元(例如4至约48个环氧乙烷单元)。在一些情况下，包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷是直链。在其他情况下，包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷是支链。
在一些情况下，聚合物部分C是包含离散的环氧乙烷单元的聚环氧烷(例如，PEG)。在一些情况下，聚合物部分C包含约4至约48个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C包含约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47或约48个环氧乙烷单元。
在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约4至约48个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47或约48个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约4个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约5个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约6个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约7个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约8个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约9个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约10个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约11个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约12个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约13个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约14个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约15个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约16个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约17个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约18个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约19个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约20个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约21个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约22个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约23个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约24个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约25个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约26个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约27个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约28个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约29个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约30个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约31个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约32个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约33个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约34个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约35个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约36个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约37个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约38个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约39个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约40个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约41个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约42个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约43个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约44个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约45个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约46个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约47个环氧乙烷单元。在一些情况下，聚合物部分C是离散的PEG，其包含，例如，约48个环氧乙烷单元。
在一些情况下，聚合物部分C是(Quanta Biodesign Ltd)。
在一些方面，聚合物部分C包含基于阳离子粘酸的聚合物(cMAP)。在一些情况下，cMAP包含至少一个重复亚单位的一个或多个亚单位，并且该亚单位结构表示为式(V)：
其中m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选4-6或5；并且n在每次出现时独立地为1、2、3、4或5。在一些方面，m和n为例如约10。
在一些情况下，cMAP进一步缀合至PEG部分，生成cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约50,000Da。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约1000Da、大于1000Da至约5000Da、大于5000Da至约10,000Da、大于10,000至约25,000Da、大于25,000Da至约50,000Da，或这些范围中的两个或更多个的任意组合。
在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物。在其他情况下，聚合物部分C是mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物。在另外的情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。
在一些方面，聚合物部分C如上文所述缀合至多核酸分子、结合部分和可选的内体溶解部分。
内体溶解部分或细胞膜穿透部分
在一些方面，式(I)的分子：A-X1-B-X2-C进一步包含另外的缀合部分。在一些情况下，另外的缀合部分是内体溶解部分和/或细胞膜穿透部分。在一些情况下，内体溶解部分是细胞区室释放组分，例如能够从本领域已知的任何细胞区室释放的化合物，例如内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体，或细胞内的其他囊泡体。在一些情况下，内体溶解部分包含内体溶解多肽、内体溶解聚合物、内体溶解脂质或内体溶解小分子。在一些情况下，内体溶解部分包含内体溶解多肽。在其他情况下，内体溶解部分包含内体溶解聚合物。在一些情况下，细胞膜穿透部分包含细胞穿透肽(CPP)。在其他情况下，细胞膜穿透部分包含细胞穿透脂质。在其他情况下，细胞膜穿透部分包含细胞穿透小分子。
内体溶解多肽和细胞膜穿透多肽
在一些方面，式(I)——A-X1-B-X2-C——的分子进一步与内体溶解多肽缀合。在一些情况下，该内体溶解多肽是pH依赖性膜活性肽。在一些情况下，该内体溶解多肽是两亲性多肽。在另外的情况下，该内体溶解多肽是拟肽。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF、蜂毒肽、meucin或其各自的衍生物。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF或其衍生物。在其他情况下，该内体溶解多肽包含蜂毒肽或其衍生物。在另外的情况下，该内体溶解多肽包含meucin或其衍生物。
在一些情况下，INF7是一种24个残基的多肽，那些序列包含CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA(SEQ ID NO:331)，或GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(SEQ ID NO:332)。在一些情况下，INF7或其衍生物包含以下序列：GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG(SEQID NO:333)、GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2(SEQ ID NO:334)或GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2(SEQ ID NO:335)。
在一些情况下，蜂毒肽是一种26个残基的多肽，那些序列包含CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ(SEQ ID NO:336)，或GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQID NO:337)。在一些情况下，蜂毒肽包含如美国专利号8,501,930中所述的多肽序列。
在一些情况下，meucin是一种源自蝎子条斑钳蝎(Mesobuthus eupeus)毒腺的抗菌肽(AMP)。在一些情况下，meucin包含meucin-13(那些序列包含IFGAIAGLLKNIF-NH2(SEQID NO:338))和meucin-18(那些序列包含FFGHLFKLATKIIPSLFQ(SEQ ID NO:339))。
在一些情况下，内体溶解多肽包括这样的多肽，它的序列与INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。在一些情况下，内体溶解部分包括INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物。
在一些情况下，内体溶解部分是INF7或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:331-335具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:331具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:332-335具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:331。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:332-335。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:331组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:332-335组成。
在一些情况下，内体溶解部分是蜂毒肽或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:336或337具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:336具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:337具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:286。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:337。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ IDNO:336组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:337组成。
在一些情况下，内体溶解部分是meucin或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:338或339具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:338具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:339具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:338。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:339。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ IDNO:338组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:339组成。在一些情况下，内体溶解部分包含如表8中所示的序列。
表8
在一些情况下，内体溶解部分包含Bak BH3多肽，后者通过拮抗抑制剂靶标如Bcl-2和/或Bcl-xL诱导凋亡。在一些情况下，内体溶解部分包含Albarran等人,“Efficientintracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsivecarrier,”Reactive&Functional Polymers 71:261-265(2011)描述的Bak BH3多肽。
在一些情况下，内体溶解部分包含PCT公开号WO2013/166155或WO2015/069587中描述的多肽(例如，细胞穿透多肽)。
内体溶解脂质
在一些方面，内体溶解部分是脂质(例如，促融合脂质)。在一些方面，式(I)——A-X1-B-X2-C——的分子进一步与内体溶解脂质(例如，促融合脂质)缀合。示例性促融合脂质包括1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)和N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙胺(XTC)。
在一些情况下，内体溶解部分是PCT公开号WO09/126,933中描述的脂质(例如，促融合脂质)。
内体溶解小分子
在一些方面，内体溶解部分是小分子。在一些方面，式(I)——A-X1-B-X2-C——的分子进一步与内体溶解小分子缀合。适合作为内体溶解部分的示例性小分子包括但不限于奎宁、氯喹、羟基氯喹、氨酚喹(carnoquine)、阿莫吡喹、伯氨喹、甲氟喹、硫酸氯喹、卤泛群、醌亚胺或其组合。在一些情况下，喹啉内体溶解部分包括但不限于7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(氯喹)；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(羟基氯喹)；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉；4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基氯喹)；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉)；4-(4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基-乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基-)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；磷酸羟基氯喹；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基-1)-氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基羟基氯喹)；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基]-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-丁酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；3-氯-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉，4-[(4-二乙基-氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3-氟-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉、4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉；4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3,4-二氢-1-(2H)-喹啉羧基醛；1,1'-五亚甲基二喹啉鎓二碘化物；8-羟基喹啉硫酸盐及其氨基、醛、羧基、羟基、卤素、酮基、巯基和乙烯基衍生物或类似物。在一些情况下，内体溶解部分是Naisbitt等人(1997,J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893)和美国专利号5,736,557中描述的小分子。
细胞穿透多肽(CPP)
在一些方面，细胞穿透多肽包含具有5-30个氨基酸的带正电荷的短肽。在一些方面，细胞穿透多肽包含富含精氨酸或赖氨酸的氨基酸序列。在一些方面，细胞穿透多肽包括表9中列出的任何多肽或其组合
表9
接头
在一些方面，本文所述的接头是可切割接头或不可切割接头。在一些情况下，接头是可切割接头。在其他情况下，接头是不可切割接头。
在一些情况下，接头是非聚合接头。非聚合接头是指不含通过聚合过程生成的单体重复单元的接头。示例性的非聚合接头包括但不限于C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽接头、无痕接头、自牺牲(self-immolative)接头、基于马来酰亚胺的接头或其组合。在一些情况下，非聚合接头包含C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽接头、无痕接头、自牺牲接头、基于马来酰亚胺的接头或其组合。在另外的情况下，非聚合接头不包含超过两个相同类型的接头，例如，超过两个同双官能交联体，或超过两个肽接头。在其他情况下，非聚合接头任选地包含一个或多个反应性官能团。
在一些情况下，非聚合接头不包含以上描述的聚合物。在一些情况下，非聚合接头不包含由聚合物部分C所包含的聚合物。在一些情况下，非聚合接头不包含聚环氧烷(例如PEG)。在一些情况下，非聚合接头不包含PEG。
在一些情况下，接头包括同双官能接头。示例性的同双官能接头包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3’3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)乙二醇酯(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二酰亚胺酯(DMA)、二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)、二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)、二甲基-3,3’-二硫代双丙酰亚胺酯(DTBP)、1,4-二-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4’-二氟-3,3’-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基氨基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α’-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N’-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N’-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。
在一些方面，接头包括异双官能接头。示例性的异双官能接头包括但不限于胺反应性和巯基交联体，诸如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-((((4-碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对-硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)；羰基反应性和巯基反应性交联体，诸如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)；胺反应性和光反应性交联体，诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨基酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)乙基-1,3’-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3’-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3’-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3’-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(ρ-叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、ρ-硝基苯基重氮基丙酮酸酯(ρNPDP)、ρ-硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)；巯基反应性和光反应性交联体，诸如1-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺；羰基反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)；羧酸酯反应性和光反应性交联体，诸如4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)；以及精氨酸反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些情况下，接头包含反应性官能团。在一些情况下，该反应性官能团包含对结合部分上存在的亲电子基团具有反应性的亲核基团。示例性的亲电子基团包括羰基，如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰卤或酸酐。在一些方面，该反应性官能团是醛。示例性的亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基肼。
在一些方面，接头包含马来酰亚胺基团。在一些情况下，马来酰亚胺基团也被称为马来酰亚胺间隔基。在一些情况下，该马来酰亚胺基团进一步包含己酸，形成马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该接头包含马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该接头是马来酰亚胺己酰基(mc)。在其他情况下，该马来酰亚胺基团包括马来酰亚胺甲基，例如如上所述的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些方面，马来酰亚胺基团是自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)并入邻近马来酰亚胺的碱性氨基，以提供硫代琥珀酰亚胺环水解的分子内催化，从而阻止马来酰亚胺发生通过逆迈克尔反应的消除反应。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺是Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimides improve thestability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates,”Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)描述的马来酰亚胺基团。在一些情况下，接头包含自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，接头是自稳定的马来酰亚胺。
在一些方面，接头包含肽部分。在一些情况下，肽部分包含至少2、3、4、5或6个以上的氨基酸残基。在一些情况下，肽部分包含至多2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。在一些情况下，肽部分包含约2、约3、约4、约5或约6个氨基酸残基。在一些情况下，肽部分是可切割的肽部分(例如，酶促或化学)。在一些情况下，肽部分是不可切割的肽部分。在一些情况下，肽部分包含Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:294223)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:294224)、或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ IDNO:294225)。在一些情况下，接头包含肽部分，例如：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:294223)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO:294224)、或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:294225)。在一些情况下，接头包含Val-Cit。在一些情况下，接头是Val-Cit。
在一些方面，接头包含苯甲酸基团或其衍生物。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含对氨基苯甲酸(PABA)。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含γ-氨基丁酸(GABA)。
在一些方面，接头包含任意组合的马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团中的一种或多种。在一些方面，接头包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在一些情况下，该马来酰亚胺基团是马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该肽基团是val-cit。在一些情况下，该苯甲酸基团是PABA。在一些情况下，接头包含mc-val-cit基团。在一些情况下，接头包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，接头包含mc-val-cit-PABA基团。
在一些方面，接头是自牺牲接头或自消除接头。在一些情况下，接头是自牺牲接头。在其他情况下，接头是自消除接头(例如，环化自消除接头)。在一些情况下，接头包括美国专利号9,089,614或PCT公开号WO2015038426中描述的接头。
在一些方面，接头是树枝型接头。在一些情况下，该树枝型接头包含支化的多官能接头部分。在一些情况下，该树枝型接头用来增加多核苷酸B与结合部分A的摩尔比。在一些情况下，该树枝型接头包含PAMAM树枝状高分子。
在一些方面，接头是无痕接头或者在切割后不会给结合部分A、多核苷酸B、聚合物C或内体溶解部分D留下接头部分(例如，原子或接头基团)的接头。示例性的无痕接头包括但不限于锗接头、硅接头、硫接头、硒接头、氮接头、磷接头、硼接头、铬接头或苯肼接头。在一些情况下，接头是如Hejesen等人,“A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry,”Org Biomol Chem 11(15):2493-2497(2013)描述的无痕芳基-三氮烯接头。在一些情况下，接头是Blaney等人,“Traceless solid-phase organicsynthesis,”Chem.Rev.102:2607-2024(2002)描述的无痕接头。在一些情况下，接头是美国专利号6,821,783中描述的无痕接头。
在一些情况下，接头是以下文献中描述的接头：美国专利号6,884,869；7,498,298；8,288,352；8,609,105；或8,697,688；美国专利公开号2014/0127239；2013/028919；2014/286970；2013/0309256；2015/037360；或2014/0294851；或者PCT公开号WO2015057699；WO2014080251；WO2014197854；WO2014145090；或WO2014177042。
在一些方面，X1和X2各自独立地为键或非聚合接头。在一些情况下，X1和X2各自独立地为键。在一些情况下，X1和X2各自独立地为非聚合接头。
在一些情况下，X1为键或非聚合接头。在一些情况下，X1为键。在一些情况下，X1为非聚合接头。在一些情况下，接头为C1-C6烷基。在一些情况下，X1为C1-C6烷基，例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基。在一些情况下，该C1-C6烷基是未取代的C1-C6烷基。如在接头的语境中，特别是在X1的语境中所使用的，烷基意指含有最多六个碳原子的饱和直链或支链烃基团。在一些情况下，X1包括以上所述的同双官能接头或异双官能接头。在一些情况下，X1包括异双官能接头。在一些情况下，X1包括sMCC。在其他情况下，X1包括任选地缀合至C1-C6烷基的异双官能接头。在其他情况下，X1包括任选地缀合至C1-C6烷基的sMCC。在另外的情况下，X1不包括以上所述的同双官能接头或异双官能接头。
在一些情况下，X2为键或接头。在一些情况下，X2为键。在其他情况下，X2为接头。在一些情况下，X2为非聚合接头。在一些方面，X2为C1-C6烷基。在一些情况下，X2为以上所述的同双官能接头或异双官能接头。在一些情况下，X2为以上所述的同双官能接头。在一些情况下，X2为以上所述的异双官能接头。在一些情况下，X2包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺基己酰基(mc)或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，X2包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，X2包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，X2包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下，X2包含mc基团。在另外的情况下，X2包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，X2包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，X2包含mc-val-cit-PABA基团。
使用方法
肌萎缩是指肌肉质量损失和/或肌肉的进行性弱化和退化。在一些情况下，由于蛋白质降解率高、蛋白质合成率低或两者兼而有之，发生肌肉质量损失和/或肌肉的进行性弱化和退化。在一些情况下，肌肉蛋白质的高降解率是由于肌肉蛋白质的分解代谢(即，为了使用氨基酸作为糖原异生的底物而导致的肌肉蛋白质的分解)引起的。
在一个实施方案中，肌萎缩是指肌力的显著损失。肌力的显著损失是指相对于对照对象中的相同肌肉组织，对象中病变、受伤或未使用的肌肉组织的力量降低。在一个实施方案中，肌力的显著损失是力量相对于对照对象中的相同肌肉组织降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。在另一个实施方案中，肌力的显著损失是指相对于在一段时间之前同一对象中相同肌肉组织的肌力，未使用肌肉组织的力量降低。在一个实施方案中，肌力的显著损失是相对于在一段时间之前同一对象中相同肌肉组织的肌力降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。
在另一个实施方案中，肌萎缩是指肌肉质量的显著损失。肌肉质量的显著损失是指相对于对照对象中的相同肌肉组织，对象中病变、受伤或未使用的肌肉组织的肌肉体积减少。在一个实施方案中，肌肉体积的显著损失为相对于对照对象中的相同肌肉组织至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。在另一个实施方案中，肌肉质量的显著损失是指相对于在一段时间之前同一对象中相同肌肉组织的肌肉体积，未使用的肌肉组织的肌肉体积减少。在一个实施方案中，肌肉组织的显著损失是相对于在一段时间之前同一对象中相同肌肉组织的肌肉体积至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。任选地，例如通过磁共振成像(例如，通过肌肉体积/横截面积(CSA)MRI方法)，通过评估肌肉的横截面积来测量肌肉体积。
在一些方面，本文描述的是治疗对象肌萎缩的方法，其包括提供本文所述的多核酸分子并向对象施用治疗有效量的本文所述的多核酸分子或本文所述的多核酸分子缀合物以减少人DUX4的mRNA转录物的数量。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且反义链与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列是相同的。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列是相同的。
在一些情况下，肌萎缩与面肩肱型肌营养不良(FSHD)有关。多核酸部分介导针对人DUX4的RNA干扰，以调节对象的肌萎缩。在一些方面，受DUX4表达影响的一种或多种标志物基因的表达也因人DUX4表达降低而改变或调节(例如，降低)。标志物基因包括但不限于MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。在一些方面，与未处理的细胞相比，一种或多种标志物基因的表达降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些方面，与未处理的细胞相比，一种或多种标志物基因作为组或复合的表达降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
在一些方面，本文描述了一种治疗对象肌萎缩的方法，其包括提供本文所述的siRNA-抗体缀合物并向所述对象施用治疗有效量的本文所述的siRNA-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。在一些情况下，肌萎缩与FSHD相关。siRNA-抗体缀合物介导针对人DUX4 mRNA的RNA干扰以治疗对象的肌萎缩，该治疗包括向对象施用治疗有效量的本文所述的siRNA-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。
在一些方面，本文描述的是治疗对象肌萎缩的方法，其包括提供本文所述的DUX4siRNA-抗体缀合物(DUX4 siRNA-缀合物或DUX4-AOC)并向对象施用治疗有效量的本文所述的DUX4 siRNA-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。在一些情况下，肌萎缩与FSHD相关。DUX4 siRNA-抗体缀合物介导针对人DUX4 mRNA的RNA干扰以治疗对象的肌萎缩，该治疗包括向对象施用治疗有效量的本文所述的DUX4 siRNA-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。
在一些方面，本文描述的是治疗对象FSHD的方法，其包括提供本文所述的DUX4siRNA-抗体缀合物(DUX4 siRNA缀合物或DUX4-AOC)并向对象施用治疗有效量的本文所述的DUX4 siRNA-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。在一些情况下，FSHD是FSHD类型1(FSHD1)。在一些情况下，FSHD是FSHD类型2(FSHD2)。DUX4 siRNA-抗体缀合物介导针对人DUX4 mRNA的RNA干扰以治疗对象的FSHD，该治疗包括向对象施用治疗有效量的本文所述的DUX4 siRNA缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA转录物的水平。在一些方面，受DUX4表达影响的一种或多种标志物基因的表达水平也因人DUX4表达水平降低而改变或调节。DUX4生物标志物基因包括但不限于MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
在一些方面，本文描述了通过降低人DUX4的mRNA转录物的水平在患有FSHD的对象中减轻症状的方法，所述方法包括提供本文所述的DUX siRNA-抗体缀合物(DUX4-siRNA缀合物或DUX4-AOC)并向对象施用治疗有效量的本文所述的siRNA缀合物。在一些情况下，FSHD是FSHD类型1(FSHD1)。在一些情况下，FSHD是FSHD类型2(FSHD2)。在另一些方面，本文描述了通过降低人DUX4的mRNA转录物的水平或降低DUX4蛋白的水平在FSHD患者中缓解症状的方法，所述方法包括提供本文所述的siRNA缀合物并且向FSHD患者施用治疗有效量的本文所述的siRNA缀合物。
在一些情况下，FSHD的症状影响骨骼肌。受FSHD影响的骨骼肌包括眼睛和嘴巴周围的肌肉、肩部肌肉、上臂肌肉、小腿肌肉、腹部肌肉和臀部肌肉。在一些情况下，FSHD的症状也会影响视力和听力。在一些情况下，FSHD的症状也会影响心脏或肺的功能。在一些情况下，FSHD的症状包括肌无力、肌萎缩、肌营养不良、疼痛性炎症、挛缩、脊柱侧弯、脊柱前凸、换气不足、视网膜异常、暴露于角膜炎、轻度听力损失和EMG异常。
在一些方面，本文描述的是通过降低人DUX4的mRNA转录物的水平或降低DUX4蛋白的水平来改善FSHD患者的骨骼肌功能的方法，所述方法包括以下步骤：向FSHD患者施用治疗有效量的本文所述的siRNA缀合物。在一些情况下，FSHD是FSHD类型1(FSHD1)。在一些情况下，FSHD是FSHD类型2。在一些方面，本文描述的是通过降低人DUX4的mRNA转录物的水平或降低DUX4蛋白的水平来改善患有FSHD的患者的骨骼肌功能、视力、听力、心脏功能或肺功能的方法，所述方法包括以下步骤：向FSHD患者施用治疗有效量的本文所述的siRNA缀合物。
在一些方面，本文描述的是治疗对象中的FSHD的方法，所述方法包括提供本文所述的反义寡核苷酸(ASO)抗体缀合物(ASO缀合物)并向对象施用治疗有效量的本文所述的ASO-抗体缀合物并且降低所述对象中人DUX4的mRNA的转录物水平。在一些情况下，FSHD是FSHD类型1(FSHD1)。在一些情况下，FSHD是FSHD类型2。ASO-抗体缀合物介导针对人DUX4mRNA的RNA干扰以治疗对象的FSHD，该治疗包括向对象施用治疗有效量的本文所述的ASO-抗体缀合物并降低所述对象中人DUX4的mRNA的转录物水平。在一些方面，受DUX4表达影响的一种或多种标志物基因的表达水平也因人DUX4表达水平降低而改变或调节。DUX4生物标志物基因包括但不限于MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
在一些方面，本文描述的是治疗对象的FSHD的方法。在一些情况下，FSHD对象患有FSHD1。在其他情况下，FSHD对象患有FSHD2。在另一个实施方案中，FSHD对象的肌细胞异常表达DUX4蛋白，这是由4号染色体长臂的D4Z4区域中的遗传和表观遗传分子变化引起的。肌细胞中的遗传分子变化是突变，该突变导致包含1-10个重复而不是FSHD对象的4号染色体的正常11到100个重复的D4Z4区域的收缩。肌细胞中的表观遗传分子变化是导致FSHD对象4号染色体的D4Z4区域低甲基化的变化。在一些情况下，肌细胞是骨骼肌细胞。
药物制剂
在一些方面，本文所述的药物制剂通过多种施用途径施用于对象，该施用途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内)、口服、鼻内、颊、直肠或透皮施用途径。在一些情况下，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、鞘内、大脑内、脑室内或颅内)施用。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于口服施用。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于鼻内施用。
在一些方面，药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如，纳米颗粒制剂)以及立即和控制释放混合型制剂。
在一些情况下，药物制剂包括多颗粒制剂。在一些情况下，药物制剂包括纳米颗粒制剂。在一些情况下，纳米颗粒包含cMAP、环糊精或脂质。在一些情况下，纳米颗粒包括固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、自乳化纳米颗粒、脂质体、微乳液或胶束溶液。另外的示例性纳米颗粒包括但不限于顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角(nanohoms)、纳米洋葱(nano-onions)、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些情况下，纳米颗粒是金属纳米颗粒，例如钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑及其组合、合金或氧化物的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒包含核或者核和壳，如在核-壳纳米颗粒中。
在一些情况下，纳米颗粒进一步涂覆有用于附接功能元件的分子(例如，与本文所述的多核酸分子或结合部分中的一种或多种)。在一些情况下，涂层包含硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、羧甲基葡聚糖、藻酸、果胶、角叉菜聚糖、岩藻多糖、琼脂胶、紫菜聚糖、刺梧桐胶、结冷胶、黄原胶、透明质酸、葡糖胺、半乳糖胺、壳多糖(或壳聚糖)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚赖氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、卵清蛋白、糊精或环糊精。在一些情况下，纳米颗粒包括石墨烯涂覆的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒具有小于约500nm、400nm、300nm、200nm或100nm的至少一个维度。
在一些情况下，纳米颗粒制剂包含顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳或量子点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。在一些情况下，至少1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。
在一些方面，药物制剂包含递送载体，例如重组载体，将多核酸分子递送到细胞中。在一些情况下，该重组载体是DNA质粒。在其他情况下，该重组载体是病毒载体。示例性的病毒载体包括衍生自腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒的载体。在一些情况下，能够表达多核酸分子的重组载体在靶细胞中提供稳定的表达。在另外的情况下，使用提供多核酸分子的瞬时表达的病毒载体。
在一些方面，药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择的载体或载体材料。示例性的载体材料包括，例如，粘合剂、混悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些情况下，药物制剂进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这样的酸、碱和缓冲液以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量包含在内。
在一些情况下，药物制剂包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这样的盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些情况下，药物制剂进一步包含用来稳定化合物的稀释剂，因为它们提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
在一些情况下，药物制剂包含崩解剂以便于物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当与胃肠液接触时剂型的溶解和分散。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如National 1551或或羟基乙酸淀粉钠如或纤维素如木制品，甲基结晶纤维素，例如 PH101、PH102、PH105、P100、和甲基纤维素，交联羧甲纤维素，或交联纤维素如交联羧甲基纤维素钠交联羧甲基纤维素或交联的交联羧甲纤维素，交联淀粉如羟基乙酸淀粉钠，交联聚合物如聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐如藻酸或藻酸的盐如藻酸钠，粘土如HV(硅酸镁铝)，树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘浆，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合，等等。
在一些情况下，药物制剂包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物制剂中，用于预防、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
增塑剂包括用来软化微胶囊化材料或膜涂层以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂也用作分散剂或润湿剂。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
混悬剂包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
表面活性剂包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如(BASF)等化合物。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。有时，包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
润湿剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些方面，施用本文所述的药物组合物用于治疗性应用。在一些方面，药物组合物每天一次、每天两次、每天三次或更多次施用。每天、每一天、每隔一天、一周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次、两个月一次、三个月一次、四个月一次、五个月一次、六个月或更长时间一次施用药物组合物。施用药物组合物至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年、或者更长时间。
在一些方面，一种或多种药物组合物同时、依次或间隔一段时间施用。在一些方面，一种或多种药物组合物同时施用。在一些情况下，一种或多种药物组合物依次施用。在另外的情况下，一种或多种药物组合物间隔一段时间施用(例如，第一药物组合物的第一次施用在第一天，然后在施用至少第二药物组合物之前间隔至少1、2、3、4、5天或更多天)。
在一些方面，共同施用两种或更多种不同的药物组合物。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物同时共同施用。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，施用之间没有时间间隔。在其他情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，施用之间的间隔为约0.5小时、1小时、2小时、3小时、12小时、1天、2天或更长时间。
在患者的状况确实得到改善的情况下，根据医生的判断，继续给予组合物的施用；或者，将所施用的组合物的剂量暂时减少或暂时暂停某一时间长度(即“休药期”)。在一些情况下，休药期的长度在2天与1年之间不等，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。休药期期间的剂量减少为10％-100％，仅举例而言，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的病况出现改善，如有必要，施用维持剂量。随后，可根据症状的变化，任选地将施用剂量或频率或两者降低至该疾病、病症或病况的改善得以保持的水平。
在一些方面，对应于这样的量的给定药剂的量根据诸如具体化合物、疾病严重程度、需要治疗的对象或宿主的特征(例如，体重)等因素而变化，然而其仍然根据与该实例有关的具体情况以本领域已知的方式常规地确定，该具体情况包括例如所施用的具体药剂、施用途径以及所治疗的对象或宿主。在一些情况下，所需的剂量方便地以单剂量或以分剂量呈现，该分剂量同时(或在短时间段内)施用或以适当的间隔施用，例如每天2、3、4个或更多个亚剂量。
前述范围仅为提示性的，因为关于个体治疗方案的变量的数量巨大，并且相距这些推荐值的相当大的偏差并不罕见。这样的剂量根据多个变量而改变，这些变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、施用方式、个体对象的需求、所治疗的疾病或病况的严重程度以及执业医师的判断。
在一些方面，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，包括但不限于LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％在治疗上有效的剂量)的确定。毒性效果与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且表示为LD50与ED50之比。优选表现出高治疗指数的化合物。使用从细胞培养试验和动物研究获得的数据来制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包含ED50且具有最小毒性的循环浓度范围内。根据所用的剂型和所用的施用途径，剂量在该范围内变化。
试剂盒/制品
在某些方面，本文公开了与本文所述的一种或多种组合物和方法一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的施用和治疗方式的任何包装材料。
例如，容器包含本文所述的靶核酸分子。这样的试剂盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。
试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。
在一个实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗性应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。
在某些方面，药物组合物在含有一个或多个单位剂型的包装或分配器装置中提供，该单位剂型含有本文提供的化合物。例如，该包装包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，该包装或分配器装置伴随有给药说明书。在一个实施方案中，该包装或分配器还伴随有由监管药物制造、使用或销售的政府机构所规定形式的、与容器相关联的公告，该公告反映出该机构已批准该药物形式用于人类或兽医给药。这样的公告例如是由美国食品和药品管理局批准用于处方药的标记或已批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备含有在相容性药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将该组合物置于适当的容器中，并标出用于治疗所指示的病况。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所请求保护的主题所属领域的技术人员所一般理解的含义相同的含义。应当理解，前面的一般描述和以下详细描述均仅为示例性和说明性的，并非限制任何所请求保护的主题。在本申请中，除非另有具体说明，否则单数的使用包括复数。必须指出，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用是非限制性的。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”还包括准确量。因此，“约5μL”意指“约5μL”，并且还指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量。
本文使用的章节标题仅用于组织结构的目的，而不应理解为限制所描述的主题。
如本文所用的，术语“个体”、“对象”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些方面，该哺乳动物为人。在一些方面，该哺乳动物为非人类。这些术语均不要求或不限于以医疗保健工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇性)为特征的情况。
术语“治疗有效量”是指足以在哺乳动物对象中提供所需治疗效果的多核酸分子缀合物的量。在一些情况下，该量是向患者(如人)施用的单次或多次剂量，以用于对病症进行治疗、预防、预防其发作、治愈、延迟、降低其严重程度、减轻病症的至少一种症状或病症的复发，或延长患者的生存期至超出在没有这种治疗的情况下所预期的生存期。自然地，用于提供治疗有效量的特定多核酸分子缀合物的剂量水平根据损伤的类型，对象的年龄、体重、性别、医疗状况，病况的严重程度，施用途径，和所用的特定抑制剂而不同。在一些情况下，如本文所述，最初从细胞培养和动物模型中估计多核酸分子缀合物的治疗有效量。例如，在细胞培养方法中确定的IC50值任选地用作动物模型的起点，而在动物模型中确定的IC50值任选地用于在人类中寻找治疗有效剂量。
骨骼肌，或随意肌，通常被腱固定到骨，并且通常用来实现骨骼运动，如运动或保持姿势。尽管通常以无意识反射的方式维持对骨骼肌的某些控制(例如姿势肌或膈肌)，但是骨骼肌对有意识的控制作出反应。在诸如食管、胃、肠、子宫、尿道和血管等器官和结构的壁中存在平滑肌或不随意肌。
骨骼肌进一步分为两大类：I型(或“慢肌”)和II型(或“快肌”)。I型肌纤维具有密集的毛细血管，并富含线粒体和肌红蛋白，这使I型肌肉组织具有特征性的红色。在一些情况下，I型肌纤维携带更多的氧气，并使用脂肪或碳水化合物作为燃料来维持有氧运动。I型肌纤维可长时间收缩，但力度很小。II型肌纤维进一步细分为三种主要的亚型(IIa、IIx和IIb)，它们在收缩速度和产生的力上各不相同。II型肌纤维快速而有力地收缩，但很快疲劳，因此在肌肉收缩变得疼痛之前仅产生短暂的厌氧爆发活动。
与骨骼肌不同，平滑肌不受意识控制。
心肌也是不随意肌，但在结构上更类似于骨骼肌，并且仅存在于心脏中。心肌和骨骼肌是有横纹的，因为它们含有被包装为成束的高度规则的排列的肌节。相反，平滑肌细胞的肌原纤维没有以肌节排列，因此没有横纹。
肌细胞包括任何对肌肉组织有贡献的细胞。示例性的肌细胞包括成肌细胞、卫星细胞、肌管和肌原纤维组织。
如本文所用的，肌力与横截面积(CSA)成比例，而肌肉速度与肌纤维长度成比例。因此，比较各种肌肉之间的横截面积和肌纤维能够提供肌萎缩的指征。测量肌肉力量和肌肉重量的各种方法在本领域中是已知的，例如，参见，Hazel M.Clarkson,“Musculoskeletal assessment:Joint range of motion and manual muscle strength”Lippincott Williams&Wilkins,2000年出版。通过计算机轴向断层扫描和超声检查评估从选定的肌肉组织产生断层图像是测量肌肉质量的另外的方法。
术语抗体寡核苷酸缀合物(AOC)是指与核苷酸缀合的抗体。
术语“siRNA缀合物”或“siRNA-抗体缀合物”是指与siRNA缀合的抗体。
术语“DUX4 siRNA-缀合物”或“DUX4 siRNA-抗体缀合物”是指与跟人DUX4 mRNA的靶序列杂交的siRNA缀合的抗体。
术语“DUX4-AOC”是指与跟人DUX4 mRNA的靶序列杂交的siRNA缀合的抗体。
实施方案
实施方案1.一种多核酸分子缀合物，其包含：缀合至与DUX4的靶序列杂交的多核酸分子的抗体或其抗原结合片段；并且其中所述多核酸分子缀合物介导针对所述DUX4的RNA干扰。
实施方案2.如实施方案1所述的多核酸分子缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括非人抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体或其抗原结合片段、单价Fab'、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或骆驼科抗体或其抗原结合片段。
实施方案3.如实施方案1或2所述的多核酸分子缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。
实施方案4.如实施方案1-3中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且其中所述有义链和/或所述反义链各自独立地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个经修饰的核苷酸间连接，或至少一个反向无碱基部分。
实施方案5.如实施方案1-4中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核苷酸与DUX4的靶序列的至少8个连续碱基杂交。
实施方案6.如实施方案1-5中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核苷酸的长度为约8至约50个核苷酸或长度为约10至约30个核苷酸。
实施方案7.如实施方案1-6中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且所述有义链与选自SEQ ID NO:1-70或SEQ ID NO:141-210的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
实施方案8.如实施方案1-7中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且所述有义链与选自SEQ ID NO:142、146、196、201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
实施方案9.如实施方案1-8中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且所述反义链与选自SEQ ID NO:71-140或SEQ ID NO:211-280的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
实施方案10.如实施方案1-9中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和/或反义链，并且所述反义链与选自SEQ ID NO:412-420和430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
实施方案11.如实施方案1-10中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸，并且进一步地，其中所述2’修饰的核苷酸包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸；包含锁核酸(LNA)或乙烯核酸(ENA)；或包含其组合。
实施方案12.如实施方案1-11中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。
实施方案13.如实施方案1-12中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含3个或更多个选自2’-O-甲基和2’-脱氧-2’-氟的2’修饰的核苷酸。
实施方案14.如实施方案1-13中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸。
实施方案15.如实施方案1-14中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；
R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且
J是与所述多核苷酸的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述2’修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且2’-O-甲基修饰的核苷酸位于所述有义链和/或所述反义链的5’端。
实施方案17.如实施方案16所述的多核酸分子缀合物，其中所述2’-O-甲基修饰的核苷酸是嘌呤核苷酸。
实施方案18.如实施方案16所述的多核酸分子缀合物，其中所述2’-O-甲基修饰的核苷酸是吡啶核苷酸。
实施方案19.如实施方案16-18中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述有义链和/或反义链在5’端包含至少两个、三个、四个连续的所述2’-O-甲基修饰的核苷酸。
实施方案20.如实施方案1-19中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子缀合物包含将所述抗体或其抗原结合片段连接至所述多核酸分子的接头。
实施方案21.如实施方案20所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是C1-C6烷基接头。
实施方案22.如实施方案20所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是同双官能接头或异双官能接头，并且包含马来酰亚胺基团、二肽部分、苯甲酸基团或其衍生物。
实施方案23.如实施方案20所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是可切割或不可切割的接头。
实施方案24.如实施方案1-23中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子与所述抗体或其抗原结合片段之间的比率为约1:1、2:1、3:1或4:1。
实施方案25.如实施方案1-24中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子介导针对人DUX4的RNA干扰并调节对象的肌萎缩。
实施方案26.如实施方案25所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括与未处理细胞中DUX4基因的mRNA转录物的量相比，使DUX4基因的mRNA转录物的表达降低至少50％、至少60％或至少70％或更多。
实施方案27.如实施方案25-26中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L和LEUTX。
实施方案28.如实施方案25-26中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
实施方案29.如实施方案28所述的多核酸分子缀合物，其中影响所述标志物基因的表达是使所述标志物基因的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更多。
实施方案30.如实施方案25-29中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
实施方案31.如实施方案1-30中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子缀合物包含式(I)的分子：
A-X-B
(式I)
其中，
A是所述抗体或其抗原结合片段；
B是与DUX4的靶序列杂交的所述多核酸分子；
X是键或非聚合接头；并且
其中X与A的半胱氨酸残基缀合。
实施方案32.一种药物组合物，其包含：
如实施方案1-31所述的多核酸分子缀合物；以及药学上可接受的赋形剂。
实施方案33.如实施方案32所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。
实施方案34.如实施方案32-33中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊、直肠、透皮、静脉内、皮下或鞘内施用。
实施方案35.一种用于治疗有需要的对象的肌营养不良的方法，所述方法包括：
提供如实施方案1-34中任一项所述的多核酸缀合物；以及向所述有需要的对象施用所述多核酸缀合物以治疗所述肌营养不良，其中所述多核酸缀合物减少人DUX4的mRNA转录物的量。
实施方案36.如实施方案35所述的方法，其中所述多核酸部分介导针对人DUX4的RNA干扰并且调节对象的肌萎缩。
实施方案37.如实施方案36所述的方法，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在受肌营养不良影响的细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
实施方案38.如实施方案35-37中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
实施方案39.如实施方案1-30中任一项所述的多核酸分子缀合物或如实施方案32-34中任一项所述的药物组合物用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的用途。
实施方案40.如实施方案1-30中任一项所述的多核酸分子缀合物或如实施方案32-34中任一项所述的药物组合物用于制造用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的药物的用途。
实施方案41.一种试剂盒，其包含如实施方案1-31所述的多核酸分子缀合物或如实施方案32-34中任一项所述的药物组合物。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.针对人全长DUX4转录物的生物信息学siRNA文库设计
图2显示了DUX4 siRNA的计算机模拟选择过程的流程图。收集所有可以与DUX4或DUX4的预定区域结合的siRNA的序列，以生成DUX4 siRNA的起始组。从DUX siRNA的起始组中，第一消除步骤包括消除具有单核苷酸多态性(SNP)和/或MEF<-5的一种或多种DUX4siRNA。然后，第二消除步骤包括消除在人转录组中具有0和1个MM的DUX siRNA(使得被允许的命中仅为DUX、DUX5和DBET)。然后，第三消除步骤包括消除在人基因内区域中具有0个错配(MM)的DUX siRNA(使得被允许的命中仅为DUX1、DUX5和DBET假基因)。然后，下一个消除步骤包括消除对于FLExDUX4 FSHD小鼠模型中使用的DUX4人序列具有MM的DUX siRNA。然后，下一步骤是仅继续使用或继续使用预测生存力≥60的一种或多种DUX siRNA。接下来，消除步骤包括消除与已知miRNA 1-1000的种子区域具有匹配的一种或多种DUX siRNA。然后，消除步骤继续消除％GC含量为75及以上的DUX siRNA。然后，最终选择过程包括八个或更少的具有2个MM的预测脱靶命中，但区域295-1132除外，对于其最多允许12个命中。使用这样的一系列选择步骤，可以从1694个DUX siRNA的起始组中选择最终的70个候选DUXsiRNA。图3显示了DUX4 mRNA转录物(NM_001306068)中这样的所选DUX4 siRNA的位置和数量。
鉴定的siRNA候选者在其序列中具有共同特征，如下表10中所示。鉴定的siRNA大多具有2’-O-Me修饰，其中2’-F修饰仅位于全部3种DUX4模板的有义链的第7、8、9位。2’-O-Me修饰与2’-F修饰位于DUX4模板1的反义链的第1、2、6、14、16位并且位于DUX4模板1和2的第2、6、14、16位。此外，鉴定的siRNA在每条链上包含4个硫代磷酸酯修饰，位于每个5’和3’末端的最后2个连接处。鉴定的siRNA在DUX4模板1的反义链的5’端的第一个位置进一步包含“Uf”，而与实际的靶mRNA序列无关(在有义链的3’端的最后一个位置与“a”偶联)并且在DUX4模板3的反义链的5’端的第一个位置包含“vpN”。鉴定的siRNA还仅在反义链的3’端包含“uu”突出端，而在有义链的3’端没有突出端。鉴定的siRNA的优化可包括乙烯基膦酸酯核苷酸、反向无碱基部分或对于过客链或引导链的胺接头。
表10
vpN＝乙烯基膦酸酯VpUq；大写字母(N)＝2’-OH(核糖)；小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)
dN＝2’-H(脱氧)；Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰；iB＝反向无碱基
表11、12、13、14和15说明了经鉴定的用于调节人DUX4的siRNA候选者。
表11
表12
vpN＝乙烯基膦酸酯2’-MOE；大写字母(N)＝2’-OH(核糖)；小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)
dN＝2’-H(脱氧)；Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰；iB＝反向无碱基
表13
表14
vpN＝乙烯基膦酸酯vpUq；大写字母(N)＝2’-OH(核糖)；小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)
dN＝2’-H(脱氧)；Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰；iB＝反向无碱基
表15
vpN＝乙烯基膦酸酯vpUq；大写字母(N)＝2’-OH(核糖)；小写字母(n)＝2’-O-Me(甲基)
dN＝2’-H(脱氧)；Nf＝2’-F(氟)；s＝硫代磷酸酯骨架修饰；iB＝反向无碱基
实施例2.siRNA序列和合成
使用标准亚磷酰胺化学在固相上完全组装所有siRNA单链，并通过HPLC纯化。将纯化的单链进行双链体化以获得双链siRNA。对于乙烯基膦酸酯修饰的引导链，产生在5’端具有乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸结构的引导链(VpUq)。所有siRNA过客链都包含不同形式的缀合柄，C6-NH2和/或C6-SH，在链的每一端一个。一个或多个缀合柄通过反向无碱基磷酸二酯或硫代磷酸酯连接至siRNA过客链或siRNA引导链。图5A-5F是体内实验中使用的形式的代表性结构。图5A图示了在过客链或引导链的5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-SH的siRNA的代表性结构。图5B图示了5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-S-PEG的siRNA过客链或引导链的代表性结构。图5C图示了5’端具有C6-NH2缀合柄且3’端具有C6-S-NEM的siRNA过客链或引导链的代表性结构。图5D图示了5’端具有C6-N-SMCC缀合柄且3’端具有C6-S-NEM的siRNA过客链的代表性结构。图5E图示了5’端具有PEG且3’端具有C6-SH的siRNA过客链或引导链的代表性结构。图5F图示了5’端具有C6-S-NEM且3’端具有C6-NH2缀合柄的siRNA过客链或引导链的代表性结构。
实施例3.缀合物合成
图6A-图6F图示了本文所述的A-X1-B-X2-Y(式I)架构的示例性结构。图6A图示了抗体-Cys-SMCC-5’-过客链(架构-1)。该缀合物通过与过客链5’端的马来酰亚胺(SMCC)的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。图6B图示了抗体-Cys-SMCC-3’-过客链(架构-2)。该缀合物通过与过客链3’端的马来酰亚胺(SMCC)的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。图6C图示了抗体-Cys-bisMal-3’-过客链(ASC架构-3)。该缀合物通过与过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头的抗体链间半胱氨酸缀合而生成。图6D图示了Fab-Cys-bisMal-3’-过客链的模型结构(ASC架构-4)。该缀合物通过与过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头的Fab链间半胱氨酸缀合而生成。图6E图示了抗体siRNA缀合物的模型结构(ASC架构-5)，其中两个不同的siRNA与一个抗体分子连接。该缀合物通过将SSB siRNA和HPRT siRNA的混合物在每个siRNA过客链3’端的双马来酰亚胺(bisMal)接头处缀合至还原的mAb链间半胱氨酸而生成。图6F图示了抗体siRNA缀合物的模型结构(ASC架构-6)，其中连接有两个不同的siRNA。该缀合物通过将SSB siRNA和HPRT siRNA的混合物在每个siRNA过客链3’端的马来酰亚胺(SMCC)接头处缀合至还原的mAb链间半胱氨酸而生成。实施例3.1使用SMCC接头的抗体siRNA缀合物合成
图7A图示了通过抗体半胱氨酸缀合的抗体-Cys-SMCC-siRNA-PEG缀合物的示例性合成方案(合成方案-1)。
步骤1：使用TCEP进行的抗体链间二硫化物还原
用硼砂缓冲液(pH 8)对抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到10mg/ml。向该溶液中加入在水中的2当量TCEP，并在室温下旋转2小时。将所得反应混合物用含有5mM EDTA的pH 7.4PBS进行缓冲液交换，并在室温下将其添加至SMCC-C6-siRNA或SMCC-C6-siRNA-C6-NHCO-PEG-XkDa(2当量)(X＝0.5kDa至10kDa)在含有5mM EDTA的pH 7.4PBS中的溶液中，并旋转过夜。通过分析型SAX柱色谱法对反应混合物进行的分析显示了抗体siRNA缀合物以及未反应的抗体和siRNA。
步骤2：纯化
使用如实施例3.4所述的阴离子交换色谱方法-1，通过AKTA explorer FPLC来纯化粗反应混合物。分离含有DAR1和DAR>2抗体-siRNA-PEG缀合物的级分，浓缩，并用pH7.4PBS进行缓冲液交换。
步骤-3：经纯化的缀合物的分析
通过SEC、SAX色谱法和SDS-PAGE来表征经分离的缀合物。使用阴离子交换色谱方法-2或阴离子交换色谱方法-3，通过分析型HPLC评估缀合物的纯度。两种方法均描述于实施例3.4中。经分离的DAR1缀合物在分析型SAX方法中通常在9.0±0.3min处洗脱，并且纯度大于90％。典型的DAR>2半胱氨酸缀合物含有超过85％的DAR2和少于15％的DAR3。
实施例3.2.使用双马来酰亚胺(BisMal)接头的抗体siRNA缀合物合成
图7B图示了抗体-Cys-BisMal-siRNA-PEG缀合物的示例性合成方案(合成方案-2)。
步骤1：用TCEP还原抗体
用硼砂缓冲液(pH 8)对抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到5mg/ml。向该溶液中加入在水中的2当量TCEP，并在室温下旋转2小时。将所得反应混合物用含有5mM EDTA的pH 7.4PBS进行交换，并在室温下将其添加至BisMal-C6-siRNA-C6-S-NEM(2当量)在含有5mM EDTA的pH 7.4PBS中的溶液中，并在4℃下保持过夜。通过分析型SAX柱色谱法对反应混合物进行的分析显示了抗体siRNA缀合物以及未反应的抗体和siRNA。
步骤2：纯化
使用阴离子交换色谱方法-1，通过AKTA explorer FPLC纯化粗反应混合物。分离含有DAR1和DAR2抗体-siRNA缀合物的级分，浓缩，并用pH 7.4PBS进行缓冲液交换。
步骤-3：经纯化的缀合物的分析
通过质谱法或SDS-PAGE来表征经分离的缀合物。使用阴离子交换色谱方法-2或3以及大小排阻色谱方法-1，通过分析型HPLC评估缀合物的纯度。
实施例3.3.从mAb生成Fab’并与siRNA缀合
图7C图示了Fab-siRNA缀合物生成的示例性合成方案(合成方案-3)。
步骤1：用胃蛋白酶消化抗体
用pH 4.0的20mM乙酸钠/乙酸缓冲液对抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到5mg/ml。添加固定化的胃蛋白酶(Thermo Scientific,产品编号20343)，并在37℃下孵育3小时。使用30kDa MWCO Amicon旋转过滤器和pH 7.4PBS来过滤反应混合物。收集保留物，并使用大小排阻色谱法进行纯化以分离F(ab')2。然后用10当量的TCEP对收集的F(ab')2进行还原，并在室温下于pH 7.4PBS中与SMCC-C6-siRNA-PEG5缀合。通过SAX色谱法对反应混合物进行的分析显示了Fab-siRNA缀合物以及未反应的Fab和siRNA-PEG。
步骤2：纯化
使用阴离子交换色谱方法-1，通过AKTA explorer FPLC纯化粗反应混合物。分离含有DAR1和DAR2 Fab-siRNA缀合物的级分，浓缩，并用pH 7.4PBS进行缓冲液交换。
步骤-3：经纯化的缀合物的分析
使用阴离子交换色谱方法-2或3以及SEC方法-1，通过分析型HPLC评估经分离的缀合物的特征和纯度。
实施例3.4.纯化和分析方法
阴离子交换色谱方法(SAX)-1.
1.柱：Tosoh Bioscience,TSKGel SuperQ-5PW,21.5mm ID X 15cm,13um
2.溶剂A：20mM TRIS缓冲液，pH 8.0；溶剂B：20mM TRIS，1.5M NaCl，pH 8.0；流速：6.0ml/min
3.梯度：
阴离子交换色谱(SAX)方法-2
1.柱：Thermo Scientific,ProPacTM SAX-10,Bio LCTM,4X250mm
2.溶剂A：80％10mM TRIS pH 8，20％乙醇；溶剂B：80％10mM TRIS pH 8，20％乙醇，1.5M NaCl；流速：0.75ml/min
3.梯度：
阴离子交换色谱(SAX)方法-3
1.柱：Thermo Scientific,ProPacTM SAX-10,Bio LCTM,4X250mm
2.溶剂A：80％10mM TRIS pH 8，20％乙醇；溶剂B：80％10mM TRIS pH 8,20％乙醇，1.5M NaCl
3.流速：0.75ml/min
4.梯度：
大小排阻色谱(SEC)方法-1
1.柱：TOSOH Biosciences,TSKgelG3000SW XL,7.8X300mm,5μM
2.流动相：150mM磷酸盐缓冲液
3.流速：1.0ml/min，持续15min
实施例3.5.使用双马来酰亚胺(BisMal)接头的抗体siRNA缀合物合成
用TCEP还原抗体
用含有1mM DTPA的25mM硼酸盐缓冲液(pH 8)对抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到10mg/ml。向该溶液中加入在相同硼酸盐缓冲液中的4当量TCEP，并在37℃下孵育2小时。在室温下，将所得反应混合物与BisMal-siRNA(1.25当量)在pH 6.0的10mM乙酸盐缓冲液中的溶液合并，并在4℃下保持过夜。通过分析型SAX柱色谱法对反应混合物进行的分析显示了抗体siRNA缀合物以及未反应的抗体和siRNA。将反应混合物用10EQ的N-乙基马来酰亚胺(在DMSO中为10mg/mL)处理，以对任何剩余的游离半胱氨酸残基进行加帽。
步骤2：纯化
使用阴离子交换色谱(SAX)方法-1，通过AKTA Pure FPLC纯化粗反应混合物。分离含有DAR1和DAR2抗体-siRNA缀合物的级分，浓缩，并用pH 7.4PBS进行缓冲液交换。
阴离子交换色谱方法(SAX)-1.
柱：Tosoh Bioscience,TSKGel SuperQ-5PW,21.5mm ID X 15cm,13um
溶剂A：20mM TRIS缓冲液，pH 8.0；溶剂B：20mM TRIS，1.5M NaCl，pH 8.0；流速：6.0ml/min
梯度：
阴离子交换色谱(SAX)方法-2
柱：Thermo Scientific,ProPacTM SAX-10,Bio LCTM,4X250mm
溶剂A：80％10mM TRIS pH 8，20％乙醇；溶剂B：80％10mM TRIS pH 8，20％乙醇，1.5M NaCl；流速：0.75ml/min
梯度：
实施例4.靶向DUX4的AOC在FSHD小鼠模型ACTA1-MCM:FLExDUX4中的体内活性
将DUX4 siRNA(DUX4.61 non-VP、DUX4.61 vpUq和DUX4.1613 vpUq)与鼠转铁蛋白受体(Tfrc)抗体缀合，以生成小鼠特异性DUX4 AOC。将DUX4 AOC静脉内施用于表达人DUX4基因的FSHD疾病的ACTA1-MCM:FLExDUX4小鼠模型：与B6(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm1.1(DUX4*)Plj/J(库存号028710)杂交的库存Tg(ACTA1-cre/Esr1*)2Kesr/J(库存号025750)(JonesT,Jones PL.A cre-inducible DUX4 transgenic mouse model for investigatingfacioscapulohumeral muscular dystrophy.PLoS One.2018年2月7日；13(2):e0192657)。第0天的小鼠年龄：8-11周(N＝8或10只混合的雄性和雌性)。在单次IV剂量的DUX4 AOC后3周收集骨骼肌。
通过RT-qPCR分析基因表达。使用匀浆器FastPrep-24(MPBio)将肌肉组织在裂解基质D(Lysing Matrix D)中的Trizol中匀浆，并在4℃下以6,000RPM旋转5min。使用Zymo-SpinTMI-96试剂盒，根据制造商的说明分离RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)使用SimpliAmp热循环仪(Applied Biosystems)合成cDNA。使用QuantStudio6或7Flex实时PCR仪器(Applied Biosystems)，使用TaqMan Fast Universal Master MixII(Thermo Fisher)和TaqMan探针(Thermo Fisher)通过qPCR分析cDNA，一式两份。通过QuantStudioTM实时PCR软件v1.3(Applied Biosystems)分析数据。评估了4种DUX4-靶基因的表达水平：WFDC3、ILVBL、SLC15A2、SORD(Jones TI,Chew GL,Barraza-Flores P,Schreier S,Ramirez M,Wuebbles RD,Burkin DJ,Bradley RK,Jones PL.Transgenicmice expressing tunable levels of DUX4 develop characteristicfacioscapulohumeral muscular dystrophy-like pathophysiology ranging inseverity.Skelet Muscle.2020年4月11日；10(1):8)。将DUX4-靶基因表达针对PPIB参考基因归一化。通过使用2-ΔΔC方法确定相对于PBS媒介物处理动物的靶mRNA下调水平。
一般引物和TaqMan探针设计以及茎-环RT-qPCR(SL-RT-qPCR)测定方法先前已有描述(Chen,2005,Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33,e179)。设计了特定的SL-RT-qPCR测定来量化DUX4 siRNA的引导链。将组织匀浆稀释到含有0.1％ Triton X-100的TE缓冲液中，然后通过SL-RT-qPCR进行分析。通过将不同浓度的siRNA掺入适当的基质中来生成标准曲线以与样品进行比较。在Prism中进行siRNA标准曲线的线性回归，并使用斜率和y截距值来内推组织和血浆样品浓度。
DUX4靶基因的复合值(composite)是4种DUX4靶小鼠基因(WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD)的几何平均值，并且数据表示为媒介物(PBS)处理动物的平均值-/+SEM％，N＝8或10只混合的雄性和雌性。
图4A和图4B示出靶向DUX4的AOC在FSHD小鼠模型ACTA1-MCM；FLExDUX4中的体内活性。图4A显示，在单次AOC剂量后3周，DUX4 AOC展示出复合的鼠DUX4靶基因(WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD)在胫骨前肌、腓肠肌和四头肌骨骼肌中的剂量依赖性下调。此外，图4B示出单次静脉内剂量的DUX4 AOC后3周，肌肉组织中的DUX4 siRNA浓度的剂量依赖性增加。
总体而言，这些数据证明了DUX4 AOC在体内具有强大且持久的活性，从而证明了它们治疗FSHD疾病的潜力。
实施例5.用靶向DUX4的AOC治疗后FSHD小鼠模型的功能改善
实施例5证明了在骨骼肌中表达人DUX4的小鼠中，在用靶向DUX4的AOC治疗后DUX4siRNA在抑制FSHD疾病表型方面的功效。ACTA1-MCM；FLExDUX4小鼠在6-9周龄时接受治疗。每组10只小鼠用单次IP注射他莫昔芬(Tamoxifen)(TMX)5mg/kg一次或两次来处理，以诱导FSHD表型。在TMX给药后两天内，通过IV注射测试DUX4 AOC和对照AOC制品或媒介物对小鼠给药。给药后立即针对以下方面对小鼠进行观察，之后每周观察三次：疼痛、运动受损、回避、水合作用的迹象。每周测量三次体重。每周进行三次神经评分。
进行以下功能测量来评估肌肉表型：
1.AOC治疗后13天进行体内肌肉力测量(等距力-频率曲线(Isometric force-frequency curve)和破伤风松弛时间(relaxation time from tetanus))，
2.AOC治疗后第7、10和14天进行跑步机锻炼，
3.AOC治疗后15天将对所有小鼠进行EMG。
功能终点测量完成后一天或两天，将小鼠处死并收集以下组织尸检以用于进一步评估：
a.腓肠肌
i.将左腿肌肉快速冷冻并储存在-80℃。
ii.将右腿肌肉在室温下在10％ NBF中固定。
b.胫骨前肌
i.将左腿肌肉快速冷冻并储存在-80℃。
ii.将右腿肌肉在室温下在10％ NBF中固定。
c.四头肌
i.将左腿肌肉快速冷冻并储存在-80℃。
ii.将右腿肌肉在室温下在10％ NBF中固定。
d.切成两半的膈膜
i.将左半部快速冷冻并储存在-80℃。
ii.将右半部在室温下在10％ NBF中固定。
针对组织中的DUX4依赖性基因表达和DUX4 siRNA浓度，分析冷冻组织样品。
修剪甲醛固定的组织以进行包埋。从每个组织上切下两个切片。
a.一个切片用天狼星红(Sirius Red)染色。在天狼星红染色的切片上，通过半自动图像分析测量纤维化的程度。
b.对另一个切片进行网硬蛋白染色。在网硬蛋白染色的切片上，通过自动图像分析测量肌肉纤维尺寸和％中央核。
尽管已经在本文中示出并描述了本公开的优选方面，但是对于本领域技术人员明显的是，这些方面仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，在本公开的实践中可以采用本文所述的本公开的方面的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (37)

1.一种多核酸分子缀合物，其包含：
缀合至与DUX4的靶序列杂交的多核酸分子的抗体或其抗原结合片段；
其中所述多核酸分子包含与选自SEQ ID NO:72、76、126或131-136的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，其中所述多核酸分子在2、6、14和16位包含2’-F修饰的核苷酸，并且
其中所述多核酸分子缀合物介导针对所述DUX4的RNA干扰。
2.如权利要求1所述的多核酸分子缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括非人抗体或其抗原结合片段、人抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体或其抗原结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或骆驼科抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求1或2所述的多核酸分子缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是抗转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子的长度为约16至约30个核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和反义链，并且所述反义链包含UfsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu、usNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsusu或vpNsNfsnnnNfnnnnnnnNfnNfnnnsus中的至少一个的核酸序列，其中vpN＝乙烯基膦酸酯VpUq，小写字母(n)＝2’-O-Me修饰的，Nf＝2’-F修饰的，并且s＝硫代磷酸酯骨架修饰。
6.如权利要求1-4中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和反义链，并且所述反义链包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和反义链，并且所述有义链包含与选自SEQ ID NO:2、6、56或61-66的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，其中所述有义链包含至少2个或至少3个连续的2’-F修饰的核苷酸。
8.如权利要求1-6中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含有义链和反义链，并且所述有义链包含与选自SEQ ID NO:2、6、56或61-66的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。
10.如权利要求1-9中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含六个或更多个选自2’-O-甲基和2’-脱氧-2’-氟的2’修饰的核苷酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子包含5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述5’-末端乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸选自：
其中B是杂环碱基部分；
R6选自氢、卤素、烷基或烷氧基；并且
J是与所述多核酸分子的相邻核苷酸连接的核苷酸间连接基团。
13.如权利要求10-12中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述有义链和/或反义链在5’端或3’端包含至少两个、至少三个或至少四个连续的所述2’-O-甲基修饰的核苷酸。
14.如权利要求1-13中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子缀合物包含通过所述抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基或赖氨酸残基将所述抗体或其抗原结合片段连接至所述多核酸分子的接头。
15.如权利要求14所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是C1-C6烷基接头。
16.如权利要求14所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是同双官能接头或异双官能接头，并且包含马来酰亚胺基团、二肽部分、苯甲酸基团或其衍生物。
17.如权利要求14所述的多核酸分子缀合物，其中所述接头是可切割或不可切割的接头。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子与所述抗体或其抗原结合片段之间的比率为约1:1、2:1、3:1或4:1。
19.如权利要求1-18中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中所述多核酸分子介导针对人DUX4的RNA干扰并调节对象的肌萎缩。
20.如权利要求19所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括与未处理细胞中DUX4基因的mRNA转录物的量相比，使DUX4基因的mRNA转录物的表达降低至少50％、至少60％或至少70％或更多。
21.如权利要求19或20所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L和LEUTX。
22.如权利要求19或20所述的多核酸分子缀合物，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在细胞中的表达，所述标志物基因选自WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
23.如权利要求22所述的多核酸分子缀合物，其中所述影响所述标志物基因的表达是使所述标志物基因的表达降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更多。
24.如权利要求19-23中任一项所述的多核酸分子缀合物，其中肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
25.一种药物组合物，其包含：
如权利要求1-24所述的多核酸分子缀合物；以及
药学上可接受的赋形剂。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成纳米颗粒制剂。
27.如权利要求24或26所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊、直肠、透皮、静脉内、皮下或鞘内施用。
28.一种用于治疗有需要的对象的肌营养不良的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-24中任一项所述的多核酸缀合物；以及
向所述有需要的对象施用所述多核酸缀合物以治疗所述肌营养不良，其中所述多核酸缀合物减少人DUX4的mRNA转录物的量。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述多核酸缀合物介导针对人DUX4的RNA干扰并且调节所述对象的肌营养不良。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述RNA干扰包括影响标志物基因在受肌营养不良影响的细胞中的表达，所述标志物基因选自MBD3L2、TRIM43、PRAMEF1、ZSCAN4、KHDC1L、LEUTX、WFDC3、ILVBL、SLC15A2和SORD。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良是面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
32.如权利要求1-24中任一项所述的多核酸分子缀合物或如权利要求25-27中任一项所述的药物组合物用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的用途。
33.如权利要求1-24中任一项所述的多核酸分子缀合物或如权利要求25-27中任一项所述的药物组合物用于制造用于治疗被诊断患有或疑似患有面肩肱型肌营养不良(FSHD)的对象的药物的用途。
34.一种试剂盒，其包含如权利要求1-24所述的多核酸分子缀合物或如权利要求25-27中任一项所述的药物组合物。
35.一种介导针对DUX4的RNA干扰的多核酸分子，其中所述多核酸分子包含与选自SEQID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
36.一种介导针对DUX4的RNA干扰的双链多核酸分子，其中所述双链多核酸分子包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列，并且有义链包含与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的核酸序列。
37.一种介导针对DUX4的RNA干扰的双链多核酸分子，其中所述双链多核酸分子包含有义链和反义链，其中所述反义链包含含有与选自SEQ ID NO:412-420或430-438的序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的核酸序列，并且有义链包含含有与选自SEQ ID NO:142、146、196或201-206的序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
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