JP7506601B2 - 筋萎縮症と筋緊張性ジストロフィーを処置するための組成物および方法 - Google Patents

筋萎縮症と筋緊張性ジストロフィーを処置するための組成物および方法 Download PDF

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ラマナ ドパラプディ，ヴェンカタ
サイ－ホ チュウ，デイヴィッド
カラミアン コクラン，マイケル
フード，マイケル
ダイアナ ダリモント，ベアトリス
バーク，ロブ
シ，ユンユ
エルドガン マレリウス，グリン
マレコヴァ，バーボラ
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Description

相互参照
本出願は、２０１７年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５９５，５４５号と、２０１８年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７２５，８８３号の利益を主張するものであり、これらは各々、その全体において引用により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１８年１２月６日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４５５３２－７２２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、３，１４３，３８２バイトのサイズである。
ＲＮＡ誘導された遺伝子サイレンシングによる遺伝子抑制は複数のレベルの制御：転写不活性化、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘導ｍＲＮＡ低下、およびｓｉＲＮＡ誘導転写減衰を提供する。いくつかの例では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、複数の細胞分裂にわたって長い永続的な効果を与える。したがって、ＲＮＡｉは、薬物標的の検証、遺伝子機能分析、経路分析、および疾患治療に役立つ実行可能な方法を表す。
ある実施形態では、筋萎縮症（あるいはアトロジーン（ａｔｒｏｇｅｎｅ））に関連する遺伝子を調節するためのポリ核酸分子および医薬組成物が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるポリ核酸分子あるいはポリ核酸分子抱合体で筋萎縮症を処置する方法も本明細書に記載される。
特定の実施形態において、式（Ｉ）：（Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃ（式Ｉ）の分子が本明細書で開示され、式中、Ａは結合部分であり；Ｂはアトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり；Ｃはポリマーであり；および、Ｘ１とＸ２はそれぞれ、単結合あるいは非ポリマーリンカーから独立して選択され；ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み；および、ＡとＣは同じ末端でＢに結合しない。いくつかの実施形態において、アトロジーンは、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ経路、グルココルチコイド－ＧＲ経路、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ経路、ＴＮＦα－ＮＦκＢ経路、あるいはミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３経路内の示差的に調節された（例えば、アップレギュレートされたあるいはダウンレギュレートされた）遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、アトロジーンはＥ３リガーゼをコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンはフォークヘッドボックス転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンはアトロジン－１（ａｔｒｏｇｉｎ－１）遺伝子（ＦＢＸＯ３２）、ＭｕＲＦ１遺伝子（ＴＲＩＭ６３）、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、あるいはＭＳＴＮを含む。いくつかの実施形態では、アトロジーンはＤＭＰＫを含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、Ｃはポリマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズする一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、第１のポリヌクレオチドあるいは第２のポリヌクレオチドのいずれかは、さらにアトロジーンの標的配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列の少なくとも８つの隣接する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１、３７０－４８０、および７０３－３４０６に記載の配列に、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは９９％相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２は独立してＣ１－Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、Ａは、ヒト化抗体または結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、Ａは抗トランスフェリン受容体抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、Ａ－Ｘ１はＢの５’末端へ結合し、Ｘ２－ＣはＢの３’末端へ結合する。いくつかの実施形態において、Ｘ２－ＣはＢの５’末端へ結合し、Ａ－Ｘ１はＢの３’末端へ結合する。いくつかの実施形態において、ＡはＸ１に直接結合する。いくつかの実施形態において、ＣはＸ２に直接結合する。いくつかの実施形態において、ＢはＸ１とＸ２に直接結合する。いくつかの実施形態では、分子はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに結合する。いくつかの実施形態において、Ｄはエンドソーム溶解性ポリマーである。
ある実施形態では、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに結合した結合部分を含むポリ核酸分子抱合体が本明細書で開示され；ここで、ポリヌクレオチドは随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、ポリ核酸分子抱合体は、アトロジーンに対するＲＮＡ干渉を媒介し、それによって、被験体の筋萎縮症を処置する。いくつかの実施形態において、アトロジーンは、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ経路、グルココルチコイド－ＧＲ経路、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ経路、ＴＮＦα－ＮＦκＢ経路、あるいはミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３経路内の示差的に調節された（例えば、アップレギュレートされたあるいはダウンレギュレートされた）遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、アトロジーンはＥ３リガーゼをコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンはフォークヘッドボックス転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンは、タンパク質のＴＧＦβ（形質転換増殖因子β）スーパーファミリーのリガンドを含む。いくつかの実施形態では、アトロジーンはＤＭＰＫを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、結合部分は、ヒト化抗体または結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、結合部分は抗トランスフェリン受容体抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、結合部分はコレステロールである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズする一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、第１のポリヌクレオチドあるいは第２のポリヌクレオチドのいずれかは、さらにアトロジーンの標的配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列の少なくとも８つの隣接する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１、３７０－４８０、および７０３－３４０６に記載の配列に、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは９９％相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、ポリヌクレオチドに結合部分を接続するリンカーを随意に含む。いくつかの実施形態において、さらなるポリ核酸分子抱合体は、追加のリンカーによってポリヌクレオチドに随意に間接的に結合したポリマーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーおよび追加のリンカーがそれぞれ独立して、単結合あるいは非ポリマーリンカー。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の分子を含み、（Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃ（式Ｉ）式中、Ａは結合部分であり；Ｂはアトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり；Ｃはポリマーであり；および、Ｘ１とＸ２はそれぞれ、単結合あるいは非ポリマーリンカーから独立して選択され；ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み；および、ＡとＣは同じ末端でＢに結合しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は糖尿病に関連する筋萎縮症である。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は癌性悪液質に関連する筋萎縮症である。いくつかの実施形態において、筋萎縮症はインスリン欠乏症に関連する。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は慢性腎不全に関連する。いくつかの実施形態において、筋萎縮症はうっ血性心不全に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は慢性呼吸病に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は慢性感染症に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は絶食に関連付けられる。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は除神経に関連付けられる。いくつかの実施形態において、筋萎縮症はサルコペニア、グルココルチコイド処置、脳卒中、および／または心臓発作に関連する。場合によっては、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧ反復の拡張に関連する。
ある実施形態において、医薬組成物が本明細書で開示され、上記医薬組成物は、上記の分子あるいは上記のポリ核酸分子抱合体；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤化される。
ある実施形態において、被験体の筋萎縮症あるいは筋緊張性ジストロフィーを処置する方法が本明細書で開示され、上記方法は、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに結合した結合部分を含む、治療上有効な量のポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含み；ここで、ポリヌクレオチドは随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、ポリ核酸分子抱合体は、アトロジーンに対するＲＮＡ干渉を媒介し、それによって、被験体の筋萎縮症あるいは筋緊張性ジストロフィーを処置する。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は糖尿病に関連する筋萎縮症である。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は癌性悪液質に関連する筋萎縮症である。いくつかの実施形態において、筋萎縮症はインスリン欠乏症に関連する。いくつかの実施形態において、筋萎縮症は慢性腎不全に関連する。いくつかの実施形態において、筋萎縮症はうっ血性心不全に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は慢性呼吸病に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は慢性感染症に関連する。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は絶食に関連付けられる。いくつかの実施形態では、筋萎縮症は除神経に関連付けられる。いくつかの実施形態では、筋萎縮症はサルコペニアに関連付けられる。いくつかの実施形態では、筋緊張性ジストロフィーはＤＭ１である。いくつかの実施形態において、アトロジーンは、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ経路、グルココルチコイド－ＧＲ経路、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ経路、ＴＮＦα－ＮＦκＢ経路、あるいはミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３経路内で異なるように調節された（例えば、アップレギュレートされたあるいはダウンレギュレートされた）遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、アトロジーンはＥ３リガーゼをコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンはフォークヘッドボックス転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、アトロジーンはアトロジン－１遺伝子（ＦＢＸＯ３２）、ＭｕＲＦ１遺伝子（ＴＲＩＭ６３）、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、あるいはＭＳＴＮを含む。いくつかの実施形態では、アトロジーンはＤＭＰＫを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃ（式Ｉ）の分子を含み、式中、Ａは結合部分であり；Ｂはアトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり；Ｃはポリマーであり；および、Ｘ１とＸ２はそれぞれ、単結合あるいは非ポリマーリンカーから独立して選択され；ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み；および、ＡとＣは同じ末端でＢに結合しない。いくつかの実施形態において、Ｂは、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、Ｃはポリマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）あるいはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはホスホロジチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆脱塩基部分は少なくとも１つの末端にある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列にハイブリダイズする一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含み、ここで、第１のポリヌクレオチドあるいは第２のポリヌクレオチドのいずれかは、さらにアトロジーンの標的配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アトロジーンの標的配列の少なくとも８つの隣接する塩基にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１、３７０－４８０、および７０３－３４０６に記載の配列に、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは９９％相補的である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および、３４０７－１４２２２で記載される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２は独立してＣ１－Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、Ａは、ヒト化抗体または結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、Ａは抗トランスフェリン受容体抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、Ａ－Ｘ１はＢの５’末端へ結合し、Ｘ２－ＣはＢの３’末端へ結合する。いくつかの実施形態において、Ｘ２－ＣはＢの５’末端へ結合し、Ａ－Ｘ１はＢの３’末端へ結合する。いくつかの実施形態において、ＡはＸ１に直接結合する。いくつかの実施形態において、ＣはＸ２に直接結合する。いくつかの実施形態において、ＢはＸ１とＸ２に直接結合する。いくつかの実施形態では、方法はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに結合する。いくつかの実施形態において、Ｄはエンドソーム溶解性ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
特定の実施形態において、上記の分子、あるいは上記のポリ核酸分子抱合体を含むキットが本明細書で開示される。
本開示の様々な態様が、添付の請求項において具体的に明記されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が利用されている例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と以下の添付の図面とを参照することにより得られる。本特許出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を包含している。カラーの図面を有するこの特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払い後に当該事務局によって提供される。
コレステロール－ミオスタチンｓｉＲＮＡ抱合体の例示的な構造を例証する。 ＴｆＲ ｍＡｂ－（Ｃｙｓ）－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５ｋ、ＤＡＲ１のＳＡＸ ＨＰＬＣクロマトグラムを例証する。 ＴｆＲ ｍＡｂ－（Ｃｙｓ）－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５ｋ、ＤＡＲ１のＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムを例証する。 ＴｆＲ１ｍＡｂ－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ抱合体のＤＡＲ１とＤＡＲ２のＳＡＸ ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを例証する。 ＴｆＲ１ｍＡｂ－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ抱合体のＤＡＲ１とＤＡＲ２のＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを例証する。 ＣＤ７１ Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５のＳＥＣクロマトグラムを例証する。 ＣＤ７１ Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５のＳＡＸクロマトグラムを例証する。 Ｃ２Ｃ１２の筋芽細胞と筋管におけるＭｕｒｆ１およびアトロジン－１の相対的な発現レベルを例証しており、Ｃ２Ｃ１２の筋芽細胞と筋管は、実施例４に記載されるように生成された。ｍＲＮＡレベルは実施例４に記載されるように決定された。 骨格筋においてミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介する能力について、例示的な抱合体の能力を評価するためのインビボの試験デザインを例証する。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウンを示す。 骨格筋においてミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介する能力について、例示的な抱合体の能力を評価するためのインビボの試験デザインを例証する。 式（Ｉ）の例示的な分子の投与後１００８ｈまでの組織中濃度－時間プロフィールを示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウンを示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウン後の血漿ＭＳＴＮタンパク質減少を示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウン後の筋肉の大きさの変化を示す。 図１０ＥのＷｅｌｃｈの両側非対合ｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 支持された投与量での式（Ｉ）の例示的な分子の単回静脈内投与後にマウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のｓｉＲＮＡの組織蓄積を示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウンを示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 様々な筋組織におけるｓｉＲＮＡの蓄積を示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）と心筋中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウンを示す。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のＭＳＴＮガイド鎖のＲＩＳＣローティングを示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）、四頭筋、三頭筋、および心臓中のマウスＭＳＴＮのｓｉＲＮＡ媒介性のｍＲＮＡノックダウンを示す。 血漿ミオスタチンレベルを例証する。 様々な組織型：腓腹筋、三頭筋、四頭筋、および心臓組織中のｓｉＲＮＡ蓄積を例証する。 マウス腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）中のＭＳＴＮガイド鎖のＲＩＳＣローティングを示す。 筋肉領域の変化を示す。 図１３ＦのＷｅｌｃｈの両側非対合ｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 本明細書に記載される例示的な抱合体による腓腹筋のＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現を示す。 本明細書に記載される例示的な抱合体による腓腹筋のＳＳＢ ｍＲＮＡ発現を示す。 本明細書に記載される例示的な抱合体による心臓組織のＨＰＲＴ ｍＲＮＡ発現を示す。 本明細書に記載される例示的な抱合体による心臓組織のＳＳＢ ｍＲＮＡ発現を示す。 腓腹筋におけるｓｉＲＮＡの蓄積を示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）筋肉におけるアトロジン－１のダウンレギュレーションを示す。 心臓組織におけるアトロジン－１のダウンレギュレーションを示す。 例示的なインビボの試験デザインを例証する。 腓腹筋におけるＭｕＲＦ－１のダウンレギュレーションを示す。 心臓組織におけるＭｕＲＦ－１のダウンレギュレーションを示す。 マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞へインビトロでトランスフェクトされたｓｉＲＮＡｓを例証する。評価された４つのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓはすべて、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンを示したが、陰性対照ｓｉＲＮＡはＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンを示さなかった。点線は非線形回帰によってフィットされた３つのパラメータ曲線である。 Ａ－Ｆは、ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡ－抗体抱合体の単回静脈内投与７日後のＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンについて強固な用量反応を実証するインビボの結果を示す。Ａ：腓腹筋；Ｂ：前脛骨筋；Ｃ：四頭筋；Ｄ：横隔膜；Ｅ：心臓；および、Ｆ：肝臓。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 本明細書に記載される例示的な抗体核酸抱合体を示す。 図１９Ａ－図１９Ｅにおいて利用された抗体の劇画表示を提示する。 実施例２０で利用される例示的な２１量体の二重鎖を例証する。Ａは、５’末端にＣ６－ＮＨ２抱合ハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭを有するｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造を示す。 実施例２０で利用される例示的な２１量体の二重鎖を例証する。Ｂは、相補性の１９の塩基と３’ジヌクレオチドオーバーハングを有する２１量体の二重鎖の代表的な構造を示す。 実施例２０で利用される第２の例示的な２１量体の二重鎖を例証する。Ａは、５’抱合ハンドルを有するｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造を示す。 実施例２０で利用される第２の例示的な２１量体の二重鎖を例証する。Ｂは、相補性の１９の塩基と１つの３’ジヌクレオチドオーバーハングを有する平滑末端二重鎖の代表的な構造を示す。 例示的なインビボの試験デザインを示す。 ３ｍｇ／ｋｇの単回投与の投与量でＩＶ送達後にＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体によって媒介される腓腹筋中のアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの時間的経過を例証する。 ３ｍｇ／ｋｇの単回投与の投与量でＩＶ送達後にＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体によって媒介される心筋中のアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの時間的経過を例証する。 例示的なインビボの試験デザインを示す。 指定された投与量でＩＶ送達後にＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体によって媒介される腓腹筋中の９６時間でのＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションを示す。 指定された投与量でＩＶ送達後にＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体によって媒介される心筋中の９６時間でのＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションを示す。 デキサメタゾン誘導性の筋萎縮症の存在下と不在下において、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体（３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡでのＩＶ送達）によって媒介される腓腹筋中のＭｕＲＦ１とアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの時間的経過を示す。 デキサメタゾン誘導性の筋萎縮症の存在下と不在下において、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体（３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡのＩＶ送達）によって媒介される心筋中のＭｕＲＦ１とアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの時間的経過を示す。 筋萎縮症の存在下と不在下で、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体（３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡのＩＶ送達）によって媒介される胃の重量の変化の時間的経過を示す。 筋萎縮症の存在下と不在下で、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体（３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡのＩＶ送達）によって媒介される腓腹筋と心筋中のｓｉＲＮＡ組織濃度の時間的経過を示す。 例示的なインビボの試験デザインを示す。 組織中のｓｉＲＮＡの測定された濃度に対する、デキサメタゾン誘導性の筋萎縮症（７日目に開始）の存在下と不在下における、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の１０日後の、腓腹筋中のアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションを示す。 デキサメタゾン誘導性の筋萎縮症の不在下（群１０＆１３、および群１１＆１４）と存在下（群１２＆１５）において、スクランブルされた対照群に対する腓腹筋中の相対的なアトロジン－１ ｍＲＮＡレベルを示す。 デキサメタゾン誘導性の筋萎縮症の不在下）と存在下において、ＴｆＲ１－ｍＡｂ抱合体送達後に、マウスの腓腹筋中のアトロジン－１ガイド鎖の相対的なＲＩＳＣローティングを示す。 ＰＢＳ対照に対する、デキサメタゾン誘導性の筋委縮症（７日目に開始）の不在下（実線）と存在下（点線）において、ＴｆＲ１抗体ｓｉＲＮＡ抱合体送達後に腓腹筋中のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションの時間的経過を示す。 デキサメタゾン誘導性の筋委縮症の存在下と不在下において、ＴｆＲ１－ｍＡｂ抱合体送達後の腓腹筋中の脚筋の成長速度を示す。 例示的なインビボの試験デザインを示す。 ４．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）のアトロジン－１ ｓｉＲＮＡあるいはＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡのいずれか、または、組み合わせた両方のｓｉＲＮＡの１回投与量の単回処置が、腓腹筋中の各標的の最大７５％のダウンレギュレーションをもたらしたことを示す。 腓腹筋中の両方の標的のｍＲＮＡノックダウンがＡＳＣ投与後３７日目まで未処置の脚において７５％で維持されることを示す。 筋肉領域の変化を示す。 腓腹筋重量の変化を示す。 脚の筋肉領域に関して筋消耗の処置によって誘導された温存率を示す。統計分析はＷｅｌｃｈのＴ検定を使用して、ｓｉＲＮＡ対照群を、スクランブルされた処置群と比較した。 腓腹筋重量に関して筋消耗の処置によって誘導された温存率を示す。
筋萎縮症は、筋肉量の喪失あるいは筋肉、例えば、運動、心筋、および平滑筋を制御する骨格または随意筋の進行性の低下と変性である。廃用、癌、糖尿病、および腎不全を含む様々な病態生理学的な疾病、あるいは、グルココルチコイドを用いる処置は、筋萎縮症および強度の喪失を引き起こす。筋萎縮症の表現効果は、筋タンパク質合成の阻害、筋タンパク質の増強されたターンオーバー、衛星細胞分化の異常なレギュレーション、および筋線維型の異常な転換を含む様々な分子事象によって引き起こされる。
広範な研究によって、筋萎縮症が特定のシグナル伝達経路と転写プログラムにより制御された活動的なプロセスであることが特定されている。このプロセスに関与する例示的な経路は、限定されないが、ＩＧＦ１－Ａｋｔ－ＦｏｘＯ、グルココルチコイド－ＧＲ、ＰＧＣ１α－ＦｏｘＯ、ＴＮＦα－ＮＦκＢ、およびミオスタチン－ＡｃｔＲＩＩｂ－Ｓｍａｄ２／３を含む。
いくつかの例では、筋萎縮症を調節するメカニズムの治療操作は、ＩＧＦ１－Ａｋｔ、ＴＮＦα－ＮｆκＢ、およびミオスタチンに焦点を当ててきた。ＩＧＦ１アナログは筋萎縮症を処置する際に効果的であることが示されたが、腫瘍形成と肥大を促す際のＩＧＦ１－Ａｋｔ経路の関与は、これらの治療を妨げかねない。同様のリスクは、Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路のレギュレーションのためのβ－アドレナリンアゴニストの使用に関与する。溶解可能なＡｃｔＲＩＩＢあるいはリガンドブロックＡｃｔＲＩＩｂ抗体を使用することによってミオスタチンの阻害は、骨格筋の喪失を防ぎ回復に向かわせ、および、腫瘍を有する動物の生存期間を延ばした。しかしながら、支配的な陰性ＡｃｔＲＩＩｂの発現もＳｍａｄ２／３のノックダウンも除神経後に筋力の喪失を防がなかったので、ミオスタチン遮断の抗萎縮性効果のメカニズムは不確かなままである（Ｓａｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｄ２ ａｎｄ ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｈｏｏｄ”、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６： Ｃ１２４８－Ｃ１２５７、２００９）。
筋萎縮症（糖尿病、癌性悪液質、慢性腎不全、断食、および除神経を含む）の様々なモデルにおける遺伝子発現を比較することで、一般的に萎縮している筋肉中でアップレギュレートまたはダウンレギュレートする、アトロジーンと呼ばれる（Ｓａｃｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｕｓｅ ａｎｄ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎｖｏｌｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｗａｓｔｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ”、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２１（１）： １４０－１５５、２００７）萎縮に関連する遺伝子を特定した。萎縮状態で強くアップレギュレートされる遺伝子のうち、筋肉に特異的なユビキチンタンパク質（Ｅ３）リガーゼ（例えば、アトロジン－１、ＭｕＲＦ１）、フォークヘッドボックス転写因子、およびストレス応答を媒介するタンパク質である。場合によっては、これらのエフェクタータンパク質の多くは、従来の薬物を使用して調節するのが難しい。
核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は高い選択率と特異性を誇る標的療法である。しかしながら、いくつかの例では、核酸治療も、脆弱な細胞内取り込み、限定的な血液安定性、および非特異的な免疫刺激によって妨害される。こうした諸問題に対応するために、核酸組成物の様々な修飾、例えば、より優れた安定化および／またはより低い毒性のための新規なリンカー、増加した標的特異性および／または標的送達用の結合部分の最適化、ならびに、安定性の増加および／または的外れの効果の減少のための核酸ポリマー修飾などが探求されている。
いくつかの実施形態において、核酸組成物を構成する様々な成分の構成または順序はさらに、細胞内取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激をもたらす。例えば、核酸成分が結合部分、ポリマー、およびポリ核酸分子（あるいは、ポリヌクレオチド）を含む場合、結合部分、ポリマー、および／または、ポリ核酸分子（あるいは、ポリヌクレオチド）の順序または構成）（例えば、結合部分ポリ核酸分子ポリマー、結合部分ポリマーポリ核酸分子、あるいはポリマー結合部分ポリ核酸分子）はさらに、細胞内取り込み、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激をもたらす。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるものは、筋萎縮症または筋緊張性ジストロフィーの処置のためのポリ核酸分子およびポリ核酸分子抱合体を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体は、細胞内の取り込み、安定性、および／または有効性を増強する。いくつかの例では、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の分子：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃを含む場合によっては、ポリ核酸分子は、１つ以上のアトロジーンの標的配列にハイブリダイズする。
本明細書に記載されるさらなる実施形態は、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいはポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む、筋萎縮症あるいは筋緊張性ジストロフィーを処置する方法を含む。
アトロジーン（Ａｔｒｏｇｅｎｅｓ）
アトロジーンあるいは萎縮に関連する遺伝子は、委縮する筋肉でアップレギュレートあるいはダウンレギュレートされる遺伝子である。いくつかの例では、アップレギュレートされたアトロジーンは、ユビキチンリガーゼ、フォークヘッドボックス転写因子、成長因子、脱ユビキチン化酵素、あるいはグルココルチコイドにより誘導された萎縮に関与するタンパク質コードする遺伝子を含む。
ユビキチンリガーゼ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする。例示的なＥ３ユビキチンリガーゼは、限定されないが、アトロジン－１（ａｔｒｏｇｉｎ－１）／ＭＡＦｂｘ、ｍｕｓｃｌｅ ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ１（ＭｕＲＦ１）、ＴＮＦ受容体アダプタータンパク質６（ＴＲＡＦ６）、Ｆ－Ｂｏｘタンパク質３０（Ｆｂｘｏ３０）、Ｆ－Ｂｏｘタンパク質４０（Ｆｂｘｏ４０）、神経前駆細胞発現発達ダウンレギュレートタンパク質４（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）（Ｎｅｄｄ４－１）、および三者モチーフ含有タンパク質３２（Ｔｒｉｍ３２）を含む。例示的なミトコンドリアのユビキチンリガーゼは、限定されないが、ミトコンドリアＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（Ｍｕｌ１）とＨｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシ末端（ＣＨＩＰ）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、Ｆ－ボックスタンパク質ファミリーのメンバーである、筋萎縮症Ｆ－ボックス（ＭＡＦｂｘ）とも呼ばれる、アトロジン－１をコードする。アトロジン－１／ＭＡＦｂｘは、ＭｙｏＤ、筋肉転写因子、および真核細胞翻訳開始因子３サブユニットＦ（ｅＩＦ３－ｆ）の分解を促すユビキチンリガーゼ複合体ＳＫＰ１－ｃｕｌｌｉｎ－Ｆ－ボックス（ＳＣＦ）の４つのサブユニットのうちの１つである。アトロジン－１／ＭＡＦｂｘはＦＢＸＯ３２によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ｍｕｓｃｌｅ ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ １（ＭｕＲＦ１）をコードする。ＭｕＲＦ１は、筋肉特異的なＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒタンパク質のメンバーであり、およびファミリーメンバーＭｕＲＦ２とＭｕＲＦ３とともに、筋原線維のＭ線とＺ線の格子で見られる。さらに、いくつかの試験は、ＭｕＲＦ１が筋構造タンパク質、例えば、トロポニンＩ、ミオシン重鎖、アクチン、ミオシン結合タンパク質Ｃ、およびミオシン軽鎖１と２などに相互作用し、および／またはその半減期を調節することを示している。ＭｕＲＦ１はＴＲＩＭ６３によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ＴＮＦ受容体アダプタータンパク質６（ＴＲＡＦ６）（インターロイキン１シグナルトランスデューサー、ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ タンパク質８５、あるいはＲＮＦ８５としても知られている）をコードする。ＴＲＡＦ６は、標的タンパク質に対するＬｙｓ６３結合型ポリユビキチン鎖の抱合を媒介するＥ３リガーゼのメンバーである。Ｌｙｓ６３結合型ポリユビキチン鎖は、足場タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ１）によるオートファジー依存性のカーゴ認識をシグナル伝達する。ＴＲＡＦ６はＴＲＡＦ６遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、Ｆ－ボックスタンパク質３０（Ｆｂｘｏ３０）（Ｆ－ボックスのみのタンパク質としても知られている、ヘリカーゼ、１８；萎縮－１中のＳＣＦ複合体の筋肉ユビキチンリガーゼ；あるいはＭＵＳＡ１）をコードする。Ｆｂｘｏ３０は、Ｅ３ユビキチンリガーゼのＳＣＦ複合体ファミリーのメンバーである。ある研究では、Ｆｂｏｘ３０は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）経路によって、および萎縮誘導状態時に阻害されることが提案されており、アップレギュレートされ、その後、自動ユビキチン化を経験する。Ｆｂｘｏ３０はＦＢＸＯ３０遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、Ｆ－ボックスタンパク質４０（Ｆｂｘｏ４０）（Ｆ－ボックスのみのタンパク質４０あるいは筋肉疾患関連タンパク質としても知られている）をコードする。Ｅ３ユビキチンリガーゼのＳＣＦ複合体ファミリーの第２のメンバー、Ｆｂｘｏ４０は、タンパク同化シグナルを調節する。いくつかの例では、Ｆｂｘｏ４０は、インスリン受容体基質１、インスリン受容体媒介性のシグナル伝達の下流のエフェクターをユビキチン化して、その分解に影響を与える。Ｆｂｘｏ４０はＦＢＸＯ４０遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、神経前駆細胞発現発達ダウンレギュレートタンパク質４（Ｎｅｄｄ４－１）、廃用中に筋細胞でアップレギュレートされることを示されているＨＥＣＴ ドメインＥ３ユビキチンリガーゼをコードする。Ｎｅｄｄ４－１はＮＥＤＤ４遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、三者モチーフ含有タンパク質３２（Ｔｒｉｍ３２）をコードする。Ｔｒｉｍ３２は、アクチン、トロポミオシン、およびトロポニン；α－アクチン；ならびに、デスミンなどの細い線維の分解に関与する、Ｅ３ユビキチンリガーゼのメンバーである。Ｔｒｉｍ３２はＴｒｉｍ３２遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ミトコンドリアＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（Ｍｕｌ１）（ミトコンドリアアンカータンパク質リガーゼ、ＲＩＮＧ ｆｉｎｇｅｒ タンパク質２１８、ＲＮＦ２１８、ＭＡＰＬ、ＭＵＬＡＮ、およびＧＩＤＥとしても知られている）をコードする。Ｍｕｌ１は、ミトコンドリアネットワーク改造に関与し、除神経あるいは絶食などの異化状態下で転写因子のＦｏｘＯファミリーによってアップレギュレートされ、その後、オートファジー（マイトファジー）を介してミトコンドリアの切断と除去を引き起こす。さらに、Ｍｕｌ１は、ミトコンドリアの融合に関与するＧＴＰアーゼであるミトコンドリアｐｒｏ－ｆｕｓｉｏｎ融合タンパク質ミトフシン２をユビキチン化して、ミトフシン２の分解を引き起こす。Ｍｕｌ１はＭｕｌ１遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシ末端（ＣＨＩＰ）（ＳＴＩＰ１相同性およびＵボックス含有タンパク質１、ＳＴＵＢ１、ＣＬＬ関連抗原ＫＷ－８、抗原ＮＹ－ＣＯ－７、ＳＣＡＲ１６、ＳＤＣＣＡＧ７、あるいはＵＢＯＸ１としても知られている）をコードする。ＣＨＩＰは、フィラミンＣ（Ｚ線で見られる筋タンパク質）のユビキチン化およびリソソーム依存性の分解を調節するミトコンドリアユビキチンリガーゼである。Ｚ線またはＺディスクは隣接するサルコメア間で形成された構造であり、サルコメアは筋肉の基本単位である。フィラミン構造の改質は、ＣＨＩＰを有するシャペロンＨｓｃ７０とＨｓｐＢ８を含む複合体である、コシャペロンＢＡＧ３の結合を誘発する。ＣＨＩＰによるＢＡＧ３とフィラミンのその後のユビキチン化は、オートファジー系を活性化し、フィラミンＣの分解に結びつく。ＣＨＩＰはＳＴＵＢ１遺伝子によってコードされる。
フォークヘッドボックス転写因子
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、フォークヘッドボックス転写因子をコードする。例示的なフォークヘッドボックス転写因子は、限定されないが、アイソフォームフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｏ３（ＦｏｘＯ３）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦｏｘＯ１）（横紋筋肉腫、ＦＫＨＲ、あるいはＦＫＨ１中のフォークヘッドホモログとしても知られている）をコードする。ＦｏｘＯ１は、糖新生とグリコーゲン分解のレギュレーション、および、前脂肪細胞による脂肪生成の開始に関与する。ＦｏｘＯ１はＦＯＸＯ１遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ３（ＦｏｘＯ３）（横紋筋肉腫様１、ＦＫＨＲＬ１、あるいはＦＯＸＯ３Ａのフォークヘッドとしても知られている）をコードする。ＦｏｘＯ３はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼＡＭＰＫによって活性化され、これは順にアトロジン－１とＭｕＲＦ１の発現を引き起こす。ＦｏｘＯ３はＦＯＸＯ３遺伝子によってコードされる。
成長因子
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは成長因子をコードする。例示的な成長因子はミオスタチンを含む。
いくつかの例では、本明細書に記載されるアトロジーンは、ミオスタチン（Ｍｓｔｎ）（成長／分化因子８（ＧＤＦ－８）としても知られている）をコードする。ミオスタチンは細胞内でアクチベーターに変換され、筋肉分解を刺激し、Ｓｍａｄ（ｓｍａｌｌ ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）のリン酸化／活性化によってＡｋｔを阻害することにより、筋肉合成を抑える。いくつかの例では、ミオスタチンはＡｋｔ－ＦｏｘＯシグナル伝達経路によって調節されることが分かっている。さらなる例では、ミオスタチンは衛星細胞の分化を抑え、Ａｋｔ経路の阻害によって筋肉分解を刺激し、ｍＴＯＲ経路を介して筋肉合成を抑えることが示されている。
脱ユビキチン化酵素
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは脱ユビキチン化酵素をコードする。例示的な脱ユビキチン化酵素は、限定されないが、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１４（ＵＳＰ１４）およびユビキチン特異的ペプチダーゼ１９（ＵＳＰ１９）を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるアトロジーンは、ＵＳＰ１４（脱ユビキチン化酵素１４あるいはＴＧＴとしても知られている）をコードする。他の例では、本明細書に記載されるアトロジーンは、ＵＳＰ１９（ジンクフィンガーＭＹＮＤドメイン含有タンパク質９、脱ユビキチン化酵素１９、あるいはＺＭＹＮＤ９としても知られている）をコードする。ＵＳＰ１４はＵＳＰ１４遺伝子によってコードされる。ＵＳＰ１９はＵＳＰ１９遺伝子によってコードされる。
さらなるアトロジーン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ＤＮＡ損傷誘導性転写物４（ＤＤＩＴ４）およびＨＩＦ－１反応性タンパク質ＲＴＰ８０１としても知られている、ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ１（Ｒｅｄｄ１）をコードする。Ｒｅｄｄ１は１４－３－３を隔離することによりｍＴＯＲ機能を抑制し、ＴＳＣ１／２活性を増大させる。さらに、Ｒｅｄｄ１は、筋タンパク質合成に関与する４Ｅ－ＢＰ１とＳ６Ｋ１のリン酸化を減少させる。Ｒｅｄｄ１はＤＤＩＴ４遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、カテプシンＶとしても知られているカテプシンＬ２をコードする。カテプシンＬ２はリソソームシステインプロテイナーゼである。これはＣＴＳＬ２遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ＴＧ相互作用因子、あるいはホメオボックスタンパク質ＴＧＩＦ１をコードする。ＴＧ相互作用因子は、胚発生に関与するシグナル伝達経路を調節する転写因子である。このタンパク質はＴＧＩＦ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、筋原性因子４としても知られているミオゲニンをコードする。ミオゲニンは、骨格筋発育と修復の協調に関与する筋特異的な塩基螺旋ループ螺旋（ｂＨＬＨ）転写因子のＭｙｏＤファミリーのメンバーである。ミオゲニンはＭＹＯＧ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＭＤＰＫ）あるいは筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＫ）としても知られている、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）をコードする。ＭＴ－ＰＫはセリン／トレオニンキナーゼであり、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバとさらに相互作用する。ヒトでは、ＭＴ－ＰＫはＤＭＰＫ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ヒストンデアセチラーゼ２（ヒストンデアセチラーゼファミリーのメンバー）をコードする。ヒストンデアセチラーゼ２はＨＤＡＣ２遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、ヒストンデアセチラーゼ３、ヒストンデアセチラーゼファミリーの別のメンバーをコードする。ヒストンデアセチラーゼ３はＨＤＡＣ３遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、メタロチオネイン１、メタロチオネインファミリーのメンバーをコードする。メタロチオネイン（ＭＴ）は、重金属に結合することができるシステインに富む低分子量タンパク質であり、それによって、金属毒性および／または酸化ストレスに対する保護を与える。メタロチオネイン１ＬはＭＴ１Ｌ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、メタロチオネイン１Ｂ、メタロチオネインファミリーの第２のメンバーをコードする。メタロチオネイン１ＢはＭＴ１Ｂ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアトロジーンは、表１４に表記されるアトロジーンである。
ポリ核酸分子
ある実施形態では、ポリ核酸分子は、萎縮関連遺伝子（アトロジーンとも呼ばれる）の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼあるいはミトコンドリアユビキチンリガーゼ）の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、フォークヘッドボックス転写因子の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、成長因子の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、脱ユビキチン化酵素の標的配列にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２、ＴＲＩＭ６３、ＴＲＡＦ６、ＦＢＸＯ３０、ＦＢＸＯ４０、ＮＥＤＤ４、ＴＲＩＭ３２、ＭＵＬ１、ＳＴＵＢ１、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＭＳＴＮ、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ１９、ＤＤＩＴ４、ＣＴＳＬ２、ＴＧＩＦ、ＭＹＯＧ、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＭＴ１Ｌ、ＭＴ１Ｂ、あるいはＤＭＰＫの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２、ＴＲＩＭ６３、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、あるいはＭＳＴＮの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＩＭ６３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＡＦ６の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ３０の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＢＸＯ４０の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＮＥＤＤ４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＲＩＭ３２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＵＬ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＳＴＵＢ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＯＸＯ１の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＦＯＸＯ３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＳＴＮの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＵＳＰ１４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＵＳＰ１９の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＤＩＴ４の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＣＴＳＬ２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＴＧＩＦの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＹＯＧの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＨＤＡＣ２の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＨＤＡＣ３の標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＴ１Ｌの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＭＴ１Ｂの標的配列にハイブリダイズする。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＰＫの標的配列にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－１４１および３７０－４８０で記載される標的配列からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４３－３４０６で記載される標的配列からなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および３４０７－１４２２２で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、２５６－３６９、４８１－５９１、５９２－７０２、および３４０７－１４２２２で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、４８１－５９１、３４０７－６１１０、および８８１５－１１５１８で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６－３６９、５９２－７０２、６１１１－８８１４、および１１５１９－１４２２２の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）とアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）を含む。いくつかの例では、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２－２５５、４８１－５９１、３４０７－６１１０、および８８１５－１１５１８で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６－３６９、５９２－７０２、６１１１－８８１４、および１１５１９－１４２２２で記載される標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によっては、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドはセンス鎖またはパッセンジャー鎖である。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドはアンチセンス鎖またはガイド鎖である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらに平滑末端、オーバーハングあるいはその組み合わせを含む。いくつかの例では、平滑末端は、５’平滑末端、３’平滑末端、あるいはその両方である。場合によっては、オーバーハングは５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、あるいは６の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、あるいは４の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは２つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは３つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは４つの非塩基対ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載された標的配列に対して、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９９％相補的である。いくつかの例では、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に１００％相補的である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して５つ以下のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、あるいは１００％の配列相補性である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションは高いストリンジェントなハイブリダイゼーション状態である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はオフターゲット効果を減少させた。いくつかの例において、「オフターゲット」あるいは「オフターゲット効果」とは、所定の標的に対するポリ核酸ポリマーが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、あるいは細胞タンパク質またはその他の部分を直接的あるいは間接的に相互作用することによって意図しない効果を引き起こすあらゆる例を指す。いくつかの例では、その他の転写物とポリ核酸分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性あるいは相補性によって他の転写物の同時の分解がある場合に、「オフターゲット効果」が生じる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は天然または合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組み合わせを含む。いくつかの例では、合成または人工ヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、あるいはその組み合わせの１つ以上で修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログあるいは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾を有する核酸を含む。いくつかの例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、あるいはＣＮを含み、Ｒはアルキル部分である。例示的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例では、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、あるいはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネートまたはシアナート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィド）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環基の炭素は窒素、酸素、あるいは硫黄によって置換される。いくつかの例では、複素環式置換は、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、および、ピロリジノを含む。
いくつかの事例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’－Ｏ－メチル修飾は、メチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加え、一方で２’Ｏ－メトキシエチル修飾は、メトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子の２’－Ｏ－メチル修飾およびウリジンの２’Ｏ－メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合させる、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。２’－Ｏ－アミノプロピルヌクレオシドホスホラミダイトの典型的な化学構造が、以下に例証される。
いくつかの例では、２’ヒドロキシル基の修飾はロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、ここで、２’炭素で結合された酸素分子はメチレン基によって４’炭素に結合され、したがって、２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシ－メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。ＬＮＡの化学構造の代表例が以下に例証される。左に示される代表例は、ＬＮＡ単量体の化学結合性を強調している。右に示される代表例は、ＬＮＡ単量体のフラノース環のロックド３’－ｅｎｄｏ（３Ｅ）構造を強調している。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、糖構造を３’－ｅｎｄｏ糖パッカリング構造（ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとロックする、例えば、２’－４’－エチレン架橋した核酸などのエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋された核酸の典型的な化学構造は、以下に例証される。
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での追加の修飾は、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、および、５位置に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メトキシウリジン、７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６－アゾウリジン、６－アゾシチジン、６－アゾチミジン、５－メチル－２－チオウリジン、他のチオ塩基、例えば、２－チオウリジンと４－チオウリジン、および２－チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、Ｏ－およびＮ－アルキル化プリンおよびピリミジン、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン、５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えば、アミノフェノールまたは２，４，６－トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８－置換されたアデニンおよびグアニン、５－置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖あるいはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、糖部は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’－チオリボース、および、その他の糖類、複素環、あるいは炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドとの用語はさらに、普遍的な塩基として当技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、またはネブラリンを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組み合わせをさらに含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、正常な糖およびリン酸塩構造からの偏差（ｄｅｖｉａｔｅｓ）によって天然の核酸構造を模倣している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。いくつかの場合では、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合する。場合によっては、骨格の変質は、荷電オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ）の助けを借りることなく細胞膜を横断することができるモルホリノ中性分子を作るすべての正および負の電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格環もリン酸塩結合を含まず、塩基は結合し、オリゴグリシン様分子によって適切に間隔を置かれ、ゆえに、骨格電荷を除去する。
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾が随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、三フッ化ホウ素（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅｓ）、３’－５’結合あるいは２’－５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホロチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’－アルキルホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カルボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルジメチルヒドラゾ、ホルムアセタル、チオホルムアセタル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリル、あるいはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換されたおよび／またはヘテロ原子を含む１～１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルあるいはシクロアルキル結合、モルホリノ構造との結合、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的あるいは間接的に結合したポリアミド、またはこれらの組み合わせを含む。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例示的なＰＳ ＡＳＯが以下に説明される。
いくつかの例では、修飾は、メチルホスホネートあるいはチオールホスホネート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示される２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含む：
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示されるヘキシトール核酸（あるいは、１’、５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を含む：
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾はさらに、リボース部分、ホスフェート骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログの修飾を含む。例えば、３’末端は随意に３’カチオン基を含み、あるいは、３’－３’結合を含む３’－末端でヌクレオシドを反転させる。別の代替物では、３’－末端は随意に、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５－アミノアルキルｄＴと結合する。追加の代替物では、３’－末端は随意に、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と結合する。いくつかの例では、５’－末端は、アミノアルキル基、例えば、５’－Ｏ－アミノアルキル置換基と結合する。場合によっては、５’－末端は、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と結合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載された１つ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、あるいはそれ以上のチオールホスホネートヌクレオチドを含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。
場合によっては、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。
さらなる場合には、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
いくつかの例では、約５から約１００％のポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、－メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１～約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、１つのポリヌクレオチドはセンス鎖を含み、第２のポリヌクレオチドはポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、センス鎖はリンカー分子によってアンチセンス鎖に接続され、これは、いくつかの例では、ポリヌクレオチドリンカーあるいは非ヌクレオチドリンカーである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’－デオキシ－プリンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、センス鎖の５’－末端、３’－末端、あるいは５’と３’の末端の両方でキャップ部分を含む。他の実施形態では、末端のキャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分である。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にリン酸塩骨格修飾を含む。いくつかの例では、ホスフェート骨格修飾は、ホスホロチオエートである。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のに関するおよび／または、普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、あるいは１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約２５以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、約１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約５、例えば、約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’－末端、５’－末端、あるいは３’－と５’－の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において、約１～約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸分子である。
別の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列鎖の３’－末端、５’－末端、あるいは３’－末端と５’－末端の両方にある。追加の例では、２’－５’ヌクレオチド間結合は、一方あるいは両方の配列鎖内の様々な他の位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含み、あるいは、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上は、２’－５’ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、細胞中のＲＮＡｉ活性を媒介するか、インビトロ系で再構成された単鎖ポリ核酸分子であり、ここで、ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み、および、ポリ核酸中に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、ここで、ピリミジンヌクレオチドはすべて２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、あるいは、代替的に、複数のピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドである）、および、ポリ核酸中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’－デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、すべてのプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは代替的に、複数のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドである）、および、末端のキャップ修飾は、アンチセンス配列の３’－末端、５’－末端、あるいは３’と５’－末端の両方で随意に存在し、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の３’末端に約１～約４（例えば、約１、２、３、あるいは４）の末端２’－デオキシリボヌクレオチドを随意にさらに含み、ここで、末端のヌクレオチドはさらに、１つ以上（例えば、１、２、３、あるいは４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および、ポリ核酸分子は随意に５’－末端リン酸基などの末端リン酸基をさらに含む。
場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、あるいは、これらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’－Ｏメチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ－デオキシ－２’－Ｏ－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、モルホリノは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性を有する（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’－５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、本明細書に記載された５’抱合体は５’－３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載された３’抱合体は３’－５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比較して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。場合によっては、増加した親和性は、低Ｋｄ、高融解温度（Ｔｍ）、あるいはその組み合わせで例証される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、キラル純粋（あるいはステレオ純粋）なポリ核酸分子、または単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＬ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＤ－ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１４／１９４６１０号と第２０１５／２１１００６号；および、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、アプタマー結合部分を含めるようにさらに修飾される。いくつかの例では、アプタマー結合部分はＤＮＡアプタマー結合部分である。いくつかの例では、アプタマー結合部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定細胞表面標的と、循環抗体に結合するための特定のエピトープを示す部分とを認識するアプタマー部分を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号、第８，５９１，９１０号、および、第７，８５０，９７５号に記載されるようなアプタマー結合部分を含めるようにさらに修飾される。
追加の実施形態では、本明細書に記載されるポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために上に記載された修飾の１つ以上によって修飾されている。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾、あるいは、ロックドまたは架橋リボース構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増大させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および／または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はキラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子である。いくつかの例では、キラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾されている。送達の安定性を増大させるためのＲＮＡの適切な修飾は当業者には明らかである。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む、二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は２つの別々のポリヌクレオチドから組み立てられ、１つの鎖はセンス鎖であり、もう一つの鎖はアンチセンス鎖であり、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的であり（例えば、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖とセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合など。例えば、二本鎖領域は約１９、２０、２１、２２、２３、またはそれ以上の塩基対である）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替的に、ポリ核酸分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ポリ核酸分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合する。
場合によっては、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する、二重の、非対称的で二重の、ヘアピン型の、または非対称的なヘアピン型の二次構造を有するポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合には、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む基部とを有する、環状の単鎖ポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性なポリ核酸分子を生成するためにインビボまたはインビトロで処理される。さらなる場合には、ポリ核酸分子はさらに、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、そのようなポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’－リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３－５７４と、Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７－５６８を参照）あるいは５’，３’－二リン酸塩などの末端のリン酸基を含む。
いくつかの例では、非対称のヘアピンは、アンチセンス領域と、ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドを含むループ部分と、センス領域とを含む線形のポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすのに十分な相補的なヌクレオチドを有し、ループを有する二重鎖を形成する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有し、かつ、および約４～約８のヌクレオチドを含むループ領域を有するアンチセンス領域（例えば約１９～約２２ヌクレオチド）と、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。場合によっては、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子はさらに、化学修飾された５’末端のリン酸基を含む。さらなる場合には、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、あるいは抱合体分子を含む。
いくつかの実施形態において、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域と塩基対をなすのに十分な相補的なヌクレオチドを有し、かつ、二重鎖を形成する程度で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば約１９約２２のヌクレオチド）、および、アンチセンス領域に相補的な約３～約１８のヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。
場合によっては、普遍的な塩基とは、ほとんど見分けがつかない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的な塩基の非限定的な例は、従来技術で知られているようなＣ－フェニル、Ｃ－ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、および６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含む（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７－２４４７を参照）。
ポリ核酸分子合成
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、当該技術分野で知られている手順を用いて、化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築される。例えば、ポリ核酸分子は、自然発生のヌクレオチドを使用して、あるいは、分子の生体安定性を増大させるために、または、ポリ核酸分子と標的核酸との間で形成された二重鎖の物理安定度を増大させるために設計されたさまざまな修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成される。例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：米国特許第５，１４２，０４７号；第５，１８５，４４４号；第５，８８９，１３６号；第６，００８，４００号；および、第６，１１１，０８６号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９０９９９４２号；あるいは、欧州特許公開第１５７９０１５号。追加の例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：Ｇｒｉｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ．，“２’－Ｏ－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，” Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９（２６）：５１００－５１０９ （１９９７））； Ｏｂｉｋａ，ｅｔ ａｌ． “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ －ｃｙｔｉｄｉｎｅ． Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３，－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８ （５０）： ８７３５ １９９７； Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ． “ＥＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８ （２）： １４４－１４９ （２００６）； ａｎｄ Ａｂｒａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，” Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１－１７２６ （２００９）。代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンス配向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生成される（つまり、挿入されたポリ核酸分子の転写されたＲＮＡは所望の標的ポリ核酸分子に対してアンチセンス配向になる）。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はタンデム合成方法によって合成され、ここで、両方の鎖は切断リンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチドフラグメントあるいは鎖として合成され、これはその後切断されることで、二重鎖をハイブリダイズして二重鎖の精製を可能にする別々のフラグメントまたは鎖をもたらす。
いくつかの例では、ポリ核酸分子も２つの特徴的な核酸鎖あるいはフラグメントから組み立てられ、ここで、１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントは分子のアンチセンス領域を含む。
例えば、糖、塩基、およびホスフェート修飾を組み込むためのさらなる修飾方法は、以下を含む：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９２／０７０６５； Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５－５６８； Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４－３１７； Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４－３３９； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９３／１５１８７； Ｓｐｒｏａｔ，Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，３３４，７１１ ａｎｄ Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２； Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９７／２６２７０； Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７１６，８２４； Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，６２７，０５３； Ｗｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９８／１３５２６； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ． Ｓｅｒ． Ｎｏ． ６０／０８２，４０４ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｉｌｅｄ ｏｎ Ａｐｒ． ２０，１９９８； Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１； Ｅａｒｎｓｈａｗ ａｎｄ Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９－５５； Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９－１３４；および、Ｂｕｒｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，５，１９９９－２０１０．上記公報は、触媒作用を調節することなく、核酸分子へ糖、塩基、および／またはリン酸塩修飾を取り込むための位置を決定するための方法や戦術を記載している。
いくつかの例では、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’－メチルホスホネート結合とのポリ核酸分子のヌクレオチド間結合の化学修飾が安定性を改善する一方で、過度の修飾はしばしば毒性または活性の減少を引き起こす。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は場合によっては最小限に抑えられる。そのような場合、これらの結合の濃度の減少は、これらの分子の毒性を低下させ、有効性と高い特異性を増加させる。
ポリ核酸分子抱合体
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はさらに、所望の部位へ送達されるポリペプチドＡに結合する。場合によっては、ポリ核酸分子はポリペプチドＡと随意にポリマー部分に結合する。
いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢに結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、Ａ－Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに結合する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＡは、Ｂの５’末端、Ｂの３’末端、Ｂの内部部位、あるいはその任意の組み合わせに結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも２つのＢに結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、あるいはそれ以上のＢに結合する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で結合され、その一方で、少なくとも１つのＣは、Ａ－Ｂ－Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢの反対側の末端で結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で結合され、その一方で、Ｃの少なくとも１つは少なくとも１つのＢの内部部位で結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＣに直接結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、Ａ－Ｃ－Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＣを介して少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的に結合する。
いくつかの例では、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、ならびに随意に少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに結合する。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、少なくとも１つのポリペプチドＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で結合され、あるいは少なくとも１つのポリペプチドＡに内部部位を介して結合する。場合によっては、少なくとも１つのＣは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、あるいは少なくとも１つのＢによって間接的に結合する。間接的に、少なくとも１つのＢによって、少なくとも１つのＣは、Ｂ上の少なくとも１つのポリペプチドＡと同じ末端で、少なくとも１つのポリペプチドＡからの対抗する末端で、あるいは、独立して内部部位で結合する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のポリペプチドＡはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに結合する。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、少なくとも１つのポリペプチドＡ、少なくとも１つのＢ、あるいは少なくとも１つのＣに、直接的あるいは間接的に結合する。直接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに結合される場合、少なくとも１つのＤもＡ－Ｄ－Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に結合され、あるいは、Ａ－Ｄ－Ｂ－Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に結合する。いくつかの例では、Ｄ－Ａ－Ｂ－Ｃ抱合体を形成するために、少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、および少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに間接的に結合する。間接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに結合される場合、少なくとも１つのＤもＡ－Ｂ－Ｄ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に結合され、あるいは、Ａ－Ｂ－Ｄ－Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に結合する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＤはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに結合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ａで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｂで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｃで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｄで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｅで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｆで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｇで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｈで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｉで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｊで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｋで例示されるような構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、図１９Ｌで例示されるような構築物を含む。
図１９Ｍに例証されるような抗体の劇画表示は、例示目的のために過ぎず、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいは、ラクダ抗体またはその結合フラグメントを包含する。
結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分Ａはポリペプチドである。いくつかの例では、ポリペプチドは、抗体またはそのそのフラグメントである。場合によっては、フラグメントは結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体である。いくつかの例では、Ａはヒト化抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはマウス抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはキメラ抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはモノクローナル抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは一価Ｆａｂ’である。いくつかの例では、Ａは二価Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態では、結合部分Ａは、二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、二重特異性抗体は三機能性抗体あるいは二重特異性ミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原のための結合部位を含む完全長のモノクローナル抗体である。
場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、二重特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、あるいは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは二重特異性ビス－ｓｃＦｖである。場合によっては、Ａは二重特異性（ｓｃＦｖ）であるいくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ダイアボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ミニボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性の三重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性の四重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性のＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは三重特異性抗体である。いくつかの例では、三重特異性抗体はＦ（ａｂ）’３フラグメントあるいは三重特異性抗体を含む。いくつかの例では、Ａは三重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｄｉｍａｓ、ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）： ３４９０－３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、結合部分Ａは、筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。場合によっては、結合部分Ａは、骨格筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。
いくつかの実施形態において、例示的な抗体は、限定されないが、抗ミオシン抗体、抗トランスフェリン抗体、および、筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）を認識する抗体である。いくつかの例では、抗体は抗トランスフェリン（抗ＣＤ７１）抗体である。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基またはシステイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。場合によっては、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、ポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基、システイン残基を介して、５’－末端で、３’－末端で、非天然アミノ酸、あるいは酵素修飾または酵素触媒された残留物で、ポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、５’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、３’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、非天然アミノ酸を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で酵素修飾または酵素触媒された残留物を介してポリ核酸分子（Ｂ）に結合する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリ核酸分子（Ｂ）は結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のポリ核酸分子は、１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約７のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約８のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約９のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１０のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。いくつかの例では、約１６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに結合する。場合によっては、１つ以上のポリ核酸分子が同じである。他の例では、１つ以上のポリ核酸分子が異なる。
いくつかの実施形態において、結合部分Ａに結合したポリ核酸分子（Ｂ）の数は、ある比率を形成する。いくつかの例では、比率はＤＡＲ（薬物対抗体の）比率と呼ばれ、本明細書で言及されるような薬物はポリ核酸分子（Ｂ）である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２以上である。
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１６である。
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１２である。
いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、活性を改善させた。いくつかの例では、改善された活性は、生物学的に関連する機能の増強、例えば、疾患状態の処置または予防における安定性、親和性、結合、機能的な活性、および有効性の改善をもたらす。いくつかの例では、疾患状態は、遺伝子の１つ以上の突然変異エクソンの結果である。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、１つ以上の突然変異したエクソンのエクソンスキッピングの増加をもたらす。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、エクソンスキッピングは、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体において、少なくともまたは約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは、９５％以上増加する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、単独であるいは組み合わせて、当該技術分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、追加を用いることによって、および／または、組換え、ならびに／あるいは、当該技術分野で知られている他の修飾（例えば、グリコシル化とリン酸化などの翻訳後および化学的な修飾）によって、さらに修飾される。いくつかの例では、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。いくつかの例では、１つ以上の修飾は、例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものを含み、当該文献はＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与するアミノ酸残基を開示している。抗体またはその結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎となる核酸配列にそのような修飾を導入する方法は、当業者に周知である。
いくつかの例では、抗体結合フラグメントはさらにその誘導体を包含し、少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド配列を含んでいる。
いくつかの例では、本明細書に記載されるような「単鎖」との用語は、二重特異性の単鎖構築物の第１と第２のドメインが、好ましくは、単一核酸分子によってコードすることができる共線形アミノ酸配列（ｃｏ－ｌｉｎｅａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の形態で共有結合されるということを意味する。
いくつかの例では、二重特異性単鎖抗体構築物は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関する。そのような実施形態では、二重特異性の単鎖抗体構築物はタンデムｂｉ－ｓｃＦｖあるいはダイアボディである。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続されたＶＨとＶＬのドメインを含む。いくつかの例では、リンカーは、第１と第２のドメインのそれぞれが、互いから独立して、その差次的な結合特異性を保持することができる十分な長さと配列である。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるように、～との結合または～による相互作用とは、互いに少なくとも２つの抗原相互作用部位の結合／相互作用を定義する。いくつかの例では、抗原相互作用部位は、特異性抗原または抗原の特異的な群との特定の相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合によっては、結合／相互作用は特定の認識を定義するとも理解される。そのような場合、特定の認識は、抗体あるいはその結合フラグメントが、標的分子の各々の少なくとも２つのアミノ酸に特異的に相互作用および／または結合することができるということを指す。例えば、特定の認識は、抗体分子の特異性、あるいは標的分子の特定の範囲を区別するその能力に関する。追加の例では、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、例えば、抗原の立体配座の変化、抗原のオリゴマー化などの誘導による、シグナルの開始をもたらす。さらなる実施形態では、結合は「鍵と鍵穴の原則（ｋｅｙ－ｌｏｃｋ－ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。したがって、いくつかの例では、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、上記構造の第２の修飾の結果と同様に、その１次、２次、または３次構造の結果として互いに結合する。そのような場合、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、その部位の抗原への簡単な結合をもたらす。
いくつかの例では、特異的な相互作用はさらに、抗体またはその結合フラグメントの減少した交差反応性、あるいは減少したオフターゲット効果を指す。例えば、所望のポリペプチド／タンパク質に結合するが、他のポリペプチドのいずれにも本質的には結合しない抗体あるいはその結合フラグメントは、所望のポリペプチド／タンパク質に対して特異的であるとみなされる。抗原相互作用部位の特異性抗原との特定の相互作用の例は、リガンドのその受容体との特異性、例えば、抗原決定基群（エピトープ）の、抗体の抗原結合部位との相互作用を含む。
追加の結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分は血漿タンパク質である。いくつかの例では、血漿タンパク質はアルブミンを含む。いくつかの例では、結合部分Ａはアルブミンである。いくつかの例では、アルブミンは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によって、ポリ核酸分子に結合する。いくつかの例では、アルブミンは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例では、アルブミンは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合する。
いくつかの例では、結合部分Ａはステロイドである。例示的なステロイドは、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（飽和、不飽和であり、置換、あるいはそれらの組み合わせを含む）を含む。いくつかの例では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの例では、結合部分はコレステロールである。いくつかの例では、コレステロールは、本明細書に記載される結合化学の１つ以上によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例では、コレステロールは、天然のライゲーション化学によってポリ核酸分子に結合する。いくつかの例では、コレステロールは、リジン結合によってポリ核酸分子に結合する。
いくつかの例では、結合部分は、限定されないが、細胞上の特定の表面マーカーに結合するポリ核酸分子アプタマーを含むポリマーである。この例では、結合部分は、標的遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、その代りに、細胞表面マーカーのその特定のエピトープに結合する抗体と同様に、細胞表面マーカーに選択的に結合することができるポリ核酸である。
場合によっては、結合部分Ａはペプチドである。場合によっては、ペプチドは約１～約３ｋＤａを含む。場合によっては、ペプチドは、約１．２～約２．８ｋＤａ、約１．５～約２．５ｋＤａ、あるいは約１．５～約２ｋＤａを含む。いくつかの例では、ペプチドは二環式ペプチドである。場合によっては、二環式ペプチドは束縛された二環式ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。いくつかの例では、ペプチド部分は二環式ペプチド（例えば、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのｂｉｃｙｃｌｅｓ）である。
さらなる場合には、結合部分は小分子である。いくつかの例では、小分子は抗体動員小分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。場合によっては、抗体動員小分子は、標的結合末端および抗体結合末端を含み、標的結合末端はそれで細胞表面受容体を認識して、相互作用することができる例えば、いくつかの例では、グルタミン酸塩尿素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｕｒｅａ ）化合物を含む標的結合末端は、ＰＳＭＡとの相互作用を可能にし、それにより、ＰＳＭＡを発現する細胞との抗体相互作用を増強する。いくつかの例では、結合部分は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｅｍｏｔｅ ａｒｅｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． １３２（３６）： １２７１１－１２７１６ （２０１０）；あるいは、ＭｃＥｎａｎｅｙ， ｅｔ ａｌ．， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ，” ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ７（７）： １１３９－１１５１ （２０１２）に記載される小分子である。
抗体あるいはその結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗体とその結合フラグメント）は、とりわけ、化学合成によって、あるいは組換え発現によって、ポリペプチド（例えば、抗体）の合成に役立つように、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して生成され、および、好ましくは組換え発現技術によって生成される。
いくつかの例では、抗体あるいはその結合フラグメントは組換え発現され、抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２に記載されるような）から組み立てられ、これは、抗体をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、オリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーション、および、その後のＰＣＲによるライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローンを作ることによって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）から随意に生成される。
いくつかの例では、抗体またはその結合は、ポリクローナル抗体を産生するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、あるいは、より好ましくは、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）によって記載されるように、あるいは、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）またはＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６）によって記載されるように、モノクローナル抗体を産生することによって、随意に生成される。代替的に、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコードするクローンは、特異性抗原に結合するＦＡｂフラグメントのクローンのためにＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１に記載される）をスクリーニングすることにより、あるいは抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４； Ｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９３７を参照）をスクリーニングすることにより、随意に得られる。
いくつかの実施形態において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８５１－８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４－６０８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２－４５４）の産生のために開発された技術が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト化抗体）を有する動物種などの様々な動物種に由来する分子である。
いくつかの実施形態において、単鎖抗体の産生について記載された技術（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６９４，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３； ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４）は、単鎖抗体を産生するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸ブリッジによってＦｖ領域の重鎖または軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、結果として単鎖ポリペプチドを生じさせる。大腸菌中の機能的なＦｖフラグメントの組み立てのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１）。
いくつかの実施形態において、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターあるいは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、および、リン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞はその後、抗体を産生するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導可能、あるいは組織特異的なプロモーターによって調節される。
いくつかの実施形態において、様々な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される抗体またはその結合フラグメントを発現するために利用される。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列が生成され、その後精製されるビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列で変形されるか、あるいはトランスフェクトされるときに、抗体またはその結合フラグメントをインサイチュで発現する細胞も表す。これらは、限定されないが、組み換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいは抗体またはその結合フラグメントコード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）などの微生物；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス・ピキア）；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組替えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウィルス）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または、抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）のゲノム、あるいは、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む、組換え発現構築物を保護する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。
組換えタンパク質の長期的かつ高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。いくつかの例では、安定して抗体を発現する細胞株が随意に操作される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後に、細胞を操作して栄養強化培地で１－２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体に安定的に統合させ、成長し、クローン化されて細胞株へと拡張するフォーカスを形成するのを可能にする。この方法は、抗体またはその結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用することができる。
いくつかの例では、限定されないが、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、あるいはａｐｒｔ－細胞で利用される単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７）遺伝子を含む、多くの選択系が使用される。同様に、代謝拮抗薬の耐性は、以下の遺伝子の選定基準として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５； Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， １９９１， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３－５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１－２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５）、ならびに、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で知られている既知の方法は一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ．； Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）に記載される。
いくつかの例では、抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって増大する（検討のために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７を参照）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが増大すると、標識遺伝子のコピーの数が増大する。増幅した領域が抗体のヌクレオチド配列に関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５７）。
いくつかの例では、抗体または抗体抱合体の精製あるいは分析のための当該技術分野で知られているいかなる方法が、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異性抗原への親和性、および、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性、あるいはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって使用される。例示的なクロマトグラフィー方法としては、限定されないが、強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられる。
結合化学
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは結合部分に結合する。いくつかの例では、結合部分は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、炭水化物、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールなどのポリマー、ならびに、これらのクラスの物質のすべてのアナログあるいは誘導体を含む。結合部分の追加の例はさらに、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、飽和、不飽和、または、置換を含む）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類などのステロイドを含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらにポリマーに結合され、随意にエンドソーム溶解性部分に結合する。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は化学的なライゲーションプロセスによって結合部分に結合する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は天然のライゲーションによって結合部分に結合する。いくつかの例において、抱合体は、以下に記載される：Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， ２６６，７７６－７７９； Ｄａｗｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７， １１９， ４３２５－４３２９； Ｈａｃｋｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９，９６，１００６８－１００７３；あるいは、Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，” Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，４１１６－４１２５。いくつかの例では、結合は米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるとおりである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学を介して、結合部分に部位特異的あるいは非特異的に結合する。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」カップリング技術（ＰｈｉｌｏＣｈｅｍ）を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例では、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含むポリ核酸分子とその後結合される結合部分のＮ末端 １，２－アミノチオール基を利用する。（Ｃａｓｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，” ＪＡＣＳ １３４（１３）： ５８８７－５８９２ （２０１２）を参照）
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、結合部分に導入された非天然のアミノ酸を利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例では、非天然アミノ酸はｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するために、アルコキシ－アミン由来の結合部分に選択的に結合する。（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，” ＰＮＡＳ １０９（４０）： １６１０１－１６１０６ （２０１２））を参照）。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する部位指定的な方法によって結合部分に結合する。いくつかの例では、部位指定的な方法はＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｃａｔａｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を利用する。いくつかの例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスを介するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残留物の生成、および、ヒドラジノ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介するアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子へのＦＧｌｙのその後の結合を含む。（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ，” ＰＮＡＳ １０６（９）： ３０００－３００５ （２００９）； Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” ＰＮＡＳ １１０（１）： ４６－５１ （２０１３）を参照）
いくつかの例では、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを用いて結合部分に結合する。いくつかの例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化されたポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から産生される。（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ： ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２） １６１－１６７ （２０１３）を参照）
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、配列特異的なトランスペプチダーゼを利用するＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載されるような方法によって結合部分に結合する。
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許公開第２０１５／０１０５５３９号および第２０１５／０１０５５４０号に記載されるような方法によって結合部分に結合する。
ポリマー結合部分
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはさらに、本明細書に記載されるポリ核酸分子、本明細書に記載される結合部分、あるいはこれらの組み合わせに結合する。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子に結合する。場合によっては、ポリマー部分Ｃは結合部分に結合する。他の場合には、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子結合部分分子に結合する。さらなる場合には、ポリマー部分Ｃは上で例証されるように結合する。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは分枝したあるいは分枝していない単量体、および／または、二次元または三次元の単量体の架橋したネットワークの長鎖からなる、天然または合成のポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは多糖、リグニン、ゴム、あるいはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのポリマー部分Ｃとしては、限定されないが、アルファ－、オメガ－ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生分解性ラクトンベースのポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ、またはＰＥＴＥとしても知られている）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、あるいはポリウレタン、およびこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関連する場合と同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーの単量体から構築されるポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、ポリマー部分ＣはＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリエチレン・イミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
いくつかの例では、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端で結合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端で結合されるが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端で結合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位に結合する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分、結合部分、あるいはその組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位に結合する。いくつかの例において、抱合体は直接抱合体である。いくつかの例では、結合は天然のライゲーションを介するものである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、多分散または単分散の化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散した分布を含む。いくつかの例では、単分散のＰＥＧは１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）分子の分子量の平均を表す。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、あるいは１００，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０，０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１００，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、別々のエチレンオキシド単位（例えば、４～約４８のエチレンオキシド単位）を含む。いくつかの例では、別々エチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは直鎖である。他の症例では、別々エチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは分枝鎖である。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは別々のエチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）である。場合によっては、ポリマー部分Ｃは約４～約４８エチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８エチレンオキシド単位を含む。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは例えば、約４～約４８エチレンオキシド単位を含む別のＰＥＧを含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８エチレンオキシド単位を含む、別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。
場合によっては、ポリマー部分Ｃは、ｄＰＥＧＲ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）である。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはカチオン性ムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例では、ｃＭＡＰは、少なくとも１つの反復サブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユニット構造は式（∨）として表される：
ここで、ｍは、各出現時、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは、４－６、または５であり；および、ｎは、各出現時、独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態において、ｍとｎは、例えば、約１０である。
いくつかの例では、ｃＭＡＰはさらにＰＥＧ部分に結合し、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ～約１０００Ｄａ、１０００Ｄａよりも大きい～約５０００Ｄａ、５０００Ｄａよりも大きい～約１０，０００Ｄａ、１０，０００よりも大きい～約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａよりも大きい～約５０，０００Ｄａ、あるいはこれらの範囲の２つ以上の任意の組み合わせである。
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ポリマー部分ＣはｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、上で例証されるように、ポリ核酸分子、結合部分、および、随意にエンドソーム溶解性部分に結合する。
エンドソーム溶解性部分
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子はさらに、追加の結合部分を含む。いくつかの例では、追加の結合部分はエンドソーム溶解性部分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、細胞区画放出成分、例えば、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、あるいは細胞を有する他の小胞体などの、当該技術分野で知られている細胞の区分のいずれかから放出することができる化合物である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、あるいはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合では、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。
エンドソーム溶解性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性ポリペプチドとさらに結合する。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドはｐＨ依存性膜活性ペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。追加の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣薬である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、ムチン（ｍｅｕｃｉｎ）、あるいはそのそれぞれの誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例では、ＩＮＦ７は２４残留物ポリペプチドであり、これらの配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、あるいはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。いくつかの例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ－（ＰＥＧ）６－ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、または ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ－ＳＧＳＣ－Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。
場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、あるいはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含む。いくつかの例では、メリチンは、米国特許第８，５０１，９３０号に記載されるポリペプチド配列を含む。
いくつかの例では、ムチンは、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例では、ムチンはムチン－１３（これらの配列は、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ－ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む）およびムチン－１８（これらの配列は、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を含む）から構成される。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、その配列がＩＮＦ７あるいはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは９９％の配列同一性であるポリペプチド、メリチンあるいはその誘導体、または、ムチンあるいはその誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－５からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６または７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はムチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８または９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９からなる。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表１で例証されるような配列を含む。
場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ－２および／またはＢｃｌ－ｘＬなどの抑制因子標的の拮抗を介してアポトーシスを誘発するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ，” Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１： ２６１－２６５ （２０１１）に記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３／１６６１５５号またはＷＯ２０１５／０６９５８７号に記載されるようなポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。
エンドソーム溶解性脂質
いくつかの実施形態において、エンドソーム溶解性部分は脂質（例えば、融合性脂質）である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性脂質（例えば、融合性脂質）とさらに結合する。例示的な融合性脂質は、１，２－ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ、３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６、９、２８、３１－テトラエン－１９－オール（Ｄｉ－Ｌｉｎ）、およびＮ－メチル（２，２－ジ（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ－ｋ－ＤＭＡ）ならびにＮ－メチル－２－（２，２－ジ（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタンアミン（ＸＴＣ）を含む。
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０９／１２６，９３３に記載される脂質（例えば、融合性脂質）である。
エンドソーム溶解性小分子
いくつかの実施形態では、エンドソーム溶解性部分は小分子である。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性小分子とさらに結合する。エンドソーム溶解性部分として適切な例示的な小分子としては、限定されないが、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ）、アモピロキン、プリマキン、メフロキン、ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ、ハロファントリン、キノンイミン、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、キノリンエンドソーム溶解性部分としては、限定されないが、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（クロロキン）；７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン；４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（４－エチル－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ－）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；ヒドロキシクロロキンホスフェート；７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル－１）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）；７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ（キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン；７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン；８－［（４－アミノペンチル）アミノ－６－メトキシジヒドロクロリドキノリン；１－アセチル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン；８－［（４－アミノペンチル）アミノ］－６－メトキシキノリンジヒドロクロリド；１－ブチリル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン；３－クロロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン）（４－［（４－ジエチル－アミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；３－フルオロ－４－（４－ヒドロキシ－α，α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン（４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；４－（４－ヒドロキシ－α、α’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン；４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン；３，４－ジヒドロ－１－（２Ｈ）－キノリンカルボキシアルデヒド；１、１’－ペンタメチレンキノリニウムヨージド；８－硫酸キノリノールおよびアミノ、アルデヒド、カルボン酸、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、ならびにビニル誘導体またはそのアナログ。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ （１９９７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４－８９３）および米国特許第５，７３６，５５７号に記載される小分子である。
リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。
場合によっては、リンカーは非ポリマーリンカーである。非ポリマーリンカーは、重合プロセスによって生成された単量体の反復単位を含まないリンカーを指す。例示的な非ポリマーリンカーとしては、限定されないが、Ｃ１－Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。場合によっては、非ポリマーリンカーは、Ｃ１－Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせを含む。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは、２つを超える同じタイプのリンカー、例えば、２つを超えるホモ二機能性架橋リンカー、あるいは２つを超えるペプチドリンカーを含まない。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは随意に１つ以上の反応性官能基を含む。
いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、上に記載されたポリマーを包含しない。いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）を包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはＰＥＧを包含しない。
いくつかの例では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。例示的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’－ジスクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４、４’－ジフルオロ－３、３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３、３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレン・スルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。例示的なヘテロ二機能性リンカーとしては、限定されないが、アミン反応的およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノアート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド・エステル（ＧＭＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル ６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル ６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノアート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル ４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル ６－（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノアート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などのカルボニル反応的およびスルフヒドリル反応的な架橋リンカー、アミン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノアート（スルホ－ＮＨ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ρ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル ４－（ρ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル ２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル ７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ρ－ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミドカルボニル反応性および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボン酸塩反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、および、アルギニン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられる。
いくつかの例では、リンカーは反応性官能基を含む。場合によっては、反応性官能基は、結合部分に存在する求電子基に反応性の求核基を含む。例示的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。例示的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例では、マレイミド基はカプロン酸をさらに包含し、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上に記載されたスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、あるいは、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
いくつかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用をもたらすために、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を取り込むべくジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応による脱離反応を経験することのないようにする。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｌｆ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３２（１０）：１０５９－１０６２ （２０１４） に記載されるマレイミド基である。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドである。
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、少なくとも１、２、３、４、５、または６より多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、または８のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、約２、約３、約４、約５、あるいは約６のアミノ酸残基を含む。いくつかの例では、ペプチド部分は、切断可能なペプチド部分（例えば、酵素的または化学的に）である。いくつかの例では、ペプチド部分は切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２３）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２４）、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２５）を含む。いくつかの例では、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２３）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２４）、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２５）などのペプチド部分を含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔを含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ－Ｃｉｔである。
いくつかの実施形態において、リンカーは安息香酸基あるいはその誘導体を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、任意の組み合わせにおける、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、ペプチド基はｖａｌ－ｃｉｔである。いくつかの例では、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例では、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。場合によっては、リンカーはｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは自壊性リンカーあるいは自己排除リンカーである。場合によっては、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己排除リンカー（例えば、環化自己排除リンカー）である。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４あるいはＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるリンカーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは樹状型リンカーである。いくつかの例では、樹状型リンカーは分岐した多機能リンカー部分を含む。いくつかの例では、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例では、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
いくつかの実施形態において、リンカーは、トレースレスリンカーあるいは切断後にリンカー部分（例えば、原子あるいはリンカー基）を結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解性部分Ｄに残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーは、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、あるいはフェニルヒドラジドリンカーを含む。場合によっては、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ－ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）：２４９３－２４９７ （２０１３）に記載されるトレースレスアリール－トリアゼンリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：２６０７－２０２４（２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号に記載されるトレースレスリンカーである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号；第７，４９８，２９８号；第８，２８８，３５２号；第８，６０９，１０５号；あるいは、第８，６９７，６８８号；米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号；第２０１３／０２８９１９号；第２０１４／２８６９７０号；第２０１３／０３０９２５６号；第２０１５／０３７３６０号；あるいは、第２０１４／０２９４８５１号；または、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５０５７６９９号；第ＷＯ２０１４０８０２５１号；第ＷＯ２０１４１９７８５４号；第ＷＯ２０１４１４５０９０号；あるいは、第ＷＯ２０１４１７７０４２号に記載されるリンカーである。
いくつかの実施形態において、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して、単結合あるいは非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して単結合である。場合によっては、Ｘ１とＸ２はそれぞれ独立して非ポリマーリンカーである。
いくつかの例では、Ｘ１は単結合または、非ポリマーリンカーを含む。いくつかの例では、Ｘ１は単結合である。いくつかの例では、Ｘ１は非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、リンカーはＣ１－Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｘ１は、例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基などのＣ１－Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｃ１－Ｃ６アルキル基は非置換のＣ１－Ｃ６アルキル基である。リンカーの文脈において、とりわけ、Ｘ１の文脈において使用される場合、アルキルは、最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例では、Ｘ１は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘ１はｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合したヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘ１は、Ｃ１－Ｃ６アルキル基に随意に結合したｓＭＣＣを含む。いくつかの追加例では、Ｘ１は、上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含まない。
いくつかの例では、Ｘ２は単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は単結合である。その他の場合において、Ｘ２はリンカーである。さらなる場合には、Ｘ２は非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＣ１－Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は上に記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｘ２は、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、Ｘ２はＶａｌ－Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、Ｘ２はＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｘ２は、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｘ２はｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。
使用の方法
筋萎縮症は、筋肉量の喪失および／または筋肉の進行性の低下と変性を指す。場合によっては、筋肉量の喪失あるいは筋肉の進行性の低下と変性は、高いタンパク質分解率、低いタンパク質合成率、あるいは両方の組み合わせによって生じる。場合によっては、高い筋タンパク質分解率は、筋タンパク質異化作用（つまり、糖新生のために基質としてアミノ酸を使用するための筋タンパク質の分解）による。
１つの実施形態では、筋萎縮症は、筋力の著しい喪失を指す。筋力の著しい喪失によって、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、あるいは未使用の筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋力の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上の強度の低下である。別の実施形態では、筋力の著しい喪失によって、使用不能期間の前の同じ被験体の同じ筋組織の筋力と比較して、未使用の筋組織の強度の低下を意味する。ある実施形態において、筋力の著しい喪失は、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋強度と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上の低下である。
別の実施形態では、筋萎縮症は、筋肉量の著しい喪失を指す。筋肉量の著しい喪失によって、対照被験体の同じ筋組織と比較して、被験体の病気の、損傷した、あるいは未使用の筋組織の筋肉体積の減少を意味する。ある実施形態において、筋肉体積の著しい喪失は、対照被験体の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上である。別の実施形態では、筋肉量の著しい喪失によって、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、未使用の筋組織の筋肉体積の低下を意味する。ある実施形態において、筋肉組織の著しい喪失は、使用不能期間前の同じ被験体の同じ筋組織の筋肉体積と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、あるいは、それ以上である。筋肉体積は、磁気共鳴撮像（例えば、筋肉体積／断面積（ＣＳＡ）ＭＲＩ方法による）によるなど筋肉の断面積を評価することにより随意に測定される。
筋緊張性ジストロフィーは２つの主要な型：筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）および筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）を含む多全身系神経筋である。ＤＭ１は、遺伝子ＤＭプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）中での優勢遺伝性の「ＣＴＧ」反復拡張によって引き起こされ、これは、ｍＲＮＡへ転写されるとき、タンパク質のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ－ｌｉｋｅ（ＭＢＮＬ）ファミリーに高い親和性で結合するヘアピンを形成する。ＭＢＮＬタンパク質は、転写後のスプライシングに関与し、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｎ）部位の制御とＭＢＮＬタンパク質機能の喪失は、核病巣の下流蓄積に結びつき、ミススプライシング事象を増加させ、その後、筋緊張症と他の臨床症状を引き起こす。
いくつかの実施形態において、被験体の筋萎縮症あるいは筋緊張性ジストロフィーを処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子、あるいは、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。いくつかの例では、筋萎縮症は悪液質（例えば、癌性悪液質）、除神経、ミオパシー、運動ニューロン疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患、うっ血性心不全、慢性腎不全、慢性感染症、敗血症、空腹時、サルコペニア、グルココルチコイド誘導性萎縮、廃用あるいは宇宙飛行に関連するか、および／またはこれらによって引き起こされる。場合によっては、筋緊張性ジストロフィーはＤＭ１である。
悪液質
悪液質は、基礎疾患によって引き起こされる筋肉の後天性の加速度的低下である。いくつかの例では、悪液質は、栄養では回復させることができない体重の喪失を指し、一般的には、基礎疾患、例えば、癌、ＣＯＰＤ、ＡＩＤＳ、心不全などに関連付けられる。悪液質が末期癌の患者で見られるとき、それは「癌性悪液質」と呼ばれる。癌性悪液質は、進行癌の患者の大部分に影響を与え、処置耐性、治療に対する反応、生活の質、および生存期間の減少に関連付けられる。いくつかの例では、癌性悪液質は、体脂肪量の喪失を伴ってまたは伴わずに、骨格筋量の進行中の喪失を特徴とする他因子症候群として定義され、従来の栄養学的なサポートでは完全には回復できず、進行性の機能障害を引き起こしかねない。場合によっては、骨格筋の喪失は、癌性悪液質で最も有意な事象であると思われる。加えて、癌性悪液質の分類は、診断基準が、体重減少が悪液質のプロセスのシグナル事象であることだけでなく、患者の当初の蓄え、低いＢＭＩあるいは低レベルの筋肉質も考慮されなければならないと提唱している。
いくつかの実施形態において、被験体の悪液質に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子、あるいは、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。追加の実施形態において、被験体の癌性悪液質に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子、あるいは、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
除神経
除神経は、臓器と中枢神経系の間の神経線維の部分的あるいは完全な遮断を伴う末梢性の運動ニューロンに対する損傷であり、神経伝導と運動ニューロン発火の遮断を引き起こし、順に、骨格筋の収縮性（ｃｏｎｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ ）を妨げる。神経機能のこの喪失は、運動ニューロン単位全体の喪失により局在化または一般化される。骨格筋が収縮できないと、筋萎縮症が引き起こされる。いくつかの例では、除神経は、変性、代謝性、あるいは炎症性の神経障害（例えば、ギランバレー症候群、末梢神経障害、あるいは環境毒物あるいは薬物への暴露）に関連付けられ、あるいはこれらの結果として関連付けられる。さらなる例では、除神経は肉体損傷、例えば、外科手術に関連付けられる。
いくつかの実施形態において、被験体の除神経に関連付けられる、あるいは除神経によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、被験体の除神経に関連付けられる、あるいは除神経によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
ミオパシー
ミオパシーは筋肉の疾患を記載する総称である。いくつかの例では、ミオパシーは筋緊張症；先天性ミオパシー、例えば、ネマリンミオパシー、マルチコア／ミニコアミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシー；ミトコンドリアミオパシー；家族性周期性四肢麻痺；炎症性ミオパシー；例えば、グリコーゲンまたは脂質蓄積疾患によって引き起こされた代謝性ミオパシー；皮膚筋炎；多発性筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症；および、ミオグロビン尿症を含む。いくつかの例では、ミオパシーは、デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張性、顔面肩甲上腕型、エメリ・ドレフュス型、眼咽頭型、肩甲上腕骨型、肢帯型、福山型、先天性筋ジストロフィー、あるいは遺伝的な遠位型ミオパシーなどの筋ジストロフィー症候群によって引き起こされる。いくつかの例では、ミオパシーは筋緊張性ジストロフィー（例えば、筋緊張性ジストロフィー１型あるいはＤＭ１）によって引き起こされる。いくつかの例では、ミオパシーはＤＭ１によって引き起こされる。
いくつかの実施形態において、被験体のミオパシーに関連付けられる、あるいはミオパシーによって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、被験体のミオパシーに関連付けられる、あるいはミオパシーによって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
運動ニューロン疾患
運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、運動ニューロン（身体の随意筋を制御する細胞）に影響を与える神経異常を包含する。例示的な運動ニューロン疾患は、限定されないが、成人の運動ニューロン疾患、乳児脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄性筋萎縮症、多焦点伝導ブロックによる自己免疫性のモーター神経障害、脳卒中あるいは脊髄損傷による麻痺、または外傷による骨格の固定化を含む。
いくつかの実施形態において、被験体の運動ニューロン疾患に関連付けられる、あるいは運動ニューロン疾患によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の運動ニューロン疾患に関連付けられる、あるいは運動ニューロン疾患によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
糖尿病
糖尿病（真性糖尿病、ＤＭ）は、１型糖尿病、２型糖尿病、３型糖尿病、４型糖尿病、二重糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、妊娠性糖尿病、新生児真性糖尿病（ＮＤＭ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ウルフラム症候群、アルストレーム症候群、糖尿病前症、あるいは尿崩症を含む。非インスリン依存性糖尿病とも呼ばれる２型糖尿病は、すべての糖尿病症例の９５％を占める最も一般的な型の糖尿病である。いくつかの例では、２型糖尿病は、膵臓のβ細胞機能障害によるインスリン抵抗性を含む因子の組み合わせによって引き起こされ、これは高血圧グルコース濃度に結びつく。場合によっては、グルカゴンレベルの増加が肝臓を刺激して、異常な量の必要のないグルコースを生成させ、これが高血圧グルコース濃度の原因となる。
インスリン依存性糖尿病とも呼ばれる１型糖尿病は、すべての糖尿病症例の約５％から１０％を含む。１型糖尿病は、Ｔ細胞が膵臓中のインスリン産生β細胞を攻撃して破壊する自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、１型糖尿病は遺伝子と環境要因によって引き起こされる。
４型糖尿病は、６５歳以上の糖尿病患者の約２０％に影響を与える最近発見された型の糖尿病である。いくつかの実施形態において、４型糖尿病は、年齢に関連するインスリン耐性を特徴とする。
いくつかの実施形態において、３型糖尿病は、脳におけるインスリン耐性を結果としてもたらすアルツハイマー病の用語として使用される。
いくつかの実施形態において、被験体の糖尿病に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子、あるいは、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。追加の実施形態において、被験体の癌糖尿病に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子、あるいは、本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
慢性閉塞性肺疾患
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、長期的な呼吸障害と空気の流れの悪さを特徴とする閉塞性肺疾患の一種である。慢性気管支炎と気腫は２つの異なる型のＣＯＰＤである。いくつかの例では、被験体において、ＣＯＰＤ（例えば、慢性気管支炎または気腫）に関連するか、あるいは、これにより誘導される、筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態では、被験体において、ＣＯＰＤ（例えば、慢性気管支炎または気腫）に関連するか、あるいは、これにより誘導される、筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
肝疾患
肝疾患（あるいは肝臓病）は、線維症、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝、遺伝性疾患、あるいは原発性肝癌を含む。いくつかの例では、被験体の肝疾患に関連付けられる、あるいは肝疾患によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の肝疾患に関連付けられる、あるいは肝疾患によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
うっ血性心不全
うっ血性心不全は、心臓が身体の組織に対して十分な血液と酸素を送ることができない状態である。いくつかの例では、被験体のうっ血性心不全に関連付けられる、あるいはうっ血性心不全によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体のうっ血性心不全に関連付けられる、あるいはうっ血性心不全によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
慢性腎不全
慢性腎不全または慢性腎臓病は、時間の経過とともに腎臓機能が徐々に失われていくことを特徴とする疾病である。いくつかの例では、被験体の慢性腎不全に関連付けられる、あるいは慢性腎不全によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の慢性腎不全に関連付けられる、あるいは慢性腎不全によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
慢性感染症
いくつかの実施形態において、ＡＩＤＳなどの慢性感染症はさらに、筋萎縮症を引き起こす。いくつかの例では、被験体において、慢性感染症（例えば、ＡＩＤＳ）に関連するか、あるいは、これにより誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体において、慢性感染症（例えば、ＡＩＤＳ）に関連するか、あるいは、これにより誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
敗血症
敗血症は、組織損傷、臓器機能不全、および／または死亡に結びつく感染症に対する免疫応答である。他の実施形態において、被験体の敗血症に関連付けられる、あるいは敗血症によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の敗血症に関連付けられる、あるいは敗血症によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
絶食
絶食は、一定の期間、一部のあるいはすべての食物、飲み物、あるいはその両方を自発的に断つこと、あるいは、減らすことである。他の実施形態において、被験体の絶食に関連付けられる、あるいは絶食によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の絶食に関連付けられる、あるいは絶食によって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
サルコペニア
サルコペニアとは、数ヶ月から数年にわたって徐々に筋肉量や筋力が低下していくことを特徴とする、通常の老化の過程における筋萎縮症の継続的なプロセスである。通常の老化プロセスは、骨格筋神経変性を促す障害および疾患の存在によって影響を受けないし加速されない老化作用を本明細書では意味する。
いくつかの実施形態において、被験体のサルコペニアに関連付けられる、あるいはサルコペニアによって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体のサルコペニアに関連付けられる、あるいはサルコペニアによって誘導される筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
グルココルチコイドに関連する筋萎縮症
いくつかの実施形態において、グルココルチコイドを用いる処置はさらに、筋萎縮症を引き起こす。例示的なグルココルチコイドは、限定されないが、コルチゾール、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンを含む。
いくつかの実施形態において、被験体のグルココルチコイドに関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体のグルココルチコイドに関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
廃用に関連する筋萎縮症
廃用に関連する筋萎縮症は、四肢が固定される結果として生じる（例えば、四肢または関節の骨折、あるいは殿部または膝の置換外科療法などの整形手術による）。本明細書で使用されるように、「固定」あるいは「固定された」とは、長期間（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、あるいはそれ以上）、四肢、筋肉、骨、腱、関節、あるいは他の身体部分の運動の部分的あるいは完全な制約を指す。いくつかの例では、固定化の期間は、入浴、外部装置の交換、外部装置の調整など、短期間または短時間の拘束されない動きを含む。四肢の固定化は、限定されないが、装具、スリング、ギプス、包帯、およびスプリント（これらはのいずれも随意に、限定されないが、布、ガーゼ、ガラス線維、プラスチック、石膏、または金属を含む硬質材料または軟質材料で構成される）を含む任意の様々な外部装置と、外科的に移植されたスプリント、プレート、装具などを含む任意の様々な内部装置によって実施される。四肢の固定化の文脈において、動きの制約は、単関節または多関節（例えば、肩関節または股関節などの単関節、橈骨手根関節などの複合関節、および、限定されないが、以下の１つ以上を含む、膝関節などの複関節：手の関節、肩関節、肘関節、手首の関節、補助関節、胸鎖関節、椎骨の関節、顎関節、仙腸関節、股関節、膝関節、および足の関節）、単一の腱または靭帯、あるいは複数の腱または靭帯（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：前十字靱帯、後十字靱帯、回旋腱板腱、肘と膝の内側側副靱帯、手の屈筋腱、足首の外側靱帯、顎または顎関節の腱と靭帯）、単一の骨あるいは複数の硬骨（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：頭蓋、下顎、鎖骨、肋骨、橈骨、尺骨、上腕骨、骨盤、仙骨、大腿骨、膝蓋骨、指骨、手根骨、中手骨、足根骨、中足骨、腓骨、脛骨、肩甲骨、および椎骨）、単一の筋肉あるいは複数の筋肉（例えば、限定されないが、以下の１つ以上を含む：広背筋、僧帽筋、三角筋、胸筋、二頭筋、三頭筋、外腹斜筋、腹筋、大殿筋、大腿屈筋、四頭筋、腓腹筋、および横隔膜）；一本の四肢または複数の四肢、腕と脚の１つ以上）、あるいは、骨格筋系全体またはその一部（例えば、全身ギプスあるいはスパイカギプスの場合）を含む。
いくつかの実施形態において、被験体の廃用に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子を被験体に投与する工程を含む。他の実施形態において、被験体の廃用に関連する筋萎縮症を処置する方法が本明細書に記載され、当該方法は、治療上有効な量の本明細書に記載されるポリ核酸分子抱合体を被験体に投与する工程を含む。
医薬製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、直腸、または経皮の投与経路を含む複数の投与経路によって、被験体に投与される。いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、大脳内、脳室内、あるいは頭蓋内）投与のために製剤化される。他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。また他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は、経鼻投与のために製剤化される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、限定されないが、水性分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル、丸剤、遅延放出製剤、拡張放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および、即時放出と制御放出の混合製剤を含む。
いくつかの例では、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例では、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、あるいは脂質を含む。場合によっては、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、あるいはミセル溶液を含む。さらなる例示的なナノ粒子としては、限定されないが、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットが挙げられる。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびこれらの組み合わせ、その合金またはオキシドのナノ粒子である。
いくつかの例では、ナノ粒子は、コア、あるいは、コアシェルナノ粒子におけるように、コアとシェルを含む。
いくつかの例では、ナノ粒子は、（例えば、本明細書に記載されるポリ核酸分子または結合部分の１つ以上との）機能要素の結合のために分子でさらにコーティングされる。いくつかの例では、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（あるいはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、α－キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンあるいはシクロデキストリンを含む。いくつかの例では、ナノ粒子はグラフェンコーティングされたナノ粒子を含む。
場合によっては、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、あるいは１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有する。
いくつかの例では、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合する。いくつかの例では、本明細書に記載される少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、あるいはそれ以上のポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に結合する。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、送達ベクター、例えば、細胞へのポリ核酸分子の送達のための組換えベクターを含む。いくつかの例では、組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。他の例において、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、あるいはアルファウイルスに由来したベクターを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞中での安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターが使用される。
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、本明細書で開示される組成物との適合性ならびに所望の投与形態の放出プロフィール特性に基づいて選択された担体または担体材料を含む。例示的な担体物質としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、加湿剤、希釈剤などが含まれる。薬学的に適合可能な担体材料としては 限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロース抱合体、糖ステアロイル乳酸ナトリウム（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどが挙げられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５）； Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５； Ｌｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ． （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照。
いくつかの例では、医薬製剤はさらに、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および、塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、ならびに、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、ｐＨ調節剤または緩衝剤をさらに含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持するのに必要な量で含まれる。
いくつかの例では、医薬製剤は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含む。こうした塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または重亜硫酸塩のアニオンを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。
いくつかの例では、医薬製剤は、より安定した環境を提供することから、化合物を安定させるために使用される希釈剤をさらに含む。限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水を含む緩衝液中に溶解した塩（ｐＨの制御あるいは維持ももたらす）が、当該技術分野の希釈剤として利用される。特定の例において、希釈剤は、組成物の大きさを増大させて、圧縮を促進するか、またはカプセル充填のための均質な混合のために十分な大きさ（ｂｕｌｋ）を作り出す。そのような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水乳糖、噴霧乾燥したラクトース；α化デンプン、Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮可能な糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセタート・ステアラート、スクロース系の希釈剤、粉砂糖；一塩基の硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストラート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）；加水分解したシリアル固形物、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
場合によっては、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を促進するための崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）または崩壊物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を含む。用語「崩壊する」は、胃腸液と接触した際の剤形の溶解および分散の両方を含む。崩壊剤の例は、デンプン、例えば、天然のデンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン、α化デンプン、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ １５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）、またはナトリウムデンプングリコラート、例えば、Ｐｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、セルロース、例えば、木製品、メチル結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎ Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標））、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ－Ｄｉ－Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、または架橋クロスカルメロースの架橋デンプン、例えば、ナトリウムデンプングリコラート、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、例えばアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸の塩、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、ゴム、例えば、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、またはトラガカント、ナトリウムデンプングリコラート、ベントナイト、天然のスポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類のパルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプンを組み合わせたラウリル硫酸ナトリウムなどを含む。
いくつかの例では、医薬製剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの充填剤を含む。
潤滑剤と滑剤も、材料の癒着あるいは摩擦を防ぎ、減少させ、阻害するための本明細書に記載される医薬製剤に随意に含まれる。典型的な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウム・ステアリル・フマラート、鉱油などの炭化水素、水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高級脂肪酸、およびアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ－４０００）またはメトキシポリエチレン・グリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
可塑剤は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化することでそれらの脆さを抑えるために使用される化合物を含む。適切な可塑剤は、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチンを含む。可塑剤は、分散剤または湿潤剤としても機能する。
可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００－６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
安定剤は、任意の抗酸化剤、緩衝液、酸、防腐剤などの化合物を含む。
懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、あるいは、ポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００から約６０００まで、約３３５０から約４０００まで、または約７０００から約５４００までの分子量を有する）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースステアリン酸アセテート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタンゴムを含むキサンタン、糖、セルロース系、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの、化合物を含む。
界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン・ソルビタンモノオレート、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。付加的な界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油（例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油）；および、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０などを含む。しばしば、界面活性剤は、物理的安定性を高めるために、または他の目的のために含まれる。
粘度増強剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサン、およびこれらの組み合わせを含む。
湿潤剤は、オレイン酸、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ドクサートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
治療レジメン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１日に一回、１日に２回、１日に３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、月２週間、月３週間、月１回、月２回、月３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の医薬組成物は同時に、連続して、またはある時間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は同時に投与される。場合によっては、１つ以上の医薬組成物は連続して投与される。さらなる場合には、１以上の医薬組成物は、ある時間間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１の投与は１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に少なくとも１、２、３、４、５日またはそれ以上の間隔を空ける）。
いくつかの実施形態において、２つ以上の様々な医薬組成物が同時投与される。いくつかの例では、２以上の異なる医薬組成物が同時に投与される。場合によっては、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間の間隔なく連続して同時投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日の間隔をおいて連続して投与される。
患者の状態が改善している場合、医者の判断で、組成物の投与は継続的に行われ；代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減少されるか、または特定の期間の間一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。いくつかの例では、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日～１年の間で変わる。休薬日中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％を含む、１０％～１００％である。
いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持量が投与される。その後、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、改善された疾患、障害、または疾病が保持されるレベルにまで減少可能である。
いくつかの実施形態では、このような量に対応する所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要としている被験体または宿主の性質（例えば、体重）などの要因に左右されるが、それにもかかわらず、例えば、投与されている具体的な薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主を含む、症例を取り囲む特定の環境に従って、当該技術分野で既知の方法で日常的に判定される。いくつかの例では、所望の投与量は一回量で、あるいは、同時に（または短時間にわたって）、あるいは適切な間隔を置いて投与された分割量、例えば、１日当たり２、３、あるいは４以上の分割用量（ｓｕｂ－ｄｏｓｅｓ）として、都合よく提示される。
個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値から大きく逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患または疾病、投与の様式、個々の被験体の必要条件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断を含む、多くの変数に依存して変更される。
いくつかの実施形態において、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（母集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤化するのに使用される。こうした化合物の投与量は、最小限の毒性を備えるＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に位置するのが好ましい。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わる。
キット／製品
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の組成物と方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は、本明細書中に記載されている方法を使用するための別個の要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。
例えば、容器は、本明細書に記載される標的核酸分子を含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
キットは典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベルと、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
１つの実施形態では、ラベルが容器上にあるか容器に付随する。一実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるか、あるいは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取付けられる。ラベルは、例えば、添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために使用される。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物の使用方法も示している。
ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供された化合物を含む１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置で提示される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書が添付してある。一実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、処方薬または承認された添付文書に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。一実施形態において、適合する製薬担体で製剤化される本明細書で提供される化合物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベル付けされる。
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、主題が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は例示的かつ説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
本明細書で使用されるように、範囲と量は「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。
本明細書で使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を制限するものと解釈されてはならない。
本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に制限されない。
「治療上有効な量」との用語は、哺乳動物の被験体において所望の治療効果を提供するのに十分なポリ核酸分子抱合体の量を指す。場合によっては、その量は、障害または再発性障害の少なくとも１つの症状を処置するため、予防するため、その発症を予防するため、上記症状を治癒するため、遅らせるため、その重症度を軽減するため、改善するため、あるいは、そのような治療のない場合に予想される以上に患者の生存期間を延長するために、患者（ヒトなど）への単回または複数回の投与量である。当然、治療上有効な量を提供するために使用される特定のポリ核酸分子抱合体の投与量レベルは、損傷の種類、被験体の年齢、体重、性別、被験体の病状、疾病の重症度、投与経路、および使用される特定の阻害剤に依存して変化する。いくつかの例では、治療上有効な量のポリ核酸分子抱合体は、本明細書に記載されたように、細胞培養物と動物モデルから最初に評価される。例えば、細胞培養方法で決定されたＩＣ５０値は随意に、動物モデル中の出発点として役立ち、その一方で、動物モデルで決定されたＩＣ５０値はヒトにおける治療上有効な量を見つけるために随意に使用される。
骨格筋あるいは随意筋は通常、腱によって骨へ固定され、移動あるいは姿勢を維持する際など骨格の動きをもたらすために通常使用される。骨格筋の複数の制御は一般的に無意識の反射（例えば、姿勢筋または横隔膜）として維持されるが、骨格筋は意識的な制御に反応する。平滑筋あるいは不随意筋は、食道、胃、腸、子宮、尿道、および血管などの臓器や構造の壁内で見られる。
骨格筋は、２つの広範な型：Ｉ型（あるいは「遅い収縮」）とＩＩ型（あるいは「速い収縮」）にさらに分類される。Ｉ型筋線維は毛細管で密集しており、ミトコンドリアとミオグロビンに富んでいて、このことがタイプＩの筋組織に特徴的な赤色を与えている。場合によっては、Ｉ型筋線維はより多くの酸素を運び、脂肪または炭水化物を燃料に使用して有酸素活動を維持する。Ｉ型筋線維は長時間、ただしわずかな力で収縮する。ＩＩ型筋線維は、収縮性のある速度と生じた力で異なる３つの主要な亜型（ＩＩａ、ＩＩｘ、およびＩＩｂ）へさらに細分される。ＩＩ型筋線維は、速く力強く収縮するが急速に疲労し、したがって、筋収縮が痛くなる前に、ごく短時間の集中的な無酸素活動をもたらす。
骨格筋とは異なり、平滑筋は意識的な制御下にはない。
心筋も不随意筋であるが、構造が骨格筋と非常によく似ていて、心臓でのみ見られる。心筋と骨格筋は、それらが高度な規則的配列の束に詰められているサルコメアを含むという点で条線がある。対照的に、平滑筋細胞の筋原線維はサルコメアで配されておらず、したがって、条線がない。
筋細胞は、筋組織に寄与するあらゆる細胞を包含する。例示的な筋細胞は、筋芽細胞、衛星細胞、筋管、および筋原線維組織を含む。
本明細書で使用されるように、筋力は断面積（ＣＳＡ）に比例し、筋肉速度は筋線維長さに比例する。したがって、様々な種類の筋肉間の断面積と筋線維の比較は、筋萎縮症の兆候を提供することができる。筋力および筋肉重量を測定するのに様々な方法が当該技術分野で知られており、例えば、“Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ： Ｊｏｉｎｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎｕａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ” ｂｙ Ｈａｚｅｌ Ｍ． Ｃｌａｒｋｓｏｎ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２０００」を参照。計算された横断断層撮影による選択された筋組織の断層画像の生成と音波検査評価は、筋力を測定するさらなる方法である。
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
実施例１．ｓｉＲＮＡ配列および合成
標準的なホスホロアミダイト化学を使用して固相上ですべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。すべてのｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖は、鎖の各末端にひとつある、Ｃ６－ＮＨ２および／またはＣ６－ＳＨといった様々なフォーマットの抱合ハンドルを含む。抱合ハンドルまたは複数の抱合ハンドルは、逆脱塩基ホスホジエステルまたはホスホロチオエートを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続される。以下は、インビボ実験で使用されるフォーマットの代表的な構造である。
ｓｉＲＮＡの代表的な構造は、パッセンジャー鎖の５’末端にＣ６－ＮＨ２抱合ハンドル、および３’末端にＣ６－ＳＨを備えている。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－ＮＨ２抱合ハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＰＥＧを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－ＮＨ２抱合ハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－Ｎ－ＳＭＣＣ抱合ハンドルと３’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造は、５’末端にＰＥＧと３’末端にＣ６－ＳＨを有する。
ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造は、５’末端にＣ６－Ｓ－ＮＥＭと３’末端にＣ６－ＮＨ２抱合ハンドルを有する。
コレステロール－ミオスタチンｓｉＲＮＡ抱合体
ガイド／アンチセンス鎖の配列は、ＭＳＴＮ（ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）のマウスｍＲＮＡの転写産物に対して塩基位置１１６９で始まる遺伝子配列に相補的であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、図１で以下に記載されるように結合した５’コレステロールを含んでいた。
実施例２．一般的な実験プロトコルおよび材料
動物
動物研究は、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」と同様にＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ で概説された規則を厳守する、Ｅｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に基づくプロトコルに従って行われた。マウスはすべて、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのいずれかから入手した。
野生型ＣＤ－１マウス（４－６週齢）に、指示されたＡＳＣ（あるいは、抗体核酸抱合体）および投与量で静脈内（ｉｖ）注射によって投薬した。
抗トランスフェリン受容体抗体
抗マウストランスフェリン受容体抗体あるいはＣＤ７１ ｍＡｂは、マウスＣＤ７１またはマウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）に結合するラットＩｇＧ２ａサブクラスモノクローナル抗体である。抗体はＢｉｏＸｃｅｌｌによって産生され、市販で入手可能である（カタログ＃ ＢＥ０１７５）。
ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体
ＢｉｏＸｃｅｌｌ（クローン２Ａ３、カタログ＃ ＢＥ００８９）からラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体を購入した。この抗体はトリニトロフェノールに特異的であり、マウス中で既知の抗原を持っていない。
抗ＥＧＦＲ抗体
抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して配向された完全なヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＪＴ３３において産出され、ハイブリドーマ細胞株（２Ｆ８）を産出するヒト抗ＥＧＦＲ抗体由来の抗体遺伝子を運ぶＧＳベクターでのトランスフェクションによってＣＨＯ細胞株ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶから導かれたものである。標準的な哺乳動物細胞の培養および精製の技術が抗ＥＧＦＲ抗体の製造に利用される。
グリカンのない抗ＥＧＦＲ抗体の理論上の分子量（ＭＷ）は１４６．６ｋＤａである。抗体の主要なグリコシル化されたアイソフォームの実験的なＭＷは、質量分析法によって判定されるように１４９ｋＤａである。還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用すると、軽鎖のＭＷはおよそ２５ｋＤａであり、重鎖のＭＷはおよそ５０ｋＤａであることが分かった重鎖は２つの鎖間のジスルフィド結合によって互いに接続され、１つの軽鎖は単一の鎖間ジスルフィド結合によって各重鎖に結合する。軽鎖は２つの鎖間ジスルフィド結合を有し、重鎖は４つの鎖間ジスルフィド結合を有する。抗体は、Ｎ－アセチル－グルコサミン、マンノース、フコース、およびガラクトースからなるグリカンを備えた重鎖のＡｓｎ３０５でＮ－結合され、グリコシル化される。存在する支配的なグリカンは、０または１つの末端ガラクトース残基を含むフコシル化された二分岐の構造である。
ＩｇＧ１κ抗体の荷電アイソフォームパターンは、画像化されたキャピラリーＩＥＦ、アガロースＩＥＦ、および分析的陽イオン交換ＨＰＬＣを使用して調べられた。多くの荷電アイソフォームが見つかり、主なアイソフォームはおよそ８．７の等電点を持つ。
抗ＥＧＦＲ抗体の主な作用機構は、Ａ４３１癌細胞におけるＥＧＦで誘導されたＥＧＦＲリン酸化の濃縮依存性阻害である。加えて、低い抗体濃度での抗体依存性細胞媒介性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）の誘導が、前臨床的細胞のインビトロでの研究において観察された。
ｓｉＲＮＡの能力と有効性のインビトロ評価
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ｖ／ｖＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中で育てた。トランスフェクションについては、細胞を２４ウェルプレートに１０．０００細胞／ウェルの密度で蒔き、２４時間以内にトランスフェクトした。Ｃ２Ｃ１２筋管は、３－４日間２％ｖ／ｖウマ血清で補充したＤＭＥＭ中でコンフルエントなＣ２Ｃ１２筋芽細胞培養物をインキュベートにより、生成された。分化中と分化後に、培地を毎日交換した。あらかじめ分化させた初代ヒト骨格筋細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手し、メーカーによる推奨に従って２％ｖ／ｖウマ血清を有するＤＭＥＭ中に蒔いた。ヒトＳＪＣＲＨ３０横紋筋肉腫筋芽細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ｖ／ｖの熱で不活性化したウシ胎児血清、４．５ｍｇ／ｍＬグルコース、４ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムで補充したＤＭＥＭ中で育てた。トランスフェクションについては、細胞を２４ウェルプレートに１０．０００－２０．０００細胞／ウェルの密度で蒔き、２４時間以内にトランスフェクトした。すべての細胞を、メーカーの推奨に従ってＲＮＡｉＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、の様々な濃度のｓｉＲＮＡｓ（０．０００１－１００ｎＭ；１０倍の希釈）でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、２日間３７°Ｃで５％ＣＯ２中でインキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、３００ｕｌのＴＲＩｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で収穫し、－８０°Ｃで保存した。ＲＮＡはＺＹＭＯ ９６ウェルＲＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して調製され、相対的なＲＮＡ発現レベルは市販のＴａｑＭａｎプローブ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化された。発現データはＰｐｉｂ発現に正規化された□□ＣＴ方法を使用して分析され、偽トランスフェクトされた細胞に対する％ＫＤとして提示される。データは、３つのパラメータ用量反応阻害機能（ＧｒａｐｈＰａｄプリズム７．０２）を使用して、非線形回帰によって分析された。すべてのノックダウン結果は、これらの実験条件下で観察された最大のＫＤを提示している。
ミオスタチンＥＬＩＳＡ
血漿中のミオスタチンタンパク質は、メーカーの説明書に従ってＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ のＧＤＦ－８（ミオスタチン）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ｐａｒｔ＃ ＤＧＤＦ８０）を使用して定量化された。
ＲＩＳＣローティングアッセイ
組織溶解物からのＲＩＳＣの特定の免疫沈降と、免疫沈殿物中の小型ＲＮＡの定量化は、Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． ＲＮＡ （２０１０）， １６：２５５３－２５６３によって記載されたアッセイの適応物を使用して、ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＰＣＲを決定された。
実施例３．抱合体合成
以下の構造は、本明細書に記載される例示的なＡ－Ｘ１－Ｂ－Ｘ２－Ｙ（式Ｉ）構造を例証する。
構造－１：抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－Ｓ－５’－パッセンジャー鎖。この抱合体は、パッセンジャー鎖の５’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体の鎖間システイン抱合によって生成された。
構造－２：抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－Ｓ－３’－パッセンジャー鎖。この抱合体は、パッセンジャー鎖の３’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体の鎖間システイン抱合によって生成された。
ＡＳＣ構造－３：抗体－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖。この抱合体は、パッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する抗体の鎖間システイン抱合によって生成された。
ＡＳＣ構造－４：Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖のモデル構造。この抱合体は、パッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対するＦａｂの鎖間システイン抱合によって生成された。
ＡＳＣ構造－５：１つの抗体分子に結合した２つの異なるｓｉＲＮＡｓを有する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体のモデル構造。この抱合体は、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端のビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対して還元されたｍＡｂ鎖間システインへＳＳＢとＨＰＲＴのｓｉＲＮＡｓの混合物を結合することによって生成された。
ＡＳＣ構造－６：結合した２つの異なるｓｉＲＮＡｓを有する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体のモデル構造。この抱合体は、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端のマレイミド（ＳＭＣＣ）リンカーに対して還元されたｍＡｂ鎖間システインへＳＳＢとＨＰＲＴのｓｉＲＮＡｓの混合物を結合することによって生成された。実施例３．１ ＳＭＣＣリンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の鎖間のジスルフィド還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡまたはＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－ＮＨＣＯ－ＰＥＧ－ＸｋＤａ（２当量）の溶液に加え（Ｘ＝０．５ｋＤａ～１０ｋＤａ）、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、実施例３．４に記載されるような陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ＞２の抗体－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、ＳＥＣ、ＳＡＸクロマトグラフィー、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥにより特徴化した。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２または陰イオン交換クロマトグラフィー方法－３のいずれかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。両方の方法は実施例３．４に記載されている。単離されたＤＡＲ１抱合体は典型的には、分析的ＳＡＸ方法上で９．０±０．３分で溶出され、９０％を超える純度である。典型的なＤＡＲ＞２のシステイン抱合体は、８５％を超えるＤＡＲ２および１５％未満のＤＡＲ３を含んでいる。
図２はＴｆＲ ｍＡｂ－（Ｃｙｓ）－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５ｋ、ＤＡＲ１のＳＡＸ ＨＰＬＣクロマトグラムを例証する。
図３はＴｆＲ ｍＡｂ－（Ｃｙｓ）－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５ｋ、ＤＡＲ１のＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムを例証する。
実施例３．２．ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを加え、ＲＴで２時間回転させた。結果として生じる反応混合物を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳで交換し、ＲＴで５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＢｉｓＭａｌ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－Ｓ－ＮＥＭ（２当量）の溶液に加え、４０°Ｃで一晩維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
分離された抱合体を、質量スペクトルまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥのいずれかにより特徴化した。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２とサイズ排除クロマトグラフィー方法－１のいずれかを使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。
図４は、ＴｆＲ１ｍＡｂ－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ抱合体のＤＡＲ１とＤＡＲ２のＳＡＸ ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを例証する。
図５は、ＴｆＲ１ｍＡｂ－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ抱合体のＤＡＲ１とＤＡＲ２のＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを例証する。
実施例３．３．ｍＡｂからのＦａｂ’生成とｓｉＲＮＡへの抱合
工程１：ペプシンによる抗体消化
抗体を、ｐＨ４．０、２０ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液で緩衝液交換し、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。固定されたペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｒｏｄ＃２０３４３）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。反応混合物を、３０ｋＤａのＭＷＣＯ ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびｐＨ７．４のＰＢＳを使用して濾過した。残余分を集めて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２を単離した。その後、集めたＦ（ａｂ’）２を、１０当量のＴＣＥＰによって還元し、ｐＨ７．４のＰＢＳにおいて室温でＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧ５と抱合させた。ＳＡＸクロマトグラフィー上での反応混合物の分析は、未反応のＦａｂおよびｓｉＲＮＡ－ＰＥＧと共にＦａｂ－ｓｉＲＮＡの抱合体を示した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－１を使用するＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２ Ｆａｂ－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を分離し、濃縮し、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
工程３：精製された抱合体の分析
単離された抱合体の特徴付けと純度は、ＳＥＣ方法－１と同様に、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２あるいは３を使用する分析的なＨＰＬＣによって評価された。
図６は、ＣＤ７１ Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５のＳＥＣクロマトグラムを例証する。
図７は、ＣＤ７１ Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ＨＰＲＴ－ＰＥＧ５のＳＡＸクロマトグラムを例証する。
実施例３．４．精製と分析方法
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
１．カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
２．溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍＬ／分
３．勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １．００
ｃ．６０ ４０ １８．００
ｄ．４０ ６０ ２．００
ｅ．４０ ６０ ５．００
ｆ．０ １００ ２．００
ｇ．１００ ０ ２．００
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍＬ／分
３．勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１３．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ９０ １０
ｇ．２０．００ ９０ １０
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－３
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；
３．流速：０．７５ｍＬ／分
４．勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．２３．００ ４０ ６０
ｆ．２５．００ ９０ １０
ｇ．３０．００ ９０ １０
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法－１
１．カラム：ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ ＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μＭ
２．移動相：１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液
３．流速：１５分間で１．０ｍｌ／分
実施例４インビトロのスクリーン：アトロジン－１
マウスおよびヒト／ＮＨＰアトロジン－１の調節のためのｓｉＲＮＡｓの特定
実施されたバイオインフォマティクススクリーンは、マウスアトロジン－１（Ｆｂｘｏ３２；ＮＭ＿０２６３４６．３）に特異的に結合する５６のｓｉＲＮＡｓ（１９ｍｅｒｓ）を同定した。加えて、マウスアトロジン－１とヒトアトロジン－１（ＦＢＸＯ３２；ＮＭ＿０５８２２９．３）を標的とする６つのｓｉＲＮＡｓが同定された。ヒト／ＮＨＰアトロジン－１（ＦＢＸＯ３２；ＮＭ＿０５８２２９．３）を特異的に標的とするｓｉＲＮＡｓ（１９ｍｅｒｓ）のためのスクリーンは、５２の候補（表２Ａ～表２Ｂ）をもたらした。すべての選択されたｓｉＲＮＡ標的部位がＳＮＰ（ｐｏｓ．２－１８）を有するわけではない。
表２Ａと２Ｂは、マウスおよびヒト／ＮＨＰアトロジン－１の調節に関する同定されたｓｉＲＮＡ候補を例証する。
トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞、マウスＣ２Ｃ１２筋管、初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化させた筋管、およびヒトＳＪＣＲＨ３０横紋筋肉腫筋芽細胞における選択されたアトロジン－１ ｓｉＲＮＡｓの評価。
マウスアトロジン－１を標的とする６２の同定されたｓｉＲＮＡとヒトアトロジン－１を標的とする５２の同定されたｓｉＲＮＡから、合成と機能分析のために、それぞれ３０と２０のｓｉＲＮＡｓが選択された。これらのｓｉＲＮＡの活性が、トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞、マウスＣ２Ｃ１２筋管、初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化させた筋管、およびヒトＳＪＣＲＨ３０横紋筋肉腫筋芽細胞において分析された。
マウスアトロジン－１を標的とする試験されたｓｉＲＮＡｓのいずれもマウスＣ２Ｃ１２筋管（１０ｎＭ）では有意な活性を示さなかったが、しかしながら、３つのｓｉＲＮＡｓはＣ２Ｃ１２筋芽細胞（表３）において、＞７５％だけ、マウスアトロジン－１ ｍＲＮＡをダウンレギュレートした。対照的に、もっぱらＣ２Ｃ１２筋管（図８）で発現されるＭｕｒｆ１を標的とするｓｉＲＮＡｓは、Ｃ２Ｃ１２筋管では活動的であり、このことは、ｓｉＲＮＡｓがＣ２Ｃ１２筋管にトランスフェクトされうることを実証している。アトロジン－１がＣ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管中で二者択一的にスプライシングされるかどうかを判定するために、アトロジン－１ ｍＲＮＡ中での様々な位置がＲＴ－ｑＰＣＲによって探索されたが、同様の結果をもたらした。ヒトアトロジン－１を標的とする２０の試験されたｓｉＲＮＡｓのなかで、４つだけが＞７５％のＫＤをもたらした。マウスとヒトの両方のアトロジン－１について、活性なｓｉＲＮＡはコード領域内であるいはコード領域近くに局在化される。マウスアトロジン－１（１１７９）を標的とするｓｉＲＮＡｓのうちの１つは、ヒトアトロジン－１と強く交差反応した。このｓｉＲＮＡがマウスＣ２Ｃ１２筋管中で有意な活性を示さなかったが、それは初代ヒト骨格筋細胞の筋管中のヒトアトロジン－１を有効にダウンレギュレートした。すべての効果的なｓｉＲＮＡｓは、サブナノモルの能力でそれぞれの標的をダウンレギュレートした。
表３は、トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞、マウスＣ２Ｃ１２筋管、初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化させた筋管、およびヒトＳＪＣＲＨ３０横紋筋肉腫筋芽細胞における選択されたアトロジン－１ ｓｉＲＮＡｓの活性を例証する。実験手順については、実施例２を参照する。
実施例５．インビトロのスクリーン：ＭｕＲＦ－１
マウスＭｕｒｆ１（Ｔｒｉｍ６３）および／またはヒト／ＮＨＰ ＭｕＲＦ１（ＴＲＩＭ６３）を標的とするｓｉＲＮＡｓの同定
バイオインフォマティクススクリーンが行われ、マウスＭｕｒｆ２（Ｔｒｉｍ５５；ＮＭ＿００１０３９０４８．２）あるいはＭｕｒｆ３（Ｔｒｉｍ５４）からの＞３の配列由来を示すマウスＭｕｒｆ１配列に特異的に結合する５１のｓｉＲＮＡｓ（１９ｍｅｒｓ）を同定した。加えて、マウスＭｕｒｆ１とヒトＭｕＲＦ１（ＴＲＩＭ６３；ＮＭ＿０３２５８８．３）を標的とする９つのｓｉＲＮＡｓが同定された。ヒトとＮＨＰＭｕＲＦ１（ＮＭ＿０３２５８８．３）を特異的に標的とするｓｉＲＮＡｓ（１９ｍｅｒｓ）のスクリーンは、５２の候補（表４Ａ～表４Ｂ）をもたらした。すべての選択されたｓｉＲＮＡ標的部位がＳＮＰ（ｐｏｓ．２－１８）を有するわけではない。
表４Ａと４Ｂは、マウスおよびヒト／ＮＨＰＭｕＲＦの調節に関する同定されたｓｉＲＮＡ候補を例証する。
トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋管および初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化させた筋管における選択されたＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓの活性
マウスＭｕｒｆ１を標的とする６０の同定されたｓｉＲＮＡとヒトＭｕＲＦ１を標的とする２５のｓｉＲＮＡから、それぞれ３５と２５のｓｉＲＮＡｓが合成のために選択された。これらのｓｉＲＮＡｓの活性は、トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋管とあらかじめ分化させた初代ヒト骨格筋細胞（表５）で分析された。マウスＭｕｒＦ１を標的とするｓｉＲＮＡｓのうち、１４がＭｕｒｆ１の＞７０％のノックダウンを表示したが、Ｃ２Ｃ１２筋管ではＭｕｒｆ２とＭｕｒｆ３の＜２０％ノックダウンを示した。これらの１４のｓｉＲＮＡｓの少なくとも６はヒトＭｕＲＦ１と交差反応性であった。ヒトＭｕｒＦ１を標的とする試験されたｓｉＲＮＡのうち、８がＭｕｒｆ１の＞７０％のノックダウンを表示したが、初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化させた筋管ではＭｕｒｆ２とＭｕｒｆ３の＜２０％のノックダウンを示した。これらの８つのｓｉＲＮＡのうちの１つだけが、マウスＭｕｆ１と有意な交差反応性を示した。すべての効果的なｓｉＲＮＡｓは、サブナノモルの能力でそれぞれの標的をダウンレギュレートした。
図５は、トランスフェクトされたマウスＣ２Ｃ１２筋管および初代ヒト骨格筋細胞のあらかじめ分化した筋管における選択されたＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓの活性を例証する。実施例５に記載されるように、細胞を育ててトランスフェクトし、ＲＮＡを単離して分析した。
実施例６．２０１７－ＰＫ－２７９－ＷＴ－ＣＤ７１対ＩｇＧ２Ａアイソタイプ、ＨＰＲＴ対ＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ設計および合成
ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２及び３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。
ＨＰＲＴ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２７）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、３’末端のＣ６－ＮＨ２と５’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。
負の対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（１２）：３４４５－６０）２１量体の二重鎖が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端のＣ６－ＮＨ２と３’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１抱合体が作られ、精製され、および、特徴付けられた。すべての抱合体はシステイン抱合、ＳＭＣＣリンカーを介して作られ、ＰＥＧはＭＳＴＮでは構造１を使用して、および、ＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡではスクランブルｓｉＲＮＡと構造２を使用して、チオールに結合された（実施例３を参照）。表６に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴付けられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボにおいて骨格筋でミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された（図９Ａを参照）。９６時間後、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡノックダウンは比較用のｑＰＣＲアッセイを使用して決定された。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
結果
投与後９６時間に採取された腓腹筋に関して、９０％を超える最大のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回静注投与後に観察された（図９Ｂを参照）。加えて、用量反応も観察され（投与量範囲：０．３～３．０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）、対照群では有意なｍＲＮＡダウンレギュレーションは観察されなかった。
結果
腓腹筋では、ＡＳＣが筋肉特異的遺伝子をダウンレギュレートできることが実証された。ＡＳＣは、ＭＳＴＮ ｍＲＮＡをダウンレギュレートするように意図されたｓｉＲＮＡに結合した抗トランスフェリン抗体で作られた。マウスの腓腹筋はトランスフェリン受容体を発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするために、マウス特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、腓腹筋中で抱合体の蓄積をもたらす。受容体媒介性の取り込みは、ＭＳＴＮ ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例７．表現型ｓｉＲＮＡ設計および合成のための２０１７－ＰＫ－２８９－ＷＴ－ＣＤ７１ ｍＡｂ ＭＳＴＮ時間経過
ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３”）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端のＣ６－ＮＨ２と３’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
負の対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（１２）：３４４５－６０）２１量体の二重鎖が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端のＣ６－ＮＨ２と３’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１抱合体が作られ、および、特徴付けられた。すべての抱合体はシステイン抱合、ＳＭＣＣリンカーを介して作られ、チオールは構造１を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。表７に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴付けられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中のミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１０Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１０Ａを示されるように、血漿と組織サンプルも得られた。筋組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
血漿ミオスタチンレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して判定された。十分な実験の詳細については実施例２を参照する。脚の筋肉領域の変化が判定された：測定する脚を剃毛し、消えないインクを使用して線を引き、測定領域をマークした。マウスを円錐型の拘束具で拘束し、右脚を手で保持した。デジタルノギスを使用して、矢状面で１回の測定を行い、かつ冠状面で別の測定を行った。その処置を１週間に２回繰り返した。
結果
ｓｉＲＮＡの定量化可能なレベルが抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回の静注投与後に筋組織に蓄積した。図１０Ｂを参照。強固なＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが腓腹筋で観察され、これは、結果として、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回静注投与後に、血漿中のＭＳＴＮタンパク質のレベルの低下をもたらした。図１０Ｃと図１０Ｄを参照。～９０％の最大ｍＲＮＡダウンレギュレーションは、投与後７－１４日間に観察された。投与後６週間目に、腓腹筋はおよそ７５％のｍＲＮＡダウンレギュレーションを有しており、これは、ＰＢＳまたは抗トランスフェリン抗体結合スクランブル対照と比較して、血漿タンパクレベルの約５０％の低下に相当した。ＭＳＴＮのダウンレギュレーションは統計的に有意な増加をもたらした。図１０Ｅと図１０Ｆを参照。
結論
この例では、抗トランスフェリン抗体標的化ｓｉＲＮＡ抱合体の単回投与後の様々な筋組織でのｓｉＲＮＡの蓄積が実証された。腓腹筋では、有意かつ永続的なｓｉＲＮＡ媒介性のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが観察された。マウスの腓腹筋はトランスフェリン受容体を発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするために、マウス特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、腓腹筋中で抱合体の蓄積をもたらす。受容体媒介性の取り込みは、ＭＳＴＮ遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例８：２０１７－ＰＫ－２９９－ＷＴ－ＭＳＴＮ Ｚａｌｕ対ＴｆＲ、ｍＡｂ対Ｆａｂ、ＤＡＲ１対ＤＡＲ２ ｓｉＲＮＡ設計と合成
ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端のＣ６－ＮＨ２と３’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＭＳＴＮ＊：ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された、５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の抱合体が作られ、および、特徴付けられた。群１－８と１７－２０は、構造３を使用して、システイン抱合とＢｉｓＭａｌリンカーによって作られた。群９－１６はシステイン抱合、ＳＭＣＣリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造１を使用してＮＥＭ ＰＥＧでエンドキャップされた。表８に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴付けられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中のミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１１Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１１Ａを示されるように、血漿と組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
実施例９：２０１７－ＰＫ－３０３－ＷＴ－用量反応ＭＳＴＮ ｍＡｂ対Ｆａｂ対Ｃｈｏｌ ｓｉＲＮＡ設計および合成
ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端のＣ６－ＮＨ２と３’末端のＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＭＳＴＮ＊：ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された、５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
負の対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（１２）：３４４５－６０）２１量体の二重鎖が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を、負の対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の抱合体が作られ、および、特徴付けられた。群５－１２は、構造３を使用して、システイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーによって作られた。群１３－１６はシステイン抱合、ＳＭＣＣリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造１を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。群１７－２０はシステイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造３を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。表９に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴付けられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中のミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１２Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１２Ａで示されるように、組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
実施例２に記載されるように、細胞内ＲＩＳＣローティングが決定された。
結果
ｓｉＲＮＡの定量化可能なレベル（図１２Ｂを参照）が抗体とＦａｂ ｓｉＲＮＡ抱合体の単回静注投与後に腓腹筋と心臓組織に蓄積した。ＡＳＣが抗トランスフェリン受容体抗体あるいはＦａｂのいずれかを用いて標的とされたときに、強固なＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが腓腹筋で観察された（図１２Ｂおよび図１２Ｃを参照）。はるかに高い濃度のｓｉＲＮＡが心臓組織に送達されたが、これは強固なミオスタチンｍＲＮＡダウンレギュレーションをもたらさなかった。図１２Ｂを参照。コレステロールｓｉＲＮＡ抱合体と比較して、同等のｍＲＮＡダウンレギュレーションを達成するためにはるかに少ない用量のＡＳＣが必要とされた。ＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡガイド鎖のＲＩＳＣローティングの量は、ｍＲＮＡのダウンレギュレーションと相関した。図１２Ｄを参照。
結論
この例では、抗トランスフェリン抗体とＦａｂ標的化ｓｉＲＮＡ抱合体の単回投与後に腓腹筋組織でのｓｉＲＮＡの蓄積が実証された。腓腹筋では、ＤＡＲ１抗トランスフェリン抗体あるいはＦａｂ抱合体によるｓｉＲＮＡ媒介性のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが観察された。マウスの腓腹筋はトランスフェリン受容体を発現し、抱合体はペイロードを標的とするために、マウス特異的な抗トランスフェリン抗体あるいはＦａｂを有し、腓腹筋中で抱合体の蓄積と、ＲＩＳＣ複合体へのローディングをもたらす。受容体媒介性の取り込みはｓｉＲＮＡ媒介性のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションをもたらした。
実施例１０：ＭＳＴＮ表現型ｍＡｂを有する２０１７－ＰＫ－３０４－ＷＴ－ＰＫ対Ｃｈｏｌ ｓｉＲＮＡ設計および合成
ＭＳＴＮ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２６）であった。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
負の対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（１２）：３４４５－６０）２１量体の二重鎖が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖のために使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を、負の対照ｓｉＲＮＡにおいて使用した。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ｓｉＲＮＡ ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の抱合体が作られ、および、特徴付けられた。群５－１２はシステイン抱合、ＳＭＣＣリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造１を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。群１３－１６はシステイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造３を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。表１０に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴付けられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中のミオスタチン（ＭＳＴＮ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１３Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１３Ａで示されるように、組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
実施例２に記載されるように、細胞内ＲＩＳＣローティングが決定された。血漿ＭＳＴＮタンパク質レベルは実施例２に記載されるようなＥＬＩＳＡによって測定された。
脚の筋肉領域の変化が判定された：測定する脚を剃毛し、消えないインクを使用して線を引き、測定領域をマークした。マウスを小さなデカピコン（ｄｅｃａｐｉｃｏｎｅ）バッグで拘束した。デジタルノギスを使用して、矢状面で１回の測定を行い、かつ冠状面で別の測定を行った。その処置を１週間に２回繰り返した。
結果
ｓｉＲＮＡの定量化可能なレベルが、３ｍｇ／ｋｇの抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回静注投与後に、腓腹筋、三頭筋、四頭筋（Ｑｕａｄ）、および心臓組織に蓄積した（図１３Ｄを参照）。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抱合体を有する腓腹筋、四頭筋、および三頭筋でＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが観察されたが、心臓組織では観察されなかった。図１３Ｂを参照。ＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションは、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＭＳＴＮタンパク質の血漿濃度の減少を引き起こした。図１３Ｃを参照。ＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡガイド鎖のＲＩＳＣローティングの量は、ｍＲＮＡのダウンレギュレーションと相関した。図１３Ｅを参照。ＭＳＴＮのダウンレギュレーションは統計的に有意な増加をもたらした。図１３Ｆと図１３Ｇを参照。
結論
この例では、抗トランスフェリン抗体ｓｉＲＮＡ抱合体ＤＡＲ１とＤＡＲ２の単回投与後に腓腹筋、四頭筋、および三頭筋組織中にｓｉＲＮＡが蓄積することが実証された。すべての３つの組織では、ＤＡＲ１とＤＡＲ２抗トランスフェリン抗体抱合体による測定可能なｓｉＲＮＡ媒介性のＭＳＴＮ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが観察された。ｍＲＮＡダウンレギュレーションは、低レベルの血漿ＭＳＴＮタンパク質とｓｉＲＮＡガイド鎖のＲＩＳＣローティングに相関した。すべての３つの筋肉組織はトランスフェリン受容体を発現し、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするために、３特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、腓腹筋中で抱合体の蓄積をもたらす。受容体媒介性の取り込みは、ＭＳＴＮ遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例１１：２０１７－ＰＫ－３５５－ＷＴ複数ｓｉＲＮＡ投薬ｓｉＲＮＡの設計および合成
ＨＰＲＴ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＡＡＡＵＣＵＡＣＡＧＵＣＡＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２７）であった。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、５’のＣ６－ＮＨ２を含んでおり、これは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続されていた。
ＳＳＢ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖を、マウスＭＳＴＮに対して設計した。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＡＣＡＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＵＵＧＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２９）であった。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、５’のＣ６－ＮＨ２を含んでおり、これは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続されていた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ＳｉＲＮＡ抱合体は作られ、特徴付けられた。
群１－４と５－８は、構造３を使用して、システイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーにより、パッセンジャー鎖に３’抱合ハンドルがないように作られた。群１３－１６は、システイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーを介して、パッセンジャー鎖に３’抱合ハンドルがないように作られたが、ＤＡＲ２抱合体は構造物４を使用してＨＰＲＴとＳＳＢのｓｉＲＮＡｓの混合物で作られた。表１１に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴づけられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中の２つのハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴおよびＳＳＢ）のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１４Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１４Ａで示されるように、組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
実施例２に記載されるように、ＲＩＳＣローティングアッセイが実施された。
結果
指定された投与量の抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回静注投与後に、ｍＲＮＡダウンレギュレーションは腓腹筋と心臓組織で観察された。図１４Ｂ－図１４Ｄを参照。２つの異なる遺伝子（ＨＰＲＴとＳＳＢ）を標的とする、２つのＡＳＣの混合物の併用投与は、腓腹筋と心臓組織で両方の標的の効率的なｍＲＮＡダウンレギュレーションをもたらした。加えて、２つの異なるｓｉＲＮＡｓ（ＨＰＲＴとＳＳＢ）の１：１混合物を使用して合成されたＤＡＲ２抱合体の投与は、腓腹筋と心臓組織で両方の標的の効率的なｍＲＮＡダウンレギュレーションも引き起こした。すべての送達アプローチは、腓腹筋組織に蓄積する測定可能な量のｓｉＲＮＡをもたらした。図１４Ｆを参照。
結論
この例では、抗トランスフェリン抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回投与後に腓腹筋と心臓組織でｓｉＲＮＡの蓄積が実証された。２つの遺伝子は、同じ抗トランスフェリン抗体を用いる産生された２つのＡＳＣの併用投与によってダウンレギュレートされたが、２つの異なるｓｉＲＮＡｓ（ＨＰＲＴとＳＳＢ）に結合した。加えて、２つの遺伝子は、２つの異なるｓｉＲＮＡｓ（ＨＰＲＴとＳＳＢ）の１：１混合物を使用して合成された抗トランスフェリンｍＡｂ ＤＡＲ２抱合体によってダウンレギュレートされた。いくつかの例では、１つを超える遺伝子の同時のダウンレギュレーションは筋萎縮症に有用である。
実施例１２：アトロジン－１ ｓｉＲＮＡインビボ（用量反応）ｓｉＲＮＡ設計および合成の２０１７－ＰＫ－３８０－ＷＴ活性
アトロジン－１ ｓｉＲＮＡｓ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ４つの異なる２１量体の二重鎖を、アトロジン－１に対して設計した。配列の詳細については実施例４を参照。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。同じ設計は４つのすべてのｓｉＲＮＡｓに使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ＳｉＲＮＡ抱合体は作られ、および、特徴付けられた。
群１－１６はシステイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造３を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。表１２に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴づけられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋中のアトロジン－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１５Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１５Ａで示されるように、組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
結果
指定された投与量の抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回静注投与後、最大８０％のアトロジン－１ ｍＲＮＡダウンレギュレーションが腓腹筋で観察され、心臓組織では最大で５０％が観察された。図１５Ｂと図１５Ｃを参照。
結論
この例で例示されるように、抗体ｓｉＲＮＡ抱合体は筋肉と心臓でアトロジン－１を示差的にダウンレギュレートする。
実施例１３：ＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡインビボ（用量反応）ｓｉＲＮＡ設計および合成の２０１７－ＰＫ－３８３－ＷＴ活性
ＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓ：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ４つの異なる２１量体の二重鎖を、アトロジン－１に対して設計した。配列の詳細については実施例５を参照。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。同じ設計は４つのすべてのｓｉＲＮＡｓに使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホロチオエート逆脱塩基ホスホロチオエートリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ＡＳＣ合成および特徴付け
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１ ｍＡｂ－ＳｉＲＮＡ抱合体は作られ、および、特徴付けられた。
群１－１６はシステイン抱合、ＢｉｓＭａｌリンカーを介して作られ、遊離チオールは構造３を使用してＮＥＭでエンドキャップされた。表１３に記載されるように、抱合体はクロマトグラフィーで特徴づけられた。
インビボ研究設計
抱合体は、野生型ＣＤ－１マウスにおいてインビボで骨格筋と心筋中のＭｕＲＦ－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、図１６Ａで示される投与量でＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣを用いる静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。図１６Ａで示されるように、組織サンプルも得られた。腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマー及びプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
結果
指定された投与量の抗体ｓｉＲＮＡ抱合体の単回静注投与後、腓腹筋中のＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡは最大７０％までダウンレギュレートし、心臓組織では最大５０％までダウンレギュレートした。図１６Ｂおよび図１６Ｃを参照。
結論
この例で例示されるように、抗体ｓｉＲＮＡ抱合体は筋肉と心臓でＭｕＲＦ－１を示差的にダウンレギュレートする。
実施例１４．
表１４は、筋萎縮症を調節するために例示的なｓｉＲＮＡ（あるいはアトロジーン）標的を例証する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、表１４に記載されるアトロジーンの標的領域にハイブリダイズする。
実施例１５：配列
１つのＤＭＰＫ転写変異体（ＮＭ＿００１２８８７６６）内の２３量体の標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０３－３４０６で割り当てられる。この転写変異体に対する２３量体の標的配列のセットは、一度に１塩基ずつ転写産物の長さを追加する（ｗａｌｋｉｎｇ ｄｏｗｎ）ことにより生成され、標的配列の同様のセットは、同じ処置を用いて他のＤＭＰＫ転写変異体に対して生成され得る。ＤＭＰＫ転写産物中のこれらの部位を標的とするために使用することができる１つの一般的なｓｉＲＮＡ構造は、各鎖の３’末端の２つのオーバーハング（塩基対でない）ヌクレオチドを有する１９量体の十分に相補的な二重鎖である。したがって、２つのヌクレオチドオーバーハングの両方を有する１９量体を加えることにより、標的部位に対する合計２３の塩基が生じる。オーバーハングが、標的転写産物あるいは他のヌクレオチド（例えば、「ＵＵ」などの非関連ジヌクレオチド配列）のそれを反映する配列から構成され得る場合、１９量体の十分に相補的な配列は、各２３量体の標的部位のｓｉＲＮＡを記載するために使用することができる。
ＤＭＰＫ転写産物内の各部位を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖に対する１９量体のセンス配列とアンチセンス配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０７－８８１４で割り当てられる（第１のセンスとアンチセンスの対は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１１１である）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０７－６１１０はセンス鎖を例証する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１１１－８８１４はアンチセンス鎖を例証する。ＤＭＰＫ転写変異体ＮＭ＿００１２８８７６６は、例示のために使用されてきたが、ｓｉＲＮＡ二重鎖の同様のセットは、他のＤＭＰＫ転写変異体を動かす（ｗａｌｋｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ）ことによって生成され得る。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がＡｇｏ２へロードされると、第１の塩基はＡｇｏ２ポケット内で結合し、その一方で、他の塩基（アンチセンス鎖の位置２で始まる）は、相補的なｍＲＮＡ結合のために表示される。「Ｕ」がＡｇｏ２への結合んための熱力学的に好ましい第１の塩基であり、標的ｍＲＮＡに結合しないことから、アンチセンス配列のすべては標的の相補性と特異性に影響を与えることなく第１の塩基に置換される「Ｕ」を有し得る。同様に、センス鎖１９量体（位置１９）の最後の塩基は、アンチセンス鎖の第１位の「Ｕ」と確実に塩基対となるために、「Ａ」に切り替えられる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８１５－１１５１８は、塩基「Ａ」と置換された１９量体のセンス鎖の最後の位置以外のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０７－６１１０に類似する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５１９－１４２２２は、塩基「∪」と置換された１９量体のアンチセンス鎖の最初の位置以外のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１１１－８８１４に類似する。
第１のそれぞれのセンスおよびアンチセンス対合のためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８１５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５１９。
実施例１６：インビトロ活性に関するＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓの選択されたセットの当初のスクリーニング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８１５－１４２２２からのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓの当初のセットは、オンターゲット活性の可能性の最も高く、オフターゲット活性の可能性が最も低くなるように配列を選択することを目的としたバイオインフォマティック分析を用いて、８１のｓｉＲＮＡ配列のリストに絞り込まれた。活動的で特異的なｓｉＲＮＡｓを選択するためのバイオインフォマティック方法は、ＲＮＡｉの分野で十分に記載され、当業者は、他のＤＭＰＫ転写変異体のうちのいずれに対してもＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡ配列の同様のリストを作成することができるであろう。８１の配列のセット中のＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓは、オリゴヌクレオチド合成の文献に記載される標準的な固相合成方法を使用して、小規模上で合成された。未修飾のｓｉＲＮＡと化学的に修飾されたｓｉＲＮＡｓは、インビトロのトランスフェクション後に効率的なノックダウンをもたらすことが知られている。ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡ配列は、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を低下させるためにＲＮＡｉの分野で記載される、塩基、糖、およびリン酸修飾を使用して合成された。ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓのインビトロの活性を評価するために、２つのヒト細胞株：第１のＳＪＣＲＨ３０ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２０６１（商標））；および、第２の筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）患者由来の不死化ヒト骨格筋芽細胞が使用された。ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡライブラリーの当初のスクリーニングのために、それぞれのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡは、１ｎＭと０．０１ｎＭの最終濃度のＳＪＣＲＨ３０細胞へ、および、１０ｎＭと１ｎＭの最終濃度のＤＭ１筋芽細胞にトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡｓは、メーカーの「前方のトランスフェクション」指示に従って、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製剤化された。ＳＪＣＲＨ３０についてはウェルあたり８５００の細胞、および、ＤＭ１筋芽細胞についてはウェルあたり４０００の細胞を有する、９６ウェルの組織培養プレート上での三通のトランスフェクションの２４時間前に細胞を蒔いた。ランスフェクション後４８時間（ＳＪＣＲＨ３０）あるいは７２時間（ＤＭ１筋芽細胞）に、細胞をＰＢＳで洗浄して、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で収穫した。ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離された。メーカーの説明書に従って、 Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０μｌのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡサンプルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＭＰＫ特異的かつＰＰＩＢ特異的なヒト遺伝子発現プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｑＰＣＲによって評価された。ＤＭＰＫ値はＰＰＩＢ遺伝子発現に対して各サンプル内で正規化された。ＤＭＰＫダウンレギュレーションの定量化は、標準的な２－ΔΔＣｔ方法を使用して実施された。実験はすべて３回行われ、表１５Ａと表１５Ｂは３通りのうちの平均値を提示している。
実施例１７：ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓの選択されたセットのインビトロ用量反応曲線
ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓの活性をさらに確認するために、初期スクリーンで最良の活性を示した配列の多くが、用量反応フォーマットでの経過観察評価のために選択された。もう一度、ＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓのインビトロの活性を評価するために、２つのヒト細胞株：第１のＳＪＣＲＨ３０ヒト横紋筋肉腫細胞株；および、第２の筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）患者由来の不死化ヒト骨格筋芽細胞が使用された。選択されたｓｉＲＮＡｓは、１００、１０、１、０．１、０．０１、０，００１、および０．０００１ｎＭの最終濃度で１０倍の用量反応において、あるいは、５０、５．５５５５６、０．６１７２８４、０．０６８５８７、０．００７６２１、０．０００８４７、および０．００００９４ｎＭの最終濃度で９倍の用量反応においてトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡｓは、メーカーの「前方のトランスフェクション」指示に従って、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製剤化された。ＳＪＣＲＨ３０についてはウェルあたり８５００の細胞、および、ＤＭ１筋芽細胞についてはウェルあたり４０００の細胞を有する、９６ウェルの組織培養プレート上での三通のトランスフェクションの２４時間前に細胞を蒔いた。ランスフェクション後４８時間（ＳＪＣＲＨ３０）あるいは７２時間（ＤＭ１筋芽細胞）に、細胞をＰＢＳで洗浄して、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で収穫した。ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離された。メーカーの説明書に従って、 Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０μｌのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡサンプルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＭＰＫ特異的かつＰＰＩＢ特異的なヒト遺伝子発現プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｑＰＣＲによって評価された。ＤＭＰＫ値はＰＰＩＢ遺伝子発現に対して各サンプル内で正規化された。ＤＭＰＫダウンレギュレーションの定量化は、標準的な２－ΔΔＣｔ方法を使用して実施された。実験はすべて３回行われ、表１６Ａ－Ｂ、１７Ａ－Ｂ、および１８Ａ－Ｂは３通りの平均値と、非線形回帰によって用量反応に対するフィットした曲線から決定された計算されたＩＣ５０値を提示している。
実施例１８：マウス中の種交差反応性を決定するインビトロ実験
選択されたｓｉＲＮＡｓは、１００、１０、１、０．１、０．０１、０，００１、および０．０００１ｎＭの最終濃度で、Ｃ２Ｃ１２マウス筋肉筋芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７７２（商標））へトランスフェクトされた。ｓｉＲＮＡｓは、メーカーの「前方のトランスフェクション」指示に従って、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製剤化された。Ｃ２Ｃ１２播種についてウェルあたり４０００の細胞を有する、９６ウェルの組織培養プレート上での三通のトランスフェクションの２４時間前に細胞を蒔いた。トランスフェクション後４８時間に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で収穫した。ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離された。メーカーの説明書に従って、 Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０μｌのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡサンプルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＭＰＫ特異的かつＰＰＩＢ特異的なマウス遺伝子発現プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｑＰＣＲによって評価された。ＤＭＰＫ値はＰＰＩＢ遺伝子発現に対して各サンプル内で正規化された。ＤＭＰＫダウンレギュレーションの定量化は、標準的な２－ΔΔＣｔ方法を使用して実施された。すべての実験は３回繰り返して実施され、その結果を図１７に示した。４つのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓ（図１７説明文で示される数字は、表１９（表１９Ａ－１９Ｂ）に表記されるＩＤ＃に相当する）が、マウスＤＭＰＫ ｍＲＮＡと有効に交差反応しており、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞細胞株において強固なｍＲＮＡノックダウンをもたらすことが示されていた。ｓｉＲＮＡｓ（ＩＤ番号５３５および１０２８）のうちの２つは、わずかに効果的ではなく、およそ７０％の最大ｍＲＮＡノックダウンをもたらすだけであった。ｓｉＲＮＡｓ（ＩＤ番号２６２８および２６３６）のうちの２つは、より効果的であり、およそ９０％の最大ｍＲＮＡノックダウンをもたらした。
実施例１９：マウス中の種交差反応性を決定するインビボ実験
動物
動物研究は、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」と同様にＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ で概説された規則を厳守する、Ｅｘｐｌｏｒａ ＢｉｏＬａｂｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に基づくプロトコルに従って行われた。マウスはすべて、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのいずれかから入手した。
抱合体調製物
インビボ試験は合計で５つのｓｉＲＮＡ：インビトロでマウスと交差反応性であることが示された４つのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡと（図１７）、および、ＤＭＰＫノックダウンをもたらさず、および、陰性対照として使用することができるスクランブルされた配列を有する１つのｓｉＲＮＡを使用した。すべてのｓｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチド合成の文献に記載される標準的な固相合成方法を使用して合成された。一本鎖は標準分析法を使用してＨＰＬＣによって精製され、その後、純粋な一本鎖を等モルの比率で混合して純粋な二重鎖を生成した。すべてのｓｉＲＮＡは、抗体に結合される抱合ハンドルとして作用し得るパッセンジャー（センス）鎖の５’末端上のヘキシルアミンリンカーで合成された。ｓｉＲＮＡは、能力を最大化し、代謝性安定性を最大化し、および、二重鎖の免疫原性を最小限に抑えるために、ＲＮＡｉの分野でよく記載される最適な塩基、糖、およびリン酸塩修飾を使用して合成された。
抗マウスのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ１、ＣＤ７１としても知られている）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、高い親和性でマウスＣＤ７１タンパク質に結合するラットＩｇＧ２ａサブクラスモノクローナル抗体である。このＣＤ７１抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌによって産生され、市販で入手可能である（カタログ＃ ＢＥ０１７５）。抗体－ｓｉＲＮＡ抱合体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌからのＣＤ７１ ｍＡｂ、および、それぞれのＤＭＰＫまたはスクランブルｓｉＲＮＡを使用して、合成された。すべての抱合体は、先に記載されたようなビスマレイミド－ＴＦＰエステルリンカーを利用して、システイン抱合を介して抗体に、および、アミン抱合体を介してｓｉＲＮＡ（ヘキシルアミンを介して）に合成された。先に記載されたように、すべての複合体は、１（つまり、ｍＡｂ当たり１つのｓｉＲＮＡのモル比）に等しい薬物抗体比率（ＤＡＲ）で抱合体のみを単離するために、強力な陽イオン交換（ＳＡＸ）によって精製された。すべての抗体－ｓｉＲＮＡ抱合体は、インビボ投与のためにＰＢＳでの希釈によって製剤化された。
インビボの投与および分析
精製されたＤＡＲ１抗体－ｓｉＲＮＡ抱合体は、５ｍＬ／ｋｇの投与量で尾静脈への単回静脈内ボーラス注入によって、０．１、０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡの重量に基づく）で雌の野生型ＣＤ－１マウス（４－６週齢）の群（ｎ＝４）に投与された。ＰＢＳビヒクルの一回の偽投与量が、雌の野生型ＣＤ－１マウス（同様に４－６週齢）の対照群（ｎ＝５）に、一致した投与量で注入された。マウスを投与後７日目にＣＯ２窒息によって犠牲にし、複数の組織の２０－３０ｍｇの断片（腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、横隔膜、心臓、および肝臓）を、各マウスから収穫し、液体窒素中で急速凍結した。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、その後、各組織断片をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して均質化した。ＲＮＡは、メーカーの説明書に従って、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ－９６ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離された。メーカーの説明書に従って、 Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１０μｌのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡサンプルは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＭＰＫ特異的かつＰＰＩＢ特異的なマウス遺伝子発現プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるｑＰＣＲによって評価された。ＤＭＰＫ値はＰＰＩＢ遺伝子発現に対して各サンプル内で正規化された。ＤＭＰＫダウンレギュレーションの定量化は、処置された動物をＰＢＳ対照群と比較することにより、標準的な２－ΔΔＣｔ方法を使用して実施された。インビボのＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウン結果は、図１８Ａ～図１８Ｆで提示される。４つのＤＭＰＫ ｓｉＲＮＡｓ（図１８Ａ－図１８Ｆの凡例中で示された数は、表１９（表１９Ａ－１９Ｂ）に表記されるＩＤ＃に相当する）はすべて、用量依存的に分析されたすべての骨格筋（腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、および横隔膜）中のＤＭＰＫ ｍＲＮＡのレベルを有効に低下させることが示された。最も活発なｓｉＲＮＡは、最大用量（３ｍｇ／ｋｇ）ですべての骨格筋において７５％を超えるＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンを達成した。マウス（図１８Ａ～図１８Ｆ）の骨格筋中で観察されたインビボのＤＭＰＫノックダウンは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞細胞株（図１７）中で観察されたインビトロのＤＭＰＫノックダウンと十分に相関しており、ｓｉＲＮＡ ＩＤ番号２６２８および２６３６は、ｓｉＲＮＡ ＩＤ番号５３５および１０２８よりも高いノックダウンを実証している。骨格筋におけるＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンに加えて、マウス心筋（心臓）でも同様に強力な活性（５０％を超えるｍＲＮＡノックダウン）が観察された。最終的に、貧弱な活性（５０％未満のｍＲＮＡノックダウン）がマウス肝臓で観察された。これらの結果は、複数のマウス筋肉群（骨格と心臓を含む）において強固なＤＭＰＫ ｍＲＮＡノックダウンを達成しつつ、肝臓などのオフターゲットの組織においてノックダウンを最小限に抑えることができることを実証している。
実施例２０：ｓｉＲＮＡ合成
すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣを使用して精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。すべてのｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖は、５’末端のＣ６－ＮＨ２抱合ハンドルを含んでいた。図２０Ａ－図２１Ｂを参照。１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ２１量体の二重鎖について、抱合ハンドルは逆脱塩基ホスホジエステルによってｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。構造については図２０Ａ－図２０Ｂを参照。１９の塩基の相補性および１つの３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ平滑端の二重鎖について、抱合ハンドルは末端塩基上のホスホジエステルによってｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。構造については図２１Ａ－図２１Ｂを参照。
精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。
実施例２１：２０１７－ＰＫ－４０１－Ｃ５７ＢＬ６：様々なアトロジン－１ ｓｉＲＮＡｓのインビボのトランスフェリンｍＡｂ抱合体送達
群１－４については、図２２の試験設計を参照。２１量体のアトロジン－１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＵＡＣＧＵＡＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３０）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７°Ｃで２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ％Ｂ カラム体積
ｂ．１０００ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１０００ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した。抱合体ｍＴｆＲ１－ｍＡｂ－アトロジン－１（ＤＡＲ１）については、ＳＡＸ保持時間は９．１分であり、％純度（クロマトグラフィーのピーク面積による）は９９であった。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボの実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において骨格筋中のアトロジン－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された（図２２を参照）。指定された時点の後に、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）と心筋の組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
結果
アトロジン－１ ｓｉＲＮＡガイド鎖は、トランスフェリン受容体を標的とする抗ＴｆＲｍＡｂに結合すると、腓腹筋と心筋中の標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介することができた。図２３および図２４を参照。
結論
この例では、インビボ送達後に、ＴｆＲ１－ｓｉＡｔｒｏｇｉｎ－１抱合体は、腓腹筋と心筋中の標的遺伝子の特異的なダウンレギュレーションを媒介したことが実証された。ＡＳＣは抗トランスフェリン抗体で作られ、マウス腓腹筋と心筋はトランスフェリン受容体を発現し、および、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにマウス特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、結果として腓腹筋と心筋における抱合体の蓄積をもたらした。受容体媒介性の取り込みは、標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例２２：２０１７－ＰＫ－４１３－Ｃ５７ＢＬ６：様々なＭｕＲＦ１配列のインビボのトランスフェリンｍＡｂ抱合体送達
群１－２については、図２５の試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２０８９）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＵＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＵＡＧＡＡＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３１）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
群３－６については、図Ｇの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２２６５）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＧＵＧＡＧＡＣＡＧＵＡＧＡＵＧＵＵＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３２）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
群７－１０については、図Ｇの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２２６６）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＡＣＡＣＧＵＧＡＧＡＣＡＧＵＡＧＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３３）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
群１１－１４については、図Ｇの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２２６７）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＣＡＣＡＣＧＵＧＡＧＡＣＡＧＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３４）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
群１５－１８については、図Ｇの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２２６８）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＡＵＡＵＵＵＣＡＵＵＵＣＧＣＡＣＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３５）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
群１９－２２については、図Ｇの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１（２２６９）ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＵＵＧＧＣＡＵＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３６）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、１つの抱合ハンドル、すなわち、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された５’末端のＣ６－ＮＨ２を含んでいた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７Ｃ°で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した（表１９）。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボ実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、筋肉（腓腹筋と心筋）中のＭｕＲＦ１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された（図２５を参照）。９６時間後、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）と心筋の組織を採取し、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
結果
ＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡガイド鎖は、トランスフェリン受容体１を標的とする抗ＴｆＲ１ ｍＡｂに結合すると、腓腹筋と心筋中の標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介することができた。図２６および図２７を参照。
結論
この例では、インビボ送達後に、ＴｆＲ１－ＭｕＲＦ１抱合体は、腓腹筋と心筋中の標的遺伝子の特異的なダウンレギュレーションを媒介したことが実証された。ＡＳＣは抗トランスフェリン１抗体で作られ、マウス腓腹筋と心筋はトランスフェリン受容体１を発現し、および、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにマウス特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、結果として腓腹筋における抱合体の蓄積をもたらした。受容体媒介性の取り込みは、標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例２３：２０１７－ＰＫ－４１２－Ｃ５７ＢＬ６：デキサメタゾンの阻止は、アトロジン－１およびＭｕＲＦ１ ＴｆＲ１－ｍＡｂ抱合体により筋萎縮症を誘導する。
この実験については、３つの様々なｓｉＲＮＡｓが使用された：
（１）：２１量体のアトロジン－１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＵＡＣＧＵＡＧＵＵＧＡＡＵＣＵＵＣＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３０）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
（２）：２１量体のＭｕＲＦ１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＵＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＵＡＧＡＡＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３１）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
（３）：負の対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）：１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、公開された（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，３１（１２）：３４４５－６０）２１量体の二重鎖が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７Ｃ°で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した（表２０）。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボ実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、筋萎縮症の存在下と不在下で筋肉（腓腹筋）中のＭｕＲＦ１およびアトロジン－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。表２１を参照。抱合体送達の７日後、群２－４、９－１１、および１６－１８について、筋萎縮症は、２１日間のデキサメタゾンの腹腔内注入（１０ｍｇ／ｋｇ）を介して毎日の投与によって誘導された。対照群５－７、１２－１４、および１９－２１（筋萎縮症の誘導がない）について、ＰＢＳが毎日の腹腔内注入によって投与された。群１、８、１５、および２２は７日目に収穫され、筋萎縮症の誘導の前に、ｍＲＮＡ発現と重み付けされた筋肉のベースライン測定値を確立した。指定された時点の後に、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）と心筋の組織を採取し、重み付けし、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
結果
データは図２８～図３１に要約される。ＴｆＲ１ ｍＡｂ抱合体を使用して送達されるとき、アトロジン－１とＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓの同時送達は、正常な筋肉と萎縮性の筋肉においてアトロジン－１とＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡ発現を効率的にダウンレギュレートした。萎縮症の誘導は、約４倍のアトロジン－１およびＭｕＲＦ１発現を一時的に誘導する。ｍＴｆＲ１－アトロジン－１ ＋ ＴｆＲ１．ｍＡｂ－ｓｉＭｕＲＦ１（３ｍｇ／ｋｇ、それぞれおよび混合物としての投与量）の１回量は、正常な腓腹筋と萎縮性の腓腹筋においてアトロジン－１とＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡレベルを＞７０％減少させた。ＭｕＲＦ１とアトロジン－１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、腓腹筋の重量を５－１０％増大させ、ＤＥＸ誘導性の腓腹筋の重量喪失を５０％減少させる。アトロジン－１のみのダウンレギュレーションは、腓腹筋の重量変化に有意な効果がない。アトロジン－１／ＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓを用いる筋萎縮症の処置がない状態では、筋肉の肥大が誘導される。
結論
この例において、ＴｆＲ１ ｍＡｂ抱合体を使用して送達されるとき、アトロジン－１とＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡｓの同時送達は、正常な腓腹筋と萎縮性の腓腹筋においてアトロジン－１とＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡ発現を効率的にダウンレギュレートしたことが実証された。抱合体は、心筋には効果がほとんどなく、アトロジン－１のダウンレギュレーションは不利益であり得る。ＭｕＲＦ１とアトロジン－１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、腓腹筋の重量を５－１０％増大させ、ＤＥＸ誘導性の腓腹筋の重量喪失を５０％減少させた。アトロジン－１のみのダウンレギュレーションは、腓腹筋の重量変化に有意な効果がない。ＡＳＣは抗トランスフェリン抗体で作られ、マウス腓腹筋はトランスフェリン受容体を発現し、および、抱合体はｓｉＲＮＡを標的とするためにマウス特異的な抗トランスフェリン抗体を有し、結果として腓腹筋における抱合体の蓄積をもたらす。受容体媒介性の取り込みは、標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンをもたらした。
実施例２４：２０１７－ＰＫ－４３５－Ｃ５７ＢＬ６：アトロジン－１のトランスフェリンｍＡｂ抱合体送達のためのインビボの用量反応実験
群１－１２については、図３２の試験設計を参照。２１量体のアトロジン－１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＧＵＡＧＵＵＡＡＡＵＣＵＵＣＵＧＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３７）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、Ａに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
群１３－１８について、図３２の試験設計を参照。１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、２１量体の陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ３１（１２）：３４４５－６０によって公開）が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰによる抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７Ｃ°で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した（表２２）。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボ実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、筋萎縮症の存在下と不在下で筋肉（腓腹筋）中のＭｕＲＦ１およびアトロジン－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された（図３２を参照）。抱合体送達の７日後、群３、６、９、１２、および１５について、筋萎縮症は、３日間のデキサメタゾンの腹腔内注入（１０ｍｇ／ｋｇ）を介して毎日の投与によって誘導された。対照群２、５、８、１１、および１４（筋萎縮症の誘導がない）について、ＰＢＳが毎日の腹腔内注入によって投与された。群１、４、７、１０、および１３は７日目に収穫され、筋萎縮症の誘導の前に、ｍＲＮＡ発現と重み付けされた筋肉のベースライン測定値を確立した。萎縮症誘導後３日目（あるいは、抱合体送達後１０日目）に、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、重み付けし、液体窒素で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
結果
データは図３３～図３５に要約される。アトロジン－１ ｓｉＲＮＡガイド鎖は、トランスフェリン受容体を標的とする抗ＴｆＲｍＡｂに結合すると、腓腹筋中の標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介することができた。図３３を参照。投与量を３９ｍｇ／ｋｇから９ｍｇ／ｋｇに増加させることにより、萎縮症誘導性のアトロジン－１ ｍＲＮＡのレベルを２－３倍下げた。このｓｉＲＮＡを用いて達成可能な最大ＫＤは８０％であり、萎縮性の筋肉で最大ＫＤを達成するためには４０ｎＭの組織中濃度が必要であった。これは、抱合体送達アプローチが、投与量を増やすことによって、アトロジン－１の疾患誘導性のｍＲＮＡ発現レベルを変えることができる（図３４を参照）ということを強調している。図３５は、ｍＲＮＡダウンレギュレーションがアトロジン－１ガイドのＲＩＳＣローティングによって媒介され、濃度依存性であることを強調している。
結論
この例では、インビボ送達後に、ＴｆＲ１－アトロジン－１抱合体は、用量依存的に腓腹筋中の標的遺伝子の特異的なダウンレギュレーションを媒介したことが実証された。萎縮症の誘導後、抱合体は、より高い用量でアトロジン－１の疾患誘導性のｍＲＮＡ発現レベルを媒介することができた。アトロジン－１ガイド鎖のより高いＲＩＳＣローティングは、ｍＲＮＡダウンレギュレーションの増大と相関した。
実施例２５：２０１７－ＰＫ－３８１－Ｃ５７ＢＬ６：ミオスタチン（ＭＳＴＮ）ダウンレギュレーションは、デキサメタゾン処置したマウスの筋肉喪失を減らす。
群１－１２については、表２４の試験設計を参照。２１量体のアトロジン－１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＣＧＵＡＧＵＵＡＡＡＵＣＵＵＣＵＧＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３７）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
群１３－１８について、表２４の試験設計を参照。１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、２１量体の陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ３１（１２）：３４４５－６０によって公開）が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７Ｃ°で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した（表２３）。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボ実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、筋萎縮症の存在下と不在下で筋肉（腓腹筋）中のＭＳＴＮのｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された。表２４を参照。抱合体送達の７日後、群２、３、４、９、１０、および１１について、筋萎縮症は、１３日間のデキサメタゾンの腹腔内注入（１０ｍｇ／ｋｇ）を介して毎日の投与によって誘導された。対照群、５、６、７、１２、１３、および１４（筋萎縮症の誘導がない）について、ＰＢＳが毎日の腹腔内注入によって投与された。群１と８は７日目に収穫され、筋萎縮症の誘導の前に、ｍＲＮＡ発現と重み付けされた筋肉のベースライン測定値を確立した。萎縮症誘導後３、７、および１４日目（あるいは、抱合体送達後１０、１４、および２１日目）に、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）組織を採取し、重み付けし、液体窒素で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
結果
データは図３６と図３７に要約される。ＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡガイド鎖は、デキサメタゾン誘導性の萎縮症の存在下と不在下において、トランスフェリン受容体を標的とする抗ＴｆＲｍＡｂに結合すると、腓腹筋中の標的遺伝子のダウンレギュレーションを媒介することができた。図３６を参照。単回の３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡは、＞７５％だけＭＳＴＮ ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートした。デキサメタゾン誘導性の萎縮症の存在下において、ＭＳＴＮダウンレギュレーションは筋肉量を増大させ、デキセドリン誘導性の筋肉喪失を弱める。図３７を参照。
結論
この例では、インビボ送達後に、ＴｆＲ１－ＭＳＴＮ抱合体は、腓腹筋中の標的遺伝子の特異的なダウンレギュレーションを媒介したことが実証された。萎縮症の誘導後、抱合体は筋肉量を増大させ、Ｄｅｘ誘導性の筋肉喪失を弱めることができた。
実施例２６：２０１７－ＰＫ－４９６－Ｃ５７ＢＬ６：アトロジン－１およびＭｕＲＦ１ダウンレギュレーションは、マウス中の坐骨神経除神経時の脚筋肉喪失を減らす。
群１－４については、図３８の試験設計を参照。２１量体のアトロジン－１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＧＧＧＵＡＡＣＡＵＣＧＵＡＣＡＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３８）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
群５－６については、図Ｖの試験設計を参照。２１量体のＭｕＲＦ１ガイド鎖が設計された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＵＵＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＵＡＧＡＡＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２３１）であった。ガイドおよび十分に相補的なＲＮＡパッセンジャー鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で組み立てて、ＨＰＬＣで精製した。ＲＮＡｉの分野で十分に説明される塩基、糖、およびリン酸塩の修飾を使用して、二重鎖の能力を最適化して免疫原性を減らした。精製された一本鎖を二重にし、図２０Ｂに記載される二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
群７－１２については、アトロジン－１とＭｕＲＦ１は上記のような設計だった。ＴｆＲ１ ｍＡｂへの抱合後、および個々のＤＡＲ１種の精製および単離後、混合され、同時投与された。
群１３について、図３８の試験設計を参照。１９の塩基の相補性および３’ジヌクレオチドオーバーハングを持つ、２１量体の陰性対照ｓｉＲＮＡ配列（スクランブル）（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ３１（１２）：３４４５－６０によって公開）が使用された。ガイド／アンチセンス鎖の配列（５’～３’）は、ＵＡＵＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＧＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２２８）であった。活性なＭＳＴＮ ｓｉＲＮＡ二重鎖に使用されたのと同じ塩基、糖、およびリン酸塩の修飾が、負の対照ｓｉＲＮＡで使用された。すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈａｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して固相上で完全に組み立てて、ＨＰＬＣ上で精製した。精製された一本鎖を二重にし、二本鎖ｓｉＲＮＡを得た。パッセンジャー鎖は、２つの抱合ハンドル、５’末端にＣ６－ＮＨ２および３’末端にＣ６－ＳＨを含んでいた。両方の抱合ハンドルは、ホスホジエステル逆脱塩基ホスホジエステルリンカーを介してｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖に接続された。遊離チオールは抱合に使用されていなかったので、Ｎ－エチルマレイミドでエンドキャップされた。
ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用する抗体ｓｉＲＮＡ抱合体合成
工程１：ＴＣＥＰでの抗体の還元
抗体を、１ｍＭのＤＴＰＡを有する２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）と緩衝液交換し、最大で１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸塩緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを加え、３７Ｃ°で２時間インキュベートした。結果として生じた反応混合物をＲＴでｐＨ６．０、１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中でＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５の当量）の溶液と組み合わせて、４°Ｃで夜通し維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析は、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を示した。任意の残っている遊離システイン残基をキャップするために、反応混合物を、（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の）Ｎ－エチルマレイミドの１０ＥＱで処置した。
工程２：精製
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－１を使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２抗体－ｓｉＲＮＡの抱合体を含む分画を単離し、濃縮し、および、ｐＨ７．４のＰＢＳで緩衝液交換した。
陰イオン交換クロマトグラフィー方法（ＳＡＸ）－１．
カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ Ｘ １５ｃｍ、１３ｕｍ
溶媒Ａ：２０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭのＴＲＩＳ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分
勾配：
ａ．％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ．１００ ０ １
ｃ．８１ １９ ０．５
ｄ．５０ ５０ １３
ｅ．４０ ６０ ０．５
ｆ．０ １００ ０．５
ｇ．１００ ０ ２
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法－２
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃＴＭ ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣＴＭ、４×２５０ｍｍ
溶媒Ａ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、２０％のエタノール；溶媒Ｂ：８０％、１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐｈ８、２０％のエタノール、１．５ＭのＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分
勾配：
ａ．時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ．０．０ ９０ １０
ｃ．３．００ ９０ １０
ｄ．１１．００ ４０ ６０
ｅ．１４．００ ４０ ６０
ｆ．１５．００ ２０ ８０
ｇ．１６．００ ９０ １０
ｈ．２０．００ ９０ １０
工程３：精製された抱合体の分析
抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー方法－２を使用する分析的ＨＰＬＣによって評価した（表２５）。
インビボ研究設計
抱合体は、インビボ実験（Ｃ５７ＢＬ６マウス）において、坐骨神経除神経の存在下と不在下で筋肉（腓腹筋）中のＭｕＲＦ１およびアトロジン－１のｍＲＮＡダウンレギュレーションを媒介するその能力について評価された。マウスは、ＰＢＳビヒクル対照および指定されたＡＳＣと投与量を用いて静脈内（ｉｖ）注射によって投薬された（図３８を参照）。抱合体送達の７日後、群２－４、６－８、１０－１２、および１４－１６について、脚の筋萎縮症は坐骨神経除神経によって誘導された。除神経は、対照群１、５、９、１３、および１７では誘導されなかった。
７日目の除神経手術について、マウスに麻酔をかけ（５％のイソフルラン）、０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンの皮下投与量を投与した。右背骨盤領域を坐骨切痕から膝まで剃毛した。この領域を、アルコールとポビドンヨードを交互に使用して消毒した。坐骨切痕を触診で特定し、坐骨切痕から膝に向かって約１ｃｍ切開した。大腿二頭筋を分割して坐骨神経を露出させ、両端を焼灼して約１ｃｍの断片を除去した。その後、筋肉と皮膚を縫合して切開部を閉じた。その後、手術肢を毎日検査し、手術創の状態を観察し、動物の全体的な健康状態を観察した。
群４、８、１２、および１６について、脚の筋肉領域の変化が判定された：測定する脚を剃毛し、消えないインクを使用して線を引き、測定領域をマークした。マウスを円錐型の拘束具で拘束し、右脚を手で保持した。デジタルノギスを使用して、矢状面で１回の測定を行い、かつ冠状面で別の測定を行った。その処置を１週間に２回繰り返した。指定された時点のすべての群について、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）と心筋の組織を採取し、重み付けし、液体窒素中で急速凍結した。標的組織中のｍＲＮＡのノックダウンを、方法のセクションに記載されるように比較ｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ＲＮＡの合計を組織から抽出し、逆転写して、ｍＲＮＡのレベルを、適切に設計されたプライマーおよびプローブを用いるＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して定量化した。ＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）を内部ＲＮＡ負荷対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用し、比較Ｃｔ方法により結果を算出し、そこでは、標的遺伝子Ｃｔ値とＰＰＩＢ Ｃｔ値（ΔＣｔ）との間の差が算出され、その後、第２の差（ΔΔＣｔ）を得ることによってＰＢＳの対照群に対してさらに標準化された。
組織ｓｉＲＮＡ濃度の定量化を、方法のセクションに記載されるようなステム－ループｑＰＣＲアッセイを使用して判定した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を、配列に特異的なステム－ループＲＴプライマーを用いるＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キットを使用して、逆転写した。その後、ＲＴ工程からのｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲのために利用し、Ｃｔ値を、標準曲線に由来する一次方程式を使用して血漿または組織濃度に転換させた。
図３９Ａは、４．５ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡ）のアトロジン－１ ｓｉＲＮＡあるいはＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡのいずれか、または、組み合わせた両方のｓｉＲＮＡの１回投与量の単回処置が、腓腹筋中の各標的の最大７５％のダウンレギュレーションをもたらしたことを示す。
図３９Ｂは、腓腹筋中の両方の標的のｍＲＮＡノックダウンがＡＳＣ投与後３７日目まで未処置の脚において７５％で維持されることを示す。
除神経された脚では、アトロジン１ ｍＲＮＡノックダウンは、除神経後３日間維持されるが、除神経後１０日で２０％に、除神経後３０日で０％まで減少する。除神経された脚におけるＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡノックダウンは、除神経後３日間８０－８５％まで増強されるが、除神経後１０日で５０％に、除神経後３０日で４０％まで減少する（図３９Ｃ）。
両方のｓｉＲＮＡの組み合わせで処置されたとき、各標的のｍＲＮＡノックダウンは、別の標的のノックダウンによる影響を受けなかった（図３９Ｄ）。
脚の筋肉領域の測定に基づいて、ＭｕＲＦ１およびＭｕＲＦ１とアトロジン－１の組み合わせのｓｉＲＮＡ媒介性のダウンレギュレーションは、除神経に誘導された筋消耗を最大３０％減少させた。ＭｕＲＦ１ ｓｉＲＮＡだけを用いる処置は、ＭｕＲＦ１およびアトロジン－１の組み合わせを用いる処置に類似する反応を示した。アトロジン－１のみのダウンレギュレーションは、脚筋の領域に有意な効果がまったくなかった。統計分析はＷｅｌｃｈのＴ検定を使用して、ｓｉＲＮＡ対照群を、組み替えられた処置群と比較した。図３９Ｅを参照。
腓腹筋重量に基づいて、ＭｕＲＦ１だけで、スクランブルｓｉＲＮＡ対照群からの統計的に有意な差を示した。脚の筋肉領域を測定することにより得られた結果に類似して、ＭｕＲＦ１のダウンレギュレーションは、除神経に誘導された筋消耗の最大３５％の減少を示した。これらの結果は、マウスにおけるＭｕＲＦ１ノックアウトの効果に合致するものである（Ｂｏｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１， ２００１）。図３９Ｆを参照。
本開示の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは、当業者に明らかであろう。多くの変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、ならびに、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造はそれによって包含されることが、意図されている。

Claims (11)

  1. ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に結合した抗トランスフェリン受容体抗体を含む、ｓｉＲＮＡ分子抱合体であって、ここで、前記ｓｉＲＮＡは、ヒトＤＭＰＫ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズし、かつ、ヒト被験体の筋細胞において前記ヒトＤＭＰＫ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、前記ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１３４６３、１４０４８、１４０４７、１４０４９、１４１４６、１４０７２、１３４７８、１４１４７、１２２３４、１４１９９からなる群より選択される核酸配列を含むアンチセンス鎖を含み、前記抗トランスフェリン受容体抗体は、２つの軽鎖可変ドメインと２つの重鎖可変ドメインとを含む、ｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  2. ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に結合した抗トランスフェリン受容体抗体を含む、ｓｉＲＮＡ分子抱合体であって、ここで、前記ｓｉＲＮＡは、ヒトＤＭＰＫ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズし、かつ、ヒト被験体の筋細胞において前記ヒトＤＭＰＫ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、前記ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１３４６３、または配列番号１４０４８から選択される核酸配列を含むアンチセンス鎖を含み、前記抗トランスフェリン受容体抗体は、２つの軽鎖可変ドメインと２つの重鎖可変ドメインとを含む、ｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  3. 前記ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、または少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  4. 前記抗トランスフェリン受容体抗体は筋細胞の細胞表面上のトランスフェリン受容体に結合する、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  5. 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖はそれぞれ独立して、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、または少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  6. 前記ｓｉＲＮＡ分子抱合体は、前記ｓｉＲＮＡ分子に前記抗トランスフェリン受容体抗体を接続するリンカーを含む、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  7. 前記少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、
    ２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含むか、
    ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含むか、あるいは、
    それらの組み合わせを含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  8. 前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合を含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  9. 前記ｓｉＲＮＡ分子は、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される３つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  10. 前記ｓｉＲＮＡ分子抱合体は、１～４の薬物抗体比を有する、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
  11. 前記ｓｉＲＮＡ分子抱合体は、非経口投与のために製剤化される、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子抱合体。
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